【課題】本発明の目的は、癌（例えば、前立腺癌）の予防、処置および診断において使用され得る物質をさらに提供することである。癌（例えば、前立腺癌および乳癌）の予防、処置および診断における改善を提供することが、さらなる目的である。
【解決手段】本発明者らは、＋２リーディングフレームを利用するいくつかのものを含む、ＨＥＲＶ−Ｋゲノムのｅｎｖ領域においてスプライシングによって生じる一連のタンパク質をここで見出した。これらのタンパク質は、転写調節因子に典型的な活性を示し、そしてまた、腫瘍形成能を有する。これらのタンパク質は、癌の診断および治療において使用され得、そしてまた、例えばアジュバント治療のための、薬物標的である。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、以下の利益を主張する：２００１年１２月７日出願の国際特許出願ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ０１／４７８２４（ＷＯ０２／４６４７７として２００２年６月１３日に英語で公開さ
れた）；２００１年１２月７日出願の米国特許出願番号１０／０１６，６０４；２００１
年１２月７日出願の米国仮出願番号６０／３４０，０６４；および２００２年６月１２日
出願の米国仮出願番号６０／３８８，０４６。
【０００２】
本明細書中で言及される全ての刊行物および特許は、各個々の文書が参考として具体的
かつ個別に援用されることが示されるのと同程度に、参考として本明細書中で援用される
。
【０００３】
（技術分野）
本発明は、癌（例えば、前立腺癌）の診断に関する。特に、本発明は、前立腺腫瘍にお
いてアップレギュレートされた発現を示すヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）の亜群
、およびこれらのウイルスによって発現されるスプライシングされたｍＲＮＡによってコ
ードされるポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００４】
（背景技術）
参考文献１および２は、ＨＥＲＶ−ＫファミリーのＨＭＬ−２亜群のヒト内因性レトロ
ウイルス（ＨＥＲＶ）が、前立腺腫瘍においてアップレギュレートされた発現を示すこと
を開示している。参考文献１および２の内容は、本明細書中で参考として援用される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、癌（例えば、前立腺癌）の予防、処置および診断において使用され得
る物質をさらに提供することである。癌（例えば、前立腺癌および乳癌）の予防、処置お
よび診断における改善を提供することが、さらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の開示）
ＨＥＲＶは、長年にわたって知られており、そしてＨＥＲＶ−Ｋファミリーゲノム配列
は、１９８６年以降公知である｛参考文献１８７｝。通常のｇａｇ、ｐｒｔ、ｐｏｌおよ
びｅｎｖのレトロウイルスタンパク質が、ｃＯＲＦまたはＲｅｃとして公知のＨＩＶ Ｒ
ｅｖまたはＨＴＬＶ Ｒｅｘのアナログを有するとして、ＨＥＲＶ−Ｋについて同定され
ているが｛３｝、他の調節タンパク質（例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質またはＨＴＬ
Ｖ Ｔａｘタンパク質）のアナログは同定されていない。したがって、本発明は、以下をも提供する。
（１） 前立腺癌を診断する方法であって、該方法は、患者サンプルにおけるＨＭＬ−２発現産
物の存在または非存在を検出する工程を包含し、ここで、該発現産物は、スプライシング
事象によって生成され、ここで、ｅｎｖコード領域の５’領域および開始コドンが、ｅｎ
ｖのリーディングフレームに対して＋２のリーディングフレームにおける下流コード領域
に連結される、方法。
（２） 項目１に記載の方法であって、前記患者サンプルが、前立腺組織サンプル、胸部組織
サンプル、または血液サンプルである、方法。
（３） 項目１または２に記載の方法であって、前記発現産物が、ｍＲＮＡ転写物またはポリ
ペプチドである、方法。
（４） 項目１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、前記ｍＲＮＡ転写物が、配列番号
１９、２０、２１、２４、２５、２６、３８、４０および／または４２のうちの１つ以上
に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含む、方法。
（５） 項目１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、前記ｍＲＮＡ転写物が、配列番号
７、８、９、１０、１１、１２、２８、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３９、４
１、４３、６７、６８および６９のうちの１つ以上に対して少なくとも５０％の配列同一
性を有するポリペプチドをコードする、方法。
（６） 項目１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、該方法が、前記患者サンプルから
ＲＮＡを抽出する工程を包含する、方法。
（７） 項目１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、前記発現産物が、ハイブリダイゼ
ーションによって検出される、方法。
（８） 単離されたポリヌクレオチドであって、以下：（ａ）配列番号１９、２０、２１、２４
、２５、２６、３８、４０、４２、５１、５２および２７８〜４７７および／または４２
のヌクレオチド配列；（ｂ）（ａ）の少なくとも約７ヌクレオチドのフラグメント；（ｃ
）（ａ）に対して少なくとも５０％の同一性を有するヌクレオチド配列；または（ａ）、
（ｂ）もしくは（ｃ）の相補体、を含む、単離されたポリヌクレオチド。
（９） スプライシング事象により生成される転写物によりコードされる単離されたポリペプチ
ドであって、ここで、ＨＥＲＶ−Ｋ ｅｎｖコード領域の５’領域および開始コドンが、
ＨＥＲＶ−Ｋゲノムにおけるｅｎｖのリーディングフレームに対して＋２のリーディング
フレームにおける下流コード領域に連結される、ポリペプチド。
（１０） 項目９に記載のポリペプチドであって、以下：配列番号７、８、９、１０、１１、１
２、２８、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３９、４１、４３、６６、６７、６８
および７８〜２７７からなる群から選択されるアミノ酸配列；（ｂ）（ａ）の少なくとも
５アミノ酸のフラグメント；または（ｃ）（ａ）に対して少なくとも５０％の同一性を有
するポリペプチド配列、を含む、ポリペプチド。
（１１） 項目１０に記載のポリペプチドであって、ここで、（ｂ）前記フラグメントが、配列
番号７、８、９、１０、１１、１２、２８、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３９
、４１、４３、６６、６７、６８および７８〜２７７の１つ以上のＴ細胞エピトープまた
はＢ細胞エピトープを含む、ポリペプチド、
（１２） 項目９、項目１０または項目１１に記載のポリペプチドをコードする、単離され
たポリヌクレオチド。
（１３） 項目９、項目１０または項目１１に記載のポリペプチドに結合する、抗体。
（１４） 項目１３に記載の抗体であって、該抗体が、モノクローナル抗体である、抗体。
（１５） 番号７、８および／または９のアミノ酸配列を含むタンパク質に結合し得、かつ該タン
パク質が転写活性化因子として作用するのを防止し得る、単離されたポリペプチド。
（１６） 医薬として使用するための、項目８〜１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド
、ポリペプチドまたは抗体。
（１７） 前立腺癌、乳癌、精巣癌、多発性硬化症および／またはインシュリン依存性糖尿病を予
防または処置するための医薬の製造における、項目８から５のいずれか１項に記載のポ
リヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体の使用。
（１８） 項目９、項目１０または項目１１に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能
なキャリアを含む、免疫原性組成物。
（１９） アジュバントをさらに含む、項目１８に記載の組成物。
【０００７】
Ｒｅｖ／Ｒｅｘアナログである「ｃＯＲＦ」は、ｅｎｖと同じ５’領域および開始コド
ンを共有するＯＲＦによってコードされているが、スプライシング事象によりｅｎｖコー
ド配列が除去され、そしてｅｎｖのリーディングフレームに対してリーディングフレーム
を＋１にシフトさせる｛４、５｝。従って、ＰＣＡＶのｅｎｖ領域の最終エキソン内で、
リーディングフレーム１および２は、それぞれ、ｅｎｖおよびｃＯＲＦをコードするが、
第３のリーディングフレームによってコードされるタンパク質は以前に報告されておらず
、そしてこの＋２リーディングフレームは、ＨＥＲＶ−Ｋにおいて既知の機能を有さない
。
【０００８】
本発明者らは、＋２リーディングフレームを利用するいくつかのものを含む、ＨＥＲＶ
−Ｋゲノムのｅｎｖ領域においてスプライシングによって生じる一連のタンパク質をここ
で見出した。これらのタンパク質は、転写調節因子に典型的な活性を示し、そしてまた、
腫瘍形成能を有する。これらのタンパク質は、癌の診断および治療において使用され得、
そしてまた、例えばアジュバント治療のための、薬物標的である。
【０００９】
これらの新規ポリペプチド産物の同定は、注目に値する。なぜなら、完全な配列情報は
、１５年以上にわたってＨＥＲＶ−Ｋウイルスについて利用可能であったからである。
【００１０】
本発明は、癌を診断するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：患
者サンプルにおける、スプライシング事象によって生成されるＨＭＬ−２発現産物の存在
または非存在を検出する工程であって、ここで、ｅｎｖコード領域の５’領域および開始
コドンは、ゲノム中のｅｎｖのリーディングフレームに対してリーディングフレーム＋２
で、下流のコード領域に連結される。正常組織に対してより高いレベルの発現産物は、サ
ンプルが由来する患者が癌（例えば、前立腺癌）を有していることを示す。発現産物は、
ウイルス生活環において機能的であってもなくてもよい。
【００１１】
検出される発現産物は、ｍＲＮＡ転写物またはこのような転写物から翻訳されたポリペ
プチドのいずれかである。これらの発現産物は、直接的または間接的に検出され得る。直
接的試験は、患者サンプル中でＨＭＬ−２のＲＮＡまたはポリペプチドを検出するアッセ
イを使用する。間接的試験は、ＨＭＬ−２からインビボで直接発現されない生体分子を検
出するアッセイ（例えば、ＨＭＬ−２ ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを検出するア
ッセイ、またはＨＭＬ−２ポリペプチドに応答して生じた抗体を検出するアッセイ）を使
用する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリヌクレオチドの描写を有するヒト内在性レトロウイルスおよびこのレトロウイルスに関連する位置の概略図である。
【図２】図２は、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＨＭＬ−２．ＨＯＭ）（「ＥＲＶＫ６」としても公知）ゲノム内のオープンリーディングフレームの概略図である（７）。
【図３】図３は、ＨＥＲＶ−Ｋ ｍＲＮＡについて先行技術で記載されたスプライシング事象である。
【図４】図４は、ｅｎｖ ＯＲＦの５’末端およびお３’末端の付近の、同定された複数のスプライス部位を示す。３つのリーディングフレームは、別々に影を付けられている。５つの多重スプライシング産物は、ｅｎｖ ＯＲＦの下に示され、これはまた、図５において、図４の上において矢印で示されるプライマーから生じるＰＣＲ産物を示すゲルと共に示されている。
【図５】図５は、図４の上において矢印で示されるプライマーから生じるＰＣＲ産物を示すゲルである。
【図６】図６は、ｔａｔ活性について試験するための発現アッセイにおいて使用されるアデノウイルスベクターを示す。
【図７】図７は、上記ベクターから駆動されるＧＦＰ発現の結果を示す。
【図８】図８は、ＰＣＡＰポリペプチドの活性を試験するために使用されるベクターを示す。
【図９】図９は、図６のベクターと共に、上記ベクターを使用して得られたＦＡＣＳデータを示す。
【図１０】図１０は、ＰＣＡ−ｍＲＮＡのＬＴＲにおいて作製される欠失を示す。
【図１１】図１１は、上記ＬＴＲから駆動されたＧＦＰ発現を示す。
【図１２】図１２は、ＰＣＡ−ｍＲＮＡの５’末端のＲＮＡマッピングについてのデータを示す。
【図１３】図１３は、配列番号１４の推定二次構造を示す。
【図１４】図１４は、癌細胞株におけるＰＣＡＶ転写物のノーザンブロット分析を示す。左上の矢印は、ゲノムｍＲＮＡ転写物の位置を示す。隣の矢印は、ｅｎｖ転写物の位置を示す。下の２つの矢印は、他のＯＲＦの位置を示す。これらのレーンは、以下の細胞株由来のＲＮＡを含む：（１）Ｔｅｒａ １；（２）ＤＵ１４５；（３）ＰＣ３；（４）ＭＤＡ Ｐｃａ−２ｂ；（５）ＬｎＣａＰ。Ｔｅｒａ １は、奇形癌細胞株であり；他は、前立腺癌細胞株である。
【図１５】図１５は、ＬＴＲの間のスプライス事象を検出するために使用されるＰＣＲストラテジーを例示する。図１５において、横線は、ＨＭＬ−２ゲノムを表し、ゲノムの上の縦線は、スプライス部位であり、そしてゲノムの下の縦線は、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖのＡＴＧコドンである。順方向（Ｆ）および逆方向（Ｒ）ＰＣＲプライマーのおおよその位置もまた示される。
【図１６】図１６は、上記ストラテジーの結果を示す。
【図１７】図１７は、ＨＭＬ−２におけるスプライシングのパターンを示す。
【図１８】図１８は、エキソン２における様々なスプライス結合部を示す。
【図１９】図１９は、スプライス結合領域におけるエキソン１のアライメントを示す。
【図２０】図２０は、エキソン１．５のアライメントを示す。
【図２１−１】図２１−１は、エキソン２のアライメントを示す。
【図２１−２】図２１−２は、エキソン２のアライメントを示す。
【図２１−３】図２１−３は、エキソン２のアライメントを示す。
【図２２】図２０は、エキソン３のアライメントを示す。全てのアライメント中の数字は、プロトタイプＨＥＲＶ−Ｋ配列のＧｅｎＢａｎｋエントリーＹ１７８３２の位置を表す。
【図２３】図２３は、ＰＣＡＶ ｍＲＮＡの５’末端をマッピングするために使用されるＲＴ−ＰＣＲ走査アッセイの結果を示す。
【図２４】図２４は、ＲＮａｓｅ保護アッセイの詳細を示す。２つのアンチセンスプローブ（長いプローブ（２４Ｂ）および短いプローブ（２４Ｃ））を使用した。両方のプローブは、２４Ａで示される領域を保護した。２４Ｂにおいて、ＴＡＴＡシグナルの位置に基づいて「通常の」５’末端に基づいて予測されるバンドの位置、および達成される実際のバンドが示される。２４Ｂにおける３つのレーンは、（１）Ｔｅｒａ１；（２）ＲＮＡなし、（３）プローブ、ＲＮａｓｅなしである。２４Ｃにおける２つのレーンは、（１）Ｔｅｒａ１；（２）プローブ、ＲＮＡなしである。
【図２５】図２５は、ｍＲＮＡの５’領域について試験するための、図１３で削除された領域を示す。
【図２６】図２６は、欠失変異体から駆動されたＧＦＰ発現のＦＡＣＳ分析を示す。
【図２７】図２７は、ＰＣＡＰ４が、ＨＥＲＶ−Ｋ ＬＴＲ（「ＬＴＲ６２」）を活性化するが、マウス白血病ウイルスＬＴＲ（「ＭｏＬＴＲ」）を活性化しないことを示す。
【図２８】図２８は、ＰＣＡＰ４が、ＨＩＶ ＬＴＲを活性化し得ることを示す。
【図２９】図２９Ａは、ＰＣＡＰ４がＥＦ１Ａプロモーターを活性化することを示し、そして図２９Ｂは、ＰＣＡＰ４が、ＣＭＶプロモーターを活性化しないことを示す。
【図３０】図３０は、ＰＣＡＰ２の細胞成分局在化を示す。
【図３１】図３１は、マトリゲルにプレーティングされた種々の細胞を示す。
【図３２】図３２は、軟寒天で培養された細胞を示す。
【図３３】図３３は、種々の細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す（２０４）。レーン１は、２００、３００、４００、および５００ｂｐのマーカーを含む。他のレーンについて、偶数のレーンが、ＲＴを用いて得られ、そして奇数は、ＲＴを用いずに得られる：（２および３）一次ヒトリンパ球；（４および５）形質転換されたＢ細胞；（６および７）Ｔｅｒａ１細胞；（８および９）乳癌生検；（１０および１１）セミノーマ生検；（１２および１３）コントロール。
【図３４】図３４は、ＰＣＡＰ４の細胞成分局在化を示す。
【図３５】図３５は、３週間の培養後、メチレンブルーで染色された細胞を示す。
【図３６】図３６は、空のｐＣＥＰ４ベクターを示す。
【図３７】図３７は、種々のベクターでの形質転換の４日後の増殖後のＮＩＨ３Ｔ３細胞を示す。細胞密度をグラフに示し、これらの細胞自体は、１×および２００×の倍率で示される。
【図３８】図３８は、（Ａ）ＰＣＡＰ２、（Ｂ）ＰＣＡＰ３、または（Ｃ）非感染を発現する細胞のＴＵＮＥＬ分析を示す。
【図３９】図３９は、ＰＣＡＰ２でトランスフェクトしたＰｒＥＣ（図３９Ｂ）およびコントロールＰｒＥＣ（３９ＡおよびＣ）を示す。アスタリスクは、１つより多い核を有する細胞を示す。
【図４０】図４０は、細胞増殖を検出するための、ＰｒＥＣのブロモ−デオキシウリジン標識を示す。
【図４１】図４１は、乳癌組織（４１Ａ）および正常胸部組織（４１Ｂ）のＲＴ−ＰＣＲを示す。ＰＣＡＰ２およびｇｕｓＢ（βグルクロニダーゼ）転写物の位置を示す。
【図４２】図４２は、前立腺癌患者から採取した組織の染色部分に対する抗ｇａｇモノクローナル抗体５Ｇ２を使用する免疫蛍光実験を示す。図４２Ｂは、萎縮組織を示し、図４２Ｃは、グリーソン分類３の癌を示し、そして図４２Ｄは、グリーソン分類４の癌を示す。
【図４３】図４３は、ＭＤＡＬＴＲからのＧＦＰ発現を示すＦＡＣＳスペクトルである。左から右への３つのトレースは、以下である：（１）非感染細胞；（２）ＰＣＡＰ３；（３）ＰＣＡＰ４。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（Ａ−患者サンプル）
本発明の診断方法は、癌の診断についてｍＲＮＡに基づくが、患者サンプルは、一般に
、目的の組織由来の細胞（例えば、前立腺癌について前立腺細胞、乳癌について乳房細胞
など）を含む。これらの細胞は、関連する器官から採取された組織サンプル中に存在し得
るか、または（例えば、転移の間に）循環中に逃れた細胞であり得る。細胞を含むことの
かわりに、または細胞を含むのと同様に、サンプルは、ＨＭＬ−２由来のｍＲＮＡを含む
ビリオンまたは体液を含み得る。
【００１４】
本発明の診断方法がポリペプチドに基づく場合、患者サンプルは、（ｍＲＮＡについて
上記したように）細胞および／またはビリオンを含み得るか、あるいはポリペプチドを認
識する抗体を含み得る。このような抗体は、代表的に、循環中に存在する。
【００１５】
従って、一般に、雄性についての患者サンプルは、前立腺サンプル（例えば、生検）ま
たは血液サンプルであり、そして雌性については、乳房サンプル（例えば、生検）または
血液サンプルである。
【００１６】
患者は、一般にはヒトであり、そして好ましくは成体のヒトである。
【００１７】
発現産物は、患者サンプル自体において検出され得るか、またはサンプル由来の物質（
例えば、細胞溶解物の上清またはＲＮＡ抽出物またはＲＮＡ抽出物から生成されたｃＤＮ
ＡまたはＲＮＡ抽出物から翻訳されたポリペプチドまたは患者から抽出された細胞の培養
物由来の細胞など）において検出され得る。これらは、本発明の意味において「患者サン
プル」であるとなおみなされる。
【００１８】
本発明の方法は、インビトロまたはインビボで実施され得る。
【００１９】
患者サンプルの他の可能な供給源としては、単離された細胞、全組織または体液（例え
ば、血液、血漿、血清、尿、胸水、脳脊髄液、乳汁、初乳、乳房によって分泌される他の
流体、精液（ｓｅｍｅｎ、ｓｅｍｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）など）が挙げられる。
【００２０】
（Ｂ−ｍＲＮＡ発現産物）
本発明の診断方法がｍＲＮＡ検出に基づく場合、これは代表的に、本発明のポリペプチ
ドをコードするＲＮＡを検出することを含む。ＲＮＡは、Ｅｎｖ ＯＲＦのＡＴＧコドン
を含み、これは、図１７において示されるようにスプライシングされる、Ｅｎｖ ＯＲＦ
の３’由来の配列と同じリーディングフレームにあるが、（ＨＭＬ−２のゲノムＤＮＡコ
ピー中のＡＴＧに対して）＋２リーディングフレーム（すなわち、第３のリーディングフ
レーム）である。従って、本発明は、スプライシング事象によって生成されるＲＮＡを検
出する工程を包含し得、ここで、ｅｎｖコード領域の５’領域および開始コドンは、ｅｎ
ｖのリーディングフレームに対してリーディングフレーム＋２で、下流のコード領域に連
結される。
【００２１】
好ましいＲＮＡは、配列番号５２に対して少なくともｓ％の配列同一性を有する配列を
含む。配列番号５２は、図２２の「潜在的スプライシング部位Ｂ」の直ぐ下流のＨＥＲＶ
−Ｋ（Ｃ７）ウイルス｛参考文献６｝の５０ヌクレオチドである。
【００２２】
他の好ましいＲＮＡは、配列番号１９、２０、２１、２４、２５、２６、３８、４０お
よび／または４２の１つ以上に対して少なくともｓ％の配列同一性を有する配列を含む。
特に好ましいＲＮＡは、配列番号３８、４０および／または４２の１つ以上に対して少な
くともｓ％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含む。
【００２３】
好ましいＲＮＡは、配列番号７、８、９、１０、１１、２１、２８、２９、３０、３１
、３４、３５、３６、３９、４１、４３、６７、６８および６９の１つ以上に対して少な
くともｓ％の配列同一性を有する配列を含む。特に好ましいＲＮＡは、配列番号７、８お
よび／または９の１つ以上に対して少なくともｓ％の配列同一性を有するポリペプチドを
コードする配列を含む。
【００２４】
ｓの好ましい値は、少なくとも５０（例えば、少なくとも５５、６０、６５、７０、７
５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９
．５、９９．９など）である。
【００２５】
好ましいＲＮＡ配列は、配列番号４９を含むＲＮＡに結合し得るポリペプチドをコード
する。
【００２６】
ＰＮＡはまた、通常、以下のうちの１つ、２つ、３つ、４つまたは５つを含む：
１．配列番号４９に対して少なくとも７５％の同一性（例えば、７６％、７７％、７８
％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８
％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８
％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有する上流配列；または配
列番号４９に対して少なくとも５０％の同一性（例えば、５１％、５２％、５３％、５４
％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４
％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４
％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４
％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４
％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同
一性）を有し、かつ少なくとも９５％の信頼係数で、正常（すなわち、非癌性）細胞にお
ける発現と比較して、少なくとも１．５倍（例えば、２倍、２．５倍、５倍、１０倍、２
０倍、５０倍など）高いレベルで発現される、配列；または配列番号４９のうちの少なく
とも２０個連続したヌクレオチドフラグメント（例えば、２５、３０、３５、４０、４５
、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１
１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１
６５、１７０、１７５、１８０、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２
２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５個連続したヌクレオチ
ドなど）に対して、少なくとも８０％の同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４
％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４
％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同
一性）を有する配列；または配列番号４９の少なくとも２０個連続したヌクレオチドフラ
グメント（例えば、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７
５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３
５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１９
０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４
０、２４５、２５０、２５５個連続したヌクレオチドなど）に対して、少なくとも８０％
の同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％
、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％
、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有し、かつ少なくとも９５％
の信頼係数で、正常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．
５倍（例えば、２倍、２．５倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍など）高いレベルで発現
される、配列。この配列は、代表的には、ＲＮＡの５’末端にある。配列番号４９は、「
ＥＲＶＫ６」ＨＭＬ−２ウイルス（参考文献７）のＬＴＲにおけるＲ領域の初めのヌクレ
オチド配列である。Ｒ領域のこの部分は、ＨＭＬ−２転写物において見出され得、そして
このＲ領域の部分を含むｍＲＮＡ分子の転写は、前立腺癌においてアップレギュレートさ
れる。
【００２７】
２．以下の配列を含む上流領域：配列番号５０に対して少なくとも７５％の配列同一性
（例えば、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％
、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％
、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一
性）を有する配列；または配列番号５０に対して少なくとも５０％の同一性（例えば、５
１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６
１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７
１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８
１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９
１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％
、９９．９％、１００％の同一性）を有し、かつ少なくとも９５％の信頼係数で、正常（
すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍（例えば、２倍、
２．５倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍など）高いレベルで発現される、配列；または
配列番号５０の少なくとも２０個連続したヌクレオチドフラグメント（例えば、２５、３
０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５
、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５個連続し
たヌクレオチドなど）に対して、少なくとも８０％の同一性（例えば、８１％、８２％、
８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、
９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、
１００％の同一性）を有する配列；または配列番号５０の少なくとも２０個連続したヌク
レオチドフラグメント（例えば、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６
５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、
１３０、１３５、１４０、１４５個連続したヌクレオチドなど）に対して、少なくとも８
０％の同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８
８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有し、かつ少なくとも９
５％の信頼係数で、正常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも
１．５倍（例えば、２倍、２．５倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍など）高いレベルで
発現される、配列。配列番号５０は、ＥＲＶＫ６ ＬＴＲにおける配列番号４９の下流の
ＲＵ_５領域のヌクレオチド配列である。この領域は、全長ＨＭＬ−２転写物において見出
されるが、ＨＭＬ−２ ＬＴＲプロモーターから転写される全てのｍＲＮＡに存在し得る
わけではない（例えば、転写が弱められる場合）。
【００２８】
３．以下の配列を含む上流領域：配列番号６に対して少なくとも７５の同一性（例えば
、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％
、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％
、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有
する配列；または配列番号６に対して少なくとも５０％の同一性（例えば、５１％、５２
％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２
％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２
％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２
％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２
％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９
％、１００％の同一性）を有し、かつ少なくとも９５％の信頼係数で、正常（すなわち、
非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍（例えば、２倍、２．５倍、
５倍、１０倍、２０倍、５０倍など）高いレベルで発現される、配列；または配列番号６
の少なくとも２０個連続したヌクレオチドフラグメント（例えば、２５、３０、３５、４
０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００の連
続したヌクレオチドなど）に対して、少なくとも８０％の同一性（例えば、８１％、８２
％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２
％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９
％、１００％の同一性）を有し、かつ少なくとも９５％の信頼係数で、正常（すなわち、
非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍（例えば、２倍、２．５倍、
５倍、１０倍、２０倍、５０倍など）で発現される、配列；または、配列番号６の少なく
とも２０個連続したヌクレオチドフラグメント（例えば、２５、３０、３５、４０、４５
、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個連続したヌ
クレオチドなど）に対して、少なくとも８０％の同一性（例えば、８１％、８２％、８３
％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３
％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１０
０％の同一性）を有し、かつ少なくとも９５％の信頼係数で、正常（すなわち、非癌性）
細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍（例えば、２倍、２．５倍、５倍、１
０倍、２０倍、５０倍など）高いレベルで発現される、配列。配列番号６は、Ｕ_５領域と
初めの５’スプライス部位との間のＥＲＶＫ６ウイルスの領域のヌクレオチド配列である
。この領域は、全長ＨＭＬ−２転写物において見出されるが、いくつかの改変体により欠
失されており、そして上記の領域２と同様に、ＨＭＬ−２ ＬＴＲプロモーターから転写
される全てのｍＲＮＡにおいて存在し得るわけではない。
【００２９】
４．以下の配列を含む下流領域：配列番号５に対して少なくとも７５％の同一性（例え
ば、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５
％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を
有する配列；または配列番号５に対して少なくとも５０％の同一性（例えば、５１％、５
２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６
２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７
２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８
２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．
９％、１００％の同一性）を有し、かつ少なくとも９５％の信頼係数で、正常（すなわち
、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍（例えば、２倍、２．５倍
、５倍、１０倍、２０倍、５０倍など）高いレベルで発現される、配列；または配列番号
５の少なくとも２０の連続したヌクレオチドフラグメント（例えば、２５、３０、３５、
４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、
１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、
１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、
２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、
２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３５０、４００、
４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００個連続したヌクレオ
チドなど）に対して、少なくとも８０％の同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８
４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９
４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の
同一性）を有する配列；または配列番号５の少なくとも２０個連続したヌクレオチドフラ
グメント（例えば、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７
５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３
５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８
５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３
５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８
５、２９０、２９５、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５
０、７００、７５０、８００個連続したヌクレオチドなど）に対して、少なくとも８０％
の同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％
、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％
、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有し、かつ少なくとも９５％
の信頼係数で、正常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．
５倍（例えば、２倍、２．５倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍など）高いレベルで発現
される、配列。配列番号５は、ＥＲＶＫ６の３’末端におけるＵ_３Ｒ領域のヌクレオチド
配列である。この配列は、代表的に、Ｔａｔコード領域の停止コドンと、任意のポリＡテ
イルの直前にある。
【００３０】
５．下流３’ポリＡテイル。
【００３１】
上記の配列の同一性％は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムによって、デフ
ォルトパラメーター（オープンギャップペナルティー＝−２０および伸長ペナルティー＝
−５）を使用して決定される。
【００３２】
これらのｍＲＮＡ分子は、以下で、「ＰＣＡ−ｍＲＮＡ」分子（「前立腺癌関連ｍＲＮ
Ａ」）と称され、そしてこれらのＰＣＡ−ｍＲＮＡを発現する内在性ウイルスは、ＰＣＡ
Ｖ（「前立腺癌関連ウイルス」）と称される。それにもかかわらず、これらのＰＣＡＶは
また、他のタイプの癌、特に、乳癌と関連し得る。
【００３３】
従って、一般的に、検出されるｍＲＮＡは、式Ｎ_１−Ｎ_２−Ｎ_３−Ｎ_４−Ｎ_５−ポリＡ
を有し、ここで、
Ｎ_１は、配列番号４９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するか；または配列
番号４９に対して少なくとも５０％の同一性を有し、かつ少なくとも９５％の信頼係数で
、正常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍高く現さ
れるか；または配列番号４９の少なくとも２０の連続したヌクレオチドフラグメントに対
して少なくとも８０％の同一性を有するか；または配列番号４９の少なくとも２０の連続
したヌクレオチドフラグメントくとも８０％の同一性を有し、かつ少なくとも９５％の信
頼係数で、正常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍
高くされ；
Ｎ_２は、配列番号５０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するか；または配列
番号５０に対して少なくとも５０％の同一性を有し、かつ少なくとも９５％の信頼係数で
、正常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍高くされ
るか；または配列番号５０の少なくとも２０の連続したヌクレオチドフラグメントに対し
て少なくとも８０％の同一性を有するか；または配列番号５０の少なくとも２０の連続し
たヌクレオチドフラグメントに対して少なくとも８０％の同一性を有し、かつ少なくとも
９５％の信頼係数で、正常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくと
も１．５倍高く現され；
Ｎ_３は、配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するか；または配列番
号６に対して少なくとも５０％の同一性を有し、かつ少なくとも９５％の信頼係数で、正
常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍高くされるか
；または配列番号６の少なくとも２０連続したヌクレオチドフラグメントに対して少なく
とも８０％の同一性を有するか；または配列番号６の少なくとも２０個続したヌクレオチ
ドフラグメントに対して少なくとも８０％の同一性を有し、かつ少なくとも９５％の信頼
係数で、正常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍高
く発現され；
Ｎ_４は、ｅｎｖのリーディングフレームに対して＋２のリーディングフレームにおける
下流コード領域にスプライシングされたｅｎｖコード領域の開始コドンを含むＲＮＡ配列
を含む。
【００３４】
Ｎ_５は、配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するか；または配列番
号５に対して少なくとも５０％の同一性を有し、かつ少なくとも９５％の信頼係数で、正
常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍高く発現され
るか；または配列番号５の少なくとも２０個連続したヌクレオチドフラグメントに対して
少なくとも８０％の同一性を有するか；または配列番号５少なくとも２０個連続したヌク
レオチドフラグメントに対して少なくとも８０％の同一性を有し、かつ少なくとも９５％
の信頼係数で、正常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．
５倍高く発現され；
Ｎ_１およびＮ_４は存在するが、Ｎ_２、Ｎ_３、Ｎ_５およびポリＡは、必要に応じてである
。
【００３５】
Ｎ_１は、検出されるｍＲＮＡに存在し、より好ましくは、Ｎ_１−Ｎ_２が存在する。
【００３６】
Ｎ_１は、好ましくは、ｍＲＮＡの５’末端（すなわち、５’−Ｎ_１−．．．）にある。
Ｎ１は、上記の配列番号４９を参照して規定されるが、配列番号４９の５’末端から１０
０ヌクレオチド（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、７１、７２、７
３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６
、８７、８８、８９、９０または１００）までは、転写の開始部位に依存して省かれても
よい（例えば、Ｎ_１は、配列番号４７８に対して少なくとも７５％の配列同一性であり得
る）。
【００３７】
Ｎ５が存在する場合、これは３’ポリＡテイルの直前にあることが好ましい（すなわち
，．．．−Ｎ_５−ポリＡ−３’）。
【００３８】
ＲＮＡは、一般に、５’キャップを有する。
【００３９】
（Ｂ．１−サンプル中のＲＮＡの富化）
診断がｍＲＮＡ検出に基づく場合、本発明の方法は、好ましくは、以下の初期工程を包
含する：ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を患者サンプルから抽出する工程；（ｂ）ｍＲＮＡ
を除去することなく、患者サンプルからＤＮＡを除去する工程；および／または（ｃ）配
列番号４を含むＲＮＡではなく、配列番号４を含むＤＮＡを、患者サンプルから除去もし
くは破壊する工程。これは必要である。なぜなら、正常な細胞および癌細胞の両方のゲノ
ムは、複数のＰＣＡＶ ＤＮＡテンプレートを含み、一方、ＰＣＡ−ｍＲＮＡレベルの増
加は、癌細胞においてのみで見出されるからである。代替として、相同なＤＮＡの存在に
より影響を受けないＲＮＡ特異的アッセイが使用され得る。
【００４０】
生物学的サンプルからＲＮＡを抽出する方法は、周知であり（例えば、参考文献８およ
び１７）、この方法には、グアニジニウム緩衝液、塩化リチウム、ＳＤＳ／酢酸カリウム
などに基づく方法が挙げられる。総細胞ＲＮＡが抽出された後、ｍＲＮＡは、例えば、オ
リゴ−ｄＴ技術によって富化され得る。
【００４１】
ｍＲＮＡを除去することなく、生物学的サンプルからＤＮＡを除去する方法は、周知で
あり（例えば、添付物Ｃおよび参考文献８）、そしてこれにはＤＮａｓｅ消化が挙げられ
る。
【００４２】
ＰＣＲ−ｍＲＮＡ配列を含む、ＲＮＡではなくＤＮＡを除去する方法は、ＰＣＲーｍＲ
ＮＡ内の配列（例えば、配列番号４内のＤＮＡ配列を認識する制限酵素）に特異的である
が、対応するＲＮＡ配列を切断しない、試薬を使用する。
【００４３】
サンプルからＰＣＡ−ｍＲＮＡを特異的に精製する方法もまた、使用され得る。１つの
このような方法は、ＰＣＡ−ｍＲＮＡに結合する親和性支持体を使用する。この親和性支
持体は、ＰＣＡＶのＬＴＲに結合するポリペプチド配列（例えば、以下に記載のポリペプ
チド）を含み得る。
【００４４】
（Ｂ．２−ＲＮＡの直接検出）
サンプル中の特定のＲＮＡ配列の存在または非存在を検出するための種々の技術が利用
可能である（例えば、参考文献８および１７）。サンプルが、ゲノムＰＣＡＶ ＤＮＡを
含む場合、検出技術は、一般に、ＲＮＡ特異的であり；サンプルが、ＰＣＡＶ ＤＮＡを
含まない場合、検出技術は、ＲＮＡ特異的であってもなくてもよい。
【００４５】
ハイブリダイゼーションベースの検出技術が使用され得、ここで、ＰＣＡ−ｍＲＮＡの
領域に相補的なポリヌクレオチドプローブは、ハイブリダイゼーション条件下で、ＲＮＡ
含有サンプルと接触される。ハイブリダイゼーションの検出は、プローブに相補的な核酸
が存在することを示す。ＲＮＡを用いて使用するためのハイブリダイゼーション技術とし
ては、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーションおよびアレイが挙げられ
る。
【００４６】
サンプル中のＲＮＡ分子の配列が得られる配列決定もまた使用され得る。これらの技術
は、目的の配列がサンプル中に存在するか否かを直接示す。Ｎ_１に対応するＲＮＡの５’
末端の配列の決定が、一般的に適している。
【００４７】
増幅をベースにした技術もまた、使用され得る。これらとしては、ＰＣＲ増幅、ＳＤＡ
増幅、ＳＳＳＲ増幅、ＬＣＲ増幅、ＴＭＡ増幅、ＮＡＳＢＡ増幅、Ｔ７増幅などが挙げら
れる。この技術は、好ましくは、指数増幅を与える。ＲＮＡを用いる使用のために好まし
い技術は、ＲＴ−ＰＣＲ（例えば、参考文献８の第１５章を参照のこと）である。前立腺
細胞からのｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲは、参考文献９、１０、１１、１２などにおいて報告
され、そして胸部細胞からのｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲは、参考文献１３、１４、１５、１
６などにおいて報告されている。
【００４８】
（Ｂ．３ ＲＮＡの間接検出）
ＲＮＡを直接検出するよりむしろ、ＲＮＡに由来する分子を検出すること（すなわち、
ＲＮＡの間接検出）が好ましくあり得る。ｍＲＮＡを検出する代表的な間接方法は、逆転
写によってｃＤＮＡを調製することであり、次いでｃＤＮＡを直接検出することである。
ｃＤＮＡの直接検出は、一般的にＲＮＡを直接するための、上述された技術と同じ技術を
使用する（が、ＲＴ−ＰＣＲのような方法は、ＤＮＡ検出については適切ではないこと、
およびｃＤＮＡが二本鎖であり、そのため検出技術が、配列、その相補体、または二本鎖
分子に基づき得ることが理解される）。
【００４９】
（Ｂ．４ ポリヌクレオチド物質）
本発明は、例えば、ＰＣＡＶ核酸の検出において使用するためのポリヌクレオチド物質
を提供する。
【００５０】
本発明は、以下：（ａ）上で定義されたようなヌクレオチド配列Ｎ_１−Ｎ_２−Ｎ_３−Ｎ
_４−Ｎ_５−ポリＡ；（ｂ）上で定義されたようなヌクレオチド配列Ｎ_１−Ｎ_２−Ｎ_３−Ｎ
_４−Ｎ_５の少なくともｘ個のヌクレオチドのフラグメント；（ｃ）上で定義されたような
ヌクレオチド配列Ｎ_１−Ｎ_２−Ｎ_３−Ｎ_４−Ｎ_５と少なくともｓ％の同一性を有するヌク
レオチド配列；あるいは（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の相補体、を含む単離された
ポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列Ｎ_１−Ｎ
_２−Ｎ_３−Ｎ_４−Ｎ_５−ポリＡの改変体（例えば、変性改変体、対立遺伝子改変体、ホモ
ログ、オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）、変異体など）を含む。
【００５１】
フラグメント（ｂ）は、好ましくは、Ｎ_４のフラグメントを含む。
【００５２】
ｘの値は、少なくとも７（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４
、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、
４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００など）である。ｘの値は、２
０００未満（例えば、１０００、５００、１００、または５０未満）であり得る。
【００５３】
ｓの値は、好ましくは、少なくとも５０（例えば、少なくとも５５、６０、６５、７０
、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、
９９．５、９９．９など）である。
【００５４】
本発明はまた、式５’−Ａ−Ｂ−Ｃ−３’を有する単離されたポリヌクレオチドを提供
し、ここで：−Ａ−は、ａヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；−Ｃ−は、ｃ
ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；−Ｂ−は、（ａ）上で定義されたような
ヌクレオチド配列Ｎ_１−Ｎ_２−Ｎ_３−Ｎ_４−Ｎ_５のｂヌクレオチドのフラグメントまたは
（ｂ）上で定義されたようなヌクレオチド配列Ｎ_１−Ｎ_２−Ｎ_３−Ｎ_４−Ｎ_５のｂヌクレ
オチドのフラグメントの相補体のいずれかからなるヌクレオチド配列であり；そして該ポ
リヌクレオチドは、（ａ）ヌクレオチド配列Ｎ_１−Ｎ_２−Ｎ_３−Ｎ_４−Ｎ_５のフラグメン
トでも（ｂ）ヌクレオチド配列Ｎ_１−Ｎ_２−Ｎ_３−Ｎ_４−Ｎ_５のフラグメントの相補体の
どちらでもない。
【００５５】
−Ｂ−領域は、好ましくは、Ｎ_４のフラグメントである。−Ａ−および／または−Ｃ−
位置は、例えば、ＴＭＡにおいて使用するためのプロモーター配列（またはその相補体）
含み得る。
【００５６】
ａ＋ｃの値は、少なくとも１（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１
、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、
２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９
０、１００など）である。ｂの値は、少なくとも７（例えば、少なくとも８、９、１０、
１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２
４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００など）であ
る。ａ＋ｂ＋ｃの値は、少なくとも９（例えば、少なくとも１０、１１、１２、１３、１
４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５
、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００など）であることが好ましい。ａ
＋ｂ＋ｃの値は、多くても５００（例えば、多くても４５０、４００、３５０、３００、
２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、
１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８
、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９）であることが好ましい。
【００５７】
−Ｂ−がＮ_１−Ｎ_２−Ｎ_３−Ｎ_４−Ｎ_５のフラグメントである場合、−Ａ−のヌクレオ
チド配列は、代表的にはＮ_１−Ｎ_２−Ｎ_３−Ｎ_４−Ｎ_５における配列−Ｂ−の５’である
ａヌクレオチドとｎ％未満の配列同一性を共有し、そして／または−Ｃ−のヌクレオチド
配列は、代表的にはＮ_１−Ｎ_２−Ｎ_３−Ｎ_４−Ｎ_５における配列−Ｃ−の３’であるｃヌ
クレオチドとｎ％未満の配列同一性を共有する。同様に、−Ｂ−がＮ_１−Ｎ_２−Ｎ_３−Ｎ
_４−Ｎ_５のフラグメントの相補体である場合、−Ａ−のヌクレオチド配列は、代表的には
Ｎ_１−Ｎ_２−Ｎ_３−Ｎ_４−Ｎ_５における配列−Ｂ−の相補体の５’であるａヌクレオチド
の相補体とｎ％未満の配列同一性を共有し、そして／または−Ｃ−のヌクレオチド配列は
、代表的にはＮ_１−Ｎ_２−Ｎ_３−Ｎ_４−Ｎ_５における配列−Ｃ−の相補体の３’であるｃ
ヌクレオチドの相補体とｎ％未満の配列同一性を共有する。ｎの値は、概して６０以下（
例えば、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１０以下）である。
【００５８】
本発明はまた、上述されたようなヌクレオチド配列Ｎ_１−Ｎ_２−Ｎ_３−Ｎ_４−Ｎ_５を有
する核酸、または上述されたようなヌクレオチド配列Ｎ_１−Ｎ_２−Ｎ_３−Ｎ_４−Ｎ_５の相
補体を有する核酸に選択的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド配列を提供
する。このポリヌクレオチドは、好ましくは、少なくともＮ_４にハイブリダイズする。
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で実行され得る
。これは、当該分野において広く公知であり、かつ公開されているハイブリダイゼーショ
ン反応のストリンジェンシーを増大する条件である（例えば、参考文献１７の７．５２頁
を参照のこと）。関連する条件の例としては、（ストリンジェンシーを増大する順で）：
２５°Ｃ、３７°Ｃ、５０°Ｃ、５５°Ｃおよび６８°Ｃのインキュベーション温度；１
０×ＳＳＣ、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣの緩衝液濃縮物（ここで、ＳＳＣ
は、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸緩衝液である）および他の緩衝系を使
用する等価なもの；０％、２５％、５０％、および７５％のホルムアミド濃縮物；５分間
〜２４時間のインキュベーション時間；１回、２回、またはそれ以上の洗浄工程；１分間
、２分間、または１５分間の洗浄インキュベーション時間；ならびに６×ＳＳＣ、１×Ｓ
ＳＣ、０．１×ＳＳＣ、または脱イオン水の洗浄溶液が挙げられる。ハイブリダイゼーシ
ョン技術は、当該分野において周知である（例えば、参考文献８、１７、１８、１９、２
０などを参照のこと）。当業者によって理解されるように、特定のポリヌクレオチド配列
およびこのポリヌクレオチド配列によってコードされる特定のドメインに依存して、本発
明のポリヌクレオチドと既知のポリヌクレオチドとを比較する際のハイブリダイゼーショ
ン条件が異なり得る。
【００５９】
いくつかの実施形態において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、低ストリンジ
ェンシー条件下で、選択的にハイブリダイズする；他の実施形態において、この単離され
たポリヌクレオチドは、中間のストリンジェンシー条件下で、選択的にハイブリダイズす
る；他の実施形態において、この単離されたポリヌクレオチドは、高ストリンジェンシー
条件下で、選択的にハイブリダイズする。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション
の例示的なセットは、５０°Ｃおよび１０×ＳＳＣである。中間のストリンジェンシーハ
イブリダイゼーション条件の例示的なセットは、５５°Ｃおよび１×ＳＳＣである。高ス
トリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例示的なセットは、６８°Ｃおよび０．
１×ＳＳＣである。
【００６０】
本発明の特に好ましいポリヌクレオチドは、以下に規定されるようなポリヌクレオチド
をコードする。「コード」によって、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）は翻訳される
が、以下に規定されるポリヌクレオチドのアミノ酸をコードする一連のコドンを含むこと
が必ずしも意味されるのではない。
【００６１】
本発明はまた、以下：（ａ）配列番号２７８〜４７７からなる群から選択されるヌクレ
オチド配列；（ｂ）（ａ）の少なくともｘ個のヌクレオチドのフラグメント；（ｃ）（ａ
）と少なくともｓ％同一性を有するヌクレオチド配列；または（ｄ）（ａ）、（ｂ）また
は（ｃ）の相補体、を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００６２】
本発明はまた、（ａ）配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２
６、２７、３８、４０、４２、５１および５２からなる群から選択されるヌクレオチド配
列；（ｂ）（ａ）の少なくともｘ個のヌクレオチドのフラグメント；（ｃ）（ａ）と少な
くともｓ％同一性を有するヌクレオチド配列；または（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）
の相補体、を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００６３】
本発明のポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション反応および／または増幅反応に
おいて使用するためのプローブおよび／またはプライマーとして、特に有用である。
【００６４】
本発明の１つ以上のポリヌクレオチドは、同じ核酸標的にハイブリダイズし得る（例え
ば、１つ以上が単一ＲＮＡにハイブリダイズし得る）。
【００６５】
２つの核酸配列間のパーセンテージ配列同一性についての言及は、アライメントされた
場合、この塩基のパーセンテージは、２つの配列を比較した際と同じであることを意味す
る。このアライメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当該分野において公
知のソフトウェアプログラム（例えば、参考文献２０のセクション７．７．１８において
記載されるもの）を使用して実行され得る。好ましいアライメントプログラムは、ＧＣＧ
Ｇａｐ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｓ
ｕｉｔｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．１）であり、好ましくは、以下のとおりのデフォルト
パラメーターを使用する：オープンギャップ＝３；伸長ギャップ＝１。
【００６６】
本発明のポリヌクレオチドは、種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、線状、環状、ベ
クター、プライマー、プローブなど）を取り得る。
【００６７】
本発明のポリヌクレオチドは、多くの方法（例えば、化学合成（少なくとも一部分）に
よって、生物自体などに由来するゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーからの
より長いポリヌクレオチドを、制限酵素を使用して消化することによって）において調製
され得る。
【００６８】
本発明のポリヌクレオチドは、固形支持体（例えば、ビーズ、プレート、フィルター、
フィルム、スライド、樹脂など）に結合され得る。
【００６９】
本発明のポリヌクレオチドは、検出標識（例えば、放射性標識または蛍光標識、または
ビオチン標識）を含み得る。このポリヌクレオチドが核酸検出技術において使用されるべ
きである場合（例えば、この核酸が、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ、ｂＤＮＡな
どのような技術において使用するためのプライマーであるかまたはプローブである場合）
、これは特に有用である。
【００７０】
用語「ポリヌクレオチド」は、一般的に任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を意
味し、これは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそのアナ
ログを含む。ポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド
、およびＤＮＡアナログまたはＲＮＡアナログ（例えば、改変された骨格または塩基を含
むもの）、そしてまた、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などが挙げられる。用語「ポリヌクレオ
チド」は、特に示されない限り、核酸の長さまたは構造について制限することは意図され
ず、そして以下が、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグ
メント、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ
、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の供給
源から単離された任意のＤＮＡ、任意の供給源から単離された任意のＲＮＡ、核酸プロー
ブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有し得、そして既知ま
たは未知の任意の機能を実行し得る。他で特定されるか、または必要とされない限り、ポ
リヌクレオチドを含む本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態および二本鎖形態を作るこ
とが公知であるかまたは予測される２つの相補的な各一本鎖形態の両方を含む。
【００７１】
本発明のポリヌクレオチドは、単離されそして実質的な純度で、一般的にインタクトな
染色体以外として得られ得る。通常、ポリペプチドは、他の天然に存在する核酸配列が実
質的に含まない（一般的に、少なくとも約５０％（重量）の純度、通常は少なくとも約９
０％の純度である）状態で得られる。
【００７２】
本発明のポリヌクレオチド（特にＤＮＡ）は、代表的には、「組換え」（例えば、天然
に存在する染色体には、通常会合しない１つ以上のヌクレオチドによって隣接される）で
ある。
【００７３】
このポリヌクレオチドは、例えば：ポリペプチドを産生するために；生物学的サンプル
における核酸検出のためのプローブとして；ポリペプチドのさらなるコピーを生成するた
めに；リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成するために；そして一本
鎖ＤＮＡプローブとしてまたは三本鎖形成オリゴヌクレオチドとして使用され得る。この
ポリペプチドは、好ましくはＰＣＡ−ｍＲＮＡを検出するために使用される。
【００７４】
「ベクター」は１つ以上の細胞型の形質導入／トランスフェクションのために設計され
たポリヌクレオチド構築物である。ベクターは、例えば、挿入されたヌクレオチドの単離
、増殖および複製のために設計される「クローニングベクター」、宿主細胞中でのヌクレ
オチド配列の発現のために設計される「発現ベクター」、組換えウイルスまたはウイルス
様粒子を産生するために設計される「ウイルスベクター」、または「シャトルベクター」
であり得、これらは、１つ以上の型のベクターの特性を含む。
【００７５】
「宿主細胞」は、外因性のポリヌクレオチドのレシピエントであり得るかまたはレシピ
エントであった、個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子
孫を含み、そしてこの子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な変異および／または変
化に起因して、本来の親細胞と必ずしも完全に同一（形態学的にまたは総ＤＮＡ相補体に
おいて）ではあり得ない。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドで、インビボまたはイ
ンビトロで、トンラスフェクトまたは感染された細胞を含む。
【００７６】
（Ｂ．５ 核酸検出キット）
本発明は、ＰＣＡＶ核酸内に含まれるテンプレート配列を増幅するためのプライマー（
例えば、ＰＣＲプライマー）を含むキット、第１プライマーおよび第２プライマーを含む
キットを提供し、ここで第１プライマーは、該テンプレート配列に対して実質的に相補的
であり、そして第２プライマーは、該テンプレート配列の相補体に対して実質的に相補的
であり、ここで、実質的に相補性を有する該プライマーの部分が、増幅されるべきテンプ
レート配列の末端を規定する。第１プライマーおよび／または第２プライマーは、検出可
能な標識を含み得る。
【００７７】
本発明はまた、一本鎖核酸または二本鎖核酸（またはそれらの混合物）中に含まれるＰ
ＣＡＶテンプレート核酸配列の増幅を可能にする第１および第２の一本鎖オリゴヌクレオ
チドを含みキットを提供し、以下：（ａ）第１オリゴヌクレオチドは、該テンプレート核
酸配列に対して実質的に相補的であるプライマー配列を含む；（ｂ）第２オリゴヌクレオ
チドは、該テンプレート核酸配列の相補体に対して実質的に相補的であるプライマー配列
を含む；（ｃ）第１オリゴヌクレオチドおよび／または第２オリゴヌクレオチドは、該テ
ンプレート核酸に対して相補的ではない配列を含む；そして（ｄ）該プライマー配列は、
増幅されるべきテンプレート配列の末端を規定する。特徴（ｃ）の非相補性配列は、好ま
しくは、このプライマー配列の上流（すなわち、５’側）である。（ｃ）配列の一方また
は両方は、制限部位（２１）またはプロモーター配列（２２）を含み得る。この第１オリ
ゴヌクレオチドおよび／または第２オリゴヌクレオチドは、検出可能な標識を含み得る。
【００７８】
本発明のキットはまた、テンプレート配列のフラグメント（またはその相補体）を含む
標識化ポリヌクレオチドを含み得る。これは、増幅されたテンプレートを検出するための
ハイブリダイゼーション技術において使用され得る。
【００７９】
これらのキットにおいて使用されるプライマーおよびプローブは、好ましくは、セクシ
ョンＢ．４において記載されるポリヌクレオチドである。
【００８０】
標的は、セクションＢ．１において記載されるようなポリヌクレオチド配列であること
が好ましい。
【００８１】
（Ｃ ポリペプチド発現産物）
本方法がポリペプチドの検出に基づく場合、本方法は、スプライシング事象（ｅｎｖコ
ード領域の５’領域および開始コドンが、ゲノムにおけるｅｎｖのコード領域に対して、
リーディングフレーム＋２において下流コード領域に結合される）によって産生される転
写物によってコードされるＨＭＬ−２ポリペプチドの発現を検出する工程を包含する。こ
のポリペプチドは、ウイルスの生活環において機能的であっても、機能的でなくでもよい
。
【００８２】
ＨＭＬ−２ポリペプチドをコードする転写物は、内因性ゲノムの全長のｍＲＮＡのコピ
ーの選択的スプライシングによって生成される（例えば、参考文献１９５の図４；本明細
書中の図１７）。
【００８３】
本発明のポリペプチドは、ｅｎｖと同じ５’領域（および開始コドン）を共有するＯＲ
Ｆによってコードされる。スプライシング事象は、ｅｎｖコード配列を除去するが、この
コード配列は、ｅｎｖのコード配列に対してリーディングフレーム＋２において続く。ス
プライシングされたヌクレオチド配列の例としては、配列番号１８〜２７、３８、４０お
よび４２である。コードされたポリペプチド配列の例は、配列番号７〜１２および配列番
号２８、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３９、４１、４３、６７、６８および６
９である。これらのうちのいくつか（例えば、配列番号１０〜１２）は、トランスドミナ
ント（ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａｎｔ）様式でＰＣＡＰ４の機能を阻害する。
【００８４】
（Ｃ．１ ＨＭＬ−２ポリペプチドの直接検出）
サンプル中の特定のポリペプチドの存在または非存在を検出するために、種々の技術が
利用される。これらは、一般的に、抗体とポリペプチドにおける抗原性アミノ酸配列との
間の特定の相互作用に基づく免疫アッセイ技術である。適切な技術としては、標準的な免
疫組織学的方法、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ、免疫蛍光検査法などが挙げら
れる。
【００８５】
それゆえ、一般的に、本発明は、生物学的サンプルにおける本発明のＴａｔポリペプチ
ドの存在を検出し、そして／またはそのレベルを測定するための方法を提供し、本方法は
、このポリペプチドに特異的な抗体を使用する。概して本方法は、以下の工程：ａ）サン
プルとこのポリペプチドに特異的な抗体を接触させる工程；およびｂ）この抗体とサンプ
ル中のポリペプチドとの間の結合を検出する工程を含む。
【００８６】
本発明のポリペプチドはまた、機能アッセイ（例えば、結合活性または酵素活性を検出
するためのアッセイ）によって検出され得る。例えば、本発明の転写的に活性ポリペプチ
ドは、本明細書中の実施例において記載されるように、ＰＣＡＶ ＬＴＲによって駆動す
るレポーター遺伝子の発現を検出することによってアッセイされ得る。
【００８７】
本発明のポリペプチドを検出するための別の方法は、標準的なプロテオミクス技術（例
えば、ポリペプチドの精製しそして分離する）を使用し、次いでペプチド配列決定を使用
することである。配列が標的ポリペプチド中に存在するか否かを同定するために、例えば
、ポリペプチドは、２Ｄ−ＰＡＧＥを使用して分離され得、そしてポリペプチドスポット
が（例えば、質量分光学によって）配列決定され得る。
【００８８】
検出方法は、インビボで使用するために（例えば、癌細胞が存在する部位を位置付ける
か、または同定するために）適応され得る。これらの実施形態において、標的ポリペプチ
ドに特異的な抗体は個体に（例えば、注射によって）投与され、そして抗体は、標準的な
画像化技術（例えば、磁気共鳴画像法、コンピューター連動断層撮影走査など）を使用し
て、位置付けられる。適切な標識（例えば、スピン標識など）が使用される。これらの技
術を使用して、癌細胞は差次的に標識される。
【００８９】
免疫蛍光アッセイは、標的ポリペプチドの精製の必要なく細胞上で容易に実行され得る
。まず細胞は、顕微鏡用スライドまたはマイクロタイターウェルのような固形支持体上で
固定される。次いで、これらの細胞の膜は、ポリペプチドに特異的な抗体の進入を許容す
るために、透過可能にされる（ＮＢ：固定および透過可能化は、共に達成され得る）。次
に、固定化細胞は、コードされたポリペプチドに特異的であり、そして蛍光標識された抗
体に曝露される。この標識の存在（例えば、顕微鏡下で視覚化される）は、標的ＰＣＡＶ
ポリペプチドを発現する細胞を同定する。アッセイの感受性を増大させるために、抗ＰＣ
ＡＶ抗体に結合するような二次抗体（標識が二次抗体によって保持されている）を使用す
ることが可能である（２３）。
【００９０】
（Ｃ．２ ＨＭＬ−２ポリペプチドの間接検出）
ポリペプチドを直接的に検出するより、ポリペプチドに応答して生体によって産生され
る分子を検出することが好ましくはあり得る（すなわち、ポリペプチドの間接検出）。こ
れは、代表的には抗体の検出に関し、そのため患者サンプルは概して血液サンプルである
。抗体は、従来の免疫アッセイ技術によって（例えば、本発明のＰＣＡＶポリペプチドを
使用して）検出され得、これは、代表的には固定される。
【００９１】
ＨＥＲＶ−Ｋポリペプチドに対する抗体が、ヒトにおいて発見されている（１９５）。
【００９２】
（Ｃ．３ ポリペプチド物質）
本発明は、以下：（ａ）配列番号７、８、９、１０、１１、１２、２８、２９、３０、
３１、３４、３５、３６、３９、４１、４３、６７、６８および６９からなる群から選択
されるアミノ酸配列；（ｂ）（ａ）の少なくともｘ個のアミノ酸のフラグメント；または
（ｃ）（ａ）と少なくともｓ％の同一性を有するポリペプチド配列を含む単離されたポリ
ペプチドを提供する。これらのポリペプチドは、改変体（例えば、対立遺伝子改変体、ホ
モログ、オルソログ、機能的変異体および非機能的変異体）を含む。
【００９３】
ｘの値は、少なくとも５（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１
３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０
、３５、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００など）である。ｘの
値は、２０００未満（例えば、１０００未満、５００未満、１００未満、または５０未満
）であり得る。
【００９４】
ｓの値は、好ましくは、少なくとも５０（例えば、少なくとも５５、６０、６５、７０
、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、
９９．５、９９．９など）である。
【００９５】
本発明はまた、式ＮＨ_２−Ａ−Ｂ−Ｃ−ＣＯＯＨを有する単離されたポリペプチドを提
供し、ここで：Ａは、ａアミノ酸からなるポリペプチド配列であり；Ｃは、ｃアミノ酸か
らなるポリペプチド配列であり；Ｂは、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、２８、
２９、３０、３１、３４、３５、３６、３９、４１、４３、６７、６８および６９からな
る群から選択されるアミノ酸配列のｂアミノ酸のフラグメントからなるポリペプチド配列
であり；そして該ポリペプチドは、ポリペプチド配列の配列番号７、８、９、１０、１１
、１２、２８、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３９、４１、４３、６７、６８ま
たは６９のフラグメントではない。
【００９６】
ａ＋ｃの値は、少なくとも１（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、
１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２
３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０
、８０、９０、１００など）である。ｂの値は、少なくとも７（例えば、少なくとも８、
９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２
、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００
など）である。ａ＋ｂ＋ｃの値は、少なくとも９（例えば、少なくとも１０、１１、１２
、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、
３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００など）であることが好
ましい。ａ＋ｂ＋ｃの値は、多くても５００（例えば、多くても４５０、４００、３５０
、３００、２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０
、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、
１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９）であることが好ま
しい。
【００９７】
−Ａ−のアミノ酸配列は、代表的には、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、２８
、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３９、４１、４３、６７、６８および６９にお
ける配列−Ｂ−のＮ末端であるａアミノ酸とｎ％未満の配列同一性を共有し、そして−Ｃ
−のアミノ酸配列は、代表的には、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、２８、２９
、３０、３１、３４、３５、３６、３９、４１、４３、６７、６８および６９における配
列−Ｂ−のＣ末端であるｃアミノ酸とｎ％未満の配列同一性を共有する。ｎの値は、一般
的に６０以下（例えば、５０、４０、３０、２０、１０以下）である。
【００９８】
（ｂ）または−Ｂ−のフラグメントは、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、２８
、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３９、４１、４３、６７、６８および６９のＴ
細胞エピトープまたは、好ましくはＢ細胞エピトープを含み得る。Ｔ細胞エピトープおよ
びＢ細胞エピトープは、実験的に（例えば、ＰＥＰＳＣＡＮ方法（２４、２５）または類
似の方法を使用して）同定され得るか、またはそれらは予測され得る（例えば、Ｊａｍｅ
ｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指標（２６）、マトリクスベースのアプローチ（２７）、ＴＥＰ
ＩＴＯＰＥ（２８）、神経ネットワーク（２９）、ＯｐｔｉＭｅｒ ＆ ＥｐｉＭｅｒ（
３０、３１）、ＡＤＥＰＴ（３２）、Ｔｓｉｔｅｓ（３３）、親水性（３４）、抗原性指
標（３５）または参考文献３６などにおいて開示される方法を使用する）。これらの方法
は、ＨＩＶｔａｔおよびＨＴＬＶｔａｘについてのＢ細胞エピトープおよびＴ細胞エピト
ープを同定する際の首尾よさを証明する（例えば、３１、３７、３８、３９、４０、４１
、４２、４３、４４など）。
【００９９】
（ｂ）または−Ｂ−の好ましいフラグメントは、スプライシング部位の下流（すなわち
、エキソン３内）に位置付けられる。そのようなフラグメントの例は、６１〜６８（また
はそのサブフラグメント）である。ポリペプチドは、これらの配列の１つ以上を含み得る
。例えば、これは、配列番号６２〜６５のうちの２つ以上（例えば、２、３、４）、好ま
しくは順番に（例えば、ＮＨ_２−Ｏ^１−６２−Ｏ^２−６３−Ｏ^３−６４−Ｏ^４−６５−Ｏ
^５−ＣＯＯＨ、ここでＯ^１〜Ｏ^５は、１つ以上のアミノ酸の最適配列である）、そして必
要に応じて、配列番号６１（好ましくは、配列番号６２の上流に）も含み得る。他のポリ
ペプチドは、配列番号６６および／または配列番号６７を含み得る。
【０１００】
従って、本発明は、以下：（ａ）配列番号６１〜６８からなる群から選択されるアミノ
酸配列；（ｂ）（ａ）の少なくともｘ個のアミノ酸のフラグメント；または（ｃ）（ａ）
と少なくともｓ％の同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【０１０１】
本発明はまた、以下：（ａ）配列番号７８〜２７７からなる群から選択されるアミノ酸
配列；（ｂ）（ａ）の少なくともｘ個のアミノ酸のフラグメント；または（ｃ）（ａ）と
少なくともｓ％の同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【０１０２】
配列番号７、８、９、１０、１１、１２、２８、２９、３０、３１、３４、３５、３６
、３９、４１、４３、６７、６８および６９からなる群の内で、好ましいサブセットは、
配列番号７、８、１１および１２（ＰＣＡＰ２、ＰＣＡＰ３、ＰＣＡＰ４およびＰＣＡＰ
４ａ）である。
【０１０３】
好ましいポリペプチドは、配列番号４９を含むＲＮＡに結合し得る。
【０１０４】
２つのアミノ酸配列間のパーセンテージ配列同一性に対する参考は、整列された場合、
そのアミノ酸パーセンテージは、２つの配列を比較した際に同じであることを意味する。
この整列およびパーセント相同性または配列同一性は、当該分野において公知のソフトウ
ェアプログラム（例えば、参考文献２０のセクション７．７．１８において記載されるも
の）を使用して決定され得る。好ましい整列は、ギャップ開放ペナルティー１２およびギ
ャップ伸長ペナルティー２を有するアフィンギャップ検索を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔ
ｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズム（６２のＢＬＯＳＵＭマトリクス）によって決定され
る。このＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献４５におい
て教示される。
【０１０５】
本発明のポリペプチドは、多くの方法で（例えば、化学合成（少なくとも一部分）によ
って、より長いポリペプチドをプロテアーゼを使用して消化することによって、ＲＮＡか
らの翻訳によって、細胞培養物（例えば、組換え発現）からの精製によって）、生物自体
（例えば、前立腺組織または胸部組織からの単離物）、細胞株供給源などから調製され得
る。
【０１０６】
本発明のポリペプチドは、種々の形態（例えば、ネイティブ、融合、グリコシル化、非
グリコシル化など）で調製され得る。
【０１０７】
本発明のポリペプチドは、固形支持体に結合され得る。
【０１０８】
本発明のポリペプチドは、検出可能な標識（例えば、放射性標識または蛍光標識、ある
いはビオチン標識）を含み得る。
【０１０９】
一般的に、本発明のポリペプチドは、天然では存在しない環境において提供される（例
えば、それらは、その天然で存在する環境から分離される）。特定の実施形態において、
本ポリペプチドは、コントロールと比較してポリペプチドを富化にされた組成物中に存在
する。このように、精製されたポリペプチドは提供され（精製されたとは、このポリペプ
チドは、他の発現されたポリペプチドを実質的に含まない組成物中に存在することを意味
する）、（実質的に含まないとは、その組成物の９０％未満、通常は６０％未満およびよ
り通常は５０％未満が、他の発現されたポリペプチドから作られることを意味する。
【０１１０】
用語「ポリペプチド」とは、任意の長さのアミノ酸ポリマーをいう。ポリマーは、線状
または分枝であり得、これは、改変されたアミノ酸を含み得、そしてこれは、非アミノ酸
によって中断され得る。この用語はまた、天然にまたは介入によって改変されたアミノ酸
ポリマーを含む；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、
リン酸化、あるいは任意の他の操作または改変（例えば、標識成分を用いる結合体化）。
例えば、１つ以上のアミノ酸アナログ（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）を含むポ
リペプチドならびに当該分野において公知の他の改変体もまた、定義内に含まれる。ポリ
ペプチドは、単鎖または関連鎖として生じ得る。本発明のポリペプチドは、天然または非
天然にグリコシル化され得る（すなわち、ポリペプチドは、対応する天然に存在するポリ
ペプチド中に見出されるグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを有する
）。
【０１１１】
変異体は、アミノ酸置換、付加または欠失を含み得る。アミノ酸置換は、非必須のアミ
ノ酸を除去するための（例えば、グリコシル化部位、リン酸化部位またはアセチル化部位
を変更する）または機能のために必ずしも必要ではない１つ以上のシステイン残基の置換
または欠失による誤った折り畳みを最小にするための保存的アミノ酸置換または置換であ
り得る。保存的アミノ酸置換は、置換されたアミノ酸の通常電荷、親水性／疎水性、およ
び／または立体化学的な膨張性を保護する置換である。改変体は、このポリペプチドの特
定領域（例えば、機能ドメインおよび／またはこのポリペプチドがポリペプチドファミリ
ーのメンバーである場合、コンセンサス配列に関連する領域）の生物活性を保持するか、
または高めるように設計され得る。改変体の産生のためのアミノ酸改変の選択は、アミノ
酸の接近しやすさ（内部 対 外部）（例えば、ｒｅｆ．４６）、改変ポリペプチドの熱
安定性（例えば、ｒｅｆ．４７）、所望のグリコシル化部位（例えば、ｒｅｆ．４８）、
所望のジスルフィド結合（例えば、ｒｅｆ．４９および５０）、所望の金属結合部位（例
えば、ｒｅｆ．５１および５２）、およびプロリンループにおける所望の置換（例えば、
ｒｅｆ．５３）に基づき得る。システイン欠失ムテインは、参考文献５４において開示さ
れるように産生され得る。
【０１１２】
（Ｃ．４ 抗体材料）
本発明はまた、本発明のポリペプチドに結合する、単離された抗体またはその抗原結合
性フラグメントを提供する。本発明はまた、単離された抗体またはまたはその抗原結合性
フラグメントを提供し、これらは、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリ
ペプチドに結合する。
【０１１３】
本発明の抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、そして任意の適切な
手段によって（例えば、組換え発現によって）産生され得る。
【０１１４】
本発明の抗体は、標識を含み得る。この標識は、放射性標識または蛍光標識のように、
直接的に検出可能であり得る。あるいは、この標識は、その産物が検出可能である酵素（
例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼなど）のように、間
接的に検出可能であり得る。
【０１１５】
本発明の抗体は、固形支持体に結合され得る。本発明の抗体は、本発明のポリペプチド
を適切な動物（例えば、ウサギ、ハムスター、マウスまたは他のげっ歯類）に投与する（
例えば、注射する）ことによって調製され得る。
【０１１６】
抗体の抗原結合性フラグメントは、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２な
どを含む。
【０１１７】
ヒト免疫系との適合性を増強するために、抗体は、キメラまたはヒト化であり得るか（
例えば、ｒｅｆ．５５および５６）、あるいは完全なヒト抗体が使用され得る。ヒト化抗
体は、本来の非ヒトモノクローナル抗体よりヒトにおいて免疫原性が非常に低いので、そ
れらは、アナフィラキシーの危険性をほとんど伴わずヒトの処置のために使用され得る。
従って、これらの抗体は、ヒトへのインビボ投与を含む治療適用（例えば、腫瘍性疾患の
処置のために放射能感作物質としての使用または癌治療の副作用を減少するための方法に
おける使用）において好ましくあり得る。
【０１１８】
ヒト化抗体は、種々の方法によって達成され得、この方法は、例えば：（１）非ヒト抗
体からの１つ以上のフレームワーク残基の必要に応じた転移を伴う、ヒトフレームワーク
領域および定常領域上に非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を移植する工程（「ヒト化」）
；（２）表面残基の置換によってヒト様表面で非ヒト可変ドメインを「覆うこと」ではな
く、非ヒト可変ドメイン全体を移植する工程（「被膜化」（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ））を包
含する。本発明において、ヒト化抗体は、「ヒト化」抗体および「被膜化」抗体の両方を
含む（５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３）。
【０１１９】
ＣＤＲは、ネイティブな免疫グロブリン結合部位の結合親和性およびＦｖ領域の特異性
をともに規定するアミノ酸配列である（例えば、ｒｅｆ．６４および６５）。
【０１２０】
用語「定常領域」とは、エフェクター機能を供与する抗体分子の一部をいう。キメラ抗
体において、マウスの定常領域は、ヒト定常領域によって置換される。ヒト化抗体の定常
領域は、ヒト免疫グロブリンに由来する。重鎖の定常領域は、５個のアイソタイプ（α、
δ、ε、γまたはμ）のいずれかから選択され得る。
【０１２１】
抗体をヒト化する１つの方法は、ヒト重鎮配列およびヒト軽鎖配列に対して非ヒト抗体
の重鎖配列および軽鎖配列を整列する工程、非ヒトフレームワーク残基を、このようなア
ライメントに基づくヒトフレームワーク残基で置換する工程、非ヒト親抗体のコンホメー
ションと比較するヒト化配列のコンホメーションの分子モデリング、およびヒト化配列モ
デルにおけるＣＤＲの予測されるコンホメーションが、親非ヒト抗体の非ヒトＣＤＲのコ
ンホメーションを密接に近づけるまでの、非ヒトＣＤＲの構造を分配するフレームワーク
領域内の残基の繰り返し復帰変異を包含する。このようなヒト化抗体は、例えば、Ａｓｈ
ｗｅｌｌレセプター（ｒｅｆ．６６および６７）を介して、さらに吸収およびクリアラン
スを促進するように誘導され得る。
【０１２２】
ヒト化抗体または完全なヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン座を含むように操作され
るトランスジェニック動物を使用して産生され得る。例えば、ｒｅｆ．６８は、ヒトＩｇ
座を有するトランスジェニック動物を開示し、この動物は、内因性の重鎖座および軽鎖座
の不活化に起因して、機能的な内因性免疫原を産生しない。ｒｅｆ．６９はまた、免疫原
に対する免疫応答をマウントし得るトランスジェニック非霊長類哺乳動物宿主を開示し、
この抗体は、霊長類の定常領域および／または可変領域を有し、そして内因性免疫グロブ
リンをコードする座が置換されるか、または不活化される。ｒｅｆ．７０は、哺乳類にお
ける免疫グロブリン座の改変するための（例えば、改変された抗体分子を形成するために
、定常領域および可変領域の全てまたは一部分を置換するための）Ｃｒｅ／Ｌｏｘ系の使
用を開示する。ｒｅｆ．７１は、不活化内因性Ｉｇ座および機能的なヒトＩｇ座を有する
非ヒト哺乳動物宿主を開示する。ｒｅｆ．７２は、トランスジェニックマウス（このマウ
スは、内因性の重鎖を欠失し、そして１つ以上の外因性（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）の定常
領域を含む外因性（ｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓ）の免疫グロブリン座を発現する）を作る方法
を開示する。
【０１２３】
上記のトランスジェニック動物を使用して、ＰＣＡＶポリペプチドに対する免疫応答が
生じられ得、そして抗体産生細胞は動物から除去され得、そしてヒトモノクローナル抗体
を分泌するハイブリドーマを産生するために使用され得る。免疫化プロトコル、アジュバ
ントなどは当該分野において公知であり、そして例えば、ｒｅｆ．７３において記載され
るように、トランスジェニックマウスの免疫化において使用される。モノクローナル抗体
は、対応するポリペプチドの生物活性または生理的効果を阻害するか、または中和する能
力について試験され得る。
【０１２４】
（Ｄ コントロールサンプルとの比較）
（Ｄ．１ コントロール）
ＨＭＬ−２転写物は、腫瘍においてアップレギュレートされる。このようなアップレギ
ュレーションを検出するために、基準点（すなわち、コントロール）が必要とされる。コ
ントロールサンプルの分析は、患者のサンプルが比較され得る標準レベルのＲＮＡおよび
／またはタンパク質発現を与える。
【０１２５】
ネガティブコントロールは、患者サンプルが比較され得る発現のバックグラウンドレベ
ルまたはベースレベルを与える。寿命ベースラインまたはプールされた正常サンプルのよ
うなネガティブコントロールに関して発現産物のより高いレベルは、サンプルが得られた
患者は、腫瘍を有することを示す。逆に言えば、発現産物の同レベルは、患者がＨＭＬ−
２関連腫瘍を有さないことを示す。
【０１２６】
ポジティブコントロールは、患者サンプルが比較され得る発現のレベルを与える。ポジ
ティブコントロールに関して同レベルまたは発現産物のより高いレベルは、サンプルが得
られた患者は、腫瘍を有することを示す。逆に言えば、発現産物のより低いレベルは、患
者がＨＭＬ−２関連腫瘍を有さないことを示す。
【０１２７】
直接的または間接的なＲＮＡ測定のために、あるいは直接的なポリペプチド測定のため
に、ネガティブコントロールは、一般的に腫瘍細胞に由来しない細胞（例えば、胸部腫瘍
または前立腺腫瘍）を含む。間接的なポリペプチド測定のために、ネガティブコントロー
ルは、一般的に腫瘍を有さない患者由来の血液サンプルである。ネガティブコントロール
は、ＨＭＬ−２発現がアップレギュレートされない組織（例えば、雄性の非腫瘍性の非前
立腺細胞、または雌性の非腫瘍性の非胸部細胞）ではなく、この患者サンプルと同じ患者
由来のサンプルであり得る。ネガティブコントロールは、この患者サンプルと同じ患者由
来の前立腺細胞または胸部細胞であり得るが、これらは、患者の生命における初期ステー
ジで得られる。ネガティブコントロールは、腫瘍のない患者由来の細胞であり得る。この
細胞は、前立腺／胸部細胞であってもなくてもよい。ネガティブコントロール細胞は、Ｂ
ＰＨを有する患者由来の前立腺細胞であり得る。ネガティブコントロールは、正常な精液
（ｓｅｍｅｎ）、精液（ｓｅｍｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）、初乳、乳ミルクなどであり得る
。
【０１２８】
直接的または間接的なＲＮＡ測定のために、あるいは直接的なポリペプチド測定のため
に、ポジティブコントロールは、一般的に問題の腫瘍の型に由来する細胞を含む。間接的
なポリペプチド測定のために、ネガティブコントロールは、一般的に前立腺腫瘍または胸
部腫瘍を有する患者由来の血液サンプルである。ネガティブコントロールは、この患者サ
ンプルと同じ患者由来の前立腺腫瘍細胞または胸部腫瘍細胞であり得るが、これらは、例
えば、寛解をモニタリングするために、患者の生命における初期ステージで得られる。ポ
ジティブコントロールは、前立腺腫瘍または胸部腫瘍を有する別の患者由来の細胞であり
得る。ポジティブコントロールは、前立腺細胞株または胸部細胞株であり得る。
【０１２９】
他の適切なポジティブコントロールまたはネガティブコントロールは、当業者に理解さ
れる。
【０１３０】
コントロールにおけるＨＭＬ−２発現は、患者サンプルにおける発現として同時に評価
され得る。あるいは、コントロールにおけるＨＭＬ−２発現は、別個に（初期または後期
に）評価され得る。
【０１３１】
しかし、２つのサンプルを実際に比較するよりも、コントロールは、正確なコントロー
ル（すなわち、例えば、通常の条件下での腫瘍患者から得られたサンプルから経験的に決
定された（）発現レベル）であり得る。
【０１３２】
（Ｄ．２ アップレギュレーションの程度）
コントロール（１００％）に関するアップレギュレーションは、通常少なくとも１５０
％（例えば、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％以上）であ
る。
【０１３３】
（Ｄ．３ 診断）
本発明は、癌を診断するための方法を提供する。本発明に従う「診断」は、疾患の一定
の臨床診断から、患者が一定の診断を導き得るさらなる試験を受けるべきであるという指
標の範囲にあり得ることが理解される。例えば、本発明の方法は、さらなる分析に供され
るポジティブサンプルを有するスクリーニングプロセスの一部として使用され得る。
【０１３４】
さらに、診断は、癌を有することが既知である患者中の癌の進行のモニタリングを含む
。癌はまた、本発明の方法によって段階付けられ得る。
【０１３５】
例えば、その効力を決定するために、癌の処置レジメンの効力（テラメトリクス（ｔｈ
ｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ））もまた、本発明の方法によってモニタリングされ得る。
【０１３６】
例えば、発現のアップレギュレーションが生じる場合、癌が発症する前だけでなく、癌
に対する感受性もまたは検出され得る。予後法もまた含まれる。
【０１３７】
種々の癌の型のうち、本発明は、前立腺癌（前立腺上皮内腫瘍を含む）および胸部癌（
乳腺癌を含む）に対して、特に研究される。
【０１３８】
これらの技術の全ては、本発明における一般的な意味の「診断」に含まれる。
【０１３９】
（Ｅ．推定ＴＡＲ）
ＨＩＶ Ｔａｔは、転写因子として作用し、そしてそのＲＮＡ標識は、ＴＡＲである。
配列番号１４および４９は、推定のＨＭＬ−２ＴＡＲを含む１５０個のヌクレオチドのＲ
ＮＡの例である。ＨＩＶに関する限りでは、ＴＡＲにおける最小のｔａｔ−結合モチーフ
は、これら２つの分子より短くあり得る。
【０１４０】
本発明は、以下：（ａ）配列番号１４または４９のヌクレオチド配列；（ｂ）（ａ）の
少なくともｘ個のヌクレオチド配列のフラグメント；（ｃ）（ａ）と少なくともｓ％の同
一性を有するヌクレオチド配列；または（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の相補体を含
む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０１４１】
単離されたポリヌクレオチドは、好ましくは、２５０個のヌクレオチドより短い（例え
ば、２４０個のヌクレオチド、２３０個のヌクレオチド、２２０個のヌクレオチド、２１
０個のヌクレオチド、２００個のヌクレオチド、１９０個のヌクレオチド、１８０個のヌ
クレオチド、１７０個のヌクレオチド、１６０個のヌクレオチド、または１５０個のヌク
レオチドより短い）。
【０１４２】
ｘの値は、少なくとも７（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４
、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、
４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００など）である。ｘの値は、２
０００未満（例えば、１０００、５００、１００、または５０未満）であり得る。
【０１４３】
ｓの値は、好ましくは、少なくとも５０（例えば、少なくとも５５、６０、６５、７０
、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、
９９．５、９９．９など）である。
【０１４４】
単離されたポリヌクレオチドは、好ましくはアミノ酸配列（配列番号７、８および／ま
たは９）（推定ｔａｔアナログ）を含むタンパク質に結合し得る。
【０１４５】
（Ｆ．阻害性のＰＣＡＰ機能）
Ｔａｔ／ＴＡＲ相互作用の阻害はＨＩＶ治療のために使用され、そしてＴａｘ機能の阻
害はＨＴＬＶ治療のために使用される。類推によって、ＰＣＡＶにおける同等の機能の阻
害は、癌の処置、および／またはＨＥＲＶ−Ｋウイルスに結合する他の疾患（例えば、精
巣癌（１９４）、多発性硬化症（７４）、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）（７５）
など）を処置するための方法を提供する。
【０１４６】
種々の方法が、Ｔａｔ／ＴＡＲ相互作用を阻害するために提唱されてきた（例えば：
Ｔａｔを隔離するような複数のＴＡＲを含むおとりＲＮＡの使用（７６）
アンチセンスＴａｔ（７７）
優位なネガティブＴａｔ変異体（７８）
Ｔａｔリボザイム（７９）
抗ＴＡＲハンマーヘッドリボザイム（８０）
Ｔａｔ／ＴＡＲ相互作用の低分子インヒビターの使用（８１、８２、８３）
アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）の使用（８４）
ＲＮＡ干渉のための阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用（８５））。
【０１４７】
類似のアプローチが、Ｔａｘ機能を阻害するために使用されている（８６、８７、８８
）が、ＴａｘとＴａｔとの間の有意な差異は、Ｔａｔが核酸に直接結合することである。
これらの方法の全ては、推定のＰＣＡＶ ｔａｔ／ＴＡＲ相互作用またはＴａｘ機能に適
用され得る。
【０１４８】
従って、本発明は、医薬としてのそれらの使用および前立腺癌、精巣癌、多発性硬化症
および／またはインスリン依存性糖尿病を処置するための薬の製造における使用とともに
以下を提供する：
推定のＨＭＬ−２ ＴＡＲの２つ以上のコピーをコードするか、またはこれらを含むポ
リヌクレオチド；
推定のｔａｔ−コード配列と相補的なポリヌクレオチド；
機能的な推定のｔａｔに結合し、そしてトランスドミナント（ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａ
ｎｔ）方法で作用し得るポリペプチド；
ｔａｔ配列および／またはｔａｒ配列を攻撃し得るリボザイム；
推定のＴａｔ／ＴＡＲ相互作用の低分子インヒビター；
推定のｔａｔに特異的に結合する抗体またはオリゴ体（ｏｌｉｇｏｂｏｄｙ）（８９、
９０）；および
推定のＴａｔ／ＴＡＲ相互作用のアプタマーインヒビター；
推定のＴＡＲ配列に対して相補的な低阻害性ＲＮＡ（例えば、ｒｅｆ．９１〜９６）。
【０１４９】
推定のｔａｔ機能のトランスドミナントインヒビターに関して、本発明は、上記のセク
ションＣ３において規定されたようなタンパク質を提供し、これは、以下：（ａ）配列番
号１０、１１、１２および１３からなる群から選択されるアミノ酸配列；（ｂ）（ａ）の
少なくともｘ個のアミノ酸のフラグメント；または（ｃ）（ａ）と少なくともｓ％の同一
性を有するポリペプチド配列を含む。配列番号１０、１１、１２および１３のアミノ酸を
有するタンパク質は全て、最も強く優位にネガティブである配列番号１３（ｃＯＲＦ）を
有する推定のｔａｔの活性を抑制することが見出されてきた。
【０１５０】
（スクリーニング方法および薬剤設計）
本発明はまた、癌に対して活性を有する化合物についてのスクリーニング方法を提供し
、該方法は、以下：試験化合物を推定のＴａｔポリヌクレオチドまたはポリペプチドと、
あるいは推定のＴＡＲポリヌクレオチドとを接触させる工程；および試験化合物とこれら
のポリヌクレオチド／ポリペプチドとの間の結合相互作用を検出する工程を包含する。結
合相互作用は、試験化合物の潜在的な抗癌効果を示す。
【０１５１】
本発明はまた、前立腺癌に対して活性を有する化合物についてスクリーニング方法を手
供し、該方法は、以下：試験化合物を本発明の推定のＴａｔポリペプチドと接触させる工
程；およびポリペプチドの機能をアッセイする工程を包含する。このポリペプチドの機能
の阻害（例えば、本明細書中の実施例において記載されるような、ＰＣＡＶ ＬＴＲによ
って作動されるレポーター遺伝子の発現の消失）は、試験化合物の潜在的な抗癌効果を示
す。
【０１５２】
代表的な試験化合物としては、ペプチド（環状ペプチド（８２）を含む）、ペプトイド
、脂質、金属、ヌクレオチド、ヌクレオシド、低有機分子（９７）、抗生物質、ポリアミ
ン、ならびにこれらの組み合わせおよび誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
低有機分子は、５０ダルトン以上および約２，５００ダルトン未満、そして最も好ましく
は、約３００ダルトンと約８００ダルトンとの間の分子量を有する。天然の産物または混
合されたコンビナトリアル合成の産物を含む抽出物のような基質の複合混合物がまた試験
され、そして標的ＲＮＡに結合する化合物が、引き続く工程において、この混合物から精
製され得る。
【０１５３】
試験化合物は、合成化合物または天然の化合物の巨大ライブラリーに由来され得る（９
８）。例えば、合成化合物ライブラリーは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ、Ｃｏｒｎｗａｌｌ、ＵＫ）またはＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗ
ａｕｋｅｅ、ＷＩ）から市販される。あるいは、天然化合物のライブラリーは、細菌抽出
物、真菌抽出物、植物抽出物および動物抽出物の形態で使用され得る。さらに、試験化合
物は、個々の化合物または混合物のいずれかとして、コンビナトリアル化学を使用して合
成的に産生され得る。
【０１５４】
本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストは、当該分野において公知の
任意に利用可能な方法（例えば、シグナル伝達、抗体結合、レセプター結合、マイトジェ
ンアッセイ、走化性アッセイなど）を使用してスクリーニングされ得る。アッセイ条件は
、理想的には、ネイティブの活性がインビボで示される下での（すなわち、生理的ｐＨ、
温度、およびイオン強度の下での）条件と似ているべきである。適切なアゴニストまたは
アンタゴニストは、被験体において有毒な副作用を引き起こさない濃度で、ネイティブな
活性の強い阻害または増加を示す。ネイティブなポリペプチドへの結合に関して競合する
アゴニストまたはアンタゴニストは、ネイティブな濃度と同等な濃度またはより高い濃度
を必要とし得るが、ポリペプチドに不可逆的に結合し得るインヒビターは、ネイティブな
濃度のオーダーに類似するように濃縮して添加され得る。
【０１５５】
そのようなスクリーニングおよび実験法は、ＨＭＬ−２ポリペプチドのアゴニストまた
はアンタゴニストの同定を導き得る。このようなアゴニストまたはアンタゴニストは、Ｈ
ＭＬ−２の発現および／または機能を調節するか、増強するか、または阻害するために使
用され得る（９９）。
【０１５６】
本発明は、本発明のポリペプチド（例えば、組換え的に産生されたＨＭＬ−２ポリペプ
チド）を使用して、結合するか、そうでなければＨＭＬ−２ポリペプチドの活性を調節す
る（例えば、阻害する）能力について、化合物をスクリーニングし、従って、例えば、Ｈ
ＭＬ−２ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る化合物を同定
する方法に関連する。１つのスクリーニングアッセイにおいて、ＨＭＬ−２ポリペプチド
は、試験化合物の存在または非存在下でＨＭＬ−２の増殖刺激活性に対して感受性のある
細胞とともにインキュベーションされる。ＨＭＬ−２活性の改変または試験化合物の結合
効力が測定される。次いで、細胞増殖が決定される。試験サンプルにおける細胞増殖の減
少は、この試験化合物がＨＭＬ−２ポリペプチドに結合し、それによってＨＭＬ−２ポリ
ペプチドを不活化するか、そうでなければＨＭＬ−２ポリペプチド活性を阻害することを
示す。
【０１５７】
ＨＭＬ−２遺伝子を過剰発現するように形質転換されたトランスジェニック動物（例え
ば、げっ歯類）は、ＨＭＬ−２の過剰発現から生じる腫瘍発生を阻害する能力または一旦
発生したそのような腫瘍を処置する能力について、インビボで化合物をスクリーニングす
るために使用され得る。増大した侵襲性の前立腺腫瘍または悪性の可能性のある前立腺腫
瘍を有するトランスジェニック動物は、ＨＭＬ−２ポリペプチドの効果を阻害する能力に
ついて、化合物（抗体またはペプチドを含む）をスクリーニングするために使用され得る
。そのような動物は、例えば、本明細書中の実施例において記載されるように生成され得
る。
【０１５８】
上で記載されるようなスクリーニング手順は、前立腺癌処置の際の薬理学的な介入スト
ラテジーにおける潜在的な使用のための薬剤を同定するために有用である。さらに、ＨＭ
Ｌ−２に対応するポリヌクレオチド配列（ＬＴＲを含む）は、高められた遺伝子発現のイ
ンヒビターについてアッセイするために使用され得る。
【０１５９】
ＨＥＲＶ−Ｋプロテアーゼの強力なインヒビターは、既知である（１００）。ＨＩＶ−
１プロテアーゼインヒビターによるＨＥＲＶ−Ｋプロテアーゼの阻害もまた報告されてい
る（１０１）。これらの化合物は、前立腺癌治療における使用のために研究され得、そし
てまた薬物設計のための有用なリード化合物であり得る。
【０１６０】
ｃＯＲＦのトランスドミナント（ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａｎｔ）ネガティブ変異体もま
た報告されている（１０２、１０３）。トランスドミナントｃＯＲＦ変異体は、前立腺癌
治療における使用のために研究され得る。
【０１６１】
ＨＭＬ−２ ｍＲＮＡに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ポリペプ
チドの発現を選択的に減少させるか、またはオブレート（ｏｂｌａｔｅ）するために使用
され得る。より詳細には、アンチセンス構築物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドは
、前立腺腫瘍細胞中でのＨＭＬ−２ポリペプチドの産生を阻害するために使用され得る。
アンチセンスｍＲＮＡは、標的癌細胞に本発明のＨＭＬ−２ポリヌクレオチド（ＰＣＡＶ
−ｍＲＮＡ転写の方向に関してアンチセンスの方向で配向される）を有する発現ベクター
でトランスフェクトすることによって産生され得る。適切なベクターとしては、ウイルス
ベクター（レトロウイルスベクターを含む）および非ウイルスベクターが挙げられる。あ
るいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、同じ目的を達成するために直接標的細胞に
導入され得る。オリゴヌクレオチドは、最大レベル特異性を達成し、そして例えば、イニ
シエーターＡＴＧでＰＣＡＶ−ｍＲＮＡに結合するために選択／設計され得る。
【０１６２】
ＨＭＬ−２ポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、ポリペプチドの作用をブロッ
クし、そしてこれによって癌細胞の増殖を制御するために使用され得る。これは、ＨＭＬ
−２ポリペプチドに結合し、そしてその作用をブロックする抗体の注入によって達成され
得る。
【０１６３】
本発明はまた、Ｔａｔおよび／またはＴＡＲに結合する化合物を同定するためのハイス
ループットのスクリーニング方法を提供する。好ましくは、このアッセイのための全ての
生化学的工程は、単一溶液中で、例えば、試験管またはマイクロタイタープレートにおい
て実行され、そして試験化合物は、初めに単一の化合物濃度で分析される。ハイスループ
ットのスクリーニングの目的の為に、実験条件は、スクリーニングされた総化合物の中か
ら「ポジティブ」化合物として同定された試験化合物の比を達成するように調整される。
このアッセイは、好ましくは、例えば、巨大な化合物ライブラリーからの０．１％〜１％
の総試験化合物が、１０μＭ以下（例えば、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭまたはそれよ
り下）のＫ_ｉで所定の標的に結合することが示される場合、標的に対して測定可能な親和
性を有する化合物を同定するために設定される。
【０１６４】
本発明はまた、推定の相互作用をブロックし得る化合物を同定するために、推定のＴａ
ｔおよび／または推定のＴＡＲの構造表示に対して適用され得る構造ベースの薬物設計技
術を提供する。種々の適切な技術（例えば、ｒｅｆ．１０４）が当業者に利用可能である
。
【０１６５】
構造ベースの薬物設計において使用するために分子モデルリング技術を実行するための
ソフトウェアパッケージとしては、ＳＹＢＹＬ（１０５）、ＡＭＢＥＲ（１０６）、ＣＥ
ＲＩＵＳ^２（１０７）、ＩＮＳＩＧＨＴ ＩＩ（１０７）、ＣＡＴＡＬＹＳＴ（１０７）
、ＱＵＡＮＴＡ（１０７）、ＨＹＰＥＲＣＨＥＭ（１０８）、ＣＨＥＭＳＩＴＥ（１０９
）などが挙げられる。このソフトウェアは、ファン・デル・ワールス接触、静電相互作用
、および／または水素結合機会のような特徴を明らかにするために、推定のＴａｔおよび
／または推定のＴＡＲの結合性表面を決定するために使用され得る。
【０１６６】
本発明はまた、推定のＴａｔおよび／またはＴＡＲに結合する化合物を同定するための
インシリコでのスクリーニング方法を提供する。潜在的リガンドの構造表示は、ＳＤ形式
またはＭＤＬ形式のようなコンピューターで読み取り可能な形態で保存される。リガンド
の３Ｄ構造は、好ましくは、ＣＯＲＩＮＡ、ＣＯＮＣＯＲＤＥまたはＩｎｓｉｇｈｔ Ｉ
Ｉのようなプログラムを使用する２Ｄ表示から作成される。一旦インシリコでレセプター
と相互作用するリガンドが同定されれば、これは、提供され得（例えば、合成され得るか
、精製され得るか、または購入され得る）、そしてこの相互作用は、実験的に証明され得
る。本発明は、本発明の方法を使用して同定されるリガンドを提供する。
【０１６７】
構造ベースのインシリコスクリーニングは、ＨＩＶのＴａｔ／ＴＡＲ相互作用のインヒ
ビターを同定するために使用されている（１１０）。
【０１６８】
これらの種々の方法の効力は、本発明の組成物の投与後、本発明のポリヌクレオチドお
よび／またはポリペプチドの発現をモニタリングすることによって試験され得る。ｔａｔ
ベースのＨＩＶ免疫においてこれまで首尾よく使用されている本発明の全てが、使用され
得る。
【０１６９】
（Ｇ．ワクチン）
Ｔａｔタンパク質は、ＨＩＶ治療のためのワクチン抗原として使用されており、そして
Ｔａｘタンパク質は、ＨＴＬＶ治療のためのワクチン抗原として使用されている。ポリペ
プチドワクチン（１１１、１１２、１１３、１１４、１１５）およびＤＮＡワクチン（１
１６、１１７）が提唱されてきた。類推によって、本発明のポリペプチドは、前立腺癌ま
たは乳癌に対して免疫するために使用され得、そしてまたＨＥＲＶ−Ｋウイルスに関連す
る他の疾患（例えば、精巣癌、多発性硬化症、ＩＤＤＭなど）を処置するために使用され
得る。
【０１７０】
それゆえ、本発明は、以下を含む組成物を提供する：（ａ）上のセクションＣ．３にお
いて規定されるようなポリペプチドおよび（ｂ）薬学的に受容可能キャリア。本発明はま
た、以下を含む組成物を提供する：（ａ）上で規定されるようなポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドおよび（ｂ）薬学的に受容可能キャリア。
【０１７１】
さらに組成物は、アジュバントを含み得る。例えば、組成物は、１つ以上の以下のアジ
ュバントを含み得る：（１）水中油型のエマルジョン処方（ムラミルペプチド（以下を参
照のこと）または細菌細胞壁成分のような他の特異的な免疫刺激剤のあるまたはなしで）
（例えば、（ａ）マイクロフルダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を使用してミ
クロン以下の粒子で処方される、５％ Ｓｑｕａｌｅｎｅ、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ８０
、および０．５％ Ｓｐａｎ ８５（必要に応じてＭＴＰ−ＰＥを含む）を含むＭＦ５９
^ＴＭ（１１８：ｒｅｆ．１１９における第１０章）、（ｂ）１０％ Ｓｑｕａｌｅｎｅ、
０．４％ Ｔｗｅｅｎ ８０、５％プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）でブロックされた
ポリマー（Ｌ１２１）を含むＳＡＦ、およびミクロン以下の粒子にマイクロフルダイズさ
れるか、またはより大きな粒子サイズのエマルジョンを生成するためにボルテックスされ
るｔｈｒ−ＭＤＰ、ならびに（ｃ）２％ Ｓｑｕａｌｅｎｅ、０．２％ Ｔｗｅｅｎ ８
０およびモノホスホリリピッドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）から
なる群からの１つ以上の細菌細胞壁成分、ならびに細胞壁骨格（ＣＷＳ）（好ましくは、
ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ））を含むＲｉｂｉ^ＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒ
ｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ））；（２）ＱＳ２１またはＳ
ｔｉｍｕｌｏｎＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ
、ＭＡ）のようなサポニンアジュバントが使用され得るか、あるいはそれから生成された
粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激性複合体））（ＩＳＣＯＭＳは、さらなる界面活性
剤を含まなくてよい）（１２０）；（３）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および
不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（４）インターロイキン（例えば、ＩＬ−１
、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフ
ェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ
）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのようなサイトカイン；（５）モノホスホリルリピドＡ
（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、１２１、１２２）
；（６）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組み
合わせ（例えば、１２３、１２４、１２５）；（７）ＣｐＧモチーフ（すなわち、必要に
応じて５−メチルシトシンがシトシンの代わりに使用される、少なくとも１つのＣＧジヌ
クレオチドを含む）を含むオリゴヌクレオチド；（８）ポリオキシエチレンエーテルまた
はポリオキシエチレンエステル（１２６）；（９）オクトキシノールとの組み合わせたポ
リオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（１２７）またはオクトキシノールのよ
うな少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤との組み合わせたポリオキシエチレ
ンアルキルエーテル界面活性剤あるいはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤
（１２８）；（１０）免疫刺激性のオリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオ
チド）およびサポニン（１２９）；（１１）免疫刺激剤および金属塩の粒子（１３０）；
（１２）サポニンおよび水中油型エマルジョン（１３１）；（１３）サポニン（例えば、
ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）（１３２）；（１４
）アルミニウム塩（好ましくは水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム）（しかし
任意の他の適切な塩がまた、使用され得る（例えば、ヒドロキシリン酸アルミニウム、オ
キシ水酸化アルミニウム、オルトリン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど（ｒｅｆ．
１１９の第８章および第９章））。異なるアルミニウム塩の混合物がまた使用され得る。
この塩は、任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、アモルファスなど）を採り得る；（
１５）キトサン；（１６）コレラ毒素またはＥ．ｃｏｌｉの熱不安定性毒素、あるいはそ
れらの無毒化された変異体（１３３）；（１７）ＰＬＧのようなポリ（ａ−ヒドロキシ）
酸の微粒子；（１８）組成物の効力を高めるために免疫刺激剤として作用する他の物質。
アルミニウム塩および／またはＭＦ５９^ＴＭが好ましい。
【０１７２】
組成物は、好ましくは、無菌であり、そして／または発熱物質を含まない。それは、代
表的には、ｐＨ７周辺に緩衝化される。
【０１７３】
組成物は、好ましくは免疫原性の組成物であり、そしてより好ましくはワクチン組成物
である。組成物は、哺乳動物（例えば、ヒト）において抗体を生成するために使用され得
る。
【０１７４】
本発明のワクチンは、予防薬（すなわち、疾患を防止するため）であり得るか、または
治療薬（すなわち、疾患の症状を減少させるか、または除去するため）であり得る。
【０１７５】
効力は、本発明の組成物の投与後、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプ
チドの発現をモニタリングすることによって試験され得る。ｔａｔベースのＨＩＶ免疫に
おいて以前から使用されている方法の全てが、使用され得る。
【０１７６】
（Ｈ．薬学的組成物）
本発明は、上記で定義されたようなポリヌクレオチド、ポリペプチド、また抗体を含む
薬学的組成物を提供する。本発明はまた、薬としての使用および癌を処置するための薬の
製造におけるそれらの使用を提供する。本発明はまた、免疫応答を生じるための方法を提
供し、この方法は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの免疫原性用量を動物
に投与する工程を包含する。
【０１７７】
本発明によって含まれる薬学的組成物は、活性薬剤として、本明細書中で開示される本
発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、または抗体を薬学的有効量で含む。「有効量」
とは、有益または所望の結果（臨床結果を含む）をもたらすために十分な量である。有効
量は、１回以上の投与で投与され得る。本発明の目的のために、有効量は、癌の症状およ
び／または進行を軽減するか、改善するか、安定にするか、後退させるか、遅らせるか（
ｓｌｏｗ）または遅らせる（ｄｅｌａｙ）ために十分である量である。
【０１７８】
組成物は、癌および原発性癌の転移を処置するために使用され得る。さらに、薬学的組
成物は、癌処置の従来の方法（例えば、腫瘍を放射線療法または従来の化学療法に感作す
るような）とともに使用され得る。用語「処置」「処置している」「処置する」などとは
、本明細書中で概して、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることをい
うために用いられる。この効果は、その疾患および／またはこの疾患に起因し得る副作用
または症状を完全にまたは部分的に予防する点では予防であり得、そして／あるいは疾患
のための部分的または完全な安定化または治療の点では治療であり得る。本明細書中で使
用される場合、「処置」は、哺乳動物（特に、ヒト）における疾患の任意の処置を含み、
そして以下を含む：（ａ）疾患または症状の素因があり得るが、まだそれらを有している
と診断されていない被験体において、疾患または症状が生じるのを防ぐこと；（ｂ）疾患
の症状を阻害すること（すなわち、その発症を阻止すること）；または（ｃ）疾患の症状
を軽減すること（すなわち、疾患または症状の後退を引き起こすこと）。
【０１７９】
薬学的組成物が、差示的に発現したポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物
に特異的に結合する抗体を含む場合、抗体は処置部位への送達のための薬物に結合され得
るか、または前立腺癌細胞のような癌細胞を含む部位の画像化を促進するために検出可能
な標識に結合され得る。抗体を薬物および検出可能な標識に結合する方法は、検出可能な
標識を使用して画像化するための方法のように、当該分野において周知である。
【０１８０】
本明細書中で使用される場合、用語「治療的に有効な量」とは、所望の疾患もしくは状
態を処置するか、改善するか、もしくは予防するような、または検出可能な治療効果もし
くは予防効果を示すような治療剤の量をいう。この効果は、例えば、化学的マーカーまた
は抗原レベルによって検出され得る。治療効果はまた、身体的症状の減少を含む。被験体
のための正確な有効量は、被験体のサイズおよび健康、状態の特性および程度、ならびに
投与のために選択される治療法または治療法の組み合わせに依存する。所定の状態のため
の有効量は、慣用的な実験によって決定され、そして医師の判断にある。本発明の目的の
ために、有効用量は、該して、投与される個体において、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍ
ｇ／ｋｇ、または約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇもしくは約０．０５ｍｇ／ｋ
ｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの本発明の組成物である。
【０１８１】
薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。用語「薬学的に受容可
能なキャリア」とは、抗体またはポリペプチド、遺伝子、および他の治療剤のような治療
剤の投与のためのキャリアをいう。この用語は、それ自体は組成物を受け入れる個体に対
して有害な抗体の産生を誘導せず、そして過度な毒性なしに投与され得る任意の薬学的キ
ャリアをいう。適切なキャリアは、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、
ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子のような、巨大でゆ
っくりと代謝される高分子であり得る。そのようなキャリアは、当業者に周知である。治
療組成物中の薬学的に受容なキャリアは、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノー
ルのような液体を含み得る。湿潤剤または乳化剤のような補助物質、ｐＨ緩衝物質なども
また、そのようなビヒクル中に存在し得る。代表的に、治療組成物は、注射可能物（液体
の溶液または懸濁液のいずれか）として調製される；注射前に液体ビヒクルに溶解または
懸濁するに適切な固形形態もまた、調製され得る。リポソームは、薬学的に受容可能なキ
ャリアの定義内に包含される。例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの
鉱酸塩；および、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩のよ
うな薬学的に受容可能な塩もまた、薬学的組成物中に存在し得る。薬学的に受容可能な賦
形剤の一貫した考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａ
ｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９９５） Ａｌｆｏｎｓｏ Ｇｅｎｎａｒｏ、
Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、およびＷｉｌｋｉｎｓ、または参考文献１３
４で入手可能である。
【０１８２】
一旦処方されたならば、本発明によって企図される組成物は、（１）被験体に直接投与
され得るか（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、低分子アゴニストまたは低分子
アンタゴニストなどとして）；または（２）被験体に由来する細胞にエクスビボで送達さ
れ得る（例えば、エクスビボでの遺伝子治療として）。組成物の直接送達は、一般的に非
経口の注射（例えば、皮下、腹腔内、静脈内もしくは筋内、腫瘍内あるいは組織の間隙空
間に対して）によって達成される。他の投与形態としては、経口投与および肺への投与、
坐剤、ならびに経皮への塗布、針、かつ遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）またはハイポスプ
レーが挙げられる。投薬処理は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールで
あり得る。
【０１８３】
エクスビボで送達し、そして形質転換された細胞を被験体に再移植するための方法は、
当該分野において公知である（例えば、ｒｅｆ．１３５）。エクスビボでの適用において
有用な細胞の例としては、例えば、幹細胞（特に、造血幹細胞）、リンパ球、マクロファ
ージ、樹状細胞、または腫瘍細胞が挙げられる。一般的に、エクスビボでの適用およびイ
ンビトロでの適用の両方についての核酸の送達は、例えば、デキストラン媒介性のトラン
スフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）媒介性のト
ランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中への
ポリヌクレオチドのカプセル化、および核内へのＤＮＡの直接の微量注入によって達成さ
れ得、これらは全て当該分野において周知である。
【０１８４】
ＰＣＡＶポリヌクレオチドの差示的発現は、腫瘍と相関することが見出されてきた。腫
瘍は、提供されたポリヌクレオチド、対応するポリペプチドまたは他の対応する分子（例
えば、アンチセンス、リボザイムなど）をベースにした治療剤の投与による処置を受けや
すくあり得る。他の実施形態において、障害は、例えば、正常細胞と比較して癌細胞中で
発現が増加した遺伝子のコードされた遺伝子産物の機能のインヒビター（アンタゴニスト
）として、または癌細胞中で発現が増加した遺伝子産物についてアゴニスト（例えば、腫
瘍サプレッサーとして作用する遺伝子産物の活性を促進するような）として作用する低分
子薬物の投与による処置手順を受けやすくあり得る。
【０１８５】
本発明の薬学的組成物の投与の用量および方法は、治療組成物の特定の質、患者の状態
、年齢、および体重、疾患の進行、および他の関連因子に基づいて決定される。例えば、
ポリヌクレオチド治療組成物薬剤の投与は、局所投与または全身投与を含み、これは、注
射、経口投与、粒子銃またはカテーテル投与、および局所投与を含む。好ましくは、治療
ポリヌクレオチド組成物は、本発明のポリヌクレオチドに作動可能に連結するプロモータ
ーを含む発現構築物を含む。種々の方法が、治療組成物を直接体内の特定部位に投与する
ために使用され得る。例えば、小さい転移性の病巣が位置付けられ、そして治療組成物が
腫瘍体のいくつかの異なる位置において数回注射される。あるいは、腫瘍に供給する動脈
が同定され、そして組成物を直接腫瘍内へ送達するために、治療組成物がそのような動脈
中に注射される。壊死性中心を有する腫瘍が吸引され、そして組成物が、今や空の腫瘍中
心に直接注射される。アンチセンス組成物は、例えば、組成物の局所適用によって、直接
腫瘍表面に投与される。Ｘ線画像化が、特定の上記の送達方法を補助するために使用され
る。
【０１８６】
アンチセンスポリヌクレオチド、サブゲノムのポリヌクレオチド、または抗体を含む治
療組成物の特定の組織への標的化送達もまた使用され得る。レセプター媒介性ＤＮＡ送達
技術が、例えば、参考文献１３６〜１４１において記載される。ポリヌクレオチドを含む
治療組成物は、遺伝子治療プロトコルにおける局所投与について、約１００ｎｇ〜約２０
０ｍｇのＤＮＡの範囲で投与される。約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、
約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇの濃度範囲のＤＮＡがまた、
遺伝子治療プロトコルの間に使用され得る。作用方法（例えば、コードされた遺伝子産物
のレベルを上昇させるか、または阻害するために）のような要素ならびに形質転換および
発現の効力は、アンチセンスサブゲノムポリヌクレオチドの最終的効力に必要とされる投
薬量に影響を与える考慮すべき問題である。より多い発現が、組織のより広い領域にわた
って所望される場合、連続投与のプロトコルにおいて再投与されたものより多い量のアン
チセンスサブゲノムのポリヌクレオチドもしくは同量のアンチセンスサブゲノムのポリヌ
クレオチド、または例えば腫瘍部位とは異なる隣接の組織部分、もしくは近い組織部分へ
の数回の投与が、ポジティブな治療の結果をもたらすために必要とされ得る。全ての場合
において、臨床試験における慣用的な実験は、最適な治療効果のための特定範囲を決定す
る。
【０１８７】
本発明の治療ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクルを使用して
送達され得る。この遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス起源または非ウイルス起源であり得
る（一般的には、参考文献１４２、１４３、１４４および１４５を参照のこと）。そのよ
うなコード配列の発現は、内在性の哺乳動物プロモーターまたは異種のプロモーターを使
用して誘導され得る。このコード配列の発現は、構成的または調節的のいずれかであり得
る。
【０１８８】
所望のポリヌクレオチドの送達および所望の細胞中での発現のためのウイルスベースの
ベクターは、当該分野において周知である。例示的なウイルスベースのビヒクルとしては
、組換えレトロウイルス（例えば、参考文献１４６〜１５６）、αウイルスベースのベク
ター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−
６７；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２７４）、ロス川ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３；ＡＴＣ
Ｃ ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３；Ａ
ＴＣＣ ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ ＶＲ １２４９；ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２））、ア
デノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、参考文献
１５７〜１６２を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。殺傷されたアデノウイ
ルスに連結したＤＮＡの投与（１６３）もまた、用いられ得る。
【０１８９】
非ウイルス送達ビヒクルおよび方法もまた使用され得、これらとしては、殺傷されたア
デノウイルスに連結しているか、または連結していない単独の、多陽イオン性（ｐｏｌｙ
ｃａｔｉｏｎｉｃ）の縮合ＤＮＡ（例えば、１６３）、リガンド連結ＤＮＡ（１６４）、
真核生物細胞送達ビヒクル細胞（例えば、ｒｅｆ．１６５〜１６９）および核電荷中和ま
たは細胞膜との融合が挙げられるが、これらに限定されない。裸のＤＮＡがまた使用され
得る。例示的な裸のＤＮＡ導入方法が、ｒｅｆ．１７０および１７１において記載される
。遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソームは、ｒｅｆ．１７２〜１７６において
記載される。さらなるアプローチが、ｒｅｆ．１７７および１７８において記載される。
【０１９０】
さらに、使用に適切な非ウイルス送達としては、ｒｅｆ．１７８において記載されるア
プローチのような機械的な送達系が挙げられる。そのうえ、そのようなコード配列および
発現産物は、光重合性ヒドロゲル物質の沈積または電離放射線の使用を介して送達され得
る（例えば、ｒｅｆ．１７９および１８０）。コード配列の送達のために使用され得る遺
伝子送達のための他の従来の方法としては、例えば、携帯型遺伝子移入粒子銃の使用（１
８１）または移入された遺伝子を活性化するための電離放射線の使用（１７９および１８
２）が挙げられる。
【０１９１】
（Ｉ ヒト内因性レトロウイルスのＨＭＬ−２ファミリー）
全真核生物のゲノムは、感染性レトロウイルスに関連する配列の複数のコピーを含む。
これらの内在性レトロウイルスは、実際の感染形態および何千もの欠損レトロウイルス様
エレメント（例えば、ＩＡＰおよびＥｔｎ配列ファミリー）の両方が存在するマウスにお
いて十分研究されてきた。生殖細胞系突然変異または腫瘍形成形質転換を引き起こすこれ
らのエレメントの挿入が証明されてきたので、ＩＡＰおよびＥｔｎファミリーのいくつか
のメンバーは、「活性」なレトロトランスポゾンである。
【０１９２】
内在性レトロウイルスは、ヒトゲノムＤＮＡにおいて、他の脊椎動物のレトロウイルス
とのその相同性によって同定された（１８３、１８４）。ヒトゲノムは、おそらく内在性
のプロウイルスＤＮＡの多数のコピーを含むと考えられているが、その機能についてはほ
とんど未知である。ほとんどのＨＥＲＶファミリーは、相対的に数個のメンバー（１〜５
０個）を有するが、１つのファミリー（ＨＥＲＶ−Ｈ）は、全ての染色体について分配さ
れるハプロイドゲノムあたり約１０００個のコピーからなる。胚細胞株および腫瘍細胞株
における大多数のＨＥＲＶおよびＨＥＲＶの普遍的な転写活性は、それらが、疾患を引き
起こす挿入突然変異として作用し得るか、または中立的の方法または有益な方法で隣接す
る遺伝子の発現に影響を及ぼし得ることを示唆する。
【０１９３】
ヒト内在性レトロウイルスのＫファミリー（ＨＥＲＶ−Ｋ）は、周知である（１８５）
。これは、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）と関連し、そしてヒト、サル（ａｐｅ）、
および旧世界ザルのゲノム中に存在するが、いくつかのヒトＨＥＲＶ−Ｋプロウイルスは
、ヒトに独特である（１８６）。ＨＥＲＶ−Ｋファミリーは、ハプロイドヒトゲノムあた
り３０〜５０個の全長コピーで存在し、そして潜在的にウイルスのタンパク質中へ翻訳さ
れる長型オープンリーディングフレームを保持する（１８７、１８８）。２つの型のプロ
ウイルスゲノムが公知であり、これは、ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子の重複する境界
における２９２個のヌクレオチドのストレッチの存在（２型）または非存在（１型）によ
って異なる。ＨＥＲＶ−Ｋファミリーのいくつかのメンバーは、ｇａｇタンパク質および
レトロウイルス粒子をコードすることが公知であり、これは、生殖細胞腫瘍および誘導細
胞株の両方において検出可能である（１９０）。全長ＨＥＲＶ−ＫのＲＮＡ発現パターン
分析はまた、ＨＩＶのＲｅｖタンパク質と機能的に等価な配列特異的な核ＲＮＡエクスポ
ート因子である中心ＯＲＦ（ｃＯＲＦ）と命名された１０５個のアミノ酸タンパク質をコ
ードする二重スプライシングＲＮＡを同定する（１９１）。ＨＥＲＶ−Ｋ１０は、全長ｇ
ａｇと相同的な７３ｋＤａのタンパク質および機能的なプロテアーゼをコードすることが
示されてきた（１９２）。
【０１９４】
生殖細胞腫瘍に罹患する患者は、腫瘍検出時にＨＥＲＶ−Ｋｇａｇおよびｅｎｖタンパ
ク質に対する高い抗体力価を示す（１９３）。正常な精巣および精巣腫瘍において、ＨＥ
ＲＶ−Ｋ膜貫通エンベロープタンパク質は、生殖細胞および腫瘍細胞の両方において検出
されるが、周辺組織では検出されない。精巣腫瘍の場合、ｅｎｖに特異的なｍＲＮＡの発
現、膜貫通ｅｎｖの存在、ｃＯＲＦと、患者の血漿中のｇａｇタンパク質およびＨＥＲＶ
に特異的なペプチドに対する抗体との間の相関が、報告されてきた。参考文献１９４は、
ＨＥＲＶ−Ｋ１０ｇａｇタンパク質および／またはｅｎｖタンパク質は、セミノーマ細胞
中で合成されること、およびその腫瘍を有する患者は、相対的にｇａｇおよび／またはｅ
ｎｖに対して高い抗体力価を示すことを報告する。
【０１９５】
ＨＥＲＶ−Ｋから粒子の形態で放出されるＧａｇタンパク質は、奇形癌由来細胞株Ｔｅ
ｒａ １の細胞培養上清中で同定された。これらのレトロウイルス様粒子（「ヒト奇形癌
由来ウイルス」またはＨＴＤＶと命名された）は、ＨＥＲＶ−Ｋ１０ゲノムと９０％の配
列相同性を有することが示されてきた（１９０、１９５）。
【０１９６】
ＨＥＲＶ−Ｋファミリーが、ヒト細胞ごとのゲノムにおいて存在する一方で、ｍＲＮＡ
の高レベル発現、タンパク質および粒子は、ヒト奇形癌細胞株においてのみ観察される（
１９６）。他の組織および細胞株において、非常に感度の高い方法を使用してでも、ｍＲ
ＮＡの基底レベルの発現が証明されただけであった（１９７）。レトロウイルスのプロウ
イルスの発現は、一般的に５’長末端反復（ＬＴＲ）のエレメントによって調節される。
ＨＥＲＶ−Ｋ ＬＴＲの活性は、転写因子によってアップレギュレートされることが公知
である。さらに、内因性レトロウイルスの発現の活性化は、腫瘍性作用の引き金となる下
流遺伝子の発現の引き金となり得る。
【０１９７】
ＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ）の配列（第３染色体に位置する）が開示されてきた（１９８）。
【０１９８】
ＨＭＬ−２は、ＨＥＲＶ−Ｋファミリーのサブグループである（１９９）。ＨＭＬ−２
小群のメンバーであるＨＥＲＶ単離体としては、ＨＥＲＶ−Ｋ１０（１８９、１９４）、
参考文献２００の図面４において示された２７個のＨＭＬ−２ウイルス、ＨＥＲＶ−Ｋ（
Ｃ７）（２０１）、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ）（１９８）、およびＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）が挙
げられる。
【０１９９】
ＨＭＬ−２は十分認識されたファミリーであるため、当業者は、任意の特定の内因性レ
トロウイルスがＨＭＬ−２であるか否かを困難なく決定し得る。本発明に従って使用する
ために好ましいＨＭＬ−２ファミリーのメンバーは、そのプロウイルスゲノムが配列番号
４４と少なくとも７５％の配列同一性を有するＬＴＲ（ＨＭＬ−２．ＨＯＭ（７）に由来
するＬＴＲ配列）を有するメンバーである。ＬＴＲの例としては、配列番号４５〜４８が
挙げられる。
【０２００】
（否認（ｄｉｓｃｌａｉｍｅｒ））
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号６９〜７６のアミノ酸配列のうちの
１つを有するポリペプチド、または配列番号６９〜７６を含むポリペプチドを含み得ない
（２０４）。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、本発明は、以下を含み得ない：（ｉ）参考文献１におい
て開示されるヌクレオチド配列を含む核酸；（ｉｉ）参考文献１における配列１〜２２５
内のヌクレオチド配列を含む核酸；（ｉｉｉ）公知の核酸；（ｉｖ）参考文献１において
開示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｖ）参考文献１における配列１〜２２５
内のアミノ酸配列を含むポリオペプチド；（ｖｉ）公知のポリペプチド；（ｖｉｉ）２０
０１年１２月７日の核酸またはポリペプチドとして公知の核酸またはポリペプチド（例え
ば、その配列は、２００１年１２月７日以前のＧｅｎｅＢａｎｋまたはＧｅｎｅＳｅｑの
ような公開のデータベースで利用可能である）；または（ｖｉｉｉ）２００２年６月１０
日のポリペプチドまたは核酸として公知のポリペプチドまたは核酸（例えば、その配列は
、２００２年６月１０日以前のＧｅｎｅＢａｎｋまたはＧｅｎｅＳｅｑのような公開のデ
ータベースで利用可能である）。
【０２０２】
（定義）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「
構成する（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」（例えば、Ｘを「含む」組成物は、独占的にＸから
なり得るか、またはさらなる何か（例えば、Ｘ＋Ｙ）を含み得る）を意味する。
【０２０３】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０２０４】
用語「腫瘍性細胞」、「新形成」、「腫瘍」、「腫瘍細胞」、「癌」および「癌細胞」
（交換可能に使用される）とは、相対的に自立性増殖を示す細胞をいい、そのため、これ
らは、細胞増殖の制御の有意な消失（すなわち、統制解除された細胞分裂）によって特徴
付けられる異常な増殖の表現型を示す。腫瘍性細胞は、悪性または良性であり得、そして
前立腺癌または乳癌に由来する組織を含む。
【０２０５】
単語「実質的に」は、「完全に」を排除しない（例えば、Ｙを「実質的に含まない」組
成物は、完全にＹを含まない状態であり得る。必要な場合、単語「実質的に」は、本発明
の定義から削除され得る。
【０２０６】
（本発明を実行するための様式）
本発明の特定の局面は、以下に続く非限定的な例においてより詳細に記載される。当業
者に本発明の作製方法および使用方法の完全な開示および記載を提供するように、実施例
が示され、そして本発明者らが、その発明であるとみなすものの範囲に限定することが意
図されなければ、以下の実験が実行された全ての実験および実行された実験のみであるこ
とを示すことも意図されない。使用される数（例えば、量、温度など）に関する正確さを
保証するための努力が為されるが、いくつかの実験誤差および偏差が考慮されるべきであ
る。他で示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセ
氏温度であり、そして圧力は大気圧であるか、または大気圧周辺である。
【０２０７】
（ＨＭＬ−２配列の前立腺関連発現）
参考文献１は、前立腺癌とＨＥＲＶ−Ｋ内因性レトロウイルスのＨＭＬ−２サブグルー
プの発現のアップレギュレーションとの関連を記載する。
【０２０８】
（ｍＲＮＡのスプライシングパターン）
前立腺癌細胞株のノーザンブロットは、それらがいくつかのサイズ（全長ウイルスゲノ
ム配列およびサブゲノムのスプライシングされた転写物の両方に対応する）のＰＣＡＶ転
写物の発現することを示す（図１４）。そのような転写物の発現はまた、図１４のレーン
１において示されるように、奇形癌細胞株においても観察される（４）。さらに、ＰＣＡ
Ｖのスプライシングパターンを特徴付けるために、取り込まれたプロウイルス配列の隣接
するＬＴＲ間の任意のスプライス事象を検出し得るＲＴ−ＰＣＲストラテジーを使用した
。統合ＰＣＡＶゲノムの一般的な特徴に対して、このアプローチにおいて使用された順方
向プライマー（配列番号１５）および逆方向プライマー（配列番号１６および１７）のお
よその位置は、図１５中の矢印によって示される。
【０２０９】
逆転写酵素がＲＴ−ＰＣＲ反応物中に含まれる場合のみ（図１６中のレーン１、３、５
、７、および９）、ｅｎｖおよび他のＯＲＦの転写物に対応するＤＮＡフラグメントは、
これらの実験において検出され得、これは、このＤＮＡフラグメントがスプライシングさ
れたＰＣＡＶ ｍＲＮＡに由来されることを示す。これらのスプライシングされたｍＲＮ
Ａは、奇形癌細胞株Ｔｅｒａ１（図１６、レーン１）ならびに前立腺癌細胞株ＤＵ１４５
、ＰＣ３、ＬＮＣａＰ、およびＭＤＡ−ＰＣａ−２ｂ（図１６）において検出された。類
似の結果がまた、前立腺癌患者から得られたいくつかの腫瘍サンプルにおいて観察された
。
【０２１０】
正確なスプライシングパターンを決定するために、細胞株および患者組織から得られた
ＲＴ−ＰＣＲ産物をクローニングし、そして配列決定した。ｅｎｖのスプライシングされ
たｍＲＮＡに加えて、多くの他のスプライス改変体が見られた（図１７および１８におい
てスプライスＡ〜Ｊと命名された；これらのスプライス改変体のコンセンサス配列につい
て、以下を参照のこと）。これらの結果の詳細な分析は、４つのエキソン（エキソン１、
１．５、２および３）およびＨＭＬ−２ゲノム配列の全域で１３個のスプライス連結（図
１７〜２２においてＩ〜ＸＩＩＩと命名された）を同定する。
【０２１１】
図１７において略図で示されるように、エキソン１は、ＬＴＲにおける転写開始部位か
らスプライス部位Ｉの配列を含む。スプライス連結Ｉは、ＨＭＬ−２の全ての統合された
コピーの間で保存され、そしてｇａｇについての開始メチオニンの上流（図１９、ヌクレ
オチド１５０２とヌクレオチド１５０３との間）に位置する。試験された全てのスプライ
シングされたｍＲＮＡは、スプライスＪのｍＲＮＡ（エキソン２とエキソン３との間のイ
ントロンのみを除去するようである）を除いて、正確にこの部位でスプライシングされる
。
【０２１２】
エキソン１．５は非常に小さく、そしてスプライスＤのｍＲＮＡにおいて検出されるの
みであった（図１７）。このエキソンは、ｇａｇコード配列（ヌクレオチド２６２４と２
６６８との間、図２０を参照のこと）に位置し、そして潜在的な開始メチオニンをコード
する。ＰＣＡＶゲノムの統合されたコピーのうちのいくつかのみが、原型Ｙ１７８３２ゲ
ノムの２６２２位〜２６２３位で見出されるＡＧ３’スプライス連結コンセンサス配列を
含む。おそらくこれは、ウイルスを含まない進化の間に、統合ウイルスゲノムとしての霊
長類の進化の間に、いくつかのＰＣＡＶ改変体におけるこのイントロンの獲得または消失
のいずれかを示す。
【０２１３】
エキソン２は非常に異質性であり、これは、エキソンの５’末端に２個の異なる３’ス
プライス連結（スプライス部位ＩＶおよびＶ、図１８および２１を参照のこと）およびエ
キソンの３’末端に７個の５’スプライス連結（スプライス部位ＶＩ〜ＸＩＩ、図１９お
よび２１を参照のこと）を含む。さらに、エキソン２は、実験の分析で検出されなかった
他の潜在的なプライス部位を含む。これらの潜在的な部位のうちの１つ（図２１において
、「潜在的なスプライス部位Ａ」として示される）は、ＨＩＶｔａｔまたはＨＴＬＶｔａ
ｘと等価なものをコードするｍＲＮＡを生成するために使用され得る（以下を参照のこと
）。
【０２１４】
各スプライス改変体におけるエキソン２のサイズは、いずれのスプライス部位がそれぞ
れ個々のスプライス事象において使用されるかに依存する。図１８は、観察されたスプラ
イス改変体（配列番号１８〜４３もまた参照のこと）の全てを要約するが、原則として、
２つ以上のエキソンを有するｍＲＮＡにおける内部エキソンについて非常に巨大であるエ
キソンを潜在的に除いて、任意の他の組み合わせが可能である。複雑性のレベルに加えて
、これらのスプライス部位のうちの４つが、ヒトゲノム中に統合されたことが見出された
２つのＰＣＡＶ配列改変体に特異的である。Ｉ型ウイルス（図２１における配列ＡＢ０４
７２４０、Ｙ１８８９０およびＭ１４１２３）は、ｅｎｖのＮ末端領域における約３００
個のヌクレオチドの欠失、２つの潜在的な開始メチオニンの後ろに続く約３５〜４３個の
ヌクレオチドの欠失を含む（図１８を参照のこと）。この欠失部位に近位のスプライス部
位ＶＩは、Ｉ型ウイルスにおいてのみ見出される（図２１を参照のこと）。それらを含む
配列がＩ型ウイルスにおいて欠失されるので、スプライス部位ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩ
Ｘは、ＩＩ型ウイルスにおいて見出されるのみである（図２１における配列Ｙ１７８３２
、ＡＦ０７４０８６−Ｔ１、ＡＦ０７４０８６−Ｔ２、Ｙ１７８３３、Ｙ１７８３４、Ａ
Ｐ０００３４６およびＡＬ０３５５８７）。従って、エキソン２によってコードされるペ
プチドのサイズは、スプライシングのパターンおよびそのｍＲＮＡが由来するウイルスの
型の両方に依存する。ｅｎｖについての開始メチオニンは、全てのエキソン２の検出され
る形態で存在し、そしてそのオープンリーディングフレームは、特徴付けられた全てのス
プライス部位をとおって開いている。
【０２１５】
エキソン３配列は、第２のＬＴＲの前にある約９０個のヌクレオチド（原型配列Ｙ１７
８３２の８８１７位で、図２２を参照のこと）で始まり、そしてＬＴＲ内に含まれるポリ
アデニル化部位に続く。検出される全てのスプライス形態は、８８１６位と８８１７位と
の間のスプライス部位ＸＩＩＩを使用する（図２２）。第２の潜在的なスプライス部位コ
ンセンサス部位は、８８２４位と８８２５位との間に位置する（図２２、潜在的なスプラ
イス部位Ｂ）が、分析されたｃＤＮＡクローンのいずれにおいても観察されなかった（す
なわち、それは、低頻度で使用され得る）。このスプライス部位はまた、ＰＣＡＶ ｔａ
ｔまたはｔａｘ等価物を生成するために使用され得る（以下を参照のこと）。このエキソ
ンにおいて、３つのリーディングフレーム全てが開放されている。フレーム１がエキソン
２の配列を有するフレームにある場合、フレームＩは、８８７１位（図２２）で終わり、
そして１８個のアミノをこのコードされたポリペプチドに添加する。このリーディングフ
レームは、スプライス部位ＩＸにおけるエキソン２が、ＰＣＡＶｒｅｖポリペプチドをコ
ードするようにスプライス部位ＩＸがスプライス部位ＸＩＩＩでエキソン３に連結される
、前もって特徴付けられたスプライス形態（ｃＯＲＦと呼ばれる）で使用される。エキソ
ン２を有するフレームにある場合、フレーム２は、８９９５位（図９）で終わり、そして
５９個のアミノ酸をコードされたポリペプチドに添加する。このフレームは、以下に記載
されるＰＣＡＶｔａｔ／ｔａｘ等価物をコードする。エキソン３における第３のフレーム
は、ＰＣＡＶ ｅｎｖのＣ末端に対応し、そして図２２における整列内の８９５４位で終
わる。
【０２１６】
このスプライシングのパターンおよびいずれのスプライシング部位が利用されるかに依
存する複数の産物をコードする能力は、一般的にＨＩＶおよびＨＴＬＶのスプライシング
パターンに類似する。これは、ＰＣＡＶがレトロウイルスのレンチウイルス型に属するこ
とを示唆する。全ての可能なスプライス改変体は、配列番号１８〜４３（コンセンサス配
列）として同定され、そして表１において記載される。
【０２１７】
（ｔａｔまたはｔａｘに類似のポリペプチドの同定）
レンチウイルスの明確な特徴は、それらがウイルスＬＴＲプロモーターからの転写を活
性化し得るポリペプチドをコードすることである。ＨＩＶのｔａｔポリペプチドは、これ
らのアクチベーターの最も理解される例である。ｔａｔ遺伝子は、ＨＩＶにおけるｒｅｖ
遺伝子およびｅｎｖ遺伝子と物理的に重複し、そしてｅｎｖ領域にわたるＨＩＶのｍＲＮ
Ａの変更スプライシングを介して作られる。Ｔａｔポリペプチドは、ＴＡＲと呼ばれる特
定部位でＨＩＶのｍＲＮＡの５’末端に結合し、そしてＨＩＶに特定の活性化を提供する
。
【０２１８】
全長ＨＥＲＶ−ＫのｍＲＮＡは、２度スプライスされ得る（１度は、ｇａｇ−ｐｒｔ−
ｐｏｌを除去するためであり、１度は、大部分のｅｎｖ遺伝子を除去するために）（図３
）。二重にスプライシングされるＲＮＡによってコードされるポリペプチドが同定され、
そして「ｃＯＲＦ」と呼ばれる。このポリペプチドは、ＨＩＶｒｅｖと類似の活性を有す
ると考えられるが、ｔａｔポリペプチドは、ＨＥＲＶ−Ｋファミリーのメンバーについて
以前に同定されていない。潜在的なｔａｔホモログをコードするスプライシングＰＣＡＶ
のｍＲＮＡが、これまでに同定されてきた。
【０２１９】
ＰＣＡＶ−ｍＲＮＡにおける複数の変更スプライシング部位が同定されてきた（図４お
よび５）。これらは、ｅｎｖ領域における最後のエキソンが、３つのリーディングフレー
ム全てにおいて使用され得ることを示す。フレーム１および２は、それぞれ、ｅｎｖおよ
びｃＯＲＦをコードするが、第３のフレームは、３つのうちの最長のオープンリーディン
グフレームを含む。いくつかの変更ｍＲＮＡは、第１のコードエキソンとこのリーディン
グフレームを結合させる。
【０２２０】
機能的な発現アッセイは、最後のｅｎｖエキソンにおける第３のリーディングフレーム
が、ＰＣＡＶ−ｍＲＮＡの転写を活性化する能力を有するポリペプチドをコードするか否
かを決定するために設計された。このアッセイの第１成分は、ＧＦＰ発現を駆動させるＰ
ＣＡＶ ＬＴＲ（配列番号４５）を有するアデノウイルスベクターである（図６）。種々
のヒト細胞株にこのウイルスで感染させ、そして蛍光を、蛍光顕微鏡またはＦＡＣＳのい
ずれかによって測定した。ポジティブコントロールとして、ＧＦＰ発現がＥＦαプロモー
ターによって駆動されるベクターを使用した。これは、全ての真核生物細胞において活性
であるべきである。
【０２２１】
このＬＴＲからのＧＦＰ発現は、卵巣癌細胞、乳癌細胞、結腸癌細胞および肝臓癌細胞
においては最小であった。それはまた、２９３細胞（不死化腎臓細胞株）および初代前立
腺上皮細胞においても最小であった。ＧＦＰは、種々の前立腺癌細胞株（ＰＣ３、ＬＮＣ
ａＰ、ＭＤＡ２Ｂ ＰＣＡ、ＤＵ１４５）において容易に検出された。代表的なデータが
、図７において示される。ＧＦＰ発現パターンは、正確に患者サンプルからのゲノム結果
とマッチする。これらのデータは、ＰＣＡＶ−ｍＲＮＡ ＬＴＲから駆動される発現が、
前立腺癌についてのマーカーであることを示す。
【０２２２】
ＬＴＲからのＧＦＰ発現が、初代前立腺細胞においてサイレントであり、そして前立腺
癌において活性であることが明白であったので、ｅｎｖ領域からのポリペプチドを、初代
前立腺細胞における発現を活性化する能力について試験した。図５において示されるコー
ド配列が発現カセット中に挿入され、そしてこれらは、アデノウイルスベクターに組み込
まれた。第１のコードエキソンは、ｅｎｖ産物、ｒｅｖ産物および５個のＰＣＡＰ産物と
共通である。このエキソンは、核局在シグナル（ＮＬＳ）としても機能するＲＮＡ結合ド
メイン、ポリペプチド二量化領域、および高度に疎水性の配列を含む。ｃＯＲＦポリペプ
チドは、末端エキソンにおける非常に短い領域に融合するこれらのドメインの３つ全て含
む（図４）。ＰＣＡＰ１転写物は、正常部位の５７塩基上流にある変更５’スプライス部
位を使用するポリペプチドをコードし、そしてｃＯＲＦからの疎水性ドメインを欠く。Ｐ
ＣＡＰ２は、３つのドメイン全てを破壊するが、最後のエキソンにおいてｅｎｖ ＡＴＧ
が第３のフレームと連結するＩ型ＨＥＲＶ−Ｋ欠失に由来する。ＰＣＡＰ３は、ＰＣＡＰ
２と類似であるが、欠失の代わりに変更スプライシングが産物を作る異なるウイルスに基
づく。ＰＣＡＰ４は、正常なｃＯＲＦ部位の５２塩基上流にある潜在的な５’スプライス
部位が、ｃＯＲＦにおいて使用される３’スプライス部位に連結されるゲノム配列に基づ
き、そしてこれは、最後のエキソンにおいて第３のコードフレームと融合するＲＮＡ結合
ドメインおよび二量化領域を含む。別の実験において、３’スプライス部位は、ｃＯＲＦ
部位の７塩基下流に存在することが見出された。この部位は、ｃＯＲＦ５’スプライス部
位およびこの部位から５７塩基上流にある部位にマッチした。この上流部位を有する産物
は、ＰＣＡＰ４ａと呼ばれ、そしてＰＣＡＰ４と同じ構造を有するが、４個のアミノ酸が
欠けている。変更に対して曲げられたｃＯＲＦ５’スプライス部位は、ＰＣＡＰ５と呼ば
れ、そして第３のコードフレームに対して曲げられた３個のドメインを有する。図５にお
ける標識「ｓａｇ」は、「スプライスＡ」産物に対応する（以下参照のこと）。
【０２２３】
ｃＯＲＦまたは５個のＰＣＡＰ産物をコードするベクター（図８）は、ＧＦＰベクター
により初代前立腺上皮細胞に共感染させられた。代表的なＦＡＣＳデータは、図９におい
て示される。３個のＰＣＡＰ産物（すなわち、ＰＣＡＰ４、ＰＣＡＰ４ａおよびＰＣＡＰ
５）は、発現を活性化し得る一方で、ＰＣＡＰ１、ＰＣＡＰ２およびＰＣＡＰ３ならびに
ｃＯＲＦは全て、発現を活性化しなかった。ＰＣＡＰ４ａは、このアッセイにおいて、最
大活性を示した。
【０２２４】
ＰＣＡＰ４産物および非活性なＰＣＡＰ産物の相互作用が、細胞をＧＦＰベクター、Ｐ
ＣＡＰ４ベクター、および非活性な産物をコードする過剰なベクターで感染することによ
って試験した。ＰＣＡＰ１、ＰＣＡＰ２およびＰＣＡＰ３ならびにｃＯＲＦは全てＰＣＡ
Ｐ４の活性を抑制し得、ｃＯＲＦは、最も強い優位なネガティブ（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎ
ｅｇａｔｉｖｅ）であった。
【０２２５】
これらのデータは、ＰＣＡＶ−ｍＲＮＡが、ＲＮＡ結合ドメイン（ＮＬＳ）、ポリペプ
チド二量化領域および第３のリーディングフレームを含むｔａｔホモログをコードする。
このポリペプチド産物を作るヌクレオチド配列は、１９８６以来公知であったが、変更ス
プライシングを介するその機能的な連結は、以前に報告されていなかった。
【０２２６】
ＨＩＶにおいて、ｔａｔポリペプチドのＲＮＡリガンドは、ＴＡＲである。ＰＣＡＶ−
ｍＲＮＡのＬＴＲにおける潜在性ＴＡＲ部位が、調査されている（図１０）。ＬＴＲにお
ける欠失は、Ｒでの領域が発現に対してとても強い影響を有することを示し（図１１）、
ＰＣＡＶ−ｍＲＮＡの５’末端は規定ＴＡＴＡ配列の３０塩基下流を脱落すると推定して
いる（図１２）。従って、変異体ＬＴＲ５７０および変異体ＬＴＲ６４１（図１０）にお
ける欠失は、ＰＣＡＶ ｍＲＮＡの５’末端に位置し、そしてこれらの効果は、ＴＡＲで
の効果と一致する。さらに、ＰＣＡＶ ｍＲＮＡ（配列番号１４）の最初の１５０ヌクレ
オチドは、ＨＩＶ ＴＡＲのように、高度に安定した二次構造（図１３）を有するＲＮＡ
を形成をし得る。
【０２２７】
しかし、他の研究では、ＰＣＡＶ−ｍＲＮＡの５’末端がさらに下流であることを示唆
する。図２３は、５’末端をマップするために使用されるＲＴ−ＰＣＲスキャニングアッ
セイの結果を示す。５’ＬＴＲのｃＤＮＡを、プロウイルスゲノム（配列番号５３）にお
ける９９７〜９７２を占めるアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、全Ｔｅｒａｌ
ＲＮＡをプライムすることにより調製した。次いで、このｃＤＮＡを分離し、そして、お
そらく５’末端を含むように設計されたプライマーセット由来のセンスプライマーと共に
、９６８〜９５０（配列番号５４）由来のアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ分析で
電気泳動した：１）５７１＜配列番号５５＞、２）６００＜配列番号５６＞、３）６２６
＜配列番号５７＞、４）６６０＜配列番号５８＞、５）７１２＜配列番号５９＞。１μｇ
のゲノムＨｅＬａ ＤＮＡでの二重のＰＣＲ反応をポジティブコントロールとして使用し
、そしてこれらの反応は、全てのプライマー対が有効であったことを示した。ｃＤＮＡで
プライムした反応は、プライマー６００およびプライマー６２６との間で著名な差異を示
し、それは、５’末端がプロウイルスゲノムにおいて、６２６位に密接に位置することを
示唆している。
【０２２８】
この結果を、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイを用いて確認した（図２４）。プロウ
イルスゲノムにおいて、塩基（２４Ｂ）５０９〜７３５および塩基（２４Ｃ）６００〜７
３５を含む標識アンチセンスＲＮＡプローブを、Ｔｅｒａｌ細胞由来の全ＲＮＡとハイブ
リダイズし、標準的な条件下でＲＮａｓｅを用いて消化した。プロセシングおよび尿素含
有ＰＡＧＥによる検出後、両プローブは１００塩基の生成物を与えた。これらの二つの結
果は一致し、そして、ＨＥＲＶ−Ｋ ＲＮＡの５’末端は、プロウイルスゲノムにおいて
約６３５塩基（すなわち、ＴＡＴＡ依存性遺伝子にとって通常３０ｂｐというよりむしろ
、ＴＡＴＡシグナルの約１００ｂｐ下流）であることを示す。
【０２２９】
これらの二つの実験は、初期のデータを作成するために使用された欠失は、プロモータ
ー配列および転写された配列の欠失を生じ得ることを示唆する。
【０２３０】
不一致を解決するために、予測されるＴＡＲ構造（図１３）のステム配列およびループ
配列を、ＬＴＲ６０で欠失した。ＰＣＡＶが転写のｔａｔ／ＴＡＲシステムを使用する場
合、これらの欠失は、翻訳を大きく縮小する。ステムおよびループのそれぞれの欠失（図
２５）を、各ＬＴＲ欠失変異体を動因するＧＦＰを有するＥ１欠失アデノウイルスベクタ
ーを用いて試験した。ＰＣ−３細胞を、５０の感染多重度（ｍｏｉ）で、各ベクターを用
いて感染し、そして、３日後、蛍光をＦＡＣＳにより測定した（図２６）。全長および全
欠失は、類似のＧＦＰ発現を示した。ＰｒＥＣ細胞での同時感染アッセイにおいて、各変
異体ＬＴＲがＰＣＡＰ４によって誘発される能力をまた、試験し（図２６）、そして、再
度、全ＬＴＲを同じ範囲まで誘発した。
【０２３１】
従って、これらのデータは、ステム領域およびループ領域がＨＥＲＶ−Ｋ ＬＴＲ−駆
動発現に関与しないことを示し、このことは、ＰＣＡＶが、レンチウイルス様ｔａｔ／Ｔ
ＡＲ系を用いて制御されないことを示唆している。ウイルス発現に対して感染細胞を活性
化するために、複合レチノウイルスで使用される別のメカニズムは、ｔａｘ型であり、Ｈ
ＴＬＶＩおよびＨＴＬＶＩＩにより使用される。Ｔａｘは、感染Ｔ細胞において多数のレ
ベルで作用する（２０２）。いくつかの転写因子およびコアクチベーターに結合すること
によって、これは、ＨＴＬＶの転写をアップレギュレートし、そしてＣＤＫ４／６インヒ
ビターに結合することによって、細胞周期をデレギュレートする。この組み合わせは、ウ
イルスが活性化される感染細胞の異常な分化を導き、最終的に感染した個体に、成体Ｔ細
胞白血病を導入する手段であると考えられている。ｔａｘ型活性化の特徴の一つは、ＨＩ
Ｖ ＴＡＲに対する高い特異性のｔａｔに対して、多数のプロモーターがｔａｘに反応す
ることである。
【０２３２】
ＰＣＡＰ４は、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ＬＴＲではなく、ＨＥＲＶ−Ｋ ＬＴ
Ｒ（ＬＴＲ６０）を活性化する（図２７）。驚くことに、ＰＣＡＰ４はまた、ＨＩＶ Ｌ
ＴＲからの発現を誘導することが発見された（図２８）。ＨＩＶ ＬＴＲ駆動ＧＦＰ、ア
デノウイルスベクターで感染させたＰｒＥＣ細胞において、ＧＦＰの発現は、ＰＣＡＰ４
を発現するベクターで共感染させることにより、誘導され（１０倍）、そして、ＨＩＶ
ＬＴＲ発現は、ｔａｔベクターで同時感染することにより、とても強く活性化され（１０
０倍）、一方、ｌａｃＺベクターでの同時感染は、効果を有さなかった。さらにＡ５４９
細胞での実験において、伸長因子１Ａプロモーター（ＥＦ１Ａ）はまた、誘導されること
が発見された（図２９Ａ）が、ＣＭＶプロモータ−では発見されなかった（図２９Ｂ）。
【０２３３】
別個の実験において、主なＰｒＥＣ継代（老化をアプローチする）は、古い型のＨＥＲ
Ｖ−Ｋ ＬＴＲ（‘ＭＤＡＬＴＲ’配列番号７７）からＧＦＰを発現するアデノウイルス
ベクター、および約２０のｍｏｉにおいてＰＣＡＰ３またはＰＣＡＰ４を発現する第二ベ
クターとを同時感染した。３日後、蛍光強度をＦＡＣｓにより測定し、ＰＣＡＰ３および
ＰＣＡＰ４による活性を認めた（図４３）。しかしながら、ＬＴＲ６０およびＰＣＡＰ３
を用いた類似の実験においては、活性化が無かった。
【０２３４】
従って、本発明のＰＣＡＰタンパク質は、ｔａｔよりもｔａｘにより類似してると考え
られるが、これらの活性の正確なメカニズムは、本発明の基本的な実施では重要でない。
【０２３５】
（ＰＣＡＰ２）
ＰＣＡＶのｅｎｖ領域内の最終エキソン内において、リーディングフレーム１およびリ
ーディングフレーム２は、それぞれｅｎｖおよびｃＯＲＦをコードする（図４および５）
。配列番号１１、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３１は、ＰＣＡＰ２であり
、それは、同一の５’領域および開始コドンをｅｎｖとして共有するが、１型ウイルスで
発見された欠失は、下流３’スプライス部位に連結する５’スプライス部位を誘導する（
図４）。
【０２３６】
従って、ＰＣＡＰ２をコードする配列の大部分は、スプライス後に位置され、３’ＬＴ
Ｒを含むエキソン内である。＋２リーディングフレームは、ＨＥＲＶ−Ｋでの公知の機能
を有さないが、前立腺癌から調製されたｃＤＮＡは、ＰＣＡＰ２をコードする転写物を含
有した。
【０２３７】
種々の整列されたＨＥＲＶ−Ｋゲノムの検査は、ＰＣＡＰ２が元のタンパク質の変異形
態であることを示唆する。従って、このタンパク質は、元の容量において機能がありそう
もないが、癌遺伝子活性は、機能ドメインの保持力を通じて生じ得た。フラグメントによ
る活性の保持力は、ｔａｔというよりむしろｔａｘに一致する別な特性である。
【０２３８】
（ＰＣＡＰ２細胞成分の局在）
ＰＣＡＰ２の細胞成分の局在を試験するために（その役割をより理解するために）、Ｃ
末端Ｖ５タグ（配列番号６０）を用いてＰＣＡＰ２を発現するアデノウイルスを、始原前
立腺上皮細胞に感染に使用した。このタンパク質は、高度に発現しなかったが、抗Ｖ５を
用いて、より広汎的に、全ての細胞にわたる核小体内を明らかにした（図３０）。この細
胞内に位置する小タンパク質の濃度は、核内にあるものと特に相互作用することを示す。
【０２３９】
これらの結果は、ＰＣＡＰ２におけるＮＬＳモチーフの存在と一致する。
【０２４０】
（ＰＣＡＰ２および前立腺細胞増殖）
ＰＷＰＥ１細胞を、ヒトパピローマウイルス１８（２０３）を用いて正常前立腺内皮細
胞を不朽化することによって、作製した。この細胞は，ヌードマウスにおいては非腫瘍形
成性であり、そして、正常前立腺内皮細胞のマーカーおよび増殖特性を有する。
【０２４１】
ＥＦ１ＡカセットからＰＣＡＰ２を発現するプラスミドを、プロマイシン選択マーカー
を用いてＰＷＰＥ１へコトランスフェクトした。個々の耐性コロニーを拡大し、全ＲＮＡ
を調製し、ＲＴ−ＰＣＲの分析に基づいて陽性クローンを拾った。増殖特性を評価するた
めに、親細胞、ＤＵ１４５前立腺癌細胞、または選択されたクローンを、マトリゲルプラ
ス完全ケラチノサイト無血清培地（完全ＫＳＦＭは、ウシ下垂体抽出物およびＥＧＦ補給
を含む培地である）へプレーティングした。プレーティングされた細胞を、図３１に示す
。
【０２４２】
正常前立腺内皮細胞およびＲＷＰＥ１細胞は、マトリゲルへのプレーティングの際に、
互いに向かって移動し、そして、これらの凝集物は、１週間にわたり、腺を暗示する中空
構造を形成した。対照して、ＤＵ１４５癌細胞は、明白な移動も分化もなく、中実コアコ
ロニーを播種した。試験した細胞株において、ＧＦＰ株の両方は、親ＰＷＰＥ１に似てお
り、このことは、ベクターの導入選択過程およびこの培養条件は、この細胞を変化させな
いことを示す。ＰＣＡＰ１を発現する細胞はまた、ＰＷＰＥ１と類似に機能した。ｃＯＲ
Ｆを発現するクローンは、初めはＲＷＰＥ１のように凝集したが、次いで、この構造は溶
解し、そしてこの細胞はさらなるコロニーの形態をとった。三つの独立したＰＣＡＰ２コ
ロニーは、凝集しなかったが、その代わりに、ＤＵ１４５癌細胞のようなコロニーを播種
した。これらのデータは、ＰＣＡＰ２が、正常前立腺細胞の増殖および分化を妨げること
を示唆する。
【０２４３】
同一の細胞株を用いて、ＲＷＰＥ１の足場独立性（ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｉｎｄｅｐｅ
ｎｄｅｎｔ）増殖に対するＰＣＡＰ２の効果を試験した。ＲＷＰＥ１細胞は、０．３５％
軟寒天で増殖しないが、これらは、より低い寒天濃度（例えば、０．３％）で増殖し、各
型の１，０００細胞を、完全ＫＳＦＭプラス軟寒天（０．３５％）へ播種した。図３２へ
示すように、ＰＣＡＰ２を発現する細胞は、ポジティブコントロールＰＣ−３細胞と同じ
ような範囲で、軟寒天内で増殖した。
【０２４４】
（腫瘍組織および形質転換細胞株におけるＰＣＡＰ２の発現）
ＰＣＡＰ２発現は、正常非形質転換細胞には関連していないが、各種の腫瘍組織および
形質転換細胞株に関連することが発見されている（２０４）。特に、発現は、乳癌細胞株
および乳癌患者組織において認められている。
【０２４５】
参考文献２０４に記載されるように、組織または細胞株から抽出されたＲＮＡは、確立
された細胞株、腫瘍生検、白血病および正常個体由来のリンパ球、ならびに正常非形質転
換細胞のパネルで、ＲＴ−ＰＣＲによって分析されている。図３３は、ＰＣＡＰ２が乳癌
およびセミノーマ生検、および形質転換Ｂ細胞およびＴｅｒａ−１奇形癌細胞において発
現されることを示す。発現は、形質転換細胞株（ｎ＝１５）の＞９０％で認められた。Ｐ
ＣＡＰ２は、サンプルの＞４５％で検出され得たが、腫瘍型に共通して一様には分布され
ていない。これは、乳癌細胞（５２％；ｎ＝２１）において最も頻繁に認められるが、腫
瘍原基細胞（３７％；ｎ＝８）および白血病血リンパ球（３３％；ｎ＝６）ではあまり頻
繁に認められなかった。二つの卵巣癌は、ネガティブと試験された。同時に、健康な組織
（ｎ＝１４；リンパ球、線維芽細胞、腸、胎盤および胃）は、ＰＣＡＰ２を発現していな
かった。野生型ｐ５３を欠失する不死化非形質転換ヒト０４１線維芽細胞およびこれらの
１７５Ｈ形質導入誘導体がポジティブと同様に、正常な複相体ヒト線維芽細胞ＫＨ５１０
９およびｐ５３腫瘍サプレッサの優性ネガティブ変異体１７５Ｈを発現するように設計さ
れた非形質転換誘導体もまた、ポジティブと試験されなかった。従って、ＰＣＡＰ２発現
は、形質転換と密接に相関する。
【０２４６】
図４１におけるＲＴ−ＰＣＲの結果は、さらに、乳房癌のＰＣＡＰ２発現の証拠を与え
る。ＲＮＡを調製し、腫瘍組織および腫瘍周囲の正常組織において、レーザー捕獲顕微鏡
を用いて、七つの乳房癌生検サンプルから増幅した。ｃＤＮＡをｄＴプライマーおよびＰ
ＣＡＰ２で調製するか、または、ｇｕｓＢ配列を３０サイクル（ｇｕｓＢ)もしくは３５
サイクル（ＰＣＡＰ２）のＰＣＲを用いて増幅した。ＰＣＡＰ２は、乳房癌組織（４１Ａ
）で認められるが、正常乳房組織（４１Ｂ）には認められない。
【０２４７】
（ＰＣＡＰ３）
配列番号１２および配列番号３６は、ＰＣＡＰ３であり、これは、ｅｎｖとして同一の
５’領域および開始コドンを共有するが、スプライシングは、ｅｎｖをコードする配列で
除去し、そして以下のｅｎｖのリーディングフレームに対して＋２のリーディングフレー
ムへシフトする。以下：
【０２４８】
【化１】


従って、ＰＣＡＰ３は、ＰＣＡＰ２に類似であるが、ＰＣＡＰ３に対して＋２のリーデ
ィングフレームへのシフトは、ＰＣＡＰ２に対する１型ゲノムで認められた大きな欠失と
いうよりむしろ、２型ゲノムにおける小さな欠失によって引き起こされる。
【０２４９】
例えば、７９％の患者サンプルにおいて２倍以上、そして５３％の患者サンプルにおい
て５倍以上の、前立腺癌ｍＲＮＡが調製される場合、前立腺癌細胞株ＭＤＡ Ｐｃａ−２
ｂから調製されるｃＤＮＡは、ＰＣＡＰ３転写物を含有した。これらの図は、ＰＣＡＰ３
が多数の前立腺癌に含有されるという見解を支持する。さらに、この図は、癌発現とＰＣ
ＡＰ３発現との間で、全体の関連性を示さない。患者がＧｌｅａｓｏｎグレードに従って
グループ化される場合、グレード３の腫瘍は、ＰＣＡＰ３の高いアップレギュレーション
を示すが、さらに発達したグレード４の腫瘍は、ＰＣＡＰ３抑制を示すと思われる（図１
８）。同様なパターンは、ｇａｇ発現で認められ（図４２）、ＰＣＡＶ発現は、早期前立
腺癌に関与することを示唆している。
【０２５０】
ＰＣＡＰ３の細胞成分の局限化は、ＰＣＡＰ２に対して上記に記載されるのと同じ方法
で試験された。このタンパク質は、相対的に安定であり、核質に認められた。この細胞位
置におけるこの小タンパク質の濃度は、核内の標的と特異的な相互作用があることを示す
。
【０２５１】
（ＰＣＡＰ４）
上記に言及されるように、ＰＣＡＰ４は、ＰＣＡＶ ＬＴＲからの発現を活性化し、ま
た、ＨＩＶ ＬＴＲからの発現を活性化する。ＰＣＡＰ４は、正常ｃＯＲＦスプライス部
位の５２塩基上流の５’スプライス部位を含む、スプライシング後に生成する。このスプ
ライシングは、最終エキソンにおいて、３番目のリーディングフレームへのシフトの原因
となる。
【０２５２】
ＰＣＡＰ２およびＰＣＡＰ３に対して上記に記載されるように、ＰＣＡＰ４の染色は、
核小体の位置を示す（図３４）。核の位置を保持することにおいて、ＰＣＡＰ４は、細胞
分裂における役割を示唆する他の活性を示す。一つの実験において、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を
、ＧＦＰ、Ｖ１２活性化変異を有するｒａｓ、ｃＯＲＦ、ＰＣＡＰ１、ＰＣＡＰ２、ＰＣ
ＡＰ４またはＰＣＡＰ４ａ（ＰＣＡＰ４のスプライシング改変体）をコードする発現プラ
スミドを用いて、一過性にトランスフェクトした。次いで、これらの細胞を３週間培養し
、そして、細胞増殖に対する全体的な効果を、細胞をメチレンブルーで染色することによ
り測定した（図３５）。比較目的のためにＧＦＰを用いて、ＰＣＡＰ４および４ａを、活
性化ｒａｓと同じ方法で、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を誘発したが、他の遺伝子では、効果
が無いかもしくは細胞増殖を阻害したかのいずれかであった。
【０２５３】
さらに、この発見を調査するために、外部遺伝子である、ＰＣＡＰ４もｃＯＲＦも発現
しない安定なＮＩＨ３Ｔ３細胞株をｐＣＥＰ４（ハイグロマイシンマーカーを有するプラ
スミド）に遺伝子を挿入することにより、作製した（図３６）。各々の安定な細胞プール
を回収し、計数し、そして二重のウェルで、４日間増殖させた。一つのウェルを染色し、
そして写真を撮り、また、もう一つのウェルをトリプシンで処理し、そして計数した（図
３７）。再び、ＰＣＡＰ４は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を促進し、そしてｃＯＲＦは、わ
ずかに抑制された増殖を有し得る。ＰＣＡＰ３を用いた類似の実験は、拡張しない細胞集
団を与えたが、代わりに、予定外の高い死亡率および高い分裂率が現れた。
【０２５４】
ＰＣＡＰ２のように、ＰＣＡＰ４は、ＤＵ１４５癌細胞のように作用するＲＷＰＥ１細
胞を作製し得た（図３１）。
【０２５５】
（ＰＣＡＰタンパク質および老化）
上記のデータは、ＰＣＡＰ２、ＰＣＡＰ３およびＰＣＡＰ４（これらの全てが、エキソ
ン３の第３番目のリーディングフレームを利用する）が、不死化細胞株（ほとんどの正常
ヒト前立腺内皮細胞に含む）の増殖特性に強い効果を有することを示す。この癌遺伝子の
潜在能は、正常組織ではなく腫瘍組織における発現と結合し、癌との明らかな関連を示唆
する。
【０２５６】
前立腺癌は、管腔内皮層に生じると考えられているが、正常管腔内皮細胞は、とてもわ
ずかの細胞分裂しか受けない。対照的に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＲＷＰＥ１細胞は、不
死である。ＰＣＡＶは、早期癌（上記を参照のこと）に含まれると思われるので、始原前
立腺内皮細胞（ＰｒＥＣ）（通常は急速に老化する）に対するＰＣＡＰポリペプチドの効
果を試験した。
【０２５７】
始原ヒト内皮細胞は、かなり限定された分裂潜在能を有する。特定数の分裂後、この細
胞は、老化に入る。老化は、休止（ポジティブな増殖シグナルが取り消される場合、また
は阻害シグナル、例えば細胞と細胞との接触が受け取られる場合、不死化細胞またはプレ
老化細胞は、休止に入るが、増殖因子を付加することにより、もしくは低濃度で細胞を再
び播種することにより、再度分裂を誘導され得る）とは異なり、そして分裂においての永
久の停止であるが、増殖培地を定期的に新しくする場合、老化細胞は、分裂しないで数ヶ
月間生存し得る。
【０２５８】
特定の遺伝子は、特にウイルス性の癌遺伝子（例えば、ＳＶ４０Ｔ抗原）は、細胞に老
化シグナルを無視させる。Ｔ抗原は、「複製クリーゼ」と称される拡大バリア（ｅｘｐａ
ｎｓｉｏｎ ｂａｒｒｉｅｒ）に対して、分裂を続けるために、細胞を刺激する。二つの
過程は、クリーゼで生じる；細胞は分裂し続けるが、細胞は、平行して、累積された遺伝
子損傷によってとても高い割合で死ぬ。細胞死が分裂を超える場合、実質的に、全ての細
胞は、短期間で死ぬ。クリーゼ後に増殖する珍しい細胞は、不死化細胞株および産出細胞
株になる。代表的に、細胞株は、明らかな遺伝子再配列を有す：これらは、しばしば四倍
体に終結し、たびたび非相互性の染色体転座があり、そして、多くの染色体が多数の位置
で欠失および増幅を有する（２０５、２０６、２０７）。
【０２５９】
前立腺癌は、高いゲノム不安定性（老化後の複製によって、引き起こされ得た）を表す
ので、クリーゼを導く遺伝子産物は、特に興味がもたれる。最近の理論では、前立腺癌は
前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）と称される病変から生じると考える（２０８）。ＰＩＮの遺
伝子分析は、多くの前立腺癌の特有の遺伝子再配列が、この段階で既に生じていることを
示す（２０９）。従って、このウイルスが、早期前立腺癌で役割を果たし得るかどうかを
決定するために、ＰＩＮ細胞をＰＣＡＶの発現について試験した。ＰＣＡＶｇａｇが多く
発現されることを発見し、このことは、前立腺癌と関連する遺伝子変化が生じる場合、Ｐ
ＣＡＶがこの時期に高く発現することを示している。ＰＣＡＰ２ およびＰＣＡＰ３は、
前立腺腫瘍において発現されることが認められているので、老化後にＰｒＥＣにおける細
胞分裂の誘導を受けやすい場合、これらの役割を、検査することによって調査した。
【０２６０】
ＰＣＡＰ発現プラスミドを用いてトランスフェクション後、薬剤耐性ＰｒＥＣを選択す
るための最初の試みは、失敗した。ＧＦＰ、ＰＣＡＰ２またはＰＣＡＰ３を発現するアデ
ノウイルスベクターで感染後、ＰｒＥＣの分析は、感染４日目にＰＣＡＰ細胞において、
多くの細胞死を示した。ニックＤＮＡで核をマークするために、ターミナルデオキシトラ
ンスフェラーゼ末端標識（ＴＵＮＥＬ）における用量依存性の増加は、細胞がアポトーシ
スを受けていることを確証した（図３８）。このアポトーシスは、薬剤耐性ＰｒＥＣを単
離する失敗を明らかにし得、そして、不平衡の増殖シグナルがアポトーシス誘導因子であ
る場合に、ＰＣＡＰ３による細胞分裂のしくみの進入機序と一致する。
【０２６１】
これらの結果は、ＰｒＥＣにおけるＰＣＡＰ発現の効果を評価し得る前に、アポトーシ
スをブロックしなければならないことを示唆した。従って、ＰＣＡＰ２、ＰＣＡＰ３およ
びＰＣＡＰ４をコードするプラスミド＋ネオマイシンマーカーは、アポトーシスをブロッ
クするために、ｂｃｌ-２またはｂｃｌ-Ｘ_Ｌのいずれかをコードする発現プラスミドで同
時感染した。コントロールとして、細胞を、単独でタンパク質を発現するプラスミドでト
ランスフェクトした。選択下で２週後、ｂｃｌ-２ディッシュおよびｂｃｌ-ＸＬディッシ
ュ全てが、ディッシュの分画内に十分に増殖した多数の耐性細胞を有した。これらの細胞
を分割した場合、これらはさらに分裂しなかったが、生存可能であり、そして老化親細胞
に似ていた。対照して、抗アポトーシスタンパク質存在下でＰＣＡＰ２、ＰＣＡＰ３また
はＰＣＡＰ４を発現した細胞は、開始プレートで十分に分裂した小細胞、および分割する
場合に分裂し続ける小細胞を作製するコロニーを産出した。
【０２６２】
上記の薬剤選択に平行して、細胞の増殖潜在能を評価した。親ＰｒＥＣは、老化に達す
る前に倍増する七つの集団を検討した。対照して、抗アポトーシス遺伝子とＰＣＡＰとで
同時感染させた薬剤耐性細胞は、増殖が終わる前に、老化ポイントに及び十分に拡大した
。
【０２６３】
【化２】


ＰＣＡＰ４でトランスフェクトした細胞は、約２週間の間、早く増殖した。次いで、細
胞の拡大は遅くなり、そして最終的には終了した。同時に、浮遊細胞の数および死細胞の
数は増殖し、そして、細胞の出現は変化した。これらは、もはや内皮細胞の規則的な「玉
石」の出現ではないが、代りにいくつかの形態を有し、そして多くの多核性細胞が存在し
た。２週後、細胞は死んだが、ｌａｃＺまたはｌａｃＺ＋ｂｃｌ−２でトランスフェクト
した細胞は、１ヵ月後もまだ生存していた。
【０２６４】
ＰＣＡＰ２細胞およびＰＣＡＰ３細胞は、同様に作用した。図３９は、培養は、補充前
立腺内皮増殖培地（ＰｒＥＭ）を、一週間に２回取り換えて、維持したことを示す（トラ
ンスフェクトされた細胞はＧ４１８を含む）。図３９Ｂは、コントロール細胞と比較して
拡大が終了している段階においての、ＰＣＡＰ２＋ｂｃｌ−Ｘ_Ｌ細胞を示す。老化ＰｒＥ
Ｃ（図３９Ａ）細胞およびｌａｃＺをトランスフェクトした細胞（図３９Ｃ）は、規則的
な出現であり、そして各細胞内に単一の核を中心に有するが、ＰＣＡＰ２細胞は、不規則
の形をとり、そして多くは多数の核を有する。
【０２６５】
老化細胞またはクリーゼをアプローチする細胞のいずれも、集団で拡大しない。しかし
、これらの間での一つの差異は、クリーゼをアプローチする細胞は、かなりの割合で分裂
および染色しているため、細胞分裂は、二つの段階の間で区別し得る。ブロモデオキシウ
リジンで標識後、１０％のＰｒＥＣがＰＣＡＰ２またはＰＣＡＰ３（＋抗アポトーシスタ
ンパク質）のいずれかでトランスフェクトされた場合、３０％のプレ老化ＰｒＥＣを標識
したが、老化のｌａｃＺまたはｃＯＲＦ＋ｂｃｌ−２コントロールを標識したものは一つ
もない（図４０）。
【０２６６】
これらの結果は、ＰＣＡＰタンパク質が、前立腺内皮細胞において増殖を誘発し得、そ
して、この増殖が前立腺癌の根本の原因であり得たことを示す。老化以上に細胞を駆動す
る能力は、ｔａｔよりむしろｔａｘに適合する別の特性である。
【０２６７】
（他のＨＥＲＶ−Ｋウイルス由来のＰＣＡＰ産物）
ヒトゲノムにおいて発見された各種のＨＥＲＶ−Ｋに対して、エキソン３の第３番目の
リーディングフレームによってコードされるアミノ酸配列は、配列番号７８〜配列番号２
７７として与えられる。他のヌクレオチド配列（ヒトゲノムにおいて天然に発見されたか
、または人工的に設計されたかのいずれか）は、コドン縮重に起因して同一のアミノ酸配
列をコードし得るが、これらの２００アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配
列番号２７８〜配列番号４７７として与えられる。アミノ酸配列を、以下に整列させる。
：
【０２６８】
【化３】

【０２６９】
【化４】

【０２７０】
【化５】

【０２７１】
【化６】

【０２７２】
【化７】

【０２７３】
【化８】

【０２７４】
【化９】


それぞれの個々の公開または特許出願は、具体的および個別に参考として援用されるか
のように、本明細書中にて言及された全ての公開物および特許出願物は、本明細書中で同
じ範囲で参考として援用される。
【０２７５】
本発明の好ましい実施形態の前述の説明は、例示ならびに明白な目的および理解に対す
る実施例によって表されている。これは、明確に開示された形態に対して、徹底的である
こと、または本発明を限定することを意図しない。これは、本発明（多くの変化および改
変が、本発明の意図から離れることなく、作製され得る）の技術の見地において、当業者
にとって容易に明らかである。本発明の範囲は、追加の特許請求の範囲およびこれらの同
義語によって、定義されることを意図する。
【０２７６】
【表１−１】

【０２７７】
【表１−２】

【０２７８】
【表２−１】

【０２７９】
【表２−２】

【０２８０】
【数１】

【０２８１】
【数２】

【０２８２】
【数３】

【０２８３】
【数４】

【０２８４】
【数５】


（配列表）
【表１０１】


【表１０２】


【表１０３】


【表１０４】


【表１０５】


【表１０６】


【表１０７】


【表１０８】


【表１０９】


【表１１０】


【表１１１】


【表１１２】


【表１１３】


【表１１４】


【表１１５】


【表１１６】


【表１１７】


【表１１８】


【表１１９】


【表１２０】


【表１２１】


【表１２２】


【表１２３】


【表１２４】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。

【図３】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１２】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１−１】

【図２１−３】

【図２２】

【図２４】

【図２８】

【図２９】

【図３６】

【図１】

【図２】

【図４】

【図５】

【図１０】

【図１１】

【図１３】

【図１４】

【図２１−２】

【図２３】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３】

【公開番号】特開２００９−１００７６８（Ｐ２００９−１００７６８Ａ）
【公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２３１５５（Ｐ２００９−２３１５５）
【出願日】平成２１年２月３日（２００９．２．３）
【分割の表示】特願２００３−５５１２８０（Ｐ２００３−５５１２８０）の分割
【原出願日】平成１４年１２月９日（２００２．１２．９）
【出願人】（５９１０７６８１１）ノバルティス　バクシンズ　アンド　ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド (265)
【Ｆターム（参考）】