脱水細胞及び疎水性溶媒からなる組成物
【課題】 細胞を休眠又は変化のない状態のまま保ち、且つ、花粉などのアレルゲンを強く付着、吸着して花粉症を軽減する組成物及び乳化物、これらの製造法が求められている。
【解決手段】 脱水細胞を疎水性溶剤に溶融したものからなる組成物、その乳化物及び製造方法が提供でき、食品、化粧品や医療用品として利用できる。また、脱水細胞が凍結乾燥細胞とすることにより休眠のまま保つことができる。
【解決手段】 脱水細胞を疎水性溶剤に溶融したものからなる組成物、その乳化物及び製造方法が提供でき、食品、化粧品や医療用品として利用できる。また、脱水細胞が凍結乾燥細胞とすることにより休眠のまま保つことができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脱水細胞を疎水性溶媒に溶解／溶融させた組成物、その乳化組成物及び製造方法や応用に関する。より詳しくは、本発明は、水分を凍結乾燥等により除去した生きた細胞又は微生物を疎水性溶媒に溶解／溶融させた組成物、乳化組成物及び製造方法であり、それらを含有する食品、化粧品及び医療用品に関する。
【背景技術】
【０００２】
紀元前より、食品には微生物を用いて作られた種々の醗酵食品があり、特に乳を原料とした醗酵乳は世界中にある。近年では、乳酸菌やビフィズス菌は整腸作用、免疫活性、抗変異原性、コレステロール低下作用などの人の健康に良いとされているバイオティクス菌であり、これらの菌を使用した醗酵食品が開発されている。これらの醗酵食品に使用している、例えば、人腸管由来のアシドフィラス菌やカゼイ菌などのバイオティクス乳酸菌は、醗酵臭としてジアセチル臭等を強く生じ、日本人には不快な匂いで好まれない欠点があった。また、ビフィズス菌は特に人の整腸作用があり健康に良い影響を及ぼすが、嫌気性菌であり酸素がある環境では生育や保存に適さず、また、嫌気性にすると乳酸以外に酢酸を生産し、風味上好ましい菌とはいえない欠点があった。
【０００３】
この問題を解決すべく、食品の醗酵に使用せずに直接飲用するために機能性乳酸菌等を腸溶性のカプセルに入れて、腸内まで運ぶことが検討（特許文献１）され、生きた菌が増殖できるカプセルも検討されている（特許文献２）。また、植物性脂肪でコーティングした乳酸菌顆粒を含有する液体の食品に関するものが検討されている（特許文献３）。しかし、これらはハードやソフトカプセルといった形状であり、通常の醗酵乳や飲料などの食品としては違和感があり、ヨーグルトや飲むヨーグルトといった本来の醗酵食品と異なっている問題点があった。また、嫌気性菌のビフィズス菌（ビフィドバクテリウム・ロンガム菌）を増殖促進物質無添加還元脱脂乳培地に接種し、培養するという操作を繰り返すことで、好気性条件であっても増殖性と培地凝固性の高い菌株を育種することを検討している（特許文献４）。しかし、この方法は時間のロスと確率の悪さと酢酸の生成を生じる問題があった。
【０００４】
そこで、優秀な機能性菌でありながら醗酵臭が風味上不敵な菌であっても、おいしい風味の醗酵食品、また、嫌気性の菌でも好気性環境で利用でき、且つ酢酸を生産せず風味が良好であるビフィズス菌入りの食品に利用でき、人の健康に有益でおいしい製品の製造技術が望まれている。
【０００５】
また、食品以外では、わが国では春になると涙や鼻水、くしゃみ、鼻づまりに悩まされ、今や国民病といった形容がなされている花粉症で困っている人が多い。花粉症などのアレルギー反応は、鼻や目の粘膜表面に付着した花粉に水分の作用によって溶出した蛋白質であるアレルゲンに起因していることが知られている。この症状を軽減するために、種々の薬が開発され提供されているが、抗ヒスタミン剤は眠気や口が渇くなどの副作用が、ステロイド剤はステロイドとしての副作用があるといった欠点があった。アレルギーの原因物質である花粉などの吸引防止にはマスクの使用がなされるが、呼吸の際に息苦しいなど煩わしいものであり、食事の際には取り外さなくてはならないといった欠点があった。
【０００６】
この問題を解決すべく、長鎖炭化水素であるワセリンと流動パラフィンの混合物を鼻腔壁に塗布し、花粉を付着させるものが検討されている（特許文献５）。しかし、花粉が付着することがあっても流動性があるために流出して、体液に会うとアレルゲンを放出してしまうという問題があった。そこで、花粉が疎水溶剤に到達した際に、物質に留まり続けさせる吸着力があることで花粉が鼻の奥の粘膜に到達する量を少なくしたり、花粉に皮膜ができて体液に接することを防止して、アレルゲンを生じさせない技術が望まれている。
【０００７】
人の健康に有益な食品や皮膚の保水性といった化粧品や花粉症などを低減する医療用品は製品としては広範なものであるが、これらに利用できる原料となる組成物、乳化物や製造法が求められている。
【特許文献１】特開平８−２４２７６３号公報
【特許文献２】特開２００１−２４５６６０号公報
【特許文献３】国際公開番号ＷＯ２００５／０７０２２１号公報
【特許文献４】特許公開２０００−２４５４４０号公報
【特許文献５】特開２００５−３１４３１１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、食品、化粧品や医療用品などの広範囲の利用が可能となる、脱水細胞を疎水性溶媒に溶解／溶融させて休眠又は変化のない状態のまま保つことができ、又は、花粉などのアレルゲンを強く付着、吸着して花粉症を軽減する組成物及び乳化物が求められ、また、その製造法が求められている。本発明の医療用品とは医薬品、医薬部外品、予防に関連する雑貨等を含むものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の発明は、脱水細胞を疎水性溶媒に溶解／溶融したものからなる組成物に関する。
第２の発明は、第１の脱水細胞が脱水微生物であるものを疎水性溶媒に溶解／溶融したものからなる組成物に関する。
第３の発明は、第１の脱水細胞、第２の脱水微生物が凍結乾燥細胞、凍結乾燥微生物であるものを疎水性溶媒に溶解／溶融したものからなる組成物に関する。
第４の発明は、第１の脱水細胞、第２の脱水微生物、第３の凍結乾燥細胞及び凍結乾燥微生物を溶解／溶融する疎水性物質が油脂類である組成物に関する。
第５の発明は、第１〜４の組成物の製造方法に関する。
第６の発明は、第１〜４の組成物の乳化製造方法に関する。
第７の発明は、第１〜４の組成物を含有する食品又は化粧品及び医療用品が、醗酵乳、飲料、醗酵豆乳、機能性食品、保湿性化粧品、花粉吸着剤、ハウスダスト吸着剤に関する。
【発明の効果】
【００１０】
従来、培養細胞を疎水性溶媒に溶解／溶融するのが困難だったため、動植物組織の培養物や菌体を含む醗酵物は凍結乾燥物に油脂をコーティングしていた。水系で培養した細胞や細菌を疎水性の溶液に溶融することは不可能だと考え全く試みられることはなかった。しかし、本発明者らが、初めて疎水性の溶媒に細胞を溶融させることに成功し、細胞が疎水溶媒中に閉じ込められているにもかかわらず、死滅せず休眠を継続させ、また、この組成物を乳化することで、多くの製品に利用することができることを見出し、本発明が完成されたものである。
【００１１】
本発明によって、純粋な細胞や微生物は、湿潤時は親水性であり、乾燥時は疎水性の性質となるといった２つの相反した性質を発見し、また、以外にも疎水性溶媒に溶解／溶融すると疎水性溶媒は細胞壁で止めるようであり、再度水を含めば再生する性質を留めていることを最大限に利用できるものとなった。例えば従来、人の腸より採取した機能性のある乳酸菌等でジアセチル等の醗酵臭の強いものは日本人には嫌われ、乳やジュースなどの水を含んだものに入れるとすぐに活性化し、生育して風味異常なものとなってしまうのを改善でき、また、好気性で生育するように育種をしていないビフィズス菌を牛乳やジュースに入れると好気条件や酸のために死滅しまうが、該組成物を利用すれば嫌気性菌も生きたまま食品に利用することができる。このことで、ビフィズス菌や機能性乳酸菌でヨーグルトなど人の健康に良く、風味の良い食品の製造が容易になり、大きな改善効果がもたらされる。食品はおいしくないと人は食さず、おいしさも栄養とともに重要なファクターである。
【００１２】
また、本発明によって、花粉が粘膜に付着し花粉症の症状であるくしゃみや鼻づまり、鼻水、目のかゆみ等を生じるが、乳酸菌を疎水性溶媒に溶解／溶融することで花粉の周りを乳酸菌が包み、乳酸菌塊が花粉をブドウ状に付着させる強力な効果が生じるという、予測されない著しい能力を利用できるものとなった。
【００１３】
なお、疎水性溶媒に脱水細菌が含まれる重量は４０％前後であり、それ以上はペースト状となり、製品製造における好ましい液状を保つ含有量は１０％以下である。脱水細菌を１０％含む該組成物を醗酵乳として１０％加えれば１ｇ当り１０１１〜１０１０個／ｇの菌となり、疎水性溶媒に脱水細菌を入れない醗酵技術では至難であり、本発明の有用性がより明らかとなる。
【００１４】
本発明において、「脱水細胞」とは細胞以外の培地成分を除去し、すなわち疎水性溶液に溶解しないものを除去して、細胞を乾燥したものである。乾燥方法は、生きたまま細胞を使用するには凍結乾燥が好ましく、生菌率が下がって良い場合は減圧乾燥、ドラム乾燥、噴霧乾燥等が利用できる。
【００１５】
培養液には多くの親水性物質が存在するためこれを除去することが重要であり、培養液を洗浄する方法は通常使用される生理食塩水や緩衝液では、乾燥後食塩や無機塩類が残存するため不適であり、除菌若しくは殺菌／滅菌した清水、例えば蒸留水、イオン交換水、膜ろ過水、若しくは水道水で洗浄することが重要である。培養液を遠心分離機にて１００×ｇ〜１００００×ｇ、５分〜６０分間、遠心分離し、上澄みをデカンテーションして沈殿物にほぼ除した量の清水を加え攪拌にて均質にし、１〜１０回以上同様な条件で遠心洗浄することで、菌体以外の親水性物質を除去する。より好ましい条件は、５００×ｇ〜５０００×ｇ１０分〜４５分間の遠心分離後、同条件で２〜５回遠心洗浄すれば良い。第２の洗浄方法は膜洗浄であるが、遠心洗浄と同様に、培養終了後、ろ過装置で清水にて洗浄するが、ろ過穴の直径は０．０１〜１０００μｍでろ過し、除した量程の清水を加え均質にして１〜１０回、同様な条件でろ過洗浄することで親水性物質を除去するが、連続的に行っても良い。より好ましい条件は、細胞の大きさより若干小さなもので０．１〜１００μｍの穴の膜で、同条件で２〜５回ろ過洗浄すればよい。
【００１６】
本発明において、「脱水細胞」の種類は、乾燥した動物細胞、植物細胞、藻類、真菌、細菌が挙げられ、それぞれの用途に応じて用いれば良い。乾燥方法は凍結乾燥、減圧乾燥、ドラム乾燥、噴霧乾燥などが使用でき、利用する細胞の目的により生死体の率を考慮して乾燥法を選択することができる。特に生きた細胞の乾燥体を得るには凍結乾燥が最適で、凍結温度が−１℃〜−９０℃で、凍結解凍温度は−２０℃〜５０℃が良い。より好ましい条件としては、凍結温度が−５℃〜−５０℃、解凍温度が−１０℃〜５０℃が選択される。真空度は１００〜０．００１トール（Ｔｏｒｒ）で良く、好ましくは１０〜０．０１トールで良い。
【００１７】
食品用途に使用される細胞としては乳酸菌、ビフィズス菌、ケフィヤ菌、納豆菌、食用真菌、単細胞藻類、多細胞藻類、薬草組織（例えばハーブの培養組織）等が挙げられる。化粧品や医療用品に使用されるものとしては、乳酸菌、ビフズス菌、医療用細菌、医療用真菌、セルロース、アロエ軟組織、和漢薬組織等が挙げられる。
【００１８】
本発明において、「疎水性溶媒」とは親水性溶媒に対するもので、「油脂類」とは、動植物由来の生物系油脂と石油由来の鉱物系油脂である。具体的には、菜種油、ゴマ油、大豆油、オリーブ油、カカオ油脂、ヤシ油、パーム油、パーム核油、小麦胚芽油、アボガド油、ひまし油、乳脂肪、魚油、豚脂、牛脂、扁桃油、馬油、ワセリン、パラフィンや蝋状油脂、シリコン、プラスティックベース等が挙げられる。また、トコフェロール、カロティン等の脂溶性ビタミン類も挙げられる。
【００１９】
脱水細胞の疎水性溶媒への溶解／溶融法は、疎水溶媒を容器に採り攪拌機で攪拌しながら、３．５〜５００メッシュに篩った脱水細胞を少量ずつ落し込んで溶解／溶融するが、疎水溶媒が作業工程温度でゲル化している場合は加温等で液体として溶解／溶融を開始する。細胞の大きさで篩のメッシュを決めるが、好ましくは１０〜２００メッシュの篩を使用して製造すると良い。疎水性溶媒に細胞を溶解できる量は細胞により異なるが、重量で４０％程まで均一に溶解／溶融し、また、細胞の量が多い場合には疎水性溶媒を加える方法で混練りし、ペースト状にすることができる。生きている場合、細胞を溶解／溶融する溶媒の温度は７５℃以下で溶媒が液体の範囲で行うことができるが、より好ましくは０℃〜６５℃である。
【００２０】
本発明では、疎水性の油脂に溶融させた細胞は、生きたままで保存でき、また、水系に乳化させても休眠状態で存在する。本発明による乳化法は該組成物を食品中に含まれる乳化物質、例えば乳蛋白質、大豆たんぱく質、レシチンなどのリン脂質等で乳化できるが、食品に使われるモノ／ジグリセライド、ポリグリセリンエステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール酸エステル、シュガーエステル等の乳化剤が使用でき、化粧品や医療用品にはイオン系、非イオン系界面活性剤が使用できる。凍結乾燥細胞を７５℃までの温度で油脂に溶解させ、蛋白質やリン脂質若しく乳化剤を用いて、１〜５０ＭＰａ（メガパスカル）の圧力で乳化するが、より好ましくは１０〜３０ＭＰａである。乳化機は既知のもので良いが、食品の場合はアセプティックホモジナイザーがよい。本発明の乳化物は平均粒子径が０．０１〜１００μｍの大きさで良く、より好ましくは平均粒子径０．１〜３０μｍが好適である。
【００２１】
本発明の組成物や組成物を乳化した食品は、例えば、乳酸菌やビフィズス菌を乳脂肪又は植物性油脂に溶解／溶融させて脱脂乳又は豆乳にて乳化した醗酵乳や醗酵飲料であり、好気性条件で製造できるビフィズス菌入りのヨーグルトや酵母が存在するのに炭酸ガスを生じないケフィヤ飲料や機能性食品である。また、牛乳や豆乳の味を変えずにハーブ、朝鮮人参組織やクロレラを入れた食品が製造できる。鉱物系油脂又は／及び生物系油脂に乳酸菌やセルロースを溶解させると、油脂にてコーティングされた菌は花粉周囲に付着し、菌塊や微細セルロースは花粉やハウスダストを吸着する性質があり、鼻や目の粘膜近くに塗ることでアレルゲンの発生を不活性化して、花粉症やハウスダストアレルギーの発生を軽減するといった花粉やハウスダストの吸着塗布剤ができ、保水性のあるアロエ軟組織を混入すれば、保湿性を有する保湿クリームが製造できる。尚、脱水細胞を含んだ疎水性溶媒又はその乳化物を添加する食品、化粧品、医療用品はこれらに限定されるものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。尚、実施例における組成は重量％で示す。
【実施例１】
【００２３】
「湿菌体」、「脱水菌体培養物」及び「脱水菌体」の溶解性比較
乳酸菌を培養する培地は任意の液体乳酸菌培地でよいが、ここでは乳酸菌用ＭＲＳブロス（Ｄｉｃｏ社）で培養液を作製し、１２０℃１５分の滅菌を行った後に４０℃に冷却し、（ａ）ラクトバチルス・ブルガリクスＪＣＭ１００２、（ｂ）ラクトバチルス・ラムノーサスＡＴＣＣ７４６９、（ｃ）ラクトコッカス・ラクチスＡＴＣＣ１５３４６を前記培地で３８℃１８時間各々予備培養した菌液をそれぞれの培地に２％加えて低速の間欠攪拌のタンクを使用し、３８℃にて２０時間培養して各々の培養物を得た。この培養物を凍結乾燥して「脱水乳酸菌培養物」を製造した。また培養物を遠心分離機（５４２０；株式会社久保田製作所）にて５０００×ｇ１５分間遠心分離し、デカンテーションした後沈殿物に除去した上澄みとほぼ等量の無菌水を加え均質にし、同様な条件で３回遠心洗浄した。菌体以外のものを除去して、「湿乳酸菌」を製造した。この湿乳酸菌を凍結温度−３０℃で、凍結乾燥機（ＲＬＥ２；日精株式会社）を使用し、真空度０．２トール、凍結解凍温度は３０℃で凍結乾燥し「脱水乳酸菌」を製造した。
【００２４】
ビフィダス菌用ＧＡＭブイヨン培地を調整し、１２０℃１５分の滅菌を行った後に冷却し、（ｄ）ビフィドバクテリウム・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７を前記培地で３７℃１８時間予備培養した菌液を２％加えて無攪拌の容器を使用し、簡易嫌気（アネロパック；三菱ガス化学株式会社）３７℃にて２０時間培養して培養物を得た。この培養物を凍結乾燥して「脱水ビフィズス菌培養物」を製造した。また、培養物を穴の大きさ０．１μの膜（ＭＬＥ−７１０１；株式会社クラレ）にて濃縮し、除去した液とほぼ等量の無菌水を加え均質にし、同様な濃縮条件で３回ろ過洗浄した。菌体以外のものを除去して、「湿ビフィズス菌」を製造した。この湿ビフィズス菌を乳酸菌と同様に凍結乾燥処理し、「脱水ビフィズス菌」を製造した。
【００２５】
攪拌しながらイオン交換水、精製菜種油及び流動パラフィンのそれぞれの９部に「湿菌体」、「培養物脱水菌体」及び「脱水菌体」の各々１部を３０℃にて溶解／溶融した。溶解／溶融したその結果を表１に示した。「湿乳酸菌ａ、ｂ、ｃ及び湿ビフィズス菌ｄ」はイオン交換水に良くとけ、精製菜種油、流動パラフィンには全く溶融せず、「脱水乳酸菌及びビフィズス菌培養物」はオン交換水に良く溶解／溶融し、精製菜種油、流動パラフィンにはママコ状に分散した。「脱水乳酸菌及び脱水ビフィズス菌」はオン交換水にママコ状になり、精製菜種油、流動パラフィンには均一に溶解／溶融した。このことにより、疎水性溶媒に容易に溶解／溶融させる方法は、培養液を除去して細胞を洗浄し乾燥する工程が必要であることが明確になった。
【００２６】
【表１】
【実施例２】
【００２７】
脱水乳酸菌及び脱水ビフィズス菌の疎水性溶媒中の生存性
凍結乾燥乳酸菌（ｂ）１部ずつを精製大豆油９９部及びワセリン９９部に溶解、凍結乾燥ブフィズス菌（ｄ）１部を乳脂肪（バターオイル）９９部に溶解し、１０℃に保ち７日後、１４日後、２８日後の菌数を検査した結果を表２に示した。この結果から、油脂に溶融した乳酸菌、ビフィズス菌は死滅することなく菌数を保持できることが証明された。このことから、食品中に生きた状態で利用できることが判明した。
【００２８】
【表２】
【実施例３】
【００２９】
植物油脂含有豆乳発酵乳
精製大豆固化油２．９４部を８５℃にて加温殺菌した後、４０℃に冷却し、実施例１の凍結乾燥乳酸菌（ｂ）０．０６部を無菌室で溶融させた。また、豆乳９７部を８５℃１５分間の殺菌をした後４０℃に冷却し、先の乳酸菌の入った精製大豆固化油を混合し、ホモジナイザー（Ｌ−０１；三和機械株式会社）で２０ＭＰａの圧力で乳化した後容器に詰め、乳酸菌を生きたままで含有するが、風味変化のない乳酸菌入り豆乳飲料を製造することができた。１週間後の乳酸菌は１．９×１０９個／ｇを検出した。
【実施例４】
【００３０】
ビフィズス菌を含有した醗酵乳の製造法
バターを８５℃にて溶解して水分をデカンテーションで除いた後、４０℃に冷却したバターオイル２，９８部に凍結乾燥した実施例１の凍結乾燥ビフズスキン菌（ｄ）０．０２部を無菌室で溶解／溶融させた。また、脱脂乳９６部、脱脂粉乳１部を加えてミックスとし、８５℃１０分間の殺菌をした後、４０℃に冷却して先のビフィズス菌の入ったバターオイルを混合し、ホモジナイザーで１５ＭＰａの圧力で乳化した後、風味のよいブルガリヤ菌とラクチス菌のスターターを加えて容器に詰めて４０℃にて醗酵させ、ビフィダス菌を生きたままで含有し、風味が良いプレーンヨーグルトを製造することができた。１週間後のブフィズス菌は４．２×１０８個／ｇを検出した。
【実施例５】
【００３１】
スギ花粉の吸着性評価
Ａ液として、流動パラフィン１０部にスギ花粉を適量分散させた。Ｂ液として、凍結乾燥乳酸菌（ｂ）０．６部を５０℃に加温した長鎖炭化水素（流動パラフィン７部＋ワセリン２．４部）９．４部に溶解／溶融させた。Ｃ液として、脱脂綿繊維０．６部を５０℃に加温した長鎖炭化水素（流動パラフィン７部＋ワセリン２．４部）９．４部に溶解／溶解させた。Ａ液１部とＢ液１部を加え、ゆっくりと攪拌させた後、ミクロピペットで０．１ｍｌ採り平らに１０ｍｍ×１０ｍｍの面積に広げ、倍率２００の顕微鏡で２０視野を鏡検した。また、Ａ液１部とＣ液１部を加え、同様に鏡検した。その結果は、Ａ液のみではきれいに分散していたスギ花粉が６４個／２０視野あった。Ａ＋Ｂ液は、２個以上に集合し吸着したものが３５個／２０視野あり、単独である花粉にも周囲に菌塊が付着している様子が確認された。Ａ＋Ｃ液は２個以上に集合し吸着したものが６個あった。
【００３２】
また、Ｄ液として精製大豆油１０部にスギ花粉を適量分散させた。Ｅ液として凍結乾燥乳酸菌（ｂ）０．６部を精製大豆油９．４部に溶解、Ｆ液として脱脂綿繊維０．６部を精製大豆油９．４部に溶解した。Ｄ液単独、Ｄ液１部とＥ液１部、Ｄ液１部とＦ液１部を混ぜ、長鎖炭化水素と同様に処理し鏡検した。
【００３３】
これらの結果を表３に示した。このことから、特に乳酸菌を溶解／溶融した長鎖炭化水素は花粉を吸着し、凝集してブドウ状になることがわかった。これにより、流動パラフィン及びワセリンなどの長鎖炭化水素に乳酸菌を溶解／溶融させた組成物を鼻や目の回りの皮膚に塗ることで疎水性溶剤に溶解／溶融した乳酸菌が花粉の回りに付着に吸着し、乳酸菌塊に凝集し、花粉を不活性することで花粉症の軽減が図られ、また、保湿性の脱水アロエ軟組織を加えれば保湿化粧品原料となり、乳化させて点眼剤や保湿スプレーに使用でき、化粧用クリームに乳化させれば化粧品にも利用できる。
【００３４】
【表３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脱水細胞を疎水性溶媒に溶解／溶融させた組成物、その乳化組成物及び製造方法や応用に関する。より詳しくは、本発明は、水分を凍結乾燥等により除去した生きた細胞又は微生物を疎水性溶媒に溶解／溶融させた組成物、乳化組成物及び製造方法であり、それらを含有する食品、化粧品及び医療用品に関する。
【背景技術】
【０００２】
紀元前より、食品には微生物を用いて作られた種々の醗酵食品があり、特に乳を原料とした醗酵乳は世界中にある。近年では、乳酸菌やビフィズス菌は整腸作用、免疫活性、抗変異原性、コレステロール低下作用などの人の健康に良いとされているバイオティクス菌であり、これらの菌を使用した醗酵食品が開発されている。これらの醗酵食品に使用している、例えば、人腸管由来のアシドフィラス菌やカゼイ菌などのバイオティクス乳酸菌は、醗酵臭としてジアセチル臭等を強く生じ、日本人には不快な匂いで好まれない欠点があった。また、ビフィズス菌は特に人の整腸作用があり健康に良い影響を及ぼすが、嫌気性菌であり酸素がある環境では生育や保存に適さず、また、嫌気性にすると乳酸以外に酢酸を生産し、風味上好ましい菌とはいえない欠点があった。
【０００３】
この問題を解決すべく、食品の醗酵に使用せずに直接飲用するために機能性乳酸菌等を腸溶性のカプセルに入れて、腸内まで運ぶことが検討（特許文献１）され、生きた菌が増殖できるカプセルも検討されている（特許文献２）。また、植物性脂肪でコーティングした乳酸菌顆粒を含有する液体の食品に関するものが検討されている（特許文献３）。しかし、これらはハードやソフトカプセルといった形状であり、通常の醗酵乳や飲料などの食品としては違和感があり、ヨーグルトや飲むヨーグルトといった本来の醗酵食品と異なっている問題点があった。また、嫌気性菌のビフィズス菌（ビフィドバクテリウム・ロンガム菌）を増殖促進物質無添加還元脱脂乳培地に接種し、培養するという操作を繰り返すことで、好気性条件であっても増殖性と培地凝固性の高い菌株を育種することを検討している（特許文献４）。しかし、この方法は時間のロスと確率の悪さと酢酸の生成を生じる問題があった。
【０００４】
そこで、優秀な機能性菌でありながら醗酵臭が風味上不敵な菌であっても、おいしい風味の醗酵食品、また、嫌気性の菌でも好気性環境で利用でき、且つ酢酸を生産せず風味が良好であるビフィズス菌入りの食品に利用でき、人の健康に有益でおいしい製品の製造技術が望まれている。
【０００５】
また、食品以外では、わが国では春になると涙や鼻水、くしゃみ、鼻づまりに悩まされ、今や国民病といった形容がなされている花粉症で困っている人が多い。花粉症などのアレルギー反応は、鼻や目の粘膜表面に付着した花粉に水分の作用によって溶出した蛋白質であるアレルゲンに起因していることが知られている。この症状を軽減するために、種々の薬が開発され提供されているが、抗ヒスタミン剤は眠気や口が渇くなどの副作用が、ステロイド剤はステロイドとしての副作用があるといった欠点があった。アレルギーの原因物質である花粉などの吸引防止にはマスクの使用がなされるが、呼吸の際に息苦しいなど煩わしいものであり、食事の際には取り外さなくてはならないといった欠点があった。
【０００６】
この問題を解決すべく、長鎖炭化水素であるワセリンと流動パラフィンの混合物を鼻腔壁に塗布し、花粉を付着させるものが検討されている（特許文献５）。しかし、花粉が付着することがあっても流動性があるために流出して、体液に会うとアレルゲンを放出してしまうという問題があった。そこで、花粉が疎水溶剤に到達した際に、物質に留まり続けさせる吸着力があることで花粉が鼻の奥の粘膜に到達する量を少なくしたり、花粉に皮膜ができて体液に接することを防止して、アレルゲンを生じさせない技術が望まれている。
【０００７】
人の健康に有益な食品や皮膚の保水性といった化粧品や花粉症などを低減する医療用品は製品としては広範なものであるが、これらに利用できる原料となる組成物、乳化物や製造法が求められている。
【特許文献１】特開平８−２４２７６３号公報
【特許文献２】特開２００１−２４５６６０号公報
【特許文献３】国際公開番号ＷＯ２００５／０７０２２１号公報
【特許文献４】特許公開２０００−２４５４４０号公報
【特許文献５】特開２００５−３１４３１１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、食品、化粧品や医療用品などの広範囲の利用が可能となる、脱水細胞を疎水性溶媒に溶解／溶融させて休眠又は変化のない状態のまま保つことができ、又は、花粉などのアレルゲンを強く付着、吸着して花粉症を軽減する組成物及び乳化物が求められ、また、その製造法が求められている。本発明の医療用品とは医薬品、医薬部外品、予防に関連する雑貨等を含むものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の発明は、脱水細胞を疎水性溶媒に溶解／溶融したものからなる組成物に関する。
第２の発明は、第１の脱水細胞が脱水微生物であるものを疎水性溶媒に溶解／溶融したものからなる組成物に関する。
第３の発明は、第１の脱水細胞、第２の脱水微生物が凍結乾燥細胞、凍結乾燥微生物であるものを疎水性溶媒に溶解／溶融したものからなる組成物に関する。
第４の発明は、第１の脱水細胞、第２の脱水微生物、第３の凍結乾燥細胞及び凍結乾燥微生物を溶解／溶融する疎水性物質が油脂類である組成物に関する。
第５の発明は、第１〜４の組成物の製造方法に関する。
第６の発明は、第１〜４の組成物の乳化製造方法に関する。
第７の発明は、第１〜４の組成物を含有する食品又は化粧品及び医療用品が、醗酵乳、飲料、醗酵豆乳、機能性食品、保湿性化粧品、花粉吸着剤、ハウスダスト吸着剤に関する。
【発明の効果】
【００１０】
従来、培養細胞を疎水性溶媒に溶解／溶融するのが困難だったため、動植物組織の培養物や菌体を含む醗酵物は凍結乾燥物に油脂をコーティングしていた。水系で培養した細胞や細菌を疎水性の溶液に溶融することは不可能だと考え全く試みられることはなかった。しかし、本発明者らが、初めて疎水性の溶媒に細胞を溶融させることに成功し、細胞が疎水溶媒中に閉じ込められているにもかかわらず、死滅せず休眠を継続させ、また、この組成物を乳化することで、多くの製品に利用することができることを見出し、本発明が完成されたものである。
【００１１】
本発明によって、純粋な細胞や微生物は、湿潤時は親水性であり、乾燥時は疎水性の性質となるといった２つの相反した性質を発見し、また、以外にも疎水性溶媒に溶解／溶融すると疎水性溶媒は細胞壁で止めるようであり、再度水を含めば再生する性質を留めていることを最大限に利用できるものとなった。例えば従来、人の腸より採取した機能性のある乳酸菌等でジアセチル等の醗酵臭の強いものは日本人には嫌われ、乳やジュースなどの水を含んだものに入れるとすぐに活性化し、生育して風味異常なものとなってしまうのを改善でき、また、好気性で生育するように育種をしていないビフィズス菌を牛乳やジュースに入れると好気条件や酸のために死滅しまうが、該組成物を利用すれば嫌気性菌も生きたまま食品に利用することができる。このことで、ビフィズス菌や機能性乳酸菌でヨーグルトなど人の健康に良く、風味の良い食品の製造が容易になり、大きな改善効果がもたらされる。食品はおいしくないと人は食さず、おいしさも栄養とともに重要なファクターである。
【００１２】
また、本発明によって、花粉が粘膜に付着し花粉症の症状であるくしゃみや鼻づまり、鼻水、目のかゆみ等を生じるが、乳酸菌を疎水性溶媒に溶解／溶融することで花粉の周りを乳酸菌が包み、乳酸菌塊が花粉をブドウ状に付着させる強力な効果が生じるという、予測されない著しい能力を利用できるものとなった。
【００１３】
なお、疎水性溶媒に脱水細菌が含まれる重量は４０％前後であり、それ以上はペースト状となり、製品製造における好ましい液状を保つ含有量は１０％以下である。脱水細菌を１０％含む該組成物を醗酵乳として１０％加えれば１ｇ当り１０１１〜１０１０個／ｇの菌となり、疎水性溶媒に脱水細菌を入れない醗酵技術では至難であり、本発明の有用性がより明らかとなる。
【００１４】
本発明において、「脱水細胞」とは細胞以外の培地成分を除去し、すなわち疎水性溶液に溶解しないものを除去して、細胞を乾燥したものである。乾燥方法は、生きたまま細胞を使用するには凍結乾燥が好ましく、生菌率が下がって良い場合は減圧乾燥、ドラム乾燥、噴霧乾燥等が利用できる。
【００１５】
培養液には多くの親水性物質が存在するためこれを除去することが重要であり、培養液を洗浄する方法は通常使用される生理食塩水や緩衝液では、乾燥後食塩や無機塩類が残存するため不適であり、除菌若しくは殺菌／滅菌した清水、例えば蒸留水、イオン交換水、膜ろ過水、若しくは水道水で洗浄することが重要である。培養液を遠心分離機にて１００×ｇ〜１００００×ｇ、５分〜６０分間、遠心分離し、上澄みをデカンテーションして沈殿物にほぼ除した量の清水を加え攪拌にて均質にし、１〜１０回以上同様な条件で遠心洗浄することで、菌体以外の親水性物質を除去する。より好ましい条件は、５００×ｇ〜５０００×ｇ１０分〜４５分間の遠心分離後、同条件で２〜５回遠心洗浄すれば良い。第２の洗浄方法は膜洗浄であるが、遠心洗浄と同様に、培養終了後、ろ過装置で清水にて洗浄するが、ろ過穴の直径は０．０１〜１０００μｍでろ過し、除した量程の清水を加え均質にして１〜１０回、同様な条件でろ過洗浄することで親水性物質を除去するが、連続的に行っても良い。より好ましい条件は、細胞の大きさより若干小さなもので０．１〜１００μｍの穴の膜で、同条件で２〜５回ろ過洗浄すればよい。
【００１６】
本発明において、「脱水細胞」の種類は、乾燥した動物細胞、植物細胞、藻類、真菌、細菌が挙げられ、それぞれの用途に応じて用いれば良い。乾燥方法は凍結乾燥、減圧乾燥、ドラム乾燥、噴霧乾燥などが使用でき、利用する細胞の目的により生死体の率を考慮して乾燥法を選択することができる。特に生きた細胞の乾燥体を得るには凍結乾燥が最適で、凍結温度が−１℃〜−９０℃で、凍結解凍温度は−２０℃〜５０℃が良い。より好ましい条件としては、凍結温度が−５℃〜−５０℃、解凍温度が−１０℃〜５０℃が選択される。真空度は１００〜０．００１トール（Ｔｏｒｒ）で良く、好ましくは１０〜０．０１トールで良い。
【００１７】
食品用途に使用される細胞としては乳酸菌、ビフィズス菌、ケフィヤ菌、納豆菌、食用真菌、単細胞藻類、多細胞藻類、薬草組織（例えばハーブの培養組織）等が挙げられる。化粧品や医療用品に使用されるものとしては、乳酸菌、ビフズス菌、医療用細菌、医療用真菌、セルロース、アロエ軟組織、和漢薬組織等が挙げられる。
【００１８】
本発明において、「疎水性溶媒」とは親水性溶媒に対するもので、「油脂類」とは、動植物由来の生物系油脂と石油由来の鉱物系油脂である。具体的には、菜種油、ゴマ油、大豆油、オリーブ油、カカオ油脂、ヤシ油、パーム油、パーム核油、小麦胚芽油、アボガド油、ひまし油、乳脂肪、魚油、豚脂、牛脂、扁桃油、馬油、ワセリン、パラフィンや蝋状油脂、シリコン、プラスティックベース等が挙げられる。また、トコフェロール、カロティン等の脂溶性ビタミン類も挙げられる。
【００１９】
脱水細胞の疎水性溶媒への溶解／溶融法は、疎水溶媒を容器に採り攪拌機で攪拌しながら、３．５〜５００メッシュに篩った脱水細胞を少量ずつ落し込んで溶解／溶融するが、疎水溶媒が作業工程温度でゲル化している場合は加温等で液体として溶解／溶融を開始する。細胞の大きさで篩のメッシュを決めるが、好ましくは１０〜２００メッシュの篩を使用して製造すると良い。疎水性溶媒に細胞を溶解できる量は細胞により異なるが、重量で４０％程まで均一に溶解／溶融し、また、細胞の量が多い場合には疎水性溶媒を加える方法で混練りし、ペースト状にすることができる。生きている場合、細胞を溶解／溶融する溶媒の温度は７５℃以下で溶媒が液体の範囲で行うことができるが、より好ましくは０℃〜６５℃である。
【００２０】
本発明では、疎水性の油脂に溶融させた細胞は、生きたままで保存でき、また、水系に乳化させても休眠状態で存在する。本発明による乳化法は該組成物を食品中に含まれる乳化物質、例えば乳蛋白質、大豆たんぱく質、レシチンなどのリン脂質等で乳化できるが、食品に使われるモノ／ジグリセライド、ポリグリセリンエステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール酸エステル、シュガーエステル等の乳化剤が使用でき、化粧品や医療用品にはイオン系、非イオン系界面活性剤が使用できる。凍結乾燥細胞を７５℃までの温度で油脂に溶解させ、蛋白質やリン脂質若しく乳化剤を用いて、１〜５０ＭＰａ（メガパスカル）の圧力で乳化するが、より好ましくは１０〜３０ＭＰａである。乳化機は既知のもので良いが、食品の場合はアセプティックホモジナイザーがよい。本発明の乳化物は平均粒子径が０．０１〜１００μｍの大きさで良く、より好ましくは平均粒子径０．１〜３０μｍが好適である。
【００２１】
本発明の組成物や組成物を乳化した食品は、例えば、乳酸菌やビフィズス菌を乳脂肪又は植物性油脂に溶解／溶融させて脱脂乳又は豆乳にて乳化した醗酵乳や醗酵飲料であり、好気性条件で製造できるビフィズス菌入りのヨーグルトや酵母が存在するのに炭酸ガスを生じないケフィヤ飲料や機能性食品である。また、牛乳や豆乳の味を変えずにハーブ、朝鮮人参組織やクロレラを入れた食品が製造できる。鉱物系油脂又は／及び生物系油脂に乳酸菌やセルロースを溶解させると、油脂にてコーティングされた菌は花粉周囲に付着し、菌塊や微細セルロースは花粉やハウスダストを吸着する性質があり、鼻や目の粘膜近くに塗ることでアレルゲンの発生を不活性化して、花粉症やハウスダストアレルギーの発生を軽減するといった花粉やハウスダストの吸着塗布剤ができ、保水性のあるアロエ軟組織を混入すれば、保湿性を有する保湿クリームが製造できる。尚、脱水細胞を含んだ疎水性溶媒又はその乳化物を添加する食品、化粧品、医療用品はこれらに限定されるものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。尚、実施例における組成は重量％で示す。
【実施例１】
【００２３】
「湿菌体」、「脱水菌体培養物」及び「脱水菌体」の溶解性比較
乳酸菌を培養する培地は任意の液体乳酸菌培地でよいが、ここでは乳酸菌用ＭＲＳブロス（Ｄｉｃｏ社）で培養液を作製し、１２０℃１５分の滅菌を行った後に４０℃に冷却し、（ａ）ラクトバチルス・ブルガリクスＪＣＭ１００２、（ｂ）ラクトバチルス・ラムノーサスＡＴＣＣ７４６９、（ｃ）ラクトコッカス・ラクチスＡＴＣＣ１５３４６を前記培地で３８℃１８時間各々予備培養した菌液をそれぞれの培地に２％加えて低速の間欠攪拌のタンクを使用し、３８℃にて２０時間培養して各々の培養物を得た。この培養物を凍結乾燥して「脱水乳酸菌培養物」を製造した。また培養物を遠心分離機（５４２０；株式会社久保田製作所）にて５０００×ｇ１５分間遠心分離し、デカンテーションした後沈殿物に除去した上澄みとほぼ等量の無菌水を加え均質にし、同様な条件で３回遠心洗浄した。菌体以外のものを除去して、「湿乳酸菌」を製造した。この湿乳酸菌を凍結温度−３０℃で、凍結乾燥機（ＲＬＥ２；日精株式会社）を使用し、真空度０．２トール、凍結解凍温度は３０℃で凍結乾燥し「脱水乳酸菌」を製造した。
【００２４】
ビフィダス菌用ＧＡＭブイヨン培地を調整し、１２０℃１５分の滅菌を行った後に冷却し、（ｄ）ビフィドバクテリウム・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７を前記培地で３７℃１８時間予備培養した菌液を２％加えて無攪拌の容器を使用し、簡易嫌気（アネロパック；三菱ガス化学株式会社）３７℃にて２０時間培養して培養物を得た。この培養物を凍結乾燥して「脱水ビフィズス菌培養物」を製造した。また、培養物を穴の大きさ０．１μの膜（ＭＬＥ−７１０１；株式会社クラレ）にて濃縮し、除去した液とほぼ等量の無菌水を加え均質にし、同様な濃縮条件で３回ろ過洗浄した。菌体以外のものを除去して、「湿ビフィズス菌」を製造した。この湿ビフィズス菌を乳酸菌と同様に凍結乾燥処理し、「脱水ビフィズス菌」を製造した。
【００２５】
攪拌しながらイオン交換水、精製菜種油及び流動パラフィンのそれぞれの９部に「湿菌体」、「培養物脱水菌体」及び「脱水菌体」の各々１部を３０℃にて溶解／溶融した。溶解／溶融したその結果を表１に示した。「湿乳酸菌ａ、ｂ、ｃ及び湿ビフィズス菌ｄ」はイオン交換水に良くとけ、精製菜種油、流動パラフィンには全く溶融せず、「脱水乳酸菌及びビフィズス菌培養物」はオン交換水に良く溶解／溶融し、精製菜種油、流動パラフィンにはママコ状に分散した。「脱水乳酸菌及び脱水ビフィズス菌」はオン交換水にママコ状になり、精製菜種油、流動パラフィンには均一に溶解／溶融した。このことにより、疎水性溶媒に容易に溶解／溶融させる方法は、培養液を除去して細胞を洗浄し乾燥する工程が必要であることが明確になった。
【００２６】
【表１】
【実施例２】
【００２７】
脱水乳酸菌及び脱水ビフィズス菌の疎水性溶媒中の生存性
凍結乾燥乳酸菌（ｂ）１部ずつを精製大豆油９９部及びワセリン９９部に溶解、凍結乾燥ブフィズス菌（ｄ）１部を乳脂肪（バターオイル）９９部に溶解し、１０℃に保ち７日後、１４日後、２８日後の菌数を検査した結果を表２に示した。この結果から、油脂に溶融した乳酸菌、ビフィズス菌は死滅することなく菌数を保持できることが証明された。このことから、食品中に生きた状態で利用できることが判明した。
【００２８】
【表２】
【実施例３】
【００２９】
植物油脂含有豆乳発酵乳
精製大豆固化油２．９４部を８５℃にて加温殺菌した後、４０℃に冷却し、実施例１の凍結乾燥乳酸菌（ｂ）０．０６部を無菌室で溶融させた。また、豆乳９７部を８５℃１５分間の殺菌をした後４０℃に冷却し、先の乳酸菌の入った精製大豆固化油を混合し、ホモジナイザー（Ｌ−０１；三和機械株式会社）で２０ＭＰａの圧力で乳化した後容器に詰め、乳酸菌を生きたままで含有するが、風味変化のない乳酸菌入り豆乳飲料を製造することができた。１週間後の乳酸菌は１．９×１０９個／ｇを検出した。
【実施例４】
【００３０】
ビフィズス菌を含有した醗酵乳の製造法
バターを８５℃にて溶解して水分をデカンテーションで除いた後、４０℃に冷却したバターオイル２，９８部に凍結乾燥した実施例１の凍結乾燥ビフズスキン菌（ｄ）０．０２部を無菌室で溶解／溶融させた。また、脱脂乳９６部、脱脂粉乳１部を加えてミックスとし、８５℃１０分間の殺菌をした後、４０℃に冷却して先のビフィズス菌の入ったバターオイルを混合し、ホモジナイザーで１５ＭＰａの圧力で乳化した後、風味のよいブルガリヤ菌とラクチス菌のスターターを加えて容器に詰めて４０℃にて醗酵させ、ビフィダス菌を生きたままで含有し、風味が良いプレーンヨーグルトを製造することができた。１週間後のブフィズス菌は４．２×１０８個／ｇを検出した。
【実施例５】
【００３１】
スギ花粉の吸着性評価
Ａ液として、流動パラフィン１０部にスギ花粉を適量分散させた。Ｂ液として、凍結乾燥乳酸菌（ｂ）０．６部を５０℃に加温した長鎖炭化水素（流動パラフィン７部＋ワセリン２．４部）９．４部に溶解／溶融させた。Ｃ液として、脱脂綿繊維０．６部を５０℃に加温した長鎖炭化水素（流動パラフィン７部＋ワセリン２．４部）９．４部に溶解／溶解させた。Ａ液１部とＢ液１部を加え、ゆっくりと攪拌させた後、ミクロピペットで０．１ｍｌ採り平らに１０ｍｍ×１０ｍｍの面積に広げ、倍率２００の顕微鏡で２０視野を鏡検した。また、Ａ液１部とＣ液１部を加え、同様に鏡検した。その結果は、Ａ液のみではきれいに分散していたスギ花粉が６４個／２０視野あった。Ａ＋Ｂ液は、２個以上に集合し吸着したものが３５個／２０視野あり、単独である花粉にも周囲に菌塊が付着している様子が確認された。Ａ＋Ｃ液は２個以上に集合し吸着したものが６個あった。
【００３２】
また、Ｄ液として精製大豆油１０部にスギ花粉を適量分散させた。Ｅ液として凍結乾燥乳酸菌（ｂ）０．６部を精製大豆油９．４部に溶解、Ｆ液として脱脂綿繊維０．６部を精製大豆油９．４部に溶解した。Ｄ液単独、Ｄ液１部とＥ液１部、Ｄ液１部とＦ液１部を混ぜ、長鎖炭化水素と同様に処理し鏡検した。
【００３３】
これらの結果を表３に示した。このことから、特に乳酸菌を溶解／溶融した長鎖炭化水素は花粉を吸着し、凝集してブドウ状になることがわかった。これにより、流動パラフィン及びワセリンなどの長鎖炭化水素に乳酸菌を溶解／溶融させた組成物を鼻や目の回りの皮膚に塗ることで疎水性溶剤に溶解／溶融した乳酸菌が花粉の回りに付着に吸着し、乳酸菌塊に凝集し、花粉を不活性することで花粉症の軽減が図られ、また、保湿性の脱水アロエ軟組織を加えれば保湿化粧品原料となり、乳化させて点眼剤や保湿スプレーに使用でき、化粧用クリームに乳化させれば化粧品にも利用できる。
【００３４】
【表３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱水細胞を疎水性溶媒に溶解／溶融したものからなる組成物。
【請求項２】
請求項１の脱水細胞が脱水微生物である組成物。
【請求項３】
請求項１の脱水細胞が凍結乾燥細胞で、請求項２の脱水微生物が凍結乾燥微生物である組成物。
【請求項４】
請求項１〜３の疎水性溶媒が油脂類である組成物。
【請求項５】
請求項１〜４記載の組成物の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜４記載の組成物の乳化方法。
【請求項７】
請求項１、２、３、４からなる組成物を含有する食品、化粧品及び医療用品が、醗酵乳、飲料、醗酵豆乳、機能性食品、保湿性化粧品、花粉吸着剤、ハウスダスト吸着剤等である。
【請求項１】
脱水細胞を疎水性溶媒に溶解／溶融したものからなる組成物。
【請求項２】
請求項１の脱水細胞が脱水微生物である組成物。
【請求項３】
請求項１の脱水細胞が凍結乾燥細胞で、請求項２の脱水微生物が凍結乾燥微生物である組成物。
【請求項４】
請求項１〜３の疎水性溶媒が油脂類である組成物。
【請求項５】
請求項１〜４記載の組成物の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜４記載の組成物の乳化方法。
【請求項７】
請求項１、２、３、４からなる組成物を含有する食品、化粧品及び医療用品が、醗酵乳、飲料、醗酵豆乳、機能性食品、保湿性化粧品、花粉吸着剤、ハウスダスト吸着剤等である。
【公開番号】特開２００９−２７３４５０（Ｐ２００９−２７３４５０Ａ）
【公開日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１５３５２５（Ｐ２００８−１５３５２５）
【出願日】平成２０年５月１６日（２００８．５．１６）
【出願人】（５９９０７２２９７）日之出産業株式会社 (6)
【出願人】（５０８１７４３４４）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月１６日（２００８．５．１６）
【出願人】（５９９０７２２９７）日之出産業株式会社 (6)
【出願人】（５０８１７４３４４）
【Ｆターム（参考）】
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