複製タンパク質Ａを阻害する物質および方法ならびにその使用
少なくとも１種の試薬を用いて、制御されない細胞増殖およびＤＮＡを損傷する化学療法薬への耐性を標的とすることは、癌治療において有意義な可能性を有する。真核細胞１本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ結合タンパク質である複製タンパク質Ａは、ＤＮＡ複製および修復の両方における役割により、ゲノム維持および安定性のため不可欠である。本明細書に報告されるのは、ＲＰＡのインビトロ、インビボおよび細胞でのｓｓＤＮＡ結合活性を阻害し、それにより、真核細胞の細胞周期を乱し、細胞毒性を誘発する小分子であり、また、ＤＮＡを損傷させかつ／またはＤＮＡ複製および／または機能を乱す化学療法薬の効力を増大させる小分子である。これらの結果は、染色体維持および安定性におけるＲＰＡ−ｓｓＤＮＡ相互作用の機序への新たな洞察を提供する。これは、分子標的の真核細胞ＤＮＡ結合阻害剤を提起し、細胞周期を研究し、癌治療のための治療戦略をもたらす手段としてタンパク質−ＤＮＡ相互作用を標的とすることの有用性を実証する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は、参照によりその全体を本明細書に組み込まれている２０１０年２月５日出願の米国仮特許出願第６１／３０１，７７８号の利益を主張する。
【０００２】
政府権利の申告
本発明の進展の間、研究の一部は、許可番号ＣＡ８２７４１のもとに合衆国国立衛生研究所（ＮＩＨ）からの政府援助により行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明のいくつかの態様は、複製タンパク質Ａ（Replication Protein A）の活性を少なくとも部分的に阻害する分子を特定することに関し、またこれらの分子を使用して、癌を含む過剰増殖性疾患を治療することができる。
【背景技術】
【０００４】
複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）は、７０、３４および１４ｋＤａサブユニットから構成されるヘテロ三量体１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）結合タンパク質である（１）。ＲＰＡのｓｓＤＮＡ結合活性は、ＤＮＡ複製、組換えおよび修復を含むいくつかのＤＮＡ代謝経路について必要とされる。ＤＮＡとの高親和性相互作用は、３つのサブユニットのそれぞれの上に存在する数多くのオリゴ糖／オリゴヌクレオチド結合（ＯＢ）−フォールド（fold）によって維持される（２、３）。単一のＯＢ−フォールドのＤＮＡ結合ポケットは、ｓｓＤＮＡの塩基３〜４個を収容する（４、５）。主なＯＢ−フォールド、すなわちＤＮＡ結合ドメインＡおよびＢ（ＤＢＤ−ＡおよびＤＢＤ−Ｂ）は、ｐ７０サブユニットの中心領域に存在し、ＲＰＡ−ｓｓＤＮＡ相互作用のための結合エネルギーの大部分をもたらしている（２）。個々のＯＢ−フォールドは、疎水性および塩基性アミノ酸と一緒に存在する、こぢんまりとしたモジュールドメインである。これらの構造的特徴により、ＯＢ−フォールドは、ＤＮＡ結合活性の小分子阻害剤（ＳＭＩ）を開発するための魅力的な標的となっている。細胞の成長およびＤＮＡ修復におけるＲＰＡの中心的役割を考慮すれば、ＲＰＡは、その活性を妨げることができる化合物を開発するための魅力的な標的である。本発明のいくつかの態様は、ＲＰＡと相互作用する化合物、ならびにその化合物を使用して、細胞成長および細胞死に影響を及ぼす方法を包含する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の種々の態様は、複製タンパク質Ａの活性を低下させる方法および化合物、真核細胞の増殖、真核細胞の細胞周期に影響を及ぼす方法および化合物、ならびに／または癌を治療する方法および化合物であって、複製タンパク質Ａを、下記のコア構造：
【０００６】
【化１】
を含む化合物Ａまたはその代謝産物（metabolite）などの化合物と接触させるステップによる方法および化合物を包含する。
【０００７】
いくつかの実施形態において、このコア構造を含む化合物またはその代謝産物と接触させた真核細胞をさらに、ＤＮＡを直接損傷させる、またはトポイソメラーゼＩＩを阻害する少なくとも１つの化合物と接触させる。このような化合物には、シスプラチン、エトポシド、ブスルファン、ベンダムスチン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、デシタビン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロミド、トポテカンなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０００８】
本発明のいくつかの態様は、複製タンパク質Ａの活性を低下させる方法であって、化合物Ａを提供するステップであって、この化合物Ａは複製タンパク質Ａに結合する、または、代謝されて複製タンパク質Ａに結合する化学物質（chemical）となり、化合物は下記の式：
【０００９】
【化２】
（式中、Ｒ１は、５−（７−クロロ−２，３−ジヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キノリン−８−イル）、５−（キノキサリン−６−イル）および６−クロロ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｇ］キノリン−７−イルを含む、置換キノリン、チオフェンおよびフェニルからなる群から選択され；Ｒ２は、水素、ハロゲン、メチル基、ニトロ基からなる群から選択され、ここで、化合物Ａ、または化合物Ａの代謝産物が複写タンパク質Ａに結合し；Ｒ３は、ケト酪酸および
【００１０】
【化３】
からなる群から選択され、式中、ｎ＝１、２、３、４または５である）を有するステップを含む方法を包含する。いくつかの実施形態において、化合物Ａ中のキノリンまたはフェニルは、ハロゲン、メチル基、エチル基、アミノ基およびピラゾールからなる群から選択される少なくとも１つの部分で置換されている。いくつかの実施形態において、化合物Ａ中のＲ１は、２−クロロ−７−エトキシキノリン、５（キノキサリン−６−イル）、２−クロロ−６，７−ジメトキシキノリン、２−クロロ−６−エトキシキノリン、４−ブロモフェニル、４−フルオロフェニル、４−クロロフェニル、２−クロロフェニル、２−メトキシフェニル、４−エチルフェニル、４−ジエチルアミノフェニル、４−ジメチルアミノフェニル、チオフェン、４−メトキシフェニル、ｐ−トリル、２，５−ジメトキシフェニル、３，４−ジメトキシフェニル、４−エチルフェニルおよび１−フェニル−３−ｐ−トリル−１Ｈ−プリアゾール（pryazole）からなる群から選択され、化合物Ａ中のＲ２は、４−ブロモ、４−クロロ、４−ニトロ、４−メチル、４−メトキシ、Ｈ、３，４−ジメチルからなる群から選択される。
【００１１】
いくつかの実施形態において、複製タンパク質Ａに結合する分子は、化合物Ａの誘導体またはその代謝産物である。またいくつかの実施形態において、複製タンパク質Ａに結合する分子は、化合物ＴＤＬＲ−５０５、化合物ＴＤＬＲ−５０６またはそれらの代謝産物である。
【００１２】
さらに他の実施形態において、化合物Ａまたはその代謝産物のいずれかと複製タンパク質Ａの少なくとも１つのアイソフォーム（isoform）とを接触させるステップは、インビボ（in vivo）で行われる。さらに他の実施形態において、化合物Ａまたはその代謝産物と、複製タンパク質Ａの少なくとも１つのアイソフォームとを接触させるステップは、インビトロ（in vitro）で行われる。
【００１３】
本発明の他の態様は、真核細胞の細胞周期進行（cycle-progression）を変化させることにより細胞増殖を阻害する方法であって、真核細胞の細胞周期進行を妨げる化合物Ａ、または代謝されて真核細胞の細胞周期進行を妨げる化学物質となる化合物Ａを提供するステップであって、化合物Ａが、下記の式：
【００１４】
【化４】
（式中、Ｒ１は、５−（７−クロロ−２，３−ジヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キノリン−８−イル）、５−（キノキサリン−６−イル）および６−クロロ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｇ］キノリン−７−イルを含む、置換キノリン、チオフェンおよびフェニルからなる群から選択され；Ｒ２は、水素、ハロゲン、メチル基、ニトロ基からなる群から選択され、ここで、化合物Ａ、または化合物Ａの代謝産物は複製タンパク質Ａに結合し；Ｒ３は、ケト酪酸および：
【００１５】
【化５】
からなる群から選択され、式中、ｎ＝１、２、３、４または５である）を有するステップを含む方法を包含する。いくつかの実施形態において、化合物Ａ中のキノリンまたはフェニルは、ハロゲン、メチル基、エチル基、アミノ基およびピラゾールからなる群から選択される少なくとも１つの部分で置換されている。いくつかの実施形態において、化合物Ａ中のＲ１は、２−クロロ−７−エトキシキノリン、５（キノキサリン−６−イル）、２−クロロ−６，７−ジメトキシキノリン、２−クロロ−６−エトキシキノリン、４−ブロモフェニル、４−フルオロフェニル、４−クロロフェニル、２−クロロフェニル、２−メトキシフェニル、４−エチルフェニル、４−ジエチルアミノフェニル、４−ジメチルアミノフェニル、チオフェン、４−メトキシフェニル、ｐ−トリル、２，５−ジメトキシフェニル、３，４−ジメトキシフェニル、４−エチルフェニル、および１−フェニル−３−ｐ−トリル−１Ｈ−プリアゾール（pryazole）からなる群から選択され；および化合物Ａ中のＲ２は、４−ブロモ、４−クロロ、４−ニトロ、４−メチル、４−メトキシ、Ｈ、３，４−ジメチルからなる群から選択される。
【００１６】
いくつかの実施形態において、真核細胞の細胞周期進行を少なくとも部分的に妨げる化合物は、化合物Ａまたはその代謝産物である。さらに他の実施形態において、真核細胞の細胞周期進行を妨げる化合物は、化合物ＴＤＬＲ−５０５、ＴＤＬＲ−５０６またはそれらの代謝産物である。いくつかの実施形態において、化合物Ａまたはその代謝産物と複製タンパク質Ａとの間での接触させるステップは、インビボで行われる。
【００１７】
さらに他の実施形態は、ヒトまたは動物の患者を治療する方法であって、少なくとも１つの治療的に活性な量の、ＲＰＡの活性を阻害する少なくとも１つの化合物またはその薬学的に許容可能な塩を供給または提供するステップを含む方法を包含する。いくつかの実施形態は、ある用量のその化合物を患者に投与するステップであって、その用量が、その患者の体重１ｋｇ−１当たり前記化合物約５０ｍｇ、またはその患者の体重１ｋｇ−１当たり前記化合物約１００ｍｇ、またはその患者の体重１ｋｇ−１当たり前記化合物約２００ｍｇであるステップを包含する。
【００１８】
さらに他の実施形態において、前記化合物Ａまたはその代謝産物と、複製タンパク質Ａとを接触させるステップは、インビトロで行われる。本発明のさらに他の態様は、癌の治療方法であって、化合物を提供するステップであって、その化合物は癌細胞の細胞周期を妨げ、またはその化合物は代謝されて癌細胞の細胞周期を妨げる化学物質となり、またその化合物は、下記の式：
【００１９】
【化６】
（式中、Ｒ１は、置換キノリン、チオフェンおよびフェニルからなる群から選択され、化合物ＡにおいてＲ２は、ハロゲン、メチル基、ニトロ基からなる群から選択される）を有し、ここで、化合物Ａは複製タンパク質Ａに結合するステップと；前記化合物Ａを、少なくとも１の癌細胞と接触させるステップとを含む方法を包含する。いくつかの実施形態において、化合物Ａ中のキノリンまたはフェニルは、ハロゲン、メチル基、エチル基、アミノ基およびピラゾールからなる群から選択される少なくとも１つの部分で置換されている。いくつかの実施形態において、化合物Ａ中のＲ１は、２−クロロ−７−エトキシキノリン、５（キノキサリン−６−イル）、２−クロロ−６，７−ジメトキシキノリン、２−クロロ−６−エトキシキノリン、４−ブロモフェニル、４−フルオロフェニル、４−クロロフェニル、２−クロロフェニル、２−メトキシフェニル、４−エチルフェニル、４−ジエチルアミノフェニル、４−ジメチルアミノフェニル、チオフェン、４−メトキシフェニル、ｐ−トリル、２，５−ジメトキシフェニル、３，４−ジメトキシフェニル、４−エチルフェニル、および１−フェニル−３−ｐ−トリル−１Ｈ−プリアゾール（pryazole）からなる群から選択され；および化合物Ａ中のＲ２は、４−ブロモ、４−クロロ、４−ニトロ、４−メチル、４−メトキシ、Ｈ、３，４−ジメチルからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、癌細胞と接触させる化合物は、化合物Ａまたはその代謝産物である。またいくつかの実施形態において、癌細胞と接触させる化合物は、化合物ＴＤＬＲ−５０５、ＴＤＬＲ−５０６またはそれらの代謝産物である。いくつかの実施形態において、前記化合物またはその代謝産物と癌細胞との間での接触させるステップは、インビボで行われる。またさらに他の実施形態において、前記化合物Ａまたはその代謝産物と癌細胞との間での接触させるステップは、インビトロで行われる。いくつかの実施形態において、この癌細胞は、肺癌、非小細胞、小細胞、上皮性卵巣癌（epithelial ovarian cancer）、子宮頸癌、大腸（colon）癌および乳癌からなる群から選択される固形腫瘍中に見出される。本発明のいくつかの実施形態は、癌細胞を、直接ＤＮＡと結合するかもしくはＤＮＡを損傷させる、またはトポイソメラーゼＩＩの活性を低下させる少なくとも１つの化学療法試薬と接触させるステップをさらに包含する。いくつかの実施形態において、この化学療法試薬は、シスプラチンおよびエトポシドからなる群から選択されるが、これらに限定されない。このような化合物には、ブスルファン、ベンダムスチン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、デシタビン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロミド、トポテカンなどが含まれるが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】化合物３の図である。
【図１Ｂ】ＤＮＡへのＲＰＡ結合を阻害する化合物３のＥＭＳＡの図である。
【図１Ｃ】ＤＮＡへのＲＰＡ結合を阻害する化合物３のＥＭＳＡデータをプロットした図である。
【図２Ａ】化合物Ａのケト酪酸誘導体の図である。
【図２Ｂ】化合物ＴＤＬＲ−５０５の図である。
【図２Ｃ】ＤＮＡへのＲＰＡ結合を阻害する化合物ＴＤＬＲ−５０５のＥＭＳＡの図である。
【図２Ｄ】ＤＮＡへのＲＰＡ結合を阻害するＴＤＲＬ−５０５のＥＭＳＡデータをプロットした図である。
【図３】ＤＮＡへのＲＰＡ結合を阻害する化合物ＴＤＬＲ−５０６のＥＭＳＡの図である。
【図４Ａ】ＴＤＲＬ−５０５により誘発された細胞死を測定する、アネキシンＶ／ＰＩにより染色したＨ４６０細胞を点プロットした図である。
【図４Ｂ】化合物ＴＤＬＲ−５０５の種々の濃度で測定した細胞死データをプロットした図である。
【図４Ｃ】抗ＲＰＡ抗体により試験し（probed）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ抗体により視覚化した、ＲＰＡによる細胞局在の免疫蛍光検査の図である。
【図４Ｄ】化合物ＴＤＲＬ−５０５処理の関数としてのＲＰＡのｐ３４サブユニットのウエスタンブロットを示す図である。
【図５Ａ】化合物ＴＤＬＲ−５０５で処理したＨ４６０ ＮＳＣＬＣ細胞の細胞周期分布の図である。
【図５Ｂ】ノコダゾールで処理し、次いで化合物ＴＤＬＲ−５０５で４、８または１２時間処理したＨ４６０細胞の細胞周期分布の図である。
【図６】化合物ＴＤＬＲ−５０５と、シスプラチン（白丸）またはエトポシド（黒丸）のいずれかとにより同時処理したＨ４６０細胞における相乗作用の解析を示す図である。
【図７Ａ】マウス異種移植モデルにおける非小細胞肺癌に対するＴＤＲＬ−５０５のインビボ抗癌活性を示す図である。腫瘍体積を測定し、時間に対しプロットした。データは平均±Ｓ．Ｅ（ｎ＝５）として表される。
【図７Ｂ】異種移植モデルにおいて評価した個々のマウスにおける非小細胞肺癌に対するＴＤＲＬ−５０５のインビボの抗癌活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
新規技術の原理の理解を進める目的で、ここで、その好ましい実施形態を参照し、それを記述するため特定の用語が使用されるであろう。しかし、それにより、新規技術の範囲を何ら制約するものではないことが意図され、新規技術の原理のこのような変更、修正およびさらなる適用が、新規技術に関連する当業者に通常起こるものと企図される点が理解されるであろう。
【００２２】
特にまたは暗黙のうちに言及しない限り、本明細書において使用される用語「約」は、±１０パーセントを意味する。例えば、「約１．０」は、０．９〜１．１の範囲を包含する。
【００２３】
治療有効用量は、患者の健康または快適さへの単一のまたは累積された有益な効果を有する生物学的に活性な化合物の量である。
【００２４】
ＲＰＡ−ＤＮＡ相互作用の阻害は、癌細胞における数多くの特異的に制御される経路に強い影響を与える可能性がある。ＤＮＡ複製において、ＲＰＡ阻害を用いて、Ｓ期の細胞の大きな個体数によって特徴付けられる癌細胞の高度に増殖的な特性を利用することができる。ＲＰＡはまた、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）を含む、細胞におけるいくつかのＤＮＡ修復経路においても不可欠である。種々の癌治療において使用される一般的化学療法薬であるシスプラチンは、主としてＮＥＲ経路によって修復される鎖内共有結合ＤＮＡ付加体（adduct）の形成により、その細胞毒性効果を誘発する（６）。したがって、シスプラチン治療は、ＲＰＡ ｓｓＤＮＡ結合活性の低下と同時に、シスプラチン−ＤＮＡ付加体の細胞修復効率の低下をもたらし、細胞毒性を増加させると期待される。こうして、ＲＰＡを標的とすることは、単一薬剤の活性についての可能性だけではなく、シスプラチン、エトポシドおよび電離放射線（ＩＲ）などの、ＤＮＡ損傷および遺伝子不安定性を誘発する治療に対して癌細胞を増感する可能性をも有する。ブスルファン、ベンダムスチン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、デシタビン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロミド、トポテカンなどである。
【００２５】
本明細書において開示されるように、ＲＰＡのｓｓＤＮＡ結合活性を阻害する小分子が特定されている。細胞ＲＰＡの阻害は、Ｓ期に入る能力の欠如、細胞死の誘発ならびに化学療法試薬シスプラチンおよびエトポシドとの相乗的活性をもたらす。ＲＰＡのｓｓＤＮＡ結合活性を阻害することができるこれらの小分子は、癌細胞を殺すために、単剤として、また一般に使用される化学療法薬と併用してのいずれでも活性である。インビボにおいて、これらの化合物は、明らかな毒性の兆候なしにＩＰおよび強制経口投与により２００ｍｇ／ｍｇまでマウスに安全に投与することができ、マウス異種移植（xenograft）モデルにおいてヒト非小細胞肺癌に対する抗癌活性を有する。
【００２６】
材料および方法
ＴＤＲＬ５０５誘導体の合成
ここでスキーム１を参照する。市販の、１などのケトンおよび２などのアルデヒドをクライゼン−シュミット縮合に掛けて、３などのエノンを生成し、これを、ヒドラジンなどの試薬を使用して環化して、４などのＨ１ピラゾールを生成することができる。５などの種々の酸によりアミド結合の化学作用を用いて、このピラゾールのＮ１位を修飾して、６の例示的化合物ＴＤＲＬ−５０５などの化合物を形成する。
【００２７】
【化７】
【００２８】
ＴＤＲＬ５０６誘導体の合成
ここでスキーム２を参照する。ＴＤＲＬ−５０５および３−モルホリノプロパン−１−アミン（２）から、ＥＤＣカップリングによりＴＤＲＬ−５０６を調製した。
【００２９】
【化８】
【００３０】
インビトロ解析
小分子阻害剤をＣｈｅｍＤｉｖから得て、ＤＭＳＯ中に再懸濁させた。化合物ＴＤＬＲ−５０５を独立に合成し、質量分析解析により構造を確認した。以前に記述した大腸菌（E. coli）過剰発現系を使用して、ヒトＲＰＡを精製した（７）。以前に記述したように、２５ｎＭ ＲＰＡ、２５ｎＭ ５’［３２Ｐ］標識３４塩基対ＤＮＡを含有する２０μＬ反応物中でＥＭＳＡを行った（７）。ＤＭＳＯの最終濃度は１％であった。
【００３１】
フローサイトメトリー
Ｈ４６０細胞のアポトーシスは、アネキシン（Annexin）Ｖ−ＦＩＴＣヨウ化プロピジウム（ＰＩ）Ｖｙｂｒａｎｔアポトーシスアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造業者の取扱説明書に従って解析した。細胞を、１ｃｍ２当たり１×１０４個の細胞密度で平板培養し、２４時間付着させ、次いで化合物ＴＤＬＲ−５０５で４８時間処理した。上述のＨ４６０細胞の平板培養および処理に続いて、付着および非付着細胞を収集し、処理し、ＢＤ ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターで解析した。ＷｉｎＭＤＩソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｆａｃｓ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｈｔｍｌ）を使用してデータを解析した。細胞周期解析は、ＰＩ染色により行った。簡単に言うと、細胞を平板培養し、化合物で処理し、収集し、次いで１％ＢＳＡを補ったＰＢＳ−ＥＤＴＡで２回洗浄した。渦流中で細胞を−２０℃において７０％ＥｔＯＨ中に固定し、続いて氷上で３０分間インキュベートした。次いで細胞を収集し、ＰＩ溶液（１％ＢＳＡを補ったＰＢＳ−ＥＤＴＡ中、１０μｇ／ｍＬのＰＩおよび２５μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅＡ）で染色した。細胞を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターで解析した。細胞はゲートをかけ、ＦＬ２−Ａパラメーターに対してプロットした結果のヒストグラムについて解析した。ＭｏｄＦｉｔソフトウエアを使用し、細胞周期分布を解析した。０．８μｇ／ｍＬノコダゾールによる処理によって１２時間のＧ２停止を誘発した（１０）。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、媒体（vehicle）または化合物ＴＤＬＲ−５０５（１００μＭ）のいずれかで処理した。細胞を収穫し、上述の細胞周期分布について解析した。
【００３２】
間接免疫蛍光検査
Ｈ４６０細胞を、上述のようにチャンバースライド（ＬａｂＴｅｋ）上で平板培養した。次いで、示したように５０μＭの化合物ＴＤＬＲ−５０５または媒体のいずれかで細胞を３時間処理し、処理に続いて、細胞を２５℃において４％パラホルムアルデヒド中で３分間固定し、続いて４℃において０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で２分間洗浄した。次いで、スライドをＰＢＳ中１５％のＦＢＳ中において２５℃で１時間ブロックし、次いで、１５％ＦＢＳ中における希釈１：５００で抗ＲＰＡ３４一次抗体（Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ）と共に１時間インキュベートした。次いで、スライドを１５％ＦＢＳで１０分ずつ３回洗浄し、次いで希釈１：３００でＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−５９４ヤギ抗マウス二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に１時間インキュベートした。スライドを再び洗浄し、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ中に希釈した３００ｎＭ ＤＡＰＩで５分間染色した。次いで、スライドを装着し、Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡を使用して画像を捕え、そしてＲＰＡ染色を視覚化するテキサスレッドおよびＤＮＡを視覚化するＤＡＰＩ用フィルターを使用して画像を捕えた。スライドを視覚化し、ＩｍａｇｅＪソフトウエアを使用して画像を解析し、定量した。
【００３３】
ウエスタンブロット解析
Ｈ４６０細胞を平板培養し、２５μＭエトポシドの存在下または不在下において媒体または１００μＭの化合物ＴＤＬＲ−５０５のいずれかで６時間処理し、次いでＲＩＰＡ溶解および抽出手順を使用しウエスタンブロット解析のため処理した。抗ＲＰＡ ｐ３４抗体（Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ）およびヤギ抗マウスＨＲＰ二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）によりＲＰＡを検出した。化学発光検出を使用して、バンドを視覚化した。
【００３４】
インビボ解析
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（８週齢）に、化合物ＴＤＬＲ−５０５を、２００ｍｇ／ｋｇで１週当たり２回２週間ＩＰ注入投与した。明らかな毒性の兆候についてマウスを監視し、また１週当たり３回体重を測定した。マウスを犠牲にして、全身死体解剖を行って、臓器重量を調べ、毒性の兆候を試験した。ＴＤＬＲ−５０５を約２００ｍｇ／ｍｇの投与量レベルでマウスに経口投与した場合、ＴＤＬＲ−５０５に毒性がある兆候はなかった。次いで、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、０．２ｍｌの５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ中のＨ４６０細胞５×１０６個を皮下に移植した。腫瘍を７日間成長させ、またＴＤＲＬ−５０５を１週当たり２回強制経口投与により１週間投与した。腫瘍の幅および長さを測定し、これらの測定値を式：体積＝ｌ×ｗ２／２で使用することにより、腫瘍の体積を計算した。
【００３５】
薬物動態解析。ＴＤＲＬ−５０５をｉｐまたはｐｏのいずれかでマウスに２００ｍｇ／ｋｇ投与し、処理後１、２、４、８、２４および４８時間に、血液を採取した。ＴＤＲＬ−５０５の血清濃度を、ＨＰＬＣ ＭＳ／ＭＳプロトコルを使用して測定し、またオンコンパートメント（on-compartment）解析を用いＰＫパラメーター解析を行った。
【００３６】
結果
ＲＰＡの小分子阻害剤の特定
以前の研究から、ＲＰＡのＤＮＡ結合活性を阻害するが、細胞活性（cellular activity）を示さないＮＣＩライブラリーからの一連の小分子が特定された（８）。さらなる研究は、最初のアッセイ法に蛍光偏光（ＦＰ）修正を加えたものを使用して、ＣｈｅｍＤｉｖライブラリーのスクリーニングを企てた。ここに図１Ａ、ＢおよびＣを参照すると、ハイスループットスクリーニングから化合物３が特定され、かつ二次アッセイにおいて電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を使用して解析し、阻害性を確認した。図１Ｂおよび１Ｃにより示されるように、ＥＭＳＡ解析によりＲＰＡ ＤＮＡ結合の著しい阻害が観察され、データの定量化がこの阻害性の証拠となっている。
【００３７】
ここに図２ＡおよびＢを参照する。化合物Ａのコア構造において化合物を使用して観察された高レベルのインビトロＲＰＡ阻害性を考慮して、このコア構造を、Ｎ１位置に４−オキソブタン酸およびＣ３にフェニル置換基を有するジヒドロピラゾールで置換して、構造活性相関（ＳＡＲ）の解析を開始し、また細胞活性を有する他の化合物を探究した。ＣｈｅｍＤｉｖライブラリーから、フェニル環（Ｒ２）外に種々の置換を有し、またジヒドロピラゾール環（Ｒ１）のＣ５位置に種々の置換基を有する８１個の類似体が特定され、得られた（データは示さない）。解析した化合物の中で、化合物ＴＤＲＬ−５０５（図２Ｂ）が、試験された最も効力のあるＲＰＡ阻害剤であり、ＩＣ５０値１３μＭを有していた（表１）。二次スクリーニングにおいて、ＴＤＲＬ ５１８およびＴＤＲＬ ５２０〜５２３を含むいくつかの化合物も、インビトロＲＰＡ阻害活性を有するとして、または、ＲＰＡ活性を阻害することが見出された小分子と同様の化学的特性を有するとして特定された。さらに表１を参照すると、表１のそれぞれの化合物は、インビボで、またはインビトロの細胞でＲＰＡに対し滴定して、そのＩＣ５０値を測定した。表１に示すように、これらの化合物は、ＲＰＡ−ｓｓＤＮＡ相互作用を阻害する異なる能力を示した（表１）。それぞれの化合物の細胞活性を測定するために、Ｈ４６０ ＮＳＣＬＣ細胞株における細胞死の誘発を測定し、４８時間曝露後のそれぞれの化合物のＩＣ５０値を測定した。これらのデータは、表１にも示されており、インビトロ活性と細胞活性との間の相関性を明らかにしており、これらは細胞のＲＰＡ阻害性と一致し、またＲＰＡ阻害の特異性を示している。しかし、インビトロにおいて最小のＲＰＡ−ｓｓＤＮＡ相互作用阻害性を示した化合物５２３も、わずかに細胞活性を呈していた。このことは、細胞がこの化合物を代謝して、より効果的なＲＰＡ阻害剤を生成した結果である可能性がある。化合物３類似体についての細胞およびインビトロ阻害活性の解析は、化合物ＴＤＬＲ−５０５が、最も低いインビトロＩＣ５０値を示し、また細胞で試験したもののうち最も効力のある化合物であることを示した。したがって、この化合物は、広範な一連のインビトロの、細胞に基づく、およびインビボアッセイ法を使用する、その作用機序ならびに、ＲＰＡ−ｓｓＤＮＡ相互作用の阻害からもたらされる細胞効果の検討を含む、さらなる検討のため選択された。
【００３８】
ここで表１を参照すると、インビトロＩＣ５０は、図１Ａに示したようにＥＭＳＡ解析により測定した。細胞ＩＣ５０値は、Ｈ４６０細胞を、示した化合物で処理し、方法で記述したようにアネキシンＶ／ＰＩ染色物を解析することにより測定した。インビトロおよび細胞データを、標準的４パラメーターロジスティック曲線を使用して解析した。この解析からＩＣ５０値および適合の標準誤差を決定した。
【００３９】
ここで表２を参照する。表２における化合物は市販され、インビトロでＲＰＡ−ＤＮＡ結合活性を阻害することが実証されてもいる。簡単に言うと、「ｍ」は、オキソペンタン酸修飾およびキノリン外でのジオキシノール置換を有し；「ｎ」は、オキソペンタン酸修飾およびキノリンのキノキサリン−イル置換を有し；「ｒ」は、ブタン酸およびキノリン外でのジオキソロ置換を有する。
【００４０】
酪酸およびモルホリノ誘導体を含む、化合物ｍおよびｎの誘導体を作製する。フェニル環上でｐ−メチルがｐ−ブロモで置き換えられる。Ｂｒ−フェニル基およびモルホリノ基を有する「ｒ」の誘導体も作製される。本明細書において記述したＳＡＲデータは、酪酸をより長くすると（例えばペンタン酸）幾分活性を損なうように見え、しかし側鎖全体を除去するとＲＰＡ阻害活性を実質的に失う結果になることを示している。したがって、より少ない炭素スペーサーを有する、より短いモルホリノ誘導体が望ましいものである。
【００４１】
ＲＰＡの７０ｋＤａサブユニットにおけるＤＢＤ−ＡおよびＢを標的とする、ＲＰＡのＤＮＡ結合活性のインビトロ阻害
ここで図２Ｃ、ＤおよびＥ、化合物ＴＤＬＲ−５０５のＥＭＳＡ解析を参照する。簡単に言うと、３４塩基ｓｓＤＮＡ基質を使用して、濃度の増加する化合物ＴＤＲＬ−５０５をＲＰＡと一緒に前インキュベートし、ＥＭＳＡにより、ＤＮＡ結合活性を評価した。ここで図２Ｄを参照すると、図２Ｃ中に存在するゲルの定量化を示している。ここで図２Ｄを参照すると、各点の平均および標準偏差を表している。データは、Ｎ＝４を有する標準的４パラメーターロジスティック曲線に適合させた。
【００４２】
【表１】
【００４３】
【表２】
【００４４】
ＴＤＲＬ−５０５の修飾；ＴＤＲＬ−５０６の解析
ここでスキーム２を参照する。ＴＤＲＬ−５０６を合成し、精製し、インビトロＲＰＡ阻害活性について評価した。図３を参照すると、ＴＤＲＬ−５０６は、完全長ＲＰＡヘテロ三量体レーン１〜７およびＤＢＤ−Ａ／Ｂコンストラクト（レーン８〜１２）の両方に対するＲＰＡ阻害活性について評価した。使用した濃度は、ＴＤＲＬ−５０６の２５、５０、７５および１００□Ｍであった。データは、モルホリノ修飾を含有するＴＤＲＬ−５０６化合物が、完全にＲＰＡ阻害活性を保有することを実証している。
【００４５】
ＴＤＲＬ−５０５による癌細胞死の誘発
ここで、図４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄを参照すると、Ｈ４６０ ＮＳＣＬＣ細胞株における細胞死および細胞周期進行の誘発に対する化合物ＴＤＲＬ−５０５の効果を測定した。簡単に言うと、Ｈ４６０細胞を化合物ＴＤＲＬ−５０５で４８時間処理し、アネキシンＶ／ＰＩによる染色によって細胞生存能について分析し、点プロットとして示した（図３Ａを参照されたい）。ここで図４Ｂを参照すると、図４Ａからのデータを定量化し、生存細胞を示すアネキシン−／ＰＩ−細胞（四分の一区分の左下）の百分率を計算した。平均±ＳＤ（Ｎ＝４）を示し、データを４パラメーターロジスティック曲線に適合させた。これらのデータは、ＴＤＲＬ−５０５が、ＮＳＣＬＣ細胞中に細胞死を誘発することが可能であることを実証している。細胞生存能への化合物ＴＤＬＲ−５０５の影響の独立した測定値としてクリスタルバイオレット染色アッセイを使用し、ＩＣ５０値６４μＭをもたらした（データは示さない）。化合物ＴＤＬＲ−５０５によるＡ５４９ ＮＳＣＬＣ細胞株の処理においても、同様な結果が観察されたが、一方で新たに単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用した解析では、最小限の細胞毒性活性を示した（データは示さない）。これらの実験において、化合物ＴＤＬＲ−５０５は、ＮＳＣＬＣ細胞株において顕著な細胞毒性効果を示すが、非癌性細胞ではほんのわずかな活性しか示さず、これらの分子についての治療処置の窓領域が存在することを示している。
【００４６】
化合物ＴＤＬＲ−５０５による処理後に見られるこれらの細胞効果は、ＲＰＡがＤＮＡと相互作用できないことと相関し、これにより、次いで、細胞内におけるＲＰＡの分解または再分布を含む数多くの可能性をもたらし得るであろう。間接免疫蛍光検査を使用して、ＲＰＡ結合の阻害が細胞の局在にどのように影響するかを評価した。ここで図４Ｃを参照すると、Ｈ４６０細胞を化合物ＴＤＬＲ−５０５または媒体で３時間処理し、ＲＰＡ発現および局在について、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４二次抗体（赤色）を使用し間接免疫蛍光検査により解析した。スライドをＤＡＰＩ（青色）で対比染色し、画像を併合させた。箱で囲んだ細胞の拡大図を、低倍率の画像の下方に示している。簡単に言うと、化合物ＴＤＬＲ−５０５で３時間処理した後、細胞は、全体として細胞内局在に変化のない媒体で処理した対照と比較して、ＲＰＡ染色強度の低下を示した（図４Ｃ）。染色強度の定量化により、媒体で処理した細胞の染色強度は、２３％が、最大値の７０％を超える強度を示すが、化合物で処理した細胞では、その値を超える染色強度を示すのは１５％に過ぎないことが明らかになった。これらのデータは、ＴＤＲＬ−５０５による細胞の処理が、細胞内でＤＮＡに結合したＲＰＡの量を減少させることを実証している。ここに図４Ｄを参照すると、図に示すように、Ｈ４６０細胞を、エトポシドなしでまたはエトポシド（２５μＭ）と共に媒体または１００μＭの化合物ＴＤＬＲ−５０５で処理した。ＲＰＡ発現を、ｐ３４サブユニットについて試験し、ウエスタンブロット解析により評価した。レーン１は、大腸菌（E.coli）発現系から精製したＲＰＡによる陽性対照である。非リン酸化ＲＰＡ ｐ３４および高リン酸化ＲＰＡ ｐ３４の位置が、矢印によって示される。これらのデータは、ＴＤＲＬ−５０５処理の関数として、ＲＰＡが分解されないか、または発現性が低下しないことを実証している。
【００４７】
化合物ＴＤＬＲ−５０５はＨ４６０細胞株におけるＧ１停止を誘発する
細胞周期進行への化合物ＴＤＬＲ−５０５の影響を評価するため、化合物ＴＤＬＲ−５０５を試験した。ｓｉＲＮＡによるＲＰＡのノックダウンは、Ｓ期のＤＮＡ複製の開始におけるＲＰＡの本質的役割に一致して、Ｇ１細胞周期停止を誘発することが実証されている（１９）。このことが、化合物ＴＤＬＲ−５０５が示す作用機序と同一のものであるかどうか確かめるために、Ｈ４６０細胞周期進行へのその影響を測定した。図５に提供されるデータによって例示されるように、同調された（synchronized）Ｈ４６０細胞は、ＴＤＲＬ−５０５で処理した場合、Ｓ期に再入する能力が無くなることが示される。
【００４８】
ここで図５Ａを参照する。Ｈ４６０ ＮＳＣＬＣ細胞を、０および７５μＭの化合物ＴＤＬＲ−５０５で４８時間処理し、次いで、フローサイトメトリーを用い細胞周期分布について解析した。図５Ｂでは、Ｈ４６０細胞を、０．８μｇ／ｍＬのノコダゾールで１２時間処理し、洗浄し、次いで媒体または１００μＭＴＤＬＲ−５０５のいずれかで４、８および１２時間処理した。次いで細胞を収穫し、フローサイトメトリーを用い細胞周期分布について解析した。
【００４９】
非同調（asynchronous）培養についての化合物ＴＤＲＬ−５０５の解析を試験し、ＴＤＲＬ−５０５による処理に応答して、Ｇ１期における細胞の割合の増加が観察された（図５Ａ）。化合物ＴＤＬＲ−５０５で処理した細胞で、Ｓ期に入るのが阻害されるかどうか確かめるため、細胞を、ノコダゾールによりＧ２／Ｍに同調させ、次いでＧ２停止から解放し、また媒体または化合物ＴＤＬＲ−５０５のいずれかを補った完全培地を再供給した。ここで図５Ｂを参照すると、ノコダゾールを除去した後、対照および処理した細胞の両方が急速に有糸分裂を経てＧ１に進行した。媒体だけで処理した細胞は、４時間の時点で見られるようにＧ１に入り、また８時間の時点でＳ期中への進行は明らかであり、１２時間の時点でＧ２への進行は明らかである。化合物ＴＤＬＲ−５０５で処理した細胞は、ノコダゾールからの解放後、細胞周期のＧ１期に進行したが、解放後１２時間でもＳ相に入らなかった。これらのデータは、ＴＤＲＬ−５０５が、肺癌細胞において、Ｇ１細胞周期停止を誘発することを実証している。
【００５０】
ＤＮＡ修復および複製におけるＲＰＡの役割の阻害
ＤＮＡ複製におけるその本質的役割の他に、かさのあるＤＮＡ付加体ならびに、種々の型の外因性および内因性因子によって誘発されるＤＮＡ切断（break）の修復のためＲＰＡが必要とされる。ｓｓＤＮＡとのＲＰＡの会合は、全てのこれらの経路の重要な特徴であり、この活性の阻害は、ＤＮＡ損傷により誘発される細胞毒性効果を増加させるであろう。シスプラチンへの細胞感受性に対するＲＰＡ阻害の効果を確かめるため、併用指数（ＣＩ）（２０）を測定した。ここで図６を参照する。この実験で例示されるように、化合物ＴＤＬＲ−５０５は、Ｈ４６０細胞内においてシスプラチンおよびエトポシドの両方と相乗的に作用する。Ｈ４６０細胞を、シスプラチンまたはエトポシドのいずれかのＩＣ５０濃度の分率を増加させながら、化合物ＴＤＬＲ−５０５と共に４８時間処理した。処理後、細胞を収穫し、アネキシンＶ／ＰＩフローサイトメトリーにより解析した。白丸は、ＴＤＬＲ−５０５とのシスプラチンのＣＩ解析を示し、黒丸は、ＴＤＬＲ−５０５とのエトポシドのＣＩ解析を表す。併用指数解析は、以前に記述したように行った（２０）。データは、平均±ＳＤ（Ｎ＝３から）として表される。シスプラチンと化合物ＴＤＬＲ−５０５とを組み合わせて使用する場合、細胞生存能は、いずれかの薬剤単独で誘発されるものを超えるレベルまで低下し、２種の化合物間の相乗作用をもたらし、また影響を受けた細胞の最高の割合（fraction）においてＣＩ ０．４をもたらした。影響を受けた細胞のより低い割合では、相互作用は相加的であり、次いで拮抗的（ＣＩ値が１を超えることから明らかになった）となった。これらの結果は、化合物ＴＤＬＲ−５０５が、Ｈ４６０細胞におけるシスプラチンの効果を増強することができ、またＮＥＲにおいてＲＰＡの細胞活性を阻害する点で一致することを実証している。エトポシドと相乗作用するＴＤＬＲ−５０５の能力も検討した。エトポシドは、複製フォークの停止およびＤＮＡ損傷応答を誘発し、両方ともＲＰＡを必要とする細胞過程である（２１）。シスプラチンについて上述したのと同じ解析を使用して、化合物ＴＤＬＲ−５０５は、影響を受けた細胞の全ての割合においてエトポシドとの相乗作用活性を示した（図６）。様々な細胞系において、ＲＰＡ ｐ３４が、エトポシド処理に応答して高リン酸化されることが示されている（２１、２２）。興味深いことに、ウエスタンブロット解析によりＲＰＡ ｐ３４の高リン酸化を解析すると、ＴＤＬＲ−５０５との同時処理によって変化せず、また全体的なＲＰＡ発現に劇的な変化がないことが明らかになった（図４Ｄ）。このデータは、ＴＤＬＲ−５０５による処理がエトポシド依存性のＤＮＡ損傷シグナル伝達応答には劇的に影響を及ぼさず、またＲＰＡの高リン酸化が存在する状態で、相乗作用が観察されることを実証している。
【００５１】
化合物ＴＤＬＲ−５０５のインビボ解析
ここで表３を参照する。ＴＤＲＬ−５０５がＮＳＣＬＣに対し妥当なＩＣ５０値を示していることが、肺癌腫瘍成長へのＲＰＡ阻害の効果のインビボ評価を促した。未処理マウスにおけるＴＤＲＬ−５０５投与の安全性を測定した。さらなるデータは、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの、０．７５％のツウィーン８０（Tween 80）における２５％ＤＭＳＯ製剤における化合物ＴＤＬＲ−５０５のＩＰ投与が、４００ｍｇ／ｋｇまで十分に許容されることを実証した。０．１％ツウィーン８０／メチルセルロースにおける経口投与も、８００ｍｇ／ｋｇまで十分に許容された。
【００５２】
ヒトＮＳＣＬＣ腫瘍細胞を移植したマウスに経口投与療法を受けさせた。腫瘍を１００ｍｍ３まで成長させ、その後ＴＤＬＲ−５０５または媒体による処理を開始した。図７において示される結果は、ＴＤＲＬ−５０５で処理したマウスにおいて、媒体による対照と比較して腫瘍成長が低減することを実証した。図７Ｂを参照すると、個々のマウスの解析は、媒体で処理した対照と比較した腫瘍成長の著しい低減を明らかにしている。
【００５３】
ＴＲＬ−５０５のインビボ抗癌活性に基づいて、ｉｐおよびｐｏ投与療法の両者について薬物動態パラメーターの比較を行った。未処理マウスに１回投与を行い、表３において記述されるように、種々の時間間隔で血液を採取し、この化合物向けに開発されたＨＰＣＬ／ＭＳＭＳプロトコルによりＴＲＤＬ−５０５濃度を測定した。データは、ｐｏと比較して、ｉｐ投与についてのほぼ全てのパラメーターにおいて著しくより良好なＰＫパラメーターを実証している。これらのデータは、ｉｐ投与が著しく大きな生体適合性をもたらし、またより一層大きな抗癌活性に導く、増大した効力をもたらすであろうことを示唆している。さらに、ＴＤＲＬ−５０６において用いられたモルホリノ修飾は、その経口生体適合性を向上させ、それによりＴＤＲＬ−５０６についてのより効果的な経口投与療法をもたらすはずである。
【００５４】
【表３】
【００５５】
ハイスループットスクリーニングおよび化学物質ライブラリーにおける進歩は、推定上の癌標的およびそれらの阻害剤の急激な増加を招いている。今日まで、大部分のこれらの標的となる酵素活性は、特定のタンパク質に関連していた。本明細書において例示されるように、非酵素的なＲＰＡのＤＮＡ結合活性を標的とすることは、全く新たな部類の、推定上の相互作用を切り開くことである。化合物ＴＤＬＲ−５０５は、細胞がＳ期に入ることを阻害し、かつ細胞毒性／細胞増殖抑制応答をもたらし、その結果は、ＤＮＡ複製の開始におけるＲＰＡの役割を阻害することと一致し、またこの過程は、複雑な一連の相互作用を包含する可能性があり、その１つは、ＲＰＡをＳ期のＣＤＫ依存性過程中の複製開始点へ投入することである（１９、２３）。これらのデータは、ＤＮＡ合成についてはっきりと実証するものではないが、ＲＰＡが化合物ＴＤＬＲ−５０５で処理した細胞の開始点に投入し得るかどうかを確かめることが残っている。ＴＤＬＲ−５０５の存在において細胞がＳ期から出てＧ２に入ることは、伸長においてＤＢＤ−Ａおよび−Ｂ ＤＮＡ相互作用があまり重要ではない可能性を示唆し、この場合ＲＰＡが主としてラギング鎖ＤＮＡ合成に関与する（２４）。ＤＮＡ複製の初期段階におけるＲＰＡの役割は、本発明者らが観察したＳ期内停止とは対照的に、Ｇ１停止を予測するものであろう。しかし、化合物ＴＤＬＲ−５０５で処理したＳ期細胞でＲＰＡ結合が低減し、したがって、後で複製フォークの伸長およびファイヤリング（firing）を阻害する可能性を除外することはできない。このことは、化合物ＴＤＬＲ−５０５によって死滅する細胞は、それらのＤＮＡを活発に複製する細胞であり、この複製を妨げることが、観察された細胞毒性の原因である可能性を提供する。しかし、Ｇ１停止を継続すると、時間的期間が延びた後に細胞死を誘発する可能性もあり、これは、処理４８時間後の細胞死の程度が、Ｓ期中に存在する細胞数を超える理由を説明するものである。このことは、ＲＰＡの細胞活性を阻害するＳＭＩを使用する癌治療の状況において、活発に分裂する細胞を専ら標的とする治療の窓領域が存在することを例示するものである。
【００５６】
ＤＮＡ修復におけるＲＰＡの役割も、その活性を阻害することが、併用療法と関連して、ＤＮＡ損傷を誘発する現在の化学療法の効力増進を可能としている。ＤＮＡ修復を阻害することは、持続性のＤＮＡ損傷を招き、それが細胞毒性を増加させると予想される。ＮＥＲの認識および確認ステップにおけるＲＰＡの不可欠な役割は十分に特徴付けされており、またさらにＲＰＡは、損傷したオリゴヌクレオチドの除去に続く再合成ステップに関与している（２５）。先行研究は、低下したレベルのＮＥＲタンパク質を有する細胞が、シスプラチン処理への感度増加を呈することを示している（２６）。これと一致して、本発明者らのデータは、影響を受ける細胞の高い割合での、化合物ＴＤＬＲ−５０５とシスプラチンとの間の相乗的相互作用を明らかにしている。興味深いことは、影響を受ける細胞の低い割合では、拮抗的相互作用が、併用指数が１を超えることと組み合わせて観察される。これはおそらく相互作用が、修復レベルの相互作用ではなく、シグナル伝達レベルの相互作用である結果であろう。シスプラチンはＧ２チェックポイントの活性化をもたらし、Ｇ２停止の延長からアポトーシスを誘発するので、化合物ＴＤＬＲ−５０５がＧ１で細胞をブロックするという発見は、より少ない細胞が、シスプラチンが誘発するＧ２停止に曝されるであろうことを示している。同様に、化合物ＴＤＬＲ−５０５の毒性がＧ１停止の延長に由来するならば、シスプラチンにより誘発されるＧ２チェックポイントでは、処理の結果として、より少ない細胞死がもたらされるであろう。高い濃度では、この効果が、ＤＮＡ修復のレベルにおけるＲＰＡ阻害との相互作用によって軽減されて、シスプラチンの毒性を増大させており、また拮抗的なシグナル伝達の相互作用を克服している。
【００５７】
ＤＮＡ複製再開始および崩壊した複製フォークの処理におけるＲＰＡの役割も、併用療法のための機会を提供する（２７、２８）。興味深いことに、化合物ＴＤＬＲ−５０５とのエトポシドの活性の併用指数解析では、影響を受ける細胞の全ての割合で相乗作用的活性を示した。エトポシドは、トポイソメラーゼＩＩ（トポＩＩ）の酵素活性を阻害し、ＤＮＡとの持続的な共有結合切断錯体をもたらし、これが複製フォーク停止ならびに１本および２本鎖の切断につながる（２９）。ＲＰＡがこれらの型の破壊およびＤＮＡ中間体に応答して、修復することが実証されており、この活性を阻害すると、本発明者らの解析において観察されるトポＩＩの阻害により見られる効果（２１）を増強すると予想される。第二に、これらの細胞の非同調特性のため、任意の所与の時間には、複製を受ける細胞は、複製ファイヤリングの種々の段階にあると予想される。ＲＰＡは、初期の複製ファイヤリングにおいて必要とされ、一方トポＩＩはその後の段階の複製事象に必要とされることが示されている（３０）。したがって、複製進行の両段階を阻害することは、このステップのいずれか一方を個別に阻害するよりも、大きな効果を示すと予想され、このことは、化合物ＴＤＬＲ−５０５とエトポシドの間の相乗的関係を意味するであろう。ＲＰＡ活性の阻害および経路機能の抑止は、癌治療における幅広い利用のための可能性を有する。いくつかの他の修理経路におけるＲＰＡの役割は、ＲＰＡ阻害剤を使用する併用療法への他の機会を開くものである。例えば、分子標的のＲＰＡ阻害を放射線療法と組み合わせると、非相同ＤＮＡの末端結合または相同ＤＮＡ組換え（いずれの修復もＲＰＡを必要とすることが示されている）によるＤＮＡ２本鎖の切断の修復を阻害することによって、腫瘍細胞中の細胞毒性を増大させることにつながる可能性がある（３１〜３３）。
【００５８】
小分子によってタンパク質の酵素活性を標的とすることも十分許容されるが、本明細書において提供される結果は、非酵素タンパク質−ＤＮＡ相互作用を標的とすることの実現性および有用性を実証している。これらの化合物は、ＲＰＡについての小分子阻害剤（ＳＭＩ）であって、これらはインビトロ活性および細胞活性の両方で能力発揮する。癌化学療法のためにＲＰＡを標的とするこの取組みは、ＲＰＡ活性の消失を防止するのに必要な効率的なバックアップ系の不在からもたらされる、冗長性欠如を含む、いくつかの特有の利点を有する。ＲＰＡを阻害することは幅広い有用性を有するであろう。なぜなら、細胞増殖を増加させまた化学療法によるＤＮＡ損傷剤を修復するためにＲＰＡに依存することは、どんな単一の癌に対しても固有ではないからである。本明細書において開示される小さな薬剤様の分子によって、ＲＰＡのＤＮＡ結合活性を標的とする場合、この部類のタンパク質を標的として、治療用化合物を作り出すことができることを例示している。
【００５９】
新規な技術が例示され、図面および上記の記述において詳細に記述されているが、このものは、特性において例示的であって、限定的ではないとみなすべきである。好ましい実施形態のみが示されかつ記述されており、また新規な技術の精神の範囲内となる全ての変更および修正が保護されるべきと所望されていると理解される。同様に、新規な技術が特定の例、理論的議論、説明および図を使用し例示されたが、これらの図およびそれに伴う考察は、決してこの技術を限定すると解釈されるべきではない。本出願において参照した全ての特許、特許出願、および本文への参考文献、科学的論文、出版物などは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
（参考文献）
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は、参照によりその全体を本明細書に組み込まれている２０１０年２月５日出願の米国仮特許出願第６１／３０１，７７８号の利益を主張する。
【０００２】
政府権利の申告
本発明の進展の間、研究の一部は、許可番号ＣＡ８２７４１のもとに合衆国国立衛生研究所（ＮＩＨ）からの政府援助により行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明のいくつかの態様は、複製タンパク質Ａ（Replication Protein A）の活性を少なくとも部分的に阻害する分子を特定することに関し、またこれらの分子を使用して、癌を含む過剰増殖性疾患を治療することができる。
【背景技術】
【０００４】
複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）は、７０、３４および１４ｋＤａサブユニットから構成されるヘテロ三量体１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）結合タンパク質である（１）。ＲＰＡのｓｓＤＮＡ結合活性は、ＤＮＡ複製、組換えおよび修復を含むいくつかのＤＮＡ代謝経路について必要とされる。ＤＮＡとの高親和性相互作用は、３つのサブユニットのそれぞれの上に存在する数多くのオリゴ糖／オリゴヌクレオチド結合（ＯＢ）−フォールド（fold）によって維持される（２、３）。単一のＯＢ−フォールドのＤＮＡ結合ポケットは、ｓｓＤＮＡの塩基３〜４個を収容する（４、５）。主なＯＢ−フォールド、すなわちＤＮＡ結合ドメインＡおよびＢ（ＤＢＤ−ＡおよびＤＢＤ−Ｂ）は、ｐ７０サブユニットの中心領域に存在し、ＲＰＡ−ｓｓＤＮＡ相互作用のための結合エネルギーの大部分をもたらしている（２）。個々のＯＢ−フォールドは、疎水性および塩基性アミノ酸と一緒に存在する、こぢんまりとしたモジュールドメインである。これらの構造的特徴により、ＯＢ−フォールドは、ＤＮＡ結合活性の小分子阻害剤（ＳＭＩ）を開発するための魅力的な標的となっている。細胞の成長およびＤＮＡ修復におけるＲＰＡの中心的役割を考慮すれば、ＲＰＡは、その活性を妨げることができる化合物を開発するための魅力的な標的である。本発明のいくつかの態様は、ＲＰＡと相互作用する化合物、ならびにその化合物を使用して、細胞成長および細胞死に影響を及ぼす方法を包含する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の種々の態様は、複製タンパク質Ａの活性を低下させる方法および化合物、真核細胞の増殖、真核細胞の細胞周期に影響を及ぼす方法および化合物、ならびに／または癌を治療する方法および化合物であって、複製タンパク質Ａを、下記のコア構造：
【０００６】
【化１】
を含む化合物Ａまたはその代謝産物（metabolite）などの化合物と接触させるステップによる方法および化合物を包含する。
【０００７】
いくつかの実施形態において、このコア構造を含む化合物またはその代謝産物と接触させた真核細胞をさらに、ＤＮＡを直接損傷させる、またはトポイソメラーゼＩＩを阻害する少なくとも１つの化合物と接触させる。このような化合物には、シスプラチン、エトポシド、ブスルファン、ベンダムスチン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、デシタビン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロミド、トポテカンなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０００８】
本発明のいくつかの態様は、複製タンパク質Ａの活性を低下させる方法であって、化合物Ａを提供するステップであって、この化合物Ａは複製タンパク質Ａに結合する、または、代謝されて複製タンパク質Ａに結合する化学物質（chemical）となり、化合物は下記の式：
【０００９】
【化２】
（式中、Ｒ１は、５−（７−クロロ−２，３−ジヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キノリン−８−イル）、５−（キノキサリン−６−イル）および６−クロロ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｇ］キノリン−７−イルを含む、置換キノリン、チオフェンおよびフェニルからなる群から選択され；Ｒ２は、水素、ハロゲン、メチル基、ニトロ基からなる群から選択され、ここで、化合物Ａ、または化合物Ａの代謝産物が複写タンパク質Ａに結合し；Ｒ３は、ケト酪酸および
【００１０】
【化３】
からなる群から選択され、式中、ｎ＝１、２、３、４または５である）を有するステップを含む方法を包含する。いくつかの実施形態において、化合物Ａ中のキノリンまたはフェニルは、ハロゲン、メチル基、エチル基、アミノ基およびピラゾールからなる群から選択される少なくとも１つの部分で置換されている。いくつかの実施形態において、化合物Ａ中のＲ１は、２−クロロ−７−エトキシキノリン、５（キノキサリン−６−イル）、２−クロロ−６，７−ジメトキシキノリン、２−クロロ−６−エトキシキノリン、４−ブロモフェニル、４−フルオロフェニル、４−クロロフェニル、２−クロロフェニル、２−メトキシフェニル、４−エチルフェニル、４−ジエチルアミノフェニル、４−ジメチルアミノフェニル、チオフェン、４−メトキシフェニル、ｐ−トリル、２，５−ジメトキシフェニル、３，４−ジメトキシフェニル、４−エチルフェニルおよび１−フェニル−３−ｐ−トリル−１Ｈ−プリアゾール（pryazole）からなる群から選択され、化合物Ａ中のＲ２は、４−ブロモ、４−クロロ、４−ニトロ、４−メチル、４−メトキシ、Ｈ、３，４−ジメチルからなる群から選択される。
【００１１】
いくつかの実施形態において、複製タンパク質Ａに結合する分子は、化合物Ａの誘導体またはその代謝産物である。またいくつかの実施形態において、複製タンパク質Ａに結合する分子は、化合物ＴＤＬＲ−５０５、化合物ＴＤＬＲ−５０６またはそれらの代謝産物である。
【００１２】
さらに他の実施形態において、化合物Ａまたはその代謝産物のいずれかと複製タンパク質Ａの少なくとも１つのアイソフォーム（isoform）とを接触させるステップは、インビボ（in vivo）で行われる。さらに他の実施形態において、化合物Ａまたはその代謝産物と、複製タンパク質Ａの少なくとも１つのアイソフォームとを接触させるステップは、インビトロ（in vitro）で行われる。
【００１３】
本発明の他の態様は、真核細胞の細胞周期進行（cycle-progression）を変化させることにより細胞増殖を阻害する方法であって、真核細胞の細胞周期進行を妨げる化合物Ａ、または代謝されて真核細胞の細胞周期進行を妨げる化学物質となる化合物Ａを提供するステップであって、化合物Ａが、下記の式：
【００１４】
【化４】
（式中、Ｒ１は、５−（７−クロロ−２，３−ジヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キノリン−８−イル）、５−（キノキサリン−６−イル）および６−クロロ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｇ］キノリン−７−イルを含む、置換キノリン、チオフェンおよびフェニルからなる群から選択され；Ｒ２は、水素、ハロゲン、メチル基、ニトロ基からなる群から選択され、ここで、化合物Ａ、または化合物Ａの代謝産物は複製タンパク質Ａに結合し；Ｒ３は、ケト酪酸および：
【００１５】
【化５】
からなる群から選択され、式中、ｎ＝１、２、３、４または５である）を有するステップを含む方法を包含する。いくつかの実施形態において、化合物Ａ中のキノリンまたはフェニルは、ハロゲン、メチル基、エチル基、アミノ基およびピラゾールからなる群から選択される少なくとも１つの部分で置換されている。いくつかの実施形態において、化合物Ａ中のＲ１は、２−クロロ−７−エトキシキノリン、５（キノキサリン−６−イル）、２−クロロ−６，７−ジメトキシキノリン、２−クロロ−６−エトキシキノリン、４−ブロモフェニル、４−フルオロフェニル、４−クロロフェニル、２−クロロフェニル、２−メトキシフェニル、４−エチルフェニル、４−ジエチルアミノフェニル、４−ジメチルアミノフェニル、チオフェン、４−メトキシフェニル、ｐ−トリル、２，５−ジメトキシフェニル、３，４−ジメトキシフェニル、４−エチルフェニル、および１−フェニル−３−ｐ−トリル−１Ｈ−プリアゾール（pryazole）からなる群から選択され；および化合物Ａ中のＲ２は、４−ブロモ、４−クロロ、４−ニトロ、４−メチル、４−メトキシ、Ｈ、３，４−ジメチルからなる群から選択される。
【００１６】
いくつかの実施形態において、真核細胞の細胞周期進行を少なくとも部分的に妨げる化合物は、化合物Ａまたはその代謝産物である。さらに他の実施形態において、真核細胞の細胞周期進行を妨げる化合物は、化合物ＴＤＬＲ−５０５、ＴＤＬＲ−５０６またはそれらの代謝産物である。いくつかの実施形態において、化合物Ａまたはその代謝産物と複製タンパク質Ａとの間での接触させるステップは、インビボで行われる。
【００１７】
さらに他の実施形態は、ヒトまたは動物の患者を治療する方法であって、少なくとも１つの治療的に活性な量の、ＲＰＡの活性を阻害する少なくとも１つの化合物またはその薬学的に許容可能な塩を供給または提供するステップを含む方法を包含する。いくつかの実施形態は、ある用量のその化合物を患者に投与するステップであって、その用量が、その患者の体重１ｋｇ−１当たり前記化合物約５０ｍｇ、またはその患者の体重１ｋｇ−１当たり前記化合物約１００ｍｇ、またはその患者の体重１ｋｇ−１当たり前記化合物約２００ｍｇであるステップを包含する。
【００１８】
さらに他の実施形態において、前記化合物Ａまたはその代謝産物と、複製タンパク質Ａとを接触させるステップは、インビトロで行われる。本発明のさらに他の態様は、癌の治療方法であって、化合物を提供するステップであって、その化合物は癌細胞の細胞周期を妨げ、またはその化合物は代謝されて癌細胞の細胞周期を妨げる化学物質となり、またその化合物は、下記の式：
【００１９】
【化６】
（式中、Ｒ１は、置換キノリン、チオフェンおよびフェニルからなる群から選択され、化合物ＡにおいてＲ２は、ハロゲン、メチル基、ニトロ基からなる群から選択される）を有し、ここで、化合物Ａは複製タンパク質Ａに結合するステップと；前記化合物Ａを、少なくとも１の癌細胞と接触させるステップとを含む方法を包含する。いくつかの実施形態において、化合物Ａ中のキノリンまたはフェニルは、ハロゲン、メチル基、エチル基、アミノ基およびピラゾールからなる群から選択される少なくとも１つの部分で置換されている。いくつかの実施形態において、化合物Ａ中のＲ１は、２−クロロ−７−エトキシキノリン、５（キノキサリン−６−イル）、２−クロロ−６，７−ジメトキシキノリン、２−クロロ−６−エトキシキノリン、４−ブロモフェニル、４−フルオロフェニル、４−クロロフェニル、２−クロロフェニル、２−メトキシフェニル、４−エチルフェニル、４−ジエチルアミノフェニル、４−ジメチルアミノフェニル、チオフェン、４−メトキシフェニル、ｐ−トリル、２，５−ジメトキシフェニル、３，４−ジメトキシフェニル、４−エチルフェニル、および１−フェニル−３−ｐ−トリル−１Ｈ−プリアゾール（pryazole）からなる群から選択され；および化合物Ａ中のＲ２は、４−ブロモ、４−クロロ、４−ニトロ、４−メチル、４−メトキシ、Ｈ、３，４−ジメチルからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、癌細胞と接触させる化合物は、化合物Ａまたはその代謝産物である。またいくつかの実施形態において、癌細胞と接触させる化合物は、化合物ＴＤＬＲ−５０５、ＴＤＬＲ−５０６またはそれらの代謝産物である。いくつかの実施形態において、前記化合物またはその代謝産物と癌細胞との間での接触させるステップは、インビボで行われる。またさらに他の実施形態において、前記化合物Ａまたはその代謝産物と癌細胞との間での接触させるステップは、インビトロで行われる。いくつかの実施形態において、この癌細胞は、肺癌、非小細胞、小細胞、上皮性卵巣癌（epithelial ovarian cancer）、子宮頸癌、大腸（colon）癌および乳癌からなる群から選択される固形腫瘍中に見出される。本発明のいくつかの実施形態は、癌細胞を、直接ＤＮＡと結合するかもしくはＤＮＡを損傷させる、またはトポイソメラーゼＩＩの活性を低下させる少なくとも１つの化学療法試薬と接触させるステップをさらに包含する。いくつかの実施形態において、この化学療法試薬は、シスプラチンおよびエトポシドからなる群から選択されるが、これらに限定されない。このような化合物には、ブスルファン、ベンダムスチン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、デシタビン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロミド、トポテカンなどが含まれるが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】化合物３の図である。
【図１Ｂ】ＤＮＡへのＲＰＡ結合を阻害する化合物３のＥＭＳＡの図である。
【図１Ｃ】ＤＮＡへのＲＰＡ結合を阻害する化合物３のＥＭＳＡデータをプロットした図である。
【図２Ａ】化合物Ａのケト酪酸誘導体の図である。
【図２Ｂ】化合物ＴＤＬＲ−５０５の図である。
【図２Ｃ】ＤＮＡへのＲＰＡ結合を阻害する化合物ＴＤＬＲ−５０５のＥＭＳＡの図である。
【図２Ｄ】ＤＮＡへのＲＰＡ結合を阻害するＴＤＲＬ−５０５のＥＭＳＡデータをプロットした図である。
【図３】ＤＮＡへのＲＰＡ結合を阻害する化合物ＴＤＬＲ−５０６のＥＭＳＡの図である。
【図４Ａ】ＴＤＲＬ−５０５により誘発された細胞死を測定する、アネキシンＶ／ＰＩにより染色したＨ４６０細胞を点プロットした図である。
【図４Ｂ】化合物ＴＤＬＲ−５０５の種々の濃度で測定した細胞死データをプロットした図である。
【図４Ｃ】抗ＲＰＡ抗体により試験し（probed）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ抗体により視覚化した、ＲＰＡによる細胞局在の免疫蛍光検査の図である。
【図４Ｄ】化合物ＴＤＲＬ−５０５処理の関数としてのＲＰＡのｐ３４サブユニットのウエスタンブロットを示す図である。
【図５Ａ】化合物ＴＤＬＲ−５０５で処理したＨ４６０ ＮＳＣＬＣ細胞の細胞周期分布の図である。
【図５Ｂ】ノコダゾールで処理し、次いで化合物ＴＤＬＲ−５０５で４、８または１２時間処理したＨ４６０細胞の細胞周期分布の図である。
【図６】化合物ＴＤＬＲ−５０５と、シスプラチン（白丸）またはエトポシド（黒丸）のいずれかとにより同時処理したＨ４６０細胞における相乗作用の解析を示す図である。
【図７Ａ】マウス異種移植モデルにおける非小細胞肺癌に対するＴＤＲＬ−５０５のインビボ抗癌活性を示す図である。腫瘍体積を測定し、時間に対しプロットした。データは平均±Ｓ．Ｅ（ｎ＝５）として表される。
【図７Ｂ】異種移植モデルにおいて評価した個々のマウスにおける非小細胞肺癌に対するＴＤＲＬ−５０５のインビボの抗癌活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
新規技術の原理の理解を進める目的で、ここで、その好ましい実施形態を参照し、それを記述するため特定の用語が使用されるであろう。しかし、それにより、新規技術の範囲を何ら制約するものではないことが意図され、新規技術の原理のこのような変更、修正およびさらなる適用が、新規技術に関連する当業者に通常起こるものと企図される点が理解されるであろう。
【００２２】
特にまたは暗黙のうちに言及しない限り、本明細書において使用される用語「約」は、±１０パーセントを意味する。例えば、「約１．０」は、０．９〜１．１の範囲を包含する。
【００２３】
治療有効用量は、患者の健康または快適さへの単一のまたは累積された有益な効果を有する生物学的に活性な化合物の量である。
【００２４】
ＲＰＡ−ＤＮＡ相互作用の阻害は、癌細胞における数多くの特異的に制御される経路に強い影響を与える可能性がある。ＤＮＡ複製において、ＲＰＡ阻害を用いて、Ｓ期の細胞の大きな個体数によって特徴付けられる癌細胞の高度に増殖的な特性を利用することができる。ＲＰＡはまた、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）を含む、細胞におけるいくつかのＤＮＡ修復経路においても不可欠である。種々の癌治療において使用される一般的化学療法薬であるシスプラチンは、主としてＮＥＲ経路によって修復される鎖内共有結合ＤＮＡ付加体（adduct）の形成により、その細胞毒性効果を誘発する（６）。したがって、シスプラチン治療は、ＲＰＡ ｓｓＤＮＡ結合活性の低下と同時に、シスプラチン−ＤＮＡ付加体の細胞修復効率の低下をもたらし、細胞毒性を増加させると期待される。こうして、ＲＰＡを標的とすることは、単一薬剤の活性についての可能性だけではなく、シスプラチン、エトポシドおよび電離放射線（ＩＲ）などの、ＤＮＡ損傷および遺伝子不安定性を誘発する治療に対して癌細胞を増感する可能性をも有する。ブスルファン、ベンダムスチン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、デシタビン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロミド、トポテカンなどである。
【００２５】
本明細書において開示されるように、ＲＰＡのｓｓＤＮＡ結合活性を阻害する小分子が特定されている。細胞ＲＰＡの阻害は、Ｓ期に入る能力の欠如、細胞死の誘発ならびに化学療法試薬シスプラチンおよびエトポシドとの相乗的活性をもたらす。ＲＰＡのｓｓＤＮＡ結合活性を阻害することができるこれらの小分子は、癌細胞を殺すために、単剤として、また一般に使用される化学療法薬と併用してのいずれでも活性である。インビボにおいて、これらの化合物は、明らかな毒性の兆候なしにＩＰおよび強制経口投与により２００ｍｇ／ｍｇまでマウスに安全に投与することができ、マウス異種移植（xenograft）モデルにおいてヒト非小細胞肺癌に対する抗癌活性を有する。
【００２６】
材料および方法
ＴＤＲＬ５０５誘導体の合成
ここでスキーム１を参照する。市販の、１などのケトンおよび２などのアルデヒドをクライゼン−シュミット縮合に掛けて、３などのエノンを生成し、これを、ヒドラジンなどの試薬を使用して環化して、４などのＨ１ピラゾールを生成することができる。５などの種々の酸によりアミド結合の化学作用を用いて、このピラゾールのＮ１位を修飾して、６の例示的化合物ＴＤＲＬ−５０５などの化合物を形成する。
【００２７】
【化７】
【００２８】
ＴＤＲＬ５０６誘導体の合成
ここでスキーム２を参照する。ＴＤＲＬ−５０５および３−モルホリノプロパン−１−アミン（２）から、ＥＤＣカップリングによりＴＤＲＬ−５０６を調製した。
【００２９】
【化８】
【００３０】
インビトロ解析
小分子阻害剤をＣｈｅｍＤｉｖから得て、ＤＭＳＯ中に再懸濁させた。化合物ＴＤＬＲ−５０５を独立に合成し、質量分析解析により構造を確認した。以前に記述した大腸菌（E. coli）過剰発現系を使用して、ヒトＲＰＡを精製した（７）。以前に記述したように、２５ｎＭ ＲＰＡ、２５ｎＭ ５’［３２Ｐ］標識３４塩基対ＤＮＡを含有する２０μＬ反応物中でＥＭＳＡを行った（７）。ＤＭＳＯの最終濃度は１％であった。
【００３１】
フローサイトメトリー
Ｈ４６０細胞のアポトーシスは、アネキシン（Annexin）Ｖ−ＦＩＴＣヨウ化プロピジウム（ＰＩ）Ｖｙｂｒａｎｔアポトーシスアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造業者の取扱説明書に従って解析した。細胞を、１ｃｍ２当たり１×１０４個の細胞密度で平板培養し、２４時間付着させ、次いで化合物ＴＤＬＲ−５０５で４８時間処理した。上述のＨ４６０細胞の平板培養および処理に続いて、付着および非付着細胞を収集し、処理し、ＢＤ ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターで解析した。ＷｉｎＭＤＩソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｆａｃｓ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｈｔｍｌ）を使用してデータを解析した。細胞周期解析は、ＰＩ染色により行った。簡単に言うと、細胞を平板培養し、化合物で処理し、収集し、次いで１％ＢＳＡを補ったＰＢＳ−ＥＤＴＡで２回洗浄した。渦流中で細胞を−２０℃において７０％ＥｔＯＨ中に固定し、続いて氷上で３０分間インキュベートした。次いで細胞を収集し、ＰＩ溶液（１％ＢＳＡを補ったＰＢＳ−ＥＤＴＡ中、１０μｇ／ｍＬのＰＩおよび２５μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅＡ）で染色した。細胞を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターで解析した。細胞はゲートをかけ、ＦＬ２−Ａパラメーターに対してプロットした結果のヒストグラムについて解析した。ＭｏｄＦｉｔソフトウエアを使用し、細胞周期分布を解析した。０．８μｇ／ｍＬノコダゾールによる処理によって１２時間のＧ２停止を誘発した（１０）。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、媒体（vehicle）または化合物ＴＤＬＲ−５０５（１００μＭ）のいずれかで処理した。細胞を収穫し、上述の細胞周期分布について解析した。
【００３２】
間接免疫蛍光検査
Ｈ４６０細胞を、上述のようにチャンバースライド（ＬａｂＴｅｋ）上で平板培養した。次いで、示したように５０μＭの化合物ＴＤＬＲ−５０５または媒体のいずれかで細胞を３時間処理し、処理に続いて、細胞を２５℃において４％パラホルムアルデヒド中で３分間固定し、続いて４℃において０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で２分間洗浄した。次いで、スライドをＰＢＳ中１５％のＦＢＳ中において２５℃で１時間ブロックし、次いで、１５％ＦＢＳ中における希釈１：５００で抗ＲＰＡ３４一次抗体（Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ）と共に１時間インキュベートした。次いで、スライドを１５％ＦＢＳで１０分ずつ３回洗浄し、次いで希釈１：３００でＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−５９４ヤギ抗マウス二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に１時間インキュベートした。スライドを再び洗浄し、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ中に希釈した３００ｎＭ ＤＡＰＩで５分間染色した。次いで、スライドを装着し、Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡を使用して画像を捕え、そしてＲＰＡ染色を視覚化するテキサスレッドおよびＤＮＡを視覚化するＤＡＰＩ用フィルターを使用して画像を捕えた。スライドを視覚化し、ＩｍａｇｅＪソフトウエアを使用して画像を解析し、定量した。
【００３３】
ウエスタンブロット解析
Ｈ４６０細胞を平板培養し、２５μＭエトポシドの存在下または不在下において媒体または１００μＭの化合物ＴＤＬＲ−５０５のいずれかで６時間処理し、次いでＲＩＰＡ溶解および抽出手順を使用しウエスタンブロット解析のため処理した。抗ＲＰＡ ｐ３４抗体（Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ）およびヤギ抗マウスＨＲＰ二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）によりＲＰＡを検出した。化学発光検出を使用して、バンドを視覚化した。
【００３４】
インビボ解析
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（８週齢）に、化合物ＴＤＬＲ−５０５を、２００ｍｇ／ｋｇで１週当たり２回２週間ＩＰ注入投与した。明らかな毒性の兆候についてマウスを監視し、また１週当たり３回体重を測定した。マウスを犠牲にして、全身死体解剖を行って、臓器重量を調べ、毒性の兆候を試験した。ＴＤＬＲ−５０５を約２００ｍｇ／ｍｇの投与量レベルでマウスに経口投与した場合、ＴＤＬＲ−５０５に毒性がある兆候はなかった。次いで、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、０．２ｍｌの５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ中のＨ４６０細胞５×１０６個を皮下に移植した。腫瘍を７日間成長させ、またＴＤＲＬ−５０５を１週当たり２回強制経口投与により１週間投与した。腫瘍の幅および長さを測定し、これらの測定値を式：体積＝ｌ×ｗ２／２で使用することにより、腫瘍の体積を計算した。
【００３５】
薬物動態解析。ＴＤＲＬ−５０５をｉｐまたはｐｏのいずれかでマウスに２００ｍｇ／ｋｇ投与し、処理後１、２、４、８、２４および４８時間に、血液を採取した。ＴＤＲＬ−５０５の血清濃度を、ＨＰＬＣ ＭＳ／ＭＳプロトコルを使用して測定し、またオンコンパートメント（on-compartment）解析を用いＰＫパラメーター解析を行った。
【００３６】
結果
ＲＰＡの小分子阻害剤の特定
以前の研究から、ＲＰＡのＤＮＡ結合活性を阻害するが、細胞活性（cellular activity）を示さないＮＣＩライブラリーからの一連の小分子が特定された（８）。さらなる研究は、最初のアッセイ法に蛍光偏光（ＦＰ）修正を加えたものを使用して、ＣｈｅｍＤｉｖライブラリーのスクリーニングを企てた。ここに図１Ａ、ＢおよびＣを参照すると、ハイスループットスクリーニングから化合物３が特定され、かつ二次アッセイにおいて電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を使用して解析し、阻害性を確認した。図１Ｂおよび１Ｃにより示されるように、ＥＭＳＡ解析によりＲＰＡ ＤＮＡ結合の著しい阻害が観察され、データの定量化がこの阻害性の証拠となっている。
【００３７】
ここに図２ＡおよびＢを参照する。化合物Ａのコア構造において化合物を使用して観察された高レベルのインビトロＲＰＡ阻害性を考慮して、このコア構造を、Ｎ１位置に４−オキソブタン酸およびＣ３にフェニル置換基を有するジヒドロピラゾールで置換して、構造活性相関（ＳＡＲ）の解析を開始し、また細胞活性を有する他の化合物を探究した。ＣｈｅｍＤｉｖライブラリーから、フェニル環（Ｒ２）外に種々の置換を有し、またジヒドロピラゾール環（Ｒ１）のＣ５位置に種々の置換基を有する８１個の類似体が特定され、得られた（データは示さない）。解析した化合物の中で、化合物ＴＤＲＬ−５０５（図２Ｂ）が、試験された最も効力のあるＲＰＡ阻害剤であり、ＩＣ５０値１３μＭを有していた（表１）。二次スクリーニングにおいて、ＴＤＲＬ ５１８およびＴＤＲＬ ５２０〜５２３を含むいくつかの化合物も、インビトロＲＰＡ阻害活性を有するとして、または、ＲＰＡ活性を阻害することが見出された小分子と同様の化学的特性を有するとして特定された。さらに表１を参照すると、表１のそれぞれの化合物は、インビボで、またはインビトロの細胞でＲＰＡに対し滴定して、そのＩＣ５０値を測定した。表１に示すように、これらの化合物は、ＲＰＡ−ｓｓＤＮＡ相互作用を阻害する異なる能力を示した（表１）。それぞれの化合物の細胞活性を測定するために、Ｈ４６０ ＮＳＣＬＣ細胞株における細胞死の誘発を測定し、４８時間曝露後のそれぞれの化合物のＩＣ５０値を測定した。これらのデータは、表１にも示されており、インビトロ活性と細胞活性との間の相関性を明らかにしており、これらは細胞のＲＰＡ阻害性と一致し、またＲＰＡ阻害の特異性を示している。しかし、インビトロにおいて最小のＲＰＡ−ｓｓＤＮＡ相互作用阻害性を示した化合物５２３も、わずかに細胞活性を呈していた。このことは、細胞がこの化合物を代謝して、より効果的なＲＰＡ阻害剤を生成した結果である可能性がある。化合物３類似体についての細胞およびインビトロ阻害活性の解析は、化合物ＴＤＬＲ−５０５が、最も低いインビトロＩＣ５０値を示し、また細胞で試験したもののうち最も効力のある化合物であることを示した。したがって、この化合物は、広範な一連のインビトロの、細胞に基づく、およびインビボアッセイ法を使用する、その作用機序ならびに、ＲＰＡ−ｓｓＤＮＡ相互作用の阻害からもたらされる細胞効果の検討を含む、さらなる検討のため選択された。
【００３８】
ここで表１を参照すると、インビトロＩＣ５０は、図１Ａに示したようにＥＭＳＡ解析により測定した。細胞ＩＣ５０値は、Ｈ４６０細胞を、示した化合物で処理し、方法で記述したようにアネキシンＶ／ＰＩ染色物を解析することにより測定した。インビトロおよび細胞データを、標準的４パラメーターロジスティック曲線を使用して解析した。この解析からＩＣ５０値および適合の標準誤差を決定した。
【００３９】
ここで表２を参照する。表２における化合物は市販され、インビトロでＲＰＡ−ＤＮＡ結合活性を阻害することが実証されてもいる。簡単に言うと、「ｍ」は、オキソペンタン酸修飾およびキノリン外でのジオキシノール置換を有し；「ｎ」は、オキソペンタン酸修飾およびキノリンのキノキサリン−イル置換を有し；「ｒ」は、ブタン酸およびキノリン外でのジオキソロ置換を有する。
【００４０】
酪酸およびモルホリノ誘導体を含む、化合物ｍおよびｎの誘導体を作製する。フェニル環上でｐ−メチルがｐ−ブロモで置き換えられる。Ｂｒ−フェニル基およびモルホリノ基を有する「ｒ」の誘導体も作製される。本明細書において記述したＳＡＲデータは、酪酸をより長くすると（例えばペンタン酸）幾分活性を損なうように見え、しかし側鎖全体を除去するとＲＰＡ阻害活性を実質的に失う結果になることを示している。したがって、より少ない炭素スペーサーを有する、より短いモルホリノ誘導体が望ましいものである。
【００４１】
ＲＰＡの７０ｋＤａサブユニットにおけるＤＢＤ−ＡおよびＢを標的とする、ＲＰＡのＤＮＡ結合活性のインビトロ阻害
ここで図２Ｃ、ＤおよびＥ、化合物ＴＤＬＲ−５０５のＥＭＳＡ解析を参照する。簡単に言うと、３４塩基ｓｓＤＮＡ基質を使用して、濃度の増加する化合物ＴＤＲＬ−５０５をＲＰＡと一緒に前インキュベートし、ＥＭＳＡにより、ＤＮＡ結合活性を評価した。ここで図２Ｄを参照すると、図２Ｃ中に存在するゲルの定量化を示している。ここで図２Ｄを参照すると、各点の平均および標準偏差を表している。データは、Ｎ＝４を有する標準的４パラメーターロジスティック曲線に適合させた。
【００４２】
【表１】
【００４３】
【表２】
【００４４】
ＴＤＲＬ−５０５の修飾；ＴＤＲＬ−５０６の解析
ここでスキーム２を参照する。ＴＤＲＬ−５０６を合成し、精製し、インビトロＲＰＡ阻害活性について評価した。図３を参照すると、ＴＤＲＬ−５０６は、完全長ＲＰＡヘテロ三量体レーン１〜７およびＤＢＤ−Ａ／Ｂコンストラクト（レーン８〜１２）の両方に対するＲＰＡ阻害活性について評価した。使用した濃度は、ＴＤＲＬ−５０６の２５、５０、７５および１００□Ｍであった。データは、モルホリノ修飾を含有するＴＤＲＬ−５０６化合物が、完全にＲＰＡ阻害活性を保有することを実証している。
【００４５】
ＴＤＲＬ−５０５による癌細胞死の誘発
ここで、図４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄを参照すると、Ｈ４６０ ＮＳＣＬＣ細胞株における細胞死および細胞周期進行の誘発に対する化合物ＴＤＲＬ−５０５の効果を測定した。簡単に言うと、Ｈ４６０細胞を化合物ＴＤＲＬ−５０５で４８時間処理し、アネキシンＶ／ＰＩによる染色によって細胞生存能について分析し、点プロットとして示した（図３Ａを参照されたい）。ここで図４Ｂを参照すると、図４Ａからのデータを定量化し、生存細胞を示すアネキシン−／ＰＩ−細胞（四分の一区分の左下）の百分率を計算した。平均±ＳＤ（Ｎ＝４）を示し、データを４パラメーターロジスティック曲線に適合させた。これらのデータは、ＴＤＲＬ−５０５が、ＮＳＣＬＣ細胞中に細胞死を誘発することが可能であることを実証している。細胞生存能への化合物ＴＤＬＲ−５０５の影響の独立した測定値としてクリスタルバイオレット染色アッセイを使用し、ＩＣ５０値６４μＭをもたらした（データは示さない）。化合物ＴＤＬＲ−５０５によるＡ５４９ ＮＳＣＬＣ細胞株の処理においても、同様な結果が観察されたが、一方で新たに単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用した解析では、最小限の細胞毒性活性を示した（データは示さない）。これらの実験において、化合物ＴＤＬＲ−５０５は、ＮＳＣＬＣ細胞株において顕著な細胞毒性効果を示すが、非癌性細胞ではほんのわずかな活性しか示さず、これらの分子についての治療処置の窓領域が存在することを示している。
【００４６】
化合物ＴＤＬＲ−５０５による処理後に見られるこれらの細胞効果は、ＲＰＡがＤＮＡと相互作用できないことと相関し、これにより、次いで、細胞内におけるＲＰＡの分解または再分布を含む数多くの可能性をもたらし得るであろう。間接免疫蛍光検査を使用して、ＲＰＡ結合の阻害が細胞の局在にどのように影響するかを評価した。ここで図４Ｃを参照すると、Ｈ４６０細胞を化合物ＴＤＬＲ−５０５または媒体で３時間処理し、ＲＰＡ発現および局在について、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４二次抗体（赤色）を使用し間接免疫蛍光検査により解析した。スライドをＤＡＰＩ（青色）で対比染色し、画像を併合させた。箱で囲んだ細胞の拡大図を、低倍率の画像の下方に示している。簡単に言うと、化合物ＴＤＬＲ−５０５で３時間処理した後、細胞は、全体として細胞内局在に変化のない媒体で処理した対照と比較して、ＲＰＡ染色強度の低下を示した（図４Ｃ）。染色強度の定量化により、媒体で処理した細胞の染色強度は、２３％が、最大値の７０％を超える強度を示すが、化合物で処理した細胞では、その値を超える染色強度を示すのは１５％に過ぎないことが明らかになった。これらのデータは、ＴＤＲＬ−５０５による細胞の処理が、細胞内でＤＮＡに結合したＲＰＡの量を減少させることを実証している。ここに図４Ｄを参照すると、図に示すように、Ｈ４６０細胞を、エトポシドなしでまたはエトポシド（２５μＭ）と共に媒体または１００μＭの化合物ＴＤＬＲ−５０５で処理した。ＲＰＡ発現を、ｐ３４サブユニットについて試験し、ウエスタンブロット解析により評価した。レーン１は、大腸菌（E.coli）発現系から精製したＲＰＡによる陽性対照である。非リン酸化ＲＰＡ ｐ３４および高リン酸化ＲＰＡ ｐ３４の位置が、矢印によって示される。これらのデータは、ＴＤＲＬ−５０５処理の関数として、ＲＰＡが分解されないか、または発現性が低下しないことを実証している。
【００４７】
化合物ＴＤＬＲ−５０５はＨ４６０細胞株におけるＧ１停止を誘発する
細胞周期進行への化合物ＴＤＬＲ−５０５の影響を評価するため、化合物ＴＤＬＲ−５０５を試験した。ｓｉＲＮＡによるＲＰＡのノックダウンは、Ｓ期のＤＮＡ複製の開始におけるＲＰＡの本質的役割に一致して、Ｇ１細胞周期停止を誘発することが実証されている（１９）。このことが、化合物ＴＤＬＲ−５０５が示す作用機序と同一のものであるかどうか確かめるために、Ｈ４６０細胞周期進行へのその影響を測定した。図５に提供されるデータによって例示されるように、同調された（synchronized）Ｈ４６０細胞は、ＴＤＲＬ−５０５で処理した場合、Ｓ期に再入する能力が無くなることが示される。
【００４８】
ここで図５Ａを参照する。Ｈ４６０ ＮＳＣＬＣ細胞を、０および７５μＭの化合物ＴＤＬＲ−５０５で４８時間処理し、次いで、フローサイトメトリーを用い細胞周期分布について解析した。図５Ｂでは、Ｈ４６０細胞を、０．８μｇ／ｍＬのノコダゾールで１２時間処理し、洗浄し、次いで媒体または１００μＭＴＤＬＲ−５０５のいずれかで４、８および１２時間処理した。次いで細胞を収穫し、フローサイトメトリーを用い細胞周期分布について解析した。
【００４９】
非同調（asynchronous）培養についての化合物ＴＤＲＬ−５０５の解析を試験し、ＴＤＲＬ−５０５による処理に応答して、Ｇ１期における細胞の割合の増加が観察された（図５Ａ）。化合物ＴＤＬＲ−５０５で処理した細胞で、Ｓ期に入るのが阻害されるかどうか確かめるため、細胞を、ノコダゾールによりＧ２／Ｍに同調させ、次いでＧ２停止から解放し、また媒体または化合物ＴＤＬＲ−５０５のいずれかを補った完全培地を再供給した。ここで図５Ｂを参照すると、ノコダゾールを除去した後、対照および処理した細胞の両方が急速に有糸分裂を経てＧ１に進行した。媒体だけで処理した細胞は、４時間の時点で見られるようにＧ１に入り、また８時間の時点でＳ期中への進行は明らかであり、１２時間の時点でＧ２への進行は明らかである。化合物ＴＤＬＲ−５０５で処理した細胞は、ノコダゾールからの解放後、細胞周期のＧ１期に進行したが、解放後１２時間でもＳ相に入らなかった。これらのデータは、ＴＤＲＬ−５０５が、肺癌細胞において、Ｇ１細胞周期停止を誘発することを実証している。
【００５０】
ＤＮＡ修復および複製におけるＲＰＡの役割の阻害
ＤＮＡ複製におけるその本質的役割の他に、かさのあるＤＮＡ付加体ならびに、種々の型の外因性および内因性因子によって誘発されるＤＮＡ切断（break）の修復のためＲＰＡが必要とされる。ｓｓＤＮＡとのＲＰＡの会合は、全てのこれらの経路の重要な特徴であり、この活性の阻害は、ＤＮＡ損傷により誘発される細胞毒性効果を増加させるであろう。シスプラチンへの細胞感受性に対するＲＰＡ阻害の効果を確かめるため、併用指数（ＣＩ）（２０）を測定した。ここで図６を参照する。この実験で例示されるように、化合物ＴＤＬＲ−５０５は、Ｈ４６０細胞内においてシスプラチンおよびエトポシドの両方と相乗的に作用する。Ｈ４６０細胞を、シスプラチンまたはエトポシドのいずれかのＩＣ５０濃度の分率を増加させながら、化合物ＴＤＬＲ−５０５と共に４８時間処理した。処理後、細胞を収穫し、アネキシンＶ／ＰＩフローサイトメトリーにより解析した。白丸は、ＴＤＬＲ−５０５とのシスプラチンのＣＩ解析を示し、黒丸は、ＴＤＬＲ−５０５とのエトポシドのＣＩ解析を表す。併用指数解析は、以前に記述したように行った（２０）。データは、平均±ＳＤ（Ｎ＝３から）として表される。シスプラチンと化合物ＴＤＬＲ−５０５とを組み合わせて使用する場合、細胞生存能は、いずれかの薬剤単独で誘発されるものを超えるレベルまで低下し、２種の化合物間の相乗作用をもたらし、また影響を受けた細胞の最高の割合（fraction）においてＣＩ ０．４をもたらした。影響を受けた細胞のより低い割合では、相互作用は相加的であり、次いで拮抗的（ＣＩ値が１を超えることから明らかになった）となった。これらの結果は、化合物ＴＤＬＲ−５０５が、Ｈ４６０細胞におけるシスプラチンの効果を増強することができ、またＮＥＲにおいてＲＰＡの細胞活性を阻害する点で一致することを実証している。エトポシドと相乗作用するＴＤＬＲ−５０５の能力も検討した。エトポシドは、複製フォークの停止およびＤＮＡ損傷応答を誘発し、両方ともＲＰＡを必要とする細胞過程である（２１）。シスプラチンについて上述したのと同じ解析を使用して、化合物ＴＤＬＲ−５０５は、影響を受けた細胞の全ての割合においてエトポシドとの相乗作用活性を示した（図６）。様々な細胞系において、ＲＰＡ ｐ３４が、エトポシド処理に応答して高リン酸化されることが示されている（２１、２２）。興味深いことに、ウエスタンブロット解析によりＲＰＡ ｐ３４の高リン酸化を解析すると、ＴＤＬＲ−５０５との同時処理によって変化せず、また全体的なＲＰＡ発現に劇的な変化がないことが明らかになった（図４Ｄ）。このデータは、ＴＤＬＲ−５０５による処理がエトポシド依存性のＤＮＡ損傷シグナル伝達応答には劇的に影響を及ぼさず、またＲＰＡの高リン酸化が存在する状態で、相乗作用が観察されることを実証している。
【００５１】
化合物ＴＤＬＲ−５０５のインビボ解析
ここで表３を参照する。ＴＤＲＬ−５０５がＮＳＣＬＣに対し妥当なＩＣ５０値を示していることが、肺癌腫瘍成長へのＲＰＡ阻害の効果のインビボ評価を促した。未処理マウスにおけるＴＤＲＬ−５０５投与の安全性を測定した。さらなるデータは、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの、０．７５％のツウィーン８０（Tween 80）における２５％ＤＭＳＯ製剤における化合物ＴＤＬＲ−５０５のＩＰ投与が、４００ｍｇ／ｋｇまで十分に許容されることを実証した。０．１％ツウィーン８０／メチルセルロースにおける経口投与も、８００ｍｇ／ｋｇまで十分に許容された。
【００５２】
ヒトＮＳＣＬＣ腫瘍細胞を移植したマウスに経口投与療法を受けさせた。腫瘍を１００ｍｍ３まで成長させ、その後ＴＤＬＲ−５０５または媒体による処理を開始した。図７において示される結果は、ＴＤＲＬ−５０５で処理したマウスにおいて、媒体による対照と比較して腫瘍成長が低減することを実証した。図７Ｂを参照すると、個々のマウスの解析は、媒体で処理した対照と比較した腫瘍成長の著しい低減を明らかにしている。
【００５３】
ＴＲＬ−５０５のインビボ抗癌活性に基づいて、ｉｐおよびｐｏ投与療法の両者について薬物動態パラメーターの比較を行った。未処理マウスに１回投与を行い、表３において記述されるように、種々の時間間隔で血液を採取し、この化合物向けに開発されたＨＰＣＬ／ＭＳＭＳプロトコルによりＴＲＤＬ−５０５濃度を測定した。データは、ｐｏと比較して、ｉｐ投与についてのほぼ全てのパラメーターにおいて著しくより良好なＰＫパラメーターを実証している。これらのデータは、ｉｐ投与が著しく大きな生体適合性をもたらし、またより一層大きな抗癌活性に導く、増大した効力をもたらすであろうことを示唆している。さらに、ＴＤＲＬ−５０６において用いられたモルホリノ修飾は、その経口生体適合性を向上させ、それによりＴＤＲＬ−５０６についてのより効果的な経口投与療法をもたらすはずである。
【００５４】
【表３】
【００５５】
ハイスループットスクリーニングおよび化学物質ライブラリーにおける進歩は、推定上の癌標的およびそれらの阻害剤の急激な増加を招いている。今日まで、大部分のこれらの標的となる酵素活性は、特定のタンパク質に関連していた。本明細書において例示されるように、非酵素的なＲＰＡのＤＮＡ結合活性を標的とすることは、全く新たな部類の、推定上の相互作用を切り開くことである。化合物ＴＤＬＲ−５０５は、細胞がＳ期に入ることを阻害し、かつ細胞毒性／細胞増殖抑制応答をもたらし、その結果は、ＤＮＡ複製の開始におけるＲＰＡの役割を阻害することと一致し、またこの過程は、複雑な一連の相互作用を包含する可能性があり、その１つは、ＲＰＡをＳ期のＣＤＫ依存性過程中の複製開始点へ投入することである（１９、２３）。これらのデータは、ＤＮＡ合成についてはっきりと実証するものではないが、ＲＰＡが化合物ＴＤＬＲ−５０５で処理した細胞の開始点に投入し得るかどうかを確かめることが残っている。ＴＤＬＲ−５０５の存在において細胞がＳ期から出てＧ２に入ることは、伸長においてＤＢＤ−Ａおよび−Ｂ ＤＮＡ相互作用があまり重要ではない可能性を示唆し、この場合ＲＰＡが主としてラギング鎖ＤＮＡ合成に関与する（２４）。ＤＮＡ複製の初期段階におけるＲＰＡの役割は、本発明者らが観察したＳ期内停止とは対照的に、Ｇ１停止を予測するものであろう。しかし、化合物ＴＤＬＲ−５０５で処理したＳ期細胞でＲＰＡ結合が低減し、したがって、後で複製フォークの伸長およびファイヤリング（firing）を阻害する可能性を除外することはできない。このことは、化合物ＴＤＬＲ−５０５によって死滅する細胞は、それらのＤＮＡを活発に複製する細胞であり、この複製を妨げることが、観察された細胞毒性の原因である可能性を提供する。しかし、Ｇ１停止を継続すると、時間的期間が延びた後に細胞死を誘発する可能性もあり、これは、処理４８時間後の細胞死の程度が、Ｓ期中に存在する細胞数を超える理由を説明するものである。このことは、ＲＰＡの細胞活性を阻害するＳＭＩを使用する癌治療の状況において、活発に分裂する細胞を専ら標的とする治療の窓領域が存在することを例示するものである。
【００５６】
ＤＮＡ修復におけるＲＰＡの役割も、その活性を阻害することが、併用療法と関連して、ＤＮＡ損傷を誘発する現在の化学療法の効力増進を可能としている。ＤＮＡ修復を阻害することは、持続性のＤＮＡ損傷を招き、それが細胞毒性を増加させると予想される。ＮＥＲの認識および確認ステップにおけるＲＰＡの不可欠な役割は十分に特徴付けされており、またさらにＲＰＡは、損傷したオリゴヌクレオチドの除去に続く再合成ステップに関与している（２５）。先行研究は、低下したレベルのＮＥＲタンパク質を有する細胞が、シスプラチン処理への感度増加を呈することを示している（２６）。これと一致して、本発明者らのデータは、影響を受ける細胞の高い割合での、化合物ＴＤＬＲ−５０５とシスプラチンとの間の相乗的相互作用を明らかにしている。興味深いことは、影響を受ける細胞の低い割合では、拮抗的相互作用が、併用指数が１を超えることと組み合わせて観察される。これはおそらく相互作用が、修復レベルの相互作用ではなく、シグナル伝達レベルの相互作用である結果であろう。シスプラチンはＧ２チェックポイントの活性化をもたらし、Ｇ２停止の延長からアポトーシスを誘発するので、化合物ＴＤＬＲ−５０５がＧ１で細胞をブロックするという発見は、より少ない細胞が、シスプラチンが誘発するＧ２停止に曝されるであろうことを示している。同様に、化合物ＴＤＬＲ−５０５の毒性がＧ１停止の延長に由来するならば、シスプラチンにより誘発されるＧ２チェックポイントでは、処理の結果として、より少ない細胞死がもたらされるであろう。高い濃度では、この効果が、ＤＮＡ修復のレベルにおけるＲＰＡ阻害との相互作用によって軽減されて、シスプラチンの毒性を増大させており、また拮抗的なシグナル伝達の相互作用を克服している。
【００５７】
ＤＮＡ複製再開始および崩壊した複製フォークの処理におけるＲＰＡの役割も、併用療法のための機会を提供する（２７、２８）。興味深いことに、化合物ＴＤＬＲ−５０５とのエトポシドの活性の併用指数解析では、影響を受ける細胞の全ての割合で相乗作用的活性を示した。エトポシドは、トポイソメラーゼＩＩ（トポＩＩ）の酵素活性を阻害し、ＤＮＡとの持続的な共有結合切断錯体をもたらし、これが複製フォーク停止ならびに１本および２本鎖の切断につながる（２９）。ＲＰＡがこれらの型の破壊およびＤＮＡ中間体に応答して、修復することが実証されており、この活性を阻害すると、本発明者らの解析において観察されるトポＩＩの阻害により見られる効果（２１）を増強すると予想される。第二に、これらの細胞の非同調特性のため、任意の所与の時間には、複製を受ける細胞は、複製ファイヤリングの種々の段階にあると予想される。ＲＰＡは、初期の複製ファイヤリングにおいて必要とされ、一方トポＩＩはその後の段階の複製事象に必要とされることが示されている（３０）。したがって、複製進行の両段階を阻害することは、このステップのいずれか一方を個別に阻害するよりも、大きな効果を示すと予想され、このことは、化合物ＴＤＬＲ−５０５とエトポシドの間の相乗的関係を意味するであろう。ＲＰＡ活性の阻害および経路機能の抑止は、癌治療における幅広い利用のための可能性を有する。いくつかの他の修理経路におけるＲＰＡの役割は、ＲＰＡ阻害剤を使用する併用療法への他の機会を開くものである。例えば、分子標的のＲＰＡ阻害を放射線療法と組み合わせると、非相同ＤＮＡの末端結合または相同ＤＮＡ組換え（いずれの修復もＲＰＡを必要とすることが示されている）によるＤＮＡ２本鎖の切断の修復を阻害することによって、腫瘍細胞中の細胞毒性を増大させることにつながる可能性がある（３１〜３３）。
【００５８】
小分子によってタンパク質の酵素活性を標的とすることも十分許容されるが、本明細書において提供される結果は、非酵素タンパク質−ＤＮＡ相互作用を標的とすることの実現性および有用性を実証している。これらの化合物は、ＲＰＡについての小分子阻害剤（ＳＭＩ）であって、これらはインビトロ活性および細胞活性の両方で能力発揮する。癌化学療法のためにＲＰＡを標的とするこの取組みは、ＲＰＡ活性の消失を防止するのに必要な効率的なバックアップ系の不在からもたらされる、冗長性欠如を含む、いくつかの特有の利点を有する。ＲＰＡを阻害することは幅広い有用性を有するであろう。なぜなら、細胞増殖を増加させまた化学療法によるＤＮＡ損傷剤を修復するためにＲＰＡに依存することは、どんな単一の癌に対しても固有ではないからである。本明細書において開示される小さな薬剤様の分子によって、ＲＰＡのＤＮＡ結合活性を標的とする場合、この部類のタンパク質を標的として、治療用化合物を作り出すことができることを例示している。
【００５９】
新規な技術が例示され、図面および上記の記述において詳細に記述されているが、このものは、特性において例示的であって、限定的ではないとみなすべきである。好ましい実施形態のみが示されかつ記述されており、また新規な技術の精神の範囲内となる全ての変更および修正が保護されるべきと所望されていると理解される。同様に、新規な技術が特定の例、理論的議論、説明および図を使用し例示されたが、これらの図およびそれに伴う考察は、決してこの技術を限定すると解釈されるべきではない。本出願において参照した全ての特許、特許出願、および本文への参考文献、科学的論文、出版物などは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
（参考文献）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の活性を低下させる方法であって、
化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩を提供するステップであって、前記化合物Ａは複製タンパク質Ａに結合するか、または代謝されて複製タンパク質Ａに結合する化学物質となり、前記化合物Ａは下記の式：
【化９】
（式中、Ｒ１は、５−（７−クロロ−２，３−ジヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キノリン−８−イル）；５−（キノキサリン−６−イル）；および６−クロロ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｇ］キノリン−７−イルを含む、置換キノリン、チオフェンおよびフェニルからなる群から選択され；
Ｒ２は、水素、ハロゲン、メチル基、ニトロ基からなる群から選択され、ここで、化合物Ａまたは化合物Ａの代謝産物は複製タンパク質Ａに結合し；および
Ｒ３は、ケト酪酸および
【化１０】
からなる群から選択され、式中、ｎ＝１、２、３、４または５である）を有するステップと、
前記化合物Ａを複製タンパク質Ａの少なくとも１つのアイソフォームと接触させるステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記化合物Ａ中の前記キノリンまたは前記フェニルが、ハロゲン、メチル基、エチル基、アミノ基およびピラゾールからなる群から選択される少なくとも１つの部分で置換されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物Ａ中のＲ１が、５−（７−クロロ−２，３−ジヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キノリン−８−イル）、５−（キノキサリン−６−イル）および６−クロロ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｇ］キノリン−７−イルを含む、２−クロロ−７−エトキシキノリン、５（キノキサリン−６−イル）、２−クロロ−６，７−ジメトキシキノリン、２−クロロ−６−エトキシキノリン、４−ブロモフェニル、４−フルオロフェニル、４−クロロフェニル、２−クロロフェニル、２−メトキシフェニル、４−エチルフェニル、４−ジエチルアミノフェニル、４−ジメチルアミノフェニル、チオフェン、４−メトキシフェニル、ｐ−トリル、２，５−ジメトキシフェニル、３，４−ジメトキシフェニル、４−エチルフェニルおよび１−フェニル−３−ｐ−トリル−１Ｈ−プリアゾール（pryazole）からなる群から選択され、および
前記化合物Ａ中のＲ２が、４−ブロモ、４−クロロ、４−ニトロ、４−メチル、４−メトキシ、Ｈ、３，４−ジメチルからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
複製タンパク質Ａに結合する前記化合物が、化合物ＴＤＬＲ−５０６もしくはその薬学的に許容可能な塩またはその代謝産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
複製タンパク質Ａに結合する前記化合物が、化合物ＴＤＬＲ−５０５もしくはその薬学的に許容可能な塩またはその代謝産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物Ａまたはその代謝産物のいずれかと複製タンパク質Ａの少なくとも１つのアイソフォームとの間での前記接触させるステップが、インビボで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物Ａまたはその代謝産物のいずれかと複製タンパク質Ａの少なくとも１つのアイソフォームとの間での前記接触させるステップが、インビトロで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
真核細胞の細胞周期進行を変化させる方法であって、
真核細胞の細胞周期進行を妨げる化合物Ａ、または真核細胞の細胞周期進行を妨げる化学物質に代謝される化合物Ａを提供するステップであって、前記化合物Ａは、下記の式：
【化１１】
（式中、Ｒ１は、５−（７−クロロ−２，３−ジヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キノリン−８−イル）；５−（キノキサリン−６−イル）；および６−クロロ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｇ］キノリン−７−イルを含む、置換キノリン、チオフェンおよびフェニルからなる群から選択され；
Ｒ２は、ハロゲン、メチル基、ニトロ基からなる群から選択され、および
Ｒ３は、ケト酪酸および
【化１２】
からなる群から選択され、式中、ｎ＝１、２、３である）を有するステップと、
前記化合物Ａを、少なくとも１つの真核細胞と接触させるステップと
を含む方法。
【請求項９】
前記化合物Ａ中の前記キノリンまたは前記フェニルが、ハロゲン、メチル基、エチル基、アミノ基およびピラゾールからなる群から選択される少なくとも１つの部分で置換されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物Ａ中のＲ１が、２−クロロ−７−エトキシキノリン、５（キノキサリン−６−イル）、２−クロロ−６，７−ジメトキシキノリン、２−クロロ−６−エトキシキノリン、４−ブロモフェニル、４−フルオロフェニル、４−クロロフェニル、２−クロロフェニル、２−メトキシフェニル、４−エチルフェニル、４−ジエチルアミノフェニル、４−ジメチルアミノフェニル、チオフェン、４−メトキシフェニル、ｐ−トリル、２，５−ジメトキシフェニル、３，４−ジメトキシフェニル、４−エチルフェニル；および１−フェニル−３−ｐ−トリル−１Ｈ−プリアゾール（pryazole）；５−（７−クロロ−２，３−ジヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キノリン−８−イル）；５−（キノキサリン−６−イル）；および６−クロロ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｇ］キノリン−７−イルからなる群から選択され、および
前記化合物Ａ中のＲ２が、４−ブロモ、４−クロロ、４−ニトロ、４−メチル、４−メトキシ、Ｈ、３，４−ジメチルからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
真核細胞の細胞周期進行を妨げる前記化合物が、化合物ＴＤＬＲ−５０６もしくはその薬学的に許容可能な塩またはその代謝産物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
真核細胞の細胞周期進行を妨げる前記化合物が、化合物ＴＤＬＲ−５０５もしくはその薬学的に許容可能な塩またはその代謝産物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物Ａまたはその代謝産物と複製タンパク質Ａとの間での前記接触させるステップが、インビボで行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物Ａまたはその代謝産物と複製タンパク質Ａとの間での前記接触させるステップが、インビトロで行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
癌を治療する方法であって、
化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩を提供するステップであって、前記化合物Ａは癌細胞の細胞周期を妨げるか、または代謝されて癌細胞の細胞周期を妨げる化学物質となり、前記化合物Ａは、下記の式：
【化１３】
（式中、Ｒ１は、５−（７−クロロ−２，３−ジヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キノリン−８−イル）、５−（キノキサリン−６−イル）および６−クロロ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｇ］キノリン−７−イルを含む、置換キノリン、チオフェンおよびフェニルからなる群から選択され、
Ｒ２は、ハロゲン、メチル基、ニトロ基からなる群から選択され、および
Ｒ３は、ケト酪酸および
【化１４】
からなる群から選択され、式中、ｎ＝１、２、３である）を有し；Ａは下記の式：
（式中、Ｒ１は、５−（７−クロロ−２，３−ジヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キノリン−８−イル）、５−（キノキサリン−６−イル）および６−クロロ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｇ］キノリン−７−イルを含む、置換キノリン、チオフェンおよびフェニルからなる群から選択され、および
Ｒ２は、ハロゲン、メチル基、ニトロ基からなる群から選択される）を有し、ここで、化合物Ａは複製タンパク質Ａに結合するステップと、
前記化合物Ａを少なくとも１つの癌細胞と接触させるステップと
を含む方法。
【請求項１６】
前記化合物Ａ中の前記キノリンまたは前記フェニルが、ハロゲン、メチル基、エチル基、アミノ基およびピラゾールからなる群から選択される少なくとも１つの部分で置換されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物Ａ中のＲ１が、５−（７−クロロ−２，３−ジヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キノリン−８−イル）；５−（キノキサリン−６−イル）；および６−クロロ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｇ］キノリン−７−イルを含む、２−クロロ−７−エトキシキノリン、５（キノキサリン−６−イル）、２−クロロ−６，７−ジメトキシキノリン、２−クロロ−６−エトキシキノリン、４−ブロモフェニル、４−フルオロフェニル、４−クロロフェニル、２−クロロフェニル、２−メトキシフェニル、４−エチルフェニル、４−ジエチルアミノフェニル、４−ジメチルアミノフェニル、チオフェン、４−メトキシフェニル、ｐ−トリル、２，５−ジメトキシフェニル、３，４−ジメトキシフェニル、４−エチルフェニルおよび１−フェニル−３−ｐ−トリル−１Ｈ−プリアゾール（pryazole）からなる群から選択され、
前記化合物Ａ中のＲ２が、４−ブロモ、４−クロロ、４−ニトロ、４−メチル、４−メトキシ、Ｈ、３，４−ジメチルからなる群から選択され、および
Ｒ３が、ケト酪酸および
【化１５】
からなる群から選択され、式中、ｎ＝１、２、３である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
癌細胞と接触させる前記化合物が、化合物ＴＤＬＲ−５０６もしくはその薬学的に許容可能な塩またはそれらの代謝産物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
癌細胞と接触させる前記化合物が、化合物ＴＤＬＲ−５０５もしくはその薬学的に許容可能な塩またはそれらの代謝産物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物Ａまたはその代謝産物と癌細胞との間での前記接触させるステップが、インビボで行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記化合物Ａまたはその代謝産物と癌細胞との間での前記接触させるステップが、インビトロで行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項２２】
前記癌細胞が、肺癌、非小細胞、小細胞、上皮性卵巣癌、子宮頸癌、大腸癌および乳癌からなる群から選択される固形腫瘍中に見出される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記癌細胞を、トポイソメラーゼＩＩの活性を低下させる少なくとも１つの化学療法試薬と接触させるステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
トポイソメラーゼＩＩの活性を低下させる前記化学療法試薬が、限定はされないが、シスプラチンおよびエトポシドからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＲＰＡの阻害のための化合物であって、
【化１６】
（式中、
ｎ＝１、２または３であり、
Ｒ１は、５−（７−クロロ−２，３−ジヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キノリン−８−イル）；５−（キノキサリン−６−イル）；および６−クロロ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｇ］キノリン−７−イルを含む、置換キノリン、チオフェンおよびフェニルからなる群から選択され、および
Ｒ２は、水素、ハロゲン、メチル基、ニトロ基からなる群から選択され、ここで、化合物Ａまたは化合物Ａの代謝産物は複製タンパク質Ａに結合する）を含む化合物。
【請求項２６】
前記化合物中のＲ１が、５−（７−クロロ−２，３−ジヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キノリン−８−イル）；５−（キノキサリン−６−イル）；および６−クロロ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｇ］キノリン−７−イルを含む、２−クロロ−７−エトキシキノリン、５（キノキサリン−６−イル）、２−クロロ−６，７−ジメトキシキノリン、２−クロロ−６−エトキシキノリン、４−ブロモフェニル、４−フルオロフェニル、４−クロロフェニル、２−クロロフェニル、２−メトキシフェニル、４−エチルフェニル、４−ジエチルアミノフェニル、４−ジメチルアミノフェニル、チオフェン、４−メトキシフェニル、ｐ−トリル、２，５−ジメトキシフェニル、３，４−ジメトキシフェニル、４−エチルフェニルおよび１−フェニル−３−ｐ−トリル−１Ｈ−プリアゾール（pryazole）からなる群から選択され、および
前記化合物中のＲ２が、４−ブロモ、４−クロロ、４−ニトロ、４−メチル、４−メトキシ、Ｈ、３，４−ジメチルからなる群から選択される、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２７】
疾患の治療方法であって、
請求項２５に記載の少なくとも１つの化合物またはその薬学的に許容可能な塩を与えるステップを含み、前記化合物が少なくとも１つの疾患を治療するのに有効である方法。
【請求項２８】
前記化合物が、患者に投与するのに適している、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記化合物が、患者に投与するのに適している、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記化合物が、経口的に患者に投与するのに適している、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記化合物が、製剤中に存在し、かつ前記製剤がメチルセルロースを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記化合物が、患者に腹腔内投与するのに適している、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記化合物が、製剤中に存在し、かつ前記製剤がＴｗｅｅｎ−８０を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
患者の治療方法であって、
請求項１に記載の少なくとも１つの化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供するステップを含み、前記化合物は、ヒトまたは動物の患者を治療するために製剤されている方法。
【請求項３５】
前記化合物の治療有効量の少なくとも１つの用量を患者に投与するステップをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記患者が、直接ＤＮＡを損傷させるか、またはトポイソメラーゼＩＩを阻害する少なくとも１つの化合物の治療有効用量によっても治療される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記患者が、シスプラチン、エトポシド、ブスルファン、ベンダムスチン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、デシタビン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロミドおよびトポテカンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物の治療有効用量によっても治療される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記用量が、患者の体重１ｋｇ−１当たり前記化合物約５０ｍｇである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記用量が、患者の体重１ｋｇ−１当たり前記化合物約１００ｍｇである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記用量が、患者の体重１ｋｇ−１当たり前記化合物約２００ｍｇである、請求項３５に記載の方法。
【請求項１】
タンパク質の活性を低下させる方法であって、
化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩を提供するステップであって、前記化合物Ａは複製タンパク質Ａに結合するか、または代謝されて複製タンパク質Ａに結合する化学物質となり、前記化合物Ａは下記の式：
【化９】
（式中、Ｒ１は、５−（７−クロロ−２，３−ジヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キノリン−８−イル）；５−（キノキサリン−６−イル）；および６−クロロ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｇ］キノリン−７−イルを含む、置換キノリン、チオフェンおよびフェニルからなる群から選択され；
Ｒ２は、水素、ハロゲン、メチル基、ニトロ基からなる群から選択され、ここで、化合物Ａまたは化合物Ａの代謝産物は複製タンパク質Ａに結合し；および
Ｒ３は、ケト酪酸および
【化１０】
からなる群から選択され、式中、ｎ＝１、２、３、４または５である）を有するステップと、
前記化合物Ａを複製タンパク質Ａの少なくとも１つのアイソフォームと接触させるステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記化合物Ａ中の前記キノリンまたは前記フェニルが、ハロゲン、メチル基、エチル基、アミノ基およびピラゾールからなる群から選択される少なくとも１つの部分で置換されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物Ａ中のＲ１が、５−（７−クロロ−２，３−ジヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キノリン−８−イル）、５−（キノキサリン−６−イル）および６−クロロ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｇ］キノリン−７−イルを含む、２−クロロ−７−エトキシキノリン、５（キノキサリン−６−イル）、２−クロロ−６，７−ジメトキシキノリン、２−クロロ−６−エトキシキノリン、４−ブロモフェニル、４−フルオロフェニル、４−クロロフェニル、２−クロロフェニル、２−メトキシフェニル、４−エチルフェニル、４−ジエチルアミノフェニル、４−ジメチルアミノフェニル、チオフェン、４−メトキシフェニル、ｐ−トリル、２，５−ジメトキシフェニル、３，４−ジメトキシフェニル、４−エチルフェニルおよび１−フェニル−３−ｐ−トリル−１Ｈ−プリアゾール（pryazole）からなる群から選択され、および
前記化合物Ａ中のＲ２が、４−ブロモ、４−クロロ、４−ニトロ、４−メチル、４−メトキシ、Ｈ、３，４−ジメチルからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
複製タンパク質Ａに結合する前記化合物が、化合物ＴＤＬＲ−５０６もしくはその薬学的に許容可能な塩またはその代謝産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
複製タンパク質Ａに結合する前記化合物が、化合物ＴＤＬＲ−５０５もしくはその薬学的に許容可能な塩またはその代謝産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物Ａまたはその代謝産物のいずれかと複製タンパク質Ａの少なくとも１つのアイソフォームとの間での前記接触させるステップが、インビボで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物Ａまたはその代謝産物のいずれかと複製タンパク質Ａの少なくとも１つのアイソフォームとの間での前記接触させるステップが、インビトロで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
真核細胞の細胞周期進行を変化させる方法であって、
真核細胞の細胞周期進行を妨げる化合物Ａ、または真核細胞の細胞周期進行を妨げる化学物質に代謝される化合物Ａを提供するステップであって、前記化合物Ａは、下記の式：
【化１１】
（式中、Ｒ１は、５−（７−クロロ−２，３−ジヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キノリン−８−イル）；５−（キノキサリン−６−イル）；および６−クロロ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｇ］キノリン−７−イルを含む、置換キノリン、チオフェンおよびフェニルからなる群から選択され；
Ｒ２は、ハロゲン、メチル基、ニトロ基からなる群から選択され、および
Ｒ３は、ケト酪酸および
【化１２】
からなる群から選択され、式中、ｎ＝１、２、３である）を有するステップと、
前記化合物Ａを、少なくとも１つの真核細胞と接触させるステップと
を含む方法。
【請求項９】
前記化合物Ａ中の前記キノリンまたは前記フェニルが、ハロゲン、メチル基、エチル基、アミノ基およびピラゾールからなる群から選択される少なくとも１つの部分で置換されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物Ａ中のＲ１が、２−クロロ−７−エトキシキノリン、５（キノキサリン−６−イル）、２−クロロ−６，７−ジメトキシキノリン、２−クロロ−６−エトキシキノリン、４−ブロモフェニル、４−フルオロフェニル、４−クロロフェニル、２−クロロフェニル、２−メトキシフェニル、４−エチルフェニル、４−ジエチルアミノフェニル、４−ジメチルアミノフェニル、チオフェン、４−メトキシフェニル、ｐ−トリル、２，５−ジメトキシフェニル、３，４−ジメトキシフェニル、４−エチルフェニル；および１−フェニル−３−ｐ−トリル−１Ｈ−プリアゾール（pryazole）；５−（７−クロロ−２，３−ジヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キノリン−８−イル）；５−（キノキサリン−６−イル）；および６−クロロ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｇ］キノリン−７−イルからなる群から選択され、および
前記化合物Ａ中のＲ２が、４−ブロモ、４−クロロ、４−ニトロ、４−メチル、４−メトキシ、Ｈ、３，４−ジメチルからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
真核細胞の細胞周期進行を妨げる前記化合物が、化合物ＴＤＬＲ−５０６もしくはその薬学的に許容可能な塩またはその代謝産物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
真核細胞の細胞周期進行を妨げる前記化合物が、化合物ＴＤＬＲ−５０５もしくはその薬学的に許容可能な塩またはその代謝産物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物Ａまたはその代謝産物と複製タンパク質Ａとの間での前記接触させるステップが、インビボで行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物Ａまたはその代謝産物と複製タンパク質Ａとの間での前記接触させるステップが、インビトロで行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
癌を治療する方法であって、
化合物Ａまたはその薬学的に許容可能な塩を提供するステップであって、前記化合物Ａは癌細胞の細胞周期を妨げるか、または代謝されて癌細胞の細胞周期を妨げる化学物質となり、前記化合物Ａは、下記の式：
【化１３】
（式中、Ｒ１は、５−（７−クロロ−２，３−ジヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キノリン−８−イル）、５−（キノキサリン−６−イル）および６−クロロ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｇ］キノリン−７−イルを含む、置換キノリン、チオフェンおよびフェニルからなる群から選択され、
Ｒ２は、ハロゲン、メチル基、ニトロ基からなる群から選択され、および
Ｒ３は、ケト酪酸および
【化１４】
からなる群から選択され、式中、ｎ＝１、２、３である）を有し；Ａは下記の式：
（式中、Ｒ１は、５−（７−クロロ−２，３−ジヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キノリン−８−イル）、５−（キノキサリン−６−イル）および６−クロロ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｇ］キノリン−７−イルを含む、置換キノリン、チオフェンおよびフェニルからなる群から選択され、および
Ｒ２は、ハロゲン、メチル基、ニトロ基からなる群から選択される）を有し、ここで、化合物Ａは複製タンパク質Ａに結合するステップと、
前記化合物Ａを少なくとも１つの癌細胞と接触させるステップと
を含む方法。
【請求項１６】
前記化合物Ａ中の前記キノリンまたは前記フェニルが、ハロゲン、メチル基、エチル基、アミノ基およびピラゾールからなる群から選択される少なくとも１つの部分で置換されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物Ａ中のＲ１が、５−（７−クロロ−２，３−ジヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キノリン−８−イル）；５−（キノキサリン−６−イル）；および６−クロロ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｇ］キノリン−７−イルを含む、２−クロロ−７−エトキシキノリン、５（キノキサリン−６−イル）、２−クロロ−６，７−ジメトキシキノリン、２−クロロ−６−エトキシキノリン、４−ブロモフェニル、４−フルオロフェニル、４−クロロフェニル、２−クロロフェニル、２−メトキシフェニル、４−エチルフェニル、４−ジエチルアミノフェニル、４−ジメチルアミノフェニル、チオフェン、４−メトキシフェニル、ｐ−トリル、２，５−ジメトキシフェニル、３，４−ジメトキシフェニル、４−エチルフェニルおよび１−フェニル−３−ｐ−トリル−１Ｈ−プリアゾール（pryazole）からなる群から選択され、
前記化合物Ａ中のＲ２が、４−ブロモ、４−クロロ、４−ニトロ、４−メチル、４−メトキシ、Ｈ、３，４−ジメチルからなる群から選択され、および
Ｒ３が、ケト酪酸および
【化１５】
からなる群から選択され、式中、ｎ＝１、２、３である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
癌細胞と接触させる前記化合物が、化合物ＴＤＬＲ−５０６もしくはその薬学的に許容可能な塩またはそれらの代謝産物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
癌細胞と接触させる前記化合物が、化合物ＴＤＬＲ−５０５もしくはその薬学的に許容可能な塩またはそれらの代謝産物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物Ａまたはその代謝産物と癌細胞との間での前記接触させるステップが、インビボで行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記化合物Ａまたはその代謝産物と癌細胞との間での前記接触させるステップが、インビトロで行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項２２】
前記癌細胞が、肺癌、非小細胞、小細胞、上皮性卵巣癌、子宮頸癌、大腸癌および乳癌からなる群から選択される固形腫瘍中に見出される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記癌細胞を、トポイソメラーゼＩＩの活性を低下させる少なくとも１つの化学療法試薬と接触させるステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
トポイソメラーゼＩＩの活性を低下させる前記化学療法試薬が、限定はされないが、シスプラチンおよびエトポシドからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＲＰＡの阻害のための化合物であって、
【化１６】
（式中、
ｎ＝１、２または３であり、
Ｒ１は、５−（７−クロロ−２，３−ジヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キノリン−８−イル）；５−（キノキサリン−６−イル）；および６−クロロ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｇ］キノリン−７−イルを含む、置換キノリン、チオフェンおよびフェニルからなる群から選択され、および
Ｒ２は、水素、ハロゲン、メチル基、ニトロ基からなる群から選択され、ここで、化合物Ａまたは化合物Ａの代謝産物は複製タンパク質Ａに結合する）を含む化合物。
【請求項２６】
前記化合物中のＲ１が、５−（７−クロロ−２，３−ジヒドロ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］キノリン−８−イル）；５−（キノキサリン−６−イル）；および６−クロロ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｇ］キノリン−７−イルを含む、２−クロロ−７−エトキシキノリン、５（キノキサリン−６−イル）、２−クロロ−６，７−ジメトキシキノリン、２−クロロ−６−エトキシキノリン、４−ブロモフェニル、４−フルオロフェニル、４−クロロフェニル、２−クロロフェニル、２−メトキシフェニル、４−エチルフェニル、４−ジエチルアミノフェニル、４−ジメチルアミノフェニル、チオフェン、４−メトキシフェニル、ｐ−トリル、２，５−ジメトキシフェニル、３，４−ジメトキシフェニル、４−エチルフェニルおよび１−フェニル−３−ｐ−トリル−１Ｈ−プリアゾール（pryazole）からなる群から選択され、および
前記化合物中のＲ２が、４−ブロモ、４−クロロ、４−ニトロ、４−メチル、４−メトキシ、Ｈ、３，４−ジメチルからなる群から選択される、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２７】
疾患の治療方法であって、
請求項２５に記載の少なくとも１つの化合物またはその薬学的に許容可能な塩を与えるステップを含み、前記化合物が少なくとも１つの疾患を治療するのに有効である方法。
【請求項２８】
前記化合物が、患者に投与するのに適している、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記化合物が、患者に投与するのに適している、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記化合物が、経口的に患者に投与するのに適している、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記化合物が、製剤中に存在し、かつ前記製剤がメチルセルロースを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記化合物が、患者に腹腔内投与するのに適している、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記化合物が、製剤中に存在し、かつ前記製剤がＴｗｅｅｎ−８０を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
患者の治療方法であって、
請求項１に記載の少なくとも１つの化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供するステップを含み、前記化合物は、ヒトまたは動物の患者を治療するために製剤されている方法。
【請求項３５】
前記化合物の治療有効量の少なくとも１つの用量を患者に投与するステップをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記患者が、直接ＤＮＡを損傷させるか、またはトポイソメラーゼＩＩを阻害する少なくとも１つの化合物の治療有効用量によっても治療される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記患者が、シスプラチン、エトポシド、ブスルファン、ベンダムスチン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、デシタビン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロミドおよびトポテカンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物の治療有効用量によっても治療される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記用量が、患者の体重１ｋｇ−１当たり前記化合物約５０ｍｇである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記用量が、患者の体重１ｋｇ−１当たり前記化合物約１００ｍｇである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記用量が、患者の体重１ｋｇ−１当たり前記化合物約２００ｍｇである、請求項３５に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【公表番号】特表２０１３−５１８９０６（Ｐ２０１３−５１８９０６Ａ）
【公表日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５２１３０（Ｐ２０１２−５５２１３０）
【出願日】平成２３年２月５日（２０１１．２．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２３８３８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０９７５４５
【国際公開日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【出願人】（３０１０４６７８７）インディアナ・ユニバーシティ・リサーチ・アンド・テクノロジー・コーポレーション (24)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月５日（２０１１．２．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２３８３８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０９７５４５
【国際公開日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【出願人】（３０１０４６７８７）インディアナ・ユニバーシティ・リサーチ・アンド・テクノロジー・コーポレーション (24)
【Ｆターム（参考）】
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