本発明は、新規Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体及びその上に重合体を複合させたＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物を提供し、さらに、それらを含む薬物組成物及びそれらの疾病治療の用途、例えば血糖の低下、糖尿病の治療、特にＩＩ型糖尿病の治療にける用途を提供する。本発明は、体重減少におけるＥｘｅｎｄｉｎ複合物の用途をさらに提供している。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体及びその重合体と複合した複合物、並びに、これらを含む薬物組成物及びこれらの血糖の低下、特に糖尿病の治療、特にＩＩ型糖尿病の治療における用途に関する。さらに、本発明は、体重の減少におけるＥｘｅｎｄｉｎ複合物の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、経済社会の発展、人口平均寿命の延長及び生活方式の変化に伴い、世界各国における主要な保健衛生問題になって来た。糖尿病の発症率は、先進国や発展途上国のいずれにおいても急増している。２００７年において、全世界では糖尿病患者の数が約２．４６億になり、全世界範囲内で、１０秒毎に一人の糖尿病患者が死亡しており、２０２５年に全世界の糖尿病患者の数は３．３３億になると予想されている。その中、中国は、糖尿病発症の「重い罹災地」であり、現在では、糖尿病患者４０００万、糖尿病の発症率約５％、世界第二位の「糖尿病大国」（第一位はインド）である。糖尿病患者は、インスリン依存型糖尿病（Ｉ型糖尿病）とインスリン非依存型糖尿病（ＩＩ型糖尿病）という２種類に分けられる。その中、ＩＩ型糖尿病は糖尿病患者の９０％以上を占めている。ＩＩ型糖尿病の特徴は、インスリンの分泌若しくは作用の異常、及びβ−細胞機能障害によって、脂肪、炭水化合物及びタンパク質の代謝異常を引き起こして、慢性の高血糖を招き、最終的に各種の微血管、大血管及び各種の臓器の合併症が現れる。今では、糖尿病制御薬物として、１）例えばスルホニル尿素類、メグリチニド類、ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤、ＧＬＰ−１アナログ等の、インスリン分泌を促進する類と、２）例えばインスリン、α―グルコシダーゼ阻害薬、ビグアニド類、チアゾリジンジオン類、インスリンアナログ等の、非インスリン分泌促進薬物という２種類がある。現在、臨床に多く使用されている伝統的な糖尿病治療薬物は、ＩＩ型糖尿病患者に対していずれも効果的ではなく、膵臓β−細胞の経年的な悪化を抑制できず、血液中のグリコヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）レベルを低下できず、さらに例えば心蔵病、腎不全などの糖尿病の合併症も抑制できず、且ついずれも異なる程度の副作用を有する。従って、新規のＩＩ型糖尿病治療用薬物の研究が要求されている。
【０００３】
消化管ホルモンのグルカゴン様ペプチド−１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ−１、ＧＬＰ−１）は、１９８５年に発見され、摂食後、グルカゴン原遺伝子から発見され、主に消化管粘膜のＬ−細胞に分泌される産物であって、それは膵β−細胞を刺激してインスリンを分泌させることができ（Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ， ４７， ４１２８−４１３４， ２００４）、血糖レベルの安定化に重要な作用を有する。外部からＧＬＰ−１を投与すると、ＩＩ型糖尿病患者の血糖レベルを正常化になる（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ， １５， ２７０−２７６， １９９２； Ｌａｎｃｅｔ， ３５９， ８２４−８３０， ２００２； Ｅｎｄｏｅｒ． Ｒｅｖ， １６， ３９０−４１０， １９９６； Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ， ２８， ５６５−５７３， １９８５）。ＧＬＰ−１は、下記のような機能を持ち：即ち、グルコース依存性で膵β−細胞に作用して、インスリン遺伝子の転写を促進させ、インスリンの生物合成及び分泌を増加させる機能；β−細胞の増殖と分化を刺激してβ−細胞のアポトーシスを抑制することによって、膵β−細胞の数量を増加させる機能；グルカゴンの分泌を抑制する機能；周辺細胞のインスリン受容体感受性を増加する機能； ＨｂＡ１ｃを低下させる機能；食欲及び摂食を抑制する機能；胃腸の内容物の排出を遅らせる機能を有する（Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｍｅｄ， １８， １４４−１４９， ２００１； Ｄｉａｂｅｔｅｓ， ５１， １４４３−１４５２， ２００２； Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ， ４５， １２６３−１２７３， ２００２； Ｄｉａｂｅｔｅｓ， ５０， ５２５−５２９， ２００１； Ｄｉａｂｅｔｅｓ， ５０， ７２５， ２００１； Ｄｉａｂｅｔｅｓ， ５２， ３６５−３７１， ２００３； Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇ． Ｈｏｒｍｎｅ Ｒｅｓ． ５６， ３７７−３９９， ２００１； Ｄｉｓｂｅｔｏｌｏｇｉａ， ３９， １５４６−１５５３， １９９６； Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｃｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ， ２８１， Ｅ２４２−２４７， ２００１； Ｕ．Ｓ． ｐａｔｅｎｔ ４７７９６７， ４７８０１７， ４７８４２５； Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ， ２２， ４０３−４０８， １９９９； Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ， ８８， ３０８２−３０８９， ２００３； Ｄｉａｂｅｔｅｓ， ４４， １２９５， １９９５）。しかし、ＧＬＰ−１は、生体内のにおいて、ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰＩＶ）により非常に分解され易く、半減期は２分間未満であって、恐らく有効な抗糖尿病薬物にならない。
【０００４】
Ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、毒トカゲ（アメリカアリゾナ州及び北メキシコ州に生息する内陸爬虫類）の唾液分泌物から見つかったポリペプチド（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ， ２６５， ２０２５９−２０２６２， １９９０； Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ， ２６７， ７４０２−７４０５， １９９２）であって、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１（７−３６））に対し高度な相同性（５３％）を有している。研究によると、 Ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、同様にＧＬＰ−１受容体と結合することができ、また薬理学的にもＧＬＰ−１と類似したアゴニスト作用を有し、例えば、インスリン合成の増加及びグルコース依存的にインスリンの分泌を促進する機能；β細胞の増殖及び再生を刺激し、β細胞のアポトーシスを抑制することによって、β細胞の数量を増加する機能；グルカゴンの分泌を抑制する機能；グリコーゲンの生成を抑制するが、厳重な低血糖を引き起こさない機能；食後の胃腸の蠕動と分泌機能を抑制する機能；食欲を低減させ、食物の摂入を減少させる機能；神経細胞に対する保護作用、を有する（Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ， ２３， ８５７−８６１， ２００５； Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６６， ２８９７−２９０２， １９９１； Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６６， ２１４３２−２１４３７， １９９２； Ｄｉａｂｅｔｅｓ， ４４， １６−１９， １９９５； Ｎａｔｕｒｅ， ３７９， ６９−７２， １９９６）。Ｅｘｅｎｄｉｎ−４のインスリン分泌を促進する作用と食後グルカゴンの分泌を抑制する作用は、血糖依存性を有し、現在使われているスルホニル尿素類血糖降下薬より優れており、低血糖反応を引き起こし難く、血糖の検査回数を大幅に減少でき、かつ体重を低減できる。アメリカのアミリン社（Ａｍｙｌｉｎ）とイーライリリー社（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）が共同開発した、一日二回注射のＥｘｅｎｄｉｎ−４製剤（Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ、商品名：Ｂｙｅｔｔａ）は相次ぎ２００５年及び２００６年にアメリカとヨーロッパで販売開始し（Ｕ．Ｓ． ｐａｔｅｎｔ ５，４２４，２８６， ６，８５８，５７６， ６，８７２，７００， ６，９０２，７４４， ６，９５６，０２６， ７，２９７，７６１）、当該類の薬物は、全世界の糖尿病及び肥満の治療分野において幅広く使用されるようになった。
【０００５】
ポリペプチド類の薬物は、通常、生体内の半減期が短い、物理、化学安定性が悪く、生体内における各種のプロテアーゼに分解され易い等の特性を有しているので、これらの薬物を一日当たり通常複数回注射する必要がある。Ｅｘｅｎａｔｉｄｅは、皮下注射製剤として、一日当たり２回使用する必要があり、患者の体、心理と経済上に大きな負担を与え、患者の服薬遵守に影響する。従って、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４に対して構造の変更や新規製剤の開発を行うことによって、その血漿の周期を延長し、その全身薬剤曝露（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｒｕｇ ｅｘｐｏｓｕｒｅ）を増加することは、今の抗糖尿病薬物の研究において注目を集めている。
【０００６】
重合体の修飾技術は、前世紀７０年代から発展を始めた強力な修飾技術であり、その中、特にポリエチレングリコール化技術は代表的である。当該技術は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とタンパク質薬物とを化学結合させて、タンパク質の表面に対して修飾を行い、ＰＥＧの修飾によって、タンパク質の分子量を増加して、その腎蔵における排泄速度を低減する一方、カップリングしたＰＥＧ鎖が修飾されたタンパク質分子の表面に立体障害効果を発揮し、血液中のタンパク質加水分解酵素の当該タンパク質に対する加水分解作用を低減させることによって、その循環系における滞留時間を有効に延長して、薬物血漿周期の延長及び全身薬剤曝露の増加を得る上で、治療の効能を向上させる。
【０００７】
現在、ポリエチレングリコール化技術は、既に、第二世代―部位特異的ポリエチレングリコール化技術（ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）まで推進されている。部位特異的ポリエチレングリコール化技術は、特異的に、タンパク薬物のある特定のアミノ酸を修飾することが可能であり、これによってランダムに修飾することによる盲目性を避けることができる。よって、タンパク質のポリペプチド活性中心構造に対する影響を少なくすると共に、ある抗原部位を選択的に干渉することによって、非部位特異的なポリエチレングリコール化による生物活性の低下と均一性の低下等の欠点を減少できる。
【０００８】
研究者は、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４の重合体修飾に対しても一連の研究を行っている。ＹＯＵＮＧとＰＲＩＣＫＥＴＴ（ＣＮ１３７２５７０Ａ）の研究は、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４が主に腎クリアランスによって代謝することを証明しており、よって、彼らは分子量範囲が５００〜２０，０００ダルトン（Ｄａｌｔｏｎ、Ｄａ）のポリエチレングリコールを用いてＥｘｅｎｄｉｎ−４に対し修飾を行った。また、包文超、徐宏景、余剛、左亞軍（ＣＮ１０１１２５２０７Ａ）は、分子量範囲が２０ ｋＤａ〜５０ ｋＤａのポリエチレングリコールを用いてＥｘｅｎｄｉｎ−４に対しアミノ基修飾を行った。
【０００９】
しかし、現在既存のＥｘｅｎｄｉｎ−４若しくはその変異体及び各種の修飾形態は、依然として、生体内の使用において投与頻度が高いことと、患者の体、心理と経済上に大きな負担を与えることと、患者の服薬遵守に影響し、汎用できないことなどの欠点がある。従って、依然として新規なＥｘｅｎｄｉｎ−４変異体及びその重合体修飾形態が必要とされている。
【発明の概要】
【００１０】
一方、本発明は、野生型Ｅｘｅｎｄｉｎ配列と比べて、１若しくは複数のアミノ酸残基がシステインに置換された、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性を有するＥｘｅｎｄｉｎ変異体を提供する。野生型Ｅｘｅｎｄｉｎ配列と比べて、前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体は、任意に、１若しくは複数の更なるアミノ酸欠失、挿入及び／または置換を有しており、その中、挿入若しくは置換されたアミノ酸残基が、天然若しくは非天然アミノ酸、或いはアミノ酸アナログであってもよい。
【００１１】
一つの実施の形態において、前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体は、
野生型Ｅｘｅｎｄｉｎ−４配列：Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）、若しくは
Ｅｘｅｎｄｉｎ−３配列：
Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）、若しくは
これらに類似の配列と比べて、１若しくは複数のアミノ酸残基がシステイン及び任意に選択したそのほかのアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する。前記アミノ酸の置換は、それぞれ独立に野生型アミノ酸配列のＮ−末端、Ｃ−末端及び／または内部に位置する。
【００１２】
一つの好ましい実施の形態において、前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体は、少なくとも当該変異体のＣ末端にシステイン置換を有する。さらに、前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体はＣ末端の最後のアミノ酸にてシステイン置換されていることが好ましい。また、前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体は、少なくとも下記の１若しくは複数の位置でシステイン置換されていることが好ましい：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４若しくはＥｘｅｎｄｉｎ−３における第２０番目Ａｒｇ（アルギニン）、２５番目Ｔｒｐ（トリプトファン）、３５番目Ａｌａ（アラニン）及び第３９番目Ｓｅｒ（セリン）に対応する位置。
【００１３】
一方、本発明は、前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体に、１若しくは複数の天然若しくは合成重合体基、好ましくは生理的に許容される重合体基、例えばポリアルキレングリコール基、より具体的にはポリエチレングリコール基等を複合した、Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体複合物を提供する。複数の重合体基を含む場合、前記重合体基は、同一若しくは異なってもよい。前記重合体基が１若しくは複数のシステイン残基によって前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体に複合することが好ましい。一つ実施の形態において、前記重合体基は、チオエーテル結合によって前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体に複合する。
【００１４】
重合体基が複合された生物活性分子において、複合基の分子量（例えば４ ｋＤａから）の増加に伴って複合生物分子の生物活性が指数関数的に低下していくことは、当業者に周知である（Ｂａｉｌｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ， ｌｏｎｇ−ｌａｓｔｉｎｇ ｆｏｒｍ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ： Ａ ４０ ｋＤａ ｂｒａｎｃｈｅｄ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ α −２ａ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ ２００１； １２ ： １９５ −２０２； Ｂｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ａｎｄ ｄｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｍｕｔｅｉｎ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ １９９９； ２７： ４２５−３２；Ｂａｉｌｏｎ ｅｔ ａｌ． ＰＥＧ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ． Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｅｌｉｖ． ２００９； ６： １−１６）。さらに、前記重合体基の分子量の増加に伴って当該複合物分子の生物半減期及び／または血漿半減期、及び全身薬剤曝露は延長若しくは増加していくことは、当業者に周知である。
【００１５】
しかしながら、本発明者は、本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物において、前記重合体基の分子量が３０ ｋＤａまでに増加されても、複合していないＥｘｅｎｄｉｎ変異体と比べて、当該複合物分子は大部分のＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性を保留できることを、意外にも見出した。さらに、ＰＥＧ分子量が４０ ｋＤａ若しくはそれ以上に増加されても、本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物は、依然として相当量のＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性を保留している。特に、前記重合体基の分子量が５ ｋＤａ から２７ ｋＤａまでに増加された場合に、複合していないＥｘｅｎｄｉｎ変異体と比べて、前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体複合物のＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性は殆ど変化しない。
従って、一つの好ましい実施の形態において、本発明は、生物半減期及び／または血漿半減期が延長され、また、顕著なＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性を有するＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物を提供する。
【００１６】
一つの実施の形態において、前記重合体は、ポリアルキレングリコールであって、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等を含む。前記１若しくは複数の重合体基は任意の適合な分子量を有すことができ、例えば、その分子量は、２ ｋＤａ〜５０ ｋＤａ、好ましくは５ ｋＤａ〜３０ ｋＤａ、より好ましくは２０ ｋＤａ〜３０ ｋＤａであることができ、例えば、２１ ｋＤａ、２２ ｋＤａ、２３ ｋＤａ、２４ ｋＤａ、２５ ｋＤａ、２６ ｋＤａ、２７ ｋＤａ、２８ ｋＤａ、２９ ｋＤａ及び３０ ｋＤａ、及び上記の分子量値の間の任意の値である。
【００１７】
任意に、前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体複合物は、１若しくは複数のそのほかのアミノ酸残基位置にて１若しくは複数の同一若しくは異なる上記の重合体を複合してもよい。前記１若しくは複数のそのほかのアミノ酸残基位置は、それぞれＥｘｅｎｄｉｎ変異体のＮ−末端、Ｃ−末端及び／または任意中間位置であることができる。
【００１８】
本発明において、複合された重合体は、いかなる適切な態様であることができ、例えば、シングルアーム、ダブルアーム、マルチアーム及び／または分岐の構造を含み、その中、各アーム若しくは分岐は同一若しくは異なってもよい。
【００１９】
さらに、本発明は、前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体と前記重合体を接触させ、その中、好ましくは前記重合体が活性化基を持ち、若しくは接触する際に活性化させて、前記活性化重合体を当該Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体の１若しくは複数のシステイン残基上に連結させることを含む、上記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体複合物の調製方法を提供する。一つの実施の形態において、特異的な活性化基及び適切なｐＨ値を選択して、異なる重合鎖の長さ及び重合構造のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によってそれぞれＥｘｅｎｄｉｎ変異体のシステインに対して特異的な化学修飾をする。一つの具体実施の形態において、当該特異的な活性化基はマレインイミドである。
【００２０】
また、本発明は、本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体及び／またはＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物、及び任意に選択した薬学許容できるキャリアを含む、薬物組成物を提供する。
【００２１】
また、本発明は、需要がある対象に、治療有効量の本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体及び／またはＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物及び／または薬物組成物を施す、疾病の治療方法を提供する。相応して、本発明は、治療疾病用薬物の調製における、本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体及び／またはＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物及び／または薬物組成物の用途を提供する。前記疾病は、例えば食後ダンピング症候群、食後高血糖症、耐糖能障害、及びグルカゴン分泌の抑制、トリグリセリドレベルの調節、摂食量の減少などによって緩解できる症状若しくは疾病、肥満症、摂食障碍、インスリン抵抗症候群、糖尿病、高血糖症及び低血糖症から選ぶことができる。好ましくは、前記疾病が糖尿病であり、より好ましくは、Ｉ型糖尿病若しくはＩＩ型糖尿病であり、特にＩＩ型糖尿病である。
【００２２】
周知のように、Ｅｘｅｎｄｉｎは、肥満患者の体重を低減できるが、引起吐き気・嘔吐反応を引き起こすものであり、その作用メカニズムは中枢神経系において、摂食中枢を抑制することや嘔吐中枢を刺激することに関与している（Ｌａｒｓｅｎ． Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｂｅｈｉｎｄ ＧＬＰ−１ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｅｉｇｈｔ ｌｏｓｓ． Ｂｒ Ｊ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｖａｓｃ Ｄｉｓ ２００８； ８： Ｓ３４−Ｓ４１； Ｓｃｈｉｃｋ ｅｔ ａｌ． Ｇｌｕｃａｇｏｎｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ １ （７−３６）−ａｍｉｄｅ ａｃｔｓ ａｔ ｌａｔｅｒａｌ ａｎｄ ｍｅｄｉａｌ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ｓｉｔｅｓ ｔｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｆｅｅｄｉｎｇ ｉｎ ｒａｔｓ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００３； ２８４：Ｒ１４２７−３５）。但し、Ｅｘｅｎｄｉｎ若しくはその変異体の複合物は、分子量が増加しており、血液脳関門を透過し難いので、Ｅｘｅｎｄｉｎによる嘔吐反応を低減できる。従って、本研究を開始する前に、発明者は、Ｅｘｅｎｄｉｎ若しくはその変異体の複合物でも、Ｅｘｅｎｄｉｎの中枢神経系を介して摂食量及び体重を減少する作用が低減されると予測していた。しかしながら、野生型Ｅｘｅｎｄｉｎ及び複合していないＥｘｅｎｄｉｎ変異体も体重及び摂食量を減少させるが、本発明のＥｘｅｎｄｉｎ若しくはその変異体の複合物は、顕著な強力な体重及び摂食量を減少する作用を有すことを、意外に見出した。
【００２３】
従って、一方、本発明は、Ｅｘｅｎｄｉｎ若しくはその変異体の複合物及び／またはこの複合物を含む薬物組成物を用いて、体重を減少させる方法を提供する。また、体重減少用薬物の調製における、Ｅｘｅｎｄｉｎ若しくはその変異体の複合物及び／またはこの複合物を含む薬物組成物の用途を提供する。一つの実施の形態において、前記Ｅｘｅｎｄｉｎ若しくはその変異体の複合物は、上記本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は実施例１で得られたＰＢ−１０５のマススペクトルを示す図である。
【図２】図２はＰＥＧの一種の分子構造を示す図である。
【図３】図３はＨＰＬＣ分析による、実施例２で得られたＰＢ−１１０ （ＰＥＧ５０００−ＰＢ−１０５）の純度分析結果を示す図である。
【図４】図４はＰＥＧ５０００ｂの分子構造を示す図である。
【図５】図５はＰＥＧ５０００ｃの分子構造を示す図である。
【図６】図６はＰＢ−１０５ポリエチレングリコール化複合物の（Ａ）ヨード染色画像及び（Ｂ）クマシーブリリアントブルー染色画像を示す図であり、その中、各レーンは、１． 分子量基準、２． ＰＢ−１０６ （ＰＥＧ２００００−ＰＢ−１０５）、３． ＰＢ−１０７ （ＰＥＧ３００００−ＰＢ−１０５）、４． ＰＢ−１０８ （ＰＥＧ４００００−ＰＢ−１０５）、及び５． ＰＢ−１０９ （ＰＥＧ２００００＊２−ＰＢ−１０５）を代表している。
【図７】図７はＨＰＬＣ分析による、実施例３で得られたＰＢ−１０６ （ＰＥＧ２００００−ＰＢ−１０５）の純度分析結果を示す図である。
【図８】図８はＰＥＧ２００００ｂの分子構造を示す図である。
【図９】図９はＰＥＧ２００００ｃの分子構造を示す図である。
【図１０】図１０はＰＥＧ２００００ｄの分子構造を示す図である。
【００２５】
【図１１】図１１はＰＥＧ２００００ｅの分子構造を示す図である。
【図１２】図１２はＨＰＬＣ分析による、実施例３で得られたＰＢ−１１２ （ＰＥＧ２００００−ＰＢ−１１１）の純度分析結果を示す図である。
【図１３】図１３はＨＰＬＣ分析による、実施例４で得られたＰＢ−１０７ （ＰＥＧ３００００−ＰＢ−１０５）の純度分析結果を示す図である。
【図１４】図１４はＨＰＬＣ分析による、実施例５で得られたＰＢ−１０８ （ＰＥＧ４００００−ＰＢ−１０５）の純度分析結果を示す図である。
【図１５】図１５はＨＰＬＣ分析による、実施例５で得られたＰＢ−１１４ （ＰＥＧ４００００−ＰＢ−１１３）の純度分析結果を示す図である。
【図１６】図１６はＰＥＧ２００００×２の分子構造を示す図である。
【図１７】図１７はＨＰＬＣ分析による、実施例６で得られたＰＢ−１０９ （ＰＥＧ２００００＊２− ＰＢ−１０５）の純度分析結果を示す図である。
【図１８】図１８はＰＥＧ２００００×２ｂの分子構造を示す図である。
【図１９】図１９は示す図ＰＥＧ２００００×２ｃの分子構造である。
【図２０】図２０はＰＥＧ２００００×２ｄの分子構造を示す図である。
【００２６】
【図２１】図２１はＨＰＬＣ分析による、実施例７で得られたＰＢ−１１９ （ＰＥＧ２３０００−ＰＢ−１０５）の純度分析結果を示す図である。
【図２２】図２２はＨＰＬＣ分析による、実施例８で得られたＰＢ−１２０ （ＰＥＧ２７０００−ＰＢ−１０５）の純度分析結果を示す図である。
【図２３Ａ】図２３ＡはＰＢ−１０６ （ＰＥＧ２００００−ＰＢ−１０５）のｐＨ４．５、−２０℃で６０日間保存後のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図２３Ｂ】図２３ＢはＰＢ−１０６ （ＰＥＧ２００００−ＰＢ−１０５）のｐＨ７．０、４℃で６０日間保存後のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図２３Ｃ】図２３ＣはＰＢ−１０６ （ＰＥＧ２００００−ＰＢ−１０５）のｐＨ７．０、−２０℃で６０日間保存後のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図２４】図２４はＰＢ−１０１及びＰＢ−１０５の、ＰＣ１２細胞内ｃＡＭＰに対する作用の用量反応関係を示す図である。
【図２５】図２５はＰＢ−１０５及びそのポリエチレングリコール化複合物の、体外において細胞内ｃＡＭＰ活性に対する作用を示す図である。
【図２６Ａ】図２６Ａはポリエチレングリコール化複合物におけるポリエチレングリコールの分子量と体外薬物活性（ＬｏｇＥＣ_５０）の関連性を示す図である。
【図２６Ｂ】図２６Ｂはポリエチレングリコール化複合物におけるポリエチレングリコールの分子量と薬物最大活性（Ｅ_ｍａｘ）の関連性を示す図である。
【図２７】図２７はＰＢ−１０５及びそのポリエチレングリコール化複合物の、体外において細胞内ｃＡＭＰ活性に対する作用を示す図である。
【図２８】図２８はＰＢ−１０１及びＰＢ−１０５の血糖降下作用の、時間と効果の関係を示す図である。
【図２９】図２９はＰＢ−１０１及びＰＢ−１０５の血糖降下作用の、用量反応関係を示す図である。
【００２７】
【図３０】図３０はＰＢ−１０１及その変異体ＰＢ−１０２の血糖降下作用の、用量反応関係を示す図である。
【図３１】図３１はＰＢ−１０５及びそのポリエチレングリコール化複合物の等量血糖降下作用の、時間と効果の関係を示す図である。
【図３２Ａ】図３２Ａはポリエチレングリコール化Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体におけるポリエチレングリコールの分子量と生物半減期（Ｔ_１／２）の関連性を示す図である。
【図３２Ｂ】図３２Ｂはポリエチレングリコール化Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体におけるポリエチレングリコールの分子量と最大血糖降下作用（％投与前の血糖濃度）の関連性を示す図である。
【図３２Ｃ】３２Ｃ図３２Ｃはポリエチレングリコール化Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体におけるポリエチレングリコールの分子量と血糖降下作用曲線の面積（Ａｒｅａ Ａｂｏｖｅ Ｃｕｒｖｅ、ＡＡＣ）の関連性を示す図である。
【図３３】図３３はＰＢ−１０５及びそのポリエチレングリコール化（ＰＥＧ３００００）複合物ＰＢ−１０７の、同程度の有効投与量における血糖降下作用の、時間と効果の関係を示す図である。
【図３４】図３４はＰＢ−１０５及びそのポリエチレングリコール化（ＰＥＧ２００００）複合物ＰＢ−１０６の血糖降下作用の用量反応関係を示す図である。
【図３５】図３５はＰＢ−１０５、ＰＢ−１１１及びそのポリエチレングリコール化複合物の等量血糖降下作用の、時間と効果の関係を示す図。実験データは平均値±ＳＥＭで表されるである。
【００２８】
【図３６】図３６はＰＢ−１０１及その変異体ＰＢ−１０５、ＰＢ−１１１及びＰＢ−１１３及びポリエチレングリコール化複合物ＰＢ−１０６、ＰＢ−１１２及びＰＢ−１１４の血糖降下作用の、時間と効果の関係を示す図。実験データは平均値±ＳＥＭで表される。
【図３７】図３７はＰＢ−１０５及びそのポリエチレングリコール化複合物の等量血糖降下作用の、時間と効果の関係を示す図である。実験データは平均値±ＳＥＭで表される。＊はＰＢ−１０５群と比べて有意差を有している（ｐ ＜ ０．０５）。
【図３８】図３８はＰＢ−１０１、ＰＢ−１０５、ＰＢ−１０６及びＰＢ−１２０の、ハトの嘔吐の潜伏期間（Ａ）及び嘔吐回数（Ｂ）に対する影響を示す図である。実験データは平均値±ＳＥＭで表される。ａは３ ｍｇ／ｋｇ投与量においてＰＢ−１０５群と比べて統計学的に有意差（ｐ ＜ ０．０５）を有することを示し（ｐ ＜ ０．０５）、ｂは６ ｍｇ／ｋｇ投与量においてＰＢ−１０１及びＰＢ−１０５群と比べていずれにしても統計学的に有意差（ｐ ＜ ０．０５）を有することを示している。
【図３９】図３９はＰＢ−１０１、ＰＢ−１０５及びＰＢ−１０６の、テンジクネズミの全身において免疫アレルギー反応に対する影響を示す図である。実験データは平均値±ＳＥＭで表される。ａは生理食塩水群と比べて統計学的に有意差（ｐ ＜ ０．０５）を有することを示し、ｂはＰＢ−１０１若しくはＰＢ−１０５群と比べて統計学的に有意差（ｐ ＜ ０．０５）を有することを示している。
【００２９】
【図４０】図４０はＰＢ−１０１、ＰＢ−１０５及びＰＢ−１０６の、投与後（Ａ）０−１８日間及び（Ｂ）０−４日間においてテンジクネズミの体重増加に対する影響を示す図である。実験データは平均値±ＳＥＭで表される。ａは生理食塩水群と比べて統計学的に有意差（ｐ ＜ ０．０５）を有することを示し、ｂはＥｘｅｎａｔｉｄｅ若しくはＰＢ−１０５群と比べて、統計学的に有意差（ｐ ＜ ０．０５）を有することを示している。
【図４１】図４１はＰＢ−１０５、ＰＢ−１０６、ＰＢ−１１９及びＰＢ−１２０投与後、（Ａ）ラット体重及び（Ｃ）摂食量への影響を示す図である。Ｂ及びＤはそれぞれ投与後相応する各群ラット体重−時間曲線下面積図及び摂食量−時間曲線下面積図である。実験データは平均値±ＳＥＭで表される。Ａは生理食塩水群と比べて統計学的に有意差（ｐ ＜ ０．０５）を有することを示し、ｂはＰＢ−１０５群と比べて、統計学的に有意差（ｐ ＜ ０．０５）を有することを示している。
【図４２】図４２はＥｘｅｎａｔｉｄｅ及びＰＢ−１０５の単回静脈内投与の薬物−時間曲線を示す図である。
【図４３】図４３はＰＢ−１０５及びそのポリエチレングリコール化Ｅｘｅｎｄｉｎ複合物の単回静脈内投与の薬物−時間曲線を示す図である。
【図４４Ａ】図４４Ａはポリエチレングリコール化Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体複合物におけるポリエチレングリコールの分子量と血漿半減期の関係を示す図である。
【図４４Ｂ】図４４Ｂはポリエチレングリコール化Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体複合物におけるポリエチレングリコールの分子量と薬物−時間曲線下面積（ＡＵＣ）の関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
定義
本文に使われる用語「アミノ酸」は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及びアミノ酸アナログ及びこれらのＤとＬ立体異性体を含む。非天然アミノ酸は下記に限定されないが、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、アミノプロパン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、ｔ−ブチルグリシン、２，４−ジアミノイソ酪酸、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロパン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシリジン、δ−ヒドロキシリシン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン 、アロイソロイシン、Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルペンチルグリシン、Ｎ−メチルバリン、ナフチルアラニン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、ペンチルグリシン、２−ピペコリン酸及びチオプロリンを含む。アミノ酸アナログは、そのＣ−末端カルボキシル基、Ｎ末端アミノ基若しくはその側鎖基にて可逆的若しくは不可逆的に化学的閉鎖された、若しくはその他の官能基に化学修飾された天然アミノ酸及び非天然アミノ酸、例えばメチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、Ｓ−（カルボキシメチル）−システイン、Ｓ−（カルボキシメチル）−システインスルホキシド及びＳ−（カルボキシメチル）−システインスルホンを含む。
【００３１】
本文に用いる用語「ポリペプチド」若しくは「タンパク質」とは、互いに取り交わって、共有結合（例えばペプチド結合）によって接す一連の少なくとも二つのアミノ酸残基を指し、組換えポリペプチド、天然ポリペプチド若しくは合成ポリペプチドであってもよい。
【００３２】
本文に用いる用語「システイン置換」とは、例えば遺伝子工学若しくは人工化学合成の手段によって、システイン残基で天然ポリペプチド（例えばＥｘｅｎｄｉｎ−４）中の１若しくは複数のそのほかのアミノ酸残基を置換することを指す。
【００３３】
本文に用いる用語「ポリペプチド変異体」、「変異体」若しくは「アナログ」とは、１若しくは複数の置換、欠失、挿入、融合、短縮若しくはその任意の組合せによってアミノ酸配列上に若干相違するポリペプチドを指す。変異体ポリペプチドは、全部な機能を有するもの若しくはその一種若しくは複数種の活性に係る機能を欠陥しているものであってもよい。全部な機能を有す変異体は、例えば保守的な変更若しくは非肝心的な残基若しくは非肝心的な区域の変更を含む。また、機能性の変異体は、類似なアミノ酸の置換による機能が未変若しくは顕著ではない変更をさらに含む。当分野既知の方法によって機能上重要なアミノ酸を同定できる。前記方法として、例えば部位特異的突然変異誘発若しくはグリシン走査突然変異誘発がある（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．及びＷｅｌｌｓ，Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５，１９８９）。例えば、構造決定、例えば結晶、核磁気共鳴分光法若しくは親和性標識によって、ポリペプチド活性に対して重要な位置を確定できる（Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２４：８９９−９０４，１９９２；ｄｅ Ｖｏｓ， Ａ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：３０６−３１２，１９９２）。用語「チオール変異体」とは、置換、挿入、融合若しくはその任意の組合せによってアミノ酸配列上にチオールを持たせたポリペプチド変異体を指す。
【００３４】
本文に用いる用語「複合物」とは、ポリペプチド若しくはポリペプチド変異体と、本文に前述した修飾基とが共有結合若しくは非共有結合して形成された産物を指す。前記修飾基は、上文に記載の例を含むが、これらに限定されない。
【００３５】
本文に用いる用語「修飾されたポリペプチド」若しくは「修飾されたポリペプチド変異体」とは、その１若しくは複数のアミノ酸が化学修飾されたポリペプチド若しくはポリペプチド変異体を指し、その中、前記修飾とは、異なる種類の基の共有結合若しくは非共有結合的な修飾を指し、リン酸化、グリコシル化、メチル化、ＰＥＧ化、ビオチン化、ＳＵＭＯ化、アシル化等を含むが、これらに限定されない。
【００３６】
本文に用いる用語「アルキル基」は、置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、例えば、Ｃ１−Ｃ３０アルキル基、Ｃ１−Ｃ２０アルキル基、Ｃ２−Ｃ１５アルキル基若しくはＣ３−Ｃ１０アルキル基を表し、その中、ハロゲン、アミノ基、ニトロ基等から独立的に任意選択される１若しくは複数の置換基を有してもよい。
【００３７】
本文に用いる用語「シクロアルキル基」とは、置換もしくは非置換のＣ３−Ｃ８シクロアルキル基を表し、その中、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ２−Ｃ１０アルキレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、ハロゲン、アミノ基、ニトロ基等から独立的に任意選択される１若しくは複数の置換基を有してもよい。
【００３８】
本文に用いる用語「アルキレン基」とは、１若しくは複数の炭素−炭素の二重結合を有する置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐鎖のアルキレン基を表し、その中、例えば２−２０個、３−１５個、４−１０個の炭素を含んでもよく、また、例えばハロゲン、アミノ基、ニトロ基等から独立的に任意選択される１若しくは複数の置換基を有してもよい。
【００３９】
本文に用いる用語「アリール基」とは、Ｃ６−Ｃ１０アリール基を表し、例えばＣ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ２−Ｃ１０アルキレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、ハロゲン、アミノ基、ニトロ基等から独立的に任意選択される１若しくは複数の置換基で置換されてもよい。
【００４０】
本文に用いる用語「結合基」とは、ＰＥＧとＥｘｅｎｄｉｎを連結する有機基を表す。本発明において、結合基はアルキル基、エーテル基、アミド、エステル基、ニトロ基等であり、その中、例えば３０個までの炭素も含むことができ、例えば１−２５、２−２０、３−１５若しくは３−１０個の炭素を含む。
【００４１】
一般に、本文に用いる用語「ポリエチレングリコール」は、当業者が通常理解している意味であり、即ち、特に説明していない限りに、ポリエチレングリコール自身を含む上で、その末端修飾の誘導体も含む。
【００４２】
また、重合体、例えばポリエチレングリコールについて、その分子量を様々な方法で測定できる。重合体は、一定の分布範囲内の異なる重合度の分子から構成するため、通常、平均分子量で重合体の分子量を表している。具体的には、数平均分子量若しくは重量平均分子量である。重合体の重合度の差が大きい場合、数平均分子量と重量平均分子量は若干異なる場合あるが、分布範囲がシャープな重合体については、両者がほぼ等しいである。本文にかかる重合体、例えばポリエチレングリコールにおいては、その分子量を言及すると、重量平均分子量であってもよく、数平均分子量であってもよい。
【００４３】
Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体
一方、本発明は、Ｅｘｅｎｄｉｎ野生型配列若しくはその類似配列と比べて、１若しくは複数の、例えば１、２、３、４、５若しくはそれ以上のアミノ酸残基がシステインに置換されたアミノ酸配列を有する、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性を有すＥｘｅｎｄｉｎ変異体に関する。その中、前記システイン置換は、それぞれ独立に前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体配列のＮ−末端、Ｃ−末端若しくは内部に位置することができる。一部の実施の形態において、前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体は、少なくともそのＣ末端の１、２、３若しくは４個のアミノ酸残基にてシステインに置換されている。好ましくは、前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体のＣ末端の最後のアミノ酸がシステインに置換される。また一部の実施の形態において、前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体は、そのＣ末端、Ｎ末端及び／または内部の１、２、３、４個若しくはそれ以上のアミノ酸残基にてシステインに置換されている。
【００４４】
本発明における前記のＥｘｅｎｄｉｎ野生型配列若しくは類似配列は、本分野における既知のいかなる配列であり、その各種の変異体若しくはアナログ若しくはアゴニストの配列を含む。Ｅｘｅｎｄｉｎに関する教示については、例えばＥｎｇ Ｊ．ら，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６５： ２０２５９−６２， １９９０； Ｅｎｇ Ｊ．ら，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６７： ７４０２−０５， １９９２； ＷＯ００／６６６２９及びＷＯ００／４１５４６等を参照でき、本文において、そのすべての内容を援引する。
【００４５】
本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体は、１若しくは複数の、例えば１、２、３、４、５個若しくはそれ以上の更なるアミノ酸修飾、例えばアミノ酸置換、欠失、挿入及び／または添加を任意に選択して有することができる。同様に、前記更なるアミノ酸修飾は、それぞれ独立にＥｘｅｎｄｉｎ配列のＮ−末端、Ｃ−末端及び／または内部に位置することができる。置換、挿入及び／または添加のアミノ酸は、いかなる天然アミノ酸、非天然アミノ酸若しくはアミノ酸アナログ、若しくはこれらのＤ若しくはＬ立体異性体であることができる。一部の実施の形態において、前記更なるアミノ酸修飾は、保守的なアミノ酸置換、例えばＡｌａ／Ｇｌｙ、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ｇｌｕ／Ａｓｐ、Ｇｌｎ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｌｅｕ、Ａｒｇ／Ｌｙｓ、Ｐｈｅ／Ｔｙｒ等の間の相互置換である。保守的なアミノ酸置換について従来技術において数多くの教示があり、例えば、ＷＯ／２００６／０８３３０１等を参照でき、本文において、そのすべての内容を援引する。
【００４６】
本発明において、前記野生型Ｅｘｅｎｄｉｎは、Ｅｘｅｎｄｉｎ−３若しくはＥｘｅｎｄｉｎ−４であることができる。従って、一部の実施の形態において、本発明は下記のようなＥｘｅｎｄｉｎ変異体に関し、アミノ酸配列
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ− Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １；Ｅｘｅｎｄｉｎ−４）若しくは
Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２；Ｅｘｅｎｄｉｎ−３）若しくは
その類似配列と比べて、１若しくは複数の、例えば１、２、３、４、５若しくはより多くのアミノ酸残基がシステインに置換された、アミノ酸配列を有する。好ましくは、前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体における少なくとも下記から選ばれる１若しくは複数の位置でシステインに置換されている：即ち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １若しくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２における第２０位Ａｒｇ（アルギニン）、２５位Ｔｒｐ（トリプトファン）、３５位Ａｌａ（アラニン）及び３９位Ｓｅｒ（セリン）と対応する位置。
【００４７】
一つの好ましい実施の形態において、前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体は、下記から選ばれるアミノ酸配列を有する：
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）；
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）；
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ− Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）；
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）；
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）；若しくは
Ｈｉｓ−ｄＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８）。
【００４８】
前記のように、本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体において、１若しくは複数の、例えば１、２、３、４、５個若しくはより多くの更なるアミノ酸修飾、例えばアミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び／または添加を任意に選択して含むことができる。前記更なるアミノ酸修飾は、それぞれ独立にＥｘｅｎｄｉｎ配列のＮ−末端、Ｃ−末端及び／または内部に位置することができる。置換、挿入及び／または添加のアミノ酸は、いかなる天然アミノ酸、非天然アミノ酸若しくはアミノ酸アナログ、若しくはこれらのＤ若しくはＬ立体異性体であることができる。一部の実施の形態において、前記更なるアミノ酸修飾は、保守的なアミノ酸置換、例えばＡｌａ／Ｇｌｙ、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ｇｌｕ／Ａｓｐ、Ｇｌｎ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｌｅｕ、Ａｒｇ／Ｌｙｓ、Ｐｈｅ／Ｔｙｒ等の間の相互置換である。
【００４９】
本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体は、当分野の公知の様々な方法で得られる。例えば、組換え調製方法、化学合成法等を含む。
【００５０】
一つの実施の形態において、本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体は、ペプチド固相合成技術によって化学合成され、実験室で、例えば、逆相ＨＰＬＣカラム上で単に精製するステップ若しくはそのほかの適切なクロマトグラフィー方法で多量に精製される。
【００５１】
その他の実施の形態において、本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体は、組換え方法によって生産され、例えば、適切な原核若しくは真核宿主細胞にて発現させて、その後常用の技術により本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体を単離させることを含む。例えば、まず化学合成法により前記ペプチドをコードするヌクレオチド配列を合成し、その後、前記配列を適切な発現ベクタにクローニングして、適切なプロモーターの制御下で発現させる。或いは、突然変異誘発法を採用することができ、例えば、ＰＣＲ突然変異誘発法によって野生型ＥｘｅｎｄｉｎからＥｘｅｎｄｉｎ変異体をコードするヌクレオチド配列を獲得して、その後前記配列を適切な発現ベクタにクローニングし、適切なプロモーターの制御下で発現される。これらの技術は当業者の実施できる範囲内にあり、且つ従来技術において数多くの教示がある。
【００５２】
適切な真核宿主細胞としては、哺乳動物の細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−Ｈｅｐ及びＨｅｐＧ２がある。前記細胞は、本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体の発現に適した条件下で成長することが好ましい。本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体を生産若しくは単離するための試薬及び条件については特に限定がなく、当分野既知若しくは商売で入手可能ないかなる系を適用できる。一つの好ましい実施の形態において、前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体は、本分野に報告されている方法によって獲得されている。
【００５３】
Ｅｘｅｎｄｉｎ及び／またはその変異体の調製には、各種の発現ベクタを用いることができ、真核及び原核発現ベクタから選ぶことができる。 原核発現ベクタとしては、例えば、ｐＲＳＥＴ、ｐＥＴ及びｐＢＡＤ等のプラスミドを含む。それらに采用できるプロモーターとしては、例えばｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ若しくはａｒａＢＡＤ等がある。真核発現ベクタとしては、（ｉ）酵母中の発現用のベクタ、例えばｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、ｐＭＥＴがあり、例えばＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、ＡＵＧ１等のプロモーターを使用できる；（ｉｉ）昆虫細胞中の発現用のベクタ、例えばｐＭＴ、ｐＡｃ［ｄｅｌｔａ］、ｐｌＢ、ｐＭＩＢ、ｐＢＡＣ等があり、例えばＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐｌＥ２、ｇｐ６４、ｐｏｌｈ等のプロモーターを使用できる；及び（ｉｉｉ）哺乳動物細胞中の発現用のベクタ、例えばｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＢＰＶ等、及びウイルス系由来のベクタ、例えばワクチンウイルス、アデノ付随ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス等があり、例えばＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１ 、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ及びβアクチン等のプロモーターを使用できる。一つの好ましい実施の形態において、前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体は、原核若しくは真核細胞系中に発現され、且つコドン最適化されたコーディング配列を使用した。一つの好ましい実施の形態において、前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体を発現させる配列は、リーダーペプチド及び／またはシグナルペプチドを含み、前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体の細胞中から細胞外への分泌に有利であり、そして単離精製を行う。もう一つの好ましい実施の形態において、前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体を発現される配列はリーダーペプチド及び／またはシグナルペプチドを含まず、それを細胞外へ分泌しなく、細胞を破壊することによってその単離精製を行う。
【００５４】
Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体複合物
本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体は、１若しくは複数の重合体基と複合してＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物を形成できる。本文に用いられる「重合体」としては、生理的に許容されることが好ましく、水溶液若しくは懸濁液に可溶であって、且つ薬学的に有効量で当該重合体−Ｅｘｅｎｄｉｎ複合物に実施した後に哺乳動物に対し例えば副作用などのマイナスの影響がない重合体を含む。本発明に用いられる重合体としては特に限定がない。通常、前記重合体は２ないし約３０００個の繰返し単位を有することが好ましい。当該重合体基は、自天然若しくは合成重合体から選ぶことができ、その実例として、例えば多糖、ポリアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合物、ポリビニルアルコール等若しくはそれらのいかなる組合せであるが、これらに限定されない。一つの好ましい実施の形態において、本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物において、１若しくは複数のＰＥＧ基で複合修飾を行っている。
【００５５】
本発明において、前記重合体の構造は特に限定がなく、線状（例えばアルコキシＰＥＧ若しくは二重官能基ＰＥＧ）、分支若しくはマルチアームの（例えば分岐ＰＥＧ若しくはポリオールの核心に連結したＰＥＧ）、樹枝状、若しくは分解可能な結合を持つ構造を有することができる。また、重合体の内部構造は、任意数の異なる型で組み合わせることができ、ホモポリマー、交互コポリマー、ランダムコポリマー、ブロック共重合体、交互三量体、ランダム三量体及びブロック三量体等を含む。さらに、前記重合体は、ポリアルキレンオキシド重合体、ポリマレイン酸、ポリ（Ｄ，Ｌ−アラニン）等を含む。
【００５６】
一部の実施の形態において、前記重合体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）若しくはその誘導体、例えばメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）。本文において、特に説明していない限り、前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、末端基がヒドロキシ基であるものと末端がそのほかの基であるものを含む。前記そのほかの基は、アルコキシ基、シクロアルコキシ基、シクロアルキルオキシ基、アルキレン基、アリーロキシ基若しくはアリールアルキルオキシ基を含むが、これらに限定されない。これらＰＥＧ分子形態は従来技術において周知のものであり、且つポリペプチド修飾において一般的に使用されている。ＰＥＧ側鎖は、線状、分枝、分岐若しくは複数のアームからなってもよく、異なるポリエチレングリコールは、異なる重合鎖の長さ及び重合構造を有することができる。
【００５７】
本発明において用いるＰＥＧの分子量は、特に限定されない。その分子量の範囲は０．１〜２００ ｋＤａ、例えば１〜１５０ ｋＤａ、２〜１００ ｋＤａ、３〜８０ ｋＤａ若しくは４〜５０ ｋＤａであってもよく、さらに、５〜４０ ｋＤａであってもよい。一種の特に有用なＰＥＧは５〜３０ ｋＤａ範囲の分子量を有している。他の一部の有用なＰＥＧ分子として、例えばＷＯ ０３／０４０２１１、ＵＳ ６，５６６，５０６、ＵＳ ６，８６４，３５０及びＵＳ ６，４５５，６３９に開示されたものを含む。特に、前記ＰＥＧは、一般式ＨＯ−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＯＨで表され、その中、ｎの範囲は約５〜４０００である。前記のように、本発明のＰＥＧは、そのほかの末端基を持つＰＥＧ、例えば、メトキシＰＥＧ、分支ＰＥＧ、分岐ＰＥＧ等を含む。米国特許Ｎｏ． ５，９３２，４６２の記載に従って、適切な分支ＰＥＧを調製できる。本文において当該特許のすべての開示した内容を参考または援引する。前記分岐ＰＥＧとは、重合体鎖の一末端に近い箇所で分支したＰＥＧを指し、分岐ＰＥＧの主鎖は直鎖もしくは分岐鎖であることができる。
【００５８】
当業者に周知のように、重合体基を複合させた生物活性分子において、前記重合体基の分子量の増加に伴って当該複合物分子の生物活性が低下していく（Ｂａｉｌｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ， ｌｏｎｇ−ｌａｓｔｉｎｇ ｆｏｒｍ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ： Ａ ４０ ｋＤａ ｂｒａｎｃｈｅｄ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ α −２ａ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ ２００１ ； １２ ： １９５ −２０２； Ｂｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ａｎｄ ｄｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｍｕｔｅｉｎ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ １９９９； ２７： ４２５ −３２；Ｂａｉｌｏｎ ｅｔ ａｌ． ＰＥＧ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ． Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｅｌｉｖ． ２００９； ６： １−１６）。また、前記重合体基の分子量の増加に伴って当該複合物分子の生物半減期及び／または血漿半減期が延長していくことも当業者に周知である。
【００５９】
しかしながら、本発明は、本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物において、前記重合体基（例えばＰＥＧ）の分子量を３０ ｋＤａまで増加しても、複合していないＥｘｅｎｄｉｎ変異体と比べて、当該複合物分子は依然として大部分のＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性（例えば生体内の活性）が保留されていることを意外に見出した。さらに、ＰＥＧ分子量が４０ ｋＤａ若しくはそれ以上増加しても本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物は、依然として相当のＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性（例えば生体内の活性）が保留されている。特に、前記重合体基の分子量が５ ｋＤａから２７ ｋＤａまで増加した場合、複合していないＥｘｅｎｄｉｎ変異体と比べて、前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体複合物のＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性は殆ど変化していない。
【００６０】
長時間に渡って安定した治療作用を提供し、また投与頻度減少して患者の服薬遵守性を向上させるために、顕著なＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性を保留すると共に、前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体複合物の生物半減期をできるだけ延長させることが希望されている。従って、一つの実施の形態において、本発明は、生物半減期が延長され、顕著なＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性を有するＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物を提供している。
【００６１】
一つの具体的な実施の形態において、本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物において、前記１若しくは複数の重合体基（例えばＰＥＧ）の分子量が２ ｋＤａ〜５０ ｋＤａであり、好ましくは３ ｋＤａ〜４０ ｋＤａ、より好ましくは４ ｋＤａ〜３５ ｋＤａ、更に好ましくは５ ｋＤａ〜３０ ｋＤａであって、例えば５ ｋＤａ、１０ ｋＤａ、１５ ｋＤａ、２０ ｋＤａ、３０ ｋＤａ及び４０ ｋＤａ及び上記各分子量値の間の任意の値である。なお、Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体複合物における複合重合体基の分子量について、特に説明していない限り、当該複合物において複数の複合重合体基を有す場合、当該複合物におけるすべての複合重合体基の分子量の合計で計算する。
【００６２】
一つの好ましい実施の形態において、本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物は、その中、前記１若しくは複数の重合体基（例えばＰＥＧ）の分子量が２０ ｋＤａ〜３０ ｋＤａ、好ましくは２１ ｋＤａ〜２９ ｋＤａ、より好ましくは２３ ｋＤａ〜２７ ｋＤａであり、例えば２０ ｋＤａ、２１ ｋＤａ、２２ ｋＤａ、２３ ｋＤａ、２４ ｋＤａ、２５ ｋＤａ、２６ ｋＤａ、２７ ｋＤａ、２８ ｋＤａ、２９ ｋＤａ、３０ ｋＤａ及び上記各分子量の値の間の任意の値である。
【００６３】
本発明に用いられる重合体は、従来技術において既知のものである、様々なルートで得ることができる。例えば、例えばＣａｒｂｏＭｅｒ， Ｉｎｃ．，Ｊ．Ｔ． Ｂａｋｅｒ，Ｔｈｅ Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ等からビジネスルートで獲得でき、若しくは当分野既知の方法、例えばＥＰ１２４５６０８の記載に基づいて調製できる。本発明は、いかなる具体的な方法で調製された重合体に限定されない。
【００６４】
本発明の複合物において、前記少なくとも一つの重合体は、Ｅｘｅｎｄｉｎのアミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基及び／またはチオール基等によって、Ｅｘｅｎｄｉｎとカップリングしている。このような基は、通常アミノ酸残基、例えばリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン等のα−アミノ基、α−カルボキシル基及び側鎖上に位置する。
【００６５】
一部の実施の形態において、１若しくは複数の重合体分子は、Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体におけるシステインのチオール基によって、Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体とカップリングしている。タンパク質におけるシステイン残基のチオール基に対して、重合体例えばポリエチレングリコールで修飾すると、修飾の選択性を向上できる。これは、チオール基特異的な反応の試薬は多く存在し、且つタンパク質において、有用なチオールは、例えばリシン残基のラジカルアミノ基に比べてかなり少ないためである。
【００６６】
従って、一つの好ましい実施の形態において、前記１若しくは複数の重合体基は、Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体のシステイン残基に複合しており、より好ましくはチオエーテル結合によってＥｘｅｎｄｉｎ変異体のシステイン残基に複合する。
【００６７】
前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体は、野生型ｅｘｅｎｄｉｎ−３若しくはｅｘｅｎｄｉｎ−４において第２０位、２５位、３５位及び／または第３９位と対応する位置にて、１若しくは複数のシステイン置換を有し、且つ、チオール基によって、重合体例えばポリエチレングリコールとカップリングすることが好ましい。前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体は、野生型ｅｘｅｎｄｉｎ−３若しくはｅｘｅｎｄｉｎ−４における第３５位及び／または第３９位と対応する位置でシステイン置換されていることがより好ましい。前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体は、野生型ｅｘｅｎｄｉｎ−３若しくはｅｘｅｎｄｉｎ−４における第３９位と対応する位置でシステイン置換されていることが最も好ましい。
【００６８】
一つの具体的な実施の形態において、前記重合体基は、チオエーテル結合によって本発明Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体のシステイン残基に複合する。例えば、マレインイミド活性化基を持つポリエチレングリコール分子に対して、マレインイミドのアルキレン基とシステインのチオール基の間にチオエーテル結合を形成させ、これによって１若しくは複数のポリエチレングリコール基を、本発明Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体のシステイン残基に複合させる。他の一部の実施の形態において、システイン残基のＰＥＧ化は、例えばＰＥＧ−ビニルスルホン、ＰＥＧ−ヨードアセトアミド若しくはＰＥＧ−ジサルファイドピリジンによって行ってもよい。従来技術において様々な重合体基例えばＰＥＧをポリペプチドに複合させる方法が知られており、これらすべてが本発明に使用できる。
【００６９】
本文において、「ＰＥＧ化Ｅｘｅｎｄｉｎ」、「ＰＥＧ修飾Ｅｘｅｎｄｉｎ」若しくは「Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体−ＰＥＧ複合物」は、１若しくは複数のＰＥＧが複合されたＥｘｅｎｄｉｎ変異体を含む。例えば、本文に用いられる「ＰＥＧ化」若しくは「ＰＥＧ修飾」は、１若しくは複数のＰＥＧ基とＥｘｅｎｄｉｎ複合させることを含む。適切なＰＥＧ化方法として、例えばＵＳ ５，１２２，６１４及びＵＳ５，５３９，０６３において開示されており、本文においてその開示したすべてのＰＥＧ化方法を引用によって援用する。
【００７０】
一部の実施の形態において、前記複合物は、下記の式（Ｉ）の構造を有する：
【化１】

その中、Ｅｘｅｎｄｉｎは本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体を表し、 ＹはＨ若しくはＲＰＥＧ−Ｘ−を表し、且つ各Ｘ及びＺがそれぞれ独立に結合基であり、ＰＥＧは−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ−を表し、ｎが正の整数、ＲがＰＥＧの末端基を表し、好ましくは各Ｒがそれぞれ独立に、水素、アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルキル基アルキル基、アルキレン基、アリール基若しくはアリールアルキル基から選ばれる。
【００７１】
一部の具体的な実施の形態において、前記アルキル基は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基であってもよく、好ましくはＣ１−Ｃ４アルキル基、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基及びｔ−ブチル基であり；前記シクロアルキル基はＣ３−Ｃ７シクロアルキル基であってもよく、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル、シクロへキシル基及びシクロヘプチル基であり；前記シクロアルキル基アルキル基は、シクロアルキル基Ｃ１−Ｃ４アルキル基であってもよく、例えばシクロアルキル基メチル基及びシクロアルキル基エチル基であり、シクロへキシル基メチル基及びシクロへキシル基エチル基等を含み；前記アリール基はフェニル基、メチルフェニル基及びナフチル基等であってもよく；前記アリールアルキル基はベンジルメチル基、フェニルエチル基及びナフチルメチル基及びナフチルエチル基等であってもよい。従来技術において複数種の末端基を持つＰＥＧ分子が知られており、必要に応じて、これら及びそのほかのＰＥＧ分子から適当に選択できる。且つ、必要に応じて、従来技術である既知の方法で所望の末端基を持つＰＥＧ分子を合成できる。
【００７２】
一部の実施の形態において、式（Ｉ）中、前記の各「ＲＰＥＧ−」は、独立して下記の構造を有す：
【化２】

その中、ｋ及びｎはいずれも整数であり、ｋ ＝ ０、１、２、３、４、５若しくは６；ｎ ＝ ４０、４１、…、４５、４６、４７、４８、……、１２００。
【００７３】
他の一部の好ましい実施の形態において、式（Ｉ）中、前記の各「ＲＰＥＧ−」は、独立して下記の構造を有す：
【化３】

その中：ｋ及びｎはいずれも整数であり、ｋ ＝ ０、１、２若しくは３；ｎ ＝ ４０、４１、…、４５、４６、４７、４８、……、１２００。
【００７４】
一部の実施の形態において、式（Ｉ）中、前記の各「−Ｘ−」は、独立して下記の構造を有す：
【化４】

その中、ｐ及びｍはいずれも整数であり、ｐ ＝ ０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２；ｍ ＝ ０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２。
【００７５】
他の一部の実施の形態において、式（Ｉ）中、前記の各「−Ｘ−」は、独立して下記の構造を有す：
【化５】

その中：ｐ及びｍはいずれも整数であり、ｐ ＝ ０、１、２、３、４若しくは５；ｍ ＝ ０、１、２、３若しくは４。
【００７６】
一部の実施の形態において、式（Ｉ）中、前記の「−Ｚ−Ｅｘｅｎｄｉｎ」は、下記の構造を有す：
【化６】

【００７７】
好ましくは、式（Ｉ）中、前記の「−Ｚ−Ｅｘｅｎｄｉｎ」は、下記の構造を有す：
【化７】

その中：ｉ、ｊ、ｑ、ｗは整数であり、ｉ ＝ ０若しくは１；ｊ ＝ １、２、３、４、５若しくは６；ｑ ＝ １、２、３、４、５若しくは６；ｗ ＝ １、２、３、４、５若しくは６。
【００７８】
本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物は、いかなる適切な方法によって調製できる。従来技術において、複数種の重合体をタンパク質若しくはペプチドに複合させる方法が知られており、その中、適切な条件下、本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体と重合体、好ましくは活性化された重合体とをインキュベートすることを含む。一つの実施の形態において、前記重合体は、ポリエチレングリコールであり、例えば臭化シアン法、カルボニルジイミダゾール法、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド法、シアヌル酸クロリド法等によって、活性化及びＥｘｅｎｄｉｎ変異体に複合できる。若しくは、ＰＥＧ−マレインイミド、ＰＥＧ−ビニルスルホン、ＰＥＧ−ヨードアセトアミド若しくはＰＥＧ−ジサルファイドピリジンによって、Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体におけるシステイン残基のチオール基に、ＰＥＧを特異的に複合できる。
【００７９】
一部の具体的な実施の形態において、下記の条件下で、活性化されたＰＥＧと本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体とを共同インキュベートさせる。条件は、ｐＨ値５．０−７．０、ＰＥＧとペプチドのモル比の値が１−１０、反応時間が０．５−１２時間、反応温度が０−５０℃で、例えば２−４０℃若しくは４−３７℃である。
【００８０】
複合反応を行った後、適切な方法によって複合物を単離できる。活用の方法として、例えば限外濾過法、透析法若しくはクロマトグラフィー法等を含み、これらのいずれも当業者の実施できる範囲内のものである。
【００８１】
薬物組成物
本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体及び／またはＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物は、血糖低下用などの複数種の用途を有することができる。従って、本発明は、さらに、治療有効量の本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体及び／またはＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物、及び任意に選択した薬学的に許容されるキャリアを含む、血糖低下用の薬物組成物を提供する。好ましくは、前記薬物組成物は糖尿病治療用であり、より好ましくはＩ型糖尿病及び／またはＩＩ糖尿病治療用、特に好ましくはＩＩ型糖尿病治療用である。
【００８２】
本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体若しくはＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物の治療有効量は、投与ルート、受験者の類型及び考慮する具体的な哺乳動物の身の特徴によって決められる。これらの要素及びその確定しようとする当該量との関係は、医薬分野における技術者に周知のものである。該量及び施す方法を調整することによって最適な效力を達成でき、これによってペプチドを受験者に伝送できるが、医薬分野の技術者が周知の要因、例えば体重、飲食、併用薬物及びそのほかの要因に決められる。
【００８３】
本発明の薬物組成物は、併用療法で使用でき、即ち、一種若しくは複数種のそのほかの薬剤と併用でき、その中、前記治療剤と同時に施す、若しくは順次施す。他の一部の実施の形態において、前記そのほかの薬剤は、一種若しくは複数種本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体及び／またはＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物若しくはその薬物組成物を施す前、施す中若しくは之施す後に用いられる。本発明に用いられる前記そのほかの薬剤は、例えば血糖低下薬剤、例えばインスリン、インスリンアナログ、アミリンアゴニスト及びコレシストキニン、及び／またはそのほかの治療疾病用化合物若しくは組成物を含む。これらの併用薬物は、組合せ、さらに相乗の效果を実現できるものが好ましい。
【００８４】
本文に用いる「薬用キャリア」、「薬学的に許容されるキャリア」若しくは「生理的に許容されるキャリア」とは、相互に転換使用が可能で、いかなる生理的に許容される塩、溶媒、分散媒体、カプセル、抗菌剤及び抗真菌剤、等張及び吸收緩和剤等の一種若しくは複数種を含む。一部の実施の形態において、前記キャリアは、静脈内、筋肉内、皮下、胃腸外、脊髄若しくは表皮の投与（例えば注射若しくは注入による投与）に適したものである。投与ルートにもよるが、前記治療剤を所定の材料で被覆して、当該治療剤を酸及びそのほかの当該治療剤を失活させる可能な自然な条件から保護する作用を付与できる。
【００８５】
施す際に、本発明の薬物製剤は、薬用できる量で、薬用できる組成物に使用される。用語「薬用できる」とは、活性成分の生物活性效力を阻害しない無毒物質であるという意味である。このような製剤は、通常、塩、緩衝剤、防腐剤、許容キャリア及び任意に選択できるそのほかの治療剤、例えば補助剤、走化因子と細胞因子を含む補充性免疫賦活剤を含む。薬物中に用いる場合、前記塩は、薬用できるものであるが、非薬用塩は薬用できる塩に簡単に調製できるならば、それを除外したわけではない。
【００８６】
必要に応じて、本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体若しくはＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物と、薬用キャリアと組合せることができる。本文に用いられる用語「薬用キャリア」とは、一種若しくは複数種の許容の固体若しくは液体充填剤、希釈剤若しくはパッケージ用物質であり、哺乳動物例えば人に施すことに適している。用語「キャリア」は、有機若しくは無機、天然若しくは合成の成分を表し、容易に応用するように、活性成分と組合せて使用する。薬物組成物の成分は、薬物治療効果を顕著に阻害する相互作用を生じないように、混合できる。
【００８７】
好ましくは、本発明の薬物組成物は緩衝系を含むことができ、好ましくは前記緩衝系は、ｐＨが約３．０〜約６．０の酢酸塩緩衝溶液、若しくはｐＨが約５．０〜約９．０のリン酸塩緩衝溶液である。一部の具体的な実施の形態において、適切な緩衝剤として、酢酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩を含む。
【００８８】
前記薬用組成物は、任意に、適切な防腐剤、例えば、塩化ベンザルコニウム 、クロロｔ−ブタノール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類及びチオメルサールを含むことができる。
【００８９】
前記薬用組成物は、簡単にユニットドーズの形式で存在することができ、薬学分野のいかなる既知の方法で調製できる。すべての方法は、前記活性剤とキャリアを組合せるステップを含み、前記キャリアは、一種若しくは複数種の補助成分を含む。通常、前記活性化合物と、液体キャリア、細かく分割された固体キャリア若しくは上記両者と、を均一且つ密切に組合せることによって前記組成物を調製して、必要の場合、引き続き製品成形を行う。
【００９０】
胃腸外投与に適用の薬物組成物は、一種若しくは複数種Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体若しくはＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物を含む無菌水性若しくは非水性製剤であってもよい。一部の実施の形態において、前記製剤は受験者の血液と等張性である。既知の方法によって適切な分散剤若しくは湿潤剤及び懸濁助剤を使用してこの製剤を調製できる。前記無菌注射製剤は、無毒な胃腸外許容できる希釈剤若しくは溶媒中の無菌注射溶液若しくは懸濁液、例えば１，３−ブチレングリコール中の溶液であってもよい。用いられる許容できるキャリア及び溶媒としては、水、リンガー溶液及び等張塩化ナトリウム溶液を含む。また、無菌の非揮発性油は溶媒若しくは懸濁媒体として一般に用いられる。従って、いかなる温和な非揮発性油を使用でき、合成のグリセリンモノエステル若しくはグリセリンジエステルを含む。また、油酸などの脂肪酸は注射製剤に用いられる。経口、皮下、静脈内、筋肉内等での施すに適用のキャリアのレシピは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡを参照できる。
【００９１】
本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体若しくはＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物は、それを保護して高速放出から避けるキャリア、例えば、植込剤、経皮吸収促進剤及びマイクロカプセル送達システムを含む放出制御構成のキャリアと共に調製できる。例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸などの、生物分解性、生物相容性重合体を使用できる。このような構成の調製方法として、従来技術において多くのものが知られており、例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｊ．Ｒ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， ｅｄ．， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７８等を参照できる。
【００９２】
本発明の薬物組成物は、注射若しくは経時的な注入を含む、いかなる一般的なルートで施すことができる。例えば、経口、静脈内、腹膜内、筋肉内、腔内、腫瘍内若しくは経皮投与によって施すことができる。
【００９３】
本発明の薬物組成物は有効量で施す。「有効量」とは、本文に提供されたいかなるＥｘｅｎｄｉｎ変異体若しくはＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物の量であって、単独若しくは、更なる投与量及び／またはそのほかの治療剤と共に、期待の応答（例えば、受験者における血糖の低下）を獲得できる。これは、一時的な糖尿病の発症に対する抑制を含み、また一部の実施の形態において、糖尿病の発展を永久性に停止することを含む。
【００９４】
当然ながら、このような量は治療を受ける具体的な疾病、前記疾病の発症程度、患者自身のパラメタ（年齢、生理状况、身長及び体重を含む）、治療継続時間、同時に行われる治療の性質（あるとする場合）、具体的な投与ルート及び医療分野の当業者の知識の範囲内の類似の要因によって決められる。これらの要因は、当業者にとって既知のもであり、一般的な実験だけで獲得できる。一般に、各成分若しくはその組合せの最大投与量、即ち合理的な医学上の判断による一番高い安全な投与量を使用することが好ましい。但し、当業者の理解のように、患者は、医学的原因、心理原因若しくはすべてのそのほかの原因によって、低い投与量若しくは許容できる投与量を要求し得る。
【００９５】
前記方法に使用される薬物組成物は、無菌で、且つ患者の適用の重量単位若しくは体積単位当たり、有効量の、単独若しくほかの製剤と組合せたＥｘｅｎｄｉｎ変異体若しくはＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物を含むことが好ましく、これによって期待の応答、例えば血糖の降低を実現できる。
【００９６】
受験者に施すＥｘｅｎｄｉｎ変異体若しくはＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物の投与量は、異なるパラメタによって選択でき、特に、使用した投与形態及び受験者の状態によるものである。そのほかの要因としては、必要な治療期間も含む。応用後の最初の投与量で、受験者における応答が不足である場合、患者が耐える範囲内で、より高い投与量にする（若しくは異なる局部的な送達ルートにより高い有効投与量を実現する）。
【００９７】
一部の実施の形態において、本発明の薬物組成物は、０．２０ ｍｇ／ｍｌ〜５ ｍｇ／ｍｌのＥｘｅｎｄｉｎ変異体及び／または４ｍｇ／ｍｌ〜４０ ｍｇ／ｍｌのＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物を含み、好ましくは０．２０ ｍｇ／ｍｌ〜５ ｍｇ／ｍｌのＥｘｅｎｄｉｎ変異体及び／または４ｍｇ／ｍｌ〜４０ ｍｇ／ｍｌのＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物を含み、より好ましくは０．５ ｍｇ／ｍｌ〜２ ｍｇ／ｍｌのＥｘｅｎｄｉｎ変異体及び／または１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ ｍｇ／ｍｌのＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物を含む。一般に、本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体若しくはＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物の投与量範囲は、約１０ μｇ／ｋｇ患者体重〜約１００，０００ μｇ／ｋｇ患者体重である。一部の実施の形態において、前記投与量範囲は、約０．１ ｍｇ／ｋｇ〜約２０ ｍｇ／ｋｇである。他の一部の実施の形態において、前記投与量範囲は、約０．１ ｍｇ／ｋｇ〜５ ｍｇ／ｋｇ、０．１ ｍｇ／ｋｇ〜１０ ｍｇ／ｋｇ、若しくは０．１ ｍｇ／ｋｇ〜１５ ｍｇ／ｋｇである。他の一部の実施の形態において、前記投与量範囲は、約１ ｍｇ／ｋｇ〜５ ｍｇ／ｋｇ、５ ｍｇ／ｋｇ〜１０ ｍｇ／ｋｇ、１０ ｍｇ／ｋｇ〜１５ ｍｇ／ｋｇ、若しくは１５ ｍｇ／ｋｇ〜２０ ｍｇ／ｋｇである。他の一部の実施の形態において、前記投与量は約０．１ ｍｇ／ｋｇ、０．５ ｍｇ／ｋｇ、１ ｍｇ／ｋｇ、２ ｍｇ／ｋｇ、３ ｍｇ／ｋｇ、５ ｍｇ／ｋｇ、７ ｍｇ／ｋｇ、１０ ｍｇ／ｋｇ、１２ ｍｇ／ｋｇ、１５ ｍｇ／ｋｇ、１７ ｍｇ／ｋｇ、２０ ｍｇ／ｋｇ、２５ ｍｇ／ｋｇ若しくは３０ ｍｇ／ｋｇである。他の一つの実施の形態において、前記投与量は、約１ ｍｇ／ｋｇ、３ ｍｇ／ｋｇ、５ ｍｇ／ｋｇ若しくは６ ｍｇ／ｋｇである。前記組成物によって、前記投与量で連続的に送達（例えば連続ボンプによる）、若しくは周期性で間歇的に送達できる。
【００９８】
一部の実施の形態において、静脈内に投与する場合、本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体若しくはＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物の投与量は、０．１〜２０ ｍｇ／ｋｇ若しくはその間のいかなる値である。特定の組成物の複数回投与における望ましい時間間隔は、当業者によって確定でき、余剰の実験を必要しない。提供される組成物のそのほかの投与案は、当業者にとって既知であり、その投与量、施す時間表、投与の位置、投与形態等は前述と異なってもよい。一つの実施の形態において、前記投与量で静脈内投与する。他の一つの実施の形態においては、薬剤の施す方案が単回静脈内投与である。
【００９９】
Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体若しくはＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物（例えば薬物組成物に含まれる）、及び使用取扱説明書を含む試薬キットも本発明の範囲内である。前記試薬キットは、少なくとも一種のそのほかの試薬、例えば一種若しくは複数種のそのほかの血糖低下の薬剤をさらに含むことができる。他の一つの実施の形態において、試薬キットは、キャリアを含み、前記キャリアは区画化されて、その中に、１若しくは複数の容器装置若しくは一連の容器装置（例えば試験管、チューブ、フラスコ、ボトル、注射器等）を緊密に固定して収容できる。前記試薬キットの成分は、水性媒体に包装され、或いは凍結乾燥の形式である。
【０１００】
本文に提供される組成物は凍結乾燥形式若しくは水性媒体により提供されるものである。
【０１０１】
好ましくは、前記受験者は、脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトであるが、そのほかの動物、例えば家庭飼い動物（例えばイヌ、ネコ等）、家畜（例えばウシ、ヒツジ、豚、馬等）若しくは実験動物（例えば猿、ラット、マウス、ウサギ、テンジクネズミ等）であってもよい。
【０１０２】
本発明におけるＥｘｅｎｄｉｎ変異体及び／またはＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物は、単独に施すことができるが、薬物組成物として施すことが好ましく、通常、施す設計方式によって選ばれる適切な薬物賦型剤、希釈剤若しくはキャリアを含む。いかなる適合な方式によって治療を必要とする患者／受験者に適用される。精確な投与量は、複数の要因によって決められ、当該Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体及びＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物の精確な性質にもよります。
【０１０３】
一部の適切な施す方式として、（これらに限定されないが）経口、直腸、鼻、局部（口腔と舌下を含む）、皮下、膣若しくは胃腸外（皮下、筋肉、静脈、皮内、髄こう内及び硬膜外）における投与を含む。
【０１０４】
一部の実施の形態において、本発明の薬物組成物は、等浸透圧調整剤及び／または防腐剤を含み、前記等浸透圧調整剤は蔗糖、マンニトール、塩化ナトリウム及びグリセロール中の一種若しくは複数種、及び、前記防腐剤はｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、ｐ− ヒドロキシ安息香酸メチル 、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル及びｐ−ヒドロキシ安息香酸ブチルから選ばれることが好ましい。当分野の技術者は、例えば生理食塩水、リンガー注射液若しくは乳酸リンガー注射液等の張力賦型剤を使用することによって、本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体若しくはＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物の適切な溶液を調製できる。必要に応じて、さらに、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤及び／またはそのほかの一部の添加剤を添加できる。経口投与の薬物組成物は、錠剤、カプセル、粉末剤若しくは内服液等の形式である。錠剤は、例えばゼラチン若しくは補助剤などの固体キャリアを含むことができる。液体薬物組成物は、通常、液体キャリア、例えば水、石油、動物若しくは植物油、鉱物油若しくは合成油を含む。さらに、生理食塩水溶液、グルコース若しくはそのほかの糖溶液若しくは、エチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールななどのグリコール類を含んでもよい。一部の実施の形態において、前記薬物組成物は、液体製剤及び／または凍結乾燥製剤の形式であり、好ましくは前記凍結乾燥製剤が凍結乾燥保護剤を含み、より好ましくは前記凍結乾燥保護剤は、蔗糖、ラクトース、マンニトール、トレハロース等の糖から選ばれるものである。
【０１０５】
本文に記載のＥｘｅｎｄｉｎ変異体及び／またはＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物は、「治療有効量」若しくは「有効量」で受験者に投与されることが好ましい。前記組成物は、「治療有効量」で受験者で投与され、前記治療有効量若しくは有効量は前記受験者に対する有利効果を示すできることが好ましい。投与の実際の量、及び投与の速度及び時間過程は、治療者の自身の情况及び発症程度に決められる。治療の処方（例えば投与量等の確定）は医者により決められ、かつ、通常は治療の疾病、患者個体の情况、送達部位、投与方法、及び医者が既知のそのほかの要因を考慮する。
【０１０６】
一部の実施の形態において、前記のＥｘｅｎｄｉｎ変異体及び／またはＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物の投与量範囲は、３０ ｍｇ／ｋｇ体重／日〜０．００００１ ｍｇ／ｋｇ体重／日、若しくは３ ｍｇ／ｋｇ／日〜０．０００１ ｍｇ／ｋｇ／日、若しくは０．３ ｍｇ／ｋｇ ／日〜０．０１ ｍｇ／ｋｇ／日である。
【０１０７】
本発明は疾病の治療方法を提供する。前記方法は、このような必要がある受験者に治療有効量のＥｘｅｎｄｉｎ変異体及び／またはＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物を施すことを含む。一部の実施の形態において、前記疾病は、食後ダンピング症候群、食後高血糖、耐糖能障害、肥満、摂食異常、インスリン抵抗性症候群、糖尿病及び高血糖症から選ばれるものである。一つの好ましい実施の形態において、前記疾病はＩＩ型糖尿病である。
【０１０８】
周知のように、Ｅｘｅｎｄｉｎは、肥満患者の体重を低減できるが、引起吐き気・嘔吐反応を引き起こすものであり、その作用メカニズムは中枢神経系において、摂食中枢を抑制することや嘔吐中枢を刺激することに関与している（Ｌａｒｓｅｎ． Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｂｅｈｉｎｄ ＧＬＰ−１ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｅｉｇｈｔ ｌｏｓｓ． Ｂｒ Ｊ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｖａｓｃ Ｄｉｓ ２００８； ８： Ｓ３４−Ｓ４１； Ｓｃｈｉｃｋ ｅｔ ａｌ． Ｇｌｕｃａｇｏｎｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ １ （７−３６）−ａｍｉｄｅ ａｃｔｓ ａｔ ｌａｔｅｒａｌ ａｎｄ ｍｅｄｉａｌ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ｓｉｔｅｓ ｔｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｆｅｅｄｉｎｇ ｉｎ ｒａｔｓ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００３； ２８４：Ｒ１４２７−３５）。但し、Ｅｘｅｎｄｉｎ若しくはその変異体の複合物は、分子量が増加しており、血液脳関門を透過し難いので、Ｅｘｅｎｄｉｎによる嘔吐反応を低減できる。従って、本研究を開始する前に、発明者は、Ｅｘｅｎｄｉｎ若しくはその変異体の複合物においても、Ｅｘｅｎｄｉｎの中枢神経系を介して摂食量及び体重を減少する作用が低減されると予測していた。しかしながら、野生型Ｅｘｅｎｄｉｎ及び複合していないＥｘｅｎｄｉｎ変異体も体重及び摂食量を減少させるが、本発明において、Ｅｘｅｎｄｉｎ若しくはその変異体の複合物は、顕著な強力な体重及び摂食量を減少する作用を有すことを、意外に見出した。
【０１０９】
従って、一方、本発明は、Ｅｘｅｎｄｉｎ若しくはその変異体の複合物及び／またはこの複合物を含む薬物組成物を用いて、体重を減少させる方法を提供する。また、体重減少用薬物の調製における、Ｅｘｅｎｄｉｎ若しくはその変異体の複合物及び／またはこの複合物を含む薬物組成物の用途を提供する。一つの実施の形態において、前記Ｅｘｅｎｄｉｎ若しくはその変異体の複合物は、上記本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物である。
【０１１０】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これらはいかなる方式でさらなる限制であると理解してはいけない。本出願におけるすべての引用された参考文献のすべての内容（文献参考、授権された特許、公開された特許出願及び共同未决の特許出願を含む）は、明確的に引用によって本文に援用される。以下の実施例において、具体的に説明していない限りに、用いた試薬及び材料は、ビジネス上で獲得できる、少なくとも分析用純度若しくはそれと相当レベレの製品である。
【０１１１】
実施例
下記の実施例にかかる技術方案を理解しやすくするために、下記表をもって、実施例において使用された各種のＥｘｅｎｄｉｎ、Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体及びその複合物の番号及び簡単な説明を示す。
【表１】

【０１１２】
実施例１ Ｅｘｅｎｄｉｎ−４及その変異体の固相合成
ポリペプチド合成は、生物化学及び薬学分野の常用の技術として知られており、数多くの商業機構（例えばＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．等）によって様々なタイプのポリペプチド合成機器が市場上に商業的に提供され、かつ数多くの商業機構（例えば、上海生工生物工程技術服務有限公司、上海博彩生物科技有限公司等）によってポリペプチドの依頼合成サービスが提供されている。例えば、以下の方法を使用して、ポリペプチド合成機器で所定の配列を有すポリペプチドを合成できる。
【０１１３】
「Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋｅｒ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂」型の固相キャリアを用いて、Ｆｍｏｃによるアミノ基保護手法でＥｘｅｎｄｉｎ−４及びそのチオール変異体を合成させる。ステップ１：Ｆｍｏｃ保護のアミノ酸と、縮合剤としてのＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡとを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶媒において、１−５時間反応させ、ニンヒドリン方法で縮合反応が完全に進行しているかどうかを確認する。ステップ２：脱保護試薬として１０−３０％のピペリジンを用いて、ＤＭＦ溶媒において、１０−３０分間反応させ、ニンヒドリン方法でアミノ基保護基が完全に脱出されたかどうかを確認する。ステップ３：目標ポリペプチド配列に基づいて、順次に相応のアミノ酸を用いて、配列中の最後のアミノ酸のカップリングが完成するまで「ステップ１とステップ２」 を繰返す。ステップ４：分解試薬としてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて、１−５時間反応させ、ポリペプチドを固相キャリアから分解させる共に、各種の保護基を脱出させる。ステップ５：分解されたポリペプチド溶液をエチルエーテルで沈殿させ、沈殿をろ過、回収してから、Ｃ１８タイプのクロマトグラフィーカラムにて、０．１％ ＴＦＡ／アセトニトリル−水系の移動相で溶出させて、画分溶液を回収して、凍結乾燥して産物を得る。ステップ６：高速液体クロマトグラフィー方法にて産物の純度を同定して、アミノ酸配列分析及びマススペクトルで産品の構造を測定した。
【０１１４】
発明者は、成都凱捷生物医薬科技発展公司に依頼して、上記方法による、以下の配列のポリペプチドを合成させた：
ＰＢ−１０１：野生型Ｅｘｅｎｄｉｎ−４、そのアミノ酸配列は、
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）；
ＰＢ−１０２：Ｃ末端第３５位がシステイン（Ｃｙｓ）であるＥｘｅｎｄｉｎ−４変異体、そのアミノ酸配列は、
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）；
ＰＢ−１０５：Ｃ末端第３９位がシステイン（Ｃｙｓ）であるＥｘｅｎｄｉｎ−４変異体、そのアミノ酸配列は、
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）；
ＰＢ−１０３：Ｃ末端第３０位がシステイン（Ｃｙｓ）であるＥｘｅｎｄｉｎ−４変異体、そのアミノ酸配列は、
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）；
【０１１５】
ＰＢ−１０４：Ｃ末端第２５位がシステイン（Ｃｙｓ）であるＥｘｅｎｄｉｎ−４変異体、そのアミノ酸配列は、
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）；
ＰＢ−１１１：Ｃ末端第３９位がシステイン（Ｃｙｓ）に置換され且つチロシン（Ｔｙｒ）が連結されたＥｘｅｎｄｉｎ−４変異体、そのアミノ酸配列は、
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）；及び
ＰＢ−１１３：Ｎ末端第２位のグリシン（Ｇｌｙ）がＤ型アラニン（ｄＡｌａ）に取替えられ、且つＣ末端第３９位がシステイン（Ｃｙｓ）に置換されたＥｘｅｎｄｉｎ−４変異体、そのアミノ酸配列は、
Ｈｉｓ−ｄＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８）。
【０１１６】
実例として、図１は、ＰＢ−１０５のマススペクトル分析結果を表し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル測定によるＰＢ−１０５のＭ＋１ピーク（分子量＋１）は４２０３．３ Ｄａ、その理論的な分子量（４２０２．８）と一致している。
【０１１７】
実施例２ａ ＰＢ−１１０ （ＰＥＧ５０００−ＰＢ−１０５）の調製と分析
２．０ ｍｇのＰＢ−１０５を１ ｍｌ ２０ ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５） に溶解させ、ＰＥＧとペプチドのモル比が２：１になるように、５ ｍｇ ＰＥＧ５０００（派格生物医薬（蘇州）有限公司により購入、５０００はＰＥＧの分子量が５ ｋＤａであることを表し、分子構造は図２を参照）を秤取して、上記溶液を添加し、適当に揺れることによってＰＥＧを溶解させてペプチドと均一に混合し、２０ ℃の条件下で１時間反応させた後に、過剰量のシステイン溶液（０．１ ｍｌ ０．５Ｍのシステイン溶液）で反応を停止させ、最後に、−２０ ℃に放置して、単離精製用として準備しておく。
【０１１８】
５０ ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）で５倍希釈した試料を用いて、５倍カラム体積の５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）で平衡させたＳＰイオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥ社、ＸＫ１６／２０カラム、ｍａｃｒｏＣａｐ ＳＰフィラー）にセットして、その後２倍カラム体積の５０ ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）で平衡させて、そして２０倍カラム体積の内に１００％ Ｂ緩衝液（１ Ｍ ＮａＣｌを含む５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５））に線性的に増加させ、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒにて溶出ピーク画分を回収した。含量を測定したところ、約１ｍｇのポリペプチドであった。
【０１１９】
３００Ａ内径のＣ４逆相分析カラム（Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ４ ３００Ａ ４．６＊２５０ｍｍ）を用いて、０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液を６１／３９〜５４／４６の勾配で溶出（１０ ｍｉｎ）させ、分析性ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ１２００）によって分析した結果、試料保持時間が１０．４ ｍｉｎ、純度が１００％（図３を参照）であった。ＧＰＣ分析（島津ＬＣ−２０ＡＤ、ＳＢ−８０２ ＨＱ／ＳＢ−８０３ ＨＱ／ＳＢ−８０４ＨＱ、３本連続）により、０．１ Ｍ 硝酸ナトリウム溶液で１．０ ｍｌ／ｍｉｎの条件にて溶出させた。純度が９７％であった。
【０１２０】
実施例２ｂ ＰＢ−１１０ｂ （ＰＥＧ５０００ｂ−ＰＢ−１０５）の調製と分析
２．０ ｍｇ ＰＢ−１０５ を取り、１ ｍｌ ２０ ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５） に溶解させて、ＰＥＧとペプチドのモル比が２：１になるように、５ ｍｇ ＰＥＧ５０００ｂ（派格生物医薬（蘇州）有限公司より購入、分子構造は図４を参照）を秤取して、上記溶液を添加し、適当に揺れることによってＰＥＧを溶解させてペプチドと均一に混合させた。そのほかは実施例２ａと同様であり、最後に、ＧＰＣ分析（島津ＬＣ−２０ＡＤ、ＳＢ−８０２ ＨＱ／ＳＢ−８０３ ＨＱ／ＳＢ−８０４ＨＱ、３本連続、条件は０．１ Ｍ 硝酸ナトリウム溶液で１．０ ｍｌ／ｍｉｎにて溶出）を行った。純度が９６．７％であった。
【０１２１】
実施例２ｃ ＰＢ−１１０ｃ （ＰＥＧ５０００ｃ−ＰＢ−１０２）の調製と分析
２．０ ｍｇ ＰＢ−１０５を取り、１ ｍｌ ２０ ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５） に溶解させ、ＰＥＧとペプチドのモル比が２：１の量になるように、５ ｍｇ ＰＥＧ５０００ｃ（派格生物医薬（蘇州）有限公司により購入、分子構造は図５を参照）を秤取して、上記溶液を添加し、適当に揺れることによってＰＥＧを溶解させて、ペプチドと均一に混合させた。そのほかは実施例２ａと同様にして、最後に、ＧＰＣ分析（島津ＬＣ−２０ＡＤ、ＳＢ−８０２ ＨＱ／ＳＢ−８０３ ＨＱ／ＳＢ−８０４ＨＱ、３本連続、条件は０．１ Ｍ 硝酸ナトリウム溶液１．０ ｍｌ／ｍｉｎ溶出）を行った。純度が９７．８％であった。
【０１２２】
実施例３ａ ＰＢ−１０６ （ＰＥＧ２００００−ＰＢ−１０５）の調製と分析
２．０ ｍｇ ＰＢ−１０５を取り、１ ｍｌ ２０ ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５） に溶解させ、ＰＥＧとペプチドのモル比が２：１の量になるように、２０ｍｇ ＰＥＧ２００００（派格生物医薬（蘇州）有限公司により購入、２００００はＰＥＧの分子量が２０ ｋＤａであることを表し、分子構造は図２を参照）秤取して、上記溶液を添加し、適当に揺れることによってＰＥＧを溶解させて、ペプチドと均一に混合し、２０ ℃条件下で１時間反応させ、その後過剰量のシステイン溶液（０．１ ｍｌ ０．５Ｍシステイン溶液）で反応を停止させ、最後に−２０ ℃に放置して、単離精製用に準備しておく。
【０１２３】
５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）で５倍希釈した試料を用いて、５ 倍カラム体積の５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）で平衡させたＳＰイオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥ社、ＸＫ１６／２０カラム、ｍａｃｒｏＣａｐ ＳＰフィラー）にセットし、その後２倍カラム体積の５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）で平衡させて、その後２０倍カラム体積のうちに、１００％のＢ緩衝液（１ Ｍ ＮａＣｌを含む５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５））に線性的に増加させて、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒにて溶出ピークの画分を回収した。含量測定の結果、約１ｍｇのポリペプチドであった。
【０１２４】
上記回収液をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルー染色法及びヨード染色法で対照染色（図６Ａ及び６Ｂを参照）を行った。３００Ａ内径のＣ４逆相分析カラム（Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ４ ３００Ａ ４．６＊２５０ｍｍ）を用いて、０．１％ ＴＦＡ水溶液／０．１％ ＴＦＡアセトニトリル溶液を６１／３９〜５４／４６の勾配で溶出させ（１０ ｍｉｎ）、分析性ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ１２００）で分析した結果、試料保持時間が１１．５ ｍｉｎ、純度が１００％であった（図７を参照）。ＧＰＣ分析（島津ＬＣ−２０ＡＤ、ＳＢ−８０２ ＨＱ／ＳＢ−８０３ ＨＱ／ＳＢ−８０４ＨＱ、３本連続）を、０．１ Ｍ 硝酸ナトリウム溶液で１．０ ｍｌ／ｍｉｎにて溶出する条件で行った。純度が９８．９％であった。
【０１２５】
実施例３ｂ ＰＢ−１０６ｂ （ＰＥＧ２００００ｂ−ＰＢ−１０５）の調製と分析
１．０ ｍｇ ＰＢ−１０５を取り、１ ｍｌ ２０ ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５） に溶解させ、ＰＥＧとペプチドのモル比が２：１の量になるように、２．５ ｍｇ ＰＥＧ２００００ｂ（派格生物医薬（蘇州）有限公司により購入、２００００はＰＥＧの分子量が２０ ｋＤａであることを表し、分子構造は図８を参照）を秤取して、上記溶液を添加し、適当に揺れることによってＰＥＧを溶解させて、ペプチドと均一に混合させた。そのほかは実施例３ａと同様にして、最後にＧＰＣ分析（島津ＬＣ−２０ＡＤ、ＳＢ−８０２ ＨＱ／ＳＢ−８０３ ＨＱ／ＳＢ−８０４ＨＱ、３本連続、条件は０．１ Ｍ 硝酸ナトリウム溶液で１．０ ｍｌ／ｍｉｎにて溶出）を行った。純度が９８．２％であった。
【０１２６】
実施例３ｃ ＰＢ−１０６ｃ （ＰＥＧ２００００ｃ−ＰＢ−１０５）の調製と分析
２．０ ｍｇ ＰＢ−１０５を取り、１ ｍｌ ２０ ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５） に溶解させ、ＰＥＧとペプチドのモル比が２：１の量になるように、２０ ｍｇ ＰＥＧ２００００ｃ（派格生物医薬（蘇州）有限公司により購入、２００００はＰＥＧの分子量が２０ ｋＤａであることを表し、分子構造は図９を参照）を秤取して、上記溶液を添加し、適当に揺れることによってＰＥＧを溶解させて、ペプチドと均一に混合させた。そのほかは実施例３ａと同様にして、最後に、ＧＰＣ分析（島津ＬＣ−２０ＡＤ、ＳＢ−８０２ ＨＱ／ＳＢ−８０３ ＨＱ／ＳＢ−８０４ＨＱ、３本連続、条件は０．１ Ｍ 硝酸ナトリウム溶液１．０ ｍｌ／ｍｉｎ溶出）を行った。純度が９７．２％であった。
【０１２７】
実施例３ｄ ＰＢ−１０６ｄ （ＰＥＧ２００００ｄ−ＰＢ−１０５）の調製と分析
２．０ ｍｇ ＰＢ−１０５を取り、１ ｍｌ ２０ ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５） に溶解させ、按ＰＥＧとペプチドのモル比が２：１の量になるように、２０ ｍｇ ＰＥＧ２００００−３（派格生物医薬（蘇州）有限公司により購入、２００００はＰＥＧの分子量が２０ ｋＤａであることを表し、分子構造は図１０を参照）を秤取し、上記溶液を添加し、適当に揺れることによってＰＥＧを溶解させて、ペプチドと均一に混合させた。そのほかは実施例３ａと同様にして、最後に、ＧＰＣ分析（島津ＬＣ−２０ＡＤ、ＳＢ−８０２ ＨＱ／ＳＢ−８０３ ＨＱ／ＳＢ−８０４ＨＱ、３本連続、条件は０．１ Ｍ 硝酸ナトリウム溶液で１．０ ｍｌ／ｍｉｎにて溶出）を行った。純度が９７．５ ％であった。
【０１２８】
実施例３ｅ ＰＢ−１０６ｅ （ＰＥＧ２００００ｅ−ＰＢ−１０５）の調製と分析
２．０ ｍｇ ＰＢ−１０２を取り、１ ｍｌ ２０ ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５） に溶解させ、ＰＥＧとペプチドのモル比が２：１の量になるように、２０ ｍｇ ＰＥＧ２００００ｅ（派格生物医薬（蘇州）有限公司により購入、２００００はＰＥＧの分子量が２０ ｋＤａであることを表し、分子構造は図１１を参照）を秤取し、上記溶液を添加し、適当に揺れることによってＰＥＧを溶解させて、ペプチドと均一に混合させた。そのほかは実施例３ａと同様にして、最後にＧＰＣ分析（島津ＬＣ−２０ＡＤ、ＳＢ−８０２ ＨＱ／ＳＢ−８０３ ＨＱ／ＳＢ−８０４ＨＱ、３本連続、条件は０．１ Ｍ 硝酸ナトリウム溶液で１．０ ｍｌ／ｍｉｎにて溶出）を行った。純度が９５．８ ％であった。
【０１２９】
実施例３ｆ ＰＢ−１１２（ＰＥＧ２００００−ＰＢ−１１１）の調製と分析
２．０ ｍｇ ＰＢ−１１１を取り、１ ｍｌの２０ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５） に溶解させ、ＰＥＧとペプチドのモル比が２：１の量になるように、１９ ｍｇ ＰＥＧ２００００（派格生物医薬（蘇州）有限公司により購入、２００００はＰＥＧの分子量が２０ ｋＤａであることを表し、分子構造は図２を参照）を秤取し、上記溶液を添加し、適当に揺れることによってＰＥＧを溶解させて、ペプチドと均一に混合し、２０ ℃の条件下で１時間反応させ、その後、過剰量のシステイン溶液（０．１ ｍｌ ０．５Ｍシステイン溶液）で反応を停止させ、最後に−２０ ℃に放置して、単離精製用に準備しておく。
【０１３０】
５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）で５倍希釈した試料を用いて、５ 倍カラム体積の５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）で平衡化させたＳＰイオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥ社、ＸＫ１６／２０カラム、ｍａｃｒｏＣａｐ ＳＰフィラー）にセットして、その後２倍カラム体積の５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）で平衡化させ、その後２０倍カラム体積内に、１００％ Ｂ緩衝液（１ Ｍ ＮａＣｌを含む５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５））に線性的に増加させて、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒで溶出ピーク画分を回収した。含量を測定した結果、約１ｍｇのポリペプチドであった。
【０１３１】
上記回収液を、３００Ａ内径のＣ４逆相分析カラム（Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ４ ３００Ａ ４．６＊２５０ｍｍ）を用いて、０．１％ ＴＦＡ水溶液／０．１％ ＴＦＡアセトニトリル溶液を６１／３９〜５４／４６の勾配で溶出させ（１０ ｍｉｎ）、分析性ＨＰＬＣによって分析したところ、試料保持時間は１０．６ ｍｉｎ、純度が９８．５％であった（図１２を参照）。ＧＰＣ分析（島津ＬＣ−２０ＡＤ、ＳＢ−８０２ ＨＱ／ＳＢ−８０３ ＨＱ／ＳＢ−８０４ＨＱ、３本連続）を０．１ Ｍ 硝酸ナトリウム溶液で１．０ ｍｌ／ｍｉｎにて溶出する条件で行った。純度が９８．７％であった。
【０１３２】
実施例４ ＰＢ−１０７ （ＰＥＧ３００００−ＰＢ−１０５）の調製と分析
２．０ ｍｇ ＰＢ−１０５を取り、１ ｍｌの２０ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５） に溶解させ、ＰＥＧとペプチドのモル比が２：１の量になるように、３０ ｍｇ ＰＥＧ３００００（派格生物医薬（蘇州）有限公司により購入、３００００はＰＥＧの分子量が３０ ｋＤａであることを表し、分子構造は図２を参照）を秤取して、上記溶液を添加し、適当に揺れることによってＰＥＧを溶解させて、ペプチドと均一に混合し、２０ ℃の条件下で、１時間反応させ、その後過剰量のシステイン溶液（０．１ ｍｌ ０．５Ｍシステイン溶液）で反応を停止させ、最後に−２０ ℃に放置させて、単離精製用に準備しておく。
【０１３３】
５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）で５倍希釈した試料を用いて、５ 倍カラム体積の５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）で平衡化されたＳＰイオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥ社、ＸＫ１６／２０カラム、ｍａｃｒｏＣａｐ ＳＰフィラー）にセットして、その後２倍カラム体積に５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）で平衡化させ、その後２０倍カラム体積内に、１００％ Ｂ緩衝液（１ Ｍ ＮａＣｌを含む５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５））に線性的に増加させ、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒで溶出ピーク画分を回収した。含量を測定した結果、約１ｍｇのポリペプチドであった。
【０１３４】
上記回収液をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルー染色法及びヨード染色法で対照染色（図６Ａ及び６Ｂを参照）を行った。３００Ａ内径のＣ４逆相分析カラム（Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ４ ３００Ａ ４．６＊２５０ｍｍ）を用いて、０．１％ ＴＦＡ水溶液／０．１％ ＴＦＡアセトニトリル溶液を６１／３９〜５４／４６の勾配で溶出させ（１０ ｍｉｎ）、分析性ＨＰＬＣで分析した結果、試料保持時間が１１．５ ｍｉｎ、純度が９７．３％であった（図１３を参照）。ＧＰＣ分析（島津ＬＣ−２０ＡＤ、ＳＢ−８０２ ＨＱ／ＳＢ−８０３ ＨＱ／ＳＢ−８０４ＨＱ、３本連続）を、０．１ Ｍ 硝酸ナトリウム溶液で１．０ ｍｌ／ｍｉｎにて溶出する条件で行った。純度が９８．７％であった。
【０１３５】
実施例５ａ ＰＢ−１０８ （ＰＥＧ４００００−ＰＢ−１０５）の調製と分析
２．０ ｍｇ ＰＢ−１０５を取り、１ ｍｌ ２０ ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５）に溶解させ、ＰＥＧとペプチドのモル比が２：１の量になるように、４０ ｍｇ ＰＥＧ４００００（派格生物医薬（蘇州）有限公司により購入、４００００はＰＥＧの分子量が４０ ｋＤａであることを表し、分子構造は図２を参照）を秤取して、上記溶液を添加し、適当に揺れることによってＰＥＧを溶解させてペプチドと均一に混合し、２０℃の条件下で反応１時間、その後、過剰量のシステイン溶液（０．１ ｍｌ ０．５Ｍシステイン溶液）で反応を停止させ、最後に−２０ ℃に放置して、単離精製用に準備しておく。
【０１３６】
５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）で５倍希釈した試料を用いて、５ 倍カラム体積の５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）で平衡化させたＳＰイオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥ社、ＸＫ１６／２０カラム、ｍａｃｒｏＣａｐ ＳＰフィラー）にセットして、その後２倍カラム体積の５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）で平衡化させ、その後２０倍カラム体積内に、１００％ Ｂ緩衝液（１ Ｍ ＮａＣｌを含む５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５））に線性的に増加させて、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒで溶出ピーク画分を回収した。含量を測定した結果、約１ｍｇのポリペプチドであった。
【０１３７】
上記回収液をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルー染色法及びヨード染色法で対照染色（図６Ａ及び６Ｂを参照）を行った。３００Ａ内径のＣ４逆相分析カラム（Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ４ ３００Ａ ４．６＊２５０ｍｍ）を用いて、０．１％ ＴＦＡ水溶液／０．１ ％ ＴＦＡアセトニトリル溶液を６１／３９〜５４／４６の勾配で溶出させ（１０ ｍｉｎ）、分析性ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ１２００）で分析した結果、試料保持時間が１１．４ ｍｉｎ、純度が１００％（図１４を参照）。ＧＰＣ分析（島津ＬＣ−２０ＡＤ、ＳＢ−８０２ ＨＱ／ＳＢ−８０３ ＨＱ／ＳＢ−８０４ＨＱ、３本連続）を、０．１ Ｍ 硝酸ナトリウム溶液で１．０ ｍｌ／ｍｉｎにて溶出する条件で行った。純度が９７．２％であった。
【０１３８】
実施例５ｂ ＰＢ−１１４（ＰＥＧ４００００−ＰＢ−１１３）の調製と分析
２．０ ｍｇ ＰＢ−１１３を取り、１ ｍｌの２０ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５）に溶解させ、ＰＥＧとペプチドのモル比が２：１の量になるように、４０ ｍｇ ＰＥＧ４００００（派格生物医薬（蘇州）有限公司により購入、４００００はＰＥＧの分子量が４０ ｋＤａであることを表し、分子構造は図２を参照）秤取して、上記溶液を添加し、適当に揺れることによってＰＥＧを溶解させて、ペプチドと均一に混合し、２０℃の条件下で１時間反応させて、その後過剰量のシステイン溶液（０．１ ｍｌ ０．５Ｍシステイン溶液）で反応を停止させ、最後に−２０ ℃に放置して、単離精製用に準備しておく。
【０１３９】
５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）５倍希釈した試料を用いて、５ 倍カラム体積の５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）で平衡化させたＳＰイオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥ社、ＸＫ１６／２０カラム、ｍａｃｒｏＣａｐ ＳＰフィラー）にセットして、その後２倍カラム体積の５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）で平衡化させ、その後２０倍カラム体積内に、１００％ Ｂ緩衝液（１ Ｍ ＮａＣｌを含む５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５））に線性的に増加させて、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒで溶出ピーク画分を回収した。含量を測定した結果、約１ｍｇのポリペプチドであった。
【０１４０】
上記回収液を３００Ａ内径のＣ４逆相分析カラム（Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ４ ３００Ａ ４．６＊２５０ｍｍ）を用いて、０．１％ ＴＦＡ水溶液／０．１％ ＴＦＡアセトニトリル溶液を６１／３９〜５４／４６の勾配で溶出させ（１０ ｍｉｎ）、分析性ＨＰＬＣで分析した結果、試料保持時間が１２．６ ｍｉｎ、純度が９７．９％（図１５を参照）。ＧＰＣ分析（島津ＬＣ−２０ＡＤ、ＳＢ−８０２ ＨＱ／ＳＢ−８０３ ＨＱ／ＳＢ−８０４ＨＱ、３本連続）を、０．１ Ｍ 硝酸ナトリウム溶液で１．０ ｍｌ／ｍｉｎにて溶出する条件で行った。純度が９８．４％であった。
【０１４１】
実施例６ａ ＰＢ−１０９（ＰＥＧ２００００×２（ダブルアームＰＥＧ）−ＰＢ−１０５）の調製と分析
２．０ ｍｇ ＰＢ−１０５を取り、１ ｍｌ ２０ ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５） に溶解させ、ＰＥＧとペプチドのモル比が２：１の量になるように、４０ｍｇ ＰＥＧ２００００×２（派格生物医薬（蘇州）有限公司により購入、２００００は、ＰＥＧ分子中の一のアームの分子量が２０ ｋＤａであることを表し、分子構造は図１６を参照）を秤取して、上記溶液を添加し、適当に揺れることによってＰＥＧを溶解させて、ペプチドと均一に混合し、２０ ℃の条件下で、１時間反応させ、その後過剰量のシステイン溶液（０．１ ｍｌ ０．５ Ｍ システイン溶液）で反応を停止させ、最後に−２０ ℃に放置して、単離精製用に準備しておく。
【０１４２】
５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）５倍希釈した試料を用いて、５ 倍カラム体積の５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）で平衡化させたＳＰイオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥ社、ＸＫ１６／２０カラム、ｍａｃｒｏＣａｐ ＳＰフィラー）にセットして、その後２倍カラム体積の５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）で平衡化させ、その後２０倍カラム体積内に、１００％ Ｂ緩衝液（１ Ｍ ＮａＣｌを含む５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５））に線性的に増加させて、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒで溶出ピーク画分を回収した。含量を測定した結果、約１ｍｇのポリペプチドであった。
【０１４３】
上記回収液をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルー染色法及びヨード染色法で対照染色（図６Ａ及び６Ｂを参照）を行った。３００Ａ内径のＣ４逆相分析カラム（Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ４ ３００Ａ ４．６＊２５０ｍｍ）を用いて、０．１％ ＴＦＡ水溶液／０．１％ ＴＦＡアセトニトリル溶液を６１／３９〜５４／４６の勾配で溶出させ（１０ ｍｉｎ）、分析性ＨＰＬＣで分析した結果、試料保持時間が１１．５ ｍｉｎ、純度が１００％であった（図１７を参照）。ＧＰＣ分析（島津ＬＣ−２０ＡＤ、ＳＢ−８０２ ＨＱ／ＳＢ−８０３ ＨＱ／ＳＢ−８０４ＨＱ、３本連続）を、０．１ Ｍ 硝酸ナトリウム溶液で１．０ ｍｌ／ｍｉｎにて溶出する条件で行った。純度が９９．３％であった。
【０１４４】
実施例６ｂ ＰＢ−１０９ｂ（ＰＥＧ２００００×２（ダブルアームＰＥＧ）ｂ−ＰＢ−１０５）の調製と分析
２．０ ｍｇ ＰＢ−１０５を取り、１ ｍｌ ２０ ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５） に溶解させ、ＰＥＧとペプチドのモル比が２：１の量になるように、４０ ｍｇ ＰＥＧ２００００×２ｂ（派格生物医薬（蘇州）有限公司により購入、２００００＊２はＰＥＧ分子量が２０＊２ ｋＤａであることを表し、分子構造は図１８を参照）を秤取し、上記溶液を添加し、適当に揺れることによってＰＥＧを溶解させて、ペプチドと均一に混合させた。そのほかは実施例６ａと同様にして、最後にＧＰＣ分析（島津ＬＣ−２０ＡＤ、ＳＢ−８０２ ＨＱ／ＳＢ−８０３ ＨＱ／ＳＢ−８０４ＨＱ、３本連続、条件は０．１ Ｍ 硝酸ナトリウム溶液で１．０ ｍｌ／ｍｉｎにて溶出）を行った、純度が９９．２％であった。
【０１４５】
実施例６ｃ ＰＢ−１０９ｃ（ＰＥＧ２００００×２（ダブルアームＰＥＧ）ｃ−ＰＢ−１０５）の調製と分析
２．０ ｍｇ ＰＢ−１０５を取り、１ ｍｌ ２０ ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５） に溶解させ、ＰＥＧとペプチドのモル比が２：１の量になるように、４０ｍｇ ＰＥＧ２００００×２ｃ（派格生物医薬（蘇州）有限公司により購入、２００００＊２はＰＥＧ分子量が２０＊２ ｋＤａであることを表し、分子構造は図１９を参照）を秤取して、上記溶液を添加し、適当に揺れることによってＰＥＧを溶解させて、ペプチドと均一に混合させた。そのほかは実施例６ａと同様にして、最後にＧＰＣ分析（島津ＬＣ−２０ＡＤ、ＳＢ−８０２ ＨＱ／ＳＢ−８０３ ＨＱ／ＳＢ−８０４ＨＱ、３本連続、条件は０．１ Ｍ 硝酸ナトリウム溶液で１．０ ｍｌ／ｍｉｎにて溶出）を行った。純度が９８．８％であった。
【０１４６】
実施例６ｄ ＰＢ−１０９ｄ（ＰＥＧ２００００×２（ダブルアームＰＥＧ）ｄ−ＰＢ−１０５）の調製と分析
２．０ ｍｇ ＰＢ−１０５を取り、１ ｍｌ ２０ ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５） に溶解させ、ＰＥＧとペプチドのモル比が２：１の量になるように、４０ ｍｇ ＰＥＧ２００００×２ｄ（派格生物医薬（蘇州）有限公司により購入、２００００＊２はＰＥＧ分子量が２０＊２ ｋＤａであることを表し、分子構造は図２０を参照）を秤取して、上記溶液を添加し、適当に揺れることによってＰＥＧを溶解させてペプチドと均一に混合させた。そのほかは実施例６ａと同様にして、最後にＧＰＣ分析（島津ＬＣ−２０ＡＤ、ＳＢ−８０２ ＨＱ／ＳＢ−８０３ ＨＱ／ＳＢ−８０４ＨＱ、３本連続、条件は０．１ Ｍ 硝酸ナトリウム溶液で１．０ ｍｌ／ｍｉｎにて溶出）を行った、純度が９９．２％であった。
【０１４７】
実施例７ ＰＢ−１１９（ＰＥＧ２３０００−ＰＢ−１０５）の調製と分析
２．０ ｍｇ ＰＢ−１０５を取り、１ ｍｌの２０ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５） に溶解させ、ＰＥＧとペプチドのモル比が２：１の量になるように、２２ ｍｇ ＰＥＧ２３０００（派格生物医薬（蘇州）有限公司により購入、２３０００はＰＥＧの分子量が２３ ｋＤａであることを表し、その分子構造は図２を参照）秤取して、上記溶液を添加し、適当に揺れることによってＰＥＧを溶解させて、ペプチドと均一に混合し、２０℃の条件下で１時間反応させ、その後過剰量のシステイン溶液（０．１ｍｌ ０．５Ｍシステイン溶液）で反応を停止させ、最後に−２０ ℃に放置して、単離精製用に準備しておく。
【０１４８】
５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）５倍希釈した試料を用いて、５ 倍カラム体積の５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）で平衡化させたＳＰイオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥ社、ＸＫ１６／２０カラム、ｍａｃｒｏＣａｐ ＳＰフィラー）にセットして、その後２倍カラム体積の５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）で平衡化させ、その後２０倍カラム体積内に、１００％ Ｂ緩衝液（１ Ｍ ＮａＣｌを含む５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５））に線性的に増加させて、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒで溶出ピーク画分を回収した。含量を測定した結果、約１ｍｇのポリペプチドであった。
【０１４９】
上記回収液を３００Ａ内径のＣ４逆相分析カラム（Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ４ ３００Ａ ４．６＊２５０ｍｍ）を用いて、０．１％ ＴＦＡ水溶液／０．１％ ＴＦＡアセトニトリル溶液を６１／３９〜５４／４６の勾配で溶出させ（１０ ｍｉｎ）、分析性ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ１２００）で分析した結果、試料保持時間が１１．６ ｍｉｎ、純度が９６．０％であった（図２１を参照）。ＧＰＣ分析（島津ＬＣ−２０ＡＤ、ＳＢ−８０２ ＨＱ／ＳＢ−８０３ ＨＱ／ＳＢ−８０４ＨＱ、３本連続）を、０．１ Ｍ 硝酸ナトリウム溶液で１．０ ｍｌ／ｍｉｎにて溶出する条件で行った。純度が９７．１％であった。
【０１５０】
実施例８ ＰＢ−１２０（ＰＥＧ２７０００−ＰＢ−１０５）の調製と分析
２．０ ｍｇ ＰＢ−１０５を取り、１ ｍｌの２０ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５） に溶解させ、ＰＥＧとペプチドのモル比が２：１の量になるように、２４ ｍｇ ＰＥＧ２７０００（派格生物医薬（蘇州）有限公司により購入、２７０００はＰＥＧの分子量が２７ ｋＤａであることを表し、その分子構造は図２を参照）を秤取し、上記溶液を添加し、適当に揺れることによってＰＥＧを溶解させて、ペプチドと均一に混合し、２０ ℃の条件下で１時間反応させ、その後過剰量のシステイン溶液（０．１ｍｌ ０．５Ｍシステイン溶液）で反応を停止させ、最後に−２０ ℃に放置して、単離精製用に準備しておく。
【０１５１】
５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）５倍希釈した試料を用いて、５ 倍カラム体積の５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）で平衡化させたＳＰイオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥ社、ＸＫ１６／２０カラム、ｍａｃｒｏＣａｐ ＳＰフィラー）にセットして、その後２倍カラム体積の５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）で平衡化させ、その後２０倍カラム体積内に、１００％ Ｂ緩衝液（１ Ｍ ＮａＣｌを含む５０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５））に線性的に増加させて、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒで溶出ピーク画分を回収した。含量を測定した結果、約１ｍｇのポリペプチドであった。
【０１５２】
上記回収液を３００Ａ内径のＣ４逆相分析カラム（Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ４ ３００Ａ ４．６＊２５０ｍｍ）を用いて、０．１％ ＴＦＡ水溶液／０．１％ ＴＦＡアセトニトリル溶液を６１／３９〜５４／４６の勾配で溶出させ（１０ ｍｉｎ）、分析性ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ１２００）で分析した結果、試料保持時間が１２．１ ｍｉｎ、純度が９７．７％であった（図２２を参照）。ＧＰＣ分析（島津ＬＣ−２０ＡＤ、ＳＢ−８０２ ＨＱ／ＳＢ−８０３ ＨＱ／ＳＢ−８０４ＨＱ、３本連続）を、０．１ Ｍ 硝酸ナトリウム溶液で１．０ ｍｌ／ｍｉｎにて溶出する条件で行った。純度が９８．４％であった。
【０１５３】
実施例９ ＰＢ−１０５ポリエチレングリコール化複合物の平衡性試験
ＰＢ−１１０ （ＰＥＧ５０００−ＰＢ−１０５）、ＰＢ−１０６ （ＰＥＧ２００００−ＰＢ−１０５）、ＰＢ−１０７ （ＰＥＧ３００００−ＰＢ−１０５）、ＰＢ−１０８ （ＰＥＧ４００００−ＰＢ−１０５）及びＰＢ−１０９ （ＰＥＧ２００００＊２−ＰＢ−１０５）を、それぞれｐＨ値が４．５の酢酸ナトリウム緩衝液及びｐＨ値が７．０リン酸塩緩衝液、温度が４ ℃及び−２０ ℃条件下におき、その安定性を調べた。それぞれ７、１５、３０、６０日目にサンプリングを行ってＨＰＬＣ分析したが、６０日目の結果から、試料は、ｐＨ ４．５及び−２０ ℃において保存安定であり（図２３Ａ）、試料は、ｐＨ ７．０において、４ ℃若しくは−２０ ℃のいずれにおいても保存安定である（図２３Ｂ、２３Ｃ）。
【０１５４】
実施例１０ ＰＢ−１０１とＰＢ−１０５の体外における細胞内ｃＡＭＰ活性に対する影響
ＰＣ１２細胞を消化させて、１０^５細胞／ｍｌの密度で２４穴プレートに接種し、４８時間培養（６０−７０％にて集め）、原培養液を捨てて、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１ ｍｌの１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳを添加して、実験用のＰＢ−１０１及びＣ末端第３９位がシステインであるＥｘｅｎｄｉｎ−４変異体ＰＢ−１０５（１０^−１１、１０^−１０、１０^−９、１０^−８、１０^−７及び１０^−６ Ｍ）を、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、終濃度：１００ μＭ）と３０ ｍｉｎ共同インキュベートし、試薬培地を捨て、５００ μｌ ＨＣｌ （０．１ Ｍ）を添加して、ｃＡＭＰに対する酵素の分解を中止させて、細胞を收集し、超音波で細胞破砕を行って、ＢＣＡ法で細胞のタンパク質含量を測定した。ｃＡＭＰ酵素結合免疫試薬キット（米国ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍ公司）の取り扱い書に従って操作を行い、異なる濃度の標準物群を設立して検量線を作成し、反応完成後にＥＬＩＳＡ リーダー（米国Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司）で４５０ ｎｍの光吸收値を測定し、当該吸收値を用いて検量線にて対応のｃＡＭＰ濃度を読み出し、最後に試料中のｃＡＭＰ濃度を計算した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｚｍソフトを用いて、ＰＢ−１０１及びＰＢ−１０５の体外における細胞内ｃＡＭＰを増加させる用量反応関係の結果について計算を行う。
【０１５５】
図２４に示すように、実験結果は、ＰＢ−１０１が投与量依存的にＰＣ１２細胞内ｃＡＭＰ含量を増加させており、ｃＡＭＰ増加の最大値（Ｅ_ｍａｘ）が１３３．２±７．２ ｐｍｏｌ／１００ μｇ（タンパク質）、ＥＣ_５０値が１．９ｘ１０^−９ Ｍである。 ＰＢ−１０５の体外におけるＰＣ１２細胞内ｃＡＭＰに対する影響は、ＰＢ−１０１と非常に類似している。その中、ＰＢ−１０５のｃＡＭＰ増加最大値（Ｅ_ｍａｘ）が１２９．４±６．８ ｐｍｏｌ／１００ μｇ（タンパク質）（ＰＢ−１０５ ｖｓ ＰＢ−１０１， Ｐ ＞ ０．０５）であり、ＥＣ_５０値が２．５ｘ１０^−９ Ｍである。さらなる分析から、ＰＢ−１０１と ＰＢ−１０５のＬｏｇ ＥＣ_５０値がそれぞれ−８．７１±０．１５と−８．６１±０．１５ （ＰＢ−１０５ ｖｓ ＰＢ−１０１， Ｐ ＞ ０．０５）であることを分かる。これは、Ｃ末端第３９位にシステイン（チオール）を導入することは、ＰＢ−１０１自身の生物活性を変化させないことを示唆している。
【０１５６】
実施例１１ ＰＢ−１０５及びそのポリエチレングリコール化複合物の体外における細胞内ｃＡＭＰ活性に対する影響
ＰＣ１２細胞を消化させて、１０^５細胞／ｍｌ密度で２４穴プレートに接種して、４８時間（到６０−７０％にて集め）培養し、原培養液を捨て、ＰＢＳで２回洗浄し、１ ｍｌの１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを添加し、受験薬物ＰＢ−１０５、ＰＢ−１０５ポリエチレングリコール化（ＰＥＧ５０００）複合物ＰＢ−１１０、ＰＢ−１０５ポリエチレングリコール化（ＰＥＧ２００００）複合物ＰＢ−１０６、ＰＢ−１０５ポリエチレングリコール化（ＰＥＧ３００００）複合物ＰＢ−１０７、ＰＢ−１０５ポリエチレングリコール化（ＰＥＧ４００００）複合物ＰＢ−１０８及びＰＢ−１０５ポリエチレングリコール化（ＰＥＧ２００００ｘ２，ダブルアーム）複合物ＰＢ−１０９（１０^−１１、１０^−１０、１０^−９、１０^−８、１０^−７、１０^−６ 及び１０^−５ Ｍ）を、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、終濃度：１００ μＭ）と３０ ｍｉｎ共同インキュベートし、試薬培地を捨て、５００ μｌ ＨＣｌ （０．１ Ｍ）を添加して、ｃＡＭＰに対する酵素の分解を中止して、細胞を收集し、超音波で細胞破砕を行って、ＢＣＡ法で細胞のタンパク質含量を測定した。ｃＡＭＰ酵素結合免疫試薬キットの取り扱い書に従って操作を行い、異なる濃度の標準物群を設立して検量線を作成し、反応完成後にＥＬＩＳＡ リーダーで４５０ ｎｍの光吸收値を測定し、当該吸收値を用いて検量線にて対応のｃＡＭＰ濃度を読み出し、最後に試料中のｃＡＭＰ濃度を計算した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｚｍソフトを用いて、ＰＢ−１０６、ＰＢ−１０７、ＰＢ−１０８、ＰＢ−１０９及ＰＢ−１１０の体外における細胞内ｃＡＭＰを増加させる用量反応関係の結果について計算を行う。
【０１５７】
実験結果から分かるように、ＰＢ−１０５は、投与量依存的にＰＣ１２細胞内ｃＡＭＰ含量を増加させており、そのｃＡＭＰ増加最大値（Ｅ_ｍａｘ）が１０３．９±１．５ ｐｍｏｌ／１００ μｇ（タンパク質）、ＥＣ_５０値が１．３ｘ１０^−９ Ｍである。ポリエチレングリコール化修飾は、分子量（５−４０ ｋＤａ）−依存的に右へ平行に移動する用量反応関係曲線を示し、ＰＢ−１０５の生物活性が低下する（図２５）。ＰＢ−１１０、ＰＢ−１０６、ＰＢ−１０７、ＰＢ−１０８及びＰＢ−１０９のＥＣ_５０値はそれぞれ１．１ｘ１０^−９、１．１ｘ１０^−９、１．２ｘ１０^−８、９．７ｘ１０^−８及び１．３ｘ１０^−７ Ｍである。その中、５ ｋＤａ （ＰＢ−１１０） 及び２０ ｋＤａ （ＰＢ−１０６） ポリエチレングリコール化修飾は、ほぼＰＢ−１０５の活性を影響しない（それぞれＰＢ−１０５活性の１１５％）が、３０ ｋＤａ （ＰＢ−１０７）及び４０ ｋＤａ （線性的及びダブルアームを含む、ＰＢ−１０８及びＰＢ−１０９） ポリエチレングリコール化修飾は、それぞれＰＢ−１０５の活性を約９０％及び９９％低下させる。ポリエチレングリコール化複合物におけるポリエチレングリコールの分子量とこれら薬物の活性（Ｌｏｇ ＥＣ_５０）の関連性は図２６Ａ（図２４におけるＰＢ−１０５のＥＣ_５０値を含む）に参照されたい。
【０１５８】
実施例１２ ＰＢ−１０５及びそのポリエチレングリコール化複合物の体外における細胞内ｃＡＭＰ活性に対する影響
ＰＣ１２細胞を消化させて、１０^５細胞／ｍｌ密度で２４穴プレートに接種して、４８時間培養し（６０−７０％にて集め）、原培養液を捨て、ＰＢＳ で２回洗浄し、１ ｍｌの１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを添加して、受験薬物ＰＢ−１０５、ＰＢ−１０５ポリエチレングリコール化（ＰＥＧ２３０００）複合物ＰＢ−１１９及びＰＢ−１０５ポリエチレングリコール化（ＰＥＧ２７０００）複合物ＰＢ−１２０ （１０^−１１、１０^−１０、１０^−９、３ｘ１０^−９、１０^−８及び１０^−７ Ｍ）を、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、終濃度：１００ μＭ）と３０ ｍｉｎ共同インキュベートし、試薬培地を捨て、５００ μｌ ＨＣｌ （０．１ Ｍ） を添加して、ｃＡＭＰに対する酵素の分解を中止させて、細胞を收集し、超音波で細胞破砕を行って、ＢＣＡ法で細胞のタンパク質含量を測定した。ｃＡＭＰ酵素結合免疫試薬キットの取り扱い書に従って操作を行い、異なる濃度の標準物群を設立して検量線を作成し、反応完成後にＥＬＩＳＡ リーダーで４５０ ｎｍの光吸收値を測定し、当該吸收値を用いて検量線にて対応のｃＡＭＰ濃度を読み出し、最後に試料中のｃＡＭＰ濃度を計算した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｚｍソフトを用いて、ＰＢ−１０５、ＰＢ−１１９、及びＰＢ−１２０の体外における細胞内ｃＡＭＰを増加させる用量反応関係の結果について計算を行う。
【０１５９】
実験結果から分かるように、ＰＢ−１０５は投与量に依存的にＰＣ１２細胞内ｃＡＭＰ含量を増加させており、 ＥＣ_５０値が２．７ｘ１０^−９ Ｍである。ＰＢ−１０６（ＰＥＧ２００００）及びＰＢ−１１９（ＰＥＧ２３０００）は、ＰＢ−１０５のｃＡＭＰ活性を影響しないが、ＰＢ−１２０（ＰＥＧ２７０００）は用量反応関係曲線が右へ平行に移動して、ＰＢ−１０５のｃＡＭＰ生物学的効果を約５０％低下させる（図２７）。ＰＢ−１０６、ＰＢ−１１９及びＰＢ−１２０のＥＣ_５０値はそれぞれ１．５ｘ１０^−９、２．５ｘ１０^−９及び５．４ｘ１０^−９ Ｍである。
【０１６０】
通常、複合基の分子量（例えば４ ｋＤａから）の増加に伴って、複合生物分子の生物活性が指数関数的に低下していくと知られている（Ｂａｉｌｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ， ｌｏｎｇ−ｌａｓｔｉｎｇ ｆｏｒｍ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ： Ａ ４０ ｋＤａ ｂｒａｎｃｈｅｄ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ α−２ａ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ ２００１ ； １２ ： １９５ −２０２； Ｂｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ａｎｄ ｄｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｍｕｔｅｉｎ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ １９９９； ２７： ４２５ −３２；Ｂａｉｌｏｎ ｅｔ ａｌ． ＰＥＧ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ． Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｅｌｉｖ． ２００９； ６： １−１６）。しかし、図２５及び図２７において、複合された重合体基の分子量とＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物の体外における刺激によるｃＡＭＰ活性の間の関係は、このような予想とは完全に一致していないことを意外に見出した。少なくとも複合されたＰＥＧ分子量が２３ ｋＤａまで高いＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物では、ポリエチレングリコール化修飾は、Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体複合物の体外における刺激による細胞のｃＡＭＰ作用を影響しない（さらにＰＥＧ分子量が２７ ｋＤａまで高くても軽くだけに影響する）。逆に、ポリエチレングリコール化修飾は、ＰＢ−１０５の最大の刺激によるｃＡＭＰ生成作用（Ｅ_ｍａｘ）を影響しなく、ＰＢ−１１０、 ＰＢ−１０６、ＰＢ−１０７、ＰＢ−１０８及びＰＢ−１０９のＥ_ｍａｘ値は、それぞれ１０２．１±１．８、１１１．９±２．１、１２６．２±３．４、１００．４±１．７及び１１５．５±３．５ ｐｍｏｌ／１００ μｇタンパク質である。ポリエチレングリコール化複合物におけるポリエチレングリコールの分子量とこれら薬物のＥ_ｍａｘ値は関連性がない（図２６Ｂを参照）（図２４におけるＰＢ−１０５のＥ_ｍａｘ値を含む）。
【０１６１】
発明者は、このような意外な試験結果に基づいて、下記のその後の分析を行った。本実施例では反応系として血清含有培地（その中、プロテアーゼを多く含む）を使用していない上で、且つ反応溶液中にもプロテアーゼを外添していないので、本実施例において、体外条件でのＥｘｅｎｄｉｎ変異体及びその複合物の酵素分解促進作用は、生体内の環境の場合と比べて顕著に低い。即ち、より長い作用時間の生体内の試験では、複合していない野生型Ｅｘｅｎｄｉｎ若しくはＥｘｅｎｄｉｎ変異体と比べて、本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物の生物活性の低下の程度がより低く、複合Ｅｘｅｎｄｉｎ若しくはその変異体の生物活性よりも高い可能性が高いと考えられる。一方、さらに２３ ｋＤａを超えた重合体基とＥｘｅｎｄｉｎ変異体を複合しても、その生体内の生物活性を顕著に影響しない。本発明はこれらの理論推測に限定されないが、これらの予測結果は、この後の実施例において証明されている。
【０１６２】
実施例１３ ＰＢ−１０１及びＰＢ−１０５の血糖降下作用の、時間と効果の試験
雄昆明マウス（体重２７−３２ ｇ）を用い、実験前にマウスを非絶食絶水して、ランダムに３群にわけ、群ごとに６匹にする。等体積の、生理食塩水（１０ ｍｌ／ｋｇ）、ＰＢ−１０１（１０ μｇ／ｋｇ）及びＣ末端第３９位がシステインであるＥｘｅｎｄｉｎ変異体ＰＢ−１０５（１０ μｇ／ｋｇ）を、それぞれ皮下単回注射した。注射後の０、１、２、４、８、１２時間に、尾尖採血を行い、米国ジョンソン・エンド・ ジョンソン社の「ＯｎｅＴｏｕｃｈ Ｕｌｔｒａ」型グルコメーター及び付きの試験紙で血糖を測定する。縦軸が異なる時点の血糖値、横軸が時間で血糖降下作用の時間と効果の曲線を作成して、ＰＢ−１０１及ＰＢ−１０５の血糖降下作用の生物半減期を算出した。結果は図２８に示したように、システイン置換された後のＥｘｅｎｄｉｎ−４変異体とＥｘｅｎｄｉｎ−４の生物半減期はそれぞれ４．７±０．２ ｈｒｓ及び４．４±０．２ ｈｒｓ （ＰＢ−１０５ ｖｓ ＰＢ−１０１， Ｐ＞０．０５）である。Ｃ末端３９位にてシステイン置換された後のＥｘｅｎｄｉｎ−４変異体とＥｘｅｎｄｉｎ−４とは同程度の生物半減期を有していることを示した。
【０１６３】
実施例１４ ＰＢ−１０１及びＰＢ−１０５血糖降下作用の、用量反応試験
雄昆明マウス（体重２３−２７ ｇ）を用い、実験前にマウスを３ ｈ絶食させたが、絶水せず、ランダムに１６群に分け、一群当たり１８匹にした。等体積の生理食塩水（１０ ｍｌ／ｋｇ）と、ＰＢ−１０１ （０．０１，０．１，０．３，１，３，１０，１００ μｇ／ｋｇ）及びＣ末端第３９位がシステインであるＥｘｅｎｄｉｎ変異体ＰＢ−１０５ （０．０１、０．１、０．３、１，３、１０、１００ μｇ／ｋｇ）とをそれぞれ皮下単回注射した。注射後の１時間に、尾尖採血を行い、米国ジョンソン・エンド・ ジョンソン社の「ＯｎｅＴｏｕｃｈ Ｕｌｔｒａ」型グルコメーター及び付きの試験紙で血糖を測定する。縦軸に血糖値を表し、横軸に投与量を表して、血糖降下作用の用量反応曲線を作成し（図２９）、かつＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｚｍソフトを用いて、ＰＢ−１０１及びＰＢ−１０５の血糖降下作用の用量反応関係パラメタ（Ｅ_ｍａｘ及びＥＤ_５０）を計算した。その結果、ＰＢ−１０１及びＰＢ−１０５の単回注射における最大血糖降下效率はそれぞれ３２．２％及び３６．１％であり、ＥＤ_５０値がぞれぞれ０．６ 及び１．２ μｇ／ｋｇであった。さらなる分析から、ＰＢ−１０１及びＰＢ−１０５のＬｏｇ ＥＤ_５０値がそれぞれ−０．２５±０．１７及び０．０８±０．２０ （ＰＢ−１０５ ｖｓ ＰＢ−１０１， Ｐ＞０．０５）であることを分かった。実験結果から分かるように、Ｃ末端３９位でシステイン置換された後のＥｘｅｎｄｉｎ−４変異体ＰＢ−１０５とＥｘｅｎｄｉｎ−４は、血糖降下効果において顕著性な差がなかった。
【０１６４】
実施例１５ ＰＢ−１０１及その変異体ＰＢ−１０２血糖降下作用の、用量反応試験
雄昆明マウス（体重２２−２６ｇ）を用い、実験前にマウスを３ ｈ絶食したが、絶水せず、ランダムに１８群にわけて、一群当たりに６匹にした。等体積の生理食塩水（１０ ｍｌ／ｋｇ）、ＰＢ−１０１ （０．０１，０．１，１，１０，１００μｇ／ｋｇ）及びＣ末端第３５位がシステインであるＥｘｅｎｄｉｎ変異体ＰＢ−１０２（０．０１，０．１，１，１０，１００μｇ／ｋｇ）をそれぞれ皮下単回注射した。注射後の１時間に尾尖採血して、米国ジョンソン・エンド・ ジョンソン社の「ＯｎｅＴｏｕｃｈ Ｕｌｔｒａ」型グルコメーター及び付きの試験紙で血糖を測定する。縦軸に血糖値を表し、横軸に投与量を表して、血糖降下作用の用量反応曲線を作成し（図３０）、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｚｍソフトを用いて、ＰＢ−１０１及びＰＢ−１０２の血糖降下作用の用量反応関係パラメタ（Ｅ_ｍａｘ及びＥＤ_５０）を計算した。その結果、単回注射ＰＢ−１０１及びＰＢ−１０２の最大血糖降下效率はぞれぞれ３９．８％及び３２．８％であり、ＥＤ_５０値がそれぞれ０．５及び２．５ μｇ／ｋｇであった。さらなる分析により、ＰＢ−１０１及びＰＢ−１０２のＬｏｇ ＥＤ_５０値がぞれぞれ−０．２８６７±０．２２７２及び０．４０１５±０．２９４６ （ＰＢ−１０２ ｖｓ ＰＢ−１０１， Ｐ＞０．０５）であることを分かった。実験結果からわかるように、Ｃ末端３５位でシステイン置換された後のＥｘｎｅｄｉｎ−４変異体ＰＢ−１０２とＥｘｅｎｄｉｎ−４は血糖降下効果において顕著な差がなかった。
【０１６５】
実施例１６ ＰＢ−１０５及びそのポリエチレングリコール化複合物の、等量血糖降下作用の、時間と効果の試験
雄昆明マウス（体重２２−２６ｇ）を用いて、実験前にマウスを非絶食絶水にし、ランダムに６群に分けて、一群当たりに１２匹にした。ＰＢ−１０５（１０ μｇ／ｋｇ）、ＰＢ−１０５ポリエチレングリコール化（ＰＥＧ５０００）複合物ＰＢ−１１０（１０ μｇ／ｋｇ）、ＰＢ−１０５ポリエチレングリコール化（ＰＥＧ２００００）複合物ＰＢ−１０６（１０ μｇ／ｋｇ）、ＰＢ−１０５ポリエチレングリコール化（ＰＥＧ３００００）複合物ＰＢ−１０７（１０ μｇ／ｋｇ）、ＰＢ−１０５ポリエチレングリコール化（ＰＥＧ４００００）複合物ＰＢ−１０８（１０ μｇ／ｋｇ）及びＰＢ−１０５ポリエチレングリコール化（ＰＥＧ２００００ｘ２，ダブルアーム）複合物ＰＢ−１０９（１０ μｇ／ｋｇ）を、それぞれ皮下単回注射した。注射後の０、１、２、４、８、１２、１８、２４、３６時間目に尾尖採血して、米国ジョンソン・エンド・ ジョンソン社の「ＯｎｅＴｏｕｃｈ Ｕｌｔｒａ」型グルコメーター及び付きの試験紙で血糖を測定する。縦軸が異なる時点の血糖値、横軸が時間で血糖降下作用の時間と効果の曲線を作成して（図３１）、ＰＢ−１０５及びそのポリエチレングリコール化複合物血糖降下作用の生物半減期及び最大血糖降下作用及び血糖降下作用曲線下面積（表１）を算出した。
【０１６６】
表１からわかるように、複合していないＰＢ−１０５と比べて、試験に用いた各種のＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物はいずれも類似または顕著に高い（ＰＢ−１０６）累積血糖降下效果（血糖曲線下面積を参照）を示しており、且つこれらのＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物はいずれも顕著なより長い生物半減期を有している。さらなるＰＥＧ分子量ｖｓ．生物半減期、最大血糖降下作用及び血糖降下作用曲線下面積の関連分析の結果から、ＰＢ−１０５ポリエチレングリコール化複合物ＰＢ−１０６、ＰＢ−１０７、ＰＢ−１０８及びＰＢ−１０９は、いずれもＰＢ−１０５血糖降下作用の時間（生物半減期ｔ_１／２）を顕著に延長させているが、ＰＥＧ分子量が５−２０ ｋＤａの間において、その生物半減期の延長と分子量が正比になり、２０ ｋＤａからの血糖降下作用の、時間（生物半減期）はほぼ変化ずに維持され（図３２Ａ）；ポリエチレングリコール化複合物は、ＰＥＧ分子量が５−２０ ｋＤａの間に最大血糖降下作用が変化ずに保持され、その後ポリエチレングリコール分子量の増加に伴って低下していく（図３２Ｂ）。
【０１６７】
血糖降下作用曲線下面積において、ＰＢ−１０６（ＰＥＧ２０ ｋＤａ）のみがＰＢ−１０５より顕著に高く、そのほかの複合物分子はＰＢ−１０５と近似若しくはわずかに低い累積血糖降下作用を有している（図３２Ｃ）。これからわかるように、少なくともＰＥＧ分子量が２０ ｋＤａまで高い場合に、部位特異的なポリエチレングリコール化修飾（ＰＢ−１１０及びＰＢ−１０６）はＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物の最大血糖降下作用（それぞれがＰＢ−１０５活性の９６％）を顕著に影響せず、ＰＥＧ分子量が３０ ｋＤａ若しくはそれ以上の場合（ＰＢ−１０７、ＰＢ−１０８及びＰＢ−１０９）、これらの複合物がかなりの累積血糖降下作用及び顕著なより長い生物半減期を有しているが、ポリエチレングリコール化修飾はその最大血糖降下作用を顕著に降低させる。当該結果は、相対的に高い分子量の複合基を用いてＥｘｅｎｄｉｎ変異体を複合することによって、顕著なより長い生物半減期及びより緩和及び安定な血糖レベルを獲得でき、血糖レベルの短時間内での過剰低下及び大範囲の波動を避けることができる。当該発現は、前述の体外ｃＡＭＰ実験の結果と一致している（図２６を参照）。
【０１６８】
【表２】

【０１６９】
実施例１７ ＰＢ−１０５及びそのポリエチレングリコール化（ＰＥＧ３００００）複合物ＰＢ−１０７の、同程度の有効投与量における血糖降下作用の、時間と効果の試験
ＰＥＧ３００００（ＰＢ−１０７）は、体外においてＰＢ−１０５の生物活性の約９０％を降低し（図２５）、生体内においてＰＢ−１０５の生物活性の約５０％を降低している（図３１）ので、本研究は、ＰＢ−１０７の投与量を増加させてＰＢ−１０５と等效を生じる条件下において、ＰＢ−１０７の生物半減期について、さらに検討した。雄昆明マウス（体重２２−２５ ｇ）を用いて、実験前にマウス非絶食絶水して、ランダムに２群にわけて、一群当たり６匹にした。ＰＢ−１０５（１０ μｇ／ｋｇ）及びＰＢ−１０５ポリエチレングリコール化（ＰＥＧ３００００）複合物ＰＢ−１０７（１００ μｇ／ｋｇ、約１０ μｇ／ｋｇ ＰＢ−１０５の１００％血糖降下作用を生じる投与量）をそれぞれ皮下単回注射した。注射後に、０、１、２、４、８、１２、１８、２４、３６、４８、７２時間目に尾尖採血を行い、米国ジョンソン・エンド・ ジョンソン社の「ＯｎｅＴｏｕｃｈ Ｕｌｔｒａ」型グルコメーター及び付きの試験紙で血糖を測定する。縦軸が異なる時点の血糖値、横軸が時間で血糖降下作用の時間と効果の曲線を作成して、ＰＢ−１０５（１０ μｇ／ｋｇ）及びＰＢ−１０７（１００ μｇ／ｋｇ）血糖降下作用の生物半減期を計算した。その結果、図３３に示したように、ＰＢ−１０５（１０ μｇ／ｋｇ）及びＰＢ−１０７（１００ μｇ／ｋｇ）の生物半減期はそれぞれ４．５±０．４ ｈｒｓ及び４４．６±４．５ ｈｒｓ （Ｐ ＞ ０．０５， ＰＢ−１０７ ｖｓ ＰＢ−１０５）であった。等效投与量の時間と効果の関係研究結果から、ポリエチレングリコール化（ＰＥＧ３００００）（ＰＢ−１０７）はＰＢ−１０５血糖降下作用の時間を１０倍までに延長させることを分かった。
【０１７０】
実施例１８ ＰＢ−１０５及びそのポリエチレングリコール化（ＰＥＧ２００００）複合物ＰＢ−１０６の、血糖降下作用の、用量反応試験
雄昆明マウス（体重２０−２４ ｇ）を用いて、実験前にマウスを３ ｈ絶食したが、絶水せず、ランダムに１３群にわけて、一群当たり６匹にした。等体積の塩水（１０ ｍｌ／ｋｇ）、ＰＢ−１０５ （０．１、０．３、１，３、１０、３０ μｇ／ｋｇ）及び等しい投与量のポリエチレングリコール化（ＰＥＧ２００００）複合物ＰＢ−１０６ （０．１，０．３，１，３，１０，３０ μｇ／ｋｇ）を、それぞれ皮下単回注射した。ＰＢ−１０５群は、注射後の１時間目（血糖降下ピーク値の時間、図２８及び３１を参照）に尾尖採血し、ＰＢ−１０６群は注射後の４時間目（血糖降下ピーク値の時間、図３１を参照）に尾尖採血して、米国ジョンソン・エンド・ ジョンソン社の「ＯｎｅＴｏｕｃｈ Ｕｌｔｒａ」型グルコメーター及び付きの試験紙で血糖を測定する。縦軸に血糖値を表し、横軸に投与量を表して、血糖降下作用の用量反応曲線を作成し（図３４）、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｚｍソフトを用いて、ＰＢ−１０５及びＰＢ−１０６の血糖降下作用の用量反応関係パラメタ（Ｅ_ｍｉｎ、Ｅ_ｍａｘ及びＥＤ_５０）を計算した。単回注射されたＰＢ−１０５及びＰＢ−１０６のＥ_ｍｉｎはそれぞれ８．３ ± ０．２ 及び８．４ ±０．３ ｍｍｏｌ／Ｌであり、そのＥ_ｍａｘはそれぞれ６．０ ± ０．３及び５．５ ± ０．６ ｍｍｏｌ／Ｌ（最大血糖降下效率はぞれぞれ２７．８％及び３４．５％）であった。ＰＢ−１０５及びＰＢ−１０６のＥＤ_５０値はぞれぞれ１．２及び３．３ μｇ／ｋｇであった。さらなる分析から、ＰＢ−１０５及びＰＢ−１０６のＬｏｇ ＥＤ_５０値はそれぞれ０．０７ ± １．２及び０．５ ± ０．２（ＰＢ−１０６ ｖｓ． ＰＢ−１０５，Ｐ ＞ ０．０５）であることを分かった。実験結果に示すように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ２００００）修飾された後のＰＢ−１０５複合物ＰＢ−１０６とＰＢ−１０５は、血糖降下効果（Ｅ_ｍａｘ及びＥＤ_５０を含む）において顕著な差異がない。
【０１７１】
実施例１９ ＰＢ−１０５、ＰＢ−１１１及びポリエチレングリコール化複合物ＰＢ−１０６及びＰＢ−１１２の、正常のマウスに対する血糖降下の時間と効果の試験
雄昆明マウス（体重２４−３０ ｇ）を用いて、実験前にマウスを非絶食絶水し、ランダムに４群に分けて、一群当たりに６匹にした。ＰＢ−１０５（１０ μｇ／ｋｇ），ＰＢ−１０５ポリエチレングリコール化（ＰＥＧ２００００）複合物ＰＢ−１０６（１０ μｇ／ｋｇ）、ＰＢ−１１１（１０ μｇ／ｋｇ）及びＰＢ−１１１ポリエチレングリコール化（ＰＥＧ２００００）複合物ＰＢ−１１２（１０ μｇ／ｋｇ）をそれぞれ皮下単回注射した。その中、ＰＢ−１１１は、Ｃ末端３９位でシステイン連結チロシンのＰＢ−１０５誘導体。注射後の０、０．５、１、２、４、８、１２、２４、４８時間目に尾尖採血し、米国ジョンソン・エンド・ ジョンソン社の「ＯｎｅＴｏｕｃｈ Ｕｌｔｒａ」型グルコメーター及び付きの試験紙で血糖を測定する。縦軸が異なる時点の血糖値、横軸が時間で血糖降下作用の時間と効果の曲線を作成して、ＰＢ−１０５及びＰＢ−１１１及びそのポリエチレングリコール複合物血糖降下作用の生物半減期及び最大血糖降下作用を算出した。その結果、図３５に示すように、ＰＢ−１０５、ＰＢ−１０６、ＰＢ−１１１及びＰＢ−１１２はいずれも時間依存的にマウスのランダムに測る血糖を低下させている。ＰＢ−１０５及びＰＢ−１１１の生物半減期はそれぞれ４．６ ｈｒｓ及び６．０ ｈｒｓで、最大血糖降下作用はそれぞれ４４．７％及び３６．４％であった。ＰＢ−１０６及びＰＢ−１１２の生物半減期はそれぞれ１９．６ ｈｒｓ及び２１．７ ｈｒｓで、最大血糖降下作用はそれぞれ３７．３％及び３４．９％であった。結果に示したように、Ｃ末端３９位にチロシンが付加されてもＰＢ−１０５及びそのポリエチレングリコール化複合物ＰＢ−１０６の血糖降下活性及び生物半減期に影響しない。
【０１７２】
実施例２０ ＰＢ−１０１及その変異体ＰＢ−１０５、ＰＢ−１１１及びＰＢ−１１３及びポリエチレングリコール化複合物ＰＢ−１０６、ＰＢ−１１２及びＰＢ−１１４の、ＳＴＺ糖尿病マウスに対する血糖降下時間と効果の試験
糖尿病モデルを作成する前にマウスを１４時間絶食して、尾尖採血にて空腹時の血糖値を測定し、その直後に新たに調製されたＳＴＺ（ストレプトゾトシン） （１２０ ｍｇ／１０ ｍｌ／ｋｇ、新規調製、ｐＨ ４．５の０．１Ｍのクエン酸緩衝液溶解） を皮下単回性注射し、３日後に血糖を測定して、マウスのランダムに測る血糖は１６．７ ｍｍｏｌ／Ｌより高いであれば糖尿病モデルマウスにする。実験前にマウスを非絶食絶水し、７群にわけて、一群当たり４ − ６匹にする。尾静脈採血して０ ｈの血糖を検査し、そして等体積のＰＢ−１０１（１０ μｇ／１０ｍｌ／ｋｇ）、ＰＢ−１０５（１０ μｇ／ｋｇ）、ＰＢ−１０６（１０ μｇ／ｋｇ）、ＰＢ−１１１（１０ μｇ／ｋｇ）、ＰＢ−１１２（１０ μｇ／ｋｇ）、ＰＢ−１１３（１０ μｇ／ｋｇ）及びＰＢ−１１４（１０ μｇ／ｋｇ）をそれぞれ皮下単回注射した。その中、ＰＢ−１１１はＣ末端３９位でシステイン連結チロシンのＰＢ−１０５誘導体であり、ＰＢ−１１３はＮ末端第２位でグリシンがＤ型アラニンで置換されたＰＢ−１０５誘導体であり、ＰＢ−１１４はＰＢ−１１３ポリエチレングリコール化（ＰＥＧ４００００）複合物である。注射後に、０．５、１、２、４、８、１２、２４、４８ ｈｒｓで採血し、血糖を測定した。ことなる時間点の血糖値を縦軸にし、時間を横軸にして、ＰＢ−１０１、ＰＢ−１０５、ＰＢ−１０６、ＰＢ−１１１、ＰＢ−１１２、ＰＢ−１１３及びＰＢ−１１４の血糖降下作用の時間と効果の曲線を作成して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ Ｄｅｍｏソフト（Ｐｒｉｓｍ ｖ５， Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）でプロットし、数理統計学の方法でＰＢ−１０１、ＰＢ−１０５、ＰＢ−１０６、ＰＢ−１１１、ＰＢ−１１２、ＰＢ−１１３及びＰＢ−１１４の生物半減期ｔ_１／２を分析して、その差を比較した。
【０１７３】
図３６に示すように、ＰＢ−１０１、ＰＢ−１０５、ＰＢ−１０６、ＰＢ−１１１、ＰＢ−１１２、ＰＢ−１１３及びＰＢ−１１４の単回注射は、いずれもＳＴＺ誘発糖尿病マウスに対して時間依存的にランダム血糖を低下し、その最大血糖降下效率はそれぞれ４７．５％、５７．６％、６９．８％、５４．４％、５９．７％、４９．２％及び１７．９％（ＰＢ−１０１の３８％だけに相等）であった。 ＰＢ−１０１、ＰＢ−１０５、ＰＢ−１０６、ＰＢ−１１１、ＰＢ−１１２及びＰＢ−１１３の生物半減期はそれぞれ５．５、５．５、２１．８、５．０、２０．３及び５．９ ｈｒｓであって、ＰＢ−１１４の生物半減期は血糖降下作用が小さいため測算できなかった。実験結果から分かるように、Ｃ末端３９位でチロシンを付加若しくはＮ末端第２位にてＤ型アラニンでグリシンを置換しても、いずれもＰＢ−１０５の抗高血糖活性を低下しない；ポリエチレングリコール化（ＰＥＧ２００００）修飾はＰＢ−１０５及びその誘導体の活性を低下しないが、ポリエチレングリコール化（ＰＥＧ４００００）はＰＢ−１０５及びその誘導体の活性を顕著に低下させる。
【０１７４】
実施例２１ ＰＢ−１０５及びそのポリエチレングリコール化複合物ＰＢ−１０６、ＰＢ−１１９及びＰＢ−１２０の、等量血糖降下作用の、時間と効果の試験
雄昆明マウス（体重２４−３０ ｇ）を用いて、実験前にマウスを非絶食絶水にして、ランダムに４群に分け、一群当たり６匹にする。ＰＢ−１０５（１０ μｇ／ｋｇ）、ＰＢ−１０５ポリエチレングリコール化（ＰＥＧ２００００）複合物ＰＢ−１０６（１０ μｇ／ｋｇ）、ＰＢ−１０５ポリエチレングリコール化（ＰＥＧ２３０００）複合物ＰＢ−１１９（１０ μｇ／ｋｇ）及びＰＢ−１０５ポリエチレングリコール化（ＰＥＧ２７０００）複合物ＰＢ−１２０（１０ μｇ／ｋｇ）を、それぞれ皮下単回注射した。注射後の０、０．５、１、２、４、８、１２、２４、３６、４８時間目に尾尖採血し、米国ジョンソン・エンド・ ジョンソン社の「ＯｎｅＴｏｕｃｈ Ｕｌｔｒａ」型グルコメーター及び付きの試験紙で血糖を測定する。縦軸が異なる時点の血糖値、横軸が時間で血糖降下作用の時間と効果の曲線を作成して、ＰＢ−１０５及びそのポリエチレングリコール化複合物血糖降下作用の生物半減期及び最大血糖降下作用を算出した。その結果、図３７に示したように、ＰＢ−１０５、ＰＢ−１０６、ＰＢ−１１９及びＰＢ−１２０は、いずれも時間依存的にマウスのランダム血糖を低下させて、その生物半減期はそれぞれ６．０、２１．７、２４．１及び２６．１ ｈｒｓで、且つＰＥＧ分子量の増加に伴って増加する。その血糖降下作用のピーク値の時間はそれぞれ約１時間（ＰＢ−１０５）及び４時間（ＰＢ−１０６，ＰＢ−１１９及びＰＢ−１２０）で、血糖降下作用のピーク値はそれぞれ３５．０％、５０．９％、４８．２％及び４２．２％（図３７Ａ）であった。血糖降下−時間面積計算において、ＰＢ−１０６、ＰＢ−１１９及びＰＢ−１２０はいずれもＰＢ−１０５血糖降下作用（３−４倍増加）を顕著に増加させており、その累積作用は、ＰＥＧ分子量の増加に伴って増加している（図３７Ｂ）。実験結果から分かるように、分子量が２０−２７ ｋＤａの間に、ポリエチレングリコール修飾は、ＰＢ−１０５の血糖降下活性を低下させず、血糖降下の作用時間を顕著に延長させ、且つ累積血糖降下作用を増加させる。これからわかるように、ＰＥＧ分子量が２０−２７ ｋＤａの間にある場合、本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物ＰＢ−１０６、ＰＢ−１１９及びＰＢ−１２０の血糖降下作用ピーク値は、複合していないＰＢ−１０５にも超えており、且つこれらの複合物は顕著なより長い血糖降下作用時間を有し、これらの累積血糖降下作用がＰＥＧ分子量の増加に伴って増加して、より優れた総合血糖降下作用を提供できる。
【０１７５】
実施例２２ ＰＢ−１０１、ＰＢ−１０５、ＰＢ−１０６及びＰＢ−１２０によるハト嘔吐試験
健康な家鳩を雌雄に拘らずに７群に分けて、一群当たりに４−８匹にした。ＰＢ−１０１ （３ ｍｇ／ｋｇ、Ｎ ＝ ４若しくは６ ｍｇ／ｋｇ， Ｎ ＝ ８）、ＰＢ−１０５（３ ｍｇ／ｋｇ、Ｎ ＝ ４若しくは６ ｍｇ／ｋｇ， Ｎ ＝ ８）、ＰＢ−１０６（３ ｍｇ／ｋｇ、Ｎ ＝ ４若しくは６ ｍｇ／ｋｇ、Ｎ ＝ ８）及びＰＢ−１２０（６ ｍｇ／ｋｇ、Ｎ ＝ ８）をそれぞれ皮下単回注射して、電子監視システムで、投与後２４時間内の嘔吐回数及び嘔吐発生の潜伏期間（投与後から第一回の嘔吐が発生するまでの時間） を観測して記録した。嘔吐回数は、くび伸びから口開く、肩落し、腹部収束を経って平静に戻す若しくは嘔吐動作が停止するまでが一回であると定義した。以前の経験から分かるように、ハトは薬物を投与していない等の正常の情况下では嘔吐反応発生すず、ＰＢ−１０１ （３及び６ ｍｇ／ｋｇ）及びＰＢ−１０５（３及び６ ｍｇ／ｋｇ）を投与した場合に、ハトはいずれも投与量に依存的に明らかに嘔吐反応する。ＰＢ−１０１、ＰＢ−１０５の相応投与量群と比べて、ＰＢ−１０６（３ ｍｇ／ｋｇ及び６ ｍｇ／ｋｇ）及びＰＢ−１２０（６ ｍｇ／ｋｇ）群の家鳩の嘔吐潜伏期間は明らかに延長（約５ − １８倍延長、図３８Ａを参照）され、嘔吐回数は明らかに低下（約５０−７０％低下、図３８Ｂを参照）しており、その中、６ ｍｇ／ｋｇ投与量の場合、統計学的に有意差（ｐ ＜ ０．０５）を有する。結果に示されたように、ポリエチレングリコール化修飾はＥｘｅｎｄｉｎ及その変異体による嘔吐反応を明らかに低下させた。
【０１７６】
実施例２３ ＰＢ−１０１、ＰＢ−１０５及びＰＢ−１０６の、テンジクネズミ全身免疫アレルギー反応及び体重に対する影響
体重が３００ ｇ程度である健康な雄テンジクネズミ４４匹を、生理食塩水群（Ｎ ＝ １０）、ＰＢ−１０１（Ｎ ＝ １０）、ＰＢ−１０５ （Ｎ ＝ １０）、ＰＢ−１０６ （Ｎ ＝ １０）及びアルブミン投与群（Ｎ ＝ ４）の５群に分けた。生理食塩水 （１ ｍｌ／ｋｇ）、ＰＢ−１０１ （１００ μｇ／ｋｇ）、ＰＢ−１０５ （１００ μｇ／ｋｇ）、ＰＢ−１０６ （１００ μｇ／ｋｇ）及びニワトリオボアルブミン （８０ ｍｇ／ｋｇ）を、それぞれ一日の間隔で連続に３回皮下注射し、最後一回の皮下注射から１４日後に、誘発投与量の生理食塩水（１ ｍｌ／ｋｇ）、ＰＢ−１０１（３００ μｇ／ｋｇ）、ＰＢ−１０５ （３００ μｇ／ｋｇ）、ＰＢ−１０６ （３００ μｇ／ｋｇ）及びアルブミン（２４０ ｍｇ／ｋｇ） をそれぞれ背側の指で静脈注射した。注射後のすぐ動物反応を観測し、観測時間が誘発後０ − ３時間、表２の基準で動物アナフィラキシー反応症状を記録して、そして表３の基準で動物アナフィラキシー反応程度（半定量）を記録した。
【０１７７】
【表３】

【０１７８】
【表４】

【０１７９】
時間を横軸、アレルギー反応程度（半定量）を縦軸にした図３９に示すように、生理食塩水対照群テンジクネズミはすべていずれのアレルギー反応も発生しておらず、アレルギー反応陰性を示す；アルブミン群テンジクネズミはいずれも誘発後にすぐ（＜ ２ ｍｉｎ）死亡し、アレルギー反応が極めて陽性を示す； ＰＢ−１０１群及びＰＢ−１０５テンジクネズミはアレルギー反応が引き起こされ、陽性反応を示す。ＰＢ−１０１及びＰＢ−１０５は３９アミノ酸残基のポリペプチドであって、長期投与後に生体内に抗体が発生する （Ｂｕｓｅ ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｘｅｎａｔｉｄｅ （ｅｘｅｎｄｉｎ−４） ｏｎ ｇｌｙｃｅｍｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｖｅｒ ３０ ｗｅｅｋｓ ｉｎ ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ−ｔｒｅａｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ． ２００４；２７：２６２８−２６３５．）。ＰＢ−１０５ポリエチレングリコール化（ＰＥＧ２００００）複合物ＰＢ−１０６はテンジクネズミに対して弱い陰性アレルギー反応を引き起こす。結果から分かるように、ポリエチレングリコール化（ＰＢ−１０６）は、ＰＢ−１０１若しくはＰＢ−１０５免疫原性を顕著に低下させ、アレルギー反応の発生を減少できる。
【０１８０】
時間を横軸、テンジクネズミの体重を縦軸にした図（図４０）に示すように、感作期間において生理食塩水群テンジクネズミの体重は連続して増加する（実験過程１８日内に体重が約３８％増加した）。生理食塩水群と比べて、２回連続にアルブミン を投与した４日後に体重は減少しない；しかし２回連続にＰＢ−１０１ （１００ μｇ／ｋｇ）若しくはＰＢ−１０５ （１００ μｇ／ｋｇ） を投与した４日間後に、テンジクネズミ体重はそれぞれ約８％及び１１％（ｐ ＜ ０．０５）が減少される。同等投与量のＰＢ−１０６を投与した後、そのテンジクネズミ体重減少作用はＰＢ−１０１若しくはＰＢ−１０５より強い； ＰＢ−１０１及びＰＢ−１０５と比べて、ＰＢ−１０６の投与はそれぞれさらに約８％及び１１％（ｐ ＜ ０．０５）が減少される。投与停止１２日間後に、ＰＢ−１０１、ＰＢ−１０５及びＰＢ−１０６群テンジクネズミの体重は回復して、生理食塩水群と相当になる。
【０１８１】
実施例２４ ＰＢ−１０５、ＰＢ−１０６、ＰＢ−１１９及びＰＢ−１２０の、ラット体重及び摂食量に対する影響
体重が２００ ｇ程度の健康な雄ＳＤラット２４匹を、一匹ずつ２００ｇ程度、生理食塩水群（１ ｍｌ／ｋｇ， Ｎ ＝ ４）、ＰＢ−１０５（１００ μｇ／ｋｇ， Ｎ ＝ ５）、ＰＢ−１０６ （１００ μｇ／ｋｇ， Ｎ ＝ ５）、ＰＢ−１１９ （１００ μｇ／ｋｇ， Ｎ ＝ ５）及びＰＢ−１２０ （１００ μｇ／ｋｇ， Ｎ ＝ ５）の ５群に分けた。生理食塩水及び薬物を、それぞれ一日の間隔で、連続に３回皮下注射して、ラット体重及摂食量の変化を毎日観測した。
【０１８２】
時間を横軸、ラット体重を縦軸にした図（図４１Ａ）に示すように、投与期間において、生理食塩水群ラットの体重が増加し続き（実験過程９日内に体重が３３．４％増加）、生理食塩水群と比べて、ＰＢ−１０５ （１００ μｇ／ｋｇ） を連続に３回投与してから９日間後に、体重−時間ＡＵＣを指標とし、ラット体重は約５．３％（ｐ ＜ ０．０５）減少した；但し、同等投与量のＰＢ−１０６、ＰＢ−１１９及びＰＢ−１２０を投与した後、ラット体重減少作用がＰＢ−１０５よりも強い； ＰＢ−１０５投与と比べて、体重−時間ＡＵＣを指標とし、ＰＢ−１０６、ＰＢ−１１９及びＰＢ−１２０の投与は、それぞれさらに約７％、８％及び８％（ｐ ＜ ０．０５）減少させる。
【０１８３】
時間を横軸、ラット摂食量を縦軸にした図４１Ｂに示すように、投与期間において生理食塩水群ラットの摂食量はほぼ変化しない。生理食塩水群と比べて、摂食量−時間ＡＵＣを指標とし、ＰＢ−１０５ （１００ μｇ／ｋｇ）を連続に３回投与した後、摂食量は約１６％減少する；但し、同等投与量のＰＢ−１０６、ＰＢ−１１９及びＰＢ−１２０を投与した後、ラット摂食量を減少させる作用はＰＢ−１０５より強い； ＰＢ−１０５の投与と比べて、ＰＢ−１０６、ＰＢ−１１９及びＰＢ−１２０の投与はそれぞれさらに１８％、１９％及び１９％（ｐ ＜ ０．０５）減少させる。
【０１８４】
周知のように、Ｅｘｅｎｄｉｎは、肥満患者の体重を低減できるが、吐き気・嘔吐反応を引き起こすものであり、その作用メカニズムは中枢神経系において、摂食中枢を抑制することや嘔吐中枢を刺激することに関与している（Ｌａｒｓｅｎ． Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｂｅｈｉｎｄ ＧＬＰ−１ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｅｉｇｈｔ ｌｏｓｓ． Ｂｒ Ｊ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｖａｓｃ Ｄｉｓ ２００８； ８（Ｓｕｐｐｌ ２）： Ｓ３４−Ｓ４１； Ｓｃｈｉｃｋ ｅｔ ａｌ． Ｇｌｕｃａｇｏｎｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ １ （７−３６）−ａｍｉｄｅ ａｃｔｓ ａｔ ｌａｔｅｒａｌ ａｎｄ ｍｅｄｉａｌ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ｓｉｔｅｓ ｔｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｆｅｅｄｉｎｇ ｉｎ ｒａｔｓ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００３； ２８４：Ｒ１４２７−３５）。但し、Ｅｘｅｎｄｉｎ若しくはその変異体の複合物は、分子量が増加しており、血液脳関門を透過し難いので、 ＰＢ−１０１による嘔吐反応を低減できる（実施例２２を参照）。従って、本研究を開始する前に、発明者は、Ｅｘｅｎｄｉｎ若しくはその変異体の複合物においても、Ｅｘｅｎｄｉｎの中枢神経系を介して摂食量及び体重を減少する作用が低減されると予測していた。しかしながら、野生型Ｅｘｅｎｄｉｎ及び複合していないＥｘｅｎｄｉｎ変異体も体重及び摂食量を減少させるが、本発明において、Ｅｘｅｎｄｉｎ若しくはその変異体のＰＥＧ複合物は、顕著な強力な体重及び摂食量を減少する作用を有すことを、意外に見出した。
【０１８５】
実施例２５ ＰＢ−１０１及ＰＢ−１０５薬物動態学試験
雄ＳＤラット（体重２５０−３００ ｇ、中国科学院上海実験動物中心より購入）に３０ ％抱水クロラール （３００ ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を投与して麻醉して、右上縁の鼠径部に切口を開けて、大腿静脈を分離して、大腿静脈カテーテル法（ポリエチレンＰＥ５０チューブ、米国Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ公司）を実施し、右大腿動脈カニューレは血液採取に用いられ、右大腿静脈カニューレは投与に用いられ、ＰＥ−５０チューブは背部皮下を経ってくびの背部から引出され、チューブ内にヘパリン液（２００ Ｕ／ｍｌ）を充填して、切口を縫って、手術後のラットを単独の箱に飼いて、１２ ｈ以上回復させた。カニューレングされたラットの飼育箱内の活動自由、飲食自由の状態を保持して、ＰＢ−１０１群及びＰＢ−１０５群（一群当たり３−６匹）に分けて、右大腿静脈により５ μｇ／ｋｇ注入投与して、それぞれ投与後の０．０８、０．２５、０．５、１、１．５、２、２．５、３、４、５及び６時間目にＰＥ５０チューブにより採血する。血液サンプルを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにて遠心して（５０００ ｒｐｍ、５ ｍｉｎ）血漿を調製し、−２０ ℃に準備しておく。各群の血漿試料を調製済み後に、Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ ＥＩＡ Ｋｉｔ （Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ＵＳＡ）を用いて試料中の薬物濃度を測定した。結果は、血薬濃度値を縦軸、時間を横軸にして、ＰＢ−１０１及びＰＢ−１０５薬物−時間曲線（図４２）を作成した。結果から分るように、ＰＢ−１０５とＰＢ−１０１は、ラット生体内に類似した分布とクリアランす規律を示す。
【０１８６】
Ｋｉｎｅｔｉｃａ ５．０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．， ＵＳＡ）ソフトを用いて、非区分法（Ｎｏｎ−ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ ｍｅｔｈｏｄ）にて分析し、ＰＢ−１０１及びＰＢ−１０５の薬物動態学パラメタ（Ｃ_ｍａｘ， ＡＵＣ_０−ｔ， ＡＵＣ_０−８， ｔ_１／２， ＭＲＴ， ＣＬ及びＶ_ｓｓ等）を算出した。結果は表４に示す。その中、ＰＢ−１０１及びＰＢ−１０５の血漿半減期はそれぞれ４．８ ± ０．７及び４．９ ± １．４ ｈｒｓ （ＰＢ−１０５ ｖｓ． ＰＢ−１０１， Ｐ ＞ ０．０５）であり；薬物−時間曲線下面積はそれぞれ４５．４ ± １．６及び４７．９ ± １９．０ ｎｇ＊ｈｒ／ｍｌ （ＰＢ−１０５ ｖｓ． ＰＢ−１０１， Ｐ ＞ ０．０５）であった。実験結果に示すように、ＰＢ−１０５及びＰＢ−１０１は類似した薬物動態学特性を有している。
【０１８７】
【表５】

【０１８８】
実施例２６ ＰＢ−１０５及びそのポリエチレングリコール化複合物の薬物動態学試験
雄ＳＤラット（体重２５０−３００ ｇ、中国科学院上海実験動物中心より購入）に、３０ ％抱水クロラール （３００ ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を投与して麻醉し、右上縁の鼠径部切口を開けて、大腿静脈を分離して、大腿静脈カテーテル法（ポリエチレンＰＥ５０チューブ、米国Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ公司）を実施し、右大腿動脈カニューレは血液採取に用いられ、右大腿静脈カニューレは投与に用いられ、ＰＥ−５０チューブは背部皮下を経ってくびの背部から引出され、チューブ内にヘパリン液（２００ Ｕ／ｍｌ）を充填して、切口を縫って、手術後のラットを単独の箱に飼いて、１２ ｈ以上回復させた。カニューレングされたラットの飼育箱内の活動自由、飲食自由の状態を保持した。ＰＢ−１０５、ＰＢ−１１０、ＰＢ−１０６、ＰＢ−１０７、ＰＢ−１０８及びＰＢ−１０９の６群（一群当たり３匹）に分けた。右大腿静脈により５ μｇ／ｋｇ注入投与し、異なる時点で０．２ ｍｌの血を採血し、投与後の４８時間前に、ＰＥ５０チューブにより採血し、４８時間後に尾静脈にて採血する。具体的には、ＰＢ−１０５群（投与後０．０８、０．２５、０．５、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６時間）、ＰＢ−１１０群（投与後０．０８、０．２５、０．５、１、２、３、４、５、６、８、１０時間）、ＰＢ−１０６群（投与後０．０８、０．２５、０．５、１、２、４、８、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６時間）、ＰＢ−１０７群（投与後０．０８、０．２５、０．５、１、２、４、８、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６、１０８、１２０、１３２、１４４時間）、ＰＢ−１０８及びＰＢ−１０９群（投与後０．０８、０．２５、０．５、１、２、４、８、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６、１０８、１２０、１３２、１４４、１５６、１６８時間）である。血液サンプルを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにて遠心して（５０００ ｒｐｍ、５ ｍｉｎ）血漿を調製し、−２０ ℃に準備しておく。各群の血漿試料を調製済み後に、Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ ＥＩＡ Ｋｉｔ （Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ＵＳＡ）を用いて試料中の薬物濃度を測定した。結果は、血薬濃度値を縦軸、時間を横軸にして、ポリエチレングリコール化複合物薬物−時間曲線を作成した。結果から分るように、ＰＢ−１０５及びそのポリエチレングリコール化複合物は快速の分布と緩いクリアランスを示す（図４３を参照）。
【０１８９】
Ｋｉｎｅｔｉｃａ ５．０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．， ＵＳＡ）ソフトを用いて、非区分法（Ｎｏｎ−ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ ｍｅｔｈｏｄ）パラメタにて分析し、ＰＢ−１０５及びそのポリエチレングリコール化複合物の薬物動態学パラメタ（Ｃ_ｍａｘ、ＡＵＣ_０−ｔ、ＡＵＣ_０−８、ｔ_１／２、ＭＲＴ、ＣＬ及びＶ_ｓｓ等）を算出した。結果を表５に示す。その中、ＰＢ−１０５の血漿半減期は２．９±０．１ ｈｒｓで、そのポリエチレングリコール化複合物の血漿半減期はポリエチレングリコール分子量の増加に伴って延長する；ＰＢ−１０５薬物−時間曲線下面積は１８．２±１．９ ｎｇ＊ｈｒ／ｍｌで、そのポリエチレングリコール化複合物の薬物−時間曲線下面積はポリエチレングリコール分子量の増加に伴って増加する。図４４Ａ及び図４４Ｂはそれぞれポリエチレングリコール化複合物におけるポリエチレングリコール分子量と、血漿半減期及び薬物−時間曲線下面積との関係を示している。
【０１９０】
【表６】

【０１９１】
本発明のＥｘｅｎｄｉｎ変異体は、薬物動態学性質を改善し、血糖を顕著に低下でき、Ｅｘｅｎｄｉｎと相同若しくはより優れた生物学活性を有する。システインチオール基によって重合体と部位特異的にカップリングしたＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物は、Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体の半減期を顕著に延長して、高い生物活性を保持できる。
【０１９２】
本発明は各具体的な実施例によって例を挙げて説明した。しかし、本分野の普通の技術者が理解しているように、本発明は、各具体的な実施方式に限定されるものではなく、普通の技術者は、本発明の趣旨及び範囲から抜けない限り、本発明の範囲内に様々な変更若しくは変形を行うことが可能である。このような変更及び変形は、すべて本発明の範囲内に該当する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型Ｅｘｅｎｄｉｎ配列と比べて、１若しくは数個のアミノ酸残基がシステインに置換されたアミノ酸配列を有し、前記野生型Ｅｘｅｎｄｉｎ配列が好ましくは、
Ｅｘｅｎｄｉｎ−４配列
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ− Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）、
Ｅｘｅｎｄｉｎ−３配列
Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ− Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）及びその誘導配列から選ばれたものである、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性を有すＥｘｅｎｄｉｎ変異体である。
【請求項２】
少なくとも前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体のＣ末端でシステインに置換されている、請求項１のＥｘｅｎｄｉｎ変異体。
【請求項３】
少なくとも、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １若しくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２における第２０番目Ａｒｇ（アルギニン）、２５番目Ｔｒｐ（トリプトファン）、３５番目Ａｌａ（アラニン）、３９番目Ｓｅｒ（セリン）と対応する位置から選ばれる１若しくは数個の位置でシステインに置換されている、請求項１のＥｘｅｎｄｉｎ変異体。
【請求項４】
さらに、１若しくは数個の更なるアミノ酸の欠失、挿入及び／または置換を含む、請求項１〜３のいずれか一項のＥｘｅｎｄｉｎ変異体。
【請求項５】
下記から選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項１のＥｘｅｎｄｉｎ変異体、
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ− Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ− Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）；
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ− Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）；
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ− Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）；
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ− Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）；または
Ｈｉｓ−ｄＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ− Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）。
【請求項６】
１若しくは数個の重合体基が請求項１〜５のいずれか一項のＥｘｅｎｄｉｎ変異体に複合し、好ましくは、前記１若しくは数個の重合体基が前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体のシステイン残基上に複合し，より好ましくは、チオエーテル結合により前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体のシステイン残基上に複合する、Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体複合物。
【請求項７】
前記１若しくは数個の重合体基は、それぞれ独立に、多糖、ポリアルキレングリコール及びその誘導体から選ばれるものであって、例えば、ポリプロピレングリコール及びポリエチレングリコールであり、好ましくはポリエチレングリコールである、請求項６の複合物。
【請求項８】
前記１若しくは数個の重合体基の分子量が、２ ｋＤａ〜５０ ｋＤａ、好ましくは３ ｋＤａ〜４０ ｋＤａ、より好ましくは４ ｋＤａ〜３５ ｋＤａ、さらに好ましくは５ ｋＤａ〜３０ ｋＤａであって、例えば５ ｋＤａ、１０ ｋＤａ、１５ ｋＤａ、２０ ｋＤａ、３０ ｋＤａ及び４０ ｋＤａ、並びに上述した各分子量値の間の任意の値である、請求項６或いは７の複合物。
【請求項９】
前記１若しくは数個の重合体基の分子量が、２０ ｋＤａ〜３０ ｋＤａ、好ましくは２１ ｋＤａ〜２９ ｋＤａ、より好ましくは２３ ｋＤａ〜２７ ｋＤａであって、例えば２０ ｋＤａ、２１ ｋＤａ、２２ ｋＤａ、２３ ｋＤａ、２４ ｋＤａ、２５ ｋＤａ、２６ ｋＤａ、２７ ｋＤａ、２８ ｋＤａ、２９ ｋＤａ、３０ ｋＤａ、及び上述した各分子量値の間の任意の値である、請求項６〜８のいずれか一項の複合物。
【請求項１０】
下記式（Ｉ）の構造を有する、請求項６〜９のいずれか一項の複合物、
【化１】

その中、Ｅｘｅｎｄｉｎは請求項１〜５のいずれか一項に定義されたＥｘｅｎｄｉｎ変異体を表し、 ＹはＨ若しくはＲＰＥＧ−Ｘ−を表し、且つ各Ｘ及びＺがそれぞれ独立に結合基であり、ＰＥＧは−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ−を表し、その中ｎが正の整数、ＲがＰＥＧの末端基を表し、好ましくは各Ｒがそれぞれ独立に、水素、アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルキル基アルキル基、アルキレン基、アリール基若しくはアリールアルキル基から選ばれる。
【請求項１１】
各“ＲＰＥＧ−”が、それぞれ独立に下記から選ばれる構造を有する、請求項１０の複合物；
【化２】

その中、 ｋ は０、１、２、３、４、５及び６のいずれかの整数であり、各ｎはそれぞれ独立に４０〜１２００から選ばれる整数、例えば、４６、４７、４８等である。
【請求項１２】
各“ＲＰＥＧ−”は、それぞれ独立に下記から選ばれる構造を有する、請求項１０の複合物；
【化３】

その中、ｋは０、１、２及び３の任意の整数であり、各ｎはそれぞれ独立に４０〜１２００から選ばれる整数、例えば、４６、４７、４８等である。
【請求項１３】
各結合基“−Ｘ−”は、それぞれ独立に下記から選ばれる構造を有する、請求項１０の複合物；
【化４】

その中、各ｐ及びｍは、それぞれ独立に、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２中の任意の整数である。
【請求項１４】
各結合基“−Ｘ−”は、それぞれ独立に下記から選ばれる構造を有する、請求項１３の複合物；
【化５】

その中、各ｐは、それぞれ独立に、０、１、２、３、４若しくは５の任意の整数；各ｍはそれぞれ独立に、０、１、２、３若しくは４の整数。
【請求項１５】
前記の“−Ｚ−Ｅｘｅｎｄｉｎ”が、下記の構造を有する、請求項１０の複合物；
【化６】

その中、各ｉは、それぞれ独立に、０若しくは１の整数であり、各ｊは、それぞれ独立に、１、２、３、４、５若しくは６の整数であり、各ｑは、それぞれ独立に、１、２、３、４、５若しくは６の整数であり、各ｗは、それぞれ独立に、１、２、３、４、５若しくは６の整数である。
【請求項１６】
前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体が、下記から選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項１０の複合物；
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）、若しくは
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）。
【請求項１７】
請求項６〜１６のいずれか一項に記載の複合物の調製方法であって、請求項１〜５のいずれか一項記載のＥｘｅｎｄｉｎ変異体と、前記重合体とを接触させることを含み、好ましくは、その前記重合体は活性化基を持ち、若しくは接触させる際に活性化される、調製方法。
【請求項１８】
前記重合体が、ポリエチレングリコールであって、好ましくはその分子量の範囲が２ ｋＤａ〜５０ ｋＤａ、より好ましくは３ ｋＤａ〜４０ ｋＤａ、さらに好ましくは５ ｋＤａ〜３０ ｋＤａ、さらに好ましくは２０ ｋＤａ〜３０ ｋＤａ、さらに好ましくは２３ ｋＤａ〜２７ ｋＤａである、請求項１７の方法。
【請求項１９】
ｐＨ値が５．０〜７．０、ポリエチレングリコールとペプチドとのモル比の値が１〜１０、反応時間が０．５〜１２時間、反応温度が０〜５０℃、好ましくは２〜４０℃、より好ましくは４〜３７℃、の条件下で接触させる、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記ポリエチレングリコールは、該Ｅｘｅｎｄｉｎ−４変異体のアミノ酸配列におけるシステイン残基上に複合し、好ましくは前記ポリエチレングリコールはチオエーテル結合で前記システイン残基上に複合する、請求項１８の方法。
【請求項２１】
前記ポリエチレングリコールは、マレインイミドによって活性化される、請求項１８の方法。
【請求項２２】
有効量の、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＥｘｅｎｄｉｎ変異体及び／または請求項６〜１６のいずれか一項に記載の複合物、及び任意に選択した薬学的に許容されるキャリアを含む、薬物組成物。
【請求項２３】
血糖の低下、好ましくは糖尿病の治療、より好ましくはＩ型糖尿病及び／またはＩＩ型糖尿病の治療、特に好ましくはＩＩ型糖尿病の治療に用いる、請求項２２の薬物組成物。
【請求項２４】
前記薬学的に許容されるキャリアが緩衝系を含み、好ましくは前記緩衝系がｐＨ約３．０〜約６．０の酢酸塩の緩衝溶液、若しくはｐＨ約５．０〜約９．０のリン酸塩の緩衝溶液である、請求項２２の薬物組成物。
【請求項２５】
０．０２ ｍｇ／ｍｌ〜５０ ｍｇ／ｍｌ のＥｘｅｎｄｉｎ変異体、及び／または０．４ ｍｇ／ｍｌ〜４００ ｍｇ／ｍｌのＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物を含み、好ましくは０．２０ ｍｇ／ｍｌ〜５ ｍｇ／ｍｌのＥｘｅｎｄｉｎ変異体及び／または４ｍｇ／ｍｌ〜４０ ｍｇ／ｍｌのＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物を含み、より好ましくは０．５ ｍｇ／ｍｌ〜２ ｍｇ／ｍｌのＥｘｅｎｄｉｎ変異体及び／または１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ ｍｇ／ｍｌのＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物を含む、請求項２２の薬物組成物。
【請求項２６】
前記薬学的に許容されるキャリアは、等浸透圧調整剤及び／または防腐剤を含み、好ましくは前記等浸透圧調整剤が蔗糖、マンニトール、塩化ナトリウム及びグリセロールの一種若しくは複数種であり、好ましくは前記防腐剤が、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、ｐ− ヒドロキシ安息香酸メチル 、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル及びｐ−ヒドロキシ安息香酸ブチルから選ばれる一種若しくは複数種である、請求項２２の薬物組成物。
【請求項２７】
前記Ｅｘｅｎｄｉｎ変異体複合物は、親水性重合体と複合したＥｘｅｎｄｉｎ変異体複合物であり、好ましくは前記親水性重合体がポリエチレングリコール、より好ましくは前記ポリエチレングリコールの分子量が２ ｋＤａ〜５０ ｋＤａである、請求項２２の薬物組成物。
【請求項２８】
液体製剤の形態である、請求項２２〜２７のいずれか一項の薬物組成物。
【請求項２９】
凍結乾燥製剤の形態である、請求項２２〜２７のいずれか一項の薬物組成物。
【請求項３０】
前記凍結乾燥製剤は、凍結乾燥保護剤を含み、好ましくは前記凍結乾燥保護剤は、糖類、例えば蔗糖、ラクトース、マンニトール、トレハロース等から選ばれる一種若しくは複数種である、請求項２９の薬物組成物。
【請求項３１】
血糖低下用薬物の調製における、請求項１〜５のいずれか一項のＥｘｅｎｄｉｎ変異体若しくは請求項６〜１６のいずれか一項の複合物の用途。
【請求項３２】
前記薬物は、Ｉ型糖尿病及びＩＩ型糖尿病を含む糖尿病の治療、特にＩＩ型糖尿病の治療に用いられる、請求項３１の用途。
【請求項３３】
血糖を低下させる方法であって、このような需要がある対象に、請求項１〜５のいずれか一項のＥｘｅｎｄｉｎ変異体若しくは請求項６〜１６のいずれか一項の複合物を施する方法。
【請求項３４】
Ｉ型糖尿病及びＩＩ型糖尿病を含む糖尿病の治療、特にＩＩ型糖尿病の治療に用いられる、請求項３３の方法。
【請求項３５】
請求項１〜５のいずれか一項のＥｘｅｎｄｉｎ変異体及び／または請求項６〜１６のいずれか一項の複合物、及び取扱説明書を含む、試薬キット。
【請求項３６】
体重の減少方法であって、このような需要がある対象に、１若しくは数個の重合体基が複合したＥｘｅｎｄｉｎ若しくはその変異体を施することを含み、その中、前記１若しくは数個の重合体基が好ましくはポリエチレングリコール基である方法。
【請求項３７】
前記Ｅｘｅｎｄｉｎ若しくはその変異体の複合物は、請求項６〜１６のいずれか一項の複合物である、請求項３６の方法。
【請求項３８】
体重減少用薬物の調製における、１若しくは数個の重合体基が複合したＥｘｅｎｄｉｎ若しくはその変異体の用途であって、その中、前記１若しくは数個の重合体基が、好ましくはポリエチレングリコール基である用途。
【請求項３９】
前記Ｅｘｅｎｄｉｎ若しくはその変異体の複合物は、請求項６〜１６のいずれか一項の複合物である、請求項３８の用途。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３Ａ】

【図２３Ｂ】

【図２３Ｃ】

【図２４】

【図２５】

【図２６Ａ】

【図２６Ｂ】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２Ａ】

【図３２Ｂ】

【図３２Ｃ】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３】

【図４４Ａ】

【図４４Ｂ】

【公表番号】特表２０１２−５２４７３０（Ｐ２０１２−５２４７３０Ａ）
【公表日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０６３２７（Ｐ２０１２−５０６３２７）
【出願日】平成２２年４月２３日（２０１０．４．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２０１０／０７２０９４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２１５５９
【国際公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【出願人】（５１１２５５９９３）ペグバイオ　コーポレーション　リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＰＥＧＢＩＯ　ＣＯ．，　ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｓｕｉｔｅ　４１７，　Ｂｕｉｌｄｉｎｇ　Ａ３，　Ｂｉｏｂａｙ　２１８　Ｘｉｎｇｈｕ　Ｓｔｒｅｅｔ，Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｐａｒｋ，　Ｓｕｚｈｏｕ，Ｊｉａｎｇｓｕ　２１５１２３，　Ｐ．　Ｒ．　Ｃｈｉｎａ
【Ｆターム（参考）】