胃腸疾患の治療
本発明は、胃腸疾患の予防または治療において使用するための組成物(医薬および栄養製品を含む)に関する。このような組成物は、ジャガイモジュースから誘導できるアルコール可溶性画分の治療上有効な量を含んでなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、胃腸疾患の予防および治療、特に、食用植物由来の抽出物を用いる胃腸疾患の予防および治療に関する。
【背景技術】
【0002】
胃炎は、すべての胃の炎症により引き起こされる種々の異なる状態を含む。炎症は、細菌による感染に起因するものであり得るが、外傷性傷害および特定の鎮痛剤の常用をはじめとするその他の因子もまた胃炎の一因となり得る。
【0003】
胃炎と関連する多数の状態があるにもかかわらず、疾患の兆候や症状は、上腹部における灼熱痛および、時には、腹部膨満、げっぷ、悪心または嘔吐と極めて類似している。いくつかのケースでは、胃炎が潰瘍を招き、胃癌の危険の増大につながる。
【0004】
消化性潰瘍は、胃または十二指腸内層上の痛みである。消化性潰瘍の1つの原因として、細菌感染があるが、いくつかの潰瘍は、アスピリンおよびイブプロフェンのような非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)の長期使用によって引き起こされる。胃または膵臓における癌性腫瘍が潰瘍を引き起こす場合もある。
【0005】
ピロリ菌(H.pylori)は、慢性胃炎の主要な原因であり、胃潰瘍および十二指腸潰瘍の両方の発生において極めて重要な役割を果たす細菌の一種である(1)。ピロリ菌は、胃および十二指腸の保護粘膜被膜を弱め、これによって、酸が感受性内層の真下に通過することが可能となる。酸および細菌の両方が、内層を刺激し、痛みまたは潰瘍を引き起こす。
【0006】
ピロリ菌は、酸を中和する酵素を分泌するために胃酸中で生存することができる。この機序によって、ピロリ菌が「安全な」領域、すなわち保護粘膜内層に進むことが可能となる。細菌のらせん状の形が内層に穴を掘って入り込むのに役立つ。この生物による慢性感染は、胃腺癌および胃リンパ腫の発生の危険の増大と関連している(2)。胃上皮へのピロリ菌の付着は、疾患重症度に影響を及ぼすことがわかっている(3)。IV型分泌系(TFSS)によってコードされるcag病原性アイランドによって、細胞毒関連抗原A(CagA)が宿主細胞へ移動することを促進し、これが、宿主細胞機能の破壊および胃癌発生の危険の増大を引き起こす(4)。そのようなものとして、初期コロニー形成と生存の継続およびその後の宿主病変の発生を伴う増殖の両方にとって、宿主胃粘膜に接着する能力は必要条件である。
【0007】
ピロリ菌感染の治療は、通常、7または10日の3剤併用治療レジーム、例えば、オメプラゾールまたはラベプラゾールなどのプロトンポンプ阻害剤をクラリスロマイシン、メトロニダゾールおよびアモキシシリンなどのよく用いられる抗生物質とともに用いることにより行う(5)。このような治療レジームは、有効ではあるが、コストの視点から、また下痢などの副作用、金属味およびアレルギー反応が起こることがわかっているための両方で望ましくないものであり得る。クラリスロマイシンおよびメトロニダゾールに対する耐性もまた、治療の失敗の主要な原因であり、10〜20%の患者が、治療後に生物を上手く根絶するのに失敗する(6)。この高い失敗率のために、ピロリ菌感染の治療の可能性ある代替物としていくつかの非抗生物質治療が考慮されることとなった(7)。
【0008】
いくつかの報告には、ピロリ菌に対する植物抽出物の活性およびその単離成分が記載されている。例えば、胃炎の治療のためのブロッコリーなどの植物の使用はよく知られている(8)。さらに、ブロッコリーの活性成分、イソチオシアネートスルフォラファンが、抗生物質耐性株を含むピロリ菌に対して活性を示した(9)。さらに、シャロット アリウム・アスカロニカム(Allium ascalonicum)のアルコール抽出物による(10)、ならびにオレガノおよびクランベリーによる(11)ピロリ菌の増殖およびウレアーゼ産生の阻害もわかっている。ピロリ菌に対して毒性を示すことがわかっているその他の植物として、北アメリカの生薬サンギナリア・カナデンシス(Sanguinaria canadensis)およびヒドラスティス・カナデンシス(Hydrastis Canadensis)(12)、アジアの薬草セイロンマツリ(Plumbago zeylanica)(13)、さまざまなギリシャの伝統薬(14)および緑茶抽出物(15)がある。より最近、ある報告書に、ピロリ菌に対するナツメグ、パセリ、タラゴン、ロングペッパー、セージおよびシナモンの抗菌活性が記載された(16)。しかし、これらの料理用および薬用ハーブの多くは、広範なスペクトルの活性を示し、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方に対する毒性が示されている(17)。したがって、このようなハーブおよびその製品の消費もまた、その多くが有益であることがわかっているプロバイオティック微生物叢に対する悪影響を有する可能性がある(18)。したがって、有効であるには、天然抗ピロリ菌物質が、狭いスペクトルの活性を示し、理想的には、ピロリ菌のみに対して選択的であるべきである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
胃腸疾患、特に、胃および十二指腸潰瘍の予防または治療に有用な、代替非抗生物質組成物を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明の第1の態様によれば、ジャガイモジュースにアルコールを添加してアルコール可溶性画分およびアルコール不溶性沈殿物を形成する工程およびアルコール可溶性画分を回収する工程を含んでなる、胃腸疾患の予防または治療において使用するための組成物を作製する方法が提供される。
【0011】
前記方法によって調製される組成物は、胃腸疾患の予防または治療において使用できるアルコール可溶性画分である。沈殿には、エタノールが用いられることが好ましい。画分は、好ましくは、3kDa以上の可溶性画分、最も好ましくは、治療上有効な量のジャガイモジュースから誘導できる500Da以上1kDa以下の可溶性画分を含んでなる。
【0012】
本発明の第2の態様によれば、胃腸疾患の予防または治療用の医薬の製造のための、ジャガイモジュースから誘導できるアルコール可溶性画分の使用が提供される。
【0013】
本発明の第3の態様によれば、胃腸疾患の治療を必要とする患者に、ジャガイモジュースから誘導できるアルコール可溶性画分の治療上有効な量を投与することを含んでなる、胃腸疾患の治療方法が提供される。
【0014】
本発明の第4の態様によれば、アルコールと、3kDa以上、最も好ましくは、500Da以上1kDa以下のジャガイモジュースから誘導できる可溶性画分を含んでなる画分が提供される。
【0015】
アルコールおよびジャガイモジュース画分は、8kDa〜14kDa、特に、10kDa〜12kDaの範囲であることがより好ましい。画分は、pH8で正に帯電していることが好ましい。画分が、少なくともタンパク質またはポリペプチドの部分を含むことが好ましい。画分が、還元糖、タンパク質および第1級アミノ基を有する成分のうち1種以上を含むことが好ましい。
【0016】
本発明の可溶性抽出物は純粋な形であってもよく、あるいは、本発明の抽出物の抗付着特性を阻害しない化合物である限り、それらの化合物と混合してもよい。
【0017】
アルコールの、好ましくはエタノールの可溶性画分は、ピロリ菌に対して殺菌活性を有し、したがって、胃炎および十二指腸潰瘍の予防または治療のために有効性を有することがわかった。さらに、有利なことに、本抽出物は、さまざまなその他の細菌種の生存力に対しては検出可能な効果がなく、したがって、本発明による治療は、残りの正常な宿主の腸管内菌叢に対する副作用ならびに薬物耐性の発生および蔓延に関する問題がない。
【0018】
したがって、本発明の第5の態様は、ジャガイモジュースから誘導できるアルコール可溶性画分を含んでなる抗菌剤を提供する。本抗菌剤は、ピロリ菌に対して特に有効である。
【0019】
本発明のアルコール可溶性抽出物は、その最も簡単な形では、ジャガイモジュースをホモジナイズし、水性上清をデカントし、この上清を遠心分離することによって調製できる。この抽出物を、例えば、標準技術、例えば、減圧下で蒸発させることによって濃縮(concentrated)、濃厚とし(enriched)または凝縮できる。濃縮物の例として、少なくとも2倍濃縮されたもの、より普通には、少なくとも4倍、例えば、少なくとも8倍または少なくとも20倍または少なくとも100倍または少なくとも200倍または少なくとも1000倍濃縮されたものがある。
【0020】
濃縮ジャガイモジュースは、好ましくは、1回以上のアルコールでの沈殿、より好ましくは、少なくとも4回の沈殿に付され、アルコールはエタノールであることが好ましい。少なくとも70%エタノール、特に、96%エタノールが用いられることが好ましい。1容積の濃縮ジャガイモジュースが4容積のエタノールを用いて沈殿に付されることが好ましい。
【0021】
任意の適した方法、例えば、遠心分離または分子量濾過を用いて、水性活性溶液を、不溶性沈殿物から分離できる。
【0022】
本発明の粗ジャガイモジュースは、ジャガイモジュースから、以下の工程のうち1以上によって調製できる:
(a)必要により、新鮮な状態で皮をむいたジャガイモ塊茎の浸軟、
(b)得られた水性ジュースの遠心濾過。
【0023】
適当な有機溶媒が、例えばイオン交換樹脂や、Superdex(商標)等でのさらなるサイズ排除などのクロマトグラフィー手順によるアルコール可溶性画分の精製の補助のために利用される。
【0024】
アルコール可溶性画分は、好ましくは、HPLC分離によって、特に、pH8での陰イオンHPLCに付し、負に帯電している成分を結合し、結合していない成分を回収し、前記の結合していない成分をpH8の陽イオンHPLCで処理して正に帯電している成分を結合し、カラムから正に帯電している成分を溶出し、溶出された画分を精製された抽出物として回収することで更に精製される。
【0025】
本発明の好ましい実施形態では、以下の工程を含む抗菌剤を作製する方法が提供される:
ジャガイモジュースの水性抽出物を調製する工程、
水性抽出物にアルコールを添加して、アルコール可溶性画分およびアルコール不溶性沈殿物を形成する工程、
アルコール可溶性画分を回収する工程、
前記画分を、陰イオン交換樹脂で処理して、負に帯電している成分を結合し、樹脂から結合していない成分を回収する工程と、
前記の結合していない成分を、陽イオン交換樹脂で処理して、正に帯電している成分を前記の樹脂と結合する工程と、
前記の正に帯電している成分を、溶出溶液を用いて前記樹脂から溶出して、抗菌特性を有する溶出物を得る工程と、
前記溶出物を回収、および場合により濃縮する工程。
【0026】
アルコール可溶性画分は、場合により凍結または噴霧乾燥して、本発明の粉末画分を作製する。粗調製物は、実質的に「希釈せずに」用いてもよいし、またはさらに希釈してもよい。この場合には、栄養上の理由、医学的理由のために、またはさらに、治療されている患者による消費のために抽出物の嗜好性を調整する目的で、上清(希釈されていようとなかろうと)に、加えてもよいいくつかのその他の物質を混合してもよい。
【0027】
例えば、抽出物を食品または飲料製品とともに製剤し、胃炎の症状を予防または軽減するためのジャガイモジュースのアルコール可溶性画分を含むという特徴を有する機能性食品として提供できる。例えば、抽出物は、原材料として牛乳を用いる乳製品(例えば、牛乳、ミルクセーキ、ヨーグルト、ヨーグルトドリンクまたは乳製品サプリメント)として製剤し、活性画分を含むことで、胃炎の患者のための飲食物として高度に適するという利点の加わった味の良いドリンク/飲料を得てもよい。当然のことではあるが、抽出物を代替飲料、胃炎を患っている人の所望の選択であることはありそうもないがフルーツジュースなどとしても良いことはいうまでもない。
【0028】
あるいは、粗調製物を、経腸栄養法のための栄養液中に含めてもよい。例えば、アルコール可溶性画分を経腸栄養法患者のための、生理食塩水または水溶液(これにはその他のビタミン、ミネラルおよび栄養物を含めてもよい)と混合してもよい。
【0029】
粗調製物の濃縮が必要な場合もあるし、あるいは、粉末組成物が望ましい場合もある。この場合には、粗抽出物は濃縮/脱水される必要がある。
【0030】
アルコール可溶性画分は、カプセルに組み込むための粉末、顆粒または半固形物として製剤してもよい。半固形の形で提示するために、抽出物を、粘性液体またはポリエチレングリコールなどの半固形ビヒクルまたは例えば、プロピレングリコールもしくはグリセロール等のグリコール類、もしくは例えば、オリーブオイル、ヒマワリ油、サフラワー油、月見草油、ダイズ油、コールドリバーオイル(cold liver oil)、ニシン油などの植物油もしくは魚油から選択されるオイルなどの液体担体に溶解または懸濁することができる。次いで、これを、ハードゼラチンもしくはソフトゼラチンタイプまたはハードもしくはソフトゼラチン等価物製のいずれかのカプセルに詰めてもよく、ソフトゼラチンまたはゲル化が同等なカプセルが、粘性液体または半固形充填物には好ましい。
【0031】
本発明のアルコール可溶性画分を含んでなる粉末は、胃腸疾患、特に、胃および十二指腸潰瘍を予防または治療するために使用できる医薬品または栄養製品を製造するのに特に有用である。
【0032】
凍結乾燥または噴霧乾燥は、本発明の抽出物を含んでなる粉末を製造するための好ましい方法に相当する。噴霧乾燥は、良好な流動特性および迅速溶解特性を有する自由流動性顆粒状粉末混合物をもたらす。
【0033】
粉末抽出物は、透明/半透明な低粘度のドリンク/飲料として再構成できる。上記で論じられるように、水、乳製品または果汁に再構成してもよい。当然のことではあるが、粉末は、小袋に詰められ、必要に応じてまたは望まれる時に患者によってドリンクとして再構成され得る。
【0034】
粉末混合物は、本発明の好ましい実施形態に相当する。このような混合物は、さらなる成分と混合された粉末抽出物(上記のような)を含んでなる。このような成分は、栄養上の理由または医学的理由のために、または嗜好性の改善ために加えられ得る。粉末抽出物は、さまざまな粒径のグラニュー糖と混合し、さまざまな甘みの自由流動性粉末混合物を得てもよい。
【0035】
あるいは、天然甘味料または人工甘味料(例えば、アスパルテーム、サッカリンなど)を、低カロリー/カロリーを抑えた甘味のあるドリンクとしての再構成のために、粉末抽出物と混合してもよい。粉末混合物は、ミネラルサプリメントを含んでなるものであってもよい。ミネラルは、カルシウム、マグネシウム、カリウム、亜鉛、ナトリウム、鉄およびそれらの種々の組み合わせのうちいずれか1種であり得る。
【0036】
粉末混合物はまた、クエン酸バッファーおよびリン酸バッファーなどの緩衝剤および炭酸、例えば、炭酸水素ナトリウムまたはアンモニウムなどの炭酸水素から形成された発泡剤および固体酸、例えば、クエン酸または酸性クエン酸塩を含み得る。
【0037】
アルコール可溶性画分は、栄養補助食品または食品添加物として提供してもよいし、または食品、例えば、機能性食品または栄養補給食品中に組み込んでもよい。このような製品は、主食として、ならびに臨床的必要性があり得る状況下で使用してもよい。
【0038】
粉末は、パンまたはスナック食品バー、例えば、フルーツバー、ナッツバーおよびシリアルバーなどのシリアル製品中に組み込んでもよい。スナック食品バーの形での提示のために、粉末は、日干しトマト、レーズンおよびサルタナなどのドライフルーツ、挽いたナッツまたはオーツ麦およびコムギなどのシリアルから選択される任意の1種以上の成分と混合してもよい。
【0039】
アルコール可溶性画分を、医薬(処方箋を必要とするかどうかは別として)として使用するための医薬品として製剤されることは有利であり好ましい。
【0040】
粉末画分または濃縮液体画分はまた、錠剤、ロゼンジ剤、甘い食べ物またはその他の経口摂取のための食品に組み込んでもよい。また、このような粉末画分または濃縮液体画分は、持続放出カプセル剤や、摂取された後長時間にわたって画分を腸中に放出できるデバイスに組み込んでもよい。
【0041】
本画分はまた、マイクロカプセル化してもよい。例えば、カプセル化は、アルギン酸カルシウムゲルカプセル形成によっても良い。κ−カラゲナン、ジェランガム、ゼラチンおよびデンプンをマイクロカプセル化のための賦形剤として用いてもよい。
【0042】
粗調製物、液体濃縮物、粉末などを、胃炎を治療するための既知治療薬と組み合わせてもよい。そのようなものとして、本発明の抽出物は、極めて有効な併用療法において使用できる。溶液中の抽出繊維は、胃炎を治療するためのその他の治療薬のための理想的なビヒクルとして作用し好ましい。
【0043】
アルコール可溶性画分はまた、プロバイオティック部分を含む併用療法/共生療法に含めてもよい。多数のプロバイオティック混合物内に含まれる細菌は、接着特性を有さず、そのため活性画分を含めることによって影響を受けない。
【0044】
本発明の組成物は、規定濃度の抽出物を含有する単位投与形の形で提供できる。このような単位投与形は、所望のレベルの生物活性を達成するよう選択できる。
【0045】
患者によって必要とされる抽出物の量は、生物活性およびバイオアベイラビリティーによって決まり、生物活性およびバイオアベイラビリティーは、同様に、製剤、投与様式、抽出物の物理化学的特性および単剤療法として用いられるか、併用療法において用いられるかどうかに応じて変わる。通常、ヒト成人の1日用量は、凍結乾燥または噴霧乾燥された(しかし、製剤された)粉末として0.1g〜l00gの間であり、より好ましくは、1日用量は、1g〜30gの間(必要に応じて、例えば、約5g、10gまたは15g)である。
【0046】
抽出物は、錠剤またはカプセル剤などの医薬製剤中に含まれる場合に特に有用である。このような製剤は、バイオアベイラビリティーによってそう指示される場合には、経腸的にコーティングされる必要がある。製薬産業によって従来用いられるような既知手順(例えば、イン・ビボ実験、臨床試験など)を用いて、医薬組成物の特定の処方および正確な治療レジーム(化合物の1日用量および投与頻度など)を確立できる。
【0047】
従来の「栄養補給食品」手順を用いて、アルコール可溶性画分を含んでなる液体ドリンク、粉末混合物および食料品を作製することが好ましい。
【0048】
1日用量は、単回投与として(例えば、経口消費のための毎日の錠剤または単回液体ドリンクとして)投与してよい。あるいは、用いられる抽出物は、1日に2回以上の投与を必要とする場合もある。一例として、0.1〜20gの間の噴霧乾燥抽出物、好ましくは、0.3〜10gの間の噴霧乾燥抽出物、より好ましくは、0.5〜3.0gを含有する100mlのオレンジドリンクを、1日中一定間隔で用いて渇きを癒し、それによって、推奨される用量を送達してもよい。
【0049】
アルコール可溶性ジャガイモ抽出物を補給した栄養製品は、胃炎もしくはその他の胃腸疾患を有する、または胃炎もしくはその他の胃腸疾患を発生する危険のある患者に、本発明の抽出物を提供するための理想的な手段として好ましい。したがって、本発明の第5の態様によれば、ジャガイモジュースから誘導できる、アルコール可溶性画分の治療上有効な量を含んでなる、胃腸疾患の予防または治療において使用するための栄養製品が提供される。
【0050】
本栄養製品は、以下を含み得る:
(a)ジャガイモジュースから誘導できるアルコール可溶性画分を含有し、透明な、低粘度の、水のような、安定な、使用準備のできた、瓶入りの、炭酸ガスを入れた、または炭酸ガスを入れていないドリンク;または再調製のための濃縮された透明な液体、
(b)ジャガイモジュースから誘導できるアルコール可溶性画分を含有し、飲用可能な液体として、水または任意のその他の経口摂取可能な液体で再調製される粉末/顆粒混合物、または
(c)食品(例えば、シリアルまたはチョコレートバー、ロゼンジなど)中に混合された粉末または顆粒混合物。
【0051】
本栄養製品は、上記のとおりであり、また、水溶性ビタミン、さらなるミネラルサプリメント、栄養化合物、抗酸化剤または矯味剤を含んでも、また含まなくても良い。
【図面の簡単な説明】
【0052】
【図1】ジャガイモジュースの殺菌活性を示すグラフである。
【図2】ジャガイモジュースが種々の細菌に対して有する効果を示すグラフである。
【図3】ピロリ菌に対する粗ジャガイモジュース抽出物の抗菌活性に対するpHの影響を示すグラフである。
【図4】ジャガイモジュースの活性に対する模擬消化の影響を示すグラフである。
【図5】エタノールで処理した後のジャガイモジュース(PJ)の活性を示すグラフである。
【図6】EtOH可溶性画分の陰イオン交換HPLCクロマトグラムである。
【図7】陰イオン交換HPLC後のEtOH可溶性画分の活性プロフィールを示すグラフである。
【図8】バルク単離したEtOH可溶性画分の陰イオン交換フロースルー部(flow through)の陽イオン交換HPLCクロマトグラムである。
【図9】EtOH可溶性画分の陰イオン交換フロースルー部の陽イオン交換分離の活性プロフィールを示すグラフである。
【図10】HPLC陽イオン交換分画したEtOH可溶性画分陰イオン交換フロースルー部の抗菌活性および炭水化物濃度を示すグラフである。
【図11】HPLC陽イオン交換分画したEtOH可溶性画分陰イオン交換フロースルー部の抗菌活性およびタンパク質濃度を示すグラフである。
【図12】陽イオン交換分画したEtOH可溶性画分陰イオン交換フロースルー部の画分1〜15のTLCスポット試験である。
【図13a】Gemini C18逆相カラムでの1kDa以下500Da以上の画分のHPLCクロマトグラムである。280nmでのUV検出、1、2:ピーク1および2。
【図13b】Gemini C18逆相カラムでの1kDa以下500Da以上の画分のHPLCクロマトグラムである。350nmでのUV検出。
【図14a】280nmでのピーク1のUVスペクトルである。
【図14b】280nmでのピーク2のUVスペクトルである。
【図15】14〜17分の間に溶出し、350nmで検出した成分、A〜Cのクローズアップ像である:ピークA〜C。
【図16a】350nmでのピークAのUVスペクトルである。
【図16b】350nmでのピークBのUVスペクトルである。
【図16c】250nmでのピークBのUVスペクトルである。
【図17a】350nmでのクロロゲン酸マーカーのHPLCクロマトグラムである。
【図17b】350nmでのクロロゲン酸マーカーのUVスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【0053】
本発明を、以下の添付の図面を参照し、以下の例によってさらに例示する。
本発明者らは、ピロリ菌およびさまざまなその他の細菌種に対してジャガイモジュースが細菌活性を含むかどうかを調べるために研究を実施した。
【0054】
抽出物の調製:
粗ジャガイモジュース:皮をむき、洗浄したジャガイモを秤量し、ブレンダー中で挽き、篩濾過し、8,000〜13,000rpmで5〜20分間遠心分離した。次いで、この可溶性抽出物を、0.22μmメンブランを通して濾過し、この抽出物をさらなる分析のために必要とされるまで80℃で保存した。
【実施例1】
【0055】
ジャガイモジュースを、狭いスペクトラムの活性を有するか、広いスペクトラム の活性を有するかどうかを評価するために、さまざまな細菌に対してアッセイした。
以下の細菌を用いた:ピロリ菌、大腸菌、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、リステリア菌(Listeria monocytogenes)およびネズミチフス菌。ピロリ菌は、5%v/v脱線維素ウマ血液(TCS Biosciences HB035)および0.25% v/vピロリ菌選択的サプリメント(OXOID SR0147E)を含有するコロンビア寒天(OXOID CM331)中、37℃、微好気性条件下で培養した。培養物は、4日毎に新鮮培地に継代した。L.アシドフィルス(acidophilus)保存培養物は、MRS培養液(OXOID CM0359)において微好気性条件下で開始した培養物から50%グリセロール中に調製し、アッセイは、MRS培養液およびMRS寒天(OXOID CM0361)を用いて実施した。すべてのその他の細菌は、Luria−Bertani培養液/寒天で、またはMueller−Hinton培養液/寒天(OXOID CM405)で、37℃で好気的にインキュベートし、実験室のグリセロール保存培養物から開始した。
【0056】
寒天拡散法:
ピロリ菌細胞を、OD600nm=0.25(107cfu/mL)でPBS(pH8)に再懸濁した。すべてのその他の細菌は、PBSでOD625nm=0.1(107〜108cfu/mL)に調整した。
【0057】
それぞれの寒天アッセイプレートを、1mLの微生物懸濁液で浸し、過剰の接種菌液を除去し、プレートを完全に乾燥させ、その後、寒天中にウェル(6.5mm直径)を切り、その中に測定された容積(50〜100μL)のサンプル抽出物を加えた。5μLの0.00021Mテトラサイクリン対照を含めた。次いで、プレートを、3日間インキュベートし、阻害領域をmmで測定した。サンプルは3連でアッセイした。適当なネガティブコントロールをすべての場合に含めた。
【0058】
生菌数アッセイ:
サンプル抽出物の活性を、以下の方法に従って生菌数によって定量的に評価した。微生物懸濁液を上記のように調製し、サンプル抽出物と1:1の比で混合し、次いで、その個々の増殖条件下で90分間インキュベートした。陽性対照には、微生物懸濁液を、PBSと混合した。次いで、サンプルを、生菌数計測のために標準手順により処理した。サンプルは、2連/3連(3回)でアッセイした。適当なネガティブコントロールをすべての場合に含めた。
【0059】
結果から、抽出物は、ピロリ菌を死滅させる一方で、グラム陰性菌大腸菌およびネズミチフス菌に対して、ある程度の毒性を示したが、グラム陽性微生物、例えば、プロバイオティックラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)に対しては注目すべき効果は有していなかったということが示された(図2)。ピロリ菌に対して高い選択性を有するということは、活性成分が、有効な抗ピロリ菌剤としての可能性;その他の腸ミクロフローラに対して有意な副作用を有することなくピロリ菌を死滅させることを示し得ることを示す。
【実施例2】
【0060】
ジャガイモジュースの細菌活性に対するpHの効果を調べた。
ピロリ菌は、胃中の酸性胃環境に効率的にコロニー形成できる唯一の既知微生物であるという意味では独特である(19)。この細菌は、これを行うために、より穏やかなpH範囲を変動し得る酸性胃粘液にコロニー形成する前に、まず、1.4の領域のpH値を示す酸性内腔を通らなくてはならない(20)。したがって、ジャガイモジュースの効力を、有効な抗ピロリ菌剤としてさらに規定するためには、抽出物が、低pH値に曝された場合に、その殺菌活性を維持できるかどうかを証明することが重要である。
【0061】
ジャガイモジュースの10mLの部分を、濃HClを用いて1.0、3.0および5.0のpHに調整し、37℃で連続振盪しながら4時間インキュベートした。次いで、溶液を、5M NaOHを用いて中和し、0.22μmメンブレンを通して濾過し、生菌数法によってピロリ菌に対する抗菌活性についてアッセイした。ネガティブコントロールは、分析サンプルと同一方法で処理した水の10mLの部分からなるものとした。実験は、2連で行い、その各々は3つの複製を含んでいた。
【0062】
この結果から、抽出物は、pH1.0および3.0でその相対毒性を失うのに対し、pH5.0で抽出物は、ネガティブコントロールと比較して、依然として極めて活性であることが示された(図3参照のこと)。
【実施例3】
【0063】
ジャガイモジュースの殺菌活性に対する模擬消化の効果。
活性は、pH5.0で存続し得るということが判明したが(実施例2)、活性が、胃環境をより密接に模倣する系に曝された後に維持され得るかどうかを調べることを決定した。これを行うために、いくつかの改変を加えた公開された手順(21)を用いた。10mLのジャガイモジュースに、37mM NaCl、0.03M HClおよび32mgペプシンを加え、37℃で連続振盪しながら2時間インキュベートした。次いで、5M NaOHを用いて溶液を中和し、0.22μmのメンブランを通して濾過し、生菌数法によってピロリ菌に対する活性についてアッセイした。分析サンプルと同一方法で処理した10mLの水部分をネガティブコントロールとして用いた。各サンプルを、3連でアッセイした。
【0064】
この結果から、ジャガイモジュースが、37mM NaCl、0.03M HClおよび32mgペプシンを加え、37℃で連続振盪しながら2時間インキュベートされても、活性は、対応するネガティブコントロールと比較して維持されることが示された(図4)。ペプシンは、胃中でHClによって活性化される消化酵素であり、フェニルアラニンおよびトリプトファンなどの芳香族アミノ酸のカルボン酸基を選択的に切断する。ジャガイモジュースの場合の曝露は、公開された研究が薬草ラレア・ディバレカタ(Larrea divaricata)の5%w/v抽出物を、上記サプリメントを含有する100mLの模擬胃液に加えていたので、これよりもより激しかったということに留意しなくてはならない。
【実施例4】
【0065】
粗ジャガイモジュース抽出物のEtOH沈殿およびEtOH可溶性画分の陰イオンおよび陽イオンHPLC分画を実施して、画分の抗菌活性を精製した。
粗生成物のEtOH沈殿物:
粗ジャガイモジュース抽出物は、ジャガイモ組織中のポリフェノールオキシダーゼ(PPO)の十分に確立した活性によって形成される高分子量ポリマーの存在のために、暗く、かなりくすんでいた(22)。これがHPLCカラムの背圧の増大につながり、そのため、(a)活性をさらに明確にすることおよび(b)抗菌成分の単離のためにより透明な画分を得ることを目的として、粗抽出物のEtOH沈殿を行うことを決定した。Buiら(23)によって記載される手順をたどった。EtOH沈殿は、生体マトリックスからタンパク質および多糖などの高分子量成分を単離する際に用いられる普通の手順であり、ほとんどの場合、それによって、水性抽出物に数容積のアルコールを加えると、それらが溶液から沈殿する。
【0066】
粗ジャガイモジュースは、先に記載したように10.2kgの材料から調製し、2,441mLの抽出物を得た。この抽出物を凍結乾燥し、水に再懸濁して360mLの濃縮粗ジャガイモジュースを得た。沈殿のために、1溶液のジュースに4容積の96%EtOHを加え、30分間静置した。次いで、溶液を2,500rpmで20分間遠心分離し、これによってEtOH−水可溶性画分およびEtOH不溶性沈殿物を得た。この手順を4回反復し、合わせたEtOH可溶性画分(5.2L)を、±40℃で真空で濃縮乾固し、水に再懸濁し、凍結乾燥し、次いで、水に再懸濁して190mLの濃縮抽出物を得た。EtOH不溶性沈殿物を、水で反復して洗浄し、合わせた上清(1.18L)を凍結乾燥し、50mLの水に再懸濁した。すべてのサンプルは、さらなる分析のために必要とされるまで−80℃で保存した。
【0067】
得られた結果から、粗ジャガイモジュースと比較して、活性の大部分(bulk)は、エタノール可溶性画分中に位置していたということが示された(図5参照のこと)。この画分は黄色であり、自由流動性液体を構成していた。さらに、粗ジュースよりも容易に濾過され得る。EtOH沈殿物自体は暗く、濃縮粗ジャガイモジュースのように塊状であり、このことは、高分子量の暗いポリマーのほとんどがこの画分中に存在することを示した。
【0068】
多糖はEtOH中で不溶性である傾向があるのに対し、プロマリン(promaline)などの特定のタンパク質は、70%EtOHに可溶性であるので、この結果は興味深いものである。偶然にも、この場合における最終EtOH濃度は76%v/vであった。
【0069】
EtOH可溶性画分のイオン交換分離:
タンパク質およびその他の生体分子は、分子が正味電荷を保持しないpHであるPI値として知られる特性を有する。PI値を上回るpHでは、分子は負に帯電しているのに対し、PI値を下回るpHでは、分子は正に帯電している。イオン交換クロマトグラフィーの際には、この特性が利用される。基本的に、イオン交換は、抽出物を正に帯電しているカラム(陰イオン交換)または負に帯電しているカラム(陽イオン交換)に通液し、最初に、それぞれのpHで結合していない物質をTrisまたはMESなどのバッファーを用いて溶出し、次いで、直線塩勾配を導入して、カラムと結合している分子をそれぞれのpHで分離させることを含む。分子は、結合するには、用いられるpHで、カラムのものと反対の正味電荷を有さなくてはならない。
【0070】
UV検出器(215、254および280nm)および伝導率記録計を備えた、ETTAN LC(Amersham Biosciences)で、すべての分離を行った。結果は、Unicorn(商標)ソフトウェアを用いて分析した。
【0071】
陰イオン交換分画のために、用いたカラムは、MonoQ HR 5/5(1mL容量)とした、荷電基:O−CH2−CHOH−CH2−O−CH2−CHOH−CH2−N+(CH3)3。移動相:バッファーA:20mM Tris−HCl(pH8)、バッファーB:2M NaCl中20mM Tris(pH8)。3.5カラム容積の100%バッファーAを用いてカラムを溶出して、結合していない物質を除去し、その後、10カラム容積にわたって0%B〜100%Bに進む直線勾配様式を導入して、結合している物質を置換した。流速は、0.25〜0.4mL/分とした。10〜20の間、各画分の250μLの部分(バッファーA中)を、500μLの注入ループによって送った。30、各実施の0.5mLの画分を回収し、画分複写物をプールし、凍結乾燥し、抗菌活性についてアッセイする前に500μLに再懸濁した。画分8から30をアッセイする前に、製造業者の使用説明書(VIVASCIENCE)に従って、遠心濾過機(MWCO 3 kDa)によって脱塩した。
【0072】
20、各画分(バッファーA中)の250μLの部分を、MonoQカラムで分離し、画分2〜7(陰イオン交換フロースルー部)を合わせて、EtOH可溶性画分の各々の、60mLの単離された陰イオン交換フロースルー部を得た。バルク単離した陰イオン交換フロースルー部を凍結乾燥し、3mLのバッファーAに再懸濁した。EtOH可溶性画分陰イオン交換フロースルー部(3mL)を、以下のように陽イオン交換によって分離した:
【0073】
カラム:MonoS HR 5/5 (1mL)、荷電基:−O−CH2−CHOH−CH2−O−CH2−CHOH−CH2−SO3。移動相:MonoQカラムについて記載したものと同一。流速:0.5mL/分。サンプルは1mL注入ループによって送った。30、各実施および画分1〜30の、0.5mLの画分を回収し、EtOH可溶性画分由来の8〜30を脱塩した。脱塩した画分を、先に記載のとおりに処理した。
【0074】
EtOH可溶性画分の陰イオン交換分離によって、活性の大部分は、フロースルー部中に存在し、したがって、カラムに固着しなかった(図6参照)。さらに、負に帯電している物質を含む画分、画分10〜17(図7)が、画分1〜3、6および7から十分に分離されたので(図7)、ある程度の分離が生じ、これは、ピロリ菌に対する活性を示した。この結果は、pH8.0で抗菌成分は中性または正に帯電していることを示す。しかし、画分1〜7(陰イオン交換フロースルー部)のバルク単離および陽イオン交換による再分離後に、活性成分は、カラムと結合しているようであったが、これは活性が画分11〜14中に存在し、これらが塩勾配の導入後に溶出したからである(図9)。
【0075】
この時点でのNaCl濃度は、307〜721mMの間であった。対応するHPLCクロマトグラム(図8)では、画分12中に、215、254および280nmで吸収する小さなピークがあり、このことは、タンパク質性物質の存在の可能性を示す。全体的に見ると、これらの結果は、pH8.0で抗菌活性が正味の正の荷電を保持することを示す。さらに、これらの結果は、化合物が、UV吸収物質の事実上すべてが溶出されたフロースルー部中に存在しないので、化合物が実質的に精製されたように見えることを示す(図8)。
【実施例5】
【0076】
陽イオン交換分画された抗菌性EtOH可溶性画分陰イオン交換フロースルー部の植物化学分析
抗菌活性は、pH8でMonoQ陰イオン交換カラムに固着せず、したがって、フロースルー部中に存在することが、実施例4においてこれまでに調べられた。次いで、このフロースルー部を、pH8でMonoS陽イオン交換カラムで分画し、それによって活性はカラムと結合した。活性のバルクは、画分11中に存在し、画分12〜15において活性が徐々になくなった。
【0077】
画分1〜15を、還元糖およびタンパク質については、それぞれ、フェノール−硫酸およびBCAアッセイによって、第1級アミン基については、ニンヒドリンを用いるTLCスポット試験によってアッセイした。結果は、以下の表1中に要約されており、添付の図面の図10〜12に示されている。
【0078】
【表1】
【0079】
結果は、抗菌性画分、画分11は、還元糖、タンパク質について陽性と確認され、第1級アミン基(−NH2)を含む成分を含むということを示す。第一級アミン基は、アミノ酸に見られる絶対不可欠な官能基であり、ひいてはタンパク質ならびにアミノ糖中に見られる。
【0080】
生ジャガイモジュースの消費は、胃炎の症状を軽減し得るが、消費される必要があるジャガイモジュースの頻度および量のために、この方法で健康上の利益を最大にすることは不可能であることは明らかである。EtOH可溶性画分の同定および単離によって、ジュースの生物活性部分の濃縮された量が、適した製品(「機能性食品」)中に導入されることが可能となり、ジュースの活性部分が必要な量で消費されることが可能となる。
【実施例6】
【0081】
ジャガイモジュースのEtOH可溶性画分の粉末の調製
ホモジナイズしたジャガイモジュースのEtOH可溶性画分を、上記のように調製し、凍結乾燥して本発明の粉末抽出物を形成した。
【実施例7】
【0082】
EtOH可溶性画分の粉末混合物の調製
3.0gの凍結乾燥した粉末抽出物(実施例2)を、0.5gの粉末クエン酸、26.3gのグラニュー糖および0.2gの矯味剤の標準噴霧乾燥混合物と混合した。
【0083】
この混合物は、小袋に詰めるのに適している、自由流動性粉末製剤(3.0gの活性画分を含有する)である。粉末混合物は、胃炎を患っている患者によって必要とされる場合には、味わいおよび飲むために希釈してもよい。
【実施例8】
【0084】
本発明を使用するオレンジドリンクの調製
(a)100mlの粗調製物を、l00mlの二倍濃縮オレンジジュース(2倍強度に水で希釈したオレンジジュース濃縮物)と混合した。
(b)3.5gの凍結乾燥粉末を、100mlのオレンジジュースに(あるいは、オレンジジュース濃縮物および水とともに)溶解した。
【0085】
オレンジドリンク調製物(aまたはb)は、患者によって、すぐに消費されてもよいし、後の消費のために冷蔵されてもよく、または長い保管期間のためにビンおよび大型容器中に密閉してもよい。
【0086】
オレンジジュースは、味の良い代替物、例えば、ミルクドリンクと容易に置き換えても良い。
【実施例9】
【0087】
1kDa以下500Da以上の画分のHPLCフィンガープリント分析
抗付着画分、すなわち、1kDa以下500Da以上の画分を含む画分を、逆相HPLCによって分析して、HPAEC HPLCクロマトグラムの場合と同様、塩の存在がなく、LC−MS分析に直接的に適している分離を提供した。用いたHPLCカラムは、ジャガイモ中の遊離フェノール性化合物を分離するよう設計されたプログラムを用いる、5μmの粒径を用いるGemini C18250×4.6mm内径カラムであった(24)。
【0088】
移動相は、A=水:メタノール:酢酸(88:10:2)およびB=水:メタノール:酢酸(8:90:2)からなり、9分かけて10%への漸増の勾配のBと、それに続く9〜13分の間の100%Bへの急増を含み、その後、最初の状態に戻った。
【0089】
以下の結果は、1kDa以下500Da以上の画分(すなわち、≦1kDa〜≧500Da)について得られた代表的なトレースを示す(図13a)。280nmでモニターした場合に、いくつかの吸収ピークがあったが、特に、2つ、1および2が分離されているようであった(図13a)。ピーク1および2のUVスペクトルが、図14aおよびbにそれぞれ示されている。これらの化合物は両方とも事実上芳香族であり、プリン、ピリミジンまたは芳香族アミノ酸残基であろう。350nmでは、HPLCクロマトグラムが異なっており(図13b)、成分が14〜17分の間に溶出した。この領域の拡大図(図15)では、いくつかのピークを示した。完全に解明されたわけではないが、ピークA〜Cは、カフェ酸誘導体(図16a〜c)、クロロゲン酸と同一ファミリーに属するフェノール性フェニルプロパノイド(図17aおよびb)、ジャガイモ中の主なフェノールの特徴的なUVスペクトルと判断された。クロロゲン酸マーカーが溶出される15分には顕著なピークは観察されなかった(図17a、b)。
【0090】
したがって、要約すると、1kDa以下500ダルトン以上の画分範囲(≦1kDa〜≧500Da)の画分中に、微量濃度で存在する少なくとも3種のカフェ酸誘導体があり、これらのどれもクロロゲン酸ではない。さらに、この画分中には、いくつかの芳香族成分があり、そのうち2つが分離されているようであった。
【0091】
参照文献
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【技術分野】
【0001】
本発明は、胃腸疾患の予防および治療、特に、食用植物由来の抽出物を用いる胃腸疾患の予防および治療に関する。
【背景技術】
【0002】
胃炎は、すべての胃の炎症により引き起こされる種々の異なる状態を含む。炎症は、細菌による感染に起因するものであり得るが、外傷性傷害および特定の鎮痛剤の常用をはじめとするその他の因子もまた胃炎の一因となり得る。
【0003】
胃炎と関連する多数の状態があるにもかかわらず、疾患の兆候や症状は、上腹部における灼熱痛および、時には、腹部膨満、げっぷ、悪心または嘔吐と極めて類似している。いくつかのケースでは、胃炎が潰瘍を招き、胃癌の危険の増大につながる。
【0004】
消化性潰瘍は、胃または十二指腸内層上の痛みである。消化性潰瘍の1つの原因として、細菌感染があるが、いくつかの潰瘍は、アスピリンおよびイブプロフェンのような非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)の長期使用によって引き起こされる。胃または膵臓における癌性腫瘍が潰瘍を引き起こす場合もある。
【0005】
ピロリ菌(H.pylori)は、慢性胃炎の主要な原因であり、胃潰瘍および十二指腸潰瘍の両方の発生において極めて重要な役割を果たす細菌の一種である(1)。ピロリ菌は、胃および十二指腸の保護粘膜被膜を弱め、これによって、酸が感受性内層の真下に通過することが可能となる。酸および細菌の両方が、内層を刺激し、痛みまたは潰瘍を引き起こす。
【0006】
ピロリ菌は、酸を中和する酵素を分泌するために胃酸中で生存することができる。この機序によって、ピロリ菌が「安全な」領域、すなわち保護粘膜内層に進むことが可能となる。細菌のらせん状の形が内層に穴を掘って入り込むのに役立つ。この生物による慢性感染は、胃腺癌および胃リンパ腫の発生の危険の増大と関連している(2)。胃上皮へのピロリ菌の付着は、疾患重症度に影響を及ぼすことがわかっている(3)。IV型分泌系(TFSS)によってコードされるcag病原性アイランドによって、細胞毒関連抗原A(CagA)が宿主細胞へ移動することを促進し、これが、宿主細胞機能の破壊および胃癌発生の危険の増大を引き起こす(4)。そのようなものとして、初期コロニー形成と生存の継続およびその後の宿主病変の発生を伴う増殖の両方にとって、宿主胃粘膜に接着する能力は必要条件である。
【0007】
ピロリ菌感染の治療は、通常、7または10日の3剤併用治療レジーム、例えば、オメプラゾールまたはラベプラゾールなどのプロトンポンプ阻害剤をクラリスロマイシン、メトロニダゾールおよびアモキシシリンなどのよく用いられる抗生物質とともに用いることにより行う(5)。このような治療レジームは、有効ではあるが、コストの視点から、また下痢などの副作用、金属味およびアレルギー反応が起こることがわかっているための両方で望ましくないものであり得る。クラリスロマイシンおよびメトロニダゾールに対する耐性もまた、治療の失敗の主要な原因であり、10〜20%の患者が、治療後に生物を上手く根絶するのに失敗する(6)。この高い失敗率のために、ピロリ菌感染の治療の可能性ある代替物としていくつかの非抗生物質治療が考慮されることとなった(7)。
【0008】
いくつかの報告には、ピロリ菌に対する植物抽出物の活性およびその単離成分が記載されている。例えば、胃炎の治療のためのブロッコリーなどの植物の使用はよく知られている(8)。さらに、ブロッコリーの活性成分、イソチオシアネートスルフォラファンが、抗生物質耐性株を含むピロリ菌に対して活性を示した(9)。さらに、シャロット アリウム・アスカロニカム(Allium ascalonicum)のアルコール抽出物による(10)、ならびにオレガノおよびクランベリーによる(11)ピロリ菌の増殖およびウレアーゼ産生の阻害もわかっている。ピロリ菌に対して毒性を示すことがわかっているその他の植物として、北アメリカの生薬サンギナリア・カナデンシス(Sanguinaria canadensis)およびヒドラスティス・カナデンシス(Hydrastis Canadensis)(12)、アジアの薬草セイロンマツリ(Plumbago zeylanica)(13)、さまざまなギリシャの伝統薬(14)および緑茶抽出物(15)がある。より最近、ある報告書に、ピロリ菌に対するナツメグ、パセリ、タラゴン、ロングペッパー、セージおよびシナモンの抗菌活性が記載された(16)。しかし、これらの料理用および薬用ハーブの多くは、広範なスペクトルの活性を示し、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方に対する毒性が示されている(17)。したがって、このようなハーブおよびその製品の消費もまた、その多くが有益であることがわかっているプロバイオティック微生物叢に対する悪影響を有する可能性がある(18)。したがって、有効であるには、天然抗ピロリ菌物質が、狭いスペクトルの活性を示し、理想的には、ピロリ菌のみに対して選択的であるべきである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
胃腸疾患、特に、胃および十二指腸潰瘍の予防または治療に有用な、代替非抗生物質組成物を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明の第1の態様によれば、ジャガイモジュースにアルコールを添加してアルコール可溶性画分およびアルコール不溶性沈殿物を形成する工程およびアルコール可溶性画分を回収する工程を含んでなる、胃腸疾患の予防または治療において使用するための組成物を作製する方法が提供される。
【0011】
前記方法によって調製される組成物は、胃腸疾患の予防または治療において使用できるアルコール可溶性画分である。沈殿には、エタノールが用いられることが好ましい。画分は、好ましくは、3kDa以上の可溶性画分、最も好ましくは、治療上有効な量のジャガイモジュースから誘導できる500Da以上1kDa以下の可溶性画分を含んでなる。
【0012】
本発明の第2の態様によれば、胃腸疾患の予防または治療用の医薬の製造のための、ジャガイモジュースから誘導できるアルコール可溶性画分の使用が提供される。
【0013】
本発明の第3の態様によれば、胃腸疾患の治療を必要とする患者に、ジャガイモジュースから誘導できるアルコール可溶性画分の治療上有効な量を投与することを含んでなる、胃腸疾患の治療方法が提供される。
【0014】
本発明の第4の態様によれば、アルコールと、3kDa以上、最も好ましくは、500Da以上1kDa以下のジャガイモジュースから誘導できる可溶性画分を含んでなる画分が提供される。
【0015】
アルコールおよびジャガイモジュース画分は、8kDa〜14kDa、特に、10kDa〜12kDaの範囲であることがより好ましい。画分は、pH8で正に帯電していることが好ましい。画分が、少なくともタンパク質またはポリペプチドの部分を含むことが好ましい。画分が、還元糖、タンパク質および第1級アミノ基を有する成分のうち1種以上を含むことが好ましい。
【0016】
本発明の可溶性抽出物は純粋な形であってもよく、あるいは、本発明の抽出物の抗付着特性を阻害しない化合物である限り、それらの化合物と混合してもよい。
【0017】
アルコールの、好ましくはエタノールの可溶性画分は、ピロリ菌に対して殺菌活性を有し、したがって、胃炎および十二指腸潰瘍の予防または治療のために有効性を有することがわかった。さらに、有利なことに、本抽出物は、さまざまなその他の細菌種の生存力に対しては検出可能な効果がなく、したがって、本発明による治療は、残りの正常な宿主の腸管内菌叢に対する副作用ならびに薬物耐性の発生および蔓延に関する問題がない。
【0018】
したがって、本発明の第5の態様は、ジャガイモジュースから誘導できるアルコール可溶性画分を含んでなる抗菌剤を提供する。本抗菌剤は、ピロリ菌に対して特に有効である。
【0019】
本発明のアルコール可溶性抽出物は、その最も簡単な形では、ジャガイモジュースをホモジナイズし、水性上清をデカントし、この上清を遠心分離することによって調製できる。この抽出物を、例えば、標準技術、例えば、減圧下で蒸発させることによって濃縮(concentrated)、濃厚とし(enriched)または凝縮できる。濃縮物の例として、少なくとも2倍濃縮されたもの、より普通には、少なくとも4倍、例えば、少なくとも8倍または少なくとも20倍または少なくとも100倍または少なくとも200倍または少なくとも1000倍濃縮されたものがある。
【0020】
濃縮ジャガイモジュースは、好ましくは、1回以上のアルコールでの沈殿、より好ましくは、少なくとも4回の沈殿に付され、アルコールはエタノールであることが好ましい。少なくとも70%エタノール、特に、96%エタノールが用いられることが好ましい。1容積の濃縮ジャガイモジュースが4容積のエタノールを用いて沈殿に付されることが好ましい。
【0021】
任意の適した方法、例えば、遠心分離または分子量濾過を用いて、水性活性溶液を、不溶性沈殿物から分離できる。
【0022】
本発明の粗ジャガイモジュースは、ジャガイモジュースから、以下の工程のうち1以上によって調製できる:
(a)必要により、新鮮な状態で皮をむいたジャガイモ塊茎の浸軟、
(b)得られた水性ジュースの遠心濾過。
【0023】
適当な有機溶媒が、例えばイオン交換樹脂や、Superdex(商標)等でのさらなるサイズ排除などのクロマトグラフィー手順によるアルコール可溶性画分の精製の補助のために利用される。
【0024】
アルコール可溶性画分は、好ましくは、HPLC分離によって、特に、pH8での陰イオンHPLCに付し、負に帯電している成分を結合し、結合していない成分を回収し、前記の結合していない成分をpH8の陽イオンHPLCで処理して正に帯電している成分を結合し、カラムから正に帯電している成分を溶出し、溶出された画分を精製された抽出物として回収することで更に精製される。
【0025】
本発明の好ましい実施形態では、以下の工程を含む抗菌剤を作製する方法が提供される:
ジャガイモジュースの水性抽出物を調製する工程、
水性抽出物にアルコールを添加して、アルコール可溶性画分およびアルコール不溶性沈殿物を形成する工程、
アルコール可溶性画分を回収する工程、
前記画分を、陰イオン交換樹脂で処理して、負に帯電している成分を結合し、樹脂から結合していない成分を回収する工程と、
前記の結合していない成分を、陽イオン交換樹脂で処理して、正に帯電している成分を前記の樹脂と結合する工程と、
前記の正に帯電している成分を、溶出溶液を用いて前記樹脂から溶出して、抗菌特性を有する溶出物を得る工程と、
前記溶出物を回収、および場合により濃縮する工程。
【0026】
アルコール可溶性画分は、場合により凍結または噴霧乾燥して、本発明の粉末画分を作製する。粗調製物は、実質的に「希釈せずに」用いてもよいし、またはさらに希釈してもよい。この場合には、栄養上の理由、医学的理由のために、またはさらに、治療されている患者による消費のために抽出物の嗜好性を調整する目的で、上清(希釈されていようとなかろうと)に、加えてもよいいくつかのその他の物質を混合してもよい。
【0027】
例えば、抽出物を食品または飲料製品とともに製剤し、胃炎の症状を予防または軽減するためのジャガイモジュースのアルコール可溶性画分を含むという特徴を有する機能性食品として提供できる。例えば、抽出物は、原材料として牛乳を用いる乳製品(例えば、牛乳、ミルクセーキ、ヨーグルト、ヨーグルトドリンクまたは乳製品サプリメント)として製剤し、活性画分を含むことで、胃炎の患者のための飲食物として高度に適するという利点の加わった味の良いドリンク/飲料を得てもよい。当然のことではあるが、抽出物を代替飲料、胃炎を患っている人の所望の選択であることはありそうもないがフルーツジュースなどとしても良いことはいうまでもない。
【0028】
あるいは、粗調製物を、経腸栄養法のための栄養液中に含めてもよい。例えば、アルコール可溶性画分を経腸栄養法患者のための、生理食塩水または水溶液(これにはその他のビタミン、ミネラルおよび栄養物を含めてもよい)と混合してもよい。
【0029】
粗調製物の濃縮が必要な場合もあるし、あるいは、粉末組成物が望ましい場合もある。この場合には、粗抽出物は濃縮/脱水される必要がある。
【0030】
アルコール可溶性画分は、カプセルに組み込むための粉末、顆粒または半固形物として製剤してもよい。半固形の形で提示するために、抽出物を、粘性液体またはポリエチレングリコールなどの半固形ビヒクルまたは例えば、プロピレングリコールもしくはグリセロール等のグリコール類、もしくは例えば、オリーブオイル、ヒマワリ油、サフラワー油、月見草油、ダイズ油、コールドリバーオイル(cold liver oil)、ニシン油などの植物油もしくは魚油から選択されるオイルなどの液体担体に溶解または懸濁することができる。次いで、これを、ハードゼラチンもしくはソフトゼラチンタイプまたはハードもしくはソフトゼラチン等価物製のいずれかのカプセルに詰めてもよく、ソフトゼラチンまたはゲル化が同等なカプセルが、粘性液体または半固形充填物には好ましい。
【0031】
本発明のアルコール可溶性画分を含んでなる粉末は、胃腸疾患、特に、胃および十二指腸潰瘍を予防または治療するために使用できる医薬品または栄養製品を製造するのに特に有用である。
【0032】
凍結乾燥または噴霧乾燥は、本発明の抽出物を含んでなる粉末を製造するための好ましい方法に相当する。噴霧乾燥は、良好な流動特性および迅速溶解特性を有する自由流動性顆粒状粉末混合物をもたらす。
【0033】
粉末抽出物は、透明/半透明な低粘度のドリンク/飲料として再構成できる。上記で論じられるように、水、乳製品または果汁に再構成してもよい。当然のことではあるが、粉末は、小袋に詰められ、必要に応じてまたは望まれる時に患者によってドリンクとして再構成され得る。
【0034】
粉末混合物は、本発明の好ましい実施形態に相当する。このような混合物は、さらなる成分と混合された粉末抽出物(上記のような)を含んでなる。このような成分は、栄養上の理由または医学的理由のために、または嗜好性の改善ために加えられ得る。粉末抽出物は、さまざまな粒径のグラニュー糖と混合し、さまざまな甘みの自由流動性粉末混合物を得てもよい。
【0035】
あるいは、天然甘味料または人工甘味料(例えば、アスパルテーム、サッカリンなど)を、低カロリー/カロリーを抑えた甘味のあるドリンクとしての再構成のために、粉末抽出物と混合してもよい。粉末混合物は、ミネラルサプリメントを含んでなるものであってもよい。ミネラルは、カルシウム、マグネシウム、カリウム、亜鉛、ナトリウム、鉄およびそれらの種々の組み合わせのうちいずれか1種であり得る。
【0036】
粉末混合物はまた、クエン酸バッファーおよびリン酸バッファーなどの緩衝剤および炭酸、例えば、炭酸水素ナトリウムまたはアンモニウムなどの炭酸水素から形成された発泡剤および固体酸、例えば、クエン酸または酸性クエン酸塩を含み得る。
【0037】
アルコール可溶性画分は、栄養補助食品または食品添加物として提供してもよいし、または食品、例えば、機能性食品または栄養補給食品中に組み込んでもよい。このような製品は、主食として、ならびに臨床的必要性があり得る状況下で使用してもよい。
【0038】
粉末は、パンまたはスナック食品バー、例えば、フルーツバー、ナッツバーおよびシリアルバーなどのシリアル製品中に組み込んでもよい。スナック食品バーの形での提示のために、粉末は、日干しトマト、レーズンおよびサルタナなどのドライフルーツ、挽いたナッツまたはオーツ麦およびコムギなどのシリアルから選択される任意の1種以上の成分と混合してもよい。
【0039】
アルコール可溶性画分を、医薬(処方箋を必要とするかどうかは別として)として使用するための医薬品として製剤されることは有利であり好ましい。
【0040】
粉末画分または濃縮液体画分はまた、錠剤、ロゼンジ剤、甘い食べ物またはその他の経口摂取のための食品に組み込んでもよい。また、このような粉末画分または濃縮液体画分は、持続放出カプセル剤や、摂取された後長時間にわたって画分を腸中に放出できるデバイスに組み込んでもよい。
【0041】
本画分はまた、マイクロカプセル化してもよい。例えば、カプセル化は、アルギン酸カルシウムゲルカプセル形成によっても良い。κ−カラゲナン、ジェランガム、ゼラチンおよびデンプンをマイクロカプセル化のための賦形剤として用いてもよい。
【0042】
粗調製物、液体濃縮物、粉末などを、胃炎を治療するための既知治療薬と組み合わせてもよい。そのようなものとして、本発明の抽出物は、極めて有効な併用療法において使用できる。溶液中の抽出繊維は、胃炎を治療するためのその他の治療薬のための理想的なビヒクルとして作用し好ましい。
【0043】
アルコール可溶性画分はまた、プロバイオティック部分を含む併用療法/共生療法に含めてもよい。多数のプロバイオティック混合物内に含まれる細菌は、接着特性を有さず、そのため活性画分を含めることによって影響を受けない。
【0044】
本発明の組成物は、規定濃度の抽出物を含有する単位投与形の形で提供できる。このような単位投与形は、所望のレベルの生物活性を達成するよう選択できる。
【0045】
患者によって必要とされる抽出物の量は、生物活性およびバイオアベイラビリティーによって決まり、生物活性およびバイオアベイラビリティーは、同様に、製剤、投与様式、抽出物の物理化学的特性および単剤療法として用いられるか、併用療法において用いられるかどうかに応じて変わる。通常、ヒト成人の1日用量は、凍結乾燥または噴霧乾燥された(しかし、製剤された)粉末として0.1g〜l00gの間であり、より好ましくは、1日用量は、1g〜30gの間(必要に応じて、例えば、約5g、10gまたは15g)である。
【0046】
抽出物は、錠剤またはカプセル剤などの医薬製剤中に含まれる場合に特に有用である。このような製剤は、バイオアベイラビリティーによってそう指示される場合には、経腸的にコーティングされる必要がある。製薬産業によって従来用いられるような既知手順(例えば、イン・ビボ実験、臨床試験など)を用いて、医薬組成物の特定の処方および正確な治療レジーム(化合物の1日用量および投与頻度など)を確立できる。
【0047】
従来の「栄養補給食品」手順を用いて、アルコール可溶性画分を含んでなる液体ドリンク、粉末混合物および食料品を作製することが好ましい。
【0048】
1日用量は、単回投与として(例えば、経口消費のための毎日の錠剤または単回液体ドリンクとして)投与してよい。あるいは、用いられる抽出物は、1日に2回以上の投与を必要とする場合もある。一例として、0.1〜20gの間の噴霧乾燥抽出物、好ましくは、0.3〜10gの間の噴霧乾燥抽出物、より好ましくは、0.5〜3.0gを含有する100mlのオレンジドリンクを、1日中一定間隔で用いて渇きを癒し、それによって、推奨される用量を送達してもよい。
【0049】
アルコール可溶性ジャガイモ抽出物を補給した栄養製品は、胃炎もしくはその他の胃腸疾患を有する、または胃炎もしくはその他の胃腸疾患を発生する危険のある患者に、本発明の抽出物を提供するための理想的な手段として好ましい。したがって、本発明の第5の態様によれば、ジャガイモジュースから誘導できる、アルコール可溶性画分の治療上有効な量を含んでなる、胃腸疾患の予防または治療において使用するための栄養製品が提供される。
【0050】
本栄養製品は、以下を含み得る:
(a)ジャガイモジュースから誘導できるアルコール可溶性画分を含有し、透明な、低粘度の、水のような、安定な、使用準備のできた、瓶入りの、炭酸ガスを入れた、または炭酸ガスを入れていないドリンク;または再調製のための濃縮された透明な液体、
(b)ジャガイモジュースから誘導できるアルコール可溶性画分を含有し、飲用可能な液体として、水または任意のその他の経口摂取可能な液体で再調製される粉末/顆粒混合物、または
(c)食品(例えば、シリアルまたはチョコレートバー、ロゼンジなど)中に混合された粉末または顆粒混合物。
【0051】
本栄養製品は、上記のとおりであり、また、水溶性ビタミン、さらなるミネラルサプリメント、栄養化合物、抗酸化剤または矯味剤を含んでも、また含まなくても良い。
【図面の簡単な説明】
【0052】
【図1】ジャガイモジュースの殺菌活性を示すグラフである。
【図2】ジャガイモジュースが種々の細菌に対して有する効果を示すグラフである。
【図3】ピロリ菌に対する粗ジャガイモジュース抽出物の抗菌活性に対するpHの影響を示すグラフである。
【図4】ジャガイモジュースの活性に対する模擬消化の影響を示すグラフである。
【図5】エタノールで処理した後のジャガイモジュース(PJ)の活性を示すグラフである。
【図6】EtOH可溶性画分の陰イオン交換HPLCクロマトグラムである。
【図7】陰イオン交換HPLC後のEtOH可溶性画分の活性プロフィールを示すグラフである。
【図8】バルク単離したEtOH可溶性画分の陰イオン交換フロースルー部(flow through)の陽イオン交換HPLCクロマトグラムである。
【図9】EtOH可溶性画分の陰イオン交換フロースルー部の陽イオン交換分離の活性プロフィールを示すグラフである。
【図10】HPLC陽イオン交換分画したEtOH可溶性画分陰イオン交換フロースルー部の抗菌活性および炭水化物濃度を示すグラフである。
【図11】HPLC陽イオン交換分画したEtOH可溶性画分陰イオン交換フロースルー部の抗菌活性およびタンパク質濃度を示すグラフである。
【図12】陽イオン交換分画したEtOH可溶性画分陰イオン交換フロースルー部の画分1〜15のTLCスポット試験である。
【図13a】Gemini C18逆相カラムでの1kDa以下500Da以上の画分のHPLCクロマトグラムである。280nmでのUV検出、1、2:ピーク1および2。
【図13b】Gemini C18逆相カラムでの1kDa以下500Da以上の画分のHPLCクロマトグラムである。350nmでのUV検出。
【図14a】280nmでのピーク1のUVスペクトルである。
【図14b】280nmでのピーク2のUVスペクトルである。
【図15】14〜17分の間に溶出し、350nmで検出した成分、A〜Cのクローズアップ像である:ピークA〜C。
【図16a】350nmでのピークAのUVスペクトルである。
【図16b】350nmでのピークBのUVスペクトルである。
【図16c】250nmでのピークBのUVスペクトルである。
【図17a】350nmでのクロロゲン酸マーカーのHPLCクロマトグラムである。
【図17b】350nmでのクロロゲン酸マーカーのUVスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【0053】
本発明を、以下の添付の図面を参照し、以下の例によってさらに例示する。
本発明者らは、ピロリ菌およびさまざまなその他の細菌種に対してジャガイモジュースが細菌活性を含むかどうかを調べるために研究を実施した。
【0054】
抽出物の調製:
粗ジャガイモジュース:皮をむき、洗浄したジャガイモを秤量し、ブレンダー中で挽き、篩濾過し、8,000〜13,000rpmで5〜20分間遠心分離した。次いで、この可溶性抽出物を、0.22μmメンブランを通して濾過し、この抽出物をさらなる分析のために必要とされるまで80℃で保存した。
【実施例1】
【0055】
ジャガイモジュースを、狭いスペクトラムの活性を有するか、広いスペクトラム の活性を有するかどうかを評価するために、さまざまな細菌に対してアッセイした。
以下の細菌を用いた:ピロリ菌、大腸菌、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、リステリア菌(Listeria monocytogenes)およびネズミチフス菌。ピロリ菌は、5%v/v脱線維素ウマ血液(TCS Biosciences HB035)および0.25% v/vピロリ菌選択的サプリメント(OXOID SR0147E)を含有するコロンビア寒天(OXOID CM331)中、37℃、微好気性条件下で培養した。培養物は、4日毎に新鮮培地に継代した。L.アシドフィルス(acidophilus)保存培養物は、MRS培養液(OXOID CM0359)において微好気性条件下で開始した培養物から50%グリセロール中に調製し、アッセイは、MRS培養液およびMRS寒天(OXOID CM0361)を用いて実施した。すべてのその他の細菌は、Luria−Bertani培養液/寒天で、またはMueller−Hinton培養液/寒天(OXOID CM405)で、37℃で好気的にインキュベートし、実験室のグリセロール保存培養物から開始した。
【0056】
寒天拡散法:
ピロリ菌細胞を、OD600nm=0.25(107cfu/mL)でPBS(pH8)に再懸濁した。すべてのその他の細菌は、PBSでOD625nm=0.1(107〜108cfu/mL)に調整した。
【0057】
それぞれの寒天アッセイプレートを、1mLの微生物懸濁液で浸し、過剰の接種菌液を除去し、プレートを完全に乾燥させ、その後、寒天中にウェル(6.5mm直径)を切り、その中に測定された容積(50〜100μL)のサンプル抽出物を加えた。5μLの0.00021Mテトラサイクリン対照を含めた。次いで、プレートを、3日間インキュベートし、阻害領域をmmで測定した。サンプルは3連でアッセイした。適当なネガティブコントロールをすべての場合に含めた。
【0058】
生菌数アッセイ:
サンプル抽出物の活性を、以下の方法に従って生菌数によって定量的に評価した。微生物懸濁液を上記のように調製し、サンプル抽出物と1:1の比で混合し、次いで、その個々の増殖条件下で90分間インキュベートした。陽性対照には、微生物懸濁液を、PBSと混合した。次いで、サンプルを、生菌数計測のために標準手順により処理した。サンプルは、2連/3連(3回)でアッセイした。適当なネガティブコントロールをすべての場合に含めた。
【0059】
結果から、抽出物は、ピロリ菌を死滅させる一方で、グラム陰性菌大腸菌およびネズミチフス菌に対して、ある程度の毒性を示したが、グラム陽性微生物、例えば、プロバイオティックラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)に対しては注目すべき効果は有していなかったということが示された(図2)。ピロリ菌に対して高い選択性を有するということは、活性成分が、有効な抗ピロリ菌剤としての可能性;その他の腸ミクロフローラに対して有意な副作用を有することなくピロリ菌を死滅させることを示し得ることを示す。
【実施例2】
【0060】
ジャガイモジュースの細菌活性に対するpHの効果を調べた。
ピロリ菌は、胃中の酸性胃環境に効率的にコロニー形成できる唯一の既知微生物であるという意味では独特である(19)。この細菌は、これを行うために、より穏やかなpH範囲を変動し得る酸性胃粘液にコロニー形成する前に、まず、1.4の領域のpH値を示す酸性内腔を通らなくてはならない(20)。したがって、ジャガイモジュースの効力を、有効な抗ピロリ菌剤としてさらに規定するためには、抽出物が、低pH値に曝された場合に、その殺菌活性を維持できるかどうかを証明することが重要である。
【0061】
ジャガイモジュースの10mLの部分を、濃HClを用いて1.0、3.0および5.0のpHに調整し、37℃で連続振盪しながら4時間インキュベートした。次いで、溶液を、5M NaOHを用いて中和し、0.22μmメンブレンを通して濾過し、生菌数法によってピロリ菌に対する抗菌活性についてアッセイした。ネガティブコントロールは、分析サンプルと同一方法で処理した水の10mLの部分からなるものとした。実験は、2連で行い、その各々は3つの複製を含んでいた。
【0062】
この結果から、抽出物は、pH1.0および3.0でその相対毒性を失うのに対し、pH5.0で抽出物は、ネガティブコントロールと比較して、依然として極めて活性であることが示された(図3参照のこと)。
【実施例3】
【0063】
ジャガイモジュースの殺菌活性に対する模擬消化の効果。
活性は、pH5.0で存続し得るということが判明したが(実施例2)、活性が、胃環境をより密接に模倣する系に曝された後に維持され得るかどうかを調べることを決定した。これを行うために、いくつかの改変を加えた公開された手順(21)を用いた。10mLのジャガイモジュースに、37mM NaCl、0.03M HClおよび32mgペプシンを加え、37℃で連続振盪しながら2時間インキュベートした。次いで、5M NaOHを用いて溶液を中和し、0.22μmのメンブランを通して濾過し、生菌数法によってピロリ菌に対する活性についてアッセイした。分析サンプルと同一方法で処理した10mLの水部分をネガティブコントロールとして用いた。各サンプルを、3連でアッセイした。
【0064】
この結果から、ジャガイモジュースが、37mM NaCl、0.03M HClおよび32mgペプシンを加え、37℃で連続振盪しながら2時間インキュベートされても、活性は、対応するネガティブコントロールと比較して維持されることが示された(図4)。ペプシンは、胃中でHClによって活性化される消化酵素であり、フェニルアラニンおよびトリプトファンなどの芳香族アミノ酸のカルボン酸基を選択的に切断する。ジャガイモジュースの場合の曝露は、公開された研究が薬草ラレア・ディバレカタ(Larrea divaricata)の5%w/v抽出物を、上記サプリメントを含有する100mLの模擬胃液に加えていたので、これよりもより激しかったということに留意しなくてはならない。
【実施例4】
【0065】
粗ジャガイモジュース抽出物のEtOH沈殿およびEtOH可溶性画分の陰イオンおよび陽イオンHPLC分画を実施して、画分の抗菌活性を精製した。
粗生成物のEtOH沈殿物:
粗ジャガイモジュース抽出物は、ジャガイモ組織中のポリフェノールオキシダーゼ(PPO)の十分に確立した活性によって形成される高分子量ポリマーの存在のために、暗く、かなりくすんでいた(22)。これがHPLCカラムの背圧の増大につながり、そのため、(a)活性をさらに明確にすることおよび(b)抗菌成分の単離のためにより透明な画分を得ることを目的として、粗抽出物のEtOH沈殿を行うことを決定した。Buiら(23)によって記載される手順をたどった。EtOH沈殿は、生体マトリックスからタンパク質および多糖などの高分子量成分を単離する際に用いられる普通の手順であり、ほとんどの場合、それによって、水性抽出物に数容積のアルコールを加えると、それらが溶液から沈殿する。
【0066】
粗ジャガイモジュースは、先に記載したように10.2kgの材料から調製し、2,441mLの抽出物を得た。この抽出物を凍結乾燥し、水に再懸濁して360mLの濃縮粗ジャガイモジュースを得た。沈殿のために、1溶液のジュースに4容積の96%EtOHを加え、30分間静置した。次いで、溶液を2,500rpmで20分間遠心分離し、これによってEtOH−水可溶性画分およびEtOH不溶性沈殿物を得た。この手順を4回反復し、合わせたEtOH可溶性画分(5.2L)を、±40℃で真空で濃縮乾固し、水に再懸濁し、凍結乾燥し、次いで、水に再懸濁して190mLの濃縮抽出物を得た。EtOH不溶性沈殿物を、水で反復して洗浄し、合わせた上清(1.18L)を凍結乾燥し、50mLの水に再懸濁した。すべてのサンプルは、さらなる分析のために必要とされるまで−80℃で保存した。
【0067】
得られた結果から、粗ジャガイモジュースと比較して、活性の大部分(bulk)は、エタノール可溶性画分中に位置していたということが示された(図5参照のこと)。この画分は黄色であり、自由流動性液体を構成していた。さらに、粗ジュースよりも容易に濾過され得る。EtOH沈殿物自体は暗く、濃縮粗ジャガイモジュースのように塊状であり、このことは、高分子量の暗いポリマーのほとんどがこの画分中に存在することを示した。
【0068】
多糖はEtOH中で不溶性である傾向があるのに対し、プロマリン(promaline)などの特定のタンパク質は、70%EtOHに可溶性であるので、この結果は興味深いものである。偶然にも、この場合における最終EtOH濃度は76%v/vであった。
【0069】
EtOH可溶性画分のイオン交換分離:
タンパク質およびその他の生体分子は、分子が正味電荷を保持しないpHであるPI値として知られる特性を有する。PI値を上回るpHでは、分子は負に帯電しているのに対し、PI値を下回るpHでは、分子は正に帯電している。イオン交換クロマトグラフィーの際には、この特性が利用される。基本的に、イオン交換は、抽出物を正に帯電しているカラム(陰イオン交換)または負に帯電しているカラム(陽イオン交換)に通液し、最初に、それぞれのpHで結合していない物質をTrisまたはMESなどのバッファーを用いて溶出し、次いで、直線塩勾配を導入して、カラムと結合している分子をそれぞれのpHで分離させることを含む。分子は、結合するには、用いられるpHで、カラムのものと反対の正味電荷を有さなくてはならない。
【0070】
UV検出器(215、254および280nm)および伝導率記録計を備えた、ETTAN LC(Amersham Biosciences)で、すべての分離を行った。結果は、Unicorn(商標)ソフトウェアを用いて分析した。
【0071】
陰イオン交換分画のために、用いたカラムは、MonoQ HR 5/5(1mL容量)とした、荷電基:O−CH2−CHOH−CH2−O−CH2−CHOH−CH2−N+(CH3)3。移動相:バッファーA:20mM Tris−HCl(pH8)、バッファーB:2M NaCl中20mM Tris(pH8)。3.5カラム容積の100%バッファーAを用いてカラムを溶出して、結合していない物質を除去し、その後、10カラム容積にわたって0%B〜100%Bに進む直線勾配様式を導入して、結合している物質を置換した。流速は、0.25〜0.4mL/分とした。10〜20の間、各画分の250μLの部分(バッファーA中)を、500μLの注入ループによって送った。30、各実施の0.5mLの画分を回収し、画分複写物をプールし、凍結乾燥し、抗菌活性についてアッセイする前に500μLに再懸濁した。画分8から30をアッセイする前に、製造業者の使用説明書(VIVASCIENCE)に従って、遠心濾過機(MWCO 3 kDa)によって脱塩した。
【0072】
20、各画分(バッファーA中)の250μLの部分を、MonoQカラムで分離し、画分2〜7(陰イオン交換フロースルー部)を合わせて、EtOH可溶性画分の各々の、60mLの単離された陰イオン交換フロースルー部を得た。バルク単離した陰イオン交換フロースルー部を凍結乾燥し、3mLのバッファーAに再懸濁した。EtOH可溶性画分陰イオン交換フロースルー部(3mL)を、以下のように陽イオン交換によって分離した:
【0073】
カラム:MonoS HR 5/5 (1mL)、荷電基:−O−CH2−CHOH−CH2−O−CH2−CHOH−CH2−SO3。移動相:MonoQカラムについて記載したものと同一。流速:0.5mL/分。サンプルは1mL注入ループによって送った。30、各実施および画分1〜30の、0.5mLの画分を回収し、EtOH可溶性画分由来の8〜30を脱塩した。脱塩した画分を、先に記載のとおりに処理した。
【0074】
EtOH可溶性画分の陰イオン交換分離によって、活性の大部分は、フロースルー部中に存在し、したがって、カラムに固着しなかった(図6参照)。さらに、負に帯電している物質を含む画分、画分10〜17(図7)が、画分1〜3、6および7から十分に分離されたので(図7)、ある程度の分離が生じ、これは、ピロリ菌に対する活性を示した。この結果は、pH8.0で抗菌成分は中性または正に帯電していることを示す。しかし、画分1〜7(陰イオン交換フロースルー部)のバルク単離および陽イオン交換による再分離後に、活性成分は、カラムと結合しているようであったが、これは活性が画分11〜14中に存在し、これらが塩勾配の導入後に溶出したからである(図9)。
【0075】
この時点でのNaCl濃度は、307〜721mMの間であった。対応するHPLCクロマトグラム(図8)では、画分12中に、215、254および280nmで吸収する小さなピークがあり、このことは、タンパク質性物質の存在の可能性を示す。全体的に見ると、これらの結果は、pH8.0で抗菌活性が正味の正の荷電を保持することを示す。さらに、これらの結果は、化合物が、UV吸収物質の事実上すべてが溶出されたフロースルー部中に存在しないので、化合物が実質的に精製されたように見えることを示す(図8)。
【実施例5】
【0076】
陽イオン交換分画された抗菌性EtOH可溶性画分陰イオン交換フロースルー部の植物化学分析
抗菌活性は、pH8でMonoQ陰イオン交換カラムに固着せず、したがって、フロースルー部中に存在することが、実施例4においてこれまでに調べられた。次いで、このフロースルー部を、pH8でMonoS陽イオン交換カラムで分画し、それによって活性はカラムと結合した。活性のバルクは、画分11中に存在し、画分12〜15において活性が徐々になくなった。
【0077】
画分1〜15を、還元糖およびタンパク質については、それぞれ、フェノール−硫酸およびBCAアッセイによって、第1級アミン基については、ニンヒドリンを用いるTLCスポット試験によってアッセイした。結果は、以下の表1中に要約されており、添付の図面の図10〜12に示されている。
【0078】
【表1】
【0079】
結果は、抗菌性画分、画分11は、還元糖、タンパク質について陽性と確認され、第1級アミン基(−NH2)を含む成分を含むということを示す。第一級アミン基は、アミノ酸に見られる絶対不可欠な官能基であり、ひいてはタンパク質ならびにアミノ糖中に見られる。
【0080】
生ジャガイモジュースの消費は、胃炎の症状を軽減し得るが、消費される必要があるジャガイモジュースの頻度および量のために、この方法で健康上の利益を最大にすることは不可能であることは明らかである。EtOH可溶性画分の同定および単離によって、ジュースの生物活性部分の濃縮された量が、適した製品(「機能性食品」)中に導入されることが可能となり、ジュースの活性部分が必要な量で消費されることが可能となる。
【実施例6】
【0081】
ジャガイモジュースのEtOH可溶性画分の粉末の調製
ホモジナイズしたジャガイモジュースのEtOH可溶性画分を、上記のように調製し、凍結乾燥して本発明の粉末抽出物を形成した。
【実施例7】
【0082】
EtOH可溶性画分の粉末混合物の調製
3.0gの凍結乾燥した粉末抽出物(実施例2)を、0.5gの粉末クエン酸、26.3gのグラニュー糖および0.2gの矯味剤の標準噴霧乾燥混合物と混合した。
【0083】
この混合物は、小袋に詰めるのに適している、自由流動性粉末製剤(3.0gの活性画分を含有する)である。粉末混合物は、胃炎を患っている患者によって必要とされる場合には、味わいおよび飲むために希釈してもよい。
【実施例8】
【0084】
本発明を使用するオレンジドリンクの調製
(a)100mlの粗調製物を、l00mlの二倍濃縮オレンジジュース(2倍強度に水で希釈したオレンジジュース濃縮物)と混合した。
(b)3.5gの凍結乾燥粉末を、100mlのオレンジジュースに(あるいは、オレンジジュース濃縮物および水とともに)溶解した。
【0085】
オレンジドリンク調製物(aまたはb)は、患者によって、すぐに消費されてもよいし、後の消費のために冷蔵されてもよく、または長い保管期間のためにビンおよび大型容器中に密閉してもよい。
【0086】
オレンジジュースは、味の良い代替物、例えば、ミルクドリンクと容易に置き換えても良い。
【実施例9】
【0087】
1kDa以下500Da以上の画分のHPLCフィンガープリント分析
抗付着画分、すなわち、1kDa以下500Da以上の画分を含む画分を、逆相HPLCによって分析して、HPAEC HPLCクロマトグラムの場合と同様、塩の存在がなく、LC−MS分析に直接的に適している分離を提供した。用いたHPLCカラムは、ジャガイモ中の遊離フェノール性化合物を分離するよう設計されたプログラムを用いる、5μmの粒径を用いるGemini C18250×4.6mm内径カラムであった(24)。
【0088】
移動相は、A=水:メタノール:酢酸(88:10:2)およびB=水:メタノール:酢酸(8:90:2)からなり、9分かけて10%への漸増の勾配のBと、それに続く9〜13分の間の100%Bへの急増を含み、その後、最初の状態に戻った。
【0089】
以下の結果は、1kDa以下500Da以上の画分(すなわち、≦1kDa〜≧500Da)について得られた代表的なトレースを示す(図13a)。280nmでモニターした場合に、いくつかの吸収ピークがあったが、特に、2つ、1および2が分離されているようであった(図13a)。ピーク1および2のUVスペクトルが、図14aおよびbにそれぞれ示されている。これらの化合物は両方とも事実上芳香族であり、プリン、ピリミジンまたは芳香族アミノ酸残基であろう。350nmでは、HPLCクロマトグラムが異なっており(図13b)、成分が14〜17分の間に溶出した。この領域の拡大図(図15)では、いくつかのピークを示した。完全に解明されたわけではないが、ピークA〜Cは、カフェ酸誘導体(図16a〜c)、クロロゲン酸と同一ファミリーに属するフェノール性フェニルプロパノイド(図17aおよびb)、ジャガイモ中の主なフェノールの特徴的なUVスペクトルと判断された。クロロゲン酸マーカーが溶出される15分には顕著なピークは観察されなかった(図17a、b)。
【0090】
したがって、要約すると、1kDa以下500ダルトン以上の画分範囲(≦1kDa〜≧500Da)の画分中に、微量濃度で存在する少なくとも3種のカフェ酸誘導体があり、これらのどれもクロロゲン酸ではない。さらに、この画分中には、いくつかの芳香族成分があり、そのうち2つが分離されているようであった。
【0091】
参照文献
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22.Friedman,M.、Bautista,F.F.、1995年。ジャガイモ組織懸濁液の不在下または存在下での、チオールによるポリフェノールオキシダーゼの阻害(Inhibition of polyphenol oxidase by thiols in the absence and presence of potato tissue suspensions.)Journal of Agricultural and Food Chemistry43、69〜76頁。
23.Bui,A.K.T.、Bacic,A.、Pettolino,F.、2006年。モリンダ・シトリフォリア(ノニ)の果汁の多糖組成物(Polysaccharide composition of the fruit juice of Morinda citrifolia (Noni).)Phytochemistry67、1271〜1275頁。
24.Verde−Mendez,C、Delgado,M.A.R.、Rodriguez,E.M.R.、Romero,CD.、2004年。テネリフェ(カナリア諸島)において収穫されたジャガイモの栽培品種中の含量および遊離フェノール化合物(Content and free phenolic compounds in cultivars of potatoes harvested in, Tenerife (Canary Islands))J.Agric.Food Chem.52、1323〜1327頁。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
胃腸疾患の予防または治療において使用するための組成物を作製する方法であって、ジャガイモジュースにアルコールを添加し、アルコール可溶性画分およびアルコール不溶性沈殿物を形成させる工程および、アルコール可溶性画分を回収する工程を含んでなる方法。
【請求項2】
アルコールがエタノールである、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
沈殿に、少なくとも70%エタノールが用いられる請求項2に記載の方法。
【請求項4】
沈殿に、96%エタノールが用いられる、請求項3に記載の方法。
【請求項5】
濃縮ジャガイモジュースが、アルコールによる少なくとも2回の沈殿に付される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
ジャガイモジュースが、アルコールによる少なくとも4回の沈殿に付される、請求項5に記載の方法。
【請求項7】
アルコール可溶性画分が、イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
アルコール可溶性画分が、pH8の陰イオンHPLCで処理して、負に帯電している成分を結合し、結合していない成分を回収し、前記の結合していない成分を、pH8の陽イオンHPLCで処理して、正に帯電している成分を結合し、この正に結合している成分を溶出し、溶出された画分を回収する、請求項7に記載の方法。
【請求項9】
ジャガイモジュースから誘導できる3kDa以下の可溶性画分の一定量を含んでなる、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
組成物が、ジャガイモジュースから誘導できる500Da以上1kDa以下の可溶性画分の一定量を含んでなる、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
500Daを越え、1kDa以下の可溶性画分が、3種のカフェ酸誘導体および2種の芳香族誘導体を含んでなる、請求項10に記載の方法。
【請求項12】
胃腸疾患の予防または治療において使用するための請求項1から11のいずれか一項に記載の方法によって調製された組成物であって、アルコール可溶性画分が治療上有効な量で提供される組成物。
【請求項13】
画分が、少なくともタンパク質またはポリペプチドの部分を含む、請求項12に記載の組成物。
【請求項14】
画分が、還元糖および/または第1級アミノ基を有する成分を含む、請求項12または13に記載の組成物。
【請求項15】
粉末である請求項12〜14のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項16】
粉末が、噴霧乾燥または凍結乾燥画分を含んでなる、請求項15に記載の組成物。
【請求項17】
さらに、矯味剤、糖類、甘味料、抗酸化剤、ミネラルまたはビタミンのうち少なくとも1種を含んでなる、請求項12〜16のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項18】
胃または十二指腸潰瘍および胃または十二指腸癌の予防および/または治療のための、請求項12から17のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項19】
胃腸疾患を予防または治療するための医薬の製造のための、ジャガイモジュースから誘導できるアルコール可溶性画分の使用。
【請求項20】
請求項19に記載のジャガイモジュースから誘導できるアルコール可溶性画分の使用であって、当該画分が、医薬上許容される担体と組み合わせた、請求項12から18のいずれか一項に記載の組成物である使用。
【請求項21】
請求項19または20に記載のジャガイモジュースから誘導できるアルコール可溶性画分の使用であって、医薬が、経口消費のための液体、カプセル剤または錠剤である使用。
【請求項22】
胃腸疾患の治療を必要とする患者に、ジャガイモジュースから誘導できるアルコール可溶性画分の治療上有効な量を投与する工程を含んでなる、胃腸疾患の治療方法。
【請求項23】
ジャガイモジュースから誘導できるアルコール可溶性画分の治療上有効な量を含んでなる、胃腸疾患の予防または治療において使用するための栄養製品。
【請求項24】
飲料またはドリンクの形の、請求項23に記載の栄養製品。
【請求項25】
乳製品である請求項23に記載の栄養製品。
【請求項26】
1g/100ml〜30g/100mlの間の画分を含んでなる、請求項23に記載の栄養製品。
【請求項27】
粉末または粉末混合物である請求項23に記載の栄養製品。
【請求項28】
食品バーまたはその他の固体食料品である請求項23に記載の栄養製品。
【請求項29】
ジャガイモジュースから誘導できるアルコール可溶性画分を含んでなる抗菌剤。
【請求項30】
画分が正に帯電している、請求項29に記載の抗菌剤。
【請求項31】
ピロリ菌に対して活性である、請求項29または30に記載の抗菌剤。
【請求項32】
以下の工程を含んでなる抗菌剤を作製する方法:
ジャガイモジュースの水性抽出物を調製する工程と、
水性抽出物にアルコールを添加して、アルコール可溶性画分およびアルコール不溶性沈殿物を形成する工程と、
アルコール可溶性画分を回収する工程と、
前記画分を、陰イオン交換樹脂で処理して、負に帯電している成分を結合し、結合していない成分を、樹脂から回収する工程と、
前記の結合していない成分を、陽イオン交換樹脂で処理して、正に帯電している成分を前記樹脂と結合する工程と、
前記の正に帯電している成分を、溶出溶液を用いて前記樹脂から溶出し、抗菌特性を有する溶出物を得る工程と、
前記溶出物を回収および場合により濃縮する工程。
【請求項1】
胃腸疾患の予防または治療において使用するための組成物を作製する方法であって、ジャガイモジュースにアルコールを添加し、アルコール可溶性画分およびアルコール不溶性沈殿物を形成させる工程および、アルコール可溶性画分を回収する工程を含んでなる方法。
【請求項2】
アルコールがエタノールである、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
沈殿に、少なくとも70%エタノールが用いられる請求項2に記載の方法。
【請求項4】
沈殿に、96%エタノールが用いられる、請求項3に記載の方法。
【請求項5】
濃縮ジャガイモジュースが、アルコールによる少なくとも2回の沈殿に付される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
ジャガイモジュースが、アルコールによる少なくとも4回の沈殿に付される、請求項5に記載の方法。
【請求項7】
アルコール可溶性画分が、イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
アルコール可溶性画分が、pH8の陰イオンHPLCで処理して、負に帯電している成分を結合し、結合していない成分を回収し、前記の結合していない成分を、pH8の陽イオンHPLCで処理して、正に帯電している成分を結合し、この正に結合している成分を溶出し、溶出された画分を回収する、請求項7に記載の方法。
【請求項9】
ジャガイモジュースから誘導できる3kDa以下の可溶性画分の一定量を含んでなる、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
組成物が、ジャガイモジュースから誘導できる500Da以上1kDa以下の可溶性画分の一定量を含んでなる、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
500Daを越え、1kDa以下の可溶性画分が、3種のカフェ酸誘導体および2種の芳香族誘導体を含んでなる、請求項10に記載の方法。
【請求項12】
胃腸疾患の予防または治療において使用するための請求項1から11のいずれか一項に記載の方法によって調製された組成物であって、アルコール可溶性画分が治療上有効な量で提供される組成物。
【請求項13】
画分が、少なくともタンパク質またはポリペプチドの部分を含む、請求項12に記載の組成物。
【請求項14】
画分が、還元糖および/または第1級アミノ基を有する成分を含む、請求項12または13に記載の組成物。
【請求項15】
粉末である請求項12〜14のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項16】
粉末が、噴霧乾燥または凍結乾燥画分を含んでなる、請求項15に記載の組成物。
【請求項17】
さらに、矯味剤、糖類、甘味料、抗酸化剤、ミネラルまたはビタミンのうち少なくとも1種を含んでなる、請求項12〜16のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項18】
胃または十二指腸潰瘍および胃または十二指腸癌の予防および/または治療のための、請求項12から17のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項19】
胃腸疾患を予防または治療するための医薬の製造のための、ジャガイモジュースから誘導できるアルコール可溶性画分の使用。
【請求項20】
請求項19に記載のジャガイモジュースから誘導できるアルコール可溶性画分の使用であって、当該画分が、医薬上許容される担体と組み合わせた、請求項12から18のいずれか一項に記載の組成物である使用。
【請求項21】
請求項19または20に記載のジャガイモジュースから誘導できるアルコール可溶性画分の使用であって、医薬が、経口消費のための液体、カプセル剤または錠剤である使用。
【請求項22】
胃腸疾患の治療を必要とする患者に、ジャガイモジュースから誘導できるアルコール可溶性画分の治療上有効な量を投与する工程を含んでなる、胃腸疾患の治療方法。
【請求項23】
ジャガイモジュースから誘導できるアルコール可溶性画分の治療上有効な量を含んでなる、胃腸疾患の予防または治療において使用するための栄養製品。
【請求項24】
飲料またはドリンクの形の、請求項23に記載の栄養製品。
【請求項25】
乳製品である請求項23に記載の栄養製品。
【請求項26】
1g/100ml〜30g/100mlの間の画分を含んでなる、請求項23に記載の栄養製品。
【請求項27】
粉末または粉末混合物である請求項23に記載の栄養製品。
【請求項28】
食品バーまたはその他の固体食料品である請求項23に記載の栄養製品。
【請求項29】
ジャガイモジュースから誘導できるアルコール可溶性画分を含んでなる抗菌剤。
【請求項30】
画分が正に帯電している、請求項29に記載の抗菌剤。
【請求項31】
ピロリ菌に対して活性である、請求項29または30に記載の抗菌剤。
【請求項32】
以下の工程を含んでなる抗菌剤を作製する方法:
ジャガイモジュースの水性抽出物を調製する工程と、
水性抽出物にアルコールを添加して、アルコール可溶性画分およびアルコール不溶性沈殿物を形成する工程と、
アルコール可溶性画分を回収する工程と、
前記画分を、陰イオン交換樹脂で処理して、負に帯電している成分を結合し、結合していない成分を、樹脂から回収する工程と、
前記の結合していない成分を、陽イオン交換樹脂で処理して、正に帯電している成分を前記樹脂と結合する工程と、
前記の正に帯電している成分を、溶出溶液を用いて前記樹脂から溶出し、抗菌特性を有する溶出物を得る工程と、
前記溶出物を回収および場合により濃縮する工程。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13a】
【図13b】
【図14a】
【図14b】
【図15】
【図16a】
【図16b】
【図16c】
【図17a】
【図17b】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13a】
【図13b】
【図14a】
【図14b】
【図15】
【図16a】
【図16b】
【図16c】
【図17a】
【図17b】
【公表番号】特表2010−508339(P2010−508339A)
【公表日】平成22年3月18日(2010.3.18)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2009−535122(P2009−535122)
【出願日】平成19年11月2日(2007.11.2)
【国際出願番号】PCT/GB2007/004171
【国際公開番号】WO2008/053219
【国際公開日】平成20年5月8日(2008.5.8)
【出願人】(505428972)マンチェスター大学 (4)
【氏名又は名称原語表記】The University of Manchester
【Fターム(参考)】
【公表日】平成22年3月18日(2010.3.18)
【国際特許分類】
【出願日】平成19年11月2日(2007.11.2)
【国際出願番号】PCT/GB2007/004171
【国際公開番号】WO2008/053219
【国際公開日】平成20年5月8日(2008.5.8)
【出願人】(505428972)マンチェスター大学 (4)
【氏名又は名称原語表記】The University of Manchester
【Fターム(参考)】
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