本発明は、産業用、消費者用、又は製薬用利用において一以上の有用な性質を有するタンパク質を得るための効率的な方法を提供する。幾つかの好ましい実施態様においては、本発明は候補となる酵素の簡略セットをスクリーニングすることにより所定の適用に対して優れた酵素を生産するための方法を提供する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質変異体のライブラリーを提供する方法であって、
ａ）少なくとも一つの所望の試験における少なくとも一つの所望の性質の範囲にわたる複数のタンパク質変異体を試験し、
ｂ）前記少なくとも一つの所望の試験における好ましい結果に関係する前記所望の性質の範囲内で最適条件を同定し、
ｃ）前記所望の性質の範囲の最適条件内で複数のタンパク質変異体を提供し、それにより、前記少なくとも一つの所望の試験における前記好ましい結果を有するメンバーを多く有するタンパク質変異体のライブラリーを提供すること
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記所望の性質が物理的性質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記好ましい結果が前記所望の試験に観察される最大値の少なくとも約５０％より大きい値に相当することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記好ましい結果が前記所望の試験に観察される最大値の少なくとも約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約９５％より大きい値に相当することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
さらに
ｄ）前記少なくとも一つの所望の試験において、前記複数のタンパク質変異体及び少なくとも一つの野生型タンパク質を試験する
段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
改善される結果を有するような前記タンパク質変異体を同定する段階をさらに含み、野生型タンパク質が前記少なくとも一つ所望の試験において１．０の性能指標値を達成し、前記改善される結果を有するタンパク質変異体が１．０より大きい値で達成することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質が抗体、ホルモン、又はサイトカインであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質が酵素であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素が、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ポリエステラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、オキシダーゼ、又はトランスフェラーゼであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記プロテアーゼが中性メタロプロテアーゼ又はセリンプロテアーゼであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記セリンプロテアーゼがスブチリシンであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記中性メタロプロテアーゼがバシルス（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）科のメンバーから得られることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記セリンプロテアーゼがセルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属のメンバーから得られることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素がセルラーゼであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵素がアミラーゼであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記所望の性質が電荷であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
前記タンパク質変異体及び前記野生型酵素の前記電荷が決定され及び比較されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１８】
前記所望の性質がゼータ電位であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質変異体及び前記野生型酵素の前記ゼータ電位が決定され及び比較されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質変異体の前記ゼータ電位が約−４０ｍＶと約＋４０ｍＶの間であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記タンパク質変異体の前記ゼータ電位が約−２０ｍＶと約＋２０ｍＶの間であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記タンパク質変異体の前記ゼータ電位が約−１０ｍＶと約＋１０ｍＶの間であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記所望の試験が洗浄性能を含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項２４】
前記洗浄性能が血液、牛乳、インク洗浄性能を含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記タンパク質変異体及び野生型タンパク質が洗剤組成物において試験されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記洗剤組成物が約５と約１２の間のｐＨを有する粉状又は液状洗剤へ構成されることを特徴とする請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記洗浄性能が塩基性ｐＨを有する冷水液体洗剤中で試験されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記洗浄性能が温水洗剤中で試験されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも一つの所望の試験が基質結合、酵素阻害、発現レベル、洗剤安定性、熱安定性、反応速度、反応範囲、熱活性、デンプン液状化、バイオマス分解、及び／又は糖化を測定することを含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項３０】
試験タンパク質折りたたみの少なくとも一つの改良される変異体を生産する方法であって、
ａ）少なくとも一つの所望のアッセイにおける少なくとも一つの所望の性質の範囲にわたるプローブタンパク質折りたたみの複数の変異体をアッセイし、
ｂ）前記少なくとも一つの所望のアッセイにおける好ましい結果に関係する前記少なくとも一つの所望の性質の前記範囲内で最適条件を同定し、
ｃ）前記少なくとも一つの所望のアッセイにおいて試験タンパク質折りたたみの親タンパク質をアッセイし、及び
ｄ）親タンパク質にアミノ酸修飾を導入することにより前記試験タンパク質折りたたみの少なくとも一つの改良される変異体を生産し、それにより、前記少なくとも一つの改良される変異体が前記少なくとも一つの所望の性質の前記最適条件範囲内であることを特徴とすること、
を含む方法。
【請求項３１】
前記修飾が少なくとも一つのアミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記試験タンパク質折りたたみ及び前記プローブタンパク質折りたたみが異なることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記所望の性質がゼータ電位であることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記試験タンパク質折りたたみが少なくとも一つのセリンプロテアーゼを含み及び前記プローブタンパク質折りたたみが少なくとも一つの中性メタロプロテアーゼを含むことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
基質汚れに特異的な酵素変異体を生産する方法であって
ａ）標準緩衝液において基質汚れのゼータ電位を決定し、
ｂ）前記標準緩衝液において親酵素のゼータ電位を決定し、及び
ｃ）前記親酵素に少なくとも一つのアミノ酸修飾を導入することにより基質汚れに特異的な酵素変異体を生産し、それにより前記基質汚れに特異的な酵素変異体の前記ゼータ電位が前記親酵素の前記ゼータ電位より前記基質汚れのゼータ電位に近いことを特徴とする
ことを含む方法。
【請求項３６】
前記修飾が少なくとも一つのアミノ酸置換、欠損及び／又は挿入を含むことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記修飾が前記親酵素の化学的修飾を含むことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記基質汚れに特異的な酵素変異体が正に荷電し、吸熱性であり、及び前記基質汚れが負に荷電することを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記基質汚れに特異的な酵素変異体が負に荷電し、発熱性であり、及び前記基質汚れが負に荷電することを特徴とする請求項３５に記載の組成物。
【請求項４０】
前記基質汚れに特異的な酵素変異体が正に荷電し、発熱性であり、及び前記基質汚れが正に荷電することを特徴とする請求項３５に記載の組成物。
【請求項４１】
前記基質汚れに特異的な酵素変異体が負に荷電し、吸熱性であり、及び前記基質汚れが正に荷電することを特徴とする請求項３５に記載の組成物。
【請求項４２】
複数の汚れを洗浄するための組成物を生産する方法であって
ａ）標準緩衝液において前記複数の汚れのそれぞれのゼータ電位を決定し、
ｂ）前記標準緩衝液において少なくとも一つの前記複数の汚れのゼータ電位と実質的に等しいゼータ電位を有する洗浄酵素を選択し、
ｃ）複数の汚れを洗浄するための組成物を生産し、前記組成物がｂ）段階にて選択される少なくとも一つの洗浄酵素を含むことを特徴とする
ことを含む方法。
【請求項４３】
前記組成物が前記標準緩衝液と実質的に同じｐＨ及び導電率を有する洗剤溶液を含むことを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記選択段階が２以上の洗浄酵素を同定することを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記組成物が少なくとも二つの洗浄酵素を含み、前記少なくとも二つの洗浄酵素が少なくとも二つの前記複数の汚れの前記ゼータ電位に相当するゼータ電位を有することを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
請求項４２に記載の方法を用いて生産される複数の汚れを洗浄するための組成物。
【請求項４７】
前記組成物が少なくとも一つの洗浄酵素含むことを特徴とする請求項４６に記載の組成物
【請求項４８】
前記少なくとも一つ洗浄酵素が変異タンパク質であることを特徴とする請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
前記変異タンパク質が前記変異タンパク質を生産するために用いる野生型前駆体タンパク質より負に荷電することを特徴とする請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
前記変異タンパク質が前記変異タンパク質を生産するために用いる野生型前駆体タンパク質より正に荷電することを特徴とする請求項４６に記載の組成物。
【請求項５１】
前記変異タンパク質が陰イオン界面活性剤を含む洗剤における増強される安定性に関して前記変異タンパク質を生産するために用いる野生型前駆体タンパク質より負に荷電することを特徴とする請求項４６に記載の組成物。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】


【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【公表番号】特表２０１０−５２８６５６（Ｐ２０１０−５２８６５６Ａ）
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１１１９６（Ｐ２０１０−５１１１９６）
【出願日】平成２０年６月６日（２００８．６．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００７１０３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５３９２５
【国際公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（５０８３７７０１５）ダニスコ・ユーエス・インク、ジェネンコー・ディビジョン (31)
【Ｆターム（参考）】