癌を治療するためのエンザスタウリン
本発明は、単剤として又はクラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤と併用してエンザスタウリンを用いる、患者の癌を治療するための生物学的マーカーとしてのＨＤＡＣ２に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンザスタウリンを用いる癌の治療と併せて、生物学的マーカーとしてＨＤＡＣ２を用いる方法に関する。また、本発明は、癌治療における治療効果を高めるために、クラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤と併用されるエンザスタウリンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンザスタウリンは、ＰＫＣベータ選択的阻害剤である。エンザスタウリンは、化学名３−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−［１−［１−（ピリジン−２−イルメチル）ピペリジン−４−イル］−１Ｈ−インドール−３−イル］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンを有し、特許文献１に開示されている。
【０００３】
ＨＤＡＣは、ヒストン脱アセチル化酵素スーパーファミリーに属している。酵母の脱アセチル化酵素に対する相同性に基づいて４つのクラスに分類される、少なくとも１８種のＨＤＡＣ酵素が存在する。ＨＤＡＣは、ヒストンアセチル基転移酵素により付加されたアセチル基を除去する。アセチル基の除去により、ヒストンがＤＮＡに結合できるようになるため、ＤＮＡへのアクセスが制限される。結果として、ＨＤＡＣは、転写の発生を防ぐ。
【０００４】
Ｒｏｐｅｒｏは、子宮内膜、結腸、及び胃腫瘍サンプルが、ＨＤＡＣ２不活化突然変異を有することを報告している（非特許文献１）。癌細胞株及び腫瘍（乳房、膠芽腫、卵巣、腎臓、膀胱、及び結腸直腸腫瘍）に対するＱＲＴ−ＰＣＲは、ＨＤＡＣ２のＲＮＡ量の減少を示した（非特許文献２）。さらに、ＰｒｏｔｅｉｎＡｔｌａｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ）によって、胃、子宮内膜、卵巣、乳房、腎臓、頚部、肝臓、肺、悪性カルチノイド、リンパ腫、膵臓、甲状腺、及び前立腺腫瘍のサブセットにおいて、中程度〜陰性のＨＤＡＣ２の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色が見られることが明らかになっている。
【０００５】
クラスＩ ＨＤＡＣは、周知の転写コリプレッサーであり、インビボにおいて常に転写因子及びコファクターに結合している。生物学的データは、クラスＩ ＨＤＡＣが、細胞周期の進行、転移、及びアポトーシスに関連しており、癌治療の有望な標的であることを示唆している。ボリノスタット、デプシペプチド、ＭＳ−２７５、ＭＧＣＤ０１０３、ベリノスタット、Ｂａｃｅｃａ、パノビノスタット、ＰＣＩ−２４７８１、ＴＳＡ、ＬＡＱ８３４、ＳＢＨＡ、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、アピシジン、酪酸フェニル、ＣＩ９９４、トラポキシン、ＳＢ−４２９２０１、ビピリジニウムジエン（Ｂｉｓｐｙｒｉｄｉｎｕｍ ｄｉｅｎｅ）、ＳＨＩ−１：２、Ｒ３０６４６５、ＳＢ−３７９２７８Ａ、及びＰＣＩ−３４０５１等の、「クラス１ ＨＤＡＣ阻害剤」が知られている。
【０００６】
癌の生物学的基礎の理解及びその治療に向けて大いに進展がみられるが、癌は依然として主な死因の１つである。応答耐性及び応答の欠如は、病院で一般的に遭遇するので、薬剤に応答する患者における変異は、耐性に関する重要な課題を提起する。薬剤に応答する患者における変異には、遺伝子、併用薬療法、環境、ライフスタイル、健康状態、及び疾患状態を含む多くの要因が関与していると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，６６８，１５２号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｒｏｐｅｒｏ，Ｓ．ら（２００６年）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，３８（５）：５６６−５６９
【非特許文献２】Ｏｚｄａｇ，Ｈ．ら（２００６年）ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，７：９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
化学療法レジメンに対して最もよく応答する患者の同定に対する医学的要求が存在する。同定されている予測生物学的マーカーは僅かであり、診断試験にまで発展し、決定的に治療法の決定を導いているものは更に少ない。患者の選択アプローチは、患者に合わせて癌治療においてエンザスタウリンを使用するために重要な価値を有する。患者がエンザスタウリンによる治療に応答する可能性があるかどうかをタイムリーに決定する方法を有することには高い価値がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、先ず、エンザスタウリンの有効性の生物学的マーカーとして用いることができるＨＤＡＣ２の発現レベルを測定した後、エンザスタウリンを用いて癌を治療する方法に関する。ＨＤＡＣ２レベルが低いか又は検出不可能であるとき、エンザスタウリン単独が特に有効であると予測される。ＨＤＡＣ２レベルが高い場合、本発明は、クラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤と併用して有効量のエンザスタウリンを投与することを含む。
【００１１】
本発明は、低レベル又は検出不可能なレベルのＨＤＡＣ２を有する患者に有効量のエンザスタウリンを投与する工程を含む、患者の癌を治療する方法を含む。
【００１２】
更に、本発明は、ａ）患者から癌細胞を含むサンプルを得る工程と、ｂ）癌サンプル中のＨＤＡＣ２レベルを測定する工程と、ｃ）前記癌サンプルが、低レベル又は検出不可能なレベルのＨＤＡＣ２を有する場合、前記患者に有効量のエンザスタウリンを投与する工程と、を含む患者の癌を治療する方法を提供する。
【００１３】
本発明は、ＨＤＡＣ２のフレームシフトナンセンス突然変異を有する患者に有効量のエンザスタウリンを投与する工程を含む、患者の癌を治療する方法を含む。
【００１４】
更に、本発明は、ａ）患者から癌細胞を含むサンプルを得る工程と、ｂ）癌サンプル中のＨＤＡＣ２が突然変異しているかどうかを判定する工程と、ｃ）前記患者のサンプルがＨＤＡＣ２のフレームシフトナンセンス突然変異を有する場合、前記患者に有効量のエンザスタウリンを投与する工程と、を含む患者の癌を治療する方法を提供する。
【００１５】
本発明は、患者の癌を治療する方法であって、有効量のエンザスタウリンと、有効量のクラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤とを、高レベルのＨＤＡＣ２を有する患者に投与する工程を含む方法を含む。
【００１６】
更に、本発明は、ａ）患者から癌細胞を含むサンプルを得る工程と、ｂ）癌サンプル中のＨＤＡＣ２レベルを測定する工程と、ｃ）前記癌サンプルが高レベルのＨＤＡＣ２を有する場合、有効量のエンザスタウリンと、有効量のクラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤とを前記患者に投与する工程と、を含む患者の癌を治療する方法を提供する。
【００１７】
本発明は、低レベル又は検出不可能なレベルのＨＤＡＣ２を有する患者の癌を治療するための医薬の製造におけるエンザスタウリンの使用を含む。
【００１８】
更に、本発明は、患者の癌を治療するための医薬の製造において、クラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤と併用されるエンザスタウリンの使用であって、前記患者が高レベルのＨＤＡＣ２を有し、前記医薬がクラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤と併用投与される使用を提供する。
【００１９】
本発明は、前記癌が、結腸直腸癌、胃癌、子宮内膜癌、卵巣癌、乳癌、肝臓癌、肺癌、腎臓癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、膠芽腫、リンパ腫、膵臓癌、及び前立腺癌からなる群から選択される、本明細書に記載される方法及び使用を提供する。更に、クラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤は、ボリノスタット、デプシペプチド、ＭＳ−２７５、ＭＧＣＤ０１０３、ベリノスタット、Ｂａｃｅｃａ、パノビノスタット、ＰＣＩ−２４７８１、ＴＳＡ、ＬＡＱ８３４、ＳＢＨＡ、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、アピシジン、酪酸フェニル、ＣＩ９９４、トラポキシン、ＳＢ−４２９２０１、ビピリジニウムジエン、ＳＨＩ−１：２、Ｒ３０６４６５、ＳＢ−３７９２７８Ａ、及びＰＣＩ−３４０５１からなる群から選択され得る。
【００２０】
本発明は、患者の予後予測、及び癌治療においてエンザスタウリンを使用するために現在利用可能な治療法のインフォームドセレクションに役立つ生物学的マーカーの同定を含む。本発明は、好ましい生物学的マーカーとしてＨＤＡＣ２を使用する。
【００２１】
腫瘍の発達中に獲得される遺伝子異常は、疾患のドライバー、及び癌のテーラーメイド治療を行う機会の両方を意味する。特定の種類の腫瘍において遺伝子及び経路が変化している患者は、ターゲティング治療に対して異なる応答をする可能性がある。発見プロセスにおいてこれら薬剤感受性の遺伝的決定因子を早期に理解することは、臨床的指示、患者の層別化、及び併用研究に関する決定を改善及び加速させるのに役立ち得る。
【００２２】
これらの分集団は、治療効果、及び単剤としての又はクラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤と併用されるエンザスタウリンに対する応答の改善を標的とし得る、機能の低下したＨＤＡＣ２プロファイルを有する患者群を表す。
【００２３】
本発明は、結腸直腸癌、胃癌、子宮内膜癌、卵巣癌、乳癌、肝臓癌、肺癌、腎臓癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、膠芽腫、リンパ腫、膵臓癌、及び前立腺癌からなる群から選択される癌の治療に関する。
【００２４】
本発明は、エンザスタウリンと併用される、ボリノスタット、デプシペプチド、ＭＳ−２７５、ＭＧＣＤ０１０３、ベリノスタット、Ｂａｃｅｃａ、パノビノスタット、ＰＣＩ−２４７８１、ＴＳＡ、ＬＡＱ８３４、ＳＢＨＡ、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、アピシジン、酪酸フェニル、ＣＩ９９４、トラポキシン、ＳＢ−４２９２０１、ビピリジニウムジエン、ＳＨＩ−１：２、Ｒ３０６４６５、ＳＢ−３７９２７８Ａ、及びＰＣＩ−３４０５１からなる群から選択されるクラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤の使用を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
癌細胞の遺伝子又はタンパク質表現を測定するための多くの方法が知られている。免疫組織化学、ウェスタンブロット、マイクロアレイ及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、癌型、癌亜型、予後及び治療効果を分子的に理解するために用いられている幾つかの例である。遺伝子及びタンパク質発現を測定するためのこれら方法の開発により、癌の分類及び多様な種類の腫瘍の予後予測の生物学的マーカーを探し、体系的に評価することが可能になる。
【００２６】
本発明ではＨＤＡＣ２タンパク質発現は、ウェスタンブロット又は免疫組織化学によりアッセイ又は検出されることが好ましい。更に、本発明では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＨＤＡＣ２の突然変異をアッセイし、次いで配列を決定して、前記突然変異の対立遺伝子が存在するかどうかを判定する。使用される検出法は、専門知識、技術、及び試薬の利用可能性に基づいて変化する。
【００２７】
以下の定義は、本明細書の開示の理解において当業者を補助するために提供される。これら定義は、当該技術分野において知られているものを例示することを意図するため、提示される特定の要素に限定することを意図するものではない。
【００２８】
用語「治療すること」（又は「治療する」若しくは「治療」）は、症状、障害、状態、若しくは疾患の進行又は重篤度を遅延、中断、抑止、制御、低下、又は逆行させることを含むプロセスを指す。
【００２９】
「患者」は哺乳類、好ましくはヒトである。
【００３０】
用語「有効量」は、患者に単回投与又は複数回投与したときに所望の治療を提供する、エンザスタウリン若しくはＨＤＡＣ２阻害剤、又は薬学的に許容できる塩の量又は用量を指す。一般に、これら治療剤の各々の最適な投与量は、個々の患者における活性成分の相対効力に依存して変化し得る。医師は、体液若しくは身体組織中の活性成分の測定された滞留時間及び濃度、並びに／又は特定の癌に関連する疾患関連バイオマーカーのモニタリングに基づいて、用量及び投与の反復数を決定することができる。
【００３１】
用語「検出可能なレベル」はウェスタンブロット又は免疫組織化学等の診断法又はアッセイによって生体サンプル中において検出されるレベルで存在する遺伝子、遺伝子転写物、又は遺伝子産物を指す。本発明では、低レベル又は検出不可能なレベルのＨＤＡＣ２とは、ＨＣＴ１１６細胞中のＨＤＡＣ２表現に比べて、ウェスタンブロットによるＨＤＡＣ２発現が２０％未満であることを指す。更に、本発明では、高レベルのＨＤＡＣ２とは、ＨＣＴ１１６細胞中のＨＤＡＣ２表現に比べて、ウェスタンブロットによるＨＤＡＣ２発現が２０％超であることを指す。
【００３２】
当該技術分野において十分確立された技術を使用して、サンプル中のＨＤＡＣ２発現を測定することができる。本質的には、患者から腫瘍生検を採取する。組織をホモジナイズし、溶解物をウェスタンブロットにより分析して、ＨＤＡＣ２タンパク質発現量を測定する。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルの場合には、腫瘍コアの切片を作製し、免疫組織化学によりＨＤＡＣ２を検出するために染色する。Ｈ−スコア等の、既知の免疫組織化学スコアリング方法により、組織病理学者は、これらサンプルが低レベルであるか高レベルであるかをスコア化する。
【００３３】
用語「フレームシフトナンセンス突然変異」とは、報告されているようにＨＤＡＣ２遺伝子のトランケート型又は不活化突然変異を指す。Ｒｏｐｅｒｏ，Ｓ．ら（２００６年）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，３８（５）：５６６−９。
【００３４】
十分確立されている方法を使用することにより、フレームシフトナンセンス突然変異を判定することができる。基本的に、患者のサンプル由来のＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び直接配列決定により解析して、フレームシフト突然変異の存在を判定する。ＤＮＡサンプルから得られた配列クロマトグラムを、野性型配列と比較してトランケート型変異を探す。Ｒｏｐｅｒｏ，Ｓ．ら。
【実施例】
【００３５】
実施例１
エンザスタウリン薬剤応答の感作物質としてのＨＤＡＣ２
アメリカンティシューカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）からＨＣＴ１１６細胞を入手し、５％のＣＯ２を含む加湿された３７℃のインキュベータ内で、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したマッコイ５Ａ培地中で培養する。各ウェルが１３ｎＭの個々のｓｉＲＮＡ二重鎖を含むように、Ｄｒｕｇｇａｂｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ ｖ２ Ｌｉｂｒａｒｙ（Ｑｉａｇｅｎ）中の１標的当り２つのｓｉＲＮＡを用いて、プレート（３８４ウェル）を予めプリントする。標準的な逆トランスフェクションプロトコルに従って、トランスフェクション試薬リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、２ｍＭのＬ−グルタミン及び２％のＦＢＳを添加したマッコイ５Ａ培地で希釈した約１５００個の細胞とを各ウェルに添加することにより、ハイスループット逆トランスフェクションを実施する。トランスフェクションの２４時間後、１％のＤＭＳＯ中の５種類の濃度のエンザスタウリン（０〜１０μＭ）で各アッセイプレートを処理する、又は処理しない。７２時間後、製造業者の推奨に従って、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）アッセイ読み出し情報に基づいて、化学発光を用いて細胞の生存率を測定する。ＵＢＢ ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）は、陽性殺細胞対照であり、Ａｌｌ Ｓｔａｒ Ｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ（ＮＳ−ＡＳ）又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は陰性対照である。
【００３６】
生シグナル値を未処理対照ウェルに対して正規化して、プレート間で比較を行う。ＩＣ５０値を決定するために、４パラメータロジスティックスモデルに適合させる。陰性対照（上記）と比較したＩＣ５０の「変化」を以下のように計算する：（ＩＣ５０標的−ＩＣ５０対照）をＩＣ５０対照で除す。
【００３７】
ＲＴ−ＰＣＲについては、細胞を上記のように逆トランスフェクトし、３７℃で７２時間ｓｉＲＮＡと共にインキュベートし、溶解前にプレート洗浄器を用いて１×ＰＢＳで洗浄する。製造業者のプロトコルに従って、磁気ビーズ（Ａｍｂｉｏｎ，ＭａｇＭａｘ−９６全ＲＮＡ単離キット、カタログ番号１８３０）を使用してＲＮＡを抽出する。ＮａｎｏＤｒｏｐ−１０００分光光度計を使用して、サンプルの全ＲＮＡ濃度を測定する。ｃＤＮＡを合成するためにＢｉｏ−Ｒａｄ製ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（カタログ番号１７０−８８９１）を用い、製造業者の推奨に従って、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ製ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｔｅｔｒａｄ Ｐｅｌｔｉｅｒサーマルサイクラーで反応を実行する。ｑＰＣＲ反応体積１０μＬ当たり５ナノグラム（５ｎｇ）のｃＤＮＡを用いる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ化学（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、遺伝子特異的ｑＰＣＲを実施し、ＡＢＩ ７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲシステムで実行する。内因性のグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、バッファ、スクランブルド対照（上記）及び無テンプレート対照（プローブに対する標準物質）を用いて、１サンプル当り３回ずつ反応を実施する。遺伝子の発現値をＧＡＰＤＨに対して正規化し、ＡＢＩ製ＳＤＳ ＲＱ Ｍａｎａｇｅｒ１．２ソフトウェアを用いて相対定量法（ΔΔＣＴ方法）により計算する。ＣＴは標準的な測定基準であり、サイクル閾値数を指す。内因性発現に対する、特定のｓｉＲＮＡによる対象遺伝子のノックダウンは、以下のように得られる：
（ΔＣＴ）試験＝［平均標的遺伝子ＣＴ−平均ＧＡＰＤＨ ＣＴ］試験
（ΔＣＴ）対照＝［平均標的遺伝子ＣＴ−平均ＧＡＰＤＨ ＣＴ］対照
ΔΔＣＴ＝（ΔＣＴ）試験−（ΔＣＴ）対照
ＲＱ＝２−ΔΔＣＴ
％ＫＤ＝（ＲＱｓｉ−ＲＱバッファ）×１００／ＲＱバッファ
式中「試験」は、処理された（ｓｉ）ｓｉＲＮＡ又はバッファ対照（バッファ）を指し；「対照」は、陰性対照であるスクランブルドｓｉＲＮＡ対照を指す。それぞれ、ＲＱｓｉ及びＲＱバッファを上記のように計算して、（内因性量の）ｓｉＲＮＡで処理した及び処理していない対象標的の相対遺伝子発現値を決定する。
【００３８】
ＨＤＡＣ２を標的とする３つのｓｉＲＮＡは、ＩＣ５０値が２倍超変化したことから分かるように、陰性対照に比べて用量応答性死滅曲線を変化させるため、ＨＣＴ１１６のエンザスタウリンの効果に対する感受性を高める。ハイコンテンツ画像は、陰性対照及びいずれかの条件のみに比べて、エンザスタウリン及びＨＤＡＣ２ ｓｉＲＮＡで処理されたＨＣＴ１１６細胞の細胞死滅が高程度であることを反映している（データは示さない）。
【００３９】
【表１】
【００４０】
実施例２
ＨＣＴ１１６と比べたＲＫＯにおけるエンザスタウリンの活性増強
ヒト結腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６（ＨＤＡＣ２野性型）と、ＨＣＴ１１６に比べてＨＤＡＣ２のタンパク質発現を生じなくさせるナンセンス突然変異を含む細胞株であるＲＫＯ（ＨＤＡＣ２＋／−）とをアメリカンティシューカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から入手し、５％のＣＯ２を含む加湿された３７℃のインキュベータ内で、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１０％のＦＢＳを添加したＡＴＣＣ推奨増殖培地中で培養する。２５ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン及び２％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するマッコイ５Ａ培地で希釈した１０００〜２０００個の細胞を播種し、次いで１％のＤＭＳＯによるエンザスタウリンの段階希釈液（０〜１００μＭ）で処理する又は処理しないことにより、薬剤用量応答実験を実施する。７２又は９６時間後、製造業者の推奨に従って、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）アッセイ読み出し情報に基づいて、化学発光を用いて細胞の生存率を測定する。生シグナル値を未処理対照に対して正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）により非線形曲線を適合させることによって分析する。
【００４１】
薬剤用量応答曲線は、ＨＣＴ１１６に比べてＲＫＯ細胞中では、ＩＣ５０及びエンザスタウリンによる増殖阻害の最大効果において有意な差（２倍超）を示す。ＲＫＯ細胞におけるＩＣ５０が３．５６μＭであるのに対して、ＨＣＴ１１６細胞におけるエンザスタウリンのＩＣ５０は、８．３４μＭである。更に、ＲＫＯ（９５〜１００％）におけるエンザスタウリンの最大死滅効果は、ＨＣＴ１１６（５０〜６０％）よりも大きい。これらデータは、ＨＤＡＣ２ノックダウンがエンザスタウリン応答に対する感受性を高めることを遺伝学的に確認する。
【００４２】
実施例３
インビトロにおける増殖阻害及び併用薬剤研究
クラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤及びエンザスタウリンが有益な効果を提供するかどうかを判定するために、癌細胞の増殖阻害について、ＭＳ−２７５、クラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤、及びエンザスタウリンをアッセイする。
【００４３】
アメリカンティシューカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から入手したヒト結腸癌細胞株ＨＣＴ１１６を、５％ＣＯ２を含む加湿された３７℃のインキュベータ内にて、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１０％のＦＢＳを含有するマッコイ５Ａ培地中で単層として維持する。薬剤処理の２４時間前に、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングされた９６ウェルプレート中の、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン及び２％のＦＢＳを含有するマッコイ５Ａ培地に、指数関数的に増殖するＨＣＴ１１６細胞（２０００細胞／ウェル）をプレーティングする。（ｉ）Ｓ字形用量応答曲線からＩＣ５０値を決定するために、ある範囲の濃度のエンザスタウリン（０〜１０μＭ）及びＭＳ−２７５（０〜４μＭ）単独で、（ｉｉ）全て固定比デザインに従って、最終濃度０．０２％のＤＭＳＯ中において、３種の固定されたＩＣ５０比（２．５、５、１０）でエンザスタウリン及びＭＳ−２７５を同時に添加することにより、細胞を７２時間処理する（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｆ．ら（２００４年）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，１０８（３）：４６４−７２；Ｔａｌｌａｒｉｄａ，Ｒ．Ｊ．ら（１９９７年）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ，６１（２６）：ＰＬ４１７−２５）。次いで、細胞を固定し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色する。Ａｃｕｍｅｎ Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステム（Ａｃｕｍｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ，ＵＫ）により、細胞数を測定する。
【００４４】
組み合わせ指数（ＣＩ）を計算するために、Ｃａｌｃｕｓｙｎソフトウェア（Ｂｉｏｓｏｆｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を使用することにより、Ｃｈｏｕ及びＴａｌａｌａｙ（Ｃｈｏｕ，Ｔ．Ｃ．及びＰ．Ｔａｌａｌａｙ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｏｓｅ−ｅｆｆｅｃｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｒｕｇｓ ｏｒ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，Ａｄｖ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ，１９８４年．２２：ｐ．２７−５５）によって提唱されたメジアン効果原理によりデータを解析する。ＣＩは、異なる薬剤間の相互作用の程度の定量的測定値である：ＣＩ＝１である場合、相加性；ＣＩ＞１である場合、拮抗作用；及びＣＩ＜１の場合、相乗作用を示す。以下の表では、Ｆａは、影響を受けた割合であり；ＣＩは、組み合わせ指数であり；ＳＤは、標準偏差であり；Ｅは、エンザスタウリンを意味し；Ｍは、ＭＳ−２７５を意味し；Ｅ／Ｍは、各薬剤のＩＣ５０値の固定比を意味する。
【００４５】
【表２】
【００４６】
エンザスタウリン及びＭＳ−２７５の同時薬剤併用研究は、試験した全ての固定比及びＦａ値にわたって相乗相互作用（ＣＩ＜１）を示す。これらデータにより、ＨＤＡＣ２の枯渇がエンザスタウリンの作用を増強するという薬理学的証拠が得られる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンザスタウリンを用いる癌の治療と併せて、生物学的マーカーとしてＨＤＡＣ２を用いる方法に関する。また、本発明は、癌治療における治療効果を高めるために、クラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤と併用されるエンザスタウリンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンザスタウリンは、ＰＫＣベータ選択的阻害剤である。エンザスタウリンは、化学名３−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−［１−［１−（ピリジン−２−イルメチル）ピペリジン−４−イル］−１Ｈ−インドール−３−イル］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンを有し、特許文献１に開示されている。
【０００３】
ＨＤＡＣは、ヒストン脱アセチル化酵素スーパーファミリーに属している。酵母の脱アセチル化酵素に対する相同性に基づいて４つのクラスに分類される、少なくとも１８種のＨＤＡＣ酵素が存在する。ＨＤＡＣは、ヒストンアセチル基転移酵素により付加されたアセチル基を除去する。アセチル基の除去により、ヒストンがＤＮＡに結合できるようになるため、ＤＮＡへのアクセスが制限される。結果として、ＨＤＡＣは、転写の発生を防ぐ。
【０００４】
Ｒｏｐｅｒｏは、子宮内膜、結腸、及び胃腫瘍サンプルが、ＨＤＡＣ２不活化突然変異を有することを報告している（非特許文献１）。癌細胞株及び腫瘍（乳房、膠芽腫、卵巣、腎臓、膀胱、及び結腸直腸腫瘍）に対するＱＲＴ−ＰＣＲは、ＨＤＡＣ２のＲＮＡ量の減少を示した（非特許文献２）。さらに、ＰｒｏｔｅｉｎＡｔｌａｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ）によって、胃、子宮内膜、卵巣、乳房、腎臓、頚部、肝臓、肺、悪性カルチノイド、リンパ腫、膵臓、甲状腺、及び前立腺腫瘍のサブセットにおいて、中程度〜陰性のＨＤＡＣ２の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色が見られることが明らかになっている。
【０００５】
クラスＩ ＨＤＡＣは、周知の転写コリプレッサーであり、インビボにおいて常に転写因子及びコファクターに結合している。生物学的データは、クラスＩ ＨＤＡＣが、細胞周期の進行、転移、及びアポトーシスに関連しており、癌治療の有望な標的であることを示唆している。ボリノスタット、デプシペプチド、ＭＳ−２７５、ＭＧＣＤ０１０３、ベリノスタット、Ｂａｃｅｃａ、パノビノスタット、ＰＣＩ−２４７８１、ＴＳＡ、ＬＡＱ８３４、ＳＢＨＡ、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、アピシジン、酪酸フェニル、ＣＩ９９４、トラポキシン、ＳＢ−４２９２０１、ビピリジニウムジエン（Ｂｉｓｐｙｒｉｄｉｎｕｍ ｄｉｅｎｅ）、ＳＨＩ−１：２、Ｒ３０６４６５、ＳＢ−３７９２７８Ａ、及びＰＣＩ−３４０５１等の、「クラス１ ＨＤＡＣ阻害剤」が知られている。
【０００６】
癌の生物学的基礎の理解及びその治療に向けて大いに進展がみられるが、癌は依然として主な死因の１つである。応答耐性及び応答の欠如は、病院で一般的に遭遇するので、薬剤に応答する患者における変異は、耐性に関する重要な課題を提起する。薬剤に応答する患者における変異には、遺伝子、併用薬療法、環境、ライフスタイル、健康状態、及び疾患状態を含む多くの要因が関与していると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，６６８，１５２号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｒｏｐｅｒｏ，Ｓ．ら（２００６年）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，３８（５）：５６６−５６９
【非特許文献２】Ｏｚｄａｇ，Ｈ．ら（２００６年）ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，７：９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
化学療法レジメンに対して最もよく応答する患者の同定に対する医学的要求が存在する。同定されている予測生物学的マーカーは僅かであり、診断試験にまで発展し、決定的に治療法の決定を導いているものは更に少ない。患者の選択アプローチは、患者に合わせて癌治療においてエンザスタウリンを使用するために重要な価値を有する。患者がエンザスタウリンによる治療に応答する可能性があるかどうかをタイムリーに決定する方法を有することには高い価値がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、先ず、エンザスタウリンの有効性の生物学的マーカーとして用いることができるＨＤＡＣ２の発現レベルを測定した後、エンザスタウリンを用いて癌を治療する方法に関する。ＨＤＡＣ２レベルが低いか又は検出不可能であるとき、エンザスタウリン単独が特に有効であると予測される。ＨＤＡＣ２レベルが高い場合、本発明は、クラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤と併用して有効量のエンザスタウリンを投与することを含む。
【００１１】
本発明は、低レベル又は検出不可能なレベルのＨＤＡＣ２を有する患者に有効量のエンザスタウリンを投与する工程を含む、患者の癌を治療する方法を含む。
【００１２】
更に、本発明は、ａ）患者から癌細胞を含むサンプルを得る工程と、ｂ）癌サンプル中のＨＤＡＣ２レベルを測定する工程と、ｃ）前記癌サンプルが、低レベル又は検出不可能なレベルのＨＤＡＣ２を有する場合、前記患者に有効量のエンザスタウリンを投与する工程と、を含む患者の癌を治療する方法を提供する。
【００１３】
本発明は、ＨＤＡＣ２のフレームシフトナンセンス突然変異を有する患者に有効量のエンザスタウリンを投与する工程を含む、患者の癌を治療する方法を含む。
【００１４】
更に、本発明は、ａ）患者から癌細胞を含むサンプルを得る工程と、ｂ）癌サンプル中のＨＤＡＣ２が突然変異しているかどうかを判定する工程と、ｃ）前記患者のサンプルがＨＤＡＣ２のフレームシフトナンセンス突然変異を有する場合、前記患者に有効量のエンザスタウリンを投与する工程と、を含む患者の癌を治療する方法を提供する。
【００１５】
本発明は、患者の癌を治療する方法であって、有効量のエンザスタウリンと、有効量のクラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤とを、高レベルのＨＤＡＣ２を有する患者に投与する工程を含む方法を含む。
【００１６】
更に、本発明は、ａ）患者から癌細胞を含むサンプルを得る工程と、ｂ）癌サンプル中のＨＤＡＣ２レベルを測定する工程と、ｃ）前記癌サンプルが高レベルのＨＤＡＣ２を有する場合、有効量のエンザスタウリンと、有効量のクラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤とを前記患者に投与する工程と、を含む患者の癌を治療する方法を提供する。
【００１７】
本発明は、低レベル又は検出不可能なレベルのＨＤＡＣ２を有する患者の癌を治療するための医薬の製造におけるエンザスタウリンの使用を含む。
【００１８】
更に、本発明は、患者の癌を治療するための医薬の製造において、クラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤と併用されるエンザスタウリンの使用であって、前記患者が高レベルのＨＤＡＣ２を有し、前記医薬がクラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤と併用投与される使用を提供する。
【００１９】
本発明は、前記癌が、結腸直腸癌、胃癌、子宮内膜癌、卵巣癌、乳癌、肝臓癌、肺癌、腎臓癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、膠芽腫、リンパ腫、膵臓癌、及び前立腺癌からなる群から選択される、本明細書に記載される方法及び使用を提供する。更に、クラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤は、ボリノスタット、デプシペプチド、ＭＳ−２７５、ＭＧＣＤ０１０３、ベリノスタット、Ｂａｃｅｃａ、パノビノスタット、ＰＣＩ−２４７８１、ＴＳＡ、ＬＡＱ８３４、ＳＢＨＡ、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、アピシジン、酪酸フェニル、ＣＩ９９４、トラポキシン、ＳＢ−４２９２０１、ビピリジニウムジエン、ＳＨＩ−１：２、Ｒ３０６４６５、ＳＢ−３７９２７８Ａ、及びＰＣＩ−３４０５１からなる群から選択され得る。
【００２０】
本発明は、患者の予後予測、及び癌治療においてエンザスタウリンを使用するために現在利用可能な治療法のインフォームドセレクションに役立つ生物学的マーカーの同定を含む。本発明は、好ましい生物学的マーカーとしてＨＤＡＣ２を使用する。
【００２１】
腫瘍の発達中に獲得される遺伝子異常は、疾患のドライバー、及び癌のテーラーメイド治療を行う機会の両方を意味する。特定の種類の腫瘍において遺伝子及び経路が変化している患者は、ターゲティング治療に対して異なる応答をする可能性がある。発見プロセスにおいてこれら薬剤感受性の遺伝的決定因子を早期に理解することは、臨床的指示、患者の層別化、及び併用研究に関する決定を改善及び加速させるのに役立ち得る。
【００２２】
これらの分集団は、治療効果、及び単剤としての又はクラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤と併用されるエンザスタウリンに対する応答の改善を標的とし得る、機能の低下したＨＤＡＣ２プロファイルを有する患者群を表す。
【００２３】
本発明は、結腸直腸癌、胃癌、子宮内膜癌、卵巣癌、乳癌、肝臓癌、肺癌、腎臓癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、膠芽腫、リンパ腫、膵臓癌、及び前立腺癌からなる群から選択される癌の治療に関する。
【００２４】
本発明は、エンザスタウリンと併用される、ボリノスタット、デプシペプチド、ＭＳ−２７５、ＭＧＣＤ０１０３、ベリノスタット、Ｂａｃｅｃａ、パノビノスタット、ＰＣＩ−２４７８１、ＴＳＡ、ＬＡＱ８３４、ＳＢＨＡ、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、アピシジン、酪酸フェニル、ＣＩ９９４、トラポキシン、ＳＢ−４２９２０１、ビピリジニウムジエン、ＳＨＩ−１：２、Ｒ３０６４６５、ＳＢ−３７９２７８Ａ、及びＰＣＩ−３４０５１からなる群から選択されるクラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤の使用を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
癌細胞の遺伝子又はタンパク質表現を測定するための多くの方法が知られている。免疫組織化学、ウェスタンブロット、マイクロアレイ及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、癌型、癌亜型、予後及び治療効果を分子的に理解するために用いられている幾つかの例である。遺伝子及びタンパク質発現を測定するためのこれら方法の開発により、癌の分類及び多様な種類の腫瘍の予後予測の生物学的マーカーを探し、体系的に評価することが可能になる。
【００２６】
本発明ではＨＤＡＣ２タンパク質発現は、ウェスタンブロット又は免疫組織化学によりアッセイ又は検出されることが好ましい。更に、本発明では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＨＤＡＣ２の突然変異をアッセイし、次いで配列を決定して、前記突然変異の対立遺伝子が存在するかどうかを判定する。使用される検出法は、専門知識、技術、及び試薬の利用可能性に基づいて変化する。
【００２７】
以下の定義は、本明細書の開示の理解において当業者を補助するために提供される。これら定義は、当該技術分野において知られているものを例示することを意図するため、提示される特定の要素に限定することを意図するものではない。
【００２８】
用語「治療すること」（又は「治療する」若しくは「治療」）は、症状、障害、状態、若しくは疾患の進行又は重篤度を遅延、中断、抑止、制御、低下、又は逆行させることを含むプロセスを指す。
【００２９】
「患者」は哺乳類、好ましくはヒトである。
【００３０】
用語「有効量」は、患者に単回投与又は複数回投与したときに所望の治療を提供する、エンザスタウリン若しくはＨＤＡＣ２阻害剤、又は薬学的に許容できる塩の量又は用量を指す。一般に、これら治療剤の各々の最適な投与量は、個々の患者における活性成分の相対効力に依存して変化し得る。医師は、体液若しくは身体組織中の活性成分の測定された滞留時間及び濃度、並びに／又は特定の癌に関連する疾患関連バイオマーカーのモニタリングに基づいて、用量及び投与の反復数を決定することができる。
【００３１】
用語「検出可能なレベル」はウェスタンブロット又は免疫組織化学等の診断法又はアッセイによって生体サンプル中において検出されるレベルで存在する遺伝子、遺伝子転写物、又は遺伝子産物を指す。本発明では、低レベル又は検出不可能なレベルのＨＤＡＣ２とは、ＨＣＴ１１６細胞中のＨＤＡＣ２表現に比べて、ウェスタンブロットによるＨＤＡＣ２発現が２０％未満であることを指す。更に、本発明では、高レベルのＨＤＡＣ２とは、ＨＣＴ１１６細胞中のＨＤＡＣ２表現に比べて、ウェスタンブロットによるＨＤＡＣ２発現が２０％超であることを指す。
【００３２】
当該技術分野において十分確立された技術を使用して、サンプル中のＨＤＡＣ２発現を測定することができる。本質的には、患者から腫瘍生検を採取する。組織をホモジナイズし、溶解物をウェスタンブロットにより分析して、ＨＤＡＣ２タンパク質発現量を測定する。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルの場合には、腫瘍コアの切片を作製し、免疫組織化学によりＨＤＡＣ２を検出するために染色する。Ｈ−スコア等の、既知の免疫組織化学スコアリング方法により、組織病理学者は、これらサンプルが低レベルであるか高レベルであるかをスコア化する。
【００３３】
用語「フレームシフトナンセンス突然変異」とは、報告されているようにＨＤＡＣ２遺伝子のトランケート型又は不活化突然変異を指す。Ｒｏｐｅｒｏ，Ｓ．ら（２００６年）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，３８（５）：５６６−９。
【００３４】
十分確立されている方法を使用することにより、フレームシフトナンセンス突然変異を判定することができる。基本的に、患者のサンプル由来のＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び直接配列決定により解析して、フレームシフト突然変異の存在を判定する。ＤＮＡサンプルから得られた配列クロマトグラムを、野性型配列と比較してトランケート型変異を探す。Ｒｏｐｅｒｏ，Ｓ．ら。
【実施例】
【００３５】
実施例１
エンザスタウリン薬剤応答の感作物質としてのＨＤＡＣ２
アメリカンティシューカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）からＨＣＴ１１６細胞を入手し、５％のＣＯ２を含む加湿された３７℃のインキュベータ内で、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したマッコイ５Ａ培地中で培養する。各ウェルが１３ｎＭの個々のｓｉＲＮＡ二重鎖を含むように、Ｄｒｕｇｇａｂｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ ｖ２ Ｌｉｂｒａｒｙ（Ｑｉａｇｅｎ）中の１標的当り２つのｓｉＲＮＡを用いて、プレート（３８４ウェル）を予めプリントする。標準的な逆トランスフェクションプロトコルに従って、トランスフェクション試薬リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、２ｍＭのＬ−グルタミン及び２％のＦＢＳを添加したマッコイ５Ａ培地で希釈した約１５００個の細胞とを各ウェルに添加することにより、ハイスループット逆トランスフェクションを実施する。トランスフェクションの２４時間後、１％のＤＭＳＯ中の５種類の濃度のエンザスタウリン（０〜１０μＭ）で各アッセイプレートを処理する、又は処理しない。７２時間後、製造業者の推奨に従って、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）アッセイ読み出し情報に基づいて、化学発光を用いて細胞の生存率を測定する。ＵＢＢ ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）は、陽性殺細胞対照であり、Ａｌｌ Ｓｔａｒ Ｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ（ＮＳ−ＡＳ）又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は陰性対照である。
【００３６】
生シグナル値を未処理対照ウェルに対して正規化して、プレート間で比較を行う。ＩＣ５０値を決定するために、４パラメータロジスティックスモデルに適合させる。陰性対照（上記）と比較したＩＣ５０の「変化」を以下のように計算する：（ＩＣ５０標的−ＩＣ５０対照）をＩＣ５０対照で除す。
【００３７】
ＲＴ−ＰＣＲについては、細胞を上記のように逆トランスフェクトし、３７℃で７２時間ｓｉＲＮＡと共にインキュベートし、溶解前にプレート洗浄器を用いて１×ＰＢＳで洗浄する。製造業者のプロトコルに従って、磁気ビーズ（Ａｍｂｉｏｎ，ＭａｇＭａｘ−９６全ＲＮＡ単離キット、カタログ番号１８３０）を使用してＲＮＡを抽出する。ＮａｎｏＤｒｏｐ−１０００分光光度計を使用して、サンプルの全ＲＮＡ濃度を測定する。ｃＤＮＡを合成するためにＢｉｏ−Ｒａｄ製ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（カタログ番号１７０−８８９１）を用い、製造業者の推奨に従って、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ製ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｔｅｔｒａｄ Ｐｅｌｔｉｅｒサーマルサイクラーで反応を実行する。ｑＰＣＲ反応体積１０μＬ当たり５ナノグラム（５ｎｇ）のｃＤＮＡを用いる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ化学（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、遺伝子特異的ｑＰＣＲを実施し、ＡＢＩ ７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲシステムで実行する。内因性のグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、バッファ、スクランブルド対照（上記）及び無テンプレート対照（プローブに対する標準物質）を用いて、１サンプル当り３回ずつ反応を実施する。遺伝子の発現値をＧＡＰＤＨに対して正規化し、ＡＢＩ製ＳＤＳ ＲＱ Ｍａｎａｇｅｒ１．２ソフトウェアを用いて相対定量法（ΔΔＣＴ方法）により計算する。ＣＴは標準的な測定基準であり、サイクル閾値数を指す。内因性発現に対する、特定のｓｉＲＮＡによる対象遺伝子のノックダウンは、以下のように得られる：
（ΔＣＴ）試験＝［平均標的遺伝子ＣＴ−平均ＧＡＰＤＨ ＣＴ］試験
（ΔＣＴ）対照＝［平均標的遺伝子ＣＴ−平均ＧＡＰＤＨ ＣＴ］対照
ΔΔＣＴ＝（ΔＣＴ）試験−（ΔＣＴ）対照
ＲＱ＝２−ΔΔＣＴ
％ＫＤ＝（ＲＱｓｉ−ＲＱバッファ）×１００／ＲＱバッファ
式中「試験」は、処理された（ｓｉ）ｓｉＲＮＡ又はバッファ対照（バッファ）を指し；「対照」は、陰性対照であるスクランブルドｓｉＲＮＡ対照を指す。それぞれ、ＲＱｓｉ及びＲＱバッファを上記のように計算して、（内因性量の）ｓｉＲＮＡで処理した及び処理していない対象標的の相対遺伝子発現値を決定する。
【００３８】
ＨＤＡＣ２を標的とする３つのｓｉＲＮＡは、ＩＣ５０値が２倍超変化したことから分かるように、陰性対照に比べて用量応答性死滅曲線を変化させるため、ＨＣＴ１１６のエンザスタウリンの効果に対する感受性を高める。ハイコンテンツ画像は、陰性対照及びいずれかの条件のみに比べて、エンザスタウリン及びＨＤＡＣ２ ｓｉＲＮＡで処理されたＨＣＴ１１６細胞の細胞死滅が高程度であることを反映している（データは示さない）。
【００３９】
【表１】
【００４０】
実施例２
ＨＣＴ１１６と比べたＲＫＯにおけるエンザスタウリンの活性増強
ヒト結腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６（ＨＤＡＣ２野性型）と、ＨＣＴ１１６に比べてＨＤＡＣ２のタンパク質発現を生じなくさせるナンセンス突然変異を含む細胞株であるＲＫＯ（ＨＤＡＣ２＋／−）とをアメリカンティシューカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から入手し、５％のＣＯ２を含む加湿された３７℃のインキュベータ内で、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１０％のＦＢＳを添加したＡＴＣＣ推奨増殖培地中で培養する。２５ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン及び２％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するマッコイ５Ａ培地で希釈した１０００〜２０００個の細胞を播種し、次いで１％のＤＭＳＯによるエンザスタウリンの段階希釈液（０〜１００μＭ）で処理する又は処理しないことにより、薬剤用量応答実験を実施する。７２又は９６時間後、製造業者の推奨に従って、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）アッセイ読み出し情報に基づいて、化学発光を用いて細胞の生存率を測定する。生シグナル値を未処理対照に対して正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）により非線形曲線を適合させることによって分析する。
【００４１】
薬剤用量応答曲線は、ＨＣＴ１１６に比べてＲＫＯ細胞中では、ＩＣ５０及びエンザスタウリンによる増殖阻害の最大効果において有意な差（２倍超）を示す。ＲＫＯ細胞におけるＩＣ５０が３．５６μＭであるのに対して、ＨＣＴ１１６細胞におけるエンザスタウリンのＩＣ５０は、８．３４μＭである。更に、ＲＫＯ（９５〜１００％）におけるエンザスタウリンの最大死滅効果は、ＨＣＴ１１６（５０〜６０％）よりも大きい。これらデータは、ＨＤＡＣ２ノックダウンがエンザスタウリン応答に対する感受性を高めることを遺伝学的に確認する。
【００４２】
実施例３
インビトロにおける増殖阻害及び併用薬剤研究
クラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤及びエンザスタウリンが有益な効果を提供するかどうかを判定するために、癌細胞の増殖阻害について、ＭＳ−２７５、クラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤、及びエンザスタウリンをアッセイする。
【００４３】
アメリカンティシューカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から入手したヒト結腸癌細胞株ＨＣＴ１１６を、５％ＣＯ２を含む加湿された３７℃のインキュベータ内にて、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１０％のＦＢＳを含有するマッコイ５Ａ培地中で単層として維持する。薬剤処理の２４時間前に、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングされた９６ウェルプレート中の、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン及び２％のＦＢＳを含有するマッコイ５Ａ培地に、指数関数的に増殖するＨＣＴ１１６細胞（２０００細胞／ウェル）をプレーティングする。（ｉ）Ｓ字形用量応答曲線からＩＣ５０値を決定するために、ある範囲の濃度のエンザスタウリン（０〜１０μＭ）及びＭＳ−２７５（０〜４μＭ）単独で、（ｉｉ）全て固定比デザインに従って、最終濃度０．０２％のＤＭＳＯ中において、３種の固定されたＩＣ５０比（２．５、５、１０）でエンザスタウリン及びＭＳ−２７５を同時に添加することにより、細胞を７２時間処理する（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｆ．ら（２００４年）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，１０８（３）：４６４−７２；Ｔａｌｌａｒｉｄａ，Ｒ．Ｊ．ら（１９９７年）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ，６１（２６）：ＰＬ４１７−２５）。次いで、細胞を固定し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色する。Ａｃｕｍｅｎ Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステム（Ａｃｕｍｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ，ＵＫ）により、細胞数を測定する。
【００４４】
組み合わせ指数（ＣＩ）を計算するために、Ｃａｌｃｕｓｙｎソフトウェア（Ｂｉｏｓｏｆｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を使用することにより、Ｃｈｏｕ及びＴａｌａｌａｙ（Ｃｈｏｕ，Ｔ．Ｃ．及びＰ．Ｔａｌａｌａｙ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｏｓｅ−ｅｆｆｅｃｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｒｕｇｓ ｏｒ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，Ａｄｖ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ，１９８４年．２２：ｐ．２７−５５）によって提唱されたメジアン効果原理によりデータを解析する。ＣＩは、異なる薬剤間の相互作用の程度の定量的測定値である：ＣＩ＝１である場合、相加性；ＣＩ＞１である場合、拮抗作用；及びＣＩ＜１の場合、相乗作用を示す。以下の表では、Ｆａは、影響を受けた割合であり；ＣＩは、組み合わせ指数であり；ＳＤは、標準偏差であり；Ｅは、エンザスタウリンを意味し；Ｍは、ＭＳ−２７５を意味し；Ｅ／Ｍは、各薬剤のＩＣ５０値の固定比を意味する。
【００４５】
【表２】
【００４６】
エンザスタウリン及びＭＳ−２７５の同時薬剤併用研究は、試験した全ての固定比及びＦａ値にわたって相乗相互作用（ＣＩ＜１）を示す。これらデータにより、ＨＤＡＣ２の枯渇がエンザスタウリンの作用を増強するという薬理学的証拠が得られる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低レベル又は検出不可能なレベルのＨＤＡＣ２を有する患者に有効量のエンザスタウリンを投与する工程を含む患者の癌を治療する方法。
【請求項２】
ａ）患者から癌細胞を含むサンプルを得る工程と、
ｂ）癌サンプル中のＨＤＡＣ２レベルを測定する工程と、
ｃ）前記患者のサンプルが、低レベル又は検出不可能なレベルのＨＤＡＣ２を有する場合、前記患者に有効量のエンザスタウリンを投与する工程と、
を含む患者の癌を治療する方法。
【請求項３】
ＨＤＡＣ２のフレームシフトナンセンス突然変異を有する患者に有効量のエンザスタウリンを投与する工程を含む患者の癌を治療する方法。
【請求項４】
ａ）患者から癌細胞を含むサンプルを得る工程と、
ｂ）癌サンプル中のＨＤＡＣ２が突然変異しているかどうかを決定する工程と、
ｃ）前記患者のサンプルがＨＤＡＣ２のフレームシフトナンセンス突然変異を有する場合、前記患者に有効量のエンザスタウリンを投与する工程と、
を含む患者の癌を治療する方法。
【請求項５】
有効量のエンザスタウリンと、有効量のクラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤とを、高レベルのＨＤＡＣ２を有する患者に投与する工程を含む患者の癌を治療する方法。
【請求項６】
ａ）患者から癌細胞を含むサンプルを得る工程と、
ｂ）癌サンプル中のＨＤＡＣ２レベルを測定する工程と、
ｃ）前記患者のサンプルが高レベルのＨＤＡＣ２を有する場合、有効量のエンザスタウリンと、有効量のクラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤とを前記患者に投与する工程と、
を含む患者の癌を治療する方法。
【請求項７】
クラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤が、ボリノスタット、デプシペプチド、ＭＳ−２７５、ＭＧＣＤ０１０３、ベリノスタット、Ｂａｃｅｃａ、パノビノスタット、ＰＣＩ−２４７８１、ＴＳＡ、ＬＡＱ８３４、ＳＢＨＡ、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、アピシジン、酪酸フェニル、ＣＩ９９４、トラポキシン、ＳＢ−４２９２０１、ビピリジニウムジエン、ＳＨＩ−１：２、Ｒ３０６４６５、ＳＢ−３７９２７８Ａ、及びＰＣＩ−３４０５１からなる群から選択される、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
癌が、結腸直腸癌、胃癌、子宮内膜癌、卵巣癌、乳癌、肝臓癌、肺癌、腎臓癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、膠芽腫、リンパ腫、膵臓癌及び前立腺癌からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
低レベル又は検出不可能なレベルのＨＤＡＣ２を有する患者の癌を治療するための医薬の製造におけるエンザスタウリンの使用。
【請求項１０】
患者の癌を治療するための医薬の製造において、クラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤と併用されるエンザスタウリンの使用であって、前記患者が高レベルのＨＤＡＣ２を有し、前記医薬がクラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤と併用投与される使用。
【請求項１１】
クラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤が、ボリノスタット、デプシペプチド、ＭＳ−２７５、ＭＧＣＤ０１０３、ベリノスタット、Ｂａｃｅｃａ、パノビノスタット、ＰＣＩ−２４７８１、ＴＳＡ、ＬＡＱ８３４、ＳＢＨＡ、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、アピシジン、酪酸フェニル、ＣＩ９９４、トラポキシン、ＳＢ−４２９２０１、ビピリジニウムジエン、ＳＨＩ−１：２、Ｒ３０６４６５、ＳＢ−３７９２７８Ａ、及びＰＣＩ−３４０５１からなる群から選択される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
癌が、結腸直腸癌、胃癌、子宮内膜癌、卵巣癌、乳癌、肝臓癌、肺癌、腎臓癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、膠芽腫、リンパ腫、膵臓癌及び前立腺癌からなる群から選択される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１】
低レベル又は検出不可能なレベルのＨＤＡＣ２を有する患者に有効量のエンザスタウリンを投与する工程を含む患者の癌を治療する方法。
【請求項２】
ａ）患者から癌細胞を含むサンプルを得る工程と、
ｂ）癌サンプル中のＨＤＡＣ２レベルを測定する工程と、
ｃ）前記患者のサンプルが、低レベル又は検出不可能なレベルのＨＤＡＣ２を有する場合、前記患者に有効量のエンザスタウリンを投与する工程と、
を含む患者の癌を治療する方法。
【請求項３】
ＨＤＡＣ２のフレームシフトナンセンス突然変異を有する患者に有効量のエンザスタウリンを投与する工程を含む患者の癌を治療する方法。
【請求項４】
ａ）患者から癌細胞を含むサンプルを得る工程と、
ｂ）癌サンプル中のＨＤＡＣ２が突然変異しているかどうかを決定する工程と、
ｃ）前記患者のサンプルがＨＤＡＣ２のフレームシフトナンセンス突然変異を有する場合、前記患者に有効量のエンザスタウリンを投与する工程と、
を含む患者の癌を治療する方法。
【請求項５】
有効量のエンザスタウリンと、有効量のクラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤とを、高レベルのＨＤＡＣ２を有する患者に投与する工程を含む患者の癌を治療する方法。
【請求項６】
ａ）患者から癌細胞を含むサンプルを得る工程と、
ｂ）癌サンプル中のＨＤＡＣ２レベルを測定する工程と、
ｃ）前記患者のサンプルが高レベルのＨＤＡＣ２を有する場合、有効量のエンザスタウリンと、有効量のクラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤とを前記患者に投与する工程と、
を含む患者の癌を治療する方法。
【請求項７】
クラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤が、ボリノスタット、デプシペプチド、ＭＳ−２７５、ＭＧＣＤ０１０３、ベリノスタット、Ｂａｃｅｃａ、パノビノスタット、ＰＣＩ−２４７８１、ＴＳＡ、ＬＡＱ８３４、ＳＢＨＡ、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、アピシジン、酪酸フェニル、ＣＩ９９４、トラポキシン、ＳＢ−４２９２０１、ビピリジニウムジエン、ＳＨＩ−１：２、Ｒ３０６４６５、ＳＢ−３７９２７８Ａ、及びＰＣＩ−３４０５１からなる群から選択される、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
癌が、結腸直腸癌、胃癌、子宮内膜癌、卵巣癌、乳癌、肝臓癌、肺癌、腎臓癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、膠芽腫、リンパ腫、膵臓癌及び前立腺癌からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
低レベル又は検出不可能なレベルのＨＤＡＣ２を有する患者の癌を治療するための医薬の製造におけるエンザスタウリンの使用。
【請求項１０】
患者の癌を治療するための医薬の製造において、クラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤と併用されるエンザスタウリンの使用であって、前記患者が高レベルのＨＤＡＣ２を有し、前記医薬がクラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤と併用投与される使用。
【請求項１１】
クラスＩ選択的ＨＤＡＣ阻害剤が、ボリノスタット、デプシペプチド、ＭＳ−２７５、ＭＧＣＤ０１０３、ベリノスタット、Ｂａｃｅｃａ、パノビノスタット、ＰＣＩ−２４７８１、ＴＳＡ、ＬＡＱ８３４、ＳＢＨＡ、酪酸ナトリウム、バルプロ酸、アピシジン、酪酸フェニル、ＣＩ９９４、トラポキシン、ＳＢ−４２９２０１、ビピリジニウムジエン、ＳＨＩ−１：２、Ｒ３０６４６５、ＳＢ−３７９２７８Ａ、及びＰＣＩ−３４０５１からなる群から選択される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
癌が、結腸直腸癌、胃癌、子宮内膜癌、卵巣癌、乳癌、肝臓癌、肺癌、腎臓癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、膠芽腫、リンパ腫、膵臓癌及び前立腺癌からなる群から選択される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【公表番号】特表２０１２−５１２１５７（Ｐ２０１２−５１２１５７Ａ）
【公表日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４０７９６（Ｐ２０１１−５４０７９６）
【出願日】平成２１年１２月７日（２００９．１２．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６９２５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７４９３６
【国際公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【出願人】（５９４１９７８７２）イーライ リリー アンド カンパニー (301)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月７日（２００９．１２．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６９２５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７４９３６
【国際公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【出願人】（５９４１９７８７２）イーライ リリー アンド カンパニー (301)
【Ｆターム（参考）】
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