液体中の細菌の検出
飲料水、液体状の食物、飲み物、また、尿、脊髄液、羊水のような生物学的な液体のような、溶液、乳剤、懸濁液の形態をとる、水を含む液体中の細菌を光の散乱を測定して検出する方法。細菌を含むと思われる液体はまず予想の細菌より寸法の大きい粒子を除去するため濾過される。他の濾過方法は検査液の異なる構成物を除去するため追加して使用される。イオン交換クロマトグラフィーはそのような方法である。細菌による汚染の確認とそのレベルの算出は測定された散乱分布と予め格納された較正散乱分布とを合致させることでおこなわれる。光散乱測定に適したキュベットユニットを含む、測定を実行するシステムが提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に体液の分析に関する。本発明は特に細菌の存在に関する尿の光学的検査、光散乱測定および濾過に関する。
【背景技術】
【０００２】
溶液、乳剤、懸濁液のような水を含む液体は生物学的状況においてごく普通である。これらの水を含む液体は、人や動物が消費するため携行できる水、液状の食品、飲み物、尿、羊水、脊髄液を含む。このような液体は細菌の存在を時々検査される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
尿道感染をスクリーニングする検査ストリップは市販されている。このようなストリップは二つの異なるパッドに埋め込まれた特定の試薬を含む。一つのパッドはサンプルに白血球エステラーゼの存在を検査する試薬を含む。もう一つのパッドは亜硝酸菌の存在を検査するため、亜硝酸塩の分析をする試薬を含む。細菌感染の検出は、着色したパッドを目盛りつきカラーチャートの色の等級と比較して実施される。欧州公開特許公報番号０３２０１５４は、同様なアプローチに基づく尿のスクリーニング方法を開示している。この方法は特定の試薬と混合した尿サンプルの一部の上で、少なくとも二つの分割した分析の実行を含む。一つの分析は白血球の存在を検出し、もう一つは亜硝酸塩のような細菌に生成される化合物の存在を検出する。しかし上記の方法は、含まれる特定の試薬により検出できるものを生成しない細菌は検出できない。これらの方法はテストサンプルの比較的高濃度の細菌濃度に基づいており、そのためこのようなスクリーニングプロセスは感度が不十分の傾向があり、比較的特異度が低い傾向にある。さらにこれらのスクリーニング方法は患者のうちの特定の人に限られる；例えば子供や妊婦には適用すべきでない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の液体中の細菌を検出する方法は、サンプル液体を濾過して細菌より大きな粒子を除去し、前記サンプル液体を平行光線で照明し、前記サンプル液体による散乱光の強度を少なくとも１点で測定し、前記散乱光をキャリブレーションスケールと比較するステップを含む液体中の細菌を検出する方法である。
【０００５】
本発明の液体中の細菌を検出する方法は、前記液体の第二サンプルを濾過して前記細菌より小さい予め定められた限界より大きい粒子を除去し、前記第二サンプル液体を平行光線で照明し、前記第二サンプル液体による散乱光の強度を少なくとも１点で測定し、前記散乱光をキャリブレーションスケールと比較することを更に含む方法である。
【０００６】
本発明の液体中の細菌を検出する方法は、散乱分布を前記測定強度と関連づける方法である。
【０００７】
本発明の液体中の細菌を検出する方法は、前記関連づけられた散乱分布を、予め格納された較正散乱分布および予め格納された較正散乱分布の一次結合からなる項目の表から選択された項目と合致させることを更に含む方法である。
【０００８】
本発明の液体中の細菌を検出する方法は、前記平行光線を偏光させることを含む方法である。
【０００９】
本発明の液体中の細菌を検出する方法は、前記測定が少なくとも１つの波長に関しておこなわれる方法である。
【００１０】
本発明の液体中の細菌を検出する方法は、前記照明が少なくとも１つのレーザーダイオードでおこなわれる方法である。
【００１１】
本発明の液体中の細菌を検出する方法は、前記濾過の前に、化学的および生物化学的試薬を含む試薬群から選択された少なくとも１つの試薬を、前記サンプル液体に更に加えることを含む方法である。
【００１２】
本発明の液体中の細菌を検出する方法は、酸性化、アルカリ性化、クロマトグラフィーによる分離、それらの組み合わせを含む反応の群から選択された反応により、前記サンプル液体を反応させることを更に含む方法である。
【００１３】
本発明の液体中の細菌を検出する方法は、７０℃までの加熱、２℃までの冷却を含む手段の群から選択された手段により、前記サンプル液体の物理状態を変化させることを更に含む方法である。
【００１４】
本発明のキュベットユニットは、少なくとも１つのキュベットは、少なくとも規定の波長範囲の光に透明な少なくとも１つの窓を含み、前記窓の表面粗さ値の二乗平均平方根は１ナノメーターを超えず、前記窓内の屈折率ばらつきは０．０００１を超えないキュベットユニット（ＣＵ）である。
【００１５】
本発明のキュベットユニットは、少なくとも１つのキュベットは、少なくとも規定の波長範囲の光に透明な少なくとも１つの窓を含み、前記窓の幅は５００μｍを超えないキュベットユニット（ＣＵ）である。
【００１６】
本発明のキュベットユニットは、遮光手段が少なくとも１つの窓に配置されているＣＵである。
【００１７】
本発明のキュベットユニットは、少なくとも１つの前記キュベットに絞りの開口部が配置されているＣＵである。
【発明の効果】
【００１８】
臨床細菌学実験室では、分析サンプルの大部分が尿サンプルである。尿サンプルの通常の分析は顕微鏡観察と培養を含み、熟練したオペレーターを必要とし、時間と資源を消費する。そのため高価で時間のかかる分析方法のかなりの部分を除くことができる、安価で速いスクリーニング方法は有益である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（本発明の詳細な記載）
本発明のシステムは、水、溶液、ゲル、乳剤、懸濁液、液状の食品、飲み物、尿、脊髄液、羊水、血清のような水を含む液体中の細菌を検出する方法を提供する。本発明によるシステムの実施態様の記述において、本発明による細菌の検出システムの概略を示す図１を最初に参照する。システムは、検査液体のサンプルを光学的に検査する光学ユニット２からなる。光学ユニットにリンクしたプロセッサー４は測定と計算を実行し、光学ユニット２を作動させる。ユーザーインターフェースユニットは、図示しないが、プロセッサー４にリンクし、通常、測定結果とオペレーターへの指示を表示するディスプレイとデータを入力するキーボードからなる。パワーサプライは、図示しないが、光学ユニットとオペレーターインターフェースユニット、プロセッサーに電力を供給する。
【００２０】
（光学ユニット）
光学ユニット２は、光ビームを生成する光源５を含む。光ビームはコリメータ６により平行にされる。単レンズまたは組み合わせレンズからなる集光レンズ７は、検査する液体サンプルからの光を受光ユニット８に集光する。取り付け可能な、液体のサンプルを保持したキュベットユニット（ＣＵ）９が、コリメータ６と集光レンズ７の間に置かれる。ＣＵのいくつかの別の構造的な特徴を以下に述べる。一般的にキュベットという言葉は、以後、液体サンプルを保持でき、光学ユニット内に取り付けられる透明な容器を意味する。
【００２１】
光線１０は光源５から放射された照明ビームをあらわす。光ビームは、単レンズまたは組み合わせレンズ１２からなるコリメータ６と開口部１４を含む絞りにより平行にされる。光線１６であらわされる平行にされた光のビームは窓１８とキュベット内の液体を通り抜ける。遮光手段１９は、直接の照明光が受光ユニット８を貫通することを防ぐ。液体中の散乱光は、窓１８Ａの遮光されていない部分を通してキュベット９から出現する光線２０であらわされる。散乱光は、更に、単レンズまたは組み合わせレンズからなる集光レンズ７により、受光ユニット８内に取り付けられた検出器２２の面に焦点を結ぶ。コリメート手段は図示しないが、コリメートＣＵ９、遮光手段１９、絞り１４内の開口部を提供する。受光ユニット８は、検出器２２と結合し、信号増幅、サンプリング、デジタル化、中間データ格納、タイミングを供給する電子回路２４を含む。受光ユニット８により集められた光の測定強度に関連するデータは、以下に述べる後処理のため、更にプロセッサー４に伝達される。
【００２２】
システムに適した光源は次のものである：白熱電球、ガス放電灯、スパーク／アークランプ；固体デバイス、ＬＥＤ、レーザー、近赤外線から軟紫外線の範囲で動作するレーザー光源。システムの感度に規定された最小必要条件を超える照明パワーを放出できる光源が望ましい。特定の波長バンドだけを通す遮断フィルタをコリメータレンズ７の隣に配置してもよく、偏光デバイスも使用される。本発明の検出器は、通常、光源の波長、波長のバンド、波長の範囲で機能する、モノリシック単検出器、複数の検出器、モノリシック検出器配列である。面全体で散乱光の強度測定のできる、複数の検出器、モノリシック検出器配列が望ましい。
【００２３】
本発明の好適な実施態様によるキュベットの概略を示す図２を参照する。キュベット４０は、キュベットの両側に配置された透明な窓４２、４２Ａをもつ。絞り４６の開口部はキュベット内の窓４２の近くに配置される。遮光手段４８は窓４２Ａに絞り４６と同軸に配置される。平行にされた光のビームは光線５０であらわされる。窓４２を通過後、軌道に沿って散乱した光線５２は絞り４６に遮られる。
【００２４】
本発明の好適な実施態様によるシステムの光学ユニットの概略を示す図３を参照する。ビームスプリットデバイス６０は、コリメータレンズ６２とキュベット６６の窓６４の間に置かれる。二本の平行にされたビームがビームスプリットデバイス６０から放射される。第一ビームはキュベット６６に向かう。第一ビームに垂直な第二ビームはレフレクタ７２で反射され、第一ビームと平行にキュベット６６Ａに向かう。各キュベット６６、６６Ａからの光はデュアルレシーバーユニット７４の各パートに焦点を結ぶ。
【００２５】
本発明の他の実施態様による液体中の細菌の検出システムは２個のレーザーダイオードのような２つの光源を用いる。このシステムでは上記のビームスプリッタ、レフレクタは不要である。レーザーダイオードの波長は互いに異なるかもしれない。本発明の好適な実施態様では図３に示す遮光手段７８を用いてもよく、それによって蛍光測定の感度を増すことができる。
【００２６】
（キュベットユニット）
本発明の好適な実施態様によるキュベットユニット（ＣＵ）の等角図と分解図をそれぞれ示す図４Ａ、図４Ｂを参照する。ＣＵ８０は、光源に面するＣＵの側面に配置された窓８２と、反対側の側面に配置された平行窓８２ＡをもつＣＵハウジング内に配置された１個のキュベットからなる。入口孔８６をもつ濾過手段８４を、ＣＵカバー８９に取り付けられたＣＵの入口孔８８に結合してもよい。規定の大きさ以上の粒子を除去するカットオフフィルタは、図示しないが、濾過デバイス８４内に取り付けられる。
【００２７】
通常ＣＵとフィルタデバイスは、使い捨てボトルや容器に普通に用いられる、プラスチック樹脂のような材料で作られる。好ましくはキュベットは分析にかけられる特定の液体と両立可能な、つまり液体がキュベットの材料構成を変化させず、逆にキュベットが検査する液体を変化させる影響を与えないような、材料で作られる。例えば窓は通常光学レンズの製造に用いられるプラスチック、ガラス、石英で作られる。窓の屈折率の一様性、すなわち窓内での屈折率のばらつきは０．０００１を超えない。窓の表面粗さの二乗平均平方根値は１ナノメーターを超えない。スクラッチ／ディグ数が４０／２０かそれ以下で規定される光学的品質をもつ表面の窓が好ましい。本発明によると、幅が０．５ｍｍを超えないプラスチック、ガラス製の窓は実現可能な例である。窓のバルクの光学的均一性や表面の粗さは、散乱光の測定強度のＳＮ比に、したがってシステムの感度に影響する。
【００２８】
本発明の別の実施態様によるデュアルキュベット構成をもつＣＵの、２つの断面をそれぞれ示す図４Ｃ〜４Ｄを参照する。このＣＵは尿のような液体の検査に特に適している。各キュベット内の各サンプルに２つの異なる前処理をおこなうことにより、以下に詳しく述べるように、一方は他方に対して参照サンプルとなる。ＣＵ９０は、側壁の１つに沿って相互に接着された一対のキュベット９２、９２Ａからなる。ＣＵ９０は、開口９３からなる共通の入口と、サンプルを受け取るため両キュベットの上に位置するスペース９４とをもつ。フィルタ９５、９５Ａは異なるカットオフ閾値をもってもよく、各キュベットの入口に配置される。図４ＤにこのＣＵの断面図が、図４Ｃに指示されたように示される。フィルタ９５は入口９６に配置される。絞り９８の開口部は窓９７の近くに配置され、反対側の窓９７Ａの内面に配置された遮光手段９９と同軸である。キュベット９２Ａも同様に、窓、フィルタ、絞りの開口部、遮光手段をそれぞれ備える。
【００２９】
（検査）
一般的に検査は次の３つの主ステップを含む：（１）前処理ステップ；（２）測定ステップ；（３）後処理ステップ。
【００３０】
（１）前処理
尿は通常、液の屈折率と異なる屈折率をもつ塩の結晶、生物学的高分子、細胞のような微小粒子を含んでいる。このためこのような粒子は細菌に付随する散乱の読みとりを妨害するおそれがある。他の生物学的液体は多くの妨害するような構成物を含みがちである。本発明によれば、前処理ステップはサンプルから望ましくない構成物、通常、しかし常にではない、細菌より大きい寸法の粒子を除くのが目的である。前処理プロセスのステップは次を含む：単純な大きさによる除去、イオン交換クロマトグラフィー；酸性化、アルカリ性化、加熱；冷却による化学的沈殿；これらの組み合わせ。
【００３１】
再び図４Ｃを参照する。フィルタ９５、９５Ａはそれぞれキュベット９２、９２Ａの入口に配置される。各々のカットオフリミットは、カットオフリミットより小径の粒子を通過させる。例えば、約５μｍの大きさの細菌のいる尿のスクリーニングにおいて、本発明の好適な実施態様によると、フィルタ９５は５μｍ以下の粒子を通過させ、フィルタ９５Ａは１μｍ以下の粒子を通過させる。尿サンプルは加圧され、開口部９３を通ってキュベット９２、９２Ａに入る。加圧はシリンジのようなインジェクタでおこなわれる。加圧された尿はスペース９４から両キュベットへ、対応するフィルタを通って入る。その結果、キュベット９２は尿と、濃度レベルが原細菌濃度レベルとほぼ同じ細菌を保持する。一方キュベット９２Ａは、カットオフフィルタが小さいのでほとんど細菌を含まないで、主に他のキュベットにも在る結晶のような他の散乱粒子を含む。
【００３２】
検査する液体と潜在的に反応させるため、試薬を、ＣＵに入れる前に、またはＣＵ内に加えることもできる。このような試薬は、細菌または液体中の他の構成物との化学的ないし生化学的反応に潜在的に影響を与える、化学的ないし生化学的反応体からなる。このような反応の生成物は、細菌と他の粒子状物質の区別を可能にする、特定の光学的特徴をもつ。あるいはこのような試薬は生物学的化合物や有機細胞のような他の粒子と、粒子の集合および沈殿のため、化学的ないしは生化学的に作用可能である。
【００３３】
（２）測定
引き続いて分析すべき液体を保持したＣＵは光学ユニットに取り付けられる。通常、測定は光源と受光ユニットのスイッチをＯＮすることで始まる。次に光の強度が検出器平面内の異なる点で測定される。異なる後処理技法に対応したいくつかの測定手順がふさわしい。例えば、液体中の粒子で散乱した光の角度パワー密度が、照明ビームの波長や偏光角と無関係に、または関数として測定される。細菌を含む液体サンプルと含まない液体サンプルの散乱分布は、特定の角度において実質的に異なる。この差は照明光の波長が赤外線に近い領域に近づくか、またはその領域に入るかすると強調される。同様に細菌により生じるように、異なる偏光は異なる散乱パターンをもたらす。
【００３４】
（３）後処理
散乱は方位角と仰角の値で定義される。測定された散乱分布関数は基本的には、検出器の平面に衝突する光の強度が、対応するピクセルの信号レベルによりあらわされる三次元関数である。散乱分布は、特定の方位角の選択または平均化により得られる。与えられた方位角に沿う散乱分布は、検出器の平面を横切る対応する方向に沿って測定された散乱光の角度分布に似ている。平均化された散乱分布は、方位角の特定の範囲全体の、測定された角度分布関数を平均化することにより得られる。
【００３５】
一般に、本発明の後処理ステップでは、キャリブレーションスケールと測定値、または測定値から導かれた値との比較がされる。これはいくつかの方法のうちの一つでなされる。本発明による後処理プロセス技法の一例を以下説明する。この技法は、照明光の波長と偏光に依存しない散乱の測定に適切である。粗いフィルタで濾過されたため細菌を含むと考えられる尿の予備サンプルの角度強度分布は、細かいフィルタで濾過された同じ尿の第二サンプルの分布と比較される。第二測定分布はカーブフィッティング法により、予め格納された無菌の尿サンプルの角度強度分布のレベルと同一となるように、較正ないし正規化される。次に第一サンプルの現測定分布が、同じ正規化ファクターを用いて正規化される。正規化された第一分布は、規定の細菌を規定の濃度含んだ尿の、予め格納された一連の散乱分布と比較される。予め格納された、汚染された尿と汚染されていない尿とに対応する分布間に通常存在する差の傾向が、サンプルの測定分布との間の差と一致するとき、尿は細菌で汚染されていると定義される。汚染のレベルは、カーブフィッティングにより最も測定分布によく合う、予め格納された分布の規定の細菌濃度として計算される。
【００３６】
尿のような液体中の細菌を検出するための、参照散乱分布のセットは、本発明の好適な実施態様により、次のように準備される。細菌のいない種々の尿が収集される。これらの各サンプルは、規定の細菌をそれぞれ規定の濃度で添加するいくつかの別個のサブサンプルに分割される。各尿サンプルについて角度散乱分布が測定され記録される。記録された角度分布関数は、細菌の汚染レベルによりグループ分けされる。標準角度散乱分布の参照セットは、各較正済み細菌濃度レベルに対応したアンサンブル平均を取ることで実現される。較正済み散乱分布はこれらの標準角度散乱分布関数から上記の通り導かれる。細菌の濃度レベルは、ミリリットル当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）、（ＣＦＵ／ｍｌ）で測定される。１個の細菌は以後ＣＦＵと称する。
【００３７】
細菌の検出は、本発明の実施態様により、細菌を添加された尿の較正済み散乱分布の一次結合と、感染していない較正済み散乱分布を、測定された散乱分布と比較することで成し遂げられる。較正済み散乱分布の一次結合は、式：ＳＣｉ（ｘ）＝ＡｉＳｆ（ｘ）＋ＢｉＳｂｉ（ｘ）で与えられる。ここで
ｘは散乱角；
ＳＣｉ（ｘ）は、ｘの関数としての一次結合のｉ次の結果；
Ｓｆ（ｘ）は、ｘの関数としての汚染されていない較正済み散乱分布；
Ｓｂｉ（ｘ）は、細菌または細菌の規定の混合物により汚染されたｘの関数としての較正済み散乱分布のｉ次の較正済み散乱分布、インデックスｉは規定の細菌濃度。
【００３８】
Ａｉ、Ｂｉはパラメーターで、その値はｉ次の一次結合の測定分布へのカーブフィッティングで決定される。カーブフィッティングは、各値ｘでの測定分布とｉ次の一次結合分布との間の差の二乗の和を、パラメーターＡｉ、Ｂｉを変化させて最小とすることで実現される。ｊ次の一次結合がベストフィットが得られるとして選択される。このサンプルから導かれた細菌汚染のレベルは、ｊ次の較正済み散乱分布と同一である。
【００３９】
測定手順と後処理技法が、以下、実施例で更に述べられる。
【００４０】
（実施例１）
角度散乱分布の模擬的な分析をおこなった。細菌と同じ誘電率で直径２〜４μｍの球を含む尿の合成モデルがつくられた。塩の粒子は半径１μｍ以下で同じ誘電率の球であらわされる。計算は散乱のミー理論に基づく[H.C. van de Hulst. "Light scattering by small particles",
John Wiley & Sons publishing, NY, 1957]。上述の２種の粒子を含む懸濁液の、計算された角度散乱分布関数のプロットを示す図５を参照する。曲線１０１は細菌をあらわす粒子の懸濁液による散乱光の強度をあらわす。曲線１０２は尿中の結晶塩粒子をあらわす小粒子による散乱光の強度に対応する。強度は対数目盛で示され、極座標対散乱角であらわされる。大きい粒子は主に小角度散乱であるのに対し、小さい粒子からの散乱は比較的広い角度の分布をもち、０°を中心とするかなりの散乱角度範囲で強度は僅かに変化する。
【００４１】
（実施例２）
光源が規定の波長と強度のレーザーダイオードで、１つのキュベットをもつＣＵのシステムを用いて以下の測定をおこなった。細菌を含む尿の精巧なモデルが用意され、図１を再び参照して、システムの寸法配置は以下を用いた：
１）細菌の寸法は文献により定義する。
２）細菌は液体サンプルの照明された体積部分にランダムに分散している。
３）モデルの光源は、実際の測定に使用されるシステムの光源と同じ特性のレーザーダイオードである。
４）各単一の細菌による散乱光の角度強度は上記のミー散乱モデルにより計算される。
５）散乱光は、実際の測定に使用される光学ユニットのモデルを用いて光学的に追跡される。
６）散乱光のパワー密度は検出器の平面で計算される。
【００４２】
２つの典型的な尿のサンプルの、散乱光の強度対散乱角度のプロットを示す図６Ａを参照する。曲線１１０は光反射鏡を考慮したキュベットの総合透過率を示す。曲線１１４は、大腸菌に１０４ＣＦＵ／ｍｌの濃度で汚染された典型的な尿サンプルの、測定された散乱分布を示す。曲線１１６は同じ尿サンプルの、全強度が測定分布で正規化された、計算による分布を示す。
【００４３】
細菌を添加した尿を用いた、散乱強度の測定と計算の角度分布の比較が対応して示された図６Ｂを参照する。測定は、上記の実施例１で説明したのと同じ光学ユニットと単一キュベットのＣＵの構成を用いて実施した。シミュレートされた散乱強度は、精巧なモデルと一致する、２〜４μｍの間に統計的に分布した細菌について計算された。モデルの塩粒子は０〜１．５μｍの間に、測定値と合致して統計的に分布する。曲線１１８と１１９は、細菌をもつ尿を用いた散乱角度の関数として、それぞれシミュレートと測定の信号強度をあらわす。曲線１２０と１２１は細菌を含まない尿のシミュレートと測定の散乱分布をそれぞれ示す。
【００４４】
（実施例３）
光散乱測定が上記の実施例２と同じ光学ユニットとＣＵを用い、異なる細菌濃度レベルの細菌を添加した、いくつかの尿サンプルについておこなわれた。細菌濃度は従来技術により培養を用いて別々に較正された。細菌濃度レベルがそれぞれ１０３、１０４、１０５、１０６ＣＦＵ／ｍｌの、汚染された尿の典型的な角度散乱分布関数が示された図７Ａ〜７Ｄを参照する。散乱分布は、広い方位角範囲について平均化することにより、これらの典型的な分布関数から導かれた。図８に、図７Ａ〜７Ｄの測定された角度分布関数に対応する散乱分布を比較するグラフが示される。プロット１２３、１２４、１２５、１２６は、それぞれ図７Ａ〜７Ｄと同じ細菌濃度レベルの、汚染された尿の散乱分布をあらわす。
【００４５】
大腸菌で汚染されたことの知られた典型的な尿サンプルが、上述と同じ光学測定デバイスと単一キュベットのＣＵの構成を用いて、細菌が存在するかどうか検査された。散乱分布が測定され、上述の本発明の好適な実施態様による細菌の検出が上述のようにおこなわれた。この尿サンプルの、１セットの較正された分布の２つの較正された散乱分布と、測定および適合させた散乱分布が対応して示された図９を参照する。曲線１３０は汚染されていない尿の較正された散乱分布をあらわす。曲線１３２は規定の細菌濃度レベルの汚染された尿の較正された散乱分布をあらわす（塩の粒子は存在しない）。曲線１３４は検査サンプルに適合する散乱分布をあらわす。曲線１３６は検査したサンプルの測定された散乱分布をあらわす。散乱角度の広い範囲で、かなり高いレベルで合致が見られる。この検査サンプルで検出された細菌の濃度レベルは参照レベルから数％逸脱する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明による、液体中の細菌を検出するシステムの概略説明図。
【図２】本発明の好適な実施態様によるキュベットの概略断面図。
【図３】本発明の好適な実施態様による、液体中の細菌を検出するシステムの光学ユニットの概略断面図。
【図４Ａ】本発明の好適な実施態様によるキュベットユニットの等角図。
【図４Ｂ】図４Ａに示されたキュベットユニットの分解図。
【図４Ｃ】本発明の他の好適な実施態様によるキュベットユニットの断面図。
【図４Ｄ】図４Ｃに示されたキュベットユニットの分解図。
【図５】異なる大きさの２個の粒子による散乱光の、シミュレートされた角度強度分布の極座標プロット。
【図６Ａ】細菌を添加した典型的な尿の、シミュレーションと測定の散乱分布を比較したグラフ。
【図６Ｂ】図６Ａの散乱分布に対する、細菌と塩粒子の効果のシミュレーションと測定の比較のグラフ。
【図７Ａ】測定値が１０３ＣＦＵ／ｍｌの細菌を含む典型的な尿サンプルについて測定された角度散乱分布。
【図７Ｂ】１０４ＣＦＵ／ｍｌを含む典型的な尿サンプルについて測定された角度散乱分布。
【図７Ｃ】１０５ＣＦＵ／ｍｌを含む典型的な尿サンプルについて測定された角度散乱分布。
【図７Ｄ】１０６ＣＦＵ／ｍｌを含む典型的な尿サンプルについて測定された角度散乱分布。
【図８】図７Ａ〜図７Ｄに示された各々の尿サンプルの、測定散乱分布と計算による適合散乱分布を比較したグラフ。
【図９】細菌を含む典型的な尿サンプルの、測定および適合させた散乱分布を比較したグラフ。
【符号の説明】
【００４７】
２ 光学ユニット
４ プロセッサー
５ 光源
６ コリメータ
７ 集光レンズ
８ 受光ユニット
９ キュベットユニット
１０ 光線
１２ レンズ
１４ 開口部
１６ 光線
１８ 窓
１８Ａ 窓
１９ 遮光手段
２０ 光線
２２ 検出器
２４ 電子回路
４０ キュベット
４２ 窓
４２Ａ 窓
４６ 絞り
４８ 遮光手段
５０ 光線
５２ 光線
６０ ビームスプリットデバイス
６２ コリメータレンズ
６４ 窓
６６ キュベット
６６Ａ キュベット
７２ レフレクタ
７４ デュアルレシーバーユニット
７８ 遮光手段
８０ ＣＵ
８２ 窓
８２Ａ 平行窓
８４ 濾過手段
８６ 入口孔
８８ 入口孔
８９ ＣＵカバー
９０ ＣＵ
９２ キュベット
９２Ａ キュベット
９３ 開口
９４ スペース
９５ フィルタ
９５Ａ フィルタ
９６ 入口
９７ 窓
９７Ａ 窓
９８ 絞り
９９ 遮光手段
１０１ 曲線
１０２ 曲線
１１０ 曲線
１１４ 曲線
１１６ 曲線
１１８ 曲線
１１９ 曲線
１２０ 曲線
１２１ 曲線
１２３ プロット
１２４ プロット
１２５ プロット
１２６ プロット
１３０ 曲線
１３２ 曲線
１３４ 曲線
１３６ 曲線
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に体液の分析に関する。本発明は特に細菌の存在に関する尿の光学的検査、光散乱測定および濾過に関する。
【背景技術】
【０００２】
溶液、乳剤、懸濁液のような水を含む液体は生物学的状況においてごく普通である。これらの水を含む液体は、人や動物が消費するため携行できる水、液状の食品、飲み物、尿、羊水、脊髄液を含む。このような液体は細菌の存在を時々検査される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
尿道感染をスクリーニングする検査ストリップは市販されている。このようなストリップは二つの異なるパッドに埋め込まれた特定の試薬を含む。一つのパッドはサンプルに白血球エステラーゼの存在を検査する試薬を含む。もう一つのパッドは亜硝酸菌の存在を検査するため、亜硝酸塩の分析をする試薬を含む。細菌感染の検出は、着色したパッドを目盛りつきカラーチャートの色の等級と比較して実施される。欧州公開特許公報番号０３２０１５４は、同様なアプローチに基づく尿のスクリーニング方法を開示している。この方法は特定の試薬と混合した尿サンプルの一部の上で、少なくとも二つの分割した分析の実行を含む。一つの分析は白血球の存在を検出し、もう一つは亜硝酸塩のような細菌に生成される化合物の存在を検出する。しかし上記の方法は、含まれる特定の試薬により検出できるものを生成しない細菌は検出できない。これらの方法はテストサンプルの比較的高濃度の細菌濃度に基づいており、そのためこのようなスクリーニングプロセスは感度が不十分の傾向があり、比較的特異度が低い傾向にある。さらにこれらのスクリーニング方法は患者のうちの特定の人に限られる；例えば子供や妊婦には適用すべきでない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の液体中の細菌を検出する方法は、サンプル液体を濾過して細菌より大きな粒子を除去し、前記サンプル液体を平行光線で照明し、前記サンプル液体による散乱光の強度を少なくとも１点で測定し、前記散乱光をキャリブレーションスケールと比較するステップを含む液体中の細菌を検出する方法である。
【０００５】
本発明の液体中の細菌を検出する方法は、前記液体の第二サンプルを濾過して前記細菌より小さい予め定められた限界より大きい粒子を除去し、前記第二サンプル液体を平行光線で照明し、前記第二サンプル液体による散乱光の強度を少なくとも１点で測定し、前記散乱光をキャリブレーションスケールと比較することを更に含む方法である。
【０００６】
本発明の液体中の細菌を検出する方法は、散乱分布を前記測定強度と関連づける方法である。
【０００７】
本発明の液体中の細菌を検出する方法は、前記関連づけられた散乱分布を、予め格納された較正散乱分布および予め格納された較正散乱分布の一次結合からなる項目の表から選択された項目と合致させることを更に含む方法である。
【０００８】
本発明の液体中の細菌を検出する方法は、前記平行光線を偏光させることを含む方法である。
【０００９】
本発明の液体中の細菌を検出する方法は、前記測定が少なくとも１つの波長に関しておこなわれる方法である。
【００１０】
本発明の液体中の細菌を検出する方法は、前記照明が少なくとも１つのレーザーダイオードでおこなわれる方法である。
【００１１】
本発明の液体中の細菌を検出する方法は、前記濾過の前に、化学的および生物化学的試薬を含む試薬群から選択された少なくとも１つの試薬を、前記サンプル液体に更に加えることを含む方法である。
【００１２】
本発明の液体中の細菌を検出する方法は、酸性化、アルカリ性化、クロマトグラフィーによる分離、それらの組み合わせを含む反応の群から選択された反応により、前記サンプル液体を反応させることを更に含む方法である。
【００１３】
本発明の液体中の細菌を検出する方法は、７０℃までの加熱、２℃までの冷却を含む手段の群から選択された手段により、前記サンプル液体の物理状態を変化させることを更に含む方法である。
【００１４】
本発明のキュベットユニットは、少なくとも１つのキュベットは、少なくとも規定の波長範囲の光に透明な少なくとも１つの窓を含み、前記窓の表面粗さ値の二乗平均平方根は１ナノメーターを超えず、前記窓内の屈折率ばらつきは０．０００１を超えないキュベットユニット（ＣＵ）である。
【００１５】
本発明のキュベットユニットは、少なくとも１つのキュベットは、少なくとも規定の波長範囲の光に透明な少なくとも１つの窓を含み、前記窓の幅は５００μｍを超えないキュベットユニット（ＣＵ）である。
【００１６】
本発明のキュベットユニットは、遮光手段が少なくとも１つの窓に配置されているＣＵである。
【００１７】
本発明のキュベットユニットは、少なくとも１つの前記キュベットに絞りの開口部が配置されているＣＵである。
【発明の効果】
【００１８】
臨床細菌学実験室では、分析サンプルの大部分が尿サンプルである。尿サンプルの通常の分析は顕微鏡観察と培養を含み、熟練したオペレーターを必要とし、時間と資源を消費する。そのため高価で時間のかかる分析方法のかなりの部分を除くことができる、安価で速いスクリーニング方法は有益である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（本発明の詳細な記載）
本発明のシステムは、水、溶液、ゲル、乳剤、懸濁液、液状の食品、飲み物、尿、脊髄液、羊水、血清のような水を含む液体中の細菌を検出する方法を提供する。本発明によるシステムの実施態様の記述において、本発明による細菌の検出システムの概略を示す図１を最初に参照する。システムは、検査液体のサンプルを光学的に検査する光学ユニット２からなる。光学ユニットにリンクしたプロセッサー４は測定と計算を実行し、光学ユニット２を作動させる。ユーザーインターフェースユニットは、図示しないが、プロセッサー４にリンクし、通常、測定結果とオペレーターへの指示を表示するディスプレイとデータを入力するキーボードからなる。パワーサプライは、図示しないが、光学ユニットとオペレーターインターフェースユニット、プロセッサーに電力を供給する。
【００２０】
（光学ユニット）
光学ユニット２は、光ビームを生成する光源５を含む。光ビームはコリメータ６により平行にされる。単レンズまたは組み合わせレンズからなる集光レンズ７は、検査する液体サンプルからの光を受光ユニット８に集光する。取り付け可能な、液体のサンプルを保持したキュベットユニット（ＣＵ）９が、コリメータ６と集光レンズ７の間に置かれる。ＣＵのいくつかの別の構造的な特徴を以下に述べる。一般的にキュベットという言葉は、以後、液体サンプルを保持でき、光学ユニット内に取り付けられる透明な容器を意味する。
【００２１】
光線１０は光源５から放射された照明ビームをあらわす。光ビームは、単レンズまたは組み合わせレンズ１２からなるコリメータ６と開口部１４を含む絞りにより平行にされる。光線１６であらわされる平行にされた光のビームは窓１８とキュベット内の液体を通り抜ける。遮光手段１９は、直接の照明光が受光ユニット８を貫通することを防ぐ。液体中の散乱光は、窓１８Ａの遮光されていない部分を通してキュベット９から出現する光線２０であらわされる。散乱光は、更に、単レンズまたは組み合わせレンズからなる集光レンズ７により、受光ユニット８内に取り付けられた検出器２２の面に焦点を結ぶ。コリメート手段は図示しないが、コリメートＣＵ９、遮光手段１９、絞り１４内の開口部を提供する。受光ユニット８は、検出器２２と結合し、信号増幅、サンプリング、デジタル化、中間データ格納、タイミングを供給する電子回路２４を含む。受光ユニット８により集められた光の測定強度に関連するデータは、以下に述べる後処理のため、更にプロセッサー４に伝達される。
【００２２】
システムに適した光源は次のものである：白熱電球、ガス放電灯、スパーク／アークランプ；固体デバイス、ＬＥＤ、レーザー、近赤外線から軟紫外線の範囲で動作するレーザー光源。システムの感度に規定された最小必要条件を超える照明パワーを放出できる光源が望ましい。特定の波長バンドだけを通す遮断フィルタをコリメータレンズ７の隣に配置してもよく、偏光デバイスも使用される。本発明の検出器は、通常、光源の波長、波長のバンド、波長の範囲で機能する、モノリシック単検出器、複数の検出器、モノリシック検出器配列である。面全体で散乱光の強度測定のできる、複数の検出器、モノリシック検出器配列が望ましい。
【００２３】
本発明の好適な実施態様によるキュベットの概略を示す図２を参照する。キュベット４０は、キュベットの両側に配置された透明な窓４２、４２Ａをもつ。絞り４６の開口部はキュベット内の窓４２の近くに配置される。遮光手段４８は窓４２Ａに絞り４６と同軸に配置される。平行にされた光のビームは光線５０であらわされる。窓４２を通過後、軌道に沿って散乱した光線５２は絞り４６に遮られる。
【００２４】
本発明の好適な実施態様によるシステムの光学ユニットの概略を示す図３を参照する。ビームスプリットデバイス６０は、コリメータレンズ６２とキュベット６６の窓６４の間に置かれる。二本の平行にされたビームがビームスプリットデバイス６０から放射される。第一ビームはキュベット６６に向かう。第一ビームに垂直な第二ビームはレフレクタ７２で反射され、第一ビームと平行にキュベット６６Ａに向かう。各キュベット６６、６６Ａからの光はデュアルレシーバーユニット７４の各パートに焦点を結ぶ。
【００２５】
本発明の他の実施態様による液体中の細菌の検出システムは２個のレーザーダイオードのような２つの光源を用いる。このシステムでは上記のビームスプリッタ、レフレクタは不要である。レーザーダイオードの波長は互いに異なるかもしれない。本発明の好適な実施態様では図３に示す遮光手段７８を用いてもよく、それによって蛍光測定の感度を増すことができる。
【００２６】
（キュベットユニット）
本発明の好適な実施態様によるキュベットユニット（ＣＵ）の等角図と分解図をそれぞれ示す図４Ａ、図４Ｂを参照する。ＣＵ８０は、光源に面するＣＵの側面に配置された窓８２と、反対側の側面に配置された平行窓８２ＡをもつＣＵハウジング内に配置された１個のキュベットからなる。入口孔８６をもつ濾過手段８４を、ＣＵカバー８９に取り付けられたＣＵの入口孔８８に結合してもよい。規定の大きさ以上の粒子を除去するカットオフフィルタは、図示しないが、濾過デバイス８４内に取り付けられる。
【００２７】
通常ＣＵとフィルタデバイスは、使い捨てボトルや容器に普通に用いられる、プラスチック樹脂のような材料で作られる。好ましくはキュベットは分析にかけられる特定の液体と両立可能な、つまり液体がキュベットの材料構成を変化させず、逆にキュベットが検査する液体を変化させる影響を与えないような、材料で作られる。例えば窓は通常光学レンズの製造に用いられるプラスチック、ガラス、石英で作られる。窓の屈折率の一様性、すなわち窓内での屈折率のばらつきは０．０００１を超えない。窓の表面粗さの二乗平均平方根値は１ナノメーターを超えない。スクラッチ／ディグ数が４０／２０かそれ以下で規定される光学的品質をもつ表面の窓が好ましい。本発明によると、幅が０．５ｍｍを超えないプラスチック、ガラス製の窓は実現可能な例である。窓のバルクの光学的均一性や表面の粗さは、散乱光の測定強度のＳＮ比に、したがってシステムの感度に影響する。
【００２８】
本発明の別の実施態様によるデュアルキュベット構成をもつＣＵの、２つの断面をそれぞれ示す図４Ｃ〜４Ｄを参照する。このＣＵは尿のような液体の検査に特に適している。各キュベット内の各サンプルに２つの異なる前処理をおこなうことにより、以下に詳しく述べるように、一方は他方に対して参照サンプルとなる。ＣＵ９０は、側壁の１つに沿って相互に接着された一対のキュベット９２、９２Ａからなる。ＣＵ９０は、開口９３からなる共通の入口と、サンプルを受け取るため両キュベットの上に位置するスペース９４とをもつ。フィルタ９５、９５Ａは異なるカットオフ閾値をもってもよく、各キュベットの入口に配置される。図４ＤにこのＣＵの断面図が、図４Ｃに指示されたように示される。フィルタ９５は入口９６に配置される。絞り９８の開口部は窓９７の近くに配置され、反対側の窓９７Ａの内面に配置された遮光手段９９と同軸である。キュベット９２Ａも同様に、窓、フィルタ、絞りの開口部、遮光手段をそれぞれ備える。
【００２９】
（検査）
一般的に検査は次の３つの主ステップを含む：（１）前処理ステップ；（２）測定ステップ；（３）後処理ステップ。
【００３０】
（１）前処理
尿は通常、液の屈折率と異なる屈折率をもつ塩の結晶、生物学的高分子、細胞のような微小粒子を含んでいる。このためこのような粒子は細菌に付随する散乱の読みとりを妨害するおそれがある。他の生物学的液体は多くの妨害するような構成物を含みがちである。本発明によれば、前処理ステップはサンプルから望ましくない構成物、通常、しかし常にではない、細菌より大きい寸法の粒子を除くのが目的である。前処理プロセスのステップは次を含む：単純な大きさによる除去、イオン交換クロマトグラフィー；酸性化、アルカリ性化、加熱；冷却による化学的沈殿；これらの組み合わせ。
【００３１】
再び図４Ｃを参照する。フィルタ９５、９５Ａはそれぞれキュベット９２、９２Ａの入口に配置される。各々のカットオフリミットは、カットオフリミットより小径の粒子を通過させる。例えば、約５μｍの大きさの細菌のいる尿のスクリーニングにおいて、本発明の好適な実施態様によると、フィルタ９５は５μｍ以下の粒子を通過させ、フィルタ９５Ａは１μｍ以下の粒子を通過させる。尿サンプルは加圧され、開口部９３を通ってキュベット９２、９２Ａに入る。加圧はシリンジのようなインジェクタでおこなわれる。加圧された尿はスペース９４から両キュベットへ、対応するフィルタを通って入る。その結果、キュベット９２は尿と、濃度レベルが原細菌濃度レベルとほぼ同じ細菌を保持する。一方キュベット９２Ａは、カットオフフィルタが小さいのでほとんど細菌を含まないで、主に他のキュベットにも在る結晶のような他の散乱粒子を含む。
【００３２】
検査する液体と潜在的に反応させるため、試薬を、ＣＵに入れる前に、またはＣＵ内に加えることもできる。このような試薬は、細菌または液体中の他の構成物との化学的ないし生化学的反応に潜在的に影響を与える、化学的ないし生化学的反応体からなる。このような反応の生成物は、細菌と他の粒子状物質の区別を可能にする、特定の光学的特徴をもつ。あるいはこのような試薬は生物学的化合物や有機細胞のような他の粒子と、粒子の集合および沈殿のため、化学的ないしは生化学的に作用可能である。
【００３３】
（２）測定
引き続いて分析すべき液体を保持したＣＵは光学ユニットに取り付けられる。通常、測定は光源と受光ユニットのスイッチをＯＮすることで始まる。次に光の強度が検出器平面内の異なる点で測定される。異なる後処理技法に対応したいくつかの測定手順がふさわしい。例えば、液体中の粒子で散乱した光の角度パワー密度が、照明ビームの波長や偏光角と無関係に、または関数として測定される。細菌を含む液体サンプルと含まない液体サンプルの散乱分布は、特定の角度において実質的に異なる。この差は照明光の波長が赤外線に近い領域に近づくか、またはその領域に入るかすると強調される。同様に細菌により生じるように、異なる偏光は異なる散乱パターンをもたらす。
【００３４】
（３）後処理
散乱は方位角と仰角の値で定義される。測定された散乱分布関数は基本的には、検出器の平面に衝突する光の強度が、対応するピクセルの信号レベルによりあらわされる三次元関数である。散乱分布は、特定の方位角の選択または平均化により得られる。与えられた方位角に沿う散乱分布は、検出器の平面を横切る対応する方向に沿って測定された散乱光の角度分布に似ている。平均化された散乱分布は、方位角の特定の範囲全体の、測定された角度分布関数を平均化することにより得られる。
【００３５】
一般に、本発明の後処理ステップでは、キャリブレーションスケールと測定値、または測定値から導かれた値との比較がされる。これはいくつかの方法のうちの一つでなされる。本発明による後処理プロセス技法の一例を以下説明する。この技法は、照明光の波長と偏光に依存しない散乱の測定に適切である。粗いフィルタで濾過されたため細菌を含むと考えられる尿の予備サンプルの角度強度分布は、細かいフィルタで濾過された同じ尿の第二サンプルの分布と比較される。第二測定分布はカーブフィッティング法により、予め格納された無菌の尿サンプルの角度強度分布のレベルと同一となるように、較正ないし正規化される。次に第一サンプルの現測定分布が、同じ正規化ファクターを用いて正規化される。正規化された第一分布は、規定の細菌を規定の濃度含んだ尿の、予め格納された一連の散乱分布と比較される。予め格納された、汚染された尿と汚染されていない尿とに対応する分布間に通常存在する差の傾向が、サンプルの測定分布との間の差と一致するとき、尿は細菌で汚染されていると定義される。汚染のレベルは、カーブフィッティングにより最も測定分布によく合う、予め格納された分布の規定の細菌濃度として計算される。
【００３６】
尿のような液体中の細菌を検出するための、参照散乱分布のセットは、本発明の好適な実施態様により、次のように準備される。細菌のいない種々の尿が収集される。これらの各サンプルは、規定の細菌をそれぞれ規定の濃度で添加するいくつかの別個のサブサンプルに分割される。各尿サンプルについて角度散乱分布が測定され記録される。記録された角度分布関数は、細菌の汚染レベルによりグループ分けされる。標準角度散乱分布の参照セットは、各較正済み細菌濃度レベルに対応したアンサンブル平均を取ることで実現される。較正済み散乱分布はこれらの標準角度散乱分布関数から上記の通り導かれる。細菌の濃度レベルは、ミリリットル当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）、（ＣＦＵ／ｍｌ）で測定される。１個の細菌は以後ＣＦＵと称する。
【００３７】
細菌の検出は、本発明の実施態様により、細菌を添加された尿の較正済み散乱分布の一次結合と、感染していない較正済み散乱分布を、測定された散乱分布と比較することで成し遂げられる。較正済み散乱分布の一次結合は、式：ＳＣｉ（ｘ）＝ＡｉＳｆ（ｘ）＋ＢｉＳｂｉ（ｘ）で与えられる。ここで
ｘは散乱角；
ＳＣｉ（ｘ）は、ｘの関数としての一次結合のｉ次の結果；
Ｓｆ（ｘ）は、ｘの関数としての汚染されていない較正済み散乱分布；
Ｓｂｉ（ｘ）は、細菌または細菌の規定の混合物により汚染されたｘの関数としての較正済み散乱分布のｉ次の較正済み散乱分布、インデックスｉは規定の細菌濃度。
【００３８】
Ａｉ、Ｂｉはパラメーターで、その値はｉ次の一次結合の測定分布へのカーブフィッティングで決定される。カーブフィッティングは、各値ｘでの測定分布とｉ次の一次結合分布との間の差の二乗の和を、パラメーターＡｉ、Ｂｉを変化させて最小とすることで実現される。ｊ次の一次結合がベストフィットが得られるとして選択される。このサンプルから導かれた細菌汚染のレベルは、ｊ次の較正済み散乱分布と同一である。
【００３９】
測定手順と後処理技法が、以下、実施例で更に述べられる。
【００４０】
（実施例１）
角度散乱分布の模擬的な分析をおこなった。細菌と同じ誘電率で直径２〜４μｍの球を含む尿の合成モデルがつくられた。塩の粒子は半径１μｍ以下で同じ誘電率の球であらわされる。計算は散乱のミー理論に基づく[H.C. van de Hulst. "Light scattering by small particles",
John Wiley & Sons publishing, NY, 1957]。上述の２種の粒子を含む懸濁液の、計算された角度散乱分布関数のプロットを示す図５を参照する。曲線１０１は細菌をあらわす粒子の懸濁液による散乱光の強度をあらわす。曲線１０２は尿中の結晶塩粒子をあらわす小粒子による散乱光の強度に対応する。強度は対数目盛で示され、極座標対散乱角であらわされる。大きい粒子は主に小角度散乱であるのに対し、小さい粒子からの散乱は比較的広い角度の分布をもち、０°を中心とするかなりの散乱角度範囲で強度は僅かに変化する。
【００４１】
（実施例２）
光源が規定の波長と強度のレーザーダイオードで、１つのキュベットをもつＣＵのシステムを用いて以下の測定をおこなった。細菌を含む尿の精巧なモデルが用意され、図１を再び参照して、システムの寸法配置は以下を用いた：
１）細菌の寸法は文献により定義する。
２）細菌は液体サンプルの照明された体積部分にランダムに分散している。
３）モデルの光源は、実際の測定に使用されるシステムの光源と同じ特性のレーザーダイオードである。
４）各単一の細菌による散乱光の角度強度は上記のミー散乱モデルにより計算される。
５）散乱光は、実際の測定に使用される光学ユニットのモデルを用いて光学的に追跡される。
６）散乱光のパワー密度は検出器の平面で計算される。
【００４２】
２つの典型的な尿のサンプルの、散乱光の強度対散乱角度のプロットを示す図６Ａを参照する。曲線１１０は光反射鏡を考慮したキュベットの総合透過率を示す。曲線１１４は、大腸菌に１０４ＣＦＵ／ｍｌの濃度で汚染された典型的な尿サンプルの、測定された散乱分布を示す。曲線１１６は同じ尿サンプルの、全強度が測定分布で正規化された、計算による分布を示す。
【００４３】
細菌を添加した尿を用いた、散乱強度の測定と計算の角度分布の比較が対応して示された図６Ｂを参照する。測定は、上記の実施例１で説明したのと同じ光学ユニットと単一キュベットのＣＵの構成を用いて実施した。シミュレートされた散乱強度は、精巧なモデルと一致する、２〜４μｍの間に統計的に分布した細菌について計算された。モデルの塩粒子は０〜１．５μｍの間に、測定値と合致して統計的に分布する。曲線１１８と１１９は、細菌をもつ尿を用いた散乱角度の関数として、それぞれシミュレートと測定の信号強度をあらわす。曲線１２０と１２１は細菌を含まない尿のシミュレートと測定の散乱分布をそれぞれ示す。
【００４４】
（実施例３）
光散乱測定が上記の実施例２と同じ光学ユニットとＣＵを用い、異なる細菌濃度レベルの細菌を添加した、いくつかの尿サンプルについておこなわれた。細菌濃度は従来技術により培養を用いて別々に較正された。細菌濃度レベルがそれぞれ１０３、１０４、１０５、１０６ＣＦＵ／ｍｌの、汚染された尿の典型的な角度散乱分布関数が示された図７Ａ〜７Ｄを参照する。散乱分布は、広い方位角範囲について平均化することにより、これらの典型的な分布関数から導かれた。図８に、図７Ａ〜７Ｄの測定された角度分布関数に対応する散乱分布を比較するグラフが示される。プロット１２３、１２４、１２５、１２６は、それぞれ図７Ａ〜７Ｄと同じ細菌濃度レベルの、汚染された尿の散乱分布をあらわす。
【００４５】
大腸菌で汚染されたことの知られた典型的な尿サンプルが、上述と同じ光学測定デバイスと単一キュベットのＣＵの構成を用いて、細菌が存在するかどうか検査された。散乱分布が測定され、上述の本発明の好適な実施態様による細菌の検出が上述のようにおこなわれた。この尿サンプルの、１セットの較正された分布の２つの較正された散乱分布と、測定および適合させた散乱分布が対応して示された図９を参照する。曲線１３０は汚染されていない尿の較正された散乱分布をあらわす。曲線１３２は規定の細菌濃度レベルの汚染された尿の較正された散乱分布をあらわす（塩の粒子は存在しない）。曲線１３４は検査サンプルに適合する散乱分布をあらわす。曲線１３６は検査したサンプルの測定された散乱分布をあらわす。散乱角度の広い範囲で、かなり高いレベルで合致が見られる。この検査サンプルで検出された細菌の濃度レベルは参照レベルから数％逸脱する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明による、液体中の細菌を検出するシステムの概略説明図。
【図２】本発明の好適な実施態様によるキュベットの概略断面図。
【図３】本発明の好適な実施態様による、液体中の細菌を検出するシステムの光学ユニットの概略断面図。
【図４Ａ】本発明の好適な実施態様によるキュベットユニットの等角図。
【図４Ｂ】図４Ａに示されたキュベットユニットの分解図。
【図４Ｃ】本発明の他の好適な実施態様によるキュベットユニットの断面図。
【図４Ｄ】図４Ｃに示されたキュベットユニットの分解図。
【図５】異なる大きさの２個の粒子による散乱光の、シミュレートされた角度強度分布の極座標プロット。
【図６Ａ】細菌を添加した典型的な尿の、シミュレーションと測定の散乱分布を比較したグラフ。
【図６Ｂ】図６Ａの散乱分布に対する、細菌と塩粒子の効果のシミュレーションと測定の比較のグラフ。
【図７Ａ】測定値が１０３ＣＦＵ／ｍｌの細菌を含む典型的な尿サンプルについて測定された角度散乱分布。
【図７Ｂ】１０４ＣＦＵ／ｍｌを含む典型的な尿サンプルについて測定された角度散乱分布。
【図７Ｃ】１０５ＣＦＵ／ｍｌを含む典型的な尿サンプルについて測定された角度散乱分布。
【図７Ｄ】１０６ＣＦＵ／ｍｌを含む典型的な尿サンプルについて測定された角度散乱分布。
【図８】図７Ａ〜図７Ｄに示された各々の尿サンプルの、測定散乱分布と計算による適合散乱分布を比較したグラフ。
【図９】細菌を含む典型的な尿サンプルの、測定および適合させた散乱分布を比較したグラフ。
【符号の説明】
【００４７】
２ 光学ユニット
４ プロセッサー
５ 光源
６ コリメータ
７ 集光レンズ
８ 受光ユニット
９ キュベットユニット
１０ 光線
１２ レンズ
１４ 開口部
１６ 光線
１８ 窓
１８Ａ 窓
１９ 遮光手段
２０ 光線
２２ 検出器
２４ 電子回路
４０ キュベット
４２ 窓
４２Ａ 窓
４６ 絞り
４８ 遮光手段
５０ 光線
５２ 光線
６０ ビームスプリットデバイス
６２ コリメータレンズ
６４ 窓
６６ キュベット
６６Ａ キュベット
７２ レフレクタ
７４ デュアルレシーバーユニット
７８ 遮光手段
８０ ＣＵ
８２ 窓
８２Ａ 平行窓
８４ 濾過手段
８６ 入口孔
８８ 入口孔
８９ ＣＵカバー
９０ ＣＵ
９２ キュベット
９２Ａ キュベット
９３ 開口
９４ スペース
９５ フィルタ
９５Ａ フィルタ
９６ 入口
９７ 窓
９７Ａ 窓
９８ 絞り
９９ 遮光手段
１０１ 曲線
１０２ 曲線
１１０ 曲線
１１４ 曲線
１１６ 曲線
１１８ 曲線
１１９ 曲線
１２０ 曲線
１２１ 曲線
１２３ プロット
１２４ プロット
１２５ プロット
１２６ プロット
１３０ 曲線
１３２ 曲線
１３４ 曲線
１３６ 曲線
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル液体を濾過して細菌より大きな粒子を除去し、
前記サンプル液体を平行光線で照明し、
前記サンプル液体による散乱光の強度を少なくとも１点で測定し、
前記散乱光をキャリブレーションスケールと比較するステップを含む液体中の細菌を検出する方法。
【請求項２】
前記液体の第二サンプルを濾過して前記細菌より小さい予め定められた限界より大きい粒子を除去し、
前記第二サンプル液体を平行光線で照明し、
前記第二サンプル液体による散乱光の強度を少なくとも１点で測定し、
前記散乱光をキャリブレーションスケールと比較することを更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
散乱分布を前記測定強度と関連づける、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記関連づけられた散乱分布を、予め格納された較正散乱分布および予め格納された較正散乱分布の一次結合からなる項目の表から選択された項目と合致させることを更に含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記平行光線を偏光させることを含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記測定が少なくとも１つの波長に関しておこなわれる請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記照明が少なくとも１つのレーザーダイオードでおこなわれる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記濾過の前に、化学的および生物化学的試薬を含む試薬群から選択された少なくとも１つの試薬を、前記サンプル液体に更に加えることを含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
酸性化、アルカリ性化、クロマトグラフィーによる分離、それらの組み合わせを含む反応の群から選択された反応により、前記サンプル液体を反応させることを更に含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
７０℃までの加熱、２℃までの冷却を含む手段の群から選択された手段により、前記サンプル液体の物理状態を変化させることを更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つのキュベットは、少なくとも規定の波長範囲の光に透明な少なくとも１つの窓を含み、前記窓の表面粗さ値の二乗平均平方根は１ナノメーターを超えず、前記窓内の屈折率ばらつきは０．０００１を超えないキュベットユニット（ＣＵ）。
【請求項１２】
少なくとも１つのキュベットは、少なくとも規定の波長範囲の光に透明な少なくとも１つの窓を含み、前記窓の幅は５００μｍを超えないキュベットユニット（ＣＵ）。
【請求項１３】
遮光手段が少なくとも１つの窓に配置されている請求項１１又は１２のいずれかに記載のＣＵ。
【請求項１４】
少なくとも１つの前記キュベットに絞りの開口部が配置されている請求項１１又は１２のいずれかに記載のＣＵ。
【請求項１】
サンプル液体を濾過して細菌より大きな粒子を除去し、
前記サンプル液体を平行光線で照明し、
前記サンプル液体による散乱光の強度を少なくとも１点で測定し、
前記散乱光をキャリブレーションスケールと比較するステップを含む液体中の細菌を検出する方法。
【請求項２】
前記液体の第二サンプルを濾過して前記細菌より小さい予め定められた限界より大きい粒子を除去し、
前記第二サンプル液体を平行光線で照明し、
前記第二サンプル液体による散乱光の強度を少なくとも１点で測定し、
前記散乱光をキャリブレーションスケールと比較することを更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
散乱分布を前記測定強度と関連づける、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記関連づけられた散乱分布を、予め格納された較正散乱分布および予め格納された較正散乱分布の一次結合からなる項目の表から選択された項目と合致させることを更に含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記平行光線を偏光させることを含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記測定が少なくとも１つの波長に関しておこなわれる請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記照明が少なくとも１つのレーザーダイオードでおこなわれる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記濾過の前に、化学的および生物化学的試薬を含む試薬群から選択された少なくとも１つの試薬を、前記サンプル液体に更に加えることを含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
酸性化、アルカリ性化、クロマトグラフィーによる分離、それらの組み合わせを含む反応の群から選択された反応により、前記サンプル液体を反応させることを更に含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
７０℃までの加熱、２℃までの冷却を含む手段の群から選択された手段により、前記サンプル液体の物理状態を変化させることを更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つのキュベットは、少なくとも規定の波長範囲の光に透明な少なくとも１つの窓を含み、前記窓の表面粗さ値の二乗平均平方根は１ナノメーターを超えず、前記窓内の屈折率ばらつきは０．０００１を超えないキュベットユニット（ＣＵ）。
【請求項１２】
少なくとも１つのキュベットは、少なくとも規定の波長範囲の光に透明な少なくとも１つの窓を含み、前記窓の幅は５００μｍを超えないキュベットユニット（ＣＵ）。
【請求項１３】
遮光手段が少なくとも１つの窓に配置されている請求項１１又は１２のいずれかに記載のＣＵ。
【請求項１４】
少なくとも１つの前記キュベットに絞りの開口部が配置されている請求項１１又は１２のいずれかに記載のＣＵ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００８−５１０１６１（Ｐ２００８−５１０１６１Ａ）
【公表日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２６７００（Ｐ２００７−５２６７００）
【出願日】平成１７年８月１６日（２００５．８．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００５／０００８８４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１８８３９
【国際公開日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【出願人】（５０７０４８８５７）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月１６日（２００５．８．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００５／０００８８４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１８８３９
【国際公開日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【出願人】（５０７０４８８５７）
【Ｆターム（参考）】
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