蛍光観察装置
【課題】複数の蛍光タグを用いて観察する場合でも最適な蛍光観察装置を提供する。
【解決手段】光源と、該光源からの光線を選択的に反射する光線分離手段と、試料を照明または観察する対物レンズと、試料を固定するステージと、該光線分離手段を通過した光線のうち所望の波長領域を選択する波長選択手段と、該波長選択手段を通過する光を検出する検出器を備えた蛍光観察装置は、２つ以上の波長で試料の照明を行ったときに得られる散乱または蛍光による２つ以上の波長を検出し、該照明における励起波長のうちで最も長波長側のものをλ１、最も短波長側のものをλ２とし、Δ１、Δ２をλ１、λ２の軸上の集光位置としたときに、以下の条件式を満たす。
λ１−λ２≧180nm
｜Δ１−Δ２｜＜0.2μｍ
【解決手段】光源と、該光源からの光線を選択的に反射する光線分離手段と、試料を照明または観察する対物レンズと、試料を固定するステージと、該光線分離手段を通過した光線のうち所望の波長領域を選択する波長選択手段と、該波長選択手段を通過する光を検出する検出器を備えた蛍光観察装置は、２つ以上の波長で試料の照明を行ったときに得られる散乱または蛍光による２つ以上の波長を検出し、該照明における励起波長のうちで最も長波長側のものをλ１、最も短波長側のものをλ２とし、Δ１、Δ２をλ１、λ２の軸上の集光位置としたときに、以下の条件式を満たす。
λ１−λ２≧180nm
｜Δ１−Δ２｜＜0.2μｍ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光観察装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、生物試料の内部の分子挙動の観察に蛍光タグをつけた蛍光観察装置が多く用いられている。蛍光タグは蛍光物質を特定の生物学的な分子に結びつけることによって、生物内の分子の挙動や結合状態や運動状態などを観察することが可能となる。ここで蛍光タグとして使われるものとして、蛍光色素や蛍光たんぱく質や量子ドットなどが知られている。
【０００３】
また、近年の特徴として、蛍光タグの多色化が挙げられる。蛍光タグを多色化すると複数種類の分子を区別して観察することができ、生体内の分子たちの相互作用などの複雑な現象を捉えることもできる。
【０００４】
そしてこの蛍光タグの多色化によって、蛍光観察では従来よりも広い波長の範囲が利用されるようになった。
また、例えばＫａｅｄｅやＰＡ−ＧＦＰなどのフォトアクチベーション蛍光タンパク質では４４０ｎｍや４０５ｎｍの波長が用いられる。この様な短波長光は従来ではあまり利用されてこなかった光である。その結果、従来よりも広い波長域で収差補正がされた対物レンズに対する要求が高まっている。
【０００５】
一方で近年では、生物試料の観察対象も例えば細胞内の構造から分子レベルの挙動を観察することが多くなり、顕微鏡における試料平面内および光軸方向の分解能の要求レベルも高くなっている。また、共焦点顕微鏡の普及により、高分解能で観測することが可能になっている。つまり、高分解能を達成するための高開口数の対物レンズに対する要求も高い。
【０００６】
以下に示す特許文献１と特許文献２では蛍光観察に適した高開口数の顕微鏡対物レンズが提案されている。しかしながら、これらの顕微鏡対物レンズでは上記のような背景による要求を十分には満たしてはいないといえる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平７−３５９８３号公報
【特許文献２】特開２００３−２１７８６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来のアポクロマート顕微鏡対物レンズは、ｇ線（４３５．８３ｎｍ）〜Ｃ線（６５６．２７ｎｍ）の波長域で収差補正を行うのが一般的であった。よって、近年では重要になっている４０５ｎｍでの収差補正が十分でない場合があった。
【０００９】
また、従来のアポクロマート対物レンズは目視による観察を想定したものが多く、最近のレーザ走査型顕微鏡の解像度に対応しきれていない場合があった。
また、対物レンズの軸上色収差に起因して、対物レンズに入射する照明光の大きさによって集光位置が異なる場合があった。例えば、対物レンズの瞳を完全に満たす照明光束の場合と、対物レンズの瞳を完全には満たさない照明光束の場合では、照明光束の集光する位置が異なる。この現象は従来の対物レンズでは、ＮＡに対する球面収差量の特性が波長ごとに異なることによって起きていた。
【００１０】
これにより、複数の波長の蛍光タグを同時に使用した場合、本来同じ場所にある複数の蛍光タグが、対物レンズの軸上色収差や倍率色収差に起因して、異なる場所にあるという間違った結果が観測される場合があった。或いは、本来異なる場所にある複数の蛍光タグが、対物レンズの軸上色収差や倍率色収差に起因して、同じ場所にあるという間違った結果が観測される場合があった。
【００１１】
本発明の目的は、複数の蛍光タグを用いて観察する場合でも最適な蛍光観察装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、光源と、該光源からの光線を選択的に反射する光線分離手段と、試料を照明または観察する対物レンズと、試料を固定するステージと、該光線分離手段を通過した光線のうち所望の波長領域を選択する波長選択手段と、該波長選択手段を通過する光を検出する検出器を備えた蛍光観察装置において、２つ以上の波長で試料の照明を行ったときに得られる散乱または蛍光による２つ以上の波長を検出し、該照明における励起波長のうちで最も長波長側のものをλ１、最も短波長側のものをλ２とし、Δ１とΔ２をλ１とλ２の軸上の集光位置としたときに、以下の条件を満たすことを特徴とする蛍光観察装置によっても特徴付けられる。
（１１） λ１−λ２≧180nm
（１２） ｜Δ１−Δ２｜＜0.2μｍ
（１１）と（１２）式を満たすことができれば、試料内を複数の蛍光タグで染色しても色収差は無視できるレベルとなる。
【００１３】
さらに、以下の条件を満たすことが望ましい。
（１３） λ２≦442nm
近年蛍光タグには短波長側の刺激光を与えると特性が変化するフォトアクチベーション蛍光タグが用いられるようになっている。たとえばカエデやＰＡ−ＧＦＰなどのフォトコンバージョン蛍光たんぱく質では４０５ｎｍの波長を用いることが一般的である。また、４４２ｎｍはＣＦＰ−ＹＦＰの蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の観察などで用いられるため、（１３）式を満たすとフォトアクチベーションや蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の観察に対応することが可能となる。
【００１４】
さらに、以下の条件を満たすことが望ましい。
（１４） ｜δ１−δ２｜≦0.3μｍ
ここでδ１とδ２はそれぞれλ１とλ２の視野数９での倍率の色収差を示す。
【００１５】
このとき、前記対物レンズは、物体側より順に正のレンズ群Ｇａと正のレンズ群Ｇｂとレンズ群Ｇｃとレンズ群Ｇｄとレンズ群Ｇｅとから構成され、前記正のレンズ群Ｇａは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズを接合した接合レンズと正の単レンズとを含み、前記正のレンズ群Ｇｂは、接合レンズからなり、前記レンズ群Ｇｃは、少なくとも１つ以上の接合レンズを含み、前記レンズ群Ｇｄは、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状のものであり、前記レンズ群Ｇｅは、物体側に強い凹面を向けた負レンズを含み、前記レンズ群Ｇｂは正レンズと負レンズと正レンズとの３枚接合であることが考えられる。この構成の対物レンズを蛍光観察装置に利用することが、課題解決の一手段である。
【００１６】
さらに、前記対物レンズが以下の条件を満たすことが望ましい。
（１） ０．５ ≦ Ｈ２／Ｈ１ ≦ ０．７５
（２） ７．８ ≦ ｆ（Ｇｂ）／ｆ ≦ ２０
さらに、前記対物レンズが単独で色収差を行っていることが望ましい。単独で色収差を補正した場合、組み合わせるユニット（結像光学系や照明光学系）を選択する自由度が増える。
【００１７】
本発明による蛍光観察装置において、該励起波長λ１とλ２で該試料の照明を行ったときの該検出器での検出結果より形成されるそれぞれ２つの画像を保存する画像保存手段と、該画像の重ね合せまたは差分または比率計算を行う画像解析手段とを備え、２つの画像の重ね合わせまたは差分または比率計算を行うことは好適である。
【００１８】
また、該励起波長λ１とλ２とで励起した画像を保存する画像保存手段と、該画像の重ね合せまたは差分または比率計算を行う画像解析手段を備え、複数の画像の重ね合わせまたは差分または比率計算により蛍光タグで染色した試料内分子の解析が容易になる。近年ＦＲＥＴのように複数の蛍光波長のレシオをとって分子解析することが多くなっている。この場合は本発明のような色収差が補正された蛍光観察装置が適している。
【００１９】
また、本発明の実施では、該ステージまたは該対物レンズが光軸方向に移動可能であり、
該試料と該対物レンズの間隔を複数変えて該試料の照明を行ったときの該検出器での検出結果より形成される画像を取得し、該取得された画像のうち該励起波長λ１、λ２で該試料の照明を行ったときの画像を各断面位置での画像保存位置に保存し、該試料と対物レンズの間隔が同じ位置で取得されたλ１、λ２の画像の演算を行うことが好適である。
【００２０】
色収差の補正された本システムでは試料の３次元像の構築に有効である。軸上色収差がある場合、λ１、λ２での光軸方向の像位置が光軸方向にずれてしまう。このためλ１、λ２の画像を重ね合わせる場合、従来では対物レンズの軸上色収差分の異なった断面位置の像の重ね合わせを必要としていた。本システムでは軸上色収差が無視できるほど小さいため、正確な３次元像構築が可能である。
【００２１】
本発明による蛍光観察装置において、試料面にビームスポットを走査する走査手段をもち、共焦点式の検出手段を持つことは好ましい。
本発明は軸上色収差を補正しているため、前述の通り、試料の３次元像を観察することに適している。このため、３次元的な検出が可能となる共焦点式の検出手段をもっていることが望ましい。
【００２２】
また、本発明の実施による蛍光観察装置において、該複数のレーザ光源を備え、該複数波長のレーザを同一光路上に合成し、１本のファイバで蛍光観察装置に導入することが望ましい。
【００２３】
通常レーザ光を顕微鏡に導入する場合は、システムレイアウトの自由度の高い光ファイバを用いることが多い。従来は、大きく異なる波長のレーザを顕微鏡に導入する場合に複数の光ファイバを用いることが多かった。波長が大きく異なることによる色収差はファイバの後段に配置されたコリメータの調整により補正可能であったが、各ファイバの調整が複雑であることが問題であった。近年に対応波長域の広い光ファイバが開発されてきた。この光ファイバを用いれば、本システムのような軸上色収差が十分補正されているシステムにきわめて有効である。
【００２４】
本発明の実施による蛍光観察装置において、複数の蛍光タグにより標識された試料において、λ１とλ２の励起波長により取得された画像を重ね合わせ出力するとこにより２つ以上の標識された試料内分子の位置情報を解析することは好適である。
【００２５】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）やフォトコンバージョンを使った観察の場合、２つの蛍光波長の重ね合わせ、またはその比率を求める必要がある。この場合、色収差があると画像の重ね合わせにずれが生じて、正確なデータが得られない可能性がある。本システムは異なる波長を重ね合わせた場合でも波長による位置ずれが少ないため、試料内の分子の正確な位置情報を得るのに優れている。
【００２６】
本発明の実施による蛍光観察装置において、λ１とλ２の励起波長により該試料の照明を行ったときの該検出器での検出結果より形成される画像を時間の経過に応じて複数取得し、該同一時刻に取得された時間経過のλ１とλ２における画像の比率を複数とることにより試料内の分子間の蛍光共鳴エネルギー移動を観察することは好適である。
【００２７】
従来の共焦点顕微鏡では試料の３次元像を得るときに問題となる対物レンズの色収差を、複数の蛍光像を重ね合わせするときに、光軸方向に異なる断面の画像を重ねて表示する場合があった。このようにすれば、静止した試料での３次元像を得るときには問題ないが、細胞内の分子移動を見る場合は光軸方向に異なる断面を見る必要があり、波長により時間差が生じる。このため、この従来の方法ではたとえば細胞内の速い分子運動を見ることはできない。しかし、本発明のような色収差が補正された蛍光観察装置では速い分子運度も観察することが可能となる。
【００２８】
さらに、２種類以上の蛍光タグを有するサンプルの画像を取得し、得られた画像の輝度情報をピクセル毎に２次元化し、プロットすることにより各分子の局在を推定する分子局在判定をすることも好ましい。
【００２９】
２種類以上の蛍光タグを有するサンプルの画像を取得し、得られた画像の輝度情報をピクセル毎に２次元化し、プロットすることにより各分子の局在を推定する方法はコローカリゼーションと呼ばれ、２つの分子が結合しているかどうかの判定に用いる。このような観察においても本発明の色収差が補正された本発明は優れている。
【００３０】
本発明の実施による蛍光観察装置において、ある波長による励起を行ったときの該検出器での検出結果より形成される試料画像をモニタ上に出力し、モニタ上に出力された試料像の一部の領域を指定し、指定部分のみ光を照射して蛍光退色を行い、指定領域内または指定領域外の蛍光像の時間変化を記録して試料内の分子拡散を検出することは好適である。
【００３１】
試料画像をある波長により取得し、モニタ上に出力し、モニタ上に出力された試料像の一部の領域を指定し、指定部分のみ光を照射して蛍光退色を行い、指定領域内または指定領域外の蛍光像の時間変化を記録して試料内の分子拡散を求める方法はＦＲＡＰと呼ばれる手法である。この手法においても本発明のような色収差が補正された蛍光観察装置は適している。
【００３２】
本発明の実施による蛍光観察装置において、試料画像をある波長による励起を行ったときの該検出器での検出結果より形成される試料画像をモニタ上に出力し、モニタ上に出力された試料像の一部の領域を指定し、指定部分のみ光を照射して試料内蛍光色素のアクチベーションを行い、指定領域内または指定領域外の蛍光像の時間変化を記録して試料内の分子分析を行うことは好適である。
【００３３】
前述の通り、カエデやＰＡ−ＧＦＰのように４０５ｎｍの波長の光を用いてフォトコンバージョンする蛍光たんぱく質を用いる場合でも本発明のような蛍光観察装置は色収差が少ないため優れている。
【００３４】
本発明の実施による蛍光観察装置において、試料内に複数の蛍光タグをつけた分子が存在し、複数の励起光を同時に照射し、得られる蛍光を分離してλ１、λ２に相当する蛍光波長を検出し、検出された蛍光の時間変化を記録し、蛍光相互相関分光法によって試料内分子の拡散速度を求めることは好適である。
【００３５】
蛍光の時間変化を記録し相関関数を計算する手法として代表的なものにＦＣＳとＦＣＣＳ呼ばれるものがある。この手法で複数の励起波長を用いて複数の蛍光波長を検出すると分子が結合しているかが分かる。この場合、試料への集光スポットが励起波長でずれがないことが必要のため、本発明の蛍光観察装置が適している。
【００３６】
なお、蛍光観察装置の対物レンズは、物体側より順に正のレンズ群Ｇａと正のレンズ群Ｇｂとレンズ群Ｇｃとレンズ群Ｇｄとレンズ群Ｇｅとから構成され、前記正のレンズ群Ｇａは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズを接合した接合レンズと正の単レンズとを含み、前記正のレンズ群Ｇｂは、接合レンズからなり、前記レンズ群Ｇｃは、少なくとも１つ以上の接合レンズを含み、前記レンズ群Ｇｄは、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状のものであり、前記レンズ群Ｇｅは、物体側に強い凹面を向けた負レンズを含み、Ｈ１をレンズ群Ｇｂから射出するマージナル光線の光線高、Ｈ２をレンズ群Ｇｄに入射するマージナル光線の光線高、ｆを対物レンズ全系の焦点距離、ｆ（Ｇｂ）をレンズ群Ｇｂの焦点距離、前記レンズ群Ｇｅは、物体側に強い凹面を向けた負レンズＬｅｎと、正レンズＬｅｐとを含み、νｄ（Ｌｅｎ）を負レンズＬｅｎのガラスのアッベ数、νｄ（Ｌｅｐ）を正レンズＬｅｐのガラスのアッベ数、Ｈ３を前記レンズ群Ｇｅから射出するマージナル光線の光線高としたときに、次の条件式（１），（２），（３）’，（６）を満足する液浸系顕微鏡対物レンズによって解決される。
（１） ０．５ ≦ Ｈ２／Ｈ１ ≦ ０．７５
（２） ７．８ ≦ ｜ ｆ（Ｇｂ）／ｆ ｜ ≦ ２０
（３）’ ４５ ≧ νｄ（Ｌｅｎ）−νｄ（Ｌｅｐ） ≧ ３０
（６） ０．５ ≦ Ｈ３／Ｈ１ ≦ ０．６５
条件式（１）は軸上色収差を良好に補正するための条件である。条件式（１）により、レンズ群Ｇｂからレンズ群Ｇｄへの光線高を規定し軸上色収差を補正しやすくしている。条件式（１）の下限を下回ると、レンズ群Ｇｂからレンズ群Ｇｄへの光線高が低くなりすぎて、像面湾曲やコマ収差を補正することが困難となる。条件式（１）の上限を超えると、レンズ群Ｇｂからレンズ群Ｇｄへの光線高が高くなりすぎて、軸上色収差を良好に補正することが困難となる。ここではマージナル光線は、対物レンズのＮＡにより決まる軸上従属光線の最も光線高の高いものとする。
【００３７】
条件式（２）は球面収差等の諸収差を良好に補正するための条件である。条件式（２）により、レンズ群Ｇｂのパワーを規定している。条件式（２）の下限を下回ると、レンズ群Ｇｂのパワーが強くなりすぎて、ここでの球面収差の発生量が大きくなりすぎる。条件式（２）の上限を超えると、レンズ群Ｇｂのパワーが弱くなりすぎて、条件式（１）を満たすことが困難となり、軸上色収差を良好に補正できなくなる。なお、次の条件式
（１）’ ０．５５ ≦ Ｈ２／Ｈ１ ≦ ０．７３
（２）’ ８ ≦ ｜ ｆ（Ｇｂ）／ｆ ｜ ≦ ２０
を満たすことがより好ましい。
【００３８】
条件式（３）’は、レンズ群Ｇｅの負レンズと正レンズのアッベ数の差を大きくし、倍率の色収差を補正するための条件である。条件式の下限値を下回ると、倍率の色収差が補正不足となる。対物レンズ単独で軸上色収差および倍率色収差を補正するコンペンゼーションフリー対物レンズは、組み合わせるユニット（結像光学系や照明光学系）を選択する自由度が増える。
条件式（６）は諸収差を良好に補正するための条件である。条件式（６）の下限値を下回ると、レンズ群Ｇａおよびレンズ群Ｇｂのパワーが弱くなりすぎ、レンズ群Ｇｃ以降の後群に強いパワーが必要となり、後群での諸収差の発生量が大きくなる。条件式の上限値を上回ると、レンズ群Ｇａおよびレンズ群Ｇｂのパワーが強くなりすぎ、レンズ群Ｇａおよびレンズ群Ｇｂでの諸収差の発生量が大きくなる。
【００３９】
前記正レンズＬｅｐの光学ガラスは、Ｎｂ２Ｏ５成分、或いは、Ｔａ２Ｏ５成分を含む光学ガラスであり、前記正レンズＬｅｐのｄ線の屈折率をｎｄ（Ｌｅｐ）としたとき、次の条件式
（４） １．６５ ≦ ｎｄ（Ｌｅｐ） ≦ １．８
（５） ２５ ≦ νｄ（Ｌｅｐ） ≦ ４１
を満足することが望ましい。
【００４０】
コマ収差や倍率の色収差を良好に補正するため、正レンズＬｅｐは屈折率が高く色分散の大きい（アッベ数νｄの小さい）光学ガラスを用いる必要がある。Ｎｂ２Ｏ５成分、或いは、Ｔａ２Ｏ５成分を含むこれらの光学ガラスは、屈折率が高く色分散が大きい。よって、コマ収差や倍率の色収差を良好に補正できる。更に、これらの光学ガラスは、自家蛍光が小さく、紫外域での透過率が高い。よって、蛍光観察時にコントラストが高く明るい観察が可能である。
【００４１】
なお、前記レンズ群Ｇｂは、正レンズと負レンズと正レンズとの３枚接合であることが望ましい。マージナル光線の光線高が高いレンズ群Ｇｂに３枚接合レンズを配置することで、軸上色収差を良好に補正できる。
【００４２】
また、前記正のレンズ群Ｇａは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズを接合した接合レンズＧ１と、物体側に凹面を向けた正のメニスカスレンズＧ２と、正の単レンズＧ３とからなり、ｆ（Ｇ１＋Ｇ２）を接合レンズＧ１とメニスカスレンズＧ２との合成焦点距離、ｆを対物レンズ全系の焦点距離、Ｄを接合レンズＧ１とメニスカスレンズＧ２との間のマージナル光線の長さとしたときに、次の条件式（７）（８）を満足する構成も好ましい。
（７） １ ≦ ｆ（Ｇ１＋Ｇ２）／ｆ ≦ ２
（８） Ｄ／ｆ ≦ ０．６
物体からの発散光束を収斂させるために、物体側のレンズ群は強いパワーを持つのが一般的である。特にＮＡが大きな液浸系対物レンズは、最も物体側のレンズ群は半球に近い形状を持つのが一般的である。しかし、最も物体側のレンズ群に大きな収斂パワーを持たせると、そこで発生する球面収差や軸上色収差が大きくなりすぎて補正が困難となる。本発明では、これまでは最も物体側のレンズ群のみに持たせていた強い収斂作用を、接合レンズＧ１とメニスカスレンズＧ２の２つのレンズ群に持たせることにより、収差の発生量を低減し、かつ、収差を補正するレンズ面を増やしている。
【００４３】
条件式（７）と（８）は、これらのレンズ群Ｇ１とＧ２について規定している。条件式（７）の下限を下回ると、レンズ群Ｇ１とＧ２のパワーが強くなりすぎ、ここでの球面収差量や軸上色収差量が増える。条件式（７）の上限を超えると、十分な収斂パワーが得られず、それ以後のレンズ群での光線高が上がり、球面収差や軸上色収差の補正が困難となる。条件式（８）の上限を超えると、レンズ群Ｇ１とＧ２の２つのレンズ群のパワーのバランスが保たれず、２つのレンズ群で従来の物体側レンズ群を代替するという目的を達成することができなくなる。なお、条件式（７）（８）を満たすことで、レンズ群Ｇ１が半球に近い形状になるのに加えて、レンズ群Ｇ２も半球に近い形状となる。すなわち球欠が深いレンズが２つある構成となる。この構成では、レンズ群Ｇ１の屈折力の負荷をレンズ群Ｇ２にも分担させることになり、レンズ群Ｇ１のレンズ厚の公差の影響をレンズ群Ｇ２に分散させることができ、レンズ群Ｇ１の加工性を良くする効果もある。
【００４４】
また、本発明の対物レンズの外形的特徴は、接合レンズＧ１の像側面の曲率半径が焦点距離ｆより小さく、かつ、メニスカスレンズＧ２の像側の曲率半径が焦点距離ｆの２倍よりも小さいことである。これらの特徴により、レンズ群Ｇ３以降の光線高を抑えることができ、高次の収差（球面収差、コマ収差）を補正しやすくしているのと同時に、全体のレンズの外径を小さくすることができレンズの加工性が向上している。
【００４５】
なお、前記レンズ群Ｇｃが光軸方向に移動可能であり、次の条件式（９）を満足することが望ましい。
（９） ｜ ｆ（Ｇｃ）／ｆ ｜ ≦ ５０
ただし、ｆは対物レンズ全系の焦点距離、ｆ（Ｇｃ）はレンズ群Ｇｃの焦点距離である。
【００４６】
生体細胞（屈折率１．３３〜１．４５）の深部を観察する場合、細胞とオイルの屈折率が近い方が屈折率の差による球面収差の発生を抑えることができる。ところが、オイルの屈折率を１．５１より低いものを使用すると、カバーガラス（ｎｄ＝１．５２４２６）との屈折率差が大きくなる。そのため、カバーガラスの厚みが０．１７ｍｍからずれた場合、大きな球面収差が発生する。条件式（９）は、カバーガラスの厚みによる球面収差や、生体細胞（ｎｄ＝１．３３〜１．４５）とオイルの屈折率差による球面収差を補正するための条件である。条件式（９）の上限を超えると、球面収差を十分に補正することができなくなる。
【００４７】
なお、条件式（９）の代わりに以下の条件式（１０）を満たすことも考えられる。
（１０） １０ ≦ ｜ｆ（Ｇｃ）／ｆ｜ ≦ ２０
を満たすことが望ましい。この条件式の下限値を下回ると、レンズ群Ｇｃのパワーが強くなりすぎて、レンズ群Ｇｃでの収差の発生量が大きくなる。更に、レンズ群Ｇｃの移動量が小さくなり、球面収差を補正する補正環の使用時に操作性が劣化する。
【発明の効果】
【００４８】
本発明によると、複数の蛍光タグを用いて観察する場合でも最適な蛍光観察装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】実施例１の対物レンズのレンズ断面図を示す。
【図２】実施例１の対物レンズの収差図を示す。
【図３】実施例２の対物レンズのレンズ断面図を示す。
【図４】実施例２の対物レンズの収差図を示す。
【図５】実施例３の対物レンズのレンズ断面図を示す。
【図６】実施例３の対物レンズの収差図を示す。
【図７】実施例４の対物レンズのレンズ断面図を示す。
【図８】実施例４の対物レンズの収差図を示す。
【図９】実施例５の対物レンズのレンズ断面図を示す。
【図１０】実施例５の対物レンズの収差図を示す。
【図１１】実施例６の対物レンズのレンズ断面図を示す。
【図１２】実施例６の対物レンズの収差図を示す。
【図１３】実施例７の対物レンズのレンズ断面図を示す。
【図１４】実施例７の対物レンズの収差図を示す。
【図１５】比較例１の対物レンズのレンズ断面図を示す。
【図１６】比較例１の対物レンズの収差図を示す。
【図１７】比較例２の対物レンズのレンズ断面図を示す。
【図１８】比較例２の対物レンズの収差図を示す。
【図１９】比較例３の対物レンズのレンズ断面図を示す。
【図２０】比較例３の対物レンズの収差図を示す。
【図２１】結像レンズＡのレンズ断面図を示す。
【図２２】結像レンズＢのレンズ断面図を示す。
【図２３】各実施例の物体面での各波長での軸上の集光位置を示す。
【図２４】対物レンズの軸上色収差の収差図の概略図を示す。
【図２５】照明光束の大きさの違いによる、各波長の集光位置の違いを表した概略図を示す。
【図２６】各実施例の物体面での視野数９の倍率の色収差を示す。
【図２７】従来技術のレーザ走査型鏡焦点顕微鏡を示す。
【図２８】本発明の実施によるレーザ走査型鏡焦点顕微鏡を示す。
【図２９】本発明の実施によるレーザ走査型鏡焦点顕微鏡を用いた画像処理システムを示す。
【図３０】本発明を利用した蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の観察例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
次に本発明の顕微鏡対物レンズの実施の形態を各実施例にもとづいて説明する。
ただし、実施例中において、ｓは各レンズ面の面番号、ｒは各レンズ面の曲率半径（単位ｍｍ）、ｄは各レンズ面間の間隔（単位ｍｍ）、ｎｄは各レンズのｄ線の屈折率、νｄは各レンズのｄ線におけるアッベ数である。また、βは倍率、ＮＡは開口数、ＷＤは作動距離（単位ｍｍ）、ｆは対物レンズ全系の焦点距離（単位ｍｍ）、ｆ(Ｇ１+Ｇ２)は第１レンズ群と第２レンズ群との合成焦点距離（単位ｍｍ）、ｆ（Ｇａ）〜ｆ（Ｇｅ）はレンズ群Ｇａ〜レンズ群Ｇｅの各レンズ群の焦点距離（単位ｍｍ）、Ｈ１はレンズ群Ｇｂから射出するマージナル光線の光線高（単位ｍｍ）、Ｈ２はレンズ群Ｇｄに入射するマージナル光線の光線高（単位ｍｍ）、Ｈ３は対物レンズ射出側のマージナル光線の光線高（単位ｍｍ）である。
【００５１】
下記の各実施例で用いられる光学ガラスは、紫外域での透過率が優れ、自家蛍光の少ない光学ガラスを選択しており、各実施例は蛍光観察に最適な対物レンズとなっている。また、各光学ガラスは、環境対応ガラス（鉛フリーガラス）を選択しており、各実施例は環境に配慮した対物レンズとなっている。
【００５２】
なお、各媒質の各波長の屈折率は以下のとおりである。
【００５３】
【表１】
また、各実施例は、対物レンズからの射出光が平行光束となる無限遠補正型の対物レンズであり、それ自身では結像しない。そこで、例えば以下の結像レンズＡ（焦点距離１８０ｍｍ）、あるいは、結像レンズＢ（焦点距離１８０ｍｍ）と組み合わせて使用される。ただし、図２１は結像レンズＡの断面図を示し、図２２は結像レンズＢの断面図を示す。
（結像レンズＡ）
【００５４】
【表２】
（結像レンズＢ）
【００５５】
【表３】
結像レンズＡと組み合わせる場合は、各実施例の対物レンズと結像レンズＡの間の間隔は５０ｍｍ〜１７０ｍｍの間のいずれの位置でもよい。結像レンズＢと組み合わせる場合は、実施例の対物レンズと結像レンズＢの間の間隔は５０ｍｍ〜２５０ｍｍの間のいずれの位置でもよい。また、以下で示される各実施例の収差図は、結像レンズＡとの間隔を１２０ｍｍで組み合わせた場合のものである。
【００５６】
ただし、収差図の光線追跡は、結像面（受光面）から物体面（試料面）への方向で行い、物体面での収差を表示している。また、（ａ）は球面収差、（ｂ）は正弦条件違反量、（ｃ）は非点収差、（ｄ）はコマ収差を示す。これらの収差図から、本発明の対物レンズは４０５ｎｍから６５６ｎｍまで、軸上色収差、倍率色収差等の収差が良好に補正されていることが分かる。
【実施例１】
【００５７】
本発明の実施例１は、図１に示す通りの構成である。つまり、物体側より順に正のレンズ群Ｇａと正のレンズ群Ｇｂとレンズ群Ｇｃとレンズ群Ｇｄとレンズ群Ｇｅとから構成される。正のレンズ群Ｇａは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズからなる接合レンズＧ１と、正の単レンズＧ２とによって構成される。正のレンズ群Ｇｂは正レンズと負レンズと正レンズとからなる３枚接合レンズＧ３からなる。レンズ群Ｇｃは、負レンズと正レンズとからなる接合レンズＧ４と、正レンズと負レンズとからなる接合レンズＧ５とにより構成される。レンズ群Ｇｄは正レンズと負レンズとからなる接合レンズＧ６からなり、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状をしている。レンズ群Ｇｅは物体側に強い凹面を向けた負レンズＧ７と正レンズＧ８とにより構成されている。
【００５８】
この実施例１のレンズデータは下記の通りである。実施例１の対物レンズは、ｎｄ＝１．５１４８３，νｄ＝４１．０の液浸液を使用する。この液浸液は、従来から使用されている顕微鏡対物レンズ用オイルである。
【００５９】
【表４】
β＝ ６０×、ＮＡ ＝ １．４、視野数＝ ２２、ＷＤ ＝ ０．１６、ｆ ＝ ３
ｆ(Ｇａ) ＝ ４．８０９
ｆ(Ｇｂ) ＝ ２７．６５６
ｆ(Ｇｃ) ＝ １５６．４９１
ｆ(Ｇｄ) ＝ −９７．４３２
ｆ(Ｇｅ) ＝ −３２．３５９
ｆ(Ｇａ)／ｆ ＝ １．６０
ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ ９．２２
ｆ(Ｇｃ)／ｆ ＝ ５２．１６
ｆ(Ｇｄ)／ｆ ＝ −３２．４８
ｆ(Ｇｅ)／ｆ ＝ −１０．７９
Ｈ１ ＝ ７．２７
Ｈ２ ＝ ５．２
Ｈ３ ＝ ４．２
νｄ（Ｌｅｎ） ＝ ６３．３
νｄ（Ｌｅｐ） ＝ ２９．８
ｎｄ(Ｌｅｎ) ＝ １．６１８００
ｎｄ(Ｌｅｐ) ＝ １．８００００
(１) Ｈ２／Ｈ１ ＝ ０．７２
(２) ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ ９．２２
(３) νｄ(Ｌｅｎ)−νｄ(Ｌｅｐ) ＝ ３３．５
(６) Ｈ３／Ｈ１ ＝ ０．５８
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を４０５ｎｍから６５６ｎｍまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図２によって示される。
【実施例２】
【００６０】
本発明の実施例２は、図３に示す通りの構成である。つまり、物体側より順に正のレンズ群Ｇａと正のレンズ群Ｇｂとレンズ群Ｇｃとレンズ群Ｇｄとレンズ群Ｇｅとから構成される。正のレンズ群Ｇａは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズからなる接合レンズＧ１と、正の単レンズＧ２とによって構成される。正のレンズ群Ｇｂは正レンズと負レンズと正レンズとからなる３枚接合レンズＧ３からなる。レンズ群Ｇｃは、負レンズと正レンズとからなる接合レンズＧ４と、正レンズと負レンズとからなる接合レンズＧ５とにより構成される。レンズ群Ｇｄは正レンズと負レンズとからなる接合レンズＧ６からなり、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状をしている。レンズ群Ｇｅは物体側に強い凹面を向けた負レンズＧ７と正レンズＧ８とにより構成されている。
【００６１】
この実施例２のレンズデータは下記の通りである。実施例２の対物レンズは、ｎｄ＝１．５１４８３，νｄ＝４１．０の液浸液を使用する。この液浸液は、従来から使用されている顕微鏡対物レンズ用オイルである。
【００６２】
【表５】
β ＝ ６０×、ＮＡ ＝ １．４、視野数＝ ２２、ＷＤ ＝ ０．１６、ｆ ＝ ３
ｆ(Ｇａ) ＝ ４．５８７
ｆ(Ｇｂ) ＝ ２８．０１４
ｆ(Ｇｃ) ＝ １５８．７３５
ｆ(Ｇｄ) ＝ −６８．５１９
ｆ(Ｇｅ) ＝ −３６．４５２
ｆ(Ｇａ)／ｆ ＝ １．５３
ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ ９．３４
ｆ(Ｇｃ)／ｆ ＝ ５２．９１
ｆ(Ｇｄ)／ｆ ＝ −２２．８４
ｆ(Ｇｅ)／ｆ ＝ −１２．１５
Ｈ１ ＝ ６．９１
Ｈ２ ＝ ４．７２
Ｈ３ ＝ ４．２
νｄ（Ｌｅｎ） ＝ ７０．３
νｄ（Ｌｅｐ） ＝ ２９．８
ｎｄ(Ｌｅｎ) ＝ １．４８７４５
ｎｄ(Ｌｅｐ) ＝ １．８００００
(１) Ｈ２／Ｈ１ ＝ ０．６８
(２) ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ ９．３４
(３) νｄ(Ｌｅｎ)−νｄ(Ｌｅｐ) ＝ ４０．５
(６) Ｈ３／Ｈ１ ＝ ０．６１
(９) ｜ｆ(Ｇｃ)／ｆ｜ ＝ ５２．９
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を４０５ｎｍから６５６ｎｍまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図４によって示される。
【実施例３】
【００６３】
本発明の実施例３は、図５に示す通りの構成である。つまり、物体側より順に正のレンズ群Ｇａと正のレンズ群Ｇｂとレンズ群Ｇｃとレンズ群Ｇｄとレンズ群Ｇｅとから構成される。正のレンズ群Ｇａは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズからなる接合レンズＧ１と、正の単レンズＧ２と、正の単レンズＧ３と、によって構成される。正のレンズ群Ｇｂは正レンズと負レンズと正レンズとからなる３枚接合レンズＧ４からなる。レンズ群Ｇｃは、負レンズと正レンズとからなる接合レンズＧ５と、正レンズと負レンズとからなる接合レンズＧ６とにより構成される。レンズ群Ｇｄは正レンズと負レンズとからなる接合レンズＧ７からなり、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状をしている。レンズ群Ｇｅは物体側に強い凹面を向けた負レンズと正レンズとからなる接合レンズＧ８により構成されている。
【００６４】
この実施例３のレンズデータは下記の通りである。実施例３の対物レンズは、ｎｄ＝１．５１４８３，νｄ＝４１．０の液浸液を使用する。この液浸液は、従来から使用されている顕微鏡対物レンズ用オイルである。
【００６５】
【表６】
β＝ ６０×、ＮＡ ＝ １．４、視野数＝ ２２、ＷＤ ＝ ０．１６、ｆ ＝ ３
ｆ(Ｇａ) ＝ ４．０５７
ｆ(Ｇｂ) ＝ ５５．１３２
ｆ(Ｇｃ) ＝ ４２４．９２９
ｆ(Ｇｄ) ＝ −１４．７０６
ｆ(Ｇｅ) ＝ ４２５．４５９
ｆ(Ｇａ)／ｆ ＝ １．３５
ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ １８．３８
ｆ(Ｇｃ)／ｆ ＝ １４１．６４
ｆ(Ｇｄ)／ｆ ＝ −４．９０
ｆ(Ｇｅ)／ｆ ＝ １４１．８２
Ｈ１ ＝ ６．７
Ｈ２ ＝ ４．１９
Ｈ３ ＝ ４．２
νｄ（Ｌｅｎ） ＝ ７０．３
νｄ（Ｌｅｐ） ＝ ３２．２
ｎｄ(Ｌｅｎ) ＝ １．４８７４５
ｎｄ(Ｌｅｐ) ＝ １．７３８００
(１) Ｈ２／Ｈ１ ＝ ０．６３
(２) ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ １８．３８
(３) νｄ(Ｌｅｎ)−νｄ(Ｌｅｐ) ＝ ３８．１
(６) Ｈ３／Ｈ１ ＝ ０．６３
(９) ｜ｆ(Ｇｃ)／ｆ｜＝ １４１．６
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を４０５ｎｍから６５６ｎｍまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図６によって示される。
【実施例４】
【００６６】
本発明の実施例４は、図７に示す通りの構成である。つまり、物体側より順に正のレンズ群Ｇａと正のレンズ群Ｇｂとレンズ群Ｇｃとレンズ群Ｇｄとレンズ群Ｇｅとから構成される。正のレンズ群Ｇａは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズとからなる接合レンズＧ１と、正の単レンズＧ２と、正の単レンズＧ３と、によって構成される。正のレンズ群Ｇｂは正レンズと負レンズと正レンズとからなる３枚接合レンズＧ４からなる。レンズ群Ｇｃは、負レンズと正レンズとからなる接合レンズＧ５と、正レンズと負レンズとからなる接合レンズＧ６とにより構成される。レンズ群Ｇｄは正レンズと負レンズとからなる接合レンズＧ７からなり、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状をしている。レンズ群Ｇｅは物体側に強い凹面を向けた負レンズと正レンズとからなる接合レンズＧ８により構成されている。
【００６７】
この実施例４のレンズデータは下記の通りである。実施例４の対物レンズは、ｎｄ＝１．５１４８３，νｄ＝４１．０の液浸液を使用する。この液浸液は、従来から使用されている顕微鏡対物レンズ用オイルである。
【００６８】
【表７】
β＝ ６０×、ＮＡ ＝ １．４、視野数＝ ２２、ＷＤ ＝ ０．１６、ｆ ＝ ３
ｆ(Ｇａ) ＝ ４．１７８
ｆ(Ｇｂ) ＝ ３９．８１４
ｆ(Ｇｃ) ＝ １３３．７５１
ｆ(Ｇｄ) ＝ −１３．１４２
ｆ(Ｇｅ) ＝ ３５０．７２６
ｆ(Ｇａ)／ｆ ＝ １．３９
ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ １３．２７
ｆ(Ｇｃ)／ｆ ＝ ４４．５８
ｆ(Ｇｄ)／ｆ ＝ −４．３８
ｆ(Ｇｅ)／ｆ ＝ １１６．９１
Ｈ１ ＝ ６．９６
Ｈ２ ＝ ４．１
Ｈ３ ＝ ４．２
νｄ（Ｌｅｎ） ＝ ７０．３
νｄ（Ｌｅｐ） ＝ ３２．２
ｎｄ(Ｌｅｎ) ＝ １．４８７４５
ｎｄ(Ｌｅｐ) ＝ １．７３８００
(１) Ｈ２／Ｈ１ ＝ ０．５９
(２) ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ １３．２７
(３) νｄ(Ｌｅｎ)−νｄ(Ｌｅｐ) ＝ ３８．１
(６) Ｈ３／Ｈ１ ＝ ０．６０
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を４０５ｎｍから６５６ｎｍまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図８によって示される。
【実施例５】
【００６９】
本発明の実施例５は、図９に示す通りの構成である。つまり、物体側より順に正のレンズ群Ｇａと正のレンズ群Ｇｂとレンズ群Ｇｃとレンズ群Ｇｄとレンズ群Ｇｅとから構成される。正のレンズ群Ｇａは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズとからなる接合レンズＧ１と、正の単レンズＧ２とによって構成される。正のレンズ群Ｇｂは正レンズと負レンズと正レンズとからなる３枚接合レンズＧ３からなる。レンズ群Ｇｃは、負レンズと正レンズとからなる接合レンズＧ４と、正レンズと負レンズからなる接合レンズＧ５とにより構成される。レンズ群Ｇｄは正レンズと負レンズとからなる接合レンズＧ６からなり、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状をしている。レンズ群Ｇｅは物体側に強い凹面を向けた負レンズＧ７と正レンズＧ８とにより構成されている。レンズ群Ｇｃは光軸方向に移動可能である。
【００７０】
この実施例５のデータは下記の通りである。実施例５の対物レンズは、ｎｄ＝１．４０４３０，νｄ＝５２．０の液浸液を使用する。この液浸液は、シリコーンオイルである。シリコーンオイルの屈折率は、生体細胞（ｎｄ＝１．３３〜１．４５）の屈折率に近く、生体細胞との屈折率ミスマッチが少ない。そのため、シリコーンオイルを用いた対物レンズは、生体細胞の深いところまで鮮明に見えるという利点がある。また、自家蛍光が少なく、蛍光観察に適している。また、揮発しにくく、屈折率の変化が少ないため、長時間の観察に適している。一方、一般的に用いられているグリセリン液浸液や、グリセリンと水の混合液の液浸液は、長時間の観察に不適である。なぜなら、グリセリンは吸湿性のために時間とともに屈折率が変化するためである。
【００７１】
【表８】
β＝６０×、ＮＡ＝１．３、視野数＝２２、ＷＤ＝０．３２、ｆ＝３
ｆ(Ｇａ) ＝ ５．００６
ｆ(Ｇｂ) ＝ ２８．１５９
ｆ(Ｇｃ) ＝ −４３．１８４
ｆ(Ｇｄ) ＝ ３４．１０４
ｆ(Ｇｅ) ＝ −６８．７４６
ｆ(Ｇａ)／ｆ ＝ １．６７
ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ ９．３９
ｆ(Ｇｃ)／ｆ ＝ −１４．３９
ｆ(Ｇｄ)／ｆ ＝ １１．３７
ｆ(Ｇｅ)／ｆ ＝ −２２．９２
Ｈ１ ＝ ７．３２
Ｈ２ ＝ ４．４９
Ｈ３ ＝ ３．９
νｄ（Ｌｅｎ） ＝ ６４．２
νｄ（Ｌｅｐ） ＝ ３２．２
ｎｄ(Ｌｅｎ) ＝ １．５１６３０
ｎｄ(Ｌｅｐ) ＝ １．７３８００
(１) Ｈ２／Ｈ１ ＝ ０．６１
(２) ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ ９．３９
(３) νｄ(Ｌｅｎ)−νｄ(Ｌｅｐ) ＝ ３２．０
(６) Ｈ３／Ｈ１ ＝ ０．５３
(９) ｜ｆ(Ｇｃ)／ｆ｜ ＝ １４．４
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を４０５ｎｍから６５６ｎｍまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図１０によって示される。
【実施例６】
【００７２】
本発明の実施例６は、図１１に示す通りの構成である。つまり、物体側より順に正のレンズ群Ｇａと正のレンズ群Ｇｂとレンズ群Ｇｃとレンズ群Ｇｄとレンズ群Ｇｅとから構成される。正のレンズ群Ｇａは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズとを接合した接合レンズＧ１と、物体側に凹面を向けた正のメニスカスレンズＧ２と、正の単レンズＧ３とによって構成される。正のレンズ群Ｇｂは正レンズと負レンズと正レンズとからなる３枚接合レンズＧ４からなる。レンズ群Ｇｃは正レンズと負レンズとからなる接合レンズＧ５と、正レンズと負レンズとからなる接合レンズＧ６により構成される。レンズ群Ｇｄは正レンズと負レンズとからなる接合レンズＧ７からなり、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状をしている。レンズ群Ｇｅは物体側に強い凹面を向けた負レンズと正レンズとからなる接合レンズＧ８により構成されている。
【００７３】
図１１から読み取れるように、本実施例は最も物体側のレンズ群Ｇａに特徴的な形状を持っている。一般にＮＡが大きな液浸系の対物レンズはこの部分のレンズ群が半球に近い形状をもつ。しかし本実施例では、これを２つの半球状のレンズを含むことが形態上の特徴の一つとなっている。この形態により、レンズ群Ｇａによって発生する収差量を低減させている。また、接合レンズＧ１の像側面の曲率半径は焦点距離ｆより小さく、かつ、メニスカスレンズＧ２の像側の曲率半径は焦点距離ｆの２倍よりも小さい。これらの特徴により、レンズ群Ｇ３以降の光線高を抑えることができ、高次の収差（球面収差、コマ収差）を補正しやすくしているのと同時に、全体のレンズの外径を小さくすることができレンズの加工性が向上している。
【００７４】
この実施例１のデータは下記の通りである。実施例６の対物レンズは、ｎｄ＝１．５１４８３，νｄ＝４１．０の液浸液を使用する。この液浸液は、従来から使用されている顕微鏡対物レンズ用オイルである。
【００７５】
【表９】
β＝６０×、ＮＡ＝１．４、視野数＝２２、ＷＤ＝０．１６、ｆ＝３
ｆ(Ｇａ) ＝ ４．８３５
ｆ(Ｇｂ) ＝ ２４．１００
ｆ(Ｇｃ) ＝ −６６．７７０
ｆ(Ｇｄ) ＝ −３０．１５３
ｆ(Ｇｅ) ＝ −４３６．８０９
ｆ(Ｇａ)／ｆ ＝ １．６１
ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ ８．０３
ｆ(Ｇｃ)／ｆ ＝ −２２．２６
ｆ(Ｇｄ)／ｆ ＝ −１０．０５
ｆ(Ｇｅ)／ｆ ＝ −１４５．６０
ｆ(Ｇ１＋Ｇ２) ＝ ５．７４０
Ｈ１ ＝ ７．１２
Ｈ２ ＝ ４．４７
Ｈ３ ＝ ４．２
Ｄ ＝ １．３３
νｄ（Ｌｅｎ） ＝ ６４．２
νｄ（Ｌｅｐ） ＝ ２９．８
ｎｄ(Ｌｅｎ) ＝ １．５１６３０
ｎｄ(Ｌｅｐ) ＝ １．８００００
(１) Ｈ２／Ｈ１ ＝ ０．６３
(２) ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ ８．０３
(３) νｄ(Ｌｅｎ)−νｄ(Ｌｅｐ) ＝ ３４．４
(６) Ｈ３／Ｈ１ ＝ ０．５９
(７) ｆ(Ｇ１＋Ｇ２)／ｆ ＝ １．９１
(８) Ｄ／ｆ ＝ ０．４４
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を４０５ｎｍから６５６ｎｍまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図１２によって示される。
【実施例７】
【００７６】
本発明の実施例７は、図１３に示す通りの構成である。つまり、物体側より順に正のレンズ群Ｇａと正のレンズ群Ｇｂとレンズ群Ｇｃとレンズ群Ｇｄとレンズ群Ｇｅとから構成される。正のレンズ群Ｇａは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズとを接合した接合レンズＧ１と、物体側に凹面を向けた正のメニスカスレンズＧ２と、正の単レンズＧ３とによって構成される。正のレンズ群Ｇｂは正レンズと負レンズと正レンズとからなる３枚接合レンズＧ４からなる。レンズ群Ｇｃは正レンズと負レンズからなる接合レンズＧ５と正レンズと負レンズからなる接合レンズＧ６により構成される。レンズ群Ｇｄは正レンズと負レンズとからなる接合レンズＧ７からなり、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状をしている。レンズ群Ｇｅは物体側に強い凹面を向けた負レンズと正レンズとからなる接合レンズＧ８により構成されている。
【００７７】
図１３から読み取れるように、本実施例も最も物体側のレンズ群Ｇａに特徴的な形状を持っている。本実施例でもレンズ群Ｇａに２つの半球状のレンズを含むことが形態上の特徴の一つとなっている。この形態により、レンズ群Ｇａによって発生する収差量を低減させている。また、接合レンズＧ１の像側面の曲率半径は焦点距離ｆより小さく、かつ、メニスカスレンズＧ２の像側の曲率半径は焦点距離ｆの２倍よりも小さい。これらの特徴により、レンズ群Ｇ３以降の光線高を抑えることができ、高次の収差（球面収差、コマ収差）を補正しやすくしているのと同時に、全体のレンズの外径を小さくすることができレンズの加工性が向上している。
【００７８】
この実施例７のレンズデータは下記の通りである。実施例７の対物レンズは、ｎｄ＝１．５１４８３，νｄ＝４１．０の液浸液を使用する。この液浸液は、従来から使用されている顕微鏡対物レンズ用オイルである。
【００７９】
【表１０】
β＝６０×、ＮＡ＝１．４、視野数＝２２、ＷＤ＝０．１６、ｆ＝３
ｆ(Ｇａ) ＝ ３．９７３
ｆ(Ｇｂ) ＝ ２８．９６７
ｆ(Ｇｃ) ＝ ３７５６．６１７
ｆ(Ｇｄ) ＝ −１９．２３５
ｆ(Ｇｅ) ＝ ６７１．６９５
ｆ(Ｇａ)／ｆ ＝ １．３２
ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ ９．６６
ｆ(Ｇｃ)／ｆ ＝ １２５２．２１
ｆ(Ｇｄ)／ｆ ＝ −６．４１
ｆ(Ｇｅ)／ｆ ＝ ２２３．９０
ｆ(Ｇ１＋Ｇ２) ＝ ４．５
Ｈ１ ＝ ７．０１
Ｈ２ ＝ ４．１６
Ｈ３ ＝ ４．２
Ｄ ＝ １．３
νｄ（Ｌｅｎ） ＝ ７０．３
νｄ（Ｌｅｐ） ＝ ３２．２
ｎｄ(Ｌｅｎ) ＝ １．４８７４５
ｎｄ(Ｌｅｐ) ＝ １．７３８００
(１) Ｈ２／Ｈ１ ＝ ０．５９
(２) ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ ９．６６
(３) νｄ(Ｌｅｎ)−νｄ(Ｌｅｐ) ＝ ３８．１
(６) Ｈ３／Ｈ１ ＝ ０．６０
(７) ｆ(Ｇ１＋Ｇ２)／ｆ ＝ １．５０
(８) Ｄ／ｆ ＝ ０．４３
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を４０５ｎｍから６５６ｎｍまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図１４によって示される。
【００８０】
ここで上記実施例１から７における、４００ｎｍから７００ｎｍまでの軸上色収差を図２３に示す。また、従来技術との比較のために、特許文献１と特許文献２に記載の対物レンズも併記した。図２３における、比較例１は特許文献１における実施例１に記載の対物レンズであり、比較例２は特許文献１における実施例２に記載の対物レンズであり、比較例３は特許文献２における実施例４に記載の対物レンズである。なお、比較例１のレンズ断面図は図１５に記載され、収差図は図１６に記載されている。比較例２のレンズ断面図は図１７に記載され、収差図は図１８に記載されている。比較例３のレンズ断面図は図１９に記載され、収差図は図２０に記載されている。
【００８１】
この図２３はｅ線（５４６．０７ｎｍ）を基準とした場合の、各波長での物体面での軸上の集光位置を表している。横軸は波長（ｎｍ）であり、縦軸はｅ線（５４６．０７ｎｍ）を基準位置とした場合の各波長における集光位置のずれである。
【００８２】
図２３から解るように、本発明の対物レンズは軸上色収差が良好に補正されており、４００〜７００ｎｍにおいて、各波長の集光位置のずれが０．１μｍ（０．０００１ｍｍ）以内に収まっている。このことは、本発明の対物レンズが多波長観察に対して非常に有効に機能することを意味している。
【００８３】
また、各実施例の収差図（図２、図４、図６、図８、図１０、図１２、図１４）と各比較例の収差図（図１６、図１８、図２０）を比較すると解るように、本発明の実施例は球面収差の補正の仕方にも特徴を持つ。本願実施例の対物レンズは図２４（ｂ）のように、各波長ですべてのＮＡに渡って均等に球面収差を補正している。一方、従来技術である比較例では図２４（ａ）のように、ＮＡに関して球面収差が正の部分と負の部分があり、それらが相殺することによって、波長ごとの集光位置がほぼ等しく補正される。
【００８４】
上述の従来技術のような収差補正をした場合、対物レンズのＮＡの利用に偏りがある場合に大きな影響が生じる。例えばこのような影響は、対物レンズのＮＡを絞ったときや、ガウス分布をもったレーザ光を対物レンズに入射した場合に現れる。
【００８５】
図２５はこの現象を説明するための図である。同図に説明されるように、一般的な従来の対物レンズでは、ＮＡの大きい位置からの光線は波長によらずほぼ同じ位置に集光されるように色収差を補正されているが、ＮＡの小さい位置での光線は波長ごとに異なる位置に集光してしまう。この現象の直接的な原因が、従来技術における図２４（ａ）のような球面収差の補正の仕方である。
【００８６】
一方、本発明の実施による対物レンズでは、図２４（ｂ）のように、球面収差が各波長ですべてのＮＡに渡って均等に球面収差を補正しているので、対物レンズのＮＡの利用に偏りがある場合でも影響が少ない。すなわち、本発明による対物レンズは、ガウシアンビームを対物レンズに入射して利用するレーザ走査型顕微鏡に対して非常に好適である。
【００８７】
図２６は実施例１から７および比較例１から３の倍率の色収差を示している。この図は、波長４８８ｎｍを基準とした場合の、視野数９における倍率の色収差を表している。横軸は波長（ｎｍ）であり、縦軸は各波長の基準位置からの集光位置のずれである。なお、本発明の実施例はすべて６０倍であるので、視野数９は物体面で物体高０．０７５ｍｍに相当する。
【００８８】
同図から読み取れるように、本発明の実施例では倍率の色収差も良好に補正されており、各波長での色収差が０．３μｍ（０．０００３ｍｍ）以内に収まっている。
以下では本願発明の実施の形態をレーザ走査型顕微鏡の装置の視点から説明する。
【００８９】
図２７は従来のレーザ走査型顕微鏡の構成図を示す。従来のレーザ走査型顕微鏡では可視光レーザ２として例えばアルゴンイオンレーザ（波長488ｎｍ）とＨｅ−Ｎｅグリーンレーザ（波長543ｎｍ）とＨｅ−Ｎｅレーザ（波長633ｎｍ）を用いた場合、これらのレーザをダイクロイックミラー４で同一光路に合成し、集光レンズ６でシングルモードファイバ８に集光させる。シングルモードファイバはＮＡが０．１程度であり、コア径が数μｍの大きさになっているので、レーザ光をファイバに入れるのは厳密な調整が必要となる。このため、ファイバへのレーザ光の傾きと横ずれを調整するファイバカップリング機構７を備えている。
【００９０】
このとき、例えば波長405ｎｍのレーザなどをさらに用いる場合は短波用レーザ１として別なファイバを用いてレーザ走査型顕微鏡に導入し、後段のダイクロイックミラー１２によって合成させることが従来では多かった。これは対物レンズ１８の色収差をファイバ後のコリメータレンズ１０により調整していたためである。この様な調節していた理由は、従来の対物レンズでは色収差を補正している波長域が十分ではないので波長405ｎｍなどのレーザを使う場合には特別な方法を採用しなければいけなかったのである。
【００９１】
しかし、対物レンズはそれぞれが異なる色収差をもつので、この方法ではすべての対物レンズで対応することが非常に難しいという問題点がある。光ファイバはコア径が数ミクロンと非常に小さいため、顕微鏡への導入時のファイバの平行出しと傾け調整は非常に精密なファイバ傾き位置合わせ機構９の調整が必要となる。そのために、従来のレーザ走査型顕微鏡はこの調整が複雑であった。
【００９２】
本発明のレーザ走査型顕微鏡の実施例を図２８に示す。本発明の対物レンズは４０５ｎｍから６５６ｎｍまでの波長域で色収差が補正されているため、短波長側のレーザと可視レーザは同一の光で入射させることが可能となる。このため、１本のファイバ８を用いる。このファイバは使用波長域が広い光ファイバが適している。
【００９３】
ファイバ８からの光線はコリメータレンズ１０により平行光線となり、ミラーやダイクロイックミラーにより可視光レーザと短波長側レーザは同一光路に合成され、ダイクロイックミラー１３で反射される。ダイクロイックミラーで反射後のレーザ光はガルバノミラー１４でスキャンされ、瞳投影レンズ１５、結像レンズ１６によりリレーされ、対物レンズに入射する。試料からの蛍光は逆の光路を通り、ダイクロイックミラー１３を通過し、結像レンズ２０によって共焦点効果を出すためのピンホール１９に集光させる。そしてピンホール１９を通過することができた蛍光をダイクロイックミラー２１を使い分光した後、バリアフィルタ２３により所望の波長域の蛍光を光検出器２４で検出する。なお、符号３、５、１１、１７、２２は光路を曲げるためのミラーである。
【００９４】
また、ダイクロイックミラー１３は切り替えをすることなく複数の波長のレーザを反射することができるマルチバンドタイプのダイクロイックミラーが望ましい。ダイクロイックミラーに楔がある場合、ダイクロイックミラーの切り替えで標本面での集光位置がわずかにずれる。しかし、マルチバンドのダイクロイックミラーを用いると１つのダイクロイックミラーで複数のレーザに対応できるため、切り替えの必要がなく、ダイクロの楔によって標本面の集光位置がずれることがない。また、複数の対物レンズを使用した場合も、従来技術だと複数の対物レンズに対して色収差を合わせることは不可能だったが、本発明の低色収差対物レンズを用いて、本発明の蛍光観察装置の構成を用いれば、色収差のずれが少ない観察が可能となる。
【００９５】
また、本実施例の対物レンズは対物レンズ単独で色収差補正を行っている。このため、対物レンズ１８と結像レンズ１６の間にレーザ光を導入する場合に有利となる。結像レンズ１６と対物レンズ１８をコンペンゼーションして色収差補正を行う場合は、対物レンズ１８と結像レンズ１６の間からレーザなどを導入すると、集光位置のずれが生じる。一方、対物レンズ単独で色収差補正を行っている本実施例では集光位置のずれが生じないので、レーザ光で刺激しながらレーザ走査型顕微鏡で観察するような場合に有利となる。
【００９６】
図２８では、対物レンズ１８とミラー１７の間にダイクロイックミラー３２を配置して、刺激用レーザ３３を備えた構成を示している。ここでは、刺激用レーザ３３の照射位置を調節するために可動式ミラー３４を備えた構成とした。
【００９７】
図２９は本発明の実施によるレーザ走査型鏡焦点顕微鏡の外観構成例を示す。試料２５はステージ２６の上に置かれており、対物レンズ１８は顕微鏡２８のレボルバに取り付けられている。このレボルバには複数の対物レンズが取り付いていてもよい。対物レンズは光軸方向に移動する対物レンズ上下機構２７を有しており、試料２５の光軸方向の複数の断面像を得ることが可能である。試料の３次元像をとるために、共焦点スキャナー２９が顕微鏡本体２８に取り付けられており、ガルバノスキャナーやピンホールなどが内部に配置されている。図示していないが、レーザ光源は図２８のようにファイバで共焦点スキャナー２９に接続されている。共焦点スキャナー２９で得られた信号を画像処理装置３１に伝達し、画像表示装置３０で表示する。試料の３次元像を構築するため、対物レンズを光軸方向に移動させ、複数の波長の蛍光像を取得する。各断面像は画像処理装置３１に保存され、試料の３次元像を画像表示装置３０に表示する。
【００９８】
本発明は色収差が十分補正されているため、複数の蛍光像は光軸方向のずれがない。このため、画像処理装置３１に保存された複数の蛍光波長の試料の光軸方向の断面像を重ね合わせ表示するときに、波長が変わっても同じ断面像を重ね合わせするだけで正確な試料の３次元像を得ることができる。また、試料内の分子の高速な運動を見る場合にも本発明の構成は複数の蛍光画像を重ね合わせするときに、色収差補正のための光軸方向の対物レンズ駆動が不要となるため、試料内分子の高速運動も観察することが可能となる。
【００９９】
また、本発明は共焦点顕微鏡以外の蛍光顕微鏡、蛍光観察装置でも有効である。例えば、細胞内のタンパク質を複数の波長の異なった蛍光タグで標識して、細胞膜からタンパク質がどう移動しているかを見る観察法がある。この場合、細胞膜自体に顕微鏡のピントを合わせる必要があるが、対物レンズに軸上色収差がある場合は、異なった蛍光タグでピントがずれてしまう現象が生じ、蛍光波長を変えると細胞膜からずれた位置を観察することになる。このよう場合にも本発明の対物レンズを用いれば、複数の蛍光波長が異なる蛍光タグを使用する場合、常に標本内の同一平面を観察することが可能となり、正確なデータを得ることが可能となる。
【０１００】
図３０は本発明の実施による蛍光観察装置のアプリケーションである蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の観察例を示す。この観察では、たとえばカメレオンなどの蛍光プローブを用いて細胞内のカルシュウムイオン濃度を測定する。カメレオン（ｃａｍｅｌｅｏｎ）はＣＦＰ、ＹＦＰという２種類の蛍光タンパクをカルモジュリンＭなどのたんぱく質で繋げた構造を持っている。細胞内のカルシュウムイオンが低い状態では波長442nmの励起光が照射されるとＣＦＰからの波長485ｎｍの蛍光しか放射されないが、カルシュウムイオン濃度が高くなると、ＣＦＰからＹＦＰにエネルギー転移が起こり、ＹＦＰからの蛍光である波長530ｎｍの蛍光が観察される。この現象から、ＣＦＰとＹＦＰの蛍光強度の比をとることにより、カルシュウムイオン濃度を測定することが可能となる。
【０１０１】
蛍光顕微鏡またはレーザ走査型顕微鏡にて４８５ｎｍと５３０ｎｍの２つの波長で画像を取得する。たとえば、図３０の（１）を４８５ｎｍの画像とし、図３０の（２）を５３０ｎｍの画像とする。この画像（１）と画像（２）の各画素毎に輝度の比をとった像を図２９の（３）とする。このような操作によって得られた画像（３）は細胞内のカルシュウムイオン濃度の情報を持っている。上記の手順からも解るように、この観察方法では、異なる波長で取得した画像を、画素毎に正確に対応させることが必要となっている。本発明の実施による蛍光観察装置ではこのような観察に好適である。
【０１０２】
上記は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）について述べたが、ｆｕｒａ２などのカルシュウム測光などの蛍光のレシオをとる観察法において、本発明の対物レンズを用いれば、常に標本面の同一平面でのレシオをとることができるので正確な測定が可能となる。
【符号の説明】
【０１０３】
１ 短波長レーザ
２ 可視光レーザ
３ ミラー
４ ダイクロイックミラー
５ ミラー
６ 集光レンズ
７ ファイバカップリング機構
８ ファイバ
９ ファイバ傾き位置合わせ機構
１０ コリメータレンズ
１１ ミラー
１２ ダイクロイックミラー
１３ ダイクロイックミラー
１４ ガルバノミラー
１５ 瞳投影レンズ
１６ 結像レンズ
１７ ミラー
１８ 対物レンズ
１９ ピンホール
２０ 結像レンズ
２１ ダイクロイックミラー
２２ ミラー
２３ バリアフィルタ
２４ 検出器
２５ 標本
２６ ステージ
２７ 対物レンズ上下機構
２８ 顕微鏡本体
２９ 共焦点スキャナー
３０ 画像表示装置
３１ 画像処理装置
３２ ダイクロイックミラー
３３ 刺激用レーザ
３４ 可動式ミラー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光観察装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、生物試料の内部の分子挙動の観察に蛍光タグをつけた蛍光観察装置が多く用いられている。蛍光タグは蛍光物質を特定の生物学的な分子に結びつけることによって、生物内の分子の挙動や結合状態や運動状態などを観察することが可能となる。ここで蛍光タグとして使われるものとして、蛍光色素や蛍光たんぱく質や量子ドットなどが知られている。
【０００３】
また、近年の特徴として、蛍光タグの多色化が挙げられる。蛍光タグを多色化すると複数種類の分子を区別して観察することができ、生体内の分子たちの相互作用などの複雑な現象を捉えることもできる。
【０００４】
そしてこの蛍光タグの多色化によって、蛍光観察では従来よりも広い波長の範囲が利用されるようになった。
また、例えばＫａｅｄｅやＰＡ−ＧＦＰなどのフォトアクチベーション蛍光タンパク質では４４０ｎｍや４０５ｎｍの波長が用いられる。この様な短波長光は従来ではあまり利用されてこなかった光である。その結果、従来よりも広い波長域で収差補正がされた対物レンズに対する要求が高まっている。
【０００５】
一方で近年では、生物試料の観察対象も例えば細胞内の構造から分子レベルの挙動を観察することが多くなり、顕微鏡における試料平面内および光軸方向の分解能の要求レベルも高くなっている。また、共焦点顕微鏡の普及により、高分解能で観測することが可能になっている。つまり、高分解能を達成するための高開口数の対物レンズに対する要求も高い。
【０００６】
以下に示す特許文献１と特許文献２では蛍光観察に適した高開口数の顕微鏡対物レンズが提案されている。しかしながら、これらの顕微鏡対物レンズでは上記のような背景による要求を十分には満たしてはいないといえる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平７−３５９８３号公報
【特許文献２】特開２００３−２１７８６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来のアポクロマート顕微鏡対物レンズは、ｇ線（４３５．８３ｎｍ）〜Ｃ線（６５６．２７ｎｍ）の波長域で収差補正を行うのが一般的であった。よって、近年では重要になっている４０５ｎｍでの収差補正が十分でない場合があった。
【０００９】
また、従来のアポクロマート対物レンズは目視による観察を想定したものが多く、最近のレーザ走査型顕微鏡の解像度に対応しきれていない場合があった。
また、対物レンズの軸上色収差に起因して、対物レンズに入射する照明光の大きさによって集光位置が異なる場合があった。例えば、対物レンズの瞳を完全に満たす照明光束の場合と、対物レンズの瞳を完全には満たさない照明光束の場合では、照明光束の集光する位置が異なる。この現象は従来の対物レンズでは、ＮＡに対する球面収差量の特性が波長ごとに異なることによって起きていた。
【００１０】
これにより、複数の波長の蛍光タグを同時に使用した場合、本来同じ場所にある複数の蛍光タグが、対物レンズの軸上色収差や倍率色収差に起因して、異なる場所にあるという間違った結果が観測される場合があった。或いは、本来異なる場所にある複数の蛍光タグが、対物レンズの軸上色収差や倍率色収差に起因して、同じ場所にあるという間違った結果が観測される場合があった。
【００１１】
本発明の目的は、複数の蛍光タグを用いて観察する場合でも最適な蛍光観察装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、光源と、該光源からの光線を選択的に反射する光線分離手段と、試料を照明または観察する対物レンズと、試料を固定するステージと、該光線分離手段を通過した光線のうち所望の波長領域を選択する波長選択手段と、該波長選択手段を通過する光を検出する検出器を備えた蛍光観察装置において、２つ以上の波長で試料の照明を行ったときに得られる散乱または蛍光による２つ以上の波長を検出し、該照明における励起波長のうちで最も長波長側のものをλ１、最も短波長側のものをλ２とし、Δ１とΔ２をλ１とλ２の軸上の集光位置としたときに、以下の条件を満たすことを特徴とする蛍光観察装置によっても特徴付けられる。
（１１） λ１−λ２≧180nm
（１２） ｜Δ１−Δ２｜＜0.2μｍ
（１１）と（１２）式を満たすことができれば、試料内を複数の蛍光タグで染色しても色収差は無視できるレベルとなる。
【００１３】
さらに、以下の条件を満たすことが望ましい。
（１３） λ２≦442nm
近年蛍光タグには短波長側の刺激光を与えると特性が変化するフォトアクチベーション蛍光タグが用いられるようになっている。たとえばカエデやＰＡ−ＧＦＰなどのフォトコンバージョン蛍光たんぱく質では４０５ｎｍの波長を用いることが一般的である。また、４４２ｎｍはＣＦＰ−ＹＦＰの蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の観察などで用いられるため、（１３）式を満たすとフォトアクチベーションや蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の観察に対応することが可能となる。
【００１４】
さらに、以下の条件を満たすことが望ましい。
（１４） ｜δ１−δ２｜≦0.3μｍ
ここでδ１とδ２はそれぞれλ１とλ２の視野数９での倍率の色収差を示す。
【００１５】
このとき、前記対物レンズは、物体側より順に正のレンズ群Ｇａと正のレンズ群Ｇｂとレンズ群Ｇｃとレンズ群Ｇｄとレンズ群Ｇｅとから構成され、前記正のレンズ群Ｇａは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズを接合した接合レンズと正の単レンズとを含み、前記正のレンズ群Ｇｂは、接合レンズからなり、前記レンズ群Ｇｃは、少なくとも１つ以上の接合レンズを含み、前記レンズ群Ｇｄは、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状のものであり、前記レンズ群Ｇｅは、物体側に強い凹面を向けた負レンズを含み、前記レンズ群Ｇｂは正レンズと負レンズと正レンズとの３枚接合であることが考えられる。この構成の対物レンズを蛍光観察装置に利用することが、課題解決の一手段である。
【００１６】
さらに、前記対物レンズが以下の条件を満たすことが望ましい。
（１） ０．５ ≦ Ｈ２／Ｈ１ ≦ ０．７５
（２） ７．８ ≦ ｆ（Ｇｂ）／ｆ ≦ ２０
さらに、前記対物レンズが単独で色収差を行っていることが望ましい。単独で色収差を補正した場合、組み合わせるユニット（結像光学系や照明光学系）を選択する自由度が増える。
【００１７】
本発明による蛍光観察装置において、該励起波長λ１とλ２で該試料の照明を行ったときの該検出器での検出結果より形成されるそれぞれ２つの画像を保存する画像保存手段と、該画像の重ね合せまたは差分または比率計算を行う画像解析手段とを備え、２つの画像の重ね合わせまたは差分または比率計算を行うことは好適である。
【００１８】
また、該励起波長λ１とλ２とで励起した画像を保存する画像保存手段と、該画像の重ね合せまたは差分または比率計算を行う画像解析手段を備え、複数の画像の重ね合わせまたは差分または比率計算により蛍光タグで染色した試料内分子の解析が容易になる。近年ＦＲＥＴのように複数の蛍光波長のレシオをとって分子解析することが多くなっている。この場合は本発明のような色収差が補正された蛍光観察装置が適している。
【００１９】
また、本発明の実施では、該ステージまたは該対物レンズが光軸方向に移動可能であり、
該試料と該対物レンズの間隔を複数変えて該試料の照明を行ったときの該検出器での検出結果より形成される画像を取得し、該取得された画像のうち該励起波長λ１、λ２で該試料の照明を行ったときの画像を各断面位置での画像保存位置に保存し、該試料と対物レンズの間隔が同じ位置で取得されたλ１、λ２の画像の演算を行うことが好適である。
【００２０】
色収差の補正された本システムでは試料の３次元像の構築に有効である。軸上色収差がある場合、λ１、λ２での光軸方向の像位置が光軸方向にずれてしまう。このためλ１、λ２の画像を重ね合わせる場合、従来では対物レンズの軸上色収差分の異なった断面位置の像の重ね合わせを必要としていた。本システムでは軸上色収差が無視できるほど小さいため、正確な３次元像構築が可能である。
【００２１】
本発明による蛍光観察装置において、試料面にビームスポットを走査する走査手段をもち、共焦点式の検出手段を持つことは好ましい。
本発明は軸上色収差を補正しているため、前述の通り、試料の３次元像を観察することに適している。このため、３次元的な検出が可能となる共焦点式の検出手段をもっていることが望ましい。
【００２２】
また、本発明の実施による蛍光観察装置において、該複数のレーザ光源を備え、該複数波長のレーザを同一光路上に合成し、１本のファイバで蛍光観察装置に導入することが望ましい。
【００２３】
通常レーザ光を顕微鏡に導入する場合は、システムレイアウトの自由度の高い光ファイバを用いることが多い。従来は、大きく異なる波長のレーザを顕微鏡に導入する場合に複数の光ファイバを用いることが多かった。波長が大きく異なることによる色収差はファイバの後段に配置されたコリメータの調整により補正可能であったが、各ファイバの調整が複雑であることが問題であった。近年に対応波長域の広い光ファイバが開発されてきた。この光ファイバを用いれば、本システムのような軸上色収差が十分補正されているシステムにきわめて有効である。
【００２４】
本発明の実施による蛍光観察装置において、複数の蛍光タグにより標識された試料において、λ１とλ２の励起波長により取得された画像を重ね合わせ出力するとこにより２つ以上の標識された試料内分子の位置情報を解析することは好適である。
【００２５】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）やフォトコンバージョンを使った観察の場合、２つの蛍光波長の重ね合わせ、またはその比率を求める必要がある。この場合、色収差があると画像の重ね合わせにずれが生じて、正確なデータが得られない可能性がある。本システムは異なる波長を重ね合わせた場合でも波長による位置ずれが少ないため、試料内の分子の正確な位置情報を得るのに優れている。
【００２６】
本発明の実施による蛍光観察装置において、λ１とλ２の励起波長により該試料の照明を行ったときの該検出器での検出結果より形成される画像を時間の経過に応じて複数取得し、該同一時刻に取得された時間経過のλ１とλ２における画像の比率を複数とることにより試料内の分子間の蛍光共鳴エネルギー移動を観察することは好適である。
【００２７】
従来の共焦点顕微鏡では試料の３次元像を得るときに問題となる対物レンズの色収差を、複数の蛍光像を重ね合わせするときに、光軸方向に異なる断面の画像を重ねて表示する場合があった。このようにすれば、静止した試料での３次元像を得るときには問題ないが、細胞内の分子移動を見る場合は光軸方向に異なる断面を見る必要があり、波長により時間差が生じる。このため、この従来の方法ではたとえば細胞内の速い分子運動を見ることはできない。しかし、本発明のような色収差が補正された蛍光観察装置では速い分子運度も観察することが可能となる。
【００２８】
さらに、２種類以上の蛍光タグを有するサンプルの画像を取得し、得られた画像の輝度情報をピクセル毎に２次元化し、プロットすることにより各分子の局在を推定する分子局在判定をすることも好ましい。
【００２９】
２種類以上の蛍光タグを有するサンプルの画像を取得し、得られた画像の輝度情報をピクセル毎に２次元化し、プロットすることにより各分子の局在を推定する方法はコローカリゼーションと呼ばれ、２つの分子が結合しているかどうかの判定に用いる。このような観察においても本発明の色収差が補正された本発明は優れている。
【００３０】
本発明の実施による蛍光観察装置において、ある波長による励起を行ったときの該検出器での検出結果より形成される試料画像をモニタ上に出力し、モニタ上に出力された試料像の一部の領域を指定し、指定部分のみ光を照射して蛍光退色を行い、指定領域内または指定領域外の蛍光像の時間変化を記録して試料内の分子拡散を検出することは好適である。
【００３１】
試料画像をある波長により取得し、モニタ上に出力し、モニタ上に出力された試料像の一部の領域を指定し、指定部分のみ光を照射して蛍光退色を行い、指定領域内または指定領域外の蛍光像の時間変化を記録して試料内の分子拡散を求める方法はＦＲＡＰと呼ばれる手法である。この手法においても本発明のような色収差が補正された蛍光観察装置は適している。
【００３２】
本発明の実施による蛍光観察装置において、試料画像をある波長による励起を行ったときの該検出器での検出結果より形成される試料画像をモニタ上に出力し、モニタ上に出力された試料像の一部の領域を指定し、指定部分のみ光を照射して試料内蛍光色素のアクチベーションを行い、指定領域内または指定領域外の蛍光像の時間変化を記録して試料内の分子分析を行うことは好適である。
【００３３】
前述の通り、カエデやＰＡ−ＧＦＰのように４０５ｎｍの波長の光を用いてフォトコンバージョンする蛍光たんぱく質を用いる場合でも本発明のような蛍光観察装置は色収差が少ないため優れている。
【００３４】
本発明の実施による蛍光観察装置において、試料内に複数の蛍光タグをつけた分子が存在し、複数の励起光を同時に照射し、得られる蛍光を分離してλ１、λ２に相当する蛍光波長を検出し、検出された蛍光の時間変化を記録し、蛍光相互相関分光法によって試料内分子の拡散速度を求めることは好適である。
【００３５】
蛍光の時間変化を記録し相関関数を計算する手法として代表的なものにＦＣＳとＦＣＣＳ呼ばれるものがある。この手法で複数の励起波長を用いて複数の蛍光波長を検出すると分子が結合しているかが分かる。この場合、試料への集光スポットが励起波長でずれがないことが必要のため、本発明の蛍光観察装置が適している。
【００３６】
なお、蛍光観察装置の対物レンズは、物体側より順に正のレンズ群Ｇａと正のレンズ群Ｇｂとレンズ群Ｇｃとレンズ群Ｇｄとレンズ群Ｇｅとから構成され、前記正のレンズ群Ｇａは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズを接合した接合レンズと正の単レンズとを含み、前記正のレンズ群Ｇｂは、接合レンズからなり、前記レンズ群Ｇｃは、少なくとも１つ以上の接合レンズを含み、前記レンズ群Ｇｄは、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状のものであり、前記レンズ群Ｇｅは、物体側に強い凹面を向けた負レンズを含み、Ｈ１をレンズ群Ｇｂから射出するマージナル光線の光線高、Ｈ２をレンズ群Ｇｄに入射するマージナル光線の光線高、ｆを対物レンズ全系の焦点距離、ｆ（Ｇｂ）をレンズ群Ｇｂの焦点距離、前記レンズ群Ｇｅは、物体側に強い凹面を向けた負レンズＬｅｎと、正レンズＬｅｐとを含み、νｄ（Ｌｅｎ）を負レンズＬｅｎのガラスのアッベ数、νｄ（Ｌｅｐ）を正レンズＬｅｐのガラスのアッベ数、Ｈ３を前記レンズ群Ｇｅから射出するマージナル光線の光線高としたときに、次の条件式（１），（２），（３）’，（６）を満足する液浸系顕微鏡対物レンズによって解決される。
（１） ０．５ ≦ Ｈ２／Ｈ１ ≦ ０．７５
（２） ７．８ ≦ ｜ ｆ（Ｇｂ）／ｆ ｜ ≦ ２０
（３）’ ４５ ≧ νｄ（Ｌｅｎ）−νｄ（Ｌｅｐ） ≧ ３０
（６） ０．５ ≦ Ｈ３／Ｈ１ ≦ ０．６５
条件式（１）は軸上色収差を良好に補正するための条件である。条件式（１）により、レンズ群Ｇｂからレンズ群Ｇｄへの光線高を規定し軸上色収差を補正しやすくしている。条件式（１）の下限を下回ると、レンズ群Ｇｂからレンズ群Ｇｄへの光線高が低くなりすぎて、像面湾曲やコマ収差を補正することが困難となる。条件式（１）の上限を超えると、レンズ群Ｇｂからレンズ群Ｇｄへの光線高が高くなりすぎて、軸上色収差を良好に補正することが困難となる。ここではマージナル光線は、対物レンズのＮＡにより決まる軸上従属光線の最も光線高の高いものとする。
【００３７】
条件式（２）は球面収差等の諸収差を良好に補正するための条件である。条件式（２）により、レンズ群Ｇｂのパワーを規定している。条件式（２）の下限を下回ると、レンズ群Ｇｂのパワーが強くなりすぎて、ここでの球面収差の発生量が大きくなりすぎる。条件式（２）の上限を超えると、レンズ群Ｇｂのパワーが弱くなりすぎて、条件式（１）を満たすことが困難となり、軸上色収差を良好に補正できなくなる。なお、次の条件式
（１）’ ０．５５ ≦ Ｈ２／Ｈ１ ≦ ０．７３
（２）’ ８ ≦ ｜ ｆ（Ｇｂ）／ｆ ｜ ≦ ２０
を満たすことがより好ましい。
【００３８】
条件式（３）’は、レンズ群Ｇｅの負レンズと正レンズのアッベ数の差を大きくし、倍率の色収差を補正するための条件である。条件式の下限値を下回ると、倍率の色収差が補正不足となる。対物レンズ単独で軸上色収差および倍率色収差を補正するコンペンゼーションフリー対物レンズは、組み合わせるユニット（結像光学系や照明光学系）を選択する自由度が増える。
条件式（６）は諸収差を良好に補正するための条件である。条件式（６）の下限値を下回ると、レンズ群Ｇａおよびレンズ群Ｇｂのパワーが弱くなりすぎ、レンズ群Ｇｃ以降の後群に強いパワーが必要となり、後群での諸収差の発生量が大きくなる。条件式の上限値を上回ると、レンズ群Ｇａおよびレンズ群Ｇｂのパワーが強くなりすぎ、レンズ群Ｇａおよびレンズ群Ｇｂでの諸収差の発生量が大きくなる。
【００３９】
前記正レンズＬｅｐの光学ガラスは、Ｎｂ２Ｏ５成分、或いは、Ｔａ２Ｏ５成分を含む光学ガラスであり、前記正レンズＬｅｐのｄ線の屈折率をｎｄ（Ｌｅｐ）としたとき、次の条件式
（４） １．６５ ≦ ｎｄ（Ｌｅｐ） ≦ １．８
（５） ２５ ≦ νｄ（Ｌｅｐ） ≦ ４１
を満足することが望ましい。
【００４０】
コマ収差や倍率の色収差を良好に補正するため、正レンズＬｅｐは屈折率が高く色分散の大きい（アッベ数νｄの小さい）光学ガラスを用いる必要がある。Ｎｂ２Ｏ５成分、或いは、Ｔａ２Ｏ５成分を含むこれらの光学ガラスは、屈折率が高く色分散が大きい。よって、コマ収差や倍率の色収差を良好に補正できる。更に、これらの光学ガラスは、自家蛍光が小さく、紫外域での透過率が高い。よって、蛍光観察時にコントラストが高く明るい観察が可能である。
【００４１】
なお、前記レンズ群Ｇｂは、正レンズと負レンズと正レンズとの３枚接合であることが望ましい。マージナル光線の光線高が高いレンズ群Ｇｂに３枚接合レンズを配置することで、軸上色収差を良好に補正できる。
【００４２】
また、前記正のレンズ群Ｇａは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズを接合した接合レンズＧ１と、物体側に凹面を向けた正のメニスカスレンズＧ２と、正の単レンズＧ３とからなり、ｆ（Ｇ１＋Ｇ２）を接合レンズＧ１とメニスカスレンズＧ２との合成焦点距離、ｆを対物レンズ全系の焦点距離、Ｄを接合レンズＧ１とメニスカスレンズＧ２との間のマージナル光線の長さとしたときに、次の条件式（７）（８）を満足する構成も好ましい。
（７） １ ≦ ｆ（Ｇ１＋Ｇ２）／ｆ ≦ ２
（８） Ｄ／ｆ ≦ ０．６
物体からの発散光束を収斂させるために、物体側のレンズ群は強いパワーを持つのが一般的である。特にＮＡが大きな液浸系対物レンズは、最も物体側のレンズ群は半球に近い形状を持つのが一般的である。しかし、最も物体側のレンズ群に大きな収斂パワーを持たせると、そこで発生する球面収差や軸上色収差が大きくなりすぎて補正が困難となる。本発明では、これまでは最も物体側のレンズ群のみに持たせていた強い収斂作用を、接合レンズＧ１とメニスカスレンズＧ２の２つのレンズ群に持たせることにより、収差の発生量を低減し、かつ、収差を補正するレンズ面を増やしている。
【００４３】
条件式（７）と（８）は、これらのレンズ群Ｇ１とＧ２について規定している。条件式（７）の下限を下回ると、レンズ群Ｇ１とＧ２のパワーが強くなりすぎ、ここでの球面収差量や軸上色収差量が増える。条件式（７）の上限を超えると、十分な収斂パワーが得られず、それ以後のレンズ群での光線高が上がり、球面収差や軸上色収差の補正が困難となる。条件式（８）の上限を超えると、レンズ群Ｇ１とＧ２の２つのレンズ群のパワーのバランスが保たれず、２つのレンズ群で従来の物体側レンズ群を代替するという目的を達成することができなくなる。なお、条件式（７）（８）を満たすことで、レンズ群Ｇ１が半球に近い形状になるのに加えて、レンズ群Ｇ２も半球に近い形状となる。すなわち球欠が深いレンズが２つある構成となる。この構成では、レンズ群Ｇ１の屈折力の負荷をレンズ群Ｇ２にも分担させることになり、レンズ群Ｇ１のレンズ厚の公差の影響をレンズ群Ｇ２に分散させることができ、レンズ群Ｇ１の加工性を良くする効果もある。
【００４４】
また、本発明の対物レンズの外形的特徴は、接合レンズＧ１の像側面の曲率半径が焦点距離ｆより小さく、かつ、メニスカスレンズＧ２の像側の曲率半径が焦点距離ｆの２倍よりも小さいことである。これらの特徴により、レンズ群Ｇ３以降の光線高を抑えることができ、高次の収差（球面収差、コマ収差）を補正しやすくしているのと同時に、全体のレンズの外径を小さくすることができレンズの加工性が向上している。
【００４５】
なお、前記レンズ群Ｇｃが光軸方向に移動可能であり、次の条件式（９）を満足することが望ましい。
（９） ｜ ｆ（Ｇｃ）／ｆ ｜ ≦ ５０
ただし、ｆは対物レンズ全系の焦点距離、ｆ（Ｇｃ）はレンズ群Ｇｃの焦点距離である。
【００４６】
生体細胞（屈折率１．３３〜１．４５）の深部を観察する場合、細胞とオイルの屈折率が近い方が屈折率の差による球面収差の発生を抑えることができる。ところが、オイルの屈折率を１．５１より低いものを使用すると、カバーガラス（ｎｄ＝１．５２４２６）との屈折率差が大きくなる。そのため、カバーガラスの厚みが０．１７ｍｍからずれた場合、大きな球面収差が発生する。条件式（９）は、カバーガラスの厚みによる球面収差や、生体細胞（ｎｄ＝１．３３〜１．４５）とオイルの屈折率差による球面収差を補正するための条件である。条件式（９）の上限を超えると、球面収差を十分に補正することができなくなる。
【００４７】
なお、条件式（９）の代わりに以下の条件式（１０）を満たすことも考えられる。
（１０） １０ ≦ ｜ｆ（Ｇｃ）／ｆ｜ ≦ ２０
を満たすことが望ましい。この条件式の下限値を下回ると、レンズ群Ｇｃのパワーが強くなりすぎて、レンズ群Ｇｃでの収差の発生量が大きくなる。更に、レンズ群Ｇｃの移動量が小さくなり、球面収差を補正する補正環の使用時に操作性が劣化する。
【発明の効果】
【００４８】
本発明によると、複数の蛍光タグを用いて観察する場合でも最適な蛍光観察装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】実施例１の対物レンズのレンズ断面図を示す。
【図２】実施例１の対物レンズの収差図を示す。
【図３】実施例２の対物レンズのレンズ断面図を示す。
【図４】実施例２の対物レンズの収差図を示す。
【図５】実施例３の対物レンズのレンズ断面図を示す。
【図６】実施例３の対物レンズの収差図を示す。
【図７】実施例４の対物レンズのレンズ断面図を示す。
【図８】実施例４の対物レンズの収差図を示す。
【図９】実施例５の対物レンズのレンズ断面図を示す。
【図１０】実施例５の対物レンズの収差図を示す。
【図１１】実施例６の対物レンズのレンズ断面図を示す。
【図１２】実施例６の対物レンズの収差図を示す。
【図１３】実施例７の対物レンズのレンズ断面図を示す。
【図１４】実施例７の対物レンズの収差図を示す。
【図１５】比較例１の対物レンズのレンズ断面図を示す。
【図１６】比較例１の対物レンズの収差図を示す。
【図１７】比較例２の対物レンズのレンズ断面図を示す。
【図１８】比較例２の対物レンズの収差図を示す。
【図１９】比較例３の対物レンズのレンズ断面図を示す。
【図２０】比較例３の対物レンズの収差図を示す。
【図２１】結像レンズＡのレンズ断面図を示す。
【図２２】結像レンズＢのレンズ断面図を示す。
【図２３】各実施例の物体面での各波長での軸上の集光位置を示す。
【図２４】対物レンズの軸上色収差の収差図の概略図を示す。
【図２５】照明光束の大きさの違いによる、各波長の集光位置の違いを表した概略図を示す。
【図２６】各実施例の物体面での視野数９の倍率の色収差を示す。
【図２７】従来技術のレーザ走査型鏡焦点顕微鏡を示す。
【図２８】本発明の実施によるレーザ走査型鏡焦点顕微鏡を示す。
【図２９】本発明の実施によるレーザ走査型鏡焦点顕微鏡を用いた画像処理システムを示す。
【図３０】本発明を利用した蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の観察例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
次に本発明の顕微鏡対物レンズの実施の形態を各実施例にもとづいて説明する。
ただし、実施例中において、ｓは各レンズ面の面番号、ｒは各レンズ面の曲率半径（単位ｍｍ）、ｄは各レンズ面間の間隔（単位ｍｍ）、ｎｄは各レンズのｄ線の屈折率、νｄは各レンズのｄ線におけるアッベ数である。また、βは倍率、ＮＡは開口数、ＷＤは作動距離（単位ｍｍ）、ｆは対物レンズ全系の焦点距離（単位ｍｍ）、ｆ(Ｇ１+Ｇ２)は第１レンズ群と第２レンズ群との合成焦点距離（単位ｍｍ）、ｆ（Ｇａ）〜ｆ（Ｇｅ）はレンズ群Ｇａ〜レンズ群Ｇｅの各レンズ群の焦点距離（単位ｍｍ）、Ｈ１はレンズ群Ｇｂから射出するマージナル光線の光線高（単位ｍｍ）、Ｈ２はレンズ群Ｇｄに入射するマージナル光線の光線高（単位ｍｍ）、Ｈ３は対物レンズ射出側のマージナル光線の光線高（単位ｍｍ）である。
【００５１】
下記の各実施例で用いられる光学ガラスは、紫外域での透過率が優れ、自家蛍光の少ない光学ガラスを選択しており、各実施例は蛍光観察に最適な対物レンズとなっている。また、各光学ガラスは、環境対応ガラス（鉛フリーガラス）を選択しており、各実施例は環境に配慮した対物レンズとなっている。
【００５２】
なお、各媒質の各波長の屈折率は以下のとおりである。
【００５３】
【表１】
また、各実施例は、対物レンズからの射出光が平行光束となる無限遠補正型の対物レンズであり、それ自身では結像しない。そこで、例えば以下の結像レンズＡ（焦点距離１８０ｍｍ）、あるいは、結像レンズＢ（焦点距離１８０ｍｍ）と組み合わせて使用される。ただし、図２１は結像レンズＡの断面図を示し、図２２は結像レンズＢの断面図を示す。
（結像レンズＡ）
【００５４】
【表２】
（結像レンズＢ）
【００５５】
【表３】
結像レンズＡと組み合わせる場合は、各実施例の対物レンズと結像レンズＡの間の間隔は５０ｍｍ〜１７０ｍｍの間のいずれの位置でもよい。結像レンズＢと組み合わせる場合は、実施例の対物レンズと結像レンズＢの間の間隔は５０ｍｍ〜２５０ｍｍの間のいずれの位置でもよい。また、以下で示される各実施例の収差図は、結像レンズＡとの間隔を１２０ｍｍで組み合わせた場合のものである。
【００５６】
ただし、収差図の光線追跡は、結像面（受光面）から物体面（試料面）への方向で行い、物体面での収差を表示している。また、（ａ）は球面収差、（ｂ）は正弦条件違反量、（ｃ）は非点収差、（ｄ）はコマ収差を示す。これらの収差図から、本発明の対物レンズは４０５ｎｍから６５６ｎｍまで、軸上色収差、倍率色収差等の収差が良好に補正されていることが分かる。
【実施例１】
【００５７】
本発明の実施例１は、図１に示す通りの構成である。つまり、物体側より順に正のレンズ群Ｇａと正のレンズ群Ｇｂとレンズ群Ｇｃとレンズ群Ｇｄとレンズ群Ｇｅとから構成される。正のレンズ群Ｇａは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズからなる接合レンズＧ１と、正の単レンズＧ２とによって構成される。正のレンズ群Ｇｂは正レンズと負レンズと正レンズとからなる３枚接合レンズＧ３からなる。レンズ群Ｇｃは、負レンズと正レンズとからなる接合レンズＧ４と、正レンズと負レンズとからなる接合レンズＧ５とにより構成される。レンズ群Ｇｄは正レンズと負レンズとからなる接合レンズＧ６からなり、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状をしている。レンズ群Ｇｅは物体側に強い凹面を向けた負レンズＧ７と正レンズＧ８とにより構成されている。
【００５８】
この実施例１のレンズデータは下記の通りである。実施例１の対物レンズは、ｎｄ＝１．５１４８３，νｄ＝４１．０の液浸液を使用する。この液浸液は、従来から使用されている顕微鏡対物レンズ用オイルである。
【００５９】
【表４】
β＝ ６０×、ＮＡ ＝ １．４、視野数＝ ２２、ＷＤ ＝ ０．１６、ｆ ＝ ３
ｆ(Ｇａ) ＝ ４．８０９
ｆ(Ｇｂ) ＝ ２７．６５６
ｆ(Ｇｃ) ＝ １５６．４９１
ｆ(Ｇｄ) ＝ −９７．４３２
ｆ(Ｇｅ) ＝ −３２．３５９
ｆ(Ｇａ)／ｆ ＝ １．６０
ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ ９．２２
ｆ(Ｇｃ)／ｆ ＝ ５２．１６
ｆ(Ｇｄ)／ｆ ＝ −３２．４８
ｆ(Ｇｅ)／ｆ ＝ −１０．７９
Ｈ１ ＝ ７．２７
Ｈ２ ＝ ５．２
Ｈ３ ＝ ４．２
νｄ（Ｌｅｎ） ＝ ６３．３
νｄ（Ｌｅｐ） ＝ ２９．８
ｎｄ(Ｌｅｎ) ＝ １．６１８００
ｎｄ(Ｌｅｐ) ＝ １．８００００
(１) Ｈ２／Ｈ１ ＝ ０．７２
(２) ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ ９．２２
(３) νｄ(Ｌｅｎ)−νｄ(Ｌｅｐ) ＝ ３３．５
(６) Ｈ３／Ｈ１ ＝ ０．５８
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を４０５ｎｍから６５６ｎｍまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図２によって示される。
【実施例２】
【００６０】
本発明の実施例２は、図３に示す通りの構成である。つまり、物体側より順に正のレンズ群Ｇａと正のレンズ群Ｇｂとレンズ群Ｇｃとレンズ群Ｇｄとレンズ群Ｇｅとから構成される。正のレンズ群Ｇａは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズからなる接合レンズＧ１と、正の単レンズＧ２とによって構成される。正のレンズ群Ｇｂは正レンズと負レンズと正レンズとからなる３枚接合レンズＧ３からなる。レンズ群Ｇｃは、負レンズと正レンズとからなる接合レンズＧ４と、正レンズと負レンズとからなる接合レンズＧ５とにより構成される。レンズ群Ｇｄは正レンズと負レンズとからなる接合レンズＧ６からなり、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状をしている。レンズ群Ｇｅは物体側に強い凹面を向けた負レンズＧ７と正レンズＧ８とにより構成されている。
【００６１】
この実施例２のレンズデータは下記の通りである。実施例２の対物レンズは、ｎｄ＝１．５１４８３，νｄ＝４１．０の液浸液を使用する。この液浸液は、従来から使用されている顕微鏡対物レンズ用オイルである。
【００６２】
【表５】
β ＝ ６０×、ＮＡ ＝ １．４、視野数＝ ２２、ＷＤ ＝ ０．１６、ｆ ＝ ３
ｆ(Ｇａ) ＝ ４．５８７
ｆ(Ｇｂ) ＝ ２８．０１４
ｆ(Ｇｃ) ＝ １５８．７３５
ｆ(Ｇｄ) ＝ −６８．５１９
ｆ(Ｇｅ) ＝ −３６．４５２
ｆ(Ｇａ)／ｆ ＝ １．５３
ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ ９．３４
ｆ(Ｇｃ)／ｆ ＝ ５２．９１
ｆ(Ｇｄ)／ｆ ＝ −２２．８４
ｆ(Ｇｅ)／ｆ ＝ −１２．１５
Ｈ１ ＝ ６．９１
Ｈ２ ＝ ４．７２
Ｈ３ ＝ ４．２
νｄ（Ｌｅｎ） ＝ ７０．３
νｄ（Ｌｅｐ） ＝ ２９．８
ｎｄ(Ｌｅｎ) ＝ １．４８７４５
ｎｄ(Ｌｅｐ) ＝ １．８００００
(１) Ｈ２／Ｈ１ ＝ ０．６８
(２) ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ ９．３４
(３) νｄ(Ｌｅｎ)−νｄ(Ｌｅｐ) ＝ ４０．５
(６) Ｈ３／Ｈ１ ＝ ０．６１
(９) ｜ｆ(Ｇｃ)／ｆ｜ ＝ ５２．９
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を４０５ｎｍから６５６ｎｍまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図４によって示される。
【実施例３】
【００６３】
本発明の実施例３は、図５に示す通りの構成である。つまり、物体側より順に正のレンズ群Ｇａと正のレンズ群Ｇｂとレンズ群Ｇｃとレンズ群Ｇｄとレンズ群Ｇｅとから構成される。正のレンズ群Ｇａは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズからなる接合レンズＧ１と、正の単レンズＧ２と、正の単レンズＧ３と、によって構成される。正のレンズ群Ｇｂは正レンズと負レンズと正レンズとからなる３枚接合レンズＧ４からなる。レンズ群Ｇｃは、負レンズと正レンズとからなる接合レンズＧ５と、正レンズと負レンズとからなる接合レンズＧ６とにより構成される。レンズ群Ｇｄは正レンズと負レンズとからなる接合レンズＧ７からなり、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状をしている。レンズ群Ｇｅは物体側に強い凹面を向けた負レンズと正レンズとからなる接合レンズＧ８により構成されている。
【００６４】
この実施例３のレンズデータは下記の通りである。実施例３の対物レンズは、ｎｄ＝１．５１４８３，νｄ＝４１．０の液浸液を使用する。この液浸液は、従来から使用されている顕微鏡対物レンズ用オイルである。
【００６５】
【表６】
β＝ ６０×、ＮＡ ＝ １．４、視野数＝ ２２、ＷＤ ＝ ０．１６、ｆ ＝ ３
ｆ(Ｇａ) ＝ ４．０５７
ｆ(Ｇｂ) ＝ ５５．１３２
ｆ(Ｇｃ) ＝ ４２４．９２９
ｆ(Ｇｄ) ＝ −１４．７０６
ｆ(Ｇｅ) ＝ ４２５．４５９
ｆ(Ｇａ)／ｆ ＝ １．３５
ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ １８．３８
ｆ(Ｇｃ)／ｆ ＝ １４１．６４
ｆ(Ｇｄ)／ｆ ＝ −４．９０
ｆ(Ｇｅ)／ｆ ＝ １４１．８２
Ｈ１ ＝ ６．７
Ｈ２ ＝ ４．１９
Ｈ３ ＝ ４．２
νｄ（Ｌｅｎ） ＝ ７０．３
νｄ（Ｌｅｐ） ＝ ３２．２
ｎｄ(Ｌｅｎ) ＝ １．４８７４５
ｎｄ(Ｌｅｐ) ＝ １．７３８００
(１) Ｈ２／Ｈ１ ＝ ０．６３
(２) ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ １８．３８
(３) νｄ(Ｌｅｎ)−νｄ(Ｌｅｐ) ＝ ３８．１
(６) Ｈ３／Ｈ１ ＝ ０．６３
(９) ｜ｆ(Ｇｃ)／ｆ｜＝ １４１．６
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を４０５ｎｍから６５６ｎｍまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図６によって示される。
【実施例４】
【００６６】
本発明の実施例４は、図７に示す通りの構成である。つまり、物体側より順に正のレンズ群Ｇａと正のレンズ群Ｇｂとレンズ群Ｇｃとレンズ群Ｇｄとレンズ群Ｇｅとから構成される。正のレンズ群Ｇａは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズとからなる接合レンズＧ１と、正の単レンズＧ２と、正の単レンズＧ３と、によって構成される。正のレンズ群Ｇｂは正レンズと負レンズと正レンズとからなる３枚接合レンズＧ４からなる。レンズ群Ｇｃは、負レンズと正レンズとからなる接合レンズＧ５と、正レンズと負レンズとからなる接合レンズＧ６とにより構成される。レンズ群Ｇｄは正レンズと負レンズとからなる接合レンズＧ７からなり、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状をしている。レンズ群Ｇｅは物体側に強い凹面を向けた負レンズと正レンズとからなる接合レンズＧ８により構成されている。
【００６７】
この実施例４のレンズデータは下記の通りである。実施例４の対物レンズは、ｎｄ＝１．５１４８３，νｄ＝４１．０の液浸液を使用する。この液浸液は、従来から使用されている顕微鏡対物レンズ用オイルである。
【００６８】
【表７】
β＝ ６０×、ＮＡ ＝ １．４、視野数＝ ２２、ＷＤ ＝ ０．１６、ｆ ＝ ３
ｆ(Ｇａ) ＝ ４．１７８
ｆ(Ｇｂ) ＝ ３９．８１４
ｆ(Ｇｃ) ＝ １３３．７５１
ｆ(Ｇｄ) ＝ −１３．１４２
ｆ(Ｇｅ) ＝ ３５０．７２６
ｆ(Ｇａ)／ｆ ＝ １．３９
ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ １３．２７
ｆ(Ｇｃ)／ｆ ＝ ４４．５８
ｆ(Ｇｄ)／ｆ ＝ −４．３８
ｆ(Ｇｅ)／ｆ ＝ １１６．９１
Ｈ１ ＝ ６．９６
Ｈ２ ＝ ４．１
Ｈ３ ＝ ４．２
νｄ（Ｌｅｎ） ＝ ７０．３
νｄ（Ｌｅｐ） ＝ ３２．２
ｎｄ(Ｌｅｎ) ＝ １．４８７４５
ｎｄ(Ｌｅｐ) ＝ １．７３８００
(１) Ｈ２／Ｈ１ ＝ ０．５９
(２) ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ １３．２７
(３) νｄ(Ｌｅｎ)−νｄ(Ｌｅｐ) ＝ ３８．１
(６) Ｈ３／Ｈ１ ＝ ０．６０
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を４０５ｎｍから６５６ｎｍまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図８によって示される。
【実施例５】
【００６９】
本発明の実施例５は、図９に示す通りの構成である。つまり、物体側より順に正のレンズ群Ｇａと正のレンズ群Ｇｂとレンズ群Ｇｃとレンズ群Ｇｄとレンズ群Ｇｅとから構成される。正のレンズ群Ｇａは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズとからなる接合レンズＧ１と、正の単レンズＧ２とによって構成される。正のレンズ群Ｇｂは正レンズと負レンズと正レンズとからなる３枚接合レンズＧ３からなる。レンズ群Ｇｃは、負レンズと正レンズとからなる接合レンズＧ４と、正レンズと負レンズからなる接合レンズＧ５とにより構成される。レンズ群Ｇｄは正レンズと負レンズとからなる接合レンズＧ６からなり、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状をしている。レンズ群Ｇｅは物体側に強い凹面を向けた負レンズＧ７と正レンズＧ８とにより構成されている。レンズ群Ｇｃは光軸方向に移動可能である。
【００７０】
この実施例５のデータは下記の通りである。実施例５の対物レンズは、ｎｄ＝１．４０４３０，νｄ＝５２．０の液浸液を使用する。この液浸液は、シリコーンオイルである。シリコーンオイルの屈折率は、生体細胞（ｎｄ＝１．３３〜１．４５）の屈折率に近く、生体細胞との屈折率ミスマッチが少ない。そのため、シリコーンオイルを用いた対物レンズは、生体細胞の深いところまで鮮明に見えるという利点がある。また、自家蛍光が少なく、蛍光観察に適している。また、揮発しにくく、屈折率の変化が少ないため、長時間の観察に適している。一方、一般的に用いられているグリセリン液浸液や、グリセリンと水の混合液の液浸液は、長時間の観察に不適である。なぜなら、グリセリンは吸湿性のために時間とともに屈折率が変化するためである。
【００７１】
【表８】
β＝６０×、ＮＡ＝１．３、視野数＝２２、ＷＤ＝０．３２、ｆ＝３
ｆ(Ｇａ) ＝ ５．００６
ｆ(Ｇｂ) ＝ ２８．１５９
ｆ(Ｇｃ) ＝ −４３．１８４
ｆ(Ｇｄ) ＝ ３４．１０４
ｆ(Ｇｅ) ＝ −６８．７４６
ｆ(Ｇａ)／ｆ ＝ １．６７
ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ ９．３９
ｆ(Ｇｃ)／ｆ ＝ −１４．３９
ｆ(Ｇｄ)／ｆ ＝ １１．３７
ｆ(Ｇｅ)／ｆ ＝ −２２．９２
Ｈ１ ＝ ７．３２
Ｈ２ ＝ ４．４９
Ｈ３ ＝ ３．９
νｄ（Ｌｅｎ） ＝ ６４．２
νｄ（Ｌｅｐ） ＝ ３２．２
ｎｄ(Ｌｅｎ) ＝ １．５１６３０
ｎｄ(Ｌｅｐ) ＝ １．７３８００
(１) Ｈ２／Ｈ１ ＝ ０．６１
(２) ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ ９．３９
(３) νｄ(Ｌｅｎ)−νｄ(Ｌｅｐ) ＝ ３２．０
(６) Ｈ３／Ｈ１ ＝ ０．５３
(９) ｜ｆ(Ｇｃ)／ｆ｜ ＝ １４．４
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を４０５ｎｍから６５６ｎｍまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図１０によって示される。
【実施例６】
【００７２】
本発明の実施例６は、図１１に示す通りの構成である。つまり、物体側より順に正のレンズ群Ｇａと正のレンズ群Ｇｂとレンズ群Ｇｃとレンズ群Ｇｄとレンズ群Ｇｅとから構成される。正のレンズ群Ｇａは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズとを接合した接合レンズＧ１と、物体側に凹面を向けた正のメニスカスレンズＧ２と、正の単レンズＧ３とによって構成される。正のレンズ群Ｇｂは正レンズと負レンズと正レンズとからなる３枚接合レンズＧ４からなる。レンズ群Ｇｃは正レンズと負レンズとからなる接合レンズＧ５と、正レンズと負レンズとからなる接合レンズＧ６により構成される。レンズ群Ｇｄは正レンズと負レンズとからなる接合レンズＧ７からなり、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状をしている。レンズ群Ｇｅは物体側に強い凹面を向けた負レンズと正レンズとからなる接合レンズＧ８により構成されている。
【００７３】
図１１から読み取れるように、本実施例は最も物体側のレンズ群Ｇａに特徴的な形状を持っている。一般にＮＡが大きな液浸系の対物レンズはこの部分のレンズ群が半球に近い形状をもつ。しかし本実施例では、これを２つの半球状のレンズを含むことが形態上の特徴の一つとなっている。この形態により、レンズ群Ｇａによって発生する収差量を低減させている。また、接合レンズＧ１の像側面の曲率半径は焦点距離ｆより小さく、かつ、メニスカスレンズＧ２の像側の曲率半径は焦点距離ｆの２倍よりも小さい。これらの特徴により、レンズ群Ｇ３以降の光線高を抑えることができ、高次の収差（球面収差、コマ収差）を補正しやすくしているのと同時に、全体のレンズの外径を小さくすることができレンズの加工性が向上している。
【００７４】
この実施例１のデータは下記の通りである。実施例６の対物レンズは、ｎｄ＝１．５１４８３，νｄ＝４１．０の液浸液を使用する。この液浸液は、従来から使用されている顕微鏡対物レンズ用オイルである。
【００７５】
【表９】
β＝６０×、ＮＡ＝１．４、視野数＝２２、ＷＤ＝０．１６、ｆ＝３
ｆ(Ｇａ) ＝ ４．８３５
ｆ(Ｇｂ) ＝ ２４．１００
ｆ(Ｇｃ) ＝ −６６．７７０
ｆ(Ｇｄ) ＝ −３０．１５３
ｆ(Ｇｅ) ＝ −４３６．８０９
ｆ(Ｇａ)／ｆ ＝ １．６１
ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ ８．０３
ｆ(Ｇｃ)／ｆ ＝ −２２．２６
ｆ(Ｇｄ)／ｆ ＝ −１０．０５
ｆ(Ｇｅ)／ｆ ＝ −１４５．６０
ｆ(Ｇ１＋Ｇ２) ＝ ５．７４０
Ｈ１ ＝ ７．１２
Ｈ２ ＝ ４．４７
Ｈ３ ＝ ４．２
Ｄ ＝ １．３３
νｄ（Ｌｅｎ） ＝ ６４．２
νｄ（Ｌｅｐ） ＝ ２９．８
ｎｄ(Ｌｅｎ) ＝ １．５１６３０
ｎｄ(Ｌｅｐ) ＝ １．８００００
(１) Ｈ２／Ｈ１ ＝ ０．６３
(２) ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ ８．０３
(３) νｄ(Ｌｅｎ)−νｄ(Ｌｅｐ) ＝ ３４．４
(６) Ｈ３／Ｈ１ ＝ ０．５９
(７) ｆ(Ｇ１＋Ｇ２)／ｆ ＝ １．９１
(８) Ｄ／ｆ ＝ ０．４４
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を４０５ｎｍから６５６ｎｍまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図１２によって示される。
【実施例７】
【００７６】
本発明の実施例７は、図１３に示す通りの構成である。つまり、物体側より順に正のレンズ群Ｇａと正のレンズ群Ｇｂとレンズ群Ｇｃとレンズ群Ｇｄとレンズ群Ｇｅとから構成される。正のレンズ群Ｇａは、物体側に平面を向けた平凸レンズと物体側に凹面を向けたメニスカスレンズとを接合した接合レンズＧ１と、物体側に凹面を向けた正のメニスカスレンズＧ２と、正の単レンズＧ３とによって構成される。正のレンズ群Ｇｂは正レンズと負レンズと正レンズとからなる３枚接合レンズＧ４からなる。レンズ群Ｇｃは正レンズと負レンズからなる接合レンズＧ５と正レンズと負レンズからなる接合レンズＧ６により構成される。レンズ群Ｇｄは正レンズと負レンズとからなる接合レンズＧ７からなり、像側に強い凹面を向けたメニスカス形状をしている。レンズ群Ｇｅは物体側に強い凹面を向けた負レンズと正レンズとからなる接合レンズＧ８により構成されている。
【００７７】
図１３から読み取れるように、本実施例も最も物体側のレンズ群Ｇａに特徴的な形状を持っている。本実施例でもレンズ群Ｇａに２つの半球状のレンズを含むことが形態上の特徴の一つとなっている。この形態により、レンズ群Ｇａによって発生する収差量を低減させている。また、接合レンズＧ１の像側面の曲率半径は焦点距離ｆより小さく、かつ、メニスカスレンズＧ２の像側の曲率半径は焦点距離ｆの２倍よりも小さい。これらの特徴により、レンズ群Ｇ３以降の光線高を抑えることができ、高次の収差（球面収差、コマ収差）を補正しやすくしているのと同時に、全体のレンズの外径を小さくすることができレンズの加工性が向上している。
【００７８】
この実施例７のレンズデータは下記の通りである。実施例７の対物レンズは、ｎｄ＝１．５１４８３，νｄ＝４１．０の液浸液を使用する。この液浸液は、従来から使用されている顕微鏡対物レンズ用オイルである。
【００７９】
【表１０】
β＝６０×、ＮＡ＝１．４、視野数＝２２、ＷＤ＝０．１６、ｆ＝３
ｆ(Ｇａ) ＝ ３．９７３
ｆ(Ｇｂ) ＝ ２８．９６７
ｆ(Ｇｃ) ＝ ３７５６．６１７
ｆ(Ｇｄ) ＝ −１９．２３５
ｆ(Ｇｅ) ＝ ６７１．６９５
ｆ(Ｇａ)／ｆ ＝ １．３２
ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ ９．６６
ｆ(Ｇｃ)／ｆ ＝ １２５２．２１
ｆ(Ｇｄ)／ｆ ＝ −６．４１
ｆ(Ｇｅ)／ｆ ＝ ２２３．９０
ｆ(Ｇ１＋Ｇ２) ＝ ４．５
Ｈ１ ＝ ７．０１
Ｈ２ ＝ ４．１６
Ｈ３ ＝ ４．２
Ｄ ＝ １．３
νｄ（Ｌｅｎ） ＝ ７０．３
νｄ（Ｌｅｐ） ＝ ３２．２
ｎｄ(Ｌｅｎ) ＝ １．４８７４５
ｎｄ(Ｌｅｐ) ＝ １．７３８００
(１) Ｈ２／Ｈ１ ＝ ０．５９
(２) ｆ(Ｇｂ)／ｆ ＝ ９．６６
(３) νｄ(Ｌｅｎ)−νｄ(Ｌｅｐ) ＝ ３８．１
(６) Ｈ３／Ｈ１ ＝ ０．６０
(７) ｆ(Ｇ１＋Ｇ２)／ｆ ＝ １．５０
(８) Ｄ／ｆ ＝ ０．４３
上記のような構成によって、本実施例では色収差及び諸収差を４０５ｎｍから６５６ｎｍまでの波長域で収差補正を補正している。その補正の様子は、図１４によって示される。
【００８０】
ここで上記実施例１から７における、４００ｎｍから７００ｎｍまでの軸上色収差を図２３に示す。また、従来技術との比較のために、特許文献１と特許文献２に記載の対物レンズも併記した。図２３における、比較例１は特許文献１における実施例１に記載の対物レンズであり、比較例２は特許文献１における実施例２に記載の対物レンズであり、比較例３は特許文献２における実施例４に記載の対物レンズである。なお、比較例１のレンズ断面図は図１５に記載され、収差図は図１６に記載されている。比較例２のレンズ断面図は図１７に記載され、収差図は図１８に記載されている。比較例３のレンズ断面図は図１９に記載され、収差図は図２０に記載されている。
【００８１】
この図２３はｅ線（５４６．０７ｎｍ）を基準とした場合の、各波長での物体面での軸上の集光位置を表している。横軸は波長（ｎｍ）であり、縦軸はｅ線（５４６．０７ｎｍ）を基準位置とした場合の各波長における集光位置のずれである。
【００８２】
図２３から解るように、本発明の対物レンズは軸上色収差が良好に補正されており、４００〜７００ｎｍにおいて、各波長の集光位置のずれが０．１μｍ（０．０００１ｍｍ）以内に収まっている。このことは、本発明の対物レンズが多波長観察に対して非常に有効に機能することを意味している。
【００８３】
また、各実施例の収差図（図２、図４、図６、図８、図１０、図１２、図１４）と各比較例の収差図（図１６、図１８、図２０）を比較すると解るように、本発明の実施例は球面収差の補正の仕方にも特徴を持つ。本願実施例の対物レンズは図２４（ｂ）のように、各波長ですべてのＮＡに渡って均等に球面収差を補正している。一方、従来技術である比較例では図２４（ａ）のように、ＮＡに関して球面収差が正の部分と負の部分があり、それらが相殺することによって、波長ごとの集光位置がほぼ等しく補正される。
【００８４】
上述の従来技術のような収差補正をした場合、対物レンズのＮＡの利用に偏りがある場合に大きな影響が生じる。例えばこのような影響は、対物レンズのＮＡを絞ったときや、ガウス分布をもったレーザ光を対物レンズに入射した場合に現れる。
【００８５】
図２５はこの現象を説明するための図である。同図に説明されるように、一般的な従来の対物レンズでは、ＮＡの大きい位置からの光線は波長によらずほぼ同じ位置に集光されるように色収差を補正されているが、ＮＡの小さい位置での光線は波長ごとに異なる位置に集光してしまう。この現象の直接的な原因が、従来技術における図２４（ａ）のような球面収差の補正の仕方である。
【００８６】
一方、本発明の実施による対物レンズでは、図２４（ｂ）のように、球面収差が各波長ですべてのＮＡに渡って均等に球面収差を補正しているので、対物レンズのＮＡの利用に偏りがある場合でも影響が少ない。すなわち、本発明による対物レンズは、ガウシアンビームを対物レンズに入射して利用するレーザ走査型顕微鏡に対して非常に好適である。
【００８７】
図２６は実施例１から７および比較例１から３の倍率の色収差を示している。この図は、波長４８８ｎｍを基準とした場合の、視野数９における倍率の色収差を表している。横軸は波長（ｎｍ）であり、縦軸は各波長の基準位置からの集光位置のずれである。なお、本発明の実施例はすべて６０倍であるので、視野数９は物体面で物体高０．０７５ｍｍに相当する。
【００８８】
同図から読み取れるように、本発明の実施例では倍率の色収差も良好に補正されており、各波長での色収差が０．３μｍ（０．０００３ｍｍ）以内に収まっている。
以下では本願発明の実施の形態をレーザ走査型顕微鏡の装置の視点から説明する。
【００８９】
図２７は従来のレーザ走査型顕微鏡の構成図を示す。従来のレーザ走査型顕微鏡では可視光レーザ２として例えばアルゴンイオンレーザ（波長488ｎｍ）とＨｅ−Ｎｅグリーンレーザ（波長543ｎｍ）とＨｅ−Ｎｅレーザ（波長633ｎｍ）を用いた場合、これらのレーザをダイクロイックミラー４で同一光路に合成し、集光レンズ６でシングルモードファイバ８に集光させる。シングルモードファイバはＮＡが０．１程度であり、コア径が数μｍの大きさになっているので、レーザ光をファイバに入れるのは厳密な調整が必要となる。このため、ファイバへのレーザ光の傾きと横ずれを調整するファイバカップリング機構７を備えている。
【００９０】
このとき、例えば波長405ｎｍのレーザなどをさらに用いる場合は短波用レーザ１として別なファイバを用いてレーザ走査型顕微鏡に導入し、後段のダイクロイックミラー１２によって合成させることが従来では多かった。これは対物レンズ１８の色収差をファイバ後のコリメータレンズ１０により調整していたためである。この様な調節していた理由は、従来の対物レンズでは色収差を補正している波長域が十分ではないので波長405ｎｍなどのレーザを使う場合には特別な方法を採用しなければいけなかったのである。
【００９１】
しかし、対物レンズはそれぞれが異なる色収差をもつので、この方法ではすべての対物レンズで対応することが非常に難しいという問題点がある。光ファイバはコア径が数ミクロンと非常に小さいため、顕微鏡への導入時のファイバの平行出しと傾け調整は非常に精密なファイバ傾き位置合わせ機構９の調整が必要となる。そのために、従来のレーザ走査型顕微鏡はこの調整が複雑であった。
【００９２】
本発明のレーザ走査型顕微鏡の実施例を図２８に示す。本発明の対物レンズは４０５ｎｍから６５６ｎｍまでの波長域で色収差が補正されているため、短波長側のレーザと可視レーザは同一の光で入射させることが可能となる。このため、１本のファイバ８を用いる。このファイバは使用波長域が広い光ファイバが適している。
【００９３】
ファイバ８からの光線はコリメータレンズ１０により平行光線となり、ミラーやダイクロイックミラーにより可視光レーザと短波長側レーザは同一光路に合成され、ダイクロイックミラー１３で反射される。ダイクロイックミラーで反射後のレーザ光はガルバノミラー１４でスキャンされ、瞳投影レンズ１５、結像レンズ１６によりリレーされ、対物レンズに入射する。試料からの蛍光は逆の光路を通り、ダイクロイックミラー１３を通過し、結像レンズ２０によって共焦点効果を出すためのピンホール１９に集光させる。そしてピンホール１９を通過することができた蛍光をダイクロイックミラー２１を使い分光した後、バリアフィルタ２３により所望の波長域の蛍光を光検出器２４で検出する。なお、符号３、５、１１、１７、２２は光路を曲げるためのミラーである。
【００９４】
また、ダイクロイックミラー１３は切り替えをすることなく複数の波長のレーザを反射することができるマルチバンドタイプのダイクロイックミラーが望ましい。ダイクロイックミラーに楔がある場合、ダイクロイックミラーの切り替えで標本面での集光位置がわずかにずれる。しかし、マルチバンドのダイクロイックミラーを用いると１つのダイクロイックミラーで複数のレーザに対応できるため、切り替えの必要がなく、ダイクロの楔によって標本面の集光位置がずれることがない。また、複数の対物レンズを使用した場合も、従来技術だと複数の対物レンズに対して色収差を合わせることは不可能だったが、本発明の低色収差対物レンズを用いて、本発明の蛍光観察装置の構成を用いれば、色収差のずれが少ない観察が可能となる。
【００９５】
また、本実施例の対物レンズは対物レンズ単独で色収差補正を行っている。このため、対物レンズ１８と結像レンズ１６の間にレーザ光を導入する場合に有利となる。結像レンズ１６と対物レンズ１８をコンペンゼーションして色収差補正を行う場合は、対物レンズ１８と結像レンズ１６の間からレーザなどを導入すると、集光位置のずれが生じる。一方、対物レンズ単独で色収差補正を行っている本実施例では集光位置のずれが生じないので、レーザ光で刺激しながらレーザ走査型顕微鏡で観察するような場合に有利となる。
【００９６】
図２８では、対物レンズ１８とミラー１７の間にダイクロイックミラー３２を配置して、刺激用レーザ３３を備えた構成を示している。ここでは、刺激用レーザ３３の照射位置を調節するために可動式ミラー３４を備えた構成とした。
【００９７】
図２９は本発明の実施によるレーザ走査型鏡焦点顕微鏡の外観構成例を示す。試料２５はステージ２６の上に置かれており、対物レンズ１８は顕微鏡２８のレボルバに取り付けられている。このレボルバには複数の対物レンズが取り付いていてもよい。対物レンズは光軸方向に移動する対物レンズ上下機構２７を有しており、試料２５の光軸方向の複数の断面像を得ることが可能である。試料の３次元像をとるために、共焦点スキャナー２９が顕微鏡本体２８に取り付けられており、ガルバノスキャナーやピンホールなどが内部に配置されている。図示していないが、レーザ光源は図２８のようにファイバで共焦点スキャナー２９に接続されている。共焦点スキャナー２９で得られた信号を画像処理装置３１に伝達し、画像表示装置３０で表示する。試料の３次元像を構築するため、対物レンズを光軸方向に移動させ、複数の波長の蛍光像を取得する。各断面像は画像処理装置３１に保存され、試料の３次元像を画像表示装置３０に表示する。
【００９８】
本発明は色収差が十分補正されているため、複数の蛍光像は光軸方向のずれがない。このため、画像処理装置３１に保存された複数の蛍光波長の試料の光軸方向の断面像を重ね合わせ表示するときに、波長が変わっても同じ断面像を重ね合わせするだけで正確な試料の３次元像を得ることができる。また、試料内の分子の高速な運動を見る場合にも本発明の構成は複数の蛍光画像を重ね合わせするときに、色収差補正のための光軸方向の対物レンズ駆動が不要となるため、試料内分子の高速運動も観察することが可能となる。
【００９９】
また、本発明は共焦点顕微鏡以外の蛍光顕微鏡、蛍光観察装置でも有効である。例えば、細胞内のタンパク質を複数の波長の異なった蛍光タグで標識して、細胞膜からタンパク質がどう移動しているかを見る観察法がある。この場合、細胞膜自体に顕微鏡のピントを合わせる必要があるが、対物レンズに軸上色収差がある場合は、異なった蛍光タグでピントがずれてしまう現象が生じ、蛍光波長を変えると細胞膜からずれた位置を観察することになる。このよう場合にも本発明の対物レンズを用いれば、複数の蛍光波長が異なる蛍光タグを使用する場合、常に標本内の同一平面を観察することが可能となり、正確なデータを得ることが可能となる。
【０１００】
図３０は本発明の実施による蛍光観察装置のアプリケーションである蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の観察例を示す。この観察では、たとえばカメレオンなどの蛍光プローブを用いて細胞内のカルシュウムイオン濃度を測定する。カメレオン（ｃａｍｅｌｅｏｎ）はＣＦＰ、ＹＦＰという２種類の蛍光タンパクをカルモジュリンＭなどのたんぱく質で繋げた構造を持っている。細胞内のカルシュウムイオンが低い状態では波長442nmの励起光が照射されるとＣＦＰからの波長485ｎｍの蛍光しか放射されないが、カルシュウムイオン濃度が高くなると、ＣＦＰからＹＦＰにエネルギー転移が起こり、ＹＦＰからの蛍光である波長530ｎｍの蛍光が観察される。この現象から、ＣＦＰとＹＦＰの蛍光強度の比をとることにより、カルシュウムイオン濃度を測定することが可能となる。
【０１０１】
蛍光顕微鏡またはレーザ走査型顕微鏡にて４８５ｎｍと５３０ｎｍの２つの波長で画像を取得する。たとえば、図３０の（１）を４８５ｎｍの画像とし、図３０の（２）を５３０ｎｍの画像とする。この画像（１）と画像（２）の各画素毎に輝度の比をとった像を図２９の（３）とする。このような操作によって得られた画像（３）は細胞内のカルシュウムイオン濃度の情報を持っている。上記の手順からも解るように、この観察方法では、異なる波長で取得した画像を、画素毎に正確に対応させることが必要となっている。本発明の実施による蛍光観察装置ではこのような観察に好適である。
【０１０２】
上記は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）について述べたが、ｆｕｒａ２などのカルシュウム測光などの蛍光のレシオをとる観察法において、本発明の対物レンズを用いれば、常に標本面の同一平面でのレシオをとることができるので正確な測定が可能となる。
【符号の説明】
【０１０３】
１ 短波長レーザ
２ 可視光レーザ
３ ミラー
４ ダイクロイックミラー
５ ミラー
６ 集光レンズ
７ ファイバカップリング機構
８ ファイバ
９ ファイバ傾き位置合わせ機構
１０ コリメータレンズ
１１ ミラー
１２ ダイクロイックミラー
１３ ダイクロイックミラー
１４ ガルバノミラー
１５ 瞳投影レンズ
１６ 結像レンズ
１７ ミラー
１８ 対物レンズ
１９ ピンホール
２０ 結像レンズ
２１ ダイクロイックミラー
２２ ミラー
２３ バリアフィルタ
２４ 検出器
２５ 標本
２６ ステージ
２７ 対物レンズ上下機構
２８ 顕微鏡本体
２９ 共焦点スキャナー
３０ 画像表示装置
３１ 画像処理装置
３２ ダイクロイックミラー
３３ 刺激用レーザ
３４ 可動式ミラー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源と、該光源からの光線を選択的に反射する光線分離手段と、試料を照明または観察する対物レンズと、試料を固定するステージと、該光線分離手段を通過した光線のうち所望の波長領域を選択する波長選択手段と、該波長選択手段を通過する光を検出する検出器を備えた蛍光観察装置において、
２つ以上の波長で試料の照明を行ったときに得られる散乱または蛍光による２つ以上の波長を検出し、該照明における励起波長のうちで最も長波長側のものをλ１、最も短波長側のものをλ２とし、Δ１、Δ２をλ１、λ２の軸上の集光位置としたときに、以下の条件式
λ１−λ２≧180nm
｜Δ１−Δ２｜＜0.2μｍ
を満たすことを特徴とする蛍光観察装置。
【請求項２】
以下の条件式
λ２≦442nm
を満たすことを特徴とする請求項１記載の蛍光観察装置。
【請求項３】
δ１とδ２とをそれぞれ励起波長λ１とλ２との視野数９での倍率の色収差としたときに、以下の条件式
｜δ１−δ２｜≦0.3μｍ
を満たすことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の蛍光観察装置。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の蛍光観察装置において、
該励起波長λ１とλ２とで該試料の照明を行ったときの該検出器での検出結果より形成されるそれぞれ２つの画像を保存する画像保存手段と、
該画像の重ね合せまたは差分または比率計算を行う画像解析手段とを備え、
前記２つの画像の重ね合わせまたは差分または比率計算を行う蛍光観察装置。
【請求項５】
該ステージまたは該対物レンズが光軸方向に移動させる移動手段を備えることを特徴とする請求項４記載の蛍光観察装置。
【請求項６】
請求項４記載の蛍光観察装置において、試料面にビームスポットを走査する走査手段をもち、共焦点式の検出手段を持つことを特徴とする蛍光観察装置。
【請求項７】
請求項６記載の蛍光観察装置において、該複数のレーザ光源を備え、該複数波長のレーザを同一光路上に合成し、１本のファイバで該蛍光観察装置に導入することを特徴とする蛍光観察装置。
【請求項８】
請求項４記載の蛍光観察装置において、複数の蛍光タグにより標識された試料において、λ１、λ２の励起波長により該試料の照明を行ったときの該検出器での検出結果より形成される画像を重ね合わせて出力することにより、２つ以上の標識された試料内分子の位置情報を解析することを特徴とする蛍光観察装置。
【請求項９】
請求項４記載の蛍光観察装置において、λ１、λ２の励起波長により該試料の照明を行ったときの該検出器での検出結果より形成される画像を時間の経過に応じて複数取得し、該同一時刻に取得された時間経過のλ１、λ２における画像の比率を複数とることにより試料内分子間の蛍光共鳴エネルギー移動を観察することを特徴とする蛍光観察装置。
【請求項１０】
請求項６記載の蛍光観察装置において、２種類以上の蛍光タグを有するサンプルの画像を取得し、
得られた画像の輝度情報をピクセル毎に２次元化し、プロットすることにより各分子の局在を推定する蛍光観察装置。
【請求項１１】
請求項６記載の蛍光観察装置において、ある波長による励起を行ったときの該検出器での検出結果より形成される試料画像をモニタ上に出力し、該モニタ上に出力された試料像の一部の領域を指定し、指定領域のみ光を照射して蛍光退色を行い、該指定領域内または該指定領域外の蛍光像の時間変化を記録して試料内の分子拡散を検出する蛍光観察装置。
【請求項１２】
請求項６記載の蛍光観察装置において、試料画像をある波長による励起を行ったときの該検出器での検出結果より形成される試料画像をモニタ上に出力し、該モニタ上に出力された試料像の一部の領域を指定し、指定領域のみ光を照射して試料内蛍光色素のアクチベーションを行い、該指定領域内または該指定領域外の蛍光像の時間変化を記録して試料内の分子分析を行う蛍光観察装置。
【請求項１３】
請求項４記載の蛍光観察装置において、試料内に複数の蛍光タグをつけた分子が存在し、複数の励起光を同時に照射し、得られる蛍光を分離して励起波長λ１、λ２に相当する蛍光波長を検出し、検出された蛍光の時間変化を記録し、蛍光相互相関分光法によって試料内分子の拡散速度を求めることを特徴とする蛍光観察装置。
【請求項１】
光源と、該光源からの光線を選択的に反射する光線分離手段と、試料を照明または観察する対物レンズと、試料を固定するステージと、該光線分離手段を通過した光線のうち所望の波長領域を選択する波長選択手段と、該波長選択手段を通過する光を検出する検出器を備えた蛍光観察装置において、
２つ以上の波長で試料の照明を行ったときに得られる散乱または蛍光による２つ以上の波長を検出し、該照明における励起波長のうちで最も長波長側のものをλ１、最も短波長側のものをλ２とし、Δ１、Δ２をλ１、λ２の軸上の集光位置としたときに、以下の条件式
λ１−λ２≧180nm
｜Δ１−Δ２｜＜0.2μｍ
を満たすことを特徴とする蛍光観察装置。
【請求項２】
以下の条件式
λ２≦442nm
を満たすことを特徴とする請求項１記載の蛍光観察装置。
【請求項３】
δ１とδ２とをそれぞれ励起波長λ１とλ２との視野数９での倍率の色収差としたときに、以下の条件式
｜δ１−δ２｜≦0.3μｍ
を満たすことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の蛍光観察装置。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の蛍光観察装置において、
該励起波長λ１とλ２とで該試料の照明を行ったときの該検出器での検出結果より形成されるそれぞれ２つの画像を保存する画像保存手段と、
該画像の重ね合せまたは差分または比率計算を行う画像解析手段とを備え、
前記２つの画像の重ね合わせまたは差分または比率計算を行う蛍光観察装置。
【請求項５】
該ステージまたは該対物レンズが光軸方向に移動させる移動手段を備えることを特徴とする請求項４記載の蛍光観察装置。
【請求項６】
請求項４記載の蛍光観察装置において、試料面にビームスポットを走査する走査手段をもち、共焦点式の検出手段を持つことを特徴とする蛍光観察装置。
【請求項７】
請求項６記載の蛍光観察装置において、該複数のレーザ光源を備え、該複数波長のレーザを同一光路上に合成し、１本のファイバで該蛍光観察装置に導入することを特徴とする蛍光観察装置。
【請求項８】
請求項４記載の蛍光観察装置において、複数の蛍光タグにより標識された試料において、λ１、λ２の励起波長により該試料の照明を行ったときの該検出器での検出結果より形成される画像を重ね合わせて出力することにより、２つ以上の標識された試料内分子の位置情報を解析することを特徴とする蛍光観察装置。
【請求項９】
請求項４記載の蛍光観察装置において、λ１、λ２の励起波長により該試料の照明を行ったときの該検出器での検出結果より形成される画像を時間の経過に応じて複数取得し、該同一時刻に取得された時間経過のλ１、λ２における画像の比率を複数とることにより試料内分子間の蛍光共鳴エネルギー移動を観察することを特徴とする蛍光観察装置。
【請求項１０】
請求項６記載の蛍光観察装置において、２種類以上の蛍光タグを有するサンプルの画像を取得し、
得られた画像の輝度情報をピクセル毎に２次元化し、プロットすることにより各分子の局在を推定する蛍光観察装置。
【請求項１１】
請求項６記載の蛍光観察装置において、ある波長による励起を行ったときの該検出器での検出結果より形成される試料画像をモニタ上に出力し、該モニタ上に出力された試料像の一部の領域を指定し、指定領域のみ光を照射して蛍光退色を行い、該指定領域内または該指定領域外の蛍光像の時間変化を記録して試料内の分子拡散を検出する蛍光観察装置。
【請求項１２】
請求項６記載の蛍光観察装置において、試料画像をある波長による励起を行ったときの該検出器での検出結果より形成される試料画像をモニタ上に出力し、該モニタ上に出力された試料像の一部の領域を指定し、指定領域のみ光を照射して試料内蛍光色素のアクチベーションを行い、該指定領域内または該指定領域外の蛍光像の時間変化を記録して試料内の分子分析を行う蛍光観察装置。
【請求項１３】
請求項４記載の蛍光観察装置において、試料内に複数の蛍光タグをつけた分子が存在し、複数の励起光を同時に照射し、得られる蛍光を分離して励起波長λ１、λ２に相当する蛍光波長を検出し、検出された蛍光の時間変化を記録し、蛍光相互相関分光法によって試料内分子の拡散速度を求めることを特徴とする蛍光観察装置。
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図３０】
【図２８】
【図２９】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図３０】
【公開番号】特開２０１３−８０６９（Ｐ２０１３−８０６９Ａ）
【公開日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２２５７７５（Ｐ２０１２−２２５７７５）
【出願日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【分割の表示】特願２００７−３１１９６３（Ｐ２００７−３１１９６３）の分割
【原出願日】平成１９年１２月３日（２００７．１２．３）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【分割の表示】特願２００７−３１１９６３（Ｐ２００７−３１１９６３）の分割
【原出願日】平成１９年１２月３日（２００７．１２．３）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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