神経新生促進剤
【課 題】本発明は、神経疾患を治療するのに有効な神経新生を促進させうる薬剤を提供することを目的とする。
【解決手段】（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として含有することを特徴とする神経新生促進剤。
【解決手段】（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として含有することを特徴とする神経新生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は神経新生促進剤に関し、更に詳しくは肝細胞増殖因子（以下、ＨＧＦと略記する。）又はそれをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分とする神経新生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経細胞は、一旦分化成熟すると、分裂できないため神経変性が神経細胞数の減少に直結する。例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）又はハンチントン病等は、選択的な神経細胞死が進行性に起きる神経変性疾患として知られている。現在、これら疾患に対する治療に、神経変性に伴う神経伝達物質の枯渇を補う補充療法剤や対症療法剤等が使用されている。しかしながら、それら補充療法剤や対症療法剤が神経変性の進行を抑制させるわけではなく、病状の進行とともにそれらの効果は徐々に失われていく。その為、神経変性の進行を抑制し、残存した神経再生を促す薬剤の開発が望まれるが、現状ではこのような作用を有する薬剤は見出されていない。また、これまで長い間中枢神経系において神経変性が生じた場合、神経新生が不可能とされてきた。しかし、ごく最近になりヒトを含む成熟した哺乳動物の中枢神経系には神経を新生しうる神経幹細胞及び神経前駆細胞が存在する事が相次いで明らかにされ、内在性の神経幹細胞を活性化することにより障害された神経組織及び機能を再生する可能性が検討され始めた（例えば非特許文献１，２）。
【０００３】
一方、ＨＧＦは、最初に成熟肝細胞に対する強力なマイトゲンとして同定され、１９８９年にその遺伝子クローニングがなされた（非特許文献３、４参照）。ＨＧＦの投与は、抗アポトーシス活性によって劇症肝炎を伴うマウスにおけるエンドトキシン誘発致死的肝障害を予防し、ＨＧＦ遺伝子治療は致命的な肝硬変を持つラットの生存率を改善し得る（非特許文献５、６参照）。また、ノックアウト／ノックインマウスの手法を含む発現及び機能的解析における近年の多数の研究により、ＨＧＦは新規な神経栄養因子であることも明らかにされた（非特許文献７、８参照）。とりわけＨＧＦは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）に匹敵する運動ニューロンに対する最も強力な生存促進因子の一つとして知られている（非特許文献９参照）。
【０００４】
また、特許文献１には、パーキンソン病で変性する中脳黒質ドーパミンニューロンを薬剤投与により特異的に死滅させる中脳黒質ドーパミンニューロン細胞死誘導ラットを用いて、ＨＧＦ遺伝子の神経変性疾患への作用効果を行動学的に及び組織学的に検討した実施例が示されている。具体的には、ＨＧＦ遺伝子の前投与が、中脳黒質ドーパミンニューロンを神経毒６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）から保護し、中脳黒質ドーパミンニューロン細胞死誘導ラットの症状を抑えたことが示されている。そして、この特許文献１では、このような実験結果に基づいて、ＨＧＦ遺伝子がドーパミンニューロンに対する保護作用を有すると記載されている。また、特許文献２には、ＨＧＦは運動ニューロンに対する直接的神経栄養因子活性と、運動ニューロンに対するグルタミン酸細胞毒性の間接的な改善作用（神経保護作用）の２つの作用を有すると記載されている。しかしながら、ＨＧＦが神経毒６−ＯＨＤＡやグルタミンに対して神経保護作用を示したからといって、ＨＧＦが神経細胞の新生を促進するとは到底予測できない。
さらに、特許文献３には、ＨＧＦを有効成分とする脳神経障害治療剤が記載され、ＨＧＦは神経細胞の生存を延長させるが、神経是由来の細胞であるラット好クロム性細胞腫ＰＣ１２細胞のＤＮＡ合成を促進することはない旨記載されている。還元すれば、ＨＧＦはＰＣ１２細胞の新生を促進することはないということを示すものである。このことからも、ＨＧＦが神経細胞の新生を促進するということは予測すらできない。
【特許文献１】国際公開第２００３／０４５４３９号パンフレット
【特許文献２】特開２００２−８７９８３号公報
【特許文献３】特許第３６８０１１４公報
【非特許文献１】ネイチャー・メディシン(Nature Medicine）、１９９８年、第４巻、１３１３−１３１７頁
【非特許文献２】ネイチャー・メディシン(Nature Medicine）、２０００年、第６巻、２７１−２７７頁
【非特許文献３】中村（Nakamura）ら，バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・アンド・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem．Biophys．Res．Commun．），１９８４年，第１２２巻，ｐ．１４５０−１４５９
【非特許文献４】中村（Nakamura）ら，ネイチャー（Nature），１９８９年，第３４２巻，ｐ．４４０−４４３
【非特許文献５】コウサイ（Kosai）ら，ヘパトロジー（Hepatology），１９９９年，第３０，ｐ．１５１−１５９
【非特許文献６】ウエキ（Ueki）ら，ネイチャー・メディシン（Nat．Med．），１９９９年，第５巻，ｐ．２２６−２３０．
【非特許文献７】松本（Matsumoto）ら，チバ・ファウンデイション・シンポジウム（Ciba Found．Symp．），１９９７年，第２１２巻，ｐ．１９８−２１１；ディスカッション２１１−１９４
【非特許文献８】船越（Funakoshi）ら，クリニカ・チミカ・アクタ(Clin．Chim．Acta．)，２００３年，第３２７巻，ｐ．１−２３
【非特許文献９】ニューロン（Neuron），１９９６年，第１７巻，ｐ．１１５７−１１７２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、神経新生に有効な薬剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、前記課題を解決すべく種々研究を重ねた結果、ＨＧＦ蛋白質もしくはＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド（以下において、ＨＧＦ蛋白質等ということもある。）、あるいはそれらをコードするＤＮＡ又は前記ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ（以下において、ＨＧＦ遺伝子ということもある。）が神経新生効果を奏することを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明者らは、まず神経細胞死を誘発するモデルマウスとしてＲ６／２形質転換マウスを用いて、ＨＧＦ蛋白質等又はＨＧＦ遺伝子の神経新生への関与を検討した。
本発明者らは、神経向性を有し複製能を欠如したベクター（Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ベクター）を用いてＲ６／２形質転換マウスにラットＨＧＦ遺伝子を線条体に導入し、線条体においてラットＨＧＦ蛋白質を発現するＲ６／２形質転換マウスを作製し、当該マウスを用いて、実際にＨＧＦ遺伝子が神経新生に対して効果を示すか否かを検討した。神経新生には、新しい神経細胞が生まれるので細胞分裂がなされなければいけない。細胞分裂時には、遺伝情報をコピーするためにＤＮＡが合成さる。ＤＮＡが合成されたかどうかを知る手がかりとなる物質としてＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）がある。ＢｒｄＵを体内に注入すると新しく生まれる神経（細胞）には、このＢｒｄＵが取り込まれる。このためＢｒｄＵを指標に神経新生の有無を判定できる。そこで、前記ラットＨＧＦ蛋白質を発現するＲ６／２形質転換マウスにＢｒｄＵを投与し、線条体の神経細胞に取り込まれるＢｒｄＵを測定したところ、少なくとも線条体において神経が新生されるということを見出した。また、培養神経幹細胞（neurosphere）を用いた分化アッセイにおいて、ＨＧＦ受容体が神経幹細胞や該神経幹細胞から分化した神経細胞及びアストロサイト前駆細胞に存在することを見出した。さらに、培養神経幹細胞（neurosphere）を用いた分化アッセイにおいて、ＨＧＦは神経幹細胞から新生神経細胞への分化（新生神経細胞の増加）を促進し、かつ分化した神経細胞における神経線維の伸張及び神経突起の分岐を促進させることを見出した。
このような、ＨＧＦ蛋白質又はＨＧＦ遺伝子の神経新生作用は本発明において初めて見出されたものであり、発明者らはこれら知見に基づきさらに研究を進め、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、
［１］（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として含有することを特徴とする神経新生促進剤、
［２］ 有効成分が、（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡであることを特徴とする前記［１］記載の神経新生促進剤、
［３］ ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡが、（ａ）配列番号１、２又は５で表される塩基配列からなるＤＮＡ又は（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡであることを特徴とする前記［２］記載の神経新生促進剤、
［４］ ＤＮＡが、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ベクター、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターに組み込まれていることを特徴とする前記［２］又は［３］記載の神経新生促進剤、
［５］ 有効成分が、（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩であることを特徴とする前記［１］記載の神経新生促進剤、
［６］ ＨＧＦ蛋白質が、（ａ）配列番号３、４又は６で表されるアミノ酸配列と同一又は（ｂ）前記アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質であることを特徴とする前記［５］記載の神経新生促進剤、
［７］ 神経新生促進剤が、局所投与用であることを特徴とする前記［１］〜［６］のいずれかに記載の神経新生促進剤、
［８］ 局所投与が、髄腔内投与であることを特徴とする前記［７］記載の神経新生促進剤、
［９］ 神経栄養因子と組み合わせて使用されることを特徴とする前記［１］〜［８］のいずれかに記載の神経新生促進剤、及び
［１０］ 神経栄養因子が、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＣＮＴＦ、ＧＤＮＦ及びＢＤＮＦから選択される少なくとも１種であることを特徴とする前記［９］記載の神経新生促進剤、
に関する。
【０００９】
また、本発明は（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを哺乳動物に投与することを特徴とする神経新生の促進方法に関する。さらに、本発明は、神経新生を促進する医薬を製造するための（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡの使用に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の神経新生促進剤は、神経の変性又は神経細胞死を伴う神経変性疾患や神経障害において、神経の変性や神経細胞死が誘発された部位において新たな神経の新生を促進し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において「ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ」とは、ＨＧＦ蛋白質を発現し得るＤＮＡをいう。ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡとしては、例えば、Nature，342，440（1989）；特許第２７７７６７８号公報；Biochem．Biophys，Res．Commun．，1989年，第163巻，p．967-973；Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．，1991年，第88巻（16号），p．7001-7005等に記載され、例えば、GeneBank/EMBL/DDBJにAccession No．Ｍ６０７１８、Ｍ７３２４０、ＡＣ００４９６０、ＡＹ２４６５６０、Ｍ２９１４５又はＭ７３２４０等として登録されているヒト由来のＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ等が好ましく挙げられる。また、本発明のＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡには、前記ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性、例えばマイトゲン活性、モートゲン活性等を有する蛋白質をコードするＤＮＡ等が包含される。
【００１２】
ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡの具体例としては、例えば、配列番号１又は２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、若しくは配列番号１又は２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性、例えばマイトゲン活性、モートゲン活性等を有する蛋白質をコードするＤＮＡ等が好ましく挙げられる。ここで、配列番号１で表される塩基配列は、Accession No．Ｍ６０７１８の塩基配列第７３乃至２２５９に相当し、該ＤＮＡは配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡに相当する。配列番号２で表される塩基配列は、Accession No．Ｍ７３２４０の塩基配列第６６乃至２２３７に相当し、該ＤＮＡは配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡに相当する。
【００１３】
配列番号１又は２で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば上記ＤＮＡの部分配列をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、約０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、約６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、約０．１〜２倍の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムよりなる。）を用い、約６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。ストリンジェントな条件は、以下において同様である。
【００１４】
上記の配列番号１又は２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとして具体的には、配列番号１又は２で表わされる塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡ等が挙げられる。ハイブリダイゼーションは、公知の方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning，A laboratory Manual，Third Edition（J．Sambrook et al．，Cold Spring Harbor Lab．Press，2001：以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す。）に記載の方法等に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
【００１５】
さらに、本発明のＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡは上記に限定されず、発現する蛋白質がＨＧＦ蛋白質と実質的に同じ作用を有する蛋白質をコードするＤＮＡである限り、本発明のＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡとして使用できる。例えばＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドをコードするＤＮＡであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ等も好ましく使用できる。
【００１６】
ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、上記した部分ペプチドをコードする塩基配列を有しかつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡであればいかなるものであってもよい。具体的な本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、（ａ）配列番号１又は２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡであって、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ、（ｂ）配列番号１又は２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ等が挙げられる。このようなＤＮＡとしては、より具体的には、例えば、配列番号１で表されるヒトＨＧＦの塩基配列の第９４番目から第６３０番目までの塩基配列（ＨＧＦのＮ末端ヘアピンループから第１クリングルドメインまでのペプチドをコードするＤＮＡ）を有するＤＮＡや、配列番号１で表されるヒトＨＧＦの塩基配列の第９４番目から第８６４番目までの塩基配列（ＨＧＦのＮ末端ヘアピンループから第２クリングルドメインまでのペプチドをコードするＤＮＡ）を有するＤＮＡ等が好ましく挙げられる。
【００１７】
ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ又はＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡは、例えば通常のハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等により容易に得ることができ、該ＤＮＡの取得は具体的には例えば前記モレキュラー・クローニング第３版等の基本書等を参考にして行うことができる。
【００１８】
なお、本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ又はＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、細胞・組織由来のｃＤＮＡ、細胞もしくは組織由来のｃＤＮＡライブラリー又は合成ＤＮＡ等が好ましく挙げられる。前記ライブラリーにゲノムＤＮＡ断片がクローニングされるベクターとしては、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド又はファージミド等が挙げられる。
また、本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質をコードするＲＮＡ又はＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドをコードするＲＮＡであって、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＲＮＡも、逆転写酵素によりＨＧＦ蛋白質又は部分ペプチドを発現することができるものであれば、本発明に用いることができる。該ＲＮＡとしては、例えば細胞又は組織よりｍＲＮＡ画分を調製して、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅したＲＮＡ等が挙げられ、本発明の範囲内である。また該ＲＮＡも公知の手段により得ることができる。
【００１９】
本発明で使用されるＨＧＦ蛋白質は公知物質であり、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。
ＨＧＦ蛋白質は、例えばＨＧＦ蛋白質を産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養上清等から分離、精製して該ＨＧＦ蛋白質を得ることができる。あるいは遺伝子工学的手法によりＨＧＦ蛋白質をコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清液から目的とする組換えＨＧＦ蛋白質を分離すること等により得ることもできる。（例えば、特開平５−１１１３８２号公報、Biochem．Biophys．Res．Commun．1989年、第163巻，ｐ．967等を参照）。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母又は動物細胞等を用いることができる。このようにして得られたＨＧＦ蛋白質は、天然型ＨＧＦ蛋白質と実質的に同じ作用を有する限り、そのアミノ酸配列中の１若しくは複数個（例えば、１〜約２０個、好ましくは１〜約１０個；以下同様である。）のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失若しくは付加されていてもよい。そのようなＨＧＦ蛋白質として、下記する５アミノ酸欠損型ＨＧＦ蛋白質を挙げることができる。ここで、アミノ酸配列について、「１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加」とは、遺伝子工学的手法、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的手段により、又は天然に生じうる程度の数（１〜複数個）が、欠失、置換若しくは付加等されていることを意味する。糖鎖が置換、欠失若しくは付加したＨＧＦ蛋白質とは、例えば天然のＨＧＦ蛋白質に付加している糖鎖を酵素等で処理し糖鎖を欠損させたＨＧＦ蛋白質、また糖鎖が付加しない様に糖鎖付加部位のアミノ酸配列に変異が施されたもの、あるいは天然の糖鎖付加部位とは異なる部位に糖鎖が付加するようアミノ酸配列に変異が施されたもの等をいう。具体的には、例えばＮＣＢＩのデータベースに登録されているAccession No．ＮＰ＿００１０１０９３２のヒトＨＧＦに対し、糖鎖付加部位の２８９位ＡｓｎをＧｌｎに、３９７位ＡｓｎをＧｌｎに、４７１位ＴｈｒをＧｌｙに、５６１位ＡｓｎをＧｌｎに、６４８位ＡｓｎをＧｌｎにそれぞれ置換することによって糖鎖が付加しないようにしたＨＧＦ［Fukuta K et al．，Biochemical Journal，388，555-562（2005）］等を挙げることができる。
さらに、ＨＧＦ蛋白質のアミノ酸配列と少なくとも約８０％以上の相同性を有する蛋白質、好ましくは約９０％以上の相同性を有する蛋白質、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する蛋白質であって、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質も本発明に使用されるＨＧＦ蛋白質に含まれる。上記アミノ酸配列について「相同」とは、蛋白質の一次構造を比較し、配列間において各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味である。
【００２０】
上記ＨＧＦ蛋白質としては、例えばＮＣＢＩのデータベース等に登録されている例えばAccession No．Ｐ１４２１０（配列番号３）又はAccession No．ＮＰ＿００１０１０９３２（配列番号４）で表されるアミノ酸配列で示されるヒト由来の蛋白質等が好ましく挙げられる。配列番号４で表されるＨＧＦ蛋白質は、配列番号３で表されるアミノ酸配列の第１６１〜１６５番目の５個のアミノ酸残基が欠失している５アミノ酸欠損型ＨＧＦ蛋白質である。配列番号３又は４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質は、両者ともヒト由来の天然ＨＧＦ蛋白質であって、ＨＧＦとしてのマイトゲン活性、モートゲン活性等を有する。
配列番号３又は４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む蛋白質としては、配列番号３又は４で表されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質であって、ＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質、例えば配列番号３又は４で表されるアミノ酸配列から、１〜複数個のアミノ酸残基を挿入又は欠失させたアミノ酸配列、１〜複数個のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基と置換させたアミノ酸配列又は１〜複数個のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸配列等を含む蛋白質であって、ＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質であることが好ましい。挿入されるアミノ酸又は置換されるアミノ酸は、遺伝子によりコードされる２０種類のアミノ酸以外の非天然アミノ酸であってもよい。非天然アミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基を有する限りどのような化合物でもよいが、例えばγ−アミノ酪酸等が挙げられる。
これらの蛋白質は、単独であっても、これらの混合蛋白質であってもよい。配列番号３又は４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む蛋白質としては、例えばＮＣＢＩのデータベースに登録されているAccession No．ＢＡＡ１４３４８又はＡＡＣ７１６５５等のヒト由来ＨＧＦが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
なお、本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質又はそれをコードするＤＮＡは、ヒトに適用する場合は前記したヒト由来のものが好適に用いられるが、ヒト以外の哺乳動物（例えばサル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター、モルモット、チンパンジー等）に由来するＨＧＦ蛋白質又はそれをコードするＤＮＡであってもよい。このようなＨＧＦとしては、例えばＮＣＢＩのデータベース等に登録されている例えば、マウス由来ＨＧＦ（例えばAccession No．ＡＡＢ３１８５５，ＮＰ＿０３４５５７，ＢＡＡ０１０６５，ＢＡＡ０１０６４等）、ラット由来ＨＧＦ［例えばAccession No．ＮＰ＿５８７１３（配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質）等］、ウシ由来ＨＧＦ（例えばAccession No．ＮＰ＿００１０２６９２１、ＸＰ８７４０８６，ＢＡＤ０２４７５等）、ネコ由来ＨＧＦ（例えばAccession No．ＮＰ＿００１００９８３０、ＢＡＣ１０５４５，ＢＡＢ２１４９９等）、イヌ由来ＨＧＦ（例えばAccession No．ＮＰ＿００１００２９６４、ＢＡＣ５７５６０等）又はチンパンジー由来ＨＧＦ（例えばAccession No．ＸＰ５１９１７４等）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
本発明に用いられるＨＧＦ蛋白質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシラート［−ＣＯＯＭ（Ｍは金属を示す）］、アミド（−ＣＯＮＨ2）又はエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチル等のＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル等のＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチル等のＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチル等のフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチル等のα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基等のＣ７−１４アラルキル基のほか、アセチルオキシメチル、ピバロイルオキシメチル等のＣ２−６アルカノイルメチル基等が用いられる。本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質が、Ｃ末端以外にカルボキシル基又はカルボキシラートを有している場合、カルボキシル基又はカルボキシラートがアミド化又はエステル化されているものも本発明におけるＨＧＦ蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステル等が用いられる。さらに、本発明に用いられるＨＧＦ蛋白質には、上記した蛋白質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル等のＣ２−６アルカノイル基等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の反応性基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾリル基、インドリル基、グアニジノ基等）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル等のＣ２−６アルカノイル基等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質等の複合蛋白質等も含まれる。
【００２３】
本発明で用いるＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド（以下、ＨＧＦ部分ペプチドと略記する場合がある。）としては、上記したＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであって、ＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するものであればいずれのものであってもよい。本発明において、ＨＧＦ部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記したＨＧＦ蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも約２０個以上、好ましくは約５０個以上、より好ましくは約１００個以上のアミノ酸配列を含有するペプチド等が好ましい。具体的には、例えば、配列番号３で表されるヒトＨＧＦアミノ酸配列のＮ末端側から３２番目のアミノ酸から２１０番目のアミノ酸までのアミノ酸配列（ＨＧＦのＮ末端ヘアピンループから第１クリングルドメインまでの配列）で示されるペプチドや、配列番号３で表されるヒトＨＧＦアミノ酸配列のＮ末端側から３２番目のアミノ酸から２８８番目のアミノ酸までのアミノ酸配列（ＨＧＦのＮ末端ヘアピンループから第２クリングルドメインまでの配列）で示されるペプチド等が好ましく挙げられる。
本発明のＨＧＦ部分ペプチドにおいては、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシラート［−ＣＯＯＭ（Ｍは上記と同意義）］、アミド（−ＣＯＮＨ2）又はエステル（−ＣＯＯＲ；Ｒは上記と同意義）のいずれであってもよい。さらに、ＨＧＦ部分ペプチドには、上記したＨＧＦ蛋白質と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチド等の複合ペプチド等も含まれる。
【００２４】
本発明に用いられるＨＧＦ蛋白質又はその部分ペプチドの塩としては、酸又は塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等）との塩等が挙げられる。
【００２５】
本発明に用いられるＨＧＦ蛋白質の部分ペプチド又はその塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいはＨＧＦ蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれでも良い。すなわち、ＨＧＦ蛋白質を構成し得る保護基を有していてもよい部分ペプチドもしくはアミノ酸と保護基を有していてもよい残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は、保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、M．Bodanszky及びM．A．Ondetti、ペプチド・シンセシス（Peptide Synthesis），Interscience Publishers，New York（1966年）、Schroeder及びLuebke、ザ・ペプチド（The Peptide），Academic Press，New York（1965年）等に記載された方法等が挙げられる。反応後は通常の精製方法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、結晶化又は再結晶等を組み合わせてＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００２６】
本発明において「神経新生」とは、幼弱な未分化細胞（例えば神経幹細胞等）から神経芽細胞を経て新しい神経（神経細胞）に分化させることをいい、神経細胞に分化する神経芽細胞や未分化細胞等の増殖を含む。また神経新生は、損傷した神経の再生や神経修復を含む。
「神経」には、中枢神経（例えば脳、脊髄等）及び末梢神経（例えば尺骨神経、橈骨神経、腓骨神経等）を含む。
【００２７】
本発明の神経新生促進剤は、ヒトのほか、ヒト以外の哺乳動物（例えば、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター、モルモット、チンパンジー等）にも適用できる。
【００２８】
本発明の神経新生促進剤を患者に投与する場合、その投与形態、投与方法、投与量等は、有効成分がＨＧＦ蛋白質の場合と、ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡの場合と若干異なってもよい。
例えば、有効成分がＨＧＦ蛋白質である場合の本発明の製剤は、種々の製剤形態、例えば液剤、固形剤等をとりうるが、一般的にはＨＧＦ蛋白質のみを又はそれを慣用の担体と共に注射剤、噴射剤、徐放性製剤（例えば、デポ剤）等に製剤されるのが好ましい。上記注射剤は、水性注射剤又は油性注射剤のいずれでもよい。水性注射剤とする場合、公知の方法に従って、例えば、水性溶媒（注射用水、精製水等）に、医薬上許容される添加剤、例えば等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等）、緩衝剤（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等）、保存剤（パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等）、増粘剤（ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等）、安定化剤（亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等）又はｐＨ調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等）等を適宜添加した溶液に、ＨＧＦ蛋白質を溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。また適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）又は非イオン界面活性剤（ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０等）等をさらに配合してもよい。油性注射剤とする場合、油性溶媒としては、例えば、ゴマ油又は大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル又はベンジルアルコール等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプル又はバイアル等に充填される。注射剤中のＨＧＦ蛋白質含量は、通常約０．０００２〜０．２ｗ／ｖ％、好ましくは約０．００１〜０．１ｗ／ｖ％に調整され得る。なお、注射剤等の液状製剤は、凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。
【００２９】
噴霧剤も製剤上の常套手段によって調製することができる。噴霧剤として製造する場合、その噴霧剤に配合される添加剤としては、一般に吸入用製剤に使用される添加剤であればいずれのものであってもよく、例えば、噴射剤の他、上記した溶剤、保存剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤等を配合し得る。噴射剤としては、液化ガス噴射剤又は圧縮ガス等が挙げられる。液化ガス噴射剤としては、例えば、フッ化炭化水素（ＨＣＦＣ２２、ＨＣＦＣ−１２３、ＨＣＦＣ−１３４ａ、ＨＣＦＣ１４２等の代替フロン類等）、液化石油、ジメチルエーテル等が挙げられる。圧縮ガスとしては、例えば、可溶性ガス（炭酸ガス、亜酸化窒素ガス等）又は不溶性ガス（窒素ガス等）等が挙げられる。
【００３０】
また、本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質は、生体分解性高分子と共に、徐放性製剤（例えばデポ剤）とすることもできる。ＨＧＦ蛋白質は特にデポ剤とすることにより、投薬回数の低減、作用の持続性及び副作用の軽減等の効果が期待できる。該徐放性製剤は公知の方法に従って製造することができる。本徐放性製剤に使用される生体内分解性高分子は、公知の生体内分解性高分子のなかから適宜選択できるが、例えばデンプン、デキストラン又はキトサン等の多糖類；コラーゲン又はゼラチン等の蛋白質；ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリロイシン、ポリアラニン又はポリメチオニン等のポリアミノ酸；ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸−グリコール酸共重合体；ポリカプロラクトン、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリ酸無水物又はフマル酸・ポリエチレングリコール・ビニルピロリドン共重合体等のポリエステル；ポリオルソエステル又はポリメチル−α−シアノアクリル酸等のポリアルキルシアノアクリル酸；ポリエチレンカーボネート又はポリプロピレンカーボネート等のポリカーボネート等が挙げられる。好ましくはポリエステル、更に好ましくはポリ乳酸又は乳酸−グリコール酸共重合体である。乳酸−グリコール酸共重合体を使用する場合、その組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）は徐放期間によって異なるが、例えば徐放期間が約２週間ないし３カ月、好ましくは約２週間ないし１カ月の場合には、約１００／０乃至５０／５０が好ましい。該ポリ乳酸又は乳酸−グリコール酸共重合体の重量平均分子量は、一般的には約５，０００乃至２０，０００が好ましい。ポリ乳酸又は乳酸−グリコール酸共重合体は、公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の製造法に従って製造できる。生体分解性高分子とＨＧＦ蛋白質の配合比率は特に限定はないが、例えば生体分解性高分子に対して、ＨＧＦ蛋白質が約０．０１〜３０ｗ／ｗ％が好ましい。
【００３１】
投与方法としては、注射剤もしくは噴霧剤を直接神経変性や神経細胞死が誘発された部位に直接注射（髄腔内投与又は脊髄実質投与、徐放性ポンプによる髄腔内持続投与等）もしくは噴霧するか、あるいは徐放性製剤（デポ剤）を神経変性や神経細胞死が誘発された部位のある組織に近い部位に埋め込むのが好ましい。また、投与量は、剤形、疾患の程度又は年齢等に応じて適宜選択されるが、通常、1回当たり１μｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１０μｇ〜５０ｍｇ、さらに好ましくは１〜２５ｍｇである。また、投与回数も剤形、疾患の程度又は年齢等に応じて適宜選択され、１回投与とするか、ある間隔をおいて持続投与とすることもできる。持続投与の場合、投与間隔は１日１回から数ヶ月に１回でよく、例えば、徐放性製剤（デポ剤）による投与や徐放性ポンプによる髄腔内持続投与の場合は、数ヶ月に１回でもよい。
【００３２】
一方、ＨＧＦ遺伝子を患者に投与するには、常法、例えば別冊実験医学，遺伝子治療の基礎技術，羊土社，１９９６、別冊実験医学，遺伝子導入＆発現解析実験法，羊土社，１９９７、日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス，１９９９等に記載の方法に従って、行うことが好ましい。
具体的な投与方法としては、例えば、ＨＧＦ遺伝子が組み込まれた組換え発現ベクター等を神経変性や神経細胞死が誘発された部位の組織（例えば脊髄神経、脳等）へ局所注射する方法、又は、患者の病変部位の組織又は脊髄等から細胞を体外に取り出して、該細胞にＨＧＦ遺伝子が組み込まれた組換え発現ベクターを導入し形質転換させた後に、形質転換された前記細胞を、患者の病変部位又は脊髄に移植する方法等が挙げられる。
【００３３】
発現ベクターとしては、ｎａｋｅｄプラスミド、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（Ｉ型単純ヘルペスウイルス等）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０又は免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルス等が挙げられるが、これらに限定されない。前記発現ベクターに目的とする遺伝子を導入し、細胞に組換えウイルスを感染させることにより、細胞内にＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡを導入することが可能である。中でも、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ベクター、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター等が好ましい。
前記ＨＳＶ−１ベクターは神経向性を有するベクターである。ＨＳＶ−１ベクターとしては、多重遺伝子（３０ｋｂまで）が組み込まれている大きな（１５２ｋｂ）ゲノムを有し、かつ生涯にわたり潜在的に神経細胞に対して感染を樹立する能力を有するものが好ましい。具体的なＨＳＶ−１ベクターとしては、ウイルス複製のためのＩＣＲ４，ＩＣＰ３４．５及びＶＰ１６（ｖｍｗ６５）をエンコードする３つの遺伝子の欠失により、重篤な障害状態にある複製能力のないＨＳＶ−１（ＨＳＶ１７６４／４−／ｐＲ１９）ベクター（Coffin RS，et al.，J．Gen．Virol．1998年，第79巻，ｐ．3019-3026；Palmer JA，et al.，J．Virol.，2000年，第74巻，ｐ．5604-5618；Lilley CE，et al.，J．Virol．，2001年，第75巻，ｐ．4343-4356）等が挙げられる。また、ＡＡＶベクターは、非病原性ウイルスに属し、安全性が高く、また神経細胞等の非分裂細胞に効率よく遺伝子導入できるベクターである。ＡＡＶベクターとしては、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５等が挙げられる。これらＨＳＶ−１ベクターやＡＡＶベクターは目的遺伝子を神経細胞等において長期間発現させ得る。
ＨＧＦの神経新生に対する効果の評価のためには、例えば、ＨＳＶ−１ベクター、ＡＡＶベクターを使用してＨＧＦ遺伝子を神経変性や神経細胞死が誘発された部位、例えば線条体や髄腔内等へ形質導入するのが好ましい。
【００３４】
製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の公知の製剤形態［例えば、注射剤、噴霧剤、徐放性製剤（デポ剤）、マイクロカプセル剤等］をとり得ることができる。注射剤、噴霧剤、徐放性製剤（デポ剤）はＨＧＦ蛋白質の場合と同様にして調製できる。また、マイクロカプセル剤を製造する場合、例えばＨＧＦ遺伝子を含む発現プラスミドを導入した宿主細胞等を芯物質としてこれを公知の方法（例えばコアセルベーション法、界面重合法又は二重ノズル法等）に従って被膜物質で覆うことにより直径約１〜５００、好ましくは約１００〜４００μｍの微粒子として製造することができる。被膜物質としては、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート、エチルセルロース、アルギン酸又はその塩、ゼラチン、ゼラチン・アラビアゴム、ニトロセルロース、ポリビニルアルコール又はヒドロキシプロピルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸−グリコール酸共重合体、キトサン−アルギン酸塩、硫酸セルロース−ポリ（ジメチルジアリル）アンモニウムクロライド、ヒドロキシエチルメタクリレート−メチルメタクリレート、キトサン−カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩−ポリリジン−アルギン酸塩等の膜形成性高分子等が挙げられる。
製剤中のＤＮＡの含量や投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができる。また投与量は、ＨＧＦ遺伝子導入ベクターの種類により異なるが、ＨＧＦ遺伝子導入ベクターに換算して、通常１×１０6ｐｆｕ〜１×１０12ｐｆｕ、好ましくは１×１０7ｐｆｕ〜２×１０11ｐｆｕ、さらに好ましくは１．５×１０7ｐｆｕ〜１．５×１０11ｐｆｕを数日ないし数ヶ月に１回投与するのが好ましい。
【００３５】
本発明の神経新生促進剤は、ＨＧＦ蛋白質等又はＨＧＦ遺伝子の神経新生促進効果の補完及び／又は増強等のために他の神経栄養因子と組み合わせて、併用剤として投与してもよい。
ＨＧＦ蛋白質等又はＨＧＦ遺伝子と他の神経栄養因子の併用剤は、１つの製剤中に両成分を配合した配合剤の形態で投与してもよく、また別々の製剤にして投与する形態をとってもよい。この別々の製剤にして投与する場合には、同時投与、時間差による投与が含まれる。また、時間差による投与は、ＨＧＦ蛋白質等又はＨＧＦ遺伝子を含有する製剤を先に投与し、他の神経栄養因子を含有する製剤を後に投与してもよいし、他の神経栄養因子を含有する製剤を先に投与し、ＨＧＦ蛋白質等又はＨＧＦ遺伝子を含有する製剤を後に投与してもよい。それぞれの投与方法は同じでも異なっていてもよい。神経栄養因子には、未分化な神経芽細胞の増殖と分化、或いは成熟した神経細胞の生存と機能の維持又は促進をはかる因子を含む。さらに、神経栄養因子は、神経組織が障害を受けると一時的に合成分泌が亢進され、組織の変性脱落の予防や機能修復に関与するlesion factorとしての性質を示すものも含まれる。神経栄養因子としては、特に限定されず、例えばＮＴ−３（Neurotrophin３）、ＮＴ−４（Neurotrophin４）、ＣＮＴＦ(Ciliary Neurotrophic Factor；毛様体神経栄養因子)、ＧＤＮＦ（Glial-Derived Neurotrophic Factor）又はＢＤＮＦ（brain-derived neurotrophic factor；脳由来神経栄養因子）等が挙げられる。
【００３６】
本発明の神経新生促進剤は、神経の変性や神経細胞死が誘発された部位において新たな神経の新生を促進し得るので、神経の変性又は神経細胞死を伴う神経変性疾患や神経障害等において、例えば神経再生、神経修復又は神経機能改善等のために用いることができる。
神経変性疾患や神経障害には、神経の変性や細胞死が誘発される全ての神経変性疾患又は神経障害が含まれる。神経変性疾患や神経障害が誘発される要因は特に限定されず、例えば遺伝、物理的なけが（例えば、激しい運動、事故、冷気や熱気に長時間体がさらされる、圧迫の繰り返し等）、放射線照射、感染症、有毒物質や薬物、癌の神経への浸潤、糖尿病等の疾患の合併症等が含まれる。
また、神経変性疾患や神経障害には、中枢性神経疾患、中枢神経障害、末梢神経疾患及び末梢神経障害等が含まれる。
中枢性神経疾患又は中枢神経障害としては、例えば、失語症、失行、失認、健忘（ウェルニッケ脳症、コルサコフ症候、一過性全健忘、虚偽性（心因性）健忘症）、昏迷と昏睡、せん妄と痴呆、アルツハイマー病、けいれん性疾患、睡眠障害、不眠症、過眠症［睡眠発作（ナルコレプシー）］、睡眠時無呼吸症候群、錯眠等の大脳脳葉の障害；うつ病、躁うつ病、統合失調症等の精神疾患；虚血性症候群［一過性脳虚血性発作（ＴＩＡ）、虚血性発作、出血性症候群、頭蓋内出血、クモ膜下出血］、脳動静脈奇形等の脳血管疾患；頭部外傷；急性細菌性髄膜炎、急性ウイルス性脳炎と無菌性髄膜炎、亜急性及び慢性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿、中枢神経系の感染症；神経系の放射線傷害；大脳皮質基底核神経節変性症；脊柱管狭窄症；脊椎分離すべり症、後縦靭帯骨化症；ホルネル症候群、核間性眼筋麻痺、注視麻痺、網膜症等の視神経障害；第３脳神経麻痺、第４脳神経麻痺、第６脳神経麻痺、三叉神経痛、顔面神経疾患（ベル麻痺）等の脳神経疾患；振戦、ジスキネジア（ミオクローヌス、チック、トゥレット症候群、アテトーシス（ジストニア）；ハンチントン舞踏病、球脊髄性筋委縮症、脊髄小脳失調症１型、脊髄小脳失調症２型、脊髄小脳失調症３型、脊髄小脳失調症６型、脊髄小脳失調症７型、脊髄小脳失調症１２型及び歯状核赤核淡蒼球ルイ体委縮症等のポリグルタミン病；薬物誘発性の運動障害、進行性核上性麻痺等の運動の障害；脊髄圧迫、硬膜下と硬膜外の膿瘍と血腫、空洞症、血管疾患、遺伝性痙性対麻痺、急性横断性脊髄炎、脊髄損傷等の脊髄疾患；又は、糖尿病性網膜症等が挙げられる。
末梢神経疾患又は末梢神経障害としては、例えば、神経切断等を伴う外傷；下位，及び上位運動ニューロン疾患（遺伝性脊髄性筋萎縮症）、神経根疾患（髄核ヘルニア、頸椎症）、神経叢疾患、胸郭出口圧迫症候群、末梢神経障害（ギラン−バレー症候群、遺伝性ニューロパシー、神経線維腫症、プロテウス症候群）、神経筋伝達疾患（重症筋無力症）等の末梢神経系の疾患；筋ジストロフィ、ミオパシー、チャネロパシー（筋強直性疾患、家族周期性麻痺）等の筋障害等；又は、糖尿病性神経障害等が挙げられる。
【００３７】
神経新生には、新しい神経細胞が生まれるので細胞分裂がなされなければいけない。細胞分裂時には、遺伝情報をコピーするためにＤＮＡが合成さる。ＤＮＡが合成されたかどうかを知る手がかりとなる物質としては、例えばＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）等が挙げられる。例えば、ＢｒｄＵを体内に注入すると新しく生まれる細胞には、このＢｒｄＵが取り込まれるのでこのＢｒｄＵを指標に神経細胞の新生を判定できる。従って、神経新生作用は、神経細胞に取り込まれるＢｒｄＵを指標に測定する方法を用いて測定することができる。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養神経幹細胞から神経膠細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイト）又は神経細胞への分化を測定する方法を含む後述の試験例等に記載されている方法等を用いて測定することができる。なお、前記した神経細胞は細胞体、樹状突起及び軸索を含む。神経膠細胞はアストロサイト、オリゴデンドロサイト及びミクログリア細胞を含む。アストロサイトはさらに神経細胞へ分化し得る。なお、本発明においてアストロサイトはＧＦＡＰ陽性の細胞全てを包含する。
【実施例】
【００３８】
以下に試験例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例において％は特に明記しない場合は質量％を示す。
【００３９】
〔試験例１〕
脳神経細胞の新生に対するＨＧＦの作用
１．実験動物
Ｂ６ＣＢＡ−ＴｇＮ（ＨＤエクソン１）６２Ｇｐｂ／Ｊ雌性マウス（Mangiarini Ｌら，Cell，1996年，第87巻，p．493-506）から摘出した卵巣が移植されたＢ６ＣＢＡＦ１／Ｊ雌性マウスは、Jackson Laboratory（Bar Harbor，ME）から入手し、Ｂ６ＣＢＡＦ１／Ｊ雄性マウスと共に飼育し、交配した。
交配した子は、その尾組織から抽出したゲノムＤＮＡのＰＣＲ解析により遺伝子系を決定し、ＴｇＮ６２Ｇｐｂ遺伝子を有するマウスをハンチントン舞踏病モデルマウスＲ６／２マウス（以下、Ｒ６／２マウスと略記する。）とした。また、前記Ｒ６／２マウスと同腹でＴｇＮ（ＨＤエクソン１）６２Ｇｐｂ遺伝子を持たないマウスを野生型同腹子マウスとして使用した。
全ての実験は大阪大学動物倫理委員会のガイドラインに従って行なった。すべての取り組みはできるだけ動物の負担を少なくし、できるだけ少ない数の動物を使用した。
【００４０】
２．ベクターの構築、製造及び精製
ｐＲ１９ＧＦＰＷＰＲＥ（Lilley CEら，J．Virol，2001年，第75巻，p．4343-4356）のＧＦＰ（green fluorescent protein；緑色蛍光タンパク)遺伝子を、ラットＨＧＦをコードするＤＮＡの全長（ｒａｔＨＧＦ；配列番号５）にＫＴ３タグ（３’−ＣＣＧＣＣＣＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＣＴ−５’ ；配列番号７）を付加したｃＤＮＡ（Sun Ｗら，J．Neurosci，2002年，第22巻，p．6537-6548）で置換し、ｐＲ１９ｒａｔＨＧＦＫＴ３ＷＰＲＥを構築した。このベクター（ｐＲ１９ｒａｔＨＧＦＫＴ３ＷＰＲＥ）のシークエンスは、ＡＢＩ ３１０キャピラリーシークエンサーを使用する分析により確認した。次いで、Ｍ４９細胞を用いて、プラスミドｐＲ１９ｒａｔＨＧＦＫＴ３ＷＰＲＥのＤＮＡと、ＨＳＶ１７６４／−４／ｐＲ１９ＬａｃＺウイルスＤＮＡとのコトランスフェクションにより相同組換えを行なった。白色プラークを選択し、３回精製し、Palmer JAらの方法（J．Virol，2000年，第74巻，p．5604-5618）に従い、複製能力のないウイルスを増殖させた。ラットＨＧＦの発現を、免疫染色によって確認した。該発現を更にウエスタンブロット法及びラットＨＧＦの酵素抗体免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により確認した。本試験に使用するために、タイター（titer）が１〜２×１０9 ｐｆｕ（プラーク・フォーミング・ユニット）／ｍＬであるＨＳＶ１７６４／−４／ｐＲ１９ＨＧＦウイルスベクター（ＨＧＦ発現ベクター；以下、ＨＳＶ−ＨＧＦと略記する）と、タイターが１〜１．５×１０9ｐｆｕ／ｍＬであるＨＳＶ１７６４／−４／ｐＲ１９ＬａｃＺウイルスベクター（ＨＧＦ非発現ベクター；以下、ＨＳＶ−ＬａｃＺと略記する）を調製した。
【００４１】
３．脳内へのＨＳＶ挿入（Ｉｎ ｖｉｖｏ）
４週令のＲ６／２マウスに、ペントバルビタールを５０ｍｇ／ｋｇ静脈注射して深く麻酔した。線条体（−０．４ｍｍ前後，±１．８ｍｍ内外側方向、及び−３．５ｍｍ背腹方向）へ注射するために、該マウスをＫｏｐｆ脳定位固定装置に入れ固定した。５μＬのＨＳＶ−ＬａｃＺ（５×１０6ｐｆｕ）又はＨＳＶ−ＨＧＦ（３×１０5ｐｆｕ）を該マウスに注射した。注射は、マウスの前記線条体に１０μＬのハミルトンシリンジを用いて速度０．３μＬ／ｍｉｎで実施された。以下、ＨＳＶ−ＬａｃＺを注射したマウスをＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウス、ＨＳＶ−ＨＧＦを注射したマウスをＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスという。
【００４２】
４．免疫組織化学的分析
マウスに深く麻酔し、氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を心臓から流入してマウスの全身を灌流し、次いで４％（ｗ／ｗ％、以下同様）パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳで灌流固定した。脳を段階的に１０％及び２０％シュークロースで凍結保護した後、凍結し、その後凍結した脳を、２０μｍの連続切片とした。得られた凍結切片は、ニッスル物質を染色するためクレシル・バイオレットで染色した。
免疫組織化学的染色は、凍結切片を、ＰＢＳで洗浄し、１０％ヤギ又はロバ血清を含むＰＢＳに１時間浸漬し、次いで抗体と共に４℃で一晩インキュベートすることによって行なわれた。
【００４３】
（１）Ｋｉ−６７細胞に対するＨＧＦの作用
脳室下帯（subventricular zone；ＳＶＺ）及び線条体での神経細胞増殖を検討した。増殖細胞のマーカーとしてＫｉ−６７を選択し、Ｋｉ−６７の免疫染色を行い、脳室下帯及び線条体でのＫｉ−６７陽性細胞数を測定した。線条体において、Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスでのＫｉ−６７陽性細胞数は、Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスにおけるそれと比較して有意に増加した。（図１）．
【００４４】
（２）ＢｒｄＵ取り込みに対するＨＧＦの作用
５週令マウスにＢｒｄＵ（４×７５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．，生理食塩液に溶解、２時間毎に合計４回）を投与し、ＢｒｄＵ注射２８日後（９週令）に屠殺した。マウスに麻酔し、心臓からＰＢＳを流入してマウスの全身を灌流し、次いで４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳで灌流固定した。脳を段階的に１０％及び２０％シュークロースで凍結保護した後、凍結し、その後凍結した脳を、２０μｍの連続切片とした。
ＢｒｄＵ免疫組織化学的染色のために、凍結切片は、１Ｎ塩酸で６０℃、３０分インキュベートし、１０％ヤギ血清を含むＰＢＳに１時間浸漬した。その後、凍結切片は、抗ＢｒｄＵ（ラットモノクロナール抗体；Oxford Biotechnology社製；カタログ番号ＯＢＴ００３０）と共に４℃で３６時間インキュベートした。二重染色は蛍光色素アレクサ４８８と蛍光色素アレクサ５４６をコンジュゲートした２次抗体（Molecular Probes社製）で視覚化し、かつ切片はＴｏｐｒｏ−３（Molecular Probes社製）で核を対比染色した。蛍光画像は、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ−５１０共焦点蛍光顕微鏡で検出した。
脳室下帯及び線条体におけるＢｒｄＵ陽性細胞数を測定した結果、脳室下帯において、各群間にＢｒｄＵ陽性細胞数の有意な差は認められなかった。しかし、線条体において、Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスのＢｒｄＵ陽性細胞数は、Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスと比較して有意に増加した（図２）。これらのデータは、ＨＳＶ−ＨＧＦ処置により神経細胞増殖が増強されることを示す。
【００４５】
（３）ネスチンとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞に対するＨＧＦの作用
ネスチン（Nestin）は、神経幹細胞のマーカーである。ネスチンは、抗体としてネスチン抗体［マウスポリクロナール抗体（BD Biosciences製；カタログ番号５５６３０９）を１００倍希釈して使用］を用いて上記免疫組織化学的染色に従って染色した。
ネスチンとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞数を測定した。脳室下帯及び線条体において、Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスにおけるネスチンとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞は、Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスのそれと比較して有意に増加した（図３）。
【００４６】
（４）ダブルコルチンとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞に対するＨＧＦの作用
ダブルコルチン（doublecortin；ＤＣＸ）は遊走神経芽細胞のマーカーである。ＤＣＸは、抗体としてＤＣＸ抗体［ヤギポリクロナール抗体（Santa Cruz Biotechnology社製；カタログ番号ｓｃ−８０６６）を１００倍希釈して使用］を用いて上記免疫組織化学的染色に従って染色した。
ＤＣＸとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞数を測定した。Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスにおけるＤＣＸとＢｒｄＵにおける両者が陽性である細胞は、脳室下帯及び線条体において、Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスのそれと比較して有意に増加した（図４）。
【００４７】
（５）ＰＳＡ−ＮＣＡＭとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞に対するＨＧＦの作用
ＰＳＡ−ＮＣＡＭは、遊走神経芽細胞のマーカーである。ＰＳＡ−ＮＣＡＭは、抗体としてＰＳＡ−ＮＣＡＭ抗体［マウスモノクロナール抗体（AbCys S．A．社製；カタログ番号ＡｂＣ００１９）を８００倍希釈して使用］を用いて上記免疫組織化学的染色に従って染色した。
ＰＳＡ−ＮＣＡＭとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞数を測定した。Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスにおけるＰＳＡ−ＮＣＡＭとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞は、脳室下帯及び線条体においてＲ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスのそれと比較して有意に増加した（図５）。
【００４８】
（６）βIIIチューブリンとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞に対するＨＧＦの作用
βIIIチューブリンは神経細胞の初期〜分化型マーカーである。βIIIチューブリンは、抗体としてβIIIチューブリン抗体［ＴｕＪ１、マウスモノクロナール抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社製；カタログ番号ＭＡＢ１１９５）を２００倍希釈して使用］を用いて上記免疫組織化学的染色に従って染色した。
βIIIチューブリンとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞数を測定した。Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスにおけるβIIIチューブリンとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞は、脳室下帯及び線条体において、Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスのそれと比較して有意に増加した（図６）。
【００４９】
（７）ＮｅｕＮとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞に対するＨＧＦの作用
ＮｅｕＮは分化した神経細胞のマーカーである。ＮｅｕＮは、抗体としてＮｅｕＮ抗体［マウスモノクロナール抗体（Chemicon International社製；カタログ番号ＭＡＢ３７７）を５００倍希釈して使用］を用いて上記免疫組織化学的染色に従って染色した。
ＮｅｕＮとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞数を測定した。Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスにおけるＮｅｕＮｎとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞は、脳室下帯及び線条体において、Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスのそれと比較して有意に増加した（図７）。
【００５０】
（８）リン酸化ｃ−Ｍｅｔとネスチンの両者が陽性である細胞に対するＨＧＦの作用
神経細胞新生におけるＨＧＦの役割を検討するために、ネスチン陽性細胞において、ＨＧＦがｃ−Ｍｅｔのチロシンリン酸化反応に変化を与えるかどうかを検討した。リン酸化ｃ−Ｍｅｔ及びネスチンは、抗体としてそれぞれリン酸化ｃ−Ｍｅｔ抗体［ウサギポリクロナール抗体（Biosource社製；カタログ番号４４−８８８Ｇ）を１００倍希釈して使用］及びネスチン抗体［マウスポリクロナール抗体（BD Biosciences社製；カタログ番号５５６３０９）を１００倍希釈して使用］を用いて上記免疫組織化学的染色に従って染色した。
Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスでは、ネスチンとリン酸化ｃ−Ｍｅｔの両者が陽性である細胞が、他のグループと比較して有意に増加した（図８）。
【００５１】
（９）リン酸化ｃ−ＭｅｔとＤＣＸの両者が陽性である細胞に対するＨＧＦの作用
神経細胞新生におけるＨＧＦの役割を検討するために、ＤＣＸ陽性細胞において、ＨＧＦがｃ−Ｍｅｔのチロシンリン酸化反応に変化を与えるかどうかを検討した。リン酸化ｃ−Ｍｅｔ及びＤＣＸは、上記と同様に免疫組織化学的染色を行なった。
Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスでは、リン酸化ｃ−ＭｅｔとＤＣＸの両者が陽性である細胞が、他のグループと比較して有意に増加した（図９）。
〔試験例２〕
ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ含有ベクターの脊髄投与による脊髄におけるＨＧＦの発現
１．ベクターの構築、製造及び精製
（１）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ挿入ＨＳＶ−１ベクター
ＨＧＦ遺伝子を挿入したＩ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ベクターとしては、試験例１で作成したＨＳＶ１７６４／−４／ｐＲ１９ＨＧＦウイルスベクターを用いた。該ベクターを以下、ＨＳＶ−ＨＧＦと略記する。
（２）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ挿入ＡＡＶ−２ベクター及びＡＡＶ−４ベクター
ＡＡＶ Helper−Free System（Stratagene，USA；カタログ番号＃２４００７１）キット中に含まれるｐＣＭＶ−ＭＣＳのマルチクローニングサイトにラットＨＧＦ−ＫＴ３［ラットＨＧＦをコードするＤＮＡ（配列番号５）のＣ末端にＫＴ３タグ配列（３’−ＣＣＧＣＣＣＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＣＴ−５’；配列番号７）を付加したもの；Sun，Funakoshiら，J．Neurosci．，2002年，第22巻，p．6537-6548］を挿入した。挿入が正しいことをシークエンスにより確認した。ＮｏｔＩサイトでベクターを２つのフラグメントに開裂し、ラットＨＧＦ−ＫＴ３含む断片をｐＡＡＶ−ＭＣＳを同様にして開列したものと入れ替えることで、ＡＡＶ２−ＨＧＦ作成のためのｐＡＡＶ−ラットＨＧＦ−ＫＴ３を作製した。ＡＡＶ４−ＨＧＦ作成のためにはｐＡＡＶ−ＭＣＳをＡＡＶ４用に改変したものを用いることで同様に処理し、ｐＡＡＶ4−ラットＨＧＦ−ＫＴ３を作製した（Proc．Natl．Acad．Sci．USA，2000年，第97巻，p．3428-3432）。次いで上記キットに含まれるＨＥＫ１９３細胞に、ラットＨＧＦ−ＫＴ３が挿入されたｐＡＡＶ−ＭＣＳをキットの使用説明書に従い導入した。該細胞におけるラットＨＧＦ−ＫＴ３の発現とその活性は、ＥＬＩＳＡ法及びＭＤＣＫ細胞に対する散乱分析法により確認した。得られたベクターをＡＡＶ２−ＨＧＦ及びＡＡＶ４−ＨＧＦと略記する
【００５２】
２．脊髄実質への投与によるＨＧＦの発現
成体雌性ＳＤラットの腰髄部の脊髄実質に、ミニポンプを用いてベクター懸濁液（ＨＳＶ−ＨＧＦ：３×１０7ｐｆｕ、３×１０7ｐｆｕ；ＡＡＶ２−ＨＧＦ：３×１０11ｐｆｕ；又はＡＡＶ４−ＨＧＦ：３×１０11ｐｆｕ）５μＬを定位注射した。その５日後に、動物をペントバルビター深麻酔下に屠殺した。速やかに脊髄を取り出し、脊髄の上部（upper spinal；吻側；Ｕ）、中部（middle spinal；中央部；Ｍ）及び下部（lower spinal；尾側；Ｌ）の３つの領域に分け、それぞれの脊髄断片を、前記の方法でホモゲナイズした。酵素抗体免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法にてＨＧＦ蛋白質量を測定した。ＥＬＩＳＡ法は、抗ＨＧＦポリクロナール抗体（Tokushu Meneki製）を用いてSun Wら、Brain Res Mol Brain Res，2002年，第103巻，ｐ．36-48に記載に従って実施した。
その結果を図１０に示す。ベクターを腰髄部の脊髄実質に注射すると、注射部位だけでなく脊髄の吻側、中央部においてもＨＧＦの発現が認められた。発現の強度は、尾側（腰髄を含む）＞＝中央部＞吻側であった。なお、ＨＳＶ−ＨＧＦでは、濃度依存的にＨＧＦの発現量が増加した。
【００５３】
３．脊髄腔への投与によるＨＧＦの発現
成体雌性ＳＤラットの腰髄部の脊髄腔に、ミニポンプを用いてベクター懸濁液（ＨＳＶ−ＨＧＦ：３×１０7ｐｆｕ、３×１０7ｐｆｕ；ＡＡＶ２−ＨＧＦ：３×１０11ｐｆｕ；又はＡＡＶ４−ＨＧＦ：３×１０11ｐｆｕ）５μＬを定位注射した。その５日後に、上記脊髄実質への投与における方法と同様に、脊髄を取り出し、脊髄の吻側、中部及び尾側のＨＧＦ蛋白質量を上記と同様にＥＬＩＳＡ法にて測定した。
その結果を図１１に示す。ベクターを腰髄部の脊髄腔に注射すると、注射部位だけでなく脊髄の吻側、中央部においてもＨＧＦの発現が認められた。発現の強度は、脊髄実質への注射よりＨＧＦの発現量は低かったが、脊髄のいずれの部位［尾側（腰髄を含む）、中央部、吻側］において、ほぼ同じ程度であった。即ち、脊髄腔への投与では、広範囲な神経細胞へのＨＧＦの供給が可能であった。これは、脊髄実質にベクターを投与した場合に比べ、脊髄液により、ベクターが脊髄全体に拡散されたためであると考えられた。なお、ＨＳＶ−ＨＧＦでは、濃度依存的にＨＧＦの発現量が増加した。
【００５４】
〔試験例３〕
神経幹細胞の分化に対するＨＧＦの効果
（１）神経幹細胞（neurosphere）の培養方法
Ｅ１５ Ｃ５７ＢＬ６マウス胎児からＥ１４線条体をガス麻酔科に取り出し、機械的ピペッティングにより細胞をバラバラにし、NeuroCult Basal Medium（神経細胞培養用基礎培地；Stem cell technologies Inc.製)にNeuroCult Proliferation Supplements（神経細胞増殖用サプリメント；Stem cell technologies Inc.製)を１／１０容量添加した培地に、ＥＧＦ（epidermal growth factor；上皮増殖因子）を２０ｎｇ／ｍＬとなるよう培地（マウス一胎／２０ｍＬ）に添加して浮遊培養し、培養した細胞を初代培養マウスneurosphere（神経幹細胞）とした。
浮遊培養２週間後に、初代培養マウスneurosphereを神経細胞培養用基礎培地にNeuroCult Differentiation medium（神経細胞分化用培地；Stem cell technologies Inc.製）を１／１０添加した培地（ＥＧＦを添加していない培地）２０ｍＬに再懸濁し、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）をコートした培養皿（２４穴プレート；初代培養マウスneurosphereを再懸濁した液１ｍＬ／穴）にて２日培養した。培養は、３７℃、ＣＯ２インキュベータ［５％（Ｖ／Ｖ）ＣＯ２−９５％（Ｖ／Ｖ）空気］を用いて行った。得られた細胞をマウス線条体由来２次neurosphereとした。
【００５５】
（２）免疫染色の方法
上記（１）における細胞を培養した培地を除去し、そこに４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）添加リン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）を添加して室温下、１５分間静置することにより細胞を固定した。その後固定した細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ブロッキング用緩衝液（５％ヤギ血清／ＰＢＳ／０．３％トリトンＸ−１００）を添加してブロッキング（室温１５分）した。ブロッキングした細胞を、ＰＢＳで３回、洗浄後、一次抗体を添加したブロッキング用緩衝液で４℃、１晩インキュベートした。その後ＰＢＳで３回洗浄後、アレクサ４８８でコンジュゲートした抗ウサギＩｇＧ（Invitrogen社製；６００希釈）添加ＰＢＳを加え、室温で２０分間インキュベートした。インキュベート後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＬＳＭ５１０共焦点蛍光顕微鏡（Zeiss社製）で観察した。
なお、下記ｃ−Ｍｅｔ抗体の特異性を確認するため、吸収試験を行なった。吸収試験は、予め過剰量（ｃ−Ｍｅｔ抗体に対しモル比で１００倍量）のｃ−Ｍｅｔ抗体ブロッキングペプチド（ｓｃ１６２Ｐ）（Santa Cruz Biotechnology社製）で処理したｃ−Ｍｅｔ抗体を用いて前記と同様に免疫染色を行なった。吸収試験において染色像が陰性であれば、該抗体による陽性像は、ｃ−Ｍｅｔのみを特異的に検出していることを意味する。
一次抗体としては、以下を使用した。
ネスチン抗体：マウスポリクロナール抗体（BD Biosciences製；カタログ番号５５６３０９）を１００倍希釈して使用した。
ＭＡＰ２抗体：マウスモノクロナール抗体（Sigma社製；カタログ番号Ｍ４４０３）を５００倍希釈して使用した。
ＮｅｕＮ抗体：マウスモノクロナール抗体（Chemicon社製；カタログ番号ＭＡＢ３７７）を５００倍希釈して使用した。
Ａ２Ｂ５：マウスモノクロナール抗体（Chemicon International製；カタログ番号ＭＡＢ３１２Ｒ）を１００倍希釈して使用した。
ｃ−Ｍｅｔ：ＳＰ２６０、ウサギポリクロナール抗体（Santa Cruz Biotechnology社製；カタログ番号ｓｃ−１６２）を５０倍希釈して使用した。
ＧＦＡＰ抗体：マウスモノクロナール抗体（Chemicon International製）を６００倍希釈して使用した。
【００５６】
（３）初代培養マウスneurosphereの分化アッセイ
初代培養マウスneurosphereの分化アッセイを図１２に示した。神経幹細胞は浮遊培養系では球状の塊になって増殖するため、neurosphereと呼ばれる。図１２において、ネスチン（NESTIN）は神経幹細胞のマーカーを示し、ＭＡＰ２は神経細胞のマーカーを示し、ＧＦＡＰはアストロサイトのマーカーを示す。Heochstは、Heochst33342により核が染色されてることを示す。ネスチン像、ＭＡＰ２像又はＧＦＡＰ像と核染色像とを重ね合わせる（図中のMERGE）と、各細胞と核の位置が一致し、初代培養マウスneurosphereは神経細胞とアストロサイトを作出できる能力を保有していることが分かる。
【００５７】
（４）線条体由来２次neurosphereの分化アッセイ
次いで、線条体由来２次neurosphereの分化アッセイにおいて、ｃ−Ｍｅｔと他の細胞マーカー（ネスチン、ＧＦＡＰ、Heochst、Ａ２Ｂ５）との共染色を行なうことで、neurosphereから神経新生過程に於けるまでの様々な分化過程の細胞群におけるＨＧＦの標的細胞を特定した。
その結果を図１３〜１６に示す。ネスチン（Nestin）陽性の神経幹細胞はＨＧＦ受容体であるｃ−Ｍｅｔが陽性であることが確認できる（図１３，１４）。また、アストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰ陽性細胞にｃ−Ｍｅｔが発現していることを確認できる（図１５）。なお、neurosphereから分化して間もないＧＦＡＰ陽性細胞はｃ−Ｍｅｔの発現が非常に弱いことを確認した。また、Ａ２Ｂ５陽性オリゴデンドロサイト前駆細胞にｃ−Ｍｅｔの発現が確認された（図１６）。一方、Ａ２Ｂ５で染色されない細胞群にもｃ−Ｍｅｔ陽性細胞を認めた。加えて吸収試験によりｃ−Ｍｅｔの免疫染色性が消失することから、ｃ−Ｍｅｔの免疫染色におけるｃ−Ｍｅｔ抗体の特異性が確認された。
以上のように、ｃ−Ｍｅｔは神経幹細胞並びに、神経幹細胞から分化したグリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイト）及び神経細胞に発現することが確認された。この結果は、これらｃ−Ｍｅｔが発現した細胞が、ＨＧＦの標的細胞となり得ることを示している。
【００５８】
（５）各種栄養因子存在下におけるneurosphereの神経新生分化アッセイ
本試験の概略を図１７に示した。
マウス胎児由来のneurosphereをＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）存在下で２週間以上浮遊培養した後、分化培地でＥＧＦ非存在下にＰＬＬコートしたプレート上で２日間接着培養した。２日間接着培養後、ＨＧＦ及び／又は栄養因子（ＮＴ−３、ＣＮＴＦ）の添加条件でさらに５日間培養した（以下、ＥＧＦ除去７日後という。）。その後４％ＰＦＡで固定後、免疫染色法により染色した。染色した細胞をＬＳＭ５１０共焦点蛍光顕微鏡（Zeiss社製）で観察し、細胞タイプを同定した。なお、ＨＧＦは、最終濃度が３ｎｇ／ｍＬとなるよう前記培地に添加した。また、ＣＮＴＦは、最終濃度３ｎｇ／ｍＬとなるよう、ＮＴ−３は最終濃度５０ｎｇ／ｍＬとなるよう前記培地に添加した。免疫染色は上記（２）に従い実施した。なお、核は、Ｔｏｐｒｏ３（Molecular Probes社製）を用い、対比染色を行なった。
【００５９】
その結果を図１８〜２９に示す。図１８及び１９は、ＥＧＦ除去７日後のコントロールneurosphereの染色像を示す。コントロール条件下においても多くのneurosphereにおいて、神経新生を認めた。しかし、新生神経細胞数は少なく、神経繊維の長さが短く分岐の少ないことを特徴とした成熟度の低い神経新生を認めた。
【００６０】
図２０及び２１は、ＥＧＦ除去７日後のＣＮＴＦ処理neurosphereの染色像を示す。コントロールと比較して、ＣＮＴＦ添加によりＭＡＰ２陽性神経細胞数が増加することが明らかである。ＣＮＴＦ添加により得られる神経細胞は、神経繊維の分岐が少ないが、神経繊維の長さが非常に長いという特徴を示した。
【００６１】
図２２及び２３は、ＥＧＦ除去７日後のＮＴ−３処理neurosphereの染色像を示す。コントロールに比較してＮＴ−３添加により新生神経細胞の増加を認めた。但しその程度はＣＮＴＦ添加の場合と比較すると若干程度が弱かった。ＮＴ−３添加による新生神経細胞の特徴は、神経繊維長がコントロールに比べて若干長いものの伸張促進効果は著名とはいえなかった。一方、神経突起の分岐に関しては著しい分岐数の増加を認め、コントロールと異なる神経分化（より成熟した神経新生）が惹起されていることが確認された。
【００６２】
図２４及び２５は、ＥＧＦ除去７日後のＨＧＦ処理neurosphereの染色像を示す。コントロールに比較してＨＧＦ添加により新生神経細胞の増加を認めた。その程度は、コントロールはもとよりＮＴ−３添加時に比べても著しく、また、ＣＮＴＦ添加時より強いといえる。ＨＧＦ添加による新生神経細胞の特徴は、神経繊維長がコントロールに比べて若干長いもののＣＮＴＦ添加時に比べると伸張促進効果は程度が弱かった。一方、神経突起の分岐に関しては著しく、ＨＧＦ添加により分岐数の著しい増加を認めた。さらにＨＧＦ添加による新生神経細胞は、ＮＴ−３添加時に比べてより太い神経線維をもつことを特徴としており、コントロール、ＣＮＴＦ又はＮＴ−３添加群とは明らかに異なる神経分化（より成熟した神経新生）が惹起されていることが確認された。
【００６３】
図２６及び２７は、ＥＧＦ除去７日後のＨＧＦ及びＮＴ−３処理neurosphereの染色像を示す。コントロールに比較してＨＧＦとＮＴ−３の同時添加により新生神経細胞数の著名な増加を認めた。新生神経細胞数は、ＮＴ−３単独添加時よりさらに多いことを特徴とした。また、ＨＧＦとＮＴ−３の同時添加においてできた新生神経は神経繊維がコントロールより長く非常に分岐が多い形態的特徴を示した。さらに神経繊維の太さも太く、ＨＧＦとＮＴ−３の同時添加では新生神経はコントロール、ＣＮＴＦ、ＮＴ−３、ＨＧＦ単独添加群に比べて異なる形態、すなわちより成熟した形態を示した。
【００６４】
図２８及び２９は、ＥＧＦ除去７日後のＨＧＦ及びＣＮＴＦ処理neurosphereの染色像を示す。コントロールに比較してＨＧＦとＣＮＴＦ同時添加により新生神経細胞数の著名な増加を認めた。新生神経細胞数は、ＣＮＴＦ単独添加時よりさらに多いことを特徴とした。新生神経は神経繊維がコントロールより非常に長くさらに分岐も非常に多い形態的特徴を示した。さらにＨＧＦとＣＮＴＦ同時添加では新生神経繊維の太さも太い等の特徴を示していた。以上からコントロール、ＣＮＴＦ及びＮＴ−３単独添加群に比べて異なる形態を示しており、ＨＧＦとＣＮＴＦ同時添加により、より成熟した多数の神経新生の形成が起こることが確認された。
【００６５】
（６）ＨＧＦの有無によるneurosphere形成能の比較
Neurosphere形成をこれまで知られるＥＧＦの代わりにＨＧＦを用いた場合、ＥＧＦ添加時と同様にneurosphereを形成できるか（神経新生のもととなる神経幹細胞の増加を認めるか否か）を検討した。前記試験例３の［１）神経幹細胞（neurosphere）の培養方法の項において、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）の代わりにＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加して初代培養マウスneurosphereを調製した。なお、コントロールは、マウス胎児由来のneurosphereをＥＧＦ又はＨＧＦ無添加で同様に浮遊培養した。
その結果を図３０に示した。ＨＧＦによりＥＧＦを添加しなくてもコントロールに比較してneurosphere形成数の増加をみることはもとより、neurosphereの大きさの著名な増大傾向を求めた。このことから、ＨＧＦが神経幹細胞群の分裂及び／又は生存の著著名な促進効果があることがわかった。
【００６６】
〔統計的分析〕
データは平均値±標準偏差（ＳＤ）で示し、統計学的有意差の検定は、フィッシャーの最小有意差法（ＰＬＳＤ）を用いる分散分析で評価した。
各グループのデータは、解析ソフトＳｔａｔｖｉｅｗ ５．０（SAS Institute，Inc.製）で分析した。ｐ＜０．０５の確率値の違いを統計的有意差ありとした。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の神経新生促進剤は、神経変性又は神経細胞死を伴う神経疾患や神経障害における神経再生や神経修復ための薬剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウス及び野生型同腹子の線条体におけるＫｉ−６７陽性細胞の免疫染色像を示す図である。図中、Ｓｔｒは線条体を、ＬＶは脳室を、ＳＶＺは脳室下帯を示す。
【図２】図２は、マウス脳室下帯及び線条体におけるＢｒｄＵ陽性細胞数を示す図である。図中、Ａは野生型同腹子を、ＢはＲ６／２マウスを、ＣはＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスを、ＤはＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスを示す。＊は野生型同腹子に対する有意差（ｐ＜０．０５）を、＊＊はＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図３】図３は、マウス脳室下帯及び線条体におけるネスチンとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞の数を示す図である。図中、Ａは野生型同腹子を、ＢはＲ６／２マウスを、ＣはＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスを、ＤはＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスを示す。＊＊はＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図４】図４は、マウス脳室下帯及び線条体におけるＤＣＸとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞の数を示す図である。図中、Ａは野生型同腹子を、ＢはＲ６／２マウスを、ＣはＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスを、ＤはＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスを示す。＊＊Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図５】図５は、マウス脳室下帯及び線条体におけるＰＳＡ−ＮＣＡＭとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞の数を示す図である。図中、Ａは野生型同腹子を、ＢはＲ６／２マウスを、ＣはＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスを、ＤはＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスを示す。＊は野生型同腹子に対する有意差（ｐ＜０．０５）を、＊＊はＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図６】図６は、マウス脳室下帯及び線条体におけるβIIIチューブリンとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞の数を示す図である。図中、Ａは野生型同腹子を、ＢはＲ６／２マウスを、ＣはＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスを、ＤはＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスを示す。＊＊はＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図７】図７は、マウス脳室下帯及び線条体におけるＮｅｕＮとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞の数を示す図である。図中、Ａは野生型同腹子を、ＢはＲ６／２マウスを、ＣはＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスを、ＤはＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスを示す。＊＊はＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図８】図８は、マウス線条体におけるネスチンとリン酸化ｃ−Ｍｅｔの両者が陽性である細胞の免疫染色像を示す図である。
【図９】図９は、マウス線条体におけるＤＣＸとリン酸化ｃ−Ｍｅｔの両者が陽性である細胞の免疫染色像を示す図である。
【図１０】図１０は、ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡを挿入したＨＳＶ−ＨＧＦ、ＡＡＶ２−ＨＧＦ及びＡＡＶ４−ＨＧＦの３種のベクターをラット腰髄の脊髄実質に注射し、５日後の脊髄におけるＨＧＦの発現量を示す図である。図中、Ｕは脊髄の吻側を、Ｍは中央部を、Ｌは尾側を示す。＊はコントロールに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図１１】図１１は、ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡを挿入したＨＳＶ−ＨＧＦ、ＡＡＶ２−ＨＧＦ及びＡＡＶ４−ＨＧＦの３種のベクターをラット腰髄の脊髄腔に注射し、５日後の脊髄におけるＨＧＦの発現量を示す図である。図中、Ｕは脊髄の吻側を、Ｍは中央部を、Ｌは尾側を示す。＊はコントロールに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図１２】図１２は、初代培養マウスneurosphereの分化アッセイにおけるネスチン、ＭＡＰ２，ＧＦＡＰ及び核（Hoechst）の免疫染色像を示す図である。Merge：免疫染色像を重ねた図；上段：ネスチンと核；中段：ＭＡＰ２と核；下段：ＧＦＡＰと核。
【図１３】図１３は、マウス線条体由来２次neurosphereの分化アッセイにおけるネスチン、ｃ−Ｍｅｔ及び核（Hoechst）の免疫染色像を示す図である。Merge：ネスチン、ｃ−Ｍｅｔ及び核の免疫染色像を重ねた図。
【図１４】図１４は、マウス線条体由来２次neurosphereの分化アッセイにおけるネスチン、ｃ−Ｍｅｔ及び核（Hoechst）の免疫染色像を示す図である。Merge：ネスチン、ｃ−Ｍｅｔ及び核の免疫染色像を重ねた図。
【図１５】図１５は、マウス線条体由来２次neurosphereの分化アッセイにおけるＧＦＡＰ、ｃ−Ｍｅｔ及び核（Hoechst）の免疫染色像を示す図である。Merge：ＧＦＡＰ、ｃ−Ｍｅｔ及び核の免疫染色像を重ねた図。
【図１６】図１６は、マウス線条体由来２次neurosphereの分化アッセイ（４日後）におけるオリゴデンドロサイト前駆細胞（Ａ２Ｂ５）、ｃ−Ｍｅｔ及び核（Hoechst）の免疫染色像を示す図である。c-Met-Absorption：吸収試験後のｃ−Ｍｅｔの染色像；Merge：Ａ２Ｂ５、ｃ−Ｍｅｔ及び核の免疫染色像を重ねた図。
【図１７】図１７は、各種栄養因子存在下におけるneurosphereの神経新生分化アッセイのプロトコルを示す概略図である。
【図１８】図１８は、ＥＧＦ除去７日後のコントロールneurosphereのＭＡＰ２の免疫染色像を示す典型例の拡大図である。
【図１９】図１９は、ＥＧＦ除去７日後のコントロールneurosphereのＭＡＰ２及び核（Ｔｏｐｒｏ３）の免疫染色像を示す図である。
【図２０】図２０は、ＥＧＦ除去７日後のＣＮＴＦ処理neurosphereのＭＡＰ２の免疫染色像を示す典型例の拡大図である。
【図２１】図２１は、ＥＧＦ除去７日後のＣＮＴＦ処理neurosphereのＭＡＰ２及び核（Ｔｏｐｒｏ３）の免疫染色像を示す図である。
【図２２】図２２は、ＥＧＦ除去７日後のＮＴ−３処理neurosphereのＭＡＰ２の免疫染色像を示す典型例の拡大図である。
【図２３】図２３は、ＥＧＦ除去７日後のＮＴ−３処理neurosphereのＭＡＰ２及び核（Ｔｏｐｒｏ３）の免疫染色像を示す図である。
【図２４】図２４は、ＥＧＦ除去７日後のＨＧＦ処理neurosphereのＭＡＰ２の免疫染色像を示す典型例の拡大図である。
【図２５】図２５は、ＥＧＦ除去７日後のＨＧＦ処理neurosphereのＭＡＰ２及び核（Ｔｏｐｒｏ３）の免疫染色像を示す図である。
【図２６】図２６は、ＥＧＦ除去７日後のＨＧＦ及びＮＴ−３処理neurosphereのＭＡＰ２の免疫染色像を示す典型例の拡大図である。図中Ａは、高度な分化を示し、Ｂは増加した数を示す。
【図２７】図２７は、ＥＧＦ除去７日後のＨＧＦ及びＮＴ−３処理neurosphereのＭＡＰ２及び核（Ｔｏｐｒｏ３）の免疫染色像を示す図である。
【図２８】図２８は、ＥＧＦ除去７日後のＨＧＦ及びＣＮＴＦ処理neurosphereのＭＡＰ２の免疫染色像を示す典型例の拡大図である。
【図２９】図２９は、ＥＧＦ除去７日後のＨＧＦ及びＣＮＴＦ処理neurosphereのＭＡＰ２及び核（Ｔｏｐｒｏ３）の免疫染色像を示す図である。
【図３０】図３０は、ＨＧＦの有無によるneurosphere形成能の比較を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は神経新生促進剤に関し、更に詳しくは肝細胞増殖因子（以下、ＨＧＦと略記する。）又はそれをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分とする神経新生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経細胞は、一旦分化成熟すると、分裂できないため神経変性が神経細胞数の減少に直結する。例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）又はハンチントン病等は、選択的な神経細胞死が進行性に起きる神経変性疾患として知られている。現在、これら疾患に対する治療に、神経変性に伴う神経伝達物質の枯渇を補う補充療法剤や対症療法剤等が使用されている。しかしながら、それら補充療法剤や対症療法剤が神経変性の進行を抑制させるわけではなく、病状の進行とともにそれらの効果は徐々に失われていく。その為、神経変性の進行を抑制し、残存した神経再生を促す薬剤の開発が望まれるが、現状ではこのような作用を有する薬剤は見出されていない。また、これまで長い間中枢神経系において神経変性が生じた場合、神経新生が不可能とされてきた。しかし、ごく最近になりヒトを含む成熟した哺乳動物の中枢神経系には神経を新生しうる神経幹細胞及び神経前駆細胞が存在する事が相次いで明らかにされ、内在性の神経幹細胞を活性化することにより障害された神経組織及び機能を再生する可能性が検討され始めた（例えば非特許文献１，２）。
【０００３】
一方、ＨＧＦは、最初に成熟肝細胞に対する強力なマイトゲンとして同定され、１９８９年にその遺伝子クローニングがなされた（非特許文献３、４参照）。ＨＧＦの投与は、抗アポトーシス活性によって劇症肝炎を伴うマウスにおけるエンドトキシン誘発致死的肝障害を予防し、ＨＧＦ遺伝子治療は致命的な肝硬変を持つラットの生存率を改善し得る（非特許文献５、６参照）。また、ノックアウト／ノックインマウスの手法を含む発現及び機能的解析における近年の多数の研究により、ＨＧＦは新規な神経栄養因子であることも明らかにされた（非特許文献７、８参照）。とりわけＨＧＦは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）に匹敵する運動ニューロンに対する最も強力な生存促進因子の一つとして知られている（非特許文献９参照）。
【０００４】
また、特許文献１には、パーキンソン病で変性する中脳黒質ドーパミンニューロンを薬剤投与により特異的に死滅させる中脳黒質ドーパミンニューロン細胞死誘導ラットを用いて、ＨＧＦ遺伝子の神経変性疾患への作用効果を行動学的に及び組織学的に検討した実施例が示されている。具体的には、ＨＧＦ遺伝子の前投与が、中脳黒質ドーパミンニューロンを神経毒６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）から保護し、中脳黒質ドーパミンニューロン細胞死誘導ラットの症状を抑えたことが示されている。そして、この特許文献１では、このような実験結果に基づいて、ＨＧＦ遺伝子がドーパミンニューロンに対する保護作用を有すると記載されている。また、特許文献２には、ＨＧＦは運動ニューロンに対する直接的神経栄養因子活性と、運動ニューロンに対するグルタミン酸細胞毒性の間接的な改善作用（神経保護作用）の２つの作用を有すると記載されている。しかしながら、ＨＧＦが神経毒６−ＯＨＤＡやグルタミンに対して神経保護作用を示したからといって、ＨＧＦが神経細胞の新生を促進するとは到底予測できない。
さらに、特許文献３には、ＨＧＦを有効成分とする脳神経障害治療剤が記載され、ＨＧＦは神経細胞の生存を延長させるが、神経是由来の細胞であるラット好クロム性細胞腫ＰＣ１２細胞のＤＮＡ合成を促進することはない旨記載されている。還元すれば、ＨＧＦはＰＣ１２細胞の新生を促進することはないということを示すものである。このことからも、ＨＧＦが神経細胞の新生を促進するということは予測すらできない。
【特許文献１】国際公開第２００３／０４５４３９号パンフレット
【特許文献２】特開２００２−８７９８３号公報
【特許文献３】特許第３６８０１１４公報
【非特許文献１】ネイチャー・メディシン(Nature Medicine）、１９９８年、第４巻、１３１３−１３１７頁
【非特許文献２】ネイチャー・メディシン(Nature Medicine）、２０００年、第６巻、２７１−２７７頁
【非特許文献３】中村（Nakamura）ら，バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・アンド・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem．Biophys．Res．Commun．），１９８４年，第１２２巻，ｐ．１４５０−１４５９
【非特許文献４】中村（Nakamura）ら，ネイチャー（Nature），１９８９年，第３４２巻，ｐ．４４０−４４３
【非特許文献５】コウサイ（Kosai）ら，ヘパトロジー（Hepatology），１９９９年，第３０，ｐ．１５１−１５９
【非特許文献６】ウエキ（Ueki）ら，ネイチャー・メディシン（Nat．Med．），１９９９年，第５巻，ｐ．２２６−２３０．
【非特許文献７】松本（Matsumoto）ら，チバ・ファウンデイション・シンポジウム（Ciba Found．Symp．），１９９７年，第２１２巻，ｐ．１９８−２１１；ディスカッション２１１−１９４
【非特許文献８】船越（Funakoshi）ら，クリニカ・チミカ・アクタ(Clin．Chim．Acta．)，２００３年，第３２７巻，ｐ．１−２３
【非特許文献９】ニューロン（Neuron），１９９６年，第１７巻，ｐ．１１５７−１１７２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、神経新生に有効な薬剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、前記課題を解決すべく種々研究を重ねた結果、ＨＧＦ蛋白質もしくはＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド（以下において、ＨＧＦ蛋白質等ということもある。）、あるいはそれらをコードするＤＮＡ又は前記ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ（以下において、ＨＧＦ遺伝子ということもある。）が神経新生効果を奏することを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明者らは、まず神経細胞死を誘発するモデルマウスとしてＲ６／２形質転換マウスを用いて、ＨＧＦ蛋白質等又はＨＧＦ遺伝子の神経新生への関与を検討した。
本発明者らは、神経向性を有し複製能を欠如したベクター（Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ベクター）を用いてＲ６／２形質転換マウスにラットＨＧＦ遺伝子を線条体に導入し、線条体においてラットＨＧＦ蛋白質を発現するＲ６／２形質転換マウスを作製し、当該マウスを用いて、実際にＨＧＦ遺伝子が神経新生に対して効果を示すか否かを検討した。神経新生には、新しい神経細胞が生まれるので細胞分裂がなされなければいけない。細胞分裂時には、遺伝情報をコピーするためにＤＮＡが合成さる。ＤＮＡが合成されたかどうかを知る手がかりとなる物質としてＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）がある。ＢｒｄＵを体内に注入すると新しく生まれる神経（細胞）には、このＢｒｄＵが取り込まれる。このためＢｒｄＵを指標に神経新生の有無を判定できる。そこで、前記ラットＨＧＦ蛋白質を発現するＲ６／２形質転換マウスにＢｒｄＵを投与し、線条体の神経細胞に取り込まれるＢｒｄＵを測定したところ、少なくとも線条体において神経が新生されるということを見出した。また、培養神経幹細胞（neurosphere）を用いた分化アッセイにおいて、ＨＧＦ受容体が神経幹細胞や該神経幹細胞から分化した神経細胞及びアストロサイト前駆細胞に存在することを見出した。さらに、培養神経幹細胞（neurosphere）を用いた分化アッセイにおいて、ＨＧＦは神経幹細胞から新生神経細胞への分化（新生神経細胞の増加）を促進し、かつ分化した神経細胞における神経線維の伸張及び神経突起の分岐を促進させることを見出した。
このような、ＨＧＦ蛋白質又はＨＧＦ遺伝子の神経新生作用は本発明において初めて見出されたものであり、発明者らはこれら知見に基づきさらに研究を進め、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、
［１］（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として含有することを特徴とする神経新生促進剤、
［２］ 有効成分が、（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡであることを特徴とする前記［１］記載の神経新生促進剤、
［３］ ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡが、（ａ）配列番号１、２又は５で表される塩基配列からなるＤＮＡ又は（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡであることを特徴とする前記［２］記載の神経新生促進剤、
［４］ ＤＮＡが、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ベクター、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターに組み込まれていることを特徴とする前記［２］又は［３］記載の神経新生促進剤、
［５］ 有効成分が、（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩であることを特徴とする前記［１］記載の神経新生促進剤、
［６］ ＨＧＦ蛋白質が、（ａ）配列番号３、４又は６で表されるアミノ酸配列と同一又は（ｂ）前記アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質であることを特徴とする前記［５］記載の神経新生促進剤、
［７］ 神経新生促進剤が、局所投与用であることを特徴とする前記［１］〜［６］のいずれかに記載の神経新生促進剤、
［８］ 局所投与が、髄腔内投与であることを特徴とする前記［７］記載の神経新生促進剤、
［９］ 神経栄養因子と組み合わせて使用されることを特徴とする前記［１］〜［８］のいずれかに記載の神経新生促進剤、及び
［１０］ 神経栄養因子が、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＣＮＴＦ、ＧＤＮＦ及びＢＤＮＦから選択される少なくとも１種であることを特徴とする前記［９］記載の神経新生促進剤、
に関する。
【０００９】
また、本発明は（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを哺乳動物に投与することを特徴とする神経新生の促進方法に関する。さらに、本発明は、神経新生を促進する医薬を製造するための（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡの使用に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の神経新生促進剤は、神経の変性又は神経細胞死を伴う神経変性疾患や神経障害において、神経の変性や神経細胞死が誘発された部位において新たな神経の新生を促進し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において「ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ」とは、ＨＧＦ蛋白質を発現し得るＤＮＡをいう。ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡとしては、例えば、Nature，342，440（1989）；特許第２７７７６７８号公報；Biochem．Biophys，Res．Commun．，1989年，第163巻，p．967-973；Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．，1991年，第88巻（16号），p．7001-7005等に記載され、例えば、GeneBank/EMBL/DDBJにAccession No．Ｍ６０７１８、Ｍ７３２４０、ＡＣ００４９６０、ＡＹ２４６５６０、Ｍ２９１４５又はＭ７３２４０等として登録されているヒト由来のＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ等が好ましく挙げられる。また、本発明のＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡには、前記ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性、例えばマイトゲン活性、モートゲン活性等を有する蛋白質をコードするＤＮＡ等が包含される。
【００１２】
ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡの具体例としては、例えば、配列番号１又は２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、若しくは配列番号１又は２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性、例えばマイトゲン活性、モートゲン活性等を有する蛋白質をコードするＤＮＡ等が好ましく挙げられる。ここで、配列番号１で表される塩基配列は、Accession No．Ｍ６０７１８の塩基配列第７３乃至２２５９に相当し、該ＤＮＡは配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡに相当する。配列番号２で表される塩基配列は、Accession No．Ｍ７３２４０の塩基配列第６６乃至２２３７に相当し、該ＤＮＡは配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡに相当する。
【００１３】
配列番号１又は２で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば上記ＤＮＡの部分配列をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、約０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、約６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、約０．１〜２倍の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムよりなる。）を用い、約６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。ストリンジェントな条件は、以下において同様である。
【００１４】
上記の配列番号１又は２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとして具体的には、配列番号１又は２で表わされる塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡ等が挙げられる。ハイブリダイゼーションは、公知の方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning，A laboratory Manual，Third Edition（J．Sambrook et al．，Cold Spring Harbor Lab．Press，2001：以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す。）に記載の方法等に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
【００１５】
さらに、本発明のＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡは上記に限定されず、発現する蛋白質がＨＧＦ蛋白質と実質的に同じ作用を有する蛋白質をコードするＤＮＡである限り、本発明のＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡとして使用できる。例えばＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドをコードするＤＮＡであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ等も好ましく使用できる。
【００１６】
ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、上記した部分ペプチドをコードする塩基配列を有しかつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡであればいかなるものであってもよい。具体的な本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、（ａ）配列番号１又は２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡであって、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ、（ｂ）配列番号１又は２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ等が挙げられる。このようなＤＮＡとしては、より具体的には、例えば、配列番号１で表されるヒトＨＧＦの塩基配列の第９４番目から第６３０番目までの塩基配列（ＨＧＦのＮ末端ヘアピンループから第１クリングルドメインまでのペプチドをコードするＤＮＡ）を有するＤＮＡや、配列番号１で表されるヒトＨＧＦの塩基配列の第９４番目から第８６４番目までの塩基配列（ＨＧＦのＮ末端ヘアピンループから第２クリングルドメインまでのペプチドをコードするＤＮＡ）を有するＤＮＡ等が好ましく挙げられる。
【００１７】
ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ又はＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡは、例えば通常のハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等により容易に得ることができ、該ＤＮＡの取得は具体的には例えば前記モレキュラー・クローニング第３版等の基本書等を参考にして行うことができる。
【００１８】
なお、本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ又はＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、細胞・組織由来のｃＤＮＡ、細胞もしくは組織由来のｃＤＮＡライブラリー又は合成ＤＮＡ等が好ましく挙げられる。前記ライブラリーにゲノムＤＮＡ断片がクローニングされるベクターとしては、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド又はファージミド等が挙げられる。
また、本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質をコードするＲＮＡ又はＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドをコードするＲＮＡであって、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＲＮＡも、逆転写酵素によりＨＧＦ蛋白質又は部分ペプチドを発現することができるものであれば、本発明に用いることができる。該ＲＮＡとしては、例えば細胞又は組織よりｍＲＮＡ画分を調製して、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅したＲＮＡ等が挙げられ、本発明の範囲内である。また該ＲＮＡも公知の手段により得ることができる。
【００１９】
本発明で使用されるＨＧＦ蛋白質は公知物質であり、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。
ＨＧＦ蛋白質は、例えばＨＧＦ蛋白質を産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養上清等から分離、精製して該ＨＧＦ蛋白質を得ることができる。あるいは遺伝子工学的手法によりＨＧＦ蛋白質をコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清液から目的とする組換えＨＧＦ蛋白質を分離すること等により得ることもできる。（例えば、特開平５−１１１３８２号公報、Biochem．Biophys．Res．Commun．1989年、第163巻，ｐ．967等を参照）。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母又は動物細胞等を用いることができる。このようにして得られたＨＧＦ蛋白質は、天然型ＨＧＦ蛋白質と実質的に同じ作用を有する限り、そのアミノ酸配列中の１若しくは複数個（例えば、１〜約２０個、好ましくは１〜約１０個；以下同様である。）のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失若しくは付加されていてもよい。そのようなＨＧＦ蛋白質として、下記する５アミノ酸欠損型ＨＧＦ蛋白質を挙げることができる。ここで、アミノ酸配列について、「１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加」とは、遺伝子工学的手法、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的手段により、又は天然に生じうる程度の数（１〜複数個）が、欠失、置換若しくは付加等されていることを意味する。糖鎖が置換、欠失若しくは付加したＨＧＦ蛋白質とは、例えば天然のＨＧＦ蛋白質に付加している糖鎖を酵素等で処理し糖鎖を欠損させたＨＧＦ蛋白質、また糖鎖が付加しない様に糖鎖付加部位のアミノ酸配列に変異が施されたもの、あるいは天然の糖鎖付加部位とは異なる部位に糖鎖が付加するようアミノ酸配列に変異が施されたもの等をいう。具体的には、例えばＮＣＢＩのデータベースに登録されているAccession No．ＮＰ＿００１０１０９３２のヒトＨＧＦに対し、糖鎖付加部位の２８９位ＡｓｎをＧｌｎに、３９７位ＡｓｎをＧｌｎに、４７１位ＴｈｒをＧｌｙに、５６１位ＡｓｎをＧｌｎに、６４８位ＡｓｎをＧｌｎにそれぞれ置換することによって糖鎖が付加しないようにしたＨＧＦ［Fukuta K et al．，Biochemical Journal，388，555-562（2005）］等を挙げることができる。
さらに、ＨＧＦ蛋白質のアミノ酸配列と少なくとも約８０％以上の相同性を有する蛋白質、好ましくは約９０％以上の相同性を有する蛋白質、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する蛋白質であって、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質も本発明に使用されるＨＧＦ蛋白質に含まれる。上記アミノ酸配列について「相同」とは、蛋白質の一次構造を比較し、配列間において各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味である。
【００２０】
上記ＨＧＦ蛋白質としては、例えばＮＣＢＩのデータベース等に登録されている例えばAccession No．Ｐ１４２１０（配列番号３）又はAccession No．ＮＰ＿００１０１０９３２（配列番号４）で表されるアミノ酸配列で示されるヒト由来の蛋白質等が好ましく挙げられる。配列番号４で表されるＨＧＦ蛋白質は、配列番号３で表されるアミノ酸配列の第１６１〜１６５番目の５個のアミノ酸残基が欠失している５アミノ酸欠損型ＨＧＦ蛋白質である。配列番号３又は４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質は、両者ともヒト由来の天然ＨＧＦ蛋白質であって、ＨＧＦとしてのマイトゲン活性、モートゲン活性等を有する。
配列番号３又は４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む蛋白質としては、配列番号３又は４で表されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質であって、ＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質、例えば配列番号３又は４で表されるアミノ酸配列から、１〜複数個のアミノ酸残基を挿入又は欠失させたアミノ酸配列、１〜複数個のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基と置換させたアミノ酸配列又は１〜複数個のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸配列等を含む蛋白質であって、ＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質であることが好ましい。挿入されるアミノ酸又は置換されるアミノ酸は、遺伝子によりコードされる２０種類のアミノ酸以外の非天然アミノ酸であってもよい。非天然アミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基を有する限りどのような化合物でもよいが、例えばγ−アミノ酪酸等が挙げられる。
これらの蛋白質は、単独であっても、これらの混合蛋白質であってもよい。配列番号３又は４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む蛋白質としては、例えばＮＣＢＩのデータベースに登録されているAccession No．ＢＡＡ１４３４８又はＡＡＣ７１６５５等のヒト由来ＨＧＦが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
なお、本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質又はそれをコードするＤＮＡは、ヒトに適用する場合は前記したヒト由来のものが好適に用いられるが、ヒト以外の哺乳動物（例えばサル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター、モルモット、チンパンジー等）に由来するＨＧＦ蛋白質又はそれをコードするＤＮＡであってもよい。このようなＨＧＦとしては、例えばＮＣＢＩのデータベース等に登録されている例えば、マウス由来ＨＧＦ（例えばAccession No．ＡＡＢ３１８５５，ＮＰ＿０３４５５７，ＢＡＡ０１０６５，ＢＡＡ０１０６４等）、ラット由来ＨＧＦ［例えばAccession No．ＮＰ＿５８７１３（配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質）等］、ウシ由来ＨＧＦ（例えばAccession No．ＮＰ＿００１０２６９２１、ＸＰ８７４０８６，ＢＡＤ０２４７５等）、ネコ由来ＨＧＦ（例えばAccession No．ＮＰ＿００１００９８３０、ＢＡＣ１０５４５，ＢＡＢ２１４９９等）、イヌ由来ＨＧＦ（例えばAccession No．ＮＰ＿００１００２９６４、ＢＡＣ５７５６０等）又はチンパンジー由来ＨＧＦ（例えばAccession No．ＸＰ５１９１７４等）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
本発明に用いられるＨＧＦ蛋白質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシラート［−ＣＯＯＭ（Ｍは金属を示す）］、アミド（−ＣＯＮＨ2）又はエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチル等のＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル等のＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチル等のＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチル等のフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチル等のα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基等のＣ７−１４アラルキル基のほか、アセチルオキシメチル、ピバロイルオキシメチル等のＣ２−６アルカノイルメチル基等が用いられる。本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質が、Ｃ末端以外にカルボキシル基又はカルボキシラートを有している場合、カルボキシル基又はカルボキシラートがアミド化又はエステル化されているものも本発明におけるＨＧＦ蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステル等が用いられる。さらに、本発明に用いられるＨＧＦ蛋白質には、上記した蛋白質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル等のＣ２−６アルカノイル基等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の反応性基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾリル基、インドリル基、グアニジノ基等）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル等のＣ２−６アルカノイル基等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質等の複合蛋白質等も含まれる。
【００２３】
本発明で用いるＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド（以下、ＨＧＦ部分ペプチドと略記する場合がある。）としては、上記したＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであって、ＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するものであればいずれのものであってもよい。本発明において、ＨＧＦ部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記したＨＧＦ蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも約２０個以上、好ましくは約５０個以上、より好ましくは約１００個以上のアミノ酸配列を含有するペプチド等が好ましい。具体的には、例えば、配列番号３で表されるヒトＨＧＦアミノ酸配列のＮ末端側から３２番目のアミノ酸から２１０番目のアミノ酸までのアミノ酸配列（ＨＧＦのＮ末端ヘアピンループから第１クリングルドメインまでの配列）で示されるペプチドや、配列番号３で表されるヒトＨＧＦアミノ酸配列のＮ末端側から３２番目のアミノ酸から２８８番目のアミノ酸までのアミノ酸配列（ＨＧＦのＮ末端ヘアピンループから第２クリングルドメインまでの配列）で示されるペプチド等が好ましく挙げられる。
本発明のＨＧＦ部分ペプチドにおいては、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシラート［−ＣＯＯＭ（Ｍは上記と同意義）］、アミド（−ＣＯＮＨ2）又はエステル（−ＣＯＯＲ；Ｒは上記と同意義）のいずれであってもよい。さらに、ＨＧＦ部分ペプチドには、上記したＨＧＦ蛋白質と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチド等の複合ペプチド等も含まれる。
【００２４】
本発明に用いられるＨＧＦ蛋白質又はその部分ペプチドの塩としては、酸又は塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等）との塩等が挙げられる。
【００２５】
本発明に用いられるＨＧＦ蛋白質の部分ペプチド又はその塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいはＨＧＦ蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれでも良い。すなわち、ＨＧＦ蛋白質を構成し得る保護基を有していてもよい部分ペプチドもしくはアミノ酸と保護基を有していてもよい残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は、保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、M．Bodanszky及びM．A．Ondetti、ペプチド・シンセシス（Peptide Synthesis），Interscience Publishers，New York（1966年）、Schroeder及びLuebke、ザ・ペプチド（The Peptide），Academic Press，New York（1965年）等に記載された方法等が挙げられる。反応後は通常の精製方法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、結晶化又は再結晶等を組み合わせてＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００２６】
本発明において「神経新生」とは、幼弱な未分化細胞（例えば神経幹細胞等）から神経芽細胞を経て新しい神経（神経細胞）に分化させることをいい、神経細胞に分化する神経芽細胞や未分化細胞等の増殖を含む。また神経新生は、損傷した神経の再生や神経修復を含む。
「神経」には、中枢神経（例えば脳、脊髄等）及び末梢神経（例えば尺骨神経、橈骨神経、腓骨神経等）を含む。
【００２７】
本発明の神経新生促進剤は、ヒトのほか、ヒト以外の哺乳動物（例えば、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター、モルモット、チンパンジー等）にも適用できる。
【００２８】
本発明の神経新生促進剤を患者に投与する場合、その投与形態、投与方法、投与量等は、有効成分がＨＧＦ蛋白質の場合と、ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡの場合と若干異なってもよい。
例えば、有効成分がＨＧＦ蛋白質である場合の本発明の製剤は、種々の製剤形態、例えば液剤、固形剤等をとりうるが、一般的にはＨＧＦ蛋白質のみを又はそれを慣用の担体と共に注射剤、噴射剤、徐放性製剤（例えば、デポ剤）等に製剤されるのが好ましい。上記注射剤は、水性注射剤又は油性注射剤のいずれでもよい。水性注射剤とする場合、公知の方法に従って、例えば、水性溶媒（注射用水、精製水等）に、医薬上許容される添加剤、例えば等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等）、緩衝剤（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等）、保存剤（パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等）、増粘剤（ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等）、安定化剤（亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等）又はｐＨ調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等）等を適宜添加した溶液に、ＨＧＦ蛋白質を溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。また適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）又は非イオン界面活性剤（ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０等）等をさらに配合してもよい。油性注射剤とする場合、油性溶媒としては、例えば、ゴマ油又は大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル又はベンジルアルコール等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプル又はバイアル等に充填される。注射剤中のＨＧＦ蛋白質含量は、通常約０．０００２〜０．２ｗ／ｖ％、好ましくは約０．００１〜０．１ｗ／ｖ％に調整され得る。なお、注射剤等の液状製剤は、凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。
【００２９】
噴霧剤も製剤上の常套手段によって調製することができる。噴霧剤として製造する場合、その噴霧剤に配合される添加剤としては、一般に吸入用製剤に使用される添加剤であればいずれのものであってもよく、例えば、噴射剤の他、上記した溶剤、保存剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤等を配合し得る。噴射剤としては、液化ガス噴射剤又は圧縮ガス等が挙げられる。液化ガス噴射剤としては、例えば、フッ化炭化水素（ＨＣＦＣ２２、ＨＣＦＣ−１２３、ＨＣＦＣ−１３４ａ、ＨＣＦＣ１４２等の代替フロン類等）、液化石油、ジメチルエーテル等が挙げられる。圧縮ガスとしては、例えば、可溶性ガス（炭酸ガス、亜酸化窒素ガス等）又は不溶性ガス（窒素ガス等）等が挙げられる。
【００３０】
また、本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質は、生体分解性高分子と共に、徐放性製剤（例えばデポ剤）とすることもできる。ＨＧＦ蛋白質は特にデポ剤とすることにより、投薬回数の低減、作用の持続性及び副作用の軽減等の効果が期待できる。該徐放性製剤は公知の方法に従って製造することができる。本徐放性製剤に使用される生体内分解性高分子は、公知の生体内分解性高分子のなかから適宜選択できるが、例えばデンプン、デキストラン又はキトサン等の多糖類；コラーゲン又はゼラチン等の蛋白質；ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリロイシン、ポリアラニン又はポリメチオニン等のポリアミノ酸；ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸−グリコール酸共重合体；ポリカプロラクトン、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリ酸無水物又はフマル酸・ポリエチレングリコール・ビニルピロリドン共重合体等のポリエステル；ポリオルソエステル又はポリメチル−α−シアノアクリル酸等のポリアルキルシアノアクリル酸；ポリエチレンカーボネート又はポリプロピレンカーボネート等のポリカーボネート等が挙げられる。好ましくはポリエステル、更に好ましくはポリ乳酸又は乳酸−グリコール酸共重合体である。乳酸−グリコール酸共重合体を使用する場合、その組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）は徐放期間によって異なるが、例えば徐放期間が約２週間ないし３カ月、好ましくは約２週間ないし１カ月の場合には、約１００／０乃至５０／５０が好ましい。該ポリ乳酸又は乳酸−グリコール酸共重合体の重量平均分子量は、一般的には約５，０００乃至２０，０００が好ましい。ポリ乳酸又は乳酸−グリコール酸共重合体は、公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の製造法に従って製造できる。生体分解性高分子とＨＧＦ蛋白質の配合比率は特に限定はないが、例えば生体分解性高分子に対して、ＨＧＦ蛋白質が約０．０１〜３０ｗ／ｗ％が好ましい。
【００３１】
投与方法としては、注射剤もしくは噴霧剤を直接神経変性や神経細胞死が誘発された部位に直接注射（髄腔内投与又は脊髄実質投与、徐放性ポンプによる髄腔内持続投与等）もしくは噴霧するか、あるいは徐放性製剤（デポ剤）を神経変性や神経細胞死が誘発された部位のある組織に近い部位に埋め込むのが好ましい。また、投与量は、剤形、疾患の程度又は年齢等に応じて適宜選択されるが、通常、1回当たり１μｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１０μｇ〜５０ｍｇ、さらに好ましくは１〜２５ｍｇである。また、投与回数も剤形、疾患の程度又は年齢等に応じて適宜選択され、１回投与とするか、ある間隔をおいて持続投与とすることもできる。持続投与の場合、投与間隔は１日１回から数ヶ月に１回でよく、例えば、徐放性製剤（デポ剤）による投与や徐放性ポンプによる髄腔内持続投与の場合は、数ヶ月に１回でもよい。
【００３２】
一方、ＨＧＦ遺伝子を患者に投与するには、常法、例えば別冊実験医学，遺伝子治療の基礎技術，羊土社，１９９６、別冊実験医学，遺伝子導入＆発現解析実験法，羊土社，１９９７、日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス，１９９９等に記載の方法に従って、行うことが好ましい。
具体的な投与方法としては、例えば、ＨＧＦ遺伝子が組み込まれた組換え発現ベクター等を神経変性や神経細胞死が誘発された部位の組織（例えば脊髄神経、脳等）へ局所注射する方法、又は、患者の病変部位の組織又は脊髄等から細胞を体外に取り出して、該細胞にＨＧＦ遺伝子が組み込まれた組換え発現ベクターを導入し形質転換させた後に、形質転換された前記細胞を、患者の病変部位又は脊髄に移植する方法等が挙げられる。
【００３３】
発現ベクターとしては、ｎａｋｅｄプラスミド、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（Ｉ型単純ヘルペスウイルス等）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０又は免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルス等が挙げられるが、これらに限定されない。前記発現ベクターに目的とする遺伝子を導入し、細胞に組換えウイルスを感染させることにより、細胞内にＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡを導入することが可能である。中でも、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ベクター、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター等が好ましい。
前記ＨＳＶ−１ベクターは神経向性を有するベクターである。ＨＳＶ−１ベクターとしては、多重遺伝子（３０ｋｂまで）が組み込まれている大きな（１５２ｋｂ）ゲノムを有し、かつ生涯にわたり潜在的に神経細胞に対して感染を樹立する能力を有するものが好ましい。具体的なＨＳＶ−１ベクターとしては、ウイルス複製のためのＩＣＲ４，ＩＣＰ３４．５及びＶＰ１６（ｖｍｗ６５）をエンコードする３つの遺伝子の欠失により、重篤な障害状態にある複製能力のないＨＳＶ−１（ＨＳＶ１７６４／４−／ｐＲ１９）ベクター（Coffin RS，et al.，J．Gen．Virol．1998年，第79巻，ｐ．3019-3026；Palmer JA，et al.，J．Virol.，2000年，第74巻，ｐ．5604-5618；Lilley CE，et al.，J．Virol．，2001年，第75巻，ｐ．4343-4356）等が挙げられる。また、ＡＡＶベクターは、非病原性ウイルスに属し、安全性が高く、また神経細胞等の非分裂細胞に効率よく遺伝子導入できるベクターである。ＡＡＶベクターとしては、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５等が挙げられる。これらＨＳＶ−１ベクターやＡＡＶベクターは目的遺伝子を神経細胞等において長期間発現させ得る。
ＨＧＦの神経新生に対する効果の評価のためには、例えば、ＨＳＶ−１ベクター、ＡＡＶベクターを使用してＨＧＦ遺伝子を神経変性や神経細胞死が誘発された部位、例えば線条体や髄腔内等へ形質導入するのが好ましい。
【００３４】
製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の公知の製剤形態［例えば、注射剤、噴霧剤、徐放性製剤（デポ剤）、マイクロカプセル剤等］をとり得ることができる。注射剤、噴霧剤、徐放性製剤（デポ剤）はＨＧＦ蛋白質の場合と同様にして調製できる。また、マイクロカプセル剤を製造する場合、例えばＨＧＦ遺伝子を含む発現プラスミドを導入した宿主細胞等を芯物質としてこれを公知の方法（例えばコアセルベーション法、界面重合法又は二重ノズル法等）に従って被膜物質で覆うことにより直径約１〜５００、好ましくは約１００〜４００μｍの微粒子として製造することができる。被膜物質としては、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート、エチルセルロース、アルギン酸又はその塩、ゼラチン、ゼラチン・アラビアゴム、ニトロセルロース、ポリビニルアルコール又はヒドロキシプロピルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸−グリコール酸共重合体、キトサン−アルギン酸塩、硫酸セルロース−ポリ（ジメチルジアリル）アンモニウムクロライド、ヒドロキシエチルメタクリレート−メチルメタクリレート、キトサン−カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩−ポリリジン−アルギン酸塩等の膜形成性高分子等が挙げられる。
製剤中のＤＮＡの含量や投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができる。また投与量は、ＨＧＦ遺伝子導入ベクターの種類により異なるが、ＨＧＦ遺伝子導入ベクターに換算して、通常１×１０6ｐｆｕ〜１×１０12ｐｆｕ、好ましくは１×１０7ｐｆｕ〜２×１０11ｐｆｕ、さらに好ましくは１．５×１０7ｐｆｕ〜１．５×１０11ｐｆｕを数日ないし数ヶ月に１回投与するのが好ましい。
【００３５】
本発明の神経新生促進剤は、ＨＧＦ蛋白質等又はＨＧＦ遺伝子の神経新生促進効果の補完及び／又は増強等のために他の神経栄養因子と組み合わせて、併用剤として投与してもよい。
ＨＧＦ蛋白質等又はＨＧＦ遺伝子と他の神経栄養因子の併用剤は、１つの製剤中に両成分を配合した配合剤の形態で投与してもよく、また別々の製剤にして投与する形態をとってもよい。この別々の製剤にして投与する場合には、同時投与、時間差による投与が含まれる。また、時間差による投与は、ＨＧＦ蛋白質等又はＨＧＦ遺伝子を含有する製剤を先に投与し、他の神経栄養因子を含有する製剤を後に投与してもよいし、他の神経栄養因子を含有する製剤を先に投与し、ＨＧＦ蛋白質等又はＨＧＦ遺伝子を含有する製剤を後に投与してもよい。それぞれの投与方法は同じでも異なっていてもよい。神経栄養因子には、未分化な神経芽細胞の増殖と分化、或いは成熟した神経細胞の生存と機能の維持又は促進をはかる因子を含む。さらに、神経栄養因子は、神経組織が障害を受けると一時的に合成分泌が亢進され、組織の変性脱落の予防や機能修復に関与するlesion factorとしての性質を示すものも含まれる。神経栄養因子としては、特に限定されず、例えばＮＴ−３（Neurotrophin３）、ＮＴ−４（Neurotrophin４）、ＣＮＴＦ(Ciliary Neurotrophic Factor；毛様体神経栄養因子)、ＧＤＮＦ（Glial-Derived Neurotrophic Factor）又はＢＤＮＦ（brain-derived neurotrophic factor；脳由来神経栄養因子）等が挙げられる。
【００３６】
本発明の神経新生促進剤は、神経の変性や神経細胞死が誘発された部位において新たな神経の新生を促進し得るので、神経の変性又は神経細胞死を伴う神経変性疾患や神経障害等において、例えば神経再生、神経修復又は神経機能改善等のために用いることができる。
神経変性疾患や神経障害には、神経の変性や細胞死が誘発される全ての神経変性疾患又は神経障害が含まれる。神経変性疾患や神経障害が誘発される要因は特に限定されず、例えば遺伝、物理的なけが（例えば、激しい運動、事故、冷気や熱気に長時間体がさらされる、圧迫の繰り返し等）、放射線照射、感染症、有毒物質や薬物、癌の神経への浸潤、糖尿病等の疾患の合併症等が含まれる。
また、神経変性疾患や神経障害には、中枢性神経疾患、中枢神経障害、末梢神経疾患及び末梢神経障害等が含まれる。
中枢性神経疾患又は中枢神経障害としては、例えば、失語症、失行、失認、健忘（ウェルニッケ脳症、コルサコフ症候、一過性全健忘、虚偽性（心因性）健忘症）、昏迷と昏睡、せん妄と痴呆、アルツハイマー病、けいれん性疾患、睡眠障害、不眠症、過眠症［睡眠発作（ナルコレプシー）］、睡眠時無呼吸症候群、錯眠等の大脳脳葉の障害；うつ病、躁うつ病、統合失調症等の精神疾患；虚血性症候群［一過性脳虚血性発作（ＴＩＡ）、虚血性発作、出血性症候群、頭蓋内出血、クモ膜下出血］、脳動静脈奇形等の脳血管疾患；頭部外傷；急性細菌性髄膜炎、急性ウイルス性脳炎と無菌性髄膜炎、亜急性及び慢性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿、中枢神経系の感染症；神経系の放射線傷害；大脳皮質基底核神経節変性症；脊柱管狭窄症；脊椎分離すべり症、後縦靭帯骨化症；ホルネル症候群、核間性眼筋麻痺、注視麻痺、網膜症等の視神経障害；第３脳神経麻痺、第４脳神経麻痺、第６脳神経麻痺、三叉神経痛、顔面神経疾患（ベル麻痺）等の脳神経疾患；振戦、ジスキネジア（ミオクローヌス、チック、トゥレット症候群、アテトーシス（ジストニア）；ハンチントン舞踏病、球脊髄性筋委縮症、脊髄小脳失調症１型、脊髄小脳失調症２型、脊髄小脳失調症３型、脊髄小脳失調症６型、脊髄小脳失調症７型、脊髄小脳失調症１２型及び歯状核赤核淡蒼球ルイ体委縮症等のポリグルタミン病；薬物誘発性の運動障害、進行性核上性麻痺等の運動の障害；脊髄圧迫、硬膜下と硬膜外の膿瘍と血腫、空洞症、血管疾患、遺伝性痙性対麻痺、急性横断性脊髄炎、脊髄損傷等の脊髄疾患；又は、糖尿病性網膜症等が挙げられる。
末梢神経疾患又は末梢神経障害としては、例えば、神経切断等を伴う外傷；下位，及び上位運動ニューロン疾患（遺伝性脊髄性筋萎縮症）、神経根疾患（髄核ヘルニア、頸椎症）、神経叢疾患、胸郭出口圧迫症候群、末梢神経障害（ギラン−バレー症候群、遺伝性ニューロパシー、神経線維腫症、プロテウス症候群）、神経筋伝達疾患（重症筋無力症）等の末梢神経系の疾患；筋ジストロフィ、ミオパシー、チャネロパシー（筋強直性疾患、家族周期性麻痺）等の筋障害等；又は、糖尿病性神経障害等が挙げられる。
【００３７】
神経新生には、新しい神経細胞が生まれるので細胞分裂がなされなければいけない。細胞分裂時には、遺伝情報をコピーするためにＤＮＡが合成さる。ＤＮＡが合成されたかどうかを知る手がかりとなる物質としては、例えばＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）等が挙げられる。例えば、ＢｒｄＵを体内に注入すると新しく生まれる細胞には、このＢｒｄＵが取り込まれるのでこのＢｒｄＵを指標に神経細胞の新生を判定できる。従って、神経新生作用は、神経細胞に取り込まれるＢｒｄＵを指標に測定する方法を用いて測定することができる。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養神経幹細胞から神経膠細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイト）又は神経細胞への分化を測定する方法を含む後述の試験例等に記載されている方法等を用いて測定することができる。なお、前記した神経細胞は細胞体、樹状突起及び軸索を含む。神経膠細胞はアストロサイト、オリゴデンドロサイト及びミクログリア細胞を含む。アストロサイトはさらに神経細胞へ分化し得る。なお、本発明においてアストロサイトはＧＦＡＰ陽性の細胞全てを包含する。
【実施例】
【００３８】
以下に試験例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例において％は特に明記しない場合は質量％を示す。
【００３９】
〔試験例１〕
脳神経細胞の新生に対するＨＧＦの作用
１．実験動物
Ｂ６ＣＢＡ−ＴｇＮ（ＨＤエクソン１）６２Ｇｐｂ／Ｊ雌性マウス（Mangiarini Ｌら，Cell，1996年，第87巻，p．493-506）から摘出した卵巣が移植されたＢ６ＣＢＡＦ１／Ｊ雌性マウスは、Jackson Laboratory（Bar Harbor，ME）から入手し、Ｂ６ＣＢＡＦ１／Ｊ雄性マウスと共に飼育し、交配した。
交配した子は、その尾組織から抽出したゲノムＤＮＡのＰＣＲ解析により遺伝子系を決定し、ＴｇＮ６２Ｇｐｂ遺伝子を有するマウスをハンチントン舞踏病モデルマウスＲ６／２マウス（以下、Ｒ６／２マウスと略記する。）とした。また、前記Ｒ６／２マウスと同腹でＴｇＮ（ＨＤエクソン１）６２Ｇｐｂ遺伝子を持たないマウスを野生型同腹子マウスとして使用した。
全ての実験は大阪大学動物倫理委員会のガイドラインに従って行なった。すべての取り組みはできるだけ動物の負担を少なくし、できるだけ少ない数の動物を使用した。
【００４０】
２．ベクターの構築、製造及び精製
ｐＲ１９ＧＦＰＷＰＲＥ（Lilley CEら，J．Virol，2001年，第75巻，p．4343-4356）のＧＦＰ（green fluorescent protein；緑色蛍光タンパク)遺伝子を、ラットＨＧＦをコードするＤＮＡの全長（ｒａｔＨＧＦ；配列番号５）にＫＴ３タグ（３’−ＣＣＧＣＣＣＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＣＴ−５’ ；配列番号７）を付加したｃＤＮＡ（Sun Ｗら，J．Neurosci，2002年，第22巻，p．6537-6548）で置換し、ｐＲ１９ｒａｔＨＧＦＫＴ３ＷＰＲＥを構築した。このベクター（ｐＲ１９ｒａｔＨＧＦＫＴ３ＷＰＲＥ）のシークエンスは、ＡＢＩ ３１０キャピラリーシークエンサーを使用する分析により確認した。次いで、Ｍ４９細胞を用いて、プラスミドｐＲ１９ｒａｔＨＧＦＫＴ３ＷＰＲＥのＤＮＡと、ＨＳＶ１７６４／−４／ｐＲ１９ＬａｃＺウイルスＤＮＡとのコトランスフェクションにより相同組換えを行なった。白色プラークを選択し、３回精製し、Palmer JAらの方法（J．Virol，2000年，第74巻，p．5604-5618）に従い、複製能力のないウイルスを増殖させた。ラットＨＧＦの発現を、免疫染色によって確認した。該発現を更にウエスタンブロット法及びラットＨＧＦの酵素抗体免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により確認した。本試験に使用するために、タイター（titer）が１〜２×１０9 ｐｆｕ（プラーク・フォーミング・ユニット）／ｍＬであるＨＳＶ１７６４／−４／ｐＲ１９ＨＧＦウイルスベクター（ＨＧＦ発現ベクター；以下、ＨＳＶ−ＨＧＦと略記する）と、タイターが１〜１．５×１０9ｐｆｕ／ｍＬであるＨＳＶ１７６４／−４／ｐＲ１９ＬａｃＺウイルスベクター（ＨＧＦ非発現ベクター；以下、ＨＳＶ−ＬａｃＺと略記する）を調製した。
【００４１】
３．脳内へのＨＳＶ挿入（Ｉｎ ｖｉｖｏ）
４週令のＲ６／２マウスに、ペントバルビタールを５０ｍｇ／ｋｇ静脈注射して深く麻酔した。線条体（−０．４ｍｍ前後，±１．８ｍｍ内外側方向、及び−３．５ｍｍ背腹方向）へ注射するために、該マウスをＫｏｐｆ脳定位固定装置に入れ固定した。５μＬのＨＳＶ−ＬａｃＺ（５×１０6ｐｆｕ）又はＨＳＶ−ＨＧＦ（３×１０5ｐｆｕ）を該マウスに注射した。注射は、マウスの前記線条体に１０μＬのハミルトンシリンジを用いて速度０．３μＬ／ｍｉｎで実施された。以下、ＨＳＶ−ＬａｃＺを注射したマウスをＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウス、ＨＳＶ−ＨＧＦを注射したマウスをＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスという。
【００４２】
４．免疫組織化学的分析
マウスに深く麻酔し、氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を心臓から流入してマウスの全身を灌流し、次いで４％（ｗ／ｗ％、以下同様）パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳで灌流固定した。脳を段階的に１０％及び２０％シュークロースで凍結保護した後、凍結し、その後凍結した脳を、２０μｍの連続切片とした。得られた凍結切片は、ニッスル物質を染色するためクレシル・バイオレットで染色した。
免疫組織化学的染色は、凍結切片を、ＰＢＳで洗浄し、１０％ヤギ又はロバ血清を含むＰＢＳに１時間浸漬し、次いで抗体と共に４℃で一晩インキュベートすることによって行なわれた。
【００４３】
（１）Ｋｉ−６７細胞に対するＨＧＦの作用
脳室下帯（subventricular zone；ＳＶＺ）及び線条体での神経細胞増殖を検討した。増殖細胞のマーカーとしてＫｉ−６７を選択し、Ｋｉ−６７の免疫染色を行い、脳室下帯及び線条体でのＫｉ−６７陽性細胞数を測定した。線条体において、Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスでのＫｉ−６７陽性細胞数は、Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスにおけるそれと比較して有意に増加した。（図１）．
【００４４】
（２）ＢｒｄＵ取り込みに対するＨＧＦの作用
５週令マウスにＢｒｄＵ（４×７５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．，生理食塩液に溶解、２時間毎に合計４回）を投与し、ＢｒｄＵ注射２８日後（９週令）に屠殺した。マウスに麻酔し、心臓からＰＢＳを流入してマウスの全身を灌流し、次いで４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳで灌流固定した。脳を段階的に１０％及び２０％シュークロースで凍結保護した後、凍結し、その後凍結した脳を、２０μｍの連続切片とした。
ＢｒｄＵ免疫組織化学的染色のために、凍結切片は、１Ｎ塩酸で６０℃、３０分インキュベートし、１０％ヤギ血清を含むＰＢＳに１時間浸漬した。その後、凍結切片は、抗ＢｒｄＵ（ラットモノクロナール抗体；Oxford Biotechnology社製；カタログ番号ＯＢＴ００３０）と共に４℃で３６時間インキュベートした。二重染色は蛍光色素アレクサ４８８と蛍光色素アレクサ５４６をコンジュゲートした２次抗体（Molecular Probes社製）で視覚化し、かつ切片はＴｏｐｒｏ−３（Molecular Probes社製）で核を対比染色した。蛍光画像は、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ−５１０共焦点蛍光顕微鏡で検出した。
脳室下帯及び線条体におけるＢｒｄＵ陽性細胞数を測定した結果、脳室下帯において、各群間にＢｒｄＵ陽性細胞数の有意な差は認められなかった。しかし、線条体において、Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスのＢｒｄＵ陽性細胞数は、Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスと比較して有意に増加した（図２）。これらのデータは、ＨＳＶ−ＨＧＦ処置により神経細胞増殖が増強されることを示す。
【００４５】
（３）ネスチンとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞に対するＨＧＦの作用
ネスチン（Nestin）は、神経幹細胞のマーカーである。ネスチンは、抗体としてネスチン抗体［マウスポリクロナール抗体（BD Biosciences製；カタログ番号５５６３０９）を１００倍希釈して使用］を用いて上記免疫組織化学的染色に従って染色した。
ネスチンとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞数を測定した。脳室下帯及び線条体において、Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスにおけるネスチンとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞は、Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスのそれと比較して有意に増加した（図３）。
【００４６】
（４）ダブルコルチンとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞に対するＨＧＦの作用
ダブルコルチン（doublecortin；ＤＣＸ）は遊走神経芽細胞のマーカーである。ＤＣＸは、抗体としてＤＣＸ抗体［ヤギポリクロナール抗体（Santa Cruz Biotechnology社製；カタログ番号ｓｃ−８０６６）を１００倍希釈して使用］を用いて上記免疫組織化学的染色に従って染色した。
ＤＣＸとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞数を測定した。Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスにおけるＤＣＸとＢｒｄＵにおける両者が陽性である細胞は、脳室下帯及び線条体において、Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスのそれと比較して有意に増加した（図４）。
【００４７】
（５）ＰＳＡ−ＮＣＡＭとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞に対するＨＧＦの作用
ＰＳＡ−ＮＣＡＭは、遊走神経芽細胞のマーカーである。ＰＳＡ−ＮＣＡＭは、抗体としてＰＳＡ−ＮＣＡＭ抗体［マウスモノクロナール抗体（AbCys S．A．社製；カタログ番号ＡｂＣ００１９）を８００倍希釈して使用］を用いて上記免疫組織化学的染色に従って染色した。
ＰＳＡ−ＮＣＡＭとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞数を測定した。Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスにおけるＰＳＡ−ＮＣＡＭとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞は、脳室下帯及び線条体においてＲ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスのそれと比較して有意に増加した（図５）。
【００４８】
（６）βIIIチューブリンとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞に対するＨＧＦの作用
βIIIチューブリンは神経細胞の初期〜分化型マーカーである。βIIIチューブリンは、抗体としてβIIIチューブリン抗体［ＴｕＪ１、マウスモノクロナール抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社製；カタログ番号ＭＡＢ１１９５）を２００倍希釈して使用］を用いて上記免疫組織化学的染色に従って染色した。
βIIIチューブリンとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞数を測定した。Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスにおけるβIIIチューブリンとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞は、脳室下帯及び線条体において、Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスのそれと比較して有意に増加した（図６）。
【００４９】
（７）ＮｅｕＮとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞に対するＨＧＦの作用
ＮｅｕＮは分化した神経細胞のマーカーである。ＮｅｕＮは、抗体としてＮｅｕＮ抗体［マウスモノクロナール抗体（Chemicon International社製；カタログ番号ＭＡＢ３７７）を５００倍希釈して使用］を用いて上記免疫組織化学的染色に従って染色した。
ＮｅｕＮとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞数を測定した。Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスにおけるＮｅｕＮｎとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞は、脳室下帯及び線条体において、Ｒ６／２マウス及びＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスのそれと比較して有意に増加した（図７）。
【００５０】
（８）リン酸化ｃ−Ｍｅｔとネスチンの両者が陽性である細胞に対するＨＧＦの作用
神経細胞新生におけるＨＧＦの役割を検討するために、ネスチン陽性細胞において、ＨＧＦがｃ−Ｍｅｔのチロシンリン酸化反応に変化を与えるかどうかを検討した。リン酸化ｃ−Ｍｅｔ及びネスチンは、抗体としてそれぞれリン酸化ｃ−Ｍｅｔ抗体［ウサギポリクロナール抗体（Biosource社製；カタログ番号４４−８８８Ｇ）を１００倍希釈して使用］及びネスチン抗体［マウスポリクロナール抗体（BD Biosciences社製；カタログ番号５５６３０９）を１００倍希釈して使用］を用いて上記免疫組織化学的染色に従って染色した。
Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスでは、ネスチンとリン酸化ｃ−Ｍｅｔの両者が陽性である細胞が、他のグループと比較して有意に増加した（図８）。
【００５１】
（９）リン酸化ｃ−ＭｅｔとＤＣＸの両者が陽性である細胞に対するＨＧＦの作用
神経細胞新生におけるＨＧＦの役割を検討するために、ＤＣＸ陽性細胞において、ＨＧＦがｃ−Ｍｅｔのチロシンリン酸化反応に変化を与えるかどうかを検討した。リン酸化ｃ−Ｍｅｔ及びＤＣＸは、上記と同様に免疫組織化学的染色を行なった。
Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスでは、リン酸化ｃ−ＭｅｔとＤＣＸの両者が陽性である細胞が、他のグループと比較して有意に増加した（図９）。
〔試験例２〕
ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ含有ベクターの脊髄投与による脊髄におけるＨＧＦの発現
１．ベクターの構築、製造及び精製
（１）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ挿入ＨＳＶ−１ベクター
ＨＧＦ遺伝子を挿入したＩ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ベクターとしては、試験例１で作成したＨＳＶ１７６４／−４／ｐＲ１９ＨＧＦウイルスベクターを用いた。該ベクターを以下、ＨＳＶ−ＨＧＦと略記する。
（２）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ挿入ＡＡＶ−２ベクター及びＡＡＶ−４ベクター
ＡＡＶ Helper−Free System（Stratagene，USA；カタログ番号＃２４００７１）キット中に含まれるｐＣＭＶ−ＭＣＳのマルチクローニングサイトにラットＨＧＦ−ＫＴ３［ラットＨＧＦをコードするＤＮＡ（配列番号５）のＣ末端にＫＴ３タグ配列（３’−ＣＣＧＣＣＣＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＣＴ−５’；配列番号７）を付加したもの；Sun，Funakoshiら，J．Neurosci．，2002年，第22巻，p．6537-6548］を挿入した。挿入が正しいことをシークエンスにより確認した。ＮｏｔＩサイトでベクターを２つのフラグメントに開裂し、ラットＨＧＦ−ＫＴ３含む断片をｐＡＡＶ−ＭＣＳを同様にして開列したものと入れ替えることで、ＡＡＶ２−ＨＧＦ作成のためのｐＡＡＶ−ラットＨＧＦ−ＫＴ３を作製した。ＡＡＶ４−ＨＧＦ作成のためにはｐＡＡＶ−ＭＣＳをＡＡＶ４用に改変したものを用いることで同様に処理し、ｐＡＡＶ4−ラットＨＧＦ−ＫＴ３を作製した（Proc．Natl．Acad．Sci．USA，2000年，第97巻，p．3428-3432）。次いで上記キットに含まれるＨＥＫ１９３細胞に、ラットＨＧＦ−ＫＴ３が挿入されたｐＡＡＶ−ＭＣＳをキットの使用説明書に従い導入した。該細胞におけるラットＨＧＦ−ＫＴ３の発現とその活性は、ＥＬＩＳＡ法及びＭＤＣＫ細胞に対する散乱分析法により確認した。得られたベクターをＡＡＶ２−ＨＧＦ及びＡＡＶ４−ＨＧＦと略記する
【００５２】
２．脊髄実質への投与によるＨＧＦの発現
成体雌性ＳＤラットの腰髄部の脊髄実質に、ミニポンプを用いてベクター懸濁液（ＨＳＶ−ＨＧＦ：３×１０7ｐｆｕ、３×１０7ｐｆｕ；ＡＡＶ２−ＨＧＦ：３×１０11ｐｆｕ；又はＡＡＶ４−ＨＧＦ：３×１０11ｐｆｕ）５μＬを定位注射した。その５日後に、動物をペントバルビター深麻酔下に屠殺した。速やかに脊髄を取り出し、脊髄の上部（upper spinal；吻側；Ｕ）、中部（middle spinal；中央部；Ｍ）及び下部（lower spinal；尾側；Ｌ）の３つの領域に分け、それぞれの脊髄断片を、前記の方法でホモゲナイズした。酵素抗体免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法にてＨＧＦ蛋白質量を測定した。ＥＬＩＳＡ法は、抗ＨＧＦポリクロナール抗体（Tokushu Meneki製）を用いてSun Wら、Brain Res Mol Brain Res，2002年，第103巻，ｐ．36-48に記載に従って実施した。
その結果を図１０に示す。ベクターを腰髄部の脊髄実質に注射すると、注射部位だけでなく脊髄の吻側、中央部においてもＨＧＦの発現が認められた。発現の強度は、尾側（腰髄を含む）＞＝中央部＞吻側であった。なお、ＨＳＶ−ＨＧＦでは、濃度依存的にＨＧＦの発現量が増加した。
【００５３】
３．脊髄腔への投与によるＨＧＦの発現
成体雌性ＳＤラットの腰髄部の脊髄腔に、ミニポンプを用いてベクター懸濁液（ＨＳＶ−ＨＧＦ：３×１０7ｐｆｕ、３×１０7ｐｆｕ；ＡＡＶ２−ＨＧＦ：３×１０11ｐｆｕ；又はＡＡＶ４−ＨＧＦ：３×１０11ｐｆｕ）５μＬを定位注射した。その５日後に、上記脊髄実質への投与における方法と同様に、脊髄を取り出し、脊髄の吻側、中部及び尾側のＨＧＦ蛋白質量を上記と同様にＥＬＩＳＡ法にて測定した。
その結果を図１１に示す。ベクターを腰髄部の脊髄腔に注射すると、注射部位だけでなく脊髄の吻側、中央部においてもＨＧＦの発現が認められた。発現の強度は、脊髄実質への注射よりＨＧＦの発現量は低かったが、脊髄のいずれの部位［尾側（腰髄を含む）、中央部、吻側］において、ほぼ同じ程度であった。即ち、脊髄腔への投与では、広範囲な神経細胞へのＨＧＦの供給が可能であった。これは、脊髄実質にベクターを投与した場合に比べ、脊髄液により、ベクターが脊髄全体に拡散されたためであると考えられた。なお、ＨＳＶ−ＨＧＦでは、濃度依存的にＨＧＦの発現量が増加した。
【００５４】
〔試験例３〕
神経幹細胞の分化に対するＨＧＦの効果
（１）神経幹細胞（neurosphere）の培養方法
Ｅ１５ Ｃ５７ＢＬ６マウス胎児からＥ１４線条体をガス麻酔科に取り出し、機械的ピペッティングにより細胞をバラバラにし、NeuroCult Basal Medium（神経細胞培養用基礎培地；Stem cell technologies Inc.製)にNeuroCult Proliferation Supplements（神経細胞増殖用サプリメント；Stem cell technologies Inc.製)を１／１０容量添加した培地に、ＥＧＦ（epidermal growth factor；上皮増殖因子）を２０ｎｇ／ｍＬとなるよう培地（マウス一胎／２０ｍＬ）に添加して浮遊培養し、培養した細胞を初代培養マウスneurosphere（神経幹細胞）とした。
浮遊培養２週間後に、初代培養マウスneurosphereを神経細胞培養用基礎培地にNeuroCult Differentiation medium（神経細胞分化用培地；Stem cell technologies Inc.製）を１／１０添加した培地（ＥＧＦを添加していない培地）２０ｍＬに再懸濁し、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）をコートした培養皿（２４穴プレート；初代培養マウスneurosphereを再懸濁した液１ｍＬ／穴）にて２日培養した。培養は、３７℃、ＣＯ２インキュベータ［５％（Ｖ／Ｖ）ＣＯ２−９５％（Ｖ／Ｖ）空気］を用いて行った。得られた細胞をマウス線条体由来２次neurosphereとした。
【００５５】
（２）免疫染色の方法
上記（１）における細胞を培養した培地を除去し、そこに４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）添加リン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）を添加して室温下、１５分間静置することにより細胞を固定した。その後固定した細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ブロッキング用緩衝液（５％ヤギ血清／ＰＢＳ／０．３％トリトンＸ−１００）を添加してブロッキング（室温１５分）した。ブロッキングした細胞を、ＰＢＳで３回、洗浄後、一次抗体を添加したブロッキング用緩衝液で４℃、１晩インキュベートした。その後ＰＢＳで３回洗浄後、アレクサ４８８でコンジュゲートした抗ウサギＩｇＧ（Invitrogen社製；６００希釈）添加ＰＢＳを加え、室温で２０分間インキュベートした。インキュベート後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＬＳＭ５１０共焦点蛍光顕微鏡（Zeiss社製）で観察した。
なお、下記ｃ−Ｍｅｔ抗体の特異性を確認するため、吸収試験を行なった。吸収試験は、予め過剰量（ｃ−Ｍｅｔ抗体に対しモル比で１００倍量）のｃ−Ｍｅｔ抗体ブロッキングペプチド（ｓｃ１６２Ｐ）（Santa Cruz Biotechnology社製）で処理したｃ−Ｍｅｔ抗体を用いて前記と同様に免疫染色を行なった。吸収試験において染色像が陰性であれば、該抗体による陽性像は、ｃ−Ｍｅｔのみを特異的に検出していることを意味する。
一次抗体としては、以下を使用した。
ネスチン抗体：マウスポリクロナール抗体（BD Biosciences製；カタログ番号５５６３０９）を１００倍希釈して使用した。
ＭＡＰ２抗体：マウスモノクロナール抗体（Sigma社製；カタログ番号Ｍ４４０３）を５００倍希釈して使用した。
ＮｅｕＮ抗体：マウスモノクロナール抗体（Chemicon社製；カタログ番号ＭＡＢ３７７）を５００倍希釈して使用した。
Ａ２Ｂ５：マウスモノクロナール抗体（Chemicon International製；カタログ番号ＭＡＢ３１２Ｒ）を１００倍希釈して使用した。
ｃ−Ｍｅｔ：ＳＰ２６０、ウサギポリクロナール抗体（Santa Cruz Biotechnology社製；カタログ番号ｓｃ−１６２）を５０倍希釈して使用した。
ＧＦＡＰ抗体：マウスモノクロナール抗体（Chemicon International製）を６００倍希釈して使用した。
【００５６】
（３）初代培養マウスneurosphereの分化アッセイ
初代培養マウスneurosphereの分化アッセイを図１２に示した。神経幹細胞は浮遊培養系では球状の塊になって増殖するため、neurosphereと呼ばれる。図１２において、ネスチン（NESTIN）は神経幹細胞のマーカーを示し、ＭＡＰ２は神経細胞のマーカーを示し、ＧＦＡＰはアストロサイトのマーカーを示す。Heochstは、Heochst33342により核が染色されてることを示す。ネスチン像、ＭＡＰ２像又はＧＦＡＰ像と核染色像とを重ね合わせる（図中のMERGE）と、各細胞と核の位置が一致し、初代培養マウスneurosphereは神経細胞とアストロサイトを作出できる能力を保有していることが分かる。
【００５７】
（４）線条体由来２次neurosphereの分化アッセイ
次いで、線条体由来２次neurosphereの分化アッセイにおいて、ｃ−Ｍｅｔと他の細胞マーカー（ネスチン、ＧＦＡＰ、Heochst、Ａ２Ｂ５）との共染色を行なうことで、neurosphereから神経新生過程に於けるまでの様々な分化過程の細胞群におけるＨＧＦの標的細胞を特定した。
その結果を図１３〜１６に示す。ネスチン（Nestin）陽性の神経幹細胞はＨＧＦ受容体であるｃ−Ｍｅｔが陽性であることが確認できる（図１３，１４）。また、アストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰ陽性細胞にｃ−Ｍｅｔが発現していることを確認できる（図１５）。なお、neurosphereから分化して間もないＧＦＡＰ陽性細胞はｃ−Ｍｅｔの発現が非常に弱いことを確認した。また、Ａ２Ｂ５陽性オリゴデンドロサイト前駆細胞にｃ−Ｍｅｔの発現が確認された（図１６）。一方、Ａ２Ｂ５で染色されない細胞群にもｃ−Ｍｅｔ陽性細胞を認めた。加えて吸収試験によりｃ−Ｍｅｔの免疫染色性が消失することから、ｃ−Ｍｅｔの免疫染色におけるｃ−Ｍｅｔ抗体の特異性が確認された。
以上のように、ｃ−Ｍｅｔは神経幹細胞並びに、神経幹細胞から分化したグリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイト）及び神経細胞に発現することが確認された。この結果は、これらｃ−Ｍｅｔが発現した細胞が、ＨＧＦの標的細胞となり得ることを示している。
【００５８】
（５）各種栄養因子存在下におけるneurosphereの神経新生分化アッセイ
本試験の概略を図１７に示した。
マウス胎児由来のneurosphereをＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）存在下で２週間以上浮遊培養した後、分化培地でＥＧＦ非存在下にＰＬＬコートしたプレート上で２日間接着培養した。２日間接着培養後、ＨＧＦ及び／又は栄養因子（ＮＴ−３、ＣＮＴＦ）の添加条件でさらに５日間培養した（以下、ＥＧＦ除去７日後という。）。その後４％ＰＦＡで固定後、免疫染色法により染色した。染色した細胞をＬＳＭ５１０共焦点蛍光顕微鏡（Zeiss社製）で観察し、細胞タイプを同定した。なお、ＨＧＦは、最終濃度が３ｎｇ／ｍＬとなるよう前記培地に添加した。また、ＣＮＴＦは、最終濃度３ｎｇ／ｍＬとなるよう、ＮＴ−３は最終濃度５０ｎｇ／ｍＬとなるよう前記培地に添加した。免疫染色は上記（２）に従い実施した。なお、核は、Ｔｏｐｒｏ３（Molecular Probes社製）を用い、対比染色を行なった。
【００５９】
その結果を図１８〜２９に示す。図１８及び１９は、ＥＧＦ除去７日後のコントロールneurosphereの染色像を示す。コントロール条件下においても多くのneurosphereにおいて、神経新生を認めた。しかし、新生神経細胞数は少なく、神経繊維の長さが短く分岐の少ないことを特徴とした成熟度の低い神経新生を認めた。
【００６０】
図２０及び２１は、ＥＧＦ除去７日後のＣＮＴＦ処理neurosphereの染色像を示す。コントロールと比較して、ＣＮＴＦ添加によりＭＡＰ２陽性神経細胞数が増加することが明らかである。ＣＮＴＦ添加により得られる神経細胞は、神経繊維の分岐が少ないが、神経繊維の長さが非常に長いという特徴を示した。
【００６１】
図２２及び２３は、ＥＧＦ除去７日後のＮＴ−３処理neurosphereの染色像を示す。コントロールに比較してＮＴ−３添加により新生神経細胞の増加を認めた。但しその程度はＣＮＴＦ添加の場合と比較すると若干程度が弱かった。ＮＴ−３添加による新生神経細胞の特徴は、神経繊維長がコントロールに比べて若干長いものの伸張促進効果は著名とはいえなかった。一方、神経突起の分岐に関しては著しい分岐数の増加を認め、コントロールと異なる神経分化（より成熟した神経新生）が惹起されていることが確認された。
【００６２】
図２４及び２５は、ＥＧＦ除去７日後のＨＧＦ処理neurosphereの染色像を示す。コントロールに比較してＨＧＦ添加により新生神経細胞の増加を認めた。その程度は、コントロールはもとよりＮＴ−３添加時に比べても著しく、また、ＣＮＴＦ添加時より強いといえる。ＨＧＦ添加による新生神経細胞の特徴は、神経繊維長がコントロールに比べて若干長いもののＣＮＴＦ添加時に比べると伸張促進効果は程度が弱かった。一方、神経突起の分岐に関しては著しく、ＨＧＦ添加により分岐数の著しい増加を認めた。さらにＨＧＦ添加による新生神経細胞は、ＮＴ−３添加時に比べてより太い神経線維をもつことを特徴としており、コントロール、ＣＮＴＦ又はＮＴ−３添加群とは明らかに異なる神経分化（より成熟した神経新生）が惹起されていることが確認された。
【００６３】
図２６及び２７は、ＥＧＦ除去７日後のＨＧＦ及びＮＴ−３処理neurosphereの染色像を示す。コントロールに比較してＨＧＦとＮＴ−３の同時添加により新生神経細胞数の著名な増加を認めた。新生神経細胞数は、ＮＴ−３単独添加時よりさらに多いことを特徴とした。また、ＨＧＦとＮＴ−３の同時添加においてできた新生神経は神経繊維がコントロールより長く非常に分岐が多い形態的特徴を示した。さらに神経繊維の太さも太く、ＨＧＦとＮＴ−３の同時添加では新生神経はコントロール、ＣＮＴＦ、ＮＴ−３、ＨＧＦ単独添加群に比べて異なる形態、すなわちより成熟した形態を示した。
【００６４】
図２８及び２９は、ＥＧＦ除去７日後のＨＧＦ及びＣＮＴＦ処理neurosphereの染色像を示す。コントロールに比較してＨＧＦとＣＮＴＦ同時添加により新生神経細胞数の著名な増加を認めた。新生神経細胞数は、ＣＮＴＦ単独添加時よりさらに多いことを特徴とした。新生神経は神経繊維がコントロールより非常に長くさらに分岐も非常に多い形態的特徴を示した。さらにＨＧＦとＣＮＴＦ同時添加では新生神経繊維の太さも太い等の特徴を示していた。以上からコントロール、ＣＮＴＦ及びＮＴ−３単独添加群に比べて異なる形態を示しており、ＨＧＦとＣＮＴＦ同時添加により、より成熟した多数の神経新生の形成が起こることが確認された。
【００６５】
（６）ＨＧＦの有無によるneurosphere形成能の比較
Neurosphere形成をこれまで知られるＥＧＦの代わりにＨＧＦを用いた場合、ＥＧＦ添加時と同様にneurosphereを形成できるか（神経新生のもととなる神経幹細胞の増加を認めるか否か）を検討した。前記試験例３の［１）神経幹細胞（neurosphere）の培養方法の項において、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）の代わりにＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加して初代培養マウスneurosphereを調製した。なお、コントロールは、マウス胎児由来のneurosphereをＥＧＦ又はＨＧＦ無添加で同様に浮遊培養した。
その結果を図３０に示した。ＨＧＦによりＥＧＦを添加しなくてもコントロールに比較してneurosphere形成数の増加をみることはもとより、neurosphereの大きさの著名な増大傾向を求めた。このことから、ＨＧＦが神経幹細胞群の分裂及び／又は生存の著著名な促進効果があることがわかった。
【００６６】
〔統計的分析〕
データは平均値±標準偏差（ＳＤ）で示し、統計学的有意差の検定は、フィッシャーの最小有意差法（ＰＬＳＤ）を用いる分散分析で評価した。
各グループのデータは、解析ソフトＳｔａｔｖｉｅｗ ５．０（SAS Institute，Inc.製）で分析した。ｐ＜０．０５の確率値の違いを統計的有意差ありとした。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の神経新生促進剤は、神経変性又は神経細胞死を伴う神経疾患や神経障害における神経再生や神経修復ための薬剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウス及び野生型同腹子の線条体におけるＫｉ−６７陽性細胞の免疫染色像を示す図である。図中、Ｓｔｒは線条体を、ＬＶは脳室を、ＳＶＺは脳室下帯を示す。
【図２】図２は、マウス脳室下帯及び線条体におけるＢｒｄＵ陽性細胞数を示す図である。図中、Ａは野生型同腹子を、ＢはＲ６／２マウスを、ＣはＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスを、ＤはＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスを示す。＊は野生型同腹子に対する有意差（ｐ＜０．０５）を、＊＊はＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図３】図３は、マウス脳室下帯及び線条体におけるネスチンとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞の数を示す図である。図中、Ａは野生型同腹子を、ＢはＲ６／２マウスを、ＣはＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスを、ＤはＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスを示す。＊＊はＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図４】図４は、マウス脳室下帯及び線条体におけるＤＣＸとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞の数を示す図である。図中、Ａは野生型同腹子を、ＢはＲ６／２マウスを、ＣはＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスを、ＤはＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスを示す。＊＊Ｒ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図５】図５は、マウス脳室下帯及び線条体におけるＰＳＡ−ＮＣＡＭとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞の数を示す図である。図中、Ａは野生型同腹子を、ＢはＲ６／２マウスを、ＣはＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスを、ＤはＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスを示す。＊は野生型同腹子に対する有意差（ｐ＜０．０５）を、＊＊はＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図６】図６は、マウス脳室下帯及び線条体におけるβIIIチューブリンとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞の数を示す図である。図中、Ａは野生型同腹子を、ＢはＲ６／２マウスを、ＣはＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスを、ＤはＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスを示す。＊＊はＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図７】図７は、マウス脳室下帯及び線条体におけるＮｅｕＮとＢｒｄＵの両者が陽性である細胞の数を示す図である。図中、Ａは野生型同腹子を、ＢはＲ６／２マウスを、ＣはＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスを、ＤはＲ６／２（ＨＳＶ−ＨＧＦ）マウスを示す。＊＊はＲ６／２（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）マウスに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図８】図８は、マウス線条体におけるネスチンとリン酸化ｃ−Ｍｅｔの両者が陽性である細胞の免疫染色像を示す図である。
【図９】図９は、マウス線条体におけるＤＣＸとリン酸化ｃ−Ｍｅｔの両者が陽性である細胞の免疫染色像を示す図である。
【図１０】図１０は、ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡを挿入したＨＳＶ−ＨＧＦ、ＡＡＶ２−ＨＧＦ及びＡＡＶ４−ＨＧＦの３種のベクターをラット腰髄の脊髄実質に注射し、５日後の脊髄におけるＨＧＦの発現量を示す図である。図中、Ｕは脊髄の吻側を、Ｍは中央部を、Ｌは尾側を示す。＊はコントロールに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図１１】図１１は、ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡを挿入したＨＳＶ−ＨＧＦ、ＡＡＶ２−ＨＧＦ及びＡＡＶ４−ＨＧＦの３種のベクターをラット腰髄の脊髄腔に注射し、５日後の脊髄におけるＨＧＦの発現量を示す図である。図中、Ｕは脊髄の吻側を、Ｍは中央部を、Ｌは尾側を示す。＊はコントロールに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図１２】図１２は、初代培養マウスneurosphereの分化アッセイにおけるネスチン、ＭＡＰ２，ＧＦＡＰ及び核（Hoechst）の免疫染色像を示す図である。Merge：免疫染色像を重ねた図；上段：ネスチンと核；中段：ＭＡＰ２と核；下段：ＧＦＡＰと核。
【図１３】図１３は、マウス線条体由来２次neurosphereの分化アッセイにおけるネスチン、ｃ−Ｍｅｔ及び核（Hoechst）の免疫染色像を示す図である。Merge：ネスチン、ｃ−Ｍｅｔ及び核の免疫染色像を重ねた図。
【図１４】図１４は、マウス線条体由来２次neurosphereの分化アッセイにおけるネスチン、ｃ−Ｍｅｔ及び核（Hoechst）の免疫染色像を示す図である。Merge：ネスチン、ｃ−Ｍｅｔ及び核の免疫染色像を重ねた図。
【図１５】図１５は、マウス線条体由来２次neurosphereの分化アッセイにおけるＧＦＡＰ、ｃ−Ｍｅｔ及び核（Hoechst）の免疫染色像を示す図である。Merge：ＧＦＡＰ、ｃ−Ｍｅｔ及び核の免疫染色像を重ねた図。
【図１６】図１６は、マウス線条体由来２次neurosphereの分化アッセイ（４日後）におけるオリゴデンドロサイト前駆細胞（Ａ２Ｂ５）、ｃ−Ｍｅｔ及び核（Hoechst）の免疫染色像を示す図である。c-Met-Absorption：吸収試験後のｃ−Ｍｅｔの染色像；Merge：Ａ２Ｂ５、ｃ−Ｍｅｔ及び核の免疫染色像を重ねた図。
【図１７】図１７は、各種栄養因子存在下におけるneurosphereの神経新生分化アッセイのプロトコルを示す概略図である。
【図１８】図１８は、ＥＧＦ除去７日後のコントロールneurosphereのＭＡＰ２の免疫染色像を示す典型例の拡大図である。
【図１９】図１９は、ＥＧＦ除去７日後のコントロールneurosphereのＭＡＰ２及び核（Ｔｏｐｒｏ３）の免疫染色像を示す図である。
【図２０】図２０は、ＥＧＦ除去７日後のＣＮＴＦ処理neurosphereのＭＡＰ２の免疫染色像を示す典型例の拡大図である。
【図２１】図２１は、ＥＧＦ除去７日後のＣＮＴＦ処理neurosphereのＭＡＰ２及び核（Ｔｏｐｒｏ３）の免疫染色像を示す図である。
【図２２】図２２は、ＥＧＦ除去７日後のＮＴ−３処理neurosphereのＭＡＰ２の免疫染色像を示す典型例の拡大図である。
【図２３】図２３は、ＥＧＦ除去７日後のＮＴ−３処理neurosphereのＭＡＰ２及び核（Ｔｏｐｒｏ３）の免疫染色像を示す図である。
【図２４】図２４は、ＥＧＦ除去７日後のＨＧＦ処理neurosphereのＭＡＰ２の免疫染色像を示す典型例の拡大図である。
【図２５】図２５は、ＥＧＦ除去７日後のＨＧＦ処理neurosphereのＭＡＰ２及び核（Ｔｏｐｒｏ３）の免疫染色像を示す図である。
【図２６】図２６は、ＥＧＦ除去７日後のＨＧＦ及びＮＴ−３処理neurosphereのＭＡＰ２の免疫染色像を示す典型例の拡大図である。図中Ａは、高度な分化を示し、Ｂは増加した数を示す。
【図２７】図２７は、ＥＧＦ除去７日後のＨＧＦ及びＮＴ−３処理neurosphereのＭＡＰ２及び核（Ｔｏｐｒｏ３）の免疫染色像を示す図である。
【図２８】図２８は、ＥＧＦ除去７日後のＨＧＦ及びＣＮＴＦ処理neurosphereのＭＡＰ２の免疫染色像を示す典型例の拡大図である。
【図２９】図２９は、ＥＧＦ除去７日後のＨＧＦ及びＣＮＴＦ処理neurosphereのＭＡＰ２及び核（Ｔｏｐｒｏ３）の免疫染色像を示す図である。
【図３０】図３０は、ＨＧＦの有無によるneurosphere形成能の比較を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として含有することを特徴とする神経新生促進剤。
【請求項２】
有効成分が、（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡであることを特徴とする請求項１記載の神経新生促進剤。
【請求項３】
ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡが、（ａ）配列番号１、２又は５で表される塩基配列からなるＤＮＡ又は（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡであることを特徴とする請求項２記載の神経新生促進剤。
【請求項４】
ＤＮＡが、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ベクター、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターに組み込まれていることを特徴とする請求項２又は３記載の神経新生促進剤。
【請求項５】
有効成分が、（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩であることを特徴とする請求項１記載の神経新生促進剤。
【請求項６】
ＨＧＦ蛋白質が、（ａ）配列番号３、４又は６で表されるアミノ酸配列と同一又は（ｂ）前記アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質であることを特徴とする請求項５記載の神経新生促進剤。
【請求項７】
神経新生促進剤が、局所投与用であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の神経新生促進剤。
【請求項８】
局所投与が、髄腔内投与であることを特徴とする請求項７記載の神経新生促進剤。
【請求項９】
神経栄養因子と組み合わせて使用されることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の神経新生促進剤。
【請求項１０】
神経栄養因子が、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＣＮＴＦ、ＧＤＮＦ及びＢＤＮＦから選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項９記載の神経新生促進剤。
【請求項１】
（１）（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として含有することを特徴とする神経新生促進剤。
【請求項２】
有効成分が、（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡであることを特徴とする請求項１記載の神経新生促進剤。
【請求項３】
ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡが、（ａ）配列番号１、２又は５で表される塩基配列からなるＤＮＡ又は（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡであることを特徴とする請求項２記載の神経新生促進剤。
【請求項４】
ＤＮＡが、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ベクター、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターに組み込まれていることを特徴とする請求項２又は３記載の神経新生促進剤。
【請求項５】
有効成分が、（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩であることを特徴とする請求項１記載の神経新生促進剤。
【請求項６】
ＨＧＦ蛋白質が、（ａ）配列番号３、４又は６で表されるアミノ酸配列と同一又は（ｂ）前記アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質であることを特徴とする請求項５記載の神経新生促進剤。
【請求項７】
神経新生促進剤が、局所投与用であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の神経新生促進剤。
【請求項８】
局所投与が、髄腔内投与であることを特徴とする請求項７記載の神経新生促進剤。
【請求項９】
神経栄養因子と組み合わせて使用されることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の神経新生促進剤。
【請求項１０】
神経栄養因子が、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＣＮＴＦ、ＧＤＮＦ及びＢＤＮＦから選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項９記載の神経新生促進剤。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１０】
【図１１】
【図１７】
【図１】
【図８】
【図９】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１０】
【図１１】
【図１７】
【図１】
【図８】
【図９】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【公開番号】特開２００７−２８４４１０（Ｐ２００７−２８４４１０Ａ）
【公開日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１１６５９４（Ｐ２００６−１１６５９４）
【出願日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【出願人】（５０２０６８９０８）クリングルファーマ株式会社 (16)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【出願人】（５０２０６８９０８）クリングルファーマ株式会社 (16)
【Ｆターム（参考）】
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