脱色素剤または抗突然変異および抗発癌剤として使用のチオ尿素を含んでなる医薬
本発明は、一般式（Ｉ）の少くとも１種のチオ尿素、または一般式（IIａ）、（IIｂ）および（III）のそのモノオキシドもしくはジオキシド誘導体の少くとも１種、またはそれらの混合物を含んでなる医薬または化粧品組成物に関する。この医薬は、チロシナーゼを阻害するために、メラニン合成を阻害するために、皮膚をライトニングまたは脱色素するために、または老班を除去するために、並びに抗突然変異および抗発癌剤として有利に用いられる。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、特に脱色素作用を有するが、抗突然変異および／または抗発癌剤としても、チオ尿素類またはそれらのモノオキシドもしくはジオキシド誘導体を含有した医薬品に関する。
【０００２】
ヒトにおける皮膚色素沈着は、メラノサイトと称される独特な細胞群で起こる、複雑な一連の細胞プロセスから生じている。メラノサイトは表皮の下部に存在し、それらの機能は、紫外線の有害作用から体を防御する、メラニンと称される褐色色素を合成することである。メラニンは、メラノサイトの内側に存在する顆粒、メラノソームに蓄積される。メラノソームはメラノサイトから放出され、メラノソームに含有されたメラニンを同化させるケラチノサイトにより皮膚の表面へ輸送される。皮膚の黒さは、メラノサイトにより合成されてケラチノサイトへ移されたメラニンの量と比例する。ある場合には、メラニン形成を減少または阻害させて、例えば皮膚を白くすること、老化による斑点を除去すること、またはメラノサイトの過剰活性を減少させることが好ましい。
【０００３】
過酸化水素または過酸化亜鉛のような過酸化物を含有した化粧品組成物は、皮膚に現れる赤色部分のような斑点を除去する目的でずっと用いられてきた。しかしながら、過酸化物は極端に不安定であり、それらの貯蔵に問題を起こす。更に、化粧品基剤へのこれら過酸化物の安定的配合は困難であり、過酸化物自体も十分な漂白効果を有していない。
【０００４】
他方、ビタミンＣ、システインまたはコロイド状イオウを含有した化粧品は、皮膚を漂白するために用いられ始めた。しかしながら、これら物質の効果は満足しうるものではない。
【０００５】
長い間、ヒドロキノンが標準の脱色素分子となっており、多数の皮膚化粧品で用いられてきた。しかしながら、この物質は危険性がないとは言えず、メラノサイトに対して非常に細胞毒性があり、不可逆的な脱色素を引き起こす可能性がある。
【０００６】
最近、コウジ酸が、ヒト皮膚でメラニンの形成を阻害する物質として、有効に用いられている。その結果、コウジ酸（日本国特許出願公報Ｎｏ．５６‐１８５６９）、コウジ酸とケイ皮酸または安息香酸のような芳香族カルボン酸とのエステル（日本国特許出願公報Ｎｏ．６０／１００００５）、またはコウジ酸のジエステル（日本国特許出願公報Ｎｏ．６１‐６０８０１および６０‐１７９６１）を含有する、皮膚を脱色素させるための様々な化粧品が記載されてきた。したがって、これらのコウジ酸およびコウジ酸のエステルは、メラニン形成を阻害しうる物質である、として知られている。しかしながら、コウジ酸の効力は個々に異なっており、平均すると不十分である。
【０００７】
イソチオシアネート類およびチオシアネート類も脱色素剤として記載されている（ＷＯ０２／０５８６６４）。
【０００８】
したがって、他の脱色素剤を見出す差し迫った必要性がなお存在しているのである。
【０００９】
現在までに、フェニルチオ尿素類のみが、脱色素活性を有するとして記載されてきた（特許出願ＵＳ２００２／００４４９１４）。他のあるチオ尿素類、例えばチオ尿素、フェニルチオ尿素およびジメチルチオ尿素は、感作性であることが知られている（Contact and Photocontact sensitivity problems associated with thiourea and its derivatives(チオ尿素およびその誘導体に伴う接触および光接触感作問題)：A review of the literature and case reports.A.Dooms-Goosens et al.,British Journal of Dermatology,116,4,573-579）。更に、それらのうち一部、カルビマゾールは、抗甲状腺剤として用いられている。
【００１０】
意外にも、本発明者らは、チオ尿素群に属するある分子が、インビトロでメラニン合成に対して著しい阻害効果を有することを発見したのである。
【００１１】
確かに、１，３‐ビス‐（５‐メタンスルフィニルブチル）チオ尿素は、皮膚との、特に下記プロセスによる熱水との長期接触に際する、スルフォラファン（脱色素活性を有するイソチオシアネート：ＷＯ０２／０５８６６４）の分解産物の１つであることは知られている：
【化１】
（Thermal degradation of sulforaphane in aqueous solution(水溶液中におけるスルフォラファンの熱分解),Yi Jin,Mingfu Wang,Robert T.Rosen,and Chi-Tang-Ho.J.Agric.Food Chem.1999,47,3121-3123）。しかしながら、その医薬または美容活性は、特に脱色素剤として、先行文献で記載または示唆されたことが全くなく、脱色素物質の分解産物が該脱色素物質より大きな活性を有するであろうことなどは自明ではなかった。
【００１２】
突然変異誘発は、自発的または自然に、あるいは化学物質、高エネルギー照射、ストレスなどに起因する二次作用として、ＤＮＡでおよび細胞の発達に際して生じる。
【００１３】
突然変異原は、このような突然変異を起こす因子である。しばしば、それらは発癌性（即ち、癌を誘導しうる）でもある。現代社会は、環境上における突然変異原の存在に現在では気付き、懸念している。突然変異原はどこでも生じる；一部は植物で自然に生じ、他の多くは（特に調理中に）有機物質を燃やすことで生じ、他は工業により生じる。今日、人々は多くの健康問題に直面している。これら健康問題の多くは、細胞およびＤＮＡの損傷の増加に関与する突然変異原、更には突然変異誘発因子による人体の細胞およびＤＮＡの損傷から派生している。これらの突然変異原および突然変異誘発因子には、特に汚染、ストレス、老化、喫煙、紫外線、過度の運動、組織障害などがある。細胞およびＤＮＡの損傷に起因する疾患として、我々は老化、老化による斑点、癌、白内障、乾皮症、疲労、皮膚癌、ストレス性ダメージおよびシワを挙げられる。
【００１４】
医薬組成物は体内で抗突然変異活性を生じさせるために利用しうるが、それらは時には重篤な副作用を有することがある。
【００１５】
結果的に、体内の突然変異誘発を防ぐ抗突然変異効果、および抗癌効果を有する新製品を見出す必要性がある。
【発明の具体的な説明】
【００１６】
意外にも、本発明者らは、チオ尿素群に属するある分子が、突然変異原物質およびＵＶＢの双方に対して、顕著な抗突然変異および抗癌効果を有することを発見したのである。
【００１７】
本発明は、下記一般式Ｉの少くとも１種のチオ尿素：
【化２】
（上記式中：
ｎは１〜１２の整数である；
ｍは１〜１２の整数である；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して、水素原子、Ｃ１‐Ｃ６アルキル基またはアリール基を表わす）
または下記一般式IIａ、IIｂおよびIIIのそのモノオキシドもしくはジオキシド誘導体の少くとも１種：
【化３】
（上記式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍおよびｎは前記の通りである）またはそれらの混合物を含有した医薬品に関する。
【００１８】
本発明の意味において、用語“Ｃ１‐Ｃ６アルキル基”は、直鎖または分岐で炭素原子１〜６のあらゆるアルキル基、特にＣＨ３基を意味する。
【００１９】
本発明の意味において、用語“アリール基”は、共役または縮合してもよい、炭素原子５〜８の１以上の芳香環を意味する。特に、アリール基はフェニルまたはナフチル基であり、ハロゲン原子、上記のようなアルキル基、ＯＨ基またはニトロ基で置換してもよい。
【００２０】
有利には、一般式Ｉ、IIａ、IIｂおよびIIIのチオ尿素類は、基Ｒ１およびＲ２が同一、Ｒ３およびＲ４が同一で、ｍ＝ｎであるようなものである。
更に一層有利には、Ｒ１＝Ｒ２＝ＣＨ３である。
有利にはｍ＝ｎ＝４である。
有利にはＲ３＝Ｒ４＝Ｈである。
更に一層有利には、それには、下記式の１，３‐ビス‐（５‐メタンスルフィニルブチル）チオ尿素、１‐（５‐メタンスルフィニルブチル）‐３‐（５‐メタンスルホニルブチル）チオ尿素または１，３‐ビス‐（５‐メタンスルホニルブチル）チオ尿素がある：
【化４】
【００２１】
本発明によるチオ尿素類は市販されているか、または例えば１，３‐ビス‐（５‐メタンスルフィニルブチル）チオ尿素の場合は、スルフォラファンの熱分解により製造される。特に、モノオキシドまたはジオキシド誘導体は、例えば過酸化水素のような酸化剤の作用により、対応する未酸化チオ尿素から得られる。
【００２２】
有利には、本発明による医薬品は、チロシナーゼを阻害するために、特にチロシナーゼの作用を５０％減少させるために、メラニンの合成を阻害するために、およびメラノサイトの過剰活性を減少させるために用いうる。
【００２３】
有利には、本発明による医薬品は、特に突然変異原物質および／またはＵＶＢに対する抗突然変異剤として、および／または抗発癌剤として用いうる。
【００２４】
有利には、この医薬品は、癌、特に皮膚の癌、老化による斑点、老化、特に皮膚の老化、およびシワなどの出現を防止しうる。
【００２５】
本発明は、下記一般式Ｉの、本発明による、少くとも１種のチオ尿素：
【化５】
（上記式中：
ｎは１〜１２の整数である；
ｍは１〜１２の整数である；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して、水素原子、Ｃ１‐Ｃ６アルキル基またはアリール基を表わす）
または下記一般式IIａ、IIｂおよびIIIのそのモノオキシドもしくはジオキシド誘導体の少くとも１種：
【化６】
（上記式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍおよびｎは前記の通りである）またはそれらの混合物を含有した化粧品組成物にも関する。
【００２６】
有利には、上記の化粧品組成物は脱色素用組成物である。それは、表皮をライトニング、ホワイトニングまたは脱色素するために、特に老化またはシミによる、皮膚の斑点を除去するために、または表皮の色素沈着を防止するために用いうる。有利には、上記の組成物は局所適用向けである。
【００２７】
有利には、本発明による医薬品または化粧品組成物は、経口または局所用、有利には局所用の形態をとる。それらは、特に皮膚の浸透により活性成分の性質および到達性を改善させる補助剤を加えて、このタイプの投与向けによく知られた形態、即ち、特に、例えばローション、ムース、ジェル、分散液、スプレー、セラム、マスク、ボディローションまたはクリームの形態をとる。これらの組成物は、本発明による医薬品または化粧品とは別に、通常水または溶媒、例えばアルコール類、エーテル類またはグリコール類をベースにした、生理学的に許容される媒体を通常含有している。それらは、界面活性剤、保存剤、安定剤、乳化剤、増粘剤、相加または可能であれば相乗効果を発揮する他の活性成分、微量元素、精油、香料、着色料、コラーゲン、ケミカルまたはミネラルフィルター、モイスチャライザーまたは温泉水も含有してよい。
【００２８】
本発明は、皮膚への本発明による化粧品組成物の適用による、皮膚の美容トリートメントにも関する。
【実施例】
【００２９】
下記例は説明のために示されており、限定するためではない。
【００３０】
例１：スルフォラファンから出発する１，３‐ビス‐（５‐メタンスルフィニルブチル）チオ尿素の合成
（Ｄ，Ｌ）‐スルフォラファンの合成：
予めナトリウムで蒸留した無水エタノール８００ｍｌに４‐クロロブチロニトリル（ref.Aldrich C 3,000-0）４０ｇを溶解させる。次いで、メタンチオエート（ref.Fluka 71742）２７ｇを加え、２５℃で１５時間攪拌する。懸濁液をペーパーで濾過し、減圧下で蒸発させる。エチルエーテル４００ｍｌに入れる。再びペーパーで濾過する。未精製４‐メチルチオブチロニトリル３２ｇを含有したエーテル溶液を得る。エチルエーテル４００ｍｌ中水素化アルミニウムリチウム２５ｇの懸濁液を調製する。水素化アルミニウムリチウムの懸濁液へ徐々に４‐メチルチオブチロニトリルの溶液を加え、２時間３０分還流する。次いで、還流下、蒸留水８０ｍｌをゆっくり加えることにより、懸濁液を中和する。沸騰が止んだら、蒸留水１２０ｍｌを加えて、残留した水素化物の中和を完了させる。ガラスフリットで濾過する。フィルターにおいて不溶性物質をエチルエーテル２００ｍｌで洗浄する。エーテルフラクションを合わせ、蒸発乾固させる。メチルチオブチルアミン２６．９ｇを得る。得られた生成物をアセトン８０ｍｌに入れ、次いで３５％過酸化水素２３ｍｌを一度に少しずつ加える。水浴に５０℃で一夜放置する。次いで、少量の活性炭を加え、濾過し、チオホスゲン２０ｍｌを含有したクロロホルム２００ｍｌ、次いで水酸化ナトリウムの５％水溶液３００ｍｌをゆっくり加える。３０分間放置して作用させる。次いで、ジクロロメタン２００ｍｌで８回にわたり混合液を向流抽出する。有機相を集め、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させる。次いで、７．１０−２ｔｏｒｒ下１３５℃で残渣を再蒸留する。我々はＤ，Ｌ‐スルフォラファン１２．５ｇを得、これを質量スペクトル測定により同定する。
【００３１】
１，３‐ビス‐（５‐メタンスルフィニルブチル）チオ尿素の合成
赤外スペクトルをPerkin-Elmer 1600 F11R（ニート）で得た。プロトンおよび炭素‐１３ ＮＭＲスペクトルを、プロトンの場合２００ＭＨｚ、炭素の場合５０．３ＭＨｚで、Brucker AM 200SYで得た。化学シフトは、プロトンの場合７．２５ｐｐｍおよび炭素の場合７６．９ｐｐｍ（重水素置換クロロホルムの中心線）における、重水素置換クロロホルムＣＤＣｌ３のシグナルに対する百万分率（ｐｐｍ）に相当する。質量スペクトルは、化学イオン化（ＮＨ３）または電子衝撃の方法により、Normag/SIDAR V2.3で得た。
【００３２】
クロマトグラフィー
反応は、シリカゲルタイプ６０Ｆ２５４（Merck,Art.7735）のプレート上で、薄層クロマトグラフィーによりモニターした。試薬および生成物は、リンモリブデン酸の１０％エタノール溶液との処理、次いで加熱により、ＵＶ光で視覚化させた。フラッシュクロマトグラフィーは、２３０〜４００メッシュのシリカゲルＩＣＮ６０で行った。
【００３３】
溶媒の蒸留
エチルエーテルおよびＴＨＦを窒素下においてナトリウム／ベンゾフェノンで蒸留した。クロマトグラフィーに用いられるシクロヘキサン、酢酸エチルおよびメタノールは、使用前に蒸留した。
【００３４】
方法
不活性雰囲気下において、上記で得られたスルフォラファン２ｇ（１１ｍｍｏｌ）を水１５ｍｌで希釈し、次いで光から保護しながらその溶液を２４時間還流する。室温で、減圧下溶液を濃縮し、シリカゲルのカラムでのクロマトグラフィーのためにジクロロメタンに残渣を入れて（溶離液：ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ：９０／１０）、４３％の収率で無色油状物として１，３‐ビス‐（５‐メタンスルフィニルブチル）チオ尿素（ビスＭＳｉＢＴ）１．７０ｇ（５ｍｍｏｌ）を得る。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ）：６．４５（ｄｌ，２Ｈ，ＮＨ），３．５３（ｔ，Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），２．８７（ｍ，４Ｈ），２．６５（ｓ，６Ｈ），１．７８（ｍ，８Ｈ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（５０．３ＭＨｚ）：２４．０（ＣＨ２），３２．１（ＣＨ２），４１．２（ＣＨ２‐ＣＨ２），４７．２（ＣＨ３），５７．４（ＣＨ２ＳＯ），Ｃ（ＩＶ）観察されず。
ＩＲ（ν，ｃｍ−１）：２１７６，２０９６，１１４０，９４０ｃｍ−１。
ＩＣ．ＭＳ ｍ／ｚ：３１２（ＭＨ＋）。
【００３５】
例２：１‐（５‐メタンスルフィニルブチル）‐３‐（５‐メタンスルホニルブチル）チオ尿素の製造
スルフォラファン分子の２イオウ原子のうち１つのみの酸化を、不活性雰囲気下ではなく、大気中で、１，３‐ビス‐（５‐メタンスルフィニルブチル）チオ尿素の合成の例１の反応を行うことにより達成した。
スルフォラファン１ｇ（５．５ｍｍｏｌ）を水１０ｍｌで希釈し、次いで光から保護しながらその溶液を２４時間還流する。室温で、減圧下溶液を濃縮し、シリカゲルのカラムでのクロマトグラフィーのためにジクロロメタンに残渣を入れて（溶離液：ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ：９０／１０）、１２％の収率で無色油状物として１‐（５‐メタンスルフィニルブチル）‐３‐（５‐メタンスルホニルブチル）チオ尿素（ＭＳＢＭＳＢＴ）２００ｍｇを得る。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ）：６．５５（solid，２Ｈ，ＮＨ），３．５５（ｔ，４Ｈ，ＣＨ２），３．１５（ｔ，２Ｈ，ＳＯ２ＣＨ２），２．８０（ｔ，２Ｈ，ＳＯＣＨ２），２．６０（ｓ，３Ｈ，ＳＯＣＨ３），２．９０（ｓ，３Ｈ，ＳＯ２ＣＨ３），１．８０‐１．８７（ｍ，８Ｈ，ＣＨ２）。
１３Ｃ ＮＭＲ（５０．３ＭＨｚ）：２０．５（ＣＨ２），２８．５（ＣＨ２），３９．８（ＣＨ３ＳＯ），４１．０（ＣＨ３ＳＯ２），４３．５（ＣＨ２‐ＮＨ），５４．１（ＣＨ２ＳＯ），４４．８（ＣＨ２ＳＯ２），１８３．３５（Ｃ＝Ｓ）。
ＩＲ（ν，ｃｍ−１）：２１７６，２０９６，１１４０，９４０ｃｍ−１。
ＩＣ．ＭＳ ｍ／ｚ：３２８（ＭＨ＋）。
【００３６】
例３：１‐イソチオシアナト‐４‐メチルスルホニルブタンから１，３‐ビス‐（５‐メタンスルホニルブチル）チオ尿素の製造
水１５ｍｌ中１‐イソチオシアナト‐４‐メチルスルホニルブタン１ｇ（５ｍｍｏｌ）の溶液を３時間還流する。室温で、減圧下溶液を濃縮し、メタノールからの再結晶化により残渣を精製して、４０％の収率でベージュ色固体物として１，３‐ビス‐（５‐メタンスルホニルブチル）チオ尿素（ビスＭＳｏＢＴ）５３５ｍｇを得る。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ）：６．５０（ｓｌ，Ｈ，ＮＨ），３．５５（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），２．７５（ｔ，４Ｈ，ＳＯ２ＣＨ２），２．６０（ｓ，６Ｈ，ＳＯ２ＣＨ３），１．７０‐１．９０（ｍ，８Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２）。
１３Ｃ ＮＭＲ（５０．３ＭＨｚ）：２１．０（ＣＨ２），２９．２（ＣＨ２），３８．５（ＣＨ３），４４．０（ＣＨ２‐ＮＨ），５３．９（ＣＨ２ＳＯ），１８２．６（Ｃ＝Ｓ）。
ＩＲ（ν，ｃｍ−１）：２１６８，２０９６，１１４４，９３０ｃｍ−１。
ＩＣ．ＭＳ ｍ／ｚ：３４４（ＭＨ＋）。
融点：１４２℃。
【００３７】
例４：ビスＭＳｉＢＴからビス（ＭＳｏＢＴ）の製造
０℃で、アセトン１０ｍｌ中ビスＭＳｉＢＴ（１ｇ，３ｍｍｏｌ）の溶液へ３５％過酸化水素０．７０ｍｌ（２．２equiv.，６．６ｍｍｏｌ）をゆっくり加える。次いで、反応媒体を室温で４０時間放置して反応進行させる。真空蒸発によりアセトンを除去する。水性残渣をクロロホルムに入れ、その相を硫酸ナトリウムで直接トラップする。真空下で有機相を濃縮し、メタノールからの再結晶化で残渣を精製して、３０％の収率でベージュ色固体物としてビスＭＳｏＢＴを得る。
【００３８】
例５：コウジ酸と比較したビスＭＳｏＢＴの抗チロシナーゼ効果の研究
チロシナーゼを阻害する能力の測定：
下記反応を用いる：無色のＬ‐ドーパ（Ｌ‐３，４‐ジヒドロキシフェニルアラニン、Sigma社から得られる（ref.Ｄ‐９６２６））を、４７５ｎｍで吸収する有色ドーパクロムに酸化させる。この反応は真菌チロシナーゼ（ＥＣ１．１４．１８．１、Sigma社から得られる（ref.Ｔ‐７７５５））により触媒させる。３０℃で時間の関数として光学濃度（Ｏ．Ｄ．）を測定することにより、反応の速度を記録する。
【００３９】
用いられた各溶液は下記組成を有している：
緩衝液ｐＨ６．８：
リン酸緩衝液０．１Ｍ，ｐＨ６．８
基質溶液：
緩衝液ｐＨ６．８中Ｌ‐ドーパ５ｍＭ
インヒビターの溶液：
インヒビター分子は、溶解度に応じて、緩衝液ｐＨ６．８、５０％メタノール（メタノール‐蒸留水）または純粋メタノールに直接溶解させる。
インヒビターの各溶液の重量／容量としての濃度は、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０２５％、０．０１２５％、０．００６２５％および０．００３１２％である。
酵素の溶液：
緩衝液ｐＨ６．８中チロシナーゼ２５０単位
【００４０】
チロシナーゼの作用は、Ｏ．Ｄ．記録で測定された初期反応速度から評価する。インヒビターなし（濃度０）の初期反応速度および異なる試験濃度時の速度に関する曲線をプロットする。分子の阻害力は、チロシナーゼの作用を５０％減少させる濃度として規定される。記録は３分間行い、阻害率（阻害および飽和プラトーの率）を計算する。上記のように得られたビスＭＳｏＢＴは、８．３ｍＭの最終濃度で、チロシナーゼの酵素活性を５０％阻害する。コウジ酸（Aldrich社から入手、ref.22,046-9）は、０．６７０ｍＭの最終濃度で、同阻害率を示す。ビスＭＳｉＢＴおよびＭＳＢＭＳＢＴの低溶解度は、抗チロシナーゼ作用についてそれら分子を試験することが不可能であることを意味した。
【００４１】
例６：コウジ酸およびジメチルチオ尿素と比較したビスＭＳｉＢＴ、ＭＳＢＭＳＢＴおよびビスＭＳｏＢＴの脱色素効果の研究
生体系で脱色素効果を試験して、機能ヒト皮膚に存在するメラニン化単位を表示するために、ビスＭＳｉＢＴ、ＭＳＢＭＳＢＴおよびビスＭＳｏＢＴ分子をメラニン産生ヒトメラノサイト‐ケラチノサイト共培養物でも試験した。
コウジ酸およびジメチルチオ尿素をこの試験で陽性コントロールで用いた。
色素沈着表皮の試料（黒色表現型／空気／液体界面における正常ケラチノサイト‐メラノサイトの共培養物）をMatteKcorporation,ＵＳＡから入手し、その指示に従い培養する。培地もこの製造業者から入手している。物質（コウジ酸３５ｍＭ、Aldrich社,ref.D-18,870-0から得たジメチルチオ尿素２．８ｍＭ、上記の方法で得たビスＭＳｉＢＴ２．８ｍＭ、上記の方法で得たＭＳＢＭＳＢＴ２．８ｍＭおよび上記の方法で得たビスＭＳｏＢＴ２．８ｍＭ）を２１日間培地に適用する。
各物質を培地に溶液として４つの培養ウェルへ適用する。表皮のコントロール試料は徐々に色素沈着するが、最も活性な物質で処理された表皮の試料はさほど黒ずまないという色素沈着性を示すことから、各物質の脱色素効果は明確に目で見える。
【００４２】
脱色素効果は培養ウェルからメラニンの抽出により評価する。
抽出は２つの培養ウェルのプールで行い、０．０５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０ｍＭトリスＨＣｌ（アミノ‐２‐（ヒドロキシメチル）‐２‐プロパンジオール‐１，３），ｐＨ６．８を含有した１％ドデシル硫酸ナトリウム０．４５ｍｌ中でホモゲナイズする。各ホモゲネートへ５ｍｇ／ｍｌでプロテイナーゼＫ２０μＬを加える。４５℃で一夜消化させる。次いで、更にプロテイナーゼＫ２０μＬを加え、インキュベートを４時間続ける。次いで、炭酸ナトリウムの０．５Ｍ溶液５０μＬおよび過酸化水素の３０％溶液１０μＬを加える。試料を８０℃で３０分間維持し、次いでそれらを冷却する。試料をクロロホルム‐メタノール混合液（２：１，ｖ／ｖ）１００μＬで抽出する。１０，０００ｇで１０分間遠心後、４０５ｎｍで上澄の光学濃度を測定する。物質は下記表１で比較されている（結果は共培養物でメラニンの阻害率として表示されている）：
【００４３】
【表１】
【００４４】
意外にも、ビスＭＳｉＢＴはＭＳＢＭＳＢＴ、特にビスＭＳｏＢＴより弱い脱色素活性を示し、約３０％阻害を得るために必要なその濃度は、皮膚をライトニングするための製品として商業上広く用いられている対照分子である、コウジ酸の場合より２５倍低い。したがって、本発明による物質は脱色素活性を有している。
【００４５】
例７：ビスＭＳｏＢＴの抗突然変異効果の評価
この特性はAmes試験の修正法：Thermolab Systems社のVitotox 10キット（6400000）試験で証明した。
一般的に、Vitotox試験は、（細菌のＳＯＳ系により調節される）変異ｒｅｃＮプロモーターの転写調節下でVibrio fisheriのｌｕｘオペロンを含有した細菌に基づいている。細菌と遺伝毒性産物とのインキュベート後、ｒｅｃＮプロモーターを抑制解除させ、ｌｕｘオペロンを発現させる：発光，該発光は産物の遺伝毒性と比例する。一部の産物は光の発生に直接作用するか、または細菌の代謝を増して、偽陽性を生じる。更に、構成ｌｕｘオペロンを有する細菌株をコントロールとして用いる。同株は細胞毒性コントロール（偽陰性）として用いる。
【００４６】
例７．１．：ＭＭＳ（メチルメタンスルホネート）に対するビスＭＳｏＢＴの抗突然変異効果の評価
遺伝毒性分子に対する抗突然変異効果を調べるために、遺伝毒性分子メチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）を用い、標準の突然変異原分子、４‐ニトロキノリンオキシドおよびベンゾ（ａ）ピレンの混合物の遺伝毒性に対して比較する。ＭＭＳを単独でまたはビスＭＳｏＢＴとその濃度を増しながら混合して入れ、発光を比較する。こうして、突然変異誘発の５０％阻害濃度を規定することが可能となる。
（遺伝毒性試験の場合）Salmonella typhimurium ＴＡ１０４ ｒｅｃＮ２‐４および（細胞毒性試験の場合）Salmonella typhimurium ＴＡ１０４ ｐｒｌの培養をNutrient Broth８ｇ／Ｌ培地中で行い、その際に一夜攪拌しながら３７℃でインキュベートする（遺伝毒性試験用の細菌の場合で０．２〜０．５および細胞毒性試験用の細菌の場合で０．４〜０．６のＯ．Ｄ．）。翌日、遺伝毒性試験用の細菌はNutrient Broth培地で１／１０、および細胞毒性試験用の細菌は１／２希釈する。
Ｈ２Ｏ中９０ｍＭのＭＭＳストック溶液を調製し、１／２連続希釈を９６ウェルプレートで行う。標準遺伝毒性物質（４‐ニトロキノリンオキシド（ＮＱＯ）／ベンゾ（ａ）ピレン（ＢＡＰ））をＮＱＯの場合０．４ｐｐｍおよびＢＡＰの場合８００ｐｐｍで用いる。試験物質は代謝活性（フラクションＳ９：シトクロムＰ４５０を含有したミクロソームホモゲネート：２．４５ｍｌ／ｍｌ最終）下でまたはそれなしで用いる。
発光速度は、物質の遺伝毒性および細胞毒性の関数として、Fluoroskan Ascent FL（ThermoLabsystems）で３時間にわたり（５分毎に測定）測定する。
物質はSigma‐Aldrich社から入手している。
【００４７】
結果：
ビスＭＳｏＢＴは、Ｓ９無しの場合で１７ｐｐｍおよびＳ９有りの場合で２０ｐｐｍの、ＭＭＳの突然変異効果の５０％阻害濃度を有している。
【００４８】
例７．２．：ＵＶＢに対するビスＭＳｏＢＴの抗突然変異効果の評価
ＵＶＢに対する抗突然変異効果を評価するために、２０単位（ＲＬＵ）の平均発光をもたらす時間にわたり細菌培養物に照射する。次いで、ビスＭＳｏＢＴを照射前に濃度を増しながら培地に入れ、５０％阻害濃度を調べる。
例１の操作に従うが、但しＭＭＳなしで行い、ＵＶＢ２５４ｎｍで２０秒間にわたり細菌培養物に照射する。
これらの条件下で、ＭＳｏＢＴは、２５ｐｐｍの、ＵＶＢにより誘導される突然変異効果の５０％阻害濃度を有している。
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、特に脱色素作用を有するが、抗突然変異および／または抗発癌剤としても、チオ尿素類またはそれらのモノオキシドもしくはジオキシド誘導体を含有した医薬品に関する。
【０００２】
ヒトにおける皮膚色素沈着は、メラノサイトと称される独特な細胞群で起こる、複雑な一連の細胞プロセスから生じている。メラノサイトは表皮の下部に存在し、それらの機能は、紫外線の有害作用から体を防御する、メラニンと称される褐色色素を合成することである。メラニンは、メラノサイトの内側に存在する顆粒、メラノソームに蓄積される。メラノソームはメラノサイトから放出され、メラノソームに含有されたメラニンを同化させるケラチノサイトにより皮膚の表面へ輸送される。皮膚の黒さは、メラノサイトにより合成されてケラチノサイトへ移されたメラニンの量と比例する。ある場合には、メラニン形成を減少または阻害させて、例えば皮膚を白くすること、老化による斑点を除去すること、またはメラノサイトの過剰活性を減少させることが好ましい。
【０００３】
過酸化水素または過酸化亜鉛のような過酸化物を含有した化粧品組成物は、皮膚に現れる赤色部分のような斑点を除去する目的でずっと用いられてきた。しかしながら、過酸化物は極端に不安定であり、それらの貯蔵に問題を起こす。更に、化粧品基剤へのこれら過酸化物の安定的配合は困難であり、過酸化物自体も十分な漂白効果を有していない。
【０００４】
他方、ビタミンＣ、システインまたはコロイド状イオウを含有した化粧品は、皮膚を漂白するために用いられ始めた。しかしながら、これら物質の効果は満足しうるものではない。
【０００５】
長い間、ヒドロキノンが標準の脱色素分子となっており、多数の皮膚化粧品で用いられてきた。しかしながら、この物質は危険性がないとは言えず、メラノサイトに対して非常に細胞毒性があり、不可逆的な脱色素を引き起こす可能性がある。
【０００６】
最近、コウジ酸が、ヒト皮膚でメラニンの形成を阻害する物質として、有効に用いられている。その結果、コウジ酸（日本国特許出願公報Ｎｏ．５６‐１８５６９）、コウジ酸とケイ皮酸または安息香酸のような芳香族カルボン酸とのエステル（日本国特許出願公報Ｎｏ．６０／１００００５）、またはコウジ酸のジエステル（日本国特許出願公報Ｎｏ．６１‐６０８０１および６０‐１７９６１）を含有する、皮膚を脱色素させるための様々な化粧品が記載されてきた。したがって、これらのコウジ酸およびコウジ酸のエステルは、メラニン形成を阻害しうる物質である、として知られている。しかしながら、コウジ酸の効力は個々に異なっており、平均すると不十分である。
【０００７】
イソチオシアネート類およびチオシアネート類も脱色素剤として記載されている（ＷＯ０２／０５８６６４）。
【０００８】
したがって、他の脱色素剤を見出す差し迫った必要性がなお存在しているのである。
【０００９】
現在までに、フェニルチオ尿素類のみが、脱色素活性を有するとして記載されてきた（特許出願ＵＳ２００２／００４４９１４）。他のあるチオ尿素類、例えばチオ尿素、フェニルチオ尿素およびジメチルチオ尿素は、感作性であることが知られている（Contact and Photocontact sensitivity problems associated with thiourea and its derivatives(チオ尿素およびその誘導体に伴う接触および光接触感作問題)：A review of the literature and case reports.A.Dooms-Goosens et al.,British Journal of Dermatology,116,4,573-579）。更に、それらのうち一部、カルビマゾールは、抗甲状腺剤として用いられている。
【００１０】
意外にも、本発明者らは、チオ尿素群に属するある分子が、インビトロでメラニン合成に対して著しい阻害効果を有することを発見したのである。
【００１１】
確かに、１，３‐ビス‐（５‐メタンスルフィニルブチル）チオ尿素は、皮膚との、特に下記プロセスによる熱水との長期接触に際する、スルフォラファン（脱色素活性を有するイソチオシアネート：ＷＯ０２／０５８６６４）の分解産物の１つであることは知られている：
【化１】
（Thermal degradation of sulforaphane in aqueous solution(水溶液中におけるスルフォラファンの熱分解),Yi Jin,Mingfu Wang,Robert T.Rosen,and Chi-Tang-Ho.J.Agric.Food Chem.1999,47,3121-3123）。しかしながら、その医薬または美容活性は、特に脱色素剤として、先行文献で記載または示唆されたことが全くなく、脱色素物質の分解産物が該脱色素物質より大きな活性を有するであろうことなどは自明ではなかった。
【００１２】
突然変異誘発は、自発的または自然に、あるいは化学物質、高エネルギー照射、ストレスなどに起因する二次作用として、ＤＮＡでおよび細胞の発達に際して生じる。
【００１３】
突然変異原は、このような突然変異を起こす因子である。しばしば、それらは発癌性（即ち、癌を誘導しうる）でもある。現代社会は、環境上における突然変異原の存在に現在では気付き、懸念している。突然変異原はどこでも生じる；一部は植物で自然に生じ、他の多くは（特に調理中に）有機物質を燃やすことで生じ、他は工業により生じる。今日、人々は多くの健康問題に直面している。これら健康問題の多くは、細胞およびＤＮＡの損傷の増加に関与する突然変異原、更には突然変異誘発因子による人体の細胞およびＤＮＡの損傷から派生している。これらの突然変異原および突然変異誘発因子には、特に汚染、ストレス、老化、喫煙、紫外線、過度の運動、組織障害などがある。細胞およびＤＮＡの損傷に起因する疾患として、我々は老化、老化による斑点、癌、白内障、乾皮症、疲労、皮膚癌、ストレス性ダメージおよびシワを挙げられる。
【００１４】
医薬組成物は体内で抗突然変異活性を生じさせるために利用しうるが、それらは時には重篤な副作用を有することがある。
【００１５】
結果的に、体内の突然変異誘発を防ぐ抗突然変異効果、および抗癌効果を有する新製品を見出す必要性がある。
【発明の具体的な説明】
【００１６】
意外にも、本発明者らは、チオ尿素群に属するある分子が、突然変異原物質およびＵＶＢの双方に対して、顕著な抗突然変異および抗癌効果を有することを発見したのである。
【００１７】
本発明は、下記一般式Ｉの少くとも１種のチオ尿素：
【化２】
（上記式中：
ｎは１〜１２の整数である；
ｍは１〜１２の整数である；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して、水素原子、Ｃ１‐Ｃ６アルキル基またはアリール基を表わす）
または下記一般式IIａ、IIｂおよびIIIのそのモノオキシドもしくはジオキシド誘導体の少くとも１種：
【化３】
（上記式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍおよびｎは前記の通りである）またはそれらの混合物を含有した医薬品に関する。
【００１８】
本発明の意味において、用語“Ｃ１‐Ｃ６アルキル基”は、直鎖または分岐で炭素原子１〜６のあらゆるアルキル基、特にＣＨ３基を意味する。
【００１９】
本発明の意味において、用語“アリール基”は、共役または縮合してもよい、炭素原子５〜８の１以上の芳香環を意味する。特に、アリール基はフェニルまたはナフチル基であり、ハロゲン原子、上記のようなアルキル基、ＯＨ基またはニトロ基で置換してもよい。
【００２０】
有利には、一般式Ｉ、IIａ、IIｂおよびIIIのチオ尿素類は、基Ｒ１およびＲ２が同一、Ｒ３およびＲ４が同一で、ｍ＝ｎであるようなものである。
更に一層有利には、Ｒ１＝Ｒ２＝ＣＨ３である。
有利にはｍ＝ｎ＝４である。
有利にはＲ３＝Ｒ４＝Ｈである。
更に一層有利には、それには、下記式の１，３‐ビス‐（５‐メタンスルフィニルブチル）チオ尿素、１‐（５‐メタンスルフィニルブチル）‐３‐（５‐メタンスルホニルブチル）チオ尿素または１，３‐ビス‐（５‐メタンスルホニルブチル）チオ尿素がある：
【化４】
【００２１】
本発明によるチオ尿素類は市販されているか、または例えば１，３‐ビス‐（５‐メタンスルフィニルブチル）チオ尿素の場合は、スルフォラファンの熱分解により製造される。特に、モノオキシドまたはジオキシド誘導体は、例えば過酸化水素のような酸化剤の作用により、対応する未酸化チオ尿素から得られる。
【００２２】
有利には、本発明による医薬品は、チロシナーゼを阻害するために、特にチロシナーゼの作用を５０％減少させるために、メラニンの合成を阻害するために、およびメラノサイトの過剰活性を減少させるために用いうる。
【００２３】
有利には、本発明による医薬品は、特に突然変異原物質および／またはＵＶＢに対する抗突然変異剤として、および／または抗発癌剤として用いうる。
【００２４】
有利には、この医薬品は、癌、特に皮膚の癌、老化による斑点、老化、特に皮膚の老化、およびシワなどの出現を防止しうる。
【００２５】
本発明は、下記一般式Ｉの、本発明による、少くとも１種のチオ尿素：
【化５】
（上記式中：
ｎは１〜１２の整数である；
ｍは１〜１２の整数である；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して、水素原子、Ｃ１‐Ｃ６アルキル基またはアリール基を表わす）
または下記一般式IIａ、IIｂおよびIIIのそのモノオキシドもしくはジオキシド誘導体の少くとも１種：
【化６】
（上記式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍおよびｎは前記の通りである）またはそれらの混合物を含有した化粧品組成物にも関する。
【００２６】
有利には、上記の化粧品組成物は脱色素用組成物である。それは、表皮をライトニング、ホワイトニングまたは脱色素するために、特に老化またはシミによる、皮膚の斑点を除去するために、または表皮の色素沈着を防止するために用いうる。有利には、上記の組成物は局所適用向けである。
【００２７】
有利には、本発明による医薬品または化粧品組成物は、経口または局所用、有利には局所用の形態をとる。それらは、特に皮膚の浸透により活性成分の性質および到達性を改善させる補助剤を加えて、このタイプの投与向けによく知られた形態、即ち、特に、例えばローション、ムース、ジェル、分散液、スプレー、セラム、マスク、ボディローションまたはクリームの形態をとる。これらの組成物は、本発明による医薬品または化粧品とは別に、通常水または溶媒、例えばアルコール類、エーテル類またはグリコール類をベースにした、生理学的に許容される媒体を通常含有している。それらは、界面活性剤、保存剤、安定剤、乳化剤、増粘剤、相加または可能であれば相乗効果を発揮する他の活性成分、微量元素、精油、香料、着色料、コラーゲン、ケミカルまたはミネラルフィルター、モイスチャライザーまたは温泉水も含有してよい。
【００２８】
本発明は、皮膚への本発明による化粧品組成物の適用による、皮膚の美容トリートメントにも関する。
【実施例】
【００２９】
下記例は説明のために示されており、限定するためではない。
【００３０】
例１：スルフォラファンから出発する１，３‐ビス‐（５‐メタンスルフィニルブチル）チオ尿素の合成
（Ｄ，Ｌ）‐スルフォラファンの合成：
予めナトリウムで蒸留した無水エタノール８００ｍｌに４‐クロロブチロニトリル（ref.Aldrich C 3,000-0）４０ｇを溶解させる。次いで、メタンチオエート（ref.Fluka 71742）２７ｇを加え、２５℃で１５時間攪拌する。懸濁液をペーパーで濾過し、減圧下で蒸発させる。エチルエーテル４００ｍｌに入れる。再びペーパーで濾過する。未精製４‐メチルチオブチロニトリル３２ｇを含有したエーテル溶液を得る。エチルエーテル４００ｍｌ中水素化アルミニウムリチウム２５ｇの懸濁液を調製する。水素化アルミニウムリチウムの懸濁液へ徐々に４‐メチルチオブチロニトリルの溶液を加え、２時間３０分還流する。次いで、還流下、蒸留水８０ｍｌをゆっくり加えることにより、懸濁液を中和する。沸騰が止んだら、蒸留水１２０ｍｌを加えて、残留した水素化物の中和を完了させる。ガラスフリットで濾過する。フィルターにおいて不溶性物質をエチルエーテル２００ｍｌで洗浄する。エーテルフラクションを合わせ、蒸発乾固させる。メチルチオブチルアミン２６．９ｇを得る。得られた生成物をアセトン８０ｍｌに入れ、次いで３５％過酸化水素２３ｍｌを一度に少しずつ加える。水浴に５０℃で一夜放置する。次いで、少量の活性炭を加え、濾過し、チオホスゲン２０ｍｌを含有したクロロホルム２００ｍｌ、次いで水酸化ナトリウムの５％水溶液３００ｍｌをゆっくり加える。３０分間放置して作用させる。次いで、ジクロロメタン２００ｍｌで８回にわたり混合液を向流抽出する。有機相を集め、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させる。次いで、７．１０−２ｔｏｒｒ下１３５℃で残渣を再蒸留する。我々はＤ，Ｌ‐スルフォラファン１２．５ｇを得、これを質量スペクトル測定により同定する。
【００３１】
１，３‐ビス‐（５‐メタンスルフィニルブチル）チオ尿素の合成
赤外スペクトルをPerkin-Elmer 1600 F11R（ニート）で得た。プロトンおよび炭素‐１３ ＮＭＲスペクトルを、プロトンの場合２００ＭＨｚ、炭素の場合５０．３ＭＨｚで、Brucker AM 200SYで得た。化学シフトは、プロトンの場合７．２５ｐｐｍおよび炭素の場合７６．９ｐｐｍ（重水素置換クロロホルムの中心線）における、重水素置換クロロホルムＣＤＣｌ３のシグナルに対する百万分率（ｐｐｍ）に相当する。質量スペクトルは、化学イオン化（ＮＨ３）または電子衝撃の方法により、Normag/SIDAR V2.3で得た。
【００３２】
クロマトグラフィー
反応は、シリカゲルタイプ６０Ｆ２５４（Merck,Art.7735）のプレート上で、薄層クロマトグラフィーによりモニターした。試薬および生成物は、リンモリブデン酸の１０％エタノール溶液との処理、次いで加熱により、ＵＶ光で視覚化させた。フラッシュクロマトグラフィーは、２３０〜４００メッシュのシリカゲルＩＣＮ６０で行った。
【００３３】
溶媒の蒸留
エチルエーテルおよびＴＨＦを窒素下においてナトリウム／ベンゾフェノンで蒸留した。クロマトグラフィーに用いられるシクロヘキサン、酢酸エチルおよびメタノールは、使用前に蒸留した。
【００３４】
方法
不活性雰囲気下において、上記で得られたスルフォラファン２ｇ（１１ｍｍｏｌ）を水１５ｍｌで希釈し、次いで光から保護しながらその溶液を２４時間還流する。室温で、減圧下溶液を濃縮し、シリカゲルのカラムでのクロマトグラフィーのためにジクロロメタンに残渣を入れて（溶離液：ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ：９０／１０）、４３％の収率で無色油状物として１，３‐ビス‐（５‐メタンスルフィニルブチル）チオ尿素（ビスＭＳｉＢＴ）１．７０ｇ（５ｍｍｏｌ）を得る。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ）：６．４５（ｄｌ，２Ｈ，ＮＨ），３．５３（ｔ，Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），２．８７（ｍ，４Ｈ），２．６５（ｓ，６Ｈ），１．７８（ｍ，８Ｈ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（５０．３ＭＨｚ）：２４．０（ＣＨ２），３２．１（ＣＨ２），４１．２（ＣＨ２‐ＣＨ２），４７．２（ＣＨ３），５７．４（ＣＨ２ＳＯ），Ｃ（ＩＶ）観察されず。
ＩＲ（ν，ｃｍ−１）：２１７６，２０９６，１１４０，９４０ｃｍ−１。
ＩＣ．ＭＳ ｍ／ｚ：３１２（ＭＨ＋）。
【００３５】
例２：１‐（５‐メタンスルフィニルブチル）‐３‐（５‐メタンスルホニルブチル）チオ尿素の製造
スルフォラファン分子の２イオウ原子のうち１つのみの酸化を、不活性雰囲気下ではなく、大気中で、１，３‐ビス‐（５‐メタンスルフィニルブチル）チオ尿素の合成の例１の反応を行うことにより達成した。
スルフォラファン１ｇ（５．５ｍｍｏｌ）を水１０ｍｌで希釈し、次いで光から保護しながらその溶液を２４時間還流する。室温で、減圧下溶液を濃縮し、シリカゲルのカラムでのクロマトグラフィーのためにジクロロメタンに残渣を入れて（溶離液：ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ：９０／１０）、１２％の収率で無色油状物として１‐（５‐メタンスルフィニルブチル）‐３‐（５‐メタンスルホニルブチル）チオ尿素（ＭＳＢＭＳＢＴ）２００ｍｇを得る。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ）：６．５５（solid，２Ｈ，ＮＨ），３．５５（ｔ，４Ｈ，ＣＨ２），３．１５（ｔ，２Ｈ，ＳＯ２ＣＨ２），２．８０（ｔ，２Ｈ，ＳＯＣＨ２），２．６０（ｓ，３Ｈ，ＳＯＣＨ３），２．９０（ｓ，３Ｈ，ＳＯ２ＣＨ３），１．８０‐１．８７（ｍ，８Ｈ，ＣＨ２）。
１３Ｃ ＮＭＲ（５０．３ＭＨｚ）：２０．５（ＣＨ２），２８．５（ＣＨ２），３９．８（ＣＨ３ＳＯ），４１．０（ＣＨ３ＳＯ２），４３．５（ＣＨ２‐ＮＨ），５４．１（ＣＨ２ＳＯ），４４．８（ＣＨ２ＳＯ２），１８３．３５（Ｃ＝Ｓ）。
ＩＲ（ν，ｃｍ−１）：２１７６，２０９６，１１４０，９４０ｃｍ−１。
ＩＣ．ＭＳ ｍ／ｚ：３２８（ＭＨ＋）。
【００３６】
例３：１‐イソチオシアナト‐４‐メチルスルホニルブタンから１，３‐ビス‐（５‐メタンスルホニルブチル）チオ尿素の製造
水１５ｍｌ中１‐イソチオシアナト‐４‐メチルスルホニルブタン１ｇ（５ｍｍｏｌ）の溶液を３時間還流する。室温で、減圧下溶液を濃縮し、メタノールからの再結晶化により残渣を精製して、４０％の収率でベージュ色固体物として１，３‐ビス‐（５‐メタンスルホニルブチル）チオ尿素（ビスＭＳｏＢＴ）５３５ｍｇを得る。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ）：６．５０（ｓｌ，Ｈ，ＮＨ），３．５５（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），２．７５（ｔ，４Ｈ，ＳＯ２ＣＨ２），２．６０（ｓ，６Ｈ，ＳＯ２ＣＨ３），１．７０‐１．９０（ｍ，８Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２）。
１３Ｃ ＮＭＲ（５０．３ＭＨｚ）：２１．０（ＣＨ２），２９．２（ＣＨ２），３８．５（ＣＨ３），４４．０（ＣＨ２‐ＮＨ），５３．９（ＣＨ２ＳＯ），１８２．６（Ｃ＝Ｓ）。
ＩＲ（ν，ｃｍ−１）：２１６８，２０９６，１１４４，９３０ｃｍ−１。
ＩＣ．ＭＳ ｍ／ｚ：３４４（ＭＨ＋）。
融点：１４２℃。
【００３７】
例４：ビスＭＳｉＢＴからビス（ＭＳｏＢＴ）の製造
０℃で、アセトン１０ｍｌ中ビスＭＳｉＢＴ（１ｇ，３ｍｍｏｌ）の溶液へ３５％過酸化水素０．７０ｍｌ（２．２equiv.，６．６ｍｍｏｌ）をゆっくり加える。次いで、反応媒体を室温で４０時間放置して反応進行させる。真空蒸発によりアセトンを除去する。水性残渣をクロロホルムに入れ、その相を硫酸ナトリウムで直接トラップする。真空下で有機相を濃縮し、メタノールからの再結晶化で残渣を精製して、３０％の収率でベージュ色固体物としてビスＭＳｏＢＴを得る。
【００３８】
例５：コウジ酸と比較したビスＭＳｏＢＴの抗チロシナーゼ効果の研究
チロシナーゼを阻害する能力の測定：
下記反応を用いる：無色のＬ‐ドーパ（Ｌ‐３，４‐ジヒドロキシフェニルアラニン、Sigma社から得られる（ref.Ｄ‐９６２６））を、４７５ｎｍで吸収する有色ドーパクロムに酸化させる。この反応は真菌チロシナーゼ（ＥＣ１．１４．１８．１、Sigma社から得られる（ref.Ｔ‐７７５５））により触媒させる。３０℃で時間の関数として光学濃度（Ｏ．Ｄ．）を測定することにより、反応の速度を記録する。
【００３９】
用いられた各溶液は下記組成を有している：
緩衝液ｐＨ６．８：
リン酸緩衝液０．１Ｍ，ｐＨ６．８
基質溶液：
緩衝液ｐＨ６．８中Ｌ‐ドーパ５ｍＭ
インヒビターの溶液：
インヒビター分子は、溶解度に応じて、緩衝液ｐＨ６．８、５０％メタノール（メタノール‐蒸留水）または純粋メタノールに直接溶解させる。
インヒビターの各溶液の重量／容量としての濃度は、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０２５％、０．０１２５％、０．００６２５％および０．００３１２％である。
酵素の溶液：
緩衝液ｐＨ６．８中チロシナーゼ２５０単位
【００４０】
チロシナーゼの作用は、Ｏ．Ｄ．記録で測定された初期反応速度から評価する。インヒビターなし（濃度０）の初期反応速度および異なる試験濃度時の速度に関する曲線をプロットする。分子の阻害力は、チロシナーゼの作用を５０％減少させる濃度として規定される。記録は３分間行い、阻害率（阻害および飽和プラトーの率）を計算する。上記のように得られたビスＭＳｏＢＴは、８．３ｍＭの最終濃度で、チロシナーゼの酵素活性を５０％阻害する。コウジ酸（Aldrich社から入手、ref.22,046-9）は、０．６７０ｍＭの最終濃度で、同阻害率を示す。ビスＭＳｉＢＴおよびＭＳＢＭＳＢＴの低溶解度は、抗チロシナーゼ作用についてそれら分子を試験することが不可能であることを意味した。
【００４１】
例６：コウジ酸およびジメチルチオ尿素と比較したビスＭＳｉＢＴ、ＭＳＢＭＳＢＴおよびビスＭＳｏＢＴの脱色素効果の研究
生体系で脱色素効果を試験して、機能ヒト皮膚に存在するメラニン化単位を表示するために、ビスＭＳｉＢＴ、ＭＳＢＭＳＢＴおよびビスＭＳｏＢＴ分子をメラニン産生ヒトメラノサイト‐ケラチノサイト共培養物でも試験した。
コウジ酸およびジメチルチオ尿素をこの試験で陽性コントロールで用いた。
色素沈着表皮の試料（黒色表現型／空気／液体界面における正常ケラチノサイト‐メラノサイトの共培養物）をMatteKcorporation,ＵＳＡから入手し、その指示に従い培養する。培地もこの製造業者から入手している。物質（コウジ酸３５ｍＭ、Aldrich社,ref.D-18,870-0から得たジメチルチオ尿素２．８ｍＭ、上記の方法で得たビスＭＳｉＢＴ２．８ｍＭ、上記の方法で得たＭＳＢＭＳＢＴ２．８ｍＭおよび上記の方法で得たビスＭＳｏＢＴ２．８ｍＭ）を２１日間培地に適用する。
各物質を培地に溶液として４つの培養ウェルへ適用する。表皮のコントロール試料は徐々に色素沈着するが、最も活性な物質で処理された表皮の試料はさほど黒ずまないという色素沈着性を示すことから、各物質の脱色素効果は明確に目で見える。
【００４２】
脱色素効果は培養ウェルからメラニンの抽出により評価する。
抽出は２つの培養ウェルのプールで行い、０．０５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０ｍＭトリスＨＣｌ（アミノ‐２‐（ヒドロキシメチル）‐２‐プロパンジオール‐１，３），ｐＨ６．８を含有した１％ドデシル硫酸ナトリウム０．４５ｍｌ中でホモゲナイズする。各ホモゲネートへ５ｍｇ／ｍｌでプロテイナーゼＫ２０μＬを加える。４５℃で一夜消化させる。次いで、更にプロテイナーゼＫ２０μＬを加え、インキュベートを４時間続ける。次いで、炭酸ナトリウムの０．５Ｍ溶液５０μＬおよび過酸化水素の３０％溶液１０μＬを加える。試料を８０℃で３０分間維持し、次いでそれらを冷却する。試料をクロロホルム‐メタノール混合液（２：１，ｖ／ｖ）１００μＬで抽出する。１０，０００ｇで１０分間遠心後、４０５ｎｍで上澄の光学濃度を測定する。物質は下記表１で比較されている（結果は共培養物でメラニンの阻害率として表示されている）：
【００４３】
【表１】
【００４４】
意外にも、ビスＭＳｉＢＴはＭＳＢＭＳＢＴ、特にビスＭＳｏＢＴより弱い脱色素活性を示し、約３０％阻害を得るために必要なその濃度は、皮膚をライトニングするための製品として商業上広く用いられている対照分子である、コウジ酸の場合より２５倍低い。したがって、本発明による物質は脱色素活性を有している。
【００４５】
例７：ビスＭＳｏＢＴの抗突然変異効果の評価
この特性はAmes試験の修正法：Thermolab Systems社のVitotox 10キット（6400000）試験で証明した。
一般的に、Vitotox試験は、（細菌のＳＯＳ系により調節される）変異ｒｅｃＮプロモーターの転写調節下でVibrio fisheriのｌｕｘオペロンを含有した細菌に基づいている。細菌と遺伝毒性産物とのインキュベート後、ｒｅｃＮプロモーターを抑制解除させ、ｌｕｘオペロンを発現させる：発光，該発光は産物の遺伝毒性と比例する。一部の産物は光の発生に直接作用するか、または細菌の代謝を増して、偽陽性を生じる。更に、構成ｌｕｘオペロンを有する細菌株をコントロールとして用いる。同株は細胞毒性コントロール（偽陰性）として用いる。
【００４６】
例７．１．：ＭＭＳ（メチルメタンスルホネート）に対するビスＭＳｏＢＴの抗突然変異効果の評価
遺伝毒性分子に対する抗突然変異効果を調べるために、遺伝毒性分子メチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）を用い、標準の突然変異原分子、４‐ニトロキノリンオキシドおよびベンゾ（ａ）ピレンの混合物の遺伝毒性に対して比較する。ＭＭＳを単独でまたはビスＭＳｏＢＴとその濃度を増しながら混合して入れ、発光を比較する。こうして、突然変異誘発の５０％阻害濃度を規定することが可能となる。
（遺伝毒性試験の場合）Salmonella typhimurium ＴＡ１０４ ｒｅｃＮ２‐４および（細胞毒性試験の場合）Salmonella typhimurium ＴＡ１０４ ｐｒｌの培養をNutrient Broth８ｇ／Ｌ培地中で行い、その際に一夜攪拌しながら３７℃でインキュベートする（遺伝毒性試験用の細菌の場合で０．２〜０．５および細胞毒性試験用の細菌の場合で０．４〜０．６のＯ．Ｄ．）。翌日、遺伝毒性試験用の細菌はNutrient Broth培地で１／１０、および細胞毒性試験用の細菌は１／２希釈する。
Ｈ２Ｏ中９０ｍＭのＭＭＳストック溶液を調製し、１／２連続希釈を９６ウェルプレートで行う。標準遺伝毒性物質（４‐ニトロキノリンオキシド（ＮＱＯ）／ベンゾ（ａ）ピレン（ＢＡＰ））をＮＱＯの場合０．４ｐｐｍおよびＢＡＰの場合８００ｐｐｍで用いる。試験物質は代謝活性（フラクションＳ９：シトクロムＰ４５０を含有したミクロソームホモゲネート：２．４５ｍｌ／ｍｌ最終）下でまたはそれなしで用いる。
発光速度は、物質の遺伝毒性および細胞毒性の関数として、Fluoroskan Ascent FL（ThermoLabsystems）で３時間にわたり（５分毎に測定）測定する。
物質はSigma‐Aldrich社から入手している。
【００４７】
結果：
ビスＭＳｏＢＴは、Ｓ９無しの場合で１７ｐｐｍおよびＳ９有りの場合で２０ｐｐｍの、ＭＭＳの突然変異効果の５０％阻害濃度を有している。
【００４８】
例７．２．：ＵＶＢに対するビスＭＳｏＢＴの抗突然変異効果の評価
ＵＶＢに対する抗突然変異効果を評価するために、２０単位（ＲＬＵ）の平均発光をもたらす時間にわたり細菌培養物に照射する。次いで、ビスＭＳｏＢＴを照射前に濃度を増しながら培地に入れ、５０％阻害濃度を調べる。
例１の操作に従うが、但しＭＭＳなしで行い、ＵＶＢ２５４ｎｍで２０秒間にわたり細菌培養物に照射する。
これらの条件下で、ＭＳｏＢＴは、２５ｐｐｍの、ＵＶＢにより誘導される突然変異効果の５０％阻害濃度を有している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式Ｉの少くとも１種のチオ尿素：
【化１】
（上記式中：
ｎは１〜１２の整数である；
ｍは１〜１２の整数である；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して、水素原子、Ｃ１‐Ｃ６アルキル基またはアリール基を表わす）
または下記一般式IIａ、IIｂおよびIIIのそのモノオキシドもしくはジオキシド誘導体の少くとも１種：
【化２】
（上記式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍおよびｎは前記の通りである）またはそれらの混合物を含有した医薬品。
【請求項２】
チロシナーゼを阻害するための、メラニンの合成を阻害するための、またはメラノサイトの過剰活性を減少させるための、請求項１に記載の医薬品。
【請求項３】
抗突然変異および／または抗発癌剤としての、請求項１に記載の医薬品。
【請求項４】
癌、特に皮膚の癌の出現を防止するための、請求項３に記載の医薬品。
【請求項５】
基Ｒ１およびＲ２が同一、Ｒ３およびＲ４が同一で、ｍ＝ｎである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項６】
Ｒ１＝Ｒ２＝ＣＨ３である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項７】
ｍ＝ｎ＝４である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項８】
Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項９】
局所用の形態をとる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項１０】
下記一般式Ｉの少くとも１種のチオ尿素：
【化３】
（上記式中：
ｎは１〜１２の整数である；
ｍは１〜１２の整数である；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して、水素原子、Ｃ１‐Ｃ６アルキル基またはアリール基を表わす）
または下記一般式IIａ、IIｂおよびIIIのそのモノオキシドもしくはジオキシド誘導体の少くとも１種：
【化４】
（上記式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍおよびｎは前記の通りである）またはそれらの混合物を含有した脱色素用化粧品組成物。
【請求項１１】
表皮をライトニング、ホワイトニングまたは脱色素するための、特に老化またはシミによる皮膚斑点を除去するための、または表皮の色素沈着を防止するための、請求項１０に記載の化粧品組成物の使用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式Ｉの少くとも１種のチオ尿素：
【化１】
（上記式中：
ｎは１〜１２の整数である；
ｍは１〜１２の整数である；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して、水素原子、Ｃ１‐Ｃ６アルキル基またはアリール基を表わす）
または下記一般式IIａ、IIｂおよびIIIのそのモノオキシドもしくはジオキシド誘導体の少くとも１種：
【化２】
（上記式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍおよびｎは前記の通りである）またはそれらの混合物を含有した医薬品。
【請求項２】
チロシナーゼを阻害するための、メラニンの合成を阻害するための、またはメラノサイトの過剰活性を減少させるための、請求項１に記載の医薬品。
【請求項３】
有利には、突然変異原および突然変異誘発因子による人体の細胞およびＤＮＡの損傷の治療および予防のための、抗突然変異および／または抗発癌剤としての、請求項１に記載の医薬品。
【請求項４】
癌、特に皮膚の癌の出現を防止するための、請求項３に記載の医薬品。
【請求項５】
基Ｒ１およびＲ２が同一、Ｒ３およびＲ４が同一で、ｍ＝ｎである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項６】
Ｒ１＝Ｒ２＝ＣＨ３である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項７】
ｍ＝ｎ＝４である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項８】
Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項９】
局所用の形態をとる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項１０】
下記一般式Ｉの少くとも１種のチオ尿素：
【化３】
（上記式中：
ｎは１〜１２の整数である；
ｍは１〜１２の整数である；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して、水素原子、Ｃ１‐Ｃ６アルキル基またはアリール基を表わす）
または下記一般式IIａ、IIｂおよびIIIのそのモノオキシドもしくはジオキシド誘導体の少くとも１種：
【化４】
（上記式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍおよびｎは前記の通りである）またはそれらの混合物を含有した脱色素用化粧品組成物。
【請求項１１】
表皮をライトニング、ホワイトニングまたは脱色素するための、特に老化またはシミによる皮膚斑点を除去するための、または表皮の色素沈着を防止するための、請求項１０に記載の化粧品組成物の使用。
【請求項１２】
下記一般式Ｉのチオ尿素：
【化５】
（上記式中：
ｎは１〜１２の整数である；
ｍは１〜１２の整数である；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して、水素原子、Ｃ１‐Ｃ６アルキル基またはアリール基を表わす）
または下記一般式IIａ、IIｂおよびIIIのそのモノオキシドもしくはジオキシド誘導体の１種：
【化６】
（上記式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍおよびｎは前記の通りである）（但し、Ｎ，Ｎ‐ジ（メチルスルフィニルブチル）チオ尿素およびジケイロリンチオ尿素を除く）。
【請求項１３】
老化、乾皮症、疲労および／またはシワに対する、請求項１０に記載された一般式Ｉの少くとも１種のチオ尿素または一般式IIａ、IIｂおよびIIIのそのモノオキシドもしくはジオキシド誘導体の少くとも１種を含有している化粧品組成物の使用。
【請求項１】
下記一般式Ｉの少くとも１種のチオ尿素：
【化１】
（上記式中：
ｎは１〜１２の整数である；
ｍは１〜１２の整数である；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して、水素原子、Ｃ１‐Ｃ６アルキル基またはアリール基を表わす）
または下記一般式IIａ、IIｂおよびIIIのそのモノオキシドもしくはジオキシド誘導体の少くとも１種：
【化２】
（上記式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍおよびｎは前記の通りである）またはそれらの混合物を含有した医薬品。
【請求項２】
チロシナーゼを阻害するための、メラニンの合成を阻害するための、またはメラノサイトの過剰活性を減少させるための、請求項１に記載の医薬品。
【請求項３】
抗突然変異および／または抗発癌剤としての、請求項１に記載の医薬品。
【請求項４】
癌、特に皮膚の癌の出現を防止するための、請求項３に記載の医薬品。
【請求項５】
基Ｒ１およびＲ２が同一、Ｒ３およびＲ４が同一で、ｍ＝ｎである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項６】
Ｒ１＝Ｒ２＝ＣＨ３である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項７】
ｍ＝ｎ＝４である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項８】
Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項９】
局所用の形態をとる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項１０】
下記一般式Ｉの少くとも１種のチオ尿素：
【化３】
（上記式中：
ｎは１〜１２の整数である；
ｍは１〜１２の整数である；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して、水素原子、Ｃ１‐Ｃ６アルキル基またはアリール基を表わす）
または下記一般式IIａ、IIｂおよびIIIのそのモノオキシドもしくはジオキシド誘導体の少くとも１種：
【化４】
（上記式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍおよびｎは前記の通りである）またはそれらの混合物を含有した脱色素用化粧品組成物。
【請求項１１】
表皮をライトニング、ホワイトニングまたは脱色素するための、特に老化またはシミによる皮膚斑点を除去するための、または表皮の色素沈着を防止するための、請求項１０に記載の化粧品組成物の使用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式Ｉの少くとも１種のチオ尿素：
【化１】
（上記式中：
ｎは１〜１２の整数である；
ｍは１〜１２の整数である；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して、水素原子、Ｃ１‐Ｃ６アルキル基またはアリール基を表わす）
または下記一般式IIａ、IIｂおよびIIIのそのモノオキシドもしくはジオキシド誘導体の少くとも１種：
【化２】
（上記式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍおよびｎは前記の通りである）またはそれらの混合物を含有した医薬品。
【請求項２】
チロシナーゼを阻害するための、メラニンの合成を阻害するための、またはメラノサイトの過剰活性を減少させるための、請求項１に記載の医薬品。
【請求項３】
有利には、突然変異原および突然変異誘発因子による人体の細胞およびＤＮＡの損傷の治療および予防のための、抗突然変異および／または抗発癌剤としての、請求項１に記載の医薬品。
【請求項４】
癌、特に皮膚の癌の出現を防止するための、請求項３に記載の医薬品。
【請求項５】
基Ｒ１およびＲ２が同一、Ｒ３およびＲ４が同一で、ｍ＝ｎである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項６】
Ｒ１＝Ｒ２＝ＣＨ３である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項７】
ｍ＝ｎ＝４である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項８】
Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項９】
局所用の形態をとる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項１０】
下記一般式Ｉの少くとも１種のチオ尿素：
【化３】
（上記式中：
ｎは１〜１２の整数である；
ｍは１〜１２の整数である；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して、水素原子、Ｃ１‐Ｃ６アルキル基またはアリール基を表わす）
または下記一般式IIａ、IIｂおよびIIIのそのモノオキシドもしくはジオキシド誘導体の少くとも１種：
【化４】
（上記式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍおよびｎは前記の通りである）またはそれらの混合物を含有した脱色素用化粧品組成物。
【請求項１１】
表皮をライトニング、ホワイトニングまたは脱色素するための、特に老化またはシミによる皮膚斑点を除去するための、または表皮の色素沈着を防止するための、請求項１０に記載の化粧品組成物の使用。
【請求項１２】
下記一般式Ｉのチオ尿素：
【化５】
（上記式中：
ｎは１〜１２の整数である；
ｍは１〜１２の整数である；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して、水素原子、Ｃ１‐Ｃ６アルキル基またはアリール基を表わす）
または下記一般式IIａ、IIｂおよびIIIのそのモノオキシドもしくはジオキシド誘導体の１種：
【化６】
（上記式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍおよびｎは前記の通りである）（但し、Ｎ，Ｎ‐ジ（メチルスルフィニルブチル）チオ尿素およびジケイロリンチオ尿素を除く）。
【請求項１３】
老化、乾皮症、疲労および／またはシワに対する、請求項１０に記載された一般式Ｉの少くとも１種のチオ尿素または一般式IIａ、IIｂおよびIIIのそのモノオキシドもしくはジオキシド誘導体の少くとも１種を含有している化粧品組成物の使用。
【公表番号】特表２００６−５０９７３３（Ｐ２００６−５０９７３３Ａ）
【公表日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４２５４６（Ｐ２００４−５４２５４６）
【出願日】平成１５年１０月３日（２００３．１０．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００３／００２９０７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３２９１２
【国際公開日】平成１６年４月２２日（２００４．４．２２）
【出願人】（５０３３２３７６３）
【氏名又は名称原語表記】ＬＭＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１０月３日（２００３．１０．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００３／００２９０７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３２９１２
【国際公開日】平成１６年４月２２日（２００４．４．２２）
【出願人】（５０３３２３７６３）
【氏名又は名称原語表記】ＬＭＤ
【Ｆターム（参考）】
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