新脈管形成に影響を与えるポリペプチド、タンパク質及び組成物、及びそれを使用する方法
本発明は、脈管形成及び新脈管形成に関連する疾患に関係するポリヌクレオチド及びタンパク質に関する。さらに、本発明は新脈管形成に関連する遺伝子及び遺伝子産物の発現を調節する化合物の同定方法、及びかかる化合物を新脈管形成に関連する疾患の治療において治療剤として用いることに関する。また、本発明は新脈管形成に関連する疾患の診断的評価、遺伝子検査及び予後、並びにこれらの疾患を治療するための方法及び組成物に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は脈管形成及び／又は新脈管形成に関与するポリペプチド及びそれによってコードされるタンパク質に関する。これらの薬剤は、新脈管形成に関連する状態の診断及び治療において用いられる材料及び方法を製造するときに標的化されることができる。さらに、本発明はかかる診断及び治療方法及び薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
脈管形成（動脈及び静脈を含む相互作用脈管系の発達）及び新脈管形成（新しい血管の形成）の両者は、胚の発達において役割を果たしている。対照的に、新脈管形成は正常な成人においては胎盤、卵巣、子宮内膜、及び創傷治癒部位に限定されている。新脈管形成又はその不存在は、様々な病気の状態の維持において重要な役割を果たしている。これらの状態のいくつかは新生血管形成によって特徴付けられる（例えば癌、糖尿病性網膜症、緑内障、及び加齢に関連する黄斑変性）。他の状態は例えば脳卒中、不妊症、心臓病、潰瘍、及び強皮症であり、これらは新脈管形成の不十分さによる疾患である。
【０００３】
新脈管形成は多数の段階を有する（例えばＺｈｕ ａｎｄ Ｗｉｔｔｅ、Ｉｎｖｅｓｔ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ １７：１９５−２１２、１９９９を参照）。新脈管形成の初期段階は、内皮細胞プロテアーゼ生産、細胞の移動、及び増殖を含む。初期段階は、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−Ａ及び全てが仮想的な役割を果たす選択されたケモカインと共にいくつかの成長因子を必要とするようにも思える。新脈管形成の後期の段階は、壁細胞（周皮細胞又は平滑筋細胞）を有する脈管の集団化、基底膜の生成、及び脈管床の分化の誘導を含む。脈管形成の最終段階は、リモデリングとして知られるものを含み、そこでは形成された脈管構成が安定な成熟した脈管床になる。従って、この過程は極めて動的であり、遺伝子発現の調和した空間的及び時間的な波をしばしば必要とする。
【０００４】
複雑な新脈管形成の過程は、一以上の重要な工程との干渉を通して妨害され、多数の病気の状態がこの妨害によって生じ又は悪化されうる。制御されない新脈管形成は病気を引き起こし又は悪化させることがあり、例えば目の新生脈管形成は失明の最も一般的な原因であることが明らかになっており、約２０もの目の病気の病因の根底にある。関節炎の如き特定の従来から存在する状態では、新たに形成された毛細血管は関節に浸入し、軟骨を破壊する。糖尿病では、網膜に形成された新しい毛細管は硝子体液に浸入し、出血と失明の原因になる。
【０００５】
制御されない新脈管形成に関連する病気に加えて、不十分な新脈管形成も望ましくない結果に導きうる。死んだ又は損傷された組織は多数の病気に導くことがあり、健康な正常な新脈管形成過程を通した損傷組織の再脈管形成は、さらなる合併症を防止するために必須である。
【０００６】
それ故、新脈管形成を阻害するか又は高める新しい標的及び治療が必要とされる。新脈管形成のいずれかの段階に関与するより重要な要因の同定は、新脈管形成に関連する病気の状態のための新しい診断方法に導くことがありうる。さらに、新脈管形成に関与する重要な要因の解明及び理解は、新脈管形成に関連する状態のための潜在的な治療方法を研究するための新しい方法の基礎を形成することがありうる。
【発明の開示】
【０００７】
上述の目的に従って、本発明は脈管形成及び／又は新脈管形成において重要な役割を有する１０個の核酸配列及び関連するタンパク質を開示する。本発明の一つの目的は、これらの１０個の新規の要因を新脈管形成に関連する病気の状態における治療的介入のための分子標的として用いるためのアプローチを提示することである。本発明のさらなる目的は、新脈管形成又は新脈管形成に関連する状態を調節する能力について化合物をスクリーニングするために用いることができる材料及び方法を提供することである。
【０００８】
ここで同定される配列及びタンパク質を特異的に標的とする治療も、脈管形成又は新脈管形成を調節する薬剤又は組成物として提供される。
【０００９】
本発明の一実施態様によれば、配列番号２，４，７，９，１２，１４，１７，１９，２１，２４，２６，２９，３１，３４，３６，３９，４１，４４，４６，４９及び５１のいずれか一つに記載の単離された核酸分子、又はその断片もしくは類似体であって、脈管形成、新脈管形成、脈管の透過性、内皮細胞の増殖、内皮細胞の分化、内皮細胞の移動、及び内皮細胞の生存からなる群から選択される少なくとも一つの生物学的活性を刺激するか又は阻害する能力を有する単離された核酸分子又はその断片又は類似体、又はストリンジェントな条件下で上述の配列のいずれか一つとハイブリダイズする単離された核酸分子が提供される。本発明は上述の核酸分子の相補物にハイブリダイズする単離された核酸分子、及び上述の単離された核酸に標的化された少なくとも１９塩基対の単離されたｓｉＲＮＡ分子にも関する。
【００１０】
本発明のさらなる実施態様によれば、新規の核酸の一つを含む発現ベクターが提供される。核酸はこの核酸によってコードされるポリペプチドの発現を制御する調節核酸と操作可能なように結合されることができる。
【００１１】
本発明は、上述の核酸を含むように遺伝的に改変された、又は上述の発現ベクターによってトランスフェクトされた宿主細胞をさらに含む。
【００１２】
本発明のさらなる実施態様によれば、上述の発現ベクターを細胞、一群の細胞又は生物に投与する工程を含む、細胞、一群の細胞又は生物における新脈管形成に関連した状態を治療する方法が提供される。
【００１３】
本発明は、上述の核酸分子に対して特異的な反応性を有する抗体をさらに含む。この抗体はポリクローナル又はモノクローナルのものであることができ、蛍光ラベルの如き検出可能なラベルをさらに含むことができる。
【００１４】
本発明のさらなる実施態様によれば、上述の核酸を含む導入遺伝子を含むように遺伝的に改変されたトランスジェニックの非ヒト動物、及び導入遺伝子を含みかつ発現する動物が提供される。
【００１５】
本発明のさらなる実施態様によれば、上述の核酸配列を含む医薬組成物が提供される。この組成物は、脈管形成又は新脈管形成に影響を与えるために細胞、一群の細胞又は生物に投与されることができる。この効果は脈管形成又は新脈管形成を増加又は減少させることであることができ、この方法は細胞、一群の細胞又は生物が新脈管形成に関連する障害を有する場合に用いられることができる。かかる新脈管形成に関連する障害は、癌、網膜症、黄斑変性、角膜の潰瘍、脳卒中、虚血性心臓疾患、不妊症、潰瘍、強皮症、創傷治癒、虚血、心筋梗塞、心筋症、狭心症、不安定なアンギナ、冠動脈硬化症、動脈硬化閉塞、ベルガー病、動脈塞栓症、動脈血栓症、脳血管性閉塞、脳梗塞、脳血栓症、脳塞栓症、ルベオーシス、増殖性硝子体網膜症、慢性炎症、炎症性腸疾患、乾癬、サルコイドーシス、及びリウマチ性関節炎を含む。
【００１６】
本発明のさらなる実施態様によれば、配列番号３，５，８，１０，１３，１５，１８，２０，２２，２５，２７，３０，３２，３５，３７，４０，４２，４５，４７，５０及び５２のいずれか一つに記載のアミノ酸配列に実質的に相当するアミノ酸の配列を含む単離されたポリペプチド、又はその断片もしくは類似体であって、細胞、一群の細胞又は生物における新脈管形成に影響を与える能力を有するポリペプチドが提供される。
【００１７】
本発明は上述のポリペプチドを発現するように遺伝的に改変された宿主細胞、並びにこのポリペプチドと特異的に反応する抗体をさらに含む。この抗体はポリクローナル又はモノクローナルのものであることができ、蛍光ラベルの如き検出可能なラベルをさらに含むことができる。
【００１８】
本発明のさらなる実施態様によれば、上述のポリペプチドをコードする核酸を含む導入遺伝子を含むように遺伝的に改変されたトランスジェニックの非ヒト動物、及び導入遺伝子を含みかつ発現する動物が提供される。
【００１９】
さらに、本発明は上述の単離されたポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、脈管形成又は新脈管形成に影響を与えるために細胞、一群の細胞又は生物に投与されることができる。脈管形成又は新脈管形成は増加又は減少されることができる。この細胞、一群の細胞又は生物は新脈管形成に関連する障害を有することができる。代表的な新脈管形成に関連する障害は上述されている。
【００２０】
本発明のさらなる実施態様によれば、患者の細胞中の新脈管形成に関連する転写物を検出する方法であって、前記方法が、配列番号２，４，７，９，１２，１４，１７，１９，２１，２４，２６，２９，３１，３４，３６，３９，４１，４４，４６，４９及び５１のいずれか一つに記載の配列と少なくとも８０％同一である配列と選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドと患者からの生物学的サンプルを接触させることを含み、前記新脈管形成に関連する転写物はハイブリダイゼーションが検出される場所で検出される。前記ポリヌクレオチドは配列番号２，４，７，９，１２，１４，１７，１９，２１，２４，２６，２９，３１，３４，３６，３９，４１，４４，４６，４９及び５１のいずれか一つに記載の配列を含むことができる。前記生物学的サンプルは組織サンプルであるか又はｍＲＮＡの如き単離された核酸からなることができる。この方法によれば、前記核酸は生物学的サンプルをポリヌクレオチドと接触させる工程に先立って増幅されることができる。さらに、ポリヌクレオチドは固体表面上に固定される。
【００２１】
本発明のさらなる実施態様によれば、脊椎動物において新脈管形成及び脈管形成から選択される少なくとも一つの生物学的活性に影響を与える方法であって、前記方法が、ここに記述されるヌクレオチド又はポリペプチドの新脈管形成又は脈管形成に影響を与えるのに効果的な量を前記生物に投与する工程を含む方法が提供される。前記生物はマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、サル及びヒトの如き哺乳動物であることができる。脈管形成又は新脈管形成は高められ、増大され、阻害され、又は減少されることができる。この方法は、上述したような新脈管形成に関連する障害を有する生物に対して使用することができる。
【００２２】
本発明のさらなる実施態様によれば、配列番号２，４，７，９，１２，１４，１７，１９，２１，２４，２６，２９，３１，３４，３６，３９，４１，４４，４６，４９及び５１のいずれか一つに記載の配列の発現が上向き調節される、一以上の細胞を含む新脈管形成が増大されたトランスジェニックの実験用動物が提供される。配列番号２，４，７，９，１２，１４，１７，１９，２１，２４，２６，２９，３１，３４，３６，３９，４１，４４，４６，４９及び５１のいずれか一つに記載の配列の発現が下向き調節されるか、又は不存在である、一以上の細胞を含む新脈管形成が減少されたトランスジェニックの実験用動物も提供される。
【００２３】
ここで用いられる用語「新脈管形成に関連した状態」又は「新脈管形成に関連した疾患（状態）」は、脈管発達の過剰又は不足によって特徴付けられる状態、又は脈管発達の増加又は減少によって改善される状態を意味する。増加された新脈管形成に関連する障害は以下のものを含むがこれらに限定されない：癌（固形腫瘍、白血病及び腫瘍転移を含む）、良性腫瘍（血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、及び化膿性肉芽腫を含む）、網膜症、黄斑変性、及び角膜の潰瘍。減少された新脈管形成に関連するか又は増加された新脈管形成によって改善することができる病気の状態は以下のものを含むがこれらに限定されない：虚血性心臓疾患、不妊症、潰瘍、強皮症、（不十分な）創傷治癒、虚血、心筋梗塞、心筋症、狭心症、不安定なアンギナ、冠動脈硬化症、動脈硬化閉塞（ＡＳＯ）、ベルガー病、動脈塞栓症、動脈血栓症、脳血管性閉塞、脳梗塞、脳血栓症、脳塞栓症、及び脳卒中。他の新脈管形成に関連する疾患は以下のものを含むがこれらに限定されない：ルベオーシスに関連する疾患（角の新生血管形成）、及び糖尿病に関連するかどうかにかかわらず、増殖性硝子体網膜症のすべての形態を含む繊維状脈管又は繊維状組織の異常な増殖によって引き起こされる疾患、炎症性腸疾患の如き慢性炎症の徴候を有する疾患、乾癬、サルコイドーシス、及びリウマチ性関節炎。
【００２４】
「宿主細胞」は、発現ベクターを含み発現ベクターの複製又は発現を支持する形質転換された細胞又は天然に生じる細胞である。宿主細胞は、培養された細胞、外植片、インビボの細胞などであることができる。宿主細胞はイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の如き原核細胞であるか、又は酵母、昆虫、両生類、又はＣＨＯ、ＨｅＬａなどの如き哺乳類細胞の如き真核細胞であることができる（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ又はウェブサイトｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇを参照）。
【００２５】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」はここでは相互交換可能に用いられ、アミノ酸残基のポリマーに言及する。これらの用語はアミノ酸残基が対応する天然に生じるアミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然に生じるアミノ酸ポリマー、及び天然には生じないアミノ酸ポリマーに適用する。
【００２６】
用語「アミノ酸」は天然に生じるアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に生じるアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体に言及する。天然に生じるアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、並びに後で変性されたアミノ酸（例えばヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタメート、及びＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」は、天然に生じるアミノ酸と同一の基本的化学構造を有する化合物に言及する。かかる類似体は変性されたＲ基（例えばノルロイシン）又は変性されたペプチド骨格を有するが、天然に生じるアミノ酸と同一の基本的化学構造を維持している。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有する化学化合物であるが、天然に生じるアミノ酸と同様の様式で機能する化学化合物に言及する。アミノ酸はそれらの一般的に知られる三文字標記又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓによって推奨される一文字標記で言及されてもよいし、同様に、それらの一般的に受け入れられている一文字コードで言及されてもよい。
【００２７】
ここで用いられる用語「保存的改変」又は「保存的に改変された変異体」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用する。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体は、同一の又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、又は核酸がアミノ酸をコードしない場合には、本質的に同一の配列に言及する。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸がいかなる所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンによって特定されるすべての位置で、コドンはコードされるポリペプチドを変更させることなしに記述された対応するコドンのいずれにも変更されることができる。かかる核酸変異は「サイレント変異」であり、これは保存的に改変された変異の一種である。ポリペプチドをコードするすべての核酸配列は、核酸のいかなる可能なサイレント変異も記述する。当業者は、核酸中の各コドン（メチオニンに対する通常唯一のコドンであるＡＵＧ及びトリプトファンに対する通常唯一のコドンであるＴＧＧを除く）は、機能的に同一の分子を与えるように改変されることができることを認識するであろう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、発現生成物に関して（実際のプローブ配列に関してではなく）それぞれの記述された配列において暗に意味される。
【００２８】
アミノ酸配列について、コードされた配列における単一のアミノ酸又はアミノ酸の小さい割合を変更、付加又は欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列に対する個々の置換、欠失又は付加は、変更が化学的に類似のアミノ酸でのアミノ酸の置換を生じる「保存的に改変された変異体」であるということを当業者は認識するであろう。機能的に類似のアミノ酸を与える保存的置換の表は当該技術分野で周知である。かかる保存的に改変された変異体は、本発明の多型的変異体、種間相同物及び対立遺伝子に追加されるが、これらを除外するものではない。
【００２９】
ここで使用される通り、「ラベル」又は「検出可能な成分」は分光測光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、又は他の物理的手段によって検出可能な組成物に言及する。かかるラベルの例は、３２Ｐ、蛍光色素、電子密度試薬、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、又は例えば放射性ラベルをペプチドに組み入れることによって検出可能にすることができる、又はペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために用いられるハプテン及びタンパク質である。
【００３０】
ここで使用される通り、「ベクター」又は「発現ベクター」は、宿主細胞中で特定の核酸の転写を可能にする特異化された一連の核酸要素と共に組み換え的に又は合成的に生成された核酸構築物に言及する。発現ベクターはプラスミドの一部、ウイルス又は核酸断片であることができる。典型的に、発現ベクターはプロモーターに操作可能なように連結された転写されるべき核酸を含む。
ここで用いられる句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、配列がハイブリダイズする条件に言及する。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、環境が異なれば異なるであろう。当業者は、所定の配列について好適な反応条件を詳述する有意な量の記述材料に対するアクセスを有する。一例はＩｎｎｉｓら（１９９０）の「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ． Ｎ．Ｙ．）である。
【００３１】
ここで使用される通り、新脈管形成性ポリペプチド及びポリペプチド配列及び新脈管形成活性の「阻害剤」、「活性化剤」及び「調節剤」は、阻害性分子、活性化分子、又は調節分子に言及する。「阻害剤」は、例えば新脈管形成タンパク質に結合する、部分的に又は全体的に活性を阻止する、減少させる、防止する、活性化を遅延させる、不活性化させる、脱感作させる、又は新脈管形成タンパク質の活性又は発現を下向き調節する、化合物であり、その一例はアンタゴニストである。「活性化剤」は、新脈管形成タンパク質活性を増大させる、開放する、活性化する、容易にする、活性化を高める、感作する、アゴナイズする（ａｇｏｎｉｚｅ）、又は上向き調節する、化合物である。阻害剤、活性化剤又は調節剤は、新脈管形成タンパク質の遺伝的に改変されたバージョン、例えば変更された活性を有するバージョン、並びに天然に生じる及び合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、抗体、小さな化学分子などを含む。阻害剤及び活性化剤のためのアッセイは、例えば新脈管形成タンパク質をインビトロで、細胞中で、又は細胞膜で発現させること、仮想的な調節剤化合物を適用すること、及び次に上述のようにして活性に対する機能的な効果を測定することを含む。
【００３２】
図面の簡単な記述
図１は、胚の脳内皮細胞部分に対して胚の脳のとり残された部分を比較した場合、及び成体の脳内皮細胞部分に対して成体の脳のとり残された部分を比較した場合の、ｃＤＮＡライブラリーにおける遺伝子のｌｏｇ２発現比での比−比プロットを示す。
図２は、胚の脳、心臓、及び皮膚内皮細胞に対してとり残された胚の部分及びすべての成体内皮細胞及びとり残された部分を比較した場合の、ｃＤＮＡライブラリーにおける遺伝子の平均強度対ｌｏｇ２発現比での比−強度プロットを示す。
図３は、遺伝子ＯＪＣ８００９Ｊ７についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
図４は、２８ｈｐｆでの野生型ゼブラダニオ胚を示す。
図５は、２８ｈｐｆでのＯＪＣ８００９Ｊ７モルファント（ｍｏｒｐｈａｎｔ）胚を示す。
図６は、５６ｈｐｆでの野生型ゼブラダニオ胚を示す。
図７は、５６ｈｐｆでのＯＪＣ８００９Ｊ７モルファント胚を示す。
図８は、４８−５６ｈｐｆでの野生型ゼブラダニオ胚を示す。
図９は、４８−５６ｈｐｆでのＯＪＣ８００９Ｊ７モルファント胚を示す。
図１０は、遺伝子ＨＵＰ８００１Ｋ１７についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
図１１は、２８ｈｐｆでのＨＵＰ８００１Ｋ１７モルファント胚を示す。
図１２は、５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００１Ｋ１７モルファント胚を示す。
図１３は、４８−５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００１Ｋ１７モルファント胚を示す。
図１４は、遺伝子ＨＵＰ８００１Ｋ２１についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
図１５は、２８ｈｐｆでのＨＵＰ８００１Ｋ２１モルファント胚を示す。
図１６は、５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００１Ｋ２１モルファント胚を示す。
図１７は、４８−５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００１Ｋ２１モルファント胚を示す。
図１８は、遺伝子ＨＵＰ８００３Ｄ２４についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
図１９は、４８−５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００３Ｄ２４モルファント胚を示す。
図２０は、遺伝子ＨＵＰ８００４Ｎ１についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
図２１は、２８ｈｐｆでのＨＵＰ８００４Ｎ１モルファント胚を示す。
図２２は、５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００４Ｎ１モルファント胚を示す。
図２３は、４８−５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００４Ｎ１モルファント胚を示す。
図２４は、遺伝子ＨＵＰ８０１０Ａ１０についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
図２５は、２８ｈｐｆでのＨＵＰ８０１０Ａ１０モルファント胚を示す。
図２６は、５６ｈｐｆでのＨＵＰ８０１０Ａ１０モルファント胚を示す。
図２７は、４８−５６ｈｐｆでのＨＵＰ８０１０Ａ１０モルファント胚を示す。
図２８は、遺伝子ＮＯＣ８００３Ｌ１７についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
図２９は、２８ｈｐｆでのＮＯＣ８００３Ｌ１７モルファント胚を示す。
図３０は、５６ｈｐｆでのＮＯＣ８００３Ｌ１７モルファント胚を示す。
図３１は、４８−５６ｈｐｆでのＮＯＣ８００３Ｌ１７モルファント胚を示す。
図３２は、遺伝子ＮＯＣ８００９Ｃ９についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
図３３は、２８ｈｐｆでのＮＯＣ８００９Ｃ９モルファント胚を示す。
図３４は、５６ｈｐｆでのＮＯＣ８００９Ｃ９モルファント胚を示す。
図３５は、４８−５６ｈｐｆでのＮＯＣ８００９Ｃ９モルファント胚を示す。
図３６は、遺伝子ＮＯＣ８００９Ｇ２３についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
図３７は、２８ｈｐｆでのＮＯＣ８００９Ｇ２３モルファント胚を示す。
図３８は、５６ｈｐｆでのＮＯＣ８００９Ｇ２３モルファント胚を示す。
図３９は、４８−５６ｈｐｆでのＮＯＣ８００９Ｇ２３モルファント胚を示す。
図４０は、遺伝子ＯＪＣ８００３Ｃ９についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
図４１は、２８ｈｐｆでのＯＪＣ８００３Ｃ９モルファント胚を示す。
図４２は、５６ｈｐｆでのＯＪＣ８００３Ｃ９モルファント胚を示す。
図４３は、４８−５６ｈｐｆでのＯＪＣ８００３Ｃ９モルファント胚を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
詳細な記述
本発明の特定の実施態様が図示されて記述されているが、本発明の精神及び範囲から離れることなしに様々な他の変更及び改変を行うことができることは当業者には自明であろう。それ故、添付の特許請求の範囲においては、本発明の範囲内であるすべてのかかる変更及び改変をカバーすることが意図される。合成方法が特別に記述されていない材料は、商業的に入手可能であるか、又は当業者には周知の方法を用いて調節されることができる。他に明記しない限り、量、パーセント、部、及び割合を含むすべての量は語「約」によって修飾されるものと理解され、量は有意なディジットを示すことは意図されない。他に明記しない限り、冠詞「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は「一つ又はそれ以上」を意味する。引用されたすべての文献は、関連部分において参照としてここに組み込まれる。いかなる文献の引用も、それが本発明に関する従来技術であるという容認として構成されるべきではない。
【００３４】
候補遺伝子の同定
ｃＤＮＡライブラリーは、単離精製された成体及び胚のマウスの脈管断片からｍＲＮＡを収集することによって調製された。収集されたｍＲＮＡは、脈管構造中で発現される遺伝子の幅広い範囲を有するｃＤＮＡライブラリーを開発するために用いられた。マウスの齢の変動のため、脈管遺伝子は異なる時間及び脈管構造における異なる状況で活性なものを代表した。
【００３５】
ｃＤＮＡライブラリーの作成後、マイクロアレイはＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーから固体支持体上に当該技術分野では公知のようにしてプリントすることによって作成された。マイクロアレイは、遺伝子発現プロファイリングによって遺伝子候補を明らかにするために用いられた。成体からの選択された組織及びＥ１８．５胚性マウスは収集された。組織の選択は、抽出のために利用可能なＲＮＡの量及び純度に基づいていた。組織が除去された後、それらは抗体又はレクチンを用いて二つの部分に分離された。第一の部分である内皮細胞画分又はＥＣは、内皮細胞並びに脈管断片に堅固に連結されている周皮細胞及び脈管平滑筋細胞を含んでいた。第二の部分はとり残された部分又はＬＯとも称され、ＥＣが単離された後に残る細胞であった。
【００３６】
成体マウスから、脳及び心臓組織が用いられ、それぞれのＥＣとＬＯの両方が用いられた。胚性マウスからは、脳、心臓及び皮膚が用いられ、それぞれのＥＣとＬＯの両方が用いられた。各画分からのＲＮＡが抽出された。一般的な参照ＲＮＡ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍｏｕｓｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ； Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．）がこの段階で参照目的のために用いられた。単離されたＲＮＡ及び参照ＲＮＡは逆転写され、次に二ラウンドのアンチセンスＲＮＡ増幅によって二度増幅された。単離されたＲＮＡは蛍光色素シアニン−３で標識され、参照ＲＮＡはシアニン−５で標識された。
【００３７】
標識後、ＲＮＡは上述のようなマイクロアレイでのハイブリダイゼーションによりアッセイされた。ハイブリダイズしたマイクロアレイは走査され、画像分析は実験データを処理するために用いられた。シグナル強度ベースの正規化アルゴリズムによるデータの正規化は、異なって発現する遺伝子の統計学的評価を可能にした。異なる発現を示す遺伝子はさらなる分析のために選択された。
【００３８】
異なる発現を有する遺伝子の選択
上述のようにして収集されたデータを用いて、特定の遺伝子が血管で選択的に発現されるものとして指定された。これは、成体及び胚のＥＣ及びＬＯ値の間の比較に基づいていた。図１は胚性脳ＥＣとＬＯ遺伝子の間の及び成体の脳のＥＣとＬＯ遺伝子の間の比較により得られたデータ値の比率−比率プロットを示す。全胚性ＥＣと全成体ＥＣとの比較も行われたが、データは示していない。「ＤＴ１候補」又は「ＤＴ２候補」で表されるデータ点は一般的に上向き調節されていた（＞０ ｌｏｇ２発現比）。
【００３９】
他の遺伝子は、データの異なる比較により新脈管形成中に選択的に発現されるものとして指定された。全胚性ＥＣ部分（即ち、脳、心臓及び皮膚のＥＣ部分）は、全胚性ＬＯ部分及び全ての成体ＲＮＡ（脳及び心臓の両方のＥＣ及びＬＯ）を含む全ての残りの組織に対して比較された。図２は、全ての遺伝子の平均強度に対するｌｏｇ２発現比率での比率−強度プロットを示す。ＤＴ３候補及びＤＴ４候補としてマークされたデータ点は、この選択分析により上向き調節されることが示された遺伝子である。比較は、全てのＥＣ部分に対して全てのＬＯ部分を分析するためにも行われたが、そのデータは示さない。
【００４０】
関心のある１０個の遺伝子の全てはさらなる分析のために選択された。各遺伝子についての特異的な発現データは、その遺伝子の発現プロファイルを示すグラフ全体に従い、このグラフを含む。表は、マイクロアレイシグナル、ｌｏｇ２発現比率、Ｐ−値及びランク（特定のフィールドのためのみに与えられたランク）の強度を示すために用いられる。発現比率の値に基づいて、最高のランクは最高の発現比率の値を有する遺伝子に与えられ、最底のランクは最底の発現比率の値を有する遺伝子に与えられた。Ｐ−値は０〜１の値として与えられる。１に近い値は、遺伝子が上向き調節されていることを示し、０に近い値は統計的な下向き調節された遺伝子を示す。０．０５という統計的に有意なＰ−値は、０．０５又は０．９５のＰ−値に相当する。
【００４１】
グラフ、表及び本文について、省略語ｅｅｃ／ｒは胚のＥＣ部分対すべての残りの部分に言及し、ｅｃ／ｌｏはすべてのＥＣ部分対すべてのＬＯ部分に言及し、ａｂｅｃｌｏは成体の脳ＥＣ部分対成体の脳ＬＯ部分に言及し、ａｂｅｃｅｂｅｃは成体の脳ＥＣ部分対胚の脳ＥＣ部分に言及し、ａｈｅｃｌｏは成体の心臓ＥＣ部分対成体の心臓ＬＯ部分に言及し、ｅｂｅｃｌｏは胚の脳ＥＣ部分対胚の脳ＬＯ部分に言及し、ｅｈｅｃｌｏは胚の心臓ＥＣ部分対胚の心臓ＬＯ部分に言及し、ｅｓｅｃｌｏは胚の皮膚ＥＣ部分対胚の皮膚ＬＯ部分に言及する。
【００４２】
選択された遺伝子の評価
選択された遺伝子のさらなる分析は、ゼブラダニオにおけるノックダウン技術により行われた。この方法は、標的化されたｍＲＮＡ分子からの翻訳を阻止する特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を含む。これは、関心のある遺伝子の阻害を可能にし、ゼブラダニオの発達及び健康における遺伝子機能の決定を可能にする。ゼブラダニオは、マウス及びヒトの如き哺乳類脊椎動物と脊椎機能のための遺伝子を共有する。研究は、ゼブラダニオにおける器官及び／又は組織発達は、ヒトにおける効果を信頼をもって予測することができるということを示した（とりわけ、Ｓｈｉｎ ａｎｄ Ｆｉｓｈｍａｎ、 Ｆｒｏｍ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｔｏ ｈｕｍａｎｓ： Ｍｏｄｕｌａｒ ｍｅｄｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｓ、 Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔ． ２００２： ３：３１１−３４０； Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．、 Ａｎ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｌｉｂｒａｒｙ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ２００１ Ｓｅｐ； １１（９）：１５９４−６０２を参照）。それらの迅速な外部発達のため、ゼブラダニオの胚の発達は容易に監視され分析されることができる。卵黄嚢の存在は、マウスの如き他の研究生物で可能なよりもはるかに正確に欠失胚の発達からのデータを与えるのに役立つ。
【００４３】
胚を調製するために、標的遺伝子のゼブラダニオ相同物が同定された。次に、特定のモルホリノホスホロジアミデートオリゴヌクレオチドが、標的遺伝子のスプライスアクセプター／ドナー部位又はＡＵＧ開始コドンに適合するように設計された。モルホリノのストック溶液を作成するため、１００ｎｍｏｌのホスホロジアミデートオリゴヌクレオチドを含むペレットが３３．３μｌのｍｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解され、２５ｍｇ／ｍｌの濃度を与え、−２０℃で保存された。注入溶液を作成するため、８μｌのストック溶液は、９２μｌの滅菌濾過された１ＸのＤａｎｉｅｕ緩衝液（５８ｍＭのＮａＣｌ、０．７ｍＭのＫＣｌ、０．４ｍＭのＭｇＳＯ４、０．６ｍＭのＣａ（ＮＯ３）２、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６）（この緩衝液は、１５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０を補充されている）に添加された。２ｍｇ／ｍｌの注入溶液も−２０℃で保存された。
【００４４】
注入中、材料及び胚は約２８℃に維持された。注入針は、注入時間が１００〜６００ｍ秒の範囲内に最適化されることができるように較正された。一細胞段階から初期の八細胞段階までの胚が用いられた。モルホリノは卵黄嚢中に微小注入された。特定の注入体積又はモルホリノの効果的な用量は以下に記述される。典型的な初期用量は３，６及び１２ｎｇ（それぞれ１．５，３及び６ｎｌ）を含んでいた。３ｎｌ用量での毒性は、０．５，１及び２ｎｇ（それぞれ１，２及び４ｎｌ）の続く用量を生じた。約４０個の胚が各用量レベルで注入され、約４０個の胚が非注入のコントロールとして保持された。
【００４５】
モルホリノが受精した卵細胞に注入された後、特定の遺伝子のノックダウンを有するように遺伝子改変された胚は発達させられた（Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ ａｎｄ Ｅｋｋｅｒ、 Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ‘ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ’ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ、 Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｖｏｌ ２６， Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０００を参照）。胚は、形態を調査すること及び発達中の組織の特定の分析及びアッセイを行うことの両方によって発達中監察された。
【００４６】
単回のモルホリノ注入に加えて、二回のモルホリノ注入も同様に行われた。二回の注入のための特定の注入体積は以下に記述される。最初の注入した日の終わりに、胚は胞胚形成又は原腸胚形成段階にあり、プロピルチオウラシル（ＰＴＵ）の２Ｘ溶液が胚に添加され、それらの懸濁体積を倍化した。受精の４８時間後（ｈｐｆ）、二回注入された胚はインシチューハイブリダイゼーションのためにカドヘリン５（ｃｄｈ５）で固定された。
【００４７】
二回注入された胚の２０％以上がｃｄｈ５で観察される脈管構造において低い効果欠失を示した場合、又は１０％以上の胚が中程度の又は高い効果欠失を示した場合、微小脈管障害及びｆｌｉ−１、ｆｌｋ−１、ｆｌｔ−４、ｔｉｅ−１、ｔｉｅ−２、及びｃｄｈ５を用いたインシチューハイブリダイゼーションが行われた。少なくとも１２０個の胚が二回モルホリノ用量を投与され、そのうち少なくとも１００個が上述の分子マーカーを用いたインシチューハイブリダイゼーションのために２４ｈｐｆで収集された。残りの胚は微小脈管障害のために用いられた。
【００４８】
１０個の標的の各々の評価に特異的なデータが以下に記述される。一般的に、形態観察は、胚がコントロールの胚に対して一般的な遅延を示すかどうかの徴候が含まれる２４〜２８ｈｐｆで行われた。さらに、細胞死のタイプ及び度合いが記録され、一般的な胚の形状及び脳の形態も同様に記録された。最後に、卵黄嚢水腫はもし存在するなら、心臓の形態と同様に評価されて記録された。
【００４９】
また、約２４ｈｐｆで、二回モルホリノ胚はｆｌｉ−１、ｆｌｋ−１、ｆｌｔ−４、ｔｉｅ−１、ｔｉｅ−２及びｃｄｈ５のインシチューハイブリダイゼーションのために評価された。全体の形態及びコントロールの胚と比較した体節間の脈管における染色の減少度合い（失われた発現の割合に相関する）が注目された。体節間発現の１〜３５％の損失を示す胚は低い効果を有するとみなされ、体節間発現の３６〜７０％の損失を示す胚は中程度の効果を有するとみなされ、体節間発現の７１〜１００％の損失を示す胚は高い効果を有するとみなされた。
【００５０】
４８〜５６ｈｐｆに、一般的な胚の形状、細胞死の度合い、血液循環、及び心臓の形態の如き様々なパラメータが調査されて記録された。ｃｄｈ５で固定された胚については、染色は上述のような脈管構造中で評価された。
【００５１】
微小脈管障害も二回モルホリノ胚で４８ｈｐｆに評価された。血管を観察するために、胚はトリカイン溶液中に移され、静脈洞／一般的な心臓の静脈が１０μｌのＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ溶液（２００００００Ｄａ、２０ｍｇ／ｍｌ）を注入された。
【００５２】
遺伝子ＯＪＣ８００９Ｊ７
配列番号１で示される配列を有する遺伝子は、マイクロアレイデータに基づいて血管において選択的に発現するものとして同定された（図３参照）。特定のデータが以下の表１に与えられている。配列及び注釈データベースを利用して、マウスにおける同等の遺伝子（配列番号２）及びヒト相同体（配列番号４）も導出された。これらの配列によってコードされるタンパク質は、それぞれ配列番号３及び５に与えられる。
この発現プロファイルに基づいて、遺伝子はゼブラダニオ胚においてさらに分析された。一つの対応するゼブラダニオ遺伝子が標的化のために同定された。二つのモルホリノ（ｓｚ１７５及びｓｚ１７６）が調製され、それぞれがゼブラダニオ遺伝子に対して標的化された。ｓｚ１７５モルホリノの２ｎｇ及びｓｚ１７６モルホリノの１２ｎｇはそれぞれの受精卵に投与された。胚は、発達させられた。２４ｈｐｆに、６つの異なるプローブを用いた二次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングが行われた。
【００５３】
体節間発現がアッセイにおいて分析され、結果は、用いられたプローブに基づくと少し異なった。プローブｆｌｉ−１は、アッセイされた１４個のモルファント胚のうち７％が低い効果を有し、２９％が高い効果を有し、つまり体節間発現の７１〜１００％の損失であることを明らかにした。プローブｆｌｋ−１、ＶＥＧＦ受容体２は、調査された１２個のモルファントのうち２５％が低い効果を有し、８％が高い効果を有することを示した。プローブｔｉｅ−１は、観察された９個のモルファントのうち１１％が中程度の効果を有し、１１％が高い効果を有することを示した。プローブｃｄｈ５、ＶＥカドヘリンは、観察された１６個のモルファントのうち１９％が低い効果を有し、６％が中程度の効果を有し、１９％が高い効果を有することを示した。プローブｆｌｔ−４、ＶＥＧＦ受容体３は、観察された１０個のモルファントのすべてが正常であり、プローブｔｉｅ−２は、観察された６個のモルファントのすべてが正常であることを示した。
【００５４】
以下の表２はこのデータをまとめる。
【００５５】
２８ｈｐｆに、胚は形態学的に観察された。図５は、２８ｈｐｆでの代表的なモルファント胚を示す。図から明らかなように、特に図４の２８ｈｐｆ野生型胚に照らして観察した場合、モルファントは正常な形態を示していた。５６ｈｐｆに、胚は再び表現型特性について観察され、代表的なモルファント胚が図７に示される。胚において観察された正常な形態は、図７が図６の５６ｈｐｆ野生型胚に照らして観察された場合に容易に理解されることができる。
【００５６】
追加の分析が４８〜５６ｈｐｆのモルファント胚で行われた。１７個のモルファントに対するｃｄｈ５での一次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングは、８８％を正常として示した。減少した体節間発現の中程度の効果は、他の１２％の胚において見られた。モルファントに対する微小脈管障害は、胚の様々な領域におけるＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎの存在を突き止めるために用いられた（図９参照。図９は、図８に示されるようなこの時間段階での野生型胚と比較されることができる）。３３個の胚のうち、心臓及び頭に組み合わされてＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを有するものはなかったが、４％が心臓のみにＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを有していた。減少された体節間脈管構造が１５％の胚で見られた。漏れやすい脈管構造は観察されなかった。正常な胚はサンプルの８１％を占めていた。観察された漏れは、矢印によって示されるように後頭部の血管から生じていた。
【００５７】
遺伝子ＨＵＰ８００１Ｋ１７
配列番号６で示される配列を有する遺伝子は、マイクロアレイデータに基づいて血管において選択的に発現するものとして同定された（図１０参照）。特定のデータが以下の表３に与えられている。配列及び注釈データベースを利用して、マウスにおける同等の遺伝子（配列番号７）及びヒト相同体（配列番号９）も導出された。これらの配列によってコードされるタンパク質は、それぞれ配列番号８及び１０に与えられる。
この発現プロファイルに基づいて、遺伝子はゼブラダニオ胚においてさらに分析された。一つの対応するゼブラダニオ遺伝子が標的化のために同定された。二つの異なるモルホリノ（ｓｚ１４３及びｓｚ１４４）が調製され、それぞれがゼブラダニオ遺伝子に対して標的化された。異なる量のモルホリノは以下に記述されるように投与された。各モルホリノの予め決められた量は、それぞれの受精卵に投与された。胚は、発達させられた。２４ｈｐｆに、６つの異なるプローブを用いた二次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングが行われた。
【００５８】
一つのスクリーニングが、１ｎｇのｓｚ１４３モルホリノ及び４ｎｇのｓｚ１４４モルホリノを受け取った胚で行われた。軸及び体節間脈管発現を分析するために特異的に選択された４つのプローブは以下のことを明らかにした：ｆｌｉ−１プローブを用いると、分析された１７個の胚のうち６％が中程度の体節間発現効果を有していた。他の１８％は高い効果を有していた。プローブｆｌｋ−１、ＶＥＧＦ受容体２は、調査された１５個のモルファントのうち２０％が中程度の、そして１３％が高い効果を有することを示した。プローブｔｉｅ−１によって分析された場合、観察された１６個のモルファントのうち６３％が高い効果を有していた。プローブｃｄｈ５、ＶＥカドヘリンは、観察された２４個のモルファントのうち４％が中程度の効果を有し、別の４％が高い効果を有することを示した。プローブｆｌｔ−４、ＶＥＧＦ受容体３は、観察された１４個のモルファントのすべてが正常であり、プローブｔｉｅ−２は、観察された１８個のモルファントのすべてが正常であることを示した。
【００５９】
他のスクリーニングは、１．５ｎｇのｓｚ１４３モルホリノ及び６ｎｇのｓｚ１４４モルホリノを受け取った胚で行われた。プローブｆｌｉ−１は、分析された１２個のモルファントのうち４２％が高い効果を有することを示した。ｆｌｋ−１プローブは、観察された１３個のモルファントのうち２３％が高い効果を有することを示した。ｔｉｅ−１プローブは、１３個のモルファントのうち５４％が高い効果を有することを示した。プローブｃｄｈ５は、２７個のモルファントのうち１５％が中程度の効果を有し、別の１１％が高い効果を有することを示した。プローブｆｌｔ−４は、観察された１４個のモルファントのすべてが正常であることを示した。プローブｔｉｅ−２は、観察された１８個のモルファントのすべてが正常であることを示した。
【００６０】
以下の表４は上述のデータを要約する。
【００６１】
２８ｈｐｆに、胚は形態学的に観察された。コントロールとして用いられた野生型胚は、予測されたように正常な形態を示した。前に示した通り、図４は２８ｈｐｆでの野生型胚を示す。モルファント胚は１．５ｎｇ用量のｓｚ１４３及び６ｎｇ用量のｓｚ１４４を受け取ったが、すべてが正常な形態を示さなかった。代表的な胚が図１１に示されている。２０個の胚が観察され、そのうち５０％が図１１において矢印の頭で示されるように曲がった体を示し、短い矢印で示されるように卵黄管の伸長を有していた。中程度の細胞死が図１１において長い矢印で示されるように胚の６０％で観察された。最終的に、胚の５０％が卵黄細胞水腫を有していた。
【００６２】
５６ｈｐｆに、胚は再び図６に示される野生型胚を参照して観察された。対応する段階でのモルファントは図１２に示されている。２０個の胚が観察され、９０％が図１２において長い矢印で示されるように曲がった体を示し、短い矢印で示されるように縮小した頭を有していた。矢印の頭で示される心臓周辺の水腫は、胚の９０％で観察され、減少した血液流も胚の９０％で見られた。
【００６３】
追加の分析が、４８〜５６ｈｐｆのモルファント胚で行われた。１ｎｇのｓｚ１４３及び３ｎｇのｓｚ１４４を受け取った１８個のモルファントに対するｃｄｈ５での一次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングは、２８％が低い効果レベルで減少した体節間発現を有し、短く曲がった尾を有することを示した。残りの７２％は正常であった。同じインシチューハイブリダイゼーションスクリーニングが２ｎｇのｓｚ１４３及び６ｎｇのｓｚ１４４を受け取った１１個のモルファントを用いて行われた。これは、９％が低い効果レベルで減少した体節間発現を有し、極めて短い尾を有することを示した。残りの９１％は正常であった。
【００６４】
１．５ｎｇのｓｚ１４３及び６ｎｇのｓｚ１４４を受け取った２６個のモルファントに対する微小脈管障害は、胚の様々な領域でのＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎの存在を突き止めるために用いられた。心臓ではＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎは観察されなかったが、頭及び心臓では３１％の胚がＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを有していた。合計で２７％のモルファントが減少した体節間脈管構造を有しており、漏れやすい脈管構造が３５％の胚で観察された。４２％の胚のみが正常であるように見えた。組み合わせたパーセントは１００％より大きい。何故なら、いくつかの胚は一以上の非正常な特徴を示したからである。図１３は分析された４８〜５６ｈｐｆ胚の代表を示す。矢印は減少された体節間脈管構造の領域を示し、矢印の頭は漏れやすい脈管構造を示す。参考のために、この時間段階での野生型胚が図８に示されている。実験データは、この遺伝子が多くの器官に散らばった細胞によって発現されるが、ＣＮＳで最も明確に見られることを明らかにする。
【００６５】
遺伝子ＨＵＰ８００１Ｋ２１
配列番号１１で示される配列を有する遺伝子は、マイクロアレイデータに基づいて新脈管形成中に選択的に発現するものとして同定された（図１４参照）。特定のデータが以下の表５に与えられている。配列及び注釈データベースを利用して、マウスにおける同等の遺伝子（配列番号１２）及びヒト相同体（配列番号１４）も導出された。これらの配列によってコードされるタンパク質は、それぞれ配列番号１３及び１５に与えられる。
この発現プロファイルに基づいて、遺伝子はゼブラダニオ胚においてさらに分析された。二つの対応するゼブラダニオ遺伝子が標的化のために同定された。二つのモルホリノ（ｓｚ２５７及びｓｚ２５８）が調製され、それぞれがゼブラダニオ遺伝子の一つに対して標的化された。ｓｚ２５７モルホリノの１２ｎｇ及びｓｚ２５８モルホリノの１２ｎｇはそれぞれの受精卵に投与された。胚は、発達させられた。２４ｈｐｆに、６つの異なるプローブを用いた二次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングが行われた。
【００６６】
体節間発現がアッセイにおいて分析され、結果は、用いられたプローブに基づくと少し異なった。プローブｆｌｉ−１は、アッセイされた１５個のモルファント胚のすべてが正常であることを明らかにした。プローブｆｌｋ−１は、調査された１６個のモルファントのうち１３％が低い効果を有し、６％が高い効果を有することを示した。プローブｔｉｅ−１によって分析された場合、観察されたすべての１５個のモルファントは正常であった。プローブｃｄｈ５は、観察されたすべての２６個のモルファントが正常であることを示した。プローブｆｌｔ−４は、観察されたすべての１７個のモルファントが正常であることを示し、プローブｔｉｅ−２は、観察されたすべての２０個のモルファントが正常であることを示した。
【００６７】
以下の表６は、このデータをまとめる。
【００６８】
２８ｈｐｆに、胚は形態学的に観察された。図１５は、２８ｈｐｆでの代表的なモルファント胚を示す。矢印によって示されるように、卵黄嚢水腫は、分析された５５個のモルファントの４７％において観察された。５６ｈｐｆに、総数５３個の胚が観察され、代表的なモルファント胚が図１６に示される。長い矢印で強調されるように、膨張した菱脳が３４％の胚で見出された。短い矢印によって示される卵黄嚢水腫も、胚の５８％において観察された。矢印の頭は、心臓周辺の水腫について調査された場所を示す：それは観察されなかった。
【００６９】
追加の分析が４８〜５６ｈｐｆのモルファント胚で行われた。２０個のモルファントに対するｃｄｈ５での一次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングは、すべてを正常として示した。３１個のモルファントでの微小血管障害は、胚の様々な領域においてＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎの存在を突きとめるために用いられた（図１７参照）。３１個の胚のうち、１９％がＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを心臓に有していたが、心臓及び頭にそれを有するものはなかった。減少した体節間脈管構造は、図１７において矢印で示されるように見られた。高い効果は胚の１９％で観察され、中程度の効果は１３％で、低い効果は２９％で観察された。漏れやすい脈管構造は観察されなかった。正常な胚は、サンプルの１９％を占めた。
【００７０】
遺伝子ＨＵＰ８００３Ｄ２４
配列番号１６で示される配列を有する遺伝子は、マイクロアレイデータに基づいて新脈管形成中に選択的に発現するものとして同定された（図１８参照）。特定のデータが以下の表７に与えられている。配列及び注釈データベースを利用して、マウスにおける同等の遺伝子（配列番号１７）及び二つのヒト相同体（配列番号１９及び２１）も導出された。これらの配列によってコードされるタンパク質は、それぞれ配列番号１８，２０及び２２に与えられる。
この発現プロファイルに基づいて、遺伝子はゼブラダニオ胚においてさらに分析された。三つの対応するゼブラダニオ遺伝子が標的化のために同定された。二つのモルホリノ（ｓｚ１８５及びｓｚ１８６）が調製され、三つのゼブラダニオ遺伝子に対して標的化された。低用量群のためには、ｓｚ１８５モルホリノの３ｎｇ及びｓｚ１８６モルホリノの６ｎｇがそれぞれの受精卵に投与された。二倍用量の群のためには、ｓｚ１８５モルホリノの６ｎｇ及びｓｚ１８６モルホリノの１２ｎｇが投与された。胚は、発達させられた。２４ｈｐｆに、６つの異なるプローブを用いた二次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングが行われた。
【００７１】
体節間発現がアッセイにおいて分析され、結果は、用いられたプローブに基づくと少し異なった。低用量群では、プローブｆｌｉ−１は、アッセイされた１１個のモルファント胚のうち１８％が中程度の効果を有すること、即ち体節間発現の３６〜７０％の損失を有すること、及び１８％が高い効果を有することを明らかにした。プローブｆｌｋ−１は、調査された１１個のモルファントのうち３６％が高い効果を有することを示した。プローブｔｉｅ−１は、観察された１４個のモルファントのうち２９％が高い効果を有することを示した。プローブｃｄｈ５は、観察された１６個のモルファントのうち３１％が高い効果を有し、３１％が中程度の効果を有することを示した。プローブｆｌｔ−４は、観察されたすべての１６個のモルファントが正常であることを示し、プローブｔｉｅ−２は、観察されたすべての１５個のモルファントが正常であることを示した。
【００７２】
高用量群では、プローブｆｌｉ−１は、アッセイされた３個のモルファント胚のうち３３％が低い効果を有し、３３％が中程度の効果を有することを明らかにした。プローブｆｌｋ−１は、１００％又は調査された２個のモルファントのうち１００％、つまり両方が中程度の効果を有することを示した。プローブｃｄｈ５は、観察された７個のモルファントのうち１００％、つまりすべてが高い効果を有することを示した。プローブｆｌｔ−４は、観察されたすべての３個のモルファントが正常であることを示し、プローブｔｉｅ−２は、観察されたすべての７個のモルファントが正常であることを示した。
【００７３】
以下の表８はこのデータをまとめる。
【００７４】
２８ｈｐｆに、胚は形態学的に観察された。細胞死は、観察された６６個の胚のうち７０％で観察された。卵黄嚢水腫はモルファントの２９％で観察された。５６ｈｐｆに、総数６６個の胚が表現型特性について観察された。卵黄嚢水腫は胚の４２％で観察され、３５％は減少したＩＳ血液流を示し、２６％は減少した血液流を示した。
【００７５】
追加の分析が４８〜５６ｈｐｆのモルファント胚で行われた。上述の低用量（３ｎｇのｓｚ１８５、６ｎｇのｓｚ１８６）を受けとった２１個のモルファントに対するｃｄｈ５での一次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングは、５２％を正常として示した。減少した体節間発現の低い効果は、胚の４３％で見られ、中程度の効果は５％で見られた。二倍用量（６ｎｇのｓｚ１８５、１２ｎｇのｓｚ１８６）を受けとった胚は、４８〜５６ｈｐｆに観察されたとき、観察されたその２３個の胚の７４％が正常であることを明らかにした。減少した体節間発現の低い効果は、胚の２２％で見られ、中程度の効果は胚の４％で見られた。
【００７６】
低用量のモルフォリノ（３ｎｇのｓｚ１８５、６ｎｇのｓｚ１８６）を与えられたモルファントに対する微小脈管障害は、胚の様々な領域でのＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎの存在を突きとめるために用いられた（図１９参照）。３３個の胚のうち、心臓に、又は心臓及び頭にＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを有するものはなかった。減少した体節間脈管構造は、図１９において矢印で示されるように見られた。高い効果は胚の６％で観察され、中程度の効果は１５％で、低い効果は３６％で観察された。漏れやすい脈管構造は観察されなかった。正常な胚は、サンプルの４３％を占めた。
【００７７】
これらのデータは、この遺伝子が腎臓の脈管及び上皮構造、並びに心臓弁及び皮膚上皮の大脈管、巨大核細胞の如き多くの場所で発現されることを明らかにする。
【００７８】
遺伝子ＨＵＰ８００４Ｎ１
配列番号２３で示される配列を有する遺伝子は、マイクロアレイデータに基づいて新脈管形成中に選択的に発現するものとして同定された（図２０参照）。特定のデータが以下の表９に与えられている。配列及び注釈データベースを利用して、マウスにおける同等の遺伝子（配列番号２４）及びヒト相同体（配列番号２６）も導出された。これらの配列によってコードされるタンパク質は、それぞれ配列番号２５及び２７に与えられる。
この発現プロファイルに基づいて、遺伝子はゼブラダニオ胚においてさらに分析された。二つの対応するゼブラダニオ遺伝子が標的化のために同定された。二つのモルホリノ（ｓｚ２２３及びｓｚ２２４）が調製され、それぞれがゼブラダニオ遺伝子の一つに対して標的化された。二つの用量計画が用いられた。ｓｚ２２３モルホリノの２ｎｇ及びｓｚ２２４モルホリノの１ｎｇを受けとった第一の用量群はそれぞれの受精卵に投与された。ｓｚ２２３モルホリノの１ｎｇ及びｓｚ２２４モルホリノの０．５ｎｇを受けとった第二の用量群はそれぞれの受精卵に投与された。胚は、発達させられた。２４ｈｐｆに、６つの異なるプローブを用いた二次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングが行われた。
【００７９】
第二の用量群（１ｎｇのｓｚ２２３、０．５ｎｇのｓｚ２２４）からの胚における体節間発現がアッセイにおいて分析され、結果は、用いられたプローブに基づくと少し異なった。プローブｆｌｉ−１は、アッセイされた１５個のモルファント胚のうち７％が低い効果を有し、７％が高い効果を有することを明らかにした。プローブｆｌｋ−１は、調査された１４個のモルファントのうち７％が高い効果を有することを示した。プローブｔｉｅ−１は、観察した１４個のモルファントのうち７％が低い効果を有し、７％が高い効果を有することを示した。プローブｃｄｈ５は、観察された２６個のモルファントのうち８％が中程度の効果を有することを示した。プローブｆｌｔ−４は、観察されたすべての１５個のモルファントが正常であることを示し、プローブｔｉｅ−２は、観察したすべての１５個のモルファントが正常であることを示した。
【００８０】
以下の表１０はこのデータをまとめる。
【００８１】
２８ｈｐｆに、胚は形態学的に観察された。図２１は、２８ｈｐｆでの代表的なモルファント胚を示す。矢印によって示されるように、卵黄嚢水腫は、研究された５９個のモルファントの５６％で観察された。５６ｈｐｆに、総数２０個の胚が表現型特性について観察され、代表的なモルファント胚が図２２に示される。矢印によって示されるように、心臓周辺の水腫は胚の３５％で観察され、６５％は卵黄に血液だまりを有し（これも矢印で示される）、３０％は減少したＩＳ血液流を示した。
【００８２】
追加の分析は、第二の用量群からの４８〜５６ｈｐｆのモルファント胚で行われた。２２個のモルファントに対するｃｄｈ５での一次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングは、すべてを正常として示した。３０個の第二の用量群に対する微小脈管障害は、胚の様々な領域におけるＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎの存在を突きとめるために用いられた（図２３参照）。３０個の胚のうち、１３％はＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを心臓に有し、３％は心臓と頭に有していた。減少した体節間脈管構造は、図２３において矢印で示されるように見られた。高い効果は胚の７％で観察され、低い効果は２０％で観察された。漏れやすい脈管構造は観察されなかった。正常な胚は、サンプルの５７％を占めた。
【００８３】
これらのデータは、この遺伝子が上皮で特異的に発現されることを示す。腎臓において、これは特定の脈管及びいくつかの他の上皮構造によって発現される。肝臓でもいくらかの発現がある。
【００８４】
遺伝子ＨＵＰ８０１０Ａ１０
配列番号２８で示される配列を有する遺伝子は、マイクロアレイデータに基づいて新脈管形成中に選択的に発現するものとして同定された（図２４参照）。特定のデータが以下の表１１に与えられている。配列及び注釈データベースを利用して、マウスにおける同等の遺伝子（配列番号２９）及びヒト相同体（配列番号３１）も導出された。これらの配列によってコードされるタンパク質は、それぞれ配列番号３０及び３２に与えられる。
この発現プロファイルに基づいて、遺伝子はゼブラダニオ胚においてさらに分析された。対応するゼブラダニオ遺伝子が標的化のために同定された。二つのモルホリノ（ｓｚ２６７及びｓｚ２６８）が調製され、それぞれがゼブラダニオ遺伝子の一つに対して標的化された。第一の用量群において、ｓｚ２６７モルホリノの４ｎｇ及びｓｚ２６８モルホリノの２ｎｇがそれぞれの受精卵に投与された。第二の用量群において、ｓｚ２６７モルホリノの６ｎｇ及びｓｚ２６８の３ｎｇが投与された。胚は、発達させられた。２４ｈｐｆに、６つの異なるプローブを用いた二次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングが行われた。
【００８５】
体節間発現がアッセイにおいて分析され、結果は、用いられたプローブに基づくと少し異なった。第一の用量群（４ｎｇのｓｚ２６７、２ｎｇのｓｚ２６８）において、プローブｆｌｉ−１は、アッセイされた１５個のモルファント胚のうち１３％が高い効果を有することを明らかにした。プローブｆｌｋ−１は、調査された１５個のモルファントの３３％が低い効果を有し、２０％が高い効果を有することを示した。プローブｔｉｅ−１は、観察されたすべての１７個のモルファントが正常であることを示した。プローブｃｄｈ５は、観察された２５個のモルファントの８％が高い効果を有することを示した。プローブｆｌｔ−４は、観察されたすべての１３個のモルファントが正常であり、プローブｔｉｅ−２は、観察されたすべての１６個のモルファントが正常であることを示した。
【００８６】
第二の用量群（６ｎｇのｓｚ２６７、３ｎｇのｓｚ２６８）において、プローブｆｌｉ−１は、アッセイされた１６個のモルファント胚のうち２５％が低い効果を有し、１９％が高い効果を有することを明らかにした。プローブｆｌｋ−１は、調査された６個のモルファントの３３％が低い効果を有することを示した。プローブｔｉｅ−１は、観察された１５個のモルファントの６７％が高い効果を有することを示した。プローブｃｄｈ５は、観察された２４個のモルファントの２１％が低い効果を有し、１３％が中程度の効果を有し、２９％が高い効果を有することを示した。プローブｆｌｔ−４は、観察されたすべての１５個のモルファントが正常であり、プローブｔｉｅ−２は、観察されたすべての１５個のモルファントが正常であることを示した。
【００８７】
以下の表１２はこのデータをまとめる。
【００８８】
２８ｈｐｆに、胚は形態学的に観察された。図２５は、２８ｈｐｆでの代表的なモルファント胚を示す。細胞死は、図２５において矢印で示されるように、観察された６１個の胚のうち４７％で観察された。矢印の頭は膨張した菱脳を示し、これは胚の５１％で見られた。中程度の卵黄嚢水腫はモルファントの２１％で観察された。５６ｈｐｆに、総数５９個の胚は表現型特性について観察され、代表的なモルファント胚が図２６に示される。矢印は膨張した菱脳を示し、これは胚の４４％で見られた。中程度の卵黄嚢水腫はモルファントの２９％で観察され、これは矢印の頭で示される。減少したＩＳ血液流は胚の１４％で観察され、減少した血液流は胚の１７％で見出された。
【００８９】
追加の分析は、第二の用量群からの４８〜５６ｈｐｆのモルファント胚で行われた。１９個のモルファントに対するｃｄｈ５での一次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングは、６８％を正常として示した。減少した体節間発現の低い効果は胚の３２％で見られた。モルファントに対する微小脈管障害は、胚の様々な領域におけるＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎの存在を突きとめるために用いられた（図２７参照）。３２個の胚のうち、心臓、又は心臓及び頭にＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを有するものはなかった。減少した体節間脈管構造は、図２７において矢印で示されるように見られた。高い効果は胚の６％で観察され、中程度の効果は３％で、低い効果は３４％で観察された。漏れやすい脈管構造は観察されなかった。正常な胚は、サンプルの５６％を占めた。
【００９０】
遺伝子ＮＯＣ８００３Ｌ１７
配列番号３３で示される配列を有する遺伝子は、マイクロアレイデータに基づいて血管において選択的に発現するものとして同定された（図２８参照）。特定のデータが以下の表１３に与えられている。配列及び注釈データベースを利用して、マウスにおける同等の遺伝子（配列番号３４）及びヒト相同体（配列番号３６）も導出された。これらの配列によってコードされるタンパク質は、それぞれ配列番号３５及び３７に与えられる。
この発現プロファイルに基づいて、遺伝子はゼブラダニオ胚においてさらに分析された。一つの対応するゼブラダニオ遺伝子が標的化のために同定された。二つのモルホリノ（ｓｚ１８０及びｓｚ１８１）が調製され、それぞれがゼブラダニオ遺伝子に対して標的化された。第一の用量群において、ｓｚ１８０の１２ｎｇ及びｓｚ１８１の１ｎｇがそれぞれの受精卵に投与された。第二の用量群において、ｓｚ１８０の１２ｎｇ及びｓｚ１８１の２ｎｇがそれぞれの受精卵に投与された。胚は、発達させられた。２４ｈｐｆに、６つの異なるプローブを用いた二次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングが行われた。
【００９１】
第一の用量群からの胚における体節間発現がアッセイにおいて分析され、結果は、用いられたプローブに基づくと少し異なった。プローブｆｌｉ−１は、アッセイされた１５個のモルファント胚のうち４０％が高い効果を有することを明らかにした。プローブｆｌｋ−１は、調査されたすべての７個のモルファントが正常であることを示した。プローブｔｉｅ−１は、観察されたすべての１５個のモルファントが正常であることを示した。プローブｃｄｈ５は、観察された２０個のモルファントの１５％が低い効果を有し、５％が中程度の効果を有し、３０％が高い効果を有することを示した。プローブｆｌｔ−４は、観察されたすべての１１個のモルファントが正常であり、プローブｔｉｅ−２は、観察されたすべての１６個のモルファントが正常であることを示した。
【００９２】
以下の表１４はこのデータをまとめる。
【００９３】
２８ｈｐｆに、胚は形態学的に観察された。図２９は、代表的なモルファント胚を示す。矢印によって示されるように、卵黄嚢水腫は、研究された４８個のモルファントのうち６７％で観察された。５６ｈｐｆに観察された胚は正常な形態を示し、代表的な胚が図３０に示される。
【００９４】
追加の分析は、第二の用量群からの４８〜５６ｈｐｆのモルファント胚で行われた。１４個のモルファントに対するｃｄｈ５での一次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングは、７９％を正常として示し、残りの２９％は減少した体節間発現の中程度の効果を示した。２９個の第一の用量群のモルファントに対する微小脈管障害は、胚の様々な領域におけるＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎの存在を突きとめるために用いられた（図３１参照）。２９個の胚のうち、心臓にＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを有するものはなく、３％は心臓及び頭にＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを有していた。減少した体節間脈管構造は、図３１において矢印で示されるように見られた。高い効果は胚の７％で観察され、中程度の効果は３％で、低い効果は３８％で観察された。漏れやすい脈管構造は観察されなかった。正常な胚は、サンプルの４５％を占めた。
【００９５】
遺伝子ＮＯＣ８００９Ｃ９
配列番号３８で示される配列を有する遺伝子は、マイクロアレイデータに基づいて新脈管形成中に選択的に発現するものとして同定された（図３２参照）。特定のデータが以下の表１５に与えられている。配列及び注釈データベースを利用して、マウスにおける同等の遺伝子（配列番号３９）及びヒト相同体（配列番号４１）も導出された。これらの配列によってコードされるタンパク質は、それぞれ配列番号４０及び４２に与えられる。
この発現プロファイルに基づいて、遺伝子はゼブラダニオ胚においてさらに分析された。一つの対応するゼブラダニオ遺伝子が標的化のために同定された。二つのモルホリノ（ｓｚ２４１及びｓｚ２４２）が調製され、ゼブラダニオ遺伝子に対して標的化された。ｓｚ２４１モルホリノの３ｎｇ及びｓｚ２４２モルホリノの１ｎｇはそれぞれの受精卵に投与された。胚は、発達させられた。２４ｈｐｆに、６つの異なるプローブを用いた二次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングが行われた。
【００９６】
体節間発現がアッセイにおいて分析され、結果は、用いられたプローブに基づくと少し異なった。プローブｆｌｉ−１は、アッセイされた１５個のモルファント胚のうち７％が中程度の効果を有することを明らかにした。プローブｆｌｋ−１は、調査されたすべての１５個のモルファントが正常であることを示した。プローブｔｉｅ−１は、観察された１５個のモルファントの７％が高い効果を有することを示した。プローブｃｄｈ５は、観察された２０個のモルファントの１５％が低い効果を有することを示した。中程度の効果は５％で見られ、高い効果は１５％で見られた。プローブｆｌｔ−４は、観察されたすべての１５個のモルファントが正常であり、プローブｔｉｅ−２は、観察されたすべての１６個のモルファントが正常であることを示した。
【００９７】
以下の表１６はこのデータをまとめる。
【００９８】
２８ｈｐｆに、胚は形態学的に観察された。図３３は、２８ｈｐｆでの代表的なモルファント胚を示す。穏やかな細胞死は、観察された５３個の胚のうち２５％で観察された。５６ｈｐｆに、５２個の胚は表現型特性について観察され、代表的なモルファント胚が図３４に示される。矢印によって示されるように、心臓周辺の水腫は胚の１３％で見られた。卵黄嚢水腫の領域の方へ向けられた矢印の頭は、胚の２５％で見られる。減少したＩＳ血液流は１３％及び１５％で観察され、減少した軸方向の血液流を示した。
【００９９】
追加の分析は、第二の用量群からの４８〜５６ｈｐｆのモルファント胚で行われた。３１個のモルファントに対するｃｄｈ５での一次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングは、すべてを正常として示した。モルファントに対する微小脈管障害は、胚の様々な領域におけるＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎの存在を突きとめるために用いられた（図３５参照）。２９個の胚のうち、７％が心臓にＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを有し、１４％が心臓及び頭に有していた。減少した体節間脈管構造は、図３５において矢印で示されるように見られた。高い効果は胚の３％で観察され、中程度の効果は３％で、低い効果は２１％で観察された。漏れやすい脈管構造は観察されなかった。正常な胚は、サンプルの５２％を占めた。これらのデータは、この遺伝子が心臓中及び心臓の周り及び選択された器官におけるいくらかの発現を含む器官の周りにおいて発現されることを明らかにする。
【０１００】
遺伝子ＮＯＣ８００９Ｇ２３
配列番号４３で示される配列を有する遺伝子は、マイクロアレイデータに基づいて新脈管形成中に選択的に発現するものとして同定された（図３６参照）。特定のデータが以下の表１７に与えられている。配列及び注釈データベースを利用して、マウスにおける同等の遺伝子（配列番号４４）及びヒト相同体（配列番号４６）も導出された。これらの配列によってコードされるタンパク質は、それぞれ配列番号４５及び４７に与えられる。
この発現プロファイルに基づいて、遺伝子はゼブラダニオ胚においてさらに分析された。一つの対応するゼブラダニオ遺伝子が標的化のために同定された。二つのモルホリノ（ｓｚ１４９及びｓｚ１５０）が調製され、それぞれがゼブラダニオ遺伝子に対して標的化された。第一の用量群において、ｓｚ１４９モルホリノの１．５ｎｇ及びｓｚ１５０モルホリノの１．５ｎｇは受精卵に投与された。第二の用量群において、ｓｚ１４９モルホリノの２ｎｇ及びｓｚ１５０モルホリノの２ｎｇは受精卵に投与された。第三の用量群において、ｓｚ１４９モルホリノの３ｎｇ及びｓｚ１５０モルホリノの３ｎｇは受精卵に投与された。胚は、発達させられた。２４ｈｐｆに、６つの異なるプローブを用いた二次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングが行われた。
【０１０１】
体節間発現がアッセイにおいて分析され、結果は、用いられたプローブに基づくと少し異なった。第一の用量群からの胚を用いた研究では、プローブｆｌｉ−１は、アッセイされた１４個のモルファント胚のうち２１％が高い効果を有することを明らかにした。プローブｆｌｋ−１は、調査されたすべての１６個のモルファントが正常であることを示した。プローブｔｉｅ−１は、観察された２２個のモルファントの３６％が高い効果を有することを示した。プローブｃｄｈ５は、観察された１５個のモルファントの１３％が軸方向発現における破壊を伴う低い効果を有することを示した。プローブｆｌｔ−４は、観察されたすべての１６個のモルファントが正常であり、プローブｔｉｅ−２は、観察されたすべての１３個のモルファントが正常であることを示した。
【０１０２】
第二の用量群からの研究では、プローブｆｌｉ−１は、アッセイされた１５個のモルファント胚のうち１３％が中程度の効果を有し、２７％が高い効果を有することを明らかにした。プローブｆｌｋ−１は、調査された１５個のモルファントのうち７％が低い効果を有し、７％が中程度の効果を有し、２０％が高い効果を有することを示した。プローブｔｉｅ−１は、観察された１３個のモルファントの６２％が高い効果を有することを示した。プローブｃｄｈ５は、観察された１２個のモルファントの２５％が高い効果を有し、いくつかのモルファントは軸方向発現における破壊を有することを示した。プローブｆｌｔ−４は、観察された１５個のモルファントの１３％が軸方向脈管において低い効果を有し、軸方向発現における破壊及び重度に異常形成された尾を含むことを示した。プローブｔｉｅ−２は、観察されたすべての８個のモルファントが正常であることを示した。
【０１０３】
以下の表１８はこのデータをまとめる。
【０１０４】
２８ｈｐｆに、胚は形態学的に観察された。図３７は、２８ｈｐｆでの代表的なモルファント胚を示す。矢印によって示されるように、細胞死は、観察された２０個の胚の４０％で観察された。矢印の頭によって示されるように、卵黄嚢水腫はモルファントの５５％で観察された。曲がった体はモルファントの４０％で見られた。５６ｈｐｆに、総数２０個の胚は表現型特性について観察され、代表的なモルファント胚は図３８に示される。矢印によって示されるように、心臓周辺の水腫はモルファントの５５％で観察された。矢印の頭は卵黄嚢水腫の方を示し、これはモルファントの５５％で観察された。曲がった体は胚の３０％で報告された。
【０１０５】
追加の分析は、４８〜５６ｈｐｆのモルファント胚で行われた。第一の用量群からの２２個のモルファントに対するｃｄｈ５での一次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングは、９０％を正常として示した。減少した体節間発現及び曲がった体の胚の低い効果は胚の５％で見られ、極めて短い尾を有する高い効果は胚の５％で見られた。第三の用量群からの２０個のモルファントに対するｃｄｈ５での一次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングは、８０％を正常として示した。減少した体節間発現の低い効果は胚の５％で見られ、中程度の効果は胚の１５％で見られた。
【０１０６】
モルファントに対する微小脈管障害は、胚の様々な領域におけるＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎの存在を突きとめるために用いられた（図３９参照）。２５個の胚のうち、心臓、又は心臓及び頭にＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを有するものはなかった。減少した体節間脈管構造は、図３９において矢印で示されるように胚の２４％で見られた。漏れやすい脈管構造は観察されなかった。正常な体節間脈管の例においてサンプルの７６％を占める正常な胚は、矢印の頭によって示される。
【０１０７】
遺伝子ＯＪＣ８００３Ｃ９
配列番号４８で示される配列を有する遺伝子は、マイクロアレイデータに基づいて血管において選択的に発現するものとして同定された（図４０参照）。特定のデータが以下の表１９に与えられている。配列及び注釈データベースを利用して、マウスにおける同等の遺伝子（配列番号４９）及びヒト相同体（配列番号５１）も導出された。これらの配列によってコードされるタンパク質は、それぞれ配列番号５０及び５２に与えられる。
この発現プロファイルに基づいて、遺伝子はゼブラダニオ胚においてさらに分析された。一つの対応するゼブラダニオ遺伝子が標的化のために同定された。二つのモルホリノ（ｓｚ１２９及びｓｚ１３０）が調製され、それぞれがゼブラダニオ遺伝子に対して標的化された。第一の用量群において、ｓｚ１２９モルホリノの３ｎｇ及びｓｚ１３０モルホリノの４．５ｎｇはそれぞれの受精卵に投与された。第二の用量群において、ｓｚ１２９モルホリノの４ｎｇ及びｓｚ１３０モルホリノの６ｎｇはそれぞれの受精卵に投与された。第三の用量群において、ｓｚ１２９モルホリノの６ｎｇ及びｓｚ１３０モルホリノの８ｎｇはそれぞれの受精卵に投与された。第四の用量群において、ｓｚ１２９モルホリノの６ｎｇ及びｓｚ１３０モルホリノの９ｎｇはそれぞれの受精卵に投与された。胚は、発達させられた。２４ｈｐｆに、６つの異なるプローブを用いた二次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングが行われた。
【０１０８】
体節間発現がアッセイにおいて分析され、結果は、用いられたプローブに基づくと少し異なった。第二の用量群からの胚では、プローブｆｌｉ−１は、アッセイされた１０個のモルファント胚のうち２０％が低い効果を有し、１０％が中程度の効果を有し、１０％が高い効果を有することを明らかにした。プローブｆｌｋ−１は、調査された９個のモルファントの１１％が低い効果を有し、３３％が中程度の効果を有し、１１％が高い効果を有することを示した。プローブｔｉｅ−１は、観察された９個のモルファントの２２％が高い効果を有することを示した。プローブｃｄｈ５は、観察された７個のモルファントの１４％が中程度の効果を有し、１４％が高い効果を有することを示した。プローブｆｌｔ−４は、観察されたすべての９個のモルファントが正常であり、プローブｔｉｅ−２は、観察されたすべての７個のモルファントが正常であることを示した。
【０１０９】
第三の用量群からの胚では、プローブｆｌｉ−１は、アッセイされた１０個のモルファント胚のうち１０％が中程度の効果を有し、５０％が高い効果を有することを明らかにした。プローブｆｌｋ−１は、調査された１２個のモルファントのうち２５％が中程度の効果を有し、２５％が高い効果を有することを示した。プローブｔｉｅ−１は、観察された６個のモルファントの１７％が低い効果を有し、５０％が高い効果を有することを示した。プローブｃｄｈ５は、観察された５個のモルファントの４０％が中程度の効果を有することを示した。プローブｆｌｔ−４は、観察されたすべての９個のモルファントが正常であり、プローブｔｉｅ−２は、観察されたすべての６個のモルファントが正常であることを示した。
【０１１０】
以下の表２０はこのデータをまとめる。
【０１１１】
２８ｈｐｆに、胚は形態学的に観察された。図４１は、２８ｈｐｆでの代表的なモルファント胚を示す。矢印によって示されるように、曲がった体は、観察された２０個のモルファントの３５％で見出された。５６ｈｐｆに、総数２０個の胚は表現型特性について観察され、代表的なモルファント胚は図４２に示される。長い矢印によって示されるように、胚の６０％は関連する膨張した菱脳室を伴う細胞死を有していた。卵黄嚢水腫は、短い矢印によって示されるように、胚の２５％で観察された。矢印の頭は、卵黄嚢水腫を伴う心臓周辺の水腫の欠失を指摘する。
【０１１２】
追加の分析は、４８〜５６ｈｐｆのモルファント胚で行われた。第一の用量群からの１９個のモルファントに対するｃｄｈ５での一次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングは、すべてが正常であることを示した。第四の用量群からの１０個のモルファントに対するｃｄｈ５での一次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングは、９０％のみが正常であることを示し、残りの１０％は曲がった尾を有する低い効果を示した。第三の用量群からの１９個のモルファントに対する微小脈管障害は、胚の様々な領域におけるＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎの存在を突きとめるために用いられた（図４３参照）。１９個の胚のうち、心臓にＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを有するものはなく、１６％が心臓のみにＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを有していた。減少した体節間脈管構造は、胚の３７％で見られた。漏れやすい脈管構造は観察されなかった。正常な胚は、サンプルの４７％を占めた。
【０１１３】
インビボデータから確認される新規の用途
本発明は１０個の遺伝子標的、及びそれに関連するタンパク質に関し、これらはマイクロアレイ評価によって脈管形成又は新脈管形成中に上向き調節されるものとして当初は同定され、続いてゼブラダニオ胚実験を用いてインビボで重大な役割を果たしていることが証明された。これらの遺伝子及びタンパク質は、新脈管形成に関連する状態に向けられた新規の方法及び治療の基礎を形成しうる。例えば、新脈管形成に関連する状態に罹患していると疑われる患者からの生物学的サンプルは、本発明の遺伝子又はタンパク質が患者中で正確な時間、位置及び強度で発現されるかどうかを確認するためにスクリーニングされることができる。かかるスクリーニング方法は特許請求の範囲に記載された発明の一部分を形成する。もし遺伝子及び／又はタンパク質が不適切に発現していると同定されるなら、遺伝子治療又は医薬の如きこの状態を矯正するための治療が、ここで記述される又は当該技術分野で公知の方法及び手順に従って開始されることができる。ここで記述したツールを用いて今や可能であるような特定のデータを用いれば、迅速な診断及び特異的な標的化された治療が可能である。
【０１１４】
想像される一つの種類のスクリーニング方法は、脈管形成又は新脈管形成に関連する状態を有する患者を検出するための遺伝子増幅に基づく。かかる方法は、状態を解明するためにＰＣＲ、インシチューハイブリダイゼーション及び／又はサザーンブロッティング技術を用いることができる。別の種類のスクリーニング方法は、定量的ＰＣＲ、マイクロアレイ、ノーザンブロッティング又はインシチューハイブリダイゼーションの如き公知の技術を用いた遺伝子発現の評価に基づくことができる。用いることができるさらに別の種類のスクリーニング方法は、タンパク質の発現を測定又は監視するものであり、免疫組織化学、ウエスターンブロッティング、ＥＬＩＺＡ又はＦＡＣＳの如き技術を用いて行われることができる。
【０１１５】
もし、新脈管形成に関連する状態が本発明による遺伝子及び／又はタンパク質を含む化合物の投与によって改良されることができることが本発明の方法又は他の方法によって決定されるなら、一以上の遺伝子及び／又はタンパク質は当該技術分野では公知の方法によって一緒に又は逐次的に投与されることができる。
【０１１６】
本発明の単離された核酸分子又はタンパク質は、例えば標準的な直接ペプチド合成技術又は組み換え方法を用いる合成によって得ることができる。タンパク質は、電気泳動精製又はクロマトグラフィー技術の如き当業者には公知の様々な方法で単離又は精製されることができる。
【０１１７】
本発明の化合物の投与は、望ましい作用部位への化合物の送達を可能にするいかなる方法によっても行われることができる。これらの方法は、経口投与、十二指腸内投与、非経口注射（静脈内、皮下、筋肉内、脈管内又は注入を含む）及び局所投与を含む。
【０１１８】
遺伝子治療アプローチは、本発明のヌクレオチドを細胞、一群の細胞又は生物中に導入するために用いられることができる。インビボ方法及びエクスビボ方法の両方が利用されることができる。ベクターは典型的にはこの手順で用いられる。非ウイルス性ベクター又はウイルスベクターが用いられることができ、これらは例えば組み換えアデノウイルス又はレトロウイルスであることができる。この用途によれば、望ましい遺伝子はＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルス中に導入され、その例は無毒性のレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、及び免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である。組み換えウイルスは次に標的細胞中に感染される。多数の遺伝子が単一のベクターに組み入れられることができ、又は代わりにそれらは同時に又は逐次的に別個のベクターにおいて標的細胞へと導入されることができる。これらの方法は当該技術分野では公知であり、多数の特許及び公報に記述されている。
【０１１９】
本発明によって予想される遺伝子発現又はタンパク質生産と干渉する別の手段は、小さな干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いることである。ｓｉＲＮＡは関心のある遺伝子、例えば配列番号２に対応するＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む。ｓｉＲＮＡ分子は約１９個のヌクレオチド及び３′末端での約２個のヌクレオチドのオーバーハングからなる。いくつかの好ましい方法は、１９〜２３個のヌクレオチド及び３′オーバーハングを含む。ｓｉＲＮＡは公知の方法によって関心のある細胞（単数又は複数）に導入される。導入後、細胞（単数又は複数）は同じ配列を持つｓｓＲＮＡを破壊する。これは標的化された遺伝子の翻訳の減少又は妨害及びタンパク質生産の対応する減少又は妨害を生じる。
【０１２０】
投与される活性化合物の量は、治療される患者、障害又は状態の重篤度、投与の割合、及び化合物の性質を評価した後に決定されることができる。用量はすべてを一度に投与されることができるし、又は不連続の時間期間にわたって分散されることもできる。
【０１２１】
本発明の化合物は、単独の治療として適用されることができるし、又は一以上の他の活性な医薬剤を含むこともできる。組成物は、当該技術分野では公知の担体、アジュバント、緩衝液、又は賦形剤を含むことができる。もし望ましいのなら、組成物は香味剤、甘味剤、結合剤、染料、潤滑剤、香料、増粘剤、安定化剤、乳化剤、分散剤、懸濁剤、保存剤、及びｐＨ調節剤の如き成分をさらに含むことができる。組成物はいかなる好適な形態であることもでき、例えば錠剤、カプセル、丸薬、粉末、徐放性処方、溶液、懸濁剤、乳液、軟膏、又はクリームの形態であることができる。組成物は滅菌されていることができる。特定量の活性化合物を有する様々な医薬組成物の調製方法は公知であるか又は当業者には明らかである。記述されてきた本発明の医薬組成物は脈管形成治療及び新脈管形成治療を必要とするすべての疾患に適用されることができる。
【０１２２】
例えば、新脈管形成に関連する疾患の一つの治療方法は、虚血組織に脈管形成を起こさせるために用いられる本発明による組成物を含む。ある組織が望ましくない脈管閉塞からの虚血傷害に罹る危険性があるかどうかを決定するためには多くの方法がある。かかる方法は当該技術分野では周知であり、例えば心筋の疾患を評価するためのＭＲＩの如き画像形成技術を含む。本発明の組成物をどこに及びいつ適用するかどうかを決定した後、組成物は脈管閉塞に罹る危険性がある組織における脈管形成を増大させるために投与されることができる。これは、かかる組織において虚血を防止及び／又は緩和する効果的な手段であることができる。虚血が緩和された度合いを評価して測定するための方法は当該技術分野では公知である。
【０１２３】
本発明によるさらなる治療方法は、患者の心臓の機能及び虚血の度合いを可視化、測定及び／又は評価するいかなる公知技術の使用も含む。かかる評価は治療開始に先立って、治療中に、治療が完了した後に、又はいくつかのもしくは全ての段階でなされることができる。かかる技術の例は心エコー検査、心脈管核画像法、磁気共鳴画像法、及び対比血管造影法を含む。
【０１２４】
本発明は脈管形成及び新脈管形成の理解、及びこれらに関連する状態の治療に向かって進んでいるが、これらの状態をさらに理解することに対する必要性が当該技術分野ではなお存在する。それ故、本発明は、分析及び実験のために用いられることができる非ヒトトランスジェニック動物の作成及び使用をさらに予想する。それ故、ここに記述される遺伝子に対応する突然変異、ノックアウト又は改変遺伝子を含むトランスジェニック動物も本発明に含まれる。トランスジェニック動物は、組み換え、外来性又はクローニングされた遺伝子材料が実験的に移入されている遺伝的に改変された動物である。かかる遺伝子材料は導入遺伝子としばしば称される。導入遺伝子の核酸配列は、特定の核酸配列が正常状態では見出されないゲノムの遺伝子座に、又は導入遺伝子のための通常の遺伝子座に組み入れられることができる。導入遺伝子は標的動物の種と同じ種のゲノム又は標的動物の種とは異なる種のゲノムから由来する核酸配列からなることができる。
【０１２５】
トランスジェニック動物は、当該技術分野では公知のようなトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、胚性幹細胞における遺伝子標的化及び組み換えウイルス及びレトロウイルス感染を含む様々な異なる方法によって作成されることができる。組み換えコンピーテント哺乳類細胞中への核酸フラグメントの導入方法は、多数の核酸分子の共形質転換に好都合であるいかなる方法であることもできる。トランスジェニック動物を作成するための詳細な手順は当業者に利用可能であり、例えば米国特許第５４８９７４３号及び第５６０２３０７号が挙げられる。
【０１２６】
トランスジェニック技術は、上述の１０個の遺伝子の一以上を欠失している動物を作成するために用いられることができる。かかるノックアウト動物は、欠失された遺伝子のタイミング及び機能を解明するために、野生型又はコントロールの動物からのデータに対してそれらの成長及び発育が測定される時に特に使用されることができる。さらに、これらの動物は新脈管形成に関連する疾患状態を示すように改変されることができ、かくして選択された疾患の進行における特定の遺伝子の役割の理解をさらに進めることができる。この知識は、技術の進歩をもたらし、疾患の予防、管理及び治療のための新規の治療方法を保証することに導く。
【０１２７】
本発明によるトランスジェニック動物のさらなる使用は、研究生物における上述の同定された遺伝子の一以上をこの遺伝子のヒト相同体で置換することを含む。例えば、配列番号７に相当する遺伝子がそのヒト相同体である配列番号９で置換されたトランスジェニックマウスである。効果的な薬物治療への研究は動物モデルで行われることができるということは受け入れられているが、かかるトランスジェニックマウスは、ヒトでの使用のための潜在的な医薬候補への一層効果的なスクリーニングツールであることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】胚の脳内皮細胞部分に対して胚の脳のとり残された部分を比較した場合、及び成体の脳内皮細胞部分に対して成体の脳のとり残された部分を比較した場合の、ｃＤＮＡライブラリーにおける遺伝子のｌｏｇ２発現比での比−比プロットを示す。
【図２】胚の脳、心臓、及び皮膚内皮細胞に対してとり残された胚の部分及びすべての成体内皮細胞及びとり残された部分を比較した場合の、ｃＤＮＡライブラリーにおける遺伝子の平均強度対ｌｏｇ２発現比での比−強度プロットを示す。
【図３】遺伝子ＯＪＣ８００９Ｊ７についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
【図４】２８ｈｐｆでの野生型ゼブラダニオ胚を示す。
【図５】２８ｈｐｆでのＯＪＣ８００９Ｊ７モルファント胚を示す。
【図６】５６ｈｐｆでの野生型ゼブラダニオ胚を示す。
【図７】５６ｈｐｆでのＯＪＣ８００９Ｊ７モルファント胚を示す。
【図８】４８−５６ｈｐｆでの野生型ゼブラダニオ胚を示す。
【図９】４８−５６ｈｐｆでのＯＪＣ８００９Ｊ７モルファント胚を示す。
【図１０】遺伝子ＨＵＰ８００１Ｋ１７についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
【図１１】２８ｈｐｆでのＨＵＰ８００１Ｋ１７モルファント胚を示す。
【図１２】５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００１Ｋ１７モルファント胚を示す。
【図１３】４８−５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００１Ｋ１７モルファント胚を示す。
【図１４】遺伝子ＨＵＰ８００１Ｋ２１についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
【図１５】２８ｈｐｆでのＨＵＰ８００１Ｋ２１モルファント胚を示す。
【図１６】５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００１Ｋ２１モルファント胚を示す。
【図１７】４８−５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００１Ｋ２１モルファント胚を示す。
【図１８】遺伝子ＨＵＰ８００３Ｄ２４についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
【図１９】４８−５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００３Ｄ２４モルファント胚を示す。
【図２０】遺伝子ＨＵＰ８００４Ｎ１についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
【図２１】２８ｈｐｆでのＨＵＰ８００４Ｎ１モルファント胚を示す。
【図２２】５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００４Ｎ１モルファント胚を示す。
【図２３】４８−５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００４Ｎ１モルファント胚を示す。
【図２４】遺伝子ＨＵＰ８０１０Ａ１０についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
【図２５】２８ｈｐｆでのＨＵＰ８０１０Ａ１０モルファント胚を示す。
【図２６】５６ｈｐｆでのＨＵＰ８０１０Ａ１０モルファント胚を示す。
【図２７】４８−５６ｈｐｆでのＨＵＰ８０１０Ａ１０モルファント胚を示す。
【図２８】遺伝子ＮＯＣ８００３Ｌ１７についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
【図２９】２８ｈｐｆでのＮＯＣ８００３Ｌ１７モルファント胚を示す。
【図３０】５６ｈｐｆでのＮＯＣ８００３Ｌ１７モルファント胚を示す。
【図３１】４８−５６ｈｐｆでのＮＯＣ８００３Ｌ１７モルファント胚を示す。
【図３２】遺伝子ＮＯＣ８００９Ｃ９についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
【図３３】２８ｈｐｆでのＮＯＣ８００９Ｃ９モルファント胚を示す。
【図３４】５６ｈｐｆでのＮＯＣ８００９Ｃ９モルファント胚を示す。
【図３５】４８−５６ｈｐｆでのＮＯＣ８００９Ｃ９モルファント胚を示す。
【図３６】遺伝子ＮＯＣ８００９Ｇ２３についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
【図３７】２８ｈｐｆでのＮＯＣ８００９Ｇ２３モルファント胚を示す。
【図３８】５６ｈｐｆでのＮＯＣ８００９Ｇ２３モルファント胚を示す。
【図３９】４８−５６ｈｐｆでのＮＯＣ８００９Ｇ２３モルファント胚を示す。
【図４０】遺伝子ＯＪＣ８００３Ｃ９についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
【図４１】２８ｈｐｆでのＯＪＣ８００３Ｃ９モルファント胚を示す。
【図４２】５６ｈｐｆでのＯＪＣ８００３Ｃ９モルファント胚を示す。
【図４３】４８−５６ｈｐｆでのＯＪＣ８００３Ｃ９モルファント胚を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１２９】
配列番号１１，２３及び３３中、ｎはａ、ｃ、ｇ又はｔである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は脈管形成及び／又は新脈管形成に関与するポリペプチド及びそれによってコードされるタンパク質に関する。これらの薬剤は、新脈管形成に関連する状態の診断及び治療において用いられる材料及び方法を製造するときに標的化されることができる。さらに、本発明はかかる診断及び治療方法及び薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
脈管形成（動脈及び静脈を含む相互作用脈管系の発達）及び新脈管形成（新しい血管の形成）の両者は、胚の発達において役割を果たしている。対照的に、新脈管形成は正常な成人においては胎盤、卵巣、子宮内膜、及び創傷治癒部位に限定されている。新脈管形成又はその不存在は、様々な病気の状態の維持において重要な役割を果たしている。これらの状態のいくつかは新生血管形成によって特徴付けられる（例えば癌、糖尿病性網膜症、緑内障、及び加齢に関連する黄斑変性）。他の状態は例えば脳卒中、不妊症、心臓病、潰瘍、及び強皮症であり、これらは新脈管形成の不十分さによる疾患である。
【０００３】
新脈管形成は多数の段階を有する（例えばＺｈｕ ａｎｄ Ｗｉｔｔｅ、Ｉｎｖｅｓｔ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ １７：１９５−２１２、１９９９を参照）。新脈管形成の初期段階は、内皮細胞プロテアーゼ生産、細胞の移動、及び増殖を含む。初期段階は、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−Ａ及び全てが仮想的な役割を果たす選択されたケモカインと共にいくつかの成長因子を必要とするようにも思える。新脈管形成の後期の段階は、壁細胞（周皮細胞又は平滑筋細胞）を有する脈管の集団化、基底膜の生成、及び脈管床の分化の誘導を含む。脈管形成の最終段階は、リモデリングとして知られるものを含み、そこでは形成された脈管構成が安定な成熟した脈管床になる。従って、この過程は極めて動的であり、遺伝子発現の調和した空間的及び時間的な波をしばしば必要とする。
【０００４】
複雑な新脈管形成の過程は、一以上の重要な工程との干渉を通して妨害され、多数の病気の状態がこの妨害によって生じ又は悪化されうる。制御されない新脈管形成は病気を引き起こし又は悪化させることがあり、例えば目の新生脈管形成は失明の最も一般的な原因であることが明らかになっており、約２０もの目の病気の病因の根底にある。関節炎の如き特定の従来から存在する状態では、新たに形成された毛細血管は関節に浸入し、軟骨を破壊する。糖尿病では、網膜に形成された新しい毛細管は硝子体液に浸入し、出血と失明の原因になる。
【０００５】
制御されない新脈管形成に関連する病気に加えて、不十分な新脈管形成も望ましくない結果に導きうる。死んだ又は損傷された組織は多数の病気に導くことがあり、健康な正常な新脈管形成過程を通した損傷組織の再脈管形成は、さらなる合併症を防止するために必須である。
【０００６】
それ故、新脈管形成を阻害するか又は高める新しい標的及び治療が必要とされる。新脈管形成のいずれかの段階に関与するより重要な要因の同定は、新脈管形成に関連する病気の状態のための新しい診断方法に導くことがありうる。さらに、新脈管形成に関与する重要な要因の解明及び理解は、新脈管形成に関連する状態のための潜在的な治療方法を研究するための新しい方法の基礎を形成することがありうる。
【発明の開示】
【０００７】
上述の目的に従って、本発明は脈管形成及び／又は新脈管形成において重要な役割を有する１０個の核酸配列及び関連するタンパク質を開示する。本発明の一つの目的は、これらの１０個の新規の要因を新脈管形成に関連する病気の状態における治療的介入のための分子標的として用いるためのアプローチを提示することである。本発明のさらなる目的は、新脈管形成又は新脈管形成に関連する状態を調節する能力について化合物をスクリーニングするために用いることができる材料及び方法を提供することである。
【０００８】
ここで同定される配列及びタンパク質を特異的に標的とする治療も、脈管形成又は新脈管形成を調節する薬剤又は組成物として提供される。
【０００９】
本発明の一実施態様によれば、配列番号２，４，７，９，１２，１４，１７，１９，２１，２４，２６，２９，３１，３４，３６，３９，４１，４４，４６，４９及び５１のいずれか一つに記載の単離された核酸分子、又はその断片もしくは類似体であって、脈管形成、新脈管形成、脈管の透過性、内皮細胞の増殖、内皮細胞の分化、内皮細胞の移動、及び内皮細胞の生存からなる群から選択される少なくとも一つの生物学的活性を刺激するか又は阻害する能力を有する単離された核酸分子又はその断片又は類似体、又はストリンジェントな条件下で上述の配列のいずれか一つとハイブリダイズする単離された核酸分子が提供される。本発明は上述の核酸分子の相補物にハイブリダイズする単離された核酸分子、及び上述の単離された核酸に標的化された少なくとも１９塩基対の単離されたｓｉＲＮＡ分子にも関する。
【００１０】
本発明のさらなる実施態様によれば、新規の核酸の一つを含む発現ベクターが提供される。核酸はこの核酸によってコードされるポリペプチドの発現を制御する調節核酸と操作可能なように結合されることができる。
【００１１】
本発明は、上述の核酸を含むように遺伝的に改変された、又は上述の発現ベクターによってトランスフェクトされた宿主細胞をさらに含む。
【００１２】
本発明のさらなる実施態様によれば、上述の発現ベクターを細胞、一群の細胞又は生物に投与する工程を含む、細胞、一群の細胞又は生物における新脈管形成に関連した状態を治療する方法が提供される。
【００１３】
本発明は、上述の核酸分子に対して特異的な反応性を有する抗体をさらに含む。この抗体はポリクローナル又はモノクローナルのものであることができ、蛍光ラベルの如き検出可能なラベルをさらに含むことができる。
【００１４】
本発明のさらなる実施態様によれば、上述の核酸を含む導入遺伝子を含むように遺伝的に改変されたトランスジェニックの非ヒト動物、及び導入遺伝子を含みかつ発現する動物が提供される。
【００１５】
本発明のさらなる実施態様によれば、上述の核酸配列を含む医薬組成物が提供される。この組成物は、脈管形成又は新脈管形成に影響を与えるために細胞、一群の細胞又は生物に投与されることができる。この効果は脈管形成又は新脈管形成を増加又は減少させることであることができ、この方法は細胞、一群の細胞又は生物が新脈管形成に関連する障害を有する場合に用いられることができる。かかる新脈管形成に関連する障害は、癌、網膜症、黄斑変性、角膜の潰瘍、脳卒中、虚血性心臓疾患、不妊症、潰瘍、強皮症、創傷治癒、虚血、心筋梗塞、心筋症、狭心症、不安定なアンギナ、冠動脈硬化症、動脈硬化閉塞、ベルガー病、動脈塞栓症、動脈血栓症、脳血管性閉塞、脳梗塞、脳血栓症、脳塞栓症、ルベオーシス、増殖性硝子体網膜症、慢性炎症、炎症性腸疾患、乾癬、サルコイドーシス、及びリウマチ性関節炎を含む。
【００１６】
本発明のさらなる実施態様によれば、配列番号３，５，８，１０，１３，１５，１８，２０，２２，２５，２７，３０，３２，３５，３７，４０，４２，４５，４７，５０及び５２のいずれか一つに記載のアミノ酸配列に実質的に相当するアミノ酸の配列を含む単離されたポリペプチド、又はその断片もしくは類似体であって、細胞、一群の細胞又は生物における新脈管形成に影響を与える能力を有するポリペプチドが提供される。
【００１７】
本発明は上述のポリペプチドを発現するように遺伝的に改変された宿主細胞、並びにこのポリペプチドと特異的に反応する抗体をさらに含む。この抗体はポリクローナル又はモノクローナルのものであることができ、蛍光ラベルの如き検出可能なラベルをさらに含むことができる。
【００１８】
本発明のさらなる実施態様によれば、上述のポリペプチドをコードする核酸を含む導入遺伝子を含むように遺伝的に改変されたトランスジェニックの非ヒト動物、及び導入遺伝子を含みかつ発現する動物が提供される。
【００１９】
さらに、本発明は上述の単離されたポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、脈管形成又は新脈管形成に影響を与えるために細胞、一群の細胞又は生物に投与されることができる。脈管形成又は新脈管形成は増加又は減少されることができる。この細胞、一群の細胞又は生物は新脈管形成に関連する障害を有することができる。代表的な新脈管形成に関連する障害は上述されている。
【００２０】
本発明のさらなる実施態様によれば、患者の細胞中の新脈管形成に関連する転写物を検出する方法であって、前記方法が、配列番号２，４，７，９，１２，１４，１７，１９，２１，２４，２６，２９，３１，３４，３６，３９，４１，４４，４６，４９及び５１のいずれか一つに記載の配列と少なくとも８０％同一である配列と選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドと患者からの生物学的サンプルを接触させることを含み、前記新脈管形成に関連する転写物はハイブリダイゼーションが検出される場所で検出される。前記ポリヌクレオチドは配列番号２，４，７，９，１２，１４，１７，１９，２１，２４，２６，２９，３１，３４，３６，３９，４１，４４，４６，４９及び５１のいずれか一つに記載の配列を含むことができる。前記生物学的サンプルは組織サンプルであるか又はｍＲＮＡの如き単離された核酸からなることができる。この方法によれば、前記核酸は生物学的サンプルをポリヌクレオチドと接触させる工程に先立って増幅されることができる。さらに、ポリヌクレオチドは固体表面上に固定される。
【００２１】
本発明のさらなる実施態様によれば、脊椎動物において新脈管形成及び脈管形成から選択される少なくとも一つの生物学的活性に影響を与える方法であって、前記方法が、ここに記述されるヌクレオチド又はポリペプチドの新脈管形成又は脈管形成に影響を与えるのに効果的な量を前記生物に投与する工程を含む方法が提供される。前記生物はマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、サル及びヒトの如き哺乳動物であることができる。脈管形成又は新脈管形成は高められ、増大され、阻害され、又は減少されることができる。この方法は、上述したような新脈管形成に関連する障害を有する生物に対して使用することができる。
【００２２】
本発明のさらなる実施態様によれば、配列番号２，４，７，９，１２，１４，１７，１９，２１，２４，２６，２９，３１，３４，３６，３９，４１，４４，４６，４９及び５１のいずれか一つに記載の配列の発現が上向き調節される、一以上の細胞を含む新脈管形成が増大されたトランスジェニックの実験用動物が提供される。配列番号２，４，７，９，１２，１４，１７，１９，２１，２４，２６，２９，３１，３４，３６，３９，４１，４４，４６，４９及び５１のいずれか一つに記載の配列の発現が下向き調節されるか、又は不存在である、一以上の細胞を含む新脈管形成が減少されたトランスジェニックの実験用動物も提供される。
【００２３】
ここで用いられる用語「新脈管形成に関連した状態」又は「新脈管形成に関連した疾患（状態）」は、脈管発達の過剰又は不足によって特徴付けられる状態、又は脈管発達の増加又は減少によって改善される状態を意味する。増加された新脈管形成に関連する障害は以下のものを含むがこれらに限定されない：癌（固形腫瘍、白血病及び腫瘍転移を含む）、良性腫瘍（血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、及び化膿性肉芽腫を含む）、網膜症、黄斑変性、及び角膜の潰瘍。減少された新脈管形成に関連するか又は増加された新脈管形成によって改善することができる病気の状態は以下のものを含むがこれらに限定されない：虚血性心臓疾患、不妊症、潰瘍、強皮症、（不十分な）創傷治癒、虚血、心筋梗塞、心筋症、狭心症、不安定なアンギナ、冠動脈硬化症、動脈硬化閉塞（ＡＳＯ）、ベルガー病、動脈塞栓症、動脈血栓症、脳血管性閉塞、脳梗塞、脳血栓症、脳塞栓症、及び脳卒中。他の新脈管形成に関連する疾患は以下のものを含むがこれらに限定されない：ルベオーシスに関連する疾患（角の新生血管形成）、及び糖尿病に関連するかどうかにかかわらず、増殖性硝子体網膜症のすべての形態を含む繊維状脈管又は繊維状組織の異常な増殖によって引き起こされる疾患、炎症性腸疾患の如き慢性炎症の徴候を有する疾患、乾癬、サルコイドーシス、及びリウマチ性関節炎。
【００２４】
「宿主細胞」は、発現ベクターを含み発現ベクターの複製又は発現を支持する形質転換された細胞又は天然に生じる細胞である。宿主細胞は、培養された細胞、外植片、インビボの細胞などであることができる。宿主細胞はイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の如き原核細胞であるか、又は酵母、昆虫、両生類、又はＣＨＯ、ＨｅＬａなどの如き哺乳類細胞の如き真核細胞であることができる（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ又はウェブサイトｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇを参照）。
【００２５】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」はここでは相互交換可能に用いられ、アミノ酸残基のポリマーに言及する。これらの用語はアミノ酸残基が対応する天然に生じるアミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然に生じるアミノ酸ポリマー、及び天然には生じないアミノ酸ポリマーに適用する。
【００２６】
用語「アミノ酸」は天然に生じるアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に生じるアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体に言及する。天然に生じるアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、並びに後で変性されたアミノ酸（例えばヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタメート、及びＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」は、天然に生じるアミノ酸と同一の基本的化学構造を有する化合物に言及する。かかる類似体は変性されたＲ基（例えばノルロイシン）又は変性されたペプチド骨格を有するが、天然に生じるアミノ酸と同一の基本的化学構造を維持している。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有する化学化合物であるが、天然に生じるアミノ酸と同様の様式で機能する化学化合物に言及する。アミノ酸はそれらの一般的に知られる三文字標記又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓによって推奨される一文字標記で言及されてもよいし、同様に、それらの一般的に受け入れられている一文字コードで言及されてもよい。
【００２７】
ここで用いられる用語「保存的改変」又は「保存的に改変された変異体」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用する。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体は、同一の又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、又は核酸がアミノ酸をコードしない場合には、本質的に同一の配列に言及する。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸がいかなる所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンによって特定されるすべての位置で、コドンはコードされるポリペプチドを変更させることなしに記述された対応するコドンのいずれにも変更されることができる。かかる核酸変異は「サイレント変異」であり、これは保存的に改変された変異の一種である。ポリペプチドをコードするすべての核酸配列は、核酸のいかなる可能なサイレント変異も記述する。当業者は、核酸中の各コドン（メチオニンに対する通常唯一のコドンであるＡＵＧ及びトリプトファンに対する通常唯一のコドンであるＴＧＧを除く）は、機能的に同一の分子を与えるように改変されることができることを認識するであろう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、発現生成物に関して（実際のプローブ配列に関してではなく）それぞれの記述された配列において暗に意味される。
【００２８】
アミノ酸配列について、コードされた配列における単一のアミノ酸又はアミノ酸の小さい割合を変更、付加又は欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列に対する個々の置換、欠失又は付加は、変更が化学的に類似のアミノ酸でのアミノ酸の置換を生じる「保存的に改変された変異体」であるということを当業者は認識するであろう。機能的に類似のアミノ酸を与える保存的置換の表は当該技術分野で周知である。かかる保存的に改変された変異体は、本発明の多型的変異体、種間相同物及び対立遺伝子に追加されるが、これらを除外するものではない。
【００２９】
ここで使用される通り、「ラベル」又は「検出可能な成分」は分光測光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、又は他の物理的手段によって検出可能な組成物に言及する。かかるラベルの例は、３２Ｐ、蛍光色素、電子密度試薬、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、又は例えば放射性ラベルをペプチドに組み入れることによって検出可能にすることができる、又はペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために用いられるハプテン及びタンパク質である。
【００３０】
ここで使用される通り、「ベクター」又は「発現ベクター」は、宿主細胞中で特定の核酸の転写を可能にする特異化された一連の核酸要素と共に組み換え的に又は合成的に生成された核酸構築物に言及する。発現ベクターはプラスミドの一部、ウイルス又は核酸断片であることができる。典型的に、発現ベクターはプロモーターに操作可能なように連結された転写されるべき核酸を含む。
ここで用いられる句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、配列がハイブリダイズする条件に言及する。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、環境が異なれば異なるであろう。当業者は、所定の配列について好適な反応条件を詳述する有意な量の記述材料に対するアクセスを有する。一例はＩｎｎｉｓら（１９９０）の「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ． Ｎ．Ｙ．）である。
【００３１】
ここで使用される通り、新脈管形成性ポリペプチド及びポリペプチド配列及び新脈管形成活性の「阻害剤」、「活性化剤」及び「調節剤」は、阻害性分子、活性化分子、又は調節分子に言及する。「阻害剤」は、例えば新脈管形成タンパク質に結合する、部分的に又は全体的に活性を阻止する、減少させる、防止する、活性化を遅延させる、不活性化させる、脱感作させる、又は新脈管形成タンパク質の活性又は発現を下向き調節する、化合物であり、その一例はアンタゴニストである。「活性化剤」は、新脈管形成タンパク質活性を増大させる、開放する、活性化する、容易にする、活性化を高める、感作する、アゴナイズする（ａｇｏｎｉｚｅ）、又は上向き調節する、化合物である。阻害剤、活性化剤又は調節剤は、新脈管形成タンパク質の遺伝的に改変されたバージョン、例えば変更された活性を有するバージョン、並びに天然に生じる及び合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、抗体、小さな化学分子などを含む。阻害剤及び活性化剤のためのアッセイは、例えば新脈管形成タンパク質をインビトロで、細胞中で、又は細胞膜で発現させること、仮想的な調節剤化合物を適用すること、及び次に上述のようにして活性に対する機能的な効果を測定することを含む。
【００３２】
図面の簡単な記述
図１は、胚の脳内皮細胞部分に対して胚の脳のとり残された部分を比較した場合、及び成体の脳内皮細胞部分に対して成体の脳のとり残された部分を比較した場合の、ｃＤＮＡライブラリーにおける遺伝子のｌｏｇ２発現比での比−比プロットを示す。
図２は、胚の脳、心臓、及び皮膚内皮細胞に対してとり残された胚の部分及びすべての成体内皮細胞及びとり残された部分を比較した場合の、ｃＤＮＡライブラリーにおける遺伝子の平均強度対ｌｏｇ２発現比での比−強度プロットを示す。
図３は、遺伝子ＯＪＣ８００９Ｊ７についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
図４は、２８ｈｐｆでの野生型ゼブラダニオ胚を示す。
図５は、２８ｈｐｆでのＯＪＣ８００９Ｊ７モルファント（ｍｏｒｐｈａｎｔ）胚を示す。
図６は、５６ｈｐｆでの野生型ゼブラダニオ胚を示す。
図７は、５６ｈｐｆでのＯＪＣ８００９Ｊ７モルファント胚を示す。
図８は、４８−５６ｈｐｆでの野生型ゼブラダニオ胚を示す。
図９は、４８−５６ｈｐｆでのＯＪＣ８００９Ｊ７モルファント胚を示す。
図１０は、遺伝子ＨＵＰ８００１Ｋ１７についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
図１１は、２８ｈｐｆでのＨＵＰ８００１Ｋ１７モルファント胚を示す。
図１２は、５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００１Ｋ１７モルファント胚を示す。
図１３は、４８−５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００１Ｋ１７モルファント胚を示す。
図１４は、遺伝子ＨＵＰ８００１Ｋ２１についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
図１５は、２８ｈｐｆでのＨＵＰ８００１Ｋ２１モルファント胚を示す。
図１６は、５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００１Ｋ２１モルファント胚を示す。
図１７は、４８−５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００１Ｋ２１モルファント胚を示す。
図１８は、遺伝子ＨＵＰ８００３Ｄ２４についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
図１９は、４８−５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００３Ｄ２４モルファント胚を示す。
図２０は、遺伝子ＨＵＰ８００４Ｎ１についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
図２１は、２８ｈｐｆでのＨＵＰ８００４Ｎ１モルファント胚を示す。
図２２は、５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００４Ｎ１モルファント胚を示す。
図２３は、４８−５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００４Ｎ１モルファント胚を示す。
図２４は、遺伝子ＨＵＰ８０１０Ａ１０についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
図２５は、２８ｈｐｆでのＨＵＰ８０１０Ａ１０モルファント胚を示す。
図２６は、５６ｈｐｆでのＨＵＰ８０１０Ａ１０モルファント胚を示す。
図２７は、４８−５６ｈｐｆでのＨＵＰ８０１０Ａ１０モルファント胚を示す。
図２８は、遺伝子ＮＯＣ８００３Ｌ１７についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
図２９は、２８ｈｐｆでのＮＯＣ８００３Ｌ１７モルファント胚を示す。
図３０は、５６ｈｐｆでのＮＯＣ８００３Ｌ１７モルファント胚を示す。
図３１は、４８−５６ｈｐｆでのＮＯＣ８００３Ｌ１７モルファント胚を示す。
図３２は、遺伝子ＮＯＣ８００９Ｃ９についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
図３３は、２８ｈｐｆでのＮＯＣ８００９Ｃ９モルファント胚を示す。
図３４は、５６ｈｐｆでのＮＯＣ８００９Ｃ９モルファント胚を示す。
図３５は、４８−５６ｈｐｆでのＮＯＣ８００９Ｃ９モルファント胚を示す。
図３６は、遺伝子ＮＯＣ８００９Ｇ２３についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
図３７は、２８ｈｐｆでのＮＯＣ８００９Ｇ２３モルファント胚を示す。
図３８は、５６ｈｐｆでのＮＯＣ８００９Ｇ２３モルファント胚を示す。
図３９は、４８−５６ｈｐｆでのＮＯＣ８００９Ｇ２３モルファント胚を示す。
図４０は、遺伝子ＯＪＣ８００３Ｃ９についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
図４１は、２８ｈｐｆでのＯＪＣ８００３Ｃ９モルファント胚を示す。
図４２は、５６ｈｐｆでのＯＪＣ８００３Ｃ９モルファント胚を示す。
図４３は、４８−５６ｈｐｆでのＯＪＣ８００３Ｃ９モルファント胚を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
詳細な記述
本発明の特定の実施態様が図示されて記述されているが、本発明の精神及び範囲から離れることなしに様々な他の変更及び改変を行うことができることは当業者には自明であろう。それ故、添付の特許請求の範囲においては、本発明の範囲内であるすべてのかかる変更及び改変をカバーすることが意図される。合成方法が特別に記述されていない材料は、商業的に入手可能であるか、又は当業者には周知の方法を用いて調節されることができる。他に明記しない限り、量、パーセント、部、及び割合を含むすべての量は語「約」によって修飾されるものと理解され、量は有意なディジットを示すことは意図されない。他に明記しない限り、冠詞「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は「一つ又はそれ以上」を意味する。引用されたすべての文献は、関連部分において参照としてここに組み込まれる。いかなる文献の引用も、それが本発明に関する従来技術であるという容認として構成されるべきではない。
【００３４】
候補遺伝子の同定
ｃＤＮＡライブラリーは、単離精製された成体及び胚のマウスの脈管断片からｍＲＮＡを収集することによって調製された。収集されたｍＲＮＡは、脈管構造中で発現される遺伝子の幅広い範囲を有するｃＤＮＡライブラリーを開発するために用いられた。マウスの齢の変動のため、脈管遺伝子は異なる時間及び脈管構造における異なる状況で活性なものを代表した。
【００３５】
ｃＤＮＡライブラリーの作成後、マイクロアレイはＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーから固体支持体上に当該技術分野では公知のようにしてプリントすることによって作成された。マイクロアレイは、遺伝子発現プロファイリングによって遺伝子候補を明らかにするために用いられた。成体からの選択された組織及びＥ１８．５胚性マウスは収集された。組織の選択は、抽出のために利用可能なＲＮＡの量及び純度に基づいていた。組織が除去された後、それらは抗体又はレクチンを用いて二つの部分に分離された。第一の部分である内皮細胞画分又はＥＣは、内皮細胞並びに脈管断片に堅固に連結されている周皮細胞及び脈管平滑筋細胞を含んでいた。第二の部分はとり残された部分又はＬＯとも称され、ＥＣが単離された後に残る細胞であった。
【００３６】
成体マウスから、脳及び心臓組織が用いられ、それぞれのＥＣとＬＯの両方が用いられた。胚性マウスからは、脳、心臓及び皮膚が用いられ、それぞれのＥＣとＬＯの両方が用いられた。各画分からのＲＮＡが抽出された。一般的な参照ＲＮＡ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍｏｕｓｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ； Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．）がこの段階で参照目的のために用いられた。単離されたＲＮＡ及び参照ＲＮＡは逆転写され、次に二ラウンドのアンチセンスＲＮＡ増幅によって二度増幅された。単離されたＲＮＡは蛍光色素シアニン−３で標識され、参照ＲＮＡはシアニン−５で標識された。
【００３７】
標識後、ＲＮＡは上述のようなマイクロアレイでのハイブリダイゼーションによりアッセイされた。ハイブリダイズしたマイクロアレイは走査され、画像分析は実験データを処理するために用いられた。シグナル強度ベースの正規化アルゴリズムによるデータの正規化は、異なって発現する遺伝子の統計学的評価を可能にした。異なる発現を示す遺伝子はさらなる分析のために選択された。
【００３８】
異なる発現を有する遺伝子の選択
上述のようにして収集されたデータを用いて、特定の遺伝子が血管で選択的に発現されるものとして指定された。これは、成体及び胚のＥＣ及びＬＯ値の間の比較に基づいていた。図１は胚性脳ＥＣとＬＯ遺伝子の間の及び成体の脳のＥＣとＬＯ遺伝子の間の比較により得られたデータ値の比率−比率プロットを示す。全胚性ＥＣと全成体ＥＣとの比較も行われたが、データは示していない。「ＤＴ１候補」又は「ＤＴ２候補」で表されるデータ点は一般的に上向き調節されていた（＞０ ｌｏｇ２発現比）。
【００３９】
他の遺伝子は、データの異なる比較により新脈管形成中に選択的に発現されるものとして指定された。全胚性ＥＣ部分（即ち、脳、心臓及び皮膚のＥＣ部分）は、全胚性ＬＯ部分及び全ての成体ＲＮＡ（脳及び心臓の両方のＥＣ及びＬＯ）を含む全ての残りの組織に対して比較された。図２は、全ての遺伝子の平均強度に対するｌｏｇ２発現比率での比率−強度プロットを示す。ＤＴ３候補及びＤＴ４候補としてマークされたデータ点は、この選択分析により上向き調節されることが示された遺伝子である。比較は、全てのＥＣ部分に対して全てのＬＯ部分を分析するためにも行われたが、そのデータは示さない。
【００４０】
関心のある１０個の遺伝子の全てはさらなる分析のために選択された。各遺伝子についての特異的な発現データは、その遺伝子の発現プロファイルを示すグラフ全体に従い、このグラフを含む。表は、マイクロアレイシグナル、ｌｏｇ２発現比率、Ｐ−値及びランク（特定のフィールドのためのみに与えられたランク）の強度を示すために用いられる。発現比率の値に基づいて、最高のランクは最高の発現比率の値を有する遺伝子に与えられ、最底のランクは最底の発現比率の値を有する遺伝子に与えられた。Ｐ−値は０〜１の値として与えられる。１に近い値は、遺伝子が上向き調節されていることを示し、０に近い値は統計的な下向き調節された遺伝子を示す。０．０５という統計的に有意なＰ−値は、０．０５又は０．９５のＰ−値に相当する。
【００４１】
グラフ、表及び本文について、省略語ｅｅｃ／ｒは胚のＥＣ部分対すべての残りの部分に言及し、ｅｃ／ｌｏはすべてのＥＣ部分対すべてのＬＯ部分に言及し、ａｂｅｃｌｏは成体の脳ＥＣ部分対成体の脳ＬＯ部分に言及し、ａｂｅｃｅｂｅｃは成体の脳ＥＣ部分対胚の脳ＥＣ部分に言及し、ａｈｅｃｌｏは成体の心臓ＥＣ部分対成体の心臓ＬＯ部分に言及し、ｅｂｅｃｌｏは胚の脳ＥＣ部分対胚の脳ＬＯ部分に言及し、ｅｈｅｃｌｏは胚の心臓ＥＣ部分対胚の心臓ＬＯ部分に言及し、ｅｓｅｃｌｏは胚の皮膚ＥＣ部分対胚の皮膚ＬＯ部分に言及する。
【００４２】
選択された遺伝子の評価
選択された遺伝子のさらなる分析は、ゼブラダニオにおけるノックダウン技術により行われた。この方法は、標的化されたｍＲＮＡ分子からの翻訳を阻止する特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を含む。これは、関心のある遺伝子の阻害を可能にし、ゼブラダニオの発達及び健康における遺伝子機能の決定を可能にする。ゼブラダニオは、マウス及びヒトの如き哺乳類脊椎動物と脊椎機能のための遺伝子を共有する。研究は、ゼブラダニオにおける器官及び／又は組織発達は、ヒトにおける効果を信頼をもって予測することができるということを示した（とりわけ、Ｓｈｉｎ ａｎｄ Ｆｉｓｈｍａｎ、 Ｆｒｏｍ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｔｏ ｈｕｍａｎｓ： Ｍｏｄｕｌａｒ ｍｅｄｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｓ、 Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔ． ２００２： ３：３１１−３４０； Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．、 Ａｎ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｌｉｂｒａｒｙ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ２００１ Ｓｅｐ； １１（９）：１５９４−６０２を参照）。それらの迅速な外部発達のため、ゼブラダニオの胚の発達は容易に監視され分析されることができる。卵黄嚢の存在は、マウスの如き他の研究生物で可能なよりもはるかに正確に欠失胚の発達からのデータを与えるのに役立つ。
【００４３】
胚を調製するために、標的遺伝子のゼブラダニオ相同物が同定された。次に、特定のモルホリノホスホロジアミデートオリゴヌクレオチドが、標的遺伝子のスプライスアクセプター／ドナー部位又はＡＵＧ開始コドンに適合するように設計された。モルホリノのストック溶液を作成するため、１００ｎｍｏｌのホスホロジアミデートオリゴヌクレオチドを含むペレットが３３．３μｌのｍｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解され、２５ｍｇ／ｍｌの濃度を与え、−２０℃で保存された。注入溶液を作成するため、８μｌのストック溶液は、９２μｌの滅菌濾過された１ＸのＤａｎｉｅｕ緩衝液（５８ｍＭのＮａＣｌ、０．７ｍＭのＫＣｌ、０．４ｍＭのＭｇＳＯ４、０．６ｍＭのＣａ（ＮＯ３）２、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６）（この緩衝液は、１５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０を補充されている）に添加された。２ｍｇ／ｍｌの注入溶液も−２０℃で保存された。
【００４４】
注入中、材料及び胚は約２８℃に維持された。注入針は、注入時間が１００〜６００ｍ秒の範囲内に最適化されることができるように較正された。一細胞段階から初期の八細胞段階までの胚が用いられた。モルホリノは卵黄嚢中に微小注入された。特定の注入体積又はモルホリノの効果的な用量は以下に記述される。典型的な初期用量は３，６及び１２ｎｇ（それぞれ１．５，３及び６ｎｌ）を含んでいた。３ｎｌ用量での毒性は、０．５，１及び２ｎｇ（それぞれ１，２及び４ｎｌ）の続く用量を生じた。約４０個の胚が各用量レベルで注入され、約４０個の胚が非注入のコントロールとして保持された。
【００４５】
モルホリノが受精した卵細胞に注入された後、特定の遺伝子のノックダウンを有するように遺伝子改変された胚は発達させられた（Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ ａｎｄ Ｅｋｋｅｒ、 Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ‘ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ’ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ、 Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｖｏｌ ２６， Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０００を参照）。胚は、形態を調査すること及び発達中の組織の特定の分析及びアッセイを行うことの両方によって発達中監察された。
【００４６】
単回のモルホリノ注入に加えて、二回のモルホリノ注入も同様に行われた。二回の注入のための特定の注入体積は以下に記述される。最初の注入した日の終わりに、胚は胞胚形成又は原腸胚形成段階にあり、プロピルチオウラシル（ＰＴＵ）の２Ｘ溶液が胚に添加され、それらの懸濁体積を倍化した。受精の４８時間後（ｈｐｆ）、二回注入された胚はインシチューハイブリダイゼーションのためにカドヘリン５（ｃｄｈ５）で固定された。
【００４７】
二回注入された胚の２０％以上がｃｄｈ５で観察される脈管構造において低い効果欠失を示した場合、又は１０％以上の胚が中程度の又は高い効果欠失を示した場合、微小脈管障害及びｆｌｉ−１、ｆｌｋ−１、ｆｌｔ−４、ｔｉｅ−１、ｔｉｅ−２、及びｃｄｈ５を用いたインシチューハイブリダイゼーションが行われた。少なくとも１２０個の胚が二回モルホリノ用量を投与され、そのうち少なくとも１００個が上述の分子マーカーを用いたインシチューハイブリダイゼーションのために２４ｈｐｆで収集された。残りの胚は微小脈管障害のために用いられた。
【００４８】
１０個の標的の各々の評価に特異的なデータが以下に記述される。一般的に、形態観察は、胚がコントロールの胚に対して一般的な遅延を示すかどうかの徴候が含まれる２４〜２８ｈｐｆで行われた。さらに、細胞死のタイプ及び度合いが記録され、一般的な胚の形状及び脳の形態も同様に記録された。最後に、卵黄嚢水腫はもし存在するなら、心臓の形態と同様に評価されて記録された。
【００４９】
また、約２４ｈｐｆで、二回モルホリノ胚はｆｌｉ−１、ｆｌｋ−１、ｆｌｔ−４、ｔｉｅ−１、ｔｉｅ−２及びｃｄｈ５のインシチューハイブリダイゼーションのために評価された。全体の形態及びコントロールの胚と比較した体節間の脈管における染色の減少度合い（失われた発現の割合に相関する）が注目された。体節間発現の１〜３５％の損失を示す胚は低い効果を有するとみなされ、体節間発現の３６〜７０％の損失を示す胚は中程度の効果を有するとみなされ、体節間発現の７１〜１００％の損失を示す胚は高い効果を有するとみなされた。
【００５０】
４８〜５６ｈｐｆに、一般的な胚の形状、細胞死の度合い、血液循環、及び心臓の形態の如き様々なパラメータが調査されて記録された。ｃｄｈ５で固定された胚については、染色は上述のような脈管構造中で評価された。
【００５１】
微小脈管障害も二回モルホリノ胚で４８ｈｐｆに評価された。血管を観察するために、胚はトリカイン溶液中に移され、静脈洞／一般的な心臓の静脈が１０μｌのＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ溶液（２００００００Ｄａ、２０ｍｇ／ｍｌ）を注入された。
【００５２】
遺伝子ＯＪＣ８００９Ｊ７
配列番号１で示される配列を有する遺伝子は、マイクロアレイデータに基づいて血管において選択的に発現するものとして同定された（図３参照）。特定のデータが以下の表１に与えられている。配列及び注釈データベースを利用して、マウスにおける同等の遺伝子（配列番号２）及びヒト相同体（配列番号４）も導出された。これらの配列によってコードされるタンパク質は、それぞれ配列番号３及び５に与えられる。
この発現プロファイルに基づいて、遺伝子はゼブラダニオ胚においてさらに分析された。一つの対応するゼブラダニオ遺伝子が標的化のために同定された。二つのモルホリノ（ｓｚ１７５及びｓｚ１７６）が調製され、それぞれがゼブラダニオ遺伝子に対して標的化された。ｓｚ１７５モルホリノの２ｎｇ及びｓｚ１７６モルホリノの１２ｎｇはそれぞれの受精卵に投与された。胚は、発達させられた。２４ｈｐｆに、６つの異なるプローブを用いた二次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングが行われた。
【００５３】
体節間発現がアッセイにおいて分析され、結果は、用いられたプローブに基づくと少し異なった。プローブｆｌｉ−１は、アッセイされた１４個のモルファント胚のうち７％が低い効果を有し、２９％が高い効果を有し、つまり体節間発現の７１〜１００％の損失であることを明らかにした。プローブｆｌｋ−１、ＶＥＧＦ受容体２は、調査された１２個のモルファントのうち２５％が低い効果を有し、８％が高い効果を有することを示した。プローブｔｉｅ−１は、観察された９個のモルファントのうち１１％が中程度の効果を有し、１１％が高い効果を有することを示した。プローブｃｄｈ５、ＶＥカドヘリンは、観察された１６個のモルファントのうち１９％が低い効果を有し、６％が中程度の効果を有し、１９％が高い効果を有することを示した。プローブｆｌｔ−４、ＶＥＧＦ受容体３は、観察された１０個のモルファントのすべてが正常であり、プローブｔｉｅ−２は、観察された６個のモルファントのすべてが正常であることを示した。
【００５４】
以下の表２はこのデータをまとめる。
【００５５】
２８ｈｐｆに、胚は形態学的に観察された。図５は、２８ｈｐｆでの代表的なモルファント胚を示す。図から明らかなように、特に図４の２８ｈｐｆ野生型胚に照らして観察した場合、モルファントは正常な形態を示していた。５６ｈｐｆに、胚は再び表現型特性について観察され、代表的なモルファント胚が図７に示される。胚において観察された正常な形態は、図７が図６の５６ｈｐｆ野生型胚に照らして観察された場合に容易に理解されることができる。
【００５６】
追加の分析が４８〜５６ｈｐｆのモルファント胚で行われた。１７個のモルファントに対するｃｄｈ５での一次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングは、８８％を正常として示した。減少した体節間発現の中程度の効果は、他の１２％の胚において見られた。モルファントに対する微小脈管障害は、胚の様々な領域におけるＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎの存在を突き止めるために用いられた（図９参照。図９は、図８に示されるようなこの時間段階での野生型胚と比較されることができる）。３３個の胚のうち、心臓及び頭に組み合わされてＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを有するものはなかったが、４％が心臓のみにＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを有していた。減少された体節間脈管構造が１５％の胚で見られた。漏れやすい脈管構造は観察されなかった。正常な胚はサンプルの８１％を占めていた。観察された漏れは、矢印によって示されるように後頭部の血管から生じていた。
【００５７】
遺伝子ＨＵＰ８００１Ｋ１７
配列番号６で示される配列を有する遺伝子は、マイクロアレイデータに基づいて血管において選択的に発現するものとして同定された（図１０参照）。特定のデータが以下の表３に与えられている。配列及び注釈データベースを利用して、マウスにおける同等の遺伝子（配列番号７）及びヒト相同体（配列番号９）も導出された。これらの配列によってコードされるタンパク質は、それぞれ配列番号８及び１０に与えられる。
この発現プロファイルに基づいて、遺伝子はゼブラダニオ胚においてさらに分析された。一つの対応するゼブラダニオ遺伝子が標的化のために同定された。二つの異なるモルホリノ（ｓｚ１４３及びｓｚ１４４）が調製され、それぞれがゼブラダニオ遺伝子に対して標的化された。異なる量のモルホリノは以下に記述されるように投与された。各モルホリノの予め決められた量は、それぞれの受精卵に投与された。胚は、発達させられた。２４ｈｐｆに、６つの異なるプローブを用いた二次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングが行われた。
【００５８】
一つのスクリーニングが、１ｎｇのｓｚ１４３モルホリノ及び４ｎｇのｓｚ１４４モルホリノを受け取った胚で行われた。軸及び体節間脈管発現を分析するために特異的に選択された４つのプローブは以下のことを明らかにした：ｆｌｉ−１プローブを用いると、分析された１７個の胚のうち６％が中程度の体節間発現効果を有していた。他の１８％は高い効果を有していた。プローブｆｌｋ−１、ＶＥＧＦ受容体２は、調査された１５個のモルファントのうち２０％が中程度の、そして１３％が高い効果を有することを示した。プローブｔｉｅ−１によって分析された場合、観察された１６個のモルファントのうち６３％が高い効果を有していた。プローブｃｄｈ５、ＶＥカドヘリンは、観察された２４個のモルファントのうち４％が中程度の効果を有し、別の４％が高い効果を有することを示した。プローブｆｌｔ−４、ＶＥＧＦ受容体３は、観察された１４個のモルファントのすべてが正常であり、プローブｔｉｅ−２は、観察された１８個のモルファントのすべてが正常であることを示した。
【００５９】
他のスクリーニングは、１．５ｎｇのｓｚ１４３モルホリノ及び６ｎｇのｓｚ１４４モルホリノを受け取った胚で行われた。プローブｆｌｉ−１は、分析された１２個のモルファントのうち４２％が高い効果を有することを示した。ｆｌｋ−１プローブは、観察された１３個のモルファントのうち２３％が高い効果を有することを示した。ｔｉｅ−１プローブは、１３個のモルファントのうち５４％が高い効果を有することを示した。プローブｃｄｈ５は、２７個のモルファントのうち１５％が中程度の効果を有し、別の１１％が高い効果を有することを示した。プローブｆｌｔ−４は、観察された１４個のモルファントのすべてが正常であることを示した。プローブｔｉｅ−２は、観察された１８個のモルファントのすべてが正常であることを示した。
【００６０】
以下の表４は上述のデータを要約する。
【００６１】
２８ｈｐｆに、胚は形態学的に観察された。コントロールとして用いられた野生型胚は、予測されたように正常な形態を示した。前に示した通り、図４は２８ｈｐｆでの野生型胚を示す。モルファント胚は１．５ｎｇ用量のｓｚ１４３及び６ｎｇ用量のｓｚ１４４を受け取ったが、すべてが正常な形態を示さなかった。代表的な胚が図１１に示されている。２０個の胚が観察され、そのうち５０％が図１１において矢印の頭で示されるように曲がった体を示し、短い矢印で示されるように卵黄管の伸長を有していた。中程度の細胞死が図１１において長い矢印で示されるように胚の６０％で観察された。最終的に、胚の５０％が卵黄細胞水腫を有していた。
【００６２】
５６ｈｐｆに、胚は再び図６に示される野生型胚を参照して観察された。対応する段階でのモルファントは図１２に示されている。２０個の胚が観察され、９０％が図１２において長い矢印で示されるように曲がった体を示し、短い矢印で示されるように縮小した頭を有していた。矢印の頭で示される心臓周辺の水腫は、胚の９０％で観察され、減少した血液流も胚の９０％で見られた。
【００６３】
追加の分析が、４８〜５６ｈｐｆのモルファント胚で行われた。１ｎｇのｓｚ１４３及び３ｎｇのｓｚ１４４を受け取った１８個のモルファントに対するｃｄｈ５での一次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングは、２８％が低い効果レベルで減少した体節間発現を有し、短く曲がった尾を有することを示した。残りの７２％は正常であった。同じインシチューハイブリダイゼーションスクリーニングが２ｎｇのｓｚ１４３及び６ｎｇのｓｚ１４４を受け取った１１個のモルファントを用いて行われた。これは、９％が低い効果レベルで減少した体節間発現を有し、極めて短い尾を有することを示した。残りの９１％は正常であった。
【００６４】
１．５ｎｇのｓｚ１４３及び６ｎｇのｓｚ１４４を受け取った２６個のモルファントに対する微小脈管障害は、胚の様々な領域でのＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎの存在を突き止めるために用いられた。心臓ではＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎは観察されなかったが、頭及び心臓では３１％の胚がＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを有していた。合計で２７％のモルファントが減少した体節間脈管構造を有しており、漏れやすい脈管構造が３５％の胚で観察された。４２％の胚のみが正常であるように見えた。組み合わせたパーセントは１００％より大きい。何故なら、いくつかの胚は一以上の非正常な特徴を示したからである。図１３は分析された４８〜５６ｈｐｆ胚の代表を示す。矢印は減少された体節間脈管構造の領域を示し、矢印の頭は漏れやすい脈管構造を示す。参考のために、この時間段階での野生型胚が図８に示されている。実験データは、この遺伝子が多くの器官に散らばった細胞によって発現されるが、ＣＮＳで最も明確に見られることを明らかにする。
【００６５】
遺伝子ＨＵＰ８００１Ｋ２１
配列番号１１で示される配列を有する遺伝子は、マイクロアレイデータに基づいて新脈管形成中に選択的に発現するものとして同定された（図１４参照）。特定のデータが以下の表５に与えられている。配列及び注釈データベースを利用して、マウスにおける同等の遺伝子（配列番号１２）及びヒト相同体（配列番号１４）も導出された。これらの配列によってコードされるタンパク質は、それぞれ配列番号１３及び１５に与えられる。
この発現プロファイルに基づいて、遺伝子はゼブラダニオ胚においてさらに分析された。二つの対応するゼブラダニオ遺伝子が標的化のために同定された。二つのモルホリノ（ｓｚ２５７及びｓｚ２５８）が調製され、それぞれがゼブラダニオ遺伝子の一つに対して標的化された。ｓｚ２５７モルホリノの１２ｎｇ及びｓｚ２５８モルホリノの１２ｎｇはそれぞれの受精卵に投与された。胚は、発達させられた。２４ｈｐｆに、６つの異なるプローブを用いた二次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングが行われた。
【００６６】
体節間発現がアッセイにおいて分析され、結果は、用いられたプローブに基づくと少し異なった。プローブｆｌｉ−１は、アッセイされた１５個のモルファント胚のすべてが正常であることを明らかにした。プローブｆｌｋ−１は、調査された１６個のモルファントのうち１３％が低い効果を有し、６％が高い効果を有することを示した。プローブｔｉｅ−１によって分析された場合、観察されたすべての１５個のモルファントは正常であった。プローブｃｄｈ５は、観察されたすべての２６個のモルファントが正常であることを示した。プローブｆｌｔ−４は、観察されたすべての１７個のモルファントが正常であることを示し、プローブｔｉｅ−２は、観察されたすべての２０個のモルファントが正常であることを示した。
【００６７】
以下の表６は、このデータをまとめる。
【００６８】
２８ｈｐｆに、胚は形態学的に観察された。図１５は、２８ｈｐｆでの代表的なモルファント胚を示す。矢印によって示されるように、卵黄嚢水腫は、分析された５５個のモルファントの４７％において観察された。５６ｈｐｆに、総数５３個の胚が観察され、代表的なモルファント胚が図１６に示される。長い矢印で強調されるように、膨張した菱脳が３４％の胚で見出された。短い矢印によって示される卵黄嚢水腫も、胚の５８％において観察された。矢印の頭は、心臓周辺の水腫について調査された場所を示す：それは観察されなかった。
【００６９】
追加の分析が４８〜５６ｈｐｆのモルファント胚で行われた。２０個のモルファントに対するｃｄｈ５での一次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングは、すべてを正常として示した。３１個のモルファントでの微小血管障害は、胚の様々な領域においてＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎの存在を突きとめるために用いられた（図１７参照）。３１個の胚のうち、１９％がＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを心臓に有していたが、心臓及び頭にそれを有するものはなかった。減少した体節間脈管構造は、図１７において矢印で示されるように見られた。高い効果は胚の１９％で観察され、中程度の効果は１３％で、低い効果は２９％で観察された。漏れやすい脈管構造は観察されなかった。正常な胚は、サンプルの１９％を占めた。
【００７０】
遺伝子ＨＵＰ８００３Ｄ２４
配列番号１６で示される配列を有する遺伝子は、マイクロアレイデータに基づいて新脈管形成中に選択的に発現するものとして同定された（図１８参照）。特定のデータが以下の表７に与えられている。配列及び注釈データベースを利用して、マウスにおける同等の遺伝子（配列番号１７）及び二つのヒト相同体（配列番号１９及び２１）も導出された。これらの配列によってコードされるタンパク質は、それぞれ配列番号１８，２０及び２２に与えられる。
この発現プロファイルに基づいて、遺伝子はゼブラダニオ胚においてさらに分析された。三つの対応するゼブラダニオ遺伝子が標的化のために同定された。二つのモルホリノ（ｓｚ１８５及びｓｚ１８６）が調製され、三つのゼブラダニオ遺伝子に対して標的化された。低用量群のためには、ｓｚ１８５モルホリノの３ｎｇ及びｓｚ１８６モルホリノの６ｎｇがそれぞれの受精卵に投与された。二倍用量の群のためには、ｓｚ１８５モルホリノの６ｎｇ及びｓｚ１８６モルホリノの１２ｎｇが投与された。胚は、発達させられた。２４ｈｐｆに、６つの異なるプローブを用いた二次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングが行われた。
【００７１】
体節間発現がアッセイにおいて分析され、結果は、用いられたプローブに基づくと少し異なった。低用量群では、プローブｆｌｉ−１は、アッセイされた１１個のモルファント胚のうち１８％が中程度の効果を有すること、即ち体節間発現の３６〜７０％の損失を有すること、及び１８％が高い効果を有することを明らかにした。プローブｆｌｋ−１は、調査された１１個のモルファントのうち３６％が高い効果を有することを示した。プローブｔｉｅ−１は、観察された１４個のモルファントのうち２９％が高い効果を有することを示した。プローブｃｄｈ５は、観察された１６個のモルファントのうち３１％が高い効果を有し、３１％が中程度の効果を有することを示した。プローブｆｌｔ−４は、観察されたすべての１６個のモルファントが正常であることを示し、プローブｔｉｅ−２は、観察されたすべての１５個のモルファントが正常であることを示した。
【００７２】
高用量群では、プローブｆｌｉ−１は、アッセイされた３個のモルファント胚のうち３３％が低い効果を有し、３３％が中程度の効果を有することを明らかにした。プローブｆｌｋ−１は、１００％又は調査された２個のモルファントのうち１００％、つまり両方が中程度の効果を有することを示した。プローブｃｄｈ５は、観察された７個のモルファントのうち１００％、つまりすべてが高い効果を有することを示した。プローブｆｌｔ−４は、観察されたすべての３個のモルファントが正常であることを示し、プローブｔｉｅ−２は、観察されたすべての７個のモルファントが正常であることを示した。
【００７３】
以下の表８はこのデータをまとめる。
【００７４】
２８ｈｐｆに、胚は形態学的に観察された。細胞死は、観察された６６個の胚のうち７０％で観察された。卵黄嚢水腫はモルファントの２９％で観察された。５６ｈｐｆに、総数６６個の胚が表現型特性について観察された。卵黄嚢水腫は胚の４２％で観察され、３５％は減少したＩＳ血液流を示し、２６％は減少した血液流を示した。
【００７５】
追加の分析が４８〜５６ｈｐｆのモルファント胚で行われた。上述の低用量（３ｎｇのｓｚ１８５、６ｎｇのｓｚ１８６）を受けとった２１個のモルファントに対するｃｄｈ５での一次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングは、５２％を正常として示した。減少した体節間発現の低い効果は、胚の４３％で見られ、中程度の効果は５％で見られた。二倍用量（６ｎｇのｓｚ１８５、１２ｎｇのｓｚ１８６）を受けとった胚は、４８〜５６ｈｐｆに観察されたとき、観察されたその２３個の胚の７４％が正常であることを明らかにした。減少した体節間発現の低い効果は、胚の２２％で見られ、中程度の効果は胚の４％で見られた。
【００７６】
低用量のモルフォリノ（３ｎｇのｓｚ１８５、６ｎｇのｓｚ１８６）を与えられたモルファントに対する微小脈管障害は、胚の様々な領域でのＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎの存在を突きとめるために用いられた（図１９参照）。３３個の胚のうち、心臓に、又は心臓及び頭にＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを有するものはなかった。減少した体節間脈管構造は、図１９において矢印で示されるように見られた。高い効果は胚の６％で観察され、中程度の効果は１５％で、低い効果は３６％で観察された。漏れやすい脈管構造は観察されなかった。正常な胚は、サンプルの４３％を占めた。
【００７７】
これらのデータは、この遺伝子が腎臓の脈管及び上皮構造、並びに心臓弁及び皮膚上皮の大脈管、巨大核細胞の如き多くの場所で発現されることを明らかにする。
【００７８】
遺伝子ＨＵＰ８００４Ｎ１
配列番号２３で示される配列を有する遺伝子は、マイクロアレイデータに基づいて新脈管形成中に選択的に発現するものとして同定された（図２０参照）。特定のデータが以下の表９に与えられている。配列及び注釈データベースを利用して、マウスにおける同等の遺伝子（配列番号２４）及びヒト相同体（配列番号２６）も導出された。これらの配列によってコードされるタンパク質は、それぞれ配列番号２５及び２７に与えられる。
この発現プロファイルに基づいて、遺伝子はゼブラダニオ胚においてさらに分析された。二つの対応するゼブラダニオ遺伝子が標的化のために同定された。二つのモルホリノ（ｓｚ２２３及びｓｚ２２４）が調製され、それぞれがゼブラダニオ遺伝子の一つに対して標的化された。二つの用量計画が用いられた。ｓｚ２２３モルホリノの２ｎｇ及びｓｚ２２４モルホリノの１ｎｇを受けとった第一の用量群はそれぞれの受精卵に投与された。ｓｚ２２３モルホリノの１ｎｇ及びｓｚ２２４モルホリノの０．５ｎｇを受けとった第二の用量群はそれぞれの受精卵に投与された。胚は、発達させられた。２４ｈｐｆに、６つの異なるプローブを用いた二次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングが行われた。
【００７９】
第二の用量群（１ｎｇのｓｚ２２３、０．５ｎｇのｓｚ２２４）からの胚における体節間発現がアッセイにおいて分析され、結果は、用いられたプローブに基づくと少し異なった。プローブｆｌｉ−１は、アッセイされた１５個のモルファント胚のうち７％が低い効果を有し、７％が高い効果を有することを明らかにした。プローブｆｌｋ−１は、調査された１４個のモルファントのうち７％が高い効果を有することを示した。プローブｔｉｅ−１は、観察した１４個のモルファントのうち７％が低い効果を有し、７％が高い効果を有することを示した。プローブｃｄｈ５は、観察された２６個のモルファントのうち８％が中程度の効果を有することを示した。プローブｆｌｔ−４は、観察されたすべての１５個のモルファントが正常であることを示し、プローブｔｉｅ−２は、観察したすべての１５個のモルファントが正常であることを示した。
【００８０】
以下の表１０はこのデータをまとめる。
【００８１】
２８ｈｐｆに、胚は形態学的に観察された。図２１は、２８ｈｐｆでの代表的なモルファント胚を示す。矢印によって示されるように、卵黄嚢水腫は、研究された５９個のモルファントの５６％で観察された。５６ｈｐｆに、総数２０個の胚が表現型特性について観察され、代表的なモルファント胚が図２２に示される。矢印によって示されるように、心臓周辺の水腫は胚の３５％で観察され、６５％は卵黄に血液だまりを有し（これも矢印で示される）、３０％は減少したＩＳ血液流を示した。
【００８２】
追加の分析は、第二の用量群からの４８〜５６ｈｐｆのモルファント胚で行われた。２２個のモルファントに対するｃｄｈ５での一次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングは、すべてを正常として示した。３０個の第二の用量群に対する微小脈管障害は、胚の様々な領域におけるＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎの存在を突きとめるために用いられた（図２３参照）。３０個の胚のうち、１３％はＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを心臓に有し、３％は心臓と頭に有していた。減少した体節間脈管構造は、図２３において矢印で示されるように見られた。高い効果は胚の７％で観察され、低い効果は２０％で観察された。漏れやすい脈管構造は観察されなかった。正常な胚は、サンプルの５７％を占めた。
【００８３】
これらのデータは、この遺伝子が上皮で特異的に発現されることを示す。腎臓において、これは特定の脈管及びいくつかの他の上皮構造によって発現される。肝臓でもいくらかの発現がある。
【００８４】
遺伝子ＨＵＰ８０１０Ａ１０
配列番号２８で示される配列を有する遺伝子は、マイクロアレイデータに基づいて新脈管形成中に選択的に発現するものとして同定された（図２４参照）。特定のデータが以下の表１１に与えられている。配列及び注釈データベースを利用して、マウスにおける同等の遺伝子（配列番号２９）及びヒト相同体（配列番号３１）も導出された。これらの配列によってコードされるタンパク質は、それぞれ配列番号３０及び３２に与えられる。
この発現プロファイルに基づいて、遺伝子はゼブラダニオ胚においてさらに分析された。対応するゼブラダニオ遺伝子が標的化のために同定された。二つのモルホリノ（ｓｚ２６７及びｓｚ２６８）が調製され、それぞれがゼブラダニオ遺伝子の一つに対して標的化された。第一の用量群において、ｓｚ２６７モルホリノの４ｎｇ及びｓｚ２６８モルホリノの２ｎｇがそれぞれの受精卵に投与された。第二の用量群において、ｓｚ２６７モルホリノの６ｎｇ及びｓｚ２６８の３ｎｇが投与された。胚は、発達させられた。２４ｈｐｆに、６つの異なるプローブを用いた二次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングが行われた。
【００８５】
体節間発現がアッセイにおいて分析され、結果は、用いられたプローブに基づくと少し異なった。第一の用量群（４ｎｇのｓｚ２６７、２ｎｇのｓｚ２６８）において、プローブｆｌｉ−１は、アッセイされた１５個のモルファント胚のうち１３％が高い効果を有することを明らかにした。プローブｆｌｋ−１は、調査された１５個のモルファントの３３％が低い効果を有し、２０％が高い効果を有することを示した。プローブｔｉｅ−１は、観察されたすべての１７個のモルファントが正常であることを示した。プローブｃｄｈ５は、観察された２５個のモルファントの８％が高い効果を有することを示した。プローブｆｌｔ−４は、観察されたすべての１３個のモルファントが正常であり、プローブｔｉｅ−２は、観察されたすべての１６個のモルファントが正常であることを示した。
【００８６】
第二の用量群（６ｎｇのｓｚ２６７、３ｎｇのｓｚ２６８）において、プローブｆｌｉ−１は、アッセイされた１６個のモルファント胚のうち２５％が低い効果を有し、１９％が高い効果を有することを明らかにした。プローブｆｌｋ−１は、調査された６個のモルファントの３３％が低い効果を有することを示した。プローブｔｉｅ−１は、観察された１５個のモルファントの６７％が高い効果を有することを示した。プローブｃｄｈ５は、観察された２４個のモルファントの２１％が低い効果を有し、１３％が中程度の効果を有し、２９％が高い効果を有することを示した。プローブｆｌｔ−４は、観察されたすべての１５個のモルファントが正常であり、プローブｔｉｅ−２は、観察されたすべての１５個のモルファントが正常であることを示した。
【００８７】
以下の表１２はこのデータをまとめる。
【００８８】
２８ｈｐｆに、胚は形態学的に観察された。図２５は、２８ｈｐｆでの代表的なモルファント胚を示す。細胞死は、図２５において矢印で示されるように、観察された６１個の胚のうち４７％で観察された。矢印の頭は膨張した菱脳を示し、これは胚の５１％で見られた。中程度の卵黄嚢水腫はモルファントの２１％で観察された。５６ｈｐｆに、総数５９個の胚は表現型特性について観察され、代表的なモルファント胚が図２６に示される。矢印は膨張した菱脳を示し、これは胚の４４％で見られた。中程度の卵黄嚢水腫はモルファントの２９％で観察され、これは矢印の頭で示される。減少したＩＳ血液流は胚の１４％で観察され、減少した血液流は胚の１７％で見出された。
【００８９】
追加の分析は、第二の用量群からの４８〜５６ｈｐｆのモルファント胚で行われた。１９個のモルファントに対するｃｄｈ５での一次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングは、６８％を正常として示した。減少した体節間発現の低い効果は胚の３２％で見られた。モルファントに対する微小脈管障害は、胚の様々な領域におけるＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎの存在を突きとめるために用いられた（図２７参照）。３２個の胚のうち、心臓、又は心臓及び頭にＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを有するものはなかった。減少した体節間脈管構造は、図２７において矢印で示されるように見られた。高い効果は胚の６％で観察され、中程度の効果は３％で、低い効果は３４％で観察された。漏れやすい脈管構造は観察されなかった。正常な胚は、サンプルの５６％を占めた。
【００９０】
遺伝子ＮＯＣ８００３Ｌ１７
配列番号３３で示される配列を有する遺伝子は、マイクロアレイデータに基づいて血管において選択的に発現するものとして同定された（図２８参照）。特定のデータが以下の表１３に与えられている。配列及び注釈データベースを利用して、マウスにおける同等の遺伝子（配列番号３４）及びヒト相同体（配列番号３６）も導出された。これらの配列によってコードされるタンパク質は、それぞれ配列番号３５及び３７に与えられる。
この発現プロファイルに基づいて、遺伝子はゼブラダニオ胚においてさらに分析された。一つの対応するゼブラダニオ遺伝子が標的化のために同定された。二つのモルホリノ（ｓｚ１８０及びｓｚ１８１）が調製され、それぞれがゼブラダニオ遺伝子に対して標的化された。第一の用量群において、ｓｚ１８０の１２ｎｇ及びｓｚ１８１の１ｎｇがそれぞれの受精卵に投与された。第二の用量群において、ｓｚ１８０の１２ｎｇ及びｓｚ１８１の２ｎｇがそれぞれの受精卵に投与された。胚は、発達させられた。２４ｈｐｆに、６つの異なるプローブを用いた二次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングが行われた。
【００９１】
第一の用量群からの胚における体節間発現がアッセイにおいて分析され、結果は、用いられたプローブに基づくと少し異なった。プローブｆｌｉ−１は、アッセイされた１５個のモルファント胚のうち４０％が高い効果を有することを明らかにした。プローブｆｌｋ−１は、調査されたすべての７個のモルファントが正常であることを示した。プローブｔｉｅ−１は、観察されたすべての１５個のモルファントが正常であることを示した。プローブｃｄｈ５は、観察された２０個のモルファントの１５％が低い効果を有し、５％が中程度の効果を有し、３０％が高い効果を有することを示した。プローブｆｌｔ−４は、観察されたすべての１１個のモルファントが正常であり、プローブｔｉｅ−２は、観察されたすべての１６個のモルファントが正常であることを示した。
【００９２】
以下の表１４はこのデータをまとめる。
【００９３】
２８ｈｐｆに、胚は形態学的に観察された。図２９は、代表的なモルファント胚を示す。矢印によって示されるように、卵黄嚢水腫は、研究された４８個のモルファントのうち６７％で観察された。５６ｈｐｆに観察された胚は正常な形態を示し、代表的な胚が図３０に示される。
【００９４】
追加の分析は、第二の用量群からの４８〜５６ｈｐｆのモルファント胚で行われた。１４個のモルファントに対するｃｄｈ５での一次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングは、７９％を正常として示し、残りの２９％は減少した体節間発現の中程度の効果を示した。２９個の第一の用量群のモルファントに対する微小脈管障害は、胚の様々な領域におけるＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎの存在を突きとめるために用いられた（図３１参照）。２９個の胚のうち、心臓にＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを有するものはなく、３％は心臓及び頭にＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを有していた。減少した体節間脈管構造は、図３１において矢印で示されるように見られた。高い効果は胚の７％で観察され、中程度の効果は３％で、低い効果は３８％で観察された。漏れやすい脈管構造は観察されなかった。正常な胚は、サンプルの４５％を占めた。
【００９５】
遺伝子ＮＯＣ８００９Ｃ９
配列番号３８で示される配列を有する遺伝子は、マイクロアレイデータに基づいて新脈管形成中に選択的に発現するものとして同定された（図３２参照）。特定のデータが以下の表１５に与えられている。配列及び注釈データベースを利用して、マウスにおける同等の遺伝子（配列番号３９）及びヒト相同体（配列番号４１）も導出された。これらの配列によってコードされるタンパク質は、それぞれ配列番号４０及び４２に与えられる。
この発現プロファイルに基づいて、遺伝子はゼブラダニオ胚においてさらに分析された。一つの対応するゼブラダニオ遺伝子が標的化のために同定された。二つのモルホリノ（ｓｚ２４１及びｓｚ２４２）が調製され、ゼブラダニオ遺伝子に対して標的化された。ｓｚ２４１モルホリノの３ｎｇ及びｓｚ２４２モルホリノの１ｎｇはそれぞれの受精卵に投与された。胚は、発達させられた。２４ｈｐｆに、６つの異なるプローブを用いた二次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングが行われた。
【００９６】
体節間発現がアッセイにおいて分析され、結果は、用いられたプローブに基づくと少し異なった。プローブｆｌｉ−１は、アッセイされた１５個のモルファント胚のうち７％が中程度の効果を有することを明らかにした。プローブｆｌｋ−１は、調査されたすべての１５個のモルファントが正常であることを示した。プローブｔｉｅ−１は、観察された１５個のモルファントの７％が高い効果を有することを示した。プローブｃｄｈ５は、観察された２０個のモルファントの１５％が低い効果を有することを示した。中程度の効果は５％で見られ、高い効果は１５％で見られた。プローブｆｌｔ−４は、観察されたすべての１５個のモルファントが正常であり、プローブｔｉｅ−２は、観察されたすべての１６個のモルファントが正常であることを示した。
【００９７】
以下の表１６はこのデータをまとめる。
【００９８】
２８ｈｐｆに、胚は形態学的に観察された。図３３は、２８ｈｐｆでの代表的なモルファント胚を示す。穏やかな細胞死は、観察された５３個の胚のうち２５％で観察された。５６ｈｐｆに、５２個の胚は表現型特性について観察され、代表的なモルファント胚が図３４に示される。矢印によって示されるように、心臓周辺の水腫は胚の１３％で見られた。卵黄嚢水腫の領域の方へ向けられた矢印の頭は、胚の２５％で見られる。減少したＩＳ血液流は１３％及び１５％で観察され、減少した軸方向の血液流を示した。
【００９９】
追加の分析は、第二の用量群からの４８〜５６ｈｐｆのモルファント胚で行われた。３１個のモルファントに対するｃｄｈ５での一次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングは、すべてを正常として示した。モルファントに対する微小脈管障害は、胚の様々な領域におけるＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎの存在を突きとめるために用いられた（図３５参照）。２９個の胚のうち、７％が心臓にＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを有し、１４％が心臓及び頭に有していた。減少した体節間脈管構造は、図３５において矢印で示されるように見られた。高い効果は胚の３％で観察され、中程度の効果は３％で、低い効果は２１％で観察された。漏れやすい脈管構造は観察されなかった。正常な胚は、サンプルの５２％を占めた。これらのデータは、この遺伝子が心臓中及び心臓の周り及び選択された器官におけるいくらかの発現を含む器官の周りにおいて発現されることを明らかにする。
【０１００】
遺伝子ＮＯＣ８００９Ｇ２３
配列番号４３で示される配列を有する遺伝子は、マイクロアレイデータに基づいて新脈管形成中に選択的に発現するものとして同定された（図３６参照）。特定のデータが以下の表１７に与えられている。配列及び注釈データベースを利用して、マウスにおける同等の遺伝子（配列番号４４）及びヒト相同体（配列番号４６）も導出された。これらの配列によってコードされるタンパク質は、それぞれ配列番号４５及び４７に与えられる。
この発現プロファイルに基づいて、遺伝子はゼブラダニオ胚においてさらに分析された。一つの対応するゼブラダニオ遺伝子が標的化のために同定された。二つのモルホリノ（ｓｚ１４９及びｓｚ１５０）が調製され、それぞれがゼブラダニオ遺伝子に対して標的化された。第一の用量群において、ｓｚ１４９モルホリノの１．５ｎｇ及びｓｚ１５０モルホリノの１．５ｎｇは受精卵に投与された。第二の用量群において、ｓｚ１４９モルホリノの２ｎｇ及びｓｚ１５０モルホリノの２ｎｇは受精卵に投与された。第三の用量群において、ｓｚ１４９モルホリノの３ｎｇ及びｓｚ１５０モルホリノの３ｎｇは受精卵に投与された。胚は、発達させられた。２４ｈｐｆに、６つの異なるプローブを用いた二次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングが行われた。
【０１０１】
体節間発現がアッセイにおいて分析され、結果は、用いられたプローブに基づくと少し異なった。第一の用量群からの胚を用いた研究では、プローブｆｌｉ−１は、アッセイされた１４個のモルファント胚のうち２１％が高い効果を有することを明らかにした。プローブｆｌｋ−１は、調査されたすべての１６個のモルファントが正常であることを示した。プローブｔｉｅ−１は、観察された２２個のモルファントの３６％が高い効果を有することを示した。プローブｃｄｈ５は、観察された１５個のモルファントの１３％が軸方向発現における破壊を伴う低い効果を有することを示した。プローブｆｌｔ−４は、観察されたすべての１６個のモルファントが正常であり、プローブｔｉｅ−２は、観察されたすべての１３個のモルファントが正常であることを示した。
【０１０２】
第二の用量群からの研究では、プローブｆｌｉ−１は、アッセイされた１５個のモルファント胚のうち１３％が中程度の効果を有し、２７％が高い効果を有することを明らかにした。プローブｆｌｋ−１は、調査された１５個のモルファントのうち７％が低い効果を有し、７％が中程度の効果を有し、２０％が高い効果を有することを示した。プローブｔｉｅ−１は、観察された１３個のモルファントの６２％が高い効果を有することを示した。プローブｃｄｈ５は、観察された１２個のモルファントの２５％が高い効果を有し、いくつかのモルファントは軸方向発現における破壊を有することを示した。プローブｆｌｔ−４は、観察された１５個のモルファントの１３％が軸方向脈管において低い効果を有し、軸方向発現における破壊及び重度に異常形成された尾を含むことを示した。プローブｔｉｅ−２は、観察されたすべての８個のモルファントが正常であることを示した。
【０１０３】
以下の表１８はこのデータをまとめる。
【０１０４】
２８ｈｐｆに、胚は形態学的に観察された。図３７は、２８ｈｐｆでの代表的なモルファント胚を示す。矢印によって示されるように、細胞死は、観察された２０個の胚の４０％で観察された。矢印の頭によって示されるように、卵黄嚢水腫はモルファントの５５％で観察された。曲がった体はモルファントの４０％で見られた。５６ｈｐｆに、総数２０個の胚は表現型特性について観察され、代表的なモルファント胚は図３８に示される。矢印によって示されるように、心臓周辺の水腫はモルファントの５５％で観察された。矢印の頭は卵黄嚢水腫の方を示し、これはモルファントの５５％で観察された。曲がった体は胚の３０％で報告された。
【０１０５】
追加の分析は、４８〜５６ｈｐｆのモルファント胚で行われた。第一の用量群からの２２個のモルファントに対するｃｄｈ５での一次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングは、９０％を正常として示した。減少した体節間発現及び曲がった体の胚の低い効果は胚の５％で見られ、極めて短い尾を有する高い効果は胚の５％で見られた。第三の用量群からの２０個のモルファントに対するｃｄｈ５での一次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングは、８０％を正常として示した。減少した体節間発現の低い効果は胚の５％で見られ、中程度の効果は胚の１５％で見られた。
【０１０６】
モルファントに対する微小脈管障害は、胚の様々な領域におけるＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎの存在を突きとめるために用いられた（図３９参照）。２５個の胚のうち、心臓、又は心臓及び頭にＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを有するものはなかった。減少した体節間脈管構造は、図３９において矢印で示されるように胚の２４％で見られた。漏れやすい脈管構造は観察されなかった。正常な体節間脈管の例においてサンプルの７６％を占める正常な胚は、矢印の頭によって示される。
【０１０７】
遺伝子ＯＪＣ８００３Ｃ９
配列番号４８で示される配列を有する遺伝子は、マイクロアレイデータに基づいて血管において選択的に発現するものとして同定された（図４０参照）。特定のデータが以下の表１９に与えられている。配列及び注釈データベースを利用して、マウスにおける同等の遺伝子（配列番号４９）及びヒト相同体（配列番号５１）も導出された。これらの配列によってコードされるタンパク質は、それぞれ配列番号５０及び５２に与えられる。
この発現プロファイルに基づいて、遺伝子はゼブラダニオ胚においてさらに分析された。一つの対応するゼブラダニオ遺伝子が標的化のために同定された。二つのモルホリノ（ｓｚ１２９及びｓｚ１３０）が調製され、それぞれがゼブラダニオ遺伝子に対して標的化された。第一の用量群において、ｓｚ１２９モルホリノの３ｎｇ及びｓｚ１３０モルホリノの４．５ｎｇはそれぞれの受精卵に投与された。第二の用量群において、ｓｚ１２９モルホリノの４ｎｇ及びｓｚ１３０モルホリノの６ｎｇはそれぞれの受精卵に投与された。第三の用量群において、ｓｚ１２９モルホリノの６ｎｇ及びｓｚ１３０モルホリノの８ｎｇはそれぞれの受精卵に投与された。第四の用量群において、ｓｚ１２９モルホリノの６ｎｇ及びｓｚ１３０モルホリノの９ｎｇはそれぞれの受精卵に投与された。胚は、発達させられた。２４ｈｐｆに、６つの異なるプローブを用いた二次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングが行われた。
【０１０８】
体節間発現がアッセイにおいて分析され、結果は、用いられたプローブに基づくと少し異なった。第二の用量群からの胚では、プローブｆｌｉ−１は、アッセイされた１０個のモルファント胚のうち２０％が低い効果を有し、１０％が中程度の効果を有し、１０％が高い効果を有することを明らかにした。プローブｆｌｋ−１は、調査された９個のモルファントの１１％が低い効果を有し、３３％が中程度の効果を有し、１１％が高い効果を有することを示した。プローブｔｉｅ−１は、観察された９個のモルファントの２２％が高い効果を有することを示した。プローブｃｄｈ５は、観察された７個のモルファントの１４％が中程度の効果を有し、１４％が高い効果を有することを示した。プローブｆｌｔ−４は、観察されたすべての９個のモルファントが正常であり、プローブｔｉｅ−２は、観察されたすべての７個のモルファントが正常であることを示した。
【０１０９】
第三の用量群からの胚では、プローブｆｌｉ−１は、アッセイされた１０個のモルファント胚のうち１０％が中程度の効果を有し、５０％が高い効果を有することを明らかにした。プローブｆｌｋ−１は、調査された１２個のモルファントのうち２５％が中程度の効果を有し、２５％が高い効果を有することを示した。プローブｔｉｅ−１は、観察された６個のモルファントの１７％が低い効果を有し、５０％が高い効果を有することを示した。プローブｃｄｈ５は、観察された５個のモルファントの４０％が中程度の効果を有することを示した。プローブｆｌｔ−４は、観察されたすべての９個のモルファントが正常であり、プローブｔｉｅ−２は、観察されたすべての６個のモルファントが正常であることを示した。
【０１１０】
以下の表２０はこのデータをまとめる。
【０１１１】
２８ｈｐｆに、胚は形態学的に観察された。図４１は、２８ｈｐｆでの代表的なモルファント胚を示す。矢印によって示されるように、曲がった体は、観察された２０個のモルファントの３５％で見出された。５６ｈｐｆに、総数２０個の胚は表現型特性について観察され、代表的なモルファント胚は図４２に示される。長い矢印によって示されるように、胚の６０％は関連する膨張した菱脳室を伴う細胞死を有していた。卵黄嚢水腫は、短い矢印によって示されるように、胚の２５％で観察された。矢印の頭は、卵黄嚢水腫を伴う心臓周辺の水腫の欠失を指摘する。
【０１１２】
追加の分析は、４８〜５６ｈｐｆのモルファント胚で行われた。第一の用量群からの１９個のモルファントに対するｃｄｈ５での一次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングは、すべてが正常であることを示した。第四の用量群からの１０個のモルファントに対するｃｄｈ５での一次インシチューハイブリダイゼーションスクリーニングは、９０％のみが正常であることを示し、残りの１０％は曲がった尾を有する低い効果を示した。第三の用量群からの１９個のモルファントに対する微小脈管障害は、胚の様々な領域におけるＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎの存在を突きとめるために用いられた（図４３参照）。１９個の胚のうち、心臓にＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを有するものはなく、１６％が心臓のみにＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎを有していた。減少した体節間脈管構造は、胚の３７％で見られた。漏れやすい脈管構造は観察されなかった。正常な胚は、サンプルの４７％を占めた。
【０１１３】
インビボデータから確認される新規の用途
本発明は１０個の遺伝子標的、及びそれに関連するタンパク質に関し、これらはマイクロアレイ評価によって脈管形成又は新脈管形成中に上向き調節されるものとして当初は同定され、続いてゼブラダニオ胚実験を用いてインビボで重大な役割を果たしていることが証明された。これらの遺伝子及びタンパク質は、新脈管形成に関連する状態に向けられた新規の方法及び治療の基礎を形成しうる。例えば、新脈管形成に関連する状態に罹患していると疑われる患者からの生物学的サンプルは、本発明の遺伝子又はタンパク質が患者中で正確な時間、位置及び強度で発現されるかどうかを確認するためにスクリーニングされることができる。かかるスクリーニング方法は特許請求の範囲に記載された発明の一部分を形成する。もし遺伝子及び／又はタンパク質が不適切に発現していると同定されるなら、遺伝子治療又は医薬の如きこの状態を矯正するための治療が、ここで記述される又は当該技術分野で公知の方法及び手順に従って開始されることができる。ここで記述したツールを用いて今や可能であるような特定のデータを用いれば、迅速な診断及び特異的な標的化された治療が可能である。
【０１１４】
想像される一つの種類のスクリーニング方法は、脈管形成又は新脈管形成に関連する状態を有する患者を検出するための遺伝子増幅に基づく。かかる方法は、状態を解明するためにＰＣＲ、インシチューハイブリダイゼーション及び／又はサザーンブロッティング技術を用いることができる。別の種類のスクリーニング方法は、定量的ＰＣＲ、マイクロアレイ、ノーザンブロッティング又はインシチューハイブリダイゼーションの如き公知の技術を用いた遺伝子発現の評価に基づくことができる。用いることができるさらに別の種類のスクリーニング方法は、タンパク質の発現を測定又は監視するものであり、免疫組織化学、ウエスターンブロッティング、ＥＬＩＺＡ又はＦＡＣＳの如き技術を用いて行われることができる。
【０１１５】
もし、新脈管形成に関連する状態が本発明による遺伝子及び／又はタンパク質を含む化合物の投与によって改良されることができることが本発明の方法又は他の方法によって決定されるなら、一以上の遺伝子及び／又はタンパク質は当該技術分野では公知の方法によって一緒に又は逐次的に投与されることができる。
【０１１６】
本発明の単離された核酸分子又はタンパク質は、例えば標準的な直接ペプチド合成技術又は組み換え方法を用いる合成によって得ることができる。タンパク質は、電気泳動精製又はクロマトグラフィー技術の如き当業者には公知の様々な方法で単離又は精製されることができる。
【０１１７】
本発明の化合物の投与は、望ましい作用部位への化合物の送達を可能にするいかなる方法によっても行われることができる。これらの方法は、経口投与、十二指腸内投与、非経口注射（静脈内、皮下、筋肉内、脈管内又は注入を含む）及び局所投与を含む。
【０１１８】
遺伝子治療アプローチは、本発明のヌクレオチドを細胞、一群の細胞又は生物中に導入するために用いられることができる。インビボ方法及びエクスビボ方法の両方が利用されることができる。ベクターは典型的にはこの手順で用いられる。非ウイルス性ベクター又はウイルスベクターが用いられることができ、これらは例えば組み換えアデノウイルス又はレトロウイルスであることができる。この用途によれば、望ましい遺伝子はＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルス中に導入され、その例は無毒性のレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、及び免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である。組み換えウイルスは次に標的細胞中に感染される。多数の遺伝子が単一のベクターに組み入れられることができ、又は代わりにそれらは同時に又は逐次的に別個のベクターにおいて標的細胞へと導入されることができる。これらの方法は当該技術分野では公知であり、多数の特許及び公報に記述されている。
【０１１９】
本発明によって予想される遺伝子発現又はタンパク質生産と干渉する別の手段は、小さな干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いることである。ｓｉＲＮＡは関心のある遺伝子、例えば配列番号２に対応するＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む。ｓｉＲＮＡ分子は約１９個のヌクレオチド及び３′末端での約２個のヌクレオチドのオーバーハングからなる。いくつかの好ましい方法は、１９〜２３個のヌクレオチド及び３′オーバーハングを含む。ｓｉＲＮＡは公知の方法によって関心のある細胞（単数又は複数）に導入される。導入後、細胞（単数又は複数）は同じ配列を持つｓｓＲＮＡを破壊する。これは標的化された遺伝子の翻訳の減少又は妨害及びタンパク質生産の対応する減少又は妨害を生じる。
【０１２０】
投与される活性化合物の量は、治療される患者、障害又は状態の重篤度、投与の割合、及び化合物の性質を評価した後に決定されることができる。用量はすべてを一度に投与されることができるし、又は不連続の時間期間にわたって分散されることもできる。
【０１２１】
本発明の化合物は、単独の治療として適用されることができるし、又は一以上の他の活性な医薬剤を含むこともできる。組成物は、当該技術分野では公知の担体、アジュバント、緩衝液、又は賦形剤を含むことができる。もし望ましいのなら、組成物は香味剤、甘味剤、結合剤、染料、潤滑剤、香料、増粘剤、安定化剤、乳化剤、分散剤、懸濁剤、保存剤、及びｐＨ調節剤の如き成分をさらに含むことができる。組成物はいかなる好適な形態であることもでき、例えば錠剤、カプセル、丸薬、粉末、徐放性処方、溶液、懸濁剤、乳液、軟膏、又はクリームの形態であることができる。組成物は滅菌されていることができる。特定量の活性化合物を有する様々な医薬組成物の調製方法は公知であるか又は当業者には明らかである。記述されてきた本発明の医薬組成物は脈管形成治療及び新脈管形成治療を必要とするすべての疾患に適用されることができる。
【０１２２】
例えば、新脈管形成に関連する疾患の一つの治療方法は、虚血組織に脈管形成を起こさせるために用いられる本発明による組成物を含む。ある組織が望ましくない脈管閉塞からの虚血傷害に罹る危険性があるかどうかを決定するためには多くの方法がある。かかる方法は当該技術分野では周知であり、例えば心筋の疾患を評価するためのＭＲＩの如き画像形成技術を含む。本発明の組成物をどこに及びいつ適用するかどうかを決定した後、組成物は脈管閉塞に罹る危険性がある組織における脈管形成を増大させるために投与されることができる。これは、かかる組織において虚血を防止及び／又は緩和する効果的な手段であることができる。虚血が緩和された度合いを評価して測定するための方法は当該技術分野では公知である。
【０１２３】
本発明によるさらなる治療方法は、患者の心臓の機能及び虚血の度合いを可視化、測定及び／又は評価するいかなる公知技術の使用も含む。かかる評価は治療開始に先立って、治療中に、治療が完了した後に、又はいくつかのもしくは全ての段階でなされることができる。かかる技術の例は心エコー検査、心脈管核画像法、磁気共鳴画像法、及び対比血管造影法を含む。
【０１２４】
本発明は脈管形成及び新脈管形成の理解、及びこれらに関連する状態の治療に向かって進んでいるが、これらの状態をさらに理解することに対する必要性が当該技術分野ではなお存在する。それ故、本発明は、分析及び実験のために用いられることができる非ヒトトランスジェニック動物の作成及び使用をさらに予想する。それ故、ここに記述される遺伝子に対応する突然変異、ノックアウト又は改変遺伝子を含むトランスジェニック動物も本発明に含まれる。トランスジェニック動物は、組み換え、外来性又はクローニングされた遺伝子材料が実験的に移入されている遺伝的に改変された動物である。かかる遺伝子材料は導入遺伝子としばしば称される。導入遺伝子の核酸配列は、特定の核酸配列が正常状態では見出されないゲノムの遺伝子座に、又は導入遺伝子のための通常の遺伝子座に組み入れられることができる。導入遺伝子は標的動物の種と同じ種のゲノム又は標的動物の種とは異なる種のゲノムから由来する核酸配列からなることができる。
【０１２５】
トランスジェニック動物は、当該技術分野では公知のようなトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、胚性幹細胞における遺伝子標的化及び組み換えウイルス及びレトロウイルス感染を含む様々な異なる方法によって作成されることができる。組み換えコンピーテント哺乳類細胞中への核酸フラグメントの導入方法は、多数の核酸分子の共形質転換に好都合であるいかなる方法であることもできる。トランスジェニック動物を作成するための詳細な手順は当業者に利用可能であり、例えば米国特許第５４８９７４３号及び第５６０２３０７号が挙げられる。
【０１２６】
トランスジェニック技術は、上述の１０個の遺伝子の一以上を欠失している動物を作成するために用いられることができる。かかるノックアウト動物は、欠失された遺伝子のタイミング及び機能を解明するために、野生型又はコントロールの動物からのデータに対してそれらの成長及び発育が測定される時に特に使用されることができる。さらに、これらの動物は新脈管形成に関連する疾患状態を示すように改変されることができ、かくして選択された疾患の進行における特定の遺伝子の役割の理解をさらに進めることができる。この知識は、技術の進歩をもたらし、疾患の予防、管理及び治療のための新規の治療方法を保証することに導く。
【０１２７】
本発明によるトランスジェニック動物のさらなる使用は、研究生物における上述の同定された遺伝子の一以上をこの遺伝子のヒト相同体で置換することを含む。例えば、配列番号７に相当する遺伝子がそのヒト相同体である配列番号９で置換されたトランスジェニックマウスである。効果的な薬物治療への研究は動物モデルで行われることができるということは受け入れられているが、かかるトランスジェニックマウスは、ヒトでの使用のための潜在的な医薬候補への一層効果的なスクリーニングツールであることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】胚の脳内皮細胞部分に対して胚の脳のとり残された部分を比較した場合、及び成体の脳内皮細胞部分に対して成体の脳のとり残された部分を比較した場合の、ｃＤＮＡライブラリーにおける遺伝子のｌｏｇ２発現比での比−比プロットを示す。
【図２】胚の脳、心臓、及び皮膚内皮細胞に対してとり残された胚の部分及びすべての成体内皮細胞及びとり残された部分を比較した場合の、ｃＤＮＡライブラリーにおける遺伝子の平均強度対ｌｏｇ２発現比での比−強度プロットを示す。
【図３】遺伝子ＯＪＣ８００９Ｊ７についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
【図４】２８ｈｐｆでの野生型ゼブラダニオ胚を示す。
【図５】２８ｈｐｆでのＯＪＣ８００９Ｊ７モルファント胚を示す。
【図６】５６ｈｐｆでの野生型ゼブラダニオ胚を示す。
【図７】５６ｈｐｆでのＯＪＣ８００９Ｊ７モルファント胚を示す。
【図８】４８−５６ｈｐｆでの野生型ゼブラダニオ胚を示す。
【図９】４８−５６ｈｐｆでのＯＪＣ８００９Ｊ７モルファント胚を示す。
【図１０】遺伝子ＨＵＰ８００１Ｋ１７についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
【図１１】２８ｈｐｆでのＨＵＰ８００１Ｋ１７モルファント胚を示す。
【図１２】５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００１Ｋ１７モルファント胚を示す。
【図１３】４８−５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００１Ｋ１７モルファント胚を示す。
【図１４】遺伝子ＨＵＰ８００１Ｋ２１についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
【図１５】２８ｈｐｆでのＨＵＰ８００１Ｋ２１モルファント胚を示す。
【図１６】５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００１Ｋ２１モルファント胚を示す。
【図１７】４８−５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００１Ｋ２１モルファント胚を示す。
【図１８】遺伝子ＨＵＰ８００３Ｄ２４についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
【図１９】４８−５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００３Ｄ２４モルファント胚を示す。
【図２０】遺伝子ＨＵＰ８００４Ｎ１についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
【図２１】２８ｈｐｆでのＨＵＰ８００４Ｎ１モルファント胚を示す。
【図２２】５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００４Ｎ１モルファント胚を示す。
【図２３】４８−５６ｈｐｆでのＨＵＰ８００４Ｎ１モルファント胚を示す。
【図２４】遺伝子ＨＵＰ８０１０Ａ１０についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
【図２５】２８ｈｐｆでのＨＵＰ８０１０Ａ１０モルファント胚を示す。
【図２６】５６ｈｐｆでのＨＵＰ８０１０Ａ１０モルファント胚を示す。
【図２７】４８−５６ｈｐｆでのＨＵＰ８０１０Ａ１０モルファント胚を示す。
【図２８】遺伝子ＮＯＣ８００３Ｌ１７についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
【図２９】２８ｈｐｆでのＮＯＣ８００３Ｌ１７モルファント胚を示す。
【図３０】５６ｈｐｆでのＮＯＣ８００３Ｌ１７モルファント胚を示す。
【図３１】４８−５６ｈｐｆでのＮＯＣ８００３Ｌ１７モルファント胚を示す。
【図３２】遺伝子ＮＯＣ８００９Ｃ９についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
【図３３】２８ｈｐｆでのＮＯＣ８００９Ｃ９モルファント胚を示す。
【図３４】５６ｈｐｆでのＮＯＣ８００９Ｃ９モルファント胚を示す。
【図３５】４８−５６ｈｐｆでのＮＯＣ８００９Ｃ９モルファント胚を示す。
【図３６】遺伝子ＮＯＣ８００９Ｇ２３についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
【図３７】２８ｈｐｆでのＮＯＣ８００９Ｇ２３モルファント胚を示す。
【図３８】５６ｈｐｆでのＮＯＣ８００９Ｇ２３モルファント胚を示す。
【図３９】４８−５６ｈｐｆでのＮＯＣ８００９Ｇ２３モルファント胚を示す。
【図４０】遺伝子ＯＪＣ８００３Ｃ９についてのマイクロアレイデータを模式的に記述する。
【図４１】２８ｈｐｆでのＯＪＣ８００３Ｃ９モルファント胚を示す。
【図４２】５６ｈｐｆでのＯＪＣ８００３Ｃ９モルファント胚を示す。
【図４３】４８−５６ｈｐｆでのＯＪＣ８００３Ｃ９モルファント胚を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１２９】
配列番号１１，２３及び３３中、ｎはａ、ｃ、ｇ又はｔである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２，４，７，９，１２，１４，１７，１９，２１，２４，２６，２９，３１，３４，３６，３９，４１，４４，４６，４９及び５１のいずれか一つに記載の単離された核酸分子、又はその断片もしくは類似体であって、脈管形成、新脈管形成、脈管の透過性、内皮細胞の増殖、内皮細胞の分化、内皮細胞の移動、及び内皮細胞の生存からなる群から選択される少なくとも一つの生物学的活性を刺激するか又は阻害する能力を有する単離された核酸分子又はその断片又は類似体、又はストリンジェントな条件下で上述の配列のいずれか一つとハイブリダイズする単離された核酸分子。
【請求項２】
ストリンジェントな条件下で請求項１に記載の核酸分子の相補物にハイブリダイズする単離された核酸分子。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の単離された核酸分子に標的化された単離されたｓｉＲＮＡ分子であって、少なくとも１９塩基対の長さである単離されたｓｉＲＮＡ分子。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の核酸を含む発現ベクターであって、所望により核酸が前記核酸によってコードされるポリペプチドの発現を制御する調節核酸と操作可能なように結合されることができる発現ベクター。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の核酸を含むように遺伝的に改変された宿主細胞。
【請求項６】
請求項４に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
請求項４に記載の発現ベクターを細胞、一群の細胞又は生物に投与する工程を含む、細胞、一群の細胞又は生物における新脈管形成に関連した状態を治療する方法。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の核酸に対して特異的な反応性を有する抗体であって、前記抗体は好ましくはポリクローナル又はモノクローナルのものであることができ、前記抗体は蛍光ラベルの如き検出可能なラベルをさらに含むことができる抗体。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の核酸を含む導入遺伝子を含むように遺伝的に改変されたトランスジェニックの非ヒト動物であって、好ましくは前記導入遺伝子は発現されることができるトランスジェニックの非ヒト動物。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載の核酸配列を含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の医薬組成物を細胞、一群の細胞又は生物に投与する工程を含む、細胞、一群の細胞又は生物における脈管形成又は新脈管形成に影響を与える方法であって、前記影響を与えることは好ましくは増加又は減少を生じることができ、より好ましくは細胞、一群の細胞又は生物は新脈管形成に関連する障害を有し、前記新脈管形成に関連する障害は例えば癌、網膜症、黄斑変性、角膜の潰瘍、脳卒中、虚血性心臓疾患、不妊症、潰瘍、強皮症、創傷治癒、虚血、心筋梗塞、心筋症、狭心症、不安定なアンギナ、冠動脈硬化症、動脈硬化閉塞、ベルガー病、動脈塞栓症、動脈血栓症、脳血管性閉塞、脳梗塞、脳血栓症、脳塞栓症、ルベオーシス、増殖性硝子体網膜症、慢性炎症、炎症性腸疾患、乾癬、サルコイドーシス、及びリウマチ性関節炎である方法。
【請求項１２】
配列番号３，５，８，１０，１３，１５，１８，２０，２２，２５，２７，３０，３２，３５，３７，４０，４２，４５，４７，５０及び５２のいずれか一つに記載のアミノ酸配列に実質的に相当するアミノ酸の配列を含む単離されたポリペプチド、又はその断片もしくは類似体であって、細胞、一群の細胞又は生物における新脈管形成に影響を与える能力を有するポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリペプチドを発現するように遺伝的に改変された宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１２に記載のポリペプチドに対して特異的な反応性を有する抗体であって、前記抗体は好ましくはポリクローナル又はモノクローナルのものであることができ、前記抗体は蛍光ラベルの如き検出可能なラベルをさらに含むことができる抗体。
【請求項１５】
請求項１２に記載のポリペプチドをコードする核酸を含む導入遺伝子を含むように遺伝的に改変されたトランスジェニックの非ヒト動物であって、好ましくは前記導入遺伝子は発現されることができるトランスジェニックの非ヒト動物。
【請求項１６】
請求項１２に記載の単離されたポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の医薬組成物を細胞、一群の細胞又は生物に投与する工程を含む、細胞、一群の細胞又は生物における脈管形成又は新脈管形成に影響を与える方法であって、前記影響を与えることは好ましくは増加又は減少を生じることができ、より好ましくは細胞、一群の細胞又は生物は新脈管形成に関連する障害を有し、前記新脈管形成に関連する障害は例えば癌、網膜症、黄斑変性、角膜の潰瘍、脳卒中、虚血性心臓疾患、不妊症、潰瘍、強皮症、創傷治癒、虚血、心筋梗塞、心筋症、狭心症、不安定なアンギナ、冠動脈硬化症、動脈硬化閉塞、ベルガー病、動脈塞栓症、動脈血栓症、脳血管性閉塞、脳梗塞、脳血栓症、脳塞栓症、ルベオーシス、増殖性硝子体網膜症、慢性炎症、炎症性腸疾患、乾癬、サルコイドーシス、及びリウマチ性関節炎である方法。
【請求項１８】
患者の細胞中の新脈管形成に関連する転写物を検出する方法であって、前記方法が、配列番号２，４，７，９，１２，１４，１７，１９，２１，２４，２６，２９，３１，３４，３６，３９，４１，４４，４６，４９及び５１のいずれか一つに記載の配列と少なくとも８０％同一である配列と選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドと患者からの生物学的サンプルを接触させることを含み、前記新脈管形成に関連する転写物はハイブリダイゼーションが検出される場所で検出され、好ましくは前記ポリヌクレオチドは配列番号２，４，７，９，１２，１４，１７，１９，２１，２４，２６，２９，３１，３４，３６，３９，４１，４４，４６，４９及び５１のいずれか一つに記載の配列を含み、好ましくは前記生物学的サンプルは組織サンプルであるか又はｍＲＮＡの如き単離された核酸からなり、好ましくは前記核酸は生物学的サンプルをポリヌクレオチドと接触させる工程に先立って増幅され、好ましくはポリヌクレオチドは固体表面上に固定される方法。
【請求項１９】
脊椎動物において新脈管形成及び脈管形成から選択される少なくとも一つの生物学的活性に影響を与える方法であって、前記方法が、請求項１又は１２に記載のヌクレオチド又はポリペプチドの新脈管形成又は脈管形成に影響を与えるのに効果的な量を前記生物に投与する工程を含み、前記生物は好ましくはマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、サル及びヒトの如き哺乳動物であり、脈管形成又は新脈管形成は好ましくは高められ、増大され、阻害され、又は減少され、前記生物は好ましくは新脈管形成に関連する障害を有し、前記新脈管形成に関連する障害は例えば癌、網膜症、黄斑変性、角膜の潰瘍、脳卒中、虚血性心臓疾患、不妊症、潰瘍、強皮症、創傷治癒、虚血、心筋梗塞、心筋症、狭心症、不安定なアンギナ、冠動脈硬化症、動脈硬化閉塞、ベルガー病、動脈塞栓症、動脈血栓症、脳血管性閉塞、脳梗塞、脳血栓症、脳塞栓症、ルベオーシス、増殖性硝子体網膜症、慢性炎症、炎症性腸疾患、乾癬、サルコイドーシス、及びリウマチ性関節炎である方法。
【請求項２０】
配列番号２，４，７，９，１２，１４，１７，１９，２１，２４，２６，２９，３１，３４，３６，３９，４１，４４，４６，４９及び５１のいずれか一つに記載の配列の発現が上向き調節されるか、下向き調節されるか、又は不存在である、一以上の細胞を含む新脈管形成が増大された又は減少されたトランスジェニックの実験用動物。
【請求項１】
配列番号２，４，７，９，１２，１４，１７，１９，２１，２４，２６，２９，３１，３４，３６，３９，４１，４４，４６，４９及び５１のいずれか一つに記載の単離された核酸分子、又はその断片もしくは類似体であって、脈管形成、新脈管形成、脈管の透過性、内皮細胞の増殖、内皮細胞の分化、内皮細胞の移動、及び内皮細胞の生存からなる群から選択される少なくとも一つの生物学的活性を刺激するか又は阻害する能力を有する単離された核酸分子又はその断片又は類似体、又はストリンジェントな条件下で上述の配列のいずれか一つとハイブリダイズする単離された核酸分子。
【請求項２】
ストリンジェントな条件下で請求項１に記載の核酸分子の相補物にハイブリダイズする単離された核酸分子。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の単離された核酸分子に標的化された単離されたｓｉＲＮＡ分子であって、少なくとも１９塩基対の長さである単離されたｓｉＲＮＡ分子。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の核酸を含む発現ベクターであって、所望により核酸が前記核酸によってコードされるポリペプチドの発現を制御する調節核酸と操作可能なように結合されることができる発現ベクター。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の核酸を含むように遺伝的に改変された宿主細胞。
【請求項６】
請求項４に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
請求項４に記載の発現ベクターを細胞、一群の細胞又は生物に投与する工程を含む、細胞、一群の細胞又は生物における新脈管形成に関連した状態を治療する方法。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の核酸に対して特異的な反応性を有する抗体であって、前記抗体は好ましくはポリクローナル又はモノクローナルのものであることができ、前記抗体は蛍光ラベルの如き検出可能なラベルをさらに含むことができる抗体。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の核酸を含む導入遺伝子を含むように遺伝的に改変されたトランスジェニックの非ヒト動物であって、好ましくは前記導入遺伝子は発現されることができるトランスジェニックの非ヒト動物。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載の核酸配列を含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の医薬組成物を細胞、一群の細胞又は生物に投与する工程を含む、細胞、一群の細胞又は生物における脈管形成又は新脈管形成に影響を与える方法であって、前記影響を与えることは好ましくは増加又は減少を生じることができ、より好ましくは細胞、一群の細胞又は生物は新脈管形成に関連する障害を有し、前記新脈管形成に関連する障害は例えば癌、網膜症、黄斑変性、角膜の潰瘍、脳卒中、虚血性心臓疾患、不妊症、潰瘍、強皮症、創傷治癒、虚血、心筋梗塞、心筋症、狭心症、不安定なアンギナ、冠動脈硬化症、動脈硬化閉塞、ベルガー病、動脈塞栓症、動脈血栓症、脳血管性閉塞、脳梗塞、脳血栓症、脳塞栓症、ルベオーシス、増殖性硝子体網膜症、慢性炎症、炎症性腸疾患、乾癬、サルコイドーシス、及びリウマチ性関節炎である方法。
【請求項１２】
配列番号３，５，８，１０，１３，１５，１８，２０，２２，２５，２７，３０，３２，３５，３７，４０，４２，４５，４７，５０及び５２のいずれか一つに記載のアミノ酸配列に実質的に相当するアミノ酸の配列を含む単離されたポリペプチド、又はその断片もしくは類似体であって、細胞、一群の細胞又は生物における新脈管形成に影響を与える能力を有するポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリペプチドを発現するように遺伝的に改変された宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１２に記載のポリペプチドに対して特異的な反応性を有する抗体であって、前記抗体は好ましくはポリクローナル又はモノクローナルのものであることができ、前記抗体は蛍光ラベルの如き検出可能なラベルをさらに含むことができる抗体。
【請求項１５】
請求項１２に記載のポリペプチドをコードする核酸を含む導入遺伝子を含むように遺伝的に改変されたトランスジェニックの非ヒト動物であって、好ましくは前記導入遺伝子は発現されることができるトランスジェニックの非ヒト動物。
【請求項１６】
請求項１２に記載の単離されたポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の医薬組成物を細胞、一群の細胞又は生物に投与する工程を含む、細胞、一群の細胞又は生物における脈管形成又は新脈管形成に影響を与える方法であって、前記影響を与えることは好ましくは増加又は減少を生じることができ、より好ましくは細胞、一群の細胞又は生物は新脈管形成に関連する障害を有し、前記新脈管形成に関連する障害は例えば癌、網膜症、黄斑変性、角膜の潰瘍、脳卒中、虚血性心臓疾患、不妊症、潰瘍、強皮症、創傷治癒、虚血、心筋梗塞、心筋症、狭心症、不安定なアンギナ、冠動脈硬化症、動脈硬化閉塞、ベルガー病、動脈塞栓症、動脈血栓症、脳血管性閉塞、脳梗塞、脳血栓症、脳塞栓症、ルベオーシス、増殖性硝子体網膜症、慢性炎症、炎症性腸疾患、乾癬、サルコイドーシス、及びリウマチ性関節炎である方法。
【請求項１８】
患者の細胞中の新脈管形成に関連する転写物を検出する方法であって、前記方法が、配列番号２，４，７，９，１２，１４，１７，１９，２１，２４，２６，２９，３１，３４，３６，３９，４１，４４，４６，４９及び５１のいずれか一つに記載の配列と少なくとも８０％同一である配列と選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドと患者からの生物学的サンプルを接触させることを含み、前記新脈管形成に関連する転写物はハイブリダイゼーションが検出される場所で検出され、好ましくは前記ポリヌクレオチドは配列番号２，４，７，９，１２，１４，１７，１９，２１，２４，２６，２９，３１，３４，３６，３９，４１，４４，４６，４９及び５１のいずれか一つに記載の配列を含み、好ましくは前記生物学的サンプルは組織サンプルであるか又はｍＲＮＡの如き単離された核酸からなり、好ましくは前記核酸は生物学的サンプルをポリヌクレオチドと接触させる工程に先立って増幅され、好ましくはポリヌクレオチドは固体表面上に固定される方法。
【請求項１９】
脊椎動物において新脈管形成及び脈管形成から選択される少なくとも一つの生物学的活性に影響を与える方法であって、前記方法が、請求項１又は１２に記載のヌクレオチド又はポリペプチドの新脈管形成又は脈管形成に影響を与えるのに効果的な量を前記生物に投与する工程を含み、前記生物は好ましくはマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、サル及びヒトの如き哺乳動物であり、脈管形成又は新脈管形成は好ましくは高められ、増大され、阻害され、又は減少され、前記生物は好ましくは新脈管形成に関連する障害を有し、前記新脈管形成に関連する障害は例えば癌、網膜症、黄斑変性、角膜の潰瘍、脳卒中、虚血性心臓疾患、不妊症、潰瘍、強皮症、創傷治癒、虚血、心筋梗塞、心筋症、狭心症、不安定なアンギナ、冠動脈硬化症、動脈硬化閉塞、ベルガー病、動脈塞栓症、動脈血栓症、脳血管性閉塞、脳梗塞、脳血栓症、脳塞栓症、ルベオーシス、増殖性硝子体網膜症、慢性炎症、炎症性腸疾患、乾癬、サルコイドーシス、及びリウマチ性関節炎である方法。
【請求項２０】
配列番号２，４，７，９，１２，１４，１７，１９，２１，２４，２６，２９，３１，３４，３６，３９，４１，４４，４６，４９及び５１のいずれか一つに記載の配列の発現が上向き調節されるか、下向き調節されるか、又は不存在である、一以上の細胞を含む新脈管形成が増大された又は減少されたトランスジェニックの実験用動物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【公表番号】特表２００７−５１２８３５（Ｐ２００７−５１２８３５Ａ）
【公表日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４２５４１（Ｐ２００６−５４２５４１）
【出願日】平成１６年１２月６日（２００４．１２．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００４／００１８１４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５４４２６
【国際公開日】平成１７年６月１６日（２００５．６．１６）
【出願人】（５０３０５３４１３）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月６日（２００４．１２．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００４／００１８１４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５４４２６
【国際公開日】平成１７年６月１６日（２００５．６．１６）
【出願人】（５０３０５３４１３）
【Ｆターム（参考）】
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