迅速なタンパク質標識および分析
本発明は、細胞ライセート内またはタンパク質の混合物中のタンパク質、特に注目する特異的タンパク質を標識、分離および分析するための方法および組成物を提供する。当該タンパク質は、アミン反応性またはチオール反応性蛍光色素、またはそのタンパク質上に存在するアミン基と反応した際に蛍光性となるアミン反応性蛍光発生性試薬で標識される。標識する工程の後、この混合物内のタンパク質は、分離および分析することができる。さらなる実施形態では、タグ化タンパク質上に存在するタグに結合することができるタグ結合蛍光発生性試薬が加えられ、その注目するタンパク質が特異的に標識される。
Notice: Undefined index: DEJ in /mnt/www/gzt_disp.php on line 298
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の混合物を蛍光標識する工程を含むタンパク質分析のための方法であって、該標識する工程が、
ａ）該タンパク質の混合物を、
ｉ）ｐＨ ８〜ｐＨ １０の間のｐＨを有する第１のバッファーと、
ｉｉ）アミン反応性蛍光発生性試薬と、
ｉｉｉ）アセトンシアノヒドリン、ニトリル、またはシアン化アルカリと
を含む組成物と混合することによって第１の反応混合物を形成する工程と、
ｂ）該第１の反応混合物を、第１の温度で第１のインキュベーション時間の間インキュベーションする工程と、
ｃ）ｐＨ ６〜ｐＨ ９の間のｐＨを有する第２のバッファーを該第１の反応混合物と混合することによって、第２の反応混合物を形成する工程と、
ｄ）第２の温度で第２のインキュベーション時間の間インキュベーションする工程と、
ｅ）該蛍光標識されたタンパク質を分離し、可視化する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記組成物がアセトンシアノヒドリンまたはマンデロニトリルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物がシアン化アルカリを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記シアン化アルカリがシアン化ナトリウムまたはシアン化カリウムである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アミン反応性蛍光発生性試薬がアロイル−２−キノリン−カルボキシアルデヒド試薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アロイル−２−キノリン−カルボキシアルデヒド試薬が３−（４−カルボキシベンゾイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒドまたは３−（２−フロイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒド）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アロイル−２−キノリン−カルボキシアルデヒド試薬が３−（２−フロイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒド）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物がさらにアニオン性界面活性剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記アニオン性界面活性剤が、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルスルホコハク酸塩、アルキルリン酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルカルボン酸塩、アルキルエーテルベンゼンスルホン酸塩、アルキルエーテルスルホン酸塩、アルキルエーテルスルホコハク酸塩、アルキルエーテルリン酸塩、アルキルエーテル硫酸塩またはアルキルエーテルカルボン酸塩である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アニオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウムまたはステアリン酸ナトリウムである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記アニオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸リチウムである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のバッファーが、炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ビス−トリスプロパン、およびビシンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２のバッファーが、リン酸塩、グリシン、クエン酸、酢酸、ＭＥＳ、カコジル酸、炭酸、ビス−トリス、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、イミダゾール、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＡＭＰＳＯ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯおよびトリエタノールアミンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２のバッファーが前記第１のバッファーよりも大きい緩衝能を有し、これにより前記第２の反応混合物のｐＨをｐＨ ６〜ｐＨ ９の間に維持する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物がさらに糖類または糖アルコールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記糖類がショ糖である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記糖アルコールがグリセロールである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１のインキュベーション時間が１分間〜１５分間の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１のインキュベーション時間が５分間〜１５分間の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１のインキュベーション時間が１０分間〜１５分間の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１のインキュベーション温度が室温または常温である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１のインキュベーション温度が２５℃〜７０℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２のインキュベーション時間が１分間〜１５分間の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２のインキュベーション時間が５分間〜１５分間の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２のインキュベーション時間が１０分間〜１５分間の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２のインキュベーション温度が２５℃〜８０℃の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記第２のインキュベーション温度が３５℃〜８０℃の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記第２のインキュベーション温度が５０℃〜８０℃の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２のインキュベーション温度が７０℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１のインキュベーション時間が５分間〜１０分間の間であり、前記第２のインキュベーション時間がおよそ１０分間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
還元剤を前記第２の反応混合物に加える工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
トリアルキルホスフィン化合物、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、亜硫酸水素ナトリウム、チオグリコール酸、メルカプトエタンスルホン酸、グルタチオンまたはこれらの組合せからなる群から選択される還元剤を前記第２の反応混合物に加える工程をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記トリアルキルホスフィン化合物がトリ−ｎ−ブチルホスフィン（ＴＢＰ）またはトリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン（ＴＣＥＰ）である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記組成物がアルキル化剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記蛍光標識されたタンパク質が電気泳動により分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記蛍光標識されたタンパク質がスラブゲル電気泳動を使用して分離される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記蛍光標識されたタンパク質がキャピラリーゲル電気泳動を使用して分離される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記蛍光標識されたタンパク質がクロマトグラフィにより分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記蛍光標識されたタンパク質を可視化する工程が撮像する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記可視化する工程が前記蛍光標識されたタンパク質の前記分離の間に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記可視化する工程が前記蛍光標識されたタンパク質の前記分離後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記蛍光標識されたタンパク質が、使い捨てのカセット内に備えられるスラブゲル上で分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記可視化する工程が前記使い捨てのカセット内のスラブゲルを用いて行われる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
可視化する工程が前記蛍光標識されたタンパク質の前記分離の間に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
可視化が前記蛍光標識されたタンパク質の前記分離後に行われる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記方法が１時間未満で完結する、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
前記方法が３０分間未満で完結する、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
前記方法が２０分間未満で完結する、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
前記方法が１０分間未満で完結する、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
前記タンパク質の混合物がタグ化タンパク質を含み、前記第２のバッファーがさらに前記タグ化タンパク質上のタグに結合するタグ結合蛍光発生性試薬を含み、前記アミン反応性蛍光発生性試薬が第１の発光波長を有し、前記タグ結合蛍光発生性色素が第２の発光波長を有し、かつ前記第１の発光波長および前記第２の発光波長が異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
前記タグ結合蛍光発生性が二ヒ素フルオロフォアである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記二ヒ素フルオロフォアがフルオレセインまたはレゾルフィンの二ヒ素誘導体である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記二ヒ素フルオロフォアが４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン−（２，２−エタンジチオール）２または４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）レゾルフィン−（２，２−エタンジチオール）２である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
さらに、前記第１の発光波長および前記第２の発光波長を比較する工程を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記タグ化タンパク質上の前記タグが、少なくとも４つのシステイン部分を含むペプチドを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ部分を含み、式中、各Ｘが独立に、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンから選択されるアミノ酸であり、かつｎが２〜２０の整数である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
前記ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５８】
前記ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ部分を含み、式中、各Ｘが独立に、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンから選択されるアミノ酸であり、かつｎが２〜２０の整数である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５９】
前記ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓである、請求項５０に記載の方法。
【請求項６０】
タグ化タンパク質を含むタンパク質の混合物を蛍光標識する工程を含むタンパク質分析のための方法であって、前記標識する工程が、
ａ）前記タンパク質の混合物を、
ｉ）ｐＨ ８〜ｐＨ １０の間のｐＨを有する第１のバッファーと、
ｉｉ）アミン反応性蛍光色素、または前記タグ化タンパク質上のタグに結合するタグ結合蛍光発生性試薬と
を含む第１の組成物と混合することによって、第１の反応混合物を形成する工程と、
ｂ）前記第１の反応混合物を、第１の温度で第１のインキュベーション時間の間インキュベーションする工程と、
ｃ）第２の組成物を前記第１の反応混合物と混合することによって、第２の反応混合物を形成する工程であって、前記第２の組成物は、
ｉ）ｐＨ ６〜ｐＨ １０の間のｐＨを有する第２のバッファーと、
ｉｉ）アミン反応性蛍光色素、またはタグ結合蛍光発生性試薬（ただし、前記第１の組成物がアミン反応性蛍光色素を含む場合、前記第２の組成物はタグ結合蛍光発生性試薬を含み、前記第１の組成物がタグ結合蛍光発生性試薬を含む場合、前記第２の組成物はアミン反応性蛍光色素を含む）と、
ｉｉｉ）少なくとも１つの還元剤と
を含む工程と、
ｄ）前記第２の反応混合物を、第２の温度で第２のインキュベーション時間の間インキュベーションする工程と、
ｅ）前記蛍光標識されたタンパク質を分離し、可視化する工程と
を含み、前記第１のバッファーは一級または二級アミンを含まず、前記アミン反応性蛍光色素は第１の発光波長を有し、前記タグ結合蛍光発生性色素は第２の発光波長を有し、かつ前記第１の発光波長および前記第２の発光波長は異なる、方法。
【請求項６１】
さらに、前記第１の発光波長および前記第２の発光波長を比較する工程を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記アミン反応性蛍光色素がフルオレセイン部分、ローダミン部分、アクリジン部分、クマリン部分、インドール部分、イソインドール部分、インドリジン部分、キノリン部分、イソキノリン部分、クロメン部分、キサンテン部分、ナフタレン部分、ピレン部分、ビマン部分およびＢＯＤＩＰＹ部分からなる群から選択される蛍光性部分を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記アミン反応性蛍光色素がさらに、アシルアジド、カルボニルアジド、イソチオシアネート、イソシアネート、スクシンイミジルエステル、カルボン酸エステル、カルボン酸、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、ＳＴＰエステル、テトラフルオロフェニルエステル、塩化スルホニル、酸ハロゲン化物、アルデヒド、カルボキシアルデヒド、ジクロロトリアジン、ＮＢＤ塩化物、またはＮＢＤフッ化物からなる群から選択される反応性部分を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記アミン反応性蛍光色素が、７−ヒドロキシ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）スクシンイミジルエステル（ＤＤＡＯ−ＳＥ）、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＲ−Ｘ−スクシンイミジルエステル、およびＢｏｄｉｐｙ ６５０／６６５−スクシンイミジルエステルからなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
前記第１のバッファーが、炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ビス−トリスプロパン、およびビシンからなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
前記第２のバッファーが、リン酸塩、グリシン、クエン酸、酢酸、ＭＥＳ、カコジル酸、炭酸、ビス−トリス、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、イミダゾール、ＢＥＳ、ＡＭＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯおよびトリエタノールアミンからなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６７】
前記第１の組成物がさらにアニオン性界面活性剤を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６８】
前記アニオン性界面活性剤が、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルスルホコハク酸塩、アルキルリン酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルカルボン酸塩、アルキルエーテルベンゼンスルホン酸塩、アルキルエーテルスルホン酸塩、アルキルエーテルスルホコハク酸塩、アルキルエーテルリン酸塩、アルキルエーテル硫酸塩またはアルキルエーテルカルボン酸塩である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記アニオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウムまたはステアリン酸ナトリウムである、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記アニオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸リチウムである、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記第１の組成物がさらに、糖類または糖アルコールを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項７２】
前記糖類がショ糖である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記糖アルコールがグリセロールである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記第１のインキュベーション時間が１分間〜１５分間の間である、請求項６０に記載の方法。
【請求項７５】
前記第１のインキュベーション時間が５分間〜１５分間の間である、請求項６０に記載の方法。
【請求項７６】
前記第１のインキュベーション時間が１０分間〜１５分間の間である、請求項６０に記載の方法。
【請求項７７】
前記第１のインキュベーション温度が室温である、請求項６０に記載の方法。
【請求項７８】
前記第１のインキュベーション温度が常温である、請求項６０に記載の方法。
【請求項７９】
前記第１のインキュベーション温度が２５℃〜７０℃である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８０】
前記第２のインキュベーション時間が１分間〜１５分間の間である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８１】
前記第２のインキュベーション時間が５分間〜１５分間の間である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８２】
前記第２のインキュベーション時間が１０分間〜１５分間の間である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８３】
前記第２のインキュベーション温度が２５℃〜８０℃である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８４】
前記第２のインキュベーション温度が３５℃〜８０℃である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８５】
前記第２のインキュベーション温度が５０℃〜８０℃である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８６】
前記第２のインキュベーション温度が７０℃である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８７】
前記第１のインキュベーション時間が５分間〜１０分間の間であり、前記第２のインキュベーション時間がおよそ１０分間である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８８】
前記還元剤が、トリアルキルホスフィン化合物、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、亜硫酸水素ナトリウム、チオグリコール酸、メルカプトエタンスルホン酸、グルタチオンまたはこれらの組合せから選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項８９】
前記タグ化タンパク質上の前記タグに結合する前記蛍光発生性色素が二ヒ素フルオロフォアである、請求項６０に記載の方法。
【請求項９０】
前記二ヒ素フルオロフォアがフルオレセインまたはレゾルフィンの二ヒ素誘導体である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記二ヒ素フルオロフォアが４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン−（２，２−エタンジチオール）２または４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）レゾルフィン−（２，２−エタンジチオール）２である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記タグ化タンパク質上の前記タグが、少なくとも４つのシステイン部分を含むペプチドを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項９３】
前記ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ部分を含み、式中、各Ｘが独立にアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンから選択されるアミノ酸であり、かつｎが２〜２０の整数である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓである、請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
前記ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ部分を含み、式中、各Ｘが独立にアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンから選択されるアミノ酸であり、かつｎが２〜２０の整数である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９６】
前記ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓである、請求項９２に記載の方法。
【請求項９７】
タグ化タンパク質を含むタンパク質の混合物を蛍光標識するためのキットであって、
ａ）ｐＨ ８〜ｐＨ １０の範囲のｐＨを有するバッファーと、アミン反応性蛍光発生性試薬またはアミン反応性蛍光色素と、糖類または糖アルコールと、アニオン性界面活性剤とを含む第１の組成物と、
ｂ）ｐＨ ６〜ｐＨ １０の範囲の第２のバッファーと、任意にタグ結合蛍光発生性試薬とを含む第２の組成物と
を含む、キット。
【請求項９８】
前記第１の組成物がアミン反応性蛍光発生性試薬を含み、さらにアセトンシアノヒドリン、ニトリルまたはシアン化アルカリのいずれかを含む、請求項９７に記載のキット。
【請求項９９】
前記第１の組成物がアセトンシアノヒドリンまたはマンデロニトリルのいずれかを含む、請求項９８に記載のキット。
【請求項１００】
前記組成物がシアン化アルカリを含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０１】
前記シアン化アルカリがシアン化ナトリウムまたはシアン化カリウムである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記アミン反応性蛍光発生性試薬がアロイル−２−キノリン−カルボキシアルデヒド試薬である、請求項９７に記載のキット。
【請求項１０３】
前記アロイル−２−キノリン−カルボキシアルデヒド試薬が、３−（４−カルボキシベンゾイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒドまたは３−（２−フロイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒド）である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記アロイル−２−キノリン−カルボキシアルデヒド試薬が３−（２−フロイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒド）である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記第１の組成物が、フルオレセイン部分、ローダミン部分、アクリジン部分、クマリン部分、インドール部分、イソインドール部分、インドリジン部分、キノリン部分、イソキノリン部分、クロメン部分、キサンテン部分、ナフタレン部分、ピレン部分、ビマン部分およびＢＯＤＩＰＹ部分からなる群から選択される蛍光性部分を含むアミン反応性蛍光色素を含む、請求項９７に記載のキット。
【請求項１０６】
前記アミン反応性蛍光色素がさらに、アシルアジド、カルボニルアジド、イソチオシアネート、イソシアネート、スクシンイミジルエステル、カルボン酸エステル、カルボン酸、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、ＳＴＰエステル、テトラフルオロフェニルエステル、塩化スルホニル、酸ハロゲン化物、アルデヒド、カルボキシアルデヒド、ジクロロトリアジン、ＮＢＤ塩化物、またはＮＢＤフッ化物からなる群から選択される反応性部分を含む、請求項１０５に記載のキット。
【請求項１０７】
前記第２の組成物がさらに、少なくとも４つのシステイン部分に結合するタグ結合蛍光発生性試薬、および少なくとも１つの還元剤を含み、前記アミン反応性蛍光発生性試薬または蛍光色素が第１の発光波長を有し、前記タグ結合蛍光発生性色素が第２の発光波長を有し、かつ前記第１の発光波長および前記第２の発光波長が異なる、請求項９７に記載のキット。
【請求項１０８】
前記タグ結合蛍光発生性試薬がフルオレセインまたはレゾルフィンの二ヒ素誘導体である、請求項１０７に記載のキット。
【請求項１０９】
前記二ヒ素フルオロフォアが４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン−（２，２−エタンジチオール）２または４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）レゾルフィン−（２，２−エタンジチオール）２である、請求項１０８に記載のキット。
【請求項１１０】
ｐＨ ８〜ｐＨ １０の範囲のｐＨを有するバッファーと、タグ結合蛍光発生性色素と、アニオン性界面活性剤と、糖類または糖アルコールと、追跡用色素と、１以上の還元剤と、炭酸水素塩とを含む組成物。
【請求項１１１】
前記１以上の還元剤が、トリアルキルホスフィン化合物、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、亜硫酸水素ナトリウム、チオグリコール酸、メルカプトエタンスルホン酸またはグルタチオンから選択される、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１１２】
前記トリアルキルホスフィン化合物がトリ−Ｎ−ブチルホスフィン（ＴＢＰ）またはトリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン（ＴＣＥＰ）である、請求項１１１に記載の組成物。
【請求項１１３】
前記タグ結合蛍光発生性色素が二ヒ素フルオロフォアである、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１１４】
前記二ヒ素フルオロフォアがフルオレセインの二ヒ素誘導体である、請求項１１３に記載の組成物。
【請求項１１５】
前記二ヒ素フルオロフォアが４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン−（２，２−エタンジチオール）２である、請求項１１４に記載の組成物。
【請求項１１６】
前記二ヒ素フルオロフォアがレゾルフィンの二ヒ素誘導体である、請求項１１４に記載の組成物。
【請求項１１７】
前記二ヒ素フルオロフォアが４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）レゾルフィン−（２，２−エタンジチオール）２である、請求項１１６に記載の組成物。
【請求項１１８】
前記アニオン性界面活性剤が、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルスルホコハク酸塩、アルキルリン酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルカルボン酸塩、アルキルエーテルベンゼンスルホン酸塩、アルキルエーテルスルホン酸塩、アルキルエーテルスルホコハク酸塩、アルキルエーテルリン酸塩、アルキルエーテル硫酸塩またはアルキルエーテルカルボン酸塩である、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１１９】
前記アニオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウムまたはステアリン酸ナトリウムである、請求項１１８に記載の組成物。
【請求項１２０】
前記アニオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸リチウムである、請求項１１８に記載の組成物。
【請求項１２１】
前記糖類がショ糖である、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１２２】
前記糖アルコールがグリセロールである、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１２３】
前記追跡用色素がブロモフェノールブルーである、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１２４】
前記バッファーが炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ビス−トリスプロパン、およびビシンからなる群から選択される、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１２５】
前記組成物がさらにタグ化タンパク質を含む、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１２６】
前記組成物がさらにアミン反応性蛍光色素を含む、請求項１２５に記載の組成物。
【請求項１２７】
前記アミン反応性蛍光色素が、フルオレセイン部分、ローダミン部分、アクリジン部分、クマリン部分、インドール部分、イソインドール部分、インドリジン部分、キノリン部分、イソキノリン部分、クロメン部分、キサンテン部分、ナフタレン部分、ピレン部分、ビマン部分およびＢＯＤＩＰＹ部分からなる群から選択される蛍光性部分を含む、請求項１２６に記載の組成物。
【請求項１２８】
前記アミン反応性蛍光色素がさらに、アシルアジド、カルボニルアジド、イソチオシアネート、イソシアネート、スクシンイミジルエステル、カルボン酸エステル、カルボン酸、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、ＳＴＰエステル、テトラフルオロフェニルエステル、塩化スルホニル、酸ハロゲン化物、アルデヒド、カルボキシアルデヒド、ジクロロトリアジン、ＮＢＤ塩化物、またはＮＢＤフッ化物からなる群から選択される反応性部分を含む、請求項１２７に記載の組成物。
【請求項１】
タンパク質の混合物を蛍光標識する工程を含むタンパク質分析のための方法であって、該標識する工程が、
ａ）該タンパク質の混合物を、
ｉ）ｐＨ ８〜ｐＨ １０の間のｐＨを有する第１のバッファーと、
ｉｉ）アミン反応性蛍光発生性試薬と、
ｉｉｉ）アセトンシアノヒドリン、ニトリル、またはシアン化アルカリと
を含む組成物と混合することによって第１の反応混合物を形成する工程と、
ｂ）該第１の反応混合物を、第１の温度で第１のインキュベーション時間の間インキュベーションする工程と、
ｃ）ｐＨ ６〜ｐＨ ９の間のｐＨを有する第２のバッファーを該第１の反応混合物と混合することによって、第２の反応混合物を形成する工程と、
ｄ）第２の温度で第２のインキュベーション時間の間インキュベーションする工程と、
ｅ）該蛍光標識されたタンパク質を分離し、可視化する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記組成物がアセトンシアノヒドリンまたはマンデロニトリルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物がシアン化アルカリを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記シアン化アルカリがシアン化ナトリウムまたはシアン化カリウムである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アミン反応性蛍光発生性試薬がアロイル−２−キノリン−カルボキシアルデヒド試薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アロイル−２−キノリン−カルボキシアルデヒド試薬が３−（４−カルボキシベンゾイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒドまたは３−（２−フロイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒド）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アロイル−２−キノリン−カルボキシアルデヒド試薬が３−（２−フロイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒド）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物がさらにアニオン性界面活性剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記アニオン性界面活性剤が、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルスルホコハク酸塩、アルキルリン酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルカルボン酸塩、アルキルエーテルベンゼンスルホン酸塩、アルキルエーテルスルホン酸塩、アルキルエーテルスルホコハク酸塩、アルキルエーテルリン酸塩、アルキルエーテル硫酸塩またはアルキルエーテルカルボン酸塩である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アニオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウムまたはステアリン酸ナトリウムである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記アニオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸リチウムである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のバッファーが、炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ビス−トリスプロパン、およびビシンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２のバッファーが、リン酸塩、グリシン、クエン酸、酢酸、ＭＥＳ、カコジル酸、炭酸、ビス−トリス、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、イミダゾール、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＡＭＰＳＯ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯおよびトリエタノールアミンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２のバッファーが前記第１のバッファーよりも大きい緩衝能を有し、これにより前記第２の反応混合物のｐＨをｐＨ ６〜ｐＨ ９の間に維持する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物がさらに糖類または糖アルコールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記糖類がショ糖である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記糖アルコールがグリセロールである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１のインキュベーション時間が１分間〜１５分間の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１のインキュベーション時間が５分間〜１５分間の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１のインキュベーション時間が１０分間〜１５分間の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１のインキュベーション温度が室温または常温である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１のインキュベーション温度が２５℃〜７０℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２のインキュベーション時間が１分間〜１５分間の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２のインキュベーション時間が５分間〜１５分間の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２のインキュベーション時間が１０分間〜１５分間の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２のインキュベーション温度が２５℃〜８０℃の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記第２のインキュベーション温度が３５℃〜８０℃の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記第２のインキュベーション温度が５０℃〜８０℃の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２のインキュベーション温度が７０℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１のインキュベーション時間が５分間〜１０分間の間であり、前記第２のインキュベーション時間がおよそ１０分間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
還元剤を前記第２の反応混合物に加える工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
トリアルキルホスフィン化合物、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、亜硫酸水素ナトリウム、チオグリコール酸、メルカプトエタンスルホン酸、グルタチオンまたはこれらの組合せからなる群から選択される還元剤を前記第２の反応混合物に加える工程をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記トリアルキルホスフィン化合物がトリ−ｎ−ブチルホスフィン（ＴＢＰ）またはトリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン（ＴＣＥＰ）である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記組成物がアルキル化剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記蛍光標識されたタンパク質が電気泳動により分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記蛍光標識されたタンパク質がスラブゲル電気泳動を使用して分離される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記蛍光標識されたタンパク質がキャピラリーゲル電気泳動を使用して分離される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記蛍光標識されたタンパク質がクロマトグラフィにより分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記蛍光標識されたタンパク質を可視化する工程が撮像する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記可視化する工程が前記蛍光標識されたタンパク質の前記分離の間に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記可視化する工程が前記蛍光標識されたタンパク質の前記分離後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記蛍光標識されたタンパク質が、使い捨てのカセット内に備えられるスラブゲル上で分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記可視化する工程が前記使い捨てのカセット内のスラブゲルを用いて行われる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
可視化する工程が前記蛍光標識されたタンパク質の前記分離の間に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
可視化が前記蛍光標識されたタンパク質の前記分離後に行われる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記方法が１時間未満で完結する、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
前記方法が３０分間未満で完結する、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
前記方法が２０分間未満で完結する、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
前記方法が１０分間未満で完結する、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
前記タンパク質の混合物がタグ化タンパク質を含み、前記第２のバッファーがさらに前記タグ化タンパク質上のタグに結合するタグ結合蛍光発生性試薬を含み、前記アミン反応性蛍光発生性試薬が第１の発光波長を有し、前記タグ結合蛍光発生性色素が第２の発光波長を有し、かつ前記第１の発光波長および前記第２の発光波長が異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
前記タグ結合蛍光発生性が二ヒ素フルオロフォアである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記二ヒ素フルオロフォアがフルオレセインまたはレゾルフィンの二ヒ素誘導体である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記二ヒ素フルオロフォアが４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン−（２，２−エタンジチオール）２または４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）レゾルフィン−（２，２−エタンジチオール）２である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
さらに、前記第１の発光波長および前記第２の発光波長を比較する工程を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記タグ化タンパク質上の前記タグが、少なくとも４つのシステイン部分を含むペプチドを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ部分を含み、式中、各Ｘが独立に、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンから選択されるアミノ酸であり、かつｎが２〜２０の整数である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
前記ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５８】
前記ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ部分を含み、式中、各Ｘが独立に、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンから選択されるアミノ酸であり、かつｎが２〜２０の整数である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５９】
前記ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓである、請求項５０に記載の方法。
【請求項６０】
タグ化タンパク質を含むタンパク質の混合物を蛍光標識する工程を含むタンパク質分析のための方法であって、前記標識する工程が、
ａ）前記タンパク質の混合物を、
ｉ）ｐＨ ８〜ｐＨ １０の間のｐＨを有する第１のバッファーと、
ｉｉ）アミン反応性蛍光色素、または前記タグ化タンパク質上のタグに結合するタグ結合蛍光発生性試薬と
を含む第１の組成物と混合することによって、第１の反応混合物を形成する工程と、
ｂ）前記第１の反応混合物を、第１の温度で第１のインキュベーション時間の間インキュベーションする工程と、
ｃ）第２の組成物を前記第１の反応混合物と混合することによって、第２の反応混合物を形成する工程であって、前記第２の組成物は、
ｉ）ｐＨ ６〜ｐＨ １０の間のｐＨを有する第２のバッファーと、
ｉｉ）アミン反応性蛍光色素、またはタグ結合蛍光発生性試薬（ただし、前記第１の組成物がアミン反応性蛍光色素を含む場合、前記第２の組成物はタグ結合蛍光発生性試薬を含み、前記第１の組成物がタグ結合蛍光発生性試薬を含む場合、前記第２の組成物はアミン反応性蛍光色素を含む）と、
ｉｉｉ）少なくとも１つの還元剤と
を含む工程と、
ｄ）前記第２の反応混合物を、第２の温度で第２のインキュベーション時間の間インキュベーションする工程と、
ｅ）前記蛍光標識されたタンパク質を分離し、可視化する工程と
を含み、前記第１のバッファーは一級または二級アミンを含まず、前記アミン反応性蛍光色素は第１の発光波長を有し、前記タグ結合蛍光発生性色素は第２の発光波長を有し、かつ前記第１の発光波長および前記第２の発光波長は異なる、方法。
【請求項６１】
さらに、前記第１の発光波長および前記第２の発光波長を比較する工程を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記アミン反応性蛍光色素がフルオレセイン部分、ローダミン部分、アクリジン部分、クマリン部分、インドール部分、イソインドール部分、インドリジン部分、キノリン部分、イソキノリン部分、クロメン部分、キサンテン部分、ナフタレン部分、ピレン部分、ビマン部分およびＢＯＤＩＰＹ部分からなる群から選択される蛍光性部分を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記アミン反応性蛍光色素がさらに、アシルアジド、カルボニルアジド、イソチオシアネート、イソシアネート、スクシンイミジルエステル、カルボン酸エステル、カルボン酸、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、ＳＴＰエステル、テトラフルオロフェニルエステル、塩化スルホニル、酸ハロゲン化物、アルデヒド、カルボキシアルデヒド、ジクロロトリアジン、ＮＢＤ塩化物、またはＮＢＤフッ化物からなる群から選択される反応性部分を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記アミン反応性蛍光色素が、７−ヒドロキシ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）スクシンイミジルエステル（ＤＤＡＯ−ＳＥ）、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＲ−Ｘ−スクシンイミジルエステル、およびＢｏｄｉｐｙ ６５０／６６５−スクシンイミジルエステルからなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
前記第１のバッファーが、炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ビス−トリスプロパン、およびビシンからなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
前記第２のバッファーが、リン酸塩、グリシン、クエン酸、酢酸、ＭＥＳ、カコジル酸、炭酸、ビス−トリス、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、イミダゾール、ＢＥＳ、ＡＭＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯおよびトリエタノールアミンからなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６７】
前記第１の組成物がさらにアニオン性界面活性剤を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６８】
前記アニオン性界面活性剤が、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルスルホコハク酸塩、アルキルリン酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルカルボン酸塩、アルキルエーテルベンゼンスルホン酸塩、アルキルエーテルスルホン酸塩、アルキルエーテルスルホコハク酸塩、アルキルエーテルリン酸塩、アルキルエーテル硫酸塩またはアルキルエーテルカルボン酸塩である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記アニオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウムまたはステアリン酸ナトリウムである、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記アニオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸リチウムである、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記第１の組成物がさらに、糖類または糖アルコールを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項７２】
前記糖類がショ糖である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記糖アルコールがグリセロールである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記第１のインキュベーション時間が１分間〜１５分間の間である、請求項６０に記載の方法。
【請求項７５】
前記第１のインキュベーション時間が５分間〜１５分間の間である、請求項６０に記載の方法。
【請求項７６】
前記第１のインキュベーション時間が１０分間〜１５分間の間である、請求項６０に記載の方法。
【請求項７７】
前記第１のインキュベーション温度が室温である、請求項６０に記載の方法。
【請求項７８】
前記第１のインキュベーション温度が常温である、請求項６０に記載の方法。
【請求項７９】
前記第１のインキュベーション温度が２５℃〜７０℃である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８０】
前記第２のインキュベーション時間が１分間〜１５分間の間である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８１】
前記第２のインキュベーション時間が５分間〜１５分間の間である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８２】
前記第２のインキュベーション時間が１０分間〜１５分間の間である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８３】
前記第２のインキュベーション温度が２５℃〜８０℃である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８４】
前記第２のインキュベーション温度が３５℃〜８０℃である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８５】
前記第２のインキュベーション温度が５０℃〜８０℃である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８６】
前記第２のインキュベーション温度が７０℃である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８７】
前記第１のインキュベーション時間が５分間〜１０分間の間であり、前記第２のインキュベーション時間がおよそ１０分間である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８８】
前記還元剤が、トリアルキルホスフィン化合物、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、亜硫酸水素ナトリウム、チオグリコール酸、メルカプトエタンスルホン酸、グルタチオンまたはこれらの組合せから選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項８９】
前記タグ化タンパク質上の前記タグに結合する前記蛍光発生性色素が二ヒ素フルオロフォアである、請求項６０に記載の方法。
【請求項９０】
前記二ヒ素フルオロフォアがフルオレセインまたはレゾルフィンの二ヒ素誘導体である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記二ヒ素フルオロフォアが４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン−（２，２−エタンジチオール）２または４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）レゾルフィン−（２，２−エタンジチオール）２である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記タグ化タンパク質上の前記タグが、少なくとも４つのシステイン部分を含むペプチドを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項９３】
前記ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ部分を含み、式中、各Ｘが独立にアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンから選択されるアミノ酸であり、かつｎが２〜２０の整数である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓである、請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
前記ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ部分を含み、式中、各Ｘが独立にアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンから選択されるアミノ酸であり、かつｎが２〜２０の整数である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９６】
前記ペプチドがＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓである、請求項９２に記載の方法。
【請求項９７】
タグ化タンパク質を含むタンパク質の混合物を蛍光標識するためのキットであって、
ａ）ｐＨ ８〜ｐＨ １０の範囲のｐＨを有するバッファーと、アミン反応性蛍光発生性試薬またはアミン反応性蛍光色素と、糖類または糖アルコールと、アニオン性界面活性剤とを含む第１の組成物と、
ｂ）ｐＨ ６〜ｐＨ １０の範囲の第２のバッファーと、任意にタグ結合蛍光発生性試薬とを含む第２の組成物と
を含む、キット。
【請求項９８】
前記第１の組成物がアミン反応性蛍光発生性試薬を含み、さらにアセトンシアノヒドリン、ニトリルまたはシアン化アルカリのいずれかを含む、請求項９７に記載のキット。
【請求項９９】
前記第１の組成物がアセトンシアノヒドリンまたはマンデロニトリルのいずれかを含む、請求項９８に記載のキット。
【請求項１００】
前記組成物がシアン化アルカリを含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０１】
前記シアン化アルカリがシアン化ナトリウムまたはシアン化カリウムである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記アミン反応性蛍光発生性試薬がアロイル−２−キノリン−カルボキシアルデヒド試薬である、請求項９７に記載のキット。
【請求項１０３】
前記アロイル−２−キノリン−カルボキシアルデヒド試薬が、３−（４−カルボキシベンゾイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒドまたは３−（２−フロイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒド）である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記アロイル−２−キノリン−カルボキシアルデヒド試薬が３−（２−フロイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒド）である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記第１の組成物が、フルオレセイン部分、ローダミン部分、アクリジン部分、クマリン部分、インドール部分、イソインドール部分、インドリジン部分、キノリン部分、イソキノリン部分、クロメン部分、キサンテン部分、ナフタレン部分、ピレン部分、ビマン部分およびＢＯＤＩＰＹ部分からなる群から選択される蛍光性部分を含むアミン反応性蛍光色素を含む、請求項９７に記載のキット。
【請求項１０６】
前記アミン反応性蛍光色素がさらに、アシルアジド、カルボニルアジド、イソチオシアネート、イソシアネート、スクシンイミジルエステル、カルボン酸エステル、カルボン酸、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、ＳＴＰエステル、テトラフルオロフェニルエステル、塩化スルホニル、酸ハロゲン化物、アルデヒド、カルボキシアルデヒド、ジクロロトリアジン、ＮＢＤ塩化物、またはＮＢＤフッ化物からなる群から選択される反応性部分を含む、請求項１０５に記載のキット。
【請求項１０７】
前記第２の組成物がさらに、少なくとも４つのシステイン部分に結合するタグ結合蛍光発生性試薬、および少なくとも１つの還元剤を含み、前記アミン反応性蛍光発生性試薬または蛍光色素が第１の発光波長を有し、前記タグ結合蛍光発生性色素が第２の発光波長を有し、かつ前記第１の発光波長および前記第２の発光波長が異なる、請求項９７に記載のキット。
【請求項１０８】
前記タグ結合蛍光発生性試薬がフルオレセインまたはレゾルフィンの二ヒ素誘導体である、請求項１０７に記載のキット。
【請求項１０９】
前記二ヒ素フルオロフォアが４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン−（２，２−エタンジチオール）２または４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）レゾルフィン−（２，２−エタンジチオール）２である、請求項１０８に記載のキット。
【請求項１１０】
ｐＨ ８〜ｐＨ １０の範囲のｐＨを有するバッファーと、タグ結合蛍光発生性色素と、アニオン性界面活性剤と、糖類または糖アルコールと、追跡用色素と、１以上の還元剤と、炭酸水素塩とを含む組成物。
【請求項１１１】
前記１以上の還元剤が、トリアルキルホスフィン化合物、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、亜硫酸水素ナトリウム、チオグリコール酸、メルカプトエタンスルホン酸またはグルタチオンから選択される、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１１２】
前記トリアルキルホスフィン化合物がトリ−Ｎ−ブチルホスフィン（ＴＢＰ）またはトリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン（ＴＣＥＰ）である、請求項１１１に記載の組成物。
【請求項１１３】
前記タグ結合蛍光発生性色素が二ヒ素フルオロフォアである、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１１４】
前記二ヒ素フルオロフォアがフルオレセインの二ヒ素誘導体である、請求項１１３に記載の組成物。
【請求項１１５】
前記二ヒ素フルオロフォアが４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン−（２，２−エタンジチオール）２である、請求項１１４に記載の組成物。
【請求項１１６】
前記二ヒ素フルオロフォアがレゾルフィンの二ヒ素誘導体である、請求項１１４に記載の組成物。
【請求項１１７】
前記二ヒ素フルオロフォアが４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）レゾルフィン−（２，２−エタンジチオール）２である、請求項１１６に記載の組成物。
【請求項１１８】
前記アニオン性界面活性剤が、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルスルホコハク酸塩、アルキルリン酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルカルボン酸塩、アルキルエーテルベンゼンスルホン酸塩、アルキルエーテルスルホン酸塩、アルキルエーテルスルホコハク酸塩、アルキルエーテルリン酸塩、アルキルエーテル硫酸塩またはアルキルエーテルカルボン酸塩である、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１１９】
前記アニオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウムまたはステアリン酸ナトリウムである、請求項１１８に記載の組成物。
【請求項１２０】
前記アニオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸リチウムである、請求項１１８に記載の組成物。
【請求項１２１】
前記糖類がショ糖である、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１２２】
前記糖アルコールがグリセロールである、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１２３】
前記追跡用色素がブロモフェノールブルーである、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１２４】
前記バッファーが炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ビス−トリスプロパン、およびビシンからなる群から選択される、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１２５】
前記組成物がさらにタグ化タンパク質を含む、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１２６】
前記組成物がさらにアミン反応性蛍光色素を含む、請求項１２５に記載の組成物。
【請求項１２７】
前記アミン反応性蛍光色素が、フルオレセイン部分、ローダミン部分、アクリジン部分、クマリン部分、インドール部分、イソインドール部分、インドリジン部分、キノリン部分、イソキノリン部分、クロメン部分、キサンテン部分、ナフタレン部分、ピレン部分、ビマン部分およびＢＯＤＩＰＹ部分からなる群から選択される蛍光性部分を含む、請求項１２６に記載の組成物。
【請求項１２８】
前記アミン反応性蛍光色素がさらに、アシルアジド、カルボニルアジド、イソチオシアネート、イソシアネート、スクシンイミジルエステル、カルボン酸エステル、カルボン酸、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、ＳＴＰエステル、テトラフルオロフェニルエステル、塩化スルホニル、酸ハロゲン化物、アルデヒド、カルボキシアルデヒド、ジクロロトリアジン、ＮＢＤ塩化物、またはＮＢＤフッ化物からなる群から選択される反応性部分を含む、請求項１２７に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公表番号】特表２０１０−５２８２６８（Ｐ２０１０−５２８２６８Ａ）
【公表日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０８６２３（Ｐ２０１０−５０８６２３）
【出願日】平成２０年５月１６日（２００８．５．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４０１４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４４５８８
【国際公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【出願人】（５０２２２１２８２）ライフ テクノロジーズ コーポレーション (113)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月１６日（２００８．５．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４０１４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４４５８８
【国際公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【出願人】（５０２２２１２８２）ライフ テクノロジーズ コーポレーション (113)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]