糖尿病の微小血管合併症における治療上の標的としてのＧＭ３合成酵素
本発明は、糖尿病の微小血管合併症の処置のためのＧＭ３合成酵素遺伝子の発現または活性の阻害薬の使用に関し、これらの合併症の処置および／または予防に有用な化合物をスクリーニングする方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病の微小血管合併症を処置するためのＧＭ３合成酵素阻害剤の使用、およびこの酵素の阻害剤をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微小血管障害は、微小血管の構造上および機能上の変化を特徴とする、糖尿病の慢性合併症である。網膜および腎臓は、病理学的状態の２つの主な標的であり、糖尿病性網膜症および糖尿病性腎症をもたらす。
【０００３】
糖尿病性網膜症は、先進国において失明を引き起こす２番目の原因である。殆ど全ての１型糖尿病患者、および６０％を超える２型糖尿病患者が、罹患後約２０年で、この微小血管合併症を発症する（Ｆｏｎｇら、２００３年）。毛細血管は、基底膜の肥厚、および周皮細胞の特異的な損失などの進行性の構造上の変化を受け、それに続いて内皮細胞における増殖および機能が変更を受ける。これらの変化は、虚血と結びつき、微小血管壁を損傷し、過剰の毛細血管透過性を促進し、浮腫、微細動脈瘤、および視力を脅かす出血をもたらす（Ｆｏｒｅｓｔｅｒら、１９９７年）。
【０００４】
腎症には、糖尿病の病歴が２０から３０年の患者の５０から６０％が罹患する。腎症は、これらの患者の死亡率の主要な原因であると考えられている（Ｋｒｏｌｅｗｓｋｉら、１９９７年）。病理学的状態の主な特徴の１つには、糸球体の腫大があるが、これは増殖が停止したメサンギウム細胞の増生により、また細胞外マトリックスのタンパク質の蓄積により基底膜が肥厚しメサンギウムが拡大した結果である。これらの事象は、血行動態の欠失と結びついて、糸球体硬化、糸球体ろ過、または糸球体ろ過のレベルの変化、およびミクロアルブミン尿症を引き起こし、重症の腎不全をもたらす（Ｗｏｌｆら、２０００年）。
【０００５】
糖尿病の対象が腎症を発症する危険性は、一般的に、ミクロアルブミン尿症を調べることにより評価される。糖尿病性腎症の出現および／または進行を遅らせるために現在用いられている予防上のまたは治療上の手段には、糖血症のモニタリング、血圧降下薬、特にアンジオテンシン転換酵素阻害剤の投与、低タンパク質食の採用、またはスタチンなどの脂質低下薬の投与が含まれる（Ｒｉｐｐｉｎら、２００４年）。
【０００６】
公衆衛生および経済に関するこれらの影響を考慮すると、糖尿病の微小血管合併症を予防し、治療する新規な方法を同定することが、主な治療上の難題を構成している。
【０００７】
糖尿病性網膜症および糖尿病性腎症の病因の細胞上および分子上の基盤は完全に理解されていないが、細胞の増殖の調節、ならびに細胞−細胞間および細胞−マトリックス間の相互作用が重要な役割を果たしているようである。糖尿病の微小血管合併症の発症、特に糖化最終産物（ＡＧＥ）の形成に関わる機序を説明するために数々の生化学上の仮説が提唱されている（Ｓｉｎｇｈら、２００１年）。
【０００８】
グルコースなどの糖が減少すると、Ｓｃｉｆｆ塩基およびＡｍａｄｏｒｉ生成物を形成する一連の反応によりタンパク質のアミノ基、脂質、および核酸と非酵素的に反応し、最終的にＡＧＥを生成する。糖化は、グルコース濃度に依存し、糖尿病で増加する。これは、細胞外マトリックスのタンパク質または循環タンパク質などの、血中グルコースに曝露されている長寿命のタンパク質に優先的に起こり、それによってこれらの構造およびこれらの機能を変更する。
【０００９】
さらに、ＡＧＥは、膜の受容体に結合して、酸化ストレスの生成による細胞の反応（Ｌａｌら、２００２年；Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９４年）、核因子κＢの活性化（Ｓｉｎｇｈら、２００１年；Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９４年）、および炎症誘発性サイトカインまたは接着分子などの様々な遺伝子の発現（Ｈｏｆｍａｎｎら、１９９９年；Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９５年）を引き起こすことができる。
【００１０】
これらの変更は全て、糖尿病の微小血管合併症に見られる多くの変化、特に、血管透過性の上昇、細胞外マトリックスの生成および硬性の増大、および細胞−マトリックス間相互作用および細胞の増殖の変化を説明することができる重要な生物学的効果を有する（Ｓｔｉｔｔら、２００３年）。実際、多くのｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの研究では、ＡＧＥが、糖尿病に付随する網膜症および腎症の発症に関与していることが示唆されている（Ｓｔｉｔｔら、２００３年；Ｗａｕｔｉｅｒら、２００１年）。
【００１１】
ガングリオシドは、原形質膜のマイクロドメインに集中しており、その構造にシアル酸が存在することを特徴とするスフィンゴ糖脂質である。ラクトシルセラミドを継続的にシアル化するとモノシアロガングリオシド（ＧＭ３）、ジシアロガングリオシド（ＧＤ３）、およびトリシアロガングリオシド（ＧＴ３）を生成する。これらのガングリオシドは、次いで、グリコシルトランスフェラーゼおよびシアルトランスフェラーゼが連続して作用することにより、より複雑なガングリオシドに転換され、それぞれａ、ｂおよびｃシリーズを形成する（Ｖａｎ Ｅｃｈｔｅｎら、１９９３年）。ガングリオシドは、インテグリンもしくはマトリックスタンパク質（コラーゲンおよびフィブロネクチン）などの接着レセプターと、または他のスフィンゴ糖脂質と相互作用することにより、細胞−細胞間および細胞−マトリックス間認識で主要な役割を果たすことが知られている。また、ガングリオシド、特にａシリーズのものは、様々な増殖因子の活性を調整することにより、細胞増殖の調整に関与している（Ｈａｋｏｍｏｒｉら、１９９０年）。
【００１２】
ＡＧＥは、網膜微小血管の周皮細胞および内皮細胞におけるスフィンゴ糖脂質の代謝の変更を引き起こすことが報告されている（Ｎａｔａｌｉｚｉｏら、２００１年）。これらの変化には、特に、ＧＭ３合成酵素の活性の上昇が伴う（Ａ．Ｄａｌｅｍｅ−Ｎａｔａｌｉｚｉｏ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｐｐｌｉｑｕｅｅｓ ｄｅ Ｌｙｏｎにおける博士論文、２００２年２月８日）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明者らは、現在、ＤＲおよびＤＮの病理学的状態をもたらすＡＧＥが媒介する効果にガングリオシドが関与することを示している。したがって、本発明者らは、それぞれ糖尿病性網膜症および糖尿病性腎症に関与する２つの細胞型である網膜周皮細胞および腎臓メサンギウム細胞の増殖をＡＧＥにより阻害することは、ＧＭ３合成酵素の活性の上昇およびシリーズａのガングリオシドの蓄積に少なくとも部分的に基づくことを実証している。ＧＭ３合成酵素の活性の上昇は、さらに、ＡＧＥが与えられている糖尿病マウスモデルに観察されている。これらの結果により、糖尿病の微小血管合併症を処置するための標的として、ＧＭ３合成酵素およびシリーズａのガングリオシドが同定されている。
【００１４】
定義
「糖尿病の微小血管合併症」は、微小血管の構造上のおよび機能上の変化を特徴とする、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病の慢性合併症を意味する。これらの合併症は、主に、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、および糖尿病性神経障害を含む。末梢神経障害は身体の四肢の神経を冒し、脚の感覚の喪失は最も蔓延している形態の１つである。不快感および疼痛（錯感覚および知覚過敏）も非常に一般的な衰弱性の症状である。この神経障害は、切断を必要とすることがある、脚の潰瘍および重症の組織損傷を引き起こすことがある。
【００１５】
本特許出願の枠組み内で、「ＧＭ３合成酵素」は、シアル酸ドナーからシアル酸アクセプターのガラクトース残基の３−ヒドロキシル基にシアル酸残基を転移することを触媒する、酵素ラクトシルセラミドα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．９）を意味する。好ましくは、シアル酸ドナーはＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸であり、シアル酸アクセプターはラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）などの糖脂質のガラクトース残基である。触媒される反応は、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸＋β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−β−Ｄ−グルコシルセラミド＝Ｃｍｐ＋α−Ｎ−アセチルノイラミニル−２，３−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−β−Ｄ−グルコシルセラミドであってもよい。好ましくは、本発明のＧＭ３合成酵素は、ヒトのＧＭ３合成酵素であり、またはげっ歯動物（例えば、ラットもしくはマウス）、ネコ科動物、イヌ科動物、霊長類（サル）などの非ヒトの哺乳動物のＧＭ３合成酵素である。例えば、ヒトおよびネズミ科動物のＧＭ３合成酵素をコードする遺伝子は、それぞれ、ＧｅｎｂａｎｋデータベースにＮＭ＿００３８９６（配列ＩＤ番号１）およびＮＭ＿０１１３７５（配列ＩＤ番号３）のアクセション番号で寄託されている。対応するアミノ酸配列は、それぞれ配列ＩＤ番号２および配列ＩＤ番号４に記載されている。
【００１６】
本特許出願の枠組み内で、「ＧＭ３合成酵素阻害剤」は、（ｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでＧＭ３合成酵素の活性および／または発現を阻害し、かつ／または（ｉｉ）シアル酸ドナーからのシアル酸アクセプターのガラクトース残基の３−ヒドロキシル基へのシアル酸残基の転移を、特にガングリオシドのＧＭ３の形成を阻止し、かつ／または（ｉｉｉ）ガングリオシドのＧＭ３の細胞内合成を阻止する化合物を意味する。阻害または阻止は、部分的でも全体的でもよい。
【００１７】
「ガングリオシド」は、１つまたは複数のシアル酸残基を含むスフィンゴ糖脂質を意味するものと理解される。より詳しくは「シリーズａのガングリオシド」は、ラクトシルセラミドのガラクトース上にシアル酸残基を１つだけ有するガングリオシドを意味する。シリーズａのガングリオシドには、化合物ＧＭ３（α−Ｎ−アセチルノイラミニル−２，３−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−β−Ｄ−グルコシルセラミド）、ＧＭ２、ＧＭ１、ＧＤ１ａ、およびＧＴ１ａが含まれる（図２を参照されたい）。
【００１８】
治療上の適用
本発明者らは、糖尿病の微小血管合併症の発症に関与する糖化最終産物（ＡＧＥ）は、ＧＭ３合成酵素の酵素活性を上昇させることによりその効果を媒介することを実証している。
【００１９】
したがって、本発明は、ＧＭ３合成酵素遺伝子の発現または活性の阻害剤を患者に投与する、糖尿病の微小血管合併症を処置する方法を提唱するものである。
【００２０】
本発明は、糖尿病の微小血管合併症を処置することを目的とする薬物を製造するための、ＧＭ３合成酵素遺伝子の発現または活性の阻害剤の使用にさらに関する。
【００２１】
好ましくは、糖尿病の微小血管合併症は、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、および糖尿病性神経障害を含む群から選択される。糖尿病の微小血管合併症が糖尿病性腎症であることが特に好ましい。
【００２２】
本発明の枠組み内で、「処置」は、疾患の予防的処置または治癒的処置、すなわち、疾患の、またはこの疾患に付随する１つもしくは複数の症状の進行を逆行させ、遅くし、または阻害する行為、または発症を予防する行為を意味する。
【００２３】
「患者」は、糖尿病の微小血管合併症に罹患し、または罹患しやすいヒト、またはマウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、もしくはサルなどの非ヒトの哺乳動物を意味する。好ましくは、本発明に関する患者は、糖尿病が検出されている対象である。
【００２４】
好ましくは、阻害剤は、ＧＭ３合成酵素遺伝子の発現または活性の特異的阻害剤、すなわちＧＭ３合成酵素以外の遺伝子またはタンパク質に対する効果が実質的にない阻害剤である。
【００２５】
第一の実施形態では、本発明の方法または使用は、ＧＭ３合成酵素遺伝子および／またはタンパク質の発現の阻害剤に採用する。このような阻害剤は、遺伝子の転写および／または転写物メッセンジャー（ｍＲＮＡ）の翻訳を阻害し、または抑制することができる。当業者であれば、この目的に最も適する戦略を選択することができる。
【００２６】
アンチセンス戦略を用いて、ＧＭ３合成酵素の発現を阻害することができる。この取組みは、例えば、ｍＲＮＡをアンチセンス核酸でマスキングすることにより、またはリボザイムでｍＲＮＡを切断することにより、特定のｍＲＮＡの転写を阻止するアンチセンス核酸またはリボザイムを利用することができる。本発明の文脈では、「アンチセンス」は、ＲＮＡ−ＲＮＡ間相互作用、ＲＮＡ−ＤＮＡ間相互作用、リボザイム、干渉ＲＮＡ、アプタマー、およびＲＮＡｓｅＨにより媒介される阻害を広く含む。アンチセンス治療法は、一般的に、ウィルスのベクターなど、アンチセンス配列を有するベクターを使用し、その後、ベクターはゲノムに統合されるので阻害は概ね安定している。発現の一時的な阻害をもたらすアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用も可能である。アンチセンス技術の一般的なプレゼンテーションは、「アンチセンスＤＮＡおよびＲＮＡ（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ）」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｄ．Ｍｅｌｔｏｎ編集、１９８８年）に見られる。
【００２７】
好ましくは、ＧＭ３合成酵素遺伝子および／またはタンパク質の発現の阻害剤は、したがって、アンチセンス核酸、リボザイム、干渉ＲＮＡ、およびアプタマーを含む群から選択される。
【００２８】
「アンチセンス核酸」または「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ分子と細胞質の条件下でハイブリダイズする場合、後者の機能を阻害する一本鎖核酸分子である。アンチセンス核酸は、組み替え遺伝子にコードして細胞で発現することができ（例えば、米国特許第５８１４５００号、および第５８１１２３４号）、または合成により調製することができる（例えば、米国特許第５７８０６０７号）。ＧＭ３合成酵素のアンチセンス核酸は、ＧＭ３合成酵素をコードする相同の配列と特異的にハイブリダイズするように、例えば、配列ＩＤ番号１に示すヒトＧＭ３合成酵素の配列、または配列ＩＤ番号３に示すネズミ科動物ＧＭ３合成酵素の配列と特異的にハイブリダイズするようにデザインすることができる。
【００２９】
「核酸の配列と特異的にハイブリダイズすることができる配列」は、参照の核酸配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を意味する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）。ストリンジェントな条件を規定するパラメーターは、一致する鎖の５０％が分離する温度（Ｔｍ）に、およびイオン強度に依存する。３０を超えた塩基を含む配列では、Ｔｍは以下の等式により規定される：Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）＋１６．６ｌｏｇ（陽イオン濃度）−０．６３（ホルムアミドの％）−（６００／塩基数）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）。３０未満の塩基の配列では、Ｔｍは以下の等式により規定される：Ｔｍ＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）。非特異的な配列がハイブリダイズしない、適度にストリンジェントな条件下では、ハイブリダイゼーション温度は、好ましくはＴｍを５から１０℃下回ることができ、用いるハイブリダイゼーション緩衝剤は、６×ＳＳＣ溶液など、イオン強度の高い溶液であることが好ましい。例えば、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は、Ｔｍに、また５０％ホルムアミドおよび５×または６×ＳＣＣを含む溶液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）で得られるようなイオン条件に対応する。
【００３０】
本発明のアンチセンス核酸を、例えば、ヒトまたは動物に注射した後に、保護作用を引き起こすために、または糖尿病の微小血管合併症を処置するために用いることができる。特に、国際特許出願第ＷＯ９０／１１０９２号パンフレットに記載されている技術により、これらを裸のＤＮＡの形態で注射することができる。これらは、例えば、デキストラン−ＤＥＡＥ（Ｐａｇａｎｏら、１９６７年）、核タンパク質（Ｋａｎｅｄａら、１９８９年）、もしくは脂質（Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９８７年）との複合体の形態で、リポソームの形態で（Ｆｒａｌｅｙら、１９８０年）、または他の同様の方法により投与することもできる。
【００３１】
核酸配列がベクターの部分を形成することが好ましい。ベクターの使用により、核酸の処理すべき細胞への投与を改善するのが可能になり、また、これらの細胞における安定性を改善し、治療効果を延長することができる。
【００３２】
「ベクター」は、それを通して宿主細胞を形質転換し、導入されている配列の発現を得る（すなわち、転写および翻訳）ためにＤＮＡまたはＲＮＡの配列を宿主細胞中に導入することができる媒体を意味する。ベクターには、プラスミド、ファージ、ウィルスなどが含まれる。
【００３３】
「リボザイム」は、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼにかなり類似した方法で他の一本鎖ＲＮＡ分子を特異的に切断することができるＲＮＡ分子である。リボザイムは、ある種のｍＲＮＡがそれ自体のイントロンを切断できることを実証することにより発見された。これらのリボザイムのヌクレオチド配列を変更することにより、ＲＮＡ分子における特異的なヌクレオチド配列を認識し、それらを切断する分子を生成することが可能である（Ｃｅｃｈ、１９８９年）。この特異性のために、特定の配列を有するｍＲＮＡだけが不活化される。
【００３４】
ＧＭ３合成酵素の転写を可逆的に阻害することは、干渉ＲＮＡを用いて実現することもできる。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の技術は、「低分子干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）などの低分子ＲＮＡ分子を用いることにより、遺伝子の発現を妨げる。この技術は、ＲＮＡ干渉が植物から昆虫および哺乳動物まで多くの生存する生物体の大多数の細胞における遺伝子の消滅の自然な生物学的機序である、という事実から利益を得ている（Ｓｈａｒｐ、２００１年）。ＲＮＡ干渉は、中間体ｍＲＮＡの破壊をもたらすことにより、遺伝子からの機能上のタンパク質の生成を防ぐ（Ｂａｓｓ、２０００年；Ｓｈａｒｐ、２００１年）。ｓｉＲＮＡは、裸の形態で、またはベクター中に組み込んで用いることができる。ＧＭ３合成酵素の転写を阻止する干渉ＲＮＡが、配列ＧＧＧＵＵＡＵＵＣＵＧＡＡＣＡＵＧＵＵｔｔ（配列ＩＤ番号５）を有することができることが好ましい。
【００３５】
アプタマーも、ＧＭ３合成酵素の転写を阻害するのに用いることができる。アプタマーは、実質的にあらゆるクラスの標的分子を、高い親和性および特異性で認識することができるオリゴヌクレオチド配列である。このようなリガンドは、ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（１９９０）に記載された、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）と呼ばれるスクリーニング方法により、ランダム配列ライブラリーから分離することができる。ランダム配列ライブラリーは、コンビナトリアル化学を用いてＤＮＡ合成により得ることができる。このようなライブラリーでは、各メンバーは、独特な配列に対応している直鎖状オリゴマー（場合により化学的に修飾されている）である。このクラスの分子の、可能な変更、適用、および利点については、Ｊａｙａｓｅｎａ（１９９９）により再考されている。
【００３６】
別の一実施形態では、本発明の方法または使用は、ＧＭ３合成酵素タンパク質の活性の阻害剤の使用に関する。ＧＭ３合成酵素活性の阻害剤は、本特許出願に記載するように、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞のまたは生化学的な試験を含むスクリーニング方法により容易に同定することができる。阻害剤は、ペプチドの性質のもの、ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）、または非ペプチド模倣物（Ｒｕｂｉｎ−Ｃａｒｒｅｚ、２０００年）とすることができ、例えば、ドナーからシアル酸アクセプターへのシアル酸基の転移を阻止しもしくは減少させ、および／またはＧＭ３合成酵素を阻止しもしくは減少させることにより、ＧＭ３合成酵素の酵素活性に干渉することができる小型の有機分子などである。
【００３７】
ＧＭ３合成酵素の阻害剤は、抗体、特に、配列ＩＤ番号２に示すヒトＧＭ３合成酵素、または配列ＩＤ番号４に示すネズミ科動物のＧＭ３合成酵素に対する阻害剤であることもできる。前記の抗体は、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、またはそれらのフラグメント、あるいはキメラの抗体、特にヒト化され、または免疫複合したものであることができる。
【００３８】
ポリクローナル抗体は、タンパク質に対して免疫化した動物の血清から慣例の手順によって得ることができる。例えば、用いる抗原は、タンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、ＫＬＨ）または別のペプチドに反応性の残基により結合しているＧＭ３合成酵素の複合体など、適切なペプチド複合体であることができる。Ｂｅｎｏｉｔら（１９８２年）が記載した手順にしたがって、ウサギを、１ｍｇのペプチドの抗原の等量で免疫化する。４週間の間隔で、動物に抗原２００μｇの注射で処置し、１０から１４日後に採血する。第３回目の注射後、クロラミン−Ｔ法により調製した、ヨウ素で放射標識したペプチド抗原に結合する能力を判定するために、抗血清を試験し、次いでカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）イオン交換カラム上のクロマトグラフィーにより精製する。次いで、抗体分子を哺乳動物から回収し、例えばＩｇＧ分画を得るためのＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘを用いるなど、当業者にはよく知られている方法により、望ましい濃度に分離する。ポリクローナル血清の特異性を上げるために、抗体を、固相に免疫ポリペプチドを用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。固相に免疫学的複合体を形成させるために、ポリペプチドが抗体分子と免疫反応を行うことをもたらすのに十分な時間、抗体を固相の免疫ポリペプチドと接触させる。
【００３９】
モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）が記載した、従来のリンパ球融解法およびハイブリドーマ培養法により得ることができる。モノクローナル抗体を調製する他の方法も知られている（Ｈａｒｌｏｗら、１９８８年）。モノクローナル抗体は、哺乳動物（例えば、マウス、ラットもしくはウサギ、またはヒトなども）を免疫化することにより、またハイブリドーマを生成するためのリンパ球融解法を用いて調製することができる（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５年）。この慣例の技術には代替が存在する。例えば、ハイブリドーマからクローンした核酸を発現することにより、モノクローナル抗体を生成することが可能である。抗体は、抗体のｃＤＮＡをベクター中に導入することにより、ファージディスプレイ技術により生成することもでき、後者は、通常、ファージの表面上にＶ遺伝子ライブラリーを有する糸状のファージである（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対するｆＵＳＥ５、ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、１９９０年）。これらの抗体ライブラリーを構築するためのプロトコールは、Ｍａｒｋｓら（１９９１年）に記載されている。
【００４０】
本発明の抗体または抗体フラグメントは、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2フラグメントであることができる。これらは、免疫複合体または標識された抗体の形態もとることができる。
【００４１】
アプタマーは、分子の認識に関して、抗体の代替を表すクラスの分子を構成する。
【００４２】
ＧＭ３合成酵素の発現または活性の阻害剤は、１つまたは複数の薬学的に許容できる賦形剤と調合することができる。先に記載したように、これらの阻害剤は、化学的に合成された化合物、アンチセンスＲＮＡもしくは干渉ＲＮＡ、または抗ＧＭ３合成酵素抗体であることができる。
【００４３】
「賦形剤」または「薬学的に許容できるビヒクル」は、ヒトまたは動物に２次反応、例えばアレルギー反応を生成しない、あらゆる溶剤、分散媒、吸収遅延剤などを意味するものと理解される。
【００４４】
投与量は、問題の作用物質、投与様式、治療上の適応ならびに患者の年齢および状態に当然依存する。タンパク質または抗体の投与量は、好ましくは１日あたり０．１から２５０ｍｇ／ｋｇであり、特に好ましくは１日あたり１から１００ｍｇ／ｋｇである。薬剤組成物が核酸を含む場合、投与する核酸（配列またはベクター）の投与量は、特に投与様式、標的にする病理学的状態、および処置の期間によっても適合される。一般的に、組換えウィルスを用いる場合、これらは、約１０4から１０14ｐｆｕ／ｍｌの、好ましくは１０6から１０10ｐｆｕ／ｍｌの投与量として調合され、投与される。「ｐｆｕ」（プラーク形成単位）は、ウィルスの溶液の感染力に相当し、適切な細胞培養物に感染させ、一般的には４８時間後に感染した細胞のプラークの数を測定することにより求めることができる。ウィルスの溶液のｐｆｕの力価を求めるための技術は、文献に詳細に記載されている。
【００４５】
非経口投与、より詳しくは注射による投与を考慮する場合、有効成分を含む本発明の組成物は、ゆっくりと潅流するためのアンプルまたはボトルに包装されている、注射可能な溶液および懸濁液の形態をとる。注射は、特に、皮下の、筋肉内の、または静脈内の経路により行うことができる。
【００４６】
経口投与の場合には、本発明の組成物は、ゼラチンカプセル、発泡錠、コーティング錠もしくは素錠、小袋、糖衣錠、経口投与のためのアンプルまたは溶液、微粒剤、または持続性放出形態の形態をとることができる。
【００４７】
非経口用投与のための形態は、有効成分を、緩衝剤、安定化剤、保存剤、可溶化剤、等張化剤、および懸濁化剤と混合することにより、従来の方法で得ることができる。周知の技術を用いて、これらの混合物を引き続き滅菌し、次いで静脈内注射の形態に包装する。
【００４８】
当業者が用いる緩衝剤は、有機のリン酸塩をベースにするものであってもよい。
【００４９】
懸濁化剤の例には、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、アラビアゴム、およびカルボキシメチルセルロースナトリウムが含まれる。
【００５０】
さらに、本発明による有用な安定化剤は、亜硫酸ナトリウムおよびメタ重亜硫酸ナトリウムであり、挙げてもよい保存剤は、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、クレゾール、およびクロロクレゾールである。経口用の溶液または懸濁液を調製するには、有効成分を適切なビヒクルに、分散剤、湿潤剤、懸濁化剤（例えば、ポリビニルピロリドン）、保存剤（例えば、メチルパラベン、またはプロピルパラベン）、矯味剤、または着色剤とともに溶解し、または懸濁する。
【００５１】
マイクロカプセルを調製するには、有効成分を適切な希釈剤、適切な安定化剤、有効物質の長時間放出を促進する物質、または中央のコアを形成するためのあらゆる他のタイプの添加剤と組み合わせ、次いでこれを適切なポリマー（例えば、水溶性樹脂、または水不溶性樹脂）で被覆する。当業者に周知の技術をこの目的で用いる。
【００５２】
得られたマイクロカプセルを、次いで場合により、適切な投与単位に調合する。
【００５３】
眼の経路による投与も、考慮することができる。
【００５４】
その場合には、本発明の薬剤組成物は、洗眼剤または眼用クリームなど、眼に局所投与するための眼科の組成物の形態をとる。
【００５５】
阻害剤をリポソームとして調合することもできる。リポソームは、水性媒体中に分散され、自発的にマルチラメラ同心性二分子膜小胞を形成するリン脂質から形成される。これらの小胞は、概ね、直径２５ｎｍから４μｍであり、超音波分解することができ、コア中に水溶液を含む直径２００から５００Åのより小型の単層膜小胞の形成をもたらす。
【００５６】
リポソームは、有効成分を正確な細胞の標的または組織の標的に投与するのに特に有利であり得る。これは、脂質を、標的とするペプチド（例えば、ホルモン）または抗体などの、標的とする分子に化学的に結合させることにより行うことができる。
【００５７】
スクリーニング方法
本発明は、糖尿病の微小血管合併症の処置および／または予防に有用な化合物をスクリーニングし、または同定するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法にさらに関し、ＧＭ３合成酵素活性を阻害する少なくとも１つの試験化合物の能力を評価し、この酵素の活性のレベルの低下により、糖尿病の微小血管合併症の処置および／または予防に有用な化合物が示唆される。
【００５８】
糖尿病の微小血管合併症が、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、および糖尿病性神経障害を含む群から選択されることが好ましい。糖尿病の微小血管合併症が糖尿病性腎症であることが、よりさらに好ましい。
【００５９】
試験化合物はあらゆるタイプであることができる。試験化合物は、天然のもしくは合成の化合物、またはこのような化合物の混合物であることができる。試験化合物は、また、構造的に規定された物質であることもでき、または知られていない構造の物質、例えば生物学的抽出物であることもできる。
【００６０】
試験化合物の存在下でのＧＭ３合成酵素の活性のレベルを、試験化合物の非存在下での活性の対照のレベルと比較することができる。
【００６１】
第一の実施形態では、スクリーニング方法は、少なくとも１つの試験化合物を、ＧＭ３合成酵素を発現する細胞と接触させること、前記の化合物がガングリオシドのＧＭ３の細胞内合成を阻害する、すなわち阻止しまたは減少させる能力を判定することとから成るステップを含む。試験化合物に曝露されていない細胞と比較して、細胞におけるガングリオシドのＧＭ３の合成のレベルが低下していれば、糖尿病の微小血管合併症の処置および／または予防に有用な化合物であることが示される。
【００６２】
細胞は、ＧＭ３合成酵素を内生的に発現する細胞、例えば、網膜の周皮細胞または腎臓のメサンギウム細胞であることができる。細胞は、ＧＭ３合成酵素遺伝子の生成物を発現するためのベクターの助けで、一時的なまたは安定した方法でＧＭ３合成酵素を発現するように形質移入された細胞であることもできる。これらの細胞は、原核生物または真核生物の宿主細胞中に、ＧＭ３合成酵素をコードする配列を含むベクターに挿入されたヌクレオチド配列を導入し、次いで前記の細胞を、形質移入したヌクレオチド配列を複製しかつ／または発現させる条件下で培養することにより得ることができる。
【００６３】
ＧＭ３合成酵素をコードする配列を含むＤＮＡベクター、例えばプラスミドベクターを、当業者に周知のあらゆる技術により、宿主細胞中に導入することができる。特に、ＤＮＡベクターを裸の形態で、すなわちベクターの細胞中への形質移入を促進するあらゆる種類のビヒクルまたはシステムの助けなしに、導入することが可能である（欧州特許第４６５５２９号）。他の利用可能な技術は、マイクロインジェクション、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈降法のもの、またはナノカプセルもしくはリポソームの助けでの製剤である。生分解性のポリアルキルシアノアクリレートのナノ粒子は、特に有利である。リポソームの場合には、陽イオン性の脂質を使用すると、陰性に荷電した核酸のカプセル化に好都合であり、陰性に荷電した細胞膜の融解を促進する。
【００６４】
他の方法では、ベクターは、そのゲノムに挿入された、ＧＭ３合成酵素をコードする核酸配列を含む、組換えウィルスの形態であることができる。ウィルスのベクターは、好ましくは、アデノウィルス、レトロウィルス、特に、レンチウィルス、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウィルス、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、痘苗などから選択することができる。これらのリコンビナント発現技術の実施は、当業者にはよく知られている。宿主細胞の例には、特に、ＣＨＯ、ＣＯＳ−７、２９３、およびＭＤＣＫ細胞などの哺乳動物の細胞、ＳＦ９細胞などの昆虫の細胞、大腸菌などの細菌、および酵母菌系が含まれる。
【００６５】
発現のレベルは、遺伝子の転写のレベル、またはこのＧＭ３合成酵素の遺伝子がコードするタンパク質の翻訳のレベルを、直接または、例えばレポーター遺伝子により判定することにより評価することができる。
【００６６】
標的遺伝子（この場合はＧＭ３合成酵素の遺伝子）またはレポーター遺伝子の転写の後のための最も一般的な試験（すなわち、転写のレベルの判定）は、ノーザンブロティング技術に基づくものである。ＧＭ３合成酵素のタンパク質またはレポータータンパク質の翻訳の後のための試験（すなわち、翻訳のレベルの判定）は、イムノアッセイ技術に特に基づくことができ、または、蛍光定量的な、発光の、またはレポータータンパク質（緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰ；ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ＣＡＴ、など）を検出するための他の技術を用いることができる。
【００６７】
イムノアッセイ技術は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ｉｎ ｓｉｔｕイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光など、当業者にはよく知られている様々な型式により行うことができる。ＧＭ３合成酵素タンパク質を検出するのに有用な抗ＧＭ３合成酵素タンパク質抗体は、以下に記載するように生成することができる。
【００６８】
別の一実施形態では、スクリーニング方法は、少なくとも１つの試験化合物を天然の、突然変異した、もしくはリコンビナントのＧＭ３合成酵素、または生物学的起源のＧＭ３合成酵素と接触させることと、前記化合物がシアル酸ドナーからシアル酸アクセプターのガラクトース残基の３−ヒドロキシル基へのシアル酸残基の転移を阻害、すなわち阻止または減少させる能力を判定することとからなるステップを含む。前記化合物の非存在下でシアル酸転移のレベルに比べて、前記化合物の存在下でのシアル酸転移の活性のレベルが低下していれば、ＧＭ３合成酵素を阻害する化合物であることを示しており、糖尿病の微小血管合併症の処置および／または予防に有用である。
【００６９】
ＧＭ３合成酵素活性のレベルは、シアル酸をドナーからアクセプターへの転移を可能にする適切な条件下で、ＧＭ３合成酵素を、シアル酸ドナーおよびシアル酸アクセプターと接触させることにより評価すると有利である。一般的に、「適切な条件」は、触媒反応が起こることのできる反応媒体を意味する。媒体は、例えば、緩衝剤、酸化剤および／または還元剤、ならびに補助因子を含むことができる。媒体のｐＨ、温度、およびイオン濃度は、一般的に調節される。好ましくは、ＧＭ３合成酵素の活性は、６と７の間の、好ましくは６．５と６．７の間のｐＨにバッファリングされた媒体で、３５と３９℃の間の、好ましくは３７℃の温度で評価される。反応は、１０ｍＭのＭｎ2+、例えば１０ｍＭのＭｎＣｌ2を含む媒体中で行うと有利である。ＧＭ３合成酵素の活性の試験は、特に、国際公開第ＷＯ９７／４７７４９号パンフレット、米国特許第６５５５３７１号明細書、またはＷａｋａｒｃｈｕｋら（１９９６年）による文献に記載されている。
【００７０】
好ましくは、ＧＭ３合成酵素の活性は、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミネートなどのシアル酸ドナーからラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）のガラクトース残基の３−ヒドロキシル基へシアル酸を転移してガングリオシドのＧＭ３を形成することを定量することにより評価する。ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミネートおよび／もしくはラクトシルセラミドの消失が減少し、かつ／またはＧＭ３の形成が減少すれば、ＧＭ３合成酵素を阻害する化合物であることを示す。したがって、本発明の方法は、試験物質の存在下または非存在下で、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミネートからラクトシルセラミドへのシアル酸の転移のレベルを判定することを含む。
【００７１】
シアル酸のドナーおよび／またはアクセプターを、検出可能な方法で標識すると有利である。標識化は、当業者にはよく知られているあらゆる適切な技術により行うことができる。これは、例えば、放射活性の、酵素的な、発光の、もしくは蛍光の標識化、またはこれらの技術の組合せであることができる。
【００７２】
本発明による好ましいスクリーニング試験を、図７に記載してある。この試験では、ＧＭ３合成酵素を［14Ｃ］−ＣＭＰ−シアル酸と、およびビオチンと結合したラクトシルセラミドと接触させる。ＳＰＡ（登録商標）技術（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、ある種の放射活性の元素の壊変によるβ粒子の放出に基づくものである。放射活性のある分子がＳＰＡシンチレーションビーズに十分近い場合は、放射活性のある崩壊がビーズにおける閃輝性の基を刺激し、蛍光の放出を生成する。シグナルは、シンチレーションカウンターおよび／またはＣＣＤ撮像装置により検出することができる。他方では、ＳＰＡビーズを含む溶液中の遊離の放射活性の分子、すなわちＳＰＡビーズと相互作用をしない放射活性の分子の場合には、放射活性の分子の崩壊に付随するβ放出は、ＳＰＡビーズに到達する十分なエネルギーを持たず、光の放出は生成されない。本試験の文脈では、したがって、発光のシグナルの測定値はＧＭ３の量を反映することになり、それは、反応媒体ではこの化合物だけが、ビオチン／ストレプトアビジン複合体によりＳＰＡビーズに付随し、放射活性のあるシアル酸基を有するからである。
【００７３】
以下の実施例および図は、本発明を説明し、限定的なものを意味するものではない。
【００７４】
図
図１は、ＡＧＥによる周皮細胞（ＢＲＰ）および腎臓のメサンギウム細胞（ＲＭＣ）の増殖の阻害を示す。細胞は、４日間（ＲＭＣ）または７日間（ＢＲＰ）、３μＭのＢＳＡまたはＡＧＥに曝露した。次いで、細胞をトリプシン処理し、血球計算機を用いて計数し、タンパク質の全量を測定した。結果はＢＳＡ対照のパーセント値として示し、各々２回ずつ行った、６個（ＢＲＰ）または９個（ＲＭＣ）の独立した実験の平均±ＳＥＭを表している。*はＢＳＡ対照に対し、ｐ＜０．０５である。
【００７５】
図２は、ｖａｎ Ｅｃｈｔｅｎら（１９９３年）による文献をもとに、変更されたガングリオシドの生合成経路を示す。シリーズａおよびｂのガングリオシドのみが、ＢＲＰおよびＲＭＣで検出されている（丸で囲んだガングリオシド）。
【００７６】
図３は、周皮細胞およびメサンギウム細胞における、ガングリオシドプロファイルの変化を示している。周皮細胞（Ａ）またはメサンギウム細胞（Ｂ）を、３μＭのＢＳＡまたはＡＧＥにそれぞれ４または７日間曝露し、次いで回収した。「材料と方法」の段落で記載するように、ガングリオシドを抽出し、精製し、ＨＰＴＬＣにより分析し、レゾルシノールで染色することにより展開した。結果は、ＢＳＡ対照のパーセントとして表し、各々２回ずつ行った、６個（ＢＲＰ）または９個（ＲＭＣ）の独立した実験の平均±ＳＥＭを表している。*はＢＳＡ対照に対しｐ＜０．０５である。（Ｃ）および（Ｄ）では、ガングリオシドを１μＣｉ／ｍｌの［14Ｃ］−ガラクトースで代謝により標識し、抽出し、ＨＰＴＬＣにより分離し、オートラジオグラフィーにより分析した。結果を、ＢＳＡ対照のパーセントで表し、３回の独立の実験の平均±ＳＥＭを表している。
【００７７】
図４は、ＡＧＥによって引き起こされた、分離された糸球体および細胞におけるＧＭ３合成酵素活性の上昇を示している。（Ａ）細胞を、４日間（ＲＭＣ）または７日間（ＢＲＰ）、３μＭのＢＳＡまたはＡＧＥで処理した。ＧＭ３合成酵素の活性を、「材料と方法」の段落に記載するように細胞ホモジネートで測定した。対照の活性は、ＢＲＰおよびＲＭＣで、それぞれ２．７および５．１ｐｍｏｌ／ｈ／ｍｇタンパク質であった。結果はＢＳＡ対照のパーセントとして表し、４または５個の独立の実験の平均±ＳＥＭを表している。（Ｂ）ＧＭ３合成酵素の活性を、対照のマウス（ｄｂ／ｍ）およびｄｂ／ｄｂマウスの糸球体の高度に精製したホモジネートについて測定した。対照の活性は、４．７ｐｍｏｌ／ｈ／ｍｇタンパク質であった。結果は対照のパーセントで表し、４〜５匹の動物の平均±ＳＥＭを表している。*はＢＳＡ対照または対照マウスに対しｐ＜０．０５である。
【００７８】
図５は、外因性のシリーズａのガングリオシドによって引き起こされる細胞の増殖の阻害を図示している。周皮細胞（Ａ）またはメサンギウム細胞（Ｂ）を、それぞれ４または７日間、ガングリオシドとＢＳＡを複合したもので処理した。処理の終わりに、全タンパク質を測定した。結果はＢＳＡ対照のパーセントとして表し、各々３回ずつ行った、５〜６個の独立の実験の平均±ＳＥＭを表している。*はＢＳＡ対照に対しｐ＜０．０５である。
【００７９】
図６は、ＡＧＥの効果に対する抗−シリーズａガングリオシドＧＭ２およびＧＭ１抗体の保護作用を示す。周皮細胞（Ａ）またはメサンギウム細胞（Ｂ）を、１ウェルあたり５μｇの抗−ＧＭ２または抗−ＧＭ１ポリクローナル抗体の存在下または非存在下で、３μＭのＢＳＡまたはＡＧＥで処理した。処理の終わりに、細胞を洗浄し、溶解し、タンパク質の全量を測定した。結果はＢＳＡ対照のパーセントとして表し、各々３回ずつ行った、５〜６個の独立の実験の平均±ＳＥＭを表している。*はＡＧＥで処理した細胞に対しｐ＜０．０５である。
【００８０】
図７は、シンチグラフィーおよび発光により、反応生成物であるガングリオシドのＧＭ３の検出を結びつける試験による、ＧＭ３合成酵素活性の検出を示す。ＧＭ３合成酵素は、［14Ｃ］−ＣＭＰ−シアル酸から、ビオチンに結合しているラクトシルセラミド（Ｂｉｏｔｉｎ−ＬａｃＣｅｒ）への標識したシアル酸の転移を触媒する。次いで、ストレプトアビジンに結合しているＳＰＡ（シンチレーション近接アッセイ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ビーズを、ビオチンに結合しており14Ｃで標識されている得られたガングリオシドのＧＭ３に接触させる。ＧＭ３放射活性とＳＰＡビーズの間の相互作用によりもたらされるＳＰＡシグナルを、次いで測定する。
【００８１】
図８は、ＧＭ３合成酵素ｓｉＲＮＡで形質移入すると、ＲＭＣを保護することを示している。４００ｎＭのＧＭ３合成酵素ｓｉＲＮＡでＲＭＣを形質移入して２４時間後、細胞を３μＭのＢＳＡ対照またはＡＧＥで処理した。処理の終わりに全タンパク質を測定した。結果はＢＳＡ対照のパーセントとして表し、６個の独立の実験の平均±ＳＥＭを表している。*はＡＧＥで処理した細胞に対しｐ＜０．０５である。
【００８２】
図９は、ＧＭ３およびＧＤ３合成酵素の活性、ならびにＧＭ３レベルは、糖尿病マウスの腎皮質で調整されることを示している。ＧＭ３合成酵素活性（Ａ）およびＧＤ３合成酵素活性（Ｂ）を、対照のマウス（ｄｂ／ｍ）および糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）の腎皮質のホモジネートで測定した。対照のマウス（ｄｂ／ｍ）および糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）におけるＧＭ３（Ｃ）のレベルを示す。対照のマウスでは、ＧＭ３レベルは、６６±９ｎｇ／ｍｌのタンパク質であった。結果はＢＳＡ対照のパーセントとして表し、４〜６匹の動物の平均±ＳＥＭを表している。*はＡＧＥで処理した細胞に対しｐ＜０．０５である。
【００８３】
実施例
【００８４】
実施例１−材料と方法
細胞の分離と培養
以前に記載されているように（Ｌｅｃｏｍｔｅら、１９９６年）、ウシ網膜微小血管から、ウシ網膜周皮細胞（ＢＲＰ）を分離した。簡単に述べると、地方の屠殺場から入手した、脱核したウシの目から無菌の条件下で解剖して、網膜を得た。汚染性の色素性の網膜の上皮細胞を取り除いた後、網膜（培養皿１個につき２個）をスライスして小片にし、Ｈａｎｋｓで平衡にした食塩水（Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ、ｐＨ７．４、抗生物質１％、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、フランス、Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、Ｓａｉｎｔ−Ｑｕｅｎｔｉｎ、Ｓｉｇｍａ）０．５％を追加した、Ｃａ2+／Ｍｇ2+を含まない酸素処理したＨＢＳＳ）中、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーでホモジナイズした。ホモジネートを、４℃で５分間１０００ｇで遠心分離し、残渣をコラゲナーゼ／ディスパーゼ（ドイツ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）（Ｃａ2+／Ｍｇ2+を含まない酸素処理したＨＢＳＳ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ、ｐＨ７．４、抗生物質１％、ＤＮａｓｅ２０Ｕ／ｍｌ、およびＮα−トシルリシンクロメチルケトン（ＴＬＣＫ）１５０ｎｇ／ｍｌ、シグマ、中に１ｍｇ／ｍｌ）を含む酵素溶液中に再懸濁した。消化後（３７℃で２０分）、微小血管の断片を４０μｍのナイロンフィルター上に置き、フィブロネクチンで覆った６ｃｍのディシュに堆積させた。初代培養を、１０％ウシ胎児血清（米国、ニューヨーク、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、１％のグルタミン、および１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を追加したＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）で培養し、培地は２日ごとに交換した。接着期間の後、微小血管から周皮細胞の異常増殖物が４８時間後に生じ、約１０日で細胞はコンフルエンスに到達した。ＢＲＰ培養物は、その偽足のある多角形の不規則な形態、および増殖して非付着細胞になることにより特徴付けられるように、またα１−アクチンおよび特異的な糖脂質の抗原（３Ｇ５抗原）の両方に対する陽性の標識化により、ならびに上皮細胞で発現されるｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子に対する陰性の標識化により評価されるように（Ｌｅｃｏｍｔｅら、１９９６年）、１００％純粋であった。細胞は、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）（１：３）で継代培養され、第２継代まで同じ培地で培養を継続し、その間ＢＲＰを処理した。
【００８５】
若年オスＷｉｓｔａｒ系ラット（フランス、ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）の精製した糸球体から、ラット腎メサンギウム細胞（ＲＭＣ）を得た。簡単に述べると、無菌条件下で除去してすぐのラットの腎臓から皮質の断片を分離した。小片をＨＢＳＳ緩衝剤で、２３０μｍのメッシュを機械的に無理やり通過させた。糸球体を、このメッシュを通過させ、次いで７３．７μｍのメッシュを無理やり通過させた。最終的に、これらを７０μｍのメッシュ上に置き、２０％のウシ胎児血清、１％のグルタミンおよび１％のペニシリン／ストレプトマイシンを追加したＤＭＥＭ中に含まれるフィブロネクチンで覆われた６ｃｍのディッシュに配置した（２個の腎糸球体に対し４ディッシュ）。付着期間の後、３週間後に糸球体からＲＭＣの異常増殖物が生じ、次いで、残留する上皮細胞および内皮細胞を除去するために細胞を第５継代まで培養した。ＲＭＣは、形態学的判定基準（コンフルエントの場合は、星型、芯型により）、また、ビメンチン、平滑筋α−アクチンおよびＴｈｙ−１抗原での陽性の標識化により特徴付けられる。次いで、細胞を、１５％のウシ胎児血清、１％のグルタミンおよび１％のペニシリン／ストレプトマイシンを追加したＤＭＥＭで培養した。これらは、第５継代と第１５継代の間で使用した。
【００８６】
マウス糸球体の分離
糖尿病の（ｄｂ／ｄｂ）または対照の（ｄｂ／ｍ）１１週齢のマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）から、Ｔａｋｅｍｏｔｏらが記載した（Ｔａｋｅｍｏｔｏら、２００２年）磁気ビーズ灌流技術により、高度に精製した糸球体を得た。簡単に述べると、マウスをＤｙｎａｂｅａｄｓ溶液（フランス、Ｃｏｍｐｉｅｇｎｅ、Ｄｙｎａｌ）で心臓を通して灌流し、次いで腎臓を除去し、細かくスライスして、コラゲナーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で消化した。ろ過後、それらの毛細血管にビーズを蓄積させた糸球体を、磁気により保持し、ホモジェナイズする前に２回洗浄した。この技術により、組織の汚染度の低い、糸球体の純粋な標本が提供される。
【００８７】
マウス腎皮質の分離
糖尿病の（ｄｂ／ｄｂ）または対照の（ｄｂ／ｍ）１１週齢のマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）の腎臓から、腎皮質の断片を分離した。簡単に述べると、動物を麻酔し、屠殺し、腎臓を取り出した。次いで、解剖により腎皮質の断片を得、ＤｏｕｎｃｅホモジナイザーでＥＤＴＡ１ｍＭおよびプロテアーゼ阻害剤１０μｌ／ｍｌを含む２５ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝剤中で機械的にホモジナイズした。
【００８８】
ＡＧＥの調製
ウシ血清アルブミン（最終濃度７．２ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）を、メチルグリオキサル（Ｓｉｇｍａ）１００ｍＭと、３７℃で５０時間インキュベートしてＡＧＥを調製した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をメチルグリオキサルの非存在下の、同じ条件下でインキュベートし、対照の調製物として用いた（ＢＳＡ対照）。ＡＧＥおよびＢＳＡ対照を、ＰＤ１０ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（スウェーデン、Ｕｐｐｓａｌａ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で精製して、塩および未反応のカルボニルを除去し、次いでろ過滅菌し、使用するまで−２０℃に保った。
【００８９】
ＡＧＥでの処理
接種２４時間後に、ＡＧＥおよびＢＳＡ対照（最終濃度３μＭ）を、培地に添加した。各細胞タイプを１継代（ＢＲＰでは約７日、ＲＭＣでは約４日）処理した。培地は、２日ごとに新しい培地と交換した。
【００９０】
細胞増殖の測定
処理の終わりに、細胞をトリプシンで回収し、細胞の残渣はリン酸緩衝食塩水（氷冷ＰＢＳ）（Ｓｉｇｍａ）で２回洗浄した。各サンプルに対し、細胞数を求めるために、血球計算機を用いて、１つのアリコートの細胞を計数した。別のアリコートを、Ｂｒａｄｆｏｒｄ技法によりタンパク質を測定するのに使用した。
【００９１】
ガングリオシドの分析
ガングリオシドを代謝標識するために、特異性の高い活性の標識実験（ＧＭ２およびＧＭ１測定実験）に、０．２μＣｉ／ｍｌまたは１μＣｉ／ｍｌの［14Ｃ（Ｕ）］−Ｄ−ガラクトース（３２９．５ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）（マサチューセッツ州、Ｂｏｓｔｏｎ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を培地に一夜加えた。細胞（周皮細胞５〜８×１０5、またはメサンギウム細胞１２〜２０×１０5）を、次いで、トリプシン化により回収し、ＰＢＳ中で３回洗浄した。ガングリオシドを、Ｂｏｕｃｈｏｎら（Ｂｏｕｃｈｏｎら、１９９０年）が記載し、Ｎａｔａｌｉｚｉｏら（Ｎａｔａｌｉｚｉｏら、２００２年）が変更した方法で、細胞残渣から抽出した。簡単に述べると、細胞残渣を、クロロホルム（Ｃ）／メタノール（Ｍ）（１：１、ｖ／ｖ）２ｍｌ中に分散し、激しく混和し、４℃で一夜抽出した。遠心分離後、残渣を同じ溶剤の２ｍｌで２回抽出した。プールした全脂質の抽出物を蒸発により乾燥し、１ｍＭのＣ／Ｍ／ＰＢＳ溶液（１０：１０：７、ｖ／ｖ／ｖ）の助けで分離した。ガングリオシドを含む上相を、次いで、Ｃ１８シリカゲルカラム（マサチューセッツ州、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で脱塩し、ＨＰＴＬＣ（ドイツ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｍｅｒｃｋ）により分析した。プレートを、０．２％Ｃ／Ｍ／ＣａＣｌ2（５５：４５：１０、ｖ／ｖ／ｖ）中で展開した。ガングリオシドは、リンのスクリーンおよびＳｔｏｒｍ ８２０（米国、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてオートラジオグラフィーにより、およびＩｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒ ＶＤＳ−ＣＬ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてレゾルシノール（ガングリオシドに特異的な染色：レゾルシノール０．３％（Ｓｉｇｍａ）、ＣｕＳＯ4０．０３％、ＨＣｌ ３０％）で標識化することにより視覚化した。Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて、定量を行った。ＧＴ１ｂは、ＢＲＰおよびＲＭＣの両方のガングリオシドプロファイルには存在しなかったので、脂質抽出の前に内部標準としてそれをサンプルに加えた。
【００９２】
ＧＭ３合成酵素活性の測定
処理の終わりに、細胞をＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝剤（２０ｍＭカコジル酸ナトリウム、ｐＨ６．６（Ｓｉｇｍａ）、０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０μｌ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤、米国、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）５０μｌ中４℃で２０分間インキュベートし、次いで掻き取って回収した。ＢＲＰの４ディッシュ（約２〜３×１０6細胞）、ＲＭＣの３ディッシュ（約３〜６×１０6細胞）をプールした。細胞溶解物を１００００ｇで５分間遠心分離し、上清のタンパク質を用いてＧＭ３合成酵素活性を測定した。糸球体の残渣を、１ｍＭ ＥＤＴＡおよびプロテアーゼ阻害物質１０μｌ／ｍｌを含む２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ中、シリンジで機械的にホモジナイズした。ホモジネートを、次いで、１０００ｇで２分間遠心分離し、核成分を分画した後の上清を用いてＧＭ３合成酵素活性を測定した。各サンプル（細胞に対し約５００μｇ、および糸球体に対し約１００μｇ）に等量のタンパク質を用いて試験を行った。最終濃度０．１ｍＭのラクトシルセラミド（フランス、Ｍａｒｎｅ ｌａ Ｖａｌｌｅｅ、Ｂｉｏｖａｌｌｅｙ、Ｍａｔｒｅｙａ）、４μＣｉ／ｍｌの［シアリック（ｓｉａｌｉｃ）−４，５，６，７，８，９−14Ｃ］−ＣＭＰ−シアル酸（３２５．２ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１００μＭ ＣＭＰ−シアル酸（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および１００ｍＭカコジル酸ナトリウム、ｐＨ６．６を含む、等体積の反応緩衝剤とサンプルを混合した。撹拌後、反応混合物を３７℃で５０分間インキュベートした。サンプルをシリカゲル６０カラム（Ｍｅｒｃｋ）に添加して、過剰の基質を生成物から分離することにより、反応を停止した。カラムを水で洗浄した後、ガングリオシドをＣ／Ｍ（１：１、ｖ／ｖ）で溶出し、溶剤を窒素下で乾燥させた。最後に、ガングリオシドを薄層クロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ）により分離し、反応生成物をオートラジオグラフィーにより現像した。ＧＭ３合成酵素活性を、生成されたＧＭ３のｐｍｏｌ／ｈ／タンパク質のｍｇで表した。
【００９３】
外因性ガングリオシドでの処理
外因性ガングリオシドのＢＲＰおよびＲＭＣの増殖に対する効果を評価するために、細胞を９６ウェルのプレートで培養した。外因性の糖脂質であるＧＭ３、ＧＭ２、ＧＭ１、およびＧＤ１ａ、グルコシルセラミド、ならびにラクトシルセラミド（Ｍａｔｒｅｙａ）を、完全培地に、ＤＭＥＭ／１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４中１：１の比でＢＳＡと複合した形態で最終濃度５０μＭで加えた。処理の終わりに、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０μｌのＲｉｐａ溶解緩衝液（ＰＢＳ１０ｍＭ、ＮＰ４０ １％（フランス、Ｂｒｅｂｉｅｒｅｓ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｉｅｒｃｅ）、デオキシコール酸ナトリウム０．５％、ＳＤＳ ０．１％、プロテアーゼ阻害物質１０μｌ／ｍｌ）で３７℃で３０分間溶解した。我々の実験における細胞数は全タンパク質濃度と相関しているので（図１を参照されたい）、細胞の増殖を評価するために、ＢＣＡタンパク質試験（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて全タンパク質を測定した。
【００９４】
抗−シリーズａガングリオシド抗体での処理
シリーズａのガングリオシドの潜在的な作用を阻止するために、細胞を９６ウェルのプレート中で培養し、ＡＧＥまたは対照のＢＳＡ３μＭで、５０μｇ／ｍｌの抗−ＧＭ２ポリクローナル抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）または抗−ＧＭ１ポリクローナル抗体（Ｍａｔｒｅｙａ）の存在下または非存在下で処理した。処理の終わりに、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０μｌのＲｉｐａ溶解緩衝液中に溶解し、細胞の増殖を定量するためにタンパク質を測定した。
【００９５】
ＧＭ３合成酵素ｓｉＲＮＡでのＲＭＣの形質移入
ＧＭ３合成酵素の活性を阻止するために、ＲＭＣを６ウェルの培養皿で３０％までのコンフルエンスで培養し、次いで、オリゴフェクタミン試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてラットのｃＤＮＡ配列（英国、Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ、Ａｍｂｉｏｎ）に対してデザインされた、ＧＭ３合成酵素に特異的な干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を形質移入した。用いたＧＭ３合成酵素のアンチセンス配列は、ＧＧＧＵＵＡＵＵＣＵＧＡＡＣＡＵＧＵＵｔｔ（配列番号５）であった。予備実験で、濃度の高いｓｉＲＮＡ（０〜８００ｎＭ）で細胞に形質移入することにより、用量−反応試験を行った。形質移入７２時間後、形質移入された細胞のホモジネートでＧＭ３合成酵素活性を測定した。次いで、ｓｉＲＮＡで形質移入した細胞で、増殖を評価した。この目的では、４００ｎＭのｓｉＲＮＡで形質移入して２４時間後に、細胞を３μＭのＢＳＡ対照またはＡＧＥで（３日）処理した。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、Ｒｉｐａ溶解緩衝剤に溶解し、細胞の増殖を評価するために、タンパク質を測定した。
【００９６】
統計学的分析
データは、平均±ＳＥＭとして表し、対照のパーセント値で表した。細胞の試験では、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位検定を用いて、群間の差の有意性を評価した。マウスに対する実験では、ＧＭ３合成酵素の活性にＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いた。ｐ＜０．０５を、統計学的に有意とみなした。
【００９７】
実施例２−結果
＜１−ＡＧＥは、周皮細胞およびメサンギウム細胞の増殖を阻害する＞
周皮細胞およびメサンギウム細胞の増殖に対するＡＧＥの効果を比較するために、細胞を３μＭの濃度のＢＳＡまたはＡＧＥで４日から７日間処理した。細胞の計数により、ＡＧＥは、周皮細胞およびメサンギウム細胞の数を、それぞれ３３および４０％減少させたことが示された（図１）。全タンパク質も測定し、細胞数と相関して減少したことが見出された。これらの結果はＡＧＥが周皮細胞の増殖にも、メサンギウム細胞の増殖にも同様の有害効果があることを実証し、この結果により本発明者らが、これら両方の細胞タイプでのＡＧＥに対する反応に関与する共通のメカニズムが解明できるようになった。
【００９８】
＜２−ＡＧＥは、周皮細胞およびメサンギウム細胞におけるシリーズａのガングリオシドを増加させる＞
本発明者らの先の結果は、ＡＧＥは、網膜の微小血管細胞におけるガングリオシドのプロファイルを調整することができることを示唆していた（Ｎａｔａｌｉｚｉｏら、２００１年）。ガングリオシドのプロファイルは、ＢＲＰおよびＲＭＣにおけるＢＳＡ対照またはＡＧＥに対する反応について分析した。ガングリオシドのプロファイルは、細胞のタイプに特異的である。対照の条件下では、周皮細胞における主なガングリオシドは、シリーズａのガングリオシドのＧＭ３（検出された全ガングリオシドの６３％）およびＧＭ１（９％）、ならびにシリーズｂのガングリオシドのＧＤ３（２８％）であった。メサンギウム細胞におけるプロファイルは、ＧＤ３（５％）が大変少量であるところが異なり、シリーズａの場合ではＧＤ１ａ（２０％）が存在するところが異なるが、ＧＭ３は依然として主要なガングリオシドであった（７５％）。
【００９９】
シリーズａのガングリオシドの増加、およびシリーズｂのガングリオシドの減少は、ＡＧＥで処理した両方の細胞タイプに観察された（図３）。周皮細胞では、シリーズａのガングリオシドのＧＭ３およびＧＭ１は約４０％増加し、一方シリーズｂのガングリオシドのＧＤ３は２４％減少した（図３Ａ）。メサンギウム細胞では、ＧＭ３は３３％増加したがＧＤ３は３０％減少し、ＧＤ１ａのレベルは影響を受けなかった（図３Ｂ）。同様の結果が、ガラクトースで標識化した後のオートラジオグラフィーにより得られた。ＢＲＰにおけるシリーズａのガングリオシドのＧＭ２、ならびにＲＭＣにおけるＧＭ２およびＧＭ１は、レゾルシノールでの標識化により検出することが難しかったので、細胞を特異的活性の高い［14Ｃ］−Ｄ−ガラクトースで標識し、次いで、対照の細胞およびＡＧＥで処理した細胞でガングリオシドを分析した。結果は、ＢＲＰではＧＭ２が５５％増加し（図３Ｃ）、ＲＭＣではＧＭ２およびＧＭ１が２５から３５％増加した（図３Ｄ）ことを示している。これらの結果は、周皮細胞でもメサンギウム細胞でも、ＡＧＥはガングリオシドのプロファイルに同様の調整を引き起こすことを指摘していた。これらはまた、シリーズａのガングリオシドの増加は、細胞の増殖の低下の根源となる共通の機序であるかもしれないことを示唆している。
【０１００】
＜３−ＡＧＥは周皮細胞およびメサンギウム細胞におけるＧＭ３合成酵素の活性を上昇させる＞
シリーズａのガングリオシドに観察される増加の原因となる機序を説明しようと、シリーズａのガングリオシドの合成の制限的酵素であるＧＭ３合成酵素の活性を、対照の細胞および処理した細胞で測定した。図４に表した結果は、ＡＧＥで処理すると、ほとんどが酵素反応の最大速度を増大させることにより、周皮細胞では約１．８、メサンギウム細胞では約１．５のファクターでＧＭ３合成酵素の活性を上昇させることを示している。これらの結果は、ＡＧＥが、ＧＭ３合成酵素を調節することにより、ＲＭＣおよびＢＲＰに共通の機序を働かせることを示唆している。
【０１０１】
＜４−外因性のシリーズａのガングリオシドは周皮細胞およびメサンギウム細胞の増殖を阻害する＞
本発明者らは、シリーズａのガングリオシドを外因性に添加すると、周皮細胞およびメサンギウム細胞の増殖に影響を及ぼすか否かを試験した。細胞を１継代（ＢＲＰでは７日間、ＲＭＣでは４日間）５０μＭガングリオシドで、ならびに対照として非シアリル化のグルコシルセラミドおよびラクトシルセラミド前駆物質で処理した。図５は、ＧＭ２、ＧＭ１、およびＧＤ１ａが周皮細胞およびメサンギウム細胞の増殖を最も効果的に（約１５から３０％）阻害することを示している。ＧＭ３は周皮細胞の増殖を弱く阻害したが、メサンギウム細胞には著しい効果がなかった。対照として用いたグルコシルセラミドおよびラクトシルセラミドは、効果がなかった。これらの結果は、シリーズａのガングリオシドは、周皮細胞およびメサンギウム細胞の増殖を阻害することを指摘している。特に、ＧＭ２およびＧＭ１は、ＡＧＥに反応してＢＲＰおよびＲＭＣで増加し、これらはこれら両方の細胞タイプの増殖を低下させる。これらのシリーズａのガングリオシドは、したがって、ＡＧＥ効果の共通のメディエーターであり得る。
【０１０２】
＜５−抗−シリーズａのガングリオシド抗体はＡＧＥが引き起こす増殖の阻害から周皮細胞およびメサンギウム細胞を保護する＞
ＧＭ２およびＧＭ１がＡＧＥの効果を媒介するか否かを試験するために、細胞を、抗−ＧＭ１および抗−ＧＭ２抗体の存在下でＡＧＥで処理した。ＢＳＡで処理した対照の細胞では、増殖は、抗−ガングリオシド抗体の存在下または非存在下で異ならなかった。細胞を抗−ＧＭ２および抗−ＧＭ１抗体の存在下でＡＧＥと処理すると、周皮細胞およびメサンギウム細胞の増殖の低下を部分的に防いだ（図６）。外因性ガングリオシドの効果を考えると、これらの所見は、シリーズａのガングリオシド、特にＧＭ１およびＧＭ２は、周皮細胞およびメサンギウム細胞でＡＧＥが引き起こす増殖の阻害の共通のメディエーターであることを示唆している。
【０１０３】
＜６−ＧＭ３合成酵素の活性は糖尿病マウスの糸球体で上昇する＞
ｉｎ ｖｉｖｏでＧＭ３合成酵素の活性に対する糖尿病の環境の効果を評価するために、ｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスモデルの高度に精製した糸球体で酵素活性を測定した。図４Ｂに表した結果は、ＧＭ３合成酵素活性は、対照（ｄｂ／ｍ）に比べて糖尿病細胞の糸球体で５０％上昇したことを示している。
【０１０４】
＜７−ＧＭ３合成酵素ｓｉＲＮＡはＡＧＥが引き起こす効果から部分的に保護する＞
ＡＧＥの効果の媒介におけるシリーズａのガングリオシドの役割をより詳しく解明するために、ＲＭＣをＧＭ３合成酵素ｓｉＲＮＡで形質移入した。予備実験では、ｓｉＲＮＡはＲＭＣにおけるＧＭ３合成酵素の活性を効果的に阻害することが示された。形質移入された細胞および処理された細胞の増殖を、次いで測定した。図８に示すように、ＲＭＣの増殖に対するＡＧＥの効果は、ＧＭ３合成酵素ｓｉＲＮＡで形質移入された細胞において部分的に阻害される。これらの結果は、ガングリオシドがＡＧＥ効果の媒介に関与することを明らかに実証している。効果の部分的な性質は、（ｉ）形質移入の有効性を上げるために細胞をコンフルエンスのより進行したレベルに処理すると、ＡＧＥの効果は前の実験より弱く、（ｉｉ）ＧＭ３合成酵素の活性は５０％だけ阻害されるという事実により説明することができる。
【０１０５】
＜８−ＧＭ３およびＧＤ３合成酵素の活性およびＧＭ３のレベルは、糖尿病マウスの腎皮質で変更される＞
ガングリオシド生合成経路に対する糖尿病の環境の効果をｅｘ ｖｉｖｏで評価するために、ｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスモデルの腎皮質のホモジネートについてＧＭ３およびＧＤ３合成酵素活性を測定した。図９Ａ〜Ｂに表した結果は、糖尿病マウスの腎皮質では、対照（ｄｂ／ｍ）に比べて、ＧＭ３合成酵素の活性は８０％上昇しているが、ＧＤ３合成酵素の活性は５０％低下していることを示している。ガングリオシドも分析し、ｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスの腎皮質におけるＧＭ３レベルが、統計的に有意ではないが上昇することが示された（図９Ｃ）。全般的に、したがって、これらの結果は、ＡＧＥで処理したＲＭＣおよびＢＲＰで得られた結果の生理病理学的意義を実証している。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】ＡＧＥによる周皮細胞（ＢＲＰ）および腎臓のメサンギウム細胞（ＲＭＣ）の増殖の阻害を示すグラフである。
【図２】ｖａｎ Ｅｃｈｔｅｎら（１９９３年）による文献をもとに変更されたガングリオシドの生合成経路を示す図である。
【図３】周皮細胞およびメサンギウム細胞における、ガングリオシドプロファイルの変化を示すグラフである。
【図４】ＡＧＥによって引き起こされた、分離された糸球体および細胞におけるＧＭ３合成酵素活性の上昇を示すグラフである。
【図５】外因性のシリーズａのガングリオシドによって引き起こされる細胞の増殖の阻害を示すグラフである。
【図６】ＡＧＥの効果に対する抗−シリーズａガングリオシドＧＭ２およびＧＭ１抗体の保護作用を示すグラフである。
【図７】シンチグラフィーおよび発光により、反応生成物であるガングリオシドのＧＭ３の検出を結びつける試験による、ＧＭ３合成酵素活性の検出を示す図である。
【図８】ＧＭ３合成酵素ｓｉＲＮＡで形質移入すると、ＲＭＣを保護することを示すグラフである。
【図９】ＧＭ３およびＧＤ３合成酵素の活性、ならびにＧＭ３レベルは、糖尿病マウスの腎皮質で調整されることを示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病の微小血管合併症を処置するためのＧＭ３合成酵素阻害剤の使用、およびこの酵素の阻害剤をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微小血管障害は、微小血管の構造上および機能上の変化を特徴とする、糖尿病の慢性合併症である。網膜および腎臓は、病理学的状態の２つの主な標的であり、糖尿病性網膜症および糖尿病性腎症をもたらす。
【０００３】
糖尿病性網膜症は、先進国において失明を引き起こす２番目の原因である。殆ど全ての１型糖尿病患者、および６０％を超える２型糖尿病患者が、罹患後約２０年で、この微小血管合併症を発症する（Ｆｏｎｇら、２００３年）。毛細血管は、基底膜の肥厚、および周皮細胞の特異的な損失などの進行性の構造上の変化を受け、それに続いて内皮細胞における増殖および機能が変更を受ける。これらの変化は、虚血と結びつき、微小血管壁を損傷し、過剰の毛細血管透過性を促進し、浮腫、微細動脈瘤、および視力を脅かす出血をもたらす（Ｆｏｒｅｓｔｅｒら、１９９７年）。
【０００４】
腎症には、糖尿病の病歴が２０から３０年の患者の５０から６０％が罹患する。腎症は、これらの患者の死亡率の主要な原因であると考えられている（Ｋｒｏｌｅｗｓｋｉら、１９９７年）。病理学的状態の主な特徴の１つには、糸球体の腫大があるが、これは増殖が停止したメサンギウム細胞の増生により、また細胞外マトリックスのタンパク質の蓄積により基底膜が肥厚しメサンギウムが拡大した結果である。これらの事象は、血行動態の欠失と結びついて、糸球体硬化、糸球体ろ過、または糸球体ろ過のレベルの変化、およびミクロアルブミン尿症を引き起こし、重症の腎不全をもたらす（Ｗｏｌｆら、２０００年）。
【０００５】
糖尿病の対象が腎症を発症する危険性は、一般的に、ミクロアルブミン尿症を調べることにより評価される。糖尿病性腎症の出現および／または進行を遅らせるために現在用いられている予防上のまたは治療上の手段には、糖血症のモニタリング、血圧降下薬、特にアンジオテンシン転換酵素阻害剤の投与、低タンパク質食の採用、またはスタチンなどの脂質低下薬の投与が含まれる（Ｒｉｐｐｉｎら、２００４年）。
【０００６】
公衆衛生および経済に関するこれらの影響を考慮すると、糖尿病の微小血管合併症を予防し、治療する新規な方法を同定することが、主な治療上の難題を構成している。
【０００７】
糖尿病性網膜症および糖尿病性腎症の病因の細胞上および分子上の基盤は完全に理解されていないが、細胞の増殖の調節、ならびに細胞−細胞間および細胞−マトリックス間の相互作用が重要な役割を果たしているようである。糖尿病の微小血管合併症の発症、特に糖化最終産物（ＡＧＥ）の形成に関わる機序を説明するために数々の生化学上の仮説が提唱されている（Ｓｉｎｇｈら、２００１年）。
【０００８】
グルコースなどの糖が減少すると、Ｓｃｉｆｆ塩基およびＡｍａｄｏｒｉ生成物を形成する一連の反応によりタンパク質のアミノ基、脂質、および核酸と非酵素的に反応し、最終的にＡＧＥを生成する。糖化は、グルコース濃度に依存し、糖尿病で増加する。これは、細胞外マトリックスのタンパク質または循環タンパク質などの、血中グルコースに曝露されている長寿命のタンパク質に優先的に起こり、それによってこれらの構造およびこれらの機能を変更する。
【０００９】
さらに、ＡＧＥは、膜の受容体に結合して、酸化ストレスの生成による細胞の反応（Ｌａｌら、２００２年；Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９４年）、核因子κＢの活性化（Ｓｉｎｇｈら、２００１年；Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９４年）、および炎症誘発性サイトカインまたは接着分子などの様々な遺伝子の発現（Ｈｏｆｍａｎｎら、１９９９年；Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９５年）を引き起こすことができる。
【００１０】
これらの変更は全て、糖尿病の微小血管合併症に見られる多くの変化、特に、血管透過性の上昇、細胞外マトリックスの生成および硬性の増大、および細胞−マトリックス間相互作用および細胞の増殖の変化を説明することができる重要な生物学的効果を有する（Ｓｔｉｔｔら、２００３年）。実際、多くのｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの研究では、ＡＧＥが、糖尿病に付随する網膜症および腎症の発症に関与していることが示唆されている（Ｓｔｉｔｔら、２００３年；Ｗａｕｔｉｅｒら、２００１年）。
【００１１】
ガングリオシドは、原形質膜のマイクロドメインに集中しており、その構造にシアル酸が存在することを特徴とするスフィンゴ糖脂質である。ラクトシルセラミドを継続的にシアル化するとモノシアロガングリオシド（ＧＭ３）、ジシアロガングリオシド（ＧＤ３）、およびトリシアロガングリオシド（ＧＴ３）を生成する。これらのガングリオシドは、次いで、グリコシルトランスフェラーゼおよびシアルトランスフェラーゼが連続して作用することにより、より複雑なガングリオシドに転換され、それぞれａ、ｂおよびｃシリーズを形成する（Ｖａｎ Ｅｃｈｔｅｎら、１９９３年）。ガングリオシドは、インテグリンもしくはマトリックスタンパク質（コラーゲンおよびフィブロネクチン）などの接着レセプターと、または他のスフィンゴ糖脂質と相互作用することにより、細胞−細胞間および細胞−マトリックス間認識で主要な役割を果たすことが知られている。また、ガングリオシド、特にａシリーズのものは、様々な増殖因子の活性を調整することにより、細胞増殖の調整に関与している（Ｈａｋｏｍｏｒｉら、１９９０年）。
【００１２】
ＡＧＥは、網膜微小血管の周皮細胞および内皮細胞におけるスフィンゴ糖脂質の代謝の変更を引き起こすことが報告されている（Ｎａｔａｌｉｚｉｏら、２００１年）。これらの変化には、特に、ＧＭ３合成酵素の活性の上昇が伴う（Ａ．Ｄａｌｅｍｅ−Ｎａｔａｌｉｚｉｏ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｐｐｌｉｑｕｅｅｓ ｄｅ Ｌｙｏｎにおける博士論文、２００２年２月８日）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明者らは、現在、ＤＲおよびＤＮの病理学的状態をもたらすＡＧＥが媒介する効果にガングリオシドが関与することを示している。したがって、本発明者らは、それぞれ糖尿病性網膜症および糖尿病性腎症に関与する２つの細胞型である網膜周皮細胞および腎臓メサンギウム細胞の増殖をＡＧＥにより阻害することは、ＧＭ３合成酵素の活性の上昇およびシリーズａのガングリオシドの蓄積に少なくとも部分的に基づくことを実証している。ＧＭ３合成酵素の活性の上昇は、さらに、ＡＧＥが与えられている糖尿病マウスモデルに観察されている。これらの結果により、糖尿病の微小血管合併症を処置するための標的として、ＧＭ３合成酵素およびシリーズａのガングリオシドが同定されている。
【００１４】
定義
「糖尿病の微小血管合併症」は、微小血管の構造上のおよび機能上の変化を特徴とする、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病の慢性合併症を意味する。これらの合併症は、主に、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、および糖尿病性神経障害を含む。末梢神経障害は身体の四肢の神経を冒し、脚の感覚の喪失は最も蔓延している形態の１つである。不快感および疼痛（錯感覚および知覚過敏）も非常に一般的な衰弱性の症状である。この神経障害は、切断を必要とすることがある、脚の潰瘍および重症の組織損傷を引き起こすことがある。
【００１５】
本特許出願の枠組み内で、「ＧＭ３合成酵素」は、シアル酸ドナーからシアル酸アクセプターのガラクトース残基の３−ヒドロキシル基にシアル酸残基を転移することを触媒する、酵素ラクトシルセラミドα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．９）を意味する。好ましくは、シアル酸ドナーはＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸であり、シアル酸アクセプターはラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）などの糖脂質のガラクトース残基である。触媒される反応は、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸＋β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−β−Ｄ−グルコシルセラミド＝Ｃｍｐ＋α−Ｎ−アセチルノイラミニル−２，３−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−β−Ｄ−グルコシルセラミドであってもよい。好ましくは、本発明のＧＭ３合成酵素は、ヒトのＧＭ３合成酵素であり、またはげっ歯動物（例えば、ラットもしくはマウス）、ネコ科動物、イヌ科動物、霊長類（サル）などの非ヒトの哺乳動物のＧＭ３合成酵素である。例えば、ヒトおよびネズミ科動物のＧＭ３合成酵素をコードする遺伝子は、それぞれ、ＧｅｎｂａｎｋデータベースにＮＭ＿００３８９６（配列ＩＤ番号１）およびＮＭ＿０１１３７５（配列ＩＤ番号３）のアクセション番号で寄託されている。対応するアミノ酸配列は、それぞれ配列ＩＤ番号２および配列ＩＤ番号４に記載されている。
【００１６】
本特許出願の枠組み内で、「ＧＭ３合成酵素阻害剤」は、（ｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでＧＭ３合成酵素の活性および／または発現を阻害し、かつ／または（ｉｉ）シアル酸ドナーからのシアル酸アクセプターのガラクトース残基の３−ヒドロキシル基へのシアル酸残基の転移を、特にガングリオシドのＧＭ３の形成を阻止し、かつ／または（ｉｉｉ）ガングリオシドのＧＭ３の細胞内合成を阻止する化合物を意味する。阻害または阻止は、部分的でも全体的でもよい。
【００１７】
「ガングリオシド」は、１つまたは複数のシアル酸残基を含むスフィンゴ糖脂質を意味するものと理解される。より詳しくは「シリーズａのガングリオシド」は、ラクトシルセラミドのガラクトース上にシアル酸残基を１つだけ有するガングリオシドを意味する。シリーズａのガングリオシドには、化合物ＧＭ３（α−Ｎ−アセチルノイラミニル−２，３−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−β−Ｄ−グルコシルセラミド）、ＧＭ２、ＧＭ１、ＧＤ１ａ、およびＧＴ１ａが含まれる（図２を参照されたい）。
【００１８】
治療上の適用
本発明者らは、糖尿病の微小血管合併症の発症に関与する糖化最終産物（ＡＧＥ）は、ＧＭ３合成酵素の酵素活性を上昇させることによりその効果を媒介することを実証している。
【００１９】
したがって、本発明は、ＧＭ３合成酵素遺伝子の発現または活性の阻害剤を患者に投与する、糖尿病の微小血管合併症を処置する方法を提唱するものである。
【００２０】
本発明は、糖尿病の微小血管合併症を処置することを目的とする薬物を製造するための、ＧＭ３合成酵素遺伝子の発現または活性の阻害剤の使用にさらに関する。
【００２１】
好ましくは、糖尿病の微小血管合併症は、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、および糖尿病性神経障害を含む群から選択される。糖尿病の微小血管合併症が糖尿病性腎症であることが特に好ましい。
【００２２】
本発明の枠組み内で、「処置」は、疾患の予防的処置または治癒的処置、すなわち、疾患の、またはこの疾患に付随する１つもしくは複数の症状の進行を逆行させ、遅くし、または阻害する行為、または発症を予防する行為を意味する。
【００２３】
「患者」は、糖尿病の微小血管合併症に罹患し、または罹患しやすいヒト、またはマウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、もしくはサルなどの非ヒトの哺乳動物を意味する。好ましくは、本発明に関する患者は、糖尿病が検出されている対象である。
【００２４】
好ましくは、阻害剤は、ＧＭ３合成酵素遺伝子の発現または活性の特異的阻害剤、すなわちＧＭ３合成酵素以外の遺伝子またはタンパク質に対する効果が実質的にない阻害剤である。
【００２５】
第一の実施形態では、本発明の方法または使用は、ＧＭ３合成酵素遺伝子および／またはタンパク質の発現の阻害剤に採用する。このような阻害剤は、遺伝子の転写および／または転写物メッセンジャー（ｍＲＮＡ）の翻訳を阻害し、または抑制することができる。当業者であれば、この目的に最も適する戦略を選択することができる。
【００２６】
アンチセンス戦略を用いて、ＧＭ３合成酵素の発現を阻害することができる。この取組みは、例えば、ｍＲＮＡをアンチセンス核酸でマスキングすることにより、またはリボザイムでｍＲＮＡを切断することにより、特定のｍＲＮＡの転写を阻止するアンチセンス核酸またはリボザイムを利用することができる。本発明の文脈では、「アンチセンス」は、ＲＮＡ−ＲＮＡ間相互作用、ＲＮＡ−ＤＮＡ間相互作用、リボザイム、干渉ＲＮＡ、アプタマー、およびＲＮＡｓｅＨにより媒介される阻害を広く含む。アンチセンス治療法は、一般的に、ウィルスのベクターなど、アンチセンス配列を有するベクターを使用し、その後、ベクターはゲノムに統合されるので阻害は概ね安定している。発現の一時的な阻害をもたらすアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用も可能である。アンチセンス技術の一般的なプレゼンテーションは、「アンチセンスＤＮＡおよびＲＮＡ（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ）」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｄ．Ｍｅｌｔｏｎ編集、１９８８年）に見られる。
【００２７】
好ましくは、ＧＭ３合成酵素遺伝子および／またはタンパク質の発現の阻害剤は、したがって、アンチセンス核酸、リボザイム、干渉ＲＮＡ、およびアプタマーを含む群から選択される。
【００２８】
「アンチセンス核酸」または「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ分子と細胞質の条件下でハイブリダイズする場合、後者の機能を阻害する一本鎖核酸分子である。アンチセンス核酸は、組み替え遺伝子にコードして細胞で発現することができ（例えば、米国特許第５８１４５００号、および第５８１１２３４号）、または合成により調製することができる（例えば、米国特許第５７８０６０７号）。ＧＭ３合成酵素のアンチセンス核酸は、ＧＭ３合成酵素をコードする相同の配列と特異的にハイブリダイズするように、例えば、配列ＩＤ番号１に示すヒトＧＭ３合成酵素の配列、または配列ＩＤ番号３に示すネズミ科動物ＧＭ３合成酵素の配列と特異的にハイブリダイズするようにデザインすることができる。
【００２９】
「核酸の配列と特異的にハイブリダイズすることができる配列」は、参照の核酸配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を意味する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）。ストリンジェントな条件を規定するパラメーターは、一致する鎖の５０％が分離する温度（Ｔｍ）に、およびイオン強度に依存する。３０を超えた塩基を含む配列では、Ｔｍは以下の等式により規定される：Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）＋１６．６ｌｏｇ（陽イオン濃度）−０．６３（ホルムアミドの％）−（６００／塩基数）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）。３０未満の塩基の配列では、Ｔｍは以下の等式により規定される：Ｔｍ＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）。非特異的な配列がハイブリダイズしない、適度にストリンジェントな条件下では、ハイブリダイゼーション温度は、好ましくはＴｍを５から１０℃下回ることができ、用いるハイブリダイゼーション緩衝剤は、６×ＳＳＣ溶液など、イオン強度の高い溶液であることが好ましい。例えば、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は、Ｔｍに、また５０％ホルムアミドおよび５×または６×ＳＣＣを含む溶液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）で得られるようなイオン条件に対応する。
【００３０】
本発明のアンチセンス核酸を、例えば、ヒトまたは動物に注射した後に、保護作用を引き起こすために、または糖尿病の微小血管合併症を処置するために用いることができる。特に、国際特許出願第ＷＯ９０／１１０９２号パンフレットに記載されている技術により、これらを裸のＤＮＡの形態で注射することができる。これらは、例えば、デキストラン−ＤＥＡＥ（Ｐａｇａｎｏら、１９６７年）、核タンパク質（Ｋａｎｅｄａら、１９８９年）、もしくは脂質（Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９８７年）との複合体の形態で、リポソームの形態で（Ｆｒａｌｅｙら、１９８０年）、または他の同様の方法により投与することもできる。
【００３１】
核酸配列がベクターの部分を形成することが好ましい。ベクターの使用により、核酸の処理すべき細胞への投与を改善するのが可能になり、また、これらの細胞における安定性を改善し、治療効果を延長することができる。
【００３２】
「ベクター」は、それを通して宿主細胞を形質転換し、導入されている配列の発現を得る（すなわち、転写および翻訳）ためにＤＮＡまたはＲＮＡの配列を宿主細胞中に導入することができる媒体を意味する。ベクターには、プラスミド、ファージ、ウィルスなどが含まれる。
【００３３】
「リボザイム」は、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼにかなり類似した方法で他の一本鎖ＲＮＡ分子を特異的に切断することができるＲＮＡ分子である。リボザイムは、ある種のｍＲＮＡがそれ自体のイントロンを切断できることを実証することにより発見された。これらのリボザイムのヌクレオチド配列を変更することにより、ＲＮＡ分子における特異的なヌクレオチド配列を認識し、それらを切断する分子を生成することが可能である（Ｃｅｃｈ、１９８９年）。この特異性のために、特定の配列を有するｍＲＮＡだけが不活化される。
【００３４】
ＧＭ３合成酵素の転写を可逆的に阻害することは、干渉ＲＮＡを用いて実現することもできる。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の技術は、「低分子干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）などの低分子ＲＮＡ分子を用いることにより、遺伝子の発現を妨げる。この技術は、ＲＮＡ干渉が植物から昆虫および哺乳動物まで多くの生存する生物体の大多数の細胞における遺伝子の消滅の自然な生物学的機序である、という事実から利益を得ている（Ｓｈａｒｐ、２００１年）。ＲＮＡ干渉は、中間体ｍＲＮＡの破壊をもたらすことにより、遺伝子からの機能上のタンパク質の生成を防ぐ（Ｂａｓｓ、２０００年；Ｓｈａｒｐ、２００１年）。ｓｉＲＮＡは、裸の形態で、またはベクター中に組み込んで用いることができる。ＧＭ３合成酵素の転写を阻止する干渉ＲＮＡが、配列ＧＧＧＵＵＡＵＵＣＵＧＡＡＣＡＵＧＵＵｔｔ（配列ＩＤ番号５）を有することができることが好ましい。
【００３５】
アプタマーも、ＧＭ３合成酵素の転写を阻害するのに用いることができる。アプタマーは、実質的にあらゆるクラスの標的分子を、高い親和性および特異性で認識することができるオリゴヌクレオチド配列である。このようなリガンドは、ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（１９９０）に記載された、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）と呼ばれるスクリーニング方法により、ランダム配列ライブラリーから分離することができる。ランダム配列ライブラリーは、コンビナトリアル化学を用いてＤＮＡ合成により得ることができる。このようなライブラリーでは、各メンバーは、独特な配列に対応している直鎖状オリゴマー（場合により化学的に修飾されている）である。このクラスの分子の、可能な変更、適用、および利点については、Ｊａｙａｓｅｎａ（１９９９）により再考されている。
【００３６】
別の一実施形態では、本発明の方法または使用は、ＧＭ３合成酵素タンパク質の活性の阻害剤の使用に関する。ＧＭ３合成酵素活性の阻害剤は、本特許出願に記載するように、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞のまたは生化学的な試験を含むスクリーニング方法により容易に同定することができる。阻害剤は、ペプチドの性質のもの、ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）、または非ペプチド模倣物（Ｒｕｂｉｎ−Ｃａｒｒｅｚ、２０００年）とすることができ、例えば、ドナーからシアル酸アクセプターへのシアル酸基の転移を阻止しもしくは減少させ、および／またはＧＭ３合成酵素を阻止しもしくは減少させることにより、ＧＭ３合成酵素の酵素活性に干渉することができる小型の有機分子などである。
【００３７】
ＧＭ３合成酵素の阻害剤は、抗体、特に、配列ＩＤ番号２に示すヒトＧＭ３合成酵素、または配列ＩＤ番号４に示すネズミ科動物のＧＭ３合成酵素に対する阻害剤であることもできる。前記の抗体は、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、またはそれらのフラグメント、あるいはキメラの抗体、特にヒト化され、または免疫複合したものであることができる。
【００３８】
ポリクローナル抗体は、タンパク質に対して免疫化した動物の血清から慣例の手順によって得ることができる。例えば、用いる抗原は、タンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、ＫＬＨ）または別のペプチドに反応性の残基により結合しているＧＭ３合成酵素の複合体など、適切なペプチド複合体であることができる。Ｂｅｎｏｉｔら（１９８２年）が記載した手順にしたがって、ウサギを、１ｍｇのペプチドの抗原の等量で免疫化する。４週間の間隔で、動物に抗原２００μｇの注射で処置し、１０から１４日後に採血する。第３回目の注射後、クロラミン−Ｔ法により調製した、ヨウ素で放射標識したペプチド抗原に結合する能力を判定するために、抗血清を試験し、次いでカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）イオン交換カラム上のクロマトグラフィーにより精製する。次いで、抗体分子を哺乳動物から回収し、例えばＩｇＧ分画を得るためのＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘを用いるなど、当業者にはよく知られている方法により、望ましい濃度に分離する。ポリクローナル血清の特異性を上げるために、抗体を、固相に免疫ポリペプチドを用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。固相に免疫学的複合体を形成させるために、ポリペプチドが抗体分子と免疫反応を行うことをもたらすのに十分な時間、抗体を固相の免疫ポリペプチドと接触させる。
【００３９】
モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）が記載した、従来のリンパ球融解法およびハイブリドーマ培養法により得ることができる。モノクローナル抗体を調製する他の方法も知られている（Ｈａｒｌｏｗら、１９８８年）。モノクローナル抗体は、哺乳動物（例えば、マウス、ラットもしくはウサギ、またはヒトなども）を免疫化することにより、またハイブリドーマを生成するためのリンパ球融解法を用いて調製することができる（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５年）。この慣例の技術には代替が存在する。例えば、ハイブリドーマからクローンした核酸を発現することにより、モノクローナル抗体を生成することが可能である。抗体は、抗体のｃＤＮＡをベクター中に導入することにより、ファージディスプレイ技術により生成することもでき、後者は、通常、ファージの表面上にＶ遺伝子ライブラリーを有する糸状のファージである（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対するｆＵＳＥ５、ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、１９９０年）。これらの抗体ライブラリーを構築するためのプロトコールは、Ｍａｒｋｓら（１９９１年）に記載されている。
【００４０】
本発明の抗体または抗体フラグメントは、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2フラグメントであることができる。これらは、免疫複合体または標識された抗体の形態もとることができる。
【００４１】
アプタマーは、分子の認識に関して、抗体の代替を表すクラスの分子を構成する。
【００４２】
ＧＭ３合成酵素の発現または活性の阻害剤は、１つまたは複数の薬学的に許容できる賦形剤と調合することができる。先に記載したように、これらの阻害剤は、化学的に合成された化合物、アンチセンスＲＮＡもしくは干渉ＲＮＡ、または抗ＧＭ３合成酵素抗体であることができる。
【００４３】
「賦形剤」または「薬学的に許容できるビヒクル」は、ヒトまたは動物に２次反応、例えばアレルギー反応を生成しない、あらゆる溶剤、分散媒、吸収遅延剤などを意味するものと理解される。
【００４４】
投与量は、問題の作用物質、投与様式、治療上の適応ならびに患者の年齢および状態に当然依存する。タンパク質または抗体の投与量は、好ましくは１日あたり０．１から２５０ｍｇ／ｋｇであり、特に好ましくは１日あたり１から１００ｍｇ／ｋｇである。薬剤組成物が核酸を含む場合、投与する核酸（配列またはベクター）の投与量は、特に投与様式、標的にする病理学的状態、および処置の期間によっても適合される。一般的に、組換えウィルスを用いる場合、これらは、約１０4から１０14ｐｆｕ／ｍｌの、好ましくは１０6から１０10ｐｆｕ／ｍｌの投与量として調合され、投与される。「ｐｆｕ」（プラーク形成単位）は、ウィルスの溶液の感染力に相当し、適切な細胞培養物に感染させ、一般的には４８時間後に感染した細胞のプラークの数を測定することにより求めることができる。ウィルスの溶液のｐｆｕの力価を求めるための技術は、文献に詳細に記載されている。
【００４５】
非経口投与、より詳しくは注射による投与を考慮する場合、有効成分を含む本発明の組成物は、ゆっくりと潅流するためのアンプルまたはボトルに包装されている、注射可能な溶液および懸濁液の形態をとる。注射は、特に、皮下の、筋肉内の、または静脈内の経路により行うことができる。
【００４６】
経口投与の場合には、本発明の組成物は、ゼラチンカプセル、発泡錠、コーティング錠もしくは素錠、小袋、糖衣錠、経口投与のためのアンプルまたは溶液、微粒剤、または持続性放出形態の形態をとることができる。
【００４７】
非経口用投与のための形態は、有効成分を、緩衝剤、安定化剤、保存剤、可溶化剤、等張化剤、および懸濁化剤と混合することにより、従来の方法で得ることができる。周知の技術を用いて、これらの混合物を引き続き滅菌し、次いで静脈内注射の形態に包装する。
【００４８】
当業者が用いる緩衝剤は、有機のリン酸塩をベースにするものであってもよい。
【００４９】
懸濁化剤の例には、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、アラビアゴム、およびカルボキシメチルセルロースナトリウムが含まれる。
【００５０】
さらに、本発明による有用な安定化剤は、亜硫酸ナトリウムおよびメタ重亜硫酸ナトリウムであり、挙げてもよい保存剤は、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、クレゾール、およびクロロクレゾールである。経口用の溶液または懸濁液を調製するには、有効成分を適切なビヒクルに、分散剤、湿潤剤、懸濁化剤（例えば、ポリビニルピロリドン）、保存剤（例えば、メチルパラベン、またはプロピルパラベン）、矯味剤、または着色剤とともに溶解し、または懸濁する。
【００５１】
マイクロカプセルを調製するには、有効成分を適切な希釈剤、適切な安定化剤、有効物質の長時間放出を促進する物質、または中央のコアを形成するためのあらゆる他のタイプの添加剤と組み合わせ、次いでこれを適切なポリマー（例えば、水溶性樹脂、または水不溶性樹脂）で被覆する。当業者に周知の技術をこの目的で用いる。
【００５２】
得られたマイクロカプセルを、次いで場合により、適切な投与単位に調合する。
【００５３】
眼の経路による投与も、考慮することができる。
【００５４】
その場合には、本発明の薬剤組成物は、洗眼剤または眼用クリームなど、眼に局所投与するための眼科の組成物の形態をとる。
【００５５】
阻害剤をリポソームとして調合することもできる。リポソームは、水性媒体中に分散され、自発的にマルチラメラ同心性二分子膜小胞を形成するリン脂質から形成される。これらの小胞は、概ね、直径２５ｎｍから４μｍであり、超音波分解することができ、コア中に水溶液を含む直径２００から５００Åのより小型の単層膜小胞の形成をもたらす。
【００５６】
リポソームは、有効成分を正確な細胞の標的または組織の標的に投与するのに特に有利であり得る。これは、脂質を、標的とするペプチド（例えば、ホルモン）または抗体などの、標的とする分子に化学的に結合させることにより行うことができる。
【００５７】
スクリーニング方法
本発明は、糖尿病の微小血管合併症の処置および／または予防に有用な化合物をスクリーニングし、または同定するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法にさらに関し、ＧＭ３合成酵素活性を阻害する少なくとも１つの試験化合物の能力を評価し、この酵素の活性のレベルの低下により、糖尿病の微小血管合併症の処置および／または予防に有用な化合物が示唆される。
【００５８】
糖尿病の微小血管合併症が、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、および糖尿病性神経障害を含む群から選択されることが好ましい。糖尿病の微小血管合併症が糖尿病性腎症であることが、よりさらに好ましい。
【００５９】
試験化合物はあらゆるタイプであることができる。試験化合物は、天然のもしくは合成の化合物、またはこのような化合物の混合物であることができる。試験化合物は、また、構造的に規定された物質であることもでき、または知られていない構造の物質、例えば生物学的抽出物であることもできる。
【００６０】
試験化合物の存在下でのＧＭ３合成酵素の活性のレベルを、試験化合物の非存在下での活性の対照のレベルと比較することができる。
【００６１】
第一の実施形態では、スクリーニング方法は、少なくとも１つの試験化合物を、ＧＭ３合成酵素を発現する細胞と接触させること、前記の化合物がガングリオシドのＧＭ３の細胞内合成を阻害する、すなわち阻止しまたは減少させる能力を判定することとから成るステップを含む。試験化合物に曝露されていない細胞と比較して、細胞におけるガングリオシドのＧＭ３の合成のレベルが低下していれば、糖尿病の微小血管合併症の処置および／または予防に有用な化合物であることが示される。
【００６２】
細胞は、ＧＭ３合成酵素を内生的に発現する細胞、例えば、網膜の周皮細胞または腎臓のメサンギウム細胞であることができる。細胞は、ＧＭ３合成酵素遺伝子の生成物を発現するためのベクターの助けで、一時的なまたは安定した方法でＧＭ３合成酵素を発現するように形質移入された細胞であることもできる。これらの細胞は、原核生物または真核生物の宿主細胞中に、ＧＭ３合成酵素をコードする配列を含むベクターに挿入されたヌクレオチド配列を導入し、次いで前記の細胞を、形質移入したヌクレオチド配列を複製しかつ／または発現させる条件下で培養することにより得ることができる。
【００６３】
ＧＭ３合成酵素をコードする配列を含むＤＮＡベクター、例えばプラスミドベクターを、当業者に周知のあらゆる技術により、宿主細胞中に導入することができる。特に、ＤＮＡベクターを裸の形態で、すなわちベクターの細胞中への形質移入を促進するあらゆる種類のビヒクルまたはシステムの助けなしに、導入することが可能である（欧州特許第４６５５２９号）。他の利用可能な技術は、マイクロインジェクション、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈降法のもの、またはナノカプセルもしくはリポソームの助けでの製剤である。生分解性のポリアルキルシアノアクリレートのナノ粒子は、特に有利である。リポソームの場合には、陽イオン性の脂質を使用すると、陰性に荷電した核酸のカプセル化に好都合であり、陰性に荷電した細胞膜の融解を促進する。
【００６４】
他の方法では、ベクターは、そのゲノムに挿入された、ＧＭ３合成酵素をコードする核酸配列を含む、組換えウィルスの形態であることができる。ウィルスのベクターは、好ましくは、アデノウィルス、レトロウィルス、特に、レンチウィルス、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウィルス、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、痘苗などから選択することができる。これらのリコンビナント発現技術の実施は、当業者にはよく知られている。宿主細胞の例には、特に、ＣＨＯ、ＣＯＳ−７、２９３、およびＭＤＣＫ細胞などの哺乳動物の細胞、ＳＦ９細胞などの昆虫の細胞、大腸菌などの細菌、および酵母菌系が含まれる。
【００６５】
発現のレベルは、遺伝子の転写のレベル、またはこのＧＭ３合成酵素の遺伝子がコードするタンパク質の翻訳のレベルを、直接または、例えばレポーター遺伝子により判定することにより評価することができる。
【００６６】
標的遺伝子（この場合はＧＭ３合成酵素の遺伝子）またはレポーター遺伝子の転写の後のための最も一般的な試験（すなわち、転写のレベルの判定）は、ノーザンブロティング技術に基づくものである。ＧＭ３合成酵素のタンパク質またはレポータータンパク質の翻訳の後のための試験（すなわち、翻訳のレベルの判定）は、イムノアッセイ技術に特に基づくことができ、または、蛍光定量的な、発光の、またはレポータータンパク質（緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰ；ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ＣＡＴ、など）を検出するための他の技術を用いることができる。
【００６７】
イムノアッセイ技術は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ｉｎ ｓｉｔｕイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光など、当業者にはよく知られている様々な型式により行うことができる。ＧＭ３合成酵素タンパク質を検出するのに有用な抗ＧＭ３合成酵素タンパク質抗体は、以下に記載するように生成することができる。
【００６８】
別の一実施形態では、スクリーニング方法は、少なくとも１つの試験化合物を天然の、突然変異した、もしくはリコンビナントのＧＭ３合成酵素、または生物学的起源のＧＭ３合成酵素と接触させることと、前記化合物がシアル酸ドナーからシアル酸アクセプターのガラクトース残基の３−ヒドロキシル基へのシアル酸残基の転移を阻害、すなわち阻止または減少させる能力を判定することとからなるステップを含む。前記化合物の非存在下でシアル酸転移のレベルに比べて、前記化合物の存在下でのシアル酸転移の活性のレベルが低下していれば、ＧＭ３合成酵素を阻害する化合物であることを示しており、糖尿病の微小血管合併症の処置および／または予防に有用である。
【００６９】
ＧＭ３合成酵素活性のレベルは、シアル酸をドナーからアクセプターへの転移を可能にする適切な条件下で、ＧＭ３合成酵素を、シアル酸ドナーおよびシアル酸アクセプターと接触させることにより評価すると有利である。一般的に、「適切な条件」は、触媒反応が起こることのできる反応媒体を意味する。媒体は、例えば、緩衝剤、酸化剤および／または還元剤、ならびに補助因子を含むことができる。媒体のｐＨ、温度、およびイオン濃度は、一般的に調節される。好ましくは、ＧＭ３合成酵素の活性は、６と７の間の、好ましくは６．５と６．７の間のｐＨにバッファリングされた媒体で、３５と３９℃の間の、好ましくは３７℃の温度で評価される。反応は、１０ｍＭのＭｎ2+、例えば１０ｍＭのＭｎＣｌ2を含む媒体中で行うと有利である。ＧＭ３合成酵素の活性の試験は、特に、国際公開第ＷＯ９７／４７７４９号パンフレット、米国特許第６５５５３７１号明細書、またはＷａｋａｒｃｈｕｋら（１９９６年）による文献に記載されている。
【００７０】
好ましくは、ＧＭ３合成酵素の活性は、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミネートなどのシアル酸ドナーからラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）のガラクトース残基の３−ヒドロキシル基へシアル酸を転移してガングリオシドのＧＭ３を形成することを定量することにより評価する。ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミネートおよび／もしくはラクトシルセラミドの消失が減少し、かつ／またはＧＭ３の形成が減少すれば、ＧＭ３合成酵素を阻害する化合物であることを示す。したがって、本発明の方法は、試験物質の存在下または非存在下で、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミネートからラクトシルセラミドへのシアル酸の転移のレベルを判定することを含む。
【００７１】
シアル酸のドナーおよび／またはアクセプターを、検出可能な方法で標識すると有利である。標識化は、当業者にはよく知られているあらゆる適切な技術により行うことができる。これは、例えば、放射活性の、酵素的な、発光の、もしくは蛍光の標識化、またはこれらの技術の組合せであることができる。
【００７２】
本発明による好ましいスクリーニング試験を、図７に記載してある。この試験では、ＧＭ３合成酵素を［14Ｃ］−ＣＭＰ−シアル酸と、およびビオチンと結合したラクトシルセラミドと接触させる。ＳＰＡ（登録商標）技術（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、ある種の放射活性の元素の壊変によるβ粒子の放出に基づくものである。放射活性のある分子がＳＰＡシンチレーションビーズに十分近い場合は、放射活性のある崩壊がビーズにおける閃輝性の基を刺激し、蛍光の放出を生成する。シグナルは、シンチレーションカウンターおよび／またはＣＣＤ撮像装置により検出することができる。他方では、ＳＰＡビーズを含む溶液中の遊離の放射活性の分子、すなわちＳＰＡビーズと相互作用をしない放射活性の分子の場合には、放射活性の分子の崩壊に付随するβ放出は、ＳＰＡビーズに到達する十分なエネルギーを持たず、光の放出は生成されない。本試験の文脈では、したがって、発光のシグナルの測定値はＧＭ３の量を反映することになり、それは、反応媒体ではこの化合物だけが、ビオチン／ストレプトアビジン複合体によりＳＰＡビーズに付随し、放射活性のあるシアル酸基を有するからである。
【００７３】
以下の実施例および図は、本発明を説明し、限定的なものを意味するものではない。
【００７４】
図
図１は、ＡＧＥによる周皮細胞（ＢＲＰ）および腎臓のメサンギウム細胞（ＲＭＣ）の増殖の阻害を示す。細胞は、４日間（ＲＭＣ）または７日間（ＢＲＰ）、３μＭのＢＳＡまたはＡＧＥに曝露した。次いで、細胞をトリプシン処理し、血球計算機を用いて計数し、タンパク質の全量を測定した。結果はＢＳＡ対照のパーセント値として示し、各々２回ずつ行った、６個（ＢＲＰ）または９個（ＲＭＣ）の独立した実験の平均±ＳＥＭを表している。*はＢＳＡ対照に対し、ｐ＜０．０５である。
【００７５】
図２は、ｖａｎ Ｅｃｈｔｅｎら（１９９３年）による文献をもとに、変更されたガングリオシドの生合成経路を示す。シリーズａおよびｂのガングリオシドのみが、ＢＲＰおよびＲＭＣで検出されている（丸で囲んだガングリオシド）。
【００７６】
図３は、周皮細胞およびメサンギウム細胞における、ガングリオシドプロファイルの変化を示している。周皮細胞（Ａ）またはメサンギウム細胞（Ｂ）を、３μＭのＢＳＡまたはＡＧＥにそれぞれ４または７日間曝露し、次いで回収した。「材料と方法」の段落で記載するように、ガングリオシドを抽出し、精製し、ＨＰＴＬＣにより分析し、レゾルシノールで染色することにより展開した。結果は、ＢＳＡ対照のパーセントとして表し、各々２回ずつ行った、６個（ＢＲＰ）または９個（ＲＭＣ）の独立した実験の平均±ＳＥＭを表している。*はＢＳＡ対照に対しｐ＜０．０５である。（Ｃ）および（Ｄ）では、ガングリオシドを１μＣｉ／ｍｌの［14Ｃ］−ガラクトースで代謝により標識し、抽出し、ＨＰＴＬＣにより分離し、オートラジオグラフィーにより分析した。結果を、ＢＳＡ対照のパーセントで表し、３回の独立の実験の平均±ＳＥＭを表している。
【００７７】
図４は、ＡＧＥによって引き起こされた、分離された糸球体および細胞におけるＧＭ３合成酵素活性の上昇を示している。（Ａ）細胞を、４日間（ＲＭＣ）または７日間（ＢＲＰ）、３μＭのＢＳＡまたはＡＧＥで処理した。ＧＭ３合成酵素の活性を、「材料と方法」の段落に記載するように細胞ホモジネートで測定した。対照の活性は、ＢＲＰおよびＲＭＣで、それぞれ２．７および５．１ｐｍｏｌ／ｈ／ｍｇタンパク質であった。結果はＢＳＡ対照のパーセントとして表し、４または５個の独立の実験の平均±ＳＥＭを表している。（Ｂ）ＧＭ３合成酵素の活性を、対照のマウス（ｄｂ／ｍ）およびｄｂ／ｄｂマウスの糸球体の高度に精製したホモジネートについて測定した。対照の活性は、４．７ｐｍｏｌ／ｈ／ｍｇタンパク質であった。結果は対照のパーセントで表し、４〜５匹の動物の平均±ＳＥＭを表している。*はＢＳＡ対照または対照マウスに対しｐ＜０．０５である。
【００７８】
図５は、外因性のシリーズａのガングリオシドによって引き起こされる細胞の増殖の阻害を図示している。周皮細胞（Ａ）またはメサンギウム細胞（Ｂ）を、それぞれ４または７日間、ガングリオシドとＢＳＡを複合したもので処理した。処理の終わりに、全タンパク質を測定した。結果はＢＳＡ対照のパーセントとして表し、各々３回ずつ行った、５〜６個の独立の実験の平均±ＳＥＭを表している。*はＢＳＡ対照に対しｐ＜０．０５である。
【００７９】
図６は、ＡＧＥの効果に対する抗−シリーズａガングリオシドＧＭ２およびＧＭ１抗体の保護作用を示す。周皮細胞（Ａ）またはメサンギウム細胞（Ｂ）を、１ウェルあたり５μｇの抗−ＧＭ２または抗−ＧＭ１ポリクローナル抗体の存在下または非存在下で、３μＭのＢＳＡまたはＡＧＥで処理した。処理の終わりに、細胞を洗浄し、溶解し、タンパク質の全量を測定した。結果はＢＳＡ対照のパーセントとして表し、各々３回ずつ行った、５〜６個の独立の実験の平均±ＳＥＭを表している。*はＡＧＥで処理した細胞に対しｐ＜０．０５である。
【００８０】
図７は、シンチグラフィーおよび発光により、反応生成物であるガングリオシドのＧＭ３の検出を結びつける試験による、ＧＭ３合成酵素活性の検出を示す。ＧＭ３合成酵素は、［14Ｃ］−ＣＭＰ−シアル酸から、ビオチンに結合しているラクトシルセラミド（Ｂｉｏｔｉｎ−ＬａｃＣｅｒ）への標識したシアル酸の転移を触媒する。次いで、ストレプトアビジンに結合しているＳＰＡ（シンチレーション近接アッセイ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ビーズを、ビオチンに結合しており14Ｃで標識されている得られたガングリオシドのＧＭ３に接触させる。ＧＭ３放射活性とＳＰＡビーズの間の相互作用によりもたらされるＳＰＡシグナルを、次いで測定する。
【００８１】
図８は、ＧＭ３合成酵素ｓｉＲＮＡで形質移入すると、ＲＭＣを保護することを示している。４００ｎＭのＧＭ３合成酵素ｓｉＲＮＡでＲＭＣを形質移入して２４時間後、細胞を３μＭのＢＳＡ対照またはＡＧＥで処理した。処理の終わりに全タンパク質を測定した。結果はＢＳＡ対照のパーセントとして表し、６個の独立の実験の平均±ＳＥＭを表している。*はＡＧＥで処理した細胞に対しｐ＜０．０５である。
【００８２】
図９は、ＧＭ３およびＧＤ３合成酵素の活性、ならびにＧＭ３レベルは、糖尿病マウスの腎皮質で調整されることを示している。ＧＭ３合成酵素活性（Ａ）およびＧＤ３合成酵素活性（Ｂ）を、対照のマウス（ｄｂ／ｍ）および糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）の腎皮質のホモジネートで測定した。対照のマウス（ｄｂ／ｍ）および糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）におけるＧＭ３（Ｃ）のレベルを示す。対照のマウスでは、ＧＭ３レベルは、６６±９ｎｇ／ｍｌのタンパク質であった。結果はＢＳＡ対照のパーセントとして表し、４〜６匹の動物の平均±ＳＥＭを表している。*はＡＧＥで処理した細胞に対しｐ＜０．０５である。
【００８３】
実施例
【００８４】
実施例１−材料と方法
細胞の分離と培養
以前に記載されているように（Ｌｅｃｏｍｔｅら、１９９６年）、ウシ網膜微小血管から、ウシ網膜周皮細胞（ＢＲＰ）を分離した。簡単に述べると、地方の屠殺場から入手した、脱核したウシの目から無菌の条件下で解剖して、網膜を得た。汚染性の色素性の網膜の上皮細胞を取り除いた後、網膜（培養皿１個につき２個）をスライスして小片にし、Ｈａｎｋｓで平衡にした食塩水（Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ、ｐＨ７．４、抗生物質１％、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、フランス、Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、Ｓａｉｎｔ−Ｑｕｅｎｔｉｎ、Ｓｉｇｍａ）０．５％を追加した、Ｃａ2+／Ｍｇ2+を含まない酸素処理したＨＢＳＳ）中、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーでホモジナイズした。ホモジネートを、４℃で５分間１０００ｇで遠心分離し、残渣をコラゲナーゼ／ディスパーゼ（ドイツ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）（Ｃａ2+／Ｍｇ2+を含まない酸素処理したＨＢＳＳ、Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ、ｐＨ７．４、抗生物質１％、ＤＮａｓｅ２０Ｕ／ｍｌ、およびＮα−トシルリシンクロメチルケトン（ＴＬＣＫ）１５０ｎｇ／ｍｌ、シグマ、中に１ｍｇ／ｍｌ）を含む酵素溶液中に再懸濁した。消化後（３７℃で２０分）、微小血管の断片を４０μｍのナイロンフィルター上に置き、フィブロネクチンで覆った６ｃｍのディシュに堆積させた。初代培養を、１０％ウシ胎児血清（米国、ニューヨーク、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、１％のグルタミン、および１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を追加したＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）で培養し、培地は２日ごとに交換した。接着期間の後、微小血管から周皮細胞の異常増殖物が４８時間後に生じ、約１０日で細胞はコンフルエンスに到達した。ＢＲＰ培養物は、その偽足のある多角形の不規則な形態、および増殖して非付着細胞になることにより特徴付けられるように、またα１−アクチンおよび特異的な糖脂質の抗原（３Ｇ５抗原）の両方に対する陽性の標識化により、ならびに上皮細胞で発現されるｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子に対する陰性の標識化により評価されるように（Ｌｅｃｏｍｔｅら、１９９６年）、１００％純粋であった。細胞は、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）（１：３）で継代培養され、第２継代まで同じ培地で培養を継続し、その間ＢＲＰを処理した。
【００８５】
若年オスＷｉｓｔａｒ系ラット（フランス、ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）の精製した糸球体から、ラット腎メサンギウム細胞（ＲＭＣ）を得た。簡単に述べると、無菌条件下で除去してすぐのラットの腎臓から皮質の断片を分離した。小片をＨＢＳＳ緩衝剤で、２３０μｍのメッシュを機械的に無理やり通過させた。糸球体を、このメッシュを通過させ、次いで７３．７μｍのメッシュを無理やり通過させた。最終的に、これらを７０μｍのメッシュ上に置き、２０％のウシ胎児血清、１％のグルタミンおよび１％のペニシリン／ストレプトマイシンを追加したＤＭＥＭ中に含まれるフィブロネクチンで覆われた６ｃｍのディッシュに配置した（２個の腎糸球体に対し４ディッシュ）。付着期間の後、３週間後に糸球体からＲＭＣの異常増殖物が生じ、次いで、残留する上皮細胞および内皮細胞を除去するために細胞を第５継代まで培養した。ＲＭＣは、形態学的判定基準（コンフルエントの場合は、星型、芯型により）、また、ビメンチン、平滑筋α−アクチンおよびＴｈｙ−１抗原での陽性の標識化により特徴付けられる。次いで、細胞を、１５％のウシ胎児血清、１％のグルタミンおよび１％のペニシリン／ストレプトマイシンを追加したＤＭＥＭで培養した。これらは、第５継代と第１５継代の間で使用した。
【００８６】
マウス糸球体の分離
糖尿病の（ｄｂ／ｄｂ）または対照の（ｄｂ／ｍ）１１週齢のマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）から、Ｔａｋｅｍｏｔｏらが記載した（Ｔａｋｅｍｏｔｏら、２００２年）磁気ビーズ灌流技術により、高度に精製した糸球体を得た。簡単に述べると、マウスをＤｙｎａｂｅａｄｓ溶液（フランス、Ｃｏｍｐｉｅｇｎｅ、Ｄｙｎａｌ）で心臓を通して灌流し、次いで腎臓を除去し、細かくスライスして、コラゲナーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で消化した。ろ過後、それらの毛細血管にビーズを蓄積させた糸球体を、磁気により保持し、ホモジェナイズする前に２回洗浄した。この技術により、組織の汚染度の低い、糸球体の純粋な標本が提供される。
【００８７】
マウス腎皮質の分離
糖尿病の（ｄｂ／ｄｂ）または対照の（ｄｂ／ｍ）１１週齢のマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）の腎臓から、腎皮質の断片を分離した。簡単に述べると、動物を麻酔し、屠殺し、腎臓を取り出した。次いで、解剖により腎皮質の断片を得、ＤｏｕｎｃｅホモジナイザーでＥＤＴＡ１ｍＭおよびプロテアーゼ阻害剤１０μｌ／ｍｌを含む２５ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝剤中で機械的にホモジナイズした。
【００８８】
ＡＧＥの調製
ウシ血清アルブミン（最終濃度７．２ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）を、メチルグリオキサル（Ｓｉｇｍａ）１００ｍＭと、３７℃で５０時間インキュベートしてＡＧＥを調製した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をメチルグリオキサルの非存在下の、同じ条件下でインキュベートし、対照の調製物として用いた（ＢＳＡ対照）。ＡＧＥおよびＢＳＡ対照を、ＰＤ１０ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（スウェーデン、Ｕｐｐｓａｌａ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で精製して、塩および未反応のカルボニルを除去し、次いでろ過滅菌し、使用するまで−２０℃に保った。
【００８９】
ＡＧＥでの処理
接種２４時間後に、ＡＧＥおよびＢＳＡ対照（最終濃度３μＭ）を、培地に添加した。各細胞タイプを１継代（ＢＲＰでは約７日、ＲＭＣでは約４日）処理した。培地は、２日ごとに新しい培地と交換した。
【００９０】
細胞増殖の測定
処理の終わりに、細胞をトリプシンで回収し、細胞の残渣はリン酸緩衝食塩水（氷冷ＰＢＳ）（Ｓｉｇｍａ）で２回洗浄した。各サンプルに対し、細胞数を求めるために、血球計算機を用いて、１つのアリコートの細胞を計数した。別のアリコートを、Ｂｒａｄｆｏｒｄ技法によりタンパク質を測定するのに使用した。
【００９１】
ガングリオシドの分析
ガングリオシドを代謝標識するために、特異性の高い活性の標識実験（ＧＭ２およびＧＭ１測定実験）に、０．２μＣｉ／ｍｌまたは１μＣｉ／ｍｌの［14Ｃ（Ｕ）］−Ｄ−ガラクトース（３２９．５ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）（マサチューセッツ州、Ｂｏｓｔｏｎ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を培地に一夜加えた。細胞（周皮細胞５〜８×１０5、またはメサンギウム細胞１２〜２０×１０5）を、次いで、トリプシン化により回収し、ＰＢＳ中で３回洗浄した。ガングリオシドを、Ｂｏｕｃｈｏｎら（Ｂｏｕｃｈｏｎら、１９９０年）が記載し、Ｎａｔａｌｉｚｉｏら（Ｎａｔａｌｉｚｉｏら、２００２年）が変更した方法で、細胞残渣から抽出した。簡単に述べると、細胞残渣を、クロロホルム（Ｃ）／メタノール（Ｍ）（１：１、ｖ／ｖ）２ｍｌ中に分散し、激しく混和し、４℃で一夜抽出した。遠心分離後、残渣を同じ溶剤の２ｍｌで２回抽出した。プールした全脂質の抽出物を蒸発により乾燥し、１ｍＭのＣ／Ｍ／ＰＢＳ溶液（１０：１０：７、ｖ／ｖ／ｖ）の助けで分離した。ガングリオシドを含む上相を、次いで、Ｃ１８シリカゲルカラム（マサチューセッツ州、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で脱塩し、ＨＰＴＬＣ（ドイツ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｍｅｒｃｋ）により分析した。プレートを、０．２％Ｃ／Ｍ／ＣａＣｌ2（５５：４５：１０、ｖ／ｖ／ｖ）中で展開した。ガングリオシドは、リンのスクリーンおよびＳｔｏｒｍ ８２０（米国、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてオートラジオグラフィーにより、およびＩｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒ ＶＤＳ−ＣＬ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてレゾルシノール（ガングリオシドに特異的な染色：レゾルシノール０．３％（Ｓｉｇｍａ）、ＣｕＳＯ4０．０３％、ＨＣｌ ３０％）で標識化することにより視覚化した。Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて、定量を行った。ＧＴ１ｂは、ＢＲＰおよびＲＭＣの両方のガングリオシドプロファイルには存在しなかったので、脂質抽出の前に内部標準としてそれをサンプルに加えた。
【００９２】
ＧＭ３合成酵素活性の測定
処理の終わりに、細胞をＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝剤（２０ｍＭカコジル酸ナトリウム、ｐＨ６．６（Ｓｉｇｍａ）、０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０μｌ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤、米国、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）５０μｌ中４℃で２０分間インキュベートし、次いで掻き取って回収した。ＢＲＰの４ディッシュ（約２〜３×１０6細胞）、ＲＭＣの３ディッシュ（約３〜６×１０6細胞）をプールした。細胞溶解物を１００００ｇで５分間遠心分離し、上清のタンパク質を用いてＧＭ３合成酵素活性を測定した。糸球体の残渣を、１ｍＭ ＥＤＴＡおよびプロテアーゼ阻害物質１０μｌ／ｍｌを含む２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ中、シリンジで機械的にホモジナイズした。ホモジネートを、次いで、１０００ｇで２分間遠心分離し、核成分を分画した後の上清を用いてＧＭ３合成酵素活性を測定した。各サンプル（細胞に対し約５００μｇ、および糸球体に対し約１００μｇ）に等量のタンパク質を用いて試験を行った。最終濃度０．１ｍＭのラクトシルセラミド（フランス、Ｍａｒｎｅ ｌａ Ｖａｌｌｅｅ、Ｂｉｏｖａｌｌｅｙ、Ｍａｔｒｅｙａ）、４μＣｉ／ｍｌの［シアリック（ｓｉａｌｉｃ）−４，５，６，７，８，９−14Ｃ］−ＣＭＰ−シアル酸（３２５．２ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１００μＭ ＣＭＰ−シアル酸（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および１００ｍＭカコジル酸ナトリウム、ｐＨ６．６を含む、等体積の反応緩衝剤とサンプルを混合した。撹拌後、反応混合物を３７℃で５０分間インキュベートした。サンプルをシリカゲル６０カラム（Ｍｅｒｃｋ）に添加して、過剰の基質を生成物から分離することにより、反応を停止した。カラムを水で洗浄した後、ガングリオシドをＣ／Ｍ（１：１、ｖ／ｖ）で溶出し、溶剤を窒素下で乾燥させた。最後に、ガングリオシドを薄層クロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ）により分離し、反応生成物をオートラジオグラフィーにより現像した。ＧＭ３合成酵素活性を、生成されたＧＭ３のｐｍｏｌ／ｈ／タンパク質のｍｇで表した。
【００９３】
外因性ガングリオシドでの処理
外因性ガングリオシドのＢＲＰおよびＲＭＣの増殖に対する効果を評価するために、細胞を９６ウェルのプレートで培養した。外因性の糖脂質であるＧＭ３、ＧＭ２、ＧＭ１、およびＧＤ１ａ、グルコシルセラミド、ならびにラクトシルセラミド（Ｍａｔｒｅｙａ）を、完全培地に、ＤＭＥＭ／１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４中１：１の比でＢＳＡと複合した形態で最終濃度５０μＭで加えた。処理の終わりに、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０μｌのＲｉｐａ溶解緩衝液（ＰＢＳ１０ｍＭ、ＮＰ４０ １％（フランス、Ｂｒｅｂｉｅｒｅｓ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｉｅｒｃｅ）、デオキシコール酸ナトリウム０．５％、ＳＤＳ ０．１％、プロテアーゼ阻害物質１０μｌ／ｍｌ）で３７℃で３０分間溶解した。我々の実験における細胞数は全タンパク質濃度と相関しているので（図１を参照されたい）、細胞の増殖を評価するために、ＢＣＡタンパク質試験（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて全タンパク質を測定した。
【００９４】
抗−シリーズａガングリオシド抗体での処理
シリーズａのガングリオシドの潜在的な作用を阻止するために、細胞を９６ウェルのプレート中で培養し、ＡＧＥまたは対照のＢＳＡ３μＭで、５０μｇ／ｍｌの抗−ＧＭ２ポリクローナル抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）または抗−ＧＭ１ポリクローナル抗体（Ｍａｔｒｅｙａ）の存在下または非存在下で処理した。処理の終わりに、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０μｌのＲｉｐａ溶解緩衝液中に溶解し、細胞の増殖を定量するためにタンパク質を測定した。
【００９５】
ＧＭ３合成酵素ｓｉＲＮＡでのＲＭＣの形質移入
ＧＭ３合成酵素の活性を阻止するために、ＲＭＣを６ウェルの培養皿で３０％までのコンフルエンスで培養し、次いで、オリゴフェクタミン試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてラットのｃＤＮＡ配列（英国、Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ、Ａｍｂｉｏｎ）に対してデザインされた、ＧＭ３合成酵素に特異的な干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を形質移入した。用いたＧＭ３合成酵素のアンチセンス配列は、ＧＧＧＵＵＡＵＵＣＵＧＡＡＣＡＵＧＵＵｔｔ（配列番号５）であった。予備実験で、濃度の高いｓｉＲＮＡ（０〜８００ｎＭ）で細胞に形質移入することにより、用量−反応試験を行った。形質移入７２時間後、形質移入された細胞のホモジネートでＧＭ３合成酵素活性を測定した。次いで、ｓｉＲＮＡで形質移入した細胞で、増殖を評価した。この目的では、４００ｎＭのｓｉＲＮＡで形質移入して２４時間後に、細胞を３μＭのＢＳＡ対照またはＡＧＥで（３日）処理した。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、Ｒｉｐａ溶解緩衝剤に溶解し、細胞の増殖を評価するために、タンパク質を測定した。
【００９６】
統計学的分析
データは、平均±ＳＥＭとして表し、対照のパーセント値で表した。細胞の試験では、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位検定を用いて、群間の差の有意性を評価した。マウスに対する実験では、ＧＭ３合成酵素の活性にＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いた。ｐ＜０．０５を、統計学的に有意とみなした。
【００９７】
実施例２−結果
＜１−ＡＧＥは、周皮細胞およびメサンギウム細胞の増殖を阻害する＞
周皮細胞およびメサンギウム細胞の増殖に対するＡＧＥの効果を比較するために、細胞を３μＭの濃度のＢＳＡまたはＡＧＥで４日から７日間処理した。細胞の計数により、ＡＧＥは、周皮細胞およびメサンギウム細胞の数を、それぞれ３３および４０％減少させたことが示された（図１）。全タンパク質も測定し、細胞数と相関して減少したことが見出された。これらの結果はＡＧＥが周皮細胞の増殖にも、メサンギウム細胞の増殖にも同様の有害効果があることを実証し、この結果により本発明者らが、これら両方の細胞タイプでのＡＧＥに対する反応に関与する共通のメカニズムが解明できるようになった。
【００９８】
＜２−ＡＧＥは、周皮細胞およびメサンギウム細胞におけるシリーズａのガングリオシドを増加させる＞
本発明者らの先の結果は、ＡＧＥは、網膜の微小血管細胞におけるガングリオシドのプロファイルを調整することができることを示唆していた（Ｎａｔａｌｉｚｉｏら、２００１年）。ガングリオシドのプロファイルは、ＢＲＰおよびＲＭＣにおけるＢＳＡ対照またはＡＧＥに対する反応について分析した。ガングリオシドのプロファイルは、細胞のタイプに特異的である。対照の条件下では、周皮細胞における主なガングリオシドは、シリーズａのガングリオシドのＧＭ３（検出された全ガングリオシドの６３％）およびＧＭ１（９％）、ならびにシリーズｂのガングリオシドのＧＤ３（２８％）であった。メサンギウム細胞におけるプロファイルは、ＧＤ３（５％）が大変少量であるところが異なり、シリーズａの場合ではＧＤ１ａ（２０％）が存在するところが異なるが、ＧＭ３は依然として主要なガングリオシドであった（７５％）。
【００９９】
シリーズａのガングリオシドの増加、およびシリーズｂのガングリオシドの減少は、ＡＧＥで処理した両方の細胞タイプに観察された（図３）。周皮細胞では、シリーズａのガングリオシドのＧＭ３およびＧＭ１は約４０％増加し、一方シリーズｂのガングリオシドのＧＤ３は２４％減少した（図３Ａ）。メサンギウム細胞では、ＧＭ３は３３％増加したがＧＤ３は３０％減少し、ＧＤ１ａのレベルは影響を受けなかった（図３Ｂ）。同様の結果が、ガラクトースで標識化した後のオートラジオグラフィーにより得られた。ＢＲＰにおけるシリーズａのガングリオシドのＧＭ２、ならびにＲＭＣにおけるＧＭ２およびＧＭ１は、レゾルシノールでの標識化により検出することが難しかったので、細胞を特異的活性の高い［14Ｃ］−Ｄ−ガラクトースで標識し、次いで、対照の細胞およびＡＧＥで処理した細胞でガングリオシドを分析した。結果は、ＢＲＰではＧＭ２が５５％増加し（図３Ｃ）、ＲＭＣではＧＭ２およびＧＭ１が２５から３５％増加した（図３Ｄ）ことを示している。これらの結果は、周皮細胞でもメサンギウム細胞でも、ＡＧＥはガングリオシドのプロファイルに同様の調整を引き起こすことを指摘していた。これらはまた、シリーズａのガングリオシドの増加は、細胞の増殖の低下の根源となる共通の機序であるかもしれないことを示唆している。
【０１００】
＜３−ＡＧＥは周皮細胞およびメサンギウム細胞におけるＧＭ３合成酵素の活性を上昇させる＞
シリーズａのガングリオシドに観察される増加の原因となる機序を説明しようと、シリーズａのガングリオシドの合成の制限的酵素であるＧＭ３合成酵素の活性を、対照の細胞および処理した細胞で測定した。図４に表した結果は、ＡＧＥで処理すると、ほとんどが酵素反応の最大速度を増大させることにより、周皮細胞では約１．８、メサンギウム細胞では約１．５のファクターでＧＭ３合成酵素の活性を上昇させることを示している。これらの結果は、ＡＧＥが、ＧＭ３合成酵素を調節することにより、ＲＭＣおよびＢＲＰに共通の機序を働かせることを示唆している。
【０１０１】
＜４−外因性のシリーズａのガングリオシドは周皮細胞およびメサンギウム細胞の増殖を阻害する＞
本発明者らは、シリーズａのガングリオシドを外因性に添加すると、周皮細胞およびメサンギウム細胞の増殖に影響を及ぼすか否かを試験した。細胞を１継代（ＢＲＰでは７日間、ＲＭＣでは４日間）５０μＭガングリオシドで、ならびに対照として非シアリル化のグルコシルセラミドおよびラクトシルセラミド前駆物質で処理した。図５は、ＧＭ２、ＧＭ１、およびＧＤ１ａが周皮細胞およびメサンギウム細胞の増殖を最も効果的に（約１５から３０％）阻害することを示している。ＧＭ３は周皮細胞の増殖を弱く阻害したが、メサンギウム細胞には著しい効果がなかった。対照として用いたグルコシルセラミドおよびラクトシルセラミドは、効果がなかった。これらの結果は、シリーズａのガングリオシドは、周皮細胞およびメサンギウム細胞の増殖を阻害することを指摘している。特に、ＧＭ２およびＧＭ１は、ＡＧＥに反応してＢＲＰおよびＲＭＣで増加し、これらはこれら両方の細胞タイプの増殖を低下させる。これらのシリーズａのガングリオシドは、したがって、ＡＧＥ効果の共通のメディエーターであり得る。
【０１０２】
＜５−抗−シリーズａのガングリオシド抗体はＡＧＥが引き起こす増殖の阻害から周皮細胞およびメサンギウム細胞を保護する＞
ＧＭ２およびＧＭ１がＡＧＥの効果を媒介するか否かを試験するために、細胞を、抗−ＧＭ１および抗−ＧＭ２抗体の存在下でＡＧＥで処理した。ＢＳＡで処理した対照の細胞では、増殖は、抗−ガングリオシド抗体の存在下または非存在下で異ならなかった。細胞を抗−ＧＭ２および抗−ＧＭ１抗体の存在下でＡＧＥと処理すると、周皮細胞およびメサンギウム細胞の増殖の低下を部分的に防いだ（図６）。外因性ガングリオシドの効果を考えると、これらの所見は、シリーズａのガングリオシド、特にＧＭ１およびＧＭ２は、周皮細胞およびメサンギウム細胞でＡＧＥが引き起こす増殖の阻害の共通のメディエーターであることを示唆している。
【０１０３】
＜６−ＧＭ３合成酵素の活性は糖尿病マウスの糸球体で上昇する＞
ｉｎ ｖｉｖｏでＧＭ３合成酵素の活性に対する糖尿病の環境の効果を評価するために、ｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスモデルの高度に精製した糸球体で酵素活性を測定した。図４Ｂに表した結果は、ＧＭ３合成酵素活性は、対照（ｄｂ／ｍ）に比べて糖尿病細胞の糸球体で５０％上昇したことを示している。
【０１０４】
＜７−ＧＭ３合成酵素ｓｉＲＮＡはＡＧＥが引き起こす効果から部分的に保護する＞
ＡＧＥの効果の媒介におけるシリーズａのガングリオシドの役割をより詳しく解明するために、ＲＭＣをＧＭ３合成酵素ｓｉＲＮＡで形質移入した。予備実験では、ｓｉＲＮＡはＲＭＣにおけるＧＭ３合成酵素の活性を効果的に阻害することが示された。形質移入された細胞および処理された細胞の増殖を、次いで測定した。図８に示すように、ＲＭＣの増殖に対するＡＧＥの効果は、ＧＭ３合成酵素ｓｉＲＮＡで形質移入された細胞において部分的に阻害される。これらの結果は、ガングリオシドがＡＧＥ効果の媒介に関与することを明らかに実証している。効果の部分的な性質は、（ｉ）形質移入の有効性を上げるために細胞をコンフルエンスのより進行したレベルに処理すると、ＡＧＥの効果は前の実験より弱く、（ｉｉ）ＧＭ３合成酵素の活性は５０％だけ阻害されるという事実により説明することができる。
【０１０５】
＜８−ＧＭ３およびＧＤ３合成酵素の活性およびＧＭ３のレベルは、糖尿病マウスの腎皮質で変更される＞
ガングリオシド生合成経路に対する糖尿病の環境の効果をｅｘ ｖｉｖｏで評価するために、ｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスモデルの腎皮質のホモジネートについてＧＭ３およびＧＤ３合成酵素活性を測定した。図９Ａ〜Ｂに表した結果は、糖尿病マウスの腎皮質では、対照（ｄｂ／ｍ）に比べて、ＧＭ３合成酵素の活性は８０％上昇しているが、ＧＤ３合成酵素の活性は５０％低下していることを示している。ガングリオシドも分析し、ｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスの腎皮質におけるＧＭ３レベルが、統計的に有意ではないが上昇することが示された（図９Ｃ）。全般的に、したがって、これらの結果は、ＡＧＥで処理したＲＭＣおよびＢＲＰで得られた結果の生理病理学的意義を実証している。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】ＡＧＥによる周皮細胞（ＢＲＰ）および腎臓のメサンギウム細胞（ＲＭＣ）の増殖の阻害を示すグラフである。
【図２】ｖａｎ Ｅｃｈｔｅｎら（１９９３年）による文献をもとに変更されたガングリオシドの生合成経路を示す図である。
【図３】周皮細胞およびメサンギウム細胞における、ガングリオシドプロファイルの変化を示すグラフである。
【図４】ＡＧＥによって引き起こされた、分離された糸球体および細胞におけるＧＭ３合成酵素活性の上昇を示すグラフである。
【図５】外因性のシリーズａのガングリオシドによって引き起こされる細胞の増殖の阻害を示すグラフである。
【図６】ＡＧＥの効果に対する抗−シリーズａガングリオシドＧＭ２およびＧＭ１抗体の保護作用を示すグラフである。
【図７】シンチグラフィーおよび発光により、反応生成物であるガングリオシドのＧＭ３の検出を結びつける試験による、ＧＭ３合成酵素活性の検出を示す図である。
【図８】ＧＭ３合成酵素ｓｉＲＮＡで形質移入すると、ＲＭＣを保護することを示すグラフである。
【図９】ＧＭ３およびＧＤ３合成酵素の活性、ならびにＧＭ３レベルは、糖尿病マウスの腎皮質で調整されることを示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病の微小血管合併症の処置を目的とする薬物を製造するためのＧＭ３合成酵素阻害剤の使用。
【請求項２】
糖尿病の微小血管合併症が糖尿病性腎症である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
阻害剤が、ＧＭ３合成酵素の遺伝子またはタンパク質の発現の阻害剤である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
阻害剤が、アンチセンス核酸、リボザイム、干渉ＲＮＡ、およびアプタマーを含む群から選択される、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
阻害剤が、高度にストリンジェントな条件下で配列ＩＤ番号１の配列と特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸配列である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
阻害剤が、ＧＭ３合成酵素の活性の阻害剤である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項７】
阻害剤が、ヒトＧＭ３合成酵素に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
少なくとも１つの試験化合物のＧＭ３合成酵素の活性を阻害する能力を評価し、ＧＭ３合成酵素の活性レベルの低下により、糖尿病の微小血管合併症の処置および／または予防に有用な化合物であることが示される、糖尿病の微小血管合併症の処置および／または予防に有用な化合物をスクリーニングし、または同定するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項９】
糖尿病の微小血管合併症が糖尿病性腎症である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記スクリーニング方法が、少なくとも１つの試験化合物をＧＭ３合成酵素を発現する細胞と接触させることと、前記化合物がガングリオシドのＧＭ３の細胞内合成を阻害する能力を判定することとから成るステップを含み、細胞におけるガングリオシドのＧＭ３の合成レベルの低下により、糖尿病の微小血管合併症の処置および／または予防に有用な化合物であることが示される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記スクリーニング方法が、少なくとも１つの試験化合物をＧＭ３合成酵素と接触させることと、前記化合物がシアル酸ドナーからシアル酸アクセプターのガラクトース残基の３−ヒドロキシル基へのシアル酸残基の転移を阻害する能力を判定することとから成るステップを含み、シアル酸転移の活性のレベルの低下により、ＧＭ３合成酵素を阻害し、糖尿病の微小血管合併症の処置および／または予防に有用な化合物であることが示される、請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸からラクトシルセラミドへのシアル酸の転移のレベルを判定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
シアル酸のドナーおよび／またはアクセプターが、検出可能な方法で標識されている、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１】
糖尿病の微小血管合併症の処置を目的とする薬物を製造するためのＧＭ３合成酵素阻害剤の使用。
【請求項２】
糖尿病の微小血管合併症が糖尿病性腎症である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
阻害剤が、ＧＭ３合成酵素の遺伝子またはタンパク質の発現の阻害剤である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
阻害剤が、アンチセンス核酸、リボザイム、干渉ＲＮＡ、およびアプタマーを含む群から選択される、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
阻害剤が、高度にストリンジェントな条件下で配列ＩＤ番号１の配列と特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸配列である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
阻害剤が、ＧＭ３合成酵素の活性の阻害剤である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項７】
阻害剤が、ヒトＧＭ３合成酵素に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
少なくとも１つの試験化合物のＧＭ３合成酵素の活性を阻害する能力を評価し、ＧＭ３合成酵素の活性レベルの低下により、糖尿病の微小血管合併症の処置および／または予防に有用な化合物であることが示される、糖尿病の微小血管合併症の処置および／または予防に有用な化合物をスクリーニングし、または同定するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項９】
糖尿病の微小血管合併症が糖尿病性腎症である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記スクリーニング方法が、少なくとも１つの試験化合物をＧＭ３合成酵素を発現する細胞と接触させることと、前記化合物がガングリオシドのＧＭ３の細胞内合成を阻害する能力を判定することとから成るステップを含み、細胞におけるガングリオシドのＧＭ３の合成レベルの低下により、糖尿病の微小血管合併症の処置および／または予防に有用な化合物であることが示される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記スクリーニング方法が、少なくとも１つの試験化合物をＧＭ３合成酵素と接触させることと、前記化合物がシアル酸ドナーからシアル酸アクセプターのガラクトース残基の３−ヒドロキシル基へのシアル酸残基の転移を阻害する能力を判定することとから成るステップを含み、シアル酸転移の活性のレベルの低下により、ＧＭ３合成酵素を阻害し、糖尿病の微小血管合併症の処置および／または予防に有用な化合物であることが示される、請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸からラクトシルセラミドへのシアル酸の転移のレベルを判定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
シアル酸のドナーおよび／またはアクセプターが、検出可能な方法で標識されている、請求項１１または１２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００７−５３６２９２（Ｐ２００７−５３６２９２Ａ）
【公表日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１１９０４（Ｐ２００７−５１１９０４）
【出願日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００３６４７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０８６００
【国際公開日】平成１７年１１月１７日（２００５．１１．１７）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００３６４７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０８６００
【国際公開日】平成１７年１１月１７日（２００５．１１．１７）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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