核酸の単離方法またはリン酸化タンパク質の単離方法における粒子およびその使用
少なくとも１つの遷移金属酸化物で形成されたコーティングを有する、ポリスチレン若しくはポリアクリレートを含んでなる単分散ポリマー微粒子、又は、少なくとも１つの遷移金属酸化物で形成されたコーティングを有する、ポリスチレン若しくはポリアクリレートを含んでなる多孔性ポリマー微粒子を開示する。リン酸化タンパク質を含んでなるサンプルからリン酸化タンパク質を単離するための方法、又は、核酸を含んでなるサンプルから核酸を単離するための方法における、このような粒子の使用も記載する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遷移金属酸化物、特にチタン及びジルコニウムの酸化物によってコーティングされた磁性ポリマー粒子、及びその製造方法に関する。本発明は更に、精製、抽出、捕捉、アッセイ又は合成用の特異的な緩衝液との組み合わせによる、上記コーティングされた磁性ポリマー粒子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
磁性粒子は、様々な医療分野、生化学分野及び環境分野において全般的な有用性を発揮し、例えば医薬製品の送達用、診断若しくは分析用、分析対象物の分離用、及び合成用の輸送担体として有用である。かかる粒子は、これらの機能を発揮するために、その磁性特性に依存する。例えば、アッセイにおいては、特に粒子に結合する分析物を含んでなるサンプルに対する磁場の印加により、遠心分離又は濾過を用いることのない、分析物の単離が可能となる。
【０００３】
本明細書において、磁性とは、上記ポリマー粒子が磁場によって吸引されることを意味する。典型的には、かかるポリマー粒子は強磁性結晶、超常磁性結晶又はそれらの混合物を含む。
【０００４】
磁性ポリマー粒子は公知で、例えば、その内容が参照により本明細書に組み入れられるＵＳ−Ａ−４，６５４，２６７（Ｕｇｅｌｓｔａｄ）（特許文献１）に記載の方法で調製できる。これらの方法により、同程度のサイズ（単分散）であり、且つ均一な磁性特性を有する磁性ポリマー粒子が提供される。
【０００５】
これらの粒子の表面は容易に官能化されて様々な基を担持することができ、それを用いて、サンプル中の分析物に親和性リガンドを結合させることができる。例えば、ストレプトアビジンを担持するために修飾されたビーズが公知である。しかしながら当業者は、ポリマー粒子を修飾して、非リガンドベースの、様々な迅速な吸着手順へそれらを応用できるようにするため、更なる方法を探究している。
【０００６】
それらの寿命を短くし潜在的にサンプルを汚染する、ポリマー粒子からの磁性結晶の浸出という公知の問題点を最小化するため、ＵＳ−Ａ−４，６５４，２６７（特許文献１）は、Ｆｅイオンをポリマー粒子に吸引するのに有用な表面官能基を有する、ポリマー粒子の使用を提案している。これらの官能基は、ポリマー粒子の調製において官能化コモノマーを使用することにより、又は、ポリマー粒子の重合後の、例えば粒子表面上の既存の基のカップリング又は変換処理による、官能基導入により得られる。
【０００７】
ＵＳ−Ａ−４，６５４，２６７（特許文献１）では、浸出の量を減少させる技術を開示しているが、それでもポリマー粒子からの超常磁性結晶の若干の浸出は生じる。更に、Ｆｅイオンを吸引する特定の表層官能基の使用により、ポリマー粒子に付与できる表層官能性の特性を著しく制限することとなる。これにより、（例えばリガンドによる）粒子の更なる官能化をより困難にする。すなわち、粒子の多用性は減り、ポリマー粒子が使用可能な用途の範囲は制限される。
【０００８】
発明者らは驚くべきことに、浸出の問題を見出し、並びに、少なくとも１つの遷移金属酸化物から形成されるコーティングを有する、任意に多孔性の、任意に磁性を有するポリマー微粒子により、代替的に官能化されたポリマー粒子が提供されることを見出した。遷移金属酸化物コーティングの存在が、浸出の潜在的課題を最小にするだけでなく、遷移金属酸化物コーティングの使用によって、ポリマー粒子が生物高分子に容易に結合できるようになり、それにより当該粒子はアッセイ手順において非常に貴重なものとなる。
【０００９】
金属酸化物コーティングを有する磁性粒子は、それ自体は新規でない。Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ ２００５、７７、５９１２−５９１９（非特許文献１）においては、酸化鉄（ＩＩＩ）／チタニアのコアシェル型のナノ粒子が記載されており、リンペプチド分析用の親和性プローブとしての用途が示唆されている。
【００１０】
また、核酸と結合する金属酸化物の使用も新規ではない。ＵＳ ６，３８３，３９３（特許文献２）は、クロマトグラフィによる、核酸混合物の精製方法及び単離方法を記載している。核酸混合物は、カラム上の金属酸化物基質に吸着される。ＵＳ ５，０５７，４２６（特許文献３）は同様の開示をしており、金属酸化物マトリックスを用いて核酸を結合させている。しかしながらこれらの開示は、クロマトグラフカラムに関するものであり、ポリマー粒子に関するものでは全くない。
【００１１】
ＵＳ ６，９１４，１３７（特許文献４）は、プレートを形成する際にプラスチック中に粉末として導入されたチタン酸化物を含んでなるポリスチレンマイクロタイタープレートを使用した、ＤＮＡの単離方法を記載している。
【００１２】
酸化チタンでコーティングされた粒子もまた公知である。Ｇｕｏら、Ｏｐｔｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２２（２００３），３９−４４（非特許文献２）では、濃厚なポリスチレン、酸化鉄（ＩＩＩ）のコアがチタニアでコーティングされている、コアシェル粒子を記載している。しかしながらこれらの粒子は、本発明の磁性多孔性粒子とは大幅に異なる。Ｇｕｏのポリスチレン／鉄のコアは高密度且つ非多孔性の材料であり、ゆえに、上記の浸出の課題は、Ｇｕｏが直面していたものでない。更に、生体分子の単離へのかかる粒子の使用に関する示唆は存在しない。Ｇｕｏらの粒子のＩＲスペクトル（その図３に記載）は、それらがごくわずかな鉄しか含有しないことを示している。また、その図７においては、その著者らが、磁石上における１５分間のインキュベーションの後に、粒子の約９０％を回収したことが示されている。
【００１３】
更に、その図２においては、当該粒子は広い粒度分布を有し、ゆえに単分散でないことが示されている。したがって、生物高分子の単離へのかかる粒子の使用は、当該標的の多くが、１５分間のインキュベーション時間の後でさえも磁石に吸引されない小さい粒子と結合して失われるため、好ましくない。また、その図１に示されるように、当該粒子は非常に凝集性が高いため、生物分子の単離にとり更に不適当となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】ＵＳ−Ａ−４，６５４，２６７
【特許文献２】ＵＳ ６，３８３，３９３
【特許文献３】ＵＳ ５，０５７，４２６
【特許文献４】ＵＳ ６，９１４，１３７
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ ２００５，７７，５９１２−５９１９
【非特許文献２】Ｇｕｏら、Ｏｐｔｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２２（２００３），３９−４４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、遷移金属酸化物、特にチタン及びジルコニウムの酸化物によってコーティングされた磁性ポリマー粒子、及びその製造方法の提供に関する。本発明は更に、精製、抽出、捕捉、アッセイ又は合成用の特異的な緩衝液との組み合わせによる、上記コーティングされた磁性ポリマー粒子の使用の提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
以上より、本発明の第１の態様は、ポリスチレン又はポリアクリレートを含んでなる単分散ポリマー微粒子の提供に関し、前記微粒子は、少なくとも１つの遷移金属酸化物で形成されたコーティングを有する。
【００１８】
本発明の他の態様は、ポリスチレン又はポリアクリレートを含んでなる多孔性ポリマー微粒子の提供に関し、前記粒子は、少なくとも１つの遷移金属酸化物で形成されたコーティングを有する。
【００１９】
本発明の第２の態様は、上記のような粒子の調製方法の提供に関し、当該方法は、ポリスチレン又はポリアクリレートを含んでなる単分散且つ／又は多孔性のポリマー微粒子と、酸化物に変換されうる少なくとも１つの遷移金属化合物とを反応させるステップと、
例えば加熱及び／又は水の添加により遷移金属酸化物のコーティングを形成させるステップとを有してなる。
【００２０】
本発明の更なる態様は、生物高分子の単離への、これらの粒子の使用の提供に関する。
【００２１】
本発明のポリマー粒子は、周知のＵｇｅｌｓｔａｄタイプの工程を使用して膨張させたコアポリマーシード（ｓｅｅｄ）を含んでなる。本願では、「ビーズ」及び「粒子」の用語は同義的に用いられる。上記コアポリマーはポリアクリレートでもよいが、好ましくはポリスチレンから形成され、ゆえに、上記シードの材料は典型的には、直径０．１〜０．５ミクロンのオーダーのポリスチレン粒子である。周知のように、かかるコアは、重合が開始される前に、モノマー（通常は重合開始剤）を当該コア中に拡散させることによって、膨張させることができる。様々なモノマーが、この膨張工程において使用できる。好適なモノマーとしては、スチレン又はアクリレートモノマー、例えばメタクリレートが挙げられる。
【００２２】
本発明の粒子は、好ましくは多孔性である。上記粒子は、周知のように、製造工程の間、好ましくはポロゲン（ｐｏｒｏｇｅｎ）を用いて多孔性にされる。更に、ポリマー粒子の製造においては、立体安定性、特定の界面活性剤、無酸素条件などを使用することが公知である。
【００２３】
本発明で使用される上記粒子は、重合の前にモノマーでコア粒子を事前に膨張させる工程か、又は、短時間の当初モノマー膨張期間の後に、更なるモノマーを添加しながら重合を開始させる工程によって調製できる。
【００２４】
粒子形成の際、膨張段階で形成されるポリマーは、ポリスチレンホモポリマー又はアクリレートポリマー（例えばメタクリレート、グリシジルメタクリレート及びエチレングリコールジメタクリレートのポリマー）でもよいが、スチレンの共重合体がより好ましい。共重合体は、スチレンと共重合できるいかなるコモノマー、例えばジビニルベンゼン（ＤＶＢ）、アミノスチレン及びニトロスチレン、特にジビニルベンゼン）により形成されてもよい。
【００２５】
ゆえに、好ましくはこのポリマーは、例えばコモノマーとして架橋剤を取り込むことによって架橋される。好適な架橋剤としては、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）又はエチレングリコールジメタクリレートなどが挙げられる。ＤＶＢが好適である。必要となる架橋剤（例えばコモノマー）の適当量は当業者にとり周知であるが、典型的には３０〜８５％（モノマー重量に対する重量％）、例えば約５０重量％である。ゆえに好ましくは、本発明で使用するポリマー粒子は、架橋スチレンポリマー粒子（例えばスチレン−ジビニルベンゼンポリマー粒子）である。
【００２６】
本発明のポリマー粒子は好ましくは、遷移金属化合物によるコーティングの前に、表面が官能化されている。換言すれば、任意に活性化することによって、遷移金属化合物と反応又は相互作用して、例えば当該表面に当該化合物を共有結合させることのできる基を、ポリマー粒子の表面に提供するのが好ましい。上記の表面は好ましくは、例えばエチレンジアミンにより直接アミノ化することによって、又は、表面をニトロ化して更に当該ニトロ基をアミンに還元することによって、アミン官能化される。かかるアミン官能化された表面を準備することにより、遷移金属化合物との直接的な反応のための、又は、遷移金属化合物との反応の前における更なる官能化のための、理想的なテンプレートが提供される。例えば、上記表面は、ＷＯ０５／０１５２１６にて説明されるように、エポキシド又はジオール／イソシアネートとの反応によって官能化されうる。ヒドロキシ官能化された表面又はポリウレタン官能化された表面が得られる。エポキシドモノマーの性質を慎重に選択することによって、ビニル基を担持する表面を形成することもできる。
【００２７】
複数のコーティングを有するポリマー粒子では、それらが単層である場合と比較し、浸出が更に少ないことが示された。ゆえに好ましくは、本発明のポリマー粒子は、複数（例えば２つ又は３つ）のコーティングを含んでなる。同じでもよいが、好ましくは異なるコーティングが、本明細書に記載されるような少なくとも１つの遷移金属化合物により形成されていてもよい。あるいは、複数のコーティングのうちの１つのみ、好ましくは最外部のコーティングが、少なくとも１つの遷移金属化合物で形成されていてもよい。この後者の場合、存在する他のコーティングは、いかなる従来公知のコーティング材料から形成されてもよく、例えばエポキシド系コーティング、ポリウレタンコーティング、又はアルコキシ基などを含むシランから形成されるコーティングが使用される。
【００２８】
本発明のポリマー粒子は、好ましくは磁性を有する。本明細書において、磁性を有するとは、ポリマー粒子が磁場によって吸引されうることを意味する。本発明のポリマー粒子は、好ましくは常磁性、非超常磁性又は超常磁性の結晶を含んでなる。常磁性粒子は、わずかな残留磁気特性を示す。非超常磁性結晶は、磁場への曝露の後、磁場がない状態で当該材料が残留磁気を有しなければならないという意味で、残留磁気特性を有する。超常磁性ポリマー粒子は、磁気的に変位可能であるが、永久に磁化可能ではない。これは、上記粒子が、磁石への曝露の後、凝固又は凝集を生じさせることなく、溶液中で懸濁又は分散されうることを意味する。磁性結晶は、ポリマー粒子の内部及び／又は表面において、磁性結晶の形態で分布されうる、いかなる材料であってもよい。磁性酸化鉄、例えば磁鉄鉱又はマグネマイトが好適であるが、しかしながら、当該結晶は必要に応じて金属酸化物の混合物又は他の磁性材料であってもよい。超常磁性結晶は典型的には直径５〜１５ｎｍ、例えば約７ｎｍであり、一方、非超常磁性（熱によりブロックされる）酸化鉄の結晶は、典型的にはそれより若干大きい。
【００２９】
本発明の磁性ポリマー粒子は好ましくは多孔性であり、これによって、大量の磁性結晶をその中に堆積させることができる。存在する上記結晶質の磁性材料の合計量は、通常１重量％超、好ましくは３重量％超、より好ましくは５重量％以上、例えば１０重量％以上である。存在する上記結晶質の磁性材料の合計量は、最高５０重量％、好ましくは最高４０重量％であってもよい。上記のパーセンテージは、コーティングされた粒子の全乾燥重量に対する、Ｆｅの重量（又は酸化鉄以外の磁性材料の場合、それと同等の金属）として算出される。
【００３０】
本発明に係るポリマー粒子は微粒子であって、一般に０．２〜１００μｍ、例えば０．２〜１０μｍ、好ましくは０．５〜５μｍ、特に０．８〜１．２μｍの範囲のサイズ（すなわち直径）である。
【００３１】
本発明の粒子に何らかのタイプのコーティング（金属酸化物コーティングか、又は他のコーティング、例えばエポキシド系）を施す前においては、本発明で用いられる表層官能化ポリマー粒子は、２．７μｍの平均粒子直径で補正した（すなわち表面積を２．７／ＭＤで乗算した（ＭＤは平均直径（μｍ）である））ときに、典型的には少なくとも１５ｍ２／ｇ（ＢＥＴ窒素吸着法で測定）、より好ましくは少なくとも３０ｍ２／ｇ、例えば最高７００ｍ２／ｇの表面積を有する。
【００３２】
本発明のポリマー粒子は、単分散性である。典型的には、上記ポリマー粒子は、それらがコーティングされる前に球形且つ単分散性であり、特に好ましくは、それらがコーティングされた後も球形且つ単分散性のままである。かかる粒子は、非単分散性の粒子よりも、バッチ間の変動が少なく、好適には、それらの使用によるデータの再現性及び信頼性が改善される。かかる再現性は、特に粒子ベースのアッセイにおいて重要であり、例えば診断技術への本発明のポリマー粒子の使用が可能となる。
【００３３】
単分散性とは、複数（例えば少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１０００、特に好ましくは実質的に全て）の粒子の場合、当該粒子が２０％未満、例えば１５％未満、好ましくは１２％未満、より好ましくは１１％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは約８％以下、例えば２〜５％の変動係数（ＣＶ）を示すことを意味する。ＣＶは、
ＣＶ＝（１００×標準偏差）／平均
としてパーセンテージで算出され、式中、平均とは平均粒径であり、標準偏差とは粒径の標準偏差である。ＣＶは好ましくは、主モード（ｍａｉｎ ｍｏｄｅ）上で、すなわち単峰性の分布曲線を検出された粒度分布にフィットさせることにより、算出される。すなわち、モード径より小さい若しくは大きい粒子は、上記の算出においては計測されず、例えば、全粒子（すなわち検出可能な粒子）数の約９０％をベースとして算出される。かかるＣＶの測定は、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＬＳ １３０粒径分析機を用いて実施できる。
【００３４】
本発明において特に有用なのが、商標「ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ」としてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌ ＡＳ（オスロ、ノルウェー）から市販されている磁性ポリマー粒子である。
【００３５】
ＷＯ０１／７０８２５にて開示されるように、一部アミノスチレンから調製される、ＷＯ９９／１９３７５（Ｄｙｎｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｒ ＡＳＡ社）及びＷＯ００／６１６４８（Ｄｙｎｏ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ＡＳ社）に記載のポリマー粒子が、特に好適であり、これらの内容は参照により本明細書に組み入れられる。ポリマー粒子の官能化は、重合反応の後、例えばニトロ化及びそれにより形成されたニトロ基のペンダントアミン基への還元により、又は、例えばアミノエタノール処理による直接のアミノ化により実施してもよい。また、ＷＯ００／６１６４７（Ｄｙｎｏ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ＡＳ社）において開示される、周知のＵｇｅｌｓｔａｄの２段階膨張工程及びその改良法により調製されるポリマー粒子を用いてもよい。また、ＷＯ９９／１９３７５及びＷＯ００／６１６４８において開示される方法で調製されるポリマー粒子を用いてもよい。これらの刊行物に記載の方法に従って調製される多孔性ポリマー粒子の孔に、例えば上記の標準的な技術によって、磁性粒子を堆積させてもよい。
【００３６】
これらの全ての方法のうち、アミノ担持ポリマー材料の調製における、コモノマーとしてのアミノスチレン、特に４−アミノスチレンの使用が好適である。このモノマー又はコモノマーの使用により、重合後のニトロ化及び還元反応が不要になる。更に、このプロセスにより、表面がより予測可能な性質（均質性）を有するようになるため、非常に信頼性が高いコーティングを塗布することが可能となる。
【００３７】
遷移金属化合物によるポリマー粒子のコーティング及びその後に形成される酸化物により、粒子表面上、及び任意にポリマー粒子の孔内に、酸化物の層が形成され、それによりこれらの孔がブロックされ、物理的にポリマー粒子中に磁性結晶が封入される。それにより、得られる「コーティング」された粒子は、出発材料よりも多孔性が減少するが、磁性材料が浸出する傾向が低い。
【００３８】
本発明においては、遷移金属酸化物とは、周期表の３〜１０族の金属、又はＡｌ若しくはＧａの酸化物を意味する。ゆえに、本発明のポリマー粒子をコーティングし、更に酸化物コーティングへ変換されるのに適切な遷移金属化合物は、周期表の３〜１０族の金属、Ａｌ又はＧａ、好ましくは４〜６族の金属又はＡｌ、特に好ましくは４族（Ｔｉ、Ｚｒ及びＨｆ）の金属又は５族（Ｖ、Ｎｂ又はＴａ）の金属である。極めて好ましくは、上記遷移金属化合物は、Ｎｂ、Ｔａ、チタン又はジルコニウムからなり、特にＺｒ又はＴｉからなる。
【００３９】
ポリマー粒子上のコーティングは、酸化物のコーティングである。好ましくは、これは目的の遷移金属の中で最も安定な酸化物である。極めて好ましいのは、上記ポリマー粒子は、酸化アルミニウム、二酸化チタン又は二酸化ジルコニウム、特にＴｉＯ２及びＺｒＯ２でコーティングされる。
【００４０】
遷移金属コーティングの形成は、化学蒸着法などの任意の簡便な方法によって実施してもよいが、好ましくはゾル−ゲル技術を使用して実施する。酸化物によるコーティング前の粒子表面は、官能化されていなくてもよいが、遷移金属化合物上のリガンドを置換できる反応基を担持させ、及び／又は、水素結合により更に安定化させるため、官能化させるのが好ましい。これにより、ポリマー粒子と遷移金属化合物との間での最初の相互作用が生じうる。簡便な方法としては、ビーズの表面に求核基、好ましくは酸素又は窒素含有基を担持させてもよい。またビーズ表面は、ホスホネート含有基を担持してもよい。すなわち、上記ビーズは、アミノ化、ヒドロキシル化、アミノヒドロキシル化、オキシム化されてもよく、又は、カルボン酸基又はアミノエタン酸基を担持してもよい。
【００４１】
理論に拘束されることは望ましくないが、遷移金属化合物の少なくとも１つの不安定な結合が、本明細書に記載のコーティング技術の成功にとり、きわめて重大であると考えられる。より具体的には、例えばポリマー粒子の表面上のアミン基との接触により、当該アミンと遷移金属化合物との間に結合又は他の相互作用が形成されると考えられる。
【００４２】
かかる遷移金属種が水（結合形成の副産物と考えられる）と接触するとき、遷移金属化合物上の結合は開裂反応を受け、ヒドロキシ基（例えば−ＴｉＯＨ）を形成しうる。この化合物は次に、更に水を放出しながら酸化物に変換される。すなわち、遷移金属化合物とビーズの最初の接触により、ポリマー粒子への遷移金属化合物の接着がなされ、その結果、例えばイオン性及び非イオン性相互作用などの相互作用を介してビーズ表面に保持される酸化物コーティングの形成がなされる。
【００４３】
ゆえにコーティングの形成は、ビーズと遷移金属との間で生じる相互作用又は反応の程度に、並びに、切断されうる遷移金属化合物の結合の数に、少なくとも部分的に依存しうる。本発明に用いられる好適な遷移金属化合物は、ポリマー粒子／水への曝露により切断されうる４つの結合を含んでなる。
【００４４】
ゆえに好適な遷移金属化合物は、ポリマー粒子表面と反応し、例えば加熱又は水との反応により酸化物へ容易に変換されうる化合物である。ゆえに適切な遷移金属化合物は、ヒドリド、ハライド、アルコール、オキシム、アルコキシド、アリールオキシド（例えばフェノラート）、エステル（例えばアセテート、アクリレート）、アセトアセテート、チオカルバメート、アミン、アルケンジオネート及びホスフェート、又はこれらの混合物（例えばアルコキシ及びハライドを担持する遷移金属化合物）である。これらの化合物は、それぞれ少なくとも１つの−Ｔｍ−Ｈ、−Ｔｍ−Ｈａｌ、−ＴｍＯＨ、−ＴｍＮＯＨ、−Ｔｍ−ＯＲ、−ＴｍＯ（Ｏ）ＣＲ、−ＴｍＳＣ（Ｓ）ＮＲ、−Ｔｍ−ＮＲ、−Ｔｍ−Ｏ−ＣＲ＝ＣＲ−Ｃ（Ｏ）Ｒ又は−ＴｍＯＰ（Ｏ）ＯＲ基を含んでなり、Ｒは水素、アリール基、アルケン基又はアルキル基であってもよく、１８Ｃ以下、好ましくは１０Ｃ以下、特に好ましくはＣ１−６である。
【００４５】
ハライド及びアルコキシドが特に好適であり、特にアルコキシドが好適である。最も好適には、遷移金属化合物上の全てのリガンドがアルコキシル基である。
【００４６】
好ましくは、上記アルコキシドは、チタン（ＩＶ）又はジルコニウム（ＩＶ）イオンのアルコキシドである。より好ましくは、上記アルコキシドは、Ｃ１−６アルコキシド、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ又はブトキシである。特に好ましくは、４つのかかる基、例えばテトラメトキシ、テトラエトキシ、テトラプロポキシ又はテトラブトキシ基が存在する。再確認のためであるが、テトラアルキルジルコネート、テトラアルキルオルトジルコネート及びテトラアルコキシジルコネートは同じ化合物である。遷移金属化合物の混合物を使用してコーティングを形成することも可能である。
【００４７】
本発明に係る好適な方法においては、ポリマー粒子を、有機溶媒中で、上記で定義した遷移金属アルコキシド化合物と反応させる。水溶性の高い若しくは低い溶媒を用いることが可能である。上記溶媒は、好ましくは不活性である。適切な溶媒の代表例としては、トルエン、キシレン及びエーテルが挙げられる。非常に好適な溶媒は、２−メトキシエチルエーテルである。典型的には、１ｇのポリマービーズを、２〜１５０ｍｌ、より好ましくは５〜１５ｍｌの溶媒中に懸濁させる。
【００４８】
本発明のコーティングされた粒子を形成させる方法は、１段階工程、又は２段階工程により実施されてもよい。１段階工程においては、水を、有機溶媒中の、ポリマー粒子及び遷移金属化合物の懸濁液又は分散液中に添加してもよい。好適な２段階工程においては、最初に上記ポリマー粒子を、有機溶媒中に懸濁若しくは分散させ、遷移金属化合物を添加し、次に水を添加する。両方の方法において、典型的には、過剰量の遷移金属化合物を添加する。好ましくは、上記反応は、例えば−１０〜２００℃、好ましくは２０〜１００℃の範囲の温度、例えば室温付近で実施される。コーティング反応がこの低温で遂行されうることは、特許請求された方法の驚くべき特徴であり、コーティングの形成の際にポリマー粒子に損傷を与えうる過剰な加熱を行う必要がない。典型的な反応時間は、１０分〜２４０分（例えば約９０分）である。
【００４９】
好ましくは、２段階工程の第１の段階は、不活性雰囲気下、例えばアルゴン雰囲気下で実施される。しかしながら、実質的に水が反応系に存在しないのがより好ましい。換言すれば、上記反応は無水的に行われる（例えば＜５重量％の水、好ましくは＜１重量％の水分含量である）。理論に拘束されたくないが、乾燥条件で最初の段階を実施することにより、ごく一部の遷移金属化合物のみが反応を受け、ポリマー粒子に結合すると考えられる。すなわち、反応の最初の段階は、ポリマー粒子上での遷移金属化合物の均一な「プライマー」層の形成として作用する。
【００５０】
２段階工程中の第２の段階においては、水、好ましくは脱イオン水を添加する。理論に拘束されることは望ましくないが、これにより、遷移金属化合物の迅速な加水分解が誘導され、粒子上の加水分解されたプライマー層と会合する酸化物が供給される。
【００５１】
典型的には、添加される遷移金属化合物１モルあたり、０．０１〜５モルの水を添加する。水の添加時、ポリマー粒子の懸濁液は典型的には室温である。典型的な反応時間は、１時間〜１０時間、好ましくは１時間〜３時間、例えば約２時間である。
【００５２】
本発明の工程は、例えば触媒として、酸又は塩基を添加する必要がありうる。しかしながら、上記反応は、酸、例えばリン酸又は氷酢酸の添加を行わずに生じるのが好ましい。また、振とう、撹拌及び／又は超音波処理を用いることにより含浸を向上し、反応速度を加速させるのも好適である。
【００５３】
反応終了後、コーティングポリマー粒子を、当業者に公知の従来法（例えば濾過）によって分離してもよい。一般的には、コーティング粒子を好ましくは最高１０回洗浄し、あらゆる遊離の試薬、例えば未反応の出発材料を除去する。いかなる溶媒及び／又は溶媒混合物も洗浄に使用でき、例えばアセトン、メタノール、水、イソプロパノール又はエーテルなどが挙げられる。好適には、最初の段階において使用する溶媒を、洗浄用の溶媒としても使用する。次にポリマー粒子を、好ましくは真空下で乾燥させてもよい。
【００５４】
以上より、本発明の他の態様は、上記したようなポリマー微粒子の調製方法の提供に関し、当該方法は、ポリスチレン又はポリアクリレートを含んでなるポリマー微粒子と、少なくとも１つの遷移金属アルコキシド及び水とを反応させる段階を有してなる。好ましくは、上記方法は、水よりも前にアルコキシドの添加を必要とする。
【００５５】
本明細書に記載の方法により得られる粒子は、本発明の更なる態様を構成する。
【００５６】
＜用途＞：
得られるポリマー粒子は、例えば生体分子（例えばペプチド、タンパク質、核酸）、金属イオン、有機化合物（例えば薬剤又は薬剤誘導体）、基質及びそれらの任意の混合物の、精製（例えば単離、分画、減少、脱塩）、抽出、又は捕捉（例えば濃縮）など、広範囲にわたる用途で使用できる。上記ポリマー粒子はまた、アッセイ及び固相合成において、複合混合物からの、例えば特異的な生体分子（例えば核酸、タンパク質、ペプチド）の単離において使用できる。
【００５７】
吸着／脱着工程により実施される、様々な生体分子の単離及び分画における、本発明のポリマー粒子の有用性は、上記の遷移金属酸化物でコートされた粒子の高い結合能に由来する。本発明のポリマー粒子により、かかる単離及び分画を、カラムの使用や、サンプルの希釈を行うことなく実施でき、またハイスループットで自動化することもできる。例えばプレートの使用と比較し、少ない体積で広い表面積を有する粒子は、特に有益である。
【００５８】
非常に好適な実施形態では、本発明の粒子を用いて、サンプルからＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸を結合させる。ＤＮＡ又はＲＮＡの単離は、多くの生化学及び診断手順における重要な段階である。例えば、複合混合物から、そこに通常存在する核酸を単離しなければ、他の試験及び手順、例えば検出、クローニング、塩基配列決定、増幅、ハイブリッド形成、ｃＤＮＡ合成、核酸の構造及び組成（例えばＤＮＡのメチル化パターン）の研究などが実施できないことが多い。かかる複合混合物中の、大量の細胞又はその他の混入物質、例えばタンパク質又は炭水化物の存在はしばしば、使用する反応及び分子生物学的な技術の多くを妨げるからである。更に、ＤＮＡはＲＮＡ調製物中に混入することもあり、またその逆もありうる。ゆえに、細胞、組織などの複合混合物からの核酸の単離方法は、調製の観点からのみならず、今日用いられている、ＤＮＡ又はＲＮＡの同定に依存する多くの技術、例えば微生物感染症の診断、法科学、組織及び血液タイピング、遺伝子タイピング、遺伝的変異の検出などの観点からも、要望されている。核酸の単離は、あらゆる適切な核酸単離手順を使用して、本発明の粒子を使用して実施することができる。
【００５９】
サンプルは、核酸を含んでなるいかなる材料でもあってもよく、例えば食品及び関連物質、臨床及び環境サンプルなどが挙げられる。サンプルは生物学的サンプルでもよく、あらゆるウイルス若しくは細胞由来の材料を含んでもよく、全ての原核若しくは真核生物細胞、ウイルス、バクテリオファージ、マイコプラズマ、原形質及び細胞小器官などが挙げられる。ゆえにかかる生物学的材料は、全ての種類の哺乳動物及び非哺乳動物由来の細胞、植物細胞、藻類（緑藻類を含む）、菌類、バクテリア、原生動物などを含んでもよい。ゆえに代表的なサンプルとしては、全血及び血漿、血清などの血液由来の生成物、軟膜、尿、糞便、脳脊髄液、又は他の体液、組織、培養細胞、細胞懸濁液などが挙げられる。
【００６０】
核酸の単離のための各種の方法が知られているが、一般的には、これらは一連の複雑な抽出及び洗浄段階に依存するものであり、時間及び手間のかかるものである。
【００６１】
例えばＵＳ−Ａ−５，２３４，８０９は、グアニジウム塩などのカオトロピック剤の存在下で、核酸をシリカ粒子の形の固相に結合させ、それによりサンプル中の残余物と分離する方法を記載している。ＷＯ９１／１２０７９は、沈殿によって核酸を固相表面にトラップする方法を記載している。一般的には、アルコール及び塩が沈殿剤として用いられる。
【００６２】
ＵＳ ５，７０５，６２８及びＵＳ ５，８９８，０７１は、７〜１３％の濃度の、大きな分子量のポリアルキレングリコール（例えばポリエチレングリコール）と、０．５〜５Ｍの範囲の塩との組合せを使用した、核酸断片の単離方法を記載しており、それにより、生物学的親和性によるＤＮＡ吸着基として機能する固体支持体上へ、官能基を結合させることができる。
【００６３】
核酸の単離への本発明の粒子の使用が特に好適であることが明らかとなった。ゆえに、本発明の他の態様は、核酸を含んでなるサンプルから核酸を単離する方法の提供に関し、当該方法は、本発明の粒子と前記サンプルとを接触させる段階を有してなる。より詳細には、本発明は、サンプルからの核酸の単離方法の提供に関し、当該方法は、
（Ｉ）１つまたは複数の核酸を含有するサンプルを準備する段階と、
（ＩＩ）上記のサンプルと、遷移金属酸化物でコーティングされた粒子を混合する段階と、
（ＩＩＩ）上記サンプル及び粒子をインキュベートする段階と、
（ＩＶ）上記粒子を任意に磁場において回収し、上清を除去する段階と、
（Ｖ）任意に、１つまたは複数の核酸を単離する段階と
を有してなる。
【００６４】
周知のように、例えば段階（ＩＶ）の後に洗浄段階をこの工程中に含めてもよい。
【００６５】
この点に関しては、核酸は、カオトロピック緩衝液の存在下で、遷移金属面に容易に吸着することもわかっている。ゆえに、特に好適な実施形態では、本発明のポリマー粒子を用いることにより、例えば、生物学的標本から、この影響力を利用することによって、すなわちカオトロピック緩衝液の存在下で、核酸を単離することが可能となる。遷移金属表面による核酸の吸着は、核酸の周囲の水による水素結合ネットワークを破壊し、それにより溶液中の高分子の構造を不安定とする、カオトロピック緩衝液の影響の結果として生じる。ゆえに、その後異なる洗浄段階を通じて周囲の環境の水素結合を再構成することによって、結合した上記の核酸を次に上記表面から、例えば所望の緩衝液を添加することにより溶出させることができる。
【００６６】
更に、発明者らは驚くべきことに、金属酸化物でコートされた粒子を使用した核酸の単離が、粒子表面と使用する緩衝液の組成との組合せに深く依存することを見出した。
【００６７】
本発明のポリマー粒子への核酸の結合は、緩衝液（特にカオトロピック緩衝液）と、任意に添加される他の物質（例えば塩）との適切な組合せ／濃度により促進される。温度及びｐＨの操作により、単離が助長されることもある。場合によっては、異なるタイプの核酸（例えばｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｄｓＤＮＡその他）を識別することが可能となる。
【００６８】
特に重要なのが、使用する緩衝液である。好適なカオトロピック緩衝液として、グアニジン塩（例えばチオシアネート又は塩化物）、尿素、過塩素酸塩又はヨウ化物が挙げられる。他の利用可能な緩衝液としては、トリス塩酸、ビシン、トリシン及びリン酸緩衝液が上げられ、カオトロピック及び非カオトロピック緩衝液の混合物であってもよい。緩衝液は、アルコール（例えばイソプロパノール）などの洗浄緩衝液及び／又は典型的には周知のように低イオン強度のトリトンなどの非イオン系界面活性剤と、組み合わせてもよい。
【００６９】
上記単離ではまた、標準的な洗浄用及び溶出用の緩衝液、例えば以下の実施例に記載の緩衝液を利用してもよい。
【００７０】
ゆえに、本発明の更なる態様は、上記ポリマー微粒子とカオトロピック緩衝液とを含んでなる、核酸単離用のキットの提供に関する。上記キットの他の任意の構成要素としては、洗浄溶液及び／又は溶出緩衝液などが挙げられる。
【００７１】
インキュベーション条件は典型的に、当該技術で通常使用される条件、例えば１０〜５０℃の温度、例えば室温である。インキュベーションは、任意の好適な時間、例えば１分間〜１週間、好ましくは１〜５時間にわたり実施してもよい。
【００７２】
上記サンプルは、リン酸化タンパク質を含んでなるいかなるサンプルでもよい。かかるサンプルの調製は周知である。サンプルは、溶解され、好ましくは少なくとも１つの単離処理（例えば少なくとも１つの塩、洗剤若しくは界面活性剤、酸若しくは塩基を含有する１つまたは複数の溶液による抽出、遠心分離、可溶化、沈殿、親和性による捕捉、二次元電気泳動又はクロマトグラフィなど）を受けた細胞画分であってもよい。
【００７３】
他の非常に好適な実施形態では、本発明の粒子は、リン酸化タンパク質（当該用語にはリン酸化ペプチドが含まれる）の単離に用いられる。本発明の微粒子は特に、非タンパク質修飾又は細胞内タンパク質の翻訳後修飾、特にリン酸化の同定に利用できる。リン酸化及び脱リン酸化により、多くの細胞内事象、例えば細胞周期の制御、細胞分化、形質転換、アポトーシス、シグナル伝達などが調節され、かつ本発明の微粒子の使用により、リン酸化状態が化学的、生物学的あるいは物理的な摂動（例えば薬剤処理、中毒性発作、物理的な曝露（例えば放射線又はＵＶ処理）、又は成長因子若しくは分化因子などによる刺激）によって変化しうるタンパク質を同定し、それにより、リン酸化カスケードの研究に対する１つのサポートが提供される。
【００７４】
リン酸化タンパク質の検出及び単離のための、様々な技術が存在する。Ｐｒｏ−Ｑ Ｄｉａｍｏｎｄ技術（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ社、ＯＲ、米国）はフルオロフォアを利用するものであり、抗体又は放射能を用いずに、タンパク質上のリン酸基を認識し、それにより微量のリン酸化タンパク質の検出が簡便に行える。リンペプチドの捕捉は、磁性ビーズにフルオロフォアを担持させることにより実施できる。
【００７５】
リン酸化タンパク質は、固定化金属イオンクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）技術を使用して単離することもでき、例えば、Ｆｅ３＋などの固定化金属を有する、カルボキシメチル化されたアスパルテートキレート剤が担持された樹脂を充填したカラムを用いて、リン酸化タンパク質を標的とする。固定化金属アフィニティカラム（ＩＭＡＣ）クロマトグラフィを用いて、標的タンパク質サンプル中の修飾及び非修飾ペプチドの混合物からリン酸化ペプチドを選抜する。標準的なプロトコルでは、塩化鉄を使用して、ＩＭＡＣカラムの金属キレート化パッキング材料と結合させる操作を行う。リン酸化ペプチドは、カラム上へロードされた際、固定化された鉄原子と結合し、酸性条件下で溶出させることができる。
【００７６】
酸性アミノ酸残基もまた、ＩＭＡＣカラム上のＦｅ３＋と結合するため、カラムに対する非特異的な結合は障害となりうる。これを防止するため、通常上記サンプルをＩＭＡＣカラム上へ添加する前に、２Ｍの塩酸メタノールで処理する。この工程により、全ての酸性アミノ酸残基、並びにペプチドのＣ末端が、カルボン酸基からメチルエステルに変換される。リン酸基は変更されていないままであり、ゆえにＩＭＡＣカラム上への選択的な結合が可能となる。
【００７７】
他の生化学者は、リン酸化タンパク質を結合する二酸化チタン粒子を、２，５−ジヒドロキシ安息香酸と組み合わせてカラムで使用し、非リン酸化タンパク質の結合を防止する。
【００７８】
本発明の微粒子は、リン酸化タンパク質の単離のため、更なる経路を提供するものである。すなわち、本発明の更なる態様は、リン酸化タンパク質の単離への、本発明の微粒子の使用の提供に関する。ゆえに、本発明の他の態様は、リン酸化タンパク質を含んでなるサンプルからのリン酸化タンパク質の単離方法の提供に関し、当該方法は、本発明の粒子と前記サンプルとを接触させる段階を有してなる。
【００７９】
したがって、本発明の他の態様は、サンプルからのリン酸化タンパク質の単離方法の提供に関し、当該方法は、
（Ｉ）１つまたは複数のリン酸化タンパク質を含有するサンプルを準備する段階と、
（ＩＩ）上記サンプルと、上記の遷移金属酸化物でコーティングされた微粒子とを混合する段階と、
（ＩＩＩ）上記サンプルと上記粒子とをインキュベートする段階と、
（ＩＶ）上記粒子を任意に磁場において回収して上清を除去する段階と、
（Ｖ）任意に、１つまたは複数の単離されたリン酸化タンパク質を溶出する段階と
を有してなる。
【００８０】
周知のように、例えば段階（ＩＶ）の後に洗浄段階をこの工程中に含めてもよい。
【００８１】
上記サンプルは、リン酸化タンパク質を含んでなるいかなるサンプルでもよい。かかるサンプルの調製は周知である。サンプルは、溶解され、好ましくは少なくとも１つの単離処理（例えば少なくとも１つの塩、洗剤若しくは界面活性剤、酸若しくは塩基を含有する１つまたは複数の溶液による抽出、遠心分離、可溶化、沈殿、親和性による捕捉、誘電泳動又はクロマトグラフィなど）を受けた細胞画分であってもよい。幾つかの実施形態では、最初に、ホスホセリン、ホスホスレオニン又はホスホチロシンと結合する１つまたは複数の特異的な結合試薬を使用した親和性による捕捉によって、リン酸化タンパク質を濃縮する。また、タンパク質は、電気泳動又はクロマトグラフィなどの方法により、細胞画分から単離することもできる。若干の好ましい実施形態では、タンパク質を１つまたは複数のプロテアーゼにより消化して、サンプル調製を行う。好ましくは、上記サンプルはプロテアーゼ消化されたタンパク質を含んでなる。
【００８２】
例えば、リン酸化ペプチドは、かかる磁性ビーズの誘導体化表面上の選択的な濃縮によって、より一般的なペプチド配列を含む複合混合物から単離されうる。
【００８３】
インキュベーション条件は典型的に、当該技術で通常使用される条件、例えば１０〜５０℃の温度、例えば室温である。インキュベーションは、任意の好適な時間、例えば１分間〜１週間、好ましくは１〜５時間にわたり実施してもよい。
【００８４】
本発明のポリマー粒子へのリン酸化タンパク質の結合は、１つまたは複数の緩衝液（特にカオトロピック緩衝液）と、任意に添加される他の物質（例えば塩）との適切な組合せ／濃度により促進される。温度及びｐＨの操作により、単離が助長されることもある。
【００８５】
この点に関しては、従来公知のＴｉＯ２粒子を使用する際、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）を、比較的高い濃度で、ローディング用及び／又は洗浄用の緩衝液に使用して、リン酸化タンパク質の選択性を高いレベルに維持することが通常行われる。ＤＨＢの非存在下では、選択性が低下し、多くの混入ペプチドが残留する。
【００８６】
しかしながら、本発明の粒子は、ＤＨＢが存在しない場合でも高い選択性を有するため、ローディング又は洗浄緩衝液中のＤＨＢの存在が必要ない。すなわち、他の実施形態では、上記の段階（ＩＩ）はＤＨＢの非存在下で実施される。
【００８７】
ＤＨＢは、水性緩衝液中で結晶化する傾向が非常に高いため、この材料の使用の回避による利点は非常に多い。その結晶の存在により、逆相樹脂における詰まりが生じ、それにより背圧が生じ、またサンプルの損失が生じる。したがって、リン酸化タンパク質の濃縮への本発明の粒子の使用は、非常に好適である。
【００８８】
単離工程において特に重要なのが、使用する緩衝液である。カオトロピック緩衝液又は界面活性剤が、有用な緩衝液、特に結合用緩衝液である。好適なカオトロピック緩衝液として、グアニジン塩、例えばチオシアネート、又は塩化物、尿素、過塩素酸塩又はヨウ化物が挙げられる。他の利用可能な緩衝液としては、トリス塩酸、ビシン、トリシン及びリン酸緩衝液が挙げられ、かつカオトロピック及び非カオトロピック緩衝液の混合物であってもよい。緩衝液は、アルコール（例えばイソプロパノール）などの洗浄緩衝液及び／又は典型的には周知のように、低イオン強度のトリトンなど非イオン系界面活性剤と組み合わせてもよい。
【００８９】
界面活性剤、例えばＷＯ９６／１８７３１に記載されているものを用いてもよい。好適な界面活性剤としては、イオン系（アニオン系及びカチオン系を含む）、非イオン系、又は双性イオン系の界面活性剤が挙げられる。本明細書で用いられる「イオン系界面活性剤」という用語には、水に溶解させたときに、部分的又は完全に、イオン化形態として存在する、あらゆる界面活性剤が包含される。アニオン系界面活性剤は、特に良好に機能するため好適である。適切なアニオン界面活性剤としては、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、又は他のアルカリ金属アルキル硫酸塩、又は同様の界面活性剤（ザルコシル）又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【００９０】
界面活性剤とカオトロピック緩衝液との組合せを使用してもよい。
【００９１】
単離において、標準的な洗浄緩衝液、例えば以下の実施例に記載のものを利用してもよい。
【００９２】
発明者らは驚くべきことに、本発明の微粒子を使用したリン酸化タンパク質の単離において、特に有用であると証明された多くの緩衝液を見出した。これらの緩衝液は、本発明の特許請求された方法において大きな有用性を発揮する一方、それらはまた、一般論として、多様な異なる技術及び粒子を使用したリン酸化タンパク質の単離においても有用であることはいうまでもない。上記緩衝液はまた、他の生体分子の単離においても有用性を発揮しうる。ゆえにこれらの緩衝液は、本発明の更なる態様を構成する。
【００９３】
本発明の微粒子に対するリン酸化タンパク質の結合の際、及び当該粒子の洗浄の際、発明者らは、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４）＋２０％のエタノール緩衝液が理想的であることを見出した。かかる緩衝液は、１．６６ｇの無水酢酸ナトリウムを５０ｍｌの脱イオンされたＨ２Ｏに溶解させることにより調製できる。０．４５又は０．２２ｍｍのフィルタで濾過した後、５．２７ｍｌの氷酢酸を添加することができ、全量をｄＨ２Ｏで最大１．７５Ｌにする。この材料のｐＨは４．０±０．１である。４５０ｍｌのエタノールを次に添加でき、脱イオン水を添加して最終的な体積を最大２．２５Ｌにする。使用する全ての試薬は、分析グレードであるべきである。
【００９４】
ゆえに、水、エタノール及び酢酸ナトリウムを含有し、３．９〜４．１のｐＨである緩衝液が理想的である。好ましくは、緩衝液中に１０〜３０重量％のエタノールが存在する。所望のｐＨとするため、緩衝液中の酢酸ナトリウムを４５〜５５ｍＭとしてもよい。
【００９５】
したがって、非常に好適な実施形態では、リン酸化タンパク質と本発明の微粒子とのインキュベーションは、この緩衝液の存在下で行われる。
【００９６】
リン酸化タンパク質は、単離した後、従来公知の技術を使用して溶出させることができる。溶出は、ピペラジン、イミダゾール、ｏ−リン酸エステルのうち１つ若しくは複数を含む溶液、又は塩基性（例えばｐＨ８〜１１）の溶液において実施できる。好適な溶出緩衝液としては、炭酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、クエン酸二アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸二水素アンモニウム又は重炭酸アンモニウムが挙げられる。
【００９７】
好適な溶出緩衝液は、フェニルホスフェート及び水酸化アンモニウムをベースとする。これは好ましくは、０．３Ｎ ＮＨ４ＯＨ中に５０ｍＭのフェニルホスフェートである。かかる緩衝液は、５００ｍｌの脱イオン水に５ｍｌの水酸化アンモニウム（１４．８Ｍ）を添加して、０．３Ｎ ＮＨ４ＯＨ溶液として調製し、次に６．３５ｇのフェニルホスフェートを添加することにより調製できる。使用する全ての試薬は、分析グレードであるべきである。
【００９８】
ゆえに、フェニルホスフェート（例えばそのナトリウム塩）及び水酸化アンモニウムを含んでなる溶出緩衝液が、本発明での使用にとり理想的であり、これは本発明の更なる態様を構成するものである。
【００９９】
好ましくは、緩衝液の調製に使用する水酸化アンモニウムは０．１〜１Ｎである。使用するフェニルホスフェートは、１０〜１００ｍＭの溶液、例えば４０〜６０ｍＭ、例えば５０ｍＭの溶液として供給できる。
【０１００】
発明者らは、驚くべきことに、本発明のコーティング粒子と共に作用するように最適化された溶出緩衝液は、表面への強力な結合に関してリン酸化された残基との競合が助長されるように、水酸化アンモニウム（例えば０．３Ｎ水酸化アンモニウム）中にフェニルホスフェート（例えば５０ｍＭのフェニルリン酸ナトリウム）を含むべきであることを見出した。
【０１０１】
したがって、非常に好適な実施形態では、上記の段階（Ｖ）におけるリン酸化タンパク質の溶出は、この緩衝液を使用して実施される。
【０１０２】
溶出の後、リン酸化タンパク質を、従来公知の手段、例えば質量分析を使用して分析し、特定のタンパク質を同定することができる。上記の方法は、ＳＩＬＡＣ（細胞培養液中のアミノ酸による安定なアイソトープ標識）が使用されるか、又は、ｉＴＲＡＱ（相対絶対定量のための、アイソトープタギング（ｔａｇｇｉｎｇ）試薬）が使用された場合のサンプルと組み合わせて使用するときに、特に有用性を発揮する。
【０１０３】
以下の実施例及び図を参照することにより、本発明を更に詳細に記載する。これらは本発明を限定することを目的とせず、単に例示することを目的とするものである。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】血清からの、ｄｓＤＮＡ（５μｇ添加）の単離を示す。レーン１から３：チタンを有する磁性ビーズ。レーン４から６：ジルコニウムを有する磁性ビーズ。レーン７：ＨｉｎｄＩＩＩで切断された、５μｇのλ ｄｓＤＮＡのラダー。
【図２】血清からの、ＲＮＡ（５μｇ添加）の単離を示す。レーン１から３：チタンを有する磁性ビーズ。レーン４から６：ジルコニウムを有する磁性ビーズ。レーン７：５μｇの０．２４〜９．５Ｋｂ ＲＮＡラダー。
【図３】ジルコニウムを有する磁性ビーズを使用した、血清からの核酸（５μｇ添加）の単離を示す。レーン１から３：ＲＮＡ。レーン４：５μｇの０．２４〜９．５Ｋｂ ＲＮＡラダー。レーン５：空。レーン６から８：ｄｓＤＮＡ。レーン９：ＨｉｎｄＩＩＩで切断された、５μｇのλ ｄｓＤＮＡのラダー。
【図４】ジルコニウムを有する磁性ビーズを使用した、血清からの核酸（５μｇ添加）の単離を示す。レーン１及び２：ｄｓＤＮＡ。レーン３：ＨｉｎｄＩＩＩで切断された、５μｇのλ ｄｓＤＮＡのラダー。
【図５】チタンを有する磁性ビーズを使用した、血清からのｄｓＤＮＡの単離を示す。レーン１から２：２．５μｇの添加から単離された、ｄｓＤＮＡ。レーン３から４：５μｇの添加から単離された、ｄｓＤＮＡ。レーン５から６：１５μｇの添加から単離された、ｄｓＤＮＡ。レーン７から８：２０μｇの添加から単離された、ｄｓＤＮＡ。レーン９：ＨｉｎｄＩＩＩで切断された、５μｇのλ ｄｓＤＮＡのラダー。
【図６】ジルコニウム及びチタンを有する磁性ビーズを使用した、血液からのゲノムＤＮＡの単離を示す。レーン１から２：ジルコニウムにより単離されたｇＤＮＡ（実施例１）。レーン３から４：ジルコニウムにより単離されたｇＤＮＡ（実施例２）。レーン５から６：チタンにより単離されたｇＤＮＡ（実施例９）。レーン７から８：チタンにより単離されたｇＤＮＡ（実施例１０）。レーン９から１０：Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＤＮＡ ＤＩＲＥＣＴ（商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌ ＡＳ社製、オスロ、ノルウェー）により単離されたｇＤＮＡ。
【図７】ジルコニウム及びチタンを有する磁性ビーズを使用した、血液からのゲノムＤＮＡの単離を示す。レーン１から２：ジルコニウムにより単離されたｇＤＮＡ（実施例１）。レーン３から４：ジルコニウムにより単離されたｇＤＮＡ（実施例２）。（レーン４の明らかに低い収率の理由は、ｇＤＮＡがビーズから溶出されなかったという事実であった。）レーン５から６：チタンにより単離されたｇＤＮＡ（実施例９）。レーン７から８：チタンにより単離されたｇＤＮＡ（実施例１０）。レーン９から１０：Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＤＮＡ ＤＩＲＥＣＴ（商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌ ＡＳ社製、オスロ、ノルウェー）により単離されたｇＤＮＡ。
【図８】チタンを有する磁性ビーズを使用した、血液からのゲノムＤＮＡの単離を示す。レーン１から２：チタンにより単離されたｇＤＮＡ（実施例１１）。レーン３から４：チタンにより単離されたｇＤＮＡ（実施例１６）。
【図９】異なる専用緩衝液を使用した、ＤＮＡの単離（％）を示す。
【図１０】図１０Ａ〜Ｄは、二酸化チタンビーズとの比較における、本発明のビーズを使用したリン酸化タンパク質の単離後の、得られる質量スペクトルを示す。
【図１１】図１１Ａ及びＢは、本発明の粒子とのインキュベートの前後におけるトリプシン消化により得られた未知のリン酸化タンパク質の質量スペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１０５】
［実施例］
＜一般手順＞：
出発材料のビーズ（以下の実施例ではビーズと称する）は、孔中に酸化鉄の結晶を有する、多孔性の１μｍの単一粒子径の架橋ポリスチレン／ジビニルベンゼンビーズである。これらの磁性ポリマー粒子、３００〜５００ｍｇの鉄含量／ｇの乾燥固体（ＤＳ）は、ＷＯ０５／０１５２１６に記載の手順で、エポキシドでコーティングされていた。
【０１０６】
洗浄段階間の各単離を磁石の上で実施し、懸濁液を各洗浄段階間において、約５分間振とうした。
【０１０７】
＜ジルコニウムコーティングされた粒子＞：
＜実施例１＞：
１．５ｇのビーズを、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、１０〜３０ｍｌの液量／各回）。最終的な懸濁液を、１１．６３ｇの重量に調整した。
【０１０８】
１３．７１ｇのテトラブチルジルコネート（ブタノール中８０％）を添加し、懸濁液を室温で２５０回転／分で撹拌した。９０分撹拌した後、３３０μｌの水を添加した。懸濁液を、更に１８時間撹拌した。
【０１０９】
１８時間後に、上記粒子をビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄し（５回、３０〜５０ｍｌの液量／各回）、次にイソプロパノールで洗浄した（５回、３０〜５０ｍｌの液量／各回）。ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によってジルコニウム層を観察することができた。
【０１１０】
＜実施例２＞：
２ｇのビーズを、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、２５〜４０ｍｌの液量／各回）。最終的な懸濁液を、１５．９５ｇの重量に調整した。
【０１１１】
１７．８４ｇのテトラプロピルジルコネート（プロパノール中７０％）を添加し、懸濁液を室温で２５０回転／分で撹拌した。９０分撹拌した後、４５０μｌの水を添加した。懸濁液を、更に１８時間撹拌した。
【０１１２】
１８時間後に、上記粒子を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄し（６回、３０〜５０ｍｌの液量／各回）、次にイソプロパノール（７回、３０〜５０ｍｌの液量／各回）で洗浄し、次に水（４回、３０〜５０ｍｌの液量／各回）で洗浄し、最後にイソプロパノールで４回（各回３０〜５０ｍｌの液量）洗浄した。ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によってジルコニウム層を観察することができた。
【０１１３】
＜実施例３＞：
２ｇのビーズを、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、２５〜４０ｍｌの液量／各回）。最終的な懸濁液を、１５．９５ｇの重量に調整した。
【０１１４】
１７．８４ｇのテトラプロピルジルコネート（プロパノール中７０％）及び４５０μｌの水を添加した。懸濁液を、室温で、２５０回転／分で１８時間撹拌した。
【０１１５】
１８時間後に、上記粒子を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄し（５回、３０〜５０ｍｌの液量／各回）、次に水で洗浄した（５回、３０〜５０ｍｌの液量／各回）。ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によってジルコニウム層を観察することができた。
【０１１６】
＜実施例４＞：
２ｇのビーズを、エタノールで洗浄した（５回洗浄、２５〜４０ｍｌの液量／各回）。最終的な懸濁液を、１５．９５ｇの重量に調整した。
【０１１７】
１７．８４ｇのテトラプロピルジルコネート（プロパノール中７０％）を添加し、懸濁液を室温で２５０回転／分で撹拌した。９０分撹拌した後、４５０μｌの水を添加した。懸濁液を、更に１８時間撹拌した。
【０１１８】
１８時間後に、上記粒子をエタノールで５回（各回３０〜５０ｍｌの液量）洗浄し、次に水で５回（各回３０〜５０ｍｌの液量）洗浄した。ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によってジルコニウム層を観察することができた。
【０１１９】
＜実施例５＞：
２ｇのビーズを、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、２５〜４０ｍｌの液量／各回）。最終的な懸濁液を、１５．９５ｇの重量に調整した。
【０１２０】
１７．８４ｇのテトラプロピルジルコネート（プロパノール中７０％）を添加し、懸濁液を２５０回転／分で撹拌し、１３０℃に加熱した。１３０℃で９０分撹拌した後、４５０μｌの水を添加した。懸濁液を、１３０℃で更に１８時間撹拌した。
【０１２１】
１８時間後に、上記粒子を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）エーテルで５回（各回３０〜５０ｍｌの液量）洗浄し、次に水で５回（各回３０〜５０ｍｌの液量）洗浄した。ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によってジルコニウム層を観察することができた。
【０１２２】
＜実施例６＞：
エポキシドでコーティングされ、カルボン酸で官能化されているビーズ１ｇを、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、２５〜４０ｍｌの液量／各回）。最終的な懸濁液を、１５．９５ｇの重量に調整した。
【０１２３】
８．９２ｇのテトラプロピルジルコネート（プロパノール中７０％）を添加し、懸濁液を室温で２５０回転／分で撹拌した。６０分撹拌した後、２２０μｌの水を添加した。懸濁液を、室温で、更に１８時間撹拌した。
【０１２４】
１８時間後に、上記粒子を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄し（５回、各回３０〜５０ｍｌの液量）、次に水で２５回（各回３０〜５０ｍｌの液量）洗浄した。ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によってジルコニウム層を観察することができた。
【０１２５】
＜実施例７＞：
２．５ｇのダイナビーズ（登録商標）ＲＰＣプロテイン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌ ＡＳ社製、オスロ、ノルウェー）を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、３０ｍｌの液量／各回）。粒子の乾燥成分を１１．７重量％に調整した。テトラプロピルジルコネート（１−プロパノール中７０％）（２２．３ｇ）、続いてビス（２−メトキシエチルエーテル）（５．０ｇ）を添加した。室温で２５０回転／分で１時間、混合物を撹拌した後、水（０．５６ｇ）を添加した。混合物を更に、室温で１８時間撹拌した。上記粒子を、５０ｍｌのビス（２−メトキシエチルエーテル）で１０回、５０ｍｌの水で２０回洗浄した。ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によってジルコニウム層を観察することができた。
【０１２６】
＜実施例８＞：
エポキシドでコーティングされているビーズ４．０ｇを、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、５０ｍｌの液量／各回）。粒子の乾燥成分を１１．７重量％に調整した。テトラプロピルジルコネート（１−プロパノール中７０％）（３５．７ｇ）、続いてビス（２−メトキシエチルエーテル）（８．０ｇ）を添加した。室温で、２５０回転／分で１時間混合物を撹拌した後、水（０．８９ｇ）を添加した。混合物を更に、室温で１８時間撹拌した。上記粒子を、８０ｍｌのビス（２−メトキシエチルエーテル）で１０回、８０ｍｌの水で２０回洗浄した。ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によってジルコニウム層を観察することができた。
【０１２７】
＜チタンコーティング＞：
＜実施例９＞：
２ｇのビーズを、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、２５〜４０ｍｌの液量／各回）。最終的な懸濁液を、１４．２９ｇの重量に調整した。
【０１２８】
８．７０ｇのテトラエチルオルトチタネートを添加し、懸濁液を室温で２５０回転／分で撹拌した。９０分撹拌した後、２１０μｌの水を添加した。懸濁液を、更に２時間撹拌した。
【０１２９】
２時間後に、上記粒子を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で１０回洗浄し（各回３０〜５０ｍｌの液量）、次にアセトンで４回洗浄し（各回３０〜５０ｍｌの液量）、最後に水で４回洗浄した（各回３０〜５０ｍｌの液量）。チタン層は、ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によって、観察可能であった。
【０１３０】
＜実施例１０＞：
１．８ｇのビーズを、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、３５−６０ｍｌの液量／各回）。最終的な懸濁液を、３７．６４ｇの重量に調整した。
【０１３１】
１３．０５ｇのテトラエチルオルトチタネートを添加し、懸濁液を室温で２５０回転／分で撹拌した。９０分撹拌した後、６７０μｌの水を添加した。懸濁液を、更に２時間撹拌した。
【０１３２】
２時間後に、上記粒子を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で９回洗浄し（各回約１００ｍｌの液量）、次にイソプロパノールで４回洗浄した（各回約１００ｍｌの液量）。チタン層は、ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によって、観察可能であった。
【０１３３】
＜実施例１１＞：
１．８ｇのビーズを、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、３５−６０ｍｌの液量／各回）。最終的な懸濁液を、３７．６４ｇの重量に調整した。
【０１３４】
１９．４６ｇのテトラブチルオルトチタネートを添加し、懸濁液を室温で２５０回転／分で撹拌した。９０分撹拌した後、６７０μｌの水を添加した。懸濁液を、更に２時間撹拌した。
【０１３５】
２時間後に、上記粒子を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で９回洗浄し（各回約１００ｍｌの液量）、次にイソプロパノールで４回洗浄した（各回約１００ｍｌの液量）。チタン層は、ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によって、観察可能であった。
【０１３６】
＜実施例１２＞：
２．０ｇのビーズを、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、２５ｍｌの液量／各回）。粒子の乾燥成分を９．５重量％に調整し、テトラブチルオルトチタネート（１３．０ｇ）を添加した。室温で１時間混合物を撹拌した後、水（０．４５ｇ）を添加した。混合物を更に、室温で１８時間撹拌した。上記粒子を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で６回、水で５回洗浄した。チタン層は、ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によって、観察可能であった。
【０１３７】
＜実施例１３＞：
１．５ｇのビーズを、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、２０〜４０ｍｌの液量／各回）。最終的な懸濁液を、１８．８２ｇの重量に調整した。
【０１３８】
６．５２ｇのテトラブチルオルトチタネートを添加し、懸濁液を室温で２５０回転／分で撹拌した。９０分撹拌した後、３３０μｌのＨＮＯ３溶液（ｐＨ＝１）を添加した。懸濁液を、更に１８時間撹拌した。
【０１３９】
１８時間後に、上記粒子を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で９回洗浄し（各回約５０ｍｌの液量）、次にイソプロパノールで４回（約１０５０ｍｌの液量／各回）洗浄した。チタン層は、ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によって、観察可能であった。
【０１４０】
＜実施例１４＞：
１．５ｇのビーズを、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、２０〜４０ｍｌの液量／各回）。最終的な懸濁液を１８．８２ｇの重量に調整した。
【０１４１】
６．５２ｇのテトラブチルオルトチタネートを添加し、懸濁液を室温で２５０回転／分で撹拌した。９０分撹拌した後、３３０μｌのＮＨ４ＯＨ溶液（ｐＨ＝１１）を添加した。懸濁液を、更に１８時間撹拌した。
【０１４２】
１８時間後に、上記粒子を、２ビス（２−メトキシエチルエーテル）で９回洗浄し（各回約５０ｍｌの液量）、次にイソプロパノールで４回洗浄した（各回約５０ｍｌの液量）。チタン層は、ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によって、観察可能であった。
【０１４３】
＜実施例１５＞：
エポキシドでコーティングされ、カルボン酸で官能化されているビーズ１ｇを、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、２０〜４０ｍｌの液量／各回）。最終的な懸濁液を、１０．５５ｇの重量に調整した。
【０１４４】
６．５２ｇのテトラブチルオルトチタネートを添加し、懸濁液を室温で２５０回転／分で撹拌した。６０分撹拌した後、２２０μｌの水を添加した。懸濁液を、更に１８時間撹拌した。
【０１４５】
１８時間後に、上記粒子を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で５回洗浄し（各回約５０ｍｌの液量）、次に水で２０回洗浄した（各回約５０ｍｌの液量）。チタン層は、ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によって、観察可能であった。
【０１４６】
＜実施例１６＞：
４ｇのエポキシドコートされたビーズ（約３３５ｍｇのＦｅ含量／ｇ ＤＳ）を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、５０〜８０ｍｌの液量／各回）。最終的な懸濁液を、４２．２２ｇの重量に調整した。
【０１４７】
２５．９５ｇのテトラブチルオルトチタネートを添加し、懸濁液を室温で２５０回転／分で撹拌した。６０分撹拌した後、８９０μｌの水を添加した。懸濁液を、更に１８時間撹拌した。
【０１４８】
１８時間後に、上記粒子を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で５回洗浄し（各回約８０ｍｌの液量）、次に水で５回洗浄した（各回約８０ｍｌの液量）。チタン層は、ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によって、観察可能であった。
【０１４９】
＜実施例１７＞：
エポキシコートされたビーズ２．０ｇ（約４３５ｍｇのＦｅ含量／ｇ ＤＳ）を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、２５ｍｌの液量／各回）。粒子の乾燥成分を９．５重量％に調整し、テトラブチルオルトチタネート（１３．０ｇ）を添加した。室温で１時間混合物を撹拌した後、水（０．４５ｇ）を添加した。混合物を更に、室温で１８時間撹拌した。上記粒子を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で６回洗浄し、水で７回洗浄した。チタン層は、ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によって、観察可能であった。
【０１５０】
＜実施例１８＞：
２．０ｇのダイナビーズ（登録商標）ＲＰＣ １８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌ ＡＳ社製、オスロ、ノルウェー）を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、２５ｍｌの液量／各回）。粒子の乾燥成分を、１１．７重量％に調整した。テトラブチルオルトチタネート（１３．０ｇ）続いてビス（２−メトキシエチルエーテル）（４．０ｇ）を添加した。室温で、２５０回転／分で１時間混合物を撹拌した後、水（０．４５ｇ）を添加した。混合物を更に、室温で１８時間撹拌した。上記粒子を、５０ｍｌのビス（２−メトキシエチルエーテル）で６回洗浄し、５０ｍｌの水で７０回洗浄した。チタン層は、ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によって、観察可能であった。
【０１５１】
＜実施例１９＞：
２．５ｇのダイナビーズ（登録商標）ＲＰＣプロテイン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌ ＡＳ社製、オスロ、ノルウェー）を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、３０ｍｌの液量／各回）。粒子の乾燥成分を、１１．７重量％に調整した。テトラブチルオルトチタネート（１６．２ｇ）、続いてビス（２−メトキシエチルエーテル）（５．０ｇ）を添加した。室温で、２５０回転／分で１時間混合物を撹拌した後、水（０．５６ｇ）を添加した。混合物を更に、室温で１８時間撹拌した。上記粒子を、５０ｍｌのビス（２−メトキシエチルエーテル）で１０回、５０ｍｌの水で２０回洗浄した。チタン層は、ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によって、観察可能であった。
【０１５２】
＜本発明の粒子の、バイオセパレーションへの応用＞：
＜核酸の単離＞：
使用した一般的なプロトコル及び材料：
＜核酸の供給源＞：
ｄｓＤＮＡ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、ＣＡ、米国から市販されている ＨｉｎｄＩＩＩ λ−ＤＮＡラダー
ＲＮＡ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、ＣＡ、米国から市販されている ０．２４−９．５Ｋｂ ＲＮＡラダー
【０１５３】
＜使用する市販の緩衝液及び溶液＞：
（＊） ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ単離キット、Ａｍｂｉｏｎ（ＴＸ、米国）社製。
（＊＊）ＤＮＡ ＤＩＲＥＣＴ（商標）Ｂｌｏｏｄキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌ ＡＳ（オスロ、ノルウェー）社製。
（＊＊＊）ＤＮＡ ＤＩＲＥＣＴ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌ ＡＳ（オスロ、ノルウェー）社製。
（＊＊＊＊）ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ（登録商標）Ｖｉｒｕｓ Ｍｉｎｉ Ｍ４８キット、Ｑｉａｇｅｎ（ＣＡ、米国）社製。
（＊＊＊＊＊）ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄキット、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社 ＧｍｂＨ（マンハイム、ドイツ）社製。
（＊＊＊＊＊＊）ダイナビーズ（登録商標）ｇＤＮＡ Ｓｉｌａｎｅキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌ ＡＳ（オスロ、ノルウェー）社製。
【０１５４】
ＲＮＡ及びｄｓＤＮＡの収率は、分光測光法による分析、及び臭化エチジウム染色したアガロースゲル電気泳動により測定した。
【０１５５】
＜実施例２０＞：
＜二酸化チタン（実施例１０）及び二酸化ジルコニウム（実施例２）磁性ビーズを使用した、血清からの二重鎖ＤＮＡの精製＞：
自動化システムにおいて、ｄｓＤＮＡと結合し、溶出させる、二酸化チタン及び二酸化ジルコニウム磁性ビーズの能力を示す試験において、１００μｌの血清、１００μｌのプロテインキナーゼＫ、１５０μｌの１００％イソプロパノール及び３００μｌのグアニジンチオシアネートを含有する溶解／結合溶液（＊）を含んでなるチューブ中で、合計５μｇのｄｓＤＮＡを、実施例２又は１０に係るビーズ２ｍｇに添加した。上記溶液を、一定速度で混合しながら室温で１０分間インキュベートした。磁場中でビーズを回収した後、上清を除去した。ビーズのペレットを次に、グアニジンチオシアネート及びイソプロパノールを含んでなる溶液（＊）８５０μｌで洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、上清をビーズから除去した。ビーズのペレットを次に、エタノールを含んでなる溶液（＊）４５０μｌで２回洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。ビーズ溶液を一定速度で混合しながら８０℃で１０分間加熱することによって、１００μｌ溶出緩衝液（＊）中にｄｓＤＮＡを溶出させた。ビーズを磁場中で回収し、溶出されたｄｓＤＮＡを含んでなる上清をビーズから除去し、新しいチューブに移した。ｄｓＤＮＡの収率を図１及びテーブル１に示す。
【０１５６】
（表１）チタンおよびジルコニウムを有する磁性ビーズを用いて血清から単離した、添加ｄｓＤＮＡ ５μｇの収率
【０１５７】
＜実施例２１＞：
＜二酸化チタン（実施例１０）及び二酸化ジルコニウム（実施例２）磁性ビーズを使用した、血清からのＲＮＡの精製＞：
自動化システムにおいて、ＲＮＡと結合し、溶出させる、二酸化チタン及び二酸化ジルコニウム磁性ビーズの能力を示す試験において、１００μｌの血清、１００μｌのプロテインキナーゼＫ、１５０μｌの１００％イソプロパノール及び３００μｌのグアニジンチオシアネートを含有する溶解／結合溶液（＊）を含んでなるチューブ中で、合計５μｇのＲＮＡを、実施例２又は１０に係るビーズ２ｍｇに添加した。上記溶液を、絶えず混合しながら室温で１０分間インキュベートした。磁場中でビーズを回収した後、上清を除去した。ビーズのペレットを次に、グアニジンチオシアネート及びイソプロパノールを含んでなる溶液（＊）８５０μｌで洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。ビーズのペレットを次に、エタノールを含んでなる溶液（＊）４５０μｌで２回洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。ビーズ溶液を絶えず混合しながら８０℃で１０分間加熱することによって、１００μｌ溶出緩衝液（＊）中にＲＮＡを溶出させた。ビーズを磁場中で回収し、溶出されたＲＮＡを含んでなる上清をビーズから除去し、新しいチューブに移した。ＲＮＡの収率を図２及びテーブル２に示す。
【０１５８】
（表２）チタンおよびジルコニウムを有する磁性ビーズを用いて血清から単離した、添加ＲＮＡ ５μｇの収率
【０１５９】
＜実施例２２＞：
＜二酸化ジルコニウム磁性ビーズ（実施例２）を使用した、血清からの核酸の精製＞：
自動化システムにおいて、ＲＮＡ及びＤＮＡと結合し、溶出させる、二酸化ジルコニウム磁性ビーズの能力を示す試験において、１００μｌの血清、１００μｌのプロテインキナーゼＫ、１５０μｌの１００％イソプロパノール、及び３００μｌの、４〜６Ｍのグアニジンチオシアネート、１０〜２０％のトリトンＸ−１００、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６〜８）を含む溶解／結合溶液を含んでなるチューブ中で、合計５μｇのＲＮＡ及び５μｇのｄｓＤＮＡを、２ｍｇのビーズに添加した。上記溶液を、絶えず混合しながら室温で１０分間インキュベートした。磁場中でビーズを回収した後、上清を除去した。ビーズのペレットを次に、グアニジンチオシアネート及びイソプロパノールを含んでなる溶液（＊）８５０μｌで洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。ビーズのペレットを次に、エタノールを含んでなる溶液（＊）４５０μｌで２回洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。ビーズ溶液を絶えず混合しながら８０℃で１０分間加熱することによって、１００μｌ溶出緩衝液（＊）中にＲＮＡを溶出させた。ビーズを磁場中で回収し、溶出された核酸を含んでなる上清をビーズから除去し、新しいチューブに移した。核酸の収率を図３及びテーブル３に示す。
【０１６０】
（表３）ジルコニウムを有する磁性ビーズを用いて血清から単離した、添加核酸５μｇの収率
【０１６１】
＜実施例２３＞：
＜二酸化ジルコニウム磁性ビーズ（実施例１）を使用した、血清からの二重鎖ＤＮＡの精製＞：
ｄｓＤＮＡと結合し、溶出させる、二酸化ジルコニウム磁性ビーズの能力を示す試験において、１００μｌの血清及びグアニジンチオシアネートを含む８００μｌの溶解／結合溶液（＊）を含んでなるチューブ中で、合計５μｇのｄｓＤＮＡを、２ｍｇのビーズに添加した。上記溶液を、４分間慎重にボルテックスした。磁場中でビーズを回収した後、上清を除去した。ビーズのペレットを次に、グアニジンチオシアネート及びイソプロパノールを含んでなる溶液（＊）４００μｌで２回洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。ビーズのペレットを次に、エタノールを含んでなる溶液（＊）４００μｌで２回洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。ビーズのペレットを２分間空気乾燥し、次にビーズ溶液を７０℃で３分間加熱することによって、１００μｌの溶出緩衝液（＊）中にｄｓＤＮＡを溶出させた。ビーズを磁場中で回収し、溶出されたｄｓＤＮＡを含んでなる上清をビーズから除去し、新しいチューブに移した。ｄｓＤＮＡの収率を図４及びテーブル４に示す。
【０１６２】
（表４）ジルコニウムを有する磁性ビーズを用いて血清から単離した、添加ｄｓＤＮＡ ５μｇの収率
【０１６３】
＜実施例２４＞：
＜二酸化チタン磁性ビーズ（実施例９）を使用した、血清からの二重鎖ＤＮＡの精製＞：
ｄｓＤＮＡと結合し、溶出させる、二酸化チタン磁性ビーズの能力を示す試験において、ｄｓＤＮＡ量を増加させて（２．５、５、１５及び２０μｇ）、１００μｌの血清及びグアニジンチオシアネートを含む８００μｌの溶解／結合溶液（＊）を含んでなるチューブ中で、２ｍｇのビーズに添加した。上記溶液を、４分間慎重にボルテックスした。磁場中でビーズを回収した後、上清を除去した。ビーズのペレットを次に、グアニジンチオシアネート及びイソプロパノールを含んでなる溶液（＊）４００μｌで２回洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。ビーズのペレットを次に、エタノールを含んでなる溶液（＊）４００μｌで２回洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。ビーズのペレットを２分間空気乾燥し、次にビーズ溶液を７０℃で３分間加熱することによって、１００μｌの溶出緩衝液（＊）中にｄｓＤＮＡを溶出させた。ビーズを磁場中で回収し、溶出されたｄｓＤＮＡを含んでなる上清をビーズから除去し、新しいチューブに移した。ｄｓＤＮＡの収率を図５及びテーブル５に示す。
【０１６４】
（表５）チタンを有する磁性ビーズを用いて血清から単離した、増加量の添加ｄｓＤＮＡの収率
【０１６５】
＜実施例２５＞：
＜二酸化チタン（実施例９及び実施例１０）及び二酸化ジルコニウム（実施例１及び実施例２）磁性ビーズを使用した、血液からのゲノムＤＮＡの精製＞：
試験によって、ゲノムＤＮＡと結合し、溶出させる、二酸化チタン及び二酸化ジルコニウム磁性ビーズの能力を証明した。１００μｌのＥＤＴＡ血液に、１ｍｌのＲｅｄ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ緩衝液（＊＊）を添加した。上記溶液を、ローラー上で、室温で５分間インキュベートした。白血球を１４０００回転／分で遠心分離してペレット状にし、上清を除去した。０．５ｍｇのビーズを、キット（＊＊）中のビーズを含めずに、２００μｌの溶解／結合緩衝液と共に添加した。ビーズ懸濁液を更に混合せず、室温で５分間静置した。ビーズのペレットを次に、ペレットを再懸濁させずに、１ｍｌの１×洗浄緩衝液（＊＊）で慎重に洗浄した。磁場中でビーズを回収した後、上清を除去した。洗浄段階を２回繰り返した。ビーズのペレットに、１００μｌの再懸濁緩衝液（＊＊）を添加し、ビーズをピペッティングにより再懸濁した。ビーズ懸濁液を、６５℃で５分間加熱した。ビーズ懸濁液をピペッティングにより混合し、磁場中でビーズを回収した。上清を新しいチューブに移した。単離されたゲノムＤＮＡの、臭化エチジウム染色したアガロースゲル上での分析結果を図６に示す。
【０１６６】
＜実施例２６＞：
＜二酸化チタン（実施例９及び実施例１０）及び二酸化ジルコニウム（実施例１及び実施例２）磁性ビーズを使用した、血液からのゲノムＤＮＡの精製＞：
試験によって、ゲノムＤＮＡと結合し、溶出させる、二酸化チタン及び二酸化ジルコニウム磁性ビーズの能力を証明した。１０μｌのＥＤＴＡ血液に、キット（＊＊＊）のビーズを含めずに、２００μｌの溶解／結合緩衝液と共に、０．５ｍｇのビーズを添加した。ビーズの懸濁液を更に混合せず、室温で５分間静置した。ビーズのペレットを次に、ペレットを再懸濁させずに、２００μｌの１×洗浄緩衝液（＊＊＊）で慎重に洗浄した。磁場中でビーズを回収した後、上清を除去した。洗浄段階を１回繰り返した。ビーズのペレットに、２０μｌの再懸濁緩衝液（＊＊＊）を添加し、ビーズをピペッティングによって再懸濁させた。ビーズ懸濁液を、６５℃で５分間加熱した。ビーズ懸濁液をピペッティングにより混合し、磁場中でビーズを回収した。上清を新しいチューブに移した。単離されたゲノムＤＮＡの、臭化エチジウム染色したアガロースゲル上での分析結果を図７に示す。
【０１６７】
＜実施例２７＞：
＜二酸化チタン（例１２及び実施例１７）を使用した、血液からのゲノムＤＮＡの精製＞：
５０μｌプロテインキナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を、３５０μｌの血液に添加し、混合し、室温で２分間インキュベートした。溶解緩衝液（＊＊＊＊＊＊）を３５０μｌ添加し、混合した。５５℃で１０分間インキュベートした後に、２．０ｍｇのビーズを添加し、サンプルと混合した。４００μｌのイソプロパノールを添加し、ビーズ及びサンプルと混合し、ローラー上で３分間インキュベートした。ビーズを磁場中で回収し、上清を除去した。その後、ビーズを１ｍｌの洗浄緩衝液１（＊＊＊＊＊＊）で２回洗浄した。ビーズのペレットを、１ｍｌの洗浄緩衝液２（＊＊＊＊＊＊）中に再懸濁し、新しいチューブに移した。ビーズを磁場中で回収し、上清を除去し、最後に１ｍｌの洗浄緩衝液２（＊＊＊＊＊＊）でビーズを洗浄した。ビーズをペレット状にし、上清を除去した後、５〜１０分間空気乾燥した。１００μｌ溶出緩衝液（＊＊＊＊＊＊）を添加し、ビーズ懸濁液をピペッティングにより混合し、次に磁場中でビーズを回収した。溶出されたＤＮＡを含有する上清を、新しいチューブに移した。単離されたゲノムＤＮＡの、臭化エチジウム染色したアガロースゲル上での分析結果を図８に示す。
【０１６８】
＜実施例２８＞：
＜二酸化チタン（実施例９）磁性ビーズ及び異なる緩衝液組成を使用した、血清から二重鎖ＤＮＡの精製＞：
二酸化チタンが、ｄｓＤＮＡと結合し、溶出するためには、特定の緩衝液組成を必要とすることを証明する試験において、磁性シリカベースのビーズを含んでなる２つの異なる市販キットを用いた。キット中の磁性ビーズを実施例９の二酸化チタン磁性ビーズで置き換えてプロトコルを実施した。第１のプロトコルは、１００μｌの血清、１３０μｌの溶解ＡＬ緩衝液（＊＊＊＊）及び２０μｌのプロテイナーゼ（＊＊＊＊）中に、合計５μｇのｄｓＤＮＡを添加することにより実施した。これを５６℃で１５分間インキュベートした。実施例９の２ｍｇのビーズと、１３０μｌの１００％イソプロパノールとを混合物に添加し、一定速度で混合しながら室温で１０分間インキュベートした。磁場中でビーズを回収した後、上清を除去した。ビーズのペレットを次に、４００μｌのＡＷ１（＊＊＊＊）で洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。ビーズのペレットを次に、４００μｌのＡＷ２（＊＊＊＊）で洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。ビーズのペレットを次に、４００μｌの９６％エタノールで洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。１００μｌ溶出緩衝液（＊＊＊＊）中にｄｓＤＮＡを溶出させた。ビーズを磁場中で回収し、溶出されたｄｓＤＮＡを含んでなる上清をビーズから除去し、新しいチューブに移した。
【０１６９】
第２のプロトコルは、１００μｌの血清、１００μｌのプロテインキナーゼＫ（＊＊＊＊＊）、１５０μｌの１００％イソプロパノール及び３００μｌの溶解／結合緩衝液（＊＊＊＊＊）を含んでなるチューブ中で、２ｍｇの実施例９のビーズに、合計５μｇのｄｓＤＮＡを添加することにより実施した。これを一定速度で混合しながら、室温で１０分間インキュベートした。磁場中でビーズを回収した後、上清を除去した。ビーズのペレットを次に、８５０μｌの洗浄緩衝液Ｉ（＊＊＊＊＊）で洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。ビーズのペレットを次に、４５０μｌの洗浄緩衝液ＩＩ（＊＊＊＊＊）で洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。ビーズのペレットを次に、４５０μｌの洗浄緩衝液ＩＩＩ（＊＊＊＊＊）で洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。１００μｌ溶出緩衝液（＊＊＊＊＊）中にｄｓＤＮＡを溶出させた。ビーズを磁場中で回収し、溶出されたｄｓＤＮＡを含んでなる上清をビーズから除去し、新しいチューブに移した。
【０１７０】
結果を図９に示す。
【０１７１】
＜リン酸化タンパク質の単離＞：
＜実施例２９＞：
リン酸化ペプチドの標準混合物［アンジオテンシンＩＩ（ＤＲＶＹＩＨＰＦ、１０４６．５４）、アンジオテンシンＩ（ＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬ、１２９６．８８）、ミエリン塩基性タンパク質断片１０４−１１８（ＧＫＧＲＧＬＳＬＳＲＦＳＷＧＡ、１５７８．８５）、ｐＴｐＹペプチド（ＭＡＰキナーゼ断片１７７−１８９、ＤＨＴＧＦＬｐＴＥｐＹＶＡＴＲ、１６６９．６７）、ｐＹペプチド（インシュリン受容体断片１１４２−１１５３（ＴＲＤＩｐＹＥＴＤＹＹＲＫ、１７０２．７５））、ｐＴペプチド（ＶＰＩＰＧＲＦＤＲＲＶｐＴＶＥ、１７２０．８９）、ｐＳペプチド（ＲＩＩリン酸化ペプチド断片８１−９９、ＤＬＤＶＰＩＰＧＲＦＤＲＲＶｐＳＶＡＡＥ、２１９２．０８）］を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（ＣＡ、米国）から購入した。
【０１７２】
上記リン酸化ペプチド標準混合物を、ｉＴＲＡＱ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＣＡ、米国）１１４、１１５、１１６又は１１７を用いて、製造業者の指示に従い、アイソトープ標識した。
【０１７３】
ｉＴＲＡＱで標識したペプチド（２ｐｍｏｌ／μｌストックを５μｌ）のアリコートを、５０％の酢酸２μｌで酸性化し、３６μｌの結合緩衝液（０．１％のＴＦＡ又は３００ｍｇ／ｍｌのＤＨＢ／８０％のアセトニトリル／０．１％のＴＦＡ）で希釈し、次に、５０ｍｇ／ｍｌの実施例９のビーズの８μｌと１０分間インキュベートするか、又は、それらを、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）２０ＭＣ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ＣＡ、米国）（約３ｍｍのパッキング長）若しくはＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ（トランス、ＣＡ）から購入した二酸化チタン球体でプレパックされたＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）ＧＥＬｏａｄｅｒ（登録商標）ｔｉｐ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ社、ハンブルグ、ドイツ）を通過させ、リン酸化ペプチド濃縮の相対的な効率を比較した。
【０１７４】
十分に洗浄（０．１％のＴＦＡ中の、８０％のアセトニトリル）した後、リン酸化ペプチドを、溶出緩衝液（０．３Ｎ水酸化アンモニウム中の、５０ｍＭのフェニルリン酸ナトリウム）１０μｌを用いて溶出させた。
【０１７５】
量的な捕捉効率（２つの異なる親和性化合物及び２つの異なる支持体により単離されたリン酸化ペプチド）を比較するため、溶出された材料を、５０％酢酸４μｌと混合して酸性化し、続いてセルフパックのＰｏｒｏｓ（登録商標）Ｒ２ ｔｉｐカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ＣＡ、米国）で脱塩した。リン酸化ペプチドをＭＡＬＤＩプレート上に直接溶出させ、ＣＨＣＡ（α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸）マトリックスと１：１の比率で混合し、４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ＣＡ．米国）を使用して分析した。
【０１７６】
サンプル分析の前に、ＣＩＤ ｇａｓセルをパージし、アイソトープ比率がレポーターイオンの範囲内で安定化するようにした。合計１４，０００のレーザーショットを用い、フラグメントイオンのシグナルを平均化した。ＭＳ／ＭＳ（タンデムＭＳ）スペクトルのレポーターイオンの強度比率を調べることにより、マニュアル操作により定量化を実施した。
【０１７７】
得られた結果を図１０ＡからＤに示す。円で印を付けたピークは、混入物質のピークである。ＤＨＢの存在が、二酸化チタン球体を使用したリン酸化ペプチドの特異的な濃縮の最適化にとり重要であることは、明らかである。対照的に、ＤＨＢの存在は、実施例９の磁性二酸化チタンでコートされた「ダイナビーズ−ＴｉＯ２」粒子を使用した濃縮の特異性にはほとんど影響を及ぼさなかった。更に、本発明の粒子の単離性能は、二酸化チタン粒子を使用したいかなる比較単離例よりも良好であった。
【０１７８】
＜実施例３０＞：
ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％のＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＣＡ．米国）を含むＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＣＡ．米国）で維持した。ＳＩＬＡＣ標識のために、ＨｅＬａ細胞のアリコートを、１０％の透析後ＦＢＳを含有し、軽Ｌ−リジン及び軽Ｌ−アルギニン（軽培地）、又は、重［Ｕ−１３Ｃ６］Ｌ−リジン及び重［Ｕ−１３Ｃ６、１５Ｎ４］Ｌ−アルギニン（重培地）で補充した、ＳＩＬＡＣ ＤＭＥＭ培地中で、少なくとも６回の倍加期間（約１０日）にわたり増殖させた。対応する血清フリーの軽又は重培地で一晩飢餓状態に置いた後、重培地（５０×１０６細胞）で標識したＨｅＬａ細胞を、１５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで５分間刺激し、一方、軽培地（５０×１０６細胞）で標識したＨｅＬａ細胞は無処理のままにした。刺激の後、重培地で標識した細胞と、軽培地で標識した細胞とを、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ−４０、０．１％のデオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１０ｍＭのＮａＦ及びプロテアーゼ阻害剤カクテルを含んでなる、ＮＰ−４０溶解緩衝液中で直ちに溶解させた。
【０１７９】
細胞可溶化物を１００，０００×ｇで１５分間遠心分離して透明にし、混合された細胞可溶化物を、ダイナビーズにコンジュゲートしたホスホチロシン抗体（ＰＹ−Ｐｌｕｓ）又はアガロースビーズにコンジュゲートした４Ｇ１０ホスホチロシン抗体約５０μｇを用いて免疫沈降させた。４℃で２時間穏やかに回転させて混合した後、ダイナビーズを磁石により捕捉し、一方、アガロースビーズは遠心分離により回収した。ビーズを溶解緩衝液で５回洗浄し、次に１００ｍＭのグリシン（ｐＨ２．５）５０μｌで溶出させた。溶出液を、１Ｍトリスで中和し、１０ｍＭのＤＴＴで還元し、１×ＳＤＳサンプルバッファー中の３０ｍＭヨードアセトアミドによってアルキル化し、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離させた。タンパク質のバンドをゲルから切り出し、ゲルをトリプシン消化した。ペプチド抽出物を、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃを使用して乾燥させた。
【０１８０】
抽出液を、２４μｌの結合緩衝液中で１０分間、実施例９の粒子２５０μｇとインキュベートし、リン酸化ペプチドを単離した。上記粒子を洗浄緩衝液で５回洗浄し、次に溶出緩衝液１０μｌにより溶出させた。溶出されたリン酸化ペプチドを５０％の酢酸２μｌによって酸性化し、次にセルフパックのＰｏｒｏｓＲ２ ｔｉｐカラムで脱塩し、続いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦを使用して分析した。
【０１８１】
図１１ａは、本発明の粒子とのインキュベート前の、抽出液の典型的なＭＳを示す。図１１ｂは、インキュベート後の、同じ抽出液のＭＳを示す。そのスペクトルは非常に単純化されており、捕捉されたリン酸化ペプチドの同定が容易であった。２３２２．１のピークが、ＥＧＦＲに由来する、重い１３Ｃ６−Ｌｙｓ−標識リン酸化ペプチドＧＳＨＱＩＳＬＤＮＰＤｐＹＱＱＤＦＦＰＫと同定された。
【０１８２】
試験の結果は、特異的な残基におけるリン酸化レベルの定量化が実施可能であることを示すものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遷移金属酸化物、特にチタン及びジルコニウムの酸化物によってコーティングされた磁性ポリマー粒子、及びその製造方法に関する。本発明は更に、精製、抽出、捕捉、アッセイ又は合成用の特異的な緩衝液との組み合わせによる、上記コーティングされた磁性ポリマー粒子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
磁性粒子は、様々な医療分野、生化学分野及び環境分野において全般的な有用性を発揮し、例えば医薬製品の送達用、診断若しくは分析用、分析対象物の分離用、及び合成用の輸送担体として有用である。かかる粒子は、これらの機能を発揮するために、その磁性特性に依存する。例えば、アッセイにおいては、特に粒子に結合する分析物を含んでなるサンプルに対する磁場の印加により、遠心分離又は濾過を用いることのない、分析物の単離が可能となる。
【０００３】
本明細書において、磁性とは、上記ポリマー粒子が磁場によって吸引されることを意味する。典型的には、かかるポリマー粒子は強磁性結晶、超常磁性結晶又はそれらの混合物を含む。
【０００４】
磁性ポリマー粒子は公知で、例えば、その内容が参照により本明細書に組み入れられるＵＳ−Ａ−４，６５４，２６７（Ｕｇｅｌｓｔａｄ）（特許文献１）に記載の方法で調製できる。これらの方法により、同程度のサイズ（単分散）であり、且つ均一な磁性特性を有する磁性ポリマー粒子が提供される。
【０００５】
これらの粒子の表面は容易に官能化されて様々な基を担持することができ、それを用いて、サンプル中の分析物に親和性リガンドを結合させることができる。例えば、ストレプトアビジンを担持するために修飾されたビーズが公知である。しかしながら当業者は、ポリマー粒子を修飾して、非リガンドベースの、様々な迅速な吸着手順へそれらを応用できるようにするため、更なる方法を探究している。
【０００６】
それらの寿命を短くし潜在的にサンプルを汚染する、ポリマー粒子からの磁性結晶の浸出という公知の問題点を最小化するため、ＵＳ−Ａ−４，６５４，２６７（特許文献１）は、Ｆｅイオンをポリマー粒子に吸引するのに有用な表面官能基を有する、ポリマー粒子の使用を提案している。これらの官能基は、ポリマー粒子の調製において官能化コモノマーを使用することにより、又は、ポリマー粒子の重合後の、例えば粒子表面上の既存の基のカップリング又は変換処理による、官能基導入により得られる。
【０００７】
ＵＳ−Ａ−４，６５４，２６７（特許文献１）では、浸出の量を減少させる技術を開示しているが、それでもポリマー粒子からの超常磁性結晶の若干の浸出は生じる。更に、Ｆｅイオンを吸引する特定の表層官能基の使用により、ポリマー粒子に付与できる表層官能性の特性を著しく制限することとなる。これにより、（例えばリガンドによる）粒子の更なる官能化をより困難にする。すなわち、粒子の多用性は減り、ポリマー粒子が使用可能な用途の範囲は制限される。
【０００８】
発明者らは驚くべきことに、浸出の問題を見出し、並びに、少なくとも１つの遷移金属酸化物から形成されるコーティングを有する、任意に多孔性の、任意に磁性を有するポリマー微粒子により、代替的に官能化されたポリマー粒子が提供されることを見出した。遷移金属酸化物コーティングの存在が、浸出の潜在的課題を最小にするだけでなく、遷移金属酸化物コーティングの使用によって、ポリマー粒子が生物高分子に容易に結合できるようになり、それにより当該粒子はアッセイ手順において非常に貴重なものとなる。
【０００９】
金属酸化物コーティングを有する磁性粒子は、それ自体は新規でない。Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ ２００５、７７、５９１２−５９１９（非特許文献１）においては、酸化鉄（ＩＩＩ）／チタニアのコアシェル型のナノ粒子が記載されており、リンペプチド分析用の親和性プローブとしての用途が示唆されている。
【００１０】
また、核酸と結合する金属酸化物の使用も新規ではない。ＵＳ ６，３８３，３９３（特許文献２）は、クロマトグラフィによる、核酸混合物の精製方法及び単離方法を記載している。核酸混合物は、カラム上の金属酸化物基質に吸着される。ＵＳ ５，０５７，４２６（特許文献３）は同様の開示をしており、金属酸化物マトリックスを用いて核酸を結合させている。しかしながらこれらの開示は、クロマトグラフカラムに関するものであり、ポリマー粒子に関するものでは全くない。
【００１１】
ＵＳ ６，９１４，１３７（特許文献４）は、プレートを形成する際にプラスチック中に粉末として導入されたチタン酸化物を含んでなるポリスチレンマイクロタイタープレートを使用した、ＤＮＡの単離方法を記載している。
【００１２】
酸化チタンでコーティングされた粒子もまた公知である。Ｇｕｏら、Ｏｐｔｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２２（２００３），３９−４４（非特許文献２）では、濃厚なポリスチレン、酸化鉄（ＩＩＩ）のコアがチタニアでコーティングされている、コアシェル粒子を記載している。しかしながらこれらの粒子は、本発明の磁性多孔性粒子とは大幅に異なる。Ｇｕｏのポリスチレン／鉄のコアは高密度且つ非多孔性の材料であり、ゆえに、上記の浸出の課題は、Ｇｕｏが直面していたものでない。更に、生体分子の単離へのかかる粒子の使用に関する示唆は存在しない。Ｇｕｏらの粒子のＩＲスペクトル（その図３に記載）は、それらがごくわずかな鉄しか含有しないことを示している。また、その図７においては、その著者らが、磁石上における１５分間のインキュベーションの後に、粒子の約９０％を回収したことが示されている。
【００１３】
更に、その図２においては、当該粒子は広い粒度分布を有し、ゆえに単分散でないことが示されている。したがって、生物高分子の単離へのかかる粒子の使用は、当該標的の多くが、１５分間のインキュベーション時間の後でさえも磁石に吸引されない小さい粒子と結合して失われるため、好ましくない。また、その図１に示されるように、当該粒子は非常に凝集性が高いため、生物分子の単離にとり更に不適当となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】ＵＳ−Ａ−４，６５４，２６７
【特許文献２】ＵＳ ６，３８３，３９３
【特許文献３】ＵＳ ５，０５７，４２６
【特許文献４】ＵＳ ６，９１４，１３７
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ ２００５，７７，５９１２−５９１９
【非特許文献２】Ｇｕｏら、Ｏｐｔｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２２（２００３），３９−４４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、遷移金属酸化物、特にチタン及びジルコニウムの酸化物によってコーティングされた磁性ポリマー粒子、及びその製造方法の提供に関する。本発明は更に、精製、抽出、捕捉、アッセイ又は合成用の特異的な緩衝液との組み合わせによる、上記コーティングされた磁性ポリマー粒子の使用の提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
以上より、本発明の第１の態様は、ポリスチレン又はポリアクリレートを含んでなる単分散ポリマー微粒子の提供に関し、前記微粒子は、少なくとも１つの遷移金属酸化物で形成されたコーティングを有する。
【００１８】
本発明の他の態様は、ポリスチレン又はポリアクリレートを含んでなる多孔性ポリマー微粒子の提供に関し、前記粒子は、少なくとも１つの遷移金属酸化物で形成されたコーティングを有する。
【００１９】
本発明の第２の態様は、上記のような粒子の調製方法の提供に関し、当該方法は、ポリスチレン又はポリアクリレートを含んでなる単分散且つ／又は多孔性のポリマー微粒子と、酸化物に変換されうる少なくとも１つの遷移金属化合物とを反応させるステップと、
例えば加熱及び／又は水の添加により遷移金属酸化物のコーティングを形成させるステップとを有してなる。
【００２０】
本発明の更なる態様は、生物高分子の単離への、これらの粒子の使用の提供に関する。
【００２１】
本発明のポリマー粒子は、周知のＵｇｅｌｓｔａｄタイプの工程を使用して膨張させたコアポリマーシード（ｓｅｅｄ）を含んでなる。本願では、「ビーズ」及び「粒子」の用語は同義的に用いられる。上記コアポリマーはポリアクリレートでもよいが、好ましくはポリスチレンから形成され、ゆえに、上記シードの材料は典型的には、直径０．１〜０．５ミクロンのオーダーのポリスチレン粒子である。周知のように、かかるコアは、重合が開始される前に、モノマー（通常は重合開始剤）を当該コア中に拡散させることによって、膨張させることができる。様々なモノマーが、この膨張工程において使用できる。好適なモノマーとしては、スチレン又はアクリレートモノマー、例えばメタクリレートが挙げられる。
【００２２】
本発明の粒子は、好ましくは多孔性である。上記粒子は、周知のように、製造工程の間、好ましくはポロゲン（ｐｏｒｏｇｅｎ）を用いて多孔性にされる。更に、ポリマー粒子の製造においては、立体安定性、特定の界面活性剤、無酸素条件などを使用することが公知である。
【００２３】
本発明で使用される上記粒子は、重合の前にモノマーでコア粒子を事前に膨張させる工程か、又は、短時間の当初モノマー膨張期間の後に、更なるモノマーを添加しながら重合を開始させる工程によって調製できる。
【００２４】
粒子形成の際、膨張段階で形成されるポリマーは、ポリスチレンホモポリマー又はアクリレートポリマー（例えばメタクリレート、グリシジルメタクリレート及びエチレングリコールジメタクリレートのポリマー）でもよいが、スチレンの共重合体がより好ましい。共重合体は、スチレンと共重合できるいかなるコモノマー、例えばジビニルベンゼン（ＤＶＢ）、アミノスチレン及びニトロスチレン、特にジビニルベンゼン）により形成されてもよい。
【００２５】
ゆえに、好ましくはこのポリマーは、例えばコモノマーとして架橋剤を取り込むことによって架橋される。好適な架橋剤としては、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）又はエチレングリコールジメタクリレートなどが挙げられる。ＤＶＢが好適である。必要となる架橋剤（例えばコモノマー）の適当量は当業者にとり周知であるが、典型的には３０〜８５％（モノマー重量に対する重量％）、例えば約５０重量％である。ゆえに好ましくは、本発明で使用するポリマー粒子は、架橋スチレンポリマー粒子（例えばスチレン−ジビニルベンゼンポリマー粒子）である。
【００２６】
本発明のポリマー粒子は好ましくは、遷移金属化合物によるコーティングの前に、表面が官能化されている。換言すれば、任意に活性化することによって、遷移金属化合物と反応又は相互作用して、例えば当該表面に当該化合物を共有結合させることのできる基を、ポリマー粒子の表面に提供するのが好ましい。上記の表面は好ましくは、例えばエチレンジアミンにより直接アミノ化することによって、又は、表面をニトロ化して更に当該ニトロ基をアミンに還元することによって、アミン官能化される。かかるアミン官能化された表面を準備することにより、遷移金属化合物との直接的な反応のための、又は、遷移金属化合物との反応の前における更なる官能化のための、理想的なテンプレートが提供される。例えば、上記表面は、ＷＯ０５／０１５２１６にて説明されるように、エポキシド又はジオール／イソシアネートとの反応によって官能化されうる。ヒドロキシ官能化された表面又はポリウレタン官能化された表面が得られる。エポキシドモノマーの性質を慎重に選択することによって、ビニル基を担持する表面を形成することもできる。
【００２７】
複数のコーティングを有するポリマー粒子では、それらが単層である場合と比較し、浸出が更に少ないことが示された。ゆえに好ましくは、本発明のポリマー粒子は、複数（例えば２つ又は３つ）のコーティングを含んでなる。同じでもよいが、好ましくは異なるコーティングが、本明細書に記載されるような少なくとも１つの遷移金属化合物により形成されていてもよい。あるいは、複数のコーティングのうちの１つのみ、好ましくは最外部のコーティングが、少なくとも１つの遷移金属化合物で形成されていてもよい。この後者の場合、存在する他のコーティングは、いかなる従来公知のコーティング材料から形成されてもよく、例えばエポキシド系コーティング、ポリウレタンコーティング、又はアルコキシ基などを含むシランから形成されるコーティングが使用される。
【００２８】
本発明のポリマー粒子は、好ましくは磁性を有する。本明細書において、磁性を有するとは、ポリマー粒子が磁場によって吸引されうることを意味する。本発明のポリマー粒子は、好ましくは常磁性、非超常磁性又は超常磁性の結晶を含んでなる。常磁性粒子は、わずかな残留磁気特性を示す。非超常磁性結晶は、磁場への曝露の後、磁場がない状態で当該材料が残留磁気を有しなければならないという意味で、残留磁気特性を有する。超常磁性ポリマー粒子は、磁気的に変位可能であるが、永久に磁化可能ではない。これは、上記粒子が、磁石への曝露の後、凝固又は凝集を生じさせることなく、溶液中で懸濁又は分散されうることを意味する。磁性結晶は、ポリマー粒子の内部及び／又は表面において、磁性結晶の形態で分布されうる、いかなる材料であってもよい。磁性酸化鉄、例えば磁鉄鉱又はマグネマイトが好適であるが、しかしながら、当該結晶は必要に応じて金属酸化物の混合物又は他の磁性材料であってもよい。超常磁性結晶は典型的には直径５〜１５ｎｍ、例えば約７ｎｍであり、一方、非超常磁性（熱によりブロックされる）酸化鉄の結晶は、典型的にはそれより若干大きい。
【００２９】
本発明の磁性ポリマー粒子は好ましくは多孔性であり、これによって、大量の磁性結晶をその中に堆積させることができる。存在する上記結晶質の磁性材料の合計量は、通常１重量％超、好ましくは３重量％超、より好ましくは５重量％以上、例えば１０重量％以上である。存在する上記結晶質の磁性材料の合計量は、最高５０重量％、好ましくは最高４０重量％であってもよい。上記のパーセンテージは、コーティングされた粒子の全乾燥重量に対する、Ｆｅの重量（又は酸化鉄以外の磁性材料の場合、それと同等の金属）として算出される。
【００３０】
本発明に係るポリマー粒子は微粒子であって、一般に０．２〜１００μｍ、例えば０．２〜１０μｍ、好ましくは０．５〜５μｍ、特に０．８〜１．２μｍの範囲のサイズ（すなわち直径）である。
【００３１】
本発明の粒子に何らかのタイプのコーティング（金属酸化物コーティングか、又は他のコーティング、例えばエポキシド系）を施す前においては、本発明で用いられる表層官能化ポリマー粒子は、２．７μｍの平均粒子直径で補正した（すなわち表面積を２．７／ＭＤで乗算した（ＭＤは平均直径（μｍ）である））ときに、典型的には少なくとも１５ｍ２／ｇ（ＢＥＴ窒素吸着法で測定）、より好ましくは少なくとも３０ｍ２／ｇ、例えば最高７００ｍ２／ｇの表面積を有する。
【００３２】
本発明のポリマー粒子は、単分散性である。典型的には、上記ポリマー粒子は、それらがコーティングされる前に球形且つ単分散性であり、特に好ましくは、それらがコーティングされた後も球形且つ単分散性のままである。かかる粒子は、非単分散性の粒子よりも、バッチ間の変動が少なく、好適には、それらの使用によるデータの再現性及び信頼性が改善される。かかる再現性は、特に粒子ベースのアッセイにおいて重要であり、例えば診断技術への本発明のポリマー粒子の使用が可能となる。
【００３３】
単分散性とは、複数（例えば少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１０００、特に好ましくは実質的に全て）の粒子の場合、当該粒子が２０％未満、例えば１５％未満、好ましくは１２％未満、より好ましくは１１％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは約８％以下、例えば２〜５％の変動係数（ＣＶ）を示すことを意味する。ＣＶは、
ＣＶ＝（１００×標準偏差）／平均
としてパーセンテージで算出され、式中、平均とは平均粒径であり、標準偏差とは粒径の標準偏差である。ＣＶは好ましくは、主モード（ｍａｉｎ ｍｏｄｅ）上で、すなわち単峰性の分布曲線を検出された粒度分布にフィットさせることにより、算出される。すなわち、モード径より小さい若しくは大きい粒子は、上記の算出においては計測されず、例えば、全粒子（すなわち検出可能な粒子）数の約９０％をベースとして算出される。かかるＣＶの測定は、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＬＳ １３０粒径分析機を用いて実施できる。
【００３４】
本発明において特に有用なのが、商標「ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ」としてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌ ＡＳ（オスロ、ノルウェー）から市販されている磁性ポリマー粒子である。
【００３５】
ＷＯ０１／７０８２５にて開示されるように、一部アミノスチレンから調製される、ＷＯ９９／１９３７５（Ｄｙｎｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｒ ＡＳＡ社）及びＷＯ００／６１６４８（Ｄｙｎｏ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ＡＳ社）に記載のポリマー粒子が、特に好適であり、これらの内容は参照により本明細書に組み入れられる。ポリマー粒子の官能化は、重合反応の後、例えばニトロ化及びそれにより形成されたニトロ基のペンダントアミン基への還元により、又は、例えばアミノエタノール処理による直接のアミノ化により実施してもよい。また、ＷＯ００／６１６４７（Ｄｙｎｏ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ＡＳ社）において開示される、周知のＵｇｅｌｓｔａｄの２段階膨張工程及びその改良法により調製されるポリマー粒子を用いてもよい。また、ＷＯ９９／１９３７５及びＷＯ００／６１６４８において開示される方法で調製されるポリマー粒子を用いてもよい。これらの刊行物に記載の方法に従って調製される多孔性ポリマー粒子の孔に、例えば上記の標準的な技術によって、磁性粒子を堆積させてもよい。
【００３６】
これらの全ての方法のうち、アミノ担持ポリマー材料の調製における、コモノマーとしてのアミノスチレン、特に４−アミノスチレンの使用が好適である。このモノマー又はコモノマーの使用により、重合後のニトロ化及び還元反応が不要になる。更に、このプロセスにより、表面がより予測可能な性質（均質性）を有するようになるため、非常に信頼性が高いコーティングを塗布することが可能となる。
【００３７】
遷移金属化合物によるポリマー粒子のコーティング及びその後に形成される酸化物により、粒子表面上、及び任意にポリマー粒子の孔内に、酸化物の層が形成され、それによりこれらの孔がブロックされ、物理的にポリマー粒子中に磁性結晶が封入される。それにより、得られる「コーティング」された粒子は、出発材料よりも多孔性が減少するが、磁性材料が浸出する傾向が低い。
【００３８】
本発明においては、遷移金属酸化物とは、周期表の３〜１０族の金属、又はＡｌ若しくはＧａの酸化物を意味する。ゆえに、本発明のポリマー粒子をコーティングし、更に酸化物コーティングへ変換されるのに適切な遷移金属化合物は、周期表の３〜１０族の金属、Ａｌ又はＧａ、好ましくは４〜６族の金属又はＡｌ、特に好ましくは４族（Ｔｉ、Ｚｒ及びＨｆ）の金属又は５族（Ｖ、Ｎｂ又はＴａ）の金属である。極めて好ましくは、上記遷移金属化合物は、Ｎｂ、Ｔａ、チタン又はジルコニウムからなり、特にＺｒ又はＴｉからなる。
【００３９】
ポリマー粒子上のコーティングは、酸化物のコーティングである。好ましくは、これは目的の遷移金属の中で最も安定な酸化物である。極めて好ましいのは、上記ポリマー粒子は、酸化アルミニウム、二酸化チタン又は二酸化ジルコニウム、特にＴｉＯ２及びＺｒＯ２でコーティングされる。
【００４０】
遷移金属コーティングの形成は、化学蒸着法などの任意の簡便な方法によって実施してもよいが、好ましくはゾル−ゲル技術を使用して実施する。酸化物によるコーティング前の粒子表面は、官能化されていなくてもよいが、遷移金属化合物上のリガンドを置換できる反応基を担持させ、及び／又は、水素結合により更に安定化させるため、官能化させるのが好ましい。これにより、ポリマー粒子と遷移金属化合物との間での最初の相互作用が生じうる。簡便な方法としては、ビーズの表面に求核基、好ましくは酸素又は窒素含有基を担持させてもよい。またビーズ表面は、ホスホネート含有基を担持してもよい。すなわち、上記ビーズは、アミノ化、ヒドロキシル化、アミノヒドロキシル化、オキシム化されてもよく、又は、カルボン酸基又はアミノエタン酸基を担持してもよい。
【００４１】
理論に拘束されることは望ましくないが、遷移金属化合物の少なくとも１つの不安定な結合が、本明細書に記載のコーティング技術の成功にとり、きわめて重大であると考えられる。より具体的には、例えばポリマー粒子の表面上のアミン基との接触により、当該アミンと遷移金属化合物との間に結合又は他の相互作用が形成されると考えられる。
【００４２】
かかる遷移金属種が水（結合形成の副産物と考えられる）と接触するとき、遷移金属化合物上の結合は開裂反応を受け、ヒドロキシ基（例えば−ＴｉＯＨ）を形成しうる。この化合物は次に、更に水を放出しながら酸化物に変換される。すなわち、遷移金属化合物とビーズの最初の接触により、ポリマー粒子への遷移金属化合物の接着がなされ、その結果、例えばイオン性及び非イオン性相互作用などの相互作用を介してビーズ表面に保持される酸化物コーティングの形成がなされる。
【００４３】
ゆえにコーティングの形成は、ビーズと遷移金属との間で生じる相互作用又は反応の程度に、並びに、切断されうる遷移金属化合物の結合の数に、少なくとも部分的に依存しうる。本発明に用いられる好適な遷移金属化合物は、ポリマー粒子／水への曝露により切断されうる４つの結合を含んでなる。
【００４４】
ゆえに好適な遷移金属化合物は、ポリマー粒子表面と反応し、例えば加熱又は水との反応により酸化物へ容易に変換されうる化合物である。ゆえに適切な遷移金属化合物は、ヒドリド、ハライド、アルコール、オキシム、アルコキシド、アリールオキシド（例えばフェノラート）、エステル（例えばアセテート、アクリレート）、アセトアセテート、チオカルバメート、アミン、アルケンジオネート及びホスフェート、又はこれらの混合物（例えばアルコキシ及びハライドを担持する遷移金属化合物）である。これらの化合物は、それぞれ少なくとも１つの−Ｔｍ−Ｈ、−Ｔｍ−Ｈａｌ、−ＴｍＯＨ、−ＴｍＮＯＨ、−Ｔｍ−ＯＲ、−ＴｍＯ（Ｏ）ＣＲ、−ＴｍＳＣ（Ｓ）ＮＲ、−Ｔｍ−ＮＲ、−Ｔｍ−Ｏ−ＣＲ＝ＣＲ−Ｃ（Ｏ）Ｒ又は−ＴｍＯＰ（Ｏ）ＯＲ基を含んでなり、Ｒは水素、アリール基、アルケン基又はアルキル基であってもよく、１８Ｃ以下、好ましくは１０Ｃ以下、特に好ましくはＣ１−６である。
【００４５】
ハライド及びアルコキシドが特に好適であり、特にアルコキシドが好適である。最も好適には、遷移金属化合物上の全てのリガンドがアルコキシル基である。
【００４６】
好ましくは、上記アルコキシドは、チタン（ＩＶ）又はジルコニウム（ＩＶ）イオンのアルコキシドである。より好ましくは、上記アルコキシドは、Ｃ１−６アルコキシド、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ又はブトキシである。特に好ましくは、４つのかかる基、例えばテトラメトキシ、テトラエトキシ、テトラプロポキシ又はテトラブトキシ基が存在する。再確認のためであるが、テトラアルキルジルコネート、テトラアルキルオルトジルコネート及びテトラアルコキシジルコネートは同じ化合物である。遷移金属化合物の混合物を使用してコーティングを形成することも可能である。
【００４７】
本発明に係る好適な方法においては、ポリマー粒子を、有機溶媒中で、上記で定義した遷移金属アルコキシド化合物と反応させる。水溶性の高い若しくは低い溶媒を用いることが可能である。上記溶媒は、好ましくは不活性である。適切な溶媒の代表例としては、トルエン、キシレン及びエーテルが挙げられる。非常に好適な溶媒は、２−メトキシエチルエーテルである。典型的には、１ｇのポリマービーズを、２〜１５０ｍｌ、より好ましくは５〜１５ｍｌの溶媒中に懸濁させる。
【００４８】
本発明のコーティングされた粒子を形成させる方法は、１段階工程、又は２段階工程により実施されてもよい。１段階工程においては、水を、有機溶媒中の、ポリマー粒子及び遷移金属化合物の懸濁液又は分散液中に添加してもよい。好適な２段階工程においては、最初に上記ポリマー粒子を、有機溶媒中に懸濁若しくは分散させ、遷移金属化合物を添加し、次に水を添加する。両方の方法において、典型的には、過剰量の遷移金属化合物を添加する。好ましくは、上記反応は、例えば−１０〜２００℃、好ましくは２０〜１００℃の範囲の温度、例えば室温付近で実施される。コーティング反応がこの低温で遂行されうることは、特許請求された方法の驚くべき特徴であり、コーティングの形成の際にポリマー粒子に損傷を与えうる過剰な加熱を行う必要がない。典型的な反応時間は、１０分〜２４０分（例えば約９０分）である。
【００４９】
好ましくは、２段階工程の第１の段階は、不活性雰囲気下、例えばアルゴン雰囲気下で実施される。しかしながら、実質的に水が反応系に存在しないのがより好ましい。換言すれば、上記反応は無水的に行われる（例えば＜５重量％の水、好ましくは＜１重量％の水分含量である）。理論に拘束されたくないが、乾燥条件で最初の段階を実施することにより、ごく一部の遷移金属化合物のみが反応を受け、ポリマー粒子に結合すると考えられる。すなわち、反応の最初の段階は、ポリマー粒子上での遷移金属化合物の均一な「プライマー」層の形成として作用する。
【００５０】
２段階工程中の第２の段階においては、水、好ましくは脱イオン水を添加する。理論に拘束されることは望ましくないが、これにより、遷移金属化合物の迅速な加水分解が誘導され、粒子上の加水分解されたプライマー層と会合する酸化物が供給される。
【００５１】
典型的には、添加される遷移金属化合物１モルあたり、０．０１〜５モルの水を添加する。水の添加時、ポリマー粒子の懸濁液は典型的には室温である。典型的な反応時間は、１時間〜１０時間、好ましくは１時間〜３時間、例えば約２時間である。
【００５２】
本発明の工程は、例えば触媒として、酸又は塩基を添加する必要がありうる。しかしながら、上記反応は、酸、例えばリン酸又は氷酢酸の添加を行わずに生じるのが好ましい。また、振とう、撹拌及び／又は超音波処理を用いることにより含浸を向上し、反応速度を加速させるのも好適である。
【００５３】
反応終了後、コーティングポリマー粒子を、当業者に公知の従来法（例えば濾過）によって分離してもよい。一般的には、コーティング粒子を好ましくは最高１０回洗浄し、あらゆる遊離の試薬、例えば未反応の出発材料を除去する。いかなる溶媒及び／又は溶媒混合物も洗浄に使用でき、例えばアセトン、メタノール、水、イソプロパノール又はエーテルなどが挙げられる。好適には、最初の段階において使用する溶媒を、洗浄用の溶媒としても使用する。次にポリマー粒子を、好ましくは真空下で乾燥させてもよい。
【００５４】
以上より、本発明の他の態様は、上記したようなポリマー微粒子の調製方法の提供に関し、当該方法は、ポリスチレン又はポリアクリレートを含んでなるポリマー微粒子と、少なくとも１つの遷移金属アルコキシド及び水とを反応させる段階を有してなる。好ましくは、上記方法は、水よりも前にアルコキシドの添加を必要とする。
【００５５】
本明細書に記載の方法により得られる粒子は、本発明の更なる態様を構成する。
【００５６】
＜用途＞：
得られるポリマー粒子は、例えば生体分子（例えばペプチド、タンパク質、核酸）、金属イオン、有機化合物（例えば薬剤又は薬剤誘導体）、基質及びそれらの任意の混合物の、精製（例えば単離、分画、減少、脱塩）、抽出、又は捕捉（例えば濃縮）など、広範囲にわたる用途で使用できる。上記ポリマー粒子はまた、アッセイ及び固相合成において、複合混合物からの、例えば特異的な生体分子（例えば核酸、タンパク質、ペプチド）の単離において使用できる。
【００５７】
吸着／脱着工程により実施される、様々な生体分子の単離及び分画における、本発明のポリマー粒子の有用性は、上記の遷移金属酸化物でコートされた粒子の高い結合能に由来する。本発明のポリマー粒子により、かかる単離及び分画を、カラムの使用や、サンプルの希釈を行うことなく実施でき、またハイスループットで自動化することもできる。例えばプレートの使用と比較し、少ない体積で広い表面積を有する粒子は、特に有益である。
【００５８】
非常に好適な実施形態では、本発明の粒子を用いて、サンプルからＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸を結合させる。ＤＮＡ又はＲＮＡの単離は、多くの生化学及び診断手順における重要な段階である。例えば、複合混合物から、そこに通常存在する核酸を単離しなければ、他の試験及び手順、例えば検出、クローニング、塩基配列決定、増幅、ハイブリッド形成、ｃＤＮＡ合成、核酸の構造及び組成（例えばＤＮＡのメチル化パターン）の研究などが実施できないことが多い。かかる複合混合物中の、大量の細胞又はその他の混入物質、例えばタンパク質又は炭水化物の存在はしばしば、使用する反応及び分子生物学的な技術の多くを妨げるからである。更に、ＤＮＡはＲＮＡ調製物中に混入することもあり、またその逆もありうる。ゆえに、細胞、組織などの複合混合物からの核酸の単離方法は、調製の観点からのみならず、今日用いられている、ＤＮＡ又はＲＮＡの同定に依存する多くの技術、例えば微生物感染症の診断、法科学、組織及び血液タイピング、遺伝子タイピング、遺伝的変異の検出などの観点からも、要望されている。核酸の単離は、あらゆる適切な核酸単離手順を使用して、本発明の粒子を使用して実施することができる。
【００５９】
サンプルは、核酸を含んでなるいかなる材料でもあってもよく、例えば食品及び関連物質、臨床及び環境サンプルなどが挙げられる。サンプルは生物学的サンプルでもよく、あらゆるウイルス若しくは細胞由来の材料を含んでもよく、全ての原核若しくは真核生物細胞、ウイルス、バクテリオファージ、マイコプラズマ、原形質及び細胞小器官などが挙げられる。ゆえにかかる生物学的材料は、全ての種類の哺乳動物及び非哺乳動物由来の細胞、植物細胞、藻類（緑藻類を含む）、菌類、バクテリア、原生動物などを含んでもよい。ゆえに代表的なサンプルとしては、全血及び血漿、血清などの血液由来の生成物、軟膜、尿、糞便、脳脊髄液、又は他の体液、組織、培養細胞、細胞懸濁液などが挙げられる。
【００６０】
核酸の単離のための各種の方法が知られているが、一般的には、これらは一連の複雑な抽出及び洗浄段階に依存するものであり、時間及び手間のかかるものである。
【００６１】
例えばＵＳ−Ａ−５，２３４，８０９は、グアニジウム塩などのカオトロピック剤の存在下で、核酸をシリカ粒子の形の固相に結合させ、それによりサンプル中の残余物と分離する方法を記載している。ＷＯ９１／１２０７９は、沈殿によって核酸を固相表面にトラップする方法を記載している。一般的には、アルコール及び塩が沈殿剤として用いられる。
【００６２】
ＵＳ ５，７０５，６２８及びＵＳ ５，８９８，０７１は、７〜１３％の濃度の、大きな分子量のポリアルキレングリコール（例えばポリエチレングリコール）と、０．５〜５Ｍの範囲の塩との組合せを使用した、核酸断片の単離方法を記載しており、それにより、生物学的親和性によるＤＮＡ吸着基として機能する固体支持体上へ、官能基を結合させることができる。
【００６３】
核酸の単離への本発明の粒子の使用が特に好適であることが明らかとなった。ゆえに、本発明の他の態様は、核酸を含んでなるサンプルから核酸を単離する方法の提供に関し、当該方法は、本発明の粒子と前記サンプルとを接触させる段階を有してなる。より詳細には、本発明は、サンプルからの核酸の単離方法の提供に関し、当該方法は、
（Ｉ）１つまたは複数の核酸を含有するサンプルを準備する段階と、
（ＩＩ）上記のサンプルと、遷移金属酸化物でコーティングされた粒子を混合する段階と、
（ＩＩＩ）上記サンプル及び粒子をインキュベートする段階と、
（ＩＶ）上記粒子を任意に磁場において回収し、上清を除去する段階と、
（Ｖ）任意に、１つまたは複数の核酸を単離する段階と
を有してなる。
【００６４】
周知のように、例えば段階（ＩＶ）の後に洗浄段階をこの工程中に含めてもよい。
【００６５】
この点に関しては、核酸は、カオトロピック緩衝液の存在下で、遷移金属面に容易に吸着することもわかっている。ゆえに、特に好適な実施形態では、本発明のポリマー粒子を用いることにより、例えば、生物学的標本から、この影響力を利用することによって、すなわちカオトロピック緩衝液の存在下で、核酸を単離することが可能となる。遷移金属表面による核酸の吸着は、核酸の周囲の水による水素結合ネットワークを破壊し、それにより溶液中の高分子の構造を不安定とする、カオトロピック緩衝液の影響の結果として生じる。ゆえに、その後異なる洗浄段階を通じて周囲の環境の水素結合を再構成することによって、結合した上記の核酸を次に上記表面から、例えば所望の緩衝液を添加することにより溶出させることができる。
【００６６】
更に、発明者らは驚くべきことに、金属酸化物でコートされた粒子を使用した核酸の単離が、粒子表面と使用する緩衝液の組成との組合せに深く依存することを見出した。
【００６７】
本発明のポリマー粒子への核酸の結合は、緩衝液（特にカオトロピック緩衝液）と、任意に添加される他の物質（例えば塩）との適切な組合せ／濃度により促進される。温度及びｐＨの操作により、単離が助長されることもある。場合によっては、異なるタイプの核酸（例えばｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｄｓＤＮＡその他）を識別することが可能となる。
【００６８】
特に重要なのが、使用する緩衝液である。好適なカオトロピック緩衝液として、グアニジン塩（例えばチオシアネート又は塩化物）、尿素、過塩素酸塩又はヨウ化物が挙げられる。他の利用可能な緩衝液としては、トリス塩酸、ビシン、トリシン及びリン酸緩衝液が上げられ、カオトロピック及び非カオトロピック緩衝液の混合物であってもよい。緩衝液は、アルコール（例えばイソプロパノール）などの洗浄緩衝液及び／又は典型的には周知のように低イオン強度のトリトンなどの非イオン系界面活性剤と、組み合わせてもよい。
【００６９】
上記単離ではまた、標準的な洗浄用及び溶出用の緩衝液、例えば以下の実施例に記載の緩衝液を利用してもよい。
【００７０】
ゆえに、本発明の更なる態様は、上記ポリマー微粒子とカオトロピック緩衝液とを含んでなる、核酸単離用のキットの提供に関する。上記キットの他の任意の構成要素としては、洗浄溶液及び／又は溶出緩衝液などが挙げられる。
【００７１】
インキュベーション条件は典型的に、当該技術で通常使用される条件、例えば１０〜５０℃の温度、例えば室温である。インキュベーションは、任意の好適な時間、例えば１分間〜１週間、好ましくは１〜５時間にわたり実施してもよい。
【００７２】
上記サンプルは、リン酸化タンパク質を含んでなるいかなるサンプルでもよい。かかるサンプルの調製は周知である。サンプルは、溶解され、好ましくは少なくとも１つの単離処理（例えば少なくとも１つの塩、洗剤若しくは界面活性剤、酸若しくは塩基を含有する１つまたは複数の溶液による抽出、遠心分離、可溶化、沈殿、親和性による捕捉、二次元電気泳動又はクロマトグラフィなど）を受けた細胞画分であってもよい。
【００７３】
他の非常に好適な実施形態では、本発明の粒子は、リン酸化タンパク質（当該用語にはリン酸化ペプチドが含まれる）の単離に用いられる。本発明の微粒子は特に、非タンパク質修飾又は細胞内タンパク質の翻訳後修飾、特にリン酸化の同定に利用できる。リン酸化及び脱リン酸化により、多くの細胞内事象、例えば細胞周期の制御、細胞分化、形質転換、アポトーシス、シグナル伝達などが調節され、かつ本発明の微粒子の使用により、リン酸化状態が化学的、生物学的あるいは物理的な摂動（例えば薬剤処理、中毒性発作、物理的な曝露（例えば放射線又はＵＶ処理）、又は成長因子若しくは分化因子などによる刺激）によって変化しうるタンパク質を同定し、それにより、リン酸化カスケードの研究に対する１つのサポートが提供される。
【００７４】
リン酸化タンパク質の検出及び単離のための、様々な技術が存在する。Ｐｒｏ−Ｑ Ｄｉａｍｏｎｄ技術（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ社、ＯＲ、米国）はフルオロフォアを利用するものであり、抗体又は放射能を用いずに、タンパク質上のリン酸基を認識し、それにより微量のリン酸化タンパク質の検出が簡便に行える。リンペプチドの捕捉は、磁性ビーズにフルオロフォアを担持させることにより実施できる。
【００７５】
リン酸化タンパク質は、固定化金属イオンクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）技術を使用して単離することもでき、例えば、Ｆｅ３＋などの固定化金属を有する、カルボキシメチル化されたアスパルテートキレート剤が担持された樹脂を充填したカラムを用いて、リン酸化タンパク質を標的とする。固定化金属アフィニティカラム（ＩＭＡＣ）クロマトグラフィを用いて、標的タンパク質サンプル中の修飾及び非修飾ペプチドの混合物からリン酸化ペプチドを選抜する。標準的なプロトコルでは、塩化鉄を使用して、ＩＭＡＣカラムの金属キレート化パッキング材料と結合させる操作を行う。リン酸化ペプチドは、カラム上へロードされた際、固定化された鉄原子と結合し、酸性条件下で溶出させることができる。
【００７６】
酸性アミノ酸残基もまた、ＩＭＡＣカラム上のＦｅ３＋と結合するため、カラムに対する非特異的な結合は障害となりうる。これを防止するため、通常上記サンプルをＩＭＡＣカラム上へ添加する前に、２Ｍの塩酸メタノールで処理する。この工程により、全ての酸性アミノ酸残基、並びにペプチドのＣ末端が、カルボン酸基からメチルエステルに変換される。リン酸基は変更されていないままであり、ゆえにＩＭＡＣカラム上への選択的な結合が可能となる。
【００７７】
他の生化学者は、リン酸化タンパク質を結合する二酸化チタン粒子を、２，５−ジヒドロキシ安息香酸と組み合わせてカラムで使用し、非リン酸化タンパク質の結合を防止する。
【００７８】
本発明の微粒子は、リン酸化タンパク質の単離のため、更なる経路を提供するものである。すなわち、本発明の更なる態様は、リン酸化タンパク質の単離への、本発明の微粒子の使用の提供に関する。ゆえに、本発明の他の態様は、リン酸化タンパク質を含んでなるサンプルからのリン酸化タンパク質の単離方法の提供に関し、当該方法は、本発明の粒子と前記サンプルとを接触させる段階を有してなる。
【００７９】
したがって、本発明の他の態様は、サンプルからのリン酸化タンパク質の単離方法の提供に関し、当該方法は、
（Ｉ）１つまたは複数のリン酸化タンパク質を含有するサンプルを準備する段階と、
（ＩＩ）上記サンプルと、上記の遷移金属酸化物でコーティングされた微粒子とを混合する段階と、
（ＩＩＩ）上記サンプルと上記粒子とをインキュベートする段階と、
（ＩＶ）上記粒子を任意に磁場において回収して上清を除去する段階と、
（Ｖ）任意に、１つまたは複数の単離されたリン酸化タンパク質を溶出する段階と
を有してなる。
【００８０】
周知のように、例えば段階（ＩＶ）の後に洗浄段階をこの工程中に含めてもよい。
【００８１】
上記サンプルは、リン酸化タンパク質を含んでなるいかなるサンプルでもよい。かかるサンプルの調製は周知である。サンプルは、溶解され、好ましくは少なくとも１つの単離処理（例えば少なくとも１つの塩、洗剤若しくは界面活性剤、酸若しくは塩基を含有する１つまたは複数の溶液による抽出、遠心分離、可溶化、沈殿、親和性による捕捉、誘電泳動又はクロマトグラフィなど）を受けた細胞画分であってもよい。幾つかの実施形態では、最初に、ホスホセリン、ホスホスレオニン又はホスホチロシンと結合する１つまたは複数の特異的な結合試薬を使用した親和性による捕捉によって、リン酸化タンパク質を濃縮する。また、タンパク質は、電気泳動又はクロマトグラフィなどの方法により、細胞画分から単離することもできる。若干の好ましい実施形態では、タンパク質を１つまたは複数のプロテアーゼにより消化して、サンプル調製を行う。好ましくは、上記サンプルはプロテアーゼ消化されたタンパク質を含んでなる。
【００８２】
例えば、リン酸化ペプチドは、かかる磁性ビーズの誘導体化表面上の選択的な濃縮によって、より一般的なペプチド配列を含む複合混合物から単離されうる。
【００８３】
インキュベーション条件は典型的に、当該技術で通常使用される条件、例えば１０〜５０℃の温度、例えば室温である。インキュベーションは、任意の好適な時間、例えば１分間〜１週間、好ましくは１〜５時間にわたり実施してもよい。
【００８４】
本発明のポリマー粒子へのリン酸化タンパク質の結合は、１つまたは複数の緩衝液（特にカオトロピック緩衝液）と、任意に添加される他の物質（例えば塩）との適切な組合せ／濃度により促進される。温度及びｐＨの操作により、単離が助長されることもある。
【００８５】
この点に関しては、従来公知のＴｉＯ２粒子を使用する際、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）を、比較的高い濃度で、ローディング用及び／又は洗浄用の緩衝液に使用して、リン酸化タンパク質の選択性を高いレベルに維持することが通常行われる。ＤＨＢの非存在下では、選択性が低下し、多くの混入ペプチドが残留する。
【００８６】
しかしながら、本発明の粒子は、ＤＨＢが存在しない場合でも高い選択性を有するため、ローディング又は洗浄緩衝液中のＤＨＢの存在が必要ない。すなわち、他の実施形態では、上記の段階（ＩＩ）はＤＨＢの非存在下で実施される。
【００８７】
ＤＨＢは、水性緩衝液中で結晶化する傾向が非常に高いため、この材料の使用の回避による利点は非常に多い。その結晶の存在により、逆相樹脂における詰まりが生じ、それにより背圧が生じ、またサンプルの損失が生じる。したがって、リン酸化タンパク質の濃縮への本発明の粒子の使用は、非常に好適である。
【００８８】
単離工程において特に重要なのが、使用する緩衝液である。カオトロピック緩衝液又は界面活性剤が、有用な緩衝液、特に結合用緩衝液である。好適なカオトロピック緩衝液として、グアニジン塩、例えばチオシアネート、又は塩化物、尿素、過塩素酸塩又はヨウ化物が挙げられる。他の利用可能な緩衝液としては、トリス塩酸、ビシン、トリシン及びリン酸緩衝液が挙げられ、かつカオトロピック及び非カオトロピック緩衝液の混合物であってもよい。緩衝液は、アルコール（例えばイソプロパノール）などの洗浄緩衝液及び／又は典型的には周知のように、低イオン強度のトリトンなど非イオン系界面活性剤と組み合わせてもよい。
【００８９】
界面活性剤、例えばＷＯ９６／１８７３１に記載されているものを用いてもよい。好適な界面活性剤としては、イオン系（アニオン系及びカチオン系を含む）、非イオン系、又は双性イオン系の界面活性剤が挙げられる。本明細書で用いられる「イオン系界面活性剤」という用語には、水に溶解させたときに、部分的又は完全に、イオン化形態として存在する、あらゆる界面活性剤が包含される。アニオン系界面活性剤は、特に良好に機能するため好適である。適切なアニオン界面活性剤としては、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、又は他のアルカリ金属アルキル硫酸塩、又は同様の界面活性剤（ザルコシル）又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【００９０】
界面活性剤とカオトロピック緩衝液との組合せを使用してもよい。
【００９１】
単離において、標準的な洗浄緩衝液、例えば以下の実施例に記載のものを利用してもよい。
【００９２】
発明者らは驚くべきことに、本発明の微粒子を使用したリン酸化タンパク質の単離において、特に有用であると証明された多くの緩衝液を見出した。これらの緩衝液は、本発明の特許請求された方法において大きな有用性を発揮する一方、それらはまた、一般論として、多様な異なる技術及び粒子を使用したリン酸化タンパク質の単離においても有用であることはいうまでもない。上記緩衝液はまた、他の生体分子の単離においても有用性を発揮しうる。ゆえにこれらの緩衝液は、本発明の更なる態様を構成する。
【００９３】
本発明の微粒子に対するリン酸化タンパク質の結合の際、及び当該粒子の洗浄の際、発明者らは、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４）＋２０％のエタノール緩衝液が理想的であることを見出した。かかる緩衝液は、１．６６ｇの無水酢酸ナトリウムを５０ｍｌの脱イオンされたＨ２Ｏに溶解させることにより調製できる。０．４５又は０．２２ｍｍのフィルタで濾過した後、５．２７ｍｌの氷酢酸を添加することができ、全量をｄＨ２Ｏで最大１．７５Ｌにする。この材料のｐＨは４．０±０．１である。４５０ｍｌのエタノールを次に添加でき、脱イオン水を添加して最終的な体積を最大２．２５Ｌにする。使用する全ての試薬は、分析グレードであるべきである。
【００９４】
ゆえに、水、エタノール及び酢酸ナトリウムを含有し、３．９〜４．１のｐＨである緩衝液が理想的である。好ましくは、緩衝液中に１０〜３０重量％のエタノールが存在する。所望のｐＨとするため、緩衝液中の酢酸ナトリウムを４５〜５５ｍＭとしてもよい。
【００９５】
したがって、非常に好適な実施形態では、リン酸化タンパク質と本発明の微粒子とのインキュベーションは、この緩衝液の存在下で行われる。
【００９６】
リン酸化タンパク質は、単離した後、従来公知の技術を使用して溶出させることができる。溶出は、ピペラジン、イミダゾール、ｏ−リン酸エステルのうち１つ若しくは複数を含む溶液、又は塩基性（例えばｐＨ８〜１１）の溶液において実施できる。好適な溶出緩衝液としては、炭酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、クエン酸二アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸二水素アンモニウム又は重炭酸アンモニウムが挙げられる。
【００９７】
好適な溶出緩衝液は、フェニルホスフェート及び水酸化アンモニウムをベースとする。これは好ましくは、０．３Ｎ ＮＨ４ＯＨ中に５０ｍＭのフェニルホスフェートである。かかる緩衝液は、５００ｍｌの脱イオン水に５ｍｌの水酸化アンモニウム（１４．８Ｍ）を添加して、０．３Ｎ ＮＨ４ＯＨ溶液として調製し、次に６．３５ｇのフェニルホスフェートを添加することにより調製できる。使用する全ての試薬は、分析グレードであるべきである。
【００９８】
ゆえに、フェニルホスフェート（例えばそのナトリウム塩）及び水酸化アンモニウムを含んでなる溶出緩衝液が、本発明での使用にとり理想的であり、これは本発明の更なる態様を構成するものである。
【００９９】
好ましくは、緩衝液の調製に使用する水酸化アンモニウムは０．１〜１Ｎである。使用するフェニルホスフェートは、１０〜１００ｍＭの溶液、例えば４０〜６０ｍＭ、例えば５０ｍＭの溶液として供給できる。
【０１００】
発明者らは、驚くべきことに、本発明のコーティング粒子と共に作用するように最適化された溶出緩衝液は、表面への強力な結合に関してリン酸化された残基との競合が助長されるように、水酸化アンモニウム（例えば０．３Ｎ水酸化アンモニウム）中にフェニルホスフェート（例えば５０ｍＭのフェニルリン酸ナトリウム）を含むべきであることを見出した。
【０１０１】
したがって、非常に好適な実施形態では、上記の段階（Ｖ）におけるリン酸化タンパク質の溶出は、この緩衝液を使用して実施される。
【０１０２】
溶出の後、リン酸化タンパク質を、従来公知の手段、例えば質量分析を使用して分析し、特定のタンパク質を同定することができる。上記の方法は、ＳＩＬＡＣ（細胞培養液中のアミノ酸による安定なアイソトープ標識）が使用されるか、又は、ｉＴＲＡＱ（相対絶対定量のための、アイソトープタギング（ｔａｇｇｉｎｇ）試薬）が使用された場合のサンプルと組み合わせて使用するときに、特に有用性を発揮する。
【０１０３】
以下の実施例及び図を参照することにより、本発明を更に詳細に記載する。これらは本発明を限定することを目的とせず、単に例示することを目的とするものである。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】血清からの、ｄｓＤＮＡ（５μｇ添加）の単離を示す。レーン１から３：チタンを有する磁性ビーズ。レーン４から６：ジルコニウムを有する磁性ビーズ。レーン７：ＨｉｎｄＩＩＩで切断された、５μｇのλ ｄｓＤＮＡのラダー。
【図２】血清からの、ＲＮＡ（５μｇ添加）の単離を示す。レーン１から３：チタンを有する磁性ビーズ。レーン４から６：ジルコニウムを有する磁性ビーズ。レーン７：５μｇの０．２４〜９．５Ｋｂ ＲＮＡラダー。
【図３】ジルコニウムを有する磁性ビーズを使用した、血清からの核酸（５μｇ添加）の単離を示す。レーン１から３：ＲＮＡ。レーン４：５μｇの０．２４〜９．５Ｋｂ ＲＮＡラダー。レーン５：空。レーン６から８：ｄｓＤＮＡ。レーン９：ＨｉｎｄＩＩＩで切断された、５μｇのλ ｄｓＤＮＡのラダー。
【図４】ジルコニウムを有する磁性ビーズを使用した、血清からの核酸（５μｇ添加）の単離を示す。レーン１及び２：ｄｓＤＮＡ。レーン３：ＨｉｎｄＩＩＩで切断された、５μｇのλ ｄｓＤＮＡのラダー。
【図５】チタンを有する磁性ビーズを使用した、血清からのｄｓＤＮＡの単離を示す。レーン１から２：２．５μｇの添加から単離された、ｄｓＤＮＡ。レーン３から４：５μｇの添加から単離された、ｄｓＤＮＡ。レーン５から６：１５μｇの添加から単離された、ｄｓＤＮＡ。レーン７から８：２０μｇの添加から単離された、ｄｓＤＮＡ。レーン９：ＨｉｎｄＩＩＩで切断された、５μｇのλ ｄｓＤＮＡのラダー。
【図６】ジルコニウム及びチタンを有する磁性ビーズを使用した、血液からのゲノムＤＮＡの単離を示す。レーン１から２：ジルコニウムにより単離されたｇＤＮＡ（実施例１）。レーン３から４：ジルコニウムにより単離されたｇＤＮＡ（実施例２）。レーン５から６：チタンにより単離されたｇＤＮＡ（実施例９）。レーン７から８：チタンにより単離されたｇＤＮＡ（実施例１０）。レーン９から１０：Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＤＮＡ ＤＩＲＥＣＴ（商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌ ＡＳ社製、オスロ、ノルウェー）により単離されたｇＤＮＡ。
【図７】ジルコニウム及びチタンを有する磁性ビーズを使用した、血液からのゲノムＤＮＡの単離を示す。レーン１から２：ジルコニウムにより単離されたｇＤＮＡ（実施例１）。レーン３から４：ジルコニウムにより単離されたｇＤＮＡ（実施例２）。（レーン４の明らかに低い収率の理由は、ｇＤＮＡがビーズから溶出されなかったという事実であった。）レーン５から６：チタンにより単離されたｇＤＮＡ（実施例９）。レーン７から８：チタンにより単離されたｇＤＮＡ（実施例１０）。レーン９から１０：Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＤＮＡ ＤＩＲＥＣＴ（商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌ ＡＳ社製、オスロ、ノルウェー）により単離されたｇＤＮＡ。
【図８】チタンを有する磁性ビーズを使用した、血液からのゲノムＤＮＡの単離を示す。レーン１から２：チタンにより単離されたｇＤＮＡ（実施例１１）。レーン３から４：チタンにより単離されたｇＤＮＡ（実施例１６）。
【図９】異なる専用緩衝液を使用した、ＤＮＡの単離（％）を示す。
【図１０】図１０Ａ〜Ｄは、二酸化チタンビーズとの比較における、本発明のビーズを使用したリン酸化タンパク質の単離後の、得られる質量スペクトルを示す。
【図１１】図１１Ａ及びＢは、本発明の粒子とのインキュベートの前後におけるトリプシン消化により得られた未知のリン酸化タンパク質の質量スペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１０５】
［実施例］
＜一般手順＞：
出発材料のビーズ（以下の実施例ではビーズと称する）は、孔中に酸化鉄の結晶を有する、多孔性の１μｍの単一粒子径の架橋ポリスチレン／ジビニルベンゼンビーズである。これらの磁性ポリマー粒子、３００〜５００ｍｇの鉄含量／ｇの乾燥固体（ＤＳ）は、ＷＯ０５／０１５２１６に記載の手順で、エポキシドでコーティングされていた。
【０１０６】
洗浄段階間の各単離を磁石の上で実施し、懸濁液を各洗浄段階間において、約５分間振とうした。
【０１０７】
＜ジルコニウムコーティングされた粒子＞：
＜実施例１＞：
１．５ｇのビーズを、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、１０〜３０ｍｌの液量／各回）。最終的な懸濁液を、１１．６３ｇの重量に調整した。
【０１０８】
１３．７１ｇのテトラブチルジルコネート（ブタノール中８０％）を添加し、懸濁液を室温で２５０回転／分で撹拌した。９０分撹拌した後、３３０μｌの水を添加した。懸濁液を、更に１８時間撹拌した。
【０１０９】
１８時間後に、上記粒子をビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄し（５回、３０〜５０ｍｌの液量／各回）、次にイソプロパノールで洗浄した（５回、３０〜５０ｍｌの液量／各回）。ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によってジルコニウム層を観察することができた。
【０１１０】
＜実施例２＞：
２ｇのビーズを、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、２５〜４０ｍｌの液量／各回）。最終的な懸濁液を、１５．９５ｇの重量に調整した。
【０１１１】
１７．８４ｇのテトラプロピルジルコネート（プロパノール中７０％）を添加し、懸濁液を室温で２５０回転／分で撹拌した。９０分撹拌した後、４５０μｌの水を添加した。懸濁液を、更に１８時間撹拌した。
【０１１２】
１８時間後に、上記粒子を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄し（６回、３０〜５０ｍｌの液量／各回）、次にイソプロパノール（７回、３０〜５０ｍｌの液量／各回）で洗浄し、次に水（４回、３０〜５０ｍｌの液量／各回）で洗浄し、最後にイソプロパノールで４回（各回３０〜５０ｍｌの液量）洗浄した。ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によってジルコニウム層を観察することができた。
【０１１３】
＜実施例３＞：
２ｇのビーズを、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、２５〜４０ｍｌの液量／各回）。最終的な懸濁液を、１５．９５ｇの重量に調整した。
【０１１４】
１７．８４ｇのテトラプロピルジルコネート（プロパノール中７０％）及び４５０μｌの水を添加した。懸濁液を、室温で、２５０回転／分で１８時間撹拌した。
【０１１５】
１８時間後に、上記粒子を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄し（５回、３０〜５０ｍｌの液量／各回）、次に水で洗浄した（５回、３０〜５０ｍｌの液量／各回）。ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によってジルコニウム層を観察することができた。
【０１１６】
＜実施例４＞：
２ｇのビーズを、エタノールで洗浄した（５回洗浄、２５〜４０ｍｌの液量／各回）。最終的な懸濁液を、１５．９５ｇの重量に調整した。
【０１１７】
１７．８４ｇのテトラプロピルジルコネート（プロパノール中７０％）を添加し、懸濁液を室温で２５０回転／分で撹拌した。９０分撹拌した後、４５０μｌの水を添加した。懸濁液を、更に１８時間撹拌した。
【０１１８】
１８時間後に、上記粒子をエタノールで５回（各回３０〜５０ｍｌの液量）洗浄し、次に水で５回（各回３０〜５０ｍｌの液量）洗浄した。ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によってジルコニウム層を観察することができた。
【０１１９】
＜実施例５＞：
２ｇのビーズを、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、２５〜４０ｍｌの液量／各回）。最終的な懸濁液を、１５．９５ｇの重量に調整した。
【０１２０】
１７．８４ｇのテトラプロピルジルコネート（プロパノール中７０％）を添加し、懸濁液を２５０回転／分で撹拌し、１３０℃に加熱した。１３０℃で９０分撹拌した後、４５０μｌの水を添加した。懸濁液を、１３０℃で更に１８時間撹拌した。
【０１２１】
１８時間後に、上記粒子を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）エーテルで５回（各回３０〜５０ｍｌの液量）洗浄し、次に水で５回（各回３０〜５０ｍｌの液量）洗浄した。ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によってジルコニウム層を観察することができた。
【０１２２】
＜実施例６＞：
エポキシドでコーティングされ、カルボン酸で官能化されているビーズ１ｇを、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、２５〜４０ｍｌの液量／各回）。最終的な懸濁液を、１５．９５ｇの重量に調整した。
【０１２３】
８．９２ｇのテトラプロピルジルコネート（プロパノール中７０％）を添加し、懸濁液を室温で２５０回転／分で撹拌した。６０分撹拌した後、２２０μｌの水を添加した。懸濁液を、室温で、更に１８時間撹拌した。
【０１２４】
１８時間後に、上記粒子を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄し（５回、各回３０〜５０ｍｌの液量）、次に水で２５回（各回３０〜５０ｍｌの液量）洗浄した。ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によってジルコニウム層を観察することができた。
【０１２５】
＜実施例７＞：
２．５ｇのダイナビーズ（登録商標）ＲＰＣプロテイン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌ ＡＳ社製、オスロ、ノルウェー）を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、３０ｍｌの液量／各回）。粒子の乾燥成分を１１．７重量％に調整した。テトラプロピルジルコネート（１−プロパノール中７０％）（２２．３ｇ）、続いてビス（２−メトキシエチルエーテル）（５．０ｇ）を添加した。室温で２５０回転／分で１時間、混合物を撹拌した後、水（０．５６ｇ）を添加した。混合物を更に、室温で１８時間撹拌した。上記粒子を、５０ｍｌのビス（２−メトキシエチルエーテル）で１０回、５０ｍｌの水で２０回洗浄した。ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によってジルコニウム層を観察することができた。
【０１２６】
＜実施例８＞：
エポキシドでコーティングされているビーズ４．０ｇを、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、５０ｍｌの液量／各回）。粒子の乾燥成分を１１．７重量％に調整した。テトラプロピルジルコネート（１−プロパノール中７０％）（３５．７ｇ）、続いてビス（２−メトキシエチルエーテル）（８．０ｇ）を添加した。室温で、２５０回転／分で１時間混合物を撹拌した後、水（０．８９ｇ）を添加した。混合物を更に、室温で１８時間撹拌した。上記粒子を、８０ｍｌのビス（２−メトキシエチルエーテル）で１０回、８０ｍｌの水で２０回洗浄した。ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によってジルコニウム層を観察することができた。
【０１２７】
＜チタンコーティング＞：
＜実施例９＞：
２ｇのビーズを、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、２５〜４０ｍｌの液量／各回）。最終的な懸濁液を、１４．２９ｇの重量に調整した。
【０１２８】
８．７０ｇのテトラエチルオルトチタネートを添加し、懸濁液を室温で２５０回転／分で撹拌した。９０分撹拌した後、２１０μｌの水を添加した。懸濁液を、更に２時間撹拌した。
【０１２９】
２時間後に、上記粒子を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で１０回洗浄し（各回３０〜５０ｍｌの液量）、次にアセトンで４回洗浄し（各回３０〜５０ｍｌの液量）、最後に水で４回洗浄した（各回３０〜５０ｍｌの液量）。チタン層は、ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によって、観察可能であった。
【０１３０】
＜実施例１０＞：
１．８ｇのビーズを、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、３５−６０ｍｌの液量／各回）。最終的な懸濁液を、３７．６４ｇの重量に調整した。
【０１３１】
１３．０５ｇのテトラエチルオルトチタネートを添加し、懸濁液を室温で２５０回転／分で撹拌した。９０分撹拌した後、６７０μｌの水を添加した。懸濁液を、更に２時間撹拌した。
【０１３２】
２時間後に、上記粒子を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で９回洗浄し（各回約１００ｍｌの液量）、次にイソプロパノールで４回洗浄した（各回約１００ｍｌの液量）。チタン層は、ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によって、観察可能であった。
【０１３３】
＜実施例１１＞：
１．８ｇのビーズを、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、３５−６０ｍｌの液量／各回）。最終的な懸濁液を、３７．６４ｇの重量に調整した。
【０１３４】
１９．４６ｇのテトラブチルオルトチタネートを添加し、懸濁液を室温で２５０回転／分で撹拌した。９０分撹拌した後、６７０μｌの水を添加した。懸濁液を、更に２時間撹拌した。
【０１３５】
２時間後に、上記粒子を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で９回洗浄し（各回約１００ｍｌの液量）、次にイソプロパノールで４回洗浄した（各回約１００ｍｌの液量）。チタン層は、ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によって、観察可能であった。
【０１３６】
＜実施例１２＞：
２．０ｇのビーズを、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、２５ｍｌの液量／各回）。粒子の乾燥成分を９．５重量％に調整し、テトラブチルオルトチタネート（１３．０ｇ）を添加した。室温で１時間混合物を撹拌した後、水（０．４５ｇ）を添加した。混合物を更に、室温で１８時間撹拌した。上記粒子を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で６回、水で５回洗浄した。チタン層は、ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によって、観察可能であった。
【０１３７】
＜実施例１３＞：
１．５ｇのビーズを、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、２０〜４０ｍｌの液量／各回）。最終的な懸濁液を、１８．８２ｇの重量に調整した。
【０１３８】
６．５２ｇのテトラブチルオルトチタネートを添加し、懸濁液を室温で２５０回転／分で撹拌した。９０分撹拌した後、３３０μｌのＨＮＯ３溶液（ｐＨ＝１）を添加した。懸濁液を、更に１８時間撹拌した。
【０１３９】
１８時間後に、上記粒子を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で９回洗浄し（各回約５０ｍｌの液量）、次にイソプロパノールで４回（約１０５０ｍｌの液量／各回）洗浄した。チタン層は、ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によって、観察可能であった。
【０１４０】
＜実施例１４＞：
１．５ｇのビーズを、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、２０〜４０ｍｌの液量／各回）。最終的な懸濁液を１８．８２ｇの重量に調整した。
【０１４１】
６．５２ｇのテトラブチルオルトチタネートを添加し、懸濁液を室温で２５０回転／分で撹拌した。９０分撹拌した後、３３０μｌのＮＨ４ＯＨ溶液（ｐＨ＝１１）を添加した。懸濁液を、更に１８時間撹拌した。
【０１４２】
１８時間後に、上記粒子を、２ビス（２−メトキシエチルエーテル）で９回洗浄し（各回約５０ｍｌの液量）、次にイソプロパノールで４回洗浄した（各回約５０ｍｌの液量）。チタン層は、ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によって、観察可能であった。
【０１４３】
＜実施例１５＞：
エポキシドでコーティングされ、カルボン酸で官能化されているビーズ１ｇを、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、２０〜４０ｍｌの液量／各回）。最終的な懸濁液を、１０．５５ｇの重量に調整した。
【０１４４】
６．５２ｇのテトラブチルオルトチタネートを添加し、懸濁液を室温で２５０回転／分で撹拌した。６０分撹拌した後、２２０μｌの水を添加した。懸濁液を、更に１８時間撹拌した。
【０１４５】
１８時間後に、上記粒子を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で５回洗浄し（各回約５０ｍｌの液量）、次に水で２０回洗浄した（各回約５０ｍｌの液量）。チタン層は、ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によって、観察可能であった。
【０１４６】
＜実施例１６＞：
４ｇのエポキシドコートされたビーズ（約３３５ｍｇのＦｅ含量／ｇ ＤＳ）を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、５０〜８０ｍｌの液量／各回）。最終的な懸濁液を、４２．２２ｇの重量に調整した。
【０１４７】
２５．９５ｇのテトラブチルオルトチタネートを添加し、懸濁液を室温で２５０回転／分で撹拌した。６０分撹拌した後、８９０μｌの水を添加した。懸濁液を、更に１８時間撹拌した。
【０１４８】
１８時間後に、上記粒子を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で５回洗浄し（各回約８０ｍｌの液量）、次に水で５回洗浄した（各回約８０ｍｌの液量）。チタン層は、ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によって、観察可能であった。
【０１４９】
＜実施例１７＞：
エポキシコートされたビーズ２．０ｇ（約４３５ｍｇのＦｅ含量／ｇ ＤＳ）を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、２５ｍｌの液量／各回）。粒子の乾燥成分を９．５重量％に調整し、テトラブチルオルトチタネート（１３．０ｇ）を添加した。室温で１時間混合物を撹拌した後、水（０．４５ｇ）を添加した。混合物を更に、室温で１８時間撹拌した。上記粒子を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で６回洗浄し、水で７回洗浄した。チタン層は、ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によって、観察可能であった。
【０１５０】
＜実施例１８＞：
２．０ｇのダイナビーズ（登録商標）ＲＰＣ １８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌ ＡＳ社製、オスロ、ノルウェー）を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、２５ｍｌの液量／各回）。粒子の乾燥成分を、１１．７重量％に調整した。テトラブチルオルトチタネート（１３．０ｇ）続いてビス（２−メトキシエチルエーテル）（４．０ｇ）を添加した。室温で、２５０回転／分で１時間混合物を撹拌した後、水（０．４５ｇ）を添加した。混合物を更に、室温で１８時間撹拌した。上記粒子を、５０ｍｌのビス（２−メトキシエチルエーテル）で６回洗浄し、５０ｍｌの水で７０回洗浄した。チタン層は、ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によって、観察可能であった。
【０１５１】
＜実施例１９＞：
２．５ｇのダイナビーズ（登録商標）ＲＰＣプロテイン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌ ＡＳ社製、オスロ、ノルウェー）を、ビス（２−メトキシエチルエーテル）で洗浄した（５回洗浄、３０ｍｌの液量／各回）。粒子の乾燥成分を、１１．７重量％に調整した。テトラブチルオルトチタネート（１６．２ｇ）、続いてビス（２−メトキシエチルエーテル）（５．０ｇ）を添加した。室温で、２５０回転／分で１時間混合物を撹拌した後、水（０．５６ｇ）を添加した。混合物を更に、室温で１８時間撹拌した。上記粒子を、５０ｍｌのビス（２−メトキシエチルエーテル）で１０回、５０ｍｌの水で２０回洗浄した。チタン層は、ＦＴ−ＩＲ（拡散反射率）によって、観察可能であった。
【０１５２】
＜本発明の粒子の、バイオセパレーションへの応用＞：
＜核酸の単離＞：
使用した一般的なプロトコル及び材料：
＜核酸の供給源＞：
ｄｓＤＮＡ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、ＣＡ、米国から市販されている ＨｉｎｄＩＩＩ λ−ＤＮＡラダー
ＲＮＡ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、ＣＡ、米国から市販されている ０．２４−９．５Ｋｂ ＲＮＡラダー
【０１５３】
＜使用する市販の緩衝液及び溶液＞：
（＊） ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ単離キット、Ａｍｂｉｏｎ（ＴＸ、米国）社製。
（＊＊）ＤＮＡ ＤＩＲＥＣＴ（商標）Ｂｌｏｏｄキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌ ＡＳ（オスロ、ノルウェー）社製。
（＊＊＊）ＤＮＡ ＤＩＲＥＣＴ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌ ＡＳ（オスロ、ノルウェー）社製。
（＊＊＊＊）ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ（登録商標）Ｖｉｒｕｓ Ｍｉｎｉ Ｍ４８キット、Ｑｉａｇｅｎ（ＣＡ、米国）社製。
（＊＊＊＊＊）ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄキット、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社 ＧｍｂＨ（マンハイム、ドイツ）社製。
（＊＊＊＊＊＊）ダイナビーズ（登録商標）ｇＤＮＡ Ｓｉｌａｎｅキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌ ＡＳ（オスロ、ノルウェー）社製。
【０１５４】
ＲＮＡ及びｄｓＤＮＡの収率は、分光測光法による分析、及び臭化エチジウム染色したアガロースゲル電気泳動により測定した。
【０１５５】
＜実施例２０＞：
＜二酸化チタン（実施例１０）及び二酸化ジルコニウム（実施例２）磁性ビーズを使用した、血清からの二重鎖ＤＮＡの精製＞：
自動化システムにおいて、ｄｓＤＮＡと結合し、溶出させる、二酸化チタン及び二酸化ジルコニウム磁性ビーズの能力を示す試験において、１００μｌの血清、１００μｌのプロテインキナーゼＫ、１５０μｌの１００％イソプロパノール及び３００μｌのグアニジンチオシアネートを含有する溶解／結合溶液（＊）を含んでなるチューブ中で、合計５μｇのｄｓＤＮＡを、実施例２又は１０に係るビーズ２ｍｇに添加した。上記溶液を、一定速度で混合しながら室温で１０分間インキュベートした。磁場中でビーズを回収した後、上清を除去した。ビーズのペレットを次に、グアニジンチオシアネート及びイソプロパノールを含んでなる溶液（＊）８５０μｌで洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、上清をビーズから除去した。ビーズのペレットを次に、エタノールを含んでなる溶液（＊）４５０μｌで２回洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。ビーズ溶液を一定速度で混合しながら８０℃で１０分間加熱することによって、１００μｌ溶出緩衝液（＊）中にｄｓＤＮＡを溶出させた。ビーズを磁場中で回収し、溶出されたｄｓＤＮＡを含んでなる上清をビーズから除去し、新しいチューブに移した。ｄｓＤＮＡの収率を図１及びテーブル１に示す。
【０１５６】
（表１）チタンおよびジルコニウムを有する磁性ビーズを用いて血清から単離した、添加ｄｓＤＮＡ ５μｇの収率
【０１５７】
＜実施例２１＞：
＜二酸化チタン（実施例１０）及び二酸化ジルコニウム（実施例２）磁性ビーズを使用した、血清からのＲＮＡの精製＞：
自動化システムにおいて、ＲＮＡと結合し、溶出させる、二酸化チタン及び二酸化ジルコニウム磁性ビーズの能力を示す試験において、１００μｌの血清、１００μｌのプロテインキナーゼＫ、１５０μｌの１００％イソプロパノール及び３００μｌのグアニジンチオシアネートを含有する溶解／結合溶液（＊）を含んでなるチューブ中で、合計５μｇのＲＮＡを、実施例２又は１０に係るビーズ２ｍｇに添加した。上記溶液を、絶えず混合しながら室温で１０分間インキュベートした。磁場中でビーズを回収した後、上清を除去した。ビーズのペレットを次に、グアニジンチオシアネート及びイソプロパノールを含んでなる溶液（＊）８５０μｌで洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。ビーズのペレットを次に、エタノールを含んでなる溶液（＊）４５０μｌで２回洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。ビーズ溶液を絶えず混合しながら８０℃で１０分間加熱することによって、１００μｌ溶出緩衝液（＊）中にＲＮＡを溶出させた。ビーズを磁場中で回収し、溶出されたＲＮＡを含んでなる上清をビーズから除去し、新しいチューブに移した。ＲＮＡの収率を図２及びテーブル２に示す。
【０１５８】
（表２）チタンおよびジルコニウムを有する磁性ビーズを用いて血清から単離した、添加ＲＮＡ ５μｇの収率
【０１５９】
＜実施例２２＞：
＜二酸化ジルコニウム磁性ビーズ（実施例２）を使用した、血清からの核酸の精製＞：
自動化システムにおいて、ＲＮＡ及びＤＮＡと結合し、溶出させる、二酸化ジルコニウム磁性ビーズの能力を示す試験において、１００μｌの血清、１００μｌのプロテインキナーゼＫ、１５０μｌの１００％イソプロパノール、及び３００μｌの、４〜６Ｍのグアニジンチオシアネート、１０〜２０％のトリトンＸ−１００、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６〜８）を含む溶解／結合溶液を含んでなるチューブ中で、合計５μｇのＲＮＡ及び５μｇのｄｓＤＮＡを、２ｍｇのビーズに添加した。上記溶液を、絶えず混合しながら室温で１０分間インキュベートした。磁場中でビーズを回収した後、上清を除去した。ビーズのペレットを次に、グアニジンチオシアネート及びイソプロパノールを含んでなる溶液（＊）８５０μｌで洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。ビーズのペレットを次に、エタノールを含んでなる溶液（＊）４５０μｌで２回洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。ビーズ溶液を絶えず混合しながら８０℃で１０分間加熱することによって、１００μｌ溶出緩衝液（＊）中にＲＮＡを溶出させた。ビーズを磁場中で回収し、溶出された核酸を含んでなる上清をビーズから除去し、新しいチューブに移した。核酸の収率を図３及びテーブル３に示す。
【０１６０】
（表３）ジルコニウムを有する磁性ビーズを用いて血清から単離した、添加核酸５μｇの収率
【０１６１】
＜実施例２３＞：
＜二酸化ジルコニウム磁性ビーズ（実施例１）を使用した、血清からの二重鎖ＤＮＡの精製＞：
ｄｓＤＮＡと結合し、溶出させる、二酸化ジルコニウム磁性ビーズの能力を示す試験において、１００μｌの血清及びグアニジンチオシアネートを含む８００μｌの溶解／結合溶液（＊）を含んでなるチューブ中で、合計５μｇのｄｓＤＮＡを、２ｍｇのビーズに添加した。上記溶液を、４分間慎重にボルテックスした。磁場中でビーズを回収した後、上清を除去した。ビーズのペレットを次に、グアニジンチオシアネート及びイソプロパノールを含んでなる溶液（＊）４００μｌで２回洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。ビーズのペレットを次に、エタノールを含んでなる溶液（＊）４００μｌで２回洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。ビーズのペレットを２分間空気乾燥し、次にビーズ溶液を７０℃で３分間加熱することによって、１００μｌの溶出緩衝液（＊）中にｄｓＤＮＡを溶出させた。ビーズを磁場中で回収し、溶出されたｄｓＤＮＡを含んでなる上清をビーズから除去し、新しいチューブに移した。ｄｓＤＮＡの収率を図４及びテーブル４に示す。
【０１６２】
（表４）ジルコニウムを有する磁性ビーズを用いて血清から単離した、添加ｄｓＤＮＡ ５μｇの収率
【０１６３】
＜実施例２４＞：
＜二酸化チタン磁性ビーズ（実施例９）を使用した、血清からの二重鎖ＤＮＡの精製＞：
ｄｓＤＮＡと結合し、溶出させる、二酸化チタン磁性ビーズの能力を示す試験において、ｄｓＤＮＡ量を増加させて（２．５、５、１５及び２０μｇ）、１００μｌの血清及びグアニジンチオシアネートを含む８００μｌの溶解／結合溶液（＊）を含んでなるチューブ中で、２ｍｇのビーズに添加した。上記溶液を、４分間慎重にボルテックスした。磁場中でビーズを回収した後、上清を除去した。ビーズのペレットを次に、グアニジンチオシアネート及びイソプロパノールを含んでなる溶液（＊）４００μｌで２回洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。ビーズのペレットを次に、エタノールを含んでなる溶液（＊）４００μｌで２回洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。ビーズのペレットを２分間空気乾燥し、次にビーズ溶液を７０℃で３分間加熱することによって、１００μｌの溶出緩衝液（＊）中にｄｓＤＮＡを溶出させた。ビーズを磁場中で回収し、溶出されたｄｓＤＮＡを含んでなる上清をビーズから除去し、新しいチューブに移した。ｄｓＤＮＡの収率を図５及びテーブル５に示す。
【０１６４】
（表５）チタンを有する磁性ビーズを用いて血清から単離した、増加量の添加ｄｓＤＮＡの収率
【０１６５】
＜実施例２５＞：
＜二酸化チタン（実施例９及び実施例１０）及び二酸化ジルコニウム（実施例１及び実施例２）磁性ビーズを使用した、血液からのゲノムＤＮＡの精製＞：
試験によって、ゲノムＤＮＡと結合し、溶出させる、二酸化チタン及び二酸化ジルコニウム磁性ビーズの能力を証明した。１００μｌのＥＤＴＡ血液に、１ｍｌのＲｅｄ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ緩衝液（＊＊）を添加した。上記溶液を、ローラー上で、室温で５分間インキュベートした。白血球を１４０００回転／分で遠心分離してペレット状にし、上清を除去した。０．５ｍｇのビーズを、キット（＊＊）中のビーズを含めずに、２００μｌの溶解／結合緩衝液と共に添加した。ビーズ懸濁液を更に混合せず、室温で５分間静置した。ビーズのペレットを次に、ペレットを再懸濁させずに、１ｍｌの１×洗浄緩衝液（＊＊）で慎重に洗浄した。磁場中でビーズを回収した後、上清を除去した。洗浄段階を２回繰り返した。ビーズのペレットに、１００μｌの再懸濁緩衝液（＊＊）を添加し、ビーズをピペッティングにより再懸濁した。ビーズ懸濁液を、６５℃で５分間加熱した。ビーズ懸濁液をピペッティングにより混合し、磁場中でビーズを回収した。上清を新しいチューブに移した。単離されたゲノムＤＮＡの、臭化エチジウム染色したアガロースゲル上での分析結果を図６に示す。
【０１６６】
＜実施例２６＞：
＜二酸化チタン（実施例９及び実施例１０）及び二酸化ジルコニウム（実施例１及び実施例２）磁性ビーズを使用した、血液からのゲノムＤＮＡの精製＞：
試験によって、ゲノムＤＮＡと結合し、溶出させる、二酸化チタン及び二酸化ジルコニウム磁性ビーズの能力を証明した。１０μｌのＥＤＴＡ血液に、キット（＊＊＊）のビーズを含めずに、２００μｌの溶解／結合緩衝液と共に、０．５ｍｇのビーズを添加した。ビーズの懸濁液を更に混合せず、室温で５分間静置した。ビーズのペレットを次に、ペレットを再懸濁させずに、２００μｌの１×洗浄緩衝液（＊＊＊）で慎重に洗浄した。磁場中でビーズを回収した後、上清を除去した。洗浄段階を１回繰り返した。ビーズのペレットに、２０μｌの再懸濁緩衝液（＊＊＊）を添加し、ビーズをピペッティングによって再懸濁させた。ビーズ懸濁液を、６５℃で５分間加熱した。ビーズ懸濁液をピペッティングにより混合し、磁場中でビーズを回収した。上清を新しいチューブに移した。単離されたゲノムＤＮＡの、臭化エチジウム染色したアガロースゲル上での分析結果を図７に示す。
【０１６７】
＜実施例２７＞：
＜二酸化チタン（例１２及び実施例１７）を使用した、血液からのゲノムＤＮＡの精製＞：
５０μｌプロテインキナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を、３５０μｌの血液に添加し、混合し、室温で２分間インキュベートした。溶解緩衝液（＊＊＊＊＊＊）を３５０μｌ添加し、混合した。５５℃で１０分間インキュベートした後に、２．０ｍｇのビーズを添加し、サンプルと混合した。４００μｌのイソプロパノールを添加し、ビーズ及びサンプルと混合し、ローラー上で３分間インキュベートした。ビーズを磁場中で回収し、上清を除去した。その後、ビーズを１ｍｌの洗浄緩衝液１（＊＊＊＊＊＊）で２回洗浄した。ビーズのペレットを、１ｍｌの洗浄緩衝液２（＊＊＊＊＊＊）中に再懸濁し、新しいチューブに移した。ビーズを磁場中で回収し、上清を除去し、最後に１ｍｌの洗浄緩衝液２（＊＊＊＊＊＊）でビーズを洗浄した。ビーズをペレット状にし、上清を除去した後、５〜１０分間空気乾燥した。１００μｌ溶出緩衝液（＊＊＊＊＊＊）を添加し、ビーズ懸濁液をピペッティングにより混合し、次に磁場中でビーズを回収した。溶出されたＤＮＡを含有する上清を、新しいチューブに移した。単離されたゲノムＤＮＡの、臭化エチジウム染色したアガロースゲル上での分析結果を図８に示す。
【０１６８】
＜実施例２８＞：
＜二酸化チタン（実施例９）磁性ビーズ及び異なる緩衝液組成を使用した、血清から二重鎖ＤＮＡの精製＞：
二酸化チタンが、ｄｓＤＮＡと結合し、溶出するためには、特定の緩衝液組成を必要とすることを証明する試験において、磁性シリカベースのビーズを含んでなる２つの異なる市販キットを用いた。キット中の磁性ビーズを実施例９の二酸化チタン磁性ビーズで置き換えてプロトコルを実施した。第１のプロトコルは、１００μｌの血清、１３０μｌの溶解ＡＬ緩衝液（＊＊＊＊）及び２０μｌのプロテイナーゼ（＊＊＊＊）中に、合計５μｇのｄｓＤＮＡを添加することにより実施した。これを５６℃で１５分間インキュベートした。実施例９の２ｍｇのビーズと、１３０μｌの１００％イソプロパノールとを混合物に添加し、一定速度で混合しながら室温で１０分間インキュベートした。磁場中でビーズを回収した後、上清を除去した。ビーズのペレットを次に、４００μｌのＡＷ１（＊＊＊＊）で洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。ビーズのペレットを次に、４００μｌのＡＷ２（＊＊＊＊）で洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。ビーズのペレットを次に、４００μｌの９６％エタノールで洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。１００μｌ溶出緩衝液（＊＊＊＊）中にｄｓＤＮＡを溶出させた。ビーズを磁場中で回収し、溶出されたｄｓＤＮＡを含んでなる上清をビーズから除去し、新しいチューブに移した。
【０１６９】
第２のプロトコルは、１００μｌの血清、１００μｌのプロテインキナーゼＫ（＊＊＊＊＊）、１５０μｌの１００％イソプロパノール及び３００μｌの溶解／結合緩衝液（＊＊＊＊＊）を含んでなるチューブ中で、２ｍｇの実施例９のビーズに、合計５μｇのｄｓＤＮＡを添加することにより実施した。これを一定速度で混合しながら、室温で１０分間インキュベートした。磁場中でビーズを回収した後、上清を除去した。ビーズのペレットを次に、８５０μｌの洗浄緩衝液Ｉ（＊＊＊＊＊）で洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。ビーズのペレットを次に、４５０μｌの洗浄緩衝液ＩＩ（＊＊＊＊＊）で洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。ビーズのペレットを次に、４５０μｌの洗浄緩衝液ＩＩＩ（＊＊＊＊＊）で洗浄した。ビーズを磁場中で回収した後、ビーズから上清を除去した。１００μｌ溶出緩衝液（＊＊＊＊＊）中にｄｓＤＮＡを溶出させた。ビーズを磁場中で回収し、溶出されたｄｓＤＮＡを含んでなる上清をビーズから除去し、新しいチューブに移した。
【０１７０】
結果を図９に示す。
【０１７１】
＜リン酸化タンパク質の単離＞：
＜実施例２９＞：
リン酸化ペプチドの標準混合物［アンジオテンシンＩＩ（ＤＲＶＹＩＨＰＦ、１０４６．５４）、アンジオテンシンＩ（ＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬ、１２９６．８８）、ミエリン塩基性タンパク質断片１０４−１１８（ＧＫＧＲＧＬＳＬＳＲＦＳＷＧＡ、１５７８．８５）、ｐＴｐＹペプチド（ＭＡＰキナーゼ断片１７７−１８９、ＤＨＴＧＦＬｐＴＥｐＹＶＡＴＲ、１６６９．６７）、ｐＹペプチド（インシュリン受容体断片１１４２−１１５３（ＴＲＤＩｐＹＥＴＤＹＹＲＫ、１７０２．７５））、ｐＴペプチド（ＶＰＩＰＧＲＦＤＲＲＶｐＴＶＥ、１７２０．８９）、ｐＳペプチド（ＲＩＩリン酸化ペプチド断片８１−９９、ＤＬＤＶＰＩＰＧＲＦＤＲＲＶｐＳＶＡＡＥ、２１９２．０８）］を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（ＣＡ、米国）から購入した。
【０１７２】
上記リン酸化ペプチド標準混合物を、ｉＴＲＡＱ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＣＡ、米国）１１４、１１５、１１６又は１１７を用いて、製造業者の指示に従い、アイソトープ標識した。
【０１７３】
ｉＴＲＡＱで標識したペプチド（２ｐｍｏｌ／μｌストックを５μｌ）のアリコートを、５０％の酢酸２μｌで酸性化し、３６μｌの結合緩衝液（０．１％のＴＦＡ又は３００ｍｇ／ｍｌのＤＨＢ／８０％のアセトニトリル／０．１％のＴＦＡ）で希釈し、次に、５０ｍｇ／ｍｌの実施例９のビーズの８μｌと１０分間インキュベートするか、又は、それらを、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）２０ＭＣ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ＣＡ、米国）（約３ｍｍのパッキング長）若しくはＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ（トランス、ＣＡ）から購入した二酸化チタン球体でプレパックされたＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）ＧＥＬｏａｄｅｒ（登録商標）ｔｉｐ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ社、ハンブルグ、ドイツ）を通過させ、リン酸化ペプチド濃縮の相対的な効率を比較した。
【０１７４】
十分に洗浄（０．１％のＴＦＡ中の、８０％のアセトニトリル）した後、リン酸化ペプチドを、溶出緩衝液（０．３Ｎ水酸化アンモニウム中の、５０ｍＭのフェニルリン酸ナトリウム）１０μｌを用いて溶出させた。
【０１７５】
量的な捕捉効率（２つの異なる親和性化合物及び２つの異なる支持体により単離されたリン酸化ペプチド）を比較するため、溶出された材料を、５０％酢酸４μｌと混合して酸性化し、続いてセルフパックのＰｏｒｏｓ（登録商標）Ｒ２ ｔｉｐカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ＣＡ、米国）で脱塩した。リン酸化ペプチドをＭＡＬＤＩプレート上に直接溶出させ、ＣＨＣＡ（α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸）マトリックスと１：１の比率で混合し、４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ＣＡ．米国）を使用して分析した。
【０１７６】
サンプル分析の前に、ＣＩＤ ｇａｓセルをパージし、アイソトープ比率がレポーターイオンの範囲内で安定化するようにした。合計１４，０００のレーザーショットを用い、フラグメントイオンのシグナルを平均化した。ＭＳ／ＭＳ（タンデムＭＳ）スペクトルのレポーターイオンの強度比率を調べることにより、マニュアル操作により定量化を実施した。
【０１７７】
得られた結果を図１０ＡからＤに示す。円で印を付けたピークは、混入物質のピークである。ＤＨＢの存在が、二酸化チタン球体を使用したリン酸化ペプチドの特異的な濃縮の最適化にとり重要であることは、明らかである。対照的に、ＤＨＢの存在は、実施例９の磁性二酸化チタンでコートされた「ダイナビーズ−ＴｉＯ２」粒子を使用した濃縮の特異性にはほとんど影響を及ぼさなかった。更に、本発明の粒子の単離性能は、二酸化チタン粒子を使用したいかなる比較単離例よりも良好であった。
【０１７８】
＜実施例３０＞：
ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％のＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＣＡ．米国）を含むＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＣＡ．米国）で維持した。ＳＩＬＡＣ標識のために、ＨｅＬａ細胞のアリコートを、１０％の透析後ＦＢＳを含有し、軽Ｌ−リジン及び軽Ｌ−アルギニン（軽培地）、又は、重［Ｕ−１３Ｃ６］Ｌ−リジン及び重［Ｕ−１３Ｃ６、１５Ｎ４］Ｌ−アルギニン（重培地）で補充した、ＳＩＬＡＣ ＤＭＥＭ培地中で、少なくとも６回の倍加期間（約１０日）にわたり増殖させた。対応する血清フリーの軽又は重培地で一晩飢餓状態に置いた後、重培地（５０×１０６細胞）で標識したＨｅＬａ細胞を、１５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで５分間刺激し、一方、軽培地（５０×１０６細胞）で標識したＨｅＬａ細胞は無処理のままにした。刺激の後、重培地で標識した細胞と、軽培地で標識した細胞とを、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ−４０、０．１％のデオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１０ｍＭのＮａＦ及びプロテアーゼ阻害剤カクテルを含んでなる、ＮＰ−４０溶解緩衝液中で直ちに溶解させた。
【０１７９】
細胞可溶化物を１００，０００×ｇで１５分間遠心分離して透明にし、混合された細胞可溶化物を、ダイナビーズにコンジュゲートしたホスホチロシン抗体（ＰＹ−Ｐｌｕｓ）又はアガロースビーズにコンジュゲートした４Ｇ１０ホスホチロシン抗体約５０μｇを用いて免疫沈降させた。４℃で２時間穏やかに回転させて混合した後、ダイナビーズを磁石により捕捉し、一方、アガロースビーズは遠心分離により回収した。ビーズを溶解緩衝液で５回洗浄し、次に１００ｍＭのグリシン（ｐＨ２．５）５０μｌで溶出させた。溶出液を、１Ｍトリスで中和し、１０ｍＭのＤＴＴで還元し、１×ＳＤＳサンプルバッファー中の３０ｍＭヨードアセトアミドによってアルキル化し、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離させた。タンパク質のバンドをゲルから切り出し、ゲルをトリプシン消化した。ペプチド抽出物を、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃを使用して乾燥させた。
【０１８０】
抽出液を、２４μｌの結合緩衝液中で１０分間、実施例９の粒子２５０μｇとインキュベートし、リン酸化ペプチドを単離した。上記粒子を洗浄緩衝液で５回洗浄し、次に溶出緩衝液１０μｌにより溶出させた。溶出されたリン酸化ペプチドを５０％の酢酸２μｌによって酸性化し、次にセルフパックのＰｏｒｏｓＲ２ ｔｉｐカラムで脱塩し、続いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦを使用して分析した。
【０１８１】
図１１ａは、本発明の粒子とのインキュベート前の、抽出液の典型的なＭＳを示す。図１１ｂは、インキュベート後の、同じ抽出液のＭＳを示す。そのスペクトルは非常に単純化されており、捕捉されたリン酸化ペプチドの同定が容易であった。２３２２．１のピークが、ＥＧＦＲに由来する、重い１３Ｃ６−Ｌｙｓ−標識リン酸化ペプチドＧＳＨＱＩＳＬＤＮＰＤｐＹＱＱＤＦＦＰＫと同定された。
【０１８２】
試験の結果は、特異的な残基におけるリン酸化レベルの定量化が実施可能であることを示すものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリスチレン又はポリアクリレートを含んでなるポリマー微粒子であって、４族金属若しくは５族金属又はＡｌのうちの少なくとも１つの遷移金属の酸化物、又はそれらの混合物で形成されたコーティングを有する微粒子。
【請求項２】
磁性を有する、請求項１記載の微粒子。
【請求項３】
前記少なくとも１つの遷移金属酸化物によるコーティングの前に、磁性材料が、粒子の表面上へ吸着される、請求項２記載の微粒子。
【請求項４】
多孔性である、請求項１から３のいずれか１項記載の微粒子。
【請求項５】
前記磁性材料が、前記少なくとも１つの遷移金属酸化物によるコーティングの前に、粒子の孔中に沈着される、請求項２又は４記載の微粒子。
【請求項６】
前記少なくとも１つの遷移金属酸化物によるコーティングの前に、更なる高分子コーティング層によって被覆される、請求項１から５のいずれか１項記載の微粒子。
【請求項７】
単分散性である、請求項１から６のいずれか１項記載の微粒子。
【請求項８】
０．２〜１０μｍの直径を有する、請求項１から７のいずれか１項記載の微粒子。
【請求項９】
前記遷移金属酸化物が、チタン、タンタル、ニオブ又はジルコニウムの酸化物である、請求項１から８のいずれか１項記載の微粒子。
【請求項１０】
スチレンジビニルベンゼン粒子である、請求項１から９のいずれか１項記載の微粒子。
【請求項１１】
ポリスチレン又はポリアクリレートを含んでなるポリマー微粒子と、酸化物に変換されうる、４族若しくは５族の金属又はＡｌのうちの少なくとも１つの遷移金属化合物又はそれらの混合物とを反応させる段階と、
例えば熱及び／又は水を加えることにより、遷移金属酸化物コーティングを形成させる段階と
を有してなる、請求項１から１０のいずれか１項記載の微粒子の調製のための方法。
【請求項１２】
事前に、前記微粒子の出発材料の表面が官能化される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記微粒子の表面が官能化されて、アミノ基、ヒドロキシ基、エポキシド基、カルボキシ基又はシロキシ基を担持する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記遷移金属化合物がアルコキシドである、請求項１１から１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記アルコキシドが、テトラ（Ｃ１−６）のジルコニウム又はチタンのアルコキシドである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも２つの段階で実施される方法であって、
第１の段階が、無水環境において遷移金属化合物と微粒子とを接触させることを含んでなり、
第２の段階が、該第１段階の生成物に水を添加することを含んでなる、
請求項１１から１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
リン酸化タンパク質を含んでなるサンプルからリン酸化タンパク質を単離するための方法であって、請求項１から１０記載のポリマー微粒子と該サンプルとを接触させる段階を含んでなる方法。
【請求項１８】
（Ｉ）１つまたは複数のリン酸化タンパク質を含んでなるサンプルを準備する段階と、
（ＩＩ）該サンプルと単分散のポリマー微粒子とを混合する段階と、
（ＩＩＩ）該サンプルと該粒子とをインキュベートする段階と、
（ＩＶ）該粒子を任意に磁場中で回収し、上清を除去する段階と、
任意で（Ｖ）１つまたは複数の単離されたリン酸化タンパク質を溶出させる段階と
を含んでなる、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
段階（Ｖ）が、フェニルホスフェート及び水酸化アンモニウムを含んでなる緩衝液の存在下で実施される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
段階（ＩＩ）が、水、エタノール及び酢酸ナトリウムを含んでなり且つ３．９〜４．１のｐＨを有する緩衝液の存在下で実施される、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
段階（ＩＩ）が、ＤＨＢの非存在下で実施される、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
リン酸化タンパク質の単離における、請求項１から１０のいずれか１項記載のポリマー微粒子の使用。
【請求項２３】
フェニルホスフェート及び水酸化アンモニウムを含んでなる緩衝液。
【請求項２４】
核酸を含んでなるサンプルから核酸を単離するための方法であって、請求項１から１０のいずれか１項記載のポリマー微粒子と該サンプルとを接触させる段階を含んでなる方法。
【請求項２５】
核酸と微粒子との接触が、カオトロピック緩衝液の存在下で生じる、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
（Ｉ）１つまたは複数の核酸を含むサンプルを準備する段階と、
（ＩＩ）該サンプルと、遷移金属酸化物でコーティングされた微粒子とを前記したように混合する段階と、
（ＩＩＩ）該サンプルと該粒子とをインキュベートする段階と、
（ＩＶ）該粒子を任意に磁場中で回収し、上清を除去する段階と、
（Ｖ）任意で、１つまたは複数の単離された核酸を溶出させる段階と
を含んでなる、サンプルから核酸を単離するための請求２４又は２５記載の方法。
【請求項２７】
核酸の単離への、請求項１から１０のいずれか１項記載のポリマー微粒子の使用。
【請求項２８】
請求項１から１０記載のポリマー微粒子と、カオトロピック緩衝液とを含んでなる、核酸単離用のキット。
【請求項１】
ポリスチレン又はポリアクリレートを含んでなるポリマー微粒子であって、４族金属若しくは５族金属又はＡｌのうちの少なくとも１つの遷移金属の酸化物、又はそれらの混合物で形成されたコーティングを有する微粒子。
【請求項２】
磁性を有する、請求項１記載の微粒子。
【請求項３】
前記少なくとも１つの遷移金属酸化物によるコーティングの前に、磁性材料が、粒子の表面上へ吸着される、請求項２記載の微粒子。
【請求項４】
多孔性である、請求項１から３のいずれか１項記載の微粒子。
【請求項５】
前記磁性材料が、前記少なくとも１つの遷移金属酸化物によるコーティングの前に、粒子の孔中に沈着される、請求項２又は４記載の微粒子。
【請求項６】
前記少なくとも１つの遷移金属酸化物によるコーティングの前に、更なる高分子コーティング層によって被覆される、請求項１から５のいずれか１項記載の微粒子。
【請求項７】
単分散性である、請求項１から６のいずれか１項記載の微粒子。
【請求項８】
０．２〜１０μｍの直径を有する、請求項１から７のいずれか１項記載の微粒子。
【請求項９】
前記遷移金属酸化物が、チタン、タンタル、ニオブ又はジルコニウムの酸化物である、請求項１から８のいずれか１項記載の微粒子。
【請求項１０】
スチレンジビニルベンゼン粒子である、請求項１から９のいずれか１項記載の微粒子。
【請求項１１】
ポリスチレン又はポリアクリレートを含んでなるポリマー微粒子と、酸化物に変換されうる、４族若しくは５族の金属又はＡｌのうちの少なくとも１つの遷移金属化合物又はそれらの混合物とを反応させる段階と、
例えば熱及び／又は水を加えることにより、遷移金属酸化物コーティングを形成させる段階と
を有してなる、請求項１から１０のいずれか１項記載の微粒子の調製のための方法。
【請求項１２】
事前に、前記微粒子の出発材料の表面が官能化される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記微粒子の表面が官能化されて、アミノ基、ヒドロキシ基、エポキシド基、カルボキシ基又はシロキシ基を担持する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記遷移金属化合物がアルコキシドである、請求項１１から１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記アルコキシドが、テトラ（Ｃ１−６）のジルコニウム又はチタンのアルコキシドである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも２つの段階で実施される方法であって、
第１の段階が、無水環境において遷移金属化合物と微粒子とを接触させることを含んでなり、
第２の段階が、該第１段階の生成物に水を添加することを含んでなる、
請求項１１から１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
リン酸化タンパク質を含んでなるサンプルからリン酸化タンパク質を単離するための方法であって、請求項１から１０記載のポリマー微粒子と該サンプルとを接触させる段階を含んでなる方法。
【請求項１８】
（Ｉ）１つまたは複数のリン酸化タンパク質を含んでなるサンプルを準備する段階と、
（ＩＩ）該サンプルと単分散のポリマー微粒子とを混合する段階と、
（ＩＩＩ）該サンプルと該粒子とをインキュベートする段階と、
（ＩＶ）該粒子を任意に磁場中で回収し、上清を除去する段階と、
任意で（Ｖ）１つまたは複数の単離されたリン酸化タンパク質を溶出させる段階と
を含んでなる、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
段階（Ｖ）が、フェニルホスフェート及び水酸化アンモニウムを含んでなる緩衝液の存在下で実施される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
段階（ＩＩ）が、水、エタノール及び酢酸ナトリウムを含んでなり且つ３．９〜４．１のｐＨを有する緩衝液の存在下で実施される、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
段階（ＩＩ）が、ＤＨＢの非存在下で実施される、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
リン酸化タンパク質の単離における、請求項１から１０のいずれか１項記載のポリマー微粒子の使用。
【請求項２３】
フェニルホスフェート及び水酸化アンモニウムを含んでなる緩衝液。
【請求項２４】
核酸を含んでなるサンプルから核酸を単離するための方法であって、請求項１から１０のいずれか１項記載のポリマー微粒子と該サンプルとを接触させる段階を含んでなる方法。
【請求項２５】
核酸と微粒子との接触が、カオトロピック緩衝液の存在下で生じる、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
（Ｉ）１つまたは複数の核酸を含むサンプルを準備する段階と、
（ＩＩ）該サンプルと、遷移金属酸化物でコーティングされた微粒子とを前記したように混合する段階と、
（ＩＩＩ）該サンプルと該粒子とをインキュベートする段階と、
（ＩＶ）該粒子を任意に磁場中で回収し、上清を除去する段階と、
（Ｖ）任意で、１つまたは複数の単離された核酸を溶出させる段階と
を含んでなる、サンプルから核酸を単離するための請求２４又は２５記載の方法。
【請求項２７】
核酸の単離への、請求項１から１０のいずれか１項記載のポリマー微粒子の使用。
【請求項２８】
請求項１から１０記載のポリマー微粒子と、カオトロピック緩衝液とを含んでなる、核酸単離用のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【公表番号】特表２０１１−５０３２４４（Ｐ２０１１−５０３２４４Ａ）
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４３１９９（Ｐ２００９−５４３１９９）
【出願日】平成１９年１２月１９日（２００７．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８８２３５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７９９０５
【国際公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【出願人】（５０６００１５１６）
【出願人】（５０９１７４４４０）ユニバーシティー オブ サウザン デンマーク (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１９日（２００７．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８８２３５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７９９０５
【国際公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【出願人】（５０６００１５１６）
【出願人】（５０９１７４４４０）ユニバーシティー オブ サウザン デンマーク (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]