接着促進剤としてのポリペプチド使用方法
【課題】高い接着力を生じる新しい接着促進剤を提供する。
【解決手段】多層複合材料またはコーティングされた基材であって、複合材料の隣接する少なくとも２層間の、またはコーティングおよび基材間の接着促進剤として、少なくとも４０質量％がペプチド結合により連結したα−アミノ酸（ポリペプチドと略称する）から構成される化合物を含む物を使用することで解決する。
【解決手段】多層複合材料またはコーティングされた基材であって、複合材料の隣接する少なくとも２層間の、またはコーティングおよび基材間の接着促進剤として、少なくとも４０質量％がペプチド結合により連結したα−アミノ酸（ポリペプチドと略称する）から構成される化合物を含む物を使用することで解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多層複合材料またはコーティングされた基材であって、複合材料の隣接する少なくとも２層間の、またはコーティングおよび基材間の接着促進剤として、少なくとも４０質量％がペプチド結合により連結したα−アミノ酸（以下、ポリペプチドと略称する）から構成される化合物を含む物に関する。さらに具体的には、本発明は接着促進剤としてのハイドロフォビン使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイドロフォビンは約１００〜１５０残基のアミノ酸の小さいタンパク質であり、例えばスエヒロタケ(Schizophyllum commune)などの糸状菌の特徴的なものである。それらは8個のシステイン単位を有するのが一般的である。
【０００３】
ハイドロフォビンは界面に顕著な親和性を有し、そのため、表面のコーティングに有用である。例えば、テフロン（登録商標）をハイドロフォビンとコーティングすると親水性表面を得ることができる。
【０００４】
ハイドロフォビンは天然資源から単離することができる。我々の先願であるＤＥ １０２００５００７４８０．４にはハイドロフォビンの生産方法が開示されている。
【０００５】
先行技術において種々の用途についてハイドロフォビンの使用方法が提案されている。
【０００６】
ＷＯ ９６／４１８８２は疎水性表面へ親水性特性を付与し、親水性物質の水耐性を改良し、水中油型乳剤または油中水型乳剤を作成して、ハイドロフォビンを乳化剤、増粘剤または界面活性剤として使用する方法を提案する。軟膏類またはクリーム類の製造の様な薬剤への応用、および肌保護、ヘアーシャンプーまたはヘアーリンスの生産のような化粧品への応用も提案されている。
【０００７】
ＥＰ−Ａ １ ２５２ ５１６には窓、コンタクトレンズ、バイオセンサー、医療機器、分析用または貯蔵用のコンテナ、船体、固形粒子、または乗用車のフレームまたは車体についてハイドロフォビンを含有する溶液で３０〜８０℃コーティングすることが開示されている。
【０００８】
ＷＯ ０３／５３３８３には化粧品への応用として角質物質を処理するためのハイドロフォビンの使用方法が開示されている。
【０００９】
ＷＯ ０３／１０３３１には、ハイドロフォビンをコーティングしたセンサー（例えば、計測用電極）であって、例えば電気活性な物質、抗体または酵素などの物質がさらに非共有結合したセンサーが開示されている。
【００１０】
以前から、全く異なる接着促進剤が接着の改善に、例えば多種多様な基材のコーティングに使用されている。Ｒｏｍｐｐ Ｃｈｅｍｉｅ Ｌｅｘｉｋｏｎ（１９９０年版）によると、例えばチタン酸塩類、シラン類、不飽和カルボン酸類のクロム錯体などが適切である。特に注目される、接着のための接着促進剤はエチレン／アシルアミド共重合体、イソシアナート重合体または反応性有機ケイ素化合物である。
【００１１】
ポリウレタン類およびポリエチレンイミン類も接着促進剤として知られている。
【００１２】
【特許文献１】ＤＥ １０２００５００７４８０．４
【特許文献２】ＷＯ ９６／４１８８２
【特許文献３】ＥＰ−Ａ １ ２５２ ５１６
【特許文献４】ＷＯ ０３／５３３８３
【特許文献５】ＷＯ ０３／１０３３１
【特許文献６】ＷＯ ９６／４１８８２
【特許文献７】ＤＥ １０２００５００７４８０．４
【非特許文献１】Ｒｏｍｐｐ Ｃｈｅｍｉｅ Ｌｅｘｉｋｏｎ（１９９０年版）
【非特許文献２】Ｗｅｓｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ.Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．，１９９４年、３２巻、４１３〜４３７頁
【非特許文献３】Ｗｏｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．,Ｅｕｒ． Ｊ Ｃｅｌｌ ｂｉｏ．６３巻、１２２−１２９頁（１９９４年）
【非特許文献４】Ｇｏｅｄｄｅｌ， ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｋｏｒｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ（１９９０年）
【非特許文献５】Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｅｄｓ． Ｐｏｕｗｅｌｓ Ｐ． Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ, Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ Ｙｏｕｋ−Ｏｘｆｏｒｄ， １９８５年、ＩＳＢＮ ０ ４４４ ９０４０１８）
【非特許文献６】Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｈ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ（１９８９年）
【非特許文献７】Ｔ．Ｊ．Ｓｉｈａｖｙ， Ｍ．Ｌ．Ｂｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）
【非特許文献８】Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７年）
【非特許文献９】Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｗｉｌｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｔｏｒｋ １９９７年
【非特許文献１０】Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ.およびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８７年）Ｃｅｌｌ ５１巻、５０３頁
【非特許文献１１】Ｃｏｏｐｅｒ，Ｆ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｈｅ Ａｒｂｅｉｔｓｍｅｔｈｏｄｅｎ，Ｖｅｒｌａｇ Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ， Ｂｅｒｌｉｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
【非特許文献１２】Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は非常に高い適用性を有し、特に、多層複合材料または基材へのコーティングの個々の層の高い接着力を生じる新しい接着促進剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
結果的に、本目的は最初に定義した多層複合材料またはコーティングされた基材により達成されることが見出された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
接着促進剤
硬質表面またはコーティングされた基材は接着促進剤として最初に定義したポリペプチドを含む。
【００１６】
ポリペプチドは少なくとも４０質量％、好ましくは少なくとも７０質量％、さらに好ましくは少なくとも９０質量％、さらに特に好ましくは少なくとも９５または９９質量％のペプチド結合により連結したα−アミノ酸から成る。
【００１７】
特別な実施形態においては、ポリペプチドは完全にペプチド結合により連結したα−アミノ酸のみから成る。
【００１８】
特に適切なα−アミノ酸はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、セリン、スレオニン、システイン、シスチン、メチオニン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、及びヒスチジンである。
【００１９】
ポリペプチドは混合物中にα−アミノ酸、システインを他のα−アミノ酸と共に含むことが好ましい。
【００２０】
特にポリペプチドは好ましくは少なくとも０．１質量％、さらに好ましくは少なくとも０．５質量％、さらに特に好ましくは少なくとも1質量％のシステインを含む。一般的に、ポリペプチド中のシステイン含有量は１５質量％、特に１０質量％を超えず、特に好ましくは７質量％を超えない。
【００２１】
特別な実施形態においては、ポリペプチドはハイドロフォビンである。
【００２２】
本発明による「ハイドロフォビン」の用語は以下に示す、一般構造式（Ｉ）
【００２３】
【化１】
【００２４】
[上記式中、Ｘは２０種の天然アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ）を表し、各々のＸは同一または異なっても良く、Ｘの隣の指数はそれぞれの場合のアミノ酸残基数を示しており、Ｃはシステイン、アラニン、セリン、グリシン、メチオニンまたはスレオニンを表し、ただし、Ｃで表されるアミノ酸の少なくとも４個はシステインであり、指数ｎおよびｍは相互に独立して、０〜５００の範囲、好ましくは１５〜３００の範囲の自然数である。]
のポリペプチドのことを言う。
【００２５】
さらに、式（Ｉ）のポリペプチドは、（ガラス面をコーテインクした後の）特性として、室温で水滴の接触角を、コーティングしていないガラス面で同サイズの水滴により形成される接触角と比較し、少なくとも２０°、好ましくは２５°、さらに好ましくは３０°まで増加させることにより特徴づけられる。
【００２６】
Ｃ1〜Ｃ8で示されるアミノ酸は、好ましくはシステインであるが、それらは同様な容積の他のアミノ酸、好ましくはアラニン、セリン、スレオニン、メチオニンまたはグリシンと置換されても良い。しかしながら、Ｃ1〜Ｃ8の位置の少なくとも４個、好ましくは少なくとも５個、さらに好ましくは少なくとも６個および特に好ましくは７個がシステインで構成されている方が良い。システインは還元型を示しても、または互いにジスルフィド架橋を形成しても良い。特に、少なくとも１個、好ましくは２個、さらに好ましくは３個および最も好ましくは４個の分子間ジスルフィド架橋を伴う、分子間のＣ−Ｃ架橋の形成が特に好ましい。上記のシステインが他の同様な容積のアミノ酸に置換する場合、そのＣ−位置が互いに分子間ジスルフィド架橋を形成できるように対交換を伴うことが有利である。
【００２７】
システイン、セリン、アラニン、グリシン、メチオニンまたはスレオニンがＸで指定された位置に用いられる場合、一般式における個々のＣ−位置の番号は適宜変化する。
【００２８】
好ましくは、一般式（ＩＩ)
【００２９】
【化２】
【００３０】
[本発明を行うため、上記式中、Ｘ、ＣおよびＸの隣の指数はそれぞれ上記と同様であるが、指数ｎおよびｍは０〜３００の範囲の数値を示し、さらに、そのタンパク質は上記の接触角の変化により識別される。]
のハイドロフォビンを使用する。
【００３１】
さらに好ましくは、一般式（ＩＩＩ）
【００３２】
【化３】
【００３３】
[上記式中、Ｘ、ＣおよびＸの隣の指数はそれぞれ上記と同様であり、指数ｎおよびｍは０〜２００の範囲の数値を示し、さらに、そのタンパク質は上記の接触角の変化により識別され、さらに、Ｃで表されるアミノ酸の少なくとも６個がシステインであり、特に好ましくはＣで表される全てのアミノ酸がシステインである。]
のハイドロフォビンを使用する。
【００３４】
ＸnおよびＸm残基はハイドロフォビンへ天然に結合するペプチド配列でも良い。しかしながら、ＸnおよびＸmのどちらか一方または両方ともがハイドロフォビンに天然には結合しないペプチド配列でも良い。これはＸnおよび／またはＸm残基について、ハイドロフォビン中に天然に生じるペプチド配列が天然に生じないペプチド配列により延長されている場合も含まれる。
【００３５】
Ｘnおよび／またはＸmがハイドロフォビンにおいて天然に生じないペプチド配列である場合、その配列の長さは一般的に少なくとも２０残基のアミノ酸、好ましくは少なくとも３５残基のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも５０残基のアミノ酸および最も好ましくは少なくとも１００残基のアミノ酸である。ハイドロフォビンに天然に結合しないこの種の残基は後述のように、融合パートナー（fusion partner）とも言う。これはそのタンパク質が少なくとも１種のハイドロフォビン部分、および天然にはこの形態で共に生じない融合パートナーとから成る事実を明確にすることを目的としている。
【００３６】
融合パートナーは多数のタンパク質から選択される。複数の融合パートナーを１種のハイドロフォビン部分、例えば、ハイドロフォビン部分のアミノ末端（Ｘn)およびカルボキシ末端（Ｘm）に結合させることもできる。しかしながら、例えば、本発明により使用されるタンパク質の１位置（ＸnまたはＸm）に２個の融合パートナー部分を結合させることもできる。
【００３７】
特に安定な融合パートナー部分は微生物、特にE.coliまたはBacillus subtilisにおいて天然に生じるポリペプチドである。このような融合パートナー部分の例としては、ｙａａｄ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５および１６）、ｙａａｅ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７および１８）およびチオレドキシンが挙げられる。また、上記配列の断片または誘導体で、その配列の一部分のみ、好ましくは７０〜９９％およびさらに好ましくは８０〜９８％を含む、または上記の配列と比較して特定のアミノ酸またはヌクレオチドが改変されたものは非常に適している（％はそれぞれの場合、アミノ酸数に関する％を表す）。
【００３８】
さらに、本発明により使用されるタンパク質をそれらのペプチド配列において、例えばグリコシル化、アセチル化または他の例えばグルタルアルデヒドなどの化学的架橋結合により修飾してもよい。
【００３９】
本発明により使用されるタンパク質の一特性は、表面がそのタンパク質でコーティングされると、表面特性が変化することである。表面特性における変化はタンパク質による表面のコーティング前後における水滴の接触角を測定し、両測定値間の差異を測定することにより実験的に測定できる。
【００４０】
接触角の測定する方法の原理は当業者に知られている。その測定は室温で、５μｌの水滴を基準として行われる。接触角の測定についての正確な実験条件は実施例の実験部分に示す。その条件において、本発明により使用されるタンパク質はコーティングしていないガラス面で同サイズの水滴の接触角と比較して、ガラス表面の水滴の接触角を少なくとも２０°、好ましくは少なくとも２５°およびさらに好ましくは３０°まで増加させる特性を有する。
【００４１】
今まで知られているハイドロフォビン類のハイドロフォビン部分において極性および非極性アミノ酸残基の位置は保存されており、結果として疎水性の性質が生じている。今まで知られているハイドロフォビン類は生物物理学的性質および疎水性における違いにより、ＩおよびＩＩの２種のクラスに分類される（Ｗｅｓｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ.Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．，１９９４年、３２巻、４１３〜４３７頁）。
【００４２】
作製されたクラスＩのハイドロフォビン類の膜は不溶性が高く（温度を高めた１質量％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液でも不溶である）、高濃度のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはギ酸によってのみ再び解離することができる。一方、作成されたクラスＩＩのハイドロフォビン類の構造はより不安定である。それらは６０質量％エタノールまたは１質量％ＳＤＳ(室温で)によって再び解離することができる。
【００４３】
アミノ酸配列の比較によると、システインＣ3及びシステインＣ4間の領域がクラスＩのハイドロフォビン類の場合よりクラスＩＩのハイドロフォビン類の場合がはっきりと短いことが明らかである。さらにクラスＩＩのハイドロフォビンはクラスＩの場合よりアミノ酸の電荷が高い。
【００４４】
特に好ましい本発明の実施形態のハイドロフォビン類はタイプｄｅｗＡ，ｒｏｄＡ、ｈｙｐＡ、ｈｙｐＢ，ｓｃ３，ｂａｓｆ１、ｂａｓｆ２、のものであり、構造的に以下にリストする配列に特徴づけられる。また、それらは、その部分のみであっても、またはそのタイプの誘導体であっても良い。複数種のハイドロフォビンを、好ましくは２または３種で、互いに同一または異なる構造で、ハイドロフォビンと天然には結合しない適切なポリペプチド配列に相当するように連結させることもできる。
【００４５】
さらに、本発明を実施するために特に適切なのは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、２２、２４およびそれをコードする核酸配列で示されるポリペプチド配列、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２１、２３の配列を有する融合タンパク質である。さらに、特に好ましい実施形態はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、２２または２４で示されるポリペプチド配列から開始し、少なくとも１個〜１０個以下、好ましくは５個、さらに好ましくは全てのアミノ酸残基の５％の置換、挿入または削除が生じ、開始タンパク質の生物学的特性の少なくとも５０％をまだ有しているタンパク質を含む。ここで、本発明により使用されるタンパク質の生物学的特性は上記の接触角における少なくとも２０°の増加を意味する。
【００４６】
本発明により使用されるポリペプチドは、例えばメリフィールドに従う固相合成法などによるペプチド合成の良く知られた技術により化学的に作製できる。
【００４７】
天然に生じるハイドロフォビンは天然資源から適切な方法を用いて単離することができる。例として、Ｗｏｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．,Ｅｕｒ． Ｊ Ｃｅｌｌ ｂｉｏ．６３巻、１２２−１２９頁（１９９４年）またはＷＯ ９６／４１８８２が挙げられる。
【００４８】
好ましくは、融合タンパク質は遺伝子工学的手法、即ち、融合パートナーをコードする１個の核酸配列、特にＤＮＡ配列およびハイドロフォビン部分をコードする１個の核酸配列、特にＤＮＡ配列を結合することで、結合した核酸配列の遺伝子発現により、宿主生物中に目的とするタンパク質を生じさせる手法で作製する。このような方法は我々の先行出願であるＤＥ １０２００５００７４８０．４で開示している。
【００４９】
上記の作製方法における適切な宿主生物（生産生物）には、原核生物（古細菌を含む）または真核生物、特に好塩菌を含む細菌、カビ、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞、さらに好ましくはEscherichia coli、Bacillus subtilis、Bacillus megaterium、Aspergillus oryzea、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Pichia pastoris、Pseudmonas spec.、Lactobacilli、Hansenula polymorpha、Trichoderma reesei、SF9(または関連細胞)などが含まれる。
【００５０】
さらに、本発明は制御核酸配列の遺伝子制御に基づいて、本発明により使用されるポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現コンストラクト（構築物（constructs））の使用方法、およびこれらの発現コンストラクトの少なくとも１種を含むベクターに関する。
【００５１】
好ましくは、使用されるコンストラクトは目的のタンパク質をコードする配列の５‘上流にプロモーターおよびそのコードする配列の３’下流にターミネーター配列が含まれ、必要に応じて、さらに、そのコードする配列に有効に連結される慣例の調節因子も含まれる。
【００５２】
「有効な連結（operative linkage）」はプロモーター、目的とするタンパク質をコードする配列、ターミネーター、および必要に応じて、そのコードする配列の発現に要求される機能果たすことができるような、さらなる調節因子の配列の配置を意味する。
【００５３】
有効に連結した配列の例としては、標的とする配列およびエンハンサー、ポリアデニル化信号などがある。さらに、調節因子には選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などが含まれる。適切な制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ， ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｋｏｒｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ（１９９０年）に記載されている。
【００５４】
これらの制御配列に加えて、これらの配列の天然の制御因子が実際の構造遺伝子の上流にまだ存在していても良く、必要に応じて、その天然の制御因子のスイッチを切り、遺伝子の発現を強めるように遺伝子修飾をしても良い。
【００５５】
好ましい核酸コンストラクトにおいては、プロモーターと機能的に連結し、核酸配列の発現を高めることができる１種以上の上記のエンハンサー配列を含むことが有利である。さらなる制御因子またはターミネーターの様なさらに有利な配列をＤＮＡ配列の３‘末端に導入しても良い。
【００５６】
核酸はコンストラクトに１個以上の複製として含まれても良い。さらにコンストラクトには、必要に応じてそのコンストラクトを選択する目的で、抗生物質耐性または補完的栄養要求性遺伝子の様なマーカーを追加して含ませても良い。
【００５７】
本発明の方法に有利な制御配列は、プロモーターでは例えば、cos、tac、 trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、laclq-T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、lambda-PRまたはlambda-Pプロモーターであり、これらのプロモーターはグラム陰性細菌に有利である。さらに、有利な制御配列は、例えばグラム陽性細菌のプロモーターamyおよびSP02、酵母またはカビのプロモーターADC1、MFalpha、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADHがある。
【００５８】
制御には人工的なプロモーターを使用することもできる。
【００５９】
宿主生物における核酸コンストラクトを発現するため、その宿主において遺伝子を最適に発現させるベクター、例えばプラスミドまたはファージに挿入するのが有利である。さらに、ベクターにはプラスミドおよびファージと同様に、それ自体知られている他のすべてのベクター、即ち、例えばSV40、CMV、バクロウイルス、アデノウイルスなどのウイルス、トランスポゾン、ISエレメント、ファスミド、コスミドおよび直鎖または環状ＤＮＡ、およびアグロバクテリウム法が含まれる。
【００６０】
これらのベクターはその宿主生物または染色体において独立して複製されても良い。これらのベクターは本発明のさらなる実施形態を構成する。適切なプラスミドの例としては、E.coliにおける、pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-lll”3-B1、tgt11またはpBdCl、Streptomycesにおける、pIJ101、pIJ364、pIJ702またはpIJ361、BacillusにおけるpUB110、pC194またはpBD214、CorynebacteriumにおけるpSA77またはpAJ667、カビにおけるｐALS1、pIL2またはpBB116、酵母における2alpha、pAG-1、YEp6、YEp13またはpEMBLYe23または植物におけるpLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004またはDH51が挙げられる。上記プラスミドは使用可能なプラスミドの一部を選択したものである。他のプラスミドは当業者に良く知られており、例えば書籍Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｅｄｓ． Ｐｏｕｗｅｌｓ Ｐ． Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ, Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ, １９８５年、ＩＳＢＮ ０ ４４４ ９０４０１８）において認められる。
【００６１】
他の遺伝子を発現するため、核酸コンストラクトは宿主生物および遺伝子または遺伝子群により最適な発現と成るように選択された、発現を強める３'−および／または５’−末端の制御配列を含むことが有利である。
【００６２】
これらの制御配列はその遺伝子およびタンパク質の発現を特異的にさせることを目的としている。宿主生物によっては、これは例えば、遺伝子が誘導後のみに発現するか、または、過剰発現し、および／または直ちに発現するか、または過剰発現することを意味する。
【００６３】
これに関しては、制御配列または因子は確実に影響を与え、結果として誘導された遺伝子の発現をより強めることが好ましい。従って、制御因子はプロモーターおよび／またはエンハンサーの様な強力な転写シグナルを使用することにより、転写レベルを有利に強めても良い。しかしながら、この他に、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の安定性を改良することにより、翻訳を強めることも可能である。
【００６４】
ベクターのさらなる実施形態において、核酸コンストラクトまたは核酸を含むベクターが直鎖ＤＮＡの形態で微生物へ有利に導入され、異種または相同的な遺伝子組み換えにより宿主生物のゲノムに組み込まれても良い。この直鎖ＤＮＡはプラスミドの様な直鎖化した（linearized）ベクターまたは単に核酸コンストラクトまたは核酸で構成されていても良い。
【００６５】
宿主生物中の異種の遺伝子の最適な発現のためには、その生物に利用される特異的なコドン使用頻度に従って核酸配列を組み換えることが有利である。コドン使用頻度は問題となる生物の他の既知遺伝子のコンピューター解析により容易に測定できる。
【００６６】
発現カセットは適切なプロモーターを目的のタンパク質をコードする適切なヌクレオチド配列およびターミネーターまたはポリアデニル化信号と融合することにより作成する。例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｈ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ（１９８９年）およびＴ．Ｊ．Ｓｉｈａｖｙ， Ｍ．Ｌ．Ｂｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７年）に記載されているような、一般的な遺伝子組み換えおよびクローニング技術は本目的のために使用される。
【００６７】
適切な宿主生物において発現させるため、組み換え核酸コンストラクトまたは遺伝子コンストラクトを宿主において遺伝子の最適な発現を提供する宿主特異的ベクターへ挿入する。ベクターはそれ自体知られており、例えば「Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ」（Ｐｏｕｗｅｌｓ Ｐ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５年）から選択しても良い。
【００６８】
ベクターによって、例えば少なくとも１個のベクターが変換され、本発明により使用されるポリペプチドの生産に使用される、組み換え微生物を作製することができる。上記の組み換えコンストラクトは適切な宿主系への導入および発現において有利である。これに関して、当業者に知られた、通常のクローニングおよびトランスフェクション法、例えば共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルスによるトランスフェクションなどを、特に発現系において上記核酸を発現させるために使用することが好ましい。適切な発現系は例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｗｉｌｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｔｏｒｋ １９９７年、またはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ａｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９年に記載されている。
【００６９】
相同的に遺伝子組み換えされた微生物も作成することができる。この目的のため、本発明により使用される遺伝子または目的のタンパク質をコードする配列であって、必要に応じて、少なくとも１個のアミノ酸の削除、アミノ酸の付加またはアミノ酸の置換が、例えば機能的崩壊した配列（ノックアウトベクター）を修飾するために導入された配列の少なくとも１部分を含むベクターが作製される。導入された配列は、例えば、関連微生物からの相同体(homolog)であっても良く、または哺乳類、酵母または昆虫資源から得られるものでも良い。その代わりに、相同的遺伝子組み換えに使用されるベクターは、内在性遺伝子が相同的遺伝子組み換えの場合に変異されるか、または改変され、それでもその遺伝子が機能的蛋白質をコードするような方法で設計されても良い（例えば、上流の制御領域が内在性タンパク質の発現がそれにより変化されるような方法で改変されても良い）。本発明により使用される遺伝子の改変される部分は相同的遺伝子組み換えベクター中にある。相同的遺伝子組み換えに適切なベクターの構築は、例えば、Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ.およびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８７年）Ｃｅｌｌ ５１巻、５０３頁に記載されている。
【００７０】
本発明により使用される核酸または核酸コンストラクトに適切な組み換え宿主生物は原則として全ての原核または真核生物が使用できる。細菌、カビ、または酵母のような微生物を宿主生物として使用することが有利である。グラム陽性またはグラム陰性細菌、好ましくはエンテロバクテリア科、シュードモナス科、リゾビウム科、ストレプトマイセス科またはノカルジア科であり、特に好ましくは、細菌の属として、Esherichia属、Pseudomonas属、Streptomyces属、Nocardia属、Burkholderia属、Salmonera属、Agrobacterium属またはRhodococcus属を使用することが有利である。
【００７１】
融合タンパク質の製造方法に使用される生物は宿主生物に応じて、当業者に知られた方法で生育または培養される。微生物の場合は、通常は糖類の形態の炭素源、通常は酵母エキスのような有機窒素源または硫酸アンモニウムのような塩の形態の窒素源、鉄塩、マンガン塩およびマグネシウム塩のような微量元素、および必要に応じてビタミン類を含む液体培地にて０℃〜１００℃、好ましくは１０℃〜６０℃の温度で、酸素を供給しながら培養するのが通常である。これに関連して、栄養培地のｐＨは一定の値に保たれても良い、即ち、培養中制御しても、しなくても良い。培養をバッチ法、セミバッチ法または連続的に行っても良い。栄養培地を発酵の開始時に最初に導入するか、またはその後に半連続または連続法で供給しても良い。酵素を実施例に記載される方法により生物から単離しても、または粗抽出液として反応に使用しても良い。
【００７２】
本発明により使用されるタンパク質またはその機能的な生理活性のある断片は遺伝子組み換え操作により作製しても良い。タンパク質を生産する微生物の培養、必要に応じて導入されるタンパク質の発現および培養物からのタンパク質の単離によることが適切である。タンパク質はまた必要であればこの方法により工業的スケールで生産しても良い。組み換え微生物既知の方法で培養または発酵しても良い。例えば、細菌はＴＢ培地またはＬＢ培地により、２０℃〜４０℃の温度、ｐＨ６から９で増殖させても良い。適切な培養条件は、例えばＴ．Ｍａｎｉｓｔｉｓ、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ(１９８８年)に詳細に記載されている。
【００７３】
タンパク質が培養培地へ分泌されない場合、それから細胞を破壊し、既知のタンパク質の単離方法により溶解物から生産物を得る。その細胞は必要に応じて高周波数の超音波処理法、フレンチプレッシャーなどの高圧処理法、浸透圧による溶菌（osmolysis）法、洗剤、溶菌酵素または有機溶剤の作用、ホモジナイザー法または２種以上の上記方法の組合せにより、破壊することができる。
【００７４】
タンパク質は分子篩クロマトグラフィ（ゲルろ過）や、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィおよび疎水性クロマトグラフィの様な既知のクロマトグラフィ法を使用して、および限外ろ過法、結晶化法、塩析法、透析法およびネイティブゲル電気泳動法などのその他の慣例的な方法を使用して精製することができる。適切な方法は例えば、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｆ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｈｅ Ａｒｂｅｉｔｓｍｅｔｈｏｄｅｎ，Ｖｅｒｌａｇ Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ， Ｂｅｒｌｉｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、またはＳｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎに記載されている。
【００７５】
組み換えタンパク質を単離するためには、相補的ＤＮＡ(cDNA)を特定のヌクレオチド配列により伸長し、それにより例えば精製を簡略化するように目的の改変ポリペプチドまたは融合タンパクをコードするベクター系またはオリゴヌクレオチドを使用することが有利である。この種の適切な修飾の例としては、例えばヘキサ−ヒスチジンアンカー、または抗体により抗原として認識できるエピトープとして知られる修飾法などのアンカーとして作用する「タグ(tags)」がある（例えば、Ｈａｒｌｏｗ，ＥおよびＬａｎｅ，Ｄ．，１９８８年，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（Ｎ．Ｙ．）Ｐｒｅｓｓに記載されている）。その他の適切な「タグ」には、例えばＨＡ、カルモジュリン−ＢＤ、ＧＳＴ、ＭＢＤ、キチン−ＢＤ、ストレプトアビジン−ＢＤ−アビ−タグ、フラッグ−タグ、Ｔ７などが挙げられる。これらのアンカーはタンパク質を付着するために、高分子充填材であって、例えばクロマトグラフィカラムに重点されたものなどの固体支持体に使用しても良く、またはマイクロタイタープレートまたはその他の支持体に使用しても良い。相当する精製手順は業務用アフィニティタグ供給業者から入手することができる。
【００７６】
上記のように精製されたタンパク質は直接、融合タンパク質としてでも、または融合パートナーを開裂および除去した後に、純粋なハイドロフォビンとしてでも使用することができる。
【００７７】
融合パートナー部分の除去をする場合は、融合タンパク質においてハイドロフォビン部分および融合パートナー部分の間に潜在的な開裂部位（プロテアーゼの特異的な認識部位）を組み込むことが望ましい。適切な開裂部位には、特に、すでに生命情報工学的な手法により測定された、ハイドロフォビン部分にも、または融合パートナー部分のどちらにも存在しないペプチド配列である。特に、例えばメチオニンのシアン化臭素による開裂または、Ｘａ因子、エンテロキナーゼ開裂、トロンビン、ＴＥＶ(タバコエッチウイルスプロテアーゼ)開裂を伴うプロテアーゼ媒介による開裂が適切である。
【００７８】
配列リストのＤＮＡおよびポリペプチド配列の配列名の指定
【００７９】
【表１】
【００８０】
多層複合材料
多層複合材料は全く異なる目的、例えば梱包手段（特に合成フィルム）または粘着性製品（self-adhesive articles）（少なくとも支持体および接着層の多層複合材料）に用いられる。
【００８１】
多層複合材料は少なくとも２種、好ましくは２〜５種の層を含み、個々の層は、例えば０．０１〜０．５ｍｍの厚さを有することができる。個々の層は天然または合成ポリマーあるいは金属で構成されていても良い。具体的には、その層はポリマーフィルム、紙、金属ホイル、金属化ポリマーフィルムなどである。
【００８２】
上記ポリペプチドは多層複合材料の隣接する少なくとも２層間の接着促進剤として使用される。好ましくは、少なくとも１層の隣接層は天然または合成ポリマーの層である。適切なポリマーは具体的にはポリエステル類の様な重縮合体、ポリウレタン類の様な付加重合体、ポリアミド類、ポリカーボネート類またはポリフェニレンエーテル類またはポリフェニレン硫化物またはエチレン様の不飽和化合物の遊離ラジカルまたはイオン重合により得られる重合体（遊離ラジカルポリマーと略称する）である。そのような遊離ラジカルポリマーは、好ましくは少なくとも６０質量％、さらに好ましくは少なくとも８０質量％の、Ｃ1〜Ｃ20アルキル（メタ）アクリレート類、２０個以下の炭素原子を含むカルボン酸のビニルエステル類、炭素原子２０個以下のビニル芳香族化合物、エチレン様の不飽和ニトリル類、ハロゲン化ビニル、１〜１０個の炭素原子から成るアルコールのビニルエーテル、２〜８個の炭素原子および１個または２個の二重結合を有する脂肪族炭化水素、特にエチレンおよびプロピレンから選択される「メインモノマー（main monomers）」から構成される。
【００８３】
本発明のポリペプチドは特に非極性ポリマーの接着促進剤として適切であり、従って、少なくとも１層の隣接層は非極性ポリマーで構成されるのが好ましい。
【００８４】
ポリマーの極性は空気中(２１℃)での表面張力により測定する。表面張力が低いほど、ポリマーはより非極性である。
【００８５】
従って、少なくとも１層の隣接層は５０ｍＮ／ｍ（ミリニュートン／メートル）未満、特に４０ｍＮ／ｍ未満の表面張力を有する非極性ポリマーで構成されるのが好ましい。この種の非極性ポリマーの例として、ポリアミド６６（４２．５ｍＮ／ｍ）、ポリスチレン（４３．５ｍＮ／ｍ）、ＰＶＣ（３８．４ｍＮ／ｍ）、ポリエチレン（３６．１ｍＮ／ｍ）、ポリプロピレン（２９ｍＮ／ｍ）またはポリテトラフルオロエタン（２２・５ｍＮ／ｍ）が挙げられる。
【００８６】
特に好ましくは、両方の隣接層がそのような非極性ポリマーで構成されることである。
【００８７】
接着促進剤のために必要とされるポリペプチドの量は通常は０．０１〜１０００ｍｇ／ｍ2（ミリグラム／平方メーター）、特に０．０１〜１００ｍｇ／ｍ2およびさらに好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｍ2である。
【００８８】
ポリペプチドは２層の隣接層のどちらか一方に塗布しても良く、およびその代りに、両方の層が既に作られている場合、両方の層に塗布しても良い。
【００８９】
ポリペプチドは水溶液の形態が好ましく、溶液のポリペプチド含有量は好ましくは水１００質量部に対し０．０１〜５質量部である。本発明による使用するため、その溶液は、好ましくは１〜１００００μｇ／ｍｌ水、特に１０〜１０００μｇ／ｍｌ水の濃度に希釈される。
【００９０】
従って、塗布工程に続いて、その水分を除去するために、まず乾燥工程が行われる。
【００９１】
続いて、２層の隣接層を慣例の方法、例えばラミネート加工により接着する。
【００９２】
ポリペプチドは特に１層の隣接層（第１層）に塗布することができ、それから、他方の隣接層(第２層)は接着促進剤が施された第１層へポリマー分散液、ポリマー溶液または無溶媒のポリマーを塗布し、続くフィルム形成および／または熱または光化学硬化することで作製することができる。この目的のために、そのポリマーは、具体的には水分散液または溶液、特に好ましくは、乳剤(emulsion)ポリマー、好ましくは上記の遊離ラジカルポリマーのいずれかの水分散液の形態である。ポリマーが塗布された後、必要に応じて、乾燥工程が行われる。
【００９３】
コーティングされた基材
基材は全く別の目的でコーティングされる。具体的には装飾的コーティングまたは保護コーティング（総称：コーティング）または他の粘着性コーティング（粘着性を与えるためにそのような基材自体に塗布することができ、または、例えば粘着性製品（ラベルまたは粘着テープ）の形態でその基材に接着することができる）がされることを言う。
【００９４】
基材または基材の表面はどのような物質で構成されていても良い。同様に、コーティングまたはコーティングの基材に面した表面もどのような物質で構成されていても良い。
【００９５】
好ましくは、基材表面またはコーティングまたはコーティングの基材に面した表面は天然または合成ポリマーから構成される。
【００９６】
適切なポリマーは、具体的にはポリエステル類の様な重縮合体、ポリウレタン類の様な付加重合体、ポリアミド類、ポリカーボネート類または
適切なポリマーは具体的にはポリエステル類の様な重縮合体、ポリウレタン類の様な付加重合体、ポリアミド類、ポリカーボネート類またはポリフェニレンエーテル類またはポリフェニレン硫化物またはエチレン様の不飽和化合物の遊離ラジカルまたはイオン重合により得られる重合体（遊離ラジカルポリマーと略称する）である。
【００９７】
遊離ラジカルポリマーの構造およびそれらのメインモノマーの含有量に関しては上記の説明が適用される。
【００９８】
本発明のポリペプチドは特に非極性ポリマー用の接着促進剤に適しており、従って、少なくとも基材表面またはコーティングの基材に面した表面は非極性ポリマーで構成される。
【００９９】
極性の指標としての接触角に関しては、上記の説明が同様に適用される。
【０１００】
基材表面またはコーティングの基材に面した表面の両方がそのような非極性ポリマーで構成されるのが特に好ましい。
【０１０１】
接触促進剤に必要なポリペプチドの量は上記に示した量に相当する。
【０１０２】
ポリペプチドは基材表面、コーティングの基材に面した表面、またはその両方へ塗布しても良い。コーティングの基材に面した表面へ塗布は、そのコーティングが前もって作成されている場合、即ち単層フィルムまたは多層複合材料（上記参照）の場合はその基材に塗布することができる。
【０１０３】
好ましくは、ポリペプチドは水溶液の形態であり、その溶液のポリペプチド含有量は上記に示した通りである。
【０１０４】
従って、塗布工程の後、その水分を除去するため、まず乾燥工程を行うことができる。
【０１０５】
コーティングは慣例の方法、例えばフィルムまたは多層複合材料をラミネート加工するなどの方法で基材に施しても良い。
【０１０６】
特に、コーティングはポリマー分散液、ポリマー溶液または無溶媒のポリマーを接着促進剤が施された基材に面した表面に塗布し、続くフィルム形成および／または熱または光化学硬化することで作製することができる。この目的のために、そのポリマーは、具体的には水分散液または溶液、特に好ましくは、乳剤ポリマー、好ましくは上記の遊離ラジカルポリマーのいずれかの水分散液の形態である。ポリマーが塗布された後、必要に応じて、乾燥工程が行われる。
【０１０７】
本発明の多層複合材料およびコーティングされた基材は強度が顕著に増加している。接着促進剤としてポリペプチドを使用することにより、基材に対するコーティングの接着性はより強力になり、多層複合材料の個々の層のもう一方に対する接着性は優秀である。
【０１０８】
本発明のさらに好ましい実施形態において、基材は金属である。原則として、いずれの金属でも良い。例えば、鉄、鋼鉄、亜鉛、錫、アルミニウム、銅およびそれらの金属およびその他の金属との合金が含まれる。それらは、具体的には鋼鉄、亜鉛メッキ鋼鉄、亜鉛合金、アルミニウムまたはアルミニウム合金でも良い。特に好ましくは、亜鉛または亜鉛合金またはそれを伴う基材、例えば、亜鉛メッキ鋼鉄（galvanized steel）のような基材である。
【０１０９】
亜鉛またはアルミニウム合金は当業者に知られている。当業者はその型および合金構成材の含有量を所望の適用目的に応じて選択する。代表的な亜鉛合金の構成材には、特にアルミニウム、鉛、ケイ素、マグネシウム、錫、銅またはカドミウムが含まれる。代表的なアルミニウム合金の構成材には、特にマグネシウム、マンガン、ケイ素、亜鉛、クロム、ジルコニウム、銅またはチタンが含まれる。その合金はまた、概ね同量のアルミニウムおよび亜鉛を含むアルミニウム／亜鉛合金でも良い。このような合金でコーティングされた鋼鉄は市販されている。
【０１１０】
金属はどのような形状でも良いが、金属ホイル、金属ストリップ(strips)または金属シートの形状が好ましい。金属はまた、金属様の表面を有する複合材料でも良い。例えば、ポリマーフィルムおよび金属の複合材料でも良い。
【０１１１】
金属様の表面は、接着促進剤として本発明により使用されるポリペプチド、好ましくはハイドロフォビンでコーティングされる。これはそのポリペプチドの水溶液を使用して行っても良い。コーティング工程の詳細は既に上記に示している。
【０１１２】
代表的な金属表面のコーティング用の塗料には、少なくとも１種の結合剤(dinder)および架橋性 (crosslinkable) 成分が含まれる。架橋性成分は結合剤に加えて使用される架橋剤でも良く、または結合剤に連結する架橋性の基でも良い。結合剤もまた、架橋性の基でも良く、架橋剤が追加的に使用されても良い。この場合、種々の組合せを考えることができる。例えば、結合剤および架橋剤をそれぞれ別々に使用しても良い。この場合、結合剤には、架橋剤の反応性官能基と相補的に反応する反応性官能基が含まれる。別の方法としては、「それら自身の」その種の官能基、または同一のポリマーにおける相補的な反応性官能基との架橋反応を起こすことができる反応性官能基を含む自己架橋結合剤がある。架橋剤が専ら、それら自身と反応する可能性もある。
【０１１３】
適切な結合剤には（メタ)アクリレート（コ）ポリマー類、特に、部分的に加水分解されたポリビニルエステル類、ポリエステル類、アルキド樹脂類、ポリラクトン類、ポリカーボネート類、ポリエーテル類、エポキシド樹脂アミン付加物、ポリ尿素類、ポリアミド類、ポリイミド類またはポリウレタン類が含まれる。当然、種々のポリマーの混合物であって、望ましくない影響を生じない混合物も使用することができる。
【０１１４】
架橋性成分は熱架橋性官能基または光化学架橋性官能基を有することができる。適切な熱架橋剤の例としては、エポキシド、メラミンまたはブロック化イソシアナートに基づいた架橋剤がある。光化学架橋性の適切な架橋剤としては、特に、多数のエチレン様の不飽和官能基を有する化合物がある。
【０１１５】
本発明によるポリペプチド、好ましくはハイドロフォビンの使用方法は、基材の塗装の接着を有利に改善する。また、耐食性試験において変形(creep)に対する塗装層の抵抗性が改善される。
【０１１６】
本発明を以下の実施例によって、より詳細に説明する。
【０１１７】
パートＡ
ハイドロフォビンの作製
【実施例１】
【０１１８】
ｙａａｄ−Ｈｉｓ6／ｙａａＥ−Ｈｉs6のクローニングの予備実験
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をオリゴヌクレオチドＨａｌ５７０およびＨａｌ５７１（Ｈａｌ５７２／Ｈａｌ５７３）を用いて行った。鋳型ＤＮＡはBacillus subtilis細菌のゲノムのＤＮＡを使用した。得られたＰＣＲ断片はBacillus subtilisのｙａａＤ／ｙａａＥ遺伝子およびそれらの末端でいずれの場合も、それぞれＮｃｏlおよびＢｇｌｌｌ制限酵素の開裂部位のコード配列を含んでいた。ＰＣＲ断片を精製し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏlおよびＢｇｌｌｌで切断した。このＤＮＡ断片を挿入物として使用し、予め制限エンドヌクレアーゼで直鎖化した、ベクターｐＱＥ６０（Ｑｉａｇｅｎ社）にクローニングした。上記により得られたベクター、ｐＱＥ６０ＹＡＡＤ＃２／ｐＱＥ６０ＹａａＥ＃５はそれぞれ、ＹＡＡＤ：：ＨＩＳ6およびＹＡＡＥ：：ＨＩＳ6から成るタンパク質の発現に使用される。
【０１１９】
【表２】
【実施例２】
【０１２０】
ｙａａｄハイドロフォビンＤｅｗＡ−Ｈｉｓ6のクローニング
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をオリゴヌクレオチドＫａＭ４１６およびＫａＭ４１７を用いて行った。鋳型ＤＮＡはAspergillus nidulansカビのゲノムＤＮＡを使用した。得られたＰＣＲ断片はハイドロフォビン遺伝子ｄｅｗＡおよびＮ末端のＸａ因子プロテアイナーゼ開裂部位のコード配列を含んでいた。ＰＣＲ断片を精製し、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨｌで切断した。このＤＮＡ断片を挿入物として使用し、あらかじめ制限エンドヌクレアーゼＢｇｌｌｌで直鎖化した、ベクターｐＱＥ６０ＹＡＡＤ＃２にクローニングした。
【０１２１】
上記により得られたベクター＃５０８はＹＡＡＤ：：Ｘａ：：ｄｅｗＡ：：ＨＩＳ6から成るタンパク質の発現に使用される。
【０１２２】
【表３】
【実施例３】
【０１２３】
ｙａａｄハイドロフォビンＲｏｄＡ−Ｈｉｓ6のクローニング
プラスミド＃５１３をプラスミド＃５０８と同様に、オリゴヌクレオチドＫａＭ４３４およびＫａＭ４３５を使用してクローニングした。
【０１２４】
【表４】
【実施例４】
【０１２５】
ｙａａｄハイドロフォビンＢＡＳＦ１−Ｈｉｓ6のクローニング
プラスミド＃５０７をプラスミド＃５０８と同様に、オリゴヌクレオチドＫａＭ４１７およびＫａＭ４１８を使用してクローニングした。鋳型ＤＮＡには人工的に合成したＤＮＡ配列であるハイドロフォビンＢＡＳＦ１（別表参照）を用いた。
【０１２６】
【表５】
【実施例５】
【０１２７】
ｙａａｄハイドロフォビンＢＡＳＦ２−Ｈｉｓ6のクローニング
プラスミド＃５０６をプラスミド＃５０８と同様に、オリゴヌクレオチドＫａＭ４１７およびＫａＭ４１８を使用してクローニングした。鋳型ＤＮＡは人工的に合成したＤＮＡ配列であるハイドロフォビンＢＡＳＦ２（別表参照）を用いた。
【０１２８】
【表６】
【実施例６】
【０１２９】
ｙａａｄハイドロフォビンＳＣ３−Ｈｉｓ6のクローニング
プラスミド＃５２６をプラスミド＃５０８と同様に、オリゴヌクレオチドＫａＭ４６４およびＫａＭ４６５を使用してクローニングした。
【０１３０】
鋳型ＤＮＡはスエヒロタケ(Schyzophyllum commune）の相補的ＤＮＡ（別表参照）を用いた。
【０１３１】
【表７】
【実施例７】
【０１３２】
組み換えE.coli：ｙａａｄハイドロフォビンＤｅｗＡ−Ｈｉｓ６株の培養
ｙａａｄハイドロフォビンＤｅｗＡ−Ｈｉｓ６を発現するE.coli株を１５ｍｌグライナー試験管中の３ｍｌＬＢ液体培地に接種した。３７℃、２００ｒｐｍで８時間振とう培養した。それぞれの場合に２本のバッフル付き１Ｌエルレンマイヤーフラスコ中の２５０ｍｌＬＢ培地（＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン）に前培養の培養液１ｍｌを接種し、３７℃、１８０ｒｐｍで９時間振とう培養した。２０Ｌファーメンター中の１３．５ＬのＬＢ培地（＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン）に前培養（水に対して測定したＯＤ600nm１：１０）の０．５Ｌを接種した。１４０ｍｌの１００ｍＭＩＰＴＧをＯＤ600nmが〜３．５の時点で添加した。３時間後、ファーメンターを１０℃に冷却し、培養液を遠心分離により除去した。細胞沈殿物を次の精製工程で使用する。
【実施例８】
【０１３３】
組み換えハイドロフォビン融合タンパク質の精製
（Ｃ−末端Ｈｉｓ６タグをプロセッシングするハイドロフォビン融合タンパク質の精製）
１００ｇの細胞沈殿物（１００〜５００ｍｇのハイドロフォビン含有）を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）にて総容量で２００ｍｌになるようにして、再懸濁した。懸濁液はＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘ ｔｙｐｅＴ２５(Ｊａｎｋｅ ａｎｄ Ｋｕｎｋｅｌ；ＩＫＡ−Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ社製)で１０分間処理し、次いで核酸を分解する目的で、５００単位のベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ,Ｄａｒｍｓｔａｄｔ社；オーダーＮｏ．１．０１６９７．０００１）で室温にて１時間反応した。細胞の破壊に先立ち、ガラスカ−トリッジ（Ｐ１）を使用してろ過を行った。細胞の破壊および残存したゲノムのＤＮＡをせん断する目的で、１５００ｂａｒで高圧ホモジナイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ Ｍ−１１０ＥＨ；Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ社）で２回処理した。ホモジネートを遠心分離（Ｓｏｖａｌｌ ＲＣ−５Ｂ，ＧＳＡローター，２５０ｍｌ遠心ビーカー、４℃、６０分、１２０００ｒｐｍ、２３０００ｇ）し、上清を氷冷し、沈殿物は１００ｍｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。遠心分離および再懸濁を３回繰り返し、３回目では１％ＳＤＳを含むリン酸緩衝液を用いた。再懸濁後、溶液を１時間攪拌し、続いて最後の遠心分離（Ｓｏｖａｌｌ ＲＣ−５Ｂ，ＧＳＡローター，２５０ｍｌ遠心ビーカー、４℃、６０分、１２０００ｒｐｍ、２３０００ｇ）をした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によると、ハイドロフォビンは最後の遠心分離後の上清に存在している（図１)。本実験はハイドロフォビンがE.coliの細胞内におそらく封入体(inclision bodies)の形態で存在していることを示している。５０ｍｌのハイドロフォビンを含有する上清を５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した５０ｍｌのｎｉｃｋｅｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ１７−５２６８−０２カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に掛けた。カラムを５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し、続いて２００ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液で溶出した。イミダゾールを除く目的で、溶液を５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で透析した。
【０１３４】
図１は作製されたハイドロフォビンの精製を示す。
【０１３５】
レーン１： ｎｉｃｋｅｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに掛けた溶液（１：１０希釈）
レーン２：透過液＝洗浄工程の溶出液
レーン３〜５：溶出画分のＯＤ２８０ｎｍ検出ピーク
図１のハイドロフォビンは分子量約５３ｋＤを有する。何本かのより小さい分子量のバンドはハイドロフォビンの分解産物を示す。
【実施例９】
【０１３６】
性能試験；ガラス状の水滴の接触角を変化することによるハイドロフォビンの特性解析
基材：
ガラス（窓ガラス，Ｓｕｄｄｅｕｔｓｈｅ Ｇｌａｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）：
ハイドロフォビン濃縮物：１００μｇ／ｍｌ、
５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）＋０．１質量％Ｔｗｅｅｎ２０中でガラススライドを１晩(温度８０℃)インキュベートし、
続いて、ハイドロフォビンコーティングされたガラススライドを蒸留水中で洗浄し、
続いて１質量％ＳＤＳ水溶液中で８０℃、１０分間インキュベートし、
蒸留水で洗浄した。
【０１３７】
そのサンプルを室温で空気乾燥し、室温で５μｌの水滴の接触角（度数）を測定する。
【０１３８】
接触角の測定はＤａｔａｐｈｙｓｉｃｓ Ｃｏｎｔａｃｔ Ａｎｇｌｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＯＣＡ １５＋、Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＳＣＡ２０．２．０（２００２年１１月）により測定した。測定はメーカー使用説明書に従って行った。
【０１３９】
未処理のガラスは接触角が３０±５°であり、実施例８の機能的なハイドロフォビン（ｙａａｄ−ｄｅｗＡ−Ｈｉｓ6）によりコーティングしたものは接触角が７５±５°であった。
【０１４０】
パートＢ） 接着促進剤としてのポリペプチドの使用
【実施例１０】
【０１４１】
ポリエチレン基材
使用材料：
使用溶液：
実施例８により作製された融合タンパク質、ｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）の水溶液を性能試験に使用した。ハイドロフォビン溶液の濃度は１００μｇ／ｍｌ（０．０１質量％）であった。
【０１４２】
基材：ポリエチレンの成型品（小プレート）。
【０１４３】
コーティング：
ポリエステルフィルムをＡｃｒｏｎａｌ Ａ ２４０（市販、感圧接着剤用の水性ポリアクリル酸分散液（ＢＡＳＦ社））でコーティングし、乾燥し、２．５ｃｍ幅のストリップに切断した。得られた接着用ストリップをポリエチレンプレートのコーティングに使用した。
【０１４４】
手順：
ポリペプチド溶液をポリエチレンプレートに塗布し、乾燥した（前処理ポリエチレンプレート）。
【０１４５】
続いて、接着用ストリップを前処理、および比較として未処理のポリエチレンプレートに接着し、接着用ストリップを剥がすために必要な力を測定した(剥離強度Ｎ)。
【０１４６】
接着促進剤としてポリペプチドを用いた場合の剥離強度：４．７Ｎ
接着促進剤としてポリペプチドを用いない場合の剥離強度：２．６Ｎ
【実施例１１】
【０１４７】
金属基材
実施例８により作製された融合タンパク質、ｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）の水溶液を性能試験に使用した。ハイドロフォビン溶液の濃度は１００μｇ／ｍｌ（０．０１質量％）であった。ｐＨの情報は不明であるが、溶液のｐＨはさらなる緩衝液を加えなければ、８〜８．５であろう。
【０１４８】
以下の試験シートを金属基材として使用した。
【０１４９】
【表８】
【０１５０】
使用された塗料はアルキド・メラミンに基づく焼きつけ上塗り塗料であった。（これは十分に塗料の特性を示すか。）
実験の説明
アルミニウムシートをアルカリ性洗浄浸漬槽（６０ｇ／リットル ＮａＯＨ、６０℃、１分間）に漬け、蒸留水ですすいだ。次いで、シートを酸性スケール除去槽（硝酸／水（１：１）、室温、１５秒間）でスケール除去し、蒸留水ですすぎ、加圧空気で乾かした。
【０１５１】
亜鉛メッキ鋼鉄および鋼鉄のシートは熱水ですすぎ、続いて蒸留水ですすぎ、加圧空気で乾かした。
【０１５２】
シートを上記の溶液に、それぞれ室温で浸すことにより、ハイドロフォビンでコーティングした。アルミニウムシートの場合は１６時間浸し、亜鉛メッキ鋼鉄および鋼鉄の場合は４時間浸した。続いて、そのシートを留水ですすぎ、加圧空気で乾かした。
【０１５３】
接着促進剤としてハイドロフォビンコーティングをした後、シートをプラスチックボール中のアルキド・メラミンに基づく焼きつけ上塗り塗料に１５秒間浸し、空気中で約１時間前乾燥した。続いて、これを１９０℃、３０分間乾燥器で乾燥し、塗料を硬化させた。
【０１５４】
比較のため、それぞれの場合で、接着促進剤としてハイドロフォビンを使用しない試料を同様に塗装処理した。
【０１５５】
性能試験
シートの性能はＥＮ ＩＳＯ ２４０９（クロスカット試験）、ＥＮ ＩＳＯ ４６２８−８（クリープ試験）およびＤＩＮ ５３１５６（エリクセンカッピング試験）により評価した。
【０１５６】
クロスカット試験では表面にクロスカットを入れた後、所定の標準法に基づいて塗装面の外観を評価する。これはクロスカットを入れたために塗装が表面から剥がれることの広がりを評価することを伴う。その評価は０〜５等級として、０が最高で５が最低の点数である、既知の方法で行われる。
【０１５７】
塗装層のクリープ試験はシートの標準腐食試験（塩水噴霧室における暴露（ＳＳＤＩＮ ５００２１））により測定される。アルミニウムシートのクリープは２９８時間後に評価し、鋼鉄シートは５０時間後、および亜鉛メッキ鋼鉄シートは１９０時間後に評価し、それぞれ、所定の標準に基づいて、０〜５等級として、０が最高で５が最低の点数とした。
【０１５８】
エリクセンカッピング試験は試料の背面にボールを押し付けること、および窪みを作ることから構成される。その跡における塗装の外観を所定の標準に基づいて評価し、この場合は５が最高で０が最低の点数とする。
【０１５９】
性能試験の結果を以下にまとめる。
【０１６０】
実施例１１−１：鋼鉄基材
【０１６１】
【表９】
【０１６２】
接着促進剤としてハイドロフォビンを使用することによって、クリープ試験についてはハイドロフォビンを使用していない試料と比較して変化はない（５等級）。クロスカット試験（より低い値）およびエリクセンカッピング試験(より高い値)についてはどちらの場合も、より良好な結果を示す。
【０１６３】
実施例１１−２：亜鉛メッキ鋼鉄基材
【０１６４】
【表１０】
【０１６５】
亜鉛メッキ鋼鉄に接着促進剤としてハイドロフォビンを使用することによって、３試験の全ての場合において、接着促進剤を使用しない場合よりも良好な結果（クロスカット試験およびクリープ試験ではより低い値、エリクセンカッピング試験ではより高い値）を示す。最も明確な改善は腐食防止の高い効果（接着促進剤を使用しない場合で４等級に対して、接着促進剤を使用した場合では１等級）において認められる。
【０１６６】
実施例１１−３：アルミニウム基材
【０１６７】
【表１１】
【０１６８】
アルミニウム基材の場合、クロスカット試験およびクリープ試験は接着促進剤を使用しない場合でさえも良好な結果である。エリクセンカッピング試験ではわずかながら改善が認められる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多層複合材料またはコーティングされた基材であって、複合材料の隣接する少なくとも２層間の、またはコーティングおよび基材間の接着促進剤として、少なくとも４０質量％がペプチド結合により連結したα−アミノ酸（以下、ポリペプチドと略称する）から構成される化合物を含む物に関する。さらに具体的には、本発明は接着促進剤としてのハイドロフォビン使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイドロフォビンは約１００〜１５０残基のアミノ酸の小さいタンパク質であり、例えばスエヒロタケ(Schizophyllum commune)などの糸状菌の特徴的なものである。それらは8個のシステイン単位を有するのが一般的である。
【０００３】
ハイドロフォビンは界面に顕著な親和性を有し、そのため、表面のコーティングに有用である。例えば、テフロン（登録商標）をハイドロフォビンとコーティングすると親水性表面を得ることができる。
【０００４】
ハイドロフォビンは天然資源から単離することができる。我々の先願であるＤＥ １０２００５００７４８０．４にはハイドロフォビンの生産方法が開示されている。
【０００５】
先行技術において種々の用途についてハイドロフォビンの使用方法が提案されている。
【０００６】
ＷＯ ９６／４１８８２は疎水性表面へ親水性特性を付与し、親水性物質の水耐性を改良し、水中油型乳剤または油中水型乳剤を作成して、ハイドロフォビンを乳化剤、増粘剤または界面活性剤として使用する方法を提案する。軟膏類またはクリーム類の製造の様な薬剤への応用、および肌保護、ヘアーシャンプーまたはヘアーリンスの生産のような化粧品への応用も提案されている。
【０００７】
ＥＰ−Ａ １ ２５２ ５１６には窓、コンタクトレンズ、バイオセンサー、医療機器、分析用または貯蔵用のコンテナ、船体、固形粒子、または乗用車のフレームまたは車体についてハイドロフォビンを含有する溶液で３０〜８０℃コーティングすることが開示されている。
【０００８】
ＷＯ ０３／５３３８３には化粧品への応用として角質物質を処理するためのハイドロフォビンの使用方法が開示されている。
【０００９】
ＷＯ ０３／１０３３１には、ハイドロフォビンをコーティングしたセンサー（例えば、計測用電極）であって、例えば電気活性な物質、抗体または酵素などの物質がさらに非共有結合したセンサーが開示されている。
【００１０】
以前から、全く異なる接着促進剤が接着の改善に、例えば多種多様な基材のコーティングに使用されている。Ｒｏｍｐｐ Ｃｈｅｍｉｅ Ｌｅｘｉｋｏｎ（１９９０年版）によると、例えばチタン酸塩類、シラン類、不飽和カルボン酸類のクロム錯体などが適切である。特に注目される、接着のための接着促進剤はエチレン／アシルアミド共重合体、イソシアナート重合体または反応性有機ケイ素化合物である。
【００１１】
ポリウレタン類およびポリエチレンイミン類も接着促進剤として知られている。
【００１２】
【特許文献１】ＤＥ １０２００５００７４８０．４
【特許文献２】ＷＯ ９６／４１８８２
【特許文献３】ＥＰ−Ａ １ ２５２ ５１６
【特許文献４】ＷＯ ０３／５３３８３
【特許文献５】ＷＯ ０３／１０３３１
【特許文献６】ＷＯ ９６／４１８８２
【特許文献７】ＤＥ １０２００５００７４８０．４
【非特許文献１】Ｒｏｍｐｐ Ｃｈｅｍｉｅ Ｌｅｘｉｋｏｎ（１９９０年版）
【非特許文献２】Ｗｅｓｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ.Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．，１９９４年、３２巻、４１３〜４３７頁
【非特許文献３】Ｗｏｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．,Ｅｕｒ． Ｊ Ｃｅｌｌ ｂｉｏ．６３巻、１２２−１２９頁（１９９４年）
【非特許文献４】Ｇｏｅｄｄｅｌ， ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｋｏｒｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ（１９９０年）
【非特許文献５】Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｅｄｓ． Ｐｏｕｗｅｌｓ Ｐ． Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ, Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ Ｙｏｕｋ−Ｏｘｆｏｒｄ， １９８５年、ＩＳＢＮ ０ ４４４ ９０４０１８）
【非特許文献６】Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｈ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ（１９８９年）
【非特許文献７】Ｔ．Ｊ．Ｓｉｈａｖｙ， Ｍ．Ｌ．Ｂｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）
【非特許文献８】Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７年）
【非特許文献９】Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｗｉｌｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｔｏｒｋ １９９７年
【非特許文献１０】Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ.およびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８７年）Ｃｅｌｌ ５１巻、５０３頁
【非特許文献１１】Ｃｏｏｐｅｒ，Ｆ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｈｅ Ａｒｂｅｉｔｓｍｅｔｈｏｄｅｎ，Ｖｅｒｌａｇ Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ， Ｂｅｒｌｉｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
【非特許文献１２】Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は非常に高い適用性を有し、特に、多層複合材料または基材へのコーティングの個々の層の高い接着力を生じる新しい接着促進剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
結果的に、本目的は最初に定義した多層複合材料またはコーティングされた基材により達成されることが見出された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
接着促進剤
硬質表面またはコーティングされた基材は接着促進剤として最初に定義したポリペプチドを含む。
【００１６】
ポリペプチドは少なくとも４０質量％、好ましくは少なくとも７０質量％、さらに好ましくは少なくとも９０質量％、さらに特に好ましくは少なくとも９５または９９質量％のペプチド結合により連結したα−アミノ酸から成る。
【００１７】
特別な実施形態においては、ポリペプチドは完全にペプチド結合により連結したα−アミノ酸のみから成る。
【００１８】
特に適切なα−アミノ酸はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、セリン、スレオニン、システイン、シスチン、メチオニン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、及びヒスチジンである。
【００１９】
ポリペプチドは混合物中にα−アミノ酸、システインを他のα−アミノ酸と共に含むことが好ましい。
【００２０】
特にポリペプチドは好ましくは少なくとも０．１質量％、さらに好ましくは少なくとも０．５質量％、さらに特に好ましくは少なくとも1質量％のシステインを含む。一般的に、ポリペプチド中のシステイン含有量は１５質量％、特に１０質量％を超えず、特に好ましくは７質量％を超えない。
【００２１】
特別な実施形態においては、ポリペプチドはハイドロフォビンである。
【００２２】
本発明による「ハイドロフォビン」の用語は以下に示す、一般構造式（Ｉ）
【００２３】
【化１】
【００２４】
[上記式中、Ｘは２０種の天然アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ）を表し、各々のＸは同一または異なっても良く、Ｘの隣の指数はそれぞれの場合のアミノ酸残基数を示しており、Ｃはシステイン、アラニン、セリン、グリシン、メチオニンまたはスレオニンを表し、ただし、Ｃで表されるアミノ酸の少なくとも４個はシステインであり、指数ｎおよびｍは相互に独立して、０〜５００の範囲、好ましくは１５〜３００の範囲の自然数である。]
のポリペプチドのことを言う。
【００２５】
さらに、式（Ｉ）のポリペプチドは、（ガラス面をコーテインクした後の）特性として、室温で水滴の接触角を、コーティングしていないガラス面で同サイズの水滴により形成される接触角と比較し、少なくとも２０°、好ましくは２５°、さらに好ましくは３０°まで増加させることにより特徴づけられる。
【００２６】
Ｃ1〜Ｃ8で示されるアミノ酸は、好ましくはシステインであるが、それらは同様な容積の他のアミノ酸、好ましくはアラニン、セリン、スレオニン、メチオニンまたはグリシンと置換されても良い。しかしながら、Ｃ1〜Ｃ8の位置の少なくとも４個、好ましくは少なくとも５個、さらに好ましくは少なくとも６個および特に好ましくは７個がシステインで構成されている方が良い。システインは還元型を示しても、または互いにジスルフィド架橋を形成しても良い。特に、少なくとも１個、好ましくは２個、さらに好ましくは３個および最も好ましくは４個の分子間ジスルフィド架橋を伴う、分子間のＣ−Ｃ架橋の形成が特に好ましい。上記のシステインが他の同様な容積のアミノ酸に置換する場合、そのＣ−位置が互いに分子間ジスルフィド架橋を形成できるように対交換を伴うことが有利である。
【００２７】
システイン、セリン、アラニン、グリシン、メチオニンまたはスレオニンがＸで指定された位置に用いられる場合、一般式における個々のＣ−位置の番号は適宜変化する。
【００２８】
好ましくは、一般式（ＩＩ)
【００２９】
【化２】
【００３０】
[本発明を行うため、上記式中、Ｘ、ＣおよびＸの隣の指数はそれぞれ上記と同様であるが、指数ｎおよびｍは０〜３００の範囲の数値を示し、さらに、そのタンパク質は上記の接触角の変化により識別される。]
のハイドロフォビンを使用する。
【００３１】
さらに好ましくは、一般式（ＩＩＩ）
【００３２】
【化３】
【００３３】
[上記式中、Ｘ、ＣおよびＸの隣の指数はそれぞれ上記と同様であり、指数ｎおよびｍは０〜２００の範囲の数値を示し、さらに、そのタンパク質は上記の接触角の変化により識別され、さらに、Ｃで表されるアミノ酸の少なくとも６個がシステインであり、特に好ましくはＣで表される全てのアミノ酸がシステインである。]
のハイドロフォビンを使用する。
【００３４】
ＸnおよびＸm残基はハイドロフォビンへ天然に結合するペプチド配列でも良い。しかしながら、ＸnおよびＸmのどちらか一方または両方ともがハイドロフォビンに天然には結合しないペプチド配列でも良い。これはＸnおよび／またはＸm残基について、ハイドロフォビン中に天然に生じるペプチド配列が天然に生じないペプチド配列により延長されている場合も含まれる。
【００３５】
Ｘnおよび／またはＸmがハイドロフォビンにおいて天然に生じないペプチド配列である場合、その配列の長さは一般的に少なくとも２０残基のアミノ酸、好ましくは少なくとも３５残基のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも５０残基のアミノ酸および最も好ましくは少なくとも１００残基のアミノ酸である。ハイドロフォビンに天然に結合しないこの種の残基は後述のように、融合パートナー（fusion partner）とも言う。これはそのタンパク質が少なくとも１種のハイドロフォビン部分、および天然にはこの形態で共に生じない融合パートナーとから成る事実を明確にすることを目的としている。
【００３６】
融合パートナーは多数のタンパク質から選択される。複数の融合パートナーを１種のハイドロフォビン部分、例えば、ハイドロフォビン部分のアミノ末端（Ｘn)およびカルボキシ末端（Ｘm）に結合させることもできる。しかしながら、例えば、本発明により使用されるタンパク質の１位置（ＸnまたはＸm）に２個の融合パートナー部分を結合させることもできる。
【００３７】
特に安定な融合パートナー部分は微生物、特にE.coliまたはBacillus subtilisにおいて天然に生じるポリペプチドである。このような融合パートナー部分の例としては、ｙａａｄ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５および１６）、ｙａａｅ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７および１８）およびチオレドキシンが挙げられる。また、上記配列の断片または誘導体で、その配列の一部分のみ、好ましくは７０〜９９％およびさらに好ましくは８０〜９８％を含む、または上記の配列と比較して特定のアミノ酸またはヌクレオチドが改変されたものは非常に適している（％はそれぞれの場合、アミノ酸数に関する％を表す）。
【００３８】
さらに、本発明により使用されるタンパク質をそれらのペプチド配列において、例えばグリコシル化、アセチル化または他の例えばグルタルアルデヒドなどの化学的架橋結合により修飾してもよい。
【００３９】
本発明により使用されるタンパク質の一特性は、表面がそのタンパク質でコーティングされると、表面特性が変化することである。表面特性における変化はタンパク質による表面のコーティング前後における水滴の接触角を測定し、両測定値間の差異を測定することにより実験的に測定できる。
【００４０】
接触角の測定する方法の原理は当業者に知られている。その測定は室温で、５μｌの水滴を基準として行われる。接触角の測定についての正確な実験条件は実施例の実験部分に示す。その条件において、本発明により使用されるタンパク質はコーティングしていないガラス面で同サイズの水滴の接触角と比較して、ガラス表面の水滴の接触角を少なくとも２０°、好ましくは少なくとも２５°およびさらに好ましくは３０°まで増加させる特性を有する。
【００４１】
今まで知られているハイドロフォビン類のハイドロフォビン部分において極性および非極性アミノ酸残基の位置は保存されており、結果として疎水性の性質が生じている。今まで知られているハイドロフォビン類は生物物理学的性質および疎水性における違いにより、ＩおよびＩＩの２種のクラスに分類される（Ｗｅｓｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ.Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．，１９９４年、３２巻、４１３〜４３７頁）。
【００４２】
作製されたクラスＩのハイドロフォビン類の膜は不溶性が高く（温度を高めた１質量％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液でも不溶である）、高濃度のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはギ酸によってのみ再び解離することができる。一方、作成されたクラスＩＩのハイドロフォビン類の構造はより不安定である。それらは６０質量％エタノールまたは１質量％ＳＤＳ(室温で)によって再び解離することができる。
【００４３】
アミノ酸配列の比較によると、システインＣ3及びシステインＣ4間の領域がクラスＩのハイドロフォビン類の場合よりクラスＩＩのハイドロフォビン類の場合がはっきりと短いことが明らかである。さらにクラスＩＩのハイドロフォビンはクラスＩの場合よりアミノ酸の電荷が高い。
【００４４】
特に好ましい本発明の実施形態のハイドロフォビン類はタイプｄｅｗＡ，ｒｏｄＡ、ｈｙｐＡ、ｈｙｐＢ，ｓｃ３，ｂａｓｆ１、ｂａｓｆ２、のものであり、構造的に以下にリストする配列に特徴づけられる。また、それらは、その部分のみであっても、またはそのタイプの誘導体であっても良い。複数種のハイドロフォビンを、好ましくは２または３種で、互いに同一または異なる構造で、ハイドロフォビンと天然には結合しない適切なポリペプチド配列に相当するように連結させることもできる。
【００４５】
さらに、本発明を実施するために特に適切なのは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、２２、２４およびそれをコードする核酸配列で示されるポリペプチド配列、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２１、２３の配列を有する融合タンパク質である。さらに、特に好ましい実施形態はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、２２または２４で示されるポリペプチド配列から開始し、少なくとも１個〜１０個以下、好ましくは５個、さらに好ましくは全てのアミノ酸残基の５％の置換、挿入または削除が生じ、開始タンパク質の生物学的特性の少なくとも５０％をまだ有しているタンパク質を含む。ここで、本発明により使用されるタンパク質の生物学的特性は上記の接触角における少なくとも２０°の増加を意味する。
【００４６】
本発明により使用されるポリペプチドは、例えばメリフィールドに従う固相合成法などによるペプチド合成の良く知られた技術により化学的に作製できる。
【００４７】
天然に生じるハイドロフォビンは天然資源から適切な方法を用いて単離することができる。例として、Ｗｏｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．,Ｅｕｒ． Ｊ Ｃｅｌｌ ｂｉｏ．６３巻、１２２−１２９頁（１９９４年）またはＷＯ ９６／４１８８２が挙げられる。
【００４８】
好ましくは、融合タンパク質は遺伝子工学的手法、即ち、融合パートナーをコードする１個の核酸配列、特にＤＮＡ配列およびハイドロフォビン部分をコードする１個の核酸配列、特にＤＮＡ配列を結合することで、結合した核酸配列の遺伝子発現により、宿主生物中に目的とするタンパク質を生じさせる手法で作製する。このような方法は我々の先行出願であるＤＥ １０２００５００７４８０．４で開示している。
【００４９】
上記の作製方法における適切な宿主生物（生産生物）には、原核生物（古細菌を含む）または真核生物、特に好塩菌を含む細菌、カビ、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞、さらに好ましくはEscherichia coli、Bacillus subtilis、Bacillus megaterium、Aspergillus oryzea、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Pichia pastoris、Pseudmonas spec.、Lactobacilli、Hansenula polymorpha、Trichoderma reesei、SF9(または関連細胞)などが含まれる。
【００５０】
さらに、本発明は制御核酸配列の遺伝子制御に基づいて、本発明により使用されるポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現コンストラクト（構築物（constructs））の使用方法、およびこれらの発現コンストラクトの少なくとも１種を含むベクターに関する。
【００５１】
好ましくは、使用されるコンストラクトは目的のタンパク質をコードする配列の５‘上流にプロモーターおよびそのコードする配列の３’下流にターミネーター配列が含まれ、必要に応じて、さらに、そのコードする配列に有効に連結される慣例の調節因子も含まれる。
【００５２】
「有効な連結（operative linkage）」はプロモーター、目的とするタンパク質をコードする配列、ターミネーター、および必要に応じて、そのコードする配列の発現に要求される機能果たすことができるような、さらなる調節因子の配列の配置を意味する。
【００５３】
有効に連結した配列の例としては、標的とする配列およびエンハンサー、ポリアデニル化信号などがある。さらに、調節因子には選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などが含まれる。適切な制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ， ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｋｏｒｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ（１９９０年）に記載されている。
【００５４】
これらの制御配列に加えて、これらの配列の天然の制御因子が実際の構造遺伝子の上流にまだ存在していても良く、必要に応じて、その天然の制御因子のスイッチを切り、遺伝子の発現を強めるように遺伝子修飾をしても良い。
【００５５】
好ましい核酸コンストラクトにおいては、プロモーターと機能的に連結し、核酸配列の発現を高めることができる１種以上の上記のエンハンサー配列を含むことが有利である。さらなる制御因子またはターミネーターの様なさらに有利な配列をＤＮＡ配列の３‘末端に導入しても良い。
【００５６】
核酸はコンストラクトに１個以上の複製として含まれても良い。さらにコンストラクトには、必要に応じてそのコンストラクトを選択する目的で、抗生物質耐性または補完的栄養要求性遺伝子の様なマーカーを追加して含ませても良い。
【００５７】
本発明の方法に有利な制御配列は、プロモーターでは例えば、cos、tac、 trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、laclq-T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、lambda-PRまたはlambda-Pプロモーターであり、これらのプロモーターはグラム陰性細菌に有利である。さらに、有利な制御配列は、例えばグラム陽性細菌のプロモーターamyおよびSP02、酵母またはカビのプロモーターADC1、MFalpha、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADHがある。
【００５８】
制御には人工的なプロモーターを使用することもできる。
【００５９】
宿主生物における核酸コンストラクトを発現するため、その宿主において遺伝子を最適に発現させるベクター、例えばプラスミドまたはファージに挿入するのが有利である。さらに、ベクターにはプラスミドおよびファージと同様に、それ自体知られている他のすべてのベクター、即ち、例えばSV40、CMV、バクロウイルス、アデノウイルスなどのウイルス、トランスポゾン、ISエレメント、ファスミド、コスミドおよび直鎖または環状ＤＮＡ、およびアグロバクテリウム法が含まれる。
【００６０】
これらのベクターはその宿主生物または染色体において独立して複製されても良い。これらのベクターは本発明のさらなる実施形態を構成する。適切なプラスミドの例としては、E.coliにおける、pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-lll”3-B1、tgt11またはpBdCl、Streptomycesにおける、pIJ101、pIJ364、pIJ702またはpIJ361、BacillusにおけるpUB110、pC194またはpBD214、CorynebacteriumにおけるpSA77またはpAJ667、カビにおけるｐALS1、pIL2またはpBB116、酵母における2alpha、pAG-1、YEp6、YEp13またはpEMBLYe23または植物におけるpLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004またはDH51が挙げられる。上記プラスミドは使用可能なプラスミドの一部を選択したものである。他のプラスミドは当業者に良く知られており、例えば書籍Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｅｄｓ． Ｐｏｕｗｅｌｓ Ｐ． Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ, Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ, １９８５年、ＩＳＢＮ ０ ４４４ ９０４０１８）において認められる。
【００６１】
他の遺伝子を発現するため、核酸コンストラクトは宿主生物および遺伝子または遺伝子群により最適な発現と成るように選択された、発現を強める３'−および／または５’−末端の制御配列を含むことが有利である。
【００６２】
これらの制御配列はその遺伝子およびタンパク質の発現を特異的にさせることを目的としている。宿主生物によっては、これは例えば、遺伝子が誘導後のみに発現するか、または、過剰発現し、および／または直ちに発現するか、または過剰発現することを意味する。
【００６３】
これに関しては、制御配列または因子は確実に影響を与え、結果として誘導された遺伝子の発現をより強めることが好ましい。従って、制御因子はプロモーターおよび／またはエンハンサーの様な強力な転写シグナルを使用することにより、転写レベルを有利に強めても良い。しかしながら、この他に、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の安定性を改良することにより、翻訳を強めることも可能である。
【００６４】
ベクターのさらなる実施形態において、核酸コンストラクトまたは核酸を含むベクターが直鎖ＤＮＡの形態で微生物へ有利に導入され、異種または相同的な遺伝子組み換えにより宿主生物のゲノムに組み込まれても良い。この直鎖ＤＮＡはプラスミドの様な直鎖化した（linearized）ベクターまたは単に核酸コンストラクトまたは核酸で構成されていても良い。
【００６５】
宿主生物中の異種の遺伝子の最適な発現のためには、その生物に利用される特異的なコドン使用頻度に従って核酸配列を組み換えることが有利である。コドン使用頻度は問題となる生物の他の既知遺伝子のコンピューター解析により容易に測定できる。
【００６６】
発現カセットは適切なプロモーターを目的のタンパク質をコードする適切なヌクレオチド配列およびターミネーターまたはポリアデニル化信号と融合することにより作成する。例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｈ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ（１９８９年）およびＴ．Ｊ．Ｓｉｈａｖｙ， Ｍ．Ｌ．Ｂｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７年）に記載されているような、一般的な遺伝子組み換えおよびクローニング技術は本目的のために使用される。
【００６７】
適切な宿主生物において発現させるため、組み換え核酸コンストラクトまたは遺伝子コンストラクトを宿主において遺伝子の最適な発現を提供する宿主特異的ベクターへ挿入する。ベクターはそれ自体知られており、例えば「Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ」（Ｐｏｕｗｅｌｓ Ｐ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５年）から選択しても良い。
【００６８】
ベクターによって、例えば少なくとも１個のベクターが変換され、本発明により使用されるポリペプチドの生産に使用される、組み換え微生物を作製することができる。上記の組み換えコンストラクトは適切な宿主系への導入および発現において有利である。これに関して、当業者に知られた、通常のクローニングおよびトランスフェクション法、例えば共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルスによるトランスフェクションなどを、特に発現系において上記核酸を発現させるために使用することが好ましい。適切な発現系は例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｗｉｌｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｔｏｒｋ １９９７年、またはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ａｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９年に記載されている。
【００６９】
相同的に遺伝子組み換えされた微生物も作成することができる。この目的のため、本発明により使用される遺伝子または目的のタンパク質をコードする配列であって、必要に応じて、少なくとも１個のアミノ酸の削除、アミノ酸の付加またはアミノ酸の置換が、例えば機能的崩壊した配列（ノックアウトベクター）を修飾するために導入された配列の少なくとも１部分を含むベクターが作製される。導入された配列は、例えば、関連微生物からの相同体(homolog)であっても良く、または哺乳類、酵母または昆虫資源から得られるものでも良い。その代わりに、相同的遺伝子組み換えに使用されるベクターは、内在性遺伝子が相同的遺伝子組み換えの場合に変異されるか、または改変され、それでもその遺伝子が機能的蛋白質をコードするような方法で設計されても良い（例えば、上流の制御領域が内在性タンパク質の発現がそれにより変化されるような方法で改変されても良い）。本発明により使用される遺伝子の改変される部分は相同的遺伝子組み換えベクター中にある。相同的遺伝子組み換えに適切なベクターの構築は、例えば、Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ.およびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８７年）Ｃｅｌｌ ５１巻、５０３頁に記載されている。
【００７０】
本発明により使用される核酸または核酸コンストラクトに適切な組み換え宿主生物は原則として全ての原核または真核生物が使用できる。細菌、カビ、または酵母のような微生物を宿主生物として使用することが有利である。グラム陽性またはグラム陰性細菌、好ましくはエンテロバクテリア科、シュードモナス科、リゾビウム科、ストレプトマイセス科またはノカルジア科であり、特に好ましくは、細菌の属として、Esherichia属、Pseudomonas属、Streptomyces属、Nocardia属、Burkholderia属、Salmonera属、Agrobacterium属またはRhodococcus属を使用することが有利である。
【００７１】
融合タンパク質の製造方法に使用される生物は宿主生物に応じて、当業者に知られた方法で生育または培養される。微生物の場合は、通常は糖類の形態の炭素源、通常は酵母エキスのような有機窒素源または硫酸アンモニウムのような塩の形態の窒素源、鉄塩、マンガン塩およびマグネシウム塩のような微量元素、および必要に応じてビタミン類を含む液体培地にて０℃〜１００℃、好ましくは１０℃〜６０℃の温度で、酸素を供給しながら培養するのが通常である。これに関連して、栄養培地のｐＨは一定の値に保たれても良い、即ち、培養中制御しても、しなくても良い。培養をバッチ法、セミバッチ法または連続的に行っても良い。栄養培地を発酵の開始時に最初に導入するか、またはその後に半連続または連続法で供給しても良い。酵素を実施例に記載される方法により生物から単離しても、または粗抽出液として反応に使用しても良い。
【００７２】
本発明により使用されるタンパク質またはその機能的な生理活性のある断片は遺伝子組み換え操作により作製しても良い。タンパク質を生産する微生物の培養、必要に応じて導入されるタンパク質の発現および培養物からのタンパク質の単離によることが適切である。タンパク質はまた必要であればこの方法により工業的スケールで生産しても良い。組み換え微生物既知の方法で培養または発酵しても良い。例えば、細菌はＴＢ培地またはＬＢ培地により、２０℃〜４０℃の温度、ｐＨ６から９で増殖させても良い。適切な培養条件は、例えばＴ．Ｍａｎｉｓｔｉｓ、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ(１９８８年)に詳細に記載されている。
【００７３】
タンパク質が培養培地へ分泌されない場合、それから細胞を破壊し、既知のタンパク質の単離方法により溶解物から生産物を得る。その細胞は必要に応じて高周波数の超音波処理法、フレンチプレッシャーなどの高圧処理法、浸透圧による溶菌（osmolysis）法、洗剤、溶菌酵素または有機溶剤の作用、ホモジナイザー法または２種以上の上記方法の組合せにより、破壊することができる。
【００７４】
タンパク質は分子篩クロマトグラフィ（ゲルろ過）や、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィおよび疎水性クロマトグラフィの様な既知のクロマトグラフィ法を使用して、および限外ろ過法、結晶化法、塩析法、透析法およびネイティブゲル電気泳動法などのその他の慣例的な方法を使用して精製することができる。適切な方法は例えば、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｆ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｈｅ Ａｒｂｅｉｔｓｍｅｔｈｏｄｅｎ，Ｖｅｒｌａｇ Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ， Ｂｅｒｌｉｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、またはＳｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎに記載されている。
【００７５】
組み換えタンパク質を単離するためには、相補的ＤＮＡ(cDNA)を特定のヌクレオチド配列により伸長し、それにより例えば精製を簡略化するように目的の改変ポリペプチドまたは融合タンパクをコードするベクター系またはオリゴヌクレオチドを使用することが有利である。この種の適切な修飾の例としては、例えばヘキサ−ヒスチジンアンカー、または抗体により抗原として認識できるエピトープとして知られる修飾法などのアンカーとして作用する「タグ(tags)」がある（例えば、Ｈａｒｌｏｗ，ＥおよびＬａｎｅ，Ｄ．，１９８８年，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（Ｎ．Ｙ．）Ｐｒｅｓｓに記載されている）。その他の適切な「タグ」には、例えばＨＡ、カルモジュリン−ＢＤ、ＧＳＴ、ＭＢＤ、キチン−ＢＤ、ストレプトアビジン−ＢＤ−アビ−タグ、フラッグ−タグ、Ｔ７などが挙げられる。これらのアンカーはタンパク質を付着するために、高分子充填材であって、例えばクロマトグラフィカラムに重点されたものなどの固体支持体に使用しても良く、またはマイクロタイタープレートまたはその他の支持体に使用しても良い。相当する精製手順は業務用アフィニティタグ供給業者から入手することができる。
【００７６】
上記のように精製されたタンパク質は直接、融合タンパク質としてでも、または融合パートナーを開裂および除去した後に、純粋なハイドロフォビンとしてでも使用することができる。
【００７７】
融合パートナー部分の除去をする場合は、融合タンパク質においてハイドロフォビン部分および融合パートナー部分の間に潜在的な開裂部位（プロテアーゼの特異的な認識部位）を組み込むことが望ましい。適切な開裂部位には、特に、すでに生命情報工学的な手法により測定された、ハイドロフォビン部分にも、または融合パートナー部分のどちらにも存在しないペプチド配列である。特に、例えばメチオニンのシアン化臭素による開裂または、Ｘａ因子、エンテロキナーゼ開裂、トロンビン、ＴＥＶ(タバコエッチウイルスプロテアーゼ)開裂を伴うプロテアーゼ媒介による開裂が適切である。
【００７８】
配列リストのＤＮＡおよびポリペプチド配列の配列名の指定
【００７９】
【表１】
【００８０】
多層複合材料
多層複合材料は全く異なる目的、例えば梱包手段（特に合成フィルム）または粘着性製品（self-adhesive articles）（少なくとも支持体および接着層の多層複合材料）に用いられる。
【００８１】
多層複合材料は少なくとも２種、好ましくは２〜５種の層を含み、個々の層は、例えば０．０１〜０．５ｍｍの厚さを有することができる。個々の層は天然または合成ポリマーあるいは金属で構成されていても良い。具体的には、その層はポリマーフィルム、紙、金属ホイル、金属化ポリマーフィルムなどである。
【００８２】
上記ポリペプチドは多層複合材料の隣接する少なくとも２層間の接着促進剤として使用される。好ましくは、少なくとも１層の隣接層は天然または合成ポリマーの層である。適切なポリマーは具体的にはポリエステル類の様な重縮合体、ポリウレタン類の様な付加重合体、ポリアミド類、ポリカーボネート類またはポリフェニレンエーテル類またはポリフェニレン硫化物またはエチレン様の不飽和化合物の遊離ラジカルまたはイオン重合により得られる重合体（遊離ラジカルポリマーと略称する）である。そのような遊離ラジカルポリマーは、好ましくは少なくとも６０質量％、さらに好ましくは少なくとも８０質量％の、Ｃ1〜Ｃ20アルキル（メタ）アクリレート類、２０個以下の炭素原子を含むカルボン酸のビニルエステル類、炭素原子２０個以下のビニル芳香族化合物、エチレン様の不飽和ニトリル類、ハロゲン化ビニル、１〜１０個の炭素原子から成るアルコールのビニルエーテル、２〜８個の炭素原子および１個または２個の二重結合を有する脂肪族炭化水素、特にエチレンおよびプロピレンから選択される「メインモノマー（main monomers）」から構成される。
【００８３】
本発明のポリペプチドは特に非極性ポリマーの接着促進剤として適切であり、従って、少なくとも１層の隣接層は非極性ポリマーで構成されるのが好ましい。
【００８４】
ポリマーの極性は空気中(２１℃)での表面張力により測定する。表面張力が低いほど、ポリマーはより非極性である。
【００８５】
従って、少なくとも１層の隣接層は５０ｍＮ／ｍ（ミリニュートン／メートル）未満、特に４０ｍＮ／ｍ未満の表面張力を有する非極性ポリマーで構成されるのが好ましい。この種の非極性ポリマーの例として、ポリアミド６６（４２．５ｍＮ／ｍ）、ポリスチレン（４３．５ｍＮ／ｍ）、ＰＶＣ（３８．４ｍＮ／ｍ）、ポリエチレン（３６．１ｍＮ／ｍ）、ポリプロピレン（２９ｍＮ／ｍ）またはポリテトラフルオロエタン（２２・５ｍＮ／ｍ）が挙げられる。
【００８６】
特に好ましくは、両方の隣接層がそのような非極性ポリマーで構成されることである。
【００８７】
接着促進剤のために必要とされるポリペプチドの量は通常は０．０１〜１０００ｍｇ／ｍ2（ミリグラム／平方メーター）、特に０．０１〜１００ｍｇ／ｍ2およびさらに好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｍ2である。
【００８８】
ポリペプチドは２層の隣接層のどちらか一方に塗布しても良く、およびその代りに、両方の層が既に作られている場合、両方の層に塗布しても良い。
【００８９】
ポリペプチドは水溶液の形態が好ましく、溶液のポリペプチド含有量は好ましくは水１００質量部に対し０．０１〜５質量部である。本発明による使用するため、その溶液は、好ましくは１〜１００００μｇ／ｍｌ水、特に１０〜１０００μｇ／ｍｌ水の濃度に希釈される。
【００９０】
従って、塗布工程に続いて、その水分を除去するために、まず乾燥工程が行われる。
【００９１】
続いて、２層の隣接層を慣例の方法、例えばラミネート加工により接着する。
【００９２】
ポリペプチドは特に１層の隣接層（第１層）に塗布することができ、それから、他方の隣接層(第２層)は接着促進剤が施された第１層へポリマー分散液、ポリマー溶液または無溶媒のポリマーを塗布し、続くフィルム形成および／または熱または光化学硬化することで作製することができる。この目的のために、そのポリマーは、具体的には水分散液または溶液、特に好ましくは、乳剤(emulsion)ポリマー、好ましくは上記の遊離ラジカルポリマーのいずれかの水分散液の形態である。ポリマーが塗布された後、必要に応じて、乾燥工程が行われる。
【００９３】
コーティングされた基材
基材は全く別の目的でコーティングされる。具体的には装飾的コーティングまたは保護コーティング（総称：コーティング）または他の粘着性コーティング（粘着性を与えるためにそのような基材自体に塗布することができ、または、例えば粘着性製品（ラベルまたは粘着テープ）の形態でその基材に接着することができる）がされることを言う。
【００９４】
基材または基材の表面はどのような物質で構成されていても良い。同様に、コーティングまたはコーティングの基材に面した表面もどのような物質で構成されていても良い。
【００９５】
好ましくは、基材表面またはコーティングまたはコーティングの基材に面した表面は天然または合成ポリマーから構成される。
【００９６】
適切なポリマーは、具体的にはポリエステル類の様な重縮合体、ポリウレタン類の様な付加重合体、ポリアミド類、ポリカーボネート類または
適切なポリマーは具体的にはポリエステル類の様な重縮合体、ポリウレタン類の様な付加重合体、ポリアミド類、ポリカーボネート類またはポリフェニレンエーテル類またはポリフェニレン硫化物またはエチレン様の不飽和化合物の遊離ラジカルまたはイオン重合により得られる重合体（遊離ラジカルポリマーと略称する）である。
【００９７】
遊離ラジカルポリマーの構造およびそれらのメインモノマーの含有量に関しては上記の説明が適用される。
【００９８】
本発明のポリペプチドは特に非極性ポリマー用の接着促進剤に適しており、従って、少なくとも基材表面またはコーティングの基材に面した表面は非極性ポリマーで構成される。
【００９９】
極性の指標としての接触角に関しては、上記の説明が同様に適用される。
【０１００】
基材表面またはコーティングの基材に面した表面の両方がそのような非極性ポリマーで構成されるのが特に好ましい。
【０１０１】
接触促進剤に必要なポリペプチドの量は上記に示した量に相当する。
【０１０２】
ポリペプチドは基材表面、コーティングの基材に面した表面、またはその両方へ塗布しても良い。コーティングの基材に面した表面へ塗布は、そのコーティングが前もって作成されている場合、即ち単層フィルムまたは多層複合材料（上記参照）の場合はその基材に塗布することができる。
【０１０３】
好ましくは、ポリペプチドは水溶液の形態であり、その溶液のポリペプチド含有量は上記に示した通りである。
【０１０４】
従って、塗布工程の後、その水分を除去するため、まず乾燥工程を行うことができる。
【０１０５】
コーティングは慣例の方法、例えばフィルムまたは多層複合材料をラミネート加工するなどの方法で基材に施しても良い。
【０１０６】
特に、コーティングはポリマー分散液、ポリマー溶液または無溶媒のポリマーを接着促進剤が施された基材に面した表面に塗布し、続くフィルム形成および／または熱または光化学硬化することで作製することができる。この目的のために、そのポリマーは、具体的には水分散液または溶液、特に好ましくは、乳剤ポリマー、好ましくは上記の遊離ラジカルポリマーのいずれかの水分散液の形態である。ポリマーが塗布された後、必要に応じて、乾燥工程が行われる。
【０１０７】
本発明の多層複合材料およびコーティングされた基材は強度が顕著に増加している。接着促進剤としてポリペプチドを使用することにより、基材に対するコーティングの接着性はより強力になり、多層複合材料の個々の層のもう一方に対する接着性は優秀である。
【０１０８】
本発明のさらに好ましい実施形態において、基材は金属である。原則として、いずれの金属でも良い。例えば、鉄、鋼鉄、亜鉛、錫、アルミニウム、銅およびそれらの金属およびその他の金属との合金が含まれる。それらは、具体的には鋼鉄、亜鉛メッキ鋼鉄、亜鉛合金、アルミニウムまたはアルミニウム合金でも良い。特に好ましくは、亜鉛または亜鉛合金またはそれを伴う基材、例えば、亜鉛メッキ鋼鉄（galvanized steel）のような基材である。
【０１０９】
亜鉛またはアルミニウム合金は当業者に知られている。当業者はその型および合金構成材の含有量を所望の適用目的に応じて選択する。代表的な亜鉛合金の構成材には、特にアルミニウム、鉛、ケイ素、マグネシウム、錫、銅またはカドミウムが含まれる。代表的なアルミニウム合金の構成材には、特にマグネシウム、マンガン、ケイ素、亜鉛、クロム、ジルコニウム、銅またはチタンが含まれる。その合金はまた、概ね同量のアルミニウムおよび亜鉛を含むアルミニウム／亜鉛合金でも良い。このような合金でコーティングされた鋼鉄は市販されている。
【０１１０】
金属はどのような形状でも良いが、金属ホイル、金属ストリップ(strips)または金属シートの形状が好ましい。金属はまた、金属様の表面を有する複合材料でも良い。例えば、ポリマーフィルムおよび金属の複合材料でも良い。
【０１１１】
金属様の表面は、接着促進剤として本発明により使用されるポリペプチド、好ましくはハイドロフォビンでコーティングされる。これはそのポリペプチドの水溶液を使用して行っても良い。コーティング工程の詳細は既に上記に示している。
【０１１２】
代表的な金属表面のコーティング用の塗料には、少なくとも１種の結合剤(dinder)および架橋性 (crosslinkable) 成分が含まれる。架橋性成分は結合剤に加えて使用される架橋剤でも良く、または結合剤に連結する架橋性の基でも良い。結合剤もまた、架橋性の基でも良く、架橋剤が追加的に使用されても良い。この場合、種々の組合せを考えることができる。例えば、結合剤および架橋剤をそれぞれ別々に使用しても良い。この場合、結合剤には、架橋剤の反応性官能基と相補的に反応する反応性官能基が含まれる。別の方法としては、「それら自身の」その種の官能基、または同一のポリマーにおける相補的な反応性官能基との架橋反応を起こすことができる反応性官能基を含む自己架橋結合剤がある。架橋剤が専ら、それら自身と反応する可能性もある。
【０１１３】
適切な結合剤には（メタ)アクリレート（コ）ポリマー類、特に、部分的に加水分解されたポリビニルエステル類、ポリエステル類、アルキド樹脂類、ポリラクトン類、ポリカーボネート類、ポリエーテル類、エポキシド樹脂アミン付加物、ポリ尿素類、ポリアミド類、ポリイミド類またはポリウレタン類が含まれる。当然、種々のポリマーの混合物であって、望ましくない影響を生じない混合物も使用することができる。
【０１１４】
架橋性成分は熱架橋性官能基または光化学架橋性官能基を有することができる。適切な熱架橋剤の例としては、エポキシド、メラミンまたはブロック化イソシアナートに基づいた架橋剤がある。光化学架橋性の適切な架橋剤としては、特に、多数のエチレン様の不飽和官能基を有する化合物がある。
【０１１５】
本発明によるポリペプチド、好ましくはハイドロフォビンの使用方法は、基材の塗装の接着を有利に改善する。また、耐食性試験において変形(creep)に対する塗装層の抵抗性が改善される。
【０１１６】
本発明を以下の実施例によって、より詳細に説明する。
【０１１７】
パートＡ
ハイドロフォビンの作製
【実施例１】
【０１１８】
ｙａａｄ−Ｈｉｓ6／ｙａａＥ−Ｈｉs6のクローニングの予備実験
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をオリゴヌクレオチドＨａｌ５７０およびＨａｌ５７１（Ｈａｌ５７２／Ｈａｌ５７３）を用いて行った。鋳型ＤＮＡはBacillus subtilis細菌のゲノムのＤＮＡを使用した。得られたＰＣＲ断片はBacillus subtilisのｙａａＤ／ｙａａＥ遺伝子およびそれらの末端でいずれの場合も、それぞれＮｃｏlおよびＢｇｌｌｌ制限酵素の開裂部位のコード配列を含んでいた。ＰＣＲ断片を精製し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏlおよびＢｇｌｌｌで切断した。このＤＮＡ断片を挿入物として使用し、予め制限エンドヌクレアーゼで直鎖化した、ベクターｐＱＥ６０（Ｑｉａｇｅｎ社）にクローニングした。上記により得られたベクター、ｐＱＥ６０ＹＡＡＤ＃２／ｐＱＥ６０ＹａａＥ＃５はそれぞれ、ＹＡＡＤ：：ＨＩＳ6およびＹＡＡＥ：：ＨＩＳ6から成るタンパク質の発現に使用される。
【０１１９】
【表２】
【実施例２】
【０１２０】
ｙａａｄハイドロフォビンＤｅｗＡ−Ｈｉｓ6のクローニング
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をオリゴヌクレオチドＫａＭ４１６およびＫａＭ４１７を用いて行った。鋳型ＤＮＡはAspergillus nidulansカビのゲノムＤＮＡを使用した。得られたＰＣＲ断片はハイドロフォビン遺伝子ｄｅｗＡおよびＮ末端のＸａ因子プロテアイナーゼ開裂部位のコード配列を含んでいた。ＰＣＲ断片を精製し、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨｌで切断した。このＤＮＡ断片を挿入物として使用し、あらかじめ制限エンドヌクレアーゼＢｇｌｌｌで直鎖化した、ベクターｐＱＥ６０ＹＡＡＤ＃２にクローニングした。
【０１２１】
上記により得られたベクター＃５０８はＹＡＡＤ：：Ｘａ：：ｄｅｗＡ：：ＨＩＳ6から成るタンパク質の発現に使用される。
【０１２２】
【表３】
【実施例３】
【０１２３】
ｙａａｄハイドロフォビンＲｏｄＡ−Ｈｉｓ6のクローニング
プラスミド＃５１３をプラスミド＃５０８と同様に、オリゴヌクレオチドＫａＭ４３４およびＫａＭ４３５を使用してクローニングした。
【０１２４】
【表４】
【実施例４】
【０１２５】
ｙａａｄハイドロフォビンＢＡＳＦ１−Ｈｉｓ6のクローニング
プラスミド＃５０７をプラスミド＃５０８と同様に、オリゴヌクレオチドＫａＭ４１７およびＫａＭ４１８を使用してクローニングした。鋳型ＤＮＡには人工的に合成したＤＮＡ配列であるハイドロフォビンＢＡＳＦ１（別表参照）を用いた。
【０１２６】
【表５】
【実施例５】
【０１２７】
ｙａａｄハイドロフォビンＢＡＳＦ２−Ｈｉｓ6のクローニング
プラスミド＃５０６をプラスミド＃５０８と同様に、オリゴヌクレオチドＫａＭ４１７およびＫａＭ４１８を使用してクローニングした。鋳型ＤＮＡは人工的に合成したＤＮＡ配列であるハイドロフォビンＢＡＳＦ２（別表参照）を用いた。
【０１２８】
【表６】
【実施例６】
【０１２９】
ｙａａｄハイドロフォビンＳＣ３−Ｈｉｓ6のクローニング
プラスミド＃５２６をプラスミド＃５０８と同様に、オリゴヌクレオチドＫａＭ４６４およびＫａＭ４６５を使用してクローニングした。
【０１３０】
鋳型ＤＮＡはスエヒロタケ(Schyzophyllum commune）の相補的ＤＮＡ（別表参照）を用いた。
【０１３１】
【表７】
【実施例７】
【０１３２】
組み換えE.coli：ｙａａｄハイドロフォビンＤｅｗＡ−Ｈｉｓ６株の培養
ｙａａｄハイドロフォビンＤｅｗＡ−Ｈｉｓ６を発現するE.coli株を１５ｍｌグライナー試験管中の３ｍｌＬＢ液体培地に接種した。３７℃、２００ｒｐｍで８時間振とう培養した。それぞれの場合に２本のバッフル付き１Ｌエルレンマイヤーフラスコ中の２５０ｍｌＬＢ培地（＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン）に前培養の培養液１ｍｌを接種し、３７℃、１８０ｒｐｍで９時間振とう培養した。２０Ｌファーメンター中の１３．５ＬのＬＢ培地（＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン）に前培養（水に対して測定したＯＤ600nm１：１０）の０．５Ｌを接種した。１４０ｍｌの１００ｍＭＩＰＴＧをＯＤ600nmが〜３．５の時点で添加した。３時間後、ファーメンターを１０℃に冷却し、培養液を遠心分離により除去した。細胞沈殿物を次の精製工程で使用する。
【実施例８】
【０１３３】
組み換えハイドロフォビン融合タンパク質の精製
（Ｃ−末端Ｈｉｓ６タグをプロセッシングするハイドロフォビン融合タンパク質の精製）
１００ｇの細胞沈殿物（１００〜５００ｍｇのハイドロフォビン含有）を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）にて総容量で２００ｍｌになるようにして、再懸濁した。懸濁液はＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘ ｔｙｐｅＴ２５(Ｊａｎｋｅ ａｎｄ Ｋｕｎｋｅｌ；ＩＫＡ−Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ社製)で１０分間処理し、次いで核酸を分解する目的で、５００単位のベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ,Ｄａｒｍｓｔａｄｔ社；オーダーＮｏ．１．０１６９７．０００１）で室温にて１時間反応した。細胞の破壊に先立ち、ガラスカ−トリッジ（Ｐ１）を使用してろ過を行った。細胞の破壊および残存したゲノムのＤＮＡをせん断する目的で、１５００ｂａｒで高圧ホモジナイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ Ｍ−１１０ＥＨ；Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ社）で２回処理した。ホモジネートを遠心分離（Ｓｏｖａｌｌ ＲＣ−５Ｂ，ＧＳＡローター，２５０ｍｌ遠心ビーカー、４℃、６０分、１２０００ｒｐｍ、２３０００ｇ）し、上清を氷冷し、沈殿物は１００ｍｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。遠心分離および再懸濁を３回繰り返し、３回目では１％ＳＤＳを含むリン酸緩衝液を用いた。再懸濁後、溶液を１時間攪拌し、続いて最後の遠心分離（Ｓｏｖａｌｌ ＲＣ−５Ｂ，ＧＳＡローター，２５０ｍｌ遠心ビーカー、４℃、６０分、１２０００ｒｐｍ、２３０００ｇ）をした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によると、ハイドロフォビンは最後の遠心分離後の上清に存在している（図１)。本実験はハイドロフォビンがE.coliの細胞内におそらく封入体(inclision bodies)の形態で存在していることを示している。５０ｍｌのハイドロフォビンを含有する上清を５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した５０ｍｌのｎｉｃｋｅｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ１７−５２６８−０２カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に掛けた。カラムを５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し、続いて２００ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液で溶出した。イミダゾールを除く目的で、溶液を５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で透析した。
【０１３４】
図１は作製されたハイドロフォビンの精製を示す。
【０１３５】
レーン１： ｎｉｃｋｅｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに掛けた溶液（１：１０希釈）
レーン２：透過液＝洗浄工程の溶出液
レーン３〜５：溶出画分のＯＤ２８０ｎｍ検出ピーク
図１のハイドロフォビンは分子量約５３ｋＤを有する。何本かのより小さい分子量のバンドはハイドロフォビンの分解産物を示す。
【実施例９】
【０１３６】
性能試験；ガラス状の水滴の接触角を変化することによるハイドロフォビンの特性解析
基材：
ガラス（窓ガラス，Ｓｕｄｄｅｕｔｓｈｅ Ｇｌａｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）：
ハイドロフォビン濃縮物：１００μｇ／ｍｌ、
５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）＋０．１質量％Ｔｗｅｅｎ２０中でガラススライドを１晩(温度８０℃)インキュベートし、
続いて、ハイドロフォビンコーティングされたガラススライドを蒸留水中で洗浄し、
続いて１質量％ＳＤＳ水溶液中で８０℃、１０分間インキュベートし、
蒸留水で洗浄した。
【０１３７】
そのサンプルを室温で空気乾燥し、室温で５μｌの水滴の接触角（度数）を測定する。
【０１３８】
接触角の測定はＤａｔａｐｈｙｓｉｃｓ Ｃｏｎｔａｃｔ Ａｎｇｌｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＯＣＡ １５＋、Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＳＣＡ２０．２．０（２００２年１１月）により測定した。測定はメーカー使用説明書に従って行った。
【０１３９】
未処理のガラスは接触角が３０±５°であり、実施例８の機能的なハイドロフォビン（ｙａａｄ−ｄｅｗＡ−Ｈｉｓ6）によりコーティングしたものは接触角が７５±５°であった。
【０１４０】
パートＢ） 接着促進剤としてのポリペプチドの使用
【実施例１０】
【０１４１】
ポリエチレン基材
使用材料：
使用溶液：
実施例８により作製された融合タンパク質、ｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）の水溶液を性能試験に使用した。ハイドロフォビン溶液の濃度は１００μｇ／ｍｌ（０．０１質量％）であった。
【０１４２】
基材：ポリエチレンの成型品（小プレート）。
【０１４３】
コーティング：
ポリエステルフィルムをＡｃｒｏｎａｌ Ａ ２４０（市販、感圧接着剤用の水性ポリアクリル酸分散液（ＢＡＳＦ社））でコーティングし、乾燥し、２．５ｃｍ幅のストリップに切断した。得られた接着用ストリップをポリエチレンプレートのコーティングに使用した。
【０１４４】
手順：
ポリペプチド溶液をポリエチレンプレートに塗布し、乾燥した（前処理ポリエチレンプレート）。
【０１４５】
続いて、接着用ストリップを前処理、および比較として未処理のポリエチレンプレートに接着し、接着用ストリップを剥がすために必要な力を測定した(剥離強度Ｎ)。
【０１４６】
接着促進剤としてポリペプチドを用いた場合の剥離強度：４．７Ｎ
接着促進剤としてポリペプチドを用いない場合の剥離強度：２．６Ｎ
【実施例１１】
【０１４７】
金属基材
実施例８により作製された融合タンパク質、ｙａａｄ−Ｘａ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）の水溶液を性能試験に使用した。ハイドロフォビン溶液の濃度は１００μｇ／ｍｌ（０．０１質量％）であった。ｐＨの情報は不明であるが、溶液のｐＨはさらなる緩衝液を加えなければ、８〜８．５であろう。
【０１４８】
以下の試験シートを金属基材として使用した。
【０１４９】
【表８】
【０１５０】
使用された塗料はアルキド・メラミンに基づく焼きつけ上塗り塗料であった。（これは十分に塗料の特性を示すか。）
実験の説明
アルミニウムシートをアルカリ性洗浄浸漬槽（６０ｇ／リットル ＮａＯＨ、６０℃、１分間）に漬け、蒸留水ですすいだ。次いで、シートを酸性スケール除去槽（硝酸／水（１：１）、室温、１５秒間）でスケール除去し、蒸留水ですすぎ、加圧空気で乾かした。
【０１５１】
亜鉛メッキ鋼鉄および鋼鉄のシートは熱水ですすぎ、続いて蒸留水ですすぎ、加圧空気で乾かした。
【０１５２】
シートを上記の溶液に、それぞれ室温で浸すことにより、ハイドロフォビンでコーティングした。アルミニウムシートの場合は１６時間浸し、亜鉛メッキ鋼鉄および鋼鉄の場合は４時間浸した。続いて、そのシートを留水ですすぎ、加圧空気で乾かした。
【０１５３】
接着促進剤としてハイドロフォビンコーティングをした後、シートをプラスチックボール中のアルキド・メラミンに基づく焼きつけ上塗り塗料に１５秒間浸し、空気中で約１時間前乾燥した。続いて、これを１９０℃、３０分間乾燥器で乾燥し、塗料を硬化させた。
【０１５４】
比較のため、それぞれの場合で、接着促進剤としてハイドロフォビンを使用しない試料を同様に塗装処理した。
【０１５５】
性能試験
シートの性能はＥＮ ＩＳＯ ２４０９（クロスカット試験）、ＥＮ ＩＳＯ ４６２８−８（クリープ試験）およびＤＩＮ ５３１５６（エリクセンカッピング試験）により評価した。
【０１５６】
クロスカット試験では表面にクロスカットを入れた後、所定の標準法に基づいて塗装面の外観を評価する。これはクロスカットを入れたために塗装が表面から剥がれることの広がりを評価することを伴う。その評価は０〜５等級として、０が最高で５が最低の点数である、既知の方法で行われる。
【０１５７】
塗装層のクリープ試験はシートの標準腐食試験（塩水噴霧室における暴露（ＳＳＤＩＮ ５００２１））により測定される。アルミニウムシートのクリープは２９８時間後に評価し、鋼鉄シートは５０時間後、および亜鉛メッキ鋼鉄シートは１９０時間後に評価し、それぞれ、所定の標準に基づいて、０〜５等級として、０が最高で５が最低の点数とした。
【０１５８】
エリクセンカッピング試験は試料の背面にボールを押し付けること、および窪みを作ることから構成される。その跡における塗装の外観を所定の標準に基づいて評価し、この場合は５が最高で０が最低の点数とする。
【０１５９】
性能試験の結果を以下にまとめる。
【０１６０】
実施例１１−１：鋼鉄基材
【０１６１】
【表９】
【０１６２】
接着促進剤としてハイドロフォビンを使用することによって、クリープ試験についてはハイドロフォビンを使用していない試料と比較して変化はない（５等級）。クロスカット試験（より低い値）およびエリクセンカッピング試験(より高い値)についてはどちらの場合も、より良好な結果を示す。
【０１６３】
実施例１１−２：亜鉛メッキ鋼鉄基材
【０１６４】
【表１０】
【０１６５】
亜鉛メッキ鋼鉄に接着促進剤としてハイドロフォビンを使用することによって、３試験の全ての場合において、接着促進剤を使用しない場合よりも良好な結果（クロスカット試験およびクリープ試験ではより低い値、エリクセンカッピング試験ではより高い値）を示す。最も明確な改善は腐食防止の高い効果（接着促進剤を使用しない場合で４等級に対して、接着促進剤を使用した場合では１等級）において認められる。
【０１６６】
実施例１１−３：アルミニウム基材
【０１６７】
【表１１】
【０１６８】
アルミニウム基材の場合、クロスカット試験およびクリープ試験は接着促進剤を使用しない場合でさえも良好な結果である。エリクセンカッピング試験ではわずかながら改善が認められる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多層複合材料またはコーティングされた基材であって、複合材料の隣接する少なくとも２層間の、またはコーティングおよび基材間の接着促進剤として、少なくとも４０質量％がペプチド結合により連結したα−アミノ酸（以下、ポリペプチドと略称する）から成る化合物を含むことを特徴とする多層複合材料またはコーティングされた基材。
【請求項２】
ポリペプチドの少なくとも８０質量％がα−アミノ酸から成る請求項１に記載の多層複合材料またはコーティングされた基材。
【請求項３】
ポリペプチドが構成成分としてシステインを含む請求項１または２に記載の多層複合材料またはコーティングされた基材。
【請求項４】
ポリペプチドが少なくとも０．５質量％のシステインから成る請求項１〜３のいずれか１項に記載の多層複合材料またはコーティングされた基材。
【請求項５】
ポリペプチドが式、
【化１】
[上記式中、Ｘは２０種の天然アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ）を表し、各々のＸは同一または異なっても良く、Ｘの隣の指数はそれぞれの場合のアミノ酸残基数を示しており、Ｃはシステイン、アラニン、セリン、グリシン、メチオニンまたはスレオニンを表し、ただし、Ｃで表されるアミノ酸の少なくとも４個はシステインであり、指数ｎおよびｍは相互に独立して、０〜５００の範囲、好ましくは１５〜３００の範囲の自然数である。]
のハイドロフォビンである請求項１または２に記載の多層複合材料またはコーティングされた基材。
【請求項６】
隣接層の少なくとも１層が天然または合成ポリマーから成る請求項１〜５のいずれか１項に記載の多層複合材料。
【請求項７】
隣接層の少なくとも１層が５０ｍＮ／ｍ未満の表面張力を有する（非極性の）合成ポリマーから成る請求項１〜６のいずれか１項に記載の多層複合材料。
【請求項８】
隣接層の両方の層が天然または合成ポリマーから成る請求項１〜７のいずれか１項に記載の多層複合材料。
【請求項９】
１層が金属または合金から成る請求項１〜５のいずれか１項に記載の多層複合材料またはコーティングされた基材。
【請求項１０】
隣接層が塗料層である請求項９に記載の多層複合材料。
【請求項１１】
金属が鋼鉄、亜鉛メッキ鋼鉄、亜鉛合金、アルミニウムまたはアルミニウム合金から成る群から選択されるか、あるいはアルミニウムまたはアルミニウム合金である請求項９または１０に記載の多層複合材料。
【請求項１２】
多層複合材料を製造する方法であって、
ポリペプチドを隣接層の１層に塗布し、
ポリペプチドを水溶液の形態で塗布する場合に、必要に応じて乾燥工程を行い、
続いて、その上にもう一方の隣接層をラミネート加工するか、あるいはもう一方の隣接層を天然または合成ポリマーのフィルムを形成することにより設けることを特徴とする方法。
【請求項１３】
もう一方の隣接層の天然または合成ポリマーが水溶液または分散液の形態であり、フィルム形成された後に乾燥工程を行う請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
基材表面またはコーティングの基材に面した表面が天然または合成ポリマーから成る請求項１〜５のいずれか１項に記載のコーティングされた基材。
【請求項１５】
基材表面またはコーティングの基材に面した表面が５０ｍＮ／ｍ未満の表面張力を有する（非極性の）合成ポリマーから成る請求項１〜５および１４のいずれか１項に記載のコーティングされた基材。
【請求項１６】
基材表面またはコーティングの基材に面した表面が天然または合成ポリマーから成る請求項１〜５、１４および１５のいずれか１項に記載のコーティングされた基材。
【請求項１７】
請求項１〜５および１４〜１６のいずれか１項に記載のコーティングされた基材を製造する方法であって、
ポリペプチドを基材表面またはコーティングの基材に面した表面に塗布し、
ポリペプチドを水溶液の形態で塗布する場合に、必要に応じて乾燥工程を行い、
続いて、コーティングを基材に施すことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載のコーティングされた基材を製造する方法であって、
ポリペプチドを基材表面に塗布し、
ポリペプチドを水溶液の形態で塗布する場合に、必要に応じて乾燥工程を行い、
続いてコーティングを基材表面に天然または合成ポリマーのフィルムを形成することにより設けることを特徴とする方法。
【請求項１９】
天然または合成ポリマーが水溶液または分散液の形態であり、フィルム形成された後に乾燥工程を行う請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
水溶液または分散液が乳剤ポリマーの水性分散液である請求項１３または１９に記載の方法。
【請求項２１】
多層複合材料の隣接する少なくとも２層間の、またはコーティングされた基材のコーティングおよび基材間の接着促進剤として、少なくとも４０質量％がペプチド結合により連結したα−アミノ酸（ポリペプチドと略称する）から成る化合物を使用する方法。
【請求項１】
多層複合材料またはコーティングされた基材であって、複合材料の隣接する少なくとも２層間の、またはコーティングおよび基材間の接着促進剤として、少なくとも４０質量％がペプチド結合により連結したα−アミノ酸（以下、ポリペプチドと略称する）から成る化合物を含むことを特徴とする多層複合材料またはコーティングされた基材。
【請求項２】
ポリペプチドの少なくとも８０質量％がα−アミノ酸から成る請求項１に記載の多層複合材料またはコーティングされた基材。
【請求項３】
ポリペプチドが構成成分としてシステインを含む請求項１または２に記載の多層複合材料またはコーティングされた基材。
【請求項４】
ポリペプチドが少なくとも０．５質量％のシステインから成る請求項１〜３のいずれか１項に記載の多層複合材料またはコーティングされた基材。
【請求項５】
ポリペプチドが式、
【化１】
[上記式中、Ｘは２０種の天然アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ）を表し、各々のＸは同一または異なっても良く、Ｘの隣の指数はそれぞれの場合のアミノ酸残基数を示しており、Ｃはシステイン、アラニン、セリン、グリシン、メチオニンまたはスレオニンを表し、ただし、Ｃで表されるアミノ酸の少なくとも４個はシステインであり、指数ｎおよびｍは相互に独立して、０〜５００の範囲、好ましくは１５〜３００の範囲の自然数である。]
のハイドロフォビンである請求項１または２に記載の多層複合材料またはコーティングされた基材。
【請求項６】
隣接層の少なくとも１層が天然または合成ポリマーから成る請求項１〜５のいずれか１項に記載の多層複合材料。
【請求項７】
隣接層の少なくとも１層が５０ｍＮ／ｍ未満の表面張力を有する（非極性の）合成ポリマーから成る請求項１〜６のいずれか１項に記載の多層複合材料。
【請求項８】
隣接層の両方の層が天然または合成ポリマーから成る請求項１〜７のいずれか１項に記載の多層複合材料。
【請求項９】
１層が金属または合金から成る請求項１〜５のいずれか１項に記載の多層複合材料またはコーティングされた基材。
【請求項１０】
隣接層が塗料層である請求項９に記載の多層複合材料。
【請求項１１】
金属が鋼鉄、亜鉛メッキ鋼鉄、亜鉛合金、アルミニウムまたはアルミニウム合金から成る群から選択されるか、あるいはアルミニウムまたはアルミニウム合金である請求項９または１０に記載の多層複合材料。
【請求項１２】
多層複合材料を製造する方法であって、
ポリペプチドを隣接層の１層に塗布し、
ポリペプチドを水溶液の形態で塗布する場合に、必要に応じて乾燥工程を行い、
続いて、その上にもう一方の隣接層をラミネート加工するか、あるいはもう一方の隣接層を天然または合成ポリマーのフィルムを形成することにより設けることを特徴とする方法。
【請求項１３】
もう一方の隣接層の天然または合成ポリマーが水溶液または分散液の形態であり、フィルム形成された後に乾燥工程を行う請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
基材表面またはコーティングの基材に面した表面が天然または合成ポリマーから成る請求項１〜５のいずれか１項に記載のコーティングされた基材。
【請求項１５】
基材表面またはコーティングの基材に面した表面が５０ｍＮ／ｍ未満の表面張力を有する（非極性の）合成ポリマーから成る請求項１〜５および１４のいずれか１項に記載のコーティングされた基材。
【請求項１６】
基材表面またはコーティングの基材に面した表面が天然または合成ポリマーから成る請求項１〜５、１４および１５のいずれか１項に記載のコーティングされた基材。
【請求項１７】
請求項１〜５および１４〜１６のいずれか１項に記載のコーティングされた基材を製造する方法であって、
ポリペプチドを基材表面またはコーティングの基材に面した表面に塗布し、
ポリペプチドを水溶液の形態で塗布する場合に、必要に応じて乾燥工程を行い、
続いて、コーティングを基材に施すことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載のコーティングされた基材を製造する方法であって、
ポリペプチドを基材表面に塗布し、
ポリペプチドを水溶液の形態で塗布する場合に、必要に応じて乾燥工程を行い、
続いてコーティングを基材表面に天然または合成ポリマーのフィルムを形成することにより設けることを特徴とする方法。
【請求項１９】
天然または合成ポリマーが水溶液または分散液の形態であり、フィルム形成された後に乾燥工程を行う請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
水溶液または分散液が乳剤ポリマーの水性分散液である請求項１３または１９に記載の方法。
【請求項２１】
多層複合材料の隣接する少なくとも２層間の、またはコーティングされた基材のコーティングおよび基材間の接着促進剤として、少なくとも４０質量％がペプチド結合により連結したα−アミノ酸（ポリペプチドと略称する）から成る化合物を使用する方法。
【公表番号】特表２００８−５３７７０１（Ｐ２００８−５３７７０１Ａ）
【公表日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０３４９６（Ｐ２００８−５０３４９６）
【出願日】平成１８年３月２８日（２００６．３．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６１０８５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０３２２５
【国際公開日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【出願人】（５０８０２０１５５）ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア (2,842)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＳＦ ＳＥ
【住所又は居所原語表記】Ｄ−６７０５６ Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２８日（２００６．３．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６１０８５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０３２２５
【国際公開日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【出願人】（５０８０２０１５５）ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア (2,842)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＳＦ ＳＥ
【住所又は居所原語表記】Ｄ−６７０５６ Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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