生体分子の安定化方法および組成物
【課題】本発明は生体分子の安定化方法および組成物に関する。特に臨床診断に用いられる酵素または標識抗体の安定化方法および組成物に関する。
【解決手段】（ａ）生体分子、および、（ｂ）セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくは、その同等物、を共存させる、生体分子を安定化する方法、（ａ）および（ｂ）が共存している、生体分子が安定化した組成物、または、セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくは、その同等物を含む、生体分子を安定化するための組成物。
【解決手段】（ａ）生体分子、および、（ｂ）セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくは、その同等物、を共存させる、生体分子を安定化する方法、（ａ）および（ｂ）が共存している、生体分子が安定化した組成物、または、セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくは、その同等物を含む、生体分子を安定化するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体分子の安定化方法および組成物に関する。特に臨床診断に用いられる酵素または標識抗体の安定化方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素および各種化合物を用いて酵素と抗体を修飾させた標識抗体は、その基質特異性の高さや簡便性によりさまざまな用途に応用されている。例えば、分子生物学用途の分析試薬、生化学用途の分析試薬、体外診断薬、液状体外診断薬、チップ状またはスリット状に加工したドライ系の体外診断薬、酵素センサーや酵素電極、医薬品、食品および飲料などである。これらの組成物に適用する酵素は、色素やビオチンまたはアビジンなどの標識化合物による標識、各種化合物による修飾、抗体、抗原とのコンジュゲート化等を受けることもある。
【０００３】
しかし、上記のような酵素や標識抗体を含む組成物の性能を長期に渡って維持するためには、言うまでもなく酵素や標識抗体の活性を安定的に保持する事が重要である。例えば、試薬組成物中の酵素活性が時間経過により低下する時、所望の試薬の有効期間と酵素の活性低下速度に合わせて予め過剰量の酵素を添加する方策があるが、多くの場合このような手段では問題の根本的な解決にはならず、酵素や標識抗体のコストが嵩むことは避けられない。
【０００４】
このため、組成物中に基質や補酵素、塩類、イオン類、糖類、糖アルコール、アミノ酸、脂肪酸エステル、牛血清アルブミンやゼラチン加水分解物等の蛋白質などを共存させることで、安定化を図る種々の方法が試みられてきた（例えば、特許文献１〜５参照）。
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−１４１１６２号公報
【特許文献２】特許第３６８５８１５号公報
【特許文献３】特許第３６９６２６７号公報
【特許文献４】特開２００５−１１４３６８号公報
【特許文献５】特開平１０−２７９５９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記安定化剤として例えば補酵素を用いた場合、概して高価である上、特定の生体分子に対する効果しか期待できないことが考えられる。また高分子或いは塩類、一部のアミノ酸を溶液中で用いた場合は、溶解度の低さや保存中の析出により、十分量添加することができないケースが考えられる。また、特に糖類やアミノ酸を診断薬に添加する場合は、試薬系に共存する若しくは酵素や標識抗体中に混在する夾雑物質と添加剤とが意図しない反応を引き起こす問題を発生させることがある。更に、牛血清アルブミンなどの動物性原料を用いる場合は、着色や牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などに対するリスクにも十分な配慮が必要となる。
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、酵素や標識抗体などの生体分子の効果的な安定化法と、それによって長期間安定性が維持された組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成する為に種々検討した結果、セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくは、その同等物を生体分子と共存させることにより、生体分子を効果的に安定化できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のようなものである。
（１）次の（ａ）および（ｂ）を共存させる、生体分子を安定化する方法：
（ａ）生体分子
（ｂ）セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくは、その同等物。
（２）生体分子が溶液中に存在する（１）記載の生体分子の安定化方法。
（３）生体分子が凍結乾燥物中に存在する（１）記載の生体分子の安定化方法。
（４）セリシンおよび／またはその加水分解物が、繭糸又は生糸から抽出した天然セリシンに由来するものである（１）記載の生体分子の安定化方法。
（５）セリシン同等物が遺伝子工学的手法により得られたものである（１）記載の生体分子の安定化方法。
（６）生体分子が蛋白質である（１）記載の生体分子の安定化方法。
（７）生体分子が酵素である（１）記載の生体分子の安定化方法。
（８）生体分子が標識抗体である（１）記載の生体分子の安定化方法。
（９）次の（ａ）および（ｂ）が共存している、生体分子が安定化した組成物：
（ａ）生体分子
（ｂ）セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくは、その同等物。
（１０）生体分子が溶液中に存在する（９）記載の生体分子の液状安定化組成物。
（１１）生体分子が凍結乾燥物中に存在する（９）記載の生体分子の安定化組成物。
（１２）セリシンおよび／またはその加水分解物が、繭糸又は生糸から抽出した天然セリシンに由来するものである（９）記載の生体分子の安定化組成物。
（１３）セリシン同等物が遺伝子工学的手法により得られたものである（９）記載の生体分子の安定化組成物。
（１４）生体分子が蛋白質である（９）記載の生体分子の安定化組成物。
（１５）生体分子が酵素である（９）記載の生体分子の安定化組成物。
（１６）生体分子が標識抗体である（９）記載の生体分子の安定化組成物。
（１７）セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくは、その同等物を共存させる工程を含む、生体分子の安定化組成物の製造方法。
（１８）セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくは、その同等物を含む、生体分子を安定化するための組成物。
（１９）（９）記載の生体分子の安定化組成物を含む診断用キット。
（２０）（９）記載の生体分子の安定化組成物を含むバイオセンサー。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、セリシンおよび／またはセリシン加水分解物、もしくは、その同等物を用いることにより、生体分子の安定化を液状、乾燥状態の如何に関わらず向上させ、これら生体分子を用いた組成物の有効性を長期間に渡って維持することが可能となる。
本発明の生体分子の安定化方法によれば、酵素や標識抗体の安定性を液状、乾燥状態の如何に関わらず向上させ、これら生体分子を用いた組成物の有効性を長期間に渡って維持することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明において「安定化」とは、生体分子がある物質と共存した状態（ａ）と共存していない状態（ｂ）において、生体分子を一定期間保存した後の該生体分子の保持する残存機能が（ａ）＞（ｂ）となるような状態をいう。
例えば、酵素や標識抗体などの生体物質を含む水溶液の状態で、ある物質を共存させた場合（ａ）と、共存させない場合（ｂ）で、適当な温度で一定時間保存した後の残存活性の比率が、（ａ）＞（ｂ）となる状態をいう。
また、例えば酵素や標識抗体などの生体物質を含む乾燥状態で、ある物質を共存させた
場合（ａ）と、共存させない場合（ｂ）で、適当な温度で一定時間保存した後の残存活性の比率が、（ａ）＞（ｂ）となる状態をいう。
例えば、安定化の評価は、ある物質を共存させた場合（ａ）と、共存させない場合（ｂ）についてそれぞれ残存機能の低下を経時的に測定し、半減期を比較することによって行うことができる。
「適当な温度で一定期間保存」の条件は、状態（ａ）と状態（ｂ）で残存活性に差があらわれる条件であれば特に限定されないが、好ましくは、診断薬試薬中などでの長期保存安定性を念頭に置いた加速（苛酷）試験の条件が選択される。具体的には、「４０℃で７日間保存」、または、「５２℃で１時間保存」などが挙げられる。時間が許せば、生体分子を含有する診断薬などが実際に長期保存される温度として汎用される２℃〜１０℃の冷蔵条件下で６ヶ月以上の保存を選択してもよい。
【００１２】
本発明の一実施態様としては、５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、酵素を２５℃で２ヶ月保存した後の残存活性率を、セリシンを添加することによって、セリシンを含まない状態に比べて向上させる方法である。
本発明の別の実施態様としては、１ｇ／Ｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む５０ｍＭ
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、酵素を４０℃で１４日間保存した後の残存活性率を、セリシンを添加することによって、セリシンを含まない状態に比べて向上させる方法である。
本発明の更に別の実施態様としては、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で、酵素を５２℃で１時間保存した後の残存活性率を、セリシンを添加することによって、セリシンを含まない状態に比べて向上させる方法である。
本発明の更に別の実施態様としては、１ｇ／Ｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中で、酵素を９℃で２４時間保存した後の残存活性率を、セリシンを添加することによって、セリシンを含まない状態に比べて向上させる方法である。
本発明の更に別の実施形態としては、１ｇ／Ｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、酵素を２５℃で１４日間保存した後の残存活性率を、セリシンを添加することによって、セリシンを含まない状態に比べて向上させる方法である。
本発明の更に別の実施形態としては、１ｇ／Ｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で、酵素を２５℃で１４日間保存した後の残存活性率を、セリシンを添加することによって、セリシンを含まない状態に比べて向上させる方法である。
本発明の更に別の実施態様としては、０．５ｇ／Ｌ アジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、酵素を２５℃で１４日間保存した後の残存活性率を、セリシンを添加することによって、セリシンを含まない状態に比べて向上させる方法である。
本発明の更に別の実施態様としては、酵素を凍結乾燥粉末の状態で３７℃で１４日間保存した後の残存活性率を、セリシンを添加することによって、セリシンを含まない状態に比べて向上させる方法である。
本発明の更に別の実施態様としては、２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、標識抗体を４℃で３日間保存させた後の残存活性率を、セリシンを添加することによって、セリシンを含まない状態に比べて向上させる方法である。
本発明の更に別の実施態様としては、１ｍＭ 塩化マグネシウム、０．１ｍＭ 塩化亜鉛、１ｇ／Ｌ アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中で、標識抗体を４℃で３日間保存させた後の残存活性率を、セリシンを添加することによって、セリシンを含まない状態に比べて向上させる方法である。
上記実施態様において、セリシンに替えてセリシン加水分解物またはセリシン同等物を用いても良い。
【００１３】
ここでセリシンとは、繭糸または生糸に存在する非結晶性の天然蛋白質であり、本明細書においては特に、繭糸または生糸から非加水分解物の状態で抽出されたものをいうものとする。
一般的に、セリシンの遺伝子は２．６ｋｂｐ〜１０．６ｋｂｐの大きさで複数種確認されており、それらは例えば、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５７ １５１９２−１５１９９（１９８２）に記載されている。本発明に用いるセリシンは、このような配列を有する遺伝子から、産生される蛋白質であり、例えば、その全長配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列から実質的になるものである。典型的には、このアミノ酸配列は、配列番号１に示される３８個のアミノ酸配列からなる本質的領域と、それ以外の非本質的領域とからなり、前記本質的領域を反復配列として含んでなるものである。例えば配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるセリシンでは、前記本質的領域が１２回反復して存在している。
本明細書において、セリシンが「配列番号２に示されるアミノ酸配列から実質的になる」とは、セリシンが生体分子を安定化する作用を有する限りにおいて、そのアミノ酸配列（配列番号２）の１もしくは複数個、好ましくは１〜２０００個、より好ましくは１〜５００個、さらに好ましくは１〜３００個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたものであってもよいことを意味する。この場合、アミノ酸残基の欠失、置換、挿入もしくは付加は、本質的領域以外の領域になされていることが好ましい。本質的領域になされる場合においては、保存的置換であることが好ましく、セリシンが生体分子を安定化する作用を有する限りにおいて、そのアミノ酸配列の１もしくは複数個、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜２０個が保存的に置換されていてもよい。保存的置換とは、蛋白質の活性が実質的に改変されないように、１もしくは複数個のアミノ酸残基が、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換されることをいう。例えば、ある疎水性残基が別の疎水性残基によって置換される場合、ある極性残基が同じ電荷を有する別の極性残基によって置換される場合、ある芳香族アミノ酸が別の芳香族アミノ酸によって置換される場合などが挙げられる。このような機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。
本発明においては、非加水分解物としてのセリシンに替えて、あるいは、非加水分解物としてのセリシンと併用して、そのものが生体分子を安定化する作用を有する限り、セリシン加水分解物を用いることができる。
前記セリシンおよびセリシン加水分解物は、ＷＯ２００２／０８６１３３号公報に開示される公知の方法に従い、繭糸または生糸から抽出して得ることができる。具体的には、非加水分解物としてのセリシンは、例えば以下のようにして、純度９０％以上の高精製度蛋白質の状態で得ることができる。
まず繭糸または生糸を、水、好ましくは８０〜１００℃程度の熱水内で処理することにより、繭糸または生糸に含まれるセリシンを、該水中に溶出させ、セリシン水溶液を得る。さらに、得られたセリシン水溶液について、例えば次の（１）〜（３）のいずれかの方法を適用することにより、分離精製処理を行って、目的とするセリシンを回収することができる。
（１）前記セリシン水溶液のｐＨを、有機酸もしくは無機酸によってｐＨ３〜５に調整した後、そこに有機凝集剤または無機凝集剤を添加してセリシンを析出させ、これをさらに濾過後、乾燥させて固体セリシンを得ることができる。
（２）前記セリシン水溶液と、メタノール、エタノールまたはジオキサンなどの水溶性溶媒と混合し、これによりセリシンを析出させた後、濾別乾燥して固体セリシンを得ることができる。
（３）特開平４−２０２４３５号公報に記載のように、前記セリシン水溶液を限外濾過膜または逆浸透膜に付し、所定の濾過処理を行った後、乾燥させてセリシン粉体を得ることができる。
また、セリシン加水分解物は、例えば以下のようにして、純度９０％以上の高精製度蛋白質の状態で得ることができる。
まず繭糸または生糸を、水、好ましくは８０〜１００℃程度の熱水内で処理することにより、繭糸または生糸に含まれるセリシンを、該水中に溶出させ、セリシン水溶液を得る。このとき、電気分解した水や、酸、アルカリまたは酵素を併用して、セリシンを部分加水分解させる。そして得られたセリシン加水分解物水溶液について、例えば上記の（１）〜（３）のいずれかの方法を適用することにより、分離精製処理を行って、目的とするセリシン加水分解物を回収することができる。
かくして得られるセリシンおよびセリシン加水分解物の分子量は通常、５００〜５００，０００の範囲内にあり、生体分子を安定化する作用を有する限りそのいずれも使用可能であるが、取扱い性の点から、重量平均分子量が５，０００〜１００，０００、特に１０，０００〜５０，０００であるセリシン加水分解物が好ましい。
【００１４】
本発明の安定化方法に用いる、「セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくは、その同等物」における「その同等物」（以下「セリシン同等物」ともいう）とは、天然セリシンに含まれる前記本質的領域、すなわち、配列番号１に示される３８個のアミノ酸配列を少なくとも含んでなるポリペプチドであって、人工的に得られたもの、すなわち、化学合成により得られたものや遺伝子工学的手法により得られたものをいうものとする。したがって、人工的に得られたものであれば、天然物由来のセリシンまたはセリシン加水分解物と同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることができる。さらに、セリシン同等物には、天然物由来のセリシンまたはセリシン加水分解物の一部を利用してそれを基にさらに合成を行って得られたものも包含される。
本発明においては、前記天然物由来の「セリシンおよび／またはその加水分解物」に替えて、そのものが生体分子を安定化する作用を有する限り、これらの「その同等物」を用いることができる。
セリシン同等物は、前記した配列番号１に示される３８個のアミノ酸配列からなる本質的領域を、複数回反復した配列として含んでなることが好ましい。反復配列を有するポリペプチドを使用することにより、生体分子を安定化する作用をより向上させることができる。セリシン同等物は、そのアミノ酸配列におけるアミノ酸残基数１００個あたりに、前記本質的領域を少なくとも１個、さらには少なくとも２個有することが好ましい。セリシン同等物において本質的領域の含まれる割合は、多い方が好ましい。このような割合で反復配列を有することにより、セリシン同等物の全長のアミノ酸残基数が増加しても、安定して生体分子を安定化する作用を示すことができる。その作用は、典型的には、天然物由来のセリシンまたはセリシン加水分解物と比較して、同等であるかまたはそれより優れた性能を有している。
セリシン同等物の全長は、生体分子を安定化する作用を有する限り特に限定されないが、製造上の点では、前記本質的領域を２〜８回反復したものであることが好ましく、より好ましくは２〜６回、さらに好ましくは２〜４回反復したものである。
セリシン同等物の本質的領域は、そのアミノ酸配列の例えば１もしくは複数個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個が保存的に置換されていてもよい。
セリシン同等物は、ＷＯ２００２／０８６１３３号公報に開示される公知の方法に従って得ることができる。例えば、化学合成する際には、ｔ−Ｂｏｃ法、Ｆｍｏｃ法による固相、液相合成法等、慣用のポリペプチドの合成手段を適宜採用することができる。また、遺伝子工学的手法により製造する際には、それをコードするＤＮＡを入手、もしくは製造することができる場合、そのＤＮＡによって宿主細胞を形質転換させた形質転換細胞において、製造することができる。
セリシン同等物は、融合タンパク質であることができる。このような融合タンパク質は、前記「セリシン」や「セリシン加水分解物」をコードするＤＮＡと異種ポリペプチドをコードするＤＮＡとを融合させて融合タンパク質をコードするＤＮＡを作成し、これを発現させて製造することができる。
【００１５】
セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくは、その同等物は、例えば０．１〜２００ｇ／Ｌ、好ましくは０．１〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．２〜２０ｇ／Ｌの濃度で添加することができる。
【００１６】
本発明の安定化方法の対象となる生体分子は特に限定されるものではないが、例えば臨床診断に用いられる酵素、標識抗体などの蛋白質、核酸など、またはそれらを含有する組成物などが挙げられる。
酵素の種類は、特に限定されるものではないが、一部例を挙げると、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、β−グルグルコシダーゼ、ウリカーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールキナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。
【００１７】
酵素は、天然に存在する各種微生物、動植物などの給源から調製されたもの、遺伝子工学的手法により製造されたもの、あるいは化学的に合成されたものを用いることができる。更に蛋白質工学などの手法により野生型から改変されたものであっても良い。
また、本発明の酵素は、色素やビオチンまたはアビジンなどの標識化合物による標識、各種化合物による修飾、抗体、抗原とのコンジュゲート化等を受けてもよい。
標識抗体、標識抗原としては、特に限定されるものではないが、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなどで標識した、マウスＩｇＧ、β２ミクログロブリン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）、α１−アンチトリプシン、α１−マイクログロブリン、ハプトグロブリン、トランスフェリン、セルロプラスミン、フェリチン、アルブミン、ヘモグロビンＡ１、ヘモグロビンＡ１Ｃ、ミオグロビン、ミオシン、デュパン−２、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、組織ポリペプチド抗原（ＴＰＡ）、アポリポ蛋白Ａ１、アポリポ蛋白Ｅ、リウマチ因子、抗ストレプトリジンＯ（ＡＳＯ）、フィブリン分解産物（ＦＤＰ）、フィブリン分解産物Ｄ分画（ＦＤＰ−Ｄ）、フィブリン分解産物Ｄ−Ｄ分画（ＦＤＰ−ＤＤｉｍｅｒ）、フィブリン分解産物Ｅ分画（ＦＤＰ−Ｅ）、アンチトロンビン−ＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）等の蛋白質、アミラーゼ、前立腺由来酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、フィブリノーゲン、エラスターゼ、プラスミノーゲン、クレアチンキナーゼ心筋型（ＣＫ−ＭＢ）等の酵素、インシュリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、３，５，３'−トリヨードサイロニン（Ｔ３）、サイロキシン（Ｔ４）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、生長ホルモン（ＧＨ）、黄体化ホルモン（ＬＨ）等のホルモン、Ｂ型肝炎ウイルス関連抗体、Ｂ型肝炎ウイルス関連抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗体、ＨＴＬＶ（成人Ｔ細胞白血病ウイルス）抗体、ＨＩＶ（エイズウイルス）抗体、クラミジア抗体、梅毒の抗体、トキソプラズマ抗体等各種感染症の原因ウイルスに対する抗体、抗原などが挙げられ、また抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体の混合物、またあるいは酵素処理や遺伝子工学的に断片化されたＦ（ａｂ‘）２，Ｆａｂ’、Ｆａｂなどの抗体フラグメントなども挙げられる。
このような複合体も本発明でいう生体分子に含まれる。
【００１８】
それらの存在状態は、液状、凍結乾燥状、顆粒状、担体への固定化やチップ等にコーティングされた状態など特に限定されない。
さらに、他の物質と混合された液状組成物、凍結乾燥状組成物などであってもよい。
このような組成物は、適当な容器に入れられたり、適当なデバイスに搭載されて、例えば、分子生物学用途の分析試薬、生化学用途の分析試薬、体外診断薬、液状体外診断薬、チップ状またはスリット状に加工したドライ系の体外診断薬、酵素センサーや酵素電極、医薬品、食品および飲料など、種々の形態をとることができる。
【００１９】
本発明においては、安定化、形状改善などの目的で、さらに他の物質を混合しても良い。
粉末の場合、一般的な安定化剤や形状改善剤として、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、キシロース、ラクトース、シュークロース、ラフィノース、トレハロース、シクロデキストリン、プルラン、イヌリン、可溶性デンプンなどの糖類およびグルシトール、マンニトール、イノシトール、キシリトールなどの糖アルコール類、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リジン、ヒスチジン等のアミノ酸およびアミノ酸塩、グリシルグリシン、グリシルグリシルグリシンなどのペプチド類、リン酸塩、ホウ酸塩、硫酸塩、トリス塩などの無機塩類、フラビン類、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、グルコン酸などの有機酸及び有機酸の塩、ゼラチン、カゼイン、アルブミンなどのタンパク質、更にコール酸類、脂肪酸の糖エステル類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコールアルキルエーテルなどの界面活性剤を含むことが可能である。
【００２０】
液状である場合、酵素タンパクなどの生体分子が完全に溶解している状態だけでなく、懸濁液のように液体の中に分散している場合も含む。液状酵素は水ではなく、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＰＩＰＥＳ，ＭＥＳ，ＴＥＳ，ＭＯＰＳ，ＨＥＰＥＳなどのＧｏｏｄ緩衝液に溶解又は懸濁されていても良く、この様な液状酵素中に硫安、燐安、食塩、塩化カリウムなどの塩類を含んでいても良い。また、エタノールやメタノール、プロパノールなどのアルコール類、グリセロールやエチレングリコールなどのポリオール類、アルキルグルコシド、ポリエチレングリコールアルキルエーテル、脂肪酸アルコールエステルなどの界面活性剤を添加しても良い。必要に応じて、ペニシリン系、セフェム系、アミノ配糖体系、マイクロライド系、テトラサイクリン系、ニュー・キノロン系等の抗生物質、アジ化物、１，１‘−Ｍｅｔｈｙｌｅｎ−ｂｉｓ［３−（１−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−２，４−ｄｉｏｘｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎ−５−ｙｌ）−ｕｒｅａ］，２−Ｍｅｔｈｙｌ−３（２Ｈ）−ｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｏｎｅ−ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，５−Ｂｒｏｍｏ−５−ｎｉｔｒｏ−１，３−ｄｉｏｘａｎｅ，２−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｙｒｉｄｉｎｅ−Ｎ−ｏｘｉｄｅ，２−Ｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｅなどの防腐剤を添加しても良い。
【００２１】
酵素、標識抗体を構成成分とする組成物は、その組成物の使用目的に応じてＮＡＤ＋やＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ＋，ＮＡＤＰＨ，ＡＴＰ，ＡＤＰ，ＡＭＰ，ＧＴＰ，ＧＭＰ，ＦＡＤやＦＭＮ、ビオチン、ナイアシン、コバラミン、ＰＱＱなどの補酵素類、ナトリウム、カリウム、亜鉛、マグネシウム、カルシウム、リチウム、銅、鉄、マンガン等の金属塩、チオール化合物、セレン化合物、硝酸塩、リン酸塩、硫酸塩、ホウ酸塩、トリス塩等の塩類、アミノ酸及びアミノ酸塩、糖および配糖体、また必要により、フェノール系およびアニリン系の各種トリンダー試薬とカプラーである４−アミノアンチピリン，テトラゾリウム塩類とフエナジンメトサルフェートなどの電子キャリヤー、ロイコ系試薬などの色素類，および基質類を添加することが可能である。
【００２２】
標識抗体を構成成分とする組成物は、その組成物の使用目的に応じて、非特異反応防止剤を添加してもよい。非特異反応防止剤としては、特に限定されるものではないが、標識抗体と同種の抗体、標識抗体と同種の酵素を添加することができる。同種の抗体として、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、高分子量化されたマウスＩｇＧ重合体、ヤギＩｇＧ，羊ＩｇＧ、馬ＩｇＧ、ラットＩｇＧ、ウサギＩｇＧが挙げられる。またこれら抗体を含む動物血清、腹水などの体液のまま添加することもできるが、ウイルス不活化処理、補体非働化処理、脱脂処理などを行って添加することが望ましい。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
【００２４】
以下の実施例１−２１において、セリシン加水分解物はＷＯ２００２／０８６１３３号公報の製造例１に開示される方法に従って製造した。
詳細は以下の通りである。
（製造例１）
繭（家蚕（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）が作ったもの）１ｋｇを、０．２％炭酸ナトリウム水溶液（ｐＨ１１〜１２）５０Ｌ中において９５℃の条件下において２時間熱水処理を施し、セリシン加水分解物を抽出した。得られたセリシン加水分解物抽出液を平均孔径０．２μｍのフィルターを用いて濾過し、凝集物を除去した後、濾液を逆浸透膜により脱塩し、濃度０．２％の無色透明のセリシン加水分解物水溶液を得た。
次いで、この水溶液をエバポレーターを用いて濃度が約２％になるまで濃縮させた後、凍結乾燥処理を行って、純度９０％以上で、平均分子量２０，０００であるセリシン加水分解物の粉体１００ｇを得た。
【００２５】
（実施例１）
ペルオキシダーゼ（東洋紡績社ＰＥＯ−３０２）、セリシン加水分解物を含有する下記試薬溶液を２５℃、２ヶ月間または５０℃で７日間保存し、残存活性率（調製直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を測定した。
（試薬の調製）
下記組成からなる試薬をそれぞれ調製した。
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．０
ペルオキシダーゼ（東洋紡績社ＰＥＯ−３０２） ５，０００Ｕ／Ｌ
セリシン加水分解物 ０．２〜２ｇ／Ｌ
【００２６】
（比較例１）
実施例１においてセリシン加水分解物を添加しない、又はセリシン加水分解物の替わりに牛血清アルブミン（シグマ社ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）０．２〜２ｇ／Ｌを含有する試薬溶液を調製し、実施例１と同様の条件で保存し、残存活性率を測定した。
表１に示す通り、ペルオキシダーゼがセリシン加水分解物による安定化されることが示された。
【００２７】
【表１】
【００２８】
（実施例２）
実施例１のペルオキシダーゼに、セリシン加水分解物２ｇ／Ｌを含有する試薬溶液に、更に防腐剤の１種であるアジ化ナトリウム０．５ｇ／Ｌを含有する試薬溶液を調製した後、２５℃で１４日間保存し、残存活性率（調製直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を測定した。
【００２９】
（比較例２）
実施例２においてセリシン加水分解物を添加しない、又はセリシン加水分解物の替わりに牛血清アルブミン（シグマ社ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）２ｇ／Ｌを含有する試薬溶液を調製し、実施例２と同様の条件で保存し、残存活性率を測定した。
表２に示す通り、防腐剤共存下のペルオキシダーゼがセリシン加水分解物による安定化されることが示された。
【００３０】
【表２】
【００３１】
（実施例３）
リポプロテインリパーゼ（東洋紡績社ＬＰＬ−３１１）、セリシン加水分解物を含有する下記試薬溶液を２５℃または４０℃で１４日間保存し、残存活性率（調製直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を測定した。
（試薬の調製）
下記組成からなる試薬をそれぞれ調製した。
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．０
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １ｇ／Ｌ
リポプロテインリパーゼ（東洋紡績社ＬＰＬ−３１１） ５，０００Ｕ／Ｌ
セリシン加水分解物 ０．２〜２ｇ／Ｌ
【００３２】
（比較例３）
実施例３においてセリシン加水分解物を添加しない、又はセリシン加水分解物の替わりに牛血清アルブミン（シグマ社ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）０．２〜２ｇ／Ｌを含有する試薬溶液を調製し、実施例３と同様の条件で保存し、残存活性率を測定した。
表３に示す通り、リポプロテインリパーゼがセリシン加水分解物により安定化されることが示された。
【００３３】
【表３】
【００３４】
（実施例４）
グリセロールキナーゼ（東洋紡績社ＧＹＫ−３０１）、セリシン加水分解物を含有する下記試薬溶液を２５℃で１４日間保存し、残存活性率（調製直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を測定した。
（試薬の調製）
下記組成からなる試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．０
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １ｇ／Ｌ
グリセロールキナーゼ（東洋紡績社ＧＹＫ−３０１） ２，０００Ｕ／Ｌ
セリシン加水分解物 ２ｇ／Ｌ
【００３５】
（比較例４）
実施例４においてセリシン加水分解物を添加しない、又はセリシン加水分解物の替わりに牛血清アルブミン（シグマ社ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）２ｇ／Ｌを含有する試薬溶液を調製し、実施例４と同様の条件で保存し、残存活性率を測定した。
表４に示す通り、グリセロールキナーゼがセリシン加水分解物により安定化されることが示された。
【００３６】
【表４】
【００３７】
（実施例５）
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡績社ＣＯＯ−３２１）、セリシン加水分解物を含有する下記試薬溶液を５２℃で１時間処理または４０℃で７日間保存し、残存活性率（調製直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を測定した。
（試薬の調製）
下記組成からなる試薬を調製した。
リン酸カリウム緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ７．０
コレステロ−ルオキシダーゼ（東洋紡績社ＣＯＯ−３２１） ２，０００Ｕ／Ｌ
セリシン加水分解物 ４ｇ／Ｌ
【００３８】
（比較例５）
実施例５においてセリシン加水分解物を添加しない、又はセリシン加水分解物の替わりに牛血清アルブミン（シグマ社ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）４ｇ／Ｌを含有する試薬溶液を調製し、実施例５と同様の条件で保存し、残存活性率を測定した。
表５に示す通り、コレステロールオキシダーゼがセリシン加水分解物により安定化されることが示された。
【００３９】
【表５】
【００４０】
（実施例６）
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（東洋紡績社Ｇ６Ｄ−３２１）、セリシン加水分解物を含有する下記試薬溶液を２５℃で１４日間保存し、残存活性率（調製直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を測定した。
（試薬の調製）
下記組成からなる試薬を調製した。
リン酸カリウム緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ７．０
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １ｇ／Ｌ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（東洋紡績社Ｇ６Ｄ−３２１） ３，０００Ｕ／Ｌ
セリシン加水分解物 １ｇ／Ｌ
【００４１】
（比較例６）
実施例６においてセリシン加水分解物を添加しない、又はセリシン加水分解物の替わりに牛血清アルブミン（シグマ社ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）１ｇ／Ｌを含有する試薬溶液を調製し、実施例６と同様の条件で保存し、残存活性率を測定した。
表６に示す通り、グルコース−６−リン酸脱水素酵素がセリシン加水分解物により安定化されることが示された。
【００４２】
【表６】
【００４３】
（実施例７）
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（東洋紡績社ＰＰＣ−３０１）、セリシン加水分解物を含有する下記試薬溶液を９℃または２５℃で２４時間保存し、残存活性率（調製直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を測定した。
（試薬の調製）
下記組成からなる試薬をそれぞれ調製した。
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ５０ｍＭ ｐＨ８．０
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １ｇ／Ｌ
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（東洋紡績社ＰＰＣ−３０１）
５，０００Ｕ／Ｌ
セリシン加水分解物 ０．２〜２０ｇ／Ｌ
【００４４】
（比較例７）
実施例７においてセリシン加水分解物を添加しない試薬溶液を調製し、実施例７と同様の条件で保存し、残存活性率を測定した。
表７に示す通り、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼがセリシン加水分解物により安定化されることが示された。
【００４５】
【表７】
【００４６】
（実施例８）
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡績社ＣＯＯ−３２１）粉末１ｇを蒸留水１０ｍｌで溶解させた後、これにセリシン加水分解物０．５ｇを加えて溶解させたコレステロールオキシダーゼ溶液を凍結乾燥することにより、セリシン加水分解物を含有するコレステロールオキシダーゼ粉末を調製した。この凍結乾燥粉末を５０℃で１４日間保存し、残存活性率（５０℃保存前の活性値に対する保存後の活性値の割合）を測定した。
【００４７】
（比較例８）
実施例８においてセリシン加水分解物を添加しない、又はセリシン加水分解物の替わりに牛血清アルブミン（シグマ社ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）０．５ｇ加えて調製したコレステロールオキシダーゼ粉末を実施例８と同様の条件で保存し、残存活性率を測定した。
表８に示す通り、コレステロールオキシダーゼがセリシン加水分解物により安定化されることが示された。
【００４８】
【表８】
【００４９】
（実施例９）
ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（東洋紡績社ＧＬＤ−３２１）粉末１ｇを蒸留水１０ｍｌで溶解させた後、これにセリシン加水分解物０．５ｇを加えて溶解させたＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ溶液を凍結乾燥することにより、セリシン加水分解物を含有するＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ粉末を調製した。この凍結乾燥粉末を３７℃で２１日間保存し、残存活性率（３７℃保存前の活性値に対する保存後の活性値の割合）を測定した。
【００５０】
（比較例９）
実施例９においてセリシン加水分解物を添加しない、又はセリシン加水分解物の替わりに牛血清アルブミン（シグマ社ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）０．５ｇ加えて調製したＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ粉末を実施例９と同様の条件で保存し、残存活性率を測定した。
表９に示す通り、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼがセリシン加水分解物により安定化されることが示された。
【００５１】
【表９】
【００５２】
（実施例１０）
クレアチニンアミドヒドロラーゼ（東洋紡績社ＣＮＨ−２１１）粉末１ｇを蒸留水１０ｍｌで溶解させた後、これにセリシン加水分解物０．５ｇを加えて溶解させたクレアチニンアミドヒドロラーゼ溶液を凍結乾燥することにより、セリシン加水分解物を含有するクレアチニンアミドヒドロラーゼ粉末を調製した。この凍結乾燥粉末を３７℃で１４日間保存し、残存活性率（３７℃保存前の活性値に対する保存後の活性値の割合）を測定した。
【００５３】
（比較例１０）
実施例１０においてセリシン加水分解物を含有しないクレアチニンアミドヒドロラーゼ粉末を実施例１０と同様の条件で保存し、残存活性率を測定した。
表１０に示す通り、クレアチニンアミドヒドロラーゼがセリシン加水分解物により安定化されることが示された。
【００５４】
【表１０】
【００５５】
（実施例１１−１６、比較例１１）
西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体の安定化
比較例１１ ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG（アマシャムバイオサイエンス社）を
５ｇ／Ｌ牛血清アルブミン（ナカライテスク社）を含む２０ｍM MOPS緩衝液ｐH７．０にて８０００倍希釈、ガンマ線滅菌済み０．２２μｍフィルターろ過し、ガンマ線滅菌済みポリプロピレン製容器中にて４℃または２５℃で３日間保存した。
実施例１１ ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG（アマシャムバイオサイエンス社）を
５ｇ／Ｌセリシン加水分解物を含む２０ｍM MOPS緩衝液ｐH７．０にて８０００倍希釈、ガンマ線滅菌済み０．２２μｍフィルターろ過し、ガンマ線滅菌済みポリプロピレン製容器中にて４℃または２５℃で３日間保存した。
実施例１２ セリシン加水分解物は予め蒸留水に１００ｇ／Ｌになるよう溶解し、１２１℃２０分間オートクレーブ処理を行った。ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG（アマシャムバイオサイエンス社）を５ｇ／Ｌオートクレーブ処理済みセリシン加水分解物を含む２０ｍM MOPS緩衝液ｐH７．０にて８０００倍希釈、ガンマ線滅菌済み０．２２μｍフィルターろ過し、ガンマ線滅菌済みポリプロピレン製容器中にて４℃または２５℃で３日間保存した。
実施例１３ ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG（アマシャムバイオサイエンス社）を
５ｇ／Ｌ セリシン加水分解物、０．２ｇ／Ｌ４−アミノアンチピリン（ナカライテスク社）を含む２０ｍM MOPS緩衝液ｐH７．０にて８０００倍希釈、ガンマ線滅菌済み０．２２μｍフィルターろ過し、ガンマ線滅菌済みポリプロピレン製容器中にて４℃または２５℃で３日間保管した。
実施例１４ ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG（アマシャムバイオサイエンス社）を
５ｇ／Ｌ セリシン加水分解物、０．２ｇ／Ｌ ４−アミノアンチピリン（ナカライテスク）を含む２０ｍM MOPS緩衝液ｐH６．５にて８０００倍希釈、ガンマ線滅菌済み０．２２μｍフィルターろ過し、ガンマ線滅菌済みポリプロピレン製容器中にて４℃または２５℃で３日間保存した。
実施例１５ 抗体固相プレート試薬の調製 ヤギ抗マウスＦｃ抗体（シグマ社）を１０μｇ／ｍｌとなるよう５０ｍＭ 炭酸緩衝液ｐＨ９．６で希釈し、１ウェルに５０μＬずつＥＬＩＳＡプレート（住友ベークライト社）に分注した。室温１時間放置して抗体をプレートに結合させた後、分注液を廃棄・十分液切りを行い、次いで蒸留水にて４倍希釈したブロックエース（大日本製薬社）を１ウェルに３００μLずつ分注し室温１時間放置しブロッキングを行った。使用前に分注液を廃棄・十分液切りを行った後０．５ｇ／Ｌ ツイーン20を含む１０ｍMリン酸生理緩衝液ｐＨ７．２ ３００μL分注廃棄を３回繰り返しプレート洗浄し（以下、PBS−T洗浄と略記）、測定に使用した。
実施例１６ マウスIgGの測定 ０．１％ＢＳＡを含むリン酸生理緩衝液にてマウスIgG（ケミコン社）を希釈し、マウスＩｇＧ ６４、１２８、２５６ｎｇ／ｍｌ濃度の試料を調製した。希釈に使用した緩衝液を０ｎｇ／ｍｌ試料とした。次いでＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ試料を５０μＬずつＮ＝２で分注し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔ洗浄後、各比較例・実施例の標識抗体液５０μＬずつ分注し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔ洗浄後、酵素反応液としてＴＭＢ＋（ダコ社）を５０μＬずつ分注し、室温遮光して１０分反応させた。１Ｎ 硫酸 ５０μＬ分注、攪拌により酵素反応を停止させた後、Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ−６５０ｎｍをマイクロプレートリーダーにて測定した。マウスＩｇＧ濃度ドーズ依存的に吸光度は上昇した。
ELISAにより得られた結果を用い、それぞれ２５６ｎｇ／ｍｌ試料と０ｎｇ／ｍｌ試料
の吸光度差を求め、対応する４℃保存条件との比の３乗根を取り、１日あたりの残存活性率を求めた結果を表１１に示す。牛血清アルブミンを用いた比較例に比べ、セリシン加水分解物を含む実施例において残存活性率は高く、安定化効果が認められた。セリシン加水分解物自体オートクレーブ処理を行っても安定化効果は失われない。セリシン加水分解物とペルオキシダーゼの基質として作用しうる物質と共存させることによりさらに残存活性率向上が可能であることもわかった。
【００５６】
【表１１】
【００５７】
（実施例１７−２１、比較例１２、１３）
アルカリフォスファターゼ標識抗体の安定化
（１）実施例１７ アルカリフォスファターゼ標識抗体の作製 マウス抗ＣＥＡ モノクローナル抗体 クローン５９０５（メディックスバイオケミカ社）200μｇと、抗体の
アミノ基で結合させる標識化キット（同仁化学社 ＬＫ１２）を用いて、標識キット取扱説明書に従い操作し、アルカリフォスファターゼ標識抗体を作製した。すなわち、キット添付のウォッシングバッファー１００μＬを同フィルトレーションチューブに入れ、ピペ
ットにより軽く混合した後、ｘ８０００ｇ１０分間遠心し、さらにウォッシングバッファー１００μＬを加えてもう一度同条件にて遠心した。キット添付のリアクションバッファー１０μＬを同ＮＨ２−ＲｅａｃｔｉｖｅＡＬＰに加えピペッティングにより溶解し、全量を抗体が濃縮されているフィルトレーションチューブのメンブレン上に加え、ピペッティングによりメンブレン上の抗体と混合し、３７℃２時間放置した。その後、キット添付のストレイジバッファー１９０μＬを加え、ピペッティングにより標識抗体２００μＬを回収し、アルカリフォスファターゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体とした。
（２）比較例１２ アルカリフォスファターゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体を１ｍＭ 塩化マグネシウム、０．１ｍＭ 塩化亜鉛、１ｇ／Ｌ アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）にて８０００倍希釈、ガンマ線滅菌済み０．２２μｍフィルターろ過し、ガンマ線滅菌済みポリプロピレン製容器中にて４℃または２５℃で３日間保存した。
（３）比較例１３ アルカリフォスファターゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体を２０ｇ／Ｌ 牛血清アルブミン（ナカライテスク社）、１ｍＭ 塩化マグネシウム、０．１ｍＭ 塩化亜鉛、１ｇ／Ｌ アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）にて８０００倍希釈、ガンマ線滅菌済み０．２２μｍフィルターろ過し、ガンマ線滅菌済みポリプロピレン製容器中にて４℃または２５℃で３日間保存した。
（４）実施例１８ アルカリフォスファターゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体を２０ｇ／Ｌ セリシン加水分解物、１ｍＭ 塩化マグネシウム、０．１ｍＭ 塩化亜鉛、１ｇ／Ｌ アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）にて８０００倍希釈、ガンマ線滅菌済み０．２２μｍフィルターろ過し、ガンマ線滅菌済みポリプロピレン製容器中にて４℃または２５℃で３日間保存した。
（５）実施例１９ セリシン加水分解物は予め蒸留水に１００ｇ／Ｌになるよう溶解し、１２１℃２０分間オートクレーブ処理を行った。アルカリフォスファターゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体を２０ｇ／Ｌ オートクレーブ済みセリシン加水分解物、１ｍＭ 塩化マグネシウム、０．１ｍＭ 塩化亜鉛、１ｇ／Ｌ アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）にて８０００倍希釈、ガンマ線滅菌済み０．２２μｍフィルターろ過し、ガンマ線滅菌済みポリプロピレン製容器中にて４℃または２５℃で３日間保存した。
（６）実施例２０ 抗ＣＥＡ抗体固相プレート試薬の調製 マウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体クローン５９０９（メディックスバイオケミカ社）を１０μｇ／ｍｌとなるよう５０ｍＭ 炭酸緩衝液ｐＨ９．６で希釈し、１ウェルに５０μＬずつ黒色ポリスチレン製アッセイプレート（コーニング社）に分注した。室温１時間放置して抗体をプレートに結合させた後、分注液を廃棄・十分液切りを行い、次いで蒸留水にて４倍希釈したブロックエース（大日本製薬社）を１ウェルに３００μLずつ分注し室温１時間放置しブロッキングを行った。使用前に分注液を廃棄・十分液切りを行った後０．５ｇ／Ｌツイーン20を含む１０ｍMトリス生理緩衝液ｐＨ７．５ にて３００μL分注・廃棄を３回繰り返し
プレート洗浄し（以下、ＴＢＳ−Ｔ洗浄と略記）、測定に使用した。
（７）実施例２１ ＣＥＡの測定 ０．１％ＢＳＡを含むリン酸生理緩衝液にてＣＥＡ抗原を希釈し、ＣＥＡ ５，２０、８０ｎｇ／ｍｌ濃度の試料を調製した。希釈に使用した緩衝液を０ｎｇ／ｍｌ試料とした。次いでＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ試料を５０μＬずつＮ＝２で分注し、３７℃で１時間反応させた。ＴＢＳ−Ｔ洗浄後、比較例３と実施例８の標識抗体液５０μＬずつ分注し、３７℃で１時間反応させた。ＴＢＳ−Ｔ洗浄後、酵素反応液としてＡＰＳ−５（ルミジェン社）を５０μＬずつ分注し、３７℃２０分反応後の発光シグナルをルミノスキャン（ラブシステムズ社）にて測定した。ＣＥＡ濃度ドーズ依存的に発光強度は上昇した。
得られた結果でそれぞれ８０ｎｇ／ｍｌ試料と０ｎｇ／ｍｌ試料の発光強度差を求め、次いで対応する４℃保存条件との比の３乗根を計算し、１日あたりの残存活性率を求めた。結果を表１２に示す。比較例で示した通り、従来技術である牛血清アルブミン添加でアルカリフォスファターゼ標識抗体安定性は向上するが、驚くべきことにセリシン加水分解物添加実施例でさらに残存活性率は高く、アルカリフォスファターゼ標識抗体安定化効果が高いことが判った。本効果はオートクレーブ処理においても失われないことも判った。
【００５８】
【表１２】
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明によれば、酵素や標識抗体などの生体分子の安定性を向上させ、これら生体分子を用いた組成物の有効性を長期間に渡って維持することが可能となる。特に臨床検査分野で用いられる診断薬用途として優れており、産業界に寄与することが大である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体分子の安定化方法および組成物に関する。特に臨床診断に用いられる酵素または標識抗体の安定化方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素および各種化合物を用いて酵素と抗体を修飾させた標識抗体は、その基質特異性の高さや簡便性によりさまざまな用途に応用されている。例えば、分子生物学用途の分析試薬、生化学用途の分析試薬、体外診断薬、液状体外診断薬、チップ状またはスリット状に加工したドライ系の体外診断薬、酵素センサーや酵素電極、医薬品、食品および飲料などである。これらの組成物に適用する酵素は、色素やビオチンまたはアビジンなどの標識化合物による標識、各種化合物による修飾、抗体、抗原とのコンジュゲート化等を受けることもある。
【０００３】
しかし、上記のような酵素や標識抗体を含む組成物の性能を長期に渡って維持するためには、言うまでもなく酵素や標識抗体の活性を安定的に保持する事が重要である。例えば、試薬組成物中の酵素活性が時間経過により低下する時、所望の試薬の有効期間と酵素の活性低下速度に合わせて予め過剰量の酵素を添加する方策があるが、多くの場合このような手段では問題の根本的な解決にはならず、酵素や標識抗体のコストが嵩むことは避けられない。
【０００４】
このため、組成物中に基質や補酵素、塩類、イオン類、糖類、糖アルコール、アミノ酸、脂肪酸エステル、牛血清アルブミンやゼラチン加水分解物等の蛋白質などを共存させることで、安定化を図る種々の方法が試みられてきた（例えば、特許文献１〜５参照）。
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−１４１１６２号公報
【特許文献２】特許第３６８５８１５号公報
【特許文献３】特許第３６９６２６７号公報
【特許文献４】特開２００５−１１４３６８号公報
【特許文献５】特開平１０−２７９５９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記安定化剤として例えば補酵素を用いた場合、概して高価である上、特定の生体分子に対する効果しか期待できないことが考えられる。また高分子或いは塩類、一部のアミノ酸を溶液中で用いた場合は、溶解度の低さや保存中の析出により、十分量添加することができないケースが考えられる。また、特に糖類やアミノ酸を診断薬に添加する場合は、試薬系に共存する若しくは酵素や標識抗体中に混在する夾雑物質と添加剤とが意図しない反応を引き起こす問題を発生させることがある。更に、牛血清アルブミンなどの動物性原料を用いる場合は、着色や牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などに対するリスクにも十分な配慮が必要となる。
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、酵素や標識抗体などの生体分子の効果的な安定化法と、それによって長期間安定性が維持された組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成する為に種々検討した結果、セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくは、その同等物を生体分子と共存させることにより、生体分子を効果的に安定化できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のようなものである。
（１）次の（ａ）および（ｂ）を共存させる、生体分子を安定化する方法：
（ａ）生体分子
（ｂ）セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくは、その同等物。
（２）生体分子が溶液中に存在する（１）記載の生体分子の安定化方法。
（３）生体分子が凍結乾燥物中に存在する（１）記載の生体分子の安定化方法。
（４）セリシンおよび／またはその加水分解物が、繭糸又は生糸から抽出した天然セリシンに由来するものである（１）記載の生体分子の安定化方法。
（５）セリシン同等物が遺伝子工学的手法により得られたものである（１）記載の生体分子の安定化方法。
（６）生体分子が蛋白質である（１）記載の生体分子の安定化方法。
（７）生体分子が酵素である（１）記載の生体分子の安定化方法。
（８）生体分子が標識抗体である（１）記載の生体分子の安定化方法。
（９）次の（ａ）および（ｂ）が共存している、生体分子が安定化した組成物：
（ａ）生体分子
（ｂ）セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくは、その同等物。
（１０）生体分子が溶液中に存在する（９）記載の生体分子の液状安定化組成物。
（１１）生体分子が凍結乾燥物中に存在する（９）記載の生体分子の安定化組成物。
（１２）セリシンおよび／またはその加水分解物が、繭糸又は生糸から抽出した天然セリシンに由来するものである（９）記載の生体分子の安定化組成物。
（１３）セリシン同等物が遺伝子工学的手法により得られたものである（９）記載の生体分子の安定化組成物。
（１４）生体分子が蛋白質である（９）記載の生体分子の安定化組成物。
（１５）生体分子が酵素である（９）記載の生体分子の安定化組成物。
（１６）生体分子が標識抗体である（９）記載の生体分子の安定化組成物。
（１７）セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくは、その同等物を共存させる工程を含む、生体分子の安定化組成物の製造方法。
（１８）セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくは、その同等物を含む、生体分子を安定化するための組成物。
（１９）（９）記載の生体分子の安定化組成物を含む診断用キット。
（２０）（９）記載の生体分子の安定化組成物を含むバイオセンサー。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、セリシンおよび／またはセリシン加水分解物、もしくは、その同等物を用いることにより、生体分子の安定化を液状、乾燥状態の如何に関わらず向上させ、これら生体分子を用いた組成物の有効性を長期間に渡って維持することが可能となる。
本発明の生体分子の安定化方法によれば、酵素や標識抗体の安定性を液状、乾燥状態の如何に関わらず向上させ、これら生体分子を用いた組成物の有効性を長期間に渡って維持することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明において「安定化」とは、生体分子がある物質と共存した状態（ａ）と共存していない状態（ｂ）において、生体分子を一定期間保存した後の該生体分子の保持する残存機能が（ａ）＞（ｂ）となるような状態をいう。
例えば、酵素や標識抗体などの生体物質を含む水溶液の状態で、ある物質を共存させた場合（ａ）と、共存させない場合（ｂ）で、適当な温度で一定時間保存した後の残存活性の比率が、（ａ）＞（ｂ）となる状態をいう。
また、例えば酵素や標識抗体などの生体物質を含む乾燥状態で、ある物質を共存させた
場合（ａ）と、共存させない場合（ｂ）で、適当な温度で一定時間保存した後の残存活性の比率が、（ａ）＞（ｂ）となる状態をいう。
例えば、安定化の評価は、ある物質を共存させた場合（ａ）と、共存させない場合（ｂ）についてそれぞれ残存機能の低下を経時的に測定し、半減期を比較することによって行うことができる。
「適当な温度で一定期間保存」の条件は、状態（ａ）と状態（ｂ）で残存活性に差があらわれる条件であれば特に限定されないが、好ましくは、診断薬試薬中などでの長期保存安定性を念頭に置いた加速（苛酷）試験の条件が選択される。具体的には、「４０℃で７日間保存」、または、「５２℃で１時間保存」などが挙げられる。時間が許せば、生体分子を含有する診断薬などが実際に長期保存される温度として汎用される２℃〜１０℃の冷蔵条件下で６ヶ月以上の保存を選択してもよい。
【００１２】
本発明の一実施態様としては、５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、酵素を２５℃で２ヶ月保存した後の残存活性率を、セリシンを添加することによって、セリシンを含まない状態に比べて向上させる方法である。
本発明の別の実施態様としては、１ｇ／Ｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む５０ｍＭ
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、酵素を４０℃で１４日間保存した後の残存活性率を、セリシンを添加することによって、セリシンを含まない状態に比べて向上させる方法である。
本発明の更に別の実施態様としては、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で、酵素を５２℃で１時間保存した後の残存活性率を、セリシンを添加することによって、セリシンを含まない状態に比べて向上させる方法である。
本発明の更に別の実施態様としては、１ｇ／Ｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中で、酵素を９℃で２４時間保存した後の残存活性率を、セリシンを添加することによって、セリシンを含まない状態に比べて向上させる方法である。
本発明の更に別の実施形態としては、１ｇ／Ｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、酵素を２５℃で１４日間保存した後の残存活性率を、セリシンを添加することによって、セリシンを含まない状態に比べて向上させる方法である。
本発明の更に別の実施形態としては、１ｇ／Ｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で、酵素を２５℃で１４日間保存した後の残存活性率を、セリシンを添加することによって、セリシンを含まない状態に比べて向上させる方法である。
本発明の更に別の実施態様としては、０．５ｇ／Ｌ アジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、酵素を２５℃で１４日間保存した後の残存活性率を、セリシンを添加することによって、セリシンを含まない状態に比べて向上させる方法である。
本発明の更に別の実施態様としては、酵素を凍結乾燥粉末の状態で３７℃で１４日間保存した後の残存活性率を、セリシンを添加することによって、セリシンを含まない状態に比べて向上させる方法である。
本発明の更に別の実施態様としては、２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、標識抗体を４℃で３日間保存させた後の残存活性率を、セリシンを添加することによって、セリシンを含まない状態に比べて向上させる方法である。
本発明の更に別の実施態様としては、１ｍＭ 塩化マグネシウム、０．１ｍＭ 塩化亜鉛、１ｇ／Ｌ アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中で、標識抗体を４℃で３日間保存させた後の残存活性率を、セリシンを添加することによって、セリシンを含まない状態に比べて向上させる方法である。
上記実施態様において、セリシンに替えてセリシン加水分解物またはセリシン同等物を用いても良い。
【００１３】
ここでセリシンとは、繭糸または生糸に存在する非結晶性の天然蛋白質であり、本明細書においては特に、繭糸または生糸から非加水分解物の状態で抽出されたものをいうものとする。
一般的に、セリシンの遺伝子は２．６ｋｂｐ〜１０．６ｋｂｐの大きさで複数種確認されており、それらは例えば、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５７ １５１９２−１５１９９（１９８２）に記載されている。本発明に用いるセリシンは、このような配列を有する遺伝子から、産生される蛋白質であり、例えば、その全長配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列から実質的になるものである。典型的には、このアミノ酸配列は、配列番号１に示される３８個のアミノ酸配列からなる本質的領域と、それ以外の非本質的領域とからなり、前記本質的領域を反復配列として含んでなるものである。例えば配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるセリシンでは、前記本質的領域が１２回反復して存在している。
本明細書において、セリシンが「配列番号２に示されるアミノ酸配列から実質的になる」とは、セリシンが生体分子を安定化する作用を有する限りにおいて、そのアミノ酸配列（配列番号２）の１もしくは複数個、好ましくは１〜２０００個、より好ましくは１〜５００個、さらに好ましくは１〜３００個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたものであってもよいことを意味する。この場合、アミノ酸残基の欠失、置換、挿入もしくは付加は、本質的領域以外の領域になされていることが好ましい。本質的領域になされる場合においては、保存的置換であることが好ましく、セリシンが生体分子を安定化する作用を有する限りにおいて、そのアミノ酸配列の１もしくは複数個、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜２０個が保存的に置換されていてもよい。保存的置換とは、蛋白質の活性が実質的に改変されないように、１もしくは複数個のアミノ酸残基が、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換されることをいう。例えば、ある疎水性残基が別の疎水性残基によって置換される場合、ある極性残基が同じ電荷を有する別の極性残基によって置換される場合、ある芳香族アミノ酸が別の芳香族アミノ酸によって置換される場合などが挙げられる。このような機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。
本発明においては、非加水分解物としてのセリシンに替えて、あるいは、非加水分解物としてのセリシンと併用して、そのものが生体分子を安定化する作用を有する限り、セリシン加水分解物を用いることができる。
前記セリシンおよびセリシン加水分解物は、ＷＯ２００２／０８６１３３号公報に開示される公知の方法に従い、繭糸または生糸から抽出して得ることができる。具体的には、非加水分解物としてのセリシンは、例えば以下のようにして、純度９０％以上の高精製度蛋白質の状態で得ることができる。
まず繭糸または生糸を、水、好ましくは８０〜１００℃程度の熱水内で処理することにより、繭糸または生糸に含まれるセリシンを、該水中に溶出させ、セリシン水溶液を得る。さらに、得られたセリシン水溶液について、例えば次の（１）〜（３）のいずれかの方法を適用することにより、分離精製処理を行って、目的とするセリシンを回収することができる。
（１）前記セリシン水溶液のｐＨを、有機酸もしくは無機酸によってｐＨ３〜５に調整した後、そこに有機凝集剤または無機凝集剤を添加してセリシンを析出させ、これをさらに濾過後、乾燥させて固体セリシンを得ることができる。
（２）前記セリシン水溶液と、メタノール、エタノールまたはジオキサンなどの水溶性溶媒と混合し、これによりセリシンを析出させた後、濾別乾燥して固体セリシンを得ることができる。
（３）特開平４−２０２４３５号公報に記載のように、前記セリシン水溶液を限外濾過膜または逆浸透膜に付し、所定の濾過処理を行った後、乾燥させてセリシン粉体を得ることができる。
また、セリシン加水分解物は、例えば以下のようにして、純度９０％以上の高精製度蛋白質の状態で得ることができる。
まず繭糸または生糸を、水、好ましくは８０〜１００℃程度の熱水内で処理することにより、繭糸または生糸に含まれるセリシンを、該水中に溶出させ、セリシン水溶液を得る。このとき、電気分解した水や、酸、アルカリまたは酵素を併用して、セリシンを部分加水分解させる。そして得られたセリシン加水分解物水溶液について、例えば上記の（１）〜（３）のいずれかの方法を適用することにより、分離精製処理を行って、目的とするセリシン加水分解物を回収することができる。
かくして得られるセリシンおよびセリシン加水分解物の分子量は通常、５００〜５００，０００の範囲内にあり、生体分子を安定化する作用を有する限りそのいずれも使用可能であるが、取扱い性の点から、重量平均分子量が５，０００〜１００，０００、特に１０，０００〜５０，０００であるセリシン加水分解物が好ましい。
【００１４】
本発明の安定化方法に用いる、「セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくは、その同等物」における「その同等物」（以下「セリシン同等物」ともいう）とは、天然セリシンに含まれる前記本質的領域、すなわち、配列番号１に示される３８個のアミノ酸配列を少なくとも含んでなるポリペプチドであって、人工的に得られたもの、すなわち、化学合成により得られたものや遺伝子工学的手法により得られたものをいうものとする。したがって、人工的に得られたものであれば、天然物由来のセリシンまたはセリシン加水分解物と同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることができる。さらに、セリシン同等物には、天然物由来のセリシンまたはセリシン加水分解物の一部を利用してそれを基にさらに合成を行って得られたものも包含される。
本発明においては、前記天然物由来の「セリシンおよび／またはその加水分解物」に替えて、そのものが生体分子を安定化する作用を有する限り、これらの「その同等物」を用いることができる。
セリシン同等物は、前記した配列番号１に示される３８個のアミノ酸配列からなる本質的領域を、複数回反復した配列として含んでなることが好ましい。反復配列を有するポリペプチドを使用することにより、生体分子を安定化する作用をより向上させることができる。セリシン同等物は、そのアミノ酸配列におけるアミノ酸残基数１００個あたりに、前記本質的領域を少なくとも１個、さらには少なくとも２個有することが好ましい。セリシン同等物において本質的領域の含まれる割合は、多い方が好ましい。このような割合で反復配列を有することにより、セリシン同等物の全長のアミノ酸残基数が増加しても、安定して生体分子を安定化する作用を示すことができる。その作用は、典型的には、天然物由来のセリシンまたはセリシン加水分解物と比較して、同等であるかまたはそれより優れた性能を有している。
セリシン同等物の全長は、生体分子を安定化する作用を有する限り特に限定されないが、製造上の点では、前記本質的領域を２〜８回反復したものであることが好ましく、より好ましくは２〜６回、さらに好ましくは２〜４回反復したものである。
セリシン同等物の本質的領域は、そのアミノ酸配列の例えば１もしくは複数個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個が保存的に置換されていてもよい。
セリシン同等物は、ＷＯ２００２／０８６１３３号公報に開示される公知の方法に従って得ることができる。例えば、化学合成する際には、ｔ−Ｂｏｃ法、Ｆｍｏｃ法による固相、液相合成法等、慣用のポリペプチドの合成手段を適宜採用することができる。また、遺伝子工学的手法により製造する際には、それをコードするＤＮＡを入手、もしくは製造することができる場合、そのＤＮＡによって宿主細胞を形質転換させた形質転換細胞において、製造することができる。
セリシン同等物は、融合タンパク質であることができる。このような融合タンパク質は、前記「セリシン」や「セリシン加水分解物」をコードするＤＮＡと異種ポリペプチドをコードするＤＮＡとを融合させて融合タンパク質をコードするＤＮＡを作成し、これを発現させて製造することができる。
【００１５】
セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくは、その同等物は、例えば０．１〜２００ｇ／Ｌ、好ましくは０．１〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．２〜２０ｇ／Ｌの濃度で添加することができる。
【００１６】
本発明の安定化方法の対象となる生体分子は特に限定されるものではないが、例えば臨床診断に用いられる酵素、標識抗体などの蛋白質、核酸など、またはそれらを含有する組成物などが挙げられる。
酵素の種類は、特に限定されるものではないが、一部例を挙げると、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、β−グルグルコシダーゼ、ウリカーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールキナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。
【００１７】
酵素は、天然に存在する各種微生物、動植物などの給源から調製されたもの、遺伝子工学的手法により製造されたもの、あるいは化学的に合成されたものを用いることができる。更に蛋白質工学などの手法により野生型から改変されたものであっても良い。
また、本発明の酵素は、色素やビオチンまたはアビジンなどの標識化合物による標識、各種化合物による修飾、抗体、抗原とのコンジュゲート化等を受けてもよい。
標識抗体、標識抗原としては、特に限定されるものではないが、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなどで標識した、マウスＩｇＧ、β２ミクログロブリン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）、α１−アンチトリプシン、α１−マイクログロブリン、ハプトグロブリン、トランスフェリン、セルロプラスミン、フェリチン、アルブミン、ヘモグロビンＡ１、ヘモグロビンＡ１Ｃ、ミオグロビン、ミオシン、デュパン−２、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、組織ポリペプチド抗原（ＴＰＡ）、アポリポ蛋白Ａ１、アポリポ蛋白Ｅ、リウマチ因子、抗ストレプトリジンＯ（ＡＳＯ）、フィブリン分解産物（ＦＤＰ）、フィブリン分解産物Ｄ分画（ＦＤＰ−Ｄ）、フィブリン分解産物Ｄ−Ｄ分画（ＦＤＰ−ＤＤｉｍｅｒ）、フィブリン分解産物Ｅ分画（ＦＤＰ−Ｅ）、アンチトロンビン−ＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）等の蛋白質、アミラーゼ、前立腺由来酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、フィブリノーゲン、エラスターゼ、プラスミノーゲン、クレアチンキナーゼ心筋型（ＣＫ−ＭＢ）等の酵素、インシュリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、３，５，３'−トリヨードサイロニン（Ｔ３）、サイロキシン（Ｔ４）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、生長ホルモン（ＧＨ）、黄体化ホルモン（ＬＨ）等のホルモン、Ｂ型肝炎ウイルス関連抗体、Ｂ型肝炎ウイルス関連抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗体、ＨＴＬＶ（成人Ｔ細胞白血病ウイルス）抗体、ＨＩＶ（エイズウイルス）抗体、クラミジア抗体、梅毒の抗体、トキソプラズマ抗体等各種感染症の原因ウイルスに対する抗体、抗原などが挙げられ、また抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体の混合物、またあるいは酵素処理や遺伝子工学的に断片化されたＦ（ａｂ‘）２，Ｆａｂ’、Ｆａｂなどの抗体フラグメントなども挙げられる。
このような複合体も本発明でいう生体分子に含まれる。
【００１８】
それらの存在状態は、液状、凍結乾燥状、顆粒状、担体への固定化やチップ等にコーティングされた状態など特に限定されない。
さらに、他の物質と混合された液状組成物、凍結乾燥状組成物などであってもよい。
このような組成物は、適当な容器に入れられたり、適当なデバイスに搭載されて、例えば、分子生物学用途の分析試薬、生化学用途の分析試薬、体外診断薬、液状体外診断薬、チップ状またはスリット状に加工したドライ系の体外診断薬、酵素センサーや酵素電極、医薬品、食品および飲料など、種々の形態をとることができる。
【００１９】
本発明においては、安定化、形状改善などの目的で、さらに他の物質を混合しても良い。
粉末の場合、一般的な安定化剤や形状改善剤として、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、キシロース、ラクトース、シュークロース、ラフィノース、トレハロース、シクロデキストリン、プルラン、イヌリン、可溶性デンプンなどの糖類およびグルシトール、マンニトール、イノシトール、キシリトールなどの糖アルコール類、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リジン、ヒスチジン等のアミノ酸およびアミノ酸塩、グリシルグリシン、グリシルグリシルグリシンなどのペプチド類、リン酸塩、ホウ酸塩、硫酸塩、トリス塩などの無機塩類、フラビン類、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、グルコン酸などの有機酸及び有機酸の塩、ゼラチン、カゼイン、アルブミンなどのタンパク質、更にコール酸類、脂肪酸の糖エステル類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコールアルキルエーテルなどの界面活性剤を含むことが可能である。
【００２０】
液状である場合、酵素タンパクなどの生体分子が完全に溶解している状態だけでなく、懸濁液のように液体の中に分散している場合も含む。液状酵素は水ではなく、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＰＩＰＥＳ，ＭＥＳ，ＴＥＳ，ＭＯＰＳ，ＨＥＰＥＳなどのＧｏｏｄ緩衝液に溶解又は懸濁されていても良く、この様な液状酵素中に硫安、燐安、食塩、塩化カリウムなどの塩類を含んでいても良い。また、エタノールやメタノール、プロパノールなどのアルコール類、グリセロールやエチレングリコールなどのポリオール類、アルキルグルコシド、ポリエチレングリコールアルキルエーテル、脂肪酸アルコールエステルなどの界面活性剤を添加しても良い。必要に応じて、ペニシリン系、セフェム系、アミノ配糖体系、マイクロライド系、テトラサイクリン系、ニュー・キノロン系等の抗生物質、アジ化物、１，１‘−Ｍｅｔｈｙｌｅｎ−ｂｉｓ［３−（１−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−２，４−ｄｉｏｘｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎ−５−ｙｌ）−ｕｒｅａ］，２−Ｍｅｔｈｙｌ−３（２Ｈ）−ｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｏｎｅ−ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，５−Ｂｒｏｍｏ−５−ｎｉｔｒｏ−１，３−ｄｉｏｘａｎｅ，２−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｙｒｉｄｉｎｅ−Ｎ−ｏｘｉｄｅ，２−Ｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｅなどの防腐剤を添加しても良い。
【００２１】
酵素、標識抗体を構成成分とする組成物は、その組成物の使用目的に応じてＮＡＤ＋やＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ＋，ＮＡＤＰＨ，ＡＴＰ，ＡＤＰ，ＡＭＰ，ＧＴＰ，ＧＭＰ，ＦＡＤやＦＭＮ、ビオチン、ナイアシン、コバラミン、ＰＱＱなどの補酵素類、ナトリウム、カリウム、亜鉛、マグネシウム、カルシウム、リチウム、銅、鉄、マンガン等の金属塩、チオール化合物、セレン化合物、硝酸塩、リン酸塩、硫酸塩、ホウ酸塩、トリス塩等の塩類、アミノ酸及びアミノ酸塩、糖および配糖体、また必要により、フェノール系およびアニリン系の各種トリンダー試薬とカプラーである４−アミノアンチピリン，テトラゾリウム塩類とフエナジンメトサルフェートなどの電子キャリヤー、ロイコ系試薬などの色素類，および基質類を添加することが可能である。
【００２２】
標識抗体を構成成分とする組成物は、その組成物の使用目的に応じて、非特異反応防止剤を添加してもよい。非特異反応防止剤としては、特に限定されるものではないが、標識抗体と同種の抗体、標識抗体と同種の酵素を添加することができる。同種の抗体として、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、高分子量化されたマウスＩｇＧ重合体、ヤギＩｇＧ，羊ＩｇＧ、馬ＩｇＧ、ラットＩｇＧ、ウサギＩｇＧが挙げられる。またこれら抗体を含む動物血清、腹水などの体液のまま添加することもできるが、ウイルス不活化処理、補体非働化処理、脱脂処理などを行って添加することが望ましい。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
【００２４】
以下の実施例１−２１において、セリシン加水分解物はＷＯ２００２／０８６１３３号公報の製造例１に開示される方法に従って製造した。
詳細は以下の通りである。
（製造例１）
繭（家蚕（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）が作ったもの）１ｋｇを、０．２％炭酸ナトリウム水溶液（ｐＨ１１〜１２）５０Ｌ中において９５℃の条件下において２時間熱水処理を施し、セリシン加水分解物を抽出した。得られたセリシン加水分解物抽出液を平均孔径０．２μｍのフィルターを用いて濾過し、凝集物を除去した後、濾液を逆浸透膜により脱塩し、濃度０．２％の無色透明のセリシン加水分解物水溶液を得た。
次いで、この水溶液をエバポレーターを用いて濃度が約２％になるまで濃縮させた後、凍結乾燥処理を行って、純度９０％以上で、平均分子量２０，０００であるセリシン加水分解物の粉体１００ｇを得た。
【００２５】
（実施例１）
ペルオキシダーゼ（東洋紡績社ＰＥＯ−３０２）、セリシン加水分解物を含有する下記試薬溶液を２５℃、２ヶ月間または５０℃で７日間保存し、残存活性率（調製直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を測定した。
（試薬の調製）
下記組成からなる試薬をそれぞれ調製した。
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．０
ペルオキシダーゼ（東洋紡績社ＰＥＯ−３０２） ５，０００Ｕ／Ｌ
セリシン加水分解物 ０．２〜２ｇ／Ｌ
【００２６】
（比較例１）
実施例１においてセリシン加水分解物を添加しない、又はセリシン加水分解物の替わりに牛血清アルブミン（シグマ社ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）０．２〜２ｇ／Ｌを含有する試薬溶液を調製し、実施例１と同様の条件で保存し、残存活性率を測定した。
表１に示す通り、ペルオキシダーゼがセリシン加水分解物による安定化されることが示された。
【００２７】
【表１】
【００２８】
（実施例２）
実施例１のペルオキシダーゼに、セリシン加水分解物２ｇ／Ｌを含有する試薬溶液に、更に防腐剤の１種であるアジ化ナトリウム０．５ｇ／Ｌを含有する試薬溶液を調製した後、２５℃で１４日間保存し、残存活性率（調製直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を測定した。
【００２９】
（比較例２）
実施例２においてセリシン加水分解物を添加しない、又はセリシン加水分解物の替わりに牛血清アルブミン（シグマ社ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）２ｇ／Ｌを含有する試薬溶液を調製し、実施例２と同様の条件で保存し、残存活性率を測定した。
表２に示す通り、防腐剤共存下のペルオキシダーゼがセリシン加水分解物による安定化されることが示された。
【００３０】
【表２】
【００３１】
（実施例３）
リポプロテインリパーゼ（東洋紡績社ＬＰＬ−３１１）、セリシン加水分解物を含有する下記試薬溶液を２５℃または４０℃で１４日間保存し、残存活性率（調製直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を測定した。
（試薬の調製）
下記組成からなる試薬をそれぞれ調製した。
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．０
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １ｇ／Ｌ
リポプロテインリパーゼ（東洋紡績社ＬＰＬ−３１１） ５，０００Ｕ／Ｌ
セリシン加水分解物 ０．２〜２ｇ／Ｌ
【００３２】
（比較例３）
実施例３においてセリシン加水分解物を添加しない、又はセリシン加水分解物の替わりに牛血清アルブミン（シグマ社ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）０．２〜２ｇ／Ｌを含有する試薬溶液を調製し、実施例３と同様の条件で保存し、残存活性率を測定した。
表３に示す通り、リポプロテインリパーゼがセリシン加水分解物により安定化されることが示された。
【００３３】
【表３】
【００３４】
（実施例４）
グリセロールキナーゼ（東洋紡績社ＧＹＫ−３０１）、セリシン加水分解物を含有する下記試薬溶液を２５℃で１４日間保存し、残存活性率（調製直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を測定した。
（試薬の調製）
下記組成からなる試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．０
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １ｇ／Ｌ
グリセロールキナーゼ（東洋紡績社ＧＹＫ−３０１） ２，０００Ｕ／Ｌ
セリシン加水分解物 ２ｇ／Ｌ
【００３５】
（比較例４）
実施例４においてセリシン加水分解物を添加しない、又はセリシン加水分解物の替わりに牛血清アルブミン（シグマ社ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）２ｇ／Ｌを含有する試薬溶液を調製し、実施例４と同様の条件で保存し、残存活性率を測定した。
表４に示す通り、グリセロールキナーゼがセリシン加水分解物により安定化されることが示された。
【００３６】
【表４】
【００３７】
（実施例５）
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡績社ＣＯＯ−３２１）、セリシン加水分解物を含有する下記試薬溶液を５２℃で１時間処理または４０℃で７日間保存し、残存活性率（調製直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を測定した。
（試薬の調製）
下記組成からなる試薬を調製した。
リン酸カリウム緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ７．０
コレステロ−ルオキシダーゼ（東洋紡績社ＣＯＯ−３２１） ２，０００Ｕ／Ｌ
セリシン加水分解物 ４ｇ／Ｌ
【００３８】
（比較例５）
実施例５においてセリシン加水分解物を添加しない、又はセリシン加水分解物の替わりに牛血清アルブミン（シグマ社ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）４ｇ／Ｌを含有する試薬溶液を調製し、実施例５と同様の条件で保存し、残存活性率を測定した。
表５に示す通り、コレステロールオキシダーゼがセリシン加水分解物により安定化されることが示された。
【００３９】
【表５】
【００４０】
（実施例６）
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（東洋紡績社Ｇ６Ｄ−３２１）、セリシン加水分解物を含有する下記試薬溶液を２５℃で１４日間保存し、残存活性率（調製直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を測定した。
（試薬の調製）
下記組成からなる試薬を調製した。
リン酸カリウム緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ７．０
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １ｇ／Ｌ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（東洋紡績社Ｇ６Ｄ−３２１） ３，０００Ｕ／Ｌ
セリシン加水分解物 １ｇ／Ｌ
【００４１】
（比較例６）
実施例６においてセリシン加水分解物を添加しない、又はセリシン加水分解物の替わりに牛血清アルブミン（シグマ社ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）１ｇ／Ｌを含有する試薬溶液を調製し、実施例６と同様の条件で保存し、残存活性率を測定した。
表６に示す通り、グルコース−６−リン酸脱水素酵素がセリシン加水分解物により安定化されることが示された。
【００４２】
【表６】
【００４３】
（実施例７）
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（東洋紡績社ＰＰＣ−３０１）、セリシン加水分解物を含有する下記試薬溶液を９℃または２５℃で２４時間保存し、残存活性率（調製直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を測定した。
（試薬の調製）
下記組成からなる試薬をそれぞれ調製した。
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ５０ｍＭ ｐＨ８．０
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １ｇ／Ｌ
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（東洋紡績社ＰＰＣ−３０１）
５，０００Ｕ／Ｌ
セリシン加水分解物 ０．２〜２０ｇ／Ｌ
【００４４】
（比較例７）
実施例７においてセリシン加水分解物を添加しない試薬溶液を調製し、実施例７と同様の条件で保存し、残存活性率を測定した。
表７に示す通り、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼがセリシン加水分解物により安定化されることが示された。
【００４５】
【表７】
【００４６】
（実施例８）
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡績社ＣＯＯ−３２１）粉末１ｇを蒸留水１０ｍｌで溶解させた後、これにセリシン加水分解物０．５ｇを加えて溶解させたコレステロールオキシダーゼ溶液を凍結乾燥することにより、セリシン加水分解物を含有するコレステロールオキシダーゼ粉末を調製した。この凍結乾燥粉末を５０℃で１４日間保存し、残存活性率（５０℃保存前の活性値に対する保存後の活性値の割合）を測定した。
【００４７】
（比較例８）
実施例８においてセリシン加水分解物を添加しない、又はセリシン加水分解物の替わりに牛血清アルブミン（シグマ社ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）０．５ｇ加えて調製したコレステロールオキシダーゼ粉末を実施例８と同様の条件で保存し、残存活性率を測定した。
表８に示す通り、コレステロールオキシダーゼがセリシン加水分解物により安定化されることが示された。
【００４８】
【表８】
【００４９】
（実施例９）
ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（東洋紡績社ＧＬＤ−３２１）粉末１ｇを蒸留水１０ｍｌで溶解させた後、これにセリシン加水分解物０．５ｇを加えて溶解させたＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ溶液を凍結乾燥することにより、セリシン加水分解物を含有するＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ粉末を調製した。この凍結乾燥粉末を３７℃で２１日間保存し、残存活性率（３７℃保存前の活性値に対する保存後の活性値の割合）を測定した。
【００５０】
（比較例９）
実施例９においてセリシン加水分解物を添加しない、又はセリシン加水分解物の替わりに牛血清アルブミン（シグマ社ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）０．５ｇ加えて調製したＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ粉末を実施例９と同様の条件で保存し、残存活性率を測定した。
表９に示す通り、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼがセリシン加水分解物により安定化されることが示された。
【００５１】
【表９】
【００５２】
（実施例１０）
クレアチニンアミドヒドロラーゼ（東洋紡績社ＣＮＨ−２１１）粉末１ｇを蒸留水１０ｍｌで溶解させた後、これにセリシン加水分解物０．５ｇを加えて溶解させたクレアチニンアミドヒドロラーゼ溶液を凍結乾燥することにより、セリシン加水分解物を含有するクレアチニンアミドヒドロラーゼ粉末を調製した。この凍結乾燥粉末を３７℃で１４日間保存し、残存活性率（３７℃保存前の活性値に対する保存後の活性値の割合）を測定した。
【００５３】
（比較例１０）
実施例１０においてセリシン加水分解物を含有しないクレアチニンアミドヒドロラーゼ粉末を実施例１０と同様の条件で保存し、残存活性率を測定した。
表１０に示す通り、クレアチニンアミドヒドロラーゼがセリシン加水分解物により安定化されることが示された。
【００５４】
【表１０】
【００５５】
（実施例１１−１６、比較例１１）
西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体の安定化
比較例１１ ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG（アマシャムバイオサイエンス社）を
５ｇ／Ｌ牛血清アルブミン（ナカライテスク社）を含む２０ｍM MOPS緩衝液ｐH７．０にて８０００倍希釈、ガンマ線滅菌済み０．２２μｍフィルターろ過し、ガンマ線滅菌済みポリプロピレン製容器中にて４℃または２５℃で３日間保存した。
実施例１１ ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG（アマシャムバイオサイエンス社）を
５ｇ／Ｌセリシン加水分解物を含む２０ｍM MOPS緩衝液ｐH７．０にて８０００倍希釈、ガンマ線滅菌済み０．２２μｍフィルターろ過し、ガンマ線滅菌済みポリプロピレン製容器中にて４℃または２５℃で３日間保存した。
実施例１２ セリシン加水分解物は予め蒸留水に１００ｇ／Ｌになるよう溶解し、１２１℃２０分間オートクレーブ処理を行った。ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG（アマシャムバイオサイエンス社）を５ｇ／Ｌオートクレーブ処理済みセリシン加水分解物を含む２０ｍM MOPS緩衝液ｐH７．０にて８０００倍希釈、ガンマ線滅菌済み０．２２μｍフィルターろ過し、ガンマ線滅菌済みポリプロピレン製容器中にて４℃または２５℃で３日間保存した。
実施例１３ ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG（アマシャムバイオサイエンス社）を
５ｇ／Ｌ セリシン加水分解物、０．２ｇ／Ｌ４−アミノアンチピリン（ナカライテスク社）を含む２０ｍM MOPS緩衝液ｐH７．０にて８０００倍希釈、ガンマ線滅菌済み０．２２μｍフィルターろ過し、ガンマ線滅菌済みポリプロピレン製容器中にて４℃または２５℃で３日間保管した。
実施例１４ ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG（アマシャムバイオサイエンス社）を
５ｇ／Ｌ セリシン加水分解物、０．２ｇ／Ｌ ４−アミノアンチピリン（ナカライテスク）を含む２０ｍM MOPS緩衝液ｐH６．５にて８０００倍希釈、ガンマ線滅菌済み０．２２μｍフィルターろ過し、ガンマ線滅菌済みポリプロピレン製容器中にて４℃または２５℃で３日間保存した。
実施例１５ 抗体固相プレート試薬の調製 ヤギ抗マウスＦｃ抗体（シグマ社）を１０μｇ／ｍｌとなるよう５０ｍＭ 炭酸緩衝液ｐＨ９．６で希釈し、１ウェルに５０μＬずつＥＬＩＳＡプレート（住友ベークライト社）に分注した。室温１時間放置して抗体をプレートに結合させた後、分注液を廃棄・十分液切りを行い、次いで蒸留水にて４倍希釈したブロックエース（大日本製薬社）を１ウェルに３００μLずつ分注し室温１時間放置しブロッキングを行った。使用前に分注液を廃棄・十分液切りを行った後０．５ｇ／Ｌ ツイーン20を含む１０ｍMリン酸生理緩衝液ｐＨ７．２ ３００μL分注廃棄を３回繰り返しプレート洗浄し（以下、PBS−T洗浄と略記）、測定に使用した。
実施例１６ マウスIgGの測定 ０．１％ＢＳＡを含むリン酸生理緩衝液にてマウスIgG（ケミコン社）を希釈し、マウスＩｇＧ ６４、１２８、２５６ｎｇ／ｍｌ濃度の試料を調製した。希釈に使用した緩衝液を０ｎｇ／ｍｌ試料とした。次いでＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ試料を５０μＬずつＮ＝２で分注し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔ洗浄後、各比較例・実施例の標識抗体液５０μＬずつ分注し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔ洗浄後、酵素反応液としてＴＭＢ＋（ダコ社）を５０μＬずつ分注し、室温遮光して１０分反応させた。１Ｎ 硫酸 ５０μＬ分注、攪拌により酵素反応を停止させた後、Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ−６５０ｎｍをマイクロプレートリーダーにて測定した。マウスＩｇＧ濃度ドーズ依存的に吸光度は上昇した。
ELISAにより得られた結果を用い、それぞれ２５６ｎｇ／ｍｌ試料と０ｎｇ／ｍｌ試料
の吸光度差を求め、対応する４℃保存条件との比の３乗根を取り、１日あたりの残存活性率を求めた結果を表１１に示す。牛血清アルブミンを用いた比較例に比べ、セリシン加水分解物を含む実施例において残存活性率は高く、安定化効果が認められた。セリシン加水分解物自体オートクレーブ処理を行っても安定化効果は失われない。セリシン加水分解物とペルオキシダーゼの基質として作用しうる物質と共存させることによりさらに残存活性率向上が可能であることもわかった。
【００５６】
【表１１】
【００５７】
（実施例１７−２１、比較例１２、１３）
アルカリフォスファターゼ標識抗体の安定化
（１）実施例１７ アルカリフォスファターゼ標識抗体の作製 マウス抗ＣＥＡ モノクローナル抗体 クローン５９０５（メディックスバイオケミカ社）200μｇと、抗体の
アミノ基で結合させる標識化キット（同仁化学社 ＬＫ１２）を用いて、標識キット取扱説明書に従い操作し、アルカリフォスファターゼ標識抗体を作製した。すなわち、キット添付のウォッシングバッファー１００μＬを同フィルトレーションチューブに入れ、ピペ
ットにより軽く混合した後、ｘ８０００ｇ１０分間遠心し、さらにウォッシングバッファー１００μＬを加えてもう一度同条件にて遠心した。キット添付のリアクションバッファー１０μＬを同ＮＨ２−ＲｅａｃｔｉｖｅＡＬＰに加えピペッティングにより溶解し、全量を抗体が濃縮されているフィルトレーションチューブのメンブレン上に加え、ピペッティングによりメンブレン上の抗体と混合し、３７℃２時間放置した。その後、キット添付のストレイジバッファー１９０μＬを加え、ピペッティングにより標識抗体２００μＬを回収し、アルカリフォスファターゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体とした。
（２）比較例１２ アルカリフォスファターゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体を１ｍＭ 塩化マグネシウム、０．１ｍＭ 塩化亜鉛、１ｇ／Ｌ アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）にて８０００倍希釈、ガンマ線滅菌済み０．２２μｍフィルターろ過し、ガンマ線滅菌済みポリプロピレン製容器中にて４℃または２５℃で３日間保存した。
（３）比較例１３ アルカリフォスファターゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体を２０ｇ／Ｌ 牛血清アルブミン（ナカライテスク社）、１ｍＭ 塩化マグネシウム、０．１ｍＭ 塩化亜鉛、１ｇ／Ｌ アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）にて８０００倍希釈、ガンマ線滅菌済み０．２２μｍフィルターろ過し、ガンマ線滅菌済みポリプロピレン製容器中にて４℃または２５℃で３日間保存した。
（４）実施例１８ アルカリフォスファターゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体を２０ｇ／Ｌ セリシン加水分解物、１ｍＭ 塩化マグネシウム、０．１ｍＭ 塩化亜鉛、１ｇ／Ｌ アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）にて８０００倍希釈、ガンマ線滅菌済み０．２２μｍフィルターろ過し、ガンマ線滅菌済みポリプロピレン製容器中にて４℃または２５℃で３日間保存した。
（５）実施例１９ セリシン加水分解物は予め蒸留水に１００ｇ／Ｌになるよう溶解し、１２１℃２０分間オートクレーブ処理を行った。アルカリフォスファターゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体を２０ｇ／Ｌ オートクレーブ済みセリシン加水分解物、１ｍＭ 塩化マグネシウム、０．１ｍＭ 塩化亜鉛、１ｇ／Ｌ アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）にて８０００倍希釈、ガンマ線滅菌済み０．２２μｍフィルターろ過し、ガンマ線滅菌済みポリプロピレン製容器中にて４℃または２５℃で３日間保存した。
（６）実施例２０ 抗ＣＥＡ抗体固相プレート試薬の調製 マウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体クローン５９０９（メディックスバイオケミカ社）を１０μｇ／ｍｌとなるよう５０ｍＭ 炭酸緩衝液ｐＨ９．６で希釈し、１ウェルに５０μＬずつ黒色ポリスチレン製アッセイプレート（コーニング社）に分注した。室温１時間放置して抗体をプレートに結合させた後、分注液を廃棄・十分液切りを行い、次いで蒸留水にて４倍希釈したブロックエース（大日本製薬社）を１ウェルに３００μLずつ分注し室温１時間放置しブロッキングを行った。使用前に分注液を廃棄・十分液切りを行った後０．５ｇ／Ｌツイーン20を含む１０ｍMトリス生理緩衝液ｐＨ７．５ にて３００μL分注・廃棄を３回繰り返し
プレート洗浄し（以下、ＴＢＳ−Ｔ洗浄と略記）、測定に使用した。
（７）実施例２１ ＣＥＡの測定 ０．１％ＢＳＡを含むリン酸生理緩衝液にてＣＥＡ抗原を希釈し、ＣＥＡ ５，２０、８０ｎｇ／ｍｌ濃度の試料を調製した。希釈に使用した緩衝液を０ｎｇ／ｍｌ試料とした。次いでＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ試料を５０μＬずつＮ＝２で分注し、３７℃で１時間反応させた。ＴＢＳ−Ｔ洗浄後、比較例３と実施例８の標識抗体液５０μＬずつ分注し、３７℃で１時間反応させた。ＴＢＳ−Ｔ洗浄後、酵素反応液としてＡＰＳ−５（ルミジェン社）を５０μＬずつ分注し、３７℃２０分反応後の発光シグナルをルミノスキャン（ラブシステムズ社）にて測定した。ＣＥＡ濃度ドーズ依存的に発光強度は上昇した。
得られた結果でそれぞれ８０ｎｇ／ｍｌ試料と０ｎｇ／ｍｌ試料の発光強度差を求め、次いで対応する４℃保存条件との比の３乗根を計算し、１日あたりの残存活性率を求めた。結果を表１２に示す。比較例で示した通り、従来技術である牛血清アルブミン添加でアルカリフォスファターゼ標識抗体安定性は向上するが、驚くべきことにセリシン加水分解物添加実施例でさらに残存活性率は高く、アルカリフォスファターゼ標識抗体安定化効果が高いことが判った。本効果はオートクレーブ処理においても失われないことも判った。
【００５８】
【表１２】
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明によれば、酵素や標識抗体などの生体分子の安定性を向上させ、これら生体分子を用いた組成物の有効性を長期間に渡って維持することが可能となる。特に臨床検査分野で用いられる診断薬用途として優れており、産業界に寄与することが大である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（ａ）および（ｂ）を共存させる、生体分子を安定化する方法：
（ａ）生体分子
（ｂ）セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくは、その同等物。
【請求項２】
生体分子が溶液中に存在する請求項１記載の生体分子の安定化方法。
【請求項３】
生体分子が凍結乾燥物中に存在する請求項１記載の生体分子の安定化方法。
【請求項４】
セリシンおよび／またはその加水分解物が、繭糸又は生糸から抽出した天然セリシンに由来するものである請求項１記載の生体分子の安定化方法。
【請求項５】
セリシン同等物が遺伝子工学的手法により得られたものである請求項１記載の生体分子の安定化方法。
【請求項６】
生体分子が蛋白質である請求項１記載の生体分子の安定化方法。
【請求項７】
生体分子が酵素である請求項１記載の生体分子の安定化方法。
【請求項８】
生体分子が標識抗体である請求項１記載の生体分子の安定化方法。
【請求項９】
次の（ａ）および（ｂ）が共存している、生体分子が安定化した組成物：
（ａ）生体分子
（ｂ）セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくは、その同等物。
【請求項１０】
生体分子が溶液中に存在する請求項９記載の生体分子の液状安定化組成物。
【請求項１１】
生体分子が凍結乾燥物中に存在する請求項９記載の生体分子の安定化組成物。
【請求項１２】
セリシンおよび／またはその加水分解物が、繭糸又は生糸から抽出した天然セリシンに由来するものである請求項９記載の生体分子の安定化組成物。
【請求項１３】
セリシン同等物が遺伝子工学的手法により得られたものである請求項９記載の生体分子の安定化組成物。
【請求項１４】
生体分子が蛋白質である請求項９記載の生体分子の安定化組成物。
【請求項１５】
生体分子が酵素である請求項９記載の生体分子の安定化組成物。
【請求項１６】
生体分子が標識抗体である請求項９記載の生体分子の安定化組成物。
【請求項１７】
セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくは、その同等物を共存させる工程を含む、生体分子の安定化組成物の製造方法。
【請求項１８】
セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくは、その同等物を含む、生体分子を安定化するための組成物。
【請求項１９】
請求項９記載の生体分子の安定化組成物を含む診断用キット。
【請求項２０】
請求項９記載の生体分子の安定化組成物を含むバイオセンサー。
【請求項１】
次の（ａ）および（ｂ）を共存させる、生体分子を安定化する方法：
（ａ）生体分子
（ｂ）セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくは、その同等物。
【請求項２】
生体分子が溶液中に存在する請求項１記載の生体分子の安定化方法。
【請求項３】
生体分子が凍結乾燥物中に存在する請求項１記載の生体分子の安定化方法。
【請求項４】
セリシンおよび／またはその加水分解物が、繭糸又は生糸から抽出した天然セリシンに由来するものである請求項１記載の生体分子の安定化方法。
【請求項５】
セリシン同等物が遺伝子工学的手法により得られたものである請求項１記載の生体分子の安定化方法。
【請求項６】
生体分子が蛋白質である請求項１記載の生体分子の安定化方法。
【請求項７】
生体分子が酵素である請求項１記載の生体分子の安定化方法。
【請求項８】
生体分子が標識抗体である請求項１記載の生体分子の安定化方法。
【請求項９】
次の（ａ）および（ｂ）が共存している、生体分子が安定化した組成物：
（ａ）生体分子
（ｂ）セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくは、その同等物。
【請求項１０】
生体分子が溶液中に存在する請求項９記載の生体分子の液状安定化組成物。
【請求項１１】
生体分子が凍結乾燥物中に存在する請求項９記載の生体分子の安定化組成物。
【請求項１２】
セリシンおよび／またはその加水分解物が、繭糸又は生糸から抽出した天然セリシンに由来するものである請求項９記載の生体分子の安定化組成物。
【請求項１３】
セリシン同等物が遺伝子工学的手法により得られたものである請求項９記載の生体分子の安定化組成物。
【請求項１４】
生体分子が蛋白質である請求項９記載の生体分子の安定化組成物。
【請求項１５】
生体分子が酵素である請求項９記載の生体分子の安定化組成物。
【請求項１６】
生体分子が標識抗体である請求項９記載の生体分子の安定化組成物。
【請求項１７】
セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくは、その同等物を共存させる工程を含む、生体分子の安定化組成物の製造方法。
【請求項１８】
セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくは、その同等物を含む、生体分子を安定化するための組成物。
【請求項１９】
請求項９記載の生体分子の安定化組成物を含む診断用キット。
【請求項２０】
請求項９記載の生体分子の安定化組成物を含むバイオセンサー。
【公開番号】特開２００７−１５１５４６（Ｐ２００７−１５１５４６Ａ）
【公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３０４０９４（Ｐ２００６−３０４０９４）
【出願日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【出願人】（０００１０７９０７）セーレン株式会社 (462)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【出願人】（０００１０７９０７）セーレン株式会社 (462)
【Ｆターム（参考）】
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