新規骨吸収抑制剤のスクリーニング方法および新規骨吸収抑制剤
【課題】破骨細胞前駆細胞が破骨細胞に成熟する前に、骨表面から破骨細胞前駆細胞を引き離して破骨細胞に成熟するのを阻止し、成熟破骨細胞による骨吸収を抑制しうる新規骨吸収抑制剤のスクリーニング方法および新規骨吸収抑制剤を提供することを課題とする。
【解決手段】破骨前駆細胞と候補物質を含む系において、候補物質とＳ１Ｐ受容体（例えばＳ１Ｐ１）との相互作用による、破骨前駆細胞の走化性を測定することを特徴とする新規骨吸収抑制剤のスクリーニング方法による。新規骨吸収抑制剤としては、Ｓ１Ｐ１作用薬であるＳＥＷ２８７１が挙げられる。
【解決手段】破骨前駆細胞と候補物質を含む系において、候補物質とＳ１Ｐ受容体（例えばＳ１Ｐ１）との相互作用による、破骨前駆細胞の走化性を測定することを特徴とする新規骨吸収抑制剤のスクリーニング方法による。新規骨吸収抑制剤としては、Ｓ１Ｐ１作用薬であるＳＥＷ２８７１が挙げられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規メカニズムを有する骨吸収抑制剤のスクリーニング方法および該スクリーニング方法により得られた新規骨吸収抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
スフィンゴシン１リン酸（以下、「Ｓ１Ｐ」という。）は、血中に存在する脂質メディエーターの１種であり、その受容体としてスフィンゴシン１リン酸受容体１型（Ｓ１Ｐ１）〜スフィンゴシン１リン酸受容体５型（Ｓ１Ｐ５）の５種類のＧ蛋白質共役受容体が知られている。特にＳ１Ｐ１とＳ１Ｐ３はＲａｃの活性を促進化し、Ｓ１Ｐに対する正の走化性（chemotaxis）を誘導するといわれており、逆にＳ１Ｐ２は走化性を抑制するといわれている。
【０００３】
これまでＳ１Ｐは、免疫システムでのリンパ球などの移動に重要であることが示されてきた。例えば、Ｔリンパ球がリンパ節内で抗原提示を受けて全身循環に戻っていくときに、Ｓ１Ｐ１の発現が増強することで、血中に戻っていくことができるようになる機構が知られている（Nat Rev Immunol. 2005 Jul;5(7):560-70. Review）。
【０００４】
骨組織は「骨芽細胞による骨新生」と「破骨細胞による骨吸収」のバランスによって恒常性が維持されている。中でも破骨細胞は、血球系の単球・マクロファージ由来の細胞であり、その前駆細胞が血中から骨表面に定着し、その場所で骨芽細胞からＲＡＮＫＬ（receptor activator of NF kappa B ligand）という分化因子による刺激を受けることにより破骨能を持った成熟破骨細胞に分化し、骨吸収が行われる（Nat Rev Genet. 2003 Aug;4(8):638-49. Review）。関節リウマチや閉経後骨粗鬆症などの骨吸収性疾患では、この破骨細胞の活性が増強している。骨粗鬆症の治療薬としては、骨量の減少を防止しうる薬剤として、ビタミンＤ３、ビタミンＫ２、イプリフラボンなどが使用されており、骨減少を防止し、骨量増加が期待される薬剤として、女性ホルモンの１種であるエストロゲンやエストロゲン受容体に作用する薬剤（選択的エストロゲン受容体モデュレーター、通称ＳＥＲＭ）などが使用されている。また、近年、最も効果が期待されている薬剤として破骨細胞を細胞死させて機能を抑えるビスフォスフォネート製剤が、これらの骨吸収性疾患の予防・治療薬として汎用されている。ビスフォスフォネート製剤は骨表面に接着し、これを破骨細胞が取り込むことによりアポトーシスが誘導されると考えられている。
【０００５】
骨関節疾患の予防および改善薬として、スフィンゴシン骨格を有する化合物を有効成分とする薬剤が開示されている（特許文献１）。また、スフィンゴシン骨格を有する化合物を有効成分とする骨形成促進剤についても開示されている（特許文献２）。これらの文献は、スフィンゴシン骨格を有する化合物が骨芽細胞を活性化し、骨形成促進剤としての機能を有することが開示されている。
【０００６】
【特許文献１】特開2001-158736号公開公報
【特許文献２】特開2004-231616号公開公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、破骨細胞前駆細胞（以下、単に「前駆細胞」という。）が破骨細胞に成熟する前に、骨表面から前駆細胞を引き離して破骨細胞に成熟するのを阻止し、成熟破骨細胞による骨吸収を抑制しうる新規骨吸収抑制剤のスクリーニング方法および新規骨吸収抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、前駆細胞にＳ１Ｐ１が発現していることを初めて確認し、Ｓ１Ｐ１の血中Ｓ１Ｐへの走化性により前駆細胞が血中へ再還流しうることを見出した。これにより前駆細胞のＳ１Ｐ１を作動させて前駆細胞を血中へ還流させることで、前駆細胞から破骨細胞へ成熟するのを阻止し、破骨細胞による骨吸収を抑制しうることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．破骨細胞前駆細胞と候補物質を含む系において、スフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体と候補物質との相互作用による、破骨細胞前駆細胞の走化性を測定することを特徴とする新規骨吸収抑制剤のスクリーニング方法。
２．少なくとも以下の工程を含む前項１に記載のスクリーニング方法：
１）破骨細胞前駆細胞に候補物質を添加する工程；
２）破骨細胞前駆細胞の走化性を測定する工程。
３．Ｓ１Ｐ受容体が、Ｓ１Ｐ１である前項１または２に記載のスクリーニング方法。
４．候補物質が、Ｓ１Ｐ受容体作用薬である前項１〜３のいずれか１に記載のスクリーニング方法。
５．前項１〜４のいずれか１に記載の方法によりスクリーニングされた新規骨吸収抑制剤。
６．Ｓ１Ｐ１に作用する薬剤からなる新規骨吸収抑制剤。
７．Ｓ１Ｐ１に作用する薬剤が、5-(4-フェニル-5-トリフルオロメチルチオフェン-2-イル)-3-(3-トリフルオロメチルフェニル)-1,2,4-オキサジアゾールまたはその誘導体である、前項６に記載の新規骨吸収抑制剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のスクリーニング方法により、前駆細胞から破骨細胞に成熟するのを抑制し、破骨細胞による骨吸収を抑制しうる新規メカニズムを有する薬剤をスクリーニングすることができる。スクリーニングにより選別された薬剤は、関節リウマチや閉経後骨粗鬆症などの骨吸収性疾患の治療および／または予防薬に適用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
まずはじめに、前駆細胞から破骨細胞に成熟する場合の骨吸収メカニズムについて説明する。背景技術の欄でも示したように、骨組織は骨芽細胞による骨新生と破骨細胞による骨吸収のバランスによって恒常性が維持されている。
破骨細胞の膜表面には分化や機能調節をつかさどる膜表面分子が存在している。正の制御に関与するものとして、ＲＡＮＫ（ＲＡＮＫＬレセプター）とＩＬ−１レセプター、およびインテグリンαｖβ３などが挙げられる。
【００１２】
血中の前駆細胞が骨組織内に侵入すると、前駆細胞の一部はＲＡＮＫとＲＡＮＫＬの相互作用により骨表面に定着する。前駆細胞がＲＡＮＫＬにより刺激を受けて成熟破骨細胞に成熟し骨吸収機能を有するようになる。
【００１３】
本発明者らは、前駆細胞と成熟破骨細胞中のＳ１Ｐ受容体に着目し、その有無を確認した。本発明者らは、前駆細胞にＳ１Ｐ受容体の１種であるＳ１Ｐ１が発現していることを初めて確認した。次に前駆細胞とＳ１Ｐ１の関係に着目し、前駆細胞に発現したＳ１Ｐ１と血中のＳ１Ｐが相互作用することにより、前駆細胞の一部は破骨細胞へ成熟することなく血中へ再還流されることを本発明者らは初めて見出した（図１参照）。
【００１４】
具体的には、次の方法により確認した。まず、前駆細胞における各種Ｓ１Ｐ受容体の遺伝子の発現を逆転写ＰＣＲ（以下ＲＴ−ＰＣＲ）法を用いて調べた（図２Ａ参照）。前駆細胞より抽出したメッセンジャーＲＮＡ（以下ｍＲＮＡ）を基にして逆転写酵素により相補的ＤＮＡ（以下ｃＤＮＡ）を作製し、これを鋳型として各種遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ反応を行う。目的とする遺伝子が発現する場合、ＰＣＲ反応産物を電気泳動するとバンドが検出されることになる。なお、図２Ａに示すＲＴは逆転写反応を意味し、ＲＴ（＋）は反応を行ったもの、ＲＴ（−）は反応を行わなかったもの意味する。ＲＴ（−）はｍＲＮＡを抽出する際に、ゲノムのＤＮＡがコンタミネーションしていないことを確認するためのネガティブ・コントロールである。
【００１５】
上記の手法により、前駆細胞においては、ＲＡＮＫＬを加えない系（ＲＡＮＫＬ（−））では、Ｓ１Ｐ１およびＳ１Ｐ２のｍＲＮＡが発現していることが確認された。一方、ＲＡＮＫＬを添加した系（ＲＡＮＫＬ（＋））では、Ｓ１Ｐ１の発現が著明に減弱しており、Ｓ１Ｐ２の発現が不変〜軽度亢進していることが確認された。この結果より、ＲＡＮＫＬ添加により、前駆細胞が成熟破骨細胞へと分化していく過程において、Ｓ１Ｐ１の発現が減少すると考察された。
【００１６】
さらに研究を進め、前駆細胞にＲＡＮＫＬ（＋）およびＲＡＮＫＬ（−）の各系で、各濃度のＳ１Ｐを加えて前駆細胞の走化性を調べた（図２Ｂ参照）。その結果、前駆細胞はＲＡＮＫＬ（−）の系では、Ｓ１Ｐ濃度依存的に細胞の走化性が増強していることが確認されたが、ＲＡＮＫＬ（＋）の系ではＳ１Ｐの濃度を変えても細胞の走化性の増強はほとんど認められなかった。さらに、前駆細胞に走化性に関連する因子Ｒａｃが存在していることを確認した（図２Ｃ）。
【００１７】
このことから、ＲＡＮＫＬ（−）の系では、血中のＳ１Ｐと前駆細胞に発現したＳ１Ｐ１の相互作用により前駆細胞の走化性が増強され、前駆細胞が血中に再還流され、骨組織から離脱することが考察された。一方、ＲＡＮＫＬ（＋）の系では前駆細胞は成熟破骨細胞に分化しつつあり、Ｓ１Ｐ１の発現が認められないため、血中のＳ１ＰとＳ１Ｐ１との相互作用が起こらず、細胞の走化性も認められず、その結果細胞は骨組織内に残り、骨吸収を促進するものと考えられた。
【００１８】
上記Ｓ１ＰとＳ１Ｐ受容体の相互作用に着目した骨吸収メカニズムについては、今まで全く報告されていなかった。本発明者らは、かかるメカニズムに着目し、Ｓ１Ｐに対する正の走化性を有するＳ１Ｐ受容体に作用し、前駆細胞の走化性に影響を及ぼす物質を測定することによる新規骨吸収抑制剤のスクリーニング方法を完成した。より詳しくは、前駆細胞の走化性を向上しうる物質を測定することによるスクリーニング方法を完成した。
【００１９】
本発明における新規骨吸収抑制剤のスクリーニングは、少なくとも以下の工程を含む方法により行うことができる。
１）破骨細胞前駆細胞にＳ１Ｐ受容体作用薬である候補物質を添加する工程；
２）破骨細胞前駆細胞の走化性を測定する工程。
【００２０】
本発明において、Ｓ１Ｐとは式（Ｉ）で示されるスフィンゴシン１リン酸を意味する。
【化１】
【００２１】
Ｓ１Ｐ受容体では、Ｓ１Ｐ１〜Ｓ１Ｐ５の５種類のＧ蛋白質共役受容体が知られている。本発明のＳ１Ｐ受容体としては、Ｓ１Ｐに対する正の走化性を示すＳ１Ｐ受容体が挙げられ、より好ましくはＳ１Ｐ１が挙げられる。
【００２２】
本発明のスクリーニング方法に使用する前駆細胞は、破骨細胞前駆細胞であればよく、特に制限されないが、スクリーニング系に使用するためには、株化され、入手可能な細胞であることが好ましい。このような細胞株としては、ＲＡＷ２６４．７細胞、ＭＯＣＰ−５細胞、ＢＭ２細胞、ＨＬ−６０細胞などが挙げられ、好ましくはＲＡＷ２６４．７細胞、ＭＯＣＰ−５細胞であり、最も好ましくはＲＡＷ２６４．７細胞である。
【００２３】
本発明のスクリーニング方法で使用する走化性の測定は、自体公知の方法により行うことができる。具体的には、細胞走化性測定技術として公知のボイデンチェンバー法、ジグモンドチェンバー法やその変法を採用することができる。さらに、今後開発される新たな細胞走化性測定技術を採用することもできる。具体的には、多数の孔を有するメンブレンにより遮断された上室に細胞を加え、下段に走化性因子を加え、一定時間反応させると、走化性因子に対して遊走活性を示す細胞は、メンブレンの孔を通過して下室に落ちるか、あるいはメンブレンの裏側に接着する。その落下した細胞を直接計測するか、またはメンブレンに接着した細胞を固定・染色後に一定面積内の細胞を計測することにより、走化性の有無を判定することができる。チェンバーをマルチウェルとすることにより、多くの試料を処理することができる。例えば、Neuro Probe社製のケモタキシスチェンバーが市販されており、利用することができる。
【００２４】
より具体的には、次の方法によりスクリーニングすることができる。
上述の前駆細胞を、細胞増殖に必要な培地を用いて２〜７日間培養容器内で培養する。得られた細胞を、常法に従って培養容器から単離し、細胞の維持に必要な培地に懸濁し、細胞浮遊液を調製する。細胞浮遊液中の細胞の濃度は、走化性の測定方法に従い、適宜決定することができる。
【００２５】
例えば、Neuro Probe社製のケモタキシスチェンバーを用いる場合について説明するが、これらに制限されるものではない。ケモタキシスチェンバーの下段には適当な濃度に希釈したＳ１Ｐ受容体作用薬である候補物質を含む溶液を満たし、メンブレンをセットし、さらに上段に上記得られた細胞浮遊液を加えて、適当な時間培養する。培養時間は、細胞の種類、細胞数、候補物質の濃度等により適宜決定することができる。培養後、メンブレンをチェンバーから取り外し、その後メンブレンに付着している細胞を固定し、染色する。その後、上室に接していた面の細胞をふき取り風乾したのち、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度を測定することにより、候補物質による細胞の走化性を測定し、評価することができる。
【００２６】
スクリーニングの対象となる候補物質は、低分子化合物、天然物由来の化合物、ペプチドなど、公知の医薬品スクリーニングシステムで使用しているスクリーニングの対象となる候補物質などを広く利用することができる。本発明では、Ｓ１Ｐ受容体との相互作用による前駆細胞の走化性に影響を及ぼす物質、具体的にはＳ１Ｐ１との相互作用による前駆細胞の走化性に影響を及ぼす物質をスクリーニングするため、Ｓ１Ｐ１の構造から新たに設計される物質も対象とすることができる。さらには、Ｓ１Ｐ受容体作用薬を候補物質として挙げることができる。Ｓ１Ｐ受容体作用薬として、Ｓ１Ｐに対する正の走化性を示すＳ１Ｐ受容体に作用し、活性化するものであればよく、天然および非天然の化合物も含まれる。Ｓ１Ｐ受容体作用薬のうち、特に好ましくはＳ１Ｐ１作用薬が挙げられる。
【００２７】
Ｓ１Ｐ１作用薬として、例えば5-(4-フェニル-5-トリフルオロメチルチオフェン-2-イル)-3-(3-トリフルオロメチルフェニル)-1,2,4-オキサジアゾール（5-(4-Phenyl-5-trifluoromethylthiophen-2-yl)-3-(3-trifluoromethylphenyl)-1,2,4-oxadiazole, 以下「ＳＥＷ２８７１」という。）およびその誘導体、2-アミノ-2-{2-[4-(3-ベンジルオキシフェニルチオ)-2-クロロフェニル]エチル}-1,3-プロパンジオール ヒドロクロリド（2-amino-2-{2-[4-(3-benzyloxyphenylthio)-2-chlorophenyl]ethyl}-1,3-propanediol hydrochloride, 以下「ＫＲＰ−２０３」という。）およびその誘導体、並びに2-アミノ-2-[2-(4-オクチルフェニル)エチル]プロパン-1,3-ジオール ヒドロクロリド（2-amino-2-[2-(4-octylphenyl)ethyl]propane-1,3-diol hydrochloride, 以下「ＦＴＹ７２０」という。） およびその誘導体を例示することができる。ＦＴＹ７２０は、冬虫夏草の一種であるlasaria sinclairii菌が産生するミリオシン（myriocin）をリード化合物として、化学修飾により創製された化合物である。細胞傷害を引き起こすＴ細胞に直接作用することが特徴で、既存の薬剤もしくは既存の免疫抑制剤と併用することで、臓器移植の拒絶反応抑制や自己免疫疾患などの治療薬になると期待されている。ＫＲＰ−２０３は、ＦＴＹ７２０と同様に、拒絶反応を抑える免疫抑制剤として使用可能であることが報告されている（Shimizu et al., Circulation 2005、Takahashi et al., Transplant Proc 2005）。
【００２８】
本発明は、上記新規骨吸収抑制剤のスクリーニング方法の他、該スクリーニング法によりスクリーニングされた物質である新規骨吸収抑制剤にも及ぶ。具体的には、上記スクリーニング方法により、前駆細胞が、Ｓ１Ｐ１作用薬であるＳＥＷ２８７１に対し、Ｓ１Ｐと同様に正の走化性を示すことが確認されたため、ＳＥＷ２８７１が新規骨吸収抑制剤として適用されることが考えられる。
【実施例】
【００２９】
以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
【００３０】
（実施例１）前駆細胞とＳ１Ｐとの作用について
１）Ｓ１Ｐの受容体発現の確認
前駆細胞および破骨細胞について、Ｓ１Ｐ１〜Ｓ１Ｐ５およびインテグリンαｖのｍＲＮＡの発現を確認した。ｍＲＮＡの発現確認のため、対照としてＧＡＰＤＨについても調べた。
【００３１】
前駆細胞の細胞株であるＲＡＷ２６４．７細胞を、培地としてαＭＥＭ（Minimal Essential Medium）に１０％熱非働化ウシ胎児血清（以下、「ＦＣＳ」）とペニシリン／ストレプトマイシンを加えたものを用いて、ＲＡＮＫＬを添加しない系（ＲＡＮＫＬ（−））および終濃度５０ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬを添加した系（ＲＡＮＫＬ（＋））で３７℃、３日間培養した。この細胞をセルスクレーパーを用いて単離して集め、該細胞からフェノール・クロロホルム抽出によりＲＮＡを抽出し、これを基にして逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製した。これを鋳型として各種遺伝子（Ｓ１Ｐ１〜Ｓ１Ｐ５、インテグリンαｖ、ＧＡＰＤＨ）に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲに用いたプライマーの配列は下記の通りである。
【００３２】
Ｓ１Ｐ１（正方向プライマー）：5'-GCTGCTTGATCATCCTAGAG-3'（配列番号１）
Ｓ１Ｐ１（逆方向プライマー）：5'-GAAAGGAGCGCGAGCTGTTG-3'（配列番号２）
Ｓ１Ｐ２（正方向プライマー）：5'-CCAAGGAGACGCTGGACATG-3'（配列番号３）
Ｓ１Ｐ２（逆方向プライマー）：5'-TGCCGTAGAGCTTGACCTTG-3'（配列番号４）
Ｓ１Ｐ３（正方向プライマー）：5'-GCAACTTGGCTCTCTGCGAC-3'（配列番号５）
Ｓ１Ｐ３（逆方向プライマー）：5'-GACGATGGTCACCAGAATGG-3'（配列番号６）
Ｓ１Ｐ４（正方向プライマー）：5'-GTGTATGGCTGCATCGGTCTGTG-3'（配列番号７）
Ｓ１Ｐ４（逆方向プライマー）：5'-GGATTAATGGCTGAGTTGAACACG-3'（配列番号８）
Ｓ１Ｐ５（正方向プライマー）：5'-GTGGCGCTCGCCGCGTCGGTG-3'（配列番号９）
Ｓ１Ｐ５（逆方向プライマー）：5'-GAAGGTGTAGATGATGGGATTCAG-3'（配列番号１０）
インテグリンαｖ（正方向プライマー）：5'-ACAGAGTACTTCTCGGTGGT-3'（配列番号１１）
インテグリンαｖ（逆方向プライマー）：5'-ACACATCTGCGTAATCATCC-3'（配列番号１２）
ＧＡＰＤＨ（正方向プライマー）：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'（配列番号１３）
ＧＡＰＤＨ（逆方向プライマー）：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'（配列番号１４）
【００３３】
ＰＣＲ反応を、９５℃・４５秒、５５℃・３０秒、７２℃・１分で２５サイクル行い、ＰＣＲ産物を得た。得られたＰＣＲ産物を１０×loading bufferと混合し、２％アガロースゲルにて１００Ｖ・２０分の電気泳動を行い、目的とする遺伝子の発現を確認した。
【００３４】
その結果を図２Ａに示した。前駆細胞においては、ＲＡＮＫＬ（−）の系では、Ｓ１Ｐ１およびＳ１Ｐ２のｍＲＮＡが発現していることが確認された。一方、ＲＡＮＫＬ（＋）の系では、Ｓ１Ｐ１の発現が著明に減弱しており、Ｓ１Ｐ２の発現が不変〜軽度亢進していることが確認された。また、Ｓ１Ｐ３〜Ｓ１Ｐ５の発現は見られなかった。
【００３５】
なお、前駆細胞および破骨細胞に発現し、ＲＡＮＫＬにてその発現が亢進することが知られているインテグリンαｖについては、ＲＡＷ２６４．７細胞においてもＲＡＮＫＬ（＋）の系で発現増強が見られた。これより、本実験系において前駆細胞はＲＡＮＫＬにより分化誘導シグナルを受けていることが確認された。また、ＧＡＰＤＨの結果より、ＲＡＮＫＬ（＋）（−）の系で全ｍＲＮＡレベルに変化がない（またはその抽出過程での変化もない）ことを確認した。図２Ａにおいて、ＲＴは逆転写反応を意味し、ＲＴ（＋）は逆転写反応を行ったもの、ＲＴ（−）は反応を行わなかったもの意味する。ＲＴ（−）はｍＲＮＡを抽出する際に、ゲノムのＤＮＡがコンタミネーションしていないことを確認するためのネガティブ・コントロールである。
【００３６】
２）前駆細胞のＳ１Ｐに対する走化性の確認
上記１）と同様に、ＲＡＮＫＬ（−）および（＋）の系で３７℃、３日間培養したＲＡＷ２６４．７細胞をセルスクレーパーおよび０．０２５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて単離した。９６ウェル・ケモタキシスチェンバー(Neuro Probe社製）にフィブロネクチンでコートしたポリカーボン製メンブレンフィルターをセットし、下段にはＳ１Ｐの終濃度が０，１０−８，１０−７，１０−６，１０−５Ｍとなるように調製したＳ１Ｐ含有培地を加えた。上段には単離したＲＡＷ２６４．７細胞を、１ウェルあたり３×１０５個加え、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃、５時間培養した。その後、メンブレンフィルターを取り出してヘマトキシリン・エオジン染色を行い、プレートリーダーを用いて吸光度を測定し、走化性によりメンブレンフィルターへ移動した細胞の数を定量した。
【００３７】
その結果を図２Ｂに示した。in vitroの実験系で、ＲＡＮＫＬ（−）、すなわち前駆細胞がＳ１Ｐに対する走化性を示すことが確認された
【００３８】
３）前駆細胞内でのＲａｃの活性化の確認
上記１）および２）と同様に、ＲＡＮＫＬ（−）の系で３７℃、３日間培養したＲＡＷ２６４．７細胞を、Ｓ１Ｐの終濃度が０，１０−７，１０−６，１０−５Ｍとなるように調製したＳ１Ｐ含有培地を用いてさらに３時間培養した。該ＲＡＷ２６４．７細胞をセルスクレーパーを用いて単離し、遠心分離により細胞を沈殿させた。沈殿した細胞を蛋白質抽出用緩衝液（150 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM Hepes-NaOH (pH 7.4), 1 mM PMSF, プロテアーゼ阻害剤カクテル）を用いて再懸濁し、これを超音波破砕器で処理し、高速微量遠心分離により不溶解物を除去したものをＲａｃ活性測定用の試料とした。
【００３９】
上記により得た試料の１／１００量を分離し、サンプル１（Ｒａｃ（１／１００））とした。残りの試料に、グルタチオン・セファロース（ビーズ）に固着させた「活性型（ＧＴＰ結合型）Ｒａｃ結合ドメイン蛋白質（大腸菌で発現・精製）」を添加し、プルダウン・アッセイ法（標準的プロトコールに従う）によりこれに結合する蛋白質を単離し、サンプル２（ＧＴＰ−Ｒａｃ）とした。
【００４０】
サンプル１およびサンプル２について、１５％アクリルアミドゲルにてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動終了後、ＰＶＤＦ膜へトランスファーした後に、抗Ｒａｃ抗体（Upstate Biotechnology社製）を用いてウェスタン・ブロッティングを行い、膜上でのＲａｃ蛋白質の同定を行った。この方法により、前駆細胞内での総Ｒａｃ量（Ｒａｃ（１／１００））、及び活性型（ＧＴＰ結合型）Ｒａｃ量（ＧＴＰ−Ｒａｃ）のそれぞれを調べた。
【００４１】
その結果を図２Ｃに示した。Ｓ１Ｐの添加により、細胞内での総Ｒａｃ量（Ｒａｃ（１／１００））には変化がないのに対し、走化性に重要な活性型Ｒａｃ（ＧＴＰ−Ｒａｃ）が増加していることが認められた。この結果は、Ｓ１Ｐによる刺激により前駆細胞内でＲａｃの活性化が見られることを意味している。
【００４２】
４）結果
前駆細胞にＳ１Ｐの受容体（Ｓ１Ｐ１およびＳ１Ｐ２）が発現していることが確認された。また、ＲＡＮＫＬの刺激により前駆細胞が成熟破骨細胞に分化すると、Ｓ１Ｐ１の発現が低下することが確認された（図２Ａ）。in vitroの実験系で、前駆細胞が実際にＳ１Ｐに対する走化性を示すことが確認された（図２Ｂ）。さらに、走化性に重要なＲａｃの活性化が前駆細胞内で起こっていることが確認された（図２Ｃ）。
【００４３】
（実施例２）前駆細胞にＳＥＷ２８７１を加えたときのＳ１Ｐに対する走化性の確認
１）実験方法
実施例１−３）と同様に、ＲＡＮＫＬ（−）の系で３日間培養したＲＡＷ２６４．７細胞を、セルスクレーパーおよび０．０２５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて単離した。９６ウェル・ケモタキシスチェンバーにフィブロネクチンでコートしたポリカーボン製メンブレンフィルターをセットし、下段にＳＥＷ２８７１の終濃度が０，１０−７，１０−６，１０−５，１０−４Ｍとなるように調製したＳＥＷ２８７１含有培地を加え、上段には単離したＲＡＷ２６４．７細胞を１ウェルあたり３×１０５個加え、ＣＯ２インキュベーターにて、３７℃、５時間培養した。その後、メンブレンフィルターを取り出し、ヘマトキシリン・エオジン染色し、プレートリーダーを用いて吸光度を測定し、走化性によりメンブレンフィルターへ移動した細胞の数を定量した。
【００４４】
２）結果
前駆細胞がＳ１Ｐ１作用薬であるＳＥＷ２８７１に対し、正の走化性を示すことが明らかになった（図３参照）。
【００４５】
（実施例３）マウス骨組織でのＳ１Ｐの発現
マウスを４％パラホルムアルデヒド（０．１Ｍリン酸緩衝液で溶解）で還流固定した後に、大腿骨を摘出した。これを４℃で４％パラホルムアルデヒド溶液で後固定した後に、１０％ＥＤＴＡ＋７．５％ショ糖溶液で脱灰した。その後３０％ショ糖溶液で脱水を行い、これを凍結薄切用コンパウンドで包埋・急速凍結し、凍結薄切機を用いて薄切した。これをスライドガラスに定着させたものを、リン酸緩衝液でよく洗浄した後に、抗Ｓ１Ｐ１抗体、および前駆細胞・破骨細胞のマーカーであるＣＤ９に対する抗体を用いて、標準的プロトコールにより免疫組織染色を行った。これを共焦点レーザー走査装置を備えた生物微分干渉（ノマルスキー）顕微鏡により観察した。
【００４６】
その結果、in vivoにおけるマウス骨組織において、Ｓ１Ｐ１の発現が認められることが確認された（図４ａ参照（矢印））。これはＣＤ９の発現と重なるため、Ｓ１Ｐ１陽性細胞は、前駆細胞と考えられた。さらに、骨梁（図４ａ）に接している成熟破骨細胞にはＳ１Ｐ１の発現は認められなかった（図４ａ（＊））。これはＲＡＮＫＬ刺激により前駆細胞が成熟するとＳ１Ｐ１の発現が低下することを示し、ＲＴ−ＰＣＲ法による増幅産物の分析結果（図２Ａ）と一致した。
【００４７】
（実施例４）Ｓ１Ｐ１の刺激によるマウス骨組織での前駆細胞の減少効果
マウスに、Ｓ１Ｐ１に対するpotent agonistであるＳＥＷ２８７１を添加した系（ＳＥＷ２８７１（＋））および添加しない系（ＳＥＷ２８７１（−））での前駆細胞に及ぼす影響を調べた。ＳＥＷ２８７１（−）の系は、リン酸緩衝液＋１０％ウシ血清アルブミン＋１０％ＤＭＳＯのみのビヒクルをサンプルとし、ＳＥＷ２８７１（＋）の系は、ビヒクルに終濃度１０μＭのＳＥＷ２８７１を加えたものをサンプルとした。
【００４８】
各々５匹のマウスについて、ＳＥＷ２８７１（−）およびＳＥＷ２８７１（＋）の各サンプル０．３ｍｌを尾静脈より緩やかに静脈内投与した。３時間後に上記各マウスを４％パラホルムアルデヒド（０．１Ｍリン酸緩衝液で溶解）で還流固定した。以降は実施例３と同様に、凍結切片を作製し、抗Ｓ１Ｐ１抗体を用いて染色した。ＳＥＷ２８７１（−）のサンプルを投与した系に比べ、ＳＥＷ２８７１（＋）のサンプルを投与した系では、マウスの骨組織でのＳ１Ｐ１陽性細胞、すなわち前駆細胞の数が有意に低下していることが確認された（図５）。これにより、Ｓ１Ｐ受容体作動薬であるＳＥＷ２８７１の投与により、前駆細胞の骨表面への導入が抑制されることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
以上詳述したように、本発明のスクリーニング方法により、新規骨吸収抑制剤をスクリーニングすることができる。本発明のスクリーニング方法により得られた新規骨吸収抑制剤、例えばＳＥＷ２８７１は、前駆細胞のＳ１Ｐ１が増強されることで、走化性により前駆細胞が骨表面から血中に出て行き、前駆細胞を血中への再還流へと導き、前駆細胞の骨表面への導入を抑制し、前駆細胞から破骨細胞に成熟するのを抑制し、結果として骨表面で成熟する破骨細胞の数を抑えることができる。本発明のスクリーニング方法により得られた薬剤は、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、骨ページェット病、および変形性関節炎などの治療薬剤や骨折、腰痛およびリウマチなどの骨関節疾患の症状を予防および改善する薬剤として利用されうる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】破骨細胞による骨吸収メカニズムおよび前駆細胞の血中への再還流メカニズムを示す図である。
【図２】前駆細胞と破骨細胞について、Ｓ１Ｐ受容体の発現およびＳ１Ｐに対する走化性を調べた図である。（実施例１）
【図３】各濃度のＳＥＷ２８７１を含む系での前駆細胞のＳ１Ｐに対する走化性を示す図である。（実施例２）
【図４】マウス骨組織でのＳ１Ｐ１の発現およびＣＤ９の発現を示す図である。（実施例３）
【図５】ＳＥＷ２８７１（−）および（＋）の系でのＳ１Ｐ１の刺激によるマウス骨組織での前駆細胞を示す図である。（実施例４）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規メカニズムを有する骨吸収抑制剤のスクリーニング方法および該スクリーニング方法により得られた新規骨吸収抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
スフィンゴシン１リン酸（以下、「Ｓ１Ｐ」という。）は、血中に存在する脂質メディエーターの１種であり、その受容体としてスフィンゴシン１リン酸受容体１型（Ｓ１Ｐ１）〜スフィンゴシン１リン酸受容体５型（Ｓ１Ｐ５）の５種類のＧ蛋白質共役受容体が知られている。特にＳ１Ｐ１とＳ１Ｐ３はＲａｃの活性を促進化し、Ｓ１Ｐに対する正の走化性（chemotaxis）を誘導するといわれており、逆にＳ１Ｐ２は走化性を抑制するといわれている。
【０００３】
これまでＳ１Ｐは、免疫システムでのリンパ球などの移動に重要であることが示されてきた。例えば、Ｔリンパ球がリンパ節内で抗原提示を受けて全身循環に戻っていくときに、Ｓ１Ｐ１の発現が増強することで、血中に戻っていくことができるようになる機構が知られている（Nat Rev Immunol. 2005 Jul;5(7):560-70. Review）。
【０００４】
骨組織は「骨芽細胞による骨新生」と「破骨細胞による骨吸収」のバランスによって恒常性が維持されている。中でも破骨細胞は、血球系の単球・マクロファージ由来の細胞であり、その前駆細胞が血中から骨表面に定着し、その場所で骨芽細胞からＲＡＮＫＬ（receptor activator of NF kappa B ligand）という分化因子による刺激を受けることにより破骨能を持った成熟破骨細胞に分化し、骨吸収が行われる（Nat Rev Genet. 2003 Aug;4(8):638-49. Review）。関節リウマチや閉経後骨粗鬆症などの骨吸収性疾患では、この破骨細胞の活性が増強している。骨粗鬆症の治療薬としては、骨量の減少を防止しうる薬剤として、ビタミンＤ３、ビタミンＫ２、イプリフラボンなどが使用されており、骨減少を防止し、骨量増加が期待される薬剤として、女性ホルモンの１種であるエストロゲンやエストロゲン受容体に作用する薬剤（選択的エストロゲン受容体モデュレーター、通称ＳＥＲＭ）などが使用されている。また、近年、最も効果が期待されている薬剤として破骨細胞を細胞死させて機能を抑えるビスフォスフォネート製剤が、これらの骨吸収性疾患の予防・治療薬として汎用されている。ビスフォスフォネート製剤は骨表面に接着し、これを破骨細胞が取り込むことによりアポトーシスが誘導されると考えられている。
【０００５】
骨関節疾患の予防および改善薬として、スフィンゴシン骨格を有する化合物を有効成分とする薬剤が開示されている（特許文献１）。また、スフィンゴシン骨格を有する化合物を有効成分とする骨形成促進剤についても開示されている（特許文献２）。これらの文献は、スフィンゴシン骨格を有する化合物が骨芽細胞を活性化し、骨形成促進剤としての機能を有することが開示されている。
【０００６】
【特許文献１】特開2001-158736号公開公報
【特許文献２】特開2004-231616号公開公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、破骨細胞前駆細胞（以下、単に「前駆細胞」という。）が破骨細胞に成熟する前に、骨表面から前駆細胞を引き離して破骨細胞に成熟するのを阻止し、成熟破骨細胞による骨吸収を抑制しうる新規骨吸収抑制剤のスクリーニング方法および新規骨吸収抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、前駆細胞にＳ１Ｐ１が発現していることを初めて確認し、Ｓ１Ｐ１の血中Ｓ１Ｐへの走化性により前駆細胞が血中へ再還流しうることを見出した。これにより前駆細胞のＳ１Ｐ１を作動させて前駆細胞を血中へ還流させることで、前駆細胞から破骨細胞へ成熟するのを阻止し、破骨細胞による骨吸収を抑制しうることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．破骨細胞前駆細胞と候補物質を含む系において、スフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体と候補物質との相互作用による、破骨細胞前駆細胞の走化性を測定することを特徴とする新規骨吸収抑制剤のスクリーニング方法。
２．少なくとも以下の工程を含む前項１に記載のスクリーニング方法：
１）破骨細胞前駆細胞に候補物質を添加する工程；
２）破骨細胞前駆細胞の走化性を測定する工程。
３．Ｓ１Ｐ受容体が、Ｓ１Ｐ１である前項１または２に記載のスクリーニング方法。
４．候補物質が、Ｓ１Ｐ受容体作用薬である前項１〜３のいずれか１に記載のスクリーニング方法。
５．前項１〜４のいずれか１に記載の方法によりスクリーニングされた新規骨吸収抑制剤。
６．Ｓ１Ｐ１に作用する薬剤からなる新規骨吸収抑制剤。
７．Ｓ１Ｐ１に作用する薬剤が、5-(4-フェニル-5-トリフルオロメチルチオフェン-2-イル)-3-(3-トリフルオロメチルフェニル)-1,2,4-オキサジアゾールまたはその誘導体である、前項６に記載の新規骨吸収抑制剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のスクリーニング方法により、前駆細胞から破骨細胞に成熟するのを抑制し、破骨細胞による骨吸収を抑制しうる新規メカニズムを有する薬剤をスクリーニングすることができる。スクリーニングにより選別された薬剤は、関節リウマチや閉経後骨粗鬆症などの骨吸収性疾患の治療および／または予防薬に適用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
まずはじめに、前駆細胞から破骨細胞に成熟する場合の骨吸収メカニズムについて説明する。背景技術の欄でも示したように、骨組織は骨芽細胞による骨新生と破骨細胞による骨吸収のバランスによって恒常性が維持されている。
破骨細胞の膜表面には分化や機能調節をつかさどる膜表面分子が存在している。正の制御に関与するものとして、ＲＡＮＫ（ＲＡＮＫＬレセプター）とＩＬ−１レセプター、およびインテグリンαｖβ３などが挙げられる。
【００１２】
血中の前駆細胞が骨組織内に侵入すると、前駆細胞の一部はＲＡＮＫとＲＡＮＫＬの相互作用により骨表面に定着する。前駆細胞がＲＡＮＫＬにより刺激を受けて成熟破骨細胞に成熟し骨吸収機能を有するようになる。
【００１３】
本発明者らは、前駆細胞と成熟破骨細胞中のＳ１Ｐ受容体に着目し、その有無を確認した。本発明者らは、前駆細胞にＳ１Ｐ受容体の１種であるＳ１Ｐ１が発現していることを初めて確認した。次に前駆細胞とＳ１Ｐ１の関係に着目し、前駆細胞に発現したＳ１Ｐ１と血中のＳ１Ｐが相互作用することにより、前駆細胞の一部は破骨細胞へ成熟することなく血中へ再還流されることを本発明者らは初めて見出した（図１参照）。
【００１４】
具体的には、次の方法により確認した。まず、前駆細胞における各種Ｓ１Ｐ受容体の遺伝子の発現を逆転写ＰＣＲ（以下ＲＴ−ＰＣＲ）法を用いて調べた（図２Ａ参照）。前駆細胞より抽出したメッセンジャーＲＮＡ（以下ｍＲＮＡ）を基にして逆転写酵素により相補的ＤＮＡ（以下ｃＤＮＡ）を作製し、これを鋳型として各種遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ反応を行う。目的とする遺伝子が発現する場合、ＰＣＲ反応産物を電気泳動するとバンドが検出されることになる。なお、図２Ａに示すＲＴは逆転写反応を意味し、ＲＴ（＋）は反応を行ったもの、ＲＴ（−）は反応を行わなかったもの意味する。ＲＴ（−）はｍＲＮＡを抽出する際に、ゲノムのＤＮＡがコンタミネーションしていないことを確認するためのネガティブ・コントロールである。
【００１５】
上記の手法により、前駆細胞においては、ＲＡＮＫＬを加えない系（ＲＡＮＫＬ（−））では、Ｓ１Ｐ１およびＳ１Ｐ２のｍＲＮＡが発現していることが確認された。一方、ＲＡＮＫＬを添加した系（ＲＡＮＫＬ（＋））では、Ｓ１Ｐ１の発現が著明に減弱しており、Ｓ１Ｐ２の発現が不変〜軽度亢進していることが確認された。この結果より、ＲＡＮＫＬ添加により、前駆細胞が成熟破骨細胞へと分化していく過程において、Ｓ１Ｐ１の発現が減少すると考察された。
【００１６】
さらに研究を進め、前駆細胞にＲＡＮＫＬ（＋）およびＲＡＮＫＬ（−）の各系で、各濃度のＳ１Ｐを加えて前駆細胞の走化性を調べた（図２Ｂ参照）。その結果、前駆細胞はＲＡＮＫＬ（−）の系では、Ｓ１Ｐ濃度依存的に細胞の走化性が増強していることが確認されたが、ＲＡＮＫＬ（＋）の系ではＳ１Ｐの濃度を変えても細胞の走化性の増強はほとんど認められなかった。さらに、前駆細胞に走化性に関連する因子Ｒａｃが存在していることを確認した（図２Ｃ）。
【００１７】
このことから、ＲＡＮＫＬ（−）の系では、血中のＳ１Ｐと前駆細胞に発現したＳ１Ｐ１の相互作用により前駆細胞の走化性が増強され、前駆細胞が血中に再還流され、骨組織から離脱することが考察された。一方、ＲＡＮＫＬ（＋）の系では前駆細胞は成熟破骨細胞に分化しつつあり、Ｓ１Ｐ１の発現が認められないため、血中のＳ１ＰとＳ１Ｐ１との相互作用が起こらず、細胞の走化性も認められず、その結果細胞は骨組織内に残り、骨吸収を促進するものと考えられた。
【００１８】
上記Ｓ１ＰとＳ１Ｐ受容体の相互作用に着目した骨吸収メカニズムについては、今まで全く報告されていなかった。本発明者らは、かかるメカニズムに着目し、Ｓ１Ｐに対する正の走化性を有するＳ１Ｐ受容体に作用し、前駆細胞の走化性に影響を及ぼす物質を測定することによる新規骨吸収抑制剤のスクリーニング方法を完成した。より詳しくは、前駆細胞の走化性を向上しうる物質を測定することによるスクリーニング方法を完成した。
【００１９】
本発明における新規骨吸収抑制剤のスクリーニングは、少なくとも以下の工程を含む方法により行うことができる。
１）破骨細胞前駆細胞にＳ１Ｐ受容体作用薬である候補物質を添加する工程；
２）破骨細胞前駆細胞の走化性を測定する工程。
【００２０】
本発明において、Ｓ１Ｐとは式（Ｉ）で示されるスフィンゴシン１リン酸を意味する。
【化１】
【００２１】
Ｓ１Ｐ受容体では、Ｓ１Ｐ１〜Ｓ１Ｐ５の５種類のＧ蛋白質共役受容体が知られている。本発明のＳ１Ｐ受容体としては、Ｓ１Ｐに対する正の走化性を示すＳ１Ｐ受容体が挙げられ、より好ましくはＳ１Ｐ１が挙げられる。
【００２２】
本発明のスクリーニング方法に使用する前駆細胞は、破骨細胞前駆細胞であればよく、特に制限されないが、スクリーニング系に使用するためには、株化され、入手可能な細胞であることが好ましい。このような細胞株としては、ＲＡＷ２６４．７細胞、ＭＯＣＰ−５細胞、ＢＭ２細胞、ＨＬ−６０細胞などが挙げられ、好ましくはＲＡＷ２６４．７細胞、ＭＯＣＰ−５細胞であり、最も好ましくはＲＡＷ２６４．７細胞である。
【００２３】
本発明のスクリーニング方法で使用する走化性の測定は、自体公知の方法により行うことができる。具体的には、細胞走化性測定技術として公知のボイデンチェンバー法、ジグモンドチェンバー法やその変法を採用することができる。さらに、今後開発される新たな細胞走化性測定技術を採用することもできる。具体的には、多数の孔を有するメンブレンにより遮断された上室に細胞を加え、下段に走化性因子を加え、一定時間反応させると、走化性因子に対して遊走活性を示す細胞は、メンブレンの孔を通過して下室に落ちるか、あるいはメンブレンの裏側に接着する。その落下した細胞を直接計測するか、またはメンブレンに接着した細胞を固定・染色後に一定面積内の細胞を計測することにより、走化性の有無を判定することができる。チェンバーをマルチウェルとすることにより、多くの試料を処理することができる。例えば、Neuro Probe社製のケモタキシスチェンバーが市販されており、利用することができる。
【００２４】
より具体的には、次の方法によりスクリーニングすることができる。
上述の前駆細胞を、細胞増殖に必要な培地を用いて２〜７日間培養容器内で培養する。得られた細胞を、常法に従って培養容器から単離し、細胞の維持に必要な培地に懸濁し、細胞浮遊液を調製する。細胞浮遊液中の細胞の濃度は、走化性の測定方法に従い、適宜決定することができる。
【００２５】
例えば、Neuro Probe社製のケモタキシスチェンバーを用いる場合について説明するが、これらに制限されるものではない。ケモタキシスチェンバーの下段には適当な濃度に希釈したＳ１Ｐ受容体作用薬である候補物質を含む溶液を満たし、メンブレンをセットし、さらに上段に上記得られた細胞浮遊液を加えて、適当な時間培養する。培養時間は、細胞の種類、細胞数、候補物質の濃度等により適宜決定することができる。培養後、メンブレンをチェンバーから取り外し、その後メンブレンに付着している細胞を固定し、染色する。その後、上室に接していた面の細胞をふき取り風乾したのち、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度を測定することにより、候補物質による細胞の走化性を測定し、評価することができる。
【００２６】
スクリーニングの対象となる候補物質は、低分子化合物、天然物由来の化合物、ペプチドなど、公知の医薬品スクリーニングシステムで使用しているスクリーニングの対象となる候補物質などを広く利用することができる。本発明では、Ｓ１Ｐ受容体との相互作用による前駆細胞の走化性に影響を及ぼす物質、具体的にはＳ１Ｐ１との相互作用による前駆細胞の走化性に影響を及ぼす物質をスクリーニングするため、Ｓ１Ｐ１の構造から新たに設計される物質も対象とすることができる。さらには、Ｓ１Ｐ受容体作用薬を候補物質として挙げることができる。Ｓ１Ｐ受容体作用薬として、Ｓ１Ｐに対する正の走化性を示すＳ１Ｐ受容体に作用し、活性化するものであればよく、天然および非天然の化合物も含まれる。Ｓ１Ｐ受容体作用薬のうち、特に好ましくはＳ１Ｐ１作用薬が挙げられる。
【００２７】
Ｓ１Ｐ１作用薬として、例えば5-(4-フェニル-5-トリフルオロメチルチオフェン-2-イル)-3-(3-トリフルオロメチルフェニル)-1,2,4-オキサジアゾール（5-(4-Phenyl-5-trifluoromethylthiophen-2-yl)-3-(3-trifluoromethylphenyl)-1,2,4-oxadiazole, 以下「ＳＥＷ２８７１」という。）およびその誘導体、2-アミノ-2-{2-[4-(3-ベンジルオキシフェニルチオ)-2-クロロフェニル]エチル}-1,3-プロパンジオール ヒドロクロリド（2-amino-2-{2-[4-(3-benzyloxyphenylthio)-2-chlorophenyl]ethyl}-1,3-propanediol hydrochloride, 以下「ＫＲＰ−２０３」という。）およびその誘導体、並びに2-アミノ-2-[2-(4-オクチルフェニル)エチル]プロパン-1,3-ジオール ヒドロクロリド（2-amino-2-[2-(4-octylphenyl)ethyl]propane-1,3-diol hydrochloride, 以下「ＦＴＹ７２０」という。） およびその誘導体を例示することができる。ＦＴＹ７２０は、冬虫夏草の一種であるlasaria sinclairii菌が産生するミリオシン（myriocin）をリード化合物として、化学修飾により創製された化合物である。細胞傷害を引き起こすＴ細胞に直接作用することが特徴で、既存の薬剤もしくは既存の免疫抑制剤と併用することで、臓器移植の拒絶反応抑制や自己免疫疾患などの治療薬になると期待されている。ＫＲＰ−２０３は、ＦＴＹ７２０と同様に、拒絶反応を抑える免疫抑制剤として使用可能であることが報告されている（Shimizu et al., Circulation 2005、Takahashi et al., Transplant Proc 2005）。
【００２８】
本発明は、上記新規骨吸収抑制剤のスクリーニング方法の他、該スクリーニング法によりスクリーニングされた物質である新規骨吸収抑制剤にも及ぶ。具体的には、上記スクリーニング方法により、前駆細胞が、Ｓ１Ｐ１作用薬であるＳＥＷ２８７１に対し、Ｓ１Ｐと同様に正の走化性を示すことが確認されたため、ＳＥＷ２８７１が新規骨吸収抑制剤として適用されることが考えられる。
【実施例】
【００２９】
以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
【００３０】
（実施例１）前駆細胞とＳ１Ｐとの作用について
１）Ｓ１Ｐの受容体発現の確認
前駆細胞および破骨細胞について、Ｓ１Ｐ１〜Ｓ１Ｐ５およびインテグリンαｖのｍＲＮＡの発現を確認した。ｍＲＮＡの発現確認のため、対照としてＧＡＰＤＨについても調べた。
【００３１】
前駆細胞の細胞株であるＲＡＷ２６４．７細胞を、培地としてαＭＥＭ（Minimal Essential Medium）に１０％熱非働化ウシ胎児血清（以下、「ＦＣＳ」）とペニシリン／ストレプトマイシンを加えたものを用いて、ＲＡＮＫＬを添加しない系（ＲＡＮＫＬ（−））および終濃度５０ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬを添加した系（ＲＡＮＫＬ（＋））で３７℃、３日間培養した。この細胞をセルスクレーパーを用いて単離して集め、該細胞からフェノール・クロロホルム抽出によりＲＮＡを抽出し、これを基にして逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製した。これを鋳型として各種遺伝子（Ｓ１Ｐ１〜Ｓ１Ｐ５、インテグリンαｖ、ＧＡＰＤＨ）に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲに用いたプライマーの配列は下記の通りである。
【００３２】
Ｓ１Ｐ１（正方向プライマー）：5'-GCTGCTTGATCATCCTAGAG-3'（配列番号１）
Ｓ１Ｐ１（逆方向プライマー）：5'-GAAAGGAGCGCGAGCTGTTG-3'（配列番号２）
Ｓ１Ｐ２（正方向プライマー）：5'-CCAAGGAGACGCTGGACATG-3'（配列番号３）
Ｓ１Ｐ２（逆方向プライマー）：5'-TGCCGTAGAGCTTGACCTTG-3'（配列番号４）
Ｓ１Ｐ３（正方向プライマー）：5'-GCAACTTGGCTCTCTGCGAC-3'（配列番号５）
Ｓ１Ｐ３（逆方向プライマー）：5'-GACGATGGTCACCAGAATGG-3'（配列番号６）
Ｓ１Ｐ４（正方向プライマー）：5'-GTGTATGGCTGCATCGGTCTGTG-3'（配列番号７）
Ｓ１Ｐ４（逆方向プライマー）：5'-GGATTAATGGCTGAGTTGAACACG-3'（配列番号８）
Ｓ１Ｐ５（正方向プライマー）：5'-GTGGCGCTCGCCGCGTCGGTG-3'（配列番号９）
Ｓ１Ｐ５（逆方向プライマー）：5'-GAAGGTGTAGATGATGGGATTCAG-3'（配列番号１０）
インテグリンαｖ（正方向プライマー）：5'-ACAGAGTACTTCTCGGTGGT-3'（配列番号１１）
インテグリンαｖ（逆方向プライマー）：5'-ACACATCTGCGTAATCATCC-3'（配列番号１２）
ＧＡＰＤＨ（正方向プライマー）：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'（配列番号１３）
ＧＡＰＤＨ（逆方向プライマー）：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'（配列番号１４）
【００３３】
ＰＣＲ反応を、９５℃・４５秒、５５℃・３０秒、７２℃・１分で２５サイクル行い、ＰＣＲ産物を得た。得られたＰＣＲ産物を１０×loading bufferと混合し、２％アガロースゲルにて１００Ｖ・２０分の電気泳動を行い、目的とする遺伝子の発現を確認した。
【００３４】
その結果を図２Ａに示した。前駆細胞においては、ＲＡＮＫＬ（−）の系では、Ｓ１Ｐ１およびＳ１Ｐ２のｍＲＮＡが発現していることが確認された。一方、ＲＡＮＫＬ（＋）の系では、Ｓ１Ｐ１の発現が著明に減弱しており、Ｓ１Ｐ２の発現が不変〜軽度亢進していることが確認された。また、Ｓ１Ｐ３〜Ｓ１Ｐ５の発現は見られなかった。
【００３５】
なお、前駆細胞および破骨細胞に発現し、ＲＡＮＫＬにてその発現が亢進することが知られているインテグリンαｖについては、ＲＡＷ２６４．７細胞においてもＲＡＮＫＬ（＋）の系で発現増強が見られた。これより、本実験系において前駆細胞はＲＡＮＫＬにより分化誘導シグナルを受けていることが確認された。また、ＧＡＰＤＨの結果より、ＲＡＮＫＬ（＋）（−）の系で全ｍＲＮＡレベルに変化がない（またはその抽出過程での変化もない）ことを確認した。図２Ａにおいて、ＲＴは逆転写反応を意味し、ＲＴ（＋）は逆転写反応を行ったもの、ＲＴ（−）は反応を行わなかったもの意味する。ＲＴ（−）はｍＲＮＡを抽出する際に、ゲノムのＤＮＡがコンタミネーションしていないことを確認するためのネガティブ・コントロールである。
【００３６】
２）前駆細胞のＳ１Ｐに対する走化性の確認
上記１）と同様に、ＲＡＮＫＬ（−）および（＋）の系で３７℃、３日間培養したＲＡＷ２６４．７細胞をセルスクレーパーおよび０．０２５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて単離した。９６ウェル・ケモタキシスチェンバー(Neuro Probe社製）にフィブロネクチンでコートしたポリカーボン製メンブレンフィルターをセットし、下段にはＳ１Ｐの終濃度が０，１０−８，１０−７，１０−６，１０−５Ｍとなるように調製したＳ１Ｐ含有培地を加えた。上段には単離したＲＡＷ２６４．７細胞を、１ウェルあたり３×１０５個加え、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃、５時間培養した。その後、メンブレンフィルターを取り出してヘマトキシリン・エオジン染色を行い、プレートリーダーを用いて吸光度を測定し、走化性によりメンブレンフィルターへ移動した細胞の数を定量した。
【００３７】
その結果を図２Ｂに示した。in vitroの実験系で、ＲＡＮＫＬ（−）、すなわち前駆細胞がＳ１Ｐに対する走化性を示すことが確認された
【００３８】
３）前駆細胞内でのＲａｃの活性化の確認
上記１）および２）と同様に、ＲＡＮＫＬ（−）の系で３７℃、３日間培養したＲＡＷ２６４．７細胞を、Ｓ１Ｐの終濃度が０，１０−７，１０−６，１０−５Ｍとなるように調製したＳ１Ｐ含有培地を用いてさらに３時間培養した。該ＲＡＷ２６４．７細胞をセルスクレーパーを用いて単離し、遠心分離により細胞を沈殿させた。沈殿した細胞を蛋白質抽出用緩衝液（150 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM Hepes-NaOH (pH 7.4), 1 mM PMSF, プロテアーゼ阻害剤カクテル）を用いて再懸濁し、これを超音波破砕器で処理し、高速微量遠心分離により不溶解物を除去したものをＲａｃ活性測定用の試料とした。
【００３９】
上記により得た試料の１／１００量を分離し、サンプル１（Ｒａｃ（１／１００））とした。残りの試料に、グルタチオン・セファロース（ビーズ）に固着させた「活性型（ＧＴＰ結合型）Ｒａｃ結合ドメイン蛋白質（大腸菌で発現・精製）」を添加し、プルダウン・アッセイ法（標準的プロトコールに従う）によりこれに結合する蛋白質を単離し、サンプル２（ＧＴＰ−Ｒａｃ）とした。
【００４０】
サンプル１およびサンプル２について、１５％アクリルアミドゲルにてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動終了後、ＰＶＤＦ膜へトランスファーした後に、抗Ｒａｃ抗体（Upstate Biotechnology社製）を用いてウェスタン・ブロッティングを行い、膜上でのＲａｃ蛋白質の同定を行った。この方法により、前駆細胞内での総Ｒａｃ量（Ｒａｃ（１／１００））、及び活性型（ＧＴＰ結合型）Ｒａｃ量（ＧＴＰ−Ｒａｃ）のそれぞれを調べた。
【００４１】
その結果を図２Ｃに示した。Ｓ１Ｐの添加により、細胞内での総Ｒａｃ量（Ｒａｃ（１／１００））には変化がないのに対し、走化性に重要な活性型Ｒａｃ（ＧＴＰ−Ｒａｃ）が増加していることが認められた。この結果は、Ｓ１Ｐによる刺激により前駆細胞内でＲａｃの活性化が見られることを意味している。
【００４２】
４）結果
前駆細胞にＳ１Ｐの受容体（Ｓ１Ｐ１およびＳ１Ｐ２）が発現していることが確認された。また、ＲＡＮＫＬの刺激により前駆細胞が成熟破骨細胞に分化すると、Ｓ１Ｐ１の発現が低下することが確認された（図２Ａ）。in vitroの実験系で、前駆細胞が実際にＳ１Ｐに対する走化性を示すことが確認された（図２Ｂ）。さらに、走化性に重要なＲａｃの活性化が前駆細胞内で起こっていることが確認された（図２Ｃ）。
【００４３】
（実施例２）前駆細胞にＳＥＷ２８７１を加えたときのＳ１Ｐに対する走化性の確認
１）実験方法
実施例１−３）と同様に、ＲＡＮＫＬ（−）の系で３日間培養したＲＡＷ２６４．７細胞を、セルスクレーパーおよび０．０２５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて単離した。９６ウェル・ケモタキシスチェンバーにフィブロネクチンでコートしたポリカーボン製メンブレンフィルターをセットし、下段にＳＥＷ２８７１の終濃度が０，１０−７，１０−６，１０−５，１０−４Ｍとなるように調製したＳＥＷ２８７１含有培地を加え、上段には単離したＲＡＷ２６４．７細胞を１ウェルあたり３×１０５個加え、ＣＯ２インキュベーターにて、３７℃、５時間培養した。その後、メンブレンフィルターを取り出し、ヘマトキシリン・エオジン染色し、プレートリーダーを用いて吸光度を測定し、走化性によりメンブレンフィルターへ移動した細胞の数を定量した。
【００４４】
２）結果
前駆細胞がＳ１Ｐ１作用薬であるＳＥＷ２８７１に対し、正の走化性を示すことが明らかになった（図３参照）。
【００４５】
（実施例３）マウス骨組織でのＳ１Ｐの発現
マウスを４％パラホルムアルデヒド（０．１Ｍリン酸緩衝液で溶解）で還流固定した後に、大腿骨を摘出した。これを４℃で４％パラホルムアルデヒド溶液で後固定した後に、１０％ＥＤＴＡ＋７．５％ショ糖溶液で脱灰した。その後３０％ショ糖溶液で脱水を行い、これを凍結薄切用コンパウンドで包埋・急速凍結し、凍結薄切機を用いて薄切した。これをスライドガラスに定着させたものを、リン酸緩衝液でよく洗浄した後に、抗Ｓ１Ｐ１抗体、および前駆細胞・破骨細胞のマーカーであるＣＤ９に対する抗体を用いて、標準的プロトコールにより免疫組織染色を行った。これを共焦点レーザー走査装置を備えた生物微分干渉（ノマルスキー）顕微鏡により観察した。
【００４６】
その結果、in vivoにおけるマウス骨組織において、Ｓ１Ｐ１の発現が認められることが確認された（図４ａ参照（矢印））。これはＣＤ９の発現と重なるため、Ｓ１Ｐ１陽性細胞は、前駆細胞と考えられた。さらに、骨梁（図４ａ）に接している成熟破骨細胞にはＳ１Ｐ１の発現は認められなかった（図４ａ（＊））。これはＲＡＮＫＬ刺激により前駆細胞が成熟するとＳ１Ｐ１の発現が低下することを示し、ＲＴ−ＰＣＲ法による増幅産物の分析結果（図２Ａ）と一致した。
【００４７】
（実施例４）Ｓ１Ｐ１の刺激によるマウス骨組織での前駆細胞の減少効果
マウスに、Ｓ１Ｐ１に対するpotent agonistであるＳＥＷ２８７１を添加した系（ＳＥＷ２８７１（＋））および添加しない系（ＳＥＷ２８７１（−））での前駆細胞に及ぼす影響を調べた。ＳＥＷ２８７１（−）の系は、リン酸緩衝液＋１０％ウシ血清アルブミン＋１０％ＤＭＳＯのみのビヒクルをサンプルとし、ＳＥＷ２８７１（＋）の系は、ビヒクルに終濃度１０μＭのＳＥＷ２８７１を加えたものをサンプルとした。
【００４８】
各々５匹のマウスについて、ＳＥＷ２８７１（−）およびＳＥＷ２８７１（＋）の各サンプル０．３ｍｌを尾静脈より緩やかに静脈内投与した。３時間後に上記各マウスを４％パラホルムアルデヒド（０．１Ｍリン酸緩衝液で溶解）で還流固定した。以降は実施例３と同様に、凍結切片を作製し、抗Ｓ１Ｐ１抗体を用いて染色した。ＳＥＷ２８７１（−）のサンプルを投与した系に比べ、ＳＥＷ２８７１（＋）のサンプルを投与した系では、マウスの骨組織でのＳ１Ｐ１陽性細胞、すなわち前駆細胞の数が有意に低下していることが確認された（図５）。これにより、Ｓ１Ｐ受容体作動薬であるＳＥＷ２８７１の投与により、前駆細胞の骨表面への導入が抑制されることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
以上詳述したように、本発明のスクリーニング方法により、新規骨吸収抑制剤をスクリーニングすることができる。本発明のスクリーニング方法により得られた新規骨吸収抑制剤、例えばＳＥＷ２８７１は、前駆細胞のＳ１Ｐ１が増強されることで、走化性により前駆細胞が骨表面から血中に出て行き、前駆細胞を血中への再還流へと導き、前駆細胞の骨表面への導入を抑制し、前駆細胞から破骨細胞に成熟するのを抑制し、結果として骨表面で成熟する破骨細胞の数を抑えることができる。本発明のスクリーニング方法により得られた薬剤は、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、骨ページェット病、および変形性関節炎などの治療薬剤や骨折、腰痛およびリウマチなどの骨関節疾患の症状を予防および改善する薬剤として利用されうる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】破骨細胞による骨吸収メカニズムおよび前駆細胞の血中への再還流メカニズムを示す図である。
【図２】前駆細胞と破骨細胞について、Ｓ１Ｐ受容体の発現およびＳ１Ｐに対する走化性を調べた図である。（実施例１）
【図３】各濃度のＳＥＷ２８７１を含む系での前駆細胞のＳ１Ｐに対する走化性を示す図である。（実施例２）
【図４】マウス骨組織でのＳ１Ｐ１の発現およびＣＤ９の発現を示す図である。（実施例３）
【図５】ＳＥＷ２８７１（−）および（＋）の系でのＳ１Ｐ１の刺激によるマウス骨組織での前駆細胞を示す図である。（実施例４）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
破骨細胞前駆細胞と候補物質を含む系において、スフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体と候補物質との相互作用による、破骨細胞前駆細胞の走化性を測定することを特徴とする新規骨吸収抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
少なくとも以下の工程を含む請求項１に記載のスクリーニング方法：
１）破骨細胞前駆細胞に候補物質を添加する工程；
２）破骨細胞前駆細胞の走化性を測定する工程。
【請求項３】
Ｓ１Ｐ受容体が、Ｓ１Ｐ１である請求項１または２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
候補物質が、Ｓ１Ｐ受容体作用薬である請求項１〜３のいずれか１に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１に記載の方法によりスクリーニングされた新規骨吸収抑制剤。
【請求項６】
Ｓ１Ｐ１に作用する薬剤からなる新規骨吸収抑制剤。
【請求項７】
Ｓ１Ｐ１に作用する薬剤が、5-(4-フェニル-5-トリフルオロメチルチオフェン-2-イル)-3-(3-トリフルオロメチルフェニル)-1,2,4-オキサジアゾールまたはその誘導体である、請求項６に記載の新規骨吸収抑制剤。
【請求項１】
破骨細胞前駆細胞と候補物質を含む系において、スフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体と候補物質との相互作用による、破骨細胞前駆細胞の走化性を測定することを特徴とする新規骨吸収抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
少なくとも以下の工程を含む請求項１に記載のスクリーニング方法：
１）破骨細胞前駆細胞に候補物質を添加する工程；
２）破骨細胞前駆細胞の走化性を測定する工程。
【請求項３】
Ｓ１Ｐ受容体が、Ｓ１Ｐ１である請求項１または２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
候補物質が、Ｓ１Ｐ受容体作用薬である請求項１〜３のいずれか１に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１に記載の方法によりスクリーニングされた新規骨吸収抑制剤。
【請求項６】
Ｓ１Ｐ１に作用する薬剤からなる新規骨吸収抑制剤。
【請求項７】
Ｓ１Ｐ１に作用する薬剤が、5-(4-フェニル-5-トリフルオロメチルチオフェン-2-イル)-3-(3-トリフルオロメチルフェニル)-1,2,4-オキサジアゾールまたはその誘導体である、請求項６に記載の新規骨吸収抑制剤。
【図３】
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００７−２６７６６５（Ｐ２００７−２６７６６５Ａ）
【公開日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−９６７２０（Ｐ２００６−９６７２０）
【出願日】平成１８年３月３１日（２００６．３．３１）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月３１日（２００６．３．３１）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
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