軟骨形成前駆細胞の分化を改良する方法
本発明者らは、軟骨、骨または靭帯修復を促進するかまたは軟骨性組織の修復または再生を誘導する方法を開示し、該方法は、軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞においてＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性を増強させるステップを含む。本発明者らはまた、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性を増大させるように改変された軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＺＮＦ１４５、またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性を増大させるよう改変された、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）などの軟骨形成前駆細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞であって、
改変されていない軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞と比較して、
（ａ）２型コラーゲン（ＣＯＬ２Ａ１）、アグリカン、ｃｏｌ１０Ａ１またはＳｏｘ９などの軟骨形成マーカーの発現の増強、
（ｂ）例えばアルシアンブルー染色により検出される、軟骨プロテオグリカンの分泌の増強、または
（ｃ）例えばＷａｋｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ（１９９４）により記載されるような組織学的類別により検出される、例えば細胞形態の任意の１以上の組織学的類別、マトリックス染色、表面規則性、軟骨の厚さおよびホスト隣接軟骨へのドナーの組込みにより検出される、軟骨、骨または靭帯欠損を修復する能力の増強、
あるいはそれらの任意の組合せを提示する、細胞。
【請求項３】
前記軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞、またはその祖先が、前記ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性を増加させる発現構築物、例えばレンチウイルス発現構築物などでトランスフェクトされている、請求項１または２に記載の軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞。
【請求項４】
例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００７に記載されるようなペレット培養系により、すなわち軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞をペレット化し、１０ｎｇ／ｍｌトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β３、１０−７Ｍデキサメタゾン、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸−２−リン酸、４０μｇ／ｍｌプロリン、１００μｇ／ｍｌピルビン酸、および５０ｍｇ／ｍｌＩＴＳ＋プレミックス（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；６．２５μｇ／ｍｌインスリン、６．２５μｇ／ｍｌトランスフェリン、６．２５μｇ／ｍｌ亜セレン酸、１．２５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、および５．３５ｍｇ／ｍｌリノール酸）を含有する軟骨形成培地で培養することにより軟骨細胞分化が誘導されている、請求項１、２または３に記載の軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞。
【請求項５】
Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、テロメラーゼ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７およびＢｍｉ−１のいずれか１以上の発現または活性を増大させるように改変された、請求項１〜４のいずれか一項に記載の軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞を含むかまたはそれに由来する細胞株、例えば不死または不死化細胞株。
【請求項７】
疾患の治療、例えば軟骨性組織、軟骨、骨または靭帯欠損に関連する疾患、損傷、障害または傷害、外傷性疾患、加齢性変性疾患または変性関節疾患の修復または再生の方法で使用するための、軟骨形成活性を含むポリペプチドをコードする能力のあるＺＮＦ１４５配列、またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体を含む核酸、例えば発現ベクター。
【請求項８】
疾患の治療、例えば軟骨性組織、軟骨、骨または靭帯欠損に関連する疾患、損傷、障害または傷害、外傷性疾患、加齢性変性疾患または変性関節疾患の修復または再生の方法で使用するための、軟骨形成活性を含む、ＺＮＦ１４５配列、またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体を含むポリペプチド。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞、請求項６に記載の細胞株、請求項７に記載の核酸または請求項８に記載のポリペプチドを含む、それらの請求項で特定された使用のための医薬組成物。
【請求項１０】
軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞において、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の該発現または活性を調節するステップと、例えばＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性を増大させて軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞の軟骨形成を促進するステップと、またはＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性をダウンレギュレートして、軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞の軟骨形成を低下させるステップとを含む、方法。
【請求項１１】
軟骨、骨または靭帯修復を促進するか、あるいは軟骨性組織の修復または再生を誘導する方法であって、該方法が、軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞において、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の前記発現または活性を増強させるステップを含む、方法。
【請求項１２】
軟骨性組織、軟骨、骨または靭帯欠損に関連する疾患、損傷、障害または傷害、外傷性疾患、加齢性変性疾患または変性関節疾患の修復または再生、のいずれか１つの該治療のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の改変された軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞、請求項６に記載の細胞株、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載のポリペプチドまたは請求項９に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１３】
例えば軟骨性組織、軟骨、骨または靭帯欠損に関連する疾患、損傷、障害または傷害、外傷性疾患、加齢性変性疾患または変性関節疾患を修復または再生する、個体において疾患を治療する方法であって、該個体においてまたは該個体の軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞において、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の該発現または活性をアップレギュレートするステップ、あるいは、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性の増加を提示する軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞を、そのような治療を必要とする個体に投与するステップを含む、方法。
【請求項１４】
軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞の軟骨細胞分化のマーカーとしての、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の使用。
【請求項１５】
Ｓｏｘ９の該発現または活性を調節する方法であって、該方法が、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の前記発現または活性を調節するステップを含む、方法。
【請求項１６】
軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞の軟骨形成を可能にするかまたは促進する能力のある薬剤を同定する方法であって、該方法が、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体を候補薬剤に接触させるステップと、該候補薬剤がＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体に結合するかどうかを決定するステップと、任意選択的に、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の該発現または活性がそれによって調節されるかどうかを決定するステップとを含む、方法。
【請求項１】
ＺＮＦ１４５、またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性を増大させるよう改変された、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）などの軟骨形成前駆細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞であって、
改変されていない軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞と比較して、
（ａ）２型コラーゲン（ＣＯＬ２Ａ１）、アグリカン、ｃｏｌ１０Ａ１またはＳｏｘ９などの軟骨形成マーカーの発現の増強、
（ｂ）例えばアルシアンブルー染色により検出される、軟骨プロテオグリカンの分泌の増強、または
（ｃ）例えばＷａｋｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ（１９９４）により記載されるような組織学的類別により検出される、例えば細胞形態の任意の１以上の組織学的類別、マトリックス染色、表面規則性、軟骨の厚さおよびホスト隣接軟骨へのドナーの組込みにより検出される、軟骨、骨または靭帯欠損を修復する能力の増強、
あるいはそれらの任意の組合せを提示する、細胞。
【請求項３】
前記軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞、またはその祖先が、前記ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性を増加させる発現構築物、例えばレンチウイルス発現構築物などでトランスフェクトされている、請求項１または２に記載の軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞。
【請求項４】
例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００７に記載されるようなペレット培養系により、すなわち軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞をペレット化し、１０ｎｇ／ｍｌトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β３、１０−７Ｍデキサメタゾン、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸−２−リン酸、４０μｇ／ｍｌプロリン、１００μｇ／ｍｌピルビン酸、および５０ｍｇ／ｍｌＩＴＳ＋プレミックス（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；６．２５μｇ／ｍｌインスリン、６．２５μｇ／ｍｌトランスフェリン、６．２５μｇ／ｍｌ亜セレン酸、１．２５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、および５．３５ｍｇ／ｍｌリノール酸）を含有する軟骨形成培地で培養することにより軟骨細胞分化が誘導されている、請求項１、２または３に記載の軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞。
【請求項５】
Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、テロメラーゼ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７およびＢｍｉ−１のいずれか１以上の発現または活性を増大させるように改変された、請求項１〜４のいずれか一項に記載の軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞を含むかまたはそれに由来する細胞株、例えば不死または不死化細胞株。
【請求項７】
疾患の治療、例えば軟骨性組織、軟骨、骨または靭帯欠損に関連する疾患、損傷、障害または傷害、外傷性疾患、加齢性変性疾患または変性関節疾患の修復または再生の方法で使用するための、軟骨形成活性を含むポリペプチドをコードする能力のあるＺＮＦ１４５配列、またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体を含む核酸、例えば発現ベクター。
【請求項８】
疾患の治療、例えば軟骨性組織、軟骨、骨または靭帯欠損に関連する疾患、損傷、障害または傷害、外傷性疾患、加齢性変性疾患または変性関節疾患の修復または再生の方法で使用するための、軟骨形成活性を含む、ＺＮＦ１４５配列、またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体を含むポリペプチド。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞、請求項６に記載の細胞株、請求項７に記載の核酸または請求項８に記載のポリペプチドを含む、それらの請求項で特定された使用のための医薬組成物。
【請求項１０】
軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞において、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の該発現または活性を調節するステップと、例えばＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性を増大させて軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞の軟骨形成を促進するステップと、またはＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性をダウンレギュレートして、軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞の軟骨形成を低下させるステップとを含む、方法。
【請求項１１】
軟骨、骨または靭帯修復を促進するか、あるいは軟骨性組織の修復または再生を誘導する方法であって、該方法が、軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞において、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の前記発現または活性を増強させるステップを含む、方法。
【請求項１２】
軟骨性組織、軟骨、骨または靭帯欠損に関連する疾患、損傷、障害または傷害、外傷性疾患、加齢性変性疾患または変性関節疾患の修復または再生、のいずれか１つの該治療のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の改変された軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞、請求項６に記載の細胞株、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載のポリペプチドまたは請求項９に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１３】
例えば軟骨性組織、軟骨、骨または靭帯欠損に関連する疾患、損傷、障害または傷害、外傷性疾患、加齢性変性疾患または変性関節疾患を修復または再生する、個体において疾患を治療する方法であって、該個体においてまたは該個体の軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞において、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の該発現または活性をアップレギュレートするステップ、あるいは、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の発現または活性の増加を提示する軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞を、そのような治療を必要とする個体に投与するステップを含む、方法。
【請求項１４】
軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞の軟骨細胞分化のマーカーとしての、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の使用。
【請求項１５】
Ｓｏｘ９の該発現または活性を調節する方法であって、該方法が、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の前記発現または活性を調節するステップを含む、方法。
【請求項１６】
軟骨形成前駆細胞、例えば間葉系幹細胞の軟骨形成を可能にするかまたは促進する能力のある薬剤を同定する方法であって、該方法が、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体を候補薬剤に接触させるステップと、該候補薬剤がＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体に結合するかどうかを決定するステップと、任意選択的に、ＺＮＦ１４５またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体の該発現または活性がそれによって調節されるかどうかを決定するステップとを含む、方法。
【公表番号】特表２０１２−５０２６５５（Ｐ２０１２−５０２６５５Ａ）
【公表日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２７７８３（Ｐ２０１１−５２７７８３）
【出願日】平成２１年９月２２日（２００９．９．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００９／０００３５１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３３０８８
【国際公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【出願人】（５１００９５０２０）エイジェンシー・フォー・サイエンス，テクノロジー・アンド・リサーチ（エイ・スター） (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月２２日（２００９．９．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００９／０００３５１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３３０８８
【国際公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【出願人】（５１００９５０２０）エイジェンシー・フォー・サイエンス，テクノロジー・アンド・リサーチ（エイ・スター） (4)
【Ｆターム（参考）】
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