莢膜多糖（ｃｐ）は、種々の細菌性疾患に関与している細菌の表面上に見られる重要な免疫原である。この特徴により、莢膜多糖は、ワクチンの設計において重要な成分となっている。莢膜多糖は、特に、担体タンパク質と連結させると、免疫応答の誘起に有用であることが示されている。本発明は、細菌培養の分野におけるものであり、特に、フィードバッチ式培養における連鎖球菌属菌株からの細菌莢膜多糖の生産を改善するための培養条件の最適化、および連鎖球菌属菌株からの細菌莢膜多糖の生産規模精製に適し、これまでの生産規模で得られるものより高い純度レベルがもたらされる新規な精製方法に関する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ｃｐを発現する連鎖球菌属菌株の播種材料を準備すること、および（ｂ）該菌株を発酵によって培養することを含み、前記培養は、培養培地への炭素源の線形添加を含み、該培養培地のｐＨをモニタリングすることにより該培養を制御するためのアルゴリズムを使用しない、製造規模での莢膜多糖（ｃｐ）の生産のための連鎖球菌属の培養方法。
【請求項２】
さらに、莢膜多糖を回収する工程（ｃ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記連鎖球菌属菌株が、さらにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ菌株が０９０、Ｈ３６ｂ、ＣＢＪ１１１、またはＭ７８１である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記播種材料の光学密度（ＯＤ）が約０．６と約１．８の間である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記培養培地のｐＨが約６．０と約７．５の間である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ｐＨが約７．３である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記培養培地の温度が約３４℃と約３８℃の間である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記温度が約３６℃である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記炭素源が、さらにグルコースを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記培養が、さらに、ＯＤが指定レベルに達したら前記炭素源の線形添加が開始されるように培養培地のＯＤをモニタリングすることを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記指定レベルが、ｃｐの高容積生産が達成されるように選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記指定レベルが約９．８と約１０．２の間である、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記指定レベルが約１０である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記培養が、さらに、ＯＤが第１および第２の即時添加レベルに達したら、前記炭素源の線形添加の前に酵母抽出物の２回の即時添加が開始されるように培養培地のＯＤをモニタリングすることを含む、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１および第２の即時添加レベルが、ｃｐの高容積生産が達成されるように選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の即時添加レベルが約２．８と約３．２の間である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の即時添加レベルが約３．０である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の即時添加レベルが約４．３と約４．７の間である、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の即時添加レベルが約４．５である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記培養培地が、リン酸源、ミネラル源、炭素源、ビタミン源、および連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む規定培地であり、前記ビタミン源が以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸から選択される６種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記培養培地が、酵母抽出物、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および任意選択で連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む複合培地であり、前記ビタミン源が以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される４種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
連鎖球菌属菌株、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む培養培地であって、前記ビタミン源が以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸から選択される６種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、培養培地。
【請求項２４】
前記連鎖球菌属がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅである、請求項２３に記載の培養培地。
【請求項２５】
前記リン酸源が、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・Ｈ_２Ｏ、ＮａＨ_２ＰＯ_４・Ｈ_２Ｏ、またはＮａＣｌからなる、請求項２３または請求項２４に記載の培養培地。
【請求項２６】
前記炭素源がグルコースである、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の培養培地。
【請求項２７】
前記ビタミン源が、以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの６種類以下からなり、２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の培養培地。
【請求項２８】
前記ビタミン源が、以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの５種類以下からなり、２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の培養培地。
【請求項２９】
前記ビタミン源が、以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの４種類以下からなり、２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の培養培地。
【請求項３０】
前記ビタミン源が、以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの３種類以下からなり、２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の培養培地。
【請求項３１】
前記ビタミン源がパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドからなる、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の培養培地。
【請求項３２】
前記アミノ酸源が、以下の１９種類のアミノ酸のリスト：アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの１９種類以下からなり、１５種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、請求項２３〜３１のいずれか１項に記載の培養培地。
【請求項３３】
前記アミノ酸源が、以下の１９種類のアミノ酸のリスト：アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの１８種類以下からなり、１５種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、請求項２３〜３１のいずれか１項に記載の培養培地。
【請求項３４】
前記アミノ酸源が、以下の１９種類のアミノ酸のリスト：アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの１７種類以下からなり、１５種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、請求項２３〜３１のいずれか１項に記載の培養培地。
【請求項３５】
前記アミノ酸源が、以下の１９種類のアミノ酸のリスト：アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの１６種類以下からなり、１５種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、請求項２３〜３１いずれか１項に記載の培養培地。
【請求項３６】
前記アミノ酸源が、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンからなる、請求項２３〜３１いずれか１項に記載の培養培地。
【請求項３７】
連鎖球菌属菌株、酵母抽出物、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および任意選択で連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む培養培地であって、前記ビタミン源が、以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される４種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない、培養培地。
【請求項３８】
前記連鎖球菌属がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅである、請求項３７に記載の培養培地。
【請求項３９】
前記ビタミン源が、以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される４種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない、請求項３７または請求項３８に記載の培養培地。
【請求項４０】
前記ビタミン源が、以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される３種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない、請求項３７または請求項３８に記載の培養培地。
【請求項４１】
前記ビタミン源が、以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される２種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない、請求項３７または請求項３８に記載の培養培地。
【請求項４２】
前記ビタミン源がビオチンからなる、請求項３７または請求項３８に記載の培養培地。
【請求項４３】
付着性フィルターを用いた濾過工程を含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅから莢膜多糖を精製するための方法。
【請求項４４】
前記莢膜多糖を沈殿させるためのカチオン系デタージェント処理工程、その後の該莢膜多糖の再可溶化工程を含まない、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記付着性フィルターがタンパク質付着性フィルターである、請求項４３または請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記付着性フィルターがカーボンフィルターである、請求項４３〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
付着性フィルターを用いた濾過工程の前に、以下の工程：
（ｉ）夾雑タンパク質および／または核酸のアルコール沈殿；ならびに
（ｉｉ）ダイアフィルトレーション
を行なう、請求項４３〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
付着性フィルターを用いた濾過工程の後に、以下の工程：
（ｉｖ）再−Ｎ−アセチル化；
（ｖ）ダイアフィルトレーション
を行なう、請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
（ａ）莢膜多糖を含む粗製分離物を準備すること；
（ｂ）該粗製分離物をアルコール溶液と接触させることによって形成されたアルコール沈殿物を取り出すこと；
（ｃ）莢膜多糖を保持したまま低分子量化合物を除去するために濾過すること；および
（ｄ）タンパク質付着性フィルターを用いてタンパク質夾雑物を除去し、精製莢膜多糖を生成すること
を含む、精製莢膜多糖の生産方法。
【請求項５０】
さらに、前記精製莢膜多糖を再−Ｎ−アセチル化する工程（ｅ）を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
さらに、前記精製莢膜多糖を沈殿させる工程（ｆ）を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
さらに、前記莢膜多糖を一成分として有するワクチンを製剤化する工程（ｇ）を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
工程（ｂ）が、核酸夾雑物を沈殿させるが莢膜多糖は沈殿させないのに充分な濃度までアルコール溶液を添加することを含む、請求項４９〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記アルコール溶液がエタノールを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記アルコール溶液が、さらにＣａＣｌ_２を含む、請求項５３または請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記アルコール溶液が約１０％と約５０％の間のエタノール濃度まで添加される、請求項５４または請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記アルコール溶液が約３０％のエタノール濃度まで添加される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記タンパク質付着性フィルターが活性炭フィルターである、請求項４９〜５７のいずれか１項に記載の方法。

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図１】

【図２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図４】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図５Ｃ】

【図５Ｄ】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【公表番号】特表２０１１−５０７５０１（Ｐ２０１１−５０７５０１Ａ）
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３８９４７（Ｐ２０１０−５３８９４７）
【出願日】平成２０年１２月１９日（２００８．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／００３７２９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８１２７６
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス　アーゲー (806)
【Ｆターム（参考）】