軟骨形成に寄与する分子の阻害によるテンディノパシーの治療
本発明は、テンディノパシーの治療法を提供する。治療または予防される障害は、例えば、テンディニティス、テンドニティス、テンディノシス、パラテンディニティス、腱滑膜炎、腱酷使損傷および外傷、腱周囲炎、パラテノニティス、または他の腱変性障害を包含する。開示される治療法は、患者に対し、テンディノパシーを受けた腱における軟骨または繊維軟骨形成に関与する分子の阻害剤を腱変性障害の治療または予防に有効な量で投与することを含み、腱悪化を遅らせ、腱の健康な構造を復旧し、腱再生を刺激し、および／または腱質量および／または質を維持する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の記載
先行出願
本出願は、２００６年３月３日に出願された米国仮特許出願番号第６０／７７９，１６５号に対して優先権を主張し、その内容は、出典明示により本明細書の一部とされる。
【０００２】
発明の分野
本発明の技術分野は、損傷を受けた腱において、軟骨および／または繊維軟骨組織の産生を減少させることによるテンディノパシー（tendinopathy）の治療に関する。本発明は、さらに、損傷を受けた腱における軟骨および／または繊維軟骨組織の産生に関与する分子の阻害に関する。
【背景技術】
【０００３】
テンディノパシーとは、種々の腱障害を表すために使用される一般用語である。「テンディニティス（tendinitis）」なる語は、「腱の炎症」を意味し、しばしば、腱で起きた問題を表すために使用されるが、炎症はめったに腱疼痛の原因とはならない。最も一般的には、腱疼痛は、実際、腱またはその周辺の結合組織における一連の微小断裂（microtear）の症状であり、より正式には、テンディノシス（tendinosis）と呼ばれる。他の腱障害は、繊維非配向性を伴うコラーゲン変性、腱におけるムコイド基質の増加、石灰化、腱の酷使、脈管化、加齢、および体の隆起部に対する腱の摩擦を原因とする腱疼痛を包含する。テンディノパシーは、益々多くの腱の専門家によって、これらの状態を表すために使用されており、しばしば、テンディニティス、テンディノシス、パラテンディニティス（paratendinitis）、腱滑膜炎、パラテノニティス（paratenonitis）、腱酷使損傷および外傷を総称するものとして特徴付けられる。Khan et al., Sports Med 27:393-408 (1999)。
【０００４】
正常な腱組織は、高い引張強度を有する一次、二次および三次繊維束において同じ方向に走っているコラーゲン繊維の規則的に配列された束が高密度に詰め込まれた結合組織から成る。これらの繊維のなかに散在しているのは、Ｉ型コラーゲンが豊富な粘性の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を合成する平坦で先細りした腱細胞である。Ｉ型コラーゲン束は、腱の柔軟性および構造的支えを提供する。健康な腱において、ＥＣＭの合成および分解の間に動的平衡が存在する。しかしながら、テンディノパシーは、この平衡に不利な影響を及ぼし、その結果、コラーゲン繊維の構造的な再配列および無秩序をもたらす。コラーゲン束の無秩序は、腱に軟骨を出現させる。繊維芽細胞、筋繊維芽細胞、新血管形成、およびＥＣＭにおけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）の病理学的蓄積は、明らかに、テンディノパシーを患った組織において顕著である。Tallon et al., Med Sci Sports Exerc 33(12):1983-90 (2001); Khan et al., Sports Med 27(6):393-408 (1999)。損傷を受けた腱における代謝的および形態学的変化により、疼痛がもたらされ、また、断裂および破壊されやすくなる。
【０００５】
現在、損傷を受けた腱のＥＣＭの分解およびリモデリングは、アグリカン、デコリンおよびビグリカンなどのマトリックス巨大分子を分解することのできる、内在結合組織細胞および侵入炎症細胞からのメタロプロテイナーゼの放出によって引き起こされると考えられている。これらのメタロプロテイナーゼは、ＭＭＰｓ（Matrix Metalloproteinases）、ＡＤＡＭｓ（A Disintegrin And Metalloproteinase）およびＡＤＡＭＴｓ（A Disintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin Motifs、例えば、アグリカナーゼ)を包含する。Riley G., Expert Rev Mol Med 7(5):1-23 (2005); Rees et al., Biochem J 350:180-188 (2000)。しかしながら、ＭＭＰｓの幅広いスペクトルの阻害剤に関する臨床試験は、テンディノパシーに対する病理学的類似性を有する骨関節炎の治療において不成功に終わった。Clark et al., Expert Opin Ther Targets 7(1):19-34 (2003)。したがって、メタロプロテイナーゼの阻害がテンディノパシーの治療に効果的であることはなさそうである。実際、棘上筋腱およびアキレス腱などの高応力下の腱において、腱に最適なレベルのＥＣＭを提供するために最小レベルのメタロプロテイナーゼ活性が必要とされるかもしれない。Riley G., Expert Rev Mol Med 7(5):1-23 (2005)。
【０００６】
現在、種々の標準的な非手術的および手術的テンディノパシー治療が存在する。非手術的方法は、休息、凍結療法、活動修正、理学療法、非スイテロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）およびコルチコステロイドを包含する。休息および活動修正は、これらの病態のいくつかの患者を助けうるが、これらの療法では治療できない臨床的に有意な集団が残っている。経口抗炎症薬物療法は、使用の広がりにもかかわらず、比較研究において有用であることが証明されておらず、望ましくない副作用を有することがある。さらに、いくつかの研究では、非スイテロイド性薬物療法は、疼痛を緩和することによって、患者にテンディノパシーの初期症状を無視させるので、実際に、治癒過程に悪影響を与えうることを示唆する。
【０００７】
コルチコステロイドは、通常、組織の炎症を減少させるために使用されるが、テンディノパシーの治療のためのかかる薬物の使用は、特に、コルチコステロイドがコラーゲン合成を阻害することから、勧められない。いくつかの研究では、コルチゾンで治療された患者において短期改善が観察されたが、１年以上患者を追跡すると、高い症状再発率および疑わしい有効率が明らかになった。コルチゾン注射は、また、腱破壊、感染、皮膚の色素脱失、および皮膚萎縮の危険性を有する。
【０００８】
腱修復のための外科的方法は、損傷を受けた腱の創面切除および修復を包含する。しかしながら、観血手術または関節鏡視下手術は、深部感染、神経血管構造に対する損傷および瘢痕形成などの多くの合併症の可能性を有する。該手術はまた、費用がかかり、局所または全身麻酔に関連した付加的な危険性を有する。
【０００９】
したがって、現存する治療法を越える腱関連傷害の治療プロトコールに対する要望が今だにある。柔軟性腱組織に対する傷害または他の損傷は、治癒が遅く、完全に修復するのに何ヶ月も、または何年もかかることがある。腱関連傷害は、社会に重大な影響を与えている。酷使による傷害は、米国における全腱関連外来診療の７パーセント近くを占める。Woodwell et al., Adv Data 346:1-44 (2004)。米国労働省労働統計局からの情報によれば、かかる傷害は、労働時間の重大な喪失につながっている（http://www.bls.gov/lif参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明の概要
本発明は、テンディノパシーの治療に対する新規なアプローチを提供する。酷使されたラットの腱の転写プロファイリングを行うことによって、今回、アグリカン、バーシカン、Ｃｏｌ２ａ１（ＩＩ型コラーゲン）およびＳｏｘ９などの軟骨特異的遺伝子の発現レベルが傷ついた腱において増加することが見出された。これらの結果は、酷使の結果として、傷ついた腱組織が繊維軟骨に変換されることを示唆する。主にＩ型コラーゲンからなる腱とは異なり、繊維軟骨は、ＩＩ型コラーゲンおよび大きなプロテオグリカン、例えば、アグリカンおよびバーシカンを含有する。軟骨組織は、腱の密接に詰められたＩ型コラーゲン繊維を崩壊させるので、腱内での軟骨および繊維軟骨の形成は、腱修復に不利益である。該崩壊は、腱の引張強度および弾力性を減少させる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、本発明は、患者の腱組織における軟骨特異的プロテオグリカンの形成を減少させることによって、患者においてテンディノパシーを治療する方法を提供する。本発明は、また、テンディノパシーの治療のための医薬の製造のための軟骨特異的プロテオグリカンの形成を減少させる化合物の使用を提供する。
【００１２】
いくつかの具体例において、該方法および使用は、患者の腱組織におけるアグリカンおよび／またはバーシカンの合成に関与する酵素の活性を減少させることを包含する。特定の具体例において、該方法および使用は、患者の腱組織におけるコンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ１（ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１）および／またはガラクトサミンポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ１（ＧａｌＮＴ−１）の活性を減少させることを包含する。他の具体例において、該方法および使用は、限定するものではないが、ＵＤＰ−Ｄ−キシロース：コアタンパク質β−Ｄ−キシロシルトランスフェラーゼ、Ｇａｌトランスフェラーゼ、ＧｌｃＡトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、コンドロイチン硫酸シンターゼ、およびヘパラン硫酸スルホトランスフェラーゼを包含する軟骨プロテオグリカン合成に関与する１以上の他の酵素の活性を減少させることを包含する。
【００１３】
軟骨構造タンパク質の産生に関与する酵素および他のタンパク質の活性は、酵素または他のタンパク質の機能を直接または間接的に阻害することによって減少されうるか、または酵素または他のタンパク質自体の発現を阻害することによって減少されうる。
【００１４】
本発明は、また、患者の腱組織における軟骨特異的構造タンパク質の発現を減少させることによって、患者においてテンディノパシーを治療する方法を提供する。本発明は、さらに、テンディノパシーを治療するための医薬の製造のための軟骨特異的構造タンパク質の発現を減少させる化合物の使用を提供する。いくつかの具体例において、例えば、限定するものではないが、アグリカン、シンデカン３（ｓｙｎ−３）、バーシカン、およびＩＩ型コラーゲンなどの軟骨特異的構造タンパク質の発現が直接阻害される。他の具体例において、軟骨特異的遺伝子の発現に関与する転写因子の活性が減少される。これらの転写因子およびシグナル変換タンパク質は、例えば、Ｓｏｘ９を包含する。
【００１５】
他の具体例において、本発明は、試験化合物を治療の必要な対象に投与し、次いで、該薬物の、腱組織におけるグリコグリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）の合成に関与する酵素の活性を阻害する能力を測定することを特徴とする、テンディノパシーを治療するための化合物の同定方法を包含する。
【００１６】
ある特定の具体例において、テンディノパシーを治療するための化合物の同定方法または治療の評価方法は、（１）Ｃｓ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ヘパラン硫酸（グルコサミン）３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ１（Ｈｓ３ｓｔ１）、ＧａｌＮＴ−１およびＳｏｘ９からなる群から選択される少なくとも１つの試料成分を提供し、（２）該試料を試験化合物と合わせ、（３）該試験化合物に応答する該試料成分の活性を測定し、次いで、（４）該試験化合物が該試料成分の活性を阻害するかどうかを決定することを含む。
【００１７】
本発明の付加的な目的および利点は、一部、下記の記載に示され、一部、該記載から明らかであり、または本発明の実施によって分かるものである。本発明の目的および利点は、下記の詳細な記載および添付の特許請求の範囲において特に示される要素および組み合わせの手段によって実現し、達成されるであろう。
【００１８】
上記の一般的な記載および下記の詳細な記載の両方は、単なる例示であって説明のためのものであり、主張されるように、本発明を制限するものではないことが理解されるべきである。
【００１９】
添付の図面は、本明細書中に組み込まれ、その一部を成すものであるが、本発明のいくつかの具体例を説明し、明細書の記載と一緒になって、本発明の原理を説明するために役立つものである。
【００２０】
図面の簡単な説明
図１〜７において、ＳＳＴは棘上筋腱を示し、ＰＴは膝蓋腱非傷害内部対照を示し、Ｒは酷使プロトコールに付された動物を示し（Soslowsky et al., J. Shoulder Elbow Surg. 9:79-84 (2000)）、Ｃは酷使プロトコールに付されなかった対照動物を示し、時間的経過は、１、２および４週であり、ＢＭは骨髄を示す。
【００２１】
図１は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるＣｏｌ２ａ１（ＩＩ型コラーゲン）の遺伝子発現プロファイルを示す（図１Ａ）。Ｃｏｌ２ａ１遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図１Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、軟骨組織および酷使した腱組織の両方において、Ｃｏｌ２ａ１が高く発現されることを示す。
【００２２】
図２は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるＡｇｃ１（アグリカン）の遺伝子発現プロファイルを示す（図２Ａ）。Ａｇｃ１遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図２Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、軟骨組織および酷使した腱組織の両方において、Ａｇｃ１が高く発現されることを示す。
【００２３】
図３は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるＳｏｘ９（ｓｒｙ型高移動度群ｂｏｘ９）の遺伝子発現プロファイルを示す（図３Ａ）。Ｓｏｘ９遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図３Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、軟骨組織および酷使した腱組織の両方において、Ｓｏｘ９が高く発現されることを示す。
【００２４】
図４は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるＣｓｐｇ２（バーシカン）の遺伝子発現プロファイルを示す（図４Ａ）。バーシカン遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図４Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、軟骨組織および酷使した腱組織の両方において、バーシカンが高く発現されることを示す。
【００２５】
図５は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるコンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１）の遺伝子発現プロファイルを示す（図５Ａ）。ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図５Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、軟骨組織および酷使した腱組織の両方において、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１が高く発現されることを示す。
【００２６】
図６は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるＧａｌＮＴ−１（ＧａｌＮＴ１−ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−アルファ−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチド−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ１）の遺伝子発現プロファイルを示す（図６Ａ）。ＧａｌＮＴ−１遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図６Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、酷使した腱組織において、ＧａｌＮＴ−１が高く発現されることを示す。
【００２７】
図７は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるＨｓ３ｓｔ１（ヘパラン硫酸（グルコサミン）３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ１）の遺伝子発現プロファイルを示す（図７Ａ）。Ｈｓ３ｓｔ１遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図７Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、酷使した腱組織において、および正常な腱組織と比べた場合、軟骨組織において、Ｈｓ３ｓｔ１が高く発現されることを示す。
【００２８】
配列の簡単な記載
ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、下記の受入番号の下、Ｇｅｎｂａｎｋから入手可能である。ヒト（ＮＭ＿０１８３７１）；マウス（ＮＭ＿１７２７５３）；およびラット（ＸＭ＿２２４７５７）。
【００２９】
ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、下記の受入番号の下、Ｇｅｎｂａｎｋから入手可能である。ヒト（ＮＭ＿０１８５９０）；マウス（ＮＭ＿０３０１６５）；およびラット（ＸＭ＿２３２３１６）。
【００３０】
ＧａｌＮＴ−１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、下記の受入番号の下、Ｇｅｎｂａｎｋから入手可能である。ヒト（ＮＭ＿０２０４７４）；マウス（ＮＭ＿０１３８１４）；およびラット（ＮＭ＿１２４３７３）。
【００３１】
アグリカンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、下記の受入番号の下、Ｇｅｎｂａｎｋから入手可能である。ヒト（ＮＭ＿００１１３５）；マウス（ＮＭ＿００７４２７）；およびラット（ＮＭ＿０２２１９０）。
【００３２】
Ｃｏｌ２ａ１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、下記の受入番号の下、Ｇｅｎｂａｎｋから入手可能である。ヒト（ＮＭ＿００１８４４）；マウス（ＮＭ＿０３１１６３）およびラット（ＮＭ＿０１２９２９）。
【００３３】
Ｓｏｘ９のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、下記の受入番号の下、Ｇｅｎｂａｎｋから入手可能である。ヒト（ＮＭ＿０００３４６）；マウス（ＮＭ＿０１１４４８）；およびラット（ＸＭ＿３４３９８１）。
【００３４】
バーシカンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、下記の受入番号の下、Ｇｅｎｂａｎｋから入手可能である。ヒト（ＮＭ＿００４３８５）；マウス（ＸＭ＿４８８５１０）およびラット（ＸＭ＿２１５４５１）。
【００３５】
ヘパラン硫酸（グルコサミン）３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、下記の受入番号の下、Ｇｅｎｂａｎｋから入手可能である。ヒト（ＮＭ＿００５１１４）、マウス（ＮＭ＿０１０４７４）、およびラット（ＮＭ＿０５３３９１）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
発明の詳細な記載
本発明は、腱組織における軟骨および／または繊維軟骨形成に関与する１以上の分子の活性を減少させることによって、テンディノパシーを治療する方法を提供する。
【００３７】
本発明がより容易に理解されために、まず、ある特定の用語を定義付ける。付加的な定義は、本発明の詳細な記載を通して示される。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「テンディノパシー」なる語は、限定するものではないが、テンディニティス、テンドニティス、テンディノシス、パラテンディニティス、腱滑膜炎、腱酷使傷害および外傷、腱周囲炎（perintendinitis）、およびパラテノニティスを包含する、腱および腱周辺で起きる全ての病状を包含する。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「腱欠陥」なる語は、限定するものではないが、テンディノパシーを包含するいずれかの腱障害を示す。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「損傷を受けた腱」なる語は、テンディノパシーまたは腱欠陥を罹患している腱組織を示す。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「酷使」なる語は、直接的な外傷とは対照的に、酷使の結果として腱欠陥またはテンディノパシーを罹患している腱を示す。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、「患者」または「対象」なる語は、腱欠陥に罹りやすい、腱欠陥に罹患している、または腱欠陥からの回復過程にあって、治療が必要ないずれかのヒトまたは動物を示す。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、「テンディニティス」なる語は、テンドニティス（もう一つ別の綴り）、テンディノパシーまたは腱の炎症を示す。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、「テンディノシス」なる語は、腱を弱くする微小断裂（microtear）が腱において起こるテンディノパシーまたはいずれかの変性状態を示し、しばしば、疼痛、凝り、力の喪失を引き起こす。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、「腱傷害」なる語は、腱組織が欠陥または変性状態になるテンディノパシーまたはいずれかの状態を示す。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、「小型分子」なる語は、生物学的プロセスに影響を及ぼすように作用することができる、ポリペプチドおよび核酸以外のいずれかの化学基または他の基を包含する。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、「治療する」または「治療」なる語は、ヒトを包含する哺乳動物における疾患のための医療のいずれかの適用または応用を示し、疾患を阻害することを包含する。それは、例えば、退行を引き起こすこと、喪失した、失われた、または欠陥のある機能を復旧または修復すること、または効果のない過程を刺激することによって、疾患発症を阻止すること、および疾患を軽減することを包含する。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、「活性」なる語は、種々の手段によって阻害、減少または干渉されることのできる酵素またはタンパク質の生物学的機能を示す。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、「酵素活性」なる語は、酵素に関連した１以上の生理学的、触媒的、調節的または酵素的活性を示す。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、「有効量」なる語は、意義のある患者の利益、すなわち、テンディノパシーの治癒または症状の治癒および改善率の増加を示すのに十分な本発明の各阻害剤の全量を意味する。
【００５１】
Ｉ．腱および軟骨の成分
腱は、少量のＩＩＩ型コラーゲン、繊維芽細胞様腱細胞および軟骨細胞様繊維軟骨細胞が間に散らばったＩ型コラーゲンの正しく並べられた層からなる。Ｉ型コラーゲンは、緻密なコラーゲン繊維中に詰められており、これは、付着した筋肉によって腱が引き伸ばされ、引っ張られる間、強度および剛性を腱に提供する。対照的に、軟骨は、ＩＩ型コラーゲンおよびプロテオグリカンからなり、圧縮には抵抗するが、引っ張りには抵抗しないように設計されている。繊維軟骨は、腱および軟骨組織の混合物であり、主として、腱と骨との間の中間面で見出される。腱内での軟骨および繊維軟骨の形成は、密接に詰められたＩ型コラーゲン繊維を破壊し、腱の引張強度を減少させるので、腱の機能に有害である。したがって、損傷を受けた、または傷ついた腱組織における軟骨および／または繊維軟骨の形成を防ぐ、または減少させるために、本発明の方法を用いてもよい。
【００５２】
腱における軟骨形成の１つの兆候は、組織におけるプロテオグリカンレベルの増加の存在であり、しばしば、これらのプロテオグリカンのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）側鎖の存在によって検出される。プロテオグリカンは、１以上の線状ＧＡＧ鎖を有するコアタンパク質によって特徴付けられる糖タンパク質のファミリーであり、反復二糖単位によってできている。アグリカンおよびバーシカンなどのコンドロイチン硫酸プロテオグリカンは、軟骨特異的である。アグリカンは、軟骨の主要な構造成分であり、軟骨の圧縮強度および弾力性の原因となる。アグリカン分子の水和および凝集は、軟骨組織における圧縮荷重を吸収する粘性ゲルを創り出す。Watanabe et al., J. Biochem 124(4):687-93 (1998)。軟骨組織に存在する他のプロテオグリカンは、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、例えば、シンデカン３（ｓｙｎ−３）を包含する。Kirn-Safran et al., Birth Defects Res 72(Part C):69-88 (2004)。
【００５３】
ＩＩ．軟骨および繊維軟骨形成を促進する分子
本発明は、一部、軟骨特異的遺伝子（例えば、アグリカン、バーシカンおよびＩＩ型コラーゲン）の発現が傷ついた腱において増加するという知見に基づく。該結果は、Soslowsky et al., J Shoulder Elbow Surg. 9:79-84 (2000)において記載されるラット腱酷使モデルにおいて得られた遺伝子発現プロファイルを用いて、酷使の結果として、傷ついた腱が繊維軟骨に変換することを示唆する。
【００５４】
本発明は、また、一部、軟骨特異的プロテオグリカンのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）側鎖の合成に関与する酵素の発現が酷使した腱において増加するという知見に基づく。軟骨特異的酵素が損傷を受けた腱においてアップレギュレートされるという知見は、激しく損傷を受けた腱において観察されるＧＡＧの蓄積のためのメカニズムを提供する。Khan et al., Sports Med 27:393-408 (1999) および Tallon et al., Med Sci Sports Exerc 33(12):1983-90 (2001)。これらの増加したＧＡＧレベルは、アグリカン、バーシカンおよびｓｙｎ−３などのプロテオグリカンのレベルが損傷を受けた腱において増加することを示す。かくして、テンディノパシーは、軟骨特異的プロテオグリカンの産生の原因である酵素の活性を減少させることにより、これらのプロテオグリカンの蓄積を防ぐことによって、治療することができる。
【００５５】
Ａ．軟骨形成を促進する分子はテンディノパシーにおいてアップレギュレートされる。
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐＲ（登録商標）システムは、正常な腱および酷使プロトコールに付された腱の間の遺伝子発現における差異を同定するために使用された。遺伝子発現プロファイルは、酷使後の棘上筋腱において差別的にレギュレートされている４００個を超える遺伝子を生じた。４週間の酷使によって、１０７個の遺伝子がアップレギュレートされ、２７個の遺伝子がダウンレギュレートされた。最も高くアップレギュレートされた遺伝子のいくつかは、軟骨特異的遺伝子であり、コラーゲン２型アルファ−１鎖（Ｃｏｌ２ａ１）、Ｓｏｘ９、バーシカンおよびアグリカンを包含する。他のアップレギュレートされた遺伝子は、軟骨プロテオグリカン上のＧＡＧ側鎖の形成に関与するものを包含し、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＧａｌＮＴ−１およびＨｓ３ｓｔ１を包含する。これらの結果に基づくと、これらの分子自体、あるいはこれらの分子の活性またはこれらの分子をコードしている遺伝子の発現の開始または維持に関与する他の分子は、酷使された腱における軟骨および／または繊維軟骨の形成に関与しうるようである。これらの分子は、下記に列挙するような酵素、転写因子およびシグナル変換因子を包含しうる。
【００５６】
１．酵素
腱組織における軟骨または繊維軟骨の産生を阻害する一の方法は、プロテオグリカン合成に関与する酵素の発現または活性を阻害することである。プロテオグリカンＧＡＧ鎖合成に関与する酵素の完全なリストのために、Silbert et al., IUBMB Life 54:177-186 (2002) および Sugahara et al., IUBMB Life 54:163-175 (2002)を参照のこと。これらの酵素は、その発現が酷使された腱において増加するタンパク質を包含する（実施例１）。したがって、本発明の一の具体例は、下記の酵素のいずれか１つの発現または活性を阻害することを含む。
【００５７】
コンドロイチン硫酸ＧＡＧ側鎖の開始および伸長に関与するＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１およびＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２（ＥＣ ２．４．１．１７４およびＥＣ ２．４．１．１７５）。ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１は、コンドロイチンＧＡＧｓの開始および伸長に関与し、一方、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２は、同じコンドロイチンＧＡＧｓの伸長に関与する。これらの酵素の詳細な記載に関しては、Uyama et al., J. Biol. Chem. 277(11):8841-8846 (2002); Gotoh et al., J. Biol. Chem. 277(41):38189-38196 (2002); Sato et al. J. Biol. Chem. 278(5):3063-3071 (2003); Uyama et al., J. Biol. Chem. 278(5):3072-3078 (2003)を参照のこと。
【００５８】
ＧＡＧ側鎖合成の第一工程の一つである、最初のＸｙｌ基のプロテオグリカンコアタンパク質上への付加に関与するＵＤＰ−Ｄ−キシロース：コアタンパク質β−Ｄ−キシロシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．２．２６９）。
【００５９】
新規なＧＡＧ側鎖のＸｙｌ基上へのガラクトース残基の付加に関与するＧａｌトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．１３３およびＥＣ ２．４．１．１３４）。
【００６０】
新規なＧＡＧ側鎖のガラクトース残基上へのＧｌｃＡ基の付加に関与するＧｌｃＡトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．１３５、ＥＣ ２．．４．１．２２６、およびＥＣ ２．４．１．２２５）。
【００６１】
ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ酵素によって付加されたコンドロイチン硫酸ＧＡＧｓのＧａｌＮＡｃ基へのＧｌｃＮＡｃ基の付加に関与するＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．２２３およびＥＣ ２．４．１．２２４）。
【００６２】
コンドロイチン硫酸ＧＡＧｓ上の硫酸残基の移動に関与するスルホトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．８．２．５およびＥＣ ２．８．２．１）。
【００６３】
コンドロイチン硫酸ＧＡＧｓへの硫酸残基の最初の付加に関与するコンドロイチン硫酸シンターゼ（ＥＣ ３．１．６．４およびＥＣ ３．１．６．１２）。
【００６４】
ＧａｌＮＴ−１（Ｅ．Ｃ．２．４．１．４１）は、糖タンパク質上のＯ−結合型オリゴ糖側鎖の形成における第一工程を触媒する。White et al., J Biol Chem 270(41):24156-65 (1995)。
【００６５】
Ｈｓ３ｓｔ１（ＥＣ ２．８．２．２３）は、ヘパラン硫酸ＧＡＧｓ上への硫酸残基の付加を触媒する。Shworak et al., J Biol Chem 272(44):28008-19 (1997)。
【００６６】
直接的または間接的に、これらの酵素のいずれか１つの活性を阻害することは、プロテオグリカンの形成を減少させるであろう。これらの酵素の阻害方法は、下記に論述する。
【００６７】
２．遺伝子発現
軟骨および／または線維軟骨の形成を防ぐための別法は、損傷を受けた腱組織における軟骨特異的タンパク質の発現を直接的または間接的に防ぐことである。例えば、バーシカンまたはアグリカン、軟骨特異的プロテオグリカンの発現は、アグリカンまたはバーシカンをコードしている遺伝子の転写または翻訳を防ぐこと、または、アグリカンまたはバーシカン遺伝子の発現に関与する転写因子の発現または機能を防いで、その結果、これらの遺伝子の転写を防ぐことを包含するいくつかの方法によって減少されうる。
【００６８】
プロテオグリカンおよびＩＩ型コラーゲンを包含する多くの軟骨特異的因子は、機能的関節軟骨および他の組織の重要な要素なので、本発明を実施する場合、軟骨特異的因子の阻害が損傷を受けた腱に局在することを確実にすることが重要である。
【００６９】
腱組織における軟骨および／または繊維軟骨の形成を阻害するための一の方法は、軟骨構造タンパク質の発現に関与する非酵素的タンパク質の活性または発現を阻害することである。これらの遺伝子の発現または活性を阻害することによって、軟骨および／または繊維軟骨組織を構成するタンパク質の発現を間接的に阻害することができる。軟骨構造タンパク質の発現に関与するタンパク質は、限定するものではないが、Ｓｏｘ９を包含する。
【００７０】
腱組織における軟骨または繊維軟骨の形成を阻害するための他の方法は、主要な軟骨構造タンパク質、例えば、アグリカン、バーシカン、およびＩＩ型コラーゲンの発現（活性とは対照的に）を直接的に阻害することを含む。下記の遺伝子は、損傷を受けた腱組織においてアップレギュレートされることが分かっており、軟骨形成に関連する。
【００７１】
ａ）Ｓｏｘ９
Ｓｏｘ９（ｓｒｙ−型高移動度群ｂｏｘ９）は、軟骨の発生に関与する転写因子である。Ｓｏｘ９は、軟骨細胞において発現し、コラーゲンアルファ１（ＩＩ）遺伝子（Ｃｏｌ２ａ１）の発現と一致する。Ｓｏｘ９は、ＩＩ型コラーゲンなどの軟骨構造タンパク質を発現する遺伝子の転写を活性化または増加することによって、軟骨形成を調節する。Shum et al., Arthritis Res. 4(2):94-106 (2002); Bi et al., Nat. Genet. 22(1):85-9 (1999)。
【００７２】
ｂ）Ｃｏｌ２ａ１
Ｃｏｌ２ａ１は、軟骨の主要成分であるＩＩ型コラーゲンのアルファ１鎖をコードする。Cheah et al., Proc Natl Acad Sci U S A 82(9):2555-9 (1985)。
【００７３】
ｃ）Ａｇｃ１
Ａｇｃ１は、アグリカンプロテオグリカンのコアタンパク質をコードする。Doege et al., Extracellular Matrix Genes (Sandel, L. J.; Boyd, C. D., eds.) Academic Press (New York) 137-152 (1990)。本明細書中で使用する場合、「アグリカン」なる語は、軟骨組織に特異的な大きなプロテオグリカンを示す。アグリカンは、多数のコンドロイチン硫酸ＧＡＧ基で被覆されたタンパク質コアからなる。アグリカンは、軟骨の主要な構造成分であり、水と結合して粘性ゲル様物質を形成することができる。この水和は、軟骨組織に弾力性および圧縮強度を提供する。
【００７４】
ｄ）Ｃｓｐｇ２
Ｃｓｐｇ２は、バーシカンプロテオグリカンのコアタンパク質をコードする。バーシカンは、多数のコンドロイチン硫酸側鎖を有する別の大きなプロテオグリカンである。アグリカンと同様に、バーシカンは水と結合して、組織の強度および弾力性を増加する粘性ゲルを形成する。Knudson et al., Sem Cell Dev Biol 12:69-78 (2001)。
【００７５】
Ｂ．軟骨形成を促進する分子の阻害によるテンディノパシーの治療
本発明は、上記に挙げた分子の発現および／または活性を減少させることによるテンディノパシーの治療または予防方法を提供する。さらに、本発明は、テンディノパシーを治療または予防するために、上記に挙げた分子の阻害剤を投与する方法を提供する。
【００７６】
１．治療法
本発明は、一部、対照組織と比較した場合、酷使した腱組織において、アグリカン、バーシカン、Ｓｏｘ９、ＩＩ型コラーゲン、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＧａｌＮＴ−１およびＨＳ３ｓｔ１をコードしている遺伝子の発現レベルが有意に増加するという知見に基づく（図１〜７）。該結果は、プロテオグリカン合成経路に関与する酵素または他の分子の増加した発現が、傷ついた腱組織の軟骨および／または繊維軟骨への変換を導くことを示す。したがって、一の具体例において、本発明は、軟骨および／または繊維軟骨の合成に関与する酵素または他の分子の活性、発現または蓄積を阻害することによって、腱組織における軟骨および／または繊維軟骨の形成を減少させることを特徴とするテンディノパシーの治療方法を包含する。
【００７７】
腱における軟骨または繊維軟骨形成に関与する酵素または他の分子の活性を遮断することのできる阻害剤は、本発明において有用である。本発明の方法において有用な阻害剤は、グリコシル化、ｐｅｇ化、または別の非タンパク性ポリマーに連結されていてもよい。阻害剤は、改変された（すなわち、元の、または天然のグリコシル化パターンから改変された）グリコシル化パターンを有するように修飾されていてもよい。本明細書中で使用される場合、「改変された」なる語は、元の阻害剤と比べて、１以上の炭水化物部分が付加または欠失されていること、および／または１以上のグリコシル化部位が付加または欠失されていることを意味する。グリコシル化部位の阻害剤への付加は、当該分野でよく知られたグリコシル化部位コンセンサス配列を含有するようにアミノ酸配列を改変することによって達成されうる。炭水化物部分の数を増加させる別の手法は、阻害剤のアミノ酸残基にグリコシドを化学的または酵素的にカップリングすることによる。これらの方法は、ＷＯ ８７／０５３３０、およびAplin et al., Crit Rev Biochem 22:259 306 (1981)に記載されている。基質上に存在するいずれかの炭水化物部分の除去は、Sojar et al., Arch Biochem Biophys 259:52-57 (1987); Edge et al., Anal Biochem 118:131-137 (1981); および by Thotakura et al., Meth Enzymol 138:350-359 (1987)によって記載されているように、化学的または酵素的に達成されうる。
【００７８】
また、例えば、ペプチド、小型分子および核酸を包含するタンパク質性および非タンパク質性阻害剤を本発明の方法に使用してもよい。
【００７９】
ａ）ペプチドおよび小型分子
本発明の方法に有用な阻害剤は、小型有機ペプチドおよび分子ならびに小型無機分子を包含する。これらのペプチドおよび小型分子は、合成および精製天然阻害剤を包含する。目的のタンパク質を特異的に標的とするペプチドおよび小型分子を同定する方法は、当該分野でよく知られている。例えば、標的タンパク質の酵素的および／または生物学的機能のアッセイを用いて、ペプチドおよび／または小型分子ライブラリーを標的タンパク質、例えば、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ＧａｌＮＴ−１および／またはＳｏｘ９の阻害についてスクリーンしてもよい。別の具体例において、小型分子および／またはペプチドライブラリーを標的タンパク質、例えば、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ＧａｌＮＴ−１および／またはＳｏｘ９の競合的放射性リガンド結合アッセイにおいて、それらの基質またはリガンドを用いてスクリーンしてもよい。
【００８０】
別法では、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づくアッセイ、例えば、時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイを、阻害剤を同定するために用いてもよい。例示的具体例において、プロテオグリカンのコアタンパク質をＨｉｓまたはＧＳＴタグで標識し、ユーロピウム、フルオロフォアに結合した抗−ＨｉｓまたはＧＳＴ抗体を用いてタンパク質を標識する。別法では、コアタンパク質は、リジンまたはシステイン残基上で、非特異的にユーロピウムで標識される。ドナー糖分子は、Ｃｙ５、蛍光染料で標識する。該アッセイにおいて有用なドナーおよびアクセプター分子のリストは、Uyama et al., J Biol Chem 278(5):3072-78 (2003)の表Ｉに見出すことができる。
【００８１】
アクセプターおよびドナー分子は、標的酵素と共に、および標的酵素を伴わずに、種々の比率で合わせられる。ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイは、３４０ｎｍで系を励起し、各々、６１５および６６５ｎｍでユーロピウムおよびＣｙ５の発光を測定し、次いで、ユーロピウム発光に対するＣｙ５発光の比を計算することによって行われる。
【００８２】
酵素が存在しない場合、ドナーおよびアクセプター分子は、互いに近接にならず、Ｃｙ５およびユーロピウム分子の個々の蛍光の消光もなく、その結果、ベースラインレベル比がもたらされる。標的酵素をアッセイ系に加えた場合、ドナー糖分子がアクセプタータンパク質に移動し、系の蛍光が消光する。Ｃｙ５のユーロピウム蛍光に対する比は、移動した糖分子の量に伴って、最大まで増加する。
【００８３】
標的酵素の阻害剤を同定するために、ペプチドまたは小型分子を該アッセイ系に加える。試験化合物が糖のタンパク質への移動を阻害できる場合、蛍光の消光が減少する。試験化合物が酵素の移動活性の１００％を阻害することができるならば、ユーロピウム発光に対するＣｙ５発光の比は、ベースラインレベルにある。該アッセイにおいて酵素活性の少なくとも５０％を阻害する化合物は、次いで、ＧＡＧ合成を減少する能力について評価するための、細胞ベースの系において評価される（下記）。
【００８４】
本発明は、また、例えば、上記に詳述したアッセイを用いて腱の形態に対するかかる分子の影響をさらに同定するために、付加的なスクリーニングアッセイ、例えば、二次および三次アッセイの使用を提供する。
【００８５】
ｂ）ドミナント・ネガティブ変異体
本発明のある特定の具体例において、変異ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ＧａｌＮＴ−１、Ｈｓ３ｓｔ１またはＳｏｘ９タンパク質を本発明の方法において阻害剤として用いてもよい。例えば、イン・ビボおよびイン・ビトロの両方で上記の分子の活性に対しドミナント・ネガティブ効果を有する天然の変種または人工改変ホモログは、本発明の方法において使用されうる。
【００８６】
ｃ）核酸
上記で挙げた標的分子の活性を遮断することのできる核酸は、本発明において有用である。かかる阻害剤は、例えば、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ＧａｌＮＴ−１、Ｈｓ３ｓｔ１またはＳｏｘ９と相互作用するタンパク質をコードしうる。別法では、かかる阻害剤は、標的分子（例えば、ＧａｌＮＡｃ）の基質またはリガンドと干渉することのできるタンパク質をコードしていてもよく、コード化されたタンパク質が標的分子のその基質またはリガンドへの結合を遮断する場合、または標的分子の結合後に基質またはリガンドの活性を遮断する場合、本発明の方法において有用でありうる。もちろん、阻害剤は、標的分子およびその基質またはリガンドと同時に相互作用するタンパク質をコードしていてもよい。かかる核酸は、例えば、本発明の方法において有用なＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、Ｈｓ３ｓｔ１、ＧａｌＮＴ−１またはＳｏｘ９阻害剤を発現するために使用することができる。
【００８７】
本発明の方法は、また、上記した分子またはそのタンパク質結合パートナーのいずれかの発現を減少させるために、限定するものではないが、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）および短鎖二本鎖ＲＮＡ（ｓｄｓＲＮＡ）を包含する干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）の使用を包含する。ＲＮＡｉは、核酸分子、例えば、合成短鎖干渉ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡ干渉剤を導入して、標的遺伝子の発現を阻害またはサイレントにすることによって開始することができる。例えば、米国特許公報第２００３／０１５３５１９号および第２００３／０１６７４９０１号および米国特許第６，５０６，５５９号および第６，５７３，０９９号を参照のこと。
【００８８】
ｓｉＲＮＡは、化学的に合成してもよく、イン・ビトロ転写によって製造してもよく、または宿主細胞内で生産してもよい。典型的には、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１５〜５０ヌクレオチド長、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡは、約１９、２０、２１または２２ヌクレオチド長を包含する約１５〜約４０ヌクレオチド長、例えば、約１５〜約２８ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であってもよく、各鎖において約０、１、２、３、４、５、または６ヌクレオチド長の３’および／または５’オーバーハンドを含有していてもよい。ｓｉＲＮＡは、転写的サイレンシングによって標的遺伝子を阻害しうる。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡの分解または特異的転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）によって、ＲＮＡ干渉を促進することができる。
【００８９】
本発明の方法において用いられるｓｉＲＮＡはまた、小型ヘアピンＲＮＡｓ（ｓｈＲＮＡｓ）を包含する。ｓｈＲＮＡは、約５〜約９ヌクレオチドのヌクレオチドループが次に続く短い（例えば、約１９〜２５ヌクレオチド）アンチセンス鎖、およびその類似のセンス鎖からなる。別法では、センス鎖は、ヌクレオチドループ構造の前にあってもよく、アンチセンス鎖が後ろに続いてもよい。これらのｓｈＲＮＡは、プラスミドおよびウイルス性ベクター中に含有されていてもよい。
【００９０】
ｓｉＲＮＡ分子の標的領域は、所定の標的配列から選択されうる。例えば、ヌクレオチド配列は、開始コドンの約２５〜１００ヌクレオチド下流から開始することができる。ヌクレオチド配列は、５’または３’非翻訳領域、ならびに開始コドンに近い領域を含有することができる。ｓｉＲＮＡ分子の設計および調製方法は、当該分野でよく知られており、ＲＮＡｉ試薬としての配列を選択するための種々の規則を包含する。例えば、Boese et al., Methods Enzymol 392:73-96 (2005)を参照のこと。
【００９１】
ｓｉＲＮＡは、Hannon et al., Nature 418:244 251 (2002); McManus et al., Nat Reviews 3:737 747 (2002); Heasman et al., Dev Biol 243:209 214 (2002); Stein et al., J Clin Invest, 108:641 644 (2001); および Zamore et al., Nat Struct Biol 8(9):746 750 (2001)に記載されるような標準的な技術を用いて製造すればよい。好ましいｓｉＲＮＡは、５’リン酸化されている。
【００９２】
ｓｉＲＮＡ阻害剤は、例えば、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ＧａｌＮＴ−１、Ｈｓ３ｓｔ１、Ｓｏｘ９、Ａｇｃ１、Ｃｓｐｇ１またはＣｏｌ２ａ１、または上記の他の分子、ならびにその基質またはリガンドを標的とするために使用することができる。
【００９３】
核酸は、その天然環境から、実質的に純粋または均一な形態で取得、単離および／または精製されうる。種々の異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のための系は、よく知られている。適当な宿主細胞は、細菌、哺乳動物細胞、酵母、およびバキュロウイルス系を包含する。異種ポリペプチドの発現のために当該分野で入手可能な哺乳動物細胞系統は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウスメラノーマ細胞等を包含する。核酸からタンパク質を製造するのに適当な他の細胞については、Gene Expression Systems, Eds. Fernandez et al., Academic Press (1999)を参照のこと。ＲＮＡｉ分子は、化学的に合成してもよく、またはｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ配列をコード化したＤＮＡ配列から発現させてもよい。
【００９４】
上記した分子のドミナント・ネガティブ変異体の製造のために、適当な調節配列を含有し、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、選択またはマーカー遺伝子および適宜、他の配列を含む適当なベクターを選択または構築することができる。ベクターは、適宜、プラスミドまたはウイルス性、例えば、ファージ、またはファージミドであってもよい。さらなる詳細については、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)を参照のこと。例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞中への導入および遺伝子発現、およびタンパク質の分析において、核酸を扱うための多くの既知の技術およびプロトコールは、Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel et al., 2nd ed., John Wiley & Sons (1992)において詳細に記載されている。
【００９５】
核酸は、付加的なポリペプチド配列をコードしている他の配列、例えば、マーカーまたはレポーターとして機能する配列に融合することができる。マーカーまたはレポーター遺伝子の例は、ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性の原因）、ジヒドロホレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃＺ（ガラクトシダーゼをコード化している）、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）、ルシフェラーゼを包含する。その他、多くが当該分野で知られている。
【００９６】
２．酵素的活性の阻害
本発明の特定の具体例において、テンディノパシーを治療する方法は、プロテオグリカンの生合成に関与する酵素、例えば、アグリカンおよび／またはバーシカンへのコンドロイチン硫酸ＧＡＧｓの付加に関与する酵素の活性を減少、阻害またはダウンレギュレートすることを含む。これらの酵素は、例えば、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ＵＤＰ−Ｄ−キシロース：コアタンパク質β−Ｄ−キシロシルトランスフェラーゼ、Ｇａｌトランスフェラーゼ、ＧｌｃＡトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、コンドロイチン硫酸シンターゼ、Ｈｓ３ｓｔ１およびＧａｌＮＴ−１を包含する。
【００９７】
例示的具体例において、本発明は、損傷を受けた腱におけるＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ＧａｌＮＴ−１、および／またはＨｓ３ｓｔ１酵素の活性を減少、阻害またはダウンレギュレートする方法を包含する。他の具体例において、本発明は、損傷を受けた腱におけるＸｙｌトランスフェラーゼ、Ｇａｌトランスフェラーゼ、ＧｌｃＡトランスフェラーゼ、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、またはコンドロイチン硫酸シンターゼ活性を減少、阻害またはダウンレギュレートする方法を包含する。上記のペプチドまたは小型分子阻害剤は、これらの方法を実施するために使用してもよい。
【００９８】
ａ）酵素活性の阻害剤の同定
本発明は、さらに、損傷を受けた腱組織において、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ＧａｌＮＴ−１、Ｈｓ３ｓｔ１、Ｘｙｌトランスフェラーゼ、Ｇａｌトランスフェラーゼ、ＧｌｃＡトランスフェラーゼ、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、および／またはコンドロイチン硫酸シンターゼの阻害剤として作用することのできる薬剤の効力を同定および評価する方法を含む。
【００９９】
かかる阻害剤は、腱における軟骨または繊維軟骨形成に関与する酵素の活性を遮断または減少させる。これらの阻害剤は、修飾された可溶性基質、タンパク質、小型分子および核酸を包含する。
【０１００】
テンディノパシーを治療するための薬剤を同定する方法は、上記の酵素に対する個々の薬剤の効果、上記の酵素の酵素活性、タンパク質−標的相互作用、またはタンパク質−タンパク質相互作用をアッセイすることを含む。種々のイン・ビボまたはイン・ビトロアッセイをテンディノパシーの治療における阻害剤の効力を決定するために用いてもよい。一の例示的具体例において、小型分子は、上記の酵素への影響力、例えば、上記の酵素の酵素活性、標的結合、またはタンパク質−タンパク質相互作用への影響力をハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）のような方法によってアッセイすることによって、その治療的有用性の可能性をイン・ビトロで評価される。
【０１０１】
典型的なＨＴＳアッセイにおいて、候補化合物の、例えば、酵素活性、リガンド−レセプター結合などに対する阻害効果は、既知濃度の候補物質の存在下におけるアッセイの終点を、候補物質の不在下および／または既知阻害化合物の存在下において実施した対照と比較することによって測定することができる。一般に、従来の染料、蛍光または放射性分子を用いて、候補化合物の影響をモニターする。かくして、例えば、リガンドとそのレセプターとの結合を阻害するか、または酵素活性を阻害し、それにより、酵素過程のターンオーバーを減少させる候補化合物を同定することができる。
【０１０２】
本発明の例示的具体例は、（１）ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ＧａｌＮＴ−１、およびＨｓ３ｓｔ１からなる群から選択される少なくとも１つの試料を提供し、（２）試験薬剤と該試料成分を合わせ、（３）該試験薬剤に応答した該試料成分の活性を測定し、次いで、（４）該試験薬剤が該試料成分の活性を阻害するかどうかを決定することを含む、テンディノパシーを治療するための薬剤を同定するイン・ビトロでの方法を提供する。
【０１０３】
一の例示的具体例において、テンディノパシーを治療するための薬剤を同定するイン・ビトロでの方法は、軟骨外植片、初代軟骨細胞ペレット培養、または軟骨細胞系統をＢＭＰ−２タンパク質またはＢＭＰ−２タンパク質を発現しているアデノウイルスで処理することを含む。ＢＭＰ−２は、ＥＣＭおよびＧＡＧ合成を刺激する。次いで、試験化合物を培養物に加え、ＧＡＧ合成に対する阻害剤の効果を、ＧＡＧ側鎖中への３５Ｓの組込みを測定することによって、および／またはＤＭＭＢアッセイによって評価する。試験化合物の効果は、適当なビヒクル対照と比較する。
【０１０４】
可能性のある酵素阻害剤のイン・ビボアッセイは、（１）試験阻害剤を哺乳動物（例えば、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット）に少なくとも２、４、６または８週間、繰り返し投与し、（２）該哺乳動物を１７ｍ／分にて１時間／日、５日間／週で下り坂ランニングプロトコールに付し（実施例１）、次いで、（３）該阻害剤の棘上筋腱に対する効果をＤＭＭＢまたはＡＢアッセイによって、または遺伝子発現プロファイリングによって決定することを含んでいてもよく、ここに、腱変性（例えば、細胞および形態学的異常）の減速は、該阻害剤に起因すると考えられ、該阻害剤が腱変性障害の治療に有効であることを示す。
【０１０５】
本発明の方法において有用な試験阻害剤は、腱変性障害の１以上の動物モデルおよび／またはヒトにおいて評価されうることが理解されよう。
【０１０６】
イン・ビボおよびイン・ビトロでの阻害剤の存在下で酵素活性を測定するための種々のアッセイが当該分野で知られている。より頻繁に使用されるアッセイのいくつかの例は、分光光度法、蛍光分光分析、円偏光二色性、自動分光光度および蛍光分光法、共役アッセイ、酸または塩基の自動滴定、放射能法、無標識光学的検出、および酵素阻害アッセイを包含する。例示的具体例において、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１および／またはＣＳＧａｌＮＡｃＴ−２の酵素活性は、Uyama et al., J Biol Chem 277(11):8841-46 (2002)に記載されているように測定される。別の例示的具体例において、ＧａｌＮＴ−１の酵素活性は、White et al., J Biol Chem 270 (41):24156-65 (1995)に記載されているように測定される。
【０１０７】
本発明の方法において有用な酵素阻害剤は、例えば、それらが阻害する酵素と相互作用しうる。別法では、阻害剤は、例えば、酵素基質（例えば、ＧａｌＮＡｃ）または他の結合パートナーと相互作用しうる。阻害剤は、酵素の基質への結合を遮断する場合、および／または酵素の結合後に基質の活性を遮断する場合、本発明において有効でありうる。もちろん、阻害剤は、酵素および第２因子、例えば、基質の両方と相互作用しうる。この点において、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ＧａｌＮＴ−１、および／またはＨｓ３ｓｔ１阻害剤は、例えば、修飾された可溶性基質、他のタンパク質（酵素に結合するもの、および／または酵素基質を包含する）、修飾された形態の酵素またはそのフラグメント、プロペプチド、ペプチド、およびこれらの阻害剤全ての模倣物を包含する。
【０１０８】
酵素阻害剤は、例えば、直接的酵素阻害剤であってもよく、酵素に結合して酵素活性を中和してもよく、酵素発現レベルを減少させてもよく、前駆体分子の活性な成熟形態への安定性または変換に影響を及ぼしてもよく、酵素の１以上の基質への結合を干渉してもよく、または酵素の細胞内機能を干渉してもよい。
【０１０９】
３．転写因子活性の阻害
本発明の方法において有用な転写因子の阻害剤は、結合することによって直接的に、またはタンパク質−タンパク質相互作用および／または結合性を干渉することによって間接的に、因子の活性を阻害または減少しうる。この点において、Ｓｏｘ９の阻害剤は、修飾された可溶性リガンドまたは標的分子、小型分子、および核酸を包含しうる。
【０１１０】
イン・ビボおよびイン・ビトロで阻害剤の存在下においてＳｏｘ９活性を測定するためのアッセイは、当該分野で知られている。より頻繁に使用されるＳｏｘ９阻害剤に関するアッセイのいくつかの例は、酵母２ハイブリッドシステム、ルシフェラーゼリポーター遺伝子、Ｓｏｘ９阻害剤の存在下で軟骨細胞特異的遺伝子（例えば、Ｃｏｌ２ａ１、Ａｇｃ１）の発現レベルを決定するためのＰＣＲアッセイ、Ｓｏｘ９または軟骨細胞特異的遺伝子のウェスタンブロット分析、一時的トランスフェクション、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）アッセイ、およびノーザンブロット分析を包含する。
【０１１１】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づいた種々のタンパク質−タンパク質またはタンパク質−核酸相互作用アッセイを、Ｓｏｘ９とその結合パートナーとの相互作用に対する阻害剤の影響をアッセイするために利用してもよい。例えば、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭ（登録商標）増幅ルミネセンス近接均一アッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＲ）を用いることができ、またはバイオルミネセンス共鳴エネルギー移動（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＲのＢＲＥＴＴＭ）を用いて、Ｓｏｘ９結合相互作用に干渉する阻害剤についてイン・ビトロでアッセイを行ってもよい。
【０１１２】
一の具体例において、本発明は、（１）ドナー蛍光発生分子と融合した上記の標的分子を提供し、（２）該標的分子を試験薬剤と合わせ、（３）アクセプター蛍光性分子に融合した該標的分子の結合パートナーを加え、（４）該標的分子とその結合パートナーとの間の蛍光エネルギー移動レベルを測定し、次いで、（５）該試験薬剤が該標的分子とその結合パートナーとの相互作用を阻害したかどうかを決定することを含む、テンディノパシーを治療するための薬剤を同定するためのイン・ビトロアッセイの方法を提供する。
【０１１３】
阻害剤は、標的分子のその結合パートナーへの結合を干渉することができ、次いで、その２物質間のＦＲＥＴレベルに影響を及ぼすことができる。したがって、ＦＲＥＴ測定は、種々の効力の阻害剤を同定するために用いることができる。いったん標的分子の阻害剤がイン・ビトロで同定されたならば、さらにイン・ビボでの試験を行って、腱における軟骨および線維軟骨の形成の防止における阻害剤の効力および利用性を決定することができる。
【０１１４】
４．タンパク質発現の阻害
別の具体例において、テンディノパシーを治療するための方法は、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ＧａｌＮＴ−１、Ｈｓ３ｓｔ１、Ｃｏｌ２ａ１、Ｃｓｐｇ１、Ａｇｃ１、および／またはＳｏｘ９などの遺伝子およびそのコード化されたポリペプチドまたはタンパク質の発現および／または蓄積を減少、阻害またはダウンレギュレートすることを含む。これらの遺伝子の発現を阻害するのに有用な組成物は、例えば、上記セクションＩＩ（Ｂ）（１）（ｃ）に記載した干渉ＲＮＡ分子を包含する。
【０１１５】
これらの阻害剤は、いずれの方法で投与してもよいが、特定の具体例において、ＲＮＡ阻害剤を発現しているＤＮＡをアデノウイルスベクター中に組み込み、次いで、それを腱修復を必要とする患者に注射する。例示的具体例において、Wahdwa et al., Curr Opin Mol Ther 6(4):367-72 (2004)に記載されているように、ＲＮＡｉをコードしているヌクレオチド配列をｐｏｌＩＩプロモーターの下流に配置する。ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡのアデノウイルスベクター中への挿入方法は、当該分野でよく知られており、例えば、Krom et al., BMC Biotech 6(11):［印刷前に電子出版された］に記載されている。別法では、Schiffelers et al., Arthritis & Rheumatism 52(4):1314-18 (2005)に記載されるように、ＲＮＡｉ阻害剤は、傷ついた腱組織中に直接注射され、エレクトロポレーションによって細胞中に輸送される。
【０１１６】
５．テンディノパシー病
本発明の方法は、ヒト、霊長類、サル、齧歯類、ヒツジ、ウサギ、イヌ、モルモット、ウマ、ウシ、およびネコを包含する治療を必要とするいずれかの哺乳動物においてテンディノパシーを治療または予防するために用いられうる。治療または予防され得る障害は、例えば、テンディニティス、テンドニティス、テンディノシス、パラテンディニティス、腱滑膜炎、腱酷使傷害、腱外傷、腱周囲炎、パラテノニティス、および「テンディノパシー」病のファミリーにおけるいずれか他の状態を包含する。
【０１１７】
テンディノパシーは、酷使および反復運動、突発的な傷害（軽度〜重度）、徐々の変性、または加齢によって引き起こされうる。ほとんどの腱傷害は、腱を弱くし、それにより、しばしば疼痛、凝り、および力の喪失を引き起こす回復が遅い一連の微小断裂からなる。テンディノパシーは、通常、数週間の治療、活動の減少または修正、および休息を必要とする。傷ついた腱をあまりにも早くに再び使用すると、より多くの腱損傷を引き起こし、それにより、損傷を受けた腱が断裂または破壊を受けやすくなる。したがって、本発明によって治療または予防される障害は、酷使、スポーツまたは事故に関連した傷害および外傷、栄養不足、および高齢に関連した急性および慢性の両方の腱変性障害を包含する。
【０１１８】
テンディノパシーの一の例は、外側上顆炎であり、「テニス肘」としても知られており、よく知られたスポーツ医学および整形外科障害である。該障害の基礎となる病理は、肘の短橈側手根伸筋の酷使および微小断裂化に関連する。体はこれらの微小断裂を修復しようとするが、多くの場合、治癒過程が不完全である。慢性外側上顆炎のための手術を受けた患者の病理組織標本は、損傷を受けた腱における無秩序な血管繊維芽細胞形成異常を示す。修復におけるこの不完全な試みは、変性し、未成熟で、かつ脈管化した組織をもたらす。不完全に修復された組織は、正常な腱組織よりも弱く、正常に機能するための力に欠けている。この弱くなった組織は、また、疼痛を引き起こし、生活の質に負の影響を与えることによって、患者を制限する。同様の不完全な修復は、他の型の腱関連傷害または損傷、例えば、膝蓋骨腱炎（ジャンパーのひざ）、アキレス腱炎（ランナーに一般的）、および腱板腱炎（野球の投手のような「オーバーヘッド」アスリートにおいて見られる）において存在しうる。
【０１１９】
テンディノパシーは、また、例えば、高齢、食事不足、スポーツ活動、外傷、傷害、またはペフロキサシン（pefloxacin）などの薬物によって引き起こされうる。例えば、プロスタグランジンＥ１（ＰＥＧ１）−、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）−またはペフロキサシン−誘導性テンディノパシーは、ヒトのテンディノパシーのよく確立された動物モデルである。一の具体例において、本発明は、個体における薬物誘導性テンディノパシー、例えば、ペフロキサシン誘導性テンディノパシーの治療または予防方法を提供する。他の例示的具体例において、本発明は、酷使、スポーツまたは事故に関連した傷害および外傷、栄養不足、および高齢によって誘導されるテンディノパシーを治療または予防する方法を提供する。
【０１２０】
本発明は、さらに、哺乳動物に、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ＧａｌＮＴ−１、Ｘｙｌトランスフェラーゼ、Ｇａｌトランスフェラーゼ、ＧｌｃＡトランスフェラーゼ、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、コンドロイチン硫酸シンターゼ、Ｃｏｌ２ａ１、アグリカン、バーシカン、Ｈｓ３ｓｔ１、および／またはＳｏｘ９などの分子の活性および／または発現の阻害剤を、テンディノパシーに罹患した組織におけるかかる分子の活性および／または発現を予防または減少させるのに有効な量で投与することによる、腱変性障害を治療または予防する、腱の悪化を遅らせる、腱の質を復旧する、腱の健康を維持する、腱組織の低酸素変性を治療または予防する、腱組織のヒアリン変性を治療または予防する、腱組織のムコイドまたはミクソイド（myxoid）変性を治療または予防する、腱組織のフィブリノイド変性を治療または予防する、腱組織のリポイド変性を治療または予防する、腱組織の石灰化を治療または予防する、腱組織の繊維軟骨および骨化生を治療または予防する、腱の微小構造無欠性を維持する、腱の繊維構造を維持する、腱の繊維配列を維持する、正常な腱血管質を維持する、腱組織における正常な細胞性を維持する、腱組織における正常なＥＣＭ含量を復旧する、腱組織におけるＧＡＧの病理学的蓄積を減少させる、および／または腱質量、引張強度および／または柔軟性を維持するための方法を提供する。
【０１２１】
６．治療および動物モデルの評価
本発明の方法は、腱組織におけるテンディノパシーまたは微小欠陥を治療するために使用されうる。治療後または治療の間の腱の質は、例えば、腱の微小構造無欠性、腱コラーゲン染色性、腱組織細胞性における変化、腱血管化、および／またはＧＡＧ含量を評価することによって決定することができる。治療後または治療の間の腱の健康を評価する方法は、当該分野で知られており、限定するものではないが、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、超音波検査、および機能および／または疼痛の評価を包含する。別法では、腱の健康は、腱組織におけるＧＡＧのレベルを評価することによって測定されうる。
【０１２２】
腱のＧＡＧ含量を決定するための一のアッセイは、腱における硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）濃度の測定のための１，９−ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）アッセイである。腱のＧＡＧ含量を決定するための別のアッセイは、腱組織におけるＧＡＧ量の増加を検出するために使用できる組織学的アルシアンブルー（Alcian blue（ＡＢ））染色である。
【０１２３】
ＩＩＩ．治療方法および医薬組成物
本発明の方法において有用な阻害剤は、局所、経口、静脈内、腹膜内、筋内、腔内、皮下、埋め込み、または経皮手段によって局所的または全身的に投与されうる。
【０１２４】
例示的具体例において、個体への阻害剤の投与は、また、阻害剤をコードしている核酸配列をイン・ビボで患者に投与する遺伝子療法の手段によって達成されうる。例示的具体例において、プロモーター配列および本発明の方法において有用な核酸阻害剤をコードしている配列を含む核酸をアデノウイルス発現ベクター中に挿入する。次いで、該アデノウイルスを患者の腱に直接注射し、ここで、核酸阻害剤が発現される。腱組織への核酸のアデノウイルス媒介性デリバリーの例は、例えば、Mehta et al., J Hand Surg 30A(1):136-41 (2005); Lou et al., J Orthoped Res 19:1199-1202 (2001)およびLou, Clin Orthopaed Rel Res 379S:S252-55 (2000)に記載されている。
【０１２５】
他の例示的具体例において、核酸阻害剤は、他のウイルス性発現ベクター、例えば、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、およびアデノ随伴ウイルス中に組み込まれる。適当なベクターは、初代腱細胞における各型のウイルスのイン・ビトロでの感染性を評価することによって選択されうる。
【０１２６】
別法では、Schiffelers et al., Arthritis & Rheumatism 52(4):1314-18 (2005)に記載されるように、核酸阻害剤を腱組織中に直接注射し、エレクトロポレーションによって細胞中に移動させる。
【０１２７】
他の例示的具体例において、本発明の方法において有用なペプチドまたは小型分子阻害剤は、Paoloni et al., J Bone Joint Surg 86A(5):916-22 (2004)に記載されているように、経皮パッチ上にコーティングされ、腱組織を覆う皮膚に直接塗布されてもよい。
【０１２８】
テンディノパシーの治療のための分子の投与方法は、当該分野で知られている。「投与」は、いずれかの特定のデリバリー系に限定されず、限定するものではないが、非経口（皮下、静脈内、髄内、関節内、筋内、腔内、または腹膜内注射を包含する）、直腸、局所、経皮、または経口（例えば、カプセル、懸濁液または錠剤において）を包含しうる。個体への投与は、単回投与または連続もしくは断続的反復投与において、種々の生理学上許容される塩形態のいずれかにおいて、および／または医薬組成物（上記）の一部としての許容される医薬担体および／または添加剤と共に、局所的または全身的に行ってもよい。生理学上許容される塩形態および標準的な医薬処方技術および賦形剤は、当業者によく知られている。例えば、Physicians' Desk Reference (PDR) 2003, 57th ed., Medical Economics Company, 2002; and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, eds. Gennado et al., 20th ed, Lippincott, Williams ＆ Wilkins, 2000)を参照のこと。
【０１２９】
本発明の方法において有用な阻害剤は、症状の重篤度および疾患の進行度にもよるが、約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与されうる。適当な有効投与量は、治療している臨床医によって、例えば、下記の範囲：約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、および約５００μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇから選択される。
【０１３０】
別の例示的具体例において、阻害剤は、例えば、テンディノパシーの治療のために、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、２０、または４０週の期間、または少なくとも１、１．５または２年間あるいは対象の寿命まで、繰り返し投与される。本発明の別の具体例において、阻害剤は、例えば、腱の正常な構造および組成の復旧を刺激するために、単回投与量において投与することができる。
【０１３１】
一般に、本発明の方法において有用な阻害剤は、１０〜８および１０〜７；１０〜７および１０〜６；１０〜６および１０〜５；または１０〜５および１０〜４ｇ／ｋｇの投与量で投与されうる。一の動物モデルにおいて達成される治療上有効投与量は、ヒトを包含する別の動物において使用するために、当該分野で知られた換算係数を用いて換算することができる。例えば、Freireich et al., Cancer Chemother Reports 50(4):219 244 (1966)を参照のこと。
【０１３２】
本発明の方法において使用されるべき阻害剤の正確な投与量は、所望の成果に基づいて経験的に決定される。例示的成果は、（１）腱変性障害が治療または予防されること、（２）腱悪化が遅くなること、（３）腱の質が復旧すること、（４）腱の健康が維持されること、（５）腱の低酸素変性が治療または予防されること、（６）腱のヒアリン変性が治療または予防されること、（７）腱のムコイドまたはミクソイド変性が治療または予防されること、（８）腱のフィブリノイド変性が治療または予防されること、（９）腱のリポイド変性が治療または予防されること、（１０）腱の石灰化が治療または予防されること、（１１）腱の繊維軟骨および骨化生が治療または予防されること、（１２）腱の繊維構造が維持されること、（１３）腱の繊維配列が維持されること、（１４）腱の正常な血管質が維持されること、（１５）腱の正常な細胞性が維持されること、（１６）腱に含有される正常なＥＣＭが復旧されること、および／または（１７）腱質量、引張強度および／または柔軟性が維持されることを包含する。例えば、阻害剤は、腱の悪化（例えば、腱質量、構造構成の喪失および／または微小断裂および疼痛になりやすいこと）を少なくとも２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００または５００％遅らせるのに有効な量で投与される。
【０１３３】
いくつかの具体例において、本発明の方法において用いられる組成物は、さらに、医薬上許容される賦形剤を含む。本明細書中で使用される場合、「医薬上許容される賦形剤」なる語は、医薬投与に適合するいずれか、および全ての溶媒、分散培地、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを示す。医薬上活性な物質に対するかかる培地および薬剤の使用は、当該分野でよく知られている。組成物は、また、補足的、付加的または強化した治療的機能を提供する他の活性な化合物を含有していてもよい。医薬組成物は、また、投与説明書と共に、容器、パックまたはディンスペンサー中に含まれていてもよい。
【０１３４】
本発明の方法と関連して投与されるべき医薬組成物は、その意図された投与経路と適合性になるように処方されるべきである。かかる処方の例は、ありのまま提供される、または生物分解性ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ＰＬＧＡ）と組み合わせて提供される結晶性タンパク質処方を包含する。
【０１３５】
本発明の方法において有用な阻害剤は、担体ゲルおよびマトリックスまたは誘導骨再生および／または骨置換のために使用される他の組成物と共に、医薬組成物として投与してもよい。かかるマトリックスの例は、合成ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシアパタイト、コラーゲンおよびフィブチンベースのマトリックス、ＴｉｓｓｅｅｌＲフィブリン接着剤などを包含する。
【０１３６】
ある特定の具体例において、阻害剤は、他の治療化合物、例えば、ＮＳＡＩＤｓ、コルチコステロイド、一酸化窒素、テストステロン、エストロゲン、成長因子（例えば、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３およびＭＰ５２）と共に、または同時に投与してもよい。
【０１３７】
本発明の方法において有用な阻害剤は、腱傷害の治療または予防を促進するように、腱インプラント、マトリックスおよびデポー系にコーティングしてもよく、またはこれらの中に組み込んでもよい。
【実施例】
【０１３８】
実施例１：ラット棘上筋腱は、酷使した軟骨マーカーを表示する。
ラット棘上筋腱の酷使に対する応答を、転写プロファイリングを用いて分子レベルで研究した。腱酷使のラットモデルは、以前に記載されている。Soslowsky et al., J Shoulder Elbow Surg 9:79-84 (2000)。該モデルでは、炎症および血管新生マーカーが変化することが分かっているが（Perry et al., J Shoulder Elbow Surg 14:79S-83S (2005)）、酷使傷害の周囲の事象を理解するために、より幅広いアプローチが行われた。
【０１３９】
２４匹の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（４００−４５０ｇ）を棘上筋腱（ＳＳＴ）酷使プロトコールに１週間（ｎ＝８）、２週間（ｎ＝８）、および４週間（ｎ＝８）付した。該プロトコールは、１７ｍ／分にて１時間／日、５日間／週の下り坂ランニング（１０％勾配）からなる。さらに６匹のラットをケージ活動対照として用いた（時間０）。各時点で、さらに２匹のランニングしていないラットを年齢をマッチさせた群対照として用いた。
【０１４０】
検死にて、各肩由来の棘上筋腱および各膝由来の膝蓋腱（ＰＴ）を摘出した。膝蓋腱は、該プロトコールを用いた酷使の著しい兆候を示さないので、運動の影響の内部対照となった。採取した腱の重量を量り、液体窒素中で即座に凍結させた。該組織を凍結切断し、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen）で抽出した。ＲＮｅａｓｙキット（QIAGEN）を用いて、抽出物の水層からＲＮＡを単離した。ＲＮＡ濃度は、分光光度計を用いて決定した。３０，０００を越える転写物の発現レベルをモニターするための転写プロファイリングを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘラットゲノム２３０ ２．０アレイを用いて行った。全てのアレイ画像を欠陥および質について視覚的に調べた。高いバックグラウンド、低いシグナル強度または重大な欠陥を有するアレイをさらなる分析から排除した。シグナル値は、Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ １．０（ＧＣＯＳ，Affymetrix）を用いて決定した。各アレイについて、統計値を平均シグナル強度値１００に標準化した。デフォルトＧＣＯＳ統計値を全ての分析に用いた。いずれかの組織における平均発現が１００シグナル単位を越え、ＧＣＯＳデフォルトセッティングによって決定されたプレゼント（Ｐ）コールを有する試料のパーセンテージが６６％以上である場合、遺伝子は、検出可能と考えられた。標準化されたシグナル値は、対数の底１０に変換された。ＡＮＯＶＡ試験由来のｐ値が＜０．０１であり、ランニングと対照との間の差異がいずれかの時点で少なくとも２倍である場合、遺伝子は差別的に発現されたと考えられた。
【０１４１】
４００個を越える遺伝子が酷使後の棘上筋腱において差別的に調節された。４週間のランニングによって、１０７個の遺伝子がアップレギュレートされ、２７個の遺伝子がダウンレギュレートされた。最高にアップレギュレートされた遺伝子のうち多くは、コラーゲンＩＩ型アルファ１、バーシカンおよびアグリカンを包含する軟骨組織において高く発現される。これらの結果は、酷使した腱が繊維軟骨表現型に変換されていることを示唆した。これらの同じ遺伝子は、走らされた動物の膝蓋腱においてアップレギュレートされなかった（図１〜７参照）。
【０１４２】
実施例２：ｓｉＲＮＡ阻害剤の調製
ｓｉＲＮＡは、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＧａｌＮＴ−１またはＨｓ３ｓｔ１のヌクレオチド配列を、特異的ｓｉＲＮＡを設計するための商業的ウェブサイト（例えば、ｓｉｒｎａｗｉｚａｒｄ．ｃｏｍまたはＡｍｂｉｏｎＲ ｓｉＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ）中に入力することによって選択される。配列選択ガイドラインがこれらのツールに埋め込まれている。
【０１４３】
ｓｉＲＮＡの効力は、それをＣ−２０／Ａ４および／またはＣ−２８／Ｉ２軟骨細胞中にトランスフェクトし、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１および／またはＧａｌＮＴ−１の発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってモニターすることによって測定される。同じヌクレオチド組成を有する適当なスクランブルｓｉＲＮＡは、実験対照として用いられる。
【０１４４】
実施例３：プロテオグリカン合成の阻害剤のためのイン・ビトロアッセイ系
ｓｉＲＮＡがＣ−２０／Ａ４および／またはＣ−２８／Ｉ２軟骨細胞におけるＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＧａｌＮＴ−１またはＨｓ３ｓｔ１の発現を減少させることができる場合、次いでそれを、プロテオグリカンＧＡＧ側鎖の産生を減少させる能力について試験する。Ｃ−２０／Ａ４および／またはＣ−２８／Ｉ２軟骨細胞は、細胞外マトリックスおよびＧＡＧ合成を刺激するためにＢＭＰ−２タンパク質またはＢＭＰ−２を発現しているアデノウイルスで処理される。ｓｉＲＮＡ、または別法では、小型分子、ＧＡＧ合成の阻害剤を培養物に加え、阻害剤の存在下または不在下におけるプロテオグリカン中への３５Ｓの組み込みを比較することによって、阻害剤の効果を評価する。別法では、Arai et al., Osteoarthritis and Cartilage 12:599-613 (2004)に記載されているように、阻害剤の存在下または不在下におけるＧＡＧレベルをＤＭＭＢアッセイによって比較することによって、阻害剤の効果を評価する。
【０１４５】
実施例４：ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＧａｌＮＴ−１またはＨｓ３ｓｔ１のｓｉＲＮＡ阻害によるテンディノパシーの治療のためのプロトコール
トレッドミル酷使プロトコール（実施例１）またはＰＧＥ１、ＰＧＥ２もしくはペフロキサシン（３００ｍｇ／ｍｌ）の週に５回、１週間の局所注射のいずれかを用いて、ラットにおいてテンディノパシーを誘導する。
【０１４６】
一旦、ｓｉＲＮＡがＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＧａｌＮＴ−１またはＨｓ３ｓｔ１のイン・ビトロ活性を減少させることが見出されたならば、例えば、Krom et al., BMC Biotech 6(11):［電子出版］に記載されるように、それをｓｈＲＮＡに変換し、ｓｈＲＮＡ配列をクローン化し、アデノウイルス中に挿入する。アデノウイルスは、ｓｈＲＮＡのイン・ビボ発現、および続く、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１および／またはＧａｌＮＴ−１の発現の阻害のために使用される。感染方法は、初代腱細胞において最適化される。
【０１４７】
ｓｈＲＮＡを発現している機能的アデノウイルスは、傷ついた腱中に直接注射されて（Mehta et al., J Hand Surg 30A(1):136-41 (2005)）、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１および／またはＧａｌＮＴ−１遺伝子の発現を局所的に減少させる。スクランブル配列は、実験対照として含まれる。腱における軟骨組織形成量は、ＧＡＧレベルを評価することによって求められる。組織学的アルシアンブルー染色を用いて、腱組織におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の増加した量を検出する。ＤＭＭＢ試薬を用いて、腱から抽出された硫酸化ＧＡＧの量を定量する。
【０１４８】
ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１および／またはＧａｌＮＴ−１の阻害のテンディノパシーに対する効果のイン・ビボ評価は、組織学によって、および腱強度の機械的または機能的試験によって決定される。非処理対照と比べてＧＡＧレベルが有意に減少する場合、および／または正常な損傷を受けていない腱と類似のレベルまで減少する場合、阻害剤は有効であると考えられる。別法では、機能的または機械的試験が非処理対照と比べて、改善された機能および／または減少した疼痛を明らかにする場合、阻害剤は有効であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】図１は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるＣｏｌ２ａ１（ＩＩ型コラーゲン）の遺伝子発現プロファイルを示す（図１Ａ）。Ｃｏｌ２ａ１遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図１Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、軟骨組織および酷使した腱組織の両方において、Ｃｏｌ２ａ１が高く発現されることを示す。
【図２】図２は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるＡｇｃ１（アグリカン）の遺伝子発現プロファイルを示す（図２Ａ）。Ａｇｃ１遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図２Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、軟骨組織および酷使した腱組織の両方において、Ａｇｃ１が高く発現されることを示す。
【図３】図３は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるＳｏｘ９（ｓｒｙ型高移動度群ｂｏｘ９）の遺伝子発現プロファイルを示す（図３Ａ）。Ｓｏｘ９遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図３Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、軟骨組織および酷使した腱組織の両方において、Ｓｏｘ９が高く発現されることを示す。
【図４】図４は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるＣｓｐｇ２（バーシカン）の遺伝子発現プロファイルを示す（図４Ａ）。バーシカン遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図４Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、軟骨組織および酷使した腱組織の両方において、バーシカンが高く発現されることを示す。
【図５】図５は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるコンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１）の遺伝子発現プロファイルを示す（図５Ａ）。ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図５Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、軟骨組織および酷使した腱組織の両方において、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１が高く発現されることを示す。
【図６】図６は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるＧａｌＮＴ−１（ＧａｌＮＴ１−ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−アルファ−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチド−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ１）の遺伝子発現プロファイルを示す（図６Ａ）。ＧａｌＮＴ−１遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図６Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、酷使した腱組織において、ＧａｌＮＴ−１が高く発現されることを示す。
【図７】図７は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるＨｓ３ｓｔ１（ヘパラン硫酸（グルコサミン）３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ１）の遺伝子発現プロファイルを示す（図７Ａ）。Ｈｓ３ｓｔ１遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図７Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、酷使した腱組織において、および正常な腱組織と比べた場合、軟骨組織において、Ｈｓ３ｓｔ１が高く発現されることを示す。
【技術分野】
【０００１】
発明の記載
先行出願
本出願は、２００６年３月３日に出願された米国仮特許出願番号第６０／７７９，１６５号に対して優先権を主張し、その内容は、出典明示により本明細書の一部とされる。
【０００２】
発明の分野
本発明の技術分野は、損傷を受けた腱において、軟骨および／または繊維軟骨組織の産生を減少させることによるテンディノパシー（tendinopathy）の治療に関する。本発明は、さらに、損傷を受けた腱における軟骨および／または繊維軟骨組織の産生に関与する分子の阻害に関する。
【背景技術】
【０００３】
テンディノパシーとは、種々の腱障害を表すために使用される一般用語である。「テンディニティス（tendinitis）」なる語は、「腱の炎症」を意味し、しばしば、腱で起きた問題を表すために使用されるが、炎症はめったに腱疼痛の原因とはならない。最も一般的には、腱疼痛は、実際、腱またはその周辺の結合組織における一連の微小断裂（microtear）の症状であり、より正式には、テンディノシス（tendinosis）と呼ばれる。他の腱障害は、繊維非配向性を伴うコラーゲン変性、腱におけるムコイド基質の増加、石灰化、腱の酷使、脈管化、加齢、および体の隆起部に対する腱の摩擦を原因とする腱疼痛を包含する。テンディノパシーは、益々多くの腱の専門家によって、これらの状態を表すために使用されており、しばしば、テンディニティス、テンディノシス、パラテンディニティス（paratendinitis）、腱滑膜炎、パラテノニティス（paratenonitis）、腱酷使損傷および外傷を総称するものとして特徴付けられる。Khan et al., Sports Med 27:393-408 (1999)。
【０００４】
正常な腱組織は、高い引張強度を有する一次、二次および三次繊維束において同じ方向に走っているコラーゲン繊維の規則的に配列された束が高密度に詰め込まれた結合組織から成る。これらの繊維のなかに散在しているのは、Ｉ型コラーゲンが豊富な粘性の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を合成する平坦で先細りした腱細胞である。Ｉ型コラーゲン束は、腱の柔軟性および構造的支えを提供する。健康な腱において、ＥＣＭの合成および分解の間に動的平衡が存在する。しかしながら、テンディノパシーは、この平衡に不利な影響を及ぼし、その結果、コラーゲン繊維の構造的な再配列および無秩序をもたらす。コラーゲン束の無秩序は、腱に軟骨を出現させる。繊維芽細胞、筋繊維芽細胞、新血管形成、およびＥＣＭにおけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）の病理学的蓄積は、明らかに、テンディノパシーを患った組織において顕著である。Tallon et al., Med Sci Sports Exerc 33(12):1983-90 (2001); Khan et al., Sports Med 27(6):393-408 (1999)。損傷を受けた腱における代謝的および形態学的変化により、疼痛がもたらされ、また、断裂および破壊されやすくなる。
【０００５】
現在、損傷を受けた腱のＥＣＭの分解およびリモデリングは、アグリカン、デコリンおよびビグリカンなどのマトリックス巨大分子を分解することのできる、内在結合組織細胞および侵入炎症細胞からのメタロプロテイナーゼの放出によって引き起こされると考えられている。これらのメタロプロテイナーゼは、ＭＭＰｓ（Matrix Metalloproteinases）、ＡＤＡＭｓ（A Disintegrin And Metalloproteinase）およびＡＤＡＭＴｓ（A Disintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin Motifs、例えば、アグリカナーゼ)を包含する。Riley G., Expert Rev Mol Med 7(5):1-23 (2005); Rees et al., Biochem J 350:180-188 (2000)。しかしながら、ＭＭＰｓの幅広いスペクトルの阻害剤に関する臨床試験は、テンディノパシーに対する病理学的類似性を有する骨関節炎の治療において不成功に終わった。Clark et al., Expert Opin Ther Targets 7(1):19-34 (2003)。したがって、メタロプロテイナーゼの阻害がテンディノパシーの治療に効果的であることはなさそうである。実際、棘上筋腱およびアキレス腱などの高応力下の腱において、腱に最適なレベルのＥＣＭを提供するために最小レベルのメタロプロテイナーゼ活性が必要とされるかもしれない。Riley G., Expert Rev Mol Med 7(5):1-23 (2005)。
【０００６】
現在、種々の標準的な非手術的および手術的テンディノパシー治療が存在する。非手術的方法は、休息、凍結療法、活動修正、理学療法、非スイテロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）およびコルチコステロイドを包含する。休息および活動修正は、これらの病態のいくつかの患者を助けうるが、これらの療法では治療できない臨床的に有意な集団が残っている。経口抗炎症薬物療法は、使用の広がりにもかかわらず、比較研究において有用であることが証明されておらず、望ましくない副作用を有することがある。さらに、いくつかの研究では、非スイテロイド性薬物療法は、疼痛を緩和することによって、患者にテンディノパシーの初期症状を無視させるので、実際に、治癒過程に悪影響を与えうることを示唆する。
【０００７】
コルチコステロイドは、通常、組織の炎症を減少させるために使用されるが、テンディノパシーの治療のためのかかる薬物の使用は、特に、コルチコステロイドがコラーゲン合成を阻害することから、勧められない。いくつかの研究では、コルチゾンで治療された患者において短期改善が観察されたが、１年以上患者を追跡すると、高い症状再発率および疑わしい有効率が明らかになった。コルチゾン注射は、また、腱破壊、感染、皮膚の色素脱失、および皮膚萎縮の危険性を有する。
【０００８】
腱修復のための外科的方法は、損傷を受けた腱の創面切除および修復を包含する。しかしながら、観血手術または関節鏡視下手術は、深部感染、神経血管構造に対する損傷および瘢痕形成などの多くの合併症の可能性を有する。該手術はまた、費用がかかり、局所または全身麻酔に関連した付加的な危険性を有する。
【０００９】
したがって、現存する治療法を越える腱関連傷害の治療プロトコールに対する要望が今だにある。柔軟性腱組織に対する傷害または他の損傷は、治癒が遅く、完全に修復するのに何ヶ月も、または何年もかかることがある。腱関連傷害は、社会に重大な影響を与えている。酷使による傷害は、米国における全腱関連外来診療の７パーセント近くを占める。Woodwell et al., Adv Data 346:1-44 (2004)。米国労働省労働統計局からの情報によれば、かかる傷害は、労働時間の重大な喪失につながっている（http://www.bls.gov/lif参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明の概要
本発明は、テンディノパシーの治療に対する新規なアプローチを提供する。酷使されたラットの腱の転写プロファイリングを行うことによって、今回、アグリカン、バーシカン、Ｃｏｌ２ａ１（ＩＩ型コラーゲン）およびＳｏｘ９などの軟骨特異的遺伝子の発現レベルが傷ついた腱において増加することが見出された。これらの結果は、酷使の結果として、傷ついた腱組織が繊維軟骨に変換されることを示唆する。主にＩ型コラーゲンからなる腱とは異なり、繊維軟骨は、ＩＩ型コラーゲンおよび大きなプロテオグリカン、例えば、アグリカンおよびバーシカンを含有する。軟骨組織は、腱の密接に詰められたＩ型コラーゲン繊維を崩壊させるので、腱内での軟骨および繊維軟骨の形成は、腱修復に不利益である。該崩壊は、腱の引張強度および弾力性を減少させる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、本発明は、患者の腱組織における軟骨特異的プロテオグリカンの形成を減少させることによって、患者においてテンディノパシーを治療する方法を提供する。本発明は、また、テンディノパシーの治療のための医薬の製造のための軟骨特異的プロテオグリカンの形成を減少させる化合物の使用を提供する。
【００１２】
いくつかの具体例において、該方法および使用は、患者の腱組織におけるアグリカンおよび／またはバーシカンの合成に関与する酵素の活性を減少させることを包含する。特定の具体例において、該方法および使用は、患者の腱組織におけるコンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ１（ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１）および／またはガラクトサミンポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ１（ＧａｌＮＴ−１）の活性を減少させることを包含する。他の具体例において、該方法および使用は、限定するものではないが、ＵＤＰ−Ｄ−キシロース：コアタンパク質β−Ｄ−キシロシルトランスフェラーゼ、Ｇａｌトランスフェラーゼ、ＧｌｃＡトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、コンドロイチン硫酸シンターゼ、およびヘパラン硫酸スルホトランスフェラーゼを包含する軟骨プロテオグリカン合成に関与する１以上の他の酵素の活性を減少させることを包含する。
【００１３】
軟骨構造タンパク質の産生に関与する酵素および他のタンパク質の活性は、酵素または他のタンパク質の機能を直接または間接的に阻害することによって減少されうるか、または酵素または他のタンパク質自体の発現を阻害することによって減少されうる。
【００１４】
本発明は、また、患者の腱組織における軟骨特異的構造タンパク質の発現を減少させることによって、患者においてテンディノパシーを治療する方法を提供する。本発明は、さらに、テンディノパシーを治療するための医薬の製造のための軟骨特異的構造タンパク質の発現を減少させる化合物の使用を提供する。いくつかの具体例において、例えば、限定するものではないが、アグリカン、シンデカン３（ｓｙｎ−３）、バーシカン、およびＩＩ型コラーゲンなどの軟骨特異的構造タンパク質の発現が直接阻害される。他の具体例において、軟骨特異的遺伝子の発現に関与する転写因子の活性が減少される。これらの転写因子およびシグナル変換タンパク質は、例えば、Ｓｏｘ９を包含する。
【００１５】
他の具体例において、本発明は、試験化合物を治療の必要な対象に投与し、次いで、該薬物の、腱組織におけるグリコグリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）の合成に関与する酵素の活性を阻害する能力を測定することを特徴とする、テンディノパシーを治療するための化合物の同定方法を包含する。
【００１６】
ある特定の具体例において、テンディノパシーを治療するための化合物の同定方法または治療の評価方法は、（１）Ｃｓ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ヘパラン硫酸（グルコサミン）３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ１（Ｈｓ３ｓｔ１）、ＧａｌＮＴ−１およびＳｏｘ９からなる群から選択される少なくとも１つの試料成分を提供し、（２）該試料を試験化合物と合わせ、（３）該試験化合物に応答する該試料成分の活性を測定し、次いで、（４）該試験化合物が該試料成分の活性を阻害するかどうかを決定することを含む。
【００１７】
本発明の付加的な目的および利点は、一部、下記の記載に示され、一部、該記載から明らかであり、または本発明の実施によって分かるものである。本発明の目的および利点は、下記の詳細な記載および添付の特許請求の範囲において特に示される要素および組み合わせの手段によって実現し、達成されるであろう。
【００１８】
上記の一般的な記載および下記の詳細な記載の両方は、単なる例示であって説明のためのものであり、主張されるように、本発明を制限するものではないことが理解されるべきである。
【００１９】
添付の図面は、本明細書中に組み込まれ、その一部を成すものであるが、本発明のいくつかの具体例を説明し、明細書の記載と一緒になって、本発明の原理を説明するために役立つものである。
【００２０】
図面の簡単な説明
図１〜７において、ＳＳＴは棘上筋腱を示し、ＰＴは膝蓋腱非傷害内部対照を示し、Ｒは酷使プロトコールに付された動物を示し（Soslowsky et al., J. Shoulder Elbow Surg. 9:79-84 (2000)）、Ｃは酷使プロトコールに付されなかった対照動物を示し、時間的経過は、１、２および４週であり、ＢＭは骨髄を示す。
【００２１】
図１は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるＣｏｌ２ａ１（ＩＩ型コラーゲン）の遺伝子発現プロファイルを示す（図１Ａ）。Ｃｏｌ２ａ１遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図１Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、軟骨組織および酷使した腱組織の両方において、Ｃｏｌ２ａ１が高く発現されることを示す。
【００２２】
図２は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるＡｇｃ１（アグリカン）の遺伝子発現プロファイルを示す（図２Ａ）。Ａｇｃ１遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図２Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、軟骨組織および酷使した腱組織の両方において、Ａｇｃ１が高く発現されることを示す。
【００２３】
図３は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるＳｏｘ９（ｓｒｙ型高移動度群ｂｏｘ９）の遺伝子発現プロファイルを示す（図３Ａ）。Ｓｏｘ９遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図３Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、軟骨組織および酷使した腱組織の両方において、Ｓｏｘ９が高く発現されることを示す。
【００２４】
図４は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるＣｓｐｇ２（バーシカン）の遺伝子発現プロファイルを示す（図４Ａ）。バーシカン遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図４Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、軟骨組織および酷使した腱組織の両方において、バーシカンが高く発現されることを示す。
【００２５】
図５は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるコンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１）の遺伝子発現プロファイルを示す（図５Ａ）。ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図５Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、軟骨組織および酷使した腱組織の両方において、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１が高く発現されることを示す。
【００２６】
図６は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるＧａｌＮＴ−１（ＧａｌＮＴ１−ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−アルファ−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチド−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ１）の遺伝子発現プロファイルを示す（図６Ａ）。ＧａｌＮＴ−１遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図６Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、酷使した腱組織において、ＧａｌＮＴ−１が高く発現されることを示す。
【００２７】
図７は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるＨｓ３ｓｔ１（ヘパラン硫酸（グルコサミン）３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ１）の遺伝子発現プロファイルを示す（図７Ａ）。Ｈｓ３ｓｔ１遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図７Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、酷使した腱組織において、および正常な腱組織と比べた場合、軟骨組織において、Ｈｓ３ｓｔ１が高く発現されることを示す。
【００２８】
配列の簡単な記載
ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、下記の受入番号の下、Ｇｅｎｂａｎｋから入手可能である。ヒト（ＮＭ＿０１８３７１）；マウス（ＮＭ＿１７２７５３）；およびラット（ＸＭ＿２２４７５７）。
【００２９】
ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、下記の受入番号の下、Ｇｅｎｂａｎｋから入手可能である。ヒト（ＮＭ＿０１８５９０）；マウス（ＮＭ＿０３０１６５）；およびラット（ＸＭ＿２３２３１６）。
【００３０】
ＧａｌＮＴ−１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、下記の受入番号の下、Ｇｅｎｂａｎｋから入手可能である。ヒト（ＮＭ＿０２０４７４）；マウス（ＮＭ＿０１３８１４）；およびラット（ＮＭ＿１２４３７３）。
【００３１】
アグリカンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、下記の受入番号の下、Ｇｅｎｂａｎｋから入手可能である。ヒト（ＮＭ＿００１１３５）；マウス（ＮＭ＿００７４２７）；およびラット（ＮＭ＿０２２１９０）。
【００３２】
Ｃｏｌ２ａ１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、下記の受入番号の下、Ｇｅｎｂａｎｋから入手可能である。ヒト（ＮＭ＿００１８４４）；マウス（ＮＭ＿０３１１６３）およびラット（ＮＭ＿０１２９２９）。
【００３３】
Ｓｏｘ９のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、下記の受入番号の下、Ｇｅｎｂａｎｋから入手可能である。ヒト（ＮＭ＿０００３４６）；マウス（ＮＭ＿０１１４４８）；およびラット（ＸＭ＿３４３９８１）。
【００３４】
バーシカンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、下記の受入番号の下、Ｇｅｎｂａｎｋから入手可能である。ヒト（ＮＭ＿００４３８５）；マウス（ＸＭ＿４８８５１０）およびラット（ＸＭ＿２１５４５１）。
【００３５】
ヘパラン硫酸（グルコサミン）３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、下記の受入番号の下、Ｇｅｎｂａｎｋから入手可能である。ヒト（ＮＭ＿００５１１４）、マウス（ＮＭ＿０１０４７４）、およびラット（ＮＭ＿０５３３９１）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
発明の詳細な記載
本発明は、腱組織における軟骨および／または繊維軟骨形成に関与する１以上の分子の活性を減少させることによって、テンディノパシーを治療する方法を提供する。
【００３７】
本発明がより容易に理解されために、まず、ある特定の用語を定義付ける。付加的な定義は、本発明の詳細な記載を通して示される。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「テンディノパシー」なる語は、限定するものではないが、テンディニティス、テンドニティス、テンディノシス、パラテンディニティス、腱滑膜炎、腱酷使傷害および外傷、腱周囲炎（perintendinitis）、およびパラテノニティスを包含する、腱および腱周辺で起きる全ての病状を包含する。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「腱欠陥」なる語は、限定するものではないが、テンディノパシーを包含するいずれかの腱障害を示す。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「損傷を受けた腱」なる語は、テンディノパシーまたは腱欠陥を罹患している腱組織を示す。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「酷使」なる語は、直接的な外傷とは対照的に、酷使の結果として腱欠陥またはテンディノパシーを罹患している腱を示す。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、「患者」または「対象」なる語は、腱欠陥に罹りやすい、腱欠陥に罹患している、または腱欠陥からの回復過程にあって、治療が必要ないずれかのヒトまたは動物を示す。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、「テンディニティス」なる語は、テンドニティス（もう一つ別の綴り）、テンディノパシーまたは腱の炎症を示す。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、「テンディノシス」なる語は、腱を弱くする微小断裂（microtear）が腱において起こるテンディノパシーまたはいずれかの変性状態を示し、しばしば、疼痛、凝り、力の喪失を引き起こす。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、「腱傷害」なる語は、腱組織が欠陥または変性状態になるテンディノパシーまたはいずれかの状態を示す。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、「小型分子」なる語は、生物学的プロセスに影響を及ぼすように作用することができる、ポリペプチドおよび核酸以外のいずれかの化学基または他の基を包含する。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、「治療する」または「治療」なる語は、ヒトを包含する哺乳動物における疾患のための医療のいずれかの適用または応用を示し、疾患を阻害することを包含する。それは、例えば、退行を引き起こすこと、喪失した、失われた、または欠陥のある機能を復旧または修復すること、または効果のない過程を刺激することによって、疾患発症を阻止すること、および疾患を軽減することを包含する。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、「活性」なる語は、種々の手段によって阻害、減少または干渉されることのできる酵素またはタンパク質の生物学的機能を示す。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、「酵素活性」なる語は、酵素に関連した１以上の生理学的、触媒的、調節的または酵素的活性を示す。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、「有効量」なる語は、意義のある患者の利益、すなわち、テンディノパシーの治癒または症状の治癒および改善率の増加を示すのに十分な本発明の各阻害剤の全量を意味する。
【００５１】
Ｉ．腱および軟骨の成分
腱は、少量のＩＩＩ型コラーゲン、繊維芽細胞様腱細胞および軟骨細胞様繊維軟骨細胞が間に散らばったＩ型コラーゲンの正しく並べられた層からなる。Ｉ型コラーゲンは、緻密なコラーゲン繊維中に詰められており、これは、付着した筋肉によって腱が引き伸ばされ、引っ張られる間、強度および剛性を腱に提供する。対照的に、軟骨は、ＩＩ型コラーゲンおよびプロテオグリカンからなり、圧縮には抵抗するが、引っ張りには抵抗しないように設計されている。繊維軟骨は、腱および軟骨組織の混合物であり、主として、腱と骨との間の中間面で見出される。腱内での軟骨および繊維軟骨の形成は、密接に詰められたＩ型コラーゲン繊維を破壊し、腱の引張強度を減少させるので、腱の機能に有害である。したがって、損傷を受けた、または傷ついた腱組織における軟骨および／または繊維軟骨の形成を防ぐ、または減少させるために、本発明の方法を用いてもよい。
【００５２】
腱における軟骨形成の１つの兆候は、組織におけるプロテオグリカンレベルの増加の存在であり、しばしば、これらのプロテオグリカンのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）側鎖の存在によって検出される。プロテオグリカンは、１以上の線状ＧＡＧ鎖を有するコアタンパク質によって特徴付けられる糖タンパク質のファミリーであり、反復二糖単位によってできている。アグリカンおよびバーシカンなどのコンドロイチン硫酸プロテオグリカンは、軟骨特異的である。アグリカンは、軟骨の主要な構造成分であり、軟骨の圧縮強度および弾力性の原因となる。アグリカン分子の水和および凝集は、軟骨組織における圧縮荷重を吸収する粘性ゲルを創り出す。Watanabe et al., J. Biochem 124(4):687-93 (1998)。軟骨組織に存在する他のプロテオグリカンは、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、例えば、シンデカン３（ｓｙｎ−３）を包含する。Kirn-Safran et al., Birth Defects Res 72(Part C):69-88 (2004)。
【００５３】
ＩＩ．軟骨および繊維軟骨形成を促進する分子
本発明は、一部、軟骨特異的遺伝子（例えば、アグリカン、バーシカンおよびＩＩ型コラーゲン）の発現が傷ついた腱において増加するという知見に基づく。該結果は、Soslowsky et al., J Shoulder Elbow Surg. 9:79-84 (2000)において記載されるラット腱酷使モデルにおいて得られた遺伝子発現プロファイルを用いて、酷使の結果として、傷ついた腱が繊維軟骨に変換することを示唆する。
【００５４】
本発明は、また、一部、軟骨特異的プロテオグリカンのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）側鎖の合成に関与する酵素の発現が酷使した腱において増加するという知見に基づく。軟骨特異的酵素が損傷を受けた腱においてアップレギュレートされるという知見は、激しく損傷を受けた腱において観察されるＧＡＧの蓄積のためのメカニズムを提供する。Khan et al., Sports Med 27:393-408 (1999) および Tallon et al., Med Sci Sports Exerc 33(12):1983-90 (2001)。これらの増加したＧＡＧレベルは、アグリカン、バーシカンおよびｓｙｎ−３などのプロテオグリカンのレベルが損傷を受けた腱において増加することを示す。かくして、テンディノパシーは、軟骨特異的プロテオグリカンの産生の原因である酵素の活性を減少させることにより、これらのプロテオグリカンの蓄積を防ぐことによって、治療することができる。
【００５５】
Ａ．軟骨形成を促進する分子はテンディノパシーにおいてアップレギュレートされる。
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐＲ（登録商標）システムは、正常な腱および酷使プロトコールに付された腱の間の遺伝子発現における差異を同定するために使用された。遺伝子発現プロファイルは、酷使後の棘上筋腱において差別的にレギュレートされている４００個を超える遺伝子を生じた。４週間の酷使によって、１０７個の遺伝子がアップレギュレートされ、２７個の遺伝子がダウンレギュレートされた。最も高くアップレギュレートされた遺伝子のいくつかは、軟骨特異的遺伝子であり、コラーゲン２型アルファ−１鎖（Ｃｏｌ２ａ１）、Ｓｏｘ９、バーシカンおよびアグリカンを包含する。他のアップレギュレートされた遺伝子は、軟骨プロテオグリカン上のＧＡＧ側鎖の形成に関与するものを包含し、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＧａｌＮＴ−１およびＨｓ３ｓｔ１を包含する。これらの結果に基づくと、これらの分子自体、あるいはこれらの分子の活性またはこれらの分子をコードしている遺伝子の発現の開始または維持に関与する他の分子は、酷使された腱における軟骨および／または繊維軟骨の形成に関与しうるようである。これらの分子は、下記に列挙するような酵素、転写因子およびシグナル変換因子を包含しうる。
【００５６】
１．酵素
腱組織における軟骨または繊維軟骨の産生を阻害する一の方法は、プロテオグリカン合成に関与する酵素の発現または活性を阻害することである。プロテオグリカンＧＡＧ鎖合成に関与する酵素の完全なリストのために、Silbert et al., IUBMB Life 54:177-186 (2002) および Sugahara et al., IUBMB Life 54:163-175 (2002)を参照のこと。これらの酵素は、その発現が酷使された腱において増加するタンパク質を包含する（実施例１）。したがって、本発明の一の具体例は、下記の酵素のいずれか１つの発現または活性を阻害することを含む。
【００５７】
コンドロイチン硫酸ＧＡＧ側鎖の開始および伸長に関与するＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１およびＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２（ＥＣ ２．４．１．１７４およびＥＣ ２．４．１．１７５）。ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１は、コンドロイチンＧＡＧｓの開始および伸長に関与し、一方、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２は、同じコンドロイチンＧＡＧｓの伸長に関与する。これらの酵素の詳細な記載に関しては、Uyama et al., J. Biol. Chem. 277(11):8841-8846 (2002); Gotoh et al., J. Biol. Chem. 277(41):38189-38196 (2002); Sato et al. J. Biol. Chem. 278(5):3063-3071 (2003); Uyama et al., J. Biol. Chem. 278(5):3072-3078 (2003)を参照のこと。
【００５８】
ＧＡＧ側鎖合成の第一工程の一つである、最初のＸｙｌ基のプロテオグリカンコアタンパク質上への付加に関与するＵＤＰ−Ｄ−キシロース：コアタンパク質β−Ｄ−キシロシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．２．２６９）。
【００５９】
新規なＧＡＧ側鎖のＸｙｌ基上へのガラクトース残基の付加に関与するＧａｌトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．１３３およびＥＣ ２．４．１．１３４）。
【００６０】
新規なＧＡＧ側鎖のガラクトース残基上へのＧｌｃＡ基の付加に関与するＧｌｃＡトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．１３５、ＥＣ ２．．４．１．２２６、およびＥＣ ２．４．１．２２５）。
【００６１】
ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ酵素によって付加されたコンドロイチン硫酸ＧＡＧｓのＧａｌＮＡｃ基へのＧｌｃＮＡｃ基の付加に関与するＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．２２３およびＥＣ ２．４．１．２２４）。
【００６２】
コンドロイチン硫酸ＧＡＧｓ上の硫酸残基の移動に関与するスルホトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．８．２．５およびＥＣ ２．８．２．１）。
【００６３】
コンドロイチン硫酸ＧＡＧｓへの硫酸残基の最初の付加に関与するコンドロイチン硫酸シンターゼ（ＥＣ ３．１．６．４およびＥＣ ３．１．６．１２）。
【００６４】
ＧａｌＮＴ−１（Ｅ．Ｃ．２．４．１．４１）は、糖タンパク質上のＯ−結合型オリゴ糖側鎖の形成における第一工程を触媒する。White et al., J Biol Chem 270(41):24156-65 (1995)。
【００６５】
Ｈｓ３ｓｔ１（ＥＣ ２．８．２．２３）は、ヘパラン硫酸ＧＡＧｓ上への硫酸残基の付加を触媒する。Shworak et al., J Biol Chem 272(44):28008-19 (1997)。
【００６６】
直接的または間接的に、これらの酵素のいずれか１つの活性を阻害することは、プロテオグリカンの形成を減少させるであろう。これらの酵素の阻害方法は、下記に論述する。
【００６７】
２．遺伝子発現
軟骨および／または線維軟骨の形成を防ぐための別法は、損傷を受けた腱組織における軟骨特異的タンパク質の発現を直接的または間接的に防ぐことである。例えば、バーシカンまたはアグリカン、軟骨特異的プロテオグリカンの発現は、アグリカンまたはバーシカンをコードしている遺伝子の転写または翻訳を防ぐこと、または、アグリカンまたはバーシカン遺伝子の発現に関与する転写因子の発現または機能を防いで、その結果、これらの遺伝子の転写を防ぐことを包含するいくつかの方法によって減少されうる。
【００６８】
プロテオグリカンおよびＩＩ型コラーゲンを包含する多くの軟骨特異的因子は、機能的関節軟骨および他の組織の重要な要素なので、本発明を実施する場合、軟骨特異的因子の阻害が損傷を受けた腱に局在することを確実にすることが重要である。
【００６９】
腱組織における軟骨および／または繊維軟骨の形成を阻害するための一の方法は、軟骨構造タンパク質の発現に関与する非酵素的タンパク質の活性または発現を阻害することである。これらの遺伝子の発現または活性を阻害することによって、軟骨および／または繊維軟骨組織を構成するタンパク質の発現を間接的に阻害することができる。軟骨構造タンパク質の発現に関与するタンパク質は、限定するものではないが、Ｓｏｘ９を包含する。
【００７０】
腱組織における軟骨または繊維軟骨の形成を阻害するための他の方法は、主要な軟骨構造タンパク質、例えば、アグリカン、バーシカン、およびＩＩ型コラーゲンの発現（活性とは対照的に）を直接的に阻害することを含む。下記の遺伝子は、損傷を受けた腱組織においてアップレギュレートされることが分かっており、軟骨形成に関連する。
【００７１】
ａ）Ｓｏｘ９
Ｓｏｘ９（ｓｒｙ−型高移動度群ｂｏｘ９）は、軟骨の発生に関与する転写因子である。Ｓｏｘ９は、軟骨細胞において発現し、コラーゲンアルファ１（ＩＩ）遺伝子（Ｃｏｌ２ａ１）の発現と一致する。Ｓｏｘ９は、ＩＩ型コラーゲンなどの軟骨構造タンパク質を発現する遺伝子の転写を活性化または増加することによって、軟骨形成を調節する。Shum et al., Arthritis Res. 4(2):94-106 (2002); Bi et al., Nat. Genet. 22(1):85-9 (1999)。
【００７２】
ｂ）Ｃｏｌ２ａ１
Ｃｏｌ２ａ１は、軟骨の主要成分であるＩＩ型コラーゲンのアルファ１鎖をコードする。Cheah et al., Proc Natl Acad Sci U S A 82(9):2555-9 (1985)。
【００７３】
ｃ）Ａｇｃ１
Ａｇｃ１は、アグリカンプロテオグリカンのコアタンパク質をコードする。Doege et al., Extracellular Matrix Genes (Sandel, L. J.; Boyd, C. D., eds.) Academic Press (New York) 137-152 (1990)。本明細書中で使用する場合、「アグリカン」なる語は、軟骨組織に特異的な大きなプロテオグリカンを示す。アグリカンは、多数のコンドロイチン硫酸ＧＡＧ基で被覆されたタンパク質コアからなる。アグリカンは、軟骨の主要な構造成分であり、水と結合して粘性ゲル様物質を形成することができる。この水和は、軟骨組織に弾力性および圧縮強度を提供する。
【００７４】
ｄ）Ｃｓｐｇ２
Ｃｓｐｇ２は、バーシカンプロテオグリカンのコアタンパク質をコードする。バーシカンは、多数のコンドロイチン硫酸側鎖を有する別の大きなプロテオグリカンである。アグリカンと同様に、バーシカンは水と結合して、組織の強度および弾力性を増加する粘性ゲルを形成する。Knudson et al., Sem Cell Dev Biol 12:69-78 (2001)。
【００７５】
Ｂ．軟骨形成を促進する分子の阻害によるテンディノパシーの治療
本発明は、上記に挙げた分子の発現および／または活性を減少させることによるテンディノパシーの治療または予防方法を提供する。さらに、本発明は、テンディノパシーを治療または予防するために、上記に挙げた分子の阻害剤を投与する方法を提供する。
【００７６】
１．治療法
本発明は、一部、対照組織と比較した場合、酷使した腱組織において、アグリカン、バーシカン、Ｓｏｘ９、ＩＩ型コラーゲン、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＧａｌＮＴ−１およびＨＳ３ｓｔ１をコードしている遺伝子の発現レベルが有意に増加するという知見に基づく（図１〜７）。該結果は、プロテオグリカン合成経路に関与する酵素または他の分子の増加した発現が、傷ついた腱組織の軟骨および／または繊維軟骨への変換を導くことを示す。したがって、一の具体例において、本発明は、軟骨および／または繊維軟骨の合成に関与する酵素または他の分子の活性、発現または蓄積を阻害することによって、腱組織における軟骨および／または繊維軟骨の形成を減少させることを特徴とするテンディノパシーの治療方法を包含する。
【００７７】
腱における軟骨または繊維軟骨形成に関与する酵素または他の分子の活性を遮断することのできる阻害剤は、本発明において有用である。本発明の方法において有用な阻害剤は、グリコシル化、ｐｅｇ化、または別の非タンパク性ポリマーに連結されていてもよい。阻害剤は、改変された（すなわち、元の、または天然のグリコシル化パターンから改変された）グリコシル化パターンを有するように修飾されていてもよい。本明細書中で使用される場合、「改変された」なる語は、元の阻害剤と比べて、１以上の炭水化物部分が付加または欠失されていること、および／または１以上のグリコシル化部位が付加または欠失されていることを意味する。グリコシル化部位の阻害剤への付加は、当該分野でよく知られたグリコシル化部位コンセンサス配列を含有するようにアミノ酸配列を改変することによって達成されうる。炭水化物部分の数を増加させる別の手法は、阻害剤のアミノ酸残基にグリコシドを化学的または酵素的にカップリングすることによる。これらの方法は、ＷＯ ８７／０５３３０、およびAplin et al., Crit Rev Biochem 22:259 306 (1981)に記載されている。基質上に存在するいずれかの炭水化物部分の除去は、Sojar et al., Arch Biochem Biophys 259:52-57 (1987); Edge et al., Anal Biochem 118:131-137 (1981); および by Thotakura et al., Meth Enzymol 138:350-359 (1987)によって記載されているように、化学的または酵素的に達成されうる。
【００７８】
また、例えば、ペプチド、小型分子および核酸を包含するタンパク質性および非タンパク質性阻害剤を本発明の方法に使用してもよい。
【００７９】
ａ）ペプチドおよび小型分子
本発明の方法に有用な阻害剤は、小型有機ペプチドおよび分子ならびに小型無機分子を包含する。これらのペプチドおよび小型分子は、合成および精製天然阻害剤を包含する。目的のタンパク質を特異的に標的とするペプチドおよび小型分子を同定する方法は、当該分野でよく知られている。例えば、標的タンパク質の酵素的および／または生物学的機能のアッセイを用いて、ペプチドおよび／または小型分子ライブラリーを標的タンパク質、例えば、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ＧａｌＮＴ−１および／またはＳｏｘ９の阻害についてスクリーンしてもよい。別の具体例において、小型分子および／またはペプチドライブラリーを標的タンパク質、例えば、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ＧａｌＮＴ−１および／またはＳｏｘ９の競合的放射性リガンド結合アッセイにおいて、それらの基質またはリガンドを用いてスクリーンしてもよい。
【００８０】
別法では、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づくアッセイ、例えば、時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイを、阻害剤を同定するために用いてもよい。例示的具体例において、プロテオグリカンのコアタンパク質をＨｉｓまたはＧＳＴタグで標識し、ユーロピウム、フルオロフォアに結合した抗−ＨｉｓまたはＧＳＴ抗体を用いてタンパク質を標識する。別法では、コアタンパク質は、リジンまたはシステイン残基上で、非特異的にユーロピウムで標識される。ドナー糖分子は、Ｃｙ５、蛍光染料で標識する。該アッセイにおいて有用なドナーおよびアクセプター分子のリストは、Uyama et al., J Biol Chem 278(5):3072-78 (2003)の表Ｉに見出すことができる。
【００８１】
アクセプターおよびドナー分子は、標的酵素と共に、および標的酵素を伴わずに、種々の比率で合わせられる。ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイは、３４０ｎｍで系を励起し、各々、６１５および６６５ｎｍでユーロピウムおよびＣｙ５の発光を測定し、次いで、ユーロピウム発光に対するＣｙ５発光の比を計算することによって行われる。
【００８２】
酵素が存在しない場合、ドナーおよびアクセプター分子は、互いに近接にならず、Ｃｙ５およびユーロピウム分子の個々の蛍光の消光もなく、その結果、ベースラインレベル比がもたらされる。標的酵素をアッセイ系に加えた場合、ドナー糖分子がアクセプタータンパク質に移動し、系の蛍光が消光する。Ｃｙ５のユーロピウム蛍光に対する比は、移動した糖分子の量に伴って、最大まで増加する。
【００８３】
標的酵素の阻害剤を同定するために、ペプチドまたは小型分子を該アッセイ系に加える。試験化合物が糖のタンパク質への移動を阻害できる場合、蛍光の消光が減少する。試験化合物が酵素の移動活性の１００％を阻害することができるならば、ユーロピウム発光に対するＣｙ５発光の比は、ベースラインレベルにある。該アッセイにおいて酵素活性の少なくとも５０％を阻害する化合物は、次いで、ＧＡＧ合成を減少する能力について評価するための、細胞ベースの系において評価される（下記）。
【００８４】
本発明は、また、例えば、上記に詳述したアッセイを用いて腱の形態に対するかかる分子の影響をさらに同定するために、付加的なスクリーニングアッセイ、例えば、二次および三次アッセイの使用を提供する。
【００８５】
ｂ）ドミナント・ネガティブ変異体
本発明のある特定の具体例において、変異ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ＧａｌＮＴ−１、Ｈｓ３ｓｔ１またはＳｏｘ９タンパク質を本発明の方法において阻害剤として用いてもよい。例えば、イン・ビボおよびイン・ビトロの両方で上記の分子の活性に対しドミナント・ネガティブ効果を有する天然の変種または人工改変ホモログは、本発明の方法において使用されうる。
【００８６】
ｃ）核酸
上記で挙げた標的分子の活性を遮断することのできる核酸は、本発明において有用である。かかる阻害剤は、例えば、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ＧａｌＮＴ−１、Ｈｓ３ｓｔ１またはＳｏｘ９と相互作用するタンパク質をコードしうる。別法では、かかる阻害剤は、標的分子（例えば、ＧａｌＮＡｃ）の基質またはリガンドと干渉することのできるタンパク質をコードしていてもよく、コード化されたタンパク質が標的分子のその基質またはリガンドへの結合を遮断する場合、または標的分子の結合後に基質またはリガンドの活性を遮断する場合、本発明の方法において有用でありうる。もちろん、阻害剤は、標的分子およびその基質またはリガンドと同時に相互作用するタンパク質をコードしていてもよい。かかる核酸は、例えば、本発明の方法において有用なＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、Ｈｓ３ｓｔ１、ＧａｌＮＴ−１またはＳｏｘ９阻害剤を発現するために使用することができる。
【００８７】
本発明の方法は、また、上記した分子またはそのタンパク質結合パートナーのいずれかの発現を減少させるために、限定するものではないが、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）および短鎖二本鎖ＲＮＡ（ｓｄｓＲＮＡ）を包含する干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）の使用を包含する。ＲＮＡｉは、核酸分子、例えば、合成短鎖干渉ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡ干渉剤を導入して、標的遺伝子の発現を阻害またはサイレントにすることによって開始することができる。例えば、米国特許公報第２００３／０１５３５１９号および第２００３／０１６７４９０１号および米国特許第６，５０６，５５９号および第６，５７３，０９９号を参照のこと。
【００８８】
ｓｉＲＮＡは、化学的に合成してもよく、イン・ビトロ転写によって製造してもよく、または宿主細胞内で生産してもよい。典型的には、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１５〜５０ヌクレオチド長、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡは、約１９、２０、２１または２２ヌクレオチド長を包含する約１５〜約４０ヌクレオチド長、例えば、約１５〜約２８ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であってもよく、各鎖において約０、１、２、３、４、５、または６ヌクレオチド長の３’および／または５’オーバーハンドを含有していてもよい。ｓｉＲＮＡは、転写的サイレンシングによって標的遺伝子を阻害しうる。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡの分解または特異的転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）によって、ＲＮＡ干渉を促進することができる。
【００８９】
本発明の方法において用いられるｓｉＲＮＡはまた、小型ヘアピンＲＮＡｓ（ｓｈＲＮＡｓ）を包含する。ｓｈＲＮＡは、約５〜約９ヌクレオチドのヌクレオチドループが次に続く短い（例えば、約１９〜２５ヌクレオチド）アンチセンス鎖、およびその類似のセンス鎖からなる。別法では、センス鎖は、ヌクレオチドループ構造の前にあってもよく、アンチセンス鎖が後ろに続いてもよい。これらのｓｈＲＮＡは、プラスミドおよびウイルス性ベクター中に含有されていてもよい。
【００９０】
ｓｉＲＮＡ分子の標的領域は、所定の標的配列から選択されうる。例えば、ヌクレオチド配列は、開始コドンの約２５〜１００ヌクレオチド下流から開始することができる。ヌクレオチド配列は、５’または３’非翻訳領域、ならびに開始コドンに近い領域を含有することができる。ｓｉＲＮＡ分子の設計および調製方法は、当該分野でよく知られており、ＲＮＡｉ試薬としての配列を選択するための種々の規則を包含する。例えば、Boese et al., Methods Enzymol 392:73-96 (2005)を参照のこと。
【００９１】
ｓｉＲＮＡは、Hannon et al., Nature 418:244 251 (2002); McManus et al., Nat Reviews 3:737 747 (2002); Heasman et al., Dev Biol 243:209 214 (2002); Stein et al., J Clin Invest, 108:641 644 (2001); および Zamore et al., Nat Struct Biol 8(9):746 750 (2001)に記載されるような標準的な技術を用いて製造すればよい。好ましいｓｉＲＮＡは、５’リン酸化されている。
【００９２】
ｓｉＲＮＡ阻害剤は、例えば、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ＧａｌＮＴ−１、Ｈｓ３ｓｔ１、Ｓｏｘ９、Ａｇｃ１、Ｃｓｐｇ１またはＣｏｌ２ａ１、または上記の他の分子、ならびにその基質またはリガンドを標的とするために使用することができる。
【００９３】
核酸は、その天然環境から、実質的に純粋または均一な形態で取得、単離および／または精製されうる。種々の異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のための系は、よく知られている。適当な宿主細胞は、細菌、哺乳動物細胞、酵母、およびバキュロウイルス系を包含する。異種ポリペプチドの発現のために当該分野で入手可能な哺乳動物細胞系統は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウスメラノーマ細胞等を包含する。核酸からタンパク質を製造するのに適当な他の細胞については、Gene Expression Systems, Eds. Fernandez et al., Academic Press (1999)を参照のこと。ＲＮＡｉ分子は、化学的に合成してもよく、またはｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ配列をコード化したＤＮＡ配列から発現させてもよい。
【００９４】
上記した分子のドミナント・ネガティブ変異体の製造のために、適当な調節配列を含有し、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、選択またはマーカー遺伝子および適宜、他の配列を含む適当なベクターを選択または構築することができる。ベクターは、適宜、プラスミドまたはウイルス性、例えば、ファージ、またはファージミドであってもよい。さらなる詳細については、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)を参照のこと。例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞中への導入および遺伝子発現、およびタンパク質の分析において、核酸を扱うための多くの既知の技術およびプロトコールは、Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel et al., 2nd ed., John Wiley & Sons (1992)において詳細に記載されている。
【００９５】
核酸は、付加的なポリペプチド配列をコードしている他の配列、例えば、マーカーまたはレポーターとして機能する配列に融合することができる。マーカーまたはレポーター遺伝子の例は、ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性の原因）、ジヒドロホレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃＺ（ガラクトシダーゼをコード化している）、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）、ルシフェラーゼを包含する。その他、多くが当該分野で知られている。
【００９６】
２．酵素的活性の阻害
本発明の特定の具体例において、テンディノパシーを治療する方法は、プロテオグリカンの生合成に関与する酵素、例えば、アグリカンおよび／またはバーシカンへのコンドロイチン硫酸ＧＡＧｓの付加に関与する酵素の活性を減少、阻害またはダウンレギュレートすることを含む。これらの酵素は、例えば、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ＵＤＰ−Ｄ−キシロース：コアタンパク質β−Ｄ−キシロシルトランスフェラーゼ、Ｇａｌトランスフェラーゼ、ＧｌｃＡトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、コンドロイチン硫酸シンターゼ、Ｈｓ３ｓｔ１およびＧａｌＮＴ−１を包含する。
【００９７】
例示的具体例において、本発明は、損傷を受けた腱におけるＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ＧａｌＮＴ−１、および／またはＨｓ３ｓｔ１酵素の活性を減少、阻害またはダウンレギュレートする方法を包含する。他の具体例において、本発明は、損傷を受けた腱におけるＸｙｌトランスフェラーゼ、Ｇａｌトランスフェラーゼ、ＧｌｃＡトランスフェラーゼ、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、またはコンドロイチン硫酸シンターゼ活性を減少、阻害またはダウンレギュレートする方法を包含する。上記のペプチドまたは小型分子阻害剤は、これらの方法を実施するために使用してもよい。
【００９８】
ａ）酵素活性の阻害剤の同定
本発明は、さらに、損傷を受けた腱組織において、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ＧａｌＮＴ−１、Ｈｓ３ｓｔ１、Ｘｙｌトランスフェラーゼ、Ｇａｌトランスフェラーゼ、ＧｌｃＡトランスフェラーゼ、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、および／またはコンドロイチン硫酸シンターゼの阻害剤として作用することのできる薬剤の効力を同定および評価する方法を含む。
【００９９】
かかる阻害剤は、腱における軟骨または繊維軟骨形成に関与する酵素の活性を遮断または減少させる。これらの阻害剤は、修飾された可溶性基質、タンパク質、小型分子および核酸を包含する。
【０１００】
テンディノパシーを治療するための薬剤を同定する方法は、上記の酵素に対する個々の薬剤の効果、上記の酵素の酵素活性、タンパク質−標的相互作用、またはタンパク質−タンパク質相互作用をアッセイすることを含む。種々のイン・ビボまたはイン・ビトロアッセイをテンディノパシーの治療における阻害剤の効力を決定するために用いてもよい。一の例示的具体例において、小型分子は、上記の酵素への影響力、例えば、上記の酵素の酵素活性、標的結合、またはタンパク質−タンパク質相互作用への影響力をハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）のような方法によってアッセイすることによって、その治療的有用性の可能性をイン・ビトロで評価される。
【０１０１】
典型的なＨＴＳアッセイにおいて、候補化合物の、例えば、酵素活性、リガンド−レセプター結合などに対する阻害効果は、既知濃度の候補物質の存在下におけるアッセイの終点を、候補物質の不在下および／または既知阻害化合物の存在下において実施した対照と比較することによって測定することができる。一般に、従来の染料、蛍光または放射性分子を用いて、候補化合物の影響をモニターする。かくして、例えば、リガンドとそのレセプターとの結合を阻害するか、または酵素活性を阻害し、それにより、酵素過程のターンオーバーを減少させる候補化合物を同定することができる。
【０１０２】
本発明の例示的具体例は、（１）ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ＧａｌＮＴ−１、およびＨｓ３ｓｔ１からなる群から選択される少なくとも１つの試料を提供し、（２）試験薬剤と該試料成分を合わせ、（３）該試験薬剤に応答した該試料成分の活性を測定し、次いで、（４）該試験薬剤が該試料成分の活性を阻害するかどうかを決定することを含む、テンディノパシーを治療するための薬剤を同定するイン・ビトロでの方法を提供する。
【０１０３】
一の例示的具体例において、テンディノパシーを治療するための薬剤を同定するイン・ビトロでの方法は、軟骨外植片、初代軟骨細胞ペレット培養、または軟骨細胞系統をＢＭＰ−２タンパク質またはＢＭＰ−２タンパク質を発現しているアデノウイルスで処理することを含む。ＢＭＰ−２は、ＥＣＭおよびＧＡＧ合成を刺激する。次いで、試験化合物を培養物に加え、ＧＡＧ合成に対する阻害剤の効果を、ＧＡＧ側鎖中への３５Ｓの組込みを測定することによって、および／またはＤＭＭＢアッセイによって評価する。試験化合物の効果は、適当なビヒクル対照と比較する。
【０１０４】
可能性のある酵素阻害剤のイン・ビボアッセイは、（１）試験阻害剤を哺乳動物（例えば、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット）に少なくとも２、４、６または８週間、繰り返し投与し、（２）該哺乳動物を１７ｍ／分にて１時間／日、５日間／週で下り坂ランニングプロトコールに付し（実施例１）、次いで、（３）該阻害剤の棘上筋腱に対する効果をＤＭＭＢまたはＡＢアッセイによって、または遺伝子発現プロファイリングによって決定することを含んでいてもよく、ここに、腱変性（例えば、細胞および形態学的異常）の減速は、該阻害剤に起因すると考えられ、該阻害剤が腱変性障害の治療に有効であることを示す。
【０１０５】
本発明の方法において有用な試験阻害剤は、腱変性障害の１以上の動物モデルおよび／またはヒトにおいて評価されうることが理解されよう。
【０１０６】
イン・ビボおよびイン・ビトロでの阻害剤の存在下で酵素活性を測定するための種々のアッセイが当該分野で知られている。より頻繁に使用されるアッセイのいくつかの例は、分光光度法、蛍光分光分析、円偏光二色性、自動分光光度および蛍光分光法、共役アッセイ、酸または塩基の自動滴定、放射能法、無標識光学的検出、および酵素阻害アッセイを包含する。例示的具体例において、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１および／またはＣＳＧａｌＮＡｃＴ−２の酵素活性は、Uyama et al., J Biol Chem 277(11):8841-46 (2002)に記載されているように測定される。別の例示的具体例において、ＧａｌＮＴ−１の酵素活性は、White et al., J Biol Chem 270 (41):24156-65 (1995)に記載されているように測定される。
【０１０７】
本発明の方法において有用な酵素阻害剤は、例えば、それらが阻害する酵素と相互作用しうる。別法では、阻害剤は、例えば、酵素基質（例えば、ＧａｌＮＡｃ）または他の結合パートナーと相互作用しうる。阻害剤は、酵素の基質への結合を遮断する場合、および／または酵素の結合後に基質の活性を遮断する場合、本発明において有効でありうる。もちろん、阻害剤は、酵素および第２因子、例えば、基質の両方と相互作用しうる。この点において、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ＧａｌＮＴ−１、および／またはＨｓ３ｓｔ１阻害剤は、例えば、修飾された可溶性基質、他のタンパク質（酵素に結合するもの、および／または酵素基質を包含する）、修飾された形態の酵素またはそのフラグメント、プロペプチド、ペプチド、およびこれらの阻害剤全ての模倣物を包含する。
【０１０８】
酵素阻害剤は、例えば、直接的酵素阻害剤であってもよく、酵素に結合して酵素活性を中和してもよく、酵素発現レベルを減少させてもよく、前駆体分子の活性な成熟形態への安定性または変換に影響を及ぼしてもよく、酵素の１以上の基質への結合を干渉してもよく、または酵素の細胞内機能を干渉してもよい。
【０１０９】
３．転写因子活性の阻害
本発明の方法において有用な転写因子の阻害剤は、結合することによって直接的に、またはタンパク質−タンパク質相互作用および／または結合性を干渉することによって間接的に、因子の活性を阻害または減少しうる。この点において、Ｓｏｘ９の阻害剤は、修飾された可溶性リガンドまたは標的分子、小型分子、および核酸を包含しうる。
【０１１０】
イン・ビボおよびイン・ビトロで阻害剤の存在下においてＳｏｘ９活性を測定するためのアッセイは、当該分野で知られている。より頻繁に使用されるＳｏｘ９阻害剤に関するアッセイのいくつかの例は、酵母２ハイブリッドシステム、ルシフェラーゼリポーター遺伝子、Ｓｏｘ９阻害剤の存在下で軟骨細胞特異的遺伝子（例えば、Ｃｏｌ２ａ１、Ａｇｃ１）の発現レベルを決定するためのＰＣＲアッセイ、Ｓｏｘ９または軟骨細胞特異的遺伝子のウェスタンブロット分析、一時的トランスフェクション、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）アッセイ、およびノーザンブロット分析を包含する。
【０１１１】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づいた種々のタンパク質−タンパク質またはタンパク質−核酸相互作用アッセイを、Ｓｏｘ９とその結合パートナーとの相互作用に対する阻害剤の影響をアッセイするために利用してもよい。例えば、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭ（登録商標）増幅ルミネセンス近接均一アッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＲ）を用いることができ、またはバイオルミネセンス共鳴エネルギー移動（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＲのＢＲＥＴＴＭ）を用いて、Ｓｏｘ９結合相互作用に干渉する阻害剤についてイン・ビトロでアッセイを行ってもよい。
【０１１２】
一の具体例において、本発明は、（１）ドナー蛍光発生分子と融合した上記の標的分子を提供し、（２）該標的分子を試験薬剤と合わせ、（３）アクセプター蛍光性分子に融合した該標的分子の結合パートナーを加え、（４）該標的分子とその結合パートナーとの間の蛍光エネルギー移動レベルを測定し、次いで、（５）該試験薬剤が該標的分子とその結合パートナーとの相互作用を阻害したかどうかを決定することを含む、テンディノパシーを治療するための薬剤を同定するためのイン・ビトロアッセイの方法を提供する。
【０１１３】
阻害剤は、標的分子のその結合パートナーへの結合を干渉することができ、次いで、その２物質間のＦＲＥＴレベルに影響を及ぼすことができる。したがって、ＦＲＥＴ測定は、種々の効力の阻害剤を同定するために用いることができる。いったん標的分子の阻害剤がイン・ビトロで同定されたならば、さらにイン・ビボでの試験を行って、腱における軟骨および線維軟骨の形成の防止における阻害剤の効力および利用性を決定することができる。
【０１１４】
４．タンパク質発現の阻害
別の具体例において、テンディノパシーを治療するための方法は、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ＧａｌＮＴ−１、Ｈｓ３ｓｔ１、Ｃｏｌ２ａ１、Ｃｓｐｇ１、Ａｇｃ１、および／またはＳｏｘ９などの遺伝子およびそのコード化されたポリペプチドまたはタンパク質の発現および／または蓄積を減少、阻害またはダウンレギュレートすることを含む。これらの遺伝子の発現を阻害するのに有用な組成物は、例えば、上記セクションＩＩ（Ｂ）（１）（ｃ）に記載した干渉ＲＮＡ分子を包含する。
【０１１５】
これらの阻害剤は、いずれの方法で投与してもよいが、特定の具体例において、ＲＮＡ阻害剤を発現しているＤＮＡをアデノウイルスベクター中に組み込み、次いで、それを腱修復を必要とする患者に注射する。例示的具体例において、Wahdwa et al., Curr Opin Mol Ther 6(4):367-72 (2004)に記載されているように、ＲＮＡｉをコードしているヌクレオチド配列をｐｏｌＩＩプロモーターの下流に配置する。ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡのアデノウイルスベクター中への挿入方法は、当該分野でよく知られており、例えば、Krom et al., BMC Biotech 6(11):［印刷前に電子出版された］に記載されている。別法では、Schiffelers et al., Arthritis & Rheumatism 52(4):1314-18 (2005)に記載されるように、ＲＮＡｉ阻害剤は、傷ついた腱組織中に直接注射され、エレクトロポレーションによって細胞中に輸送される。
【０１１６】
５．テンディノパシー病
本発明の方法は、ヒト、霊長類、サル、齧歯類、ヒツジ、ウサギ、イヌ、モルモット、ウマ、ウシ、およびネコを包含する治療を必要とするいずれかの哺乳動物においてテンディノパシーを治療または予防するために用いられうる。治療または予防され得る障害は、例えば、テンディニティス、テンドニティス、テンディノシス、パラテンディニティス、腱滑膜炎、腱酷使傷害、腱外傷、腱周囲炎、パラテノニティス、および「テンディノパシー」病のファミリーにおけるいずれか他の状態を包含する。
【０１１７】
テンディノパシーは、酷使および反復運動、突発的な傷害（軽度〜重度）、徐々の変性、または加齢によって引き起こされうる。ほとんどの腱傷害は、腱を弱くし、それにより、しばしば疼痛、凝り、および力の喪失を引き起こす回復が遅い一連の微小断裂からなる。テンディノパシーは、通常、数週間の治療、活動の減少または修正、および休息を必要とする。傷ついた腱をあまりにも早くに再び使用すると、より多くの腱損傷を引き起こし、それにより、損傷を受けた腱が断裂または破壊を受けやすくなる。したがって、本発明によって治療または予防される障害は、酷使、スポーツまたは事故に関連した傷害および外傷、栄養不足、および高齢に関連した急性および慢性の両方の腱変性障害を包含する。
【０１１８】
テンディノパシーの一の例は、外側上顆炎であり、「テニス肘」としても知られており、よく知られたスポーツ医学および整形外科障害である。該障害の基礎となる病理は、肘の短橈側手根伸筋の酷使および微小断裂化に関連する。体はこれらの微小断裂を修復しようとするが、多くの場合、治癒過程が不完全である。慢性外側上顆炎のための手術を受けた患者の病理組織標本は、損傷を受けた腱における無秩序な血管繊維芽細胞形成異常を示す。修復におけるこの不完全な試みは、変性し、未成熟で、かつ脈管化した組織をもたらす。不完全に修復された組織は、正常な腱組織よりも弱く、正常に機能するための力に欠けている。この弱くなった組織は、また、疼痛を引き起こし、生活の質に負の影響を与えることによって、患者を制限する。同様の不完全な修復は、他の型の腱関連傷害または損傷、例えば、膝蓋骨腱炎（ジャンパーのひざ）、アキレス腱炎（ランナーに一般的）、および腱板腱炎（野球の投手のような「オーバーヘッド」アスリートにおいて見られる）において存在しうる。
【０１１９】
テンディノパシーは、また、例えば、高齢、食事不足、スポーツ活動、外傷、傷害、またはペフロキサシン（pefloxacin）などの薬物によって引き起こされうる。例えば、プロスタグランジンＥ１（ＰＥＧ１）−、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）−またはペフロキサシン−誘導性テンディノパシーは、ヒトのテンディノパシーのよく確立された動物モデルである。一の具体例において、本発明は、個体における薬物誘導性テンディノパシー、例えば、ペフロキサシン誘導性テンディノパシーの治療または予防方法を提供する。他の例示的具体例において、本発明は、酷使、スポーツまたは事故に関連した傷害および外傷、栄養不足、および高齢によって誘導されるテンディノパシーを治療または予防する方法を提供する。
【０１２０】
本発明は、さらに、哺乳動物に、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ＧａｌＮＴ−１、Ｘｙｌトランスフェラーゼ、Ｇａｌトランスフェラーゼ、ＧｌｃＡトランスフェラーゼ、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、コンドロイチン硫酸シンターゼ、Ｃｏｌ２ａ１、アグリカン、バーシカン、Ｈｓ３ｓｔ１、および／またはＳｏｘ９などの分子の活性および／または発現の阻害剤を、テンディノパシーに罹患した組織におけるかかる分子の活性および／または発現を予防または減少させるのに有効な量で投与することによる、腱変性障害を治療または予防する、腱の悪化を遅らせる、腱の質を復旧する、腱の健康を維持する、腱組織の低酸素変性を治療または予防する、腱組織のヒアリン変性を治療または予防する、腱組織のムコイドまたはミクソイド（myxoid）変性を治療または予防する、腱組織のフィブリノイド変性を治療または予防する、腱組織のリポイド変性を治療または予防する、腱組織の石灰化を治療または予防する、腱組織の繊維軟骨および骨化生を治療または予防する、腱の微小構造無欠性を維持する、腱の繊維構造を維持する、腱の繊維配列を維持する、正常な腱血管質を維持する、腱組織における正常な細胞性を維持する、腱組織における正常なＥＣＭ含量を復旧する、腱組織におけるＧＡＧの病理学的蓄積を減少させる、および／または腱質量、引張強度および／または柔軟性を維持するための方法を提供する。
【０１２１】
６．治療および動物モデルの評価
本発明の方法は、腱組織におけるテンディノパシーまたは微小欠陥を治療するために使用されうる。治療後または治療の間の腱の質は、例えば、腱の微小構造無欠性、腱コラーゲン染色性、腱組織細胞性における変化、腱血管化、および／またはＧＡＧ含量を評価することによって決定することができる。治療後または治療の間の腱の健康を評価する方法は、当該分野で知られており、限定するものではないが、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、超音波検査、および機能および／または疼痛の評価を包含する。別法では、腱の健康は、腱組織におけるＧＡＧのレベルを評価することによって測定されうる。
【０１２２】
腱のＧＡＧ含量を決定するための一のアッセイは、腱における硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）濃度の測定のための１，９−ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）アッセイである。腱のＧＡＧ含量を決定するための別のアッセイは、腱組織におけるＧＡＧ量の増加を検出するために使用できる組織学的アルシアンブルー（Alcian blue（ＡＢ））染色である。
【０１２３】
ＩＩＩ．治療方法および医薬組成物
本発明の方法において有用な阻害剤は、局所、経口、静脈内、腹膜内、筋内、腔内、皮下、埋め込み、または経皮手段によって局所的または全身的に投与されうる。
【０１２４】
例示的具体例において、個体への阻害剤の投与は、また、阻害剤をコードしている核酸配列をイン・ビボで患者に投与する遺伝子療法の手段によって達成されうる。例示的具体例において、プロモーター配列および本発明の方法において有用な核酸阻害剤をコードしている配列を含む核酸をアデノウイルス発現ベクター中に挿入する。次いで、該アデノウイルスを患者の腱に直接注射し、ここで、核酸阻害剤が発現される。腱組織への核酸のアデノウイルス媒介性デリバリーの例は、例えば、Mehta et al., J Hand Surg 30A(1):136-41 (2005); Lou et al., J Orthoped Res 19:1199-1202 (2001)およびLou, Clin Orthopaed Rel Res 379S:S252-55 (2000)に記載されている。
【０１２５】
他の例示的具体例において、核酸阻害剤は、他のウイルス性発現ベクター、例えば、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、およびアデノ随伴ウイルス中に組み込まれる。適当なベクターは、初代腱細胞における各型のウイルスのイン・ビトロでの感染性を評価することによって選択されうる。
【０１２６】
別法では、Schiffelers et al., Arthritis & Rheumatism 52(4):1314-18 (2005)に記載されるように、核酸阻害剤を腱組織中に直接注射し、エレクトロポレーションによって細胞中に移動させる。
【０１２７】
他の例示的具体例において、本発明の方法において有用なペプチドまたは小型分子阻害剤は、Paoloni et al., J Bone Joint Surg 86A(5):916-22 (2004)に記載されているように、経皮パッチ上にコーティングされ、腱組織を覆う皮膚に直接塗布されてもよい。
【０１２８】
テンディノパシーの治療のための分子の投与方法は、当該分野で知られている。「投与」は、いずれかの特定のデリバリー系に限定されず、限定するものではないが、非経口（皮下、静脈内、髄内、関節内、筋内、腔内、または腹膜内注射を包含する）、直腸、局所、経皮、または経口（例えば、カプセル、懸濁液または錠剤において）を包含しうる。個体への投与は、単回投与または連続もしくは断続的反復投与において、種々の生理学上許容される塩形態のいずれかにおいて、および／または医薬組成物（上記）の一部としての許容される医薬担体および／または添加剤と共に、局所的または全身的に行ってもよい。生理学上許容される塩形態および標準的な医薬処方技術および賦形剤は、当業者によく知られている。例えば、Physicians' Desk Reference (PDR) 2003, 57th ed., Medical Economics Company, 2002; and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, eds. Gennado et al., 20th ed, Lippincott, Williams ＆ Wilkins, 2000)を参照のこと。
【０１２９】
本発明の方法において有用な阻害剤は、症状の重篤度および疾患の進行度にもよるが、約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与されうる。適当な有効投与量は、治療している臨床医によって、例えば、下記の範囲：約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、および約５００μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇから選択される。
【０１３０】
別の例示的具体例において、阻害剤は、例えば、テンディノパシーの治療のために、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、２０、または４０週の期間、または少なくとも１、１．５または２年間あるいは対象の寿命まで、繰り返し投与される。本発明の別の具体例において、阻害剤は、例えば、腱の正常な構造および組成の復旧を刺激するために、単回投与量において投与することができる。
【０１３１】
一般に、本発明の方法において有用な阻害剤は、１０〜８および１０〜７；１０〜７および１０〜６；１０〜６および１０〜５；または１０〜５および１０〜４ｇ／ｋｇの投与量で投与されうる。一の動物モデルにおいて達成される治療上有効投与量は、ヒトを包含する別の動物において使用するために、当該分野で知られた換算係数を用いて換算することができる。例えば、Freireich et al., Cancer Chemother Reports 50(4):219 244 (1966)を参照のこと。
【０１３２】
本発明の方法において使用されるべき阻害剤の正確な投与量は、所望の成果に基づいて経験的に決定される。例示的成果は、（１）腱変性障害が治療または予防されること、（２）腱悪化が遅くなること、（３）腱の質が復旧すること、（４）腱の健康が維持されること、（５）腱の低酸素変性が治療または予防されること、（６）腱のヒアリン変性が治療または予防されること、（７）腱のムコイドまたはミクソイド変性が治療または予防されること、（８）腱のフィブリノイド変性が治療または予防されること、（９）腱のリポイド変性が治療または予防されること、（１０）腱の石灰化が治療または予防されること、（１１）腱の繊維軟骨および骨化生が治療または予防されること、（１２）腱の繊維構造が維持されること、（１３）腱の繊維配列が維持されること、（１４）腱の正常な血管質が維持されること、（１５）腱の正常な細胞性が維持されること、（１６）腱に含有される正常なＥＣＭが復旧されること、および／または（１７）腱質量、引張強度および／または柔軟性が維持されることを包含する。例えば、阻害剤は、腱の悪化（例えば、腱質量、構造構成の喪失および／または微小断裂および疼痛になりやすいこと）を少なくとも２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００または５００％遅らせるのに有効な量で投与される。
【０１３３】
いくつかの具体例において、本発明の方法において用いられる組成物は、さらに、医薬上許容される賦形剤を含む。本明細書中で使用される場合、「医薬上許容される賦形剤」なる語は、医薬投与に適合するいずれか、および全ての溶媒、分散培地、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを示す。医薬上活性な物質に対するかかる培地および薬剤の使用は、当該分野でよく知られている。組成物は、また、補足的、付加的または強化した治療的機能を提供する他の活性な化合物を含有していてもよい。医薬組成物は、また、投与説明書と共に、容器、パックまたはディンスペンサー中に含まれていてもよい。
【０１３４】
本発明の方法と関連して投与されるべき医薬組成物は、その意図された投与経路と適合性になるように処方されるべきである。かかる処方の例は、ありのまま提供される、または生物分解性ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ＰＬＧＡ）と組み合わせて提供される結晶性タンパク質処方を包含する。
【０１３５】
本発明の方法において有用な阻害剤は、担体ゲルおよびマトリックスまたは誘導骨再生および／または骨置換のために使用される他の組成物と共に、医薬組成物として投与してもよい。かかるマトリックスの例は、合成ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシアパタイト、コラーゲンおよびフィブチンベースのマトリックス、ＴｉｓｓｅｅｌＲフィブリン接着剤などを包含する。
【０１３６】
ある特定の具体例において、阻害剤は、他の治療化合物、例えば、ＮＳＡＩＤｓ、コルチコステロイド、一酸化窒素、テストステロン、エストロゲン、成長因子（例えば、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３およびＭＰ５２）と共に、または同時に投与してもよい。
【０１３７】
本発明の方法において有用な阻害剤は、腱傷害の治療または予防を促進するように、腱インプラント、マトリックスおよびデポー系にコーティングしてもよく、またはこれらの中に組み込んでもよい。
【実施例】
【０１３８】
実施例１：ラット棘上筋腱は、酷使した軟骨マーカーを表示する。
ラット棘上筋腱の酷使に対する応答を、転写プロファイリングを用いて分子レベルで研究した。腱酷使のラットモデルは、以前に記載されている。Soslowsky et al., J Shoulder Elbow Surg 9:79-84 (2000)。該モデルでは、炎症および血管新生マーカーが変化することが分かっているが（Perry et al., J Shoulder Elbow Surg 14:79S-83S (2005)）、酷使傷害の周囲の事象を理解するために、より幅広いアプローチが行われた。
【０１３９】
２４匹の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（４００−４５０ｇ）を棘上筋腱（ＳＳＴ）酷使プロトコールに１週間（ｎ＝８）、２週間（ｎ＝８）、および４週間（ｎ＝８）付した。該プロトコールは、１７ｍ／分にて１時間／日、５日間／週の下り坂ランニング（１０％勾配）からなる。さらに６匹のラットをケージ活動対照として用いた（時間０）。各時点で、さらに２匹のランニングしていないラットを年齢をマッチさせた群対照として用いた。
【０１４０】
検死にて、各肩由来の棘上筋腱および各膝由来の膝蓋腱（ＰＴ）を摘出した。膝蓋腱は、該プロトコールを用いた酷使の著しい兆候を示さないので、運動の影響の内部対照となった。採取した腱の重量を量り、液体窒素中で即座に凍結させた。該組織を凍結切断し、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen）で抽出した。ＲＮｅａｓｙキット（QIAGEN）を用いて、抽出物の水層からＲＮＡを単離した。ＲＮＡ濃度は、分光光度計を用いて決定した。３０，０００を越える転写物の発現レベルをモニターするための転写プロファイリングを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘラットゲノム２３０ ２．０アレイを用いて行った。全てのアレイ画像を欠陥および質について視覚的に調べた。高いバックグラウンド、低いシグナル強度または重大な欠陥を有するアレイをさらなる分析から排除した。シグナル値は、Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ １．０（ＧＣＯＳ，Affymetrix）を用いて決定した。各アレイについて、統計値を平均シグナル強度値１００に標準化した。デフォルトＧＣＯＳ統計値を全ての分析に用いた。いずれかの組織における平均発現が１００シグナル単位を越え、ＧＣＯＳデフォルトセッティングによって決定されたプレゼント（Ｐ）コールを有する試料のパーセンテージが６６％以上である場合、遺伝子は、検出可能と考えられた。標準化されたシグナル値は、対数の底１０に変換された。ＡＮＯＶＡ試験由来のｐ値が＜０．０１であり、ランニングと対照との間の差異がいずれかの時点で少なくとも２倍である場合、遺伝子は差別的に発現されたと考えられた。
【０１４１】
４００個を越える遺伝子が酷使後の棘上筋腱において差別的に調節された。４週間のランニングによって、１０７個の遺伝子がアップレギュレートされ、２７個の遺伝子がダウンレギュレートされた。最高にアップレギュレートされた遺伝子のうち多くは、コラーゲンＩＩ型アルファ１、バーシカンおよびアグリカンを包含する軟骨組織において高く発現される。これらの結果は、酷使した腱が繊維軟骨表現型に変換されていることを示唆した。これらの同じ遺伝子は、走らされた動物の膝蓋腱においてアップレギュレートされなかった（図１〜７参照）。
【０１４２】
実施例２：ｓｉＲＮＡ阻害剤の調製
ｓｉＲＮＡは、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＧａｌＮＴ−１またはＨｓ３ｓｔ１のヌクレオチド配列を、特異的ｓｉＲＮＡを設計するための商業的ウェブサイト（例えば、ｓｉｒｎａｗｉｚａｒｄ．ｃｏｍまたはＡｍｂｉｏｎＲ ｓｉＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ）中に入力することによって選択される。配列選択ガイドラインがこれらのツールに埋め込まれている。
【０１４３】
ｓｉＲＮＡの効力は、それをＣ−２０／Ａ４および／またはＣ−２８／Ｉ２軟骨細胞中にトランスフェクトし、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１および／またはＧａｌＮＴ−１の発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってモニターすることによって測定される。同じヌクレオチド組成を有する適当なスクランブルｓｉＲＮＡは、実験対照として用いられる。
【０１４４】
実施例３：プロテオグリカン合成の阻害剤のためのイン・ビトロアッセイ系
ｓｉＲＮＡがＣ−２０／Ａ４および／またはＣ−２８／Ｉ２軟骨細胞におけるＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＧａｌＮＴ−１またはＨｓ３ｓｔ１の発現を減少させることができる場合、次いでそれを、プロテオグリカンＧＡＧ側鎖の産生を減少させる能力について試験する。Ｃ−２０／Ａ４および／またはＣ−２８／Ｉ２軟骨細胞は、細胞外マトリックスおよびＧＡＧ合成を刺激するためにＢＭＰ−２タンパク質またはＢＭＰ−２を発現しているアデノウイルスで処理される。ｓｉＲＮＡ、または別法では、小型分子、ＧＡＧ合成の阻害剤を培養物に加え、阻害剤の存在下または不在下におけるプロテオグリカン中への３５Ｓの組み込みを比較することによって、阻害剤の効果を評価する。別法では、Arai et al., Osteoarthritis and Cartilage 12:599-613 (2004)に記載されているように、阻害剤の存在下または不在下におけるＧＡＧレベルをＤＭＭＢアッセイによって比較することによって、阻害剤の効果を評価する。
【０１４５】
実施例４：ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＧａｌＮＴ−１またはＨｓ３ｓｔ１のｓｉＲＮＡ阻害によるテンディノパシーの治療のためのプロトコール
トレッドミル酷使プロトコール（実施例１）またはＰＧＥ１、ＰＧＥ２もしくはペフロキサシン（３００ｍｇ／ｍｌ）の週に５回、１週間の局所注射のいずれかを用いて、ラットにおいてテンディノパシーを誘導する。
【０１４６】
一旦、ｓｉＲＮＡがＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＧａｌＮＴ−１またはＨｓ３ｓｔ１のイン・ビトロ活性を減少させることが見出されたならば、例えば、Krom et al., BMC Biotech 6(11):［電子出版］に記載されるように、それをｓｈＲＮＡに変換し、ｓｈＲＮＡ配列をクローン化し、アデノウイルス中に挿入する。アデノウイルスは、ｓｈＲＮＡのイン・ビボ発現、および続く、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１および／またはＧａｌＮＴ−１の発現の阻害のために使用される。感染方法は、初代腱細胞において最適化される。
【０１４７】
ｓｈＲＮＡを発現している機能的アデノウイルスは、傷ついた腱中に直接注射されて（Mehta et al., J Hand Surg 30A(1):136-41 (2005)）、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１および／またはＧａｌＮＴ−１遺伝子の発現を局所的に減少させる。スクランブル配列は、実験対照として含まれる。腱における軟骨組織形成量は、ＧＡＧレベルを評価することによって求められる。組織学的アルシアンブルー染色を用いて、腱組織におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の増加した量を検出する。ＤＭＭＢ試薬を用いて、腱から抽出された硫酸化ＧＡＧの量を定量する。
【０１４８】
ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１および／またはＧａｌＮＴ−１の阻害のテンディノパシーに対する効果のイン・ビボ評価は、組織学によって、および腱強度の機械的または機能的試験によって決定される。非処理対照と比べてＧＡＧレベルが有意に減少する場合、および／または正常な損傷を受けていない腱と類似のレベルまで減少する場合、阻害剤は有効であると考えられる。別法では、機能的または機械的試験が非処理対照と比べて、改善された機能および／または減少した疼痛を明らかにする場合、阻害剤は有効であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】図１は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるＣｏｌ２ａ１（ＩＩ型コラーゲン）の遺伝子発現プロファイルを示す（図１Ａ）。Ｃｏｌ２ａ１遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図１Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、軟骨組織および酷使した腱組織の両方において、Ｃｏｌ２ａ１が高く発現されることを示す。
【図２】図２は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるＡｇｃ１（アグリカン）の遺伝子発現プロファイルを示す（図２Ａ）。Ａｇｃ１遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図２Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、軟骨組織および酷使した腱組織の両方において、Ａｇｃ１が高く発現されることを示す。
【図３】図３は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるＳｏｘ９（ｓｒｙ型高移動度群ｂｏｘ９）の遺伝子発現プロファイルを示す（図３Ａ）。Ｓｏｘ９遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図３Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、軟骨組織および酷使した腱組織の両方において、Ｓｏｘ９が高く発現されることを示す。
【図４】図４は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるＣｓｐｇ２（バーシカン）の遺伝子発現プロファイルを示す（図４Ａ）。バーシカン遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図４Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、軟骨組織および酷使した腱組織の両方において、バーシカンが高く発現されることを示す。
【図５】図５は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるコンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１）の遺伝子発現プロファイルを示す（図５Ａ）。ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図５Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、軟骨組織および酷使した腱組織の両方において、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１が高く発現されることを示す。
【図６】図６は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるＧａｌＮＴ−１（ＧａｌＮＴ１−ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−アルファ−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチド−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ１）の遺伝子発現プロファイルを示す（図６Ａ）。ＧａｌＮＴ−１遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図６Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、酷使した腱組織において、ＧａｌＮＴ−１が高く発現されることを示す。
【図７】図７は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＲＡＥ２３０ ２．０遺伝子チップを用いて４週間にわたる酷使した腱におけるＨｓ３ｓｔ１（ヘパラン硫酸（グルコサミン）３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ１）の遺伝子発現プロファイルを示す（図７Ａ）。Ｈｓ３ｓｔ１遺伝子の発現レベルは、また、示される正常な筋骨格組織においても測定された（図７Ｂ）。発現プロファイルは、正常な腱組織と比べた場合、酷使した腱組織において、および正常な腱組織と比べた場合、軟骨組織において、Ｈｓ３ｓｔ１が高く発現されることを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の腱組織において軟骨特異的プロテオグリカンの形成を減少させることを特徴とする、患者においてテンディノパシーを治療する方法。
【請求項２】
患者がヒトである請求項１記載の方法。
【請求項３】
患者が霊長類、サル、齧歯類、ヒツジ、ウサギ、イヌ、モルモット、ウマ、ウシおよびネコからなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項４】
患者の腱組織においてアグリカン、バーシカン、およびシンデカン−３からなる群から選択されるプロテオグリカンの合成に関与する酵素の活性を減少させることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
患者の腱組織において、コンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ１（ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１）および／またはガラクトサミンポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ１（ＧａｌＮＴ−１）の活性を減少させることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、Ｈｓ３ｓｔ１、および／またはＧａｌＮＴ−１の酵素活性を阻害することによって活性を減少させる請求項１記載の方法。
【請求項７】
ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、Ｈｓ３ｓｔ１、および／またはＧａｌＮＴ−１遺伝子の発現を阻害することによって活性を減少させる請求項１記載の方法。
【請求項８】
軟骨産生に関与する転写因子の活性を減少させることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
Ｓｏｘ９の活性を減少させることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
Ｓｏｘ９の軟骨特異的遺伝子の発現を増加させる能力を阻害することによって活性を減少させる請求項９記載の方法。
【請求項１１】
Ｓｏｘ９遺伝子の発現を阻害することによって活性を減少させる請求項８記載の方法。
【請求項１２】
軟骨特異的タンパク質の発現を減少させることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１３】
アグリカン、バーシカン、およびシンデカン−３からなる群から選択されるプロテオグリカンの発現を減少させることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
Ｃｏｌ２ａ１の発現を減少させることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
テンディノパシーがテンディニティスである請求項１記載の方法。
【請求項１６】
テンディノパシーがテンディノシスである請求項１記載の方法。
【請求項１７】
テンディノパシーが腱傷害である請求項１記載の方法。
【請求項１８】
患者において腱組織に対し、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ＧａｌＮＴ−１、Ｈｓ３ｓｔ１、および／またはＳｏｘ９の阻害剤を投与することを特徴とする、患者においてテンディノパシーを治療する方法。
【請求項１９】
阻害剤がＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１および／またはＧａｌＮＴ−１の酵素活性を減少させる請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
阻害剤がＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１および／またはＧａｌＮＴ−１の発現を減少させる請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
阻害剤を局所的に投与する請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
阻害剤が干渉ＲＮＡ分子を含む請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
阻害剤が小型分子を含む請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
患者の腱組織において軟骨特異的タンパク質の発現を減少させることを特徴とする、患者においてテンディノパシーを治療する方法。
【請求項２５】
アグリカン、バーシカン、および／またはＩＩ型コラーゲンの発現を阻害することを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
Ｓｏｘ９の発現を阻害することを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
Ｓｏｘ９の活性を阻害することを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
試験薬剤を治療の必要な対象に投与し、次いで、該薬剤の腱組織におけるグリコグリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）の生合成に関与する酵素の活性を阻害する能力を測定することを特徴とする、テンディノパシーの治療剤を同定する方法。
【請求項２９】
試験化合物を治療の必要な対象に投与し、次いで、該化合物の腱組織におけるグリコグリコサミノグリカンの合成に関与する酵素の活性を阻害する能力を測定することを特徴とする、テンディノパシーの治療に有用な化合物を同定する方法。
【請求項３０】
さらに、
（ａ）ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ヘパリン硫酸塩（グルコサミン）３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ１、ＧａｌＮＴ−１およびＳｏｘ９からなる群から選択される少なくとも１つの試料成分を提供し、
（ｂ）該試料を試験化合物と合わせ、
（ｃ）該試験化合物に応答した該試料成分の活性を測定し、
（ｄ）該試験化合物が該試料成分の活性を阻害するかどうかを決定する
工程を含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
テンディノパシーを治療するための医薬の製造における軟骨特異的プロテオグリカンの形成を減少させる化合物の使用。
【請求項３２】
化合物が軟骨の合成に関与する酵素または他のタンパク質の活性を減少させる請求項３１記載の使用。
【請求項３３】
化合物が酵素またはタンパク質の機能を直接的または間接的に阻害する請求項３２記載の使用。
【請求項３４】
化合物が酵素またはタンパク質の発現を阻害する請求項３２または３３記載の使用。
【請求項３５】
酵素がＵＤＰ−Ｄ−キシロース：コアタンパク質β−Ｄ−キシロシルトランスフェラーゼ、Ｇａｌトランスフェラーゼ、ＧｌｃＡトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、コンドロイチン硫酸シンターゼ、およびヘパリン硫酸スルホトランスフェラーゼからなる群から選択される請求項３２〜３４のいずれか１項記載の使用。
【請求項３６】
酵素がコンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ１（ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１）、コンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２）、ガラクトサミンポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ１（ＧａｌＮＡｃＴ−１）、およびヘパリン硫酸（グルコサミン）３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ１（Ｈｓ３ｓｔ１）からなる群から選択される請求項３５記載の使用。
【請求項３７】
化合物が軟骨特異的構造タンパク質の発現を減少させる請求項３１記載の使用。
【請求項３８】
化合物が軟骨特異的構造タンパク質の発現に関与する転写因子の活性を減少させる請求項３１記載の使用。
【請求項３９】
転写因子がＳｏｘ９である請求項３８記載の使用。
【請求項４０】
プロテオグリカンがアグリカン、バーシカン、シンデカン−３およびＩＩ型コラーゲンからなる群から選択される請求項３１〜３９のいずれか１項記載の使用。
【請求項４１】
テンディノパシーがテンドニティス、テンディニティス、テンディノシス、パラテンディニティス、腱滑膜炎、腱損傷、腱外傷、腱周囲炎およびパラテノニティスからなる群から選択される請求項３１〜４０のいずれか１項記載の使用。
【請求項４２】
霊長類、サル、齧歯類、ヒツジ、ウサギ、イヌ、モルモット、ウマ、ウシおよびネコからなる群から選択される患者に対し、医薬を投与する請求項３１〜４１のいずれか１項記載の使用。
【請求項１】
患者の腱組織において軟骨特異的プロテオグリカンの形成を減少させることを特徴とする、患者においてテンディノパシーを治療する方法。
【請求項２】
患者がヒトである請求項１記載の方法。
【請求項３】
患者が霊長類、サル、齧歯類、ヒツジ、ウサギ、イヌ、モルモット、ウマ、ウシおよびネコからなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項４】
患者の腱組織においてアグリカン、バーシカン、およびシンデカン−３からなる群から選択されるプロテオグリカンの合成に関与する酵素の活性を減少させることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
患者の腱組織において、コンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ１（ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１）および／またはガラクトサミンポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ１（ＧａｌＮＴ−１）の活性を減少させることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、Ｈｓ３ｓｔ１、および／またはＧａｌＮＴ−１の酵素活性を阻害することによって活性を減少させる請求項１記載の方法。
【請求項７】
ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、Ｈｓ３ｓｔ１、および／またはＧａｌＮＴ−１遺伝子の発現を阻害することによって活性を減少させる請求項１記載の方法。
【請求項８】
軟骨産生に関与する転写因子の活性を減少させることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
Ｓｏｘ９の活性を減少させることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
Ｓｏｘ９の軟骨特異的遺伝子の発現を増加させる能力を阻害することによって活性を減少させる請求項９記載の方法。
【請求項１１】
Ｓｏｘ９遺伝子の発現を阻害することによって活性を減少させる請求項８記載の方法。
【請求項１２】
軟骨特異的タンパク質の発現を減少させることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１３】
アグリカン、バーシカン、およびシンデカン−３からなる群から選択されるプロテオグリカンの発現を減少させることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
Ｃｏｌ２ａ１の発現を減少させることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
テンディノパシーがテンディニティスである請求項１記載の方法。
【請求項１６】
テンディノパシーがテンディノシスである請求項１記載の方法。
【請求項１７】
テンディノパシーが腱傷害である請求項１記載の方法。
【請求項１８】
患者において腱組織に対し、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ＧａｌＮＴ−１、Ｈｓ３ｓｔ１、および／またはＳｏｘ９の阻害剤を投与することを特徴とする、患者においてテンディノパシーを治療する方法。
【請求項１９】
阻害剤がＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１および／またはＧａｌＮＴ−１の酵素活性を減少させる請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
阻害剤がＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１および／またはＧａｌＮＴ−１の発現を減少させる請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
阻害剤を局所的に投与する請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
阻害剤が干渉ＲＮＡ分子を含む請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
阻害剤が小型分子を含む請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
患者の腱組織において軟骨特異的タンパク質の発現を減少させることを特徴とする、患者においてテンディノパシーを治療する方法。
【請求項２５】
アグリカン、バーシカン、および／またはＩＩ型コラーゲンの発現を阻害することを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
Ｓｏｘ９の発現を阻害することを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
Ｓｏｘ９の活性を阻害することを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
試験薬剤を治療の必要な対象に投与し、次いで、該薬剤の腱組織におけるグリコグリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）の生合成に関与する酵素の活性を阻害する能力を測定することを特徴とする、テンディノパシーの治療剤を同定する方法。
【請求項２９】
試験化合物を治療の必要な対象に投与し、次いで、該化合物の腱組織におけるグリコグリコサミノグリカンの合成に関与する酵素の活性を阻害する能力を測定することを特徴とする、テンディノパシーの治療に有用な化合物を同定する方法。
【請求項３０】
さらに、
（ａ）ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１、ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２、ヘパリン硫酸塩（グルコサミン）３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ１、ＧａｌＮＴ−１およびＳｏｘ９からなる群から選択される少なくとも１つの試料成分を提供し、
（ｂ）該試料を試験化合物と合わせ、
（ｃ）該試験化合物に応答した該試料成分の活性を測定し、
（ｄ）該試験化合物が該試料成分の活性を阻害するかどうかを決定する
工程を含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
テンディノパシーを治療するための医薬の製造における軟骨特異的プロテオグリカンの形成を減少させる化合物の使用。
【請求項３２】
化合物が軟骨の合成に関与する酵素または他のタンパク質の活性を減少させる請求項３１記載の使用。
【請求項３３】
化合物が酵素またはタンパク質の機能を直接的または間接的に阻害する請求項３２記載の使用。
【請求項３４】
化合物が酵素またはタンパク質の発現を阻害する請求項３２または３３記載の使用。
【請求項３５】
酵素がＵＤＰ−Ｄ−キシロース：コアタンパク質β−Ｄ−キシロシルトランスフェラーゼ、Ｇａｌトランスフェラーゼ、ＧｌｃＡトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、コンドロイチン硫酸シンターゼ、およびヘパリン硫酸スルホトランスフェラーゼからなる群から選択される請求項３２〜３４のいずれか１項記載の使用。
【請求項３６】
酵素がコンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ１（ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−１）、コンドロイチン硫酸Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（ＣＳ−ＧａｌＮＡｃＴ−２）、ガラクトサミンポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ１（ＧａｌＮＡｃＴ−１）、およびヘパリン硫酸（グルコサミン）３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ１（Ｈｓ３ｓｔ１）からなる群から選択される請求項３５記載の使用。
【請求項３７】
化合物が軟骨特異的構造タンパク質の発現を減少させる請求項３１記載の使用。
【請求項３８】
化合物が軟骨特異的構造タンパク質の発現に関与する転写因子の活性を減少させる請求項３１記載の使用。
【請求項３９】
転写因子がＳｏｘ９である請求項３８記載の使用。
【請求項４０】
プロテオグリカンがアグリカン、バーシカン、シンデカン−３およびＩＩ型コラーゲンからなる群から選択される請求項３１〜３９のいずれか１項記載の使用。
【請求項４１】
テンディノパシーがテンドニティス、テンディニティス、テンディノシス、パラテンディニティス、腱滑膜炎、腱損傷、腱外傷、腱周囲炎およびパラテノニティスからなる群から選択される請求項３１〜４０のいずれか１項記載の使用。
【請求項４２】
霊長類、サル、齧歯類、ヒツジ、ウサギ、イヌ、モルモット、ウマ、ウシおよびネコからなる群から選択される患者に対し、医薬を投与する請求項３１〜４１のいずれか１項記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００９−５３３３２１（Ｐ２００９−５３３３２１Ａ）
【公表日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５８４７６（Ｐ２００８−５５８４７６）
【出願日】平成１９年３月２日（２００７．３．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６３１７７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０３７８７
【国際公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス (573)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２日（２００７．３．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６３１７７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０３７８７
【国際公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス (573)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ
【Ｆターム（参考）】
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