生理活性ペプチド及びこれを含有する薬剤
配列番号１又は１３で示されるアミノ酸配列からなるペプチド、好ましくは配列番号２〜９、又は配列番号１０、１５〜１７で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞又は歯根膜由来細胞細胞等の細胞の細胞増殖促進剤又は分化促進剤の有効成分として用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は新規な生理活性ペプチドに関する。また本発明は、この生理活性ペプチドを有効成分とする薬剤に関する。本発明のペプチド及び薬剤は、医薬等の分野で有用である。
【背景技術】
シースリン（ｓｈｅａｔｈｌｉｎ）は、エナメルマトリクスに存在するタンパク質であり、アメロブラスチン（ａｍｅｌｏｂｌａｓｔｉｎ）やアメリン（ａｍｅｌｉｎ）とも呼ばれている。既にブタ、ヒト、ウシ、マウス、ラットのシースリンのアミノ酸配列が知られている（ラット切歯由来のアメロブラスチン：Ｋｒｅｂｓｂａｃｈ ＰＨ，Ｌｅｅ ＳＫ，Ｍａｔｓｕｋｉ Ｙ，Ｋｏｚａｃｋ ＣＡ，Ｙａｍａｄａ Ｋ ａｎｄ Ｙａｍａｄａ Ｙ：Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａｍｅｌｏｂｌａｓｔｉｎ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｔｏｏｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７１：４４３１−４４３５，１９９６、ラット臼歯由来のアメリン：Ｃｅｒｎｙ Ｒ，Ｓｌａｂｙ Ｉ，Ｈａｍｍａｒｓｔｒｍ Ｌ ａｎｄ Ｗｕｉｔｚ Ｔ：Ａ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｒａｔ ａｍｅｌｏｂｌａｓｔｓ ｃｏｄｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｃｅｌｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ，１１：８８３−８９１，１９９６、ブタ由来のシースリン：Ｈｕ ＣＣ，Ｆｕｋａｅ Ｍ，Ｕｃｈｉｄａ Ｔ，Ｑｉａｎ Ｑ，Ｚｈａｎｇ ＣＨ，Ｒｙｕ ＯＨ，Ｔａｎａｂｅ Ｔ，Ｙａｍａｋｏｓｈｉ Ｙ，Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｃ，Ｄｏｈｉ Ｎ，Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｍ ａｎｄ Ｓｉｍｍｅｒ ＪＰ：Ｓｈｅａｔｈｌｉｎ：Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｃＤＮＡ／ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｃａｌｏｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎａｍｅｌ ｓｈｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ Ｄｅｎｔ Ｒｅｓ，７６：６４８−６５７，１９９７、ヒト、ウシ及びマウス由来のシースリン：Ｔｏｙｏｓａｗａ Ｓ，Ｆｕｊｉｗａｒａ Ｔ，Ｏｏｓｈｉｍａ Ｔ，Ｓｈｉｎｔａｎｉ Ｓ，Ｓａｔｏ Ａ，Ｏｇａｗａ Ｙ，Ｓｏｂｕｅ Ｓ ａｎｄ Ｉｊｕｈｉｎ Ｎ：Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ａｍｅｌｏｂｌａｓｔｉｎ ｇｅｎｅ．Ｇｅｎｅ，２５６：１−１１，２０００）。
また、シースリン（ラット由来）の２７位〜４７位のアミノ酸配列（配列番号６に相当）を認識する抗体が開示されている（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５（１０），ｐ１３２９−１３４０（１９９７）。しかし当該文献の開示は、ある特定の抗体がこのようなアミノ酸配列を認識するということに止まり、このようなアミノ酸配列からなるペプチド自体を製造したり、このペプチドを医薬用途等に使用したりすることについての開示や示唆はない。
また、アメリンに由来するテトラペプチドや、アメリンの各種医薬用途（歯周病の治療や予防、歯の病変の修復、骨要素の結合、硬組織の無機質化の促進や誘発、インプラントの骨への効果的な取り込み、インプラント器具等の生体適合性の改善等）が報告されている（特表平１１−５１０３７７号公報）。しかしながら、後述する本発明ペプチドやその医薬用途等についての開示や示唆はない。
【発明の開示】
シースリンについては前記のような種々の医薬用途が知られているが、生物活性を有するシースリン内部のアミノ酸配列が特定され、そのアミノ酸配列からなるペプチドが取得できれば、シースリンの生物活性をより効果的に発揮できる医薬素材をより安価に提供することができる。
本発明は上記観点からなされたものであり、生物活性を有するシースリン由来のペプチド、及び当該ペプチドを有効成分とする医薬を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、生物活性を有するシースリン内部のアミノ酸配列を特定し、このアミノ酸配列からなるペプチドを製造し、そのペプチドが種々の生物活性を示すことを見出して、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、下記のアミノ酸配列（配列番号１）からなるペプチド（以下、「本発明ペプチド−Ｎ」という）を提供する。
（但し、Ｘ０１はＶａｌ又はＧｌｎを、Ｘ０２はＡｌａ、Ｐｈｅ又はＧｌｙを、Ｘ０３はＰｈｅ又はＬｅｕを、Ｘ０４はＰｒｏ又はＬｙｓを、Ｘ０５はＡｒｇ、Ｇｌｎ又はＰｒｏを、Ｘ０６はＧｌｎ、Ａｒｇ又はＰｈｅを、Ｘ０７はＰｒｏ、Ｓｅｒ又はＬｅｕを、Ｘ０８はアミノ酸残基が存在しないこと又はＧｌｙ若しくはＧｌｎを、Ｘ０９はアミノ酸残基が存在しないこと又はＡｌａ、Ｇｌｙ若しくはＰｒｏを、Ｘ１０はアミノ酸残基が存在しないこと又はＧｌｎ若しくはＴｈｒを、Ｘ１１はアミノ酸残基が存在しないこと又はＧｌｙ若しくはＡｌａを、Ｘ１２はアミノ酸残基が存在しないこと又はＭｅｔ若しくはＡｌａを、Ｘ１３はＧｌｙ、Ａｌａ又はＴｈｒを、Ｘ１４はＴｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ又はＧｌｙを、Ｘ１５はＰｒｏ又はＶａｌを、Ｘ１６はＧｌｙ又はＧｌｎを、Ｘ１７はＶａｌ、Ｍｅｔ又はＧｌｙを、Ｘ１８はＡｌａ又はＴｈｒを、Ｘ１９はＳｅｒ又はＰｒｏを、Ｘ２０はＬｅｕ又はＧｌｎをそれぞれ示す。）
本発明ペプチド−Ｎは、下記のアミノ酸配列（配列番号２）からなるものであることが好ましい。
（但し、Ｘ２１はＡｌａ又はＰｈｅを、Ｘ２２はＡｒｇ又はＧｌｎを、Ｘ２３はＰｒｏ又はＳｅｒを、Ｘ２４はＴｈｒ又はＩｌｅを、Ｘ２５はＶａｌ、Ｍｅｔ又はＧｌｙをそれぞれ示す。）
本発明ペプチド−Ｎは、下記（Ａ）〜（Ｇ）のいずれかのアミノ酸配列からなるものであることが好ましい。
なかでも、上記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｇ）のアミノ酸配列からなるものが好ましい。
また本発明は、下記のアミノ酸配列（配列番号１３）からなるペプチド（以下、「本発明ペプチド−Ｃ」という）を提供する。
（但し、Ｘ２６はＡｌａ又はＶａｌを、Ｘ２７はＧｌｎ又はＨｉｓを、Ｘ２８はＧｌｎ又はＧｌｕを、Ｘ２９はＩｌｅ、Ｍｅｔ又はＶａｌを、Ｘ３０はアミノ酸が存在しないこと又はＬｙｓ若しくはＭｅｔを、Ｘ３１はＡｒｇ又はＨｉｓを、Ｘ３２はＡｓｐ又はＡｓｎをそれぞれ示す。）
本発明ペプチド−Ｃは、下記のアミノ酸配列（配列番号１４）からなるものであることが好ましい。
（但し、Ｘ３３はＧｌｎ又はＧｌｕを、Ｘ３４はＩｌｅ又はＭｅｔを、Ｘ３５はＬｙｓ又はＭｅｔを、Ｘ３６はＡｒｇ又はＨｉｓをそれぞれ示す。）
本発明ペプチド−Ｃは、下記（Ｈ）〜（Ｋ）のいずれかのアミノ酸配列からなるものであることが好ましい。
なかでも、上記（Ｈ）又は（Ｉ）のアミノ酸配列からなるものが好ましい。
以下、本発明ペプチド−Ｎ及び本発明ペプチド−Ｃをまとめて、単に「本発明ペプチド」という。
また本発明は、本発明ペプチドを有効成分とする薬剤（以下、「本発明薬剤」という）を提供する。本発明薬剤は医薬であることが好ましい。
また本発明薬剤は細胞増殖促進剤又は細胞の分化促進剤であることも好ましい。増殖や分化を促進する対象となる「細胞」は、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞又は歯根膜由来細胞であることが好ましい。
また本発明薬剤は、骨若しくは軟骨の形成促進剤もしくは再生促進剤、又は歯周組織の形成促進剤もしくは再生促進剤であることも好ましい。
また本発明は、本発明ペプチドと、ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩とを少なくとも含むことを特徴とする組成物（以下、「本発明組成物」という）を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明ペプチド−Ｎ（ブタ由来）の、ＰＤＬ細胞（ヒト由来）に対する増殖促進作用を示す図である。
図２は、本発明ペプチド−Ｃ（ブタ由来）の、ＰＤＬ細胞（ヒト由来）に対する増殖促進作用を示す図である。
図３は、本発明ペプチド−Ｎ（ブタ由来及びヒト由来）の、ＭＣ３Ｔ３細胞（マウス由来）に対する増殖促進作用を示す図である。
図４は、本発明ペプチド−Ｎ及び本発明ペプチド−Ｃブタ由来）の、ＰＤＬ細胞（ヒト由来）に対する分化促進作用を示す図である。
図５は、本発明ペプチド−Ｎ（ブタ由来及びヒト由来）の、ＰＤＬ細胞（ヒト由来）に対する分化促進作用を示す図である。
図６は、本発明ペプチド−Ｎ（ブタ由来及びヒト由来）の、ＰＤＬ細胞（ヒト由来）に対する分化促進作用を示す図である。
図７は、本発明ペプチド−Ｎ（ブタ由来及びヒト由来）の、ＳＴ２細胞（マウス由来）に対する分化促進作用を示す図である。
図８は、本発明ペプチド−Ｎ（ブタ由来及びヒト由来）の、ＢＭＳＳＣ細胞（ラット由来）に対する分化促進作用を示す図である。
図９は、本発明ペプチド−Ｎ（ブタ由来及びヒト由来）の、ＭＣ３Ｔ３細胞（マウス由来）に対する分化促進作用を示す図である。
図１０は、本発明ペプチド−Ｎ（ブタ由来及びヒト由来）の、ＭＣ３Ｔ３細胞（マウス由来）に対する分化促進作用を示す図である。
図１１は、本発明ペプチド−Ｎ（ブタ由来）の、ＯＣＣＭ３０細胞（マウス由来）に対する分化促進作用を示す図である。
図１２は、本発明ペプチド（欠失を加えたもの；ヒト由来）の、ＭＣ３Ｔ３細胞（マウス由来）に対する分化促進作用を示す図である。
図１３は、本発明ペプチド（数アミノ酸を付加又は置換したもの；ヒト由来）の、ＳＴ２細胞（マウス由来）に対する分化促進作用を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明ペプチド
（１）本発明ペプチド−Ｎ
本発明ペプチド−Ｎは、下記のアミノ酸配列（配列番号１）からなるペプチドである。本発明ペプチド−Ｎは、シースリンタンパク質のＮ末端側に存在するアミノ酸配列をもとに設計されたものである。
上記アミノ酸配列において、Ｘ０１〜Ｘ２０は、下記のアミノ酸残基を示す。
Ｘ０１：Ｖａｌ又はＧｌｎ
Ｘ０２：Ａｌａ、Ｐｈｅ又はＧｌｙ
Ｘ０３：Ｐｈｅ又はＬｅｕ
Ｘ０４：Ｐｒｏ又はＬｙｓ
Ｘ０５：Ａｒｇ、Ｇｌｎ又はＰｒｏ
Ｘ０６：Ｇｌｎ、Ａｒｇ又はＰｈｅ
Ｘ０７：Ｐｒｏ、Ｓｅｒ又はＬｅｕ
Ｘ０８：アミノ酸残基が存在しない、又はＧｌｙ若しくはＧｌｎ
Ｘ０９：アミノ酸残基が存在しない、又はＡｌａ、Ｇｌｙ若しくはＰｒｏ
Ｘ１０：アミノ酸残基が存在しない、又はＧｌｎ若しくはＴｈｒ
Ｘ１１：アミノ酸残基が存在しない、又はＧｌｙ若しくはＡｌａ
Ｘ１２：アミノ酸残基が存在しない、又はＭｅｔ若しくはＡｌａ
Ｘ１３：Ｇｌｙ、Ａｌａ又はＴｈｒ
Ｘ１４：Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ又はＧｌｙ
Ｘ１５：Ｐｒｏ又はＶａｌ
Ｘ１６：Ｇｌｙ又はＧｌｎ
Ｘ１７：Ｖａｌ、Ｍｅｔ又はＧｌｙ
Ｘ１８：Ａｌａ又はＴｈｒ
Ｘ１９：Ｓｅｒ又はＰｒｏ
Ｘ２０：Ｌｅｕ又はＧｌｎ
本発明ペプチド−Ｎには、下記のアミノ酸配列（配列番号２）からなるペプチドが包含される。
上記アミノ酸配列において、Ｘ２１〜Ｘ２５は、下記のアミノ酸残基を示す。
Ｘ２１：Ａｌａ又はＰｈｅ
Ｘ２２：Ａｒｇ又はＧｌｎ
Ｘ２３：Ｐｒｏ又はＳｅｒ
Ｘ２４：Ｔｈｒ又はＩｌｅ
Ｘ２５：Ｖａｌ、Ｍｅｔ又はＧｌｙ
そして本発明ペプチド−Ｎは、具体的には、下記（Ａ）〜（Ｇ）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドであることが好ましい。
（２）本発明ペプチド−Ｃ
本発明ペプチド−Ｃは、下記のアミノ酸配列（配列番号１３）からなるペプチドである。本発明ペプチド−Ｃは、シースリンタンパク質のＣ末端側に存在するアミノ酸配列をもとに設計されたものである。
上記アミノ酸配列において、Ｘ２６〜Ｘ３２は、下記のアミノ酸残基を示す。
Ｘ２６：Ａｌａ又はＶａｌ
Ｘ２７：Ｇｌｎ又はＨｉｓ
Ｘ２８：Ｇｌｎ又はＧｌｕ
Ｘ２９：Ｉｌｅ、Ｍｅｔ又はＶａｌ
Ｘ３０：アミノ酸が存在しない、又はＬｙｓ若しくはＭｅｔ
Ｘ３１：Ａｒｇ又はＨｉｓ
Ｘ３２：Ａｓｐ又はＡｓｎ
本発明ペプチド−Ｃは、下記のアミノ酸配列（配列番号１４）からなるものであることが好ましい。
上記アミノ酸配列において、Ｘ３３〜Ｘ３６は、下記のアミノ酸残基を示す。
Ｘ３３：Ｇｌｎ又はＧｌｕ
Ｘ３４：Ｉｌｅ又はＭｅｔ
Ｘ３５：Ｌｙｓ又はＭｅｔ
Ｘ３６：Ａｒｇ又はＨｉｓ
そして本発明ペプチド−Ｃは、具体的には、下記（Ｈ）〜（Ｋ）のいずれかのアミノ酸配列からなるものであることが好ましい。
（３）本発明ペプチドの製造
本発明ペプチドは、そのアミノ酸配列が本発明により開示されたので、その配列に基づいてペプチドの公知の化学合成法（例えば液相合成法や固相合成法等；泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇 道典、「ペプチド合成の基礎と実験」１９８５、丸善（株）参照）により製造することが可能である。例えば、前記（Ａ）（配列番号３）のアミノ酸配列からなるペプチドを固相合成法で製造する場合には、アミノ酸配列のＣ末端（１６位）がロイシン残基であるから、α−アミノ基（Ｎα）−保護−ロイシンのカルボキシル基を直接、或いは場合によってはスペーサーを介して、クロロメチル基あるいはオキシメチル基を有する不溶性樹脂に結合させた後、Ｎα−保護基を除去し、アミノ酸配列の１５位から１位までの各保護アミノ酸（Ｎα−及び側鎖官能基保護アミノ酸を、単に「保護アミノ酸」と略称する）を固相合成法に従って順次結合し、次いで不溶性樹脂およびアミノ酸のＮα−及び側鎖官能基の保護基を脱離させて、前記（Ａ）（配列番号３）のアミノ酸配列からなるペプチドを得ることができる。
本発明ペプチドを合成する場合に使用される前記のクロロメチル基あるいはオキシメチル基を有する不溶性樹脂及びスペーサー、場合により保護アミノ酸を該不溶性樹脂に結合した保護アミノ酸樹脂等は、公知の方法で調製でき、各種のものが市販されている。
前記不溶性樹脂としては、Ｃ末端の保護アミノ酸のカルボキシル基と直接、或いは場合によりスペーサーを介して、結合可能であり、かつ、その後脱離可能なものであれば如何なるものでもよい。かかる不溶性樹脂としては、例えば、Ｂｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）ストラテジーの場合は、クロロメチル樹脂（クロロメチル化スチレン−ジビニルベンゼン共重合体）、オキシメチル樹脂あるいはスペーサーを導入した４−オキシメチル−Ｐａｍ（フェニルアセタミドメチル）−樹脂が、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）ストラテジーの場合は、オキシメチルフェノキシメチル樹脂（Ｗａｎｇ樹脂）及びこれらの誘導体等が好ましい。
保護アミノ酸とは、官能基を公知の方法により保護基で保護したアミノ酸であり、各種の保護アミノ酸が市販されている。
保護アミノ酸の結合は、通常の縮合法、例えば、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）法、ＤＩＰＣＤＩ（ジイソプロピルカルボジイミド）法［Ｔａｒｔａｒ，Ａ．ら；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４４、５０００（１９７９）］、活性エステル法、混合あるいは対称酸無水物法、カルボニルジイミダゾール法、ＤＣＣ−ＨＯＮＳｕ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）法［Ｗｅｙｇａｎｄ，Ｆ．ら、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．，Ｂ，２１，４２６（１９６６）］、ＤＣＣ−ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）法［Ｋｏｅｎｉｇ，Ｗ．ら；Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，１０３、７８８、２０２４、２０３４（１９７０）］、ジフエニルホスホリルアジド法、ＢＯＰ試薬（ベンゾトリアゾリル−Ｎ−ヒドロキシトリスジメチルアミノホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩）を用いるＢＯＰ−ＨＯＢｔ法（Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５３，６１７（１９８８））、ＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート）−ＨＯＢｔ法（Ｋｎｏｒｒ，Ｒ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３０，１９２７（１９８９））、ＴＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレイト）−ＨＯＢｔ法（Ｋｎｏｒｒ，Ｒ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３０，１９２７（１９８９））等に従って行なうことができる。これらのうち、ＤＣＣ法、ＤＣＣ−ＨＯＢｔ法、ＢＯＰ−ＨＯＢｔ法、ＨＢＴＵ−ＨＯＢｔ法、対称酸無水物法が好ましい。
これらの縮合反応は、通常、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）等の有機溶媒又はそれらの混合溶媒中で行なわれる。
α−アミノ基の保護基の脱離試薬としては、トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン、ＨＣｌ／ジオキサン、ピペリジン／ＤＭＦ又はピペリジン／ＮＭＰ等が用いられ、保護基の種類により適宜選択することができる。
また、合成の各段階における縮合反応の進行の程度はＥ．カイサーらの方法［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３４，５９５（１９７０）］（ニンヒドリン反応法）によって検査することができる。
以上のようにして、所望のアミノ酸配列を有する保護ペプチド樹脂を得ることができる。
保護ペプチド樹脂は、フッ化水素、ＴＦＭＳＡ（トリフルオロメタンスルホン酸）［Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ発行、Ｅ．Ｇｒｏｓｓ編集、Ｙａｊｉｍａ，Ｈら；”Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”５、６５（１９８３）］、ＴＭＳＯＴｆ（トリメチルシリルトリフラート）［Ｆｕｊｉｉ，Ｎ．ら；Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２７４（１９８７）］、ＴＭＳＢｒ（トリメチルシリルブロミド）［Ｆｕｊｉｉ，Ｎ．ら；Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３５、３８８０（１９８７）］、またはトリフルオロ酢酸などで処理することにより、該樹脂および保護基を同時に脱離させることができる。上記の脱離試薬は、用いたストラテジー（Ｂｏｃ又はＦｍｏｃ）、樹脂および保護基の種類により適宜選択することができる。これら一連の方法によって本発明ペプチドを製造することができる。
また本発明ペプチドのアミノ酸配列に対応するポリヌクレオチド（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）を製造し、当該ポリヌクレオチドを用いた遺伝子工学的手法によっても本発明ペプチドを製造することができる。
製造したペプチドは、タンパク質化学の分野において一般に知られているタンパク質の単離、精製方法によって精製することができる。具体的には、例えば抽出、再結晶、硫酸アンモニウム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法、向流分配等や、これらの任意の組合せ等の処理操作が挙げられるが、逆相高速液体クロマトグラフィーによる方法が効果的である。
製造された本発明ペプチドは、例えば塩酸やメタンスルホン酸等の酸で加水分解して公知の方法でアミノ酸組成を調べることができ、これによって本発明ペプチドが正しく製造されたか否かを推定することができる。
より厳密には、製造されたペプチドのアミノ酸配列を、公知のアミノ酸配列決定法（例えばエドマン分解法等）により決定し、本発明ペプチドが正しく製造されたか否かを確認することができる。
なお、本発明ペプチドには塩の形態のものも包含される。後述するように、本発明ペプチドは医薬用途としても有用であることから、本発明ペプチドの塩は、医学的に許容される塩であることが好ましい。
本発明ペプチドは、酸付加により塩を形成しうる。このような塩としては、例えば無機酸（塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸など）または有機カルボン酸（酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、サリチル酸、トリフルオロ酢酸など）、グルクロン酸、ガラクツロン酸、グルコン酸、アスコルビン酸等の酸性糖、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩類、ヘパラン硫酸、ヘパリン、６位脱硫酸化ヘパリン、２位脱硫酸化ヘパリン、Ｎ−脱硫酸化ヘパリン、アルギン酸等の酸性多糖、または有機スルホン酸（メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸など）等が例示される。これらの塩のうち、医学的に許容される塩が好ましい。
また本発明ペプチドは、塩基性物質との塩を形成しうる。このような塩としては、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、又はジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩等の有機塩基との塩のうち、医学的に許容される塩が例示される。
また、本発明ペプチドを修飾したペプチドも本発明ペプチドに包含される。このようなペプチドとしては、例えばα−アミノ基やα−カルボキシル基を修飾したペプチドや、側鎖官能基を修飾したペプチド等が挙げられる。修飾としては、ペプチド化学の分野で一般的に用いられる修飾基や保護基による修飾、また光学異性体であるＤ−アミノ酸等による置換が挙げられる。
本発明ペプチド−Ｎのうち、前記（Ａ）〜（Ｇ）のアミノ酸配列の関係を表１に示す。また本発明ペプチド−Ｃのうち、前記（Ｈ）〜（Ｋ）のアミノ酸配列の関係を表２に示す。アミノ酸残基は１文字記号で示した。またアミノ酸配列中の「−」はアミノ酸残基が存在していないことを示す。例えば（Ａ）についてみると、この第８番目のアミノ酸残基は「Ｐ」であり、これがペプチド結合を介して第９番目のアミノ酸残基（Ｇ）と結合し、全体として１６アミノ酸残基からなるペプチドを形成していることを示す。また、それぞれのアミノ酸配列を有するシースリン分子を保持する動物（由来）も併せて示した。
本発明ペプチドは、後述する実施例の記載から明らかなように、細胞増殖促進作用や細胞分化促進作用、特に骨芽細胞や歯根膜細胞等の細胞増殖促進作用や細胞分化促進作用を有することから、以下に詳述するような細胞増殖促進剤、細胞の分化促進剤、骨若しくは軟骨の形成促進剤又は再生促進剤、歯周組織の形成促進剤又は再生促進剤等の薬剤の有効成分として用いることができる。
＜２＞本発明薬剤
本発明薬剤は、本発明ペプチド（本発明ペプチド−Ｎ及び／又はペプチド−Ｃ）を有効成分とする薬剤である。本発明薬剤は、医薬であってもよく、実験や試験用の試薬であってもよいが、医薬であることが好ましい。
本発明薬剤は細胞増殖促進剤又は細胞の分化促進剤であることが好ましい。増殖や分化の促進の対象となる「細胞」は、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞又は歯根膜由来細胞であることが好ましい。この細胞増殖促進剤や細胞分化促進剤は、その有効成分である本発明ペプチドの作用によって優れた細胞増殖促進作用や細胞分化促進作用を発揮する。
また本発明薬剤は、このような本発明ペプチドの作用を利用して、骨若しくは軟骨の形成促進剤又は再生促進剤や、歯周組織の形成促進剤又は再生促進剤とすることもできる。
本発明薬剤の有効成分として用いる本発明ペプチドは、前記の「＜１＞本発明ペプチド」と同様である。
特に下記（Ａ）〜（Ｇ）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。
特に（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｇ）のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。
また、下記（Ｈ）〜（Ｋ）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドも好ましい。
特に（Ｈ）又は（Ｉ）のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。
本発明薬剤を構成する本発明ペプチドは、単一種類であってもよく、複数種類であってもよい。
本発明薬剤の有効成分である本発明ペプチドの純度は、本発明薬剤の目的に応じて適宜設定することができる。例えば本発明薬剤を医薬とする場合には、高純度に精製され、医薬として混入が許されない物質を実質的に含まない本発明ペプチドを用いることが好ましい。
本発明薬剤を医薬とする場合、その目的に応じて、注射（皮下、皮内、静脈内、腹腔内等）、点眼、点入、埋入、経皮、経口、吸入等、適宜投与方法を選択することができる。また投与方法に応じて注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化剤、軟膏剤、ゲル剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤、点眼剤、眼軟膏剤、座剤、ペッサリー等の剤形を適宜選択し、製剤化することができる。
本発明薬剤を医薬とする場合、そのエンドトキシン濃度は、溶液形態の剤とした場合においては０．３ＥＵ／ｍＬ以下であることが好ましい。エンドトキシン濃度は、当業者に周知慣用のエンドトキシン測定法を用いて測定することができるが、カブトガニ・アメボサイト・ライセート成分を用いるリムルス試験法が好ましい。なおＥＵ（エンドトキシン単位）は、日本工業規格生化学試薬通則（ＪＩＳ Ｋ８００８）、又は米国薬局方等に従って測定・算出できる。
また本発明薬剤には、本発明ペプチドに悪影響を与えず、かつ、本発明の効果に悪影響を与えない限りにおいて、他の医薬活性成分（例えば、ヒアルロン酸）や、慣用の安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤等、通常医薬に用いられる成分を使用することができる。
本発明薬剤を医薬とする場合、その投与量は、投与の目的（予防、維持（悪化防止）、軽減（症状の改善）または治療）、疾患の種類、患者の症状、性別、年令、体重、投与部位、投与方法等によって個別に設定されるべきものであり特に限定されないが、成人１人１回あたり概ね、本発明ペプチドとして１ｐｇ／投与部位〜３０ｍｇ／投与部位程度を投与することができる。また投与間隔は、例えば１日１回程度であってもよく、１日２〜３回に分けてもよく、１〜３日に１回程度であってもよい。
本発明薬剤を医薬とする場合、これが投与される動物も特に限定されないが、脊椎動物が好ましく、哺乳動物がより好ましく、ヒトが特に好ましい。
本発明薬剤を医薬とする場合、それぞれの用途に応じて、例えば以下のような動物に投与することができる。
細胞増殖促進剤として用いる場合には、細胞の増殖が望まれている状態にある動物に対して投与することができる。特に、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞又は歯根膜由来細胞の増殖が望まれている状態にある動物に投与されることが好ましい。このような細胞の増殖が望まれている状態としては、例えば歯周疾患、骨折、骨欠損、骨粗鬆症、関節疾患、整形外科的疾患（離断性骨軟骨炎、変形性膝関節症など）、腫瘍等に罹患している場合や、歯科治療（歯周治療など）、整形外科治療（培養細胞移植術、骨穿孔術、骨軟骨柱移植術など）、腫瘍摘出術による骨移植、骨補填が施された直後の状態等が例示される。
細胞の分化促進剤として用いる場合には、細胞の分化が望まれている状態にある動物に対して投与することができる。特に、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞又は歯根膜由来細胞の分化が望まれている状態にある動物に投与されることが好ましい。このような細胞の分化が望まれている状態の例示は、前記の細胞増殖促進剤における場合と同様である。
骨若しくは軟骨の形成促進剤又は再生促進剤として用いる場合には、骨若しくは軟骨の形成促進又は再生促進が望まれている状態にある動物に対して投与することができる。骨若しくは軟骨の形成促進又は再生促進が望まれている状態の例示は、前記の細胞増殖促進剤における場合と同様である。
歯周組織の形成促進剤又は再生促進剤として用いる場合には、歯周組織の形成促進又は再生促進が望まれている状態にある動物に対して投与することができる。歯周組織の形成促進又は再生促進が望まれている状態の例示は、前記の細胞増殖促進剤における場合と同様である。
また、本発明ペプチドを適当な不溶性担体の表面に固着させたり、適当な素材と混合したりすることによって、細胞増殖の促進や細胞の分化促進、骨組織・軟骨組織や歯周組織の形成促進又は再生促進、生体適合性の改善等を目的とする薬剤としてもよい。このような不溶性担体又は素材としては、ビーズ、フィルム、プレート、モノフィラメント、不織布、スポンジ、織物、編物、短繊維、チューブ、中空糸等をはじめとする種々の形状のものを使用できる。具体的には、医用複合材料としてインプラント、骨セメント、骨補填剤、根管充填剤、骨折プレート、人工関節等に用いることができる。本発明ペプチドは、再生医療分野における薬剤として応用することもできる。
このような素材の表面に本発明ペプチドを固着させる場合、その固着方法も特に限定されず、物理的吸着法、イオン結合法、共有結合法、包括法など固定化酵素の調製法として一般的な方法（固定化酵素、１９７５年、講談社発行、第９〜７５頁参照）を利用することができる。
例えばポリスチレン系やポリプロピレン系の不溶性担体には、物理的に本発明ペプチドを固着させることができる。また、例えばポリアミド系、セルロース系、アガロース系、ポリアクリルアミド系、デキストラン系、ビニルポリマー系の不溶性担体には、化学的に本発明ペプチドを固着させることができる。化学的な固着（結合）方法としては、不溶性担体の芳香族アミノ基を利用してジアゾカップリングさせるジアゾ化法、不溶性担体の水酸基をＣＮＢｒで活性化してペプチド結合させるＣＮＢｒ法、不溶性担体のヒドラジン誘導体等を用いてペプチド結合させる酸アジド法、ハロゲン等の反応性に富む不溶性担体の官能基を利用してペプチドをアルキル化するアルキル化法、グルタルアルデヒドのような遊離のアミノ基と反応する架橋試薬によって不溶性担体とペプチドの遊離のアミノ基との間を架橋する方法、カルボジイミド法、エポキシ活性化法、さらにこれらの方法を用いてスペーサーを介して結合させる方法等が挙げられる。これらの公知の結合法から、不溶性担体の種類に応じて適宜選択して本発明ペプチドの結合に利用することができる。
また、本発明薬剤を実験や試験用の試薬として用いる場合は、用途に応じて、本発明ペプチドはそのまま使用してもよく、他の成分と混合して用いてもよい。
＜３＞本発明組成物
本発明組成物は、本発明ペプチド（本発明ペプチド−Ｎ及び／又はペプチド−）Ｃと、ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩とを少なくとも含むことを特徴とする組成物である。
本発明組成物の構成成分である本発明ペプチドは、前記の「＜１＞本発明ペプチド」と同様である。
特に下記（Ａ）〜（Ｇ）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。
特に（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｇ）のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。
また、下記（Ｈ）〜（Ｋ）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドも好ましい。
特に（Ｈ）又は（Ｉ）のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。
本発明組成物を構成する本発明ペプチドは、単一種類であってもよく、複数種類であってもよい，
本発明組成物の構成成分である「ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩」の由来は特に限定されない。例えば、鶏冠、臍帯、ヒアルロン酸を産生する微生物等から分離、精製されたヒアルロン酸や、合成（例えば化学合成法や酵素合成法）によって製造されたヒアルロン酸のいずれをも用いることができる。ヒアルロン酸の分子サイズも特に限定されない。一例として、重量平均分子量６０万〜１２０万のヒアルロン酸が例示される。例えば、分子量８０万〜１００万程度のヒアルロン酸が好ましい例である。
「ヒアルロン酸の薬学的に許容される塩」としては、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、またはジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩のうち、薬学的に許容される塩を用いることができる。なかでもナトリウム塩であることが好ましい。
本発明ペプチドと、このような「ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩」を適宜混合することにより、本発明組成物を製造することができる。これら両者の混合比（組成物中の含有比率）も特に限定されない。尚、「本発明ペプチドと、ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩とを少なくとも含む」とは、本発明のペプチドとして、ヒアルロン酸付加塩を用いる場合を含む。
本発明組成物は、溶液状態、凍結状態、乾燥状態（凍結乾燥状態等）のいずれの状態であってもよい。
本発明組成物中の不純物含量等も、使用目的に応じて適宜設定すればよく、特に限定されないが、医薬として混入が許されない物質を実質的に含まないものが好ましい。
例えば、本発明組成物中のエンドトキシン濃度は、本発明組成物を溶液状態とした場合において０．３ＥＵ／ｍＬ以下であることが好ましい。本発明組成物中のエンドトキシン濃度は、前記と同様に当業者に周知慣用のエンドトキシンの測定法を用いて測定・算出することができる。また、鉄含量は２０ｐｐｍ以下であることが好ましい。
また本発明組成物には、本発明ペプチドに悪影響を与えず、かつ、本発明の効果に悪影響を与えない限りにおいて、他の医薬活性成分（例えば、ヒアルロン酸）や、慣用の安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤等、通常医薬に用いられる成分を使用することもできる。
このような本発明組成物は、医療用途に用いられることが好ましい
本発明組成物を医薬とする場合、前記本発明薬剤を医薬に用いるのと同様の用途に使用することができるが、特に、本発明ペプチドをある程度保持させる必要のある疾患、例えば歯周疾患、骨折、骨欠損、関節疾患、整形外科的疾患等の当該疾患部位に対してや、椎間融合術の際等に使用されることが好ましい。
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
＜実施例１＞本発明ペプチドの製造
株式会社ペプチド研究所に委託し、下記（ａ）〜（ｅ）のペプチドを固相合成法により製造した。（ａ）はシースリンタンパク質（ブタ由来）のＮ末端側に存在するアミノ酸配列をもとに、（ｂ）はシースリンタンパク質（ヒト由来）中の（ａ）に対応する部分のアミノ酸配列をもとに、（ｃ）はシースリンタンパク質（ブタ由来）のＣ末端側に存在するアミノ酸配列をもとに、（ｄ）及び（ｅ）はいずれもシースリンタンパク質（ブタ由来）のＮ末端側とＣ末端側の中間領域に存在するアミノ酸配列をもとにそれぞれデザインしたペプチドである。ペプチド（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）が本発明ペプチドに相当する。
製造したペプチド（ａ）及び（ｂ）のアミノ酸分析結果（加水分解条件：６Ｎ ＨＣｌ、１１０℃、２２時間）を以下に示す。カッコ内の数字は理論値を示す。
ペプチド（ａ）：Ｔｈｒ（１）０．９４，Ｓｅｒ（１）０．８９，Ｇｌｕ（１）１．００，Ｇｌｙ（２）２．０５，Ａｌａ（２）２．０７，Ｖａｌ（２）２．０１，Ｌｅｕ（１）１．０２，Ｐｈｅ（１）０．９９，ＮＨ２（１）１．１３，Ａｒｇ（１）０．９８，Ｐｒｏ（４）４．００
ペプチド（ｂ）：Ｔｈｒ（１）０．９４，Ｓｅｒ（２）１．７７，Ｇｌｕ（２）２．００，Ｇｌｙ（２）１．９７，Ａｌａ（１）１．００，Ｖａｌ（１）０．９７，Ｍｅｔ（１）０．９８，Ｌｅｕ（１）０．９９，Ｐｈｅ（２）１．９６，ＮＨ２（２）２．１２，Ｐｒｏ（３）２．９９
また、製造したペプチド（ａ）及び（ｂ）の純度の検定結果（高速液体クロマトグラフィーにより算出）を以下に示す。いずれのペプチドも、高速液体クロマトグラフィー（逆相クロマトグラフィー）の溶出パターンで単一のピークが認められた。
ペプチド（ａ）：９７．３％
ペプチド（ｂ）：９６．４％
なお、高速液体クロマトグラフィーの条件は下記の通りである。
・カラム ：Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ１８（４．６ｍｍＩ．Ｄ．ｘ １５０ｍｍ）（アジュレント社製）
・溶離液 ：１０〜６０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸（２５分）
・流速 ：１．０ｍＬ／分
・温度 ：ペプチド（ａ）については２５℃、ペプチド（ｂ）については５０℃。
・検出波長：２２０ｎｍ
また、製造したペプチド（ａ）及び（ｂ）の分子量を、エレクトロスプレーイオン化マススペクトロメトリー（ＥＳＩ−ＭＳ）によって分析した結果を以下に示す。
ペプチド（ａ）：１５９３．６（理論値：１５９３．８）
ペプチド（ｂ）：１６６３．６（理論値：１６６３．９）
以上の結果から、ペプチド（ａ）及び（ｂ）が正しく製造されていることが示された。
また、製造したペプチド（ｃ）〜（ｅ）についても同様に分析した結果、いずれも純度が９８．０％以上で、高速液体クロマトグラフィー（逆相クロマトグラフィー）において単一ピークを示し、アミノ酸分析値及び分子量も理論値とよく一致することが示された。このことから、ペプチド（ｃ）〜（ｅ）についても正しく製造されていることが示された。なお製造した（ａ）〜（ｅ）のペプチドは、いずれも白色の凍結乾燥体であった。
また、上記ペプチド（ｂ）の一部を欠いたペプチド（下記（ｆ）〜（ｊ）のペプチド）、上記ペプチド（ｂ）のＮ末端及び／又はＣ末端に数アミノ酸残基が付加されたペプチド（下記（ｋ）〜（ｍ）のペプチド）、及び上記ペプチド（ｂ）中の一部のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたペプチド（下記（ｎ）のペプチド）を、前記と同様に固相合成法により製造した。ペプチド（ｎ）が本発明ペプチドに相当する。
製造したペプチド（ｆ）〜（ｎ）についても同様に分析した結果、いずれも純度が９８．０％以上で、高速液体クロマトグラフィー（逆相クロマトグラフィー）において単一ピークを示し、アミノ酸分析値及び分子量も理論値とよく一致することが示された。このことから、ペプチド（ｆ）〜（ｎ）についても正しく製造されていることが示された。なお製造した（ｆ）〜（ｎ）のペプチドも、いずれも白色の凍結乾燥体であった。
＜実施例２＞細胞を用いた薬効薬理試験
（１）細胞の調製
（ｉ）ヒト由来の歯周靱帯由来細胞（ＰＤＬ細胞）
ＰＤＬ細胞は、矯正治療のために抜歯を目的として来院した患者（１６．２４歳）から歯周靱帯を可能な限り傷つけないようして注意深く抜去した健全小臼歯から分離して培養した。抜去した歯牙を、滅菌した生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ニッスイ製）で洗浄後、歯根中央１／３に存在する歯周靱帯を尖刃刀を用いてそぎ落とした。これらの歯周靱帯をプラスチックシャーレに入れ替え、丸刃刀を用いてより小さな細片にした。組織片を３５ｍｍ径のシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ社製）中で静置し、抗生物質（１００Ｕ／ｍｌ ペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン及び２５０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン）及び１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ＥＱＵＩＴＥＣＨ−ＢＩＯ社製）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ；ニッスイ製）中で、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で培養した。その後、歯周靱帯組織片から遊出してきた細胞を同様の条件下で継代培養し、３〜５代目の細胞を実験に用いた。
（ｉｉ）マウス由来の骨芽細胞
マウス由来の骨芽細胞として、ＭＣ３Ｔ３細胞株又はＳＴ２細胞株（ＲＩＫＥＮ ＣＥＬＬ ＢＡＮＫより入手）を用いた。
（ｉｉｉ）ラットの大腿骨骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭＭＳＣ）
ラットの大腿骨骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭＭＳＣ）を用いた。この細胞株は、Ｍａｎｉａｔｏｐｏｕｌｏｓらの方法（文献Ｍａｎｉａｔｏｐｏｕｌｏｓ Ｃ，Ｓｏｄｅｋ Ｊ ａｎｄ Ｍｅｌｃｈｅｒ ＡＨ：Ｂｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｏｆ ｙｏｕｎｇ ａｄｕｌｔ ｒａｔｓ．Ｃｅｌｌ ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ，２５４：３１７−３３０，１９８８）に従い、大腿骨を無菌的に摘出し、周囲軟組織を可及的に除去した。大腿骨近遠心位骨端を切断し、１５Ｓ含有ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ ａｌｐｈａ ｍｅｄｉｕｍ（αＭＥＭ；ＧＩＢＣＯ）５ｍｌを用いて、シリンジにて大腿骨骨髄組織を同培養液１０ｍｌ中に射出した。得られた組織を１５Ｓ含有αＭＥＭにて３７℃、５Ｏ２条件下で培養、３〜５代目の細胞を実験に用いた。
（ｉｖ）マウス由来のセメント芽細胞
マウス由来のセメント芽細胞として、ＯＣＣＭ３０細胞株（Ｂｏｎｅ．１９９９ Ｊｕｌ；２５（１）：３９−４７）を用いた。この細胞株は、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ大学歯学部Ｓｏｍｅｒｍａｎ教授より供与された。
（２）細胞増殖に対する本発明ペプチドの作用
２４ウエルの培養プレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に、（１）で調製したＰＤＬ細胞を５×１０３細胞／ウエルの割合で播種した。播種後１日間は１０％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で培養した。播種後１日目を０日目として、前記で製造したペプチド（ａ）を各種濃度で培養液（２％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ）に添加した。４日目および６日目に０．０８％ トリプシンと０．０４％ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有するＰＢＳを用いて細胞を剥離分散し、コールターカウンター（ＣＯＵＬＴＥＲ Ｚ１，Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社製）を用いて細胞数を計測した。
また、ペプチド（ａ）と、抗ＳＰＮ１６抗体（シースリン分子中に存在する配列番号３で示されるアミノ酸配列部分に結合する抗体；広島大学内田教授より供与）とを予め３７℃で３０分間プレインキュベートしたものについても同様に検討した。
また対照として、２％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭについても同様に検討した。
結果を図１に示す。図１中の左側の棒グラフは４日目、右側の棒グラフは６日目における結果をそれぞれ示す。図１中の「ｃｏｎｔ」は２％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭのみで培養したものを、「ＰＮ」はペプチド（ａ）のみを添加したものを、「（抗）ＰＮ」はペプチド（ａ）と抗ＳＰＮ１６抗体とのプレインキュベート産物を添加したものをそれぞれ示す。また図１中の「ｐｇ」及び「ｎｇ」は、それぞれ「ｐｇ／ｍｌ」及び「ｎｇ／ｍｌ」を示す。
この結果、ペプチド（ａ）を添加するとＰＤＬ細胞が有意に増加し、この作用は抗ＳＰＮ１６抗体（ペプチド（ａ）に結合する）によって抑制されたことから、ペプチド（ａ）には細胞増殖作用があることが示された。
また、ペプチド（ｃ）についても同様に検討した。結果を図２に示す。図２中の左側の棒グラフは４日目、右側の棒グラフは６日目における結果をそれぞれ示す。図２中の「ｃｏｎｔ」は２％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭのみで培養したものを、「ＰＣ」はペプチド（ｃ）のみを添加したものを、「（抗）ＰＣ」はペプチド（ｃ）と抗ＳＰＣ１５抗体のプレインキュベート産物を添加したものをそれぞれ示す。また図２中の「ｐｇ」及び「ｎｇ」は、それぞれ「ｐｇ／ｍｌ」及び「ｎｇ／ｍｌ」を示す。
この結果、ペプチド（ｃ）を添加するとＰＤＬ細胞が有意に増加し、この作用は抗ＳＰＣ１５抗体（ペプチド（ｃ）に結合する）によって抑制される傾向がみられたことから、ペプチド（ｃ）には細胞増殖作用があることが示された。
また、ペプチド（ａ）及び（ｂ）について、ＭＣ３Ｔ３細胞に対する細胞増殖作用を同様に検討した。結果を図３に示す。図３中の左側の棒グラフは３日目、右側の棒グラフは６日目における結果をそれぞれ示す。図３中の「ｃｏｎｔ」は２％ ＦＢＳを含有するαＭＥＭのみで培養したものを、「Ｂ」はＢＭＰ２（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ２；山之内製薬製）のみを添加したものを、「ＨＮ」はペプチド（ｂ）のみを添加したものを、「ＰＮ」はペプチド（ａ）のみを添加したものをそれぞれ示す。また図３中の「Ｂ」、「ＨＮ」及び「ＰＮ」の次に表示してある数字の単位は「ｎｇ／ｍｌ」を示す。
この結果、ペプチド（ａ）又は（ｂ）を添加すると６日目においてＭＣ３Ｔ３細胞の有意な増加がみられたことから、ペプチド（ａ）及び（ｂ）には細胞増殖作用があることが示された。
（３）細胞分化に対する本発明ペプチドの作用
細胞の分化の指標として、細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を測定した。２４ウエルの培養プレートに、５×１０３細胞／ウエルの割合で細胞を播種し、２％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ又はαＭＥＭに各種濃度のペプチド（ａ）を添加して培養した。細胞がコンフルエントに達した時点から１週間目に以下の酵素化学的方法（Ｂｅｓｓｅｙ−Ｌｏｗｒｙ法、Ｂｅｓｓｅｙ ＯＡ，Ｌｏｗｒｙ ＯＨ ａｎｄ Ｂｒｏｃｋ ＭＪ：Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｗｉｔｈ ｆｉｖｅ ｃｕｂｉｃ ｍｉｌｌｉｍｅｔｅｒ ｏｆ ｓｅｒｕｍ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１６４：３２１−３２９，１９４６）によってＡＬＰ活性を測定した。
（ＡＬＰ活性の測定方法）
培養細胞をＰＢＳで洗浄後、超音波ホモジナイザー（Ｈａｎｄｙ Ｓｏｎｉｃ ｍｏｄｅｌ ＵＲ−２０Ｐ；トミー工業製）を用いて１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、５００μｌ）中で４０秒間細胞を破砕し撹拌した。次いで、このサンプル液２５μｌをＡＬＰ緩衝液（０．１Ｍ 炭酸塩緩衝液 ｐＨ９．８、６．７ｍＭ ｐ−ニトロフェニルホスフェート、２ｍＭ ＭｇＣｌ２）１２５μｌに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。０．２Ｎ ＮａＯＨを１２５μｌを添加することによって反応を終了させた後、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ ５５０，Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を用いて４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
また、２％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ、２％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ又はαＭＥＭに各種濃度のペプチド（ｃ）を添加したものについても同様に検討した。結果を図４に示す。図４中の「ｃｏｎｔ」は２％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭのみで培養したものを、「ＰＮ」はペプチド（ａ）のみを添加したものを、「ＰＣ」はペプチド（ｃ）のみを添加したものをそれぞれ示す。また図４中の「ｐｇ」及び「ｎｇ」は、それぞれ「ｐｇ／ｍｌ」及び「ｎｇ／ｍｌ」を示す。
この結果、ペプチド（ａ）又は（ｃ）を添加するとＰＤＬ細胞のＡＬＰ活性が有意に上昇したことから、ペプチド（ａ）及び（ｃ）には細胞の分化促進作用があることが示された。
また、ペプチド（ａ）（ブタ由来）に加えて、ペプチド（ｂ）（ヒト由来）及びＢＭＰについても同様に検討した。細胞がコンフルエントに達した時点でＡＬＰ活性を測定した結果を図５に、及び、コンフルエントに達した時点から１週間目にＡＬＰ活性を測定した結果を図６にそれぞれ示す。図中の「ｃｏｎｔ」は２％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭのみで培養したものを、「Ｂ」はＢＭＰ２のみを添加したものを、「ＰＮ」はペプチド（ａ）のみを添加したものを、「ＨＮ」はペプチド（ｂ）のみを添加したものをそれぞれ示す。また図中の「Ｂ」、「ＰＮ」及び「ＨＮ」の次に表示してある数字の単位は「ｎｇ／ｍｌ」を示す。
この結果、ペプチド（ａ）又は（ｂ）を添加するとＰＤＬ細胞のＡＬＰ活性が有意に上昇した。さらにこの作用はＢＭＰ２と同等若しくはそれ以上であり、これらの結果からペプチド（ａ）及び（ｂ）には極めて高い細胞の分化促進作用があることが示された。
また、ペプチド（ａ）、（ｂ）及びＢＭＰ２について、ＳＴ２細胞及びＢＭＭＳＣ細胞を用いて同様に検討した。細胞がコンフルエントに達した時点でＡＬＰ活性を測定した結果を、それぞれ図７及び図８に示す。図中の「ｃｏｎｔ」は２％ ＦＢＳを含有するαＭＥＭのみで培養したものを、「Ｂ」はＢＭＰ２のみを添加したものを、「ＨＮ」はペプチド（ｂ）のみを添加したものを、「ＰＮ」はペプチド（ａ）のみを添加したものをそれぞれ示す。また図中の「Ｂ」、「ＨＮ」及び「ＰＮ」の次に表示してある数字の単位は「ｎｇ／ｍｌ」を示す。
この結果、ペプチド（ａ）及び（ｂ）は、ＰＤＬ細胞のみならずＳＴ２細胞及びＢＭＳＳＣ細胞に対しても有意な細胞分化促進作用を示した。またこの作用はＢＭＰ２と同等若しくはそれ以上であり、これらの結果からもペプチド（ａ）及び（ｂ）には極めて高い細胞の分化促進作用があることが示された。
また、ペプチド（ａ）及び（ｂ）について、ＭＣ３Ｔ３細胞を用いて同様に検討した。細胞がコンフルエントに達した時点でＡＬＰ活性を測定した結果を図９に、及び、コンフルエントに達した時点から１週間目にＡＬＰ活性を測定した結果を図１０にそれぞれ示す。図中の「ｃｏｎｔ」は２％ ＦＢＳを含有するαＭＥＭのみで培養したものを、「ＰＮ」はペプチド（ａ）のみを添加したものを、「ＨＮ」はペプチド（ｂ）のみを添加したものをそれぞれ示す。また図中の「ｎｇ」は、「ｎｇ／ｍｌ」を示す。
この結果、ペプチド（ａ）及び（ｂ）は、再現性よく、ＭＣ３Ｔ３細胞に対して有意な細胞分化促進作用を示した。
また、ペプチド（ａ）について、ＯＣＣＭ３０細胞を用いて同様に検討した。結果を図１１に示す。図中の「ｃｏｎｔ」は２％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭのみで培養したものを、「ＰＮ」はペプチド（ａ）のみを添加したものをそれぞれ示す。また図中の「ｎｇ」は、「ｎｇ／ｍｌ」を示す。
この結果、ペプチド（ａ）は、ＯＣＣＭ３０細胞に対しても有意な細胞分化促進作用を示した。
また、終濃度１００ｎｇ／ｍｌのペプチド（ｂ）及び（ｆ）〜（ｊ）について、ＭＣ３Ｔ３細胞株を用いて同様に検討した。結果を図１２に示す。図中の「ｃｏｎｔ」は２％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭのみで培養したものを示す。
この結果、ペプチド（ｂ）がＭＣ３Ｔ３細胞株に対して高い細胞分化促進作用を示すこと、及びペプチド（ｆ）〜（ｊ）もコントロールに比して僅かではあるが高い細胞分化促進作用を示すことが示された。
また、終濃度１００ｎｇ／ｍｌのペプチド（ｂ）及び（ｋ）〜（ｎ）について、ＳＴ２細胞株を用いて同様に検討した。結果を図１３に示す。図中の「ｃｏｎｔ」は２％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭのみで培養したものを示す。
この結果、いずれのペプチドも、ＳＴ２細胞株に対して有意に高い細胞分化促進作用を示すことが示された。これらの結果から、ペプチド（ｂ）のＮ末端及び／又はＣ末端に数個のアミノ酸残基が付加されたペプチド並びにペプチド（ｂ）中のアミノ酸残基の一部が置換されたペプチドであっても、高い細胞分化促進作用を示すことが明らかになった。
（細胞の石灰化物形成能に対するペプチドの影響）
細胞の石灰化物形成能に対するペプチドの影響を検討するために、以下の実験を行った。
細胞の石灰化能を評価するために、ダールのカルシウム染色を行った。２４ウエル培養プレートに５×１０３細胞／ウェルの割合でＰＤＬ細胞を播種し、２Ｓを含有するＤＭＥＭに各濃度のペプチド（ａ）又は（ｃ）を添加し、１０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅを加え調節した培地にて培養した。細胞がコンフルエントに達してから３週間後に、ＰＢＳで洗浄後、１０中性緩衝ホルマリンにて固定し、０．０１アリザリンレッドＳ（和光純薬）にて染色した。
この結果、ペプチド（ａ）又は（ｃ）を添加するとＰＤＬ細胞の石灰化能が有意に上昇したことから、ペプチド（ａ）及び（ｃ）には細胞の分化促進作用があることが示された。
また、ペプチド（ａ）、ＢＭＰ２及びＴＧＦβについて、ＭＣ３Ｔ３細胞を用いて同様に検討した。コンフルエントから２週間後に評価した結果、ペプチド（ａ）はＰＤＬ細胞のみならずＭＣ３Ｔ３細胞に対しても有意な細胞分化促進作用を示した。またこの作用はＢＭＰ２と同等若しくはそれ以上であり、これらの結果からもペプチド（ａ）には極めて高い細胞の分化促進作用があることが示された。
＜実施例３＞動物を用いた薬効薬理試験１
歯周病モデルに対する本発明ペプチドの作用を調べるために、以下の実験を行った。
（ｉ）歯周病モデルの作製
８週齢のＷｉｓｔａｒラットを体重１００ｇ当たり０．５ｍｌ量のカルバミル酸エチル２０溶液にて全身麻酔した後、上顎第一臼歯近心歯肉に縦切開を入れた。歯肉骨膜弁を剥離し、第一臼歯近心歯槽骨を露出させた。続いて同部の歯槽骨頂より根尖側へ、フィッシャーバーで長さ約２ｍｍ、頬舌径約１ｍｍの欠損を生食注水下に作成し、上顎第一臼歯近心根面を露出させた。露出根面に残存付着する歯周靱帯とともにセメント質ならびに象牙質表層を浅い窩洞状に削除した。
（ｉｉ）試験方法
この欠損部に、ヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量９０万）の１％ＰＢＳ溶液により調製した試料を露出根面に塗布し、歯肉骨膜弁を復位縫合した。ペプチド（ａ）を含むヒアルロン酸ナトリウムの１％ＰＢＳ溶液（ペプチド（ａ）の濃度：０．３ｍｇ／ｍｌ）を塗布した群をペプチド群とし、ヒアルロン酸ナトリウムの１％ＰＢＳ溶液のみを塗布した群（ヒアルロン酸群）、あるいはなにも塗布せずに歯肉弁を復位縫合した群（コントロール群）を対照として、術後１ヶ月の治癒形態を比較した。
（標本作製法）
クロロホルムにて動物を安楽死させた後、実験部位を摘出した。摘出した上顎骨は１０中性緩衝ホルマリンにて一日浸漬固定し、続いて急速脱灰液（Ｋ−ＣＸ）にて２日間脱灰した。常法に従ってパラフィン包埋後、実験部位について歯根長軸と平行に４．５ｍｍ厚で近遠心断切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色を施した。欠損部露出歯根面における歯周組織の付着形態や歯槽骨頂の位置を、光学顕微鏡で観察した。
（ｉｉｉ）結果（所見）
コントロール群、ヒアルロン酸群ともに上皮の根尖側移動が認められたが、ペプチド群はそれらに比較して少なかった。また、コントロール群及びヒアルロン酸群ともにセメント質及びシャーピー線維の封入を伴うセメント質の沈着はほとんどみられず、歯肉と歯根の間にはしばしば亀裂が観察された。これに対し、ペプチド群ではそのような亀裂はみられず、削除歯根表面にはシャーピー線維の封入を伴うセメント質の添加、即ち結合組織性新付着形成も観察された。また、骨再生も他の２群に比べ盛んで、高い骨再生を示した。
＜実施例４＞動物を用いた薬効薬理試験２
骨欠損モデルに対する本発明ペプチドの作用を調べるために、以下の実験を行った。
（ｉ）骨欠損モデルの作製
Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（８週齢）を体重１００ｇ当たり０．５ｍｌ量のカルバミル酸エチル２０溶液にて全身麻酔した後、左右後肢脛骨表面皮膚および脛骨骨膜に切開を入れ、骨膜を剥離して、脛骨を露出させた。続いて、生理食塩水の注水下で、同部の皮質骨を直径２ｍｍのラウンドバーで穿孔し、骨髄腔まで達する欠損（直径２ｍｍ，深さ３ｍｍ）を作製した。
（ｉｉ）試験方法
骨欠損部に、ヒアルロン酸ナトリウム製剤（商品名：アルツ（登録商標）；ヒアルロン酸ナトリウムの重量平均分子量：約９０万；ヒアルロン酸ナトリウムの濃度：１％）に溶解したペプチド（ａ）（濃度０．３ｍｇ／ｍｌ又は３ｍｇ／ｍｌ）を填入し、骨膜および皮膚を復位縫合した。ペプチドを填入した群（ペプチド群）、担体であるヒアルロン酸ナトリウムの１％ＰＢＳ溶液のみを塗布した群（ＨＡ群）又は何も塗布せずに皮膚骨膜弁を復位縫合した群（コントロール群）における、術後３週目の治癒形態をＸ線で解析した。
（ｉｉｉ）結果
各群における軟Ｘ線写真像を比較した結果、コントロール群及びＨＡ群では骨欠損の残存が比較的明瞭に観察されたが、ペプチド群（濃度０．３ｍｇ／ｍｌ又は３ｍｇ／ｍｌ）では、骨欠損がほとんど認識できない程度にまで骨が再生していることが確認された。この結果から、本発明ペプチドは、骨欠損部の骨の再生を有意に促進することが示された。
（ｉｖ）他の本発明ペプチドによる効果
同様に、コラーゲンゲル（商品名：コーケンアテロコラーゲンインプラント、株式会社高研）、ペプチド（ａ）及び（ｂ）（濃度：３ｍｇ／ｍｌ）について実験を行った。その結果、コントロール群及びコラーゲンゲル群では骨欠損の残存が比較的明瞭に観察されたが、ペプチド（ａ）のみならず（ｂ）を用いた場合であっても、骨欠損がほとんど認識できない程度にまで骨が再生していることが確認された。この結果から、本発明ペプチドは、骨欠損部の骨の再生を有意に促進することが示された。
＜実施例５＞製剤例１
以下に本発明薬剤の製剤例を示すが、これらはあくまで例示であり、本発明薬剤の剤形がこれらに限定されるものではない。
（１）軟膏剤
前記で製造したペプチド（ａ） １０ｍｇ
モノステアリン酸ソルビタン ７ｍｇ
モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン ７ｍｇ
パルミチン酸イソプロピル ３７ｍｇ
ワセリン ３７ｍｇ
流動パラフィン ３７ｍｇ
セタノール ５０ｍｇ
グリセリン ７０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
上記成分に精製水を加えて、１ｇのクリームとした。
（２）錠剤
前記で製造したペプチド（ｂ） １００ｍｇ
乳糖 ６７０ｍｇ
バレイショデンプン １５０ｍｇ
結晶セルロース ６０ｍｇ
軽質無水ケイ酸 ５０ｍｇ
上記成分を混合し、ヒドロキシプロピルセルロースを３０ｍｇをメタノールに溶解した溶液（ヒドロキシプロピルセルロース１０重量％）を加えて混練したのち造粒した。これを径０．８ｍｍのスクリーンで押し出して顆粒状にし、乾燥した後、ステアリン酸マグネシウム１５ｍｇを加え２００ｍｇづつ打錠して錠剤を得た。
（３）カプセル剤
前記で製造したペプチド（ｂ） １００ｍｇ
乳糖 ８０ｍｇ
上記成分を均一に混合し、硬カプセルに充填してカプセル剤を得た。
（４）注射剤
前記で製造したペプチド（ａ） ３０ｍｇ
上記成分を５％マンニトール水溶液２ｍＬに溶解し、これを無菌濾過した後、アンプルに入れて密封した。
（５）用時溶解用注射剤
（Ａ）前記で製造したペプチド（ｂ）（凍結乾燥体）３０ｍｇ（アンプル封入した）
（Ｂ）無菌濾過したＰＢＳ ２ｍＬ（アンプル封入した）
上記（Ａ）および（Ｂ）を１セットとして、用時溶解用注射剤を製造した。使用時には（Ａ）を（Ｂ）で溶解して用いることができる。
＜実施例６＞製造例２
以下に本発明組成物の製造例を示すが、これらはあくまで例示であり、本発明組成物の組成・形態等がこれらに限定されるものではない。
（１）液体状態の組成物
前記で製造したペプチド（ａ） ３ｍｇ
ヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量９０万）の１％ＰＢＳ溶液 １０ｍｌ
上記成分を混合することにより、液体状態の本発明組成物を製造した。
（２）液体状態の組成物
前記で製造したペプチド（ａ） ３ｍｇ
ヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量２２０万）の０．１％ＰＢＳ溶液 １０ｍｌ
上記成分を混合することにより、液体状態の本発明組成物を製造した。
（３）乾燥状態の組成物
前記で製造したペプチド（ｂ） ３０ｍｇ
ヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量９０万）の１％ＰＢＳ溶液 １０ｍｌ
上記成分を混合して凍結乾燥することにより、乾燥状態の本発明組成物を製造した。
本発明ペプチドのアミノ酸配列を保持するシースリンは、既に歯周病治療薬の一成分として利用されている。また前記の薬効薬理試験において、本発明ペプチドの添加（又は投与）期間中、細胞や動物の状態を毎日観察したが、特段の変化は認められなかった。これらのことから、本発明ペプチドや本発明薬剤の安全性が十分に推定できる。また、ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩は、既に医薬品の有効成分としても用いられていることから、本発明組成物の安全性も十分に推定できる。
【産業上の利用の可能性】
本発明ペプチドは、シースリン分子の部分ペプチドであり、シースリンに比して顕著に高い細胞増殖活性や細胞分化促進活性を示すことから、本発明薬剤、特に細胞増殖促進剤、細胞の分化促進剤、骨・軟骨若しくは歯周組織の形成促進剤又は再生促進剤の有効成分として極めて有用である。また本発明ペプチドは、再生医療等における素材としても用いることができ、この点でも極めて有用である。
さらに、本発明ペプチドは前記の通り非常に高い生物活性を示すので、本発明ペプチドを有効成分とする本発明薬剤中の有効成分量を減ずることができ、これにより安全かつ安価な本発明薬剤等を提供することができる。
本発明薬剤は、細胞増殖促進、細胞の分化促進、骨・軟骨若しくは歯周組織の形成促進又は再生促進等の種々の用途に用いることができ、極めて有用である。
本発明組成物は、ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩の物理化学的性質によって、本発明ペプチドが目的の部位に長時間保持される、あるいは目的の部位において本発明ペプチドが緩除に放出される等の効果を奏することから極めて有用である。また、本発明ペプチドの生物学的性質にヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩の生物学的性質が加わって、さらに有利な生物学的効果を奏する可能性もあることから、極めて有用である。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【技術分野】
本発明は新規な生理活性ペプチドに関する。また本発明は、この生理活性ペプチドを有効成分とする薬剤に関する。本発明のペプチド及び薬剤は、医薬等の分野で有用である。
【背景技術】
シースリン（ｓｈｅａｔｈｌｉｎ）は、エナメルマトリクスに存在するタンパク質であり、アメロブラスチン（ａｍｅｌｏｂｌａｓｔｉｎ）やアメリン（ａｍｅｌｉｎ）とも呼ばれている。既にブタ、ヒト、ウシ、マウス、ラットのシースリンのアミノ酸配列が知られている（ラット切歯由来のアメロブラスチン：Ｋｒｅｂｓｂａｃｈ ＰＨ，Ｌｅｅ ＳＫ，Ｍａｔｓｕｋｉ Ｙ，Ｋｏｚａｃｋ ＣＡ，Ｙａｍａｄａ Ｋ ａｎｄ Ｙａｍａｄａ Ｙ：Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａｍｅｌｏｂｌａｓｔｉｎ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｔｏｏｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７１：４４３１−４４３５，１９９６、ラット臼歯由来のアメリン：Ｃｅｒｎｙ Ｒ，Ｓｌａｂｙ Ｉ，Ｈａｍｍａｒｓｔｒｍ Ｌ ａｎｄ Ｗｕｉｔｚ Ｔ：Ａ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｒａｔ ａｍｅｌｏｂｌａｓｔｓ ｃｏｄｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｃｅｌｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ，１１：８８３−８９１，１９９６、ブタ由来のシースリン：Ｈｕ ＣＣ，Ｆｕｋａｅ Ｍ，Ｕｃｈｉｄａ Ｔ，Ｑｉａｎ Ｑ，Ｚｈａｎｇ ＣＨ，Ｒｙｕ ＯＨ，Ｔａｎａｂｅ Ｔ，Ｙａｍａｋｏｓｈｉ Ｙ，Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｃ，Ｄｏｈｉ Ｎ，Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｍ ａｎｄ Ｓｉｍｍｅｒ ＪＰ：Ｓｈｅａｔｈｌｉｎ：Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｃＤＮＡ／ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｃａｌｏｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎａｍｅｌ ｓｈｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ Ｄｅｎｔ Ｒｅｓ，７６：６４８−６５７，１９９７、ヒト、ウシ及びマウス由来のシースリン：Ｔｏｙｏｓａｗａ Ｓ，Ｆｕｊｉｗａｒａ Ｔ，Ｏｏｓｈｉｍａ Ｔ，Ｓｈｉｎｔａｎｉ Ｓ，Ｓａｔｏ Ａ，Ｏｇａｗａ Ｙ，Ｓｏｂｕｅ Ｓ ａｎｄ Ｉｊｕｈｉｎ Ｎ：Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ａｍｅｌｏｂｌａｓｔｉｎ ｇｅｎｅ．Ｇｅｎｅ，２５６：１−１１，２０００）。
また、シースリン（ラット由来）の２７位〜４７位のアミノ酸配列（配列番号６に相当）を認識する抗体が開示されている（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５（１０），ｐ１３２９−１３４０（１９９７）。しかし当該文献の開示は、ある特定の抗体がこのようなアミノ酸配列を認識するということに止まり、このようなアミノ酸配列からなるペプチド自体を製造したり、このペプチドを医薬用途等に使用したりすることについての開示や示唆はない。
また、アメリンに由来するテトラペプチドや、アメリンの各種医薬用途（歯周病の治療や予防、歯の病変の修復、骨要素の結合、硬組織の無機質化の促進や誘発、インプラントの骨への効果的な取り込み、インプラント器具等の生体適合性の改善等）が報告されている（特表平１１−５１０３７７号公報）。しかしながら、後述する本発明ペプチドやその医薬用途等についての開示や示唆はない。
【発明の開示】
シースリンについては前記のような種々の医薬用途が知られているが、生物活性を有するシースリン内部のアミノ酸配列が特定され、そのアミノ酸配列からなるペプチドが取得できれば、シースリンの生物活性をより効果的に発揮できる医薬素材をより安価に提供することができる。
本発明は上記観点からなされたものであり、生物活性を有するシースリン由来のペプチド、及び当該ペプチドを有効成分とする医薬を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、生物活性を有するシースリン内部のアミノ酸配列を特定し、このアミノ酸配列からなるペプチドを製造し、そのペプチドが種々の生物活性を示すことを見出して、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、下記のアミノ酸配列（配列番号１）からなるペプチド（以下、「本発明ペプチド−Ｎ」という）を提供する。
（但し、Ｘ０１はＶａｌ又はＧｌｎを、Ｘ０２はＡｌａ、Ｐｈｅ又はＧｌｙを、Ｘ０３はＰｈｅ又はＬｅｕを、Ｘ０４はＰｒｏ又はＬｙｓを、Ｘ０５はＡｒｇ、Ｇｌｎ又はＰｒｏを、Ｘ０６はＧｌｎ、Ａｒｇ又はＰｈｅを、Ｘ０７はＰｒｏ、Ｓｅｒ又はＬｅｕを、Ｘ０８はアミノ酸残基が存在しないこと又はＧｌｙ若しくはＧｌｎを、Ｘ０９はアミノ酸残基が存在しないこと又はＡｌａ、Ｇｌｙ若しくはＰｒｏを、Ｘ１０はアミノ酸残基が存在しないこと又はＧｌｎ若しくはＴｈｒを、Ｘ１１はアミノ酸残基が存在しないこと又はＧｌｙ若しくはＡｌａを、Ｘ１２はアミノ酸残基が存在しないこと又はＭｅｔ若しくはＡｌａを、Ｘ１３はＧｌｙ、Ａｌａ又はＴｈｒを、Ｘ１４はＴｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ又はＧｌｙを、Ｘ１５はＰｒｏ又はＶａｌを、Ｘ１６はＧｌｙ又はＧｌｎを、Ｘ１７はＶａｌ、Ｍｅｔ又はＧｌｙを、Ｘ１８はＡｌａ又はＴｈｒを、Ｘ１９はＳｅｒ又はＰｒｏを、Ｘ２０はＬｅｕ又はＧｌｎをそれぞれ示す。）
本発明ペプチド−Ｎは、下記のアミノ酸配列（配列番号２）からなるものであることが好ましい。
（但し、Ｘ２１はＡｌａ又はＰｈｅを、Ｘ２２はＡｒｇ又はＧｌｎを、Ｘ２３はＰｒｏ又はＳｅｒを、Ｘ２４はＴｈｒ又はＩｌｅを、Ｘ２５はＶａｌ、Ｍｅｔ又はＧｌｙをそれぞれ示す。）
本発明ペプチド−Ｎは、下記（Ａ）〜（Ｇ）のいずれかのアミノ酸配列からなるものであることが好ましい。
なかでも、上記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｇ）のアミノ酸配列からなるものが好ましい。
また本発明は、下記のアミノ酸配列（配列番号１３）からなるペプチド（以下、「本発明ペプチド−Ｃ」という）を提供する。
（但し、Ｘ２６はＡｌａ又はＶａｌを、Ｘ２７はＧｌｎ又はＨｉｓを、Ｘ２８はＧｌｎ又はＧｌｕを、Ｘ２９はＩｌｅ、Ｍｅｔ又はＶａｌを、Ｘ３０はアミノ酸が存在しないこと又はＬｙｓ若しくはＭｅｔを、Ｘ３１はＡｒｇ又はＨｉｓを、Ｘ３２はＡｓｐ又はＡｓｎをそれぞれ示す。）
本発明ペプチド−Ｃは、下記のアミノ酸配列（配列番号１４）からなるものであることが好ましい。
（但し、Ｘ３３はＧｌｎ又はＧｌｕを、Ｘ３４はＩｌｅ又はＭｅｔを、Ｘ３５はＬｙｓ又はＭｅｔを、Ｘ３６はＡｒｇ又はＨｉｓをそれぞれ示す。）
本発明ペプチド−Ｃは、下記（Ｈ）〜（Ｋ）のいずれかのアミノ酸配列からなるものであることが好ましい。
なかでも、上記（Ｈ）又は（Ｉ）のアミノ酸配列からなるものが好ましい。
以下、本発明ペプチド−Ｎ及び本発明ペプチド−Ｃをまとめて、単に「本発明ペプチド」という。
また本発明は、本発明ペプチドを有効成分とする薬剤（以下、「本発明薬剤」という）を提供する。本発明薬剤は医薬であることが好ましい。
また本発明薬剤は細胞増殖促進剤又は細胞の分化促進剤であることも好ましい。増殖や分化を促進する対象となる「細胞」は、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞又は歯根膜由来細胞であることが好ましい。
また本発明薬剤は、骨若しくは軟骨の形成促進剤もしくは再生促進剤、又は歯周組織の形成促進剤もしくは再生促進剤であることも好ましい。
また本発明は、本発明ペプチドと、ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩とを少なくとも含むことを特徴とする組成物（以下、「本発明組成物」という）を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明ペプチド−Ｎ（ブタ由来）の、ＰＤＬ細胞（ヒト由来）に対する増殖促進作用を示す図である。
図２は、本発明ペプチド−Ｃ（ブタ由来）の、ＰＤＬ細胞（ヒト由来）に対する増殖促進作用を示す図である。
図３は、本発明ペプチド−Ｎ（ブタ由来及びヒト由来）の、ＭＣ３Ｔ３細胞（マウス由来）に対する増殖促進作用を示す図である。
図４は、本発明ペプチド−Ｎ及び本発明ペプチド−Ｃブタ由来）の、ＰＤＬ細胞（ヒト由来）に対する分化促進作用を示す図である。
図５は、本発明ペプチド−Ｎ（ブタ由来及びヒト由来）の、ＰＤＬ細胞（ヒト由来）に対する分化促進作用を示す図である。
図６は、本発明ペプチド−Ｎ（ブタ由来及びヒト由来）の、ＰＤＬ細胞（ヒト由来）に対する分化促進作用を示す図である。
図７は、本発明ペプチド−Ｎ（ブタ由来及びヒト由来）の、ＳＴ２細胞（マウス由来）に対する分化促進作用を示す図である。
図８は、本発明ペプチド−Ｎ（ブタ由来及びヒト由来）の、ＢＭＳＳＣ細胞（ラット由来）に対する分化促進作用を示す図である。
図９は、本発明ペプチド−Ｎ（ブタ由来及びヒト由来）の、ＭＣ３Ｔ３細胞（マウス由来）に対する分化促進作用を示す図である。
図１０は、本発明ペプチド−Ｎ（ブタ由来及びヒト由来）の、ＭＣ３Ｔ３細胞（マウス由来）に対する分化促進作用を示す図である。
図１１は、本発明ペプチド−Ｎ（ブタ由来）の、ＯＣＣＭ３０細胞（マウス由来）に対する分化促進作用を示す図である。
図１２は、本発明ペプチド（欠失を加えたもの；ヒト由来）の、ＭＣ３Ｔ３細胞（マウス由来）に対する分化促進作用を示す図である。
図１３は、本発明ペプチド（数アミノ酸を付加又は置換したもの；ヒト由来）の、ＳＴ２細胞（マウス由来）に対する分化促進作用を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明ペプチド
（１）本発明ペプチド−Ｎ
本発明ペプチド−Ｎは、下記のアミノ酸配列（配列番号１）からなるペプチドである。本発明ペプチド−Ｎは、シースリンタンパク質のＮ末端側に存在するアミノ酸配列をもとに設計されたものである。
上記アミノ酸配列において、Ｘ０１〜Ｘ２０は、下記のアミノ酸残基を示す。
Ｘ０１：Ｖａｌ又はＧｌｎ
Ｘ０２：Ａｌａ、Ｐｈｅ又はＧｌｙ
Ｘ０３：Ｐｈｅ又はＬｅｕ
Ｘ０４：Ｐｒｏ又はＬｙｓ
Ｘ０５：Ａｒｇ、Ｇｌｎ又はＰｒｏ
Ｘ０６：Ｇｌｎ、Ａｒｇ又はＰｈｅ
Ｘ０７：Ｐｒｏ、Ｓｅｒ又はＬｅｕ
Ｘ０８：アミノ酸残基が存在しない、又はＧｌｙ若しくはＧｌｎ
Ｘ０９：アミノ酸残基が存在しない、又はＡｌａ、Ｇｌｙ若しくはＰｒｏ
Ｘ１０：アミノ酸残基が存在しない、又はＧｌｎ若しくはＴｈｒ
Ｘ１１：アミノ酸残基が存在しない、又はＧｌｙ若しくはＡｌａ
Ｘ１２：アミノ酸残基が存在しない、又はＭｅｔ若しくはＡｌａ
Ｘ１３：Ｇｌｙ、Ａｌａ又はＴｈｒ
Ｘ１４：Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ又はＧｌｙ
Ｘ１５：Ｐｒｏ又はＶａｌ
Ｘ１６：Ｇｌｙ又はＧｌｎ
Ｘ１７：Ｖａｌ、Ｍｅｔ又はＧｌｙ
Ｘ１８：Ａｌａ又はＴｈｒ
Ｘ１９：Ｓｅｒ又はＰｒｏ
Ｘ２０：Ｌｅｕ又はＧｌｎ
本発明ペプチド−Ｎには、下記のアミノ酸配列（配列番号２）からなるペプチドが包含される。
上記アミノ酸配列において、Ｘ２１〜Ｘ２５は、下記のアミノ酸残基を示す。
Ｘ２１：Ａｌａ又はＰｈｅ
Ｘ２２：Ａｒｇ又はＧｌｎ
Ｘ２３：Ｐｒｏ又はＳｅｒ
Ｘ２４：Ｔｈｒ又はＩｌｅ
Ｘ２５：Ｖａｌ、Ｍｅｔ又はＧｌｙ
そして本発明ペプチド−Ｎは、具体的には、下記（Ａ）〜（Ｇ）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドであることが好ましい。
（２）本発明ペプチド−Ｃ
本発明ペプチド−Ｃは、下記のアミノ酸配列（配列番号１３）からなるペプチドである。本発明ペプチド−Ｃは、シースリンタンパク質のＣ末端側に存在するアミノ酸配列をもとに設計されたものである。
上記アミノ酸配列において、Ｘ２６〜Ｘ３２は、下記のアミノ酸残基を示す。
Ｘ２６：Ａｌａ又はＶａｌ
Ｘ２７：Ｇｌｎ又はＨｉｓ
Ｘ２８：Ｇｌｎ又はＧｌｕ
Ｘ２９：Ｉｌｅ、Ｍｅｔ又はＶａｌ
Ｘ３０：アミノ酸が存在しない、又はＬｙｓ若しくはＭｅｔ
Ｘ３１：Ａｒｇ又はＨｉｓ
Ｘ３２：Ａｓｐ又はＡｓｎ
本発明ペプチド−Ｃは、下記のアミノ酸配列（配列番号１４）からなるものであることが好ましい。
上記アミノ酸配列において、Ｘ３３〜Ｘ３６は、下記のアミノ酸残基を示す。
Ｘ３３：Ｇｌｎ又はＧｌｕ
Ｘ３４：Ｉｌｅ又はＭｅｔ
Ｘ３５：Ｌｙｓ又はＭｅｔ
Ｘ３６：Ａｒｇ又はＨｉｓ
そして本発明ペプチド−Ｃは、具体的には、下記（Ｈ）〜（Ｋ）のいずれかのアミノ酸配列からなるものであることが好ましい。
（３）本発明ペプチドの製造
本発明ペプチドは、そのアミノ酸配列が本発明により開示されたので、その配列に基づいてペプチドの公知の化学合成法（例えば液相合成法や固相合成法等；泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇 道典、「ペプチド合成の基礎と実験」１９８５、丸善（株）参照）により製造することが可能である。例えば、前記（Ａ）（配列番号３）のアミノ酸配列からなるペプチドを固相合成法で製造する場合には、アミノ酸配列のＣ末端（１６位）がロイシン残基であるから、α−アミノ基（Ｎα）−保護−ロイシンのカルボキシル基を直接、或いは場合によってはスペーサーを介して、クロロメチル基あるいはオキシメチル基を有する不溶性樹脂に結合させた後、Ｎα−保護基を除去し、アミノ酸配列の１５位から１位までの各保護アミノ酸（Ｎα−及び側鎖官能基保護アミノ酸を、単に「保護アミノ酸」と略称する）を固相合成法に従って順次結合し、次いで不溶性樹脂およびアミノ酸のＮα−及び側鎖官能基の保護基を脱離させて、前記（Ａ）（配列番号３）のアミノ酸配列からなるペプチドを得ることができる。
本発明ペプチドを合成する場合に使用される前記のクロロメチル基あるいはオキシメチル基を有する不溶性樹脂及びスペーサー、場合により保護アミノ酸を該不溶性樹脂に結合した保護アミノ酸樹脂等は、公知の方法で調製でき、各種のものが市販されている。
前記不溶性樹脂としては、Ｃ末端の保護アミノ酸のカルボキシル基と直接、或いは場合によりスペーサーを介して、結合可能であり、かつ、その後脱離可能なものであれば如何なるものでもよい。かかる不溶性樹脂としては、例えば、Ｂｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）ストラテジーの場合は、クロロメチル樹脂（クロロメチル化スチレン−ジビニルベンゼン共重合体）、オキシメチル樹脂あるいはスペーサーを導入した４−オキシメチル−Ｐａｍ（フェニルアセタミドメチル）−樹脂が、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）ストラテジーの場合は、オキシメチルフェノキシメチル樹脂（Ｗａｎｇ樹脂）及びこれらの誘導体等が好ましい。
保護アミノ酸とは、官能基を公知の方法により保護基で保護したアミノ酸であり、各種の保護アミノ酸が市販されている。
保護アミノ酸の結合は、通常の縮合法、例えば、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）法、ＤＩＰＣＤＩ（ジイソプロピルカルボジイミド）法［Ｔａｒｔａｒ，Ａ．ら；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４４、５０００（１９７９）］、活性エステル法、混合あるいは対称酸無水物法、カルボニルジイミダゾール法、ＤＣＣ−ＨＯＮＳｕ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）法［Ｗｅｙｇａｎｄ，Ｆ．ら、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．，Ｂ，２１，４２６（１９６６）］、ＤＣＣ−ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）法［Ｋｏｅｎｉｇ，Ｗ．ら；Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，１０３、７８８、２０２４、２０３４（１９７０）］、ジフエニルホスホリルアジド法、ＢＯＰ試薬（ベンゾトリアゾリル−Ｎ−ヒドロキシトリスジメチルアミノホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩）を用いるＢＯＰ−ＨＯＢｔ法（Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５３，６１７（１９８８））、ＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート）−ＨＯＢｔ法（Ｋｎｏｒｒ，Ｒ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３０，１９２７（１９８９））、ＴＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレイト）−ＨＯＢｔ法（Ｋｎｏｒｒ，Ｒ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３０，１９２７（１９８９））等に従って行なうことができる。これらのうち、ＤＣＣ法、ＤＣＣ−ＨＯＢｔ法、ＢＯＰ−ＨＯＢｔ法、ＨＢＴＵ−ＨＯＢｔ法、対称酸無水物法が好ましい。
これらの縮合反応は、通常、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）等の有機溶媒又はそれらの混合溶媒中で行なわれる。
α−アミノ基の保護基の脱離試薬としては、トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン、ＨＣｌ／ジオキサン、ピペリジン／ＤＭＦ又はピペリジン／ＮＭＰ等が用いられ、保護基の種類により適宜選択することができる。
また、合成の各段階における縮合反応の進行の程度はＥ．カイサーらの方法［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３４，５９５（１９７０）］（ニンヒドリン反応法）によって検査することができる。
以上のようにして、所望のアミノ酸配列を有する保護ペプチド樹脂を得ることができる。
保護ペプチド樹脂は、フッ化水素、ＴＦＭＳＡ（トリフルオロメタンスルホン酸）［Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ発行、Ｅ．Ｇｒｏｓｓ編集、Ｙａｊｉｍａ，Ｈら；”Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”５、６５（１９８３）］、ＴＭＳＯＴｆ（トリメチルシリルトリフラート）［Ｆｕｊｉｉ，Ｎ．ら；Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２７４（１９８７）］、ＴＭＳＢｒ（トリメチルシリルブロミド）［Ｆｕｊｉｉ，Ｎ．ら；Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３５、３８８０（１９８７）］、またはトリフルオロ酢酸などで処理することにより、該樹脂および保護基を同時に脱離させることができる。上記の脱離試薬は、用いたストラテジー（Ｂｏｃ又はＦｍｏｃ）、樹脂および保護基の種類により適宜選択することができる。これら一連の方法によって本発明ペプチドを製造することができる。
また本発明ペプチドのアミノ酸配列に対応するポリヌクレオチド（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）を製造し、当該ポリヌクレオチドを用いた遺伝子工学的手法によっても本発明ペプチドを製造することができる。
製造したペプチドは、タンパク質化学の分野において一般に知られているタンパク質の単離、精製方法によって精製することができる。具体的には、例えば抽出、再結晶、硫酸アンモニウム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法、向流分配等や、これらの任意の組合せ等の処理操作が挙げられるが、逆相高速液体クロマトグラフィーによる方法が効果的である。
製造された本発明ペプチドは、例えば塩酸やメタンスルホン酸等の酸で加水分解して公知の方法でアミノ酸組成を調べることができ、これによって本発明ペプチドが正しく製造されたか否かを推定することができる。
より厳密には、製造されたペプチドのアミノ酸配列を、公知のアミノ酸配列決定法（例えばエドマン分解法等）により決定し、本発明ペプチドが正しく製造されたか否かを確認することができる。
なお、本発明ペプチドには塩の形態のものも包含される。後述するように、本発明ペプチドは医薬用途としても有用であることから、本発明ペプチドの塩は、医学的に許容される塩であることが好ましい。
本発明ペプチドは、酸付加により塩を形成しうる。このような塩としては、例えば無機酸（塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸など）または有機カルボン酸（酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、サリチル酸、トリフルオロ酢酸など）、グルクロン酸、ガラクツロン酸、グルコン酸、アスコルビン酸等の酸性糖、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩類、ヘパラン硫酸、ヘパリン、６位脱硫酸化ヘパリン、２位脱硫酸化ヘパリン、Ｎ−脱硫酸化ヘパリン、アルギン酸等の酸性多糖、または有機スルホン酸（メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸など）等が例示される。これらの塩のうち、医学的に許容される塩が好ましい。
また本発明ペプチドは、塩基性物質との塩を形成しうる。このような塩としては、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、又はジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩等の有機塩基との塩のうち、医学的に許容される塩が例示される。
また、本発明ペプチドを修飾したペプチドも本発明ペプチドに包含される。このようなペプチドとしては、例えばα−アミノ基やα−カルボキシル基を修飾したペプチドや、側鎖官能基を修飾したペプチド等が挙げられる。修飾としては、ペプチド化学の分野で一般的に用いられる修飾基や保護基による修飾、また光学異性体であるＤ−アミノ酸等による置換が挙げられる。
本発明ペプチド−Ｎのうち、前記（Ａ）〜（Ｇ）のアミノ酸配列の関係を表１に示す。また本発明ペプチド−Ｃのうち、前記（Ｈ）〜（Ｋ）のアミノ酸配列の関係を表２に示す。アミノ酸残基は１文字記号で示した。またアミノ酸配列中の「−」はアミノ酸残基が存在していないことを示す。例えば（Ａ）についてみると、この第８番目のアミノ酸残基は「Ｐ」であり、これがペプチド結合を介して第９番目のアミノ酸残基（Ｇ）と結合し、全体として１６アミノ酸残基からなるペプチドを形成していることを示す。また、それぞれのアミノ酸配列を有するシースリン分子を保持する動物（由来）も併せて示した。
本発明ペプチドは、後述する実施例の記載から明らかなように、細胞増殖促進作用や細胞分化促進作用、特に骨芽細胞や歯根膜細胞等の細胞増殖促進作用や細胞分化促進作用を有することから、以下に詳述するような細胞増殖促進剤、細胞の分化促進剤、骨若しくは軟骨の形成促進剤又は再生促進剤、歯周組織の形成促進剤又は再生促進剤等の薬剤の有効成分として用いることができる。
＜２＞本発明薬剤
本発明薬剤は、本発明ペプチド（本発明ペプチド−Ｎ及び／又はペプチド−Ｃ）を有効成分とする薬剤である。本発明薬剤は、医薬であってもよく、実験や試験用の試薬であってもよいが、医薬であることが好ましい。
本発明薬剤は細胞増殖促進剤又は細胞の分化促進剤であることが好ましい。増殖や分化の促進の対象となる「細胞」は、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞又は歯根膜由来細胞であることが好ましい。この細胞増殖促進剤や細胞分化促進剤は、その有効成分である本発明ペプチドの作用によって優れた細胞増殖促進作用や細胞分化促進作用を発揮する。
また本発明薬剤は、このような本発明ペプチドの作用を利用して、骨若しくは軟骨の形成促進剤又は再生促進剤や、歯周組織の形成促進剤又は再生促進剤とすることもできる。
本発明薬剤の有効成分として用いる本発明ペプチドは、前記の「＜１＞本発明ペプチド」と同様である。
特に下記（Ａ）〜（Ｇ）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。
特に（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｇ）のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。
また、下記（Ｈ）〜（Ｋ）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドも好ましい。
特に（Ｈ）又は（Ｉ）のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。
本発明薬剤を構成する本発明ペプチドは、単一種類であってもよく、複数種類であってもよい。
本発明薬剤の有効成分である本発明ペプチドの純度は、本発明薬剤の目的に応じて適宜設定することができる。例えば本発明薬剤を医薬とする場合には、高純度に精製され、医薬として混入が許されない物質を実質的に含まない本発明ペプチドを用いることが好ましい。
本発明薬剤を医薬とする場合、その目的に応じて、注射（皮下、皮内、静脈内、腹腔内等）、点眼、点入、埋入、経皮、経口、吸入等、適宜投与方法を選択することができる。また投与方法に応じて注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化剤、軟膏剤、ゲル剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤、点眼剤、眼軟膏剤、座剤、ペッサリー等の剤形を適宜選択し、製剤化することができる。
本発明薬剤を医薬とする場合、そのエンドトキシン濃度は、溶液形態の剤とした場合においては０．３ＥＵ／ｍＬ以下であることが好ましい。エンドトキシン濃度は、当業者に周知慣用のエンドトキシン測定法を用いて測定することができるが、カブトガニ・アメボサイト・ライセート成分を用いるリムルス試験法が好ましい。なおＥＵ（エンドトキシン単位）は、日本工業規格生化学試薬通則（ＪＩＳ Ｋ８００８）、又は米国薬局方等に従って測定・算出できる。
また本発明薬剤には、本発明ペプチドに悪影響を与えず、かつ、本発明の効果に悪影響を与えない限りにおいて、他の医薬活性成分（例えば、ヒアルロン酸）や、慣用の安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤等、通常医薬に用いられる成分を使用することができる。
本発明薬剤を医薬とする場合、その投与量は、投与の目的（予防、維持（悪化防止）、軽減（症状の改善）または治療）、疾患の種類、患者の症状、性別、年令、体重、投与部位、投与方法等によって個別に設定されるべきものであり特に限定されないが、成人１人１回あたり概ね、本発明ペプチドとして１ｐｇ／投与部位〜３０ｍｇ／投与部位程度を投与することができる。また投与間隔は、例えば１日１回程度であってもよく、１日２〜３回に分けてもよく、１〜３日に１回程度であってもよい。
本発明薬剤を医薬とする場合、これが投与される動物も特に限定されないが、脊椎動物が好ましく、哺乳動物がより好ましく、ヒトが特に好ましい。
本発明薬剤を医薬とする場合、それぞれの用途に応じて、例えば以下のような動物に投与することができる。
細胞増殖促進剤として用いる場合には、細胞の増殖が望まれている状態にある動物に対して投与することができる。特に、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞又は歯根膜由来細胞の増殖が望まれている状態にある動物に投与されることが好ましい。このような細胞の増殖が望まれている状態としては、例えば歯周疾患、骨折、骨欠損、骨粗鬆症、関節疾患、整形外科的疾患（離断性骨軟骨炎、変形性膝関節症など）、腫瘍等に罹患している場合や、歯科治療（歯周治療など）、整形外科治療（培養細胞移植術、骨穿孔術、骨軟骨柱移植術など）、腫瘍摘出術による骨移植、骨補填が施された直後の状態等が例示される。
細胞の分化促進剤として用いる場合には、細胞の分化が望まれている状態にある動物に対して投与することができる。特に、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞又は歯根膜由来細胞の分化が望まれている状態にある動物に投与されることが好ましい。このような細胞の分化が望まれている状態の例示は、前記の細胞増殖促進剤における場合と同様である。
骨若しくは軟骨の形成促進剤又は再生促進剤として用いる場合には、骨若しくは軟骨の形成促進又は再生促進が望まれている状態にある動物に対して投与することができる。骨若しくは軟骨の形成促進又は再生促進が望まれている状態の例示は、前記の細胞増殖促進剤における場合と同様である。
歯周組織の形成促進剤又は再生促進剤として用いる場合には、歯周組織の形成促進又は再生促進が望まれている状態にある動物に対して投与することができる。歯周組織の形成促進又は再生促進が望まれている状態の例示は、前記の細胞増殖促進剤における場合と同様である。
また、本発明ペプチドを適当な不溶性担体の表面に固着させたり、適当な素材と混合したりすることによって、細胞増殖の促進や細胞の分化促進、骨組織・軟骨組織や歯周組織の形成促進又は再生促進、生体適合性の改善等を目的とする薬剤としてもよい。このような不溶性担体又は素材としては、ビーズ、フィルム、プレート、モノフィラメント、不織布、スポンジ、織物、編物、短繊維、チューブ、中空糸等をはじめとする種々の形状のものを使用できる。具体的には、医用複合材料としてインプラント、骨セメント、骨補填剤、根管充填剤、骨折プレート、人工関節等に用いることができる。本発明ペプチドは、再生医療分野における薬剤として応用することもできる。
このような素材の表面に本発明ペプチドを固着させる場合、その固着方法も特に限定されず、物理的吸着法、イオン結合法、共有結合法、包括法など固定化酵素の調製法として一般的な方法（固定化酵素、１９７５年、講談社発行、第９〜７５頁参照）を利用することができる。
例えばポリスチレン系やポリプロピレン系の不溶性担体には、物理的に本発明ペプチドを固着させることができる。また、例えばポリアミド系、セルロース系、アガロース系、ポリアクリルアミド系、デキストラン系、ビニルポリマー系の不溶性担体には、化学的に本発明ペプチドを固着させることができる。化学的な固着（結合）方法としては、不溶性担体の芳香族アミノ基を利用してジアゾカップリングさせるジアゾ化法、不溶性担体の水酸基をＣＮＢｒで活性化してペプチド結合させるＣＮＢｒ法、不溶性担体のヒドラジン誘導体等を用いてペプチド結合させる酸アジド法、ハロゲン等の反応性に富む不溶性担体の官能基を利用してペプチドをアルキル化するアルキル化法、グルタルアルデヒドのような遊離のアミノ基と反応する架橋試薬によって不溶性担体とペプチドの遊離のアミノ基との間を架橋する方法、カルボジイミド法、エポキシ活性化法、さらにこれらの方法を用いてスペーサーを介して結合させる方法等が挙げられる。これらの公知の結合法から、不溶性担体の種類に応じて適宜選択して本発明ペプチドの結合に利用することができる。
また、本発明薬剤を実験や試験用の試薬として用いる場合は、用途に応じて、本発明ペプチドはそのまま使用してもよく、他の成分と混合して用いてもよい。
＜３＞本発明組成物
本発明組成物は、本発明ペプチド（本発明ペプチド−Ｎ及び／又はペプチド−）Ｃと、ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩とを少なくとも含むことを特徴とする組成物である。
本発明組成物の構成成分である本発明ペプチドは、前記の「＜１＞本発明ペプチド」と同様である。
特に下記（Ａ）〜（Ｇ）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。
特に（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｇ）のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。
また、下記（Ｈ）〜（Ｋ）のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドも好ましい。
特に（Ｈ）又は（Ｉ）のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。
本発明組成物を構成する本発明ペプチドは、単一種類であってもよく、複数種類であってもよい，
本発明組成物の構成成分である「ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩」の由来は特に限定されない。例えば、鶏冠、臍帯、ヒアルロン酸を産生する微生物等から分離、精製されたヒアルロン酸や、合成（例えば化学合成法や酵素合成法）によって製造されたヒアルロン酸のいずれをも用いることができる。ヒアルロン酸の分子サイズも特に限定されない。一例として、重量平均分子量６０万〜１２０万のヒアルロン酸が例示される。例えば、分子量８０万〜１００万程度のヒアルロン酸が好ましい例である。
「ヒアルロン酸の薬学的に許容される塩」としては、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、またはジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩のうち、薬学的に許容される塩を用いることができる。なかでもナトリウム塩であることが好ましい。
本発明ペプチドと、このような「ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩」を適宜混合することにより、本発明組成物を製造することができる。これら両者の混合比（組成物中の含有比率）も特に限定されない。尚、「本発明ペプチドと、ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩とを少なくとも含む」とは、本発明のペプチドとして、ヒアルロン酸付加塩を用いる場合を含む。
本発明組成物は、溶液状態、凍結状態、乾燥状態（凍結乾燥状態等）のいずれの状態であってもよい。
本発明組成物中の不純物含量等も、使用目的に応じて適宜設定すればよく、特に限定されないが、医薬として混入が許されない物質を実質的に含まないものが好ましい。
例えば、本発明組成物中のエンドトキシン濃度は、本発明組成物を溶液状態とした場合において０．３ＥＵ／ｍＬ以下であることが好ましい。本発明組成物中のエンドトキシン濃度は、前記と同様に当業者に周知慣用のエンドトキシンの測定法を用いて測定・算出することができる。また、鉄含量は２０ｐｐｍ以下であることが好ましい。
また本発明組成物には、本発明ペプチドに悪影響を与えず、かつ、本発明の効果に悪影響を与えない限りにおいて、他の医薬活性成分（例えば、ヒアルロン酸）や、慣用の安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤等、通常医薬に用いられる成分を使用することもできる。
このような本発明組成物は、医療用途に用いられることが好ましい
本発明組成物を医薬とする場合、前記本発明薬剤を医薬に用いるのと同様の用途に使用することができるが、特に、本発明ペプチドをある程度保持させる必要のある疾患、例えば歯周疾患、骨折、骨欠損、関節疾患、整形外科的疾患等の当該疾患部位に対してや、椎間融合術の際等に使用されることが好ましい。
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
＜実施例１＞本発明ペプチドの製造
株式会社ペプチド研究所に委託し、下記（ａ）〜（ｅ）のペプチドを固相合成法により製造した。（ａ）はシースリンタンパク質（ブタ由来）のＮ末端側に存在するアミノ酸配列をもとに、（ｂ）はシースリンタンパク質（ヒト由来）中の（ａ）に対応する部分のアミノ酸配列をもとに、（ｃ）はシースリンタンパク質（ブタ由来）のＣ末端側に存在するアミノ酸配列をもとに、（ｄ）及び（ｅ）はいずれもシースリンタンパク質（ブタ由来）のＮ末端側とＣ末端側の中間領域に存在するアミノ酸配列をもとにそれぞれデザインしたペプチドである。ペプチド（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）が本発明ペプチドに相当する。
製造したペプチド（ａ）及び（ｂ）のアミノ酸分析結果（加水分解条件：６Ｎ ＨＣｌ、１１０℃、２２時間）を以下に示す。カッコ内の数字は理論値を示す。
ペプチド（ａ）：Ｔｈｒ（１）０．９４，Ｓｅｒ（１）０．８９，Ｇｌｕ（１）１．００，Ｇｌｙ（２）２．０５，Ａｌａ（２）２．０７，Ｖａｌ（２）２．０１，Ｌｅｕ（１）１．０２，Ｐｈｅ（１）０．９９，ＮＨ２（１）１．１３，Ａｒｇ（１）０．９８，Ｐｒｏ（４）４．００
ペプチド（ｂ）：Ｔｈｒ（１）０．９４，Ｓｅｒ（２）１．７７，Ｇｌｕ（２）２．００，Ｇｌｙ（２）１．９７，Ａｌａ（１）１．００，Ｖａｌ（１）０．９７，Ｍｅｔ（１）０．９８，Ｌｅｕ（１）０．９９，Ｐｈｅ（２）１．９６，ＮＨ２（２）２．１２，Ｐｒｏ（３）２．９９
また、製造したペプチド（ａ）及び（ｂ）の純度の検定結果（高速液体クロマトグラフィーにより算出）を以下に示す。いずれのペプチドも、高速液体クロマトグラフィー（逆相クロマトグラフィー）の溶出パターンで単一のピークが認められた。
ペプチド（ａ）：９７．３％
ペプチド（ｂ）：９６．４％
なお、高速液体クロマトグラフィーの条件は下記の通りである。
・カラム ：Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ１８（４．６ｍｍＩ．Ｄ．ｘ １５０ｍｍ）（アジュレント社製）
・溶離液 ：１０〜６０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸（２５分）
・流速 ：１．０ｍＬ／分
・温度 ：ペプチド（ａ）については２５℃、ペプチド（ｂ）については５０℃。
・検出波長：２２０ｎｍ
また、製造したペプチド（ａ）及び（ｂ）の分子量を、エレクトロスプレーイオン化マススペクトロメトリー（ＥＳＩ−ＭＳ）によって分析した結果を以下に示す。
ペプチド（ａ）：１５９３．６（理論値：１５９３．８）
ペプチド（ｂ）：１６６３．６（理論値：１６６３．９）
以上の結果から、ペプチド（ａ）及び（ｂ）が正しく製造されていることが示された。
また、製造したペプチド（ｃ）〜（ｅ）についても同様に分析した結果、いずれも純度が９８．０％以上で、高速液体クロマトグラフィー（逆相クロマトグラフィー）において単一ピークを示し、アミノ酸分析値及び分子量も理論値とよく一致することが示された。このことから、ペプチド（ｃ）〜（ｅ）についても正しく製造されていることが示された。なお製造した（ａ）〜（ｅ）のペプチドは、いずれも白色の凍結乾燥体であった。
また、上記ペプチド（ｂ）の一部を欠いたペプチド（下記（ｆ）〜（ｊ）のペプチド）、上記ペプチド（ｂ）のＮ末端及び／又はＣ末端に数アミノ酸残基が付加されたペプチド（下記（ｋ）〜（ｍ）のペプチド）、及び上記ペプチド（ｂ）中の一部のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたペプチド（下記（ｎ）のペプチド）を、前記と同様に固相合成法により製造した。ペプチド（ｎ）が本発明ペプチドに相当する。
製造したペプチド（ｆ）〜（ｎ）についても同様に分析した結果、いずれも純度が９８．０％以上で、高速液体クロマトグラフィー（逆相クロマトグラフィー）において単一ピークを示し、アミノ酸分析値及び分子量も理論値とよく一致することが示された。このことから、ペプチド（ｆ）〜（ｎ）についても正しく製造されていることが示された。なお製造した（ｆ）〜（ｎ）のペプチドも、いずれも白色の凍結乾燥体であった。
＜実施例２＞細胞を用いた薬効薬理試験
（１）細胞の調製
（ｉ）ヒト由来の歯周靱帯由来細胞（ＰＤＬ細胞）
ＰＤＬ細胞は、矯正治療のために抜歯を目的として来院した患者（１６．２４歳）から歯周靱帯を可能な限り傷つけないようして注意深く抜去した健全小臼歯から分離して培養した。抜去した歯牙を、滅菌した生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ニッスイ製）で洗浄後、歯根中央１／３に存在する歯周靱帯を尖刃刀を用いてそぎ落とした。これらの歯周靱帯をプラスチックシャーレに入れ替え、丸刃刀を用いてより小さな細片にした。組織片を３５ｍｍ径のシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ社製）中で静置し、抗生物質（１００Ｕ／ｍｌ ペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン及び２５０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン）及び１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ＥＱＵＩＴＥＣＨ−ＢＩＯ社製）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ；ニッスイ製）中で、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で培養した。その後、歯周靱帯組織片から遊出してきた細胞を同様の条件下で継代培養し、３〜５代目の細胞を実験に用いた。
（ｉｉ）マウス由来の骨芽細胞
マウス由来の骨芽細胞として、ＭＣ３Ｔ３細胞株又はＳＴ２細胞株（ＲＩＫＥＮ ＣＥＬＬ ＢＡＮＫより入手）を用いた。
（ｉｉｉ）ラットの大腿骨骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭＭＳＣ）
ラットの大腿骨骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭＭＳＣ）を用いた。この細胞株は、Ｍａｎｉａｔｏｐｏｕｌｏｓらの方法（文献Ｍａｎｉａｔｏｐｏｕｌｏｓ Ｃ，Ｓｏｄｅｋ Ｊ ａｎｄ Ｍｅｌｃｈｅｒ ＡＨ：Ｂｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｏｆ ｙｏｕｎｇ ａｄｕｌｔ ｒａｔｓ．Ｃｅｌｌ ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ，２５４：３１７−３３０，１９８８）に従い、大腿骨を無菌的に摘出し、周囲軟組織を可及的に除去した。大腿骨近遠心位骨端を切断し、１５Ｓ含有ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ ａｌｐｈａ ｍｅｄｉｕｍ（αＭＥＭ；ＧＩＢＣＯ）５ｍｌを用いて、シリンジにて大腿骨骨髄組織を同培養液１０ｍｌ中に射出した。得られた組織を１５Ｓ含有αＭＥＭにて３７℃、５Ｏ２条件下で培養、３〜５代目の細胞を実験に用いた。
（ｉｖ）マウス由来のセメント芽細胞
マウス由来のセメント芽細胞として、ＯＣＣＭ３０細胞株（Ｂｏｎｅ．１９９９ Ｊｕｌ；２５（１）：３９−４７）を用いた。この細胞株は、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ大学歯学部Ｓｏｍｅｒｍａｎ教授より供与された。
（２）細胞増殖に対する本発明ペプチドの作用
２４ウエルの培養プレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に、（１）で調製したＰＤＬ細胞を５×１０３細胞／ウエルの割合で播種した。播種後１日間は１０％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で培養した。播種後１日目を０日目として、前記で製造したペプチド（ａ）を各種濃度で培養液（２％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ）に添加した。４日目および６日目に０．０８％ トリプシンと０．０４％ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有するＰＢＳを用いて細胞を剥離分散し、コールターカウンター（ＣＯＵＬＴＥＲ Ｚ１，Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社製）を用いて細胞数を計測した。
また、ペプチド（ａ）と、抗ＳＰＮ１６抗体（シースリン分子中に存在する配列番号３で示されるアミノ酸配列部分に結合する抗体；広島大学内田教授より供与）とを予め３７℃で３０分間プレインキュベートしたものについても同様に検討した。
また対照として、２％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭについても同様に検討した。
結果を図１に示す。図１中の左側の棒グラフは４日目、右側の棒グラフは６日目における結果をそれぞれ示す。図１中の「ｃｏｎｔ」は２％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭのみで培養したものを、「ＰＮ」はペプチド（ａ）のみを添加したものを、「（抗）ＰＮ」はペプチド（ａ）と抗ＳＰＮ１６抗体とのプレインキュベート産物を添加したものをそれぞれ示す。また図１中の「ｐｇ」及び「ｎｇ」は、それぞれ「ｐｇ／ｍｌ」及び「ｎｇ／ｍｌ」を示す。
この結果、ペプチド（ａ）を添加するとＰＤＬ細胞が有意に増加し、この作用は抗ＳＰＮ１６抗体（ペプチド（ａ）に結合する）によって抑制されたことから、ペプチド（ａ）には細胞増殖作用があることが示された。
また、ペプチド（ｃ）についても同様に検討した。結果を図２に示す。図２中の左側の棒グラフは４日目、右側の棒グラフは６日目における結果をそれぞれ示す。図２中の「ｃｏｎｔ」は２％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭのみで培養したものを、「ＰＣ」はペプチド（ｃ）のみを添加したものを、「（抗）ＰＣ」はペプチド（ｃ）と抗ＳＰＣ１５抗体のプレインキュベート産物を添加したものをそれぞれ示す。また図２中の「ｐｇ」及び「ｎｇ」は、それぞれ「ｐｇ／ｍｌ」及び「ｎｇ／ｍｌ」を示す。
この結果、ペプチド（ｃ）を添加するとＰＤＬ細胞が有意に増加し、この作用は抗ＳＰＣ１５抗体（ペプチド（ｃ）に結合する）によって抑制される傾向がみられたことから、ペプチド（ｃ）には細胞増殖作用があることが示された。
また、ペプチド（ａ）及び（ｂ）について、ＭＣ３Ｔ３細胞に対する細胞増殖作用を同様に検討した。結果を図３に示す。図３中の左側の棒グラフは３日目、右側の棒グラフは６日目における結果をそれぞれ示す。図３中の「ｃｏｎｔ」は２％ ＦＢＳを含有するαＭＥＭのみで培養したものを、「Ｂ」はＢＭＰ２（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ２；山之内製薬製）のみを添加したものを、「ＨＮ」はペプチド（ｂ）のみを添加したものを、「ＰＮ」はペプチド（ａ）のみを添加したものをそれぞれ示す。また図３中の「Ｂ」、「ＨＮ」及び「ＰＮ」の次に表示してある数字の単位は「ｎｇ／ｍｌ」を示す。
この結果、ペプチド（ａ）又は（ｂ）を添加すると６日目においてＭＣ３Ｔ３細胞の有意な増加がみられたことから、ペプチド（ａ）及び（ｂ）には細胞増殖作用があることが示された。
（３）細胞分化に対する本発明ペプチドの作用
細胞の分化の指標として、細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を測定した。２４ウエルの培養プレートに、５×１０３細胞／ウエルの割合で細胞を播種し、２％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ又はαＭＥＭに各種濃度のペプチド（ａ）を添加して培養した。細胞がコンフルエントに達した時点から１週間目に以下の酵素化学的方法（Ｂｅｓｓｅｙ−Ｌｏｗｒｙ法、Ｂｅｓｓｅｙ ＯＡ，Ｌｏｗｒｙ ＯＨ ａｎｄ Ｂｒｏｃｋ ＭＪ：Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｗｉｔｈ ｆｉｖｅ ｃｕｂｉｃ ｍｉｌｌｉｍｅｔｅｒ ｏｆ ｓｅｒｕｍ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１６４：３２１−３２９，１９４６）によってＡＬＰ活性を測定した。
（ＡＬＰ活性の測定方法）
培養細胞をＰＢＳで洗浄後、超音波ホモジナイザー（Ｈａｎｄｙ Ｓｏｎｉｃ ｍｏｄｅｌ ＵＲ−２０Ｐ；トミー工業製）を用いて１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、５００μｌ）中で４０秒間細胞を破砕し撹拌した。次いで、このサンプル液２５μｌをＡＬＰ緩衝液（０．１Ｍ 炭酸塩緩衝液 ｐＨ９．８、６．７ｍＭ ｐ−ニトロフェニルホスフェート、２ｍＭ ＭｇＣｌ２）１２５μｌに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。０．２Ｎ ＮａＯＨを１２５μｌを添加することによって反応を終了させた後、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ ５５０，Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を用いて４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
また、２％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ、２％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ又はαＭＥＭに各種濃度のペプチド（ｃ）を添加したものについても同様に検討した。結果を図４に示す。図４中の「ｃｏｎｔ」は２％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭのみで培養したものを、「ＰＮ」はペプチド（ａ）のみを添加したものを、「ＰＣ」はペプチド（ｃ）のみを添加したものをそれぞれ示す。また図４中の「ｐｇ」及び「ｎｇ」は、それぞれ「ｐｇ／ｍｌ」及び「ｎｇ／ｍｌ」を示す。
この結果、ペプチド（ａ）又は（ｃ）を添加するとＰＤＬ細胞のＡＬＰ活性が有意に上昇したことから、ペプチド（ａ）及び（ｃ）には細胞の分化促進作用があることが示された。
また、ペプチド（ａ）（ブタ由来）に加えて、ペプチド（ｂ）（ヒト由来）及びＢＭＰについても同様に検討した。細胞がコンフルエントに達した時点でＡＬＰ活性を測定した結果を図５に、及び、コンフルエントに達した時点から１週間目にＡＬＰ活性を測定した結果を図６にそれぞれ示す。図中の「ｃｏｎｔ」は２％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭのみで培養したものを、「Ｂ」はＢＭＰ２のみを添加したものを、「ＰＮ」はペプチド（ａ）のみを添加したものを、「ＨＮ」はペプチド（ｂ）のみを添加したものをそれぞれ示す。また図中の「Ｂ」、「ＰＮ」及び「ＨＮ」の次に表示してある数字の単位は「ｎｇ／ｍｌ」を示す。
この結果、ペプチド（ａ）又は（ｂ）を添加するとＰＤＬ細胞のＡＬＰ活性が有意に上昇した。さらにこの作用はＢＭＰ２と同等若しくはそれ以上であり、これらの結果からペプチド（ａ）及び（ｂ）には極めて高い細胞の分化促進作用があることが示された。
また、ペプチド（ａ）、（ｂ）及びＢＭＰ２について、ＳＴ２細胞及びＢＭＭＳＣ細胞を用いて同様に検討した。細胞がコンフルエントに達した時点でＡＬＰ活性を測定した結果を、それぞれ図７及び図８に示す。図中の「ｃｏｎｔ」は２％ ＦＢＳを含有するαＭＥＭのみで培養したものを、「Ｂ」はＢＭＰ２のみを添加したものを、「ＨＮ」はペプチド（ｂ）のみを添加したものを、「ＰＮ」はペプチド（ａ）のみを添加したものをそれぞれ示す。また図中の「Ｂ」、「ＨＮ」及び「ＰＮ」の次に表示してある数字の単位は「ｎｇ／ｍｌ」を示す。
この結果、ペプチド（ａ）及び（ｂ）は、ＰＤＬ細胞のみならずＳＴ２細胞及びＢＭＳＳＣ細胞に対しても有意な細胞分化促進作用を示した。またこの作用はＢＭＰ２と同等若しくはそれ以上であり、これらの結果からもペプチド（ａ）及び（ｂ）には極めて高い細胞の分化促進作用があることが示された。
また、ペプチド（ａ）及び（ｂ）について、ＭＣ３Ｔ３細胞を用いて同様に検討した。細胞がコンフルエントに達した時点でＡＬＰ活性を測定した結果を図９に、及び、コンフルエントに達した時点から１週間目にＡＬＰ活性を測定した結果を図１０にそれぞれ示す。図中の「ｃｏｎｔ」は２％ ＦＢＳを含有するαＭＥＭのみで培養したものを、「ＰＮ」はペプチド（ａ）のみを添加したものを、「ＨＮ」はペプチド（ｂ）のみを添加したものをそれぞれ示す。また図中の「ｎｇ」は、「ｎｇ／ｍｌ」を示す。
この結果、ペプチド（ａ）及び（ｂ）は、再現性よく、ＭＣ３Ｔ３細胞に対して有意な細胞分化促進作用を示した。
また、ペプチド（ａ）について、ＯＣＣＭ３０細胞を用いて同様に検討した。結果を図１１に示す。図中の「ｃｏｎｔ」は２％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭのみで培養したものを、「ＰＮ」はペプチド（ａ）のみを添加したものをそれぞれ示す。また図中の「ｎｇ」は、「ｎｇ／ｍｌ」を示す。
この結果、ペプチド（ａ）は、ＯＣＣＭ３０細胞に対しても有意な細胞分化促進作用を示した。
また、終濃度１００ｎｇ／ｍｌのペプチド（ｂ）及び（ｆ）〜（ｊ）について、ＭＣ３Ｔ３細胞株を用いて同様に検討した。結果を図１２に示す。図中の「ｃｏｎｔ」は２％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭのみで培養したものを示す。
この結果、ペプチド（ｂ）がＭＣ３Ｔ３細胞株に対して高い細胞分化促進作用を示すこと、及びペプチド（ｆ）〜（ｊ）もコントロールに比して僅かではあるが高い細胞分化促進作用を示すことが示された。
また、終濃度１００ｎｇ／ｍｌのペプチド（ｂ）及び（ｋ）〜（ｎ）について、ＳＴ２細胞株を用いて同様に検討した。結果を図１３に示す。図中の「ｃｏｎｔ」は２％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭのみで培養したものを示す。
この結果、いずれのペプチドも、ＳＴ２細胞株に対して有意に高い細胞分化促進作用を示すことが示された。これらの結果から、ペプチド（ｂ）のＮ末端及び／又はＣ末端に数個のアミノ酸残基が付加されたペプチド並びにペプチド（ｂ）中のアミノ酸残基の一部が置換されたペプチドであっても、高い細胞分化促進作用を示すことが明らかになった。
（細胞の石灰化物形成能に対するペプチドの影響）
細胞の石灰化物形成能に対するペプチドの影響を検討するために、以下の実験を行った。
細胞の石灰化能を評価するために、ダールのカルシウム染色を行った。２４ウエル培養プレートに５×１０３細胞／ウェルの割合でＰＤＬ細胞を播種し、２Ｓを含有するＤＭＥＭに各濃度のペプチド（ａ）又は（ｃ）を添加し、１０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅを加え調節した培地にて培養した。細胞がコンフルエントに達してから３週間後に、ＰＢＳで洗浄後、１０中性緩衝ホルマリンにて固定し、０．０１アリザリンレッドＳ（和光純薬）にて染色した。
この結果、ペプチド（ａ）又は（ｃ）を添加するとＰＤＬ細胞の石灰化能が有意に上昇したことから、ペプチド（ａ）及び（ｃ）には細胞の分化促進作用があることが示された。
また、ペプチド（ａ）、ＢＭＰ２及びＴＧＦβについて、ＭＣ３Ｔ３細胞を用いて同様に検討した。コンフルエントから２週間後に評価した結果、ペプチド（ａ）はＰＤＬ細胞のみならずＭＣ３Ｔ３細胞に対しても有意な細胞分化促進作用を示した。またこの作用はＢＭＰ２と同等若しくはそれ以上であり、これらの結果からもペプチド（ａ）には極めて高い細胞の分化促進作用があることが示された。
＜実施例３＞動物を用いた薬効薬理試験１
歯周病モデルに対する本発明ペプチドの作用を調べるために、以下の実験を行った。
（ｉ）歯周病モデルの作製
８週齢のＷｉｓｔａｒラットを体重１００ｇ当たり０．５ｍｌ量のカルバミル酸エチル２０溶液にて全身麻酔した後、上顎第一臼歯近心歯肉に縦切開を入れた。歯肉骨膜弁を剥離し、第一臼歯近心歯槽骨を露出させた。続いて同部の歯槽骨頂より根尖側へ、フィッシャーバーで長さ約２ｍｍ、頬舌径約１ｍｍの欠損を生食注水下に作成し、上顎第一臼歯近心根面を露出させた。露出根面に残存付着する歯周靱帯とともにセメント質ならびに象牙質表層を浅い窩洞状に削除した。
（ｉｉ）試験方法
この欠損部に、ヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量９０万）の１％ＰＢＳ溶液により調製した試料を露出根面に塗布し、歯肉骨膜弁を復位縫合した。ペプチド（ａ）を含むヒアルロン酸ナトリウムの１％ＰＢＳ溶液（ペプチド（ａ）の濃度：０．３ｍｇ／ｍｌ）を塗布した群をペプチド群とし、ヒアルロン酸ナトリウムの１％ＰＢＳ溶液のみを塗布した群（ヒアルロン酸群）、あるいはなにも塗布せずに歯肉弁を復位縫合した群（コントロール群）を対照として、術後１ヶ月の治癒形態を比較した。
（標本作製法）
クロロホルムにて動物を安楽死させた後、実験部位を摘出した。摘出した上顎骨は１０中性緩衝ホルマリンにて一日浸漬固定し、続いて急速脱灰液（Ｋ−ＣＸ）にて２日間脱灰した。常法に従ってパラフィン包埋後、実験部位について歯根長軸と平行に４．５ｍｍ厚で近遠心断切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色を施した。欠損部露出歯根面における歯周組織の付着形態や歯槽骨頂の位置を、光学顕微鏡で観察した。
（ｉｉｉ）結果（所見）
コントロール群、ヒアルロン酸群ともに上皮の根尖側移動が認められたが、ペプチド群はそれらに比較して少なかった。また、コントロール群及びヒアルロン酸群ともにセメント質及びシャーピー線維の封入を伴うセメント質の沈着はほとんどみられず、歯肉と歯根の間にはしばしば亀裂が観察された。これに対し、ペプチド群ではそのような亀裂はみられず、削除歯根表面にはシャーピー線維の封入を伴うセメント質の添加、即ち結合組織性新付着形成も観察された。また、骨再生も他の２群に比べ盛んで、高い骨再生を示した。
＜実施例４＞動物を用いた薬効薬理試験２
骨欠損モデルに対する本発明ペプチドの作用を調べるために、以下の実験を行った。
（ｉ）骨欠損モデルの作製
Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（８週齢）を体重１００ｇ当たり０．５ｍｌ量のカルバミル酸エチル２０溶液にて全身麻酔した後、左右後肢脛骨表面皮膚および脛骨骨膜に切開を入れ、骨膜を剥離して、脛骨を露出させた。続いて、生理食塩水の注水下で、同部の皮質骨を直径２ｍｍのラウンドバーで穿孔し、骨髄腔まで達する欠損（直径２ｍｍ，深さ３ｍｍ）を作製した。
（ｉｉ）試験方法
骨欠損部に、ヒアルロン酸ナトリウム製剤（商品名：アルツ（登録商標）；ヒアルロン酸ナトリウムの重量平均分子量：約９０万；ヒアルロン酸ナトリウムの濃度：１％）に溶解したペプチド（ａ）（濃度０．３ｍｇ／ｍｌ又は３ｍｇ／ｍｌ）を填入し、骨膜および皮膚を復位縫合した。ペプチドを填入した群（ペプチド群）、担体であるヒアルロン酸ナトリウムの１％ＰＢＳ溶液のみを塗布した群（ＨＡ群）又は何も塗布せずに皮膚骨膜弁を復位縫合した群（コントロール群）における、術後３週目の治癒形態をＸ線で解析した。
（ｉｉｉ）結果
各群における軟Ｘ線写真像を比較した結果、コントロール群及びＨＡ群では骨欠損の残存が比較的明瞭に観察されたが、ペプチド群（濃度０．３ｍｇ／ｍｌ又は３ｍｇ／ｍｌ）では、骨欠損がほとんど認識できない程度にまで骨が再生していることが確認された。この結果から、本発明ペプチドは、骨欠損部の骨の再生を有意に促進することが示された。
（ｉｖ）他の本発明ペプチドによる効果
同様に、コラーゲンゲル（商品名：コーケンアテロコラーゲンインプラント、株式会社高研）、ペプチド（ａ）及び（ｂ）（濃度：３ｍｇ／ｍｌ）について実験を行った。その結果、コントロール群及びコラーゲンゲル群では骨欠損の残存が比較的明瞭に観察されたが、ペプチド（ａ）のみならず（ｂ）を用いた場合であっても、骨欠損がほとんど認識できない程度にまで骨が再生していることが確認された。この結果から、本発明ペプチドは、骨欠損部の骨の再生を有意に促進することが示された。
＜実施例５＞製剤例１
以下に本発明薬剤の製剤例を示すが、これらはあくまで例示であり、本発明薬剤の剤形がこれらに限定されるものではない。
（１）軟膏剤
前記で製造したペプチド（ａ） １０ｍｇ
モノステアリン酸ソルビタン ７ｍｇ
モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン ７ｍｇ
パルミチン酸イソプロピル ３７ｍｇ
ワセリン ３７ｍｇ
流動パラフィン ３７ｍｇ
セタノール ５０ｍｇ
グリセリン ７０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
上記成分に精製水を加えて、１ｇのクリームとした。
（２）錠剤
前記で製造したペプチド（ｂ） １００ｍｇ
乳糖 ６７０ｍｇ
バレイショデンプン １５０ｍｇ
結晶セルロース ６０ｍｇ
軽質無水ケイ酸 ５０ｍｇ
上記成分を混合し、ヒドロキシプロピルセルロースを３０ｍｇをメタノールに溶解した溶液（ヒドロキシプロピルセルロース１０重量％）を加えて混練したのち造粒した。これを径０．８ｍｍのスクリーンで押し出して顆粒状にし、乾燥した後、ステアリン酸マグネシウム１５ｍｇを加え２００ｍｇづつ打錠して錠剤を得た。
（３）カプセル剤
前記で製造したペプチド（ｂ） １００ｍｇ
乳糖 ８０ｍｇ
上記成分を均一に混合し、硬カプセルに充填してカプセル剤を得た。
（４）注射剤
前記で製造したペプチド（ａ） ３０ｍｇ
上記成分を５％マンニトール水溶液２ｍＬに溶解し、これを無菌濾過した後、アンプルに入れて密封した。
（５）用時溶解用注射剤
（Ａ）前記で製造したペプチド（ｂ）（凍結乾燥体）３０ｍｇ（アンプル封入した）
（Ｂ）無菌濾過したＰＢＳ ２ｍＬ（アンプル封入した）
上記（Ａ）および（Ｂ）を１セットとして、用時溶解用注射剤を製造した。使用時には（Ａ）を（Ｂ）で溶解して用いることができる。
＜実施例６＞製造例２
以下に本発明組成物の製造例を示すが、これらはあくまで例示であり、本発明組成物の組成・形態等がこれらに限定されるものではない。
（１）液体状態の組成物
前記で製造したペプチド（ａ） ３ｍｇ
ヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量９０万）の１％ＰＢＳ溶液 １０ｍｌ
上記成分を混合することにより、液体状態の本発明組成物を製造した。
（２）液体状態の組成物
前記で製造したペプチド（ａ） ３ｍｇ
ヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量２２０万）の０．１％ＰＢＳ溶液 １０ｍｌ
上記成分を混合することにより、液体状態の本発明組成物を製造した。
（３）乾燥状態の組成物
前記で製造したペプチド（ｂ） ３０ｍｇ
ヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量９０万）の１％ＰＢＳ溶液 １０ｍｌ
上記成分を混合して凍結乾燥することにより、乾燥状態の本発明組成物を製造した。
本発明ペプチドのアミノ酸配列を保持するシースリンは、既に歯周病治療薬の一成分として利用されている。また前記の薬効薬理試験において、本発明ペプチドの添加（又は投与）期間中、細胞や動物の状態を毎日観察したが、特段の変化は認められなかった。これらのことから、本発明ペプチドや本発明薬剤の安全性が十分に推定できる。また、ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩は、既に医薬品の有効成分としても用いられていることから、本発明組成物の安全性も十分に推定できる。
【産業上の利用の可能性】
本発明ペプチドは、シースリン分子の部分ペプチドであり、シースリンに比して顕著に高い細胞増殖活性や細胞分化促進活性を示すことから、本発明薬剤、特に細胞増殖促進剤、細胞の分化促進剤、骨・軟骨若しくは歯周組織の形成促進剤又は再生促進剤の有効成分として極めて有用である。また本発明ペプチドは、再生医療等における素材としても用いることができ、この点でも極めて有用である。
さらに、本発明ペプチドは前記の通り非常に高い生物活性を示すので、本発明ペプチドを有効成分とする本発明薬剤中の有効成分量を減ずることができ、これにより安全かつ安価な本発明薬剤等を提供することができる。
本発明薬剤は、細胞増殖促進、細胞の分化促進、骨・軟骨若しくは歯周組織の形成促進又は再生促進等の種々の用途に用いることができ、極めて有用である。
本発明組成物は、ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩の物理化学的性質によって、本発明ペプチドが目的の部位に長時間保持される、あるいは目的の部位において本発明ペプチドが緩除に放出される等の効果を奏することから極めて有用である。また、本発明ペプチドの生物学的性質にヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩の生物学的性質が加わって、さらに有利な生物学的効果を奏する可能性もあることから、極めて有用である。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のアミノ酸配列（配列番号１）からなるペプチド。
（但し、Ｘ０１はＶａｌ又はＧｌｎを、Ｘ０２はＡｌａ、Ｐｈｅ又はＧｌｙを、Ｘ０３はＰｈｅ又はＬｅｕを、Ｘ０４はＰｒｏ又はＬｙｓを、Ｘ０５はＡｒｇ、Ｇｌｎ又はＰｒｏを、Ｘ０６はＧｌｎ、Ａｒｇ又はＰｈｅを、Ｘ０７はＰｒｏ、Ｓｅｒ又はＬｅｕを、Ｘ０８はアミノ酸残基が存在しないこと又はＧｌｙ若しくはＧｌｎを、Ｘ０９はアミノ酸残基が存在しないこと又はＡｌａ、Ｇｌｙ若しくはＰｒｏを、Ｘ１０はアミノ酸残基が存在しないこと又はＧｌｎ若しくはＴｈｒを、Ｘ１１はアミノ酸残基が存在しないこと又はＧｌｙ若しくはＡｌａを、Ｘ１２はアミノ酸残基が存在しないこと又はＭｅｔ若しくはＡｌａを、Ｘ１３はＧｌｙ、Ａｌａ又はＴｈｒを、Ｘ１４はＴｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ又はＧｌｙを、Ｘ１５はＰｒｏ又はＶａｌを、Ｘ１６はＧｌｙ又はＧｌｎを、Ｘ１７はＶａｌ、Ｍｅｔ又はＧｌｙを、Ｘ１８はＡｌａ又はＴｈｒを、Ｘ１９はＳｅｒ又はＰｒｏを、Ｘ２０はＬｅｕ又はＧｌｎをそれぞれ示す。）
【請求項２】
下記のアミノ酸配列（配列番号２）からなる、請求項１に記載のペプチド。
（但し、Ｘ２１はＡｌａ又はＰｈｅを、Ｘ２２はＡｒｇ又はＧｌｎを、Ｘ２３はＰｒｏ又はＳｅｒを、Ｘ２４はＴｈｒ又はＩｌｅを、Ｘ２５はＶａｌ、Ｍｅｔ又はＧｌｙをそれぞれ示す。）
【請求項３】
下記（Ａ）〜（Ｇ）のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドを有効成分とする薬剤。
【請求項５】
医薬であることを特徴とする、請求項４に記載の薬剤。
【請求項６】
細胞増殖促進剤であることを特徴とする、請求項４又は５に記載の薬剤。
【請求項７】
「細胞」が、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞又は歯根膜由来細胞であることを特徴とする、請求項６に記載の薬剤。
【請求項８】
細胞の分化促進剤であることを特徴とする、請求項４又は５に記載の薬剤。
【請求項９】
「細胞」が、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞又は歯根膜由来細胞であることを特徴とする、請求項８に記載の薬剤。
【請求項１０】
骨若しくは軟骨の形成促進剤又は再生促進剤であることを特徴とする、請求項４又は５に記載の薬剤。
【請求項１１】
歯周組織の形成促進剤又は再生促進剤であることを特徴とする、請求項４又は５に記載の薬剤。
【請求項１２】
下記のアミノ酸配列（配列番号１３）からなるペプチド。
（但し、Ｘ２６はＡｌａ又はＶａｌを、Ｘ２７はＧｌｎ又はＨｉｓを、Ｘ２８はＧｌｎ又はＧｌｕを、Ｘ２９はＩｌｅ、Ｍｅｔ又はＶａｌを、Ｘ３０はアミノ酸が存在しないこと又はＬｙｓ若しくはＭｅｔを、Ｘ３１はＡｒｇ又はＨｉｓを、Ｘ３２はＡｓｐ又はＡｓｎをそれぞれ示す。）
【請求項１３】
下記のアミノ酸配列（配列番号１４）からなる、請求項１２に記載のペプチド。
（但し、Ｘ３３はＧｌｎ又はＧｌｕを、Ｘ３４はＩｌｅ又はＭｅｔを、Ｘ３５はＬｙｓ又はＭｅｔを、Ｘ３６はＡｒｇ又はＨｉｓをそれぞれ示す。）
【請求項１４】
下記（Ｈ）〜（Ｋ）のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のペプチドを有効成分とする薬剤。
【請求項１６】
医薬であることを特徴とする、請求項１５に記載の薬剤。
【請求項１７】
細胞増殖促進剤であることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の薬剤。
【請求項１８】
「細胞」が、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞又は歯根膜由来細胞であることを特徴とする、請求項１７に記載の薬剤。
【請求項１９】
細胞の分化促進剤であることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の薬剤。
【請求項２０】
「細胞」が、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞又は歯根膜由来細胞であることを特徴とする、請求項１９に記載の薬剤。
【請求項２１】
骨若しくは軟骨の形成促進剤又は再生促進剤であることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の薬剤。
【請求項２２】
歯周組織の形成促進剤又は再生促進剤であることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の薬剤。
【請求項２３】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド及び／又は請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のペプチドと、ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩とを少なくとも含むことを特徴とする組成物。
【請求項１】
下記のアミノ酸配列（配列番号１）からなるペプチド。
（但し、Ｘ０１はＶａｌ又はＧｌｎを、Ｘ０２はＡｌａ、Ｐｈｅ又はＧｌｙを、Ｘ０３はＰｈｅ又はＬｅｕを、Ｘ０４はＰｒｏ又はＬｙｓを、Ｘ０５はＡｒｇ、Ｇｌｎ又はＰｒｏを、Ｘ０６はＧｌｎ、Ａｒｇ又はＰｈｅを、Ｘ０７はＰｒｏ、Ｓｅｒ又はＬｅｕを、Ｘ０８はアミノ酸残基が存在しないこと又はＧｌｙ若しくはＧｌｎを、Ｘ０９はアミノ酸残基が存在しないこと又はＡｌａ、Ｇｌｙ若しくはＰｒｏを、Ｘ１０はアミノ酸残基が存在しないこと又はＧｌｎ若しくはＴｈｒを、Ｘ１１はアミノ酸残基が存在しないこと又はＧｌｙ若しくはＡｌａを、Ｘ１２はアミノ酸残基が存在しないこと又はＭｅｔ若しくはＡｌａを、Ｘ１３はＧｌｙ、Ａｌａ又はＴｈｒを、Ｘ１４はＴｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ又はＧｌｙを、Ｘ１５はＰｒｏ又はＶａｌを、Ｘ１６はＧｌｙ又はＧｌｎを、Ｘ１７はＶａｌ、Ｍｅｔ又はＧｌｙを、Ｘ１８はＡｌａ又はＴｈｒを、Ｘ１９はＳｅｒ又はＰｒｏを、Ｘ２０はＬｅｕ又はＧｌｎをそれぞれ示す。）
【請求項２】
下記のアミノ酸配列（配列番号２）からなる、請求項１に記載のペプチド。
（但し、Ｘ２１はＡｌａ又はＰｈｅを、Ｘ２２はＡｒｇ又はＧｌｎを、Ｘ２３はＰｒｏ又はＳｅｒを、Ｘ２４はＴｈｒ又はＩｌｅを、Ｘ２５はＶａｌ、Ｍｅｔ又はＧｌｙをそれぞれ示す。）
【請求項３】
下記（Ａ）〜（Ｇ）のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドを有効成分とする薬剤。
【請求項５】
医薬であることを特徴とする、請求項４に記載の薬剤。
【請求項６】
細胞増殖促進剤であることを特徴とする、請求項４又は５に記載の薬剤。
【請求項７】
「細胞」が、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞又は歯根膜由来細胞であることを特徴とする、請求項６に記載の薬剤。
【請求項８】
細胞の分化促進剤であることを特徴とする、請求項４又は５に記載の薬剤。
【請求項９】
「細胞」が、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞又は歯根膜由来細胞であることを特徴とする、請求項８に記載の薬剤。
【請求項１０】
骨若しくは軟骨の形成促進剤又は再生促進剤であることを特徴とする、請求項４又は５に記載の薬剤。
【請求項１１】
歯周組織の形成促進剤又は再生促進剤であることを特徴とする、請求項４又は５に記載の薬剤。
【請求項１２】
下記のアミノ酸配列（配列番号１３）からなるペプチド。
（但し、Ｘ２６はＡｌａ又はＶａｌを、Ｘ２７はＧｌｎ又はＨｉｓを、Ｘ２８はＧｌｎ又はＧｌｕを、Ｘ２９はＩｌｅ、Ｍｅｔ又はＶａｌを、Ｘ３０はアミノ酸が存在しないこと又はＬｙｓ若しくはＭｅｔを、Ｘ３１はＡｒｇ又はＨｉｓを、Ｘ３２はＡｓｐ又はＡｓｎをそれぞれ示す。）
【請求項１３】
下記のアミノ酸配列（配列番号１４）からなる、請求項１２に記載のペプチド。
（但し、Ｘ３３はＧｌｎ又はＧｌｕを、Ｘ３４はＩｌｅ又はＭｅｔを、Ｘ３５はＬｙｓ又はＭｅｔを、Ｘ３６はＡｒｇ又はＨｉｓをそれぞれ示す。）
【請求項１４】
下記（Ｈ）〜（Ｋ）のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のペプチドを有効成分とする薬剤。
【請求項１６】
医薬であることを特徴とする、請求項１５に記載の薬剤。
【請求項１７】
細胞増殖促進剤であることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の薬剤。
【請求項１８】
「細胞」が、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞又は歯根膜由来細胞であることを特徴とする、請求項１７に記載の薬剤。
【請求項１９】
細胞の分化促進剤であることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の薬剤。
【請求項２０】
「細胞」が、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞又は歯根膜由来細胞であることを特徴とする、請求項１９に記載の薬剤。
【請求項２１】
骨若しくは軟骨の形成促進剤又は再生促進剤であることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の薬剤。
【請求項２２】
歯周組織の形成促進剤又は再生促進剤であることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の薬剤。
【請求項２３】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド及び／又は請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のペプチドと、ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩とを少なくとも含むことを特徴とする組成物。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７４３１９
【国際公開日】平成１６年９月２日（２００４．９．２）
【発行日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０２７９６（Ｐ２００５−５０２７９６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００２００９
【国際出願日】平成１６年２月２０日（２００４．２．２０）
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年９月２日（２００４．９．２）
【発行日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００２００９
【国際出願日】平成１６年２月２０日（２００４．２．２０）
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
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