選択的グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）類似体
ｈ［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２に比較して１つ以上の置換を含み、かつ増大した小腸／結腸および胃／結腸選択性の特性を有し得るＧＬＰ−２類似体を開示する。さらに詳細には、ここに開示する好ましいＧＬＰ−２類似体は、野生型ＧＬＰ−２配列の位置（１１、１６、２０、２４）および／または（２８）の１つ以上の位置における置換を、位置（２）および（３、５、７）のうち１つ以上の位置、および（１０）におけるさらなる置換、および／または（３１）ないし（３３）のうち１つ以上のアミノ酸の欠失および／またはＮ−末端またはＣ−末端安定化ペプチド配列の付加との組み合わせにおいて含む。この類似体は、胃および腸関連疾患の予防または治療、および化学療法の副作用の寛解に特に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選択的グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）類似体およびその医学的使用、例えば胃および腸関連疾患の予防または治療、および、化学療法および／または放射線療法の胃腸に関連した副作用の寛解に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＬＰ−２は、腸の腸管内分泌Ｌ細胞および脳幹の特定領域におけるプログルカゴンの特定の翻訳後プロセシングに由来する３３アミノ酸のペプチドであり、栄養素の摂取に反応して、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、オキシントモジュリン、およびグリセンチンと共に分泌される。
【０００３】
ＧＬＰ−２は陰窩における幹細胞増殖刺激および絨毛のアポトーシスの阻害を通じ、小腸粘膜上皮の有意な増殖を誘導する（Ｄｒｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９６，９３：７９１１−６）。ＧＬＰ−２はまた、結腸に対する増殖効果も有する。ＧＬＰ−２はまた、胃排出および胃酸分泌を阻害し（Ｗｏｊｄｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．１９９９，８４：２５１３−７）、腸のバリア機能を増強し（Ｂｅｎｊａｍｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｕｔ．２０００，４７：１１２−９．）、グルコース輸送体の発現増加を通じた腸ヘキソース輸送を刺激し（Ｃｈｅｅｓｅｍａｎ，．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９７，Ｒ１９６５−７１．）、かつ腸血流を増大させる（Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００３，１２５，１３６−４７）。
【０００４】
ＧＬＰ−２は、クラスＩＩグルカゴンセクレチンファミリーに属する単一のＧタンパク質共役型レセプターに結合する。ＧＬＰ−２レセプターは小腸、結腸および胃、ＧＬＰ−２に反応することが知られている場に発現する（Ｙｕｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２０００，１１９：７４４−５５）。しかしながら、胃腸管内におけるＧＬＰ−２レセプターからの刺激に対する標的細胞は良く分かっておらず、かつＧＬＰ−２レセプターに共役する下流の細胞内メディエーターは良く理解されていない。
【０００５】
小腸におけるＧＬＰ−２の実証された特異的かつ有益な効果は、腸疾患または傷害の治療にＧＬＰ−２を使用することへの大きな関心を引き起こした（Ｓｉｎｃｌａｉｒ ａｎｄ Ｄｒｕｃｋｅｒ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２００５：３５７−６５）。さらに、化学療法誘導性腸炎、虚血再灌流障害、デキストラン硫酸誘導性結腸炎、および炎症性腸疾患の遺伝的モデルを含む腸傷害の多数の前臨床モデルにおいて、ＧＬＰ−２が粘膜上皮損傷を防止または減少させることが示されてきた（Ｓｉｎｃｌａｉｒ ａｎｄ Ｄｒｕｃｋｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２００５：３５７−６５）。
【０００６】
さらに、胃におけるＧＬＰ−２ＲのｍＲＮＡ発現（Ｙｕｓｔａ ｅｔ ａｌ．，２０００）、およびＧＬＰ−２が腸の運動性および胃酸分泌を低下させるという観察（Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）の両者は共に、胃が直接的または間接的にＧＬＰ−２に反応するということの十分な証拠を提供している。それにもかかわらず、ＧＬＰ−２またはＧＬＰ−２類似体の、胃内面の損傷を特徴とする状態における使用についてはまだ探求されていない。
【０００７】
ＧＬＰ−２は、Ｈ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ｌｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ｌｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−ｌｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−ｌｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−ＯＨ、の配列を有する３３アミノ酸ペプチドとして分泌される。酵素ＤＰＰ ＩＶによりＮＨ２末端の位置２のアラニン（Ａ）において迅速に切断され、不活性型のヒトＧＬＰ−２（３−３３）となる。腎クリアランスに加え、この迅速なＧＬＰ−２（１−３３）の分解によってペプチドの半減期は７分間となる（Ｔａｖａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２７８：Ｅ１３４−Ｅ１３９，２０００）。
【０００８】
米国特許第５，９９４，５００号（Ｄｒｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．）に、ＧＬＰ−２のアンタゴニストおよびその胃腸組織の増殖における効果について記載されている。このアンタゴニストは過形成の治療または低形成の誘導に使用するための医薬品として処方されることが提案されており、米国特許第５，９９４，５００号では、ＧＬＰ−２の構造は置換および欠失のような変異により変化させられている。
【０００９】
米国特許第６，１８４，２０８号、５，７８９，３７９号、および６，１８４，２０１号は、ＧＬＰ−２類似体およびその医学的使用を開示している。これらの類似体は全てヒトＧＬＰ−２の置換および／または欠失により得られたものである。
【００１０】
ＤａＣａｍｂｒａら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０００，３９，８８８８−８８９４）は、ＧＬＰ−２活性の構造的な決定要因について記載している。このような決定要因の例として、ＧＬＰ−２レセプターの結合および活性化に決定的であると言われるＰｈｅ６およびＴｈｒ５が挙げられる。
【００１１】
国際公開第９７／３９０３１号に、ＧＬＰ−２類似体である［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２が開示されている。ここでは位置２のアラニン（Ａ）は、ＤＰＰ ＩＶによる切断に抵抗性のペプチドを作製するためグリシンに置換されており、このアラニンの置換によりペプチドの安定性および効力が増大されることが示されている。この特許出願は、ＧＬＰ−２類似体が腸上皮粘膜の炎症および破壊を伴う疾患に対しどのように使用され得るかについて記述している。これらの疾患には、広範囲の小腸切除、炎症性腸疾患、化学療法および／または放射線誘導性腸炎、および虚血性傷害が含まれる。
【００１２】
国際公開第０２／０６６５１１号は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期が延長されたＧＬＰ−２類似体と、それを薬剤として炎症性腸疾患のような胃腸疾患の治療に使用することについて記載している。
【００１３】
国際公開第０１／４１７７９号は、化学療法誘導性のアポトーシスの阻害および小腸上皮細胞の生存を促進するため、前処置としてｈ［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２を使用することについて記載している。
【００１４】
ここに引用した全ての参考文献は、その全体が参照によって明確に組み入れられたものとする。
【００１５】
これまでに様々な疾患の治療におけるＧＬＰ−２またはＧＬＰ−２類似体の使用が多くの科学者により提案されてきた。しかしながらなお、改良され、小腸に選択性のあるＧＬＰ−２類似体が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は大まかには、野生型ＧＬＰ−２に比し１つ以上の置換を含み、結腸に対する小腸選択性が増大した性質、ｉｎ ｖｉｖｏにおける改善された生物活性、および／または改善された化学的安定性（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏでの安定性アッセイにより評価された）を有し得るＧＬＰ−２類似体に関する。さらに詳しくは、本発明の好ましいＧＬＰ−２類似体は、野生型ＧＬＰ−２配列の位置８、１１、１２、１３、１６、１７、１８、２０、２１、２４および／または２８のうち１以上における保存されていない置換と位置２（導入部で述べたように）および位置３、５、７および１０のうち１以上におけるさらなる保存されたまたはされていない置換との任意の組み合わせ、および／または野生型ＧＬＰ−２配列の位置３１から３３に対応する１以上のアミノ酸の置換または欠失、およびＮ−末端またはＣ−末端の安定化ペプチド配列の任意の付加を含む。さらに本発明のＧＬＰ−２類似体は、位置９、１４、および１５に対応するアミノ酸の１以上の保存された置換を含み得る。改善された化学的安定性および／または生物活性を有し得るＧＬＰ−２類似体の提供と同様に、本発明はまた、特に野生型ＧＬＰ−２の位置Ａｓｎ１１および／またはＡｓｎ１６および／またはＡｒｇ２０および／またはＡｓｎ２４および／またはＧｌｎ２８の１つ以上に修飾を含むことにより、結腸に比した小腸、またはその逆における腸の優先的な増殖促進活性を有する化合物の提供にも関する。
【００１７】
従って、１つの局面において本発明は一般式Ｉ
Ｒ１−Ｚ１−Ｈｉｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘ２４−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘ２８−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｚ２−Ｒ２
により表され、
【００１８】
式中、
Ｒ１は水素、Ｃ１−４アルキル（例えばメチル）、アセチル、ホルミル、ベンゾイルまたはトリフルオロアセチルであり、
Ｘ２はＧｌｙ、ＡｌａまたはＳａｒ、
Ｘ３はＧｌｕまたはＡｓｐ、
Ｘ５はＳｅｒまたはＴｈｒ、
Ｘ６はＰｈｅまたはＰｒｏまたは保存された置換、
Ｘ７はＳｅｒまたはＴｈｒ、
Ｘ８はＡｓｐまたはＳｅｒまたは保存された置換、
Ｘ９はＧｌｕまたはＡｓｐまたは保存された置換、
Ｘ１０はＭｅｔ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅまたは酸化的に安定なＭｅｔ−置換アミノ酸、
Ｘ１１はＹ１、
Ｘ１２はＴｈｒまたはＬｙｓまたは保存された置換、
Ｘ１３はＩｌｅ、ＧｌｕまたはＧｌｎまたは保存された置換、
Ｘ１４はＬｅｕ、ＭｅｔまたはＮｌｅまたは保存された置換、
Ｘ１５はＡｓｐまたはＧｌｕまたは保存された置換、
Ｘ１６はＹ２、
Ｘ１７はＬｅｕまたはＧｌｕまたは保存された置換、
Ｘ１８はＡｌａまたはＡｉｂまたは保存されていない置換、
Ｘ１９はＡｌａまたはＴｈｒまたは保存された置換、
Ｘ２０はＹ３、
Ｘ２１はＡｓｐまたはＨｅまたは保存された置換、
Ｘ２４はＹ４、
Ｘ２８はＹ５、
Ｘ３１はＰｒｏ、Ｉｌｅまたは欠失、
Ｘ３２はＴｈｒまたは欠失、
Ｘ３３はＡｓｐ、Ａｓｎまたは欠失、
Ｒ２はＮＨ２またはＯＨであり、
式中、
Ｚ１およびＺ２は独立して存在しないかまたはＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＭｅｔおよびＯｒｎからなる群から選択される１から１０アミノ酸単位のペプチド配列であり、かつ式ＩのＸ１１，Ｘ１６，Ｘ２０，Ｘ２４，Ｘ２８残基のハイドロファティシティ（ｈｙｄｒｏｐｈａｔｉｃｉｔｙ）プロファイル（ＨＰＰ）は、
ＨＰＰ＝Σｈｐｉｘ１１＋ｈｐｉｘ１６＋ｈｐｉＸ２０＋ｈｐｉＸ２４＋ｈｐｉＸ２８は≧−１０であり、
式中、
Ｘ２０がＡｒｇの場合Ｘ１１はＳｅｒであり、Ｘ１６がＡｌａ、Ｘ２４がＡｌａ、Ｘ２８がＡｌａ、およびＺ２がＬｙｓまたは医薬的に許容される塩またはその誘導体である条件下で、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４、およびＹ５は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＭｅｔおよびＰｈｅからなる群から個々に選択でき、かつ
Ｙ３は、Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ｇｌｎ，Ｈｉｓ，Ａｒｇ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｍｅｔ ｏｒ Ｐｈｅからなる群から選択できるＧＬＰ−２類似体を提供する。１つの態様において、本発明は上に述べたようにＨＰＰが≧−４であるグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体を提供する。
【００１９】
別の態様において、本発明は上に述べたようにＨＰＰが≧０であるグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体を含む。
【００２０】
別の局面において、本発明は一般式ＩＩ
Ｒ１−Ｚ１−Ｈｉｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ａｌａ−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘ２４−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘ２８−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｚ２−Ｒ２
により表され、
【００２１】
式中、
Ｒ１は水素、Ｃ１−４アルキル（例えばメチル）、アセチル、ホルミル、ベンゾイルまたはトリフルオロアセチルであり、
Ｘ２はＧｌｙ、ＡｌａまたはＳａｒ、
Ｘ３はＧｌｕまたはＡｓｐ、
Ｘ５はＳｅｒまたはＴｈｒ、
Ｘ６はＰｈｅまたはＰｒｏ、
Ｘ７はＳｅｒまたはＴｈｒ、
Ｘ８はＡｓｐまたはＳｅｒ、
Ｘ９はＧｌｕまたはＡｓｐ、
Ｘ１０はＭｅｔ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅまたは酸化的に安定なＭｅｔ−置換アミノ酸、
Ｘ１１はＡｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ１２はＴｈｒまたはＬｙｓ、
Ｘ１３はＩｌｅ、ＧｌｕまたはＧｌｎ、
Ｘ１４はＬｅｕ、ＭｅｔまたはＮｌｅ、
Ｘ１５はＡｓｐまたはＧｌｕ、
Ｘ１６はＡｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ１７はＬｅｕまたはＧｌｕ、
Ｘ１８はＡｌａまたはＡｉｂ、
Ｘ１９はＡｌａまたはＴｈｒ、
Ｘ２０はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ２１はＡｓｐまたはＩｌｅ、
Ｘ２４はＡｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ２８はＡｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ３１はＰｒｏ、Ｉｌｅまたは欠失、
Ｘ３２はＴｈｒまたは欠失、
Ｘ３３はＡｓｐ、Ａｓｎまたは欠失、
Ｒ２はＮＨ２またはＯＨであり、
Ｘ２０がＡｒｇの場合Ｘ１１はＳｅｒであり、Ｘ１６がＡｌａ、Ｘ２４がＡｌａ、Ｘ２８がＡｌａ、およびＺ２がＬｙｓである条件下で、
Ｚ１およびＺ２は独立して存在しないかまたはＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＭｅｔおよびＯｒｎからなる群から選択される１から１０アミノ酸単位のペプチド配列であるか、または医薬的に許容される塩またはその誘導体であるグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体を提供する。
【００２２】
１つの態様において、本発明は上に述べたように、
Ｘ１１はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ１６はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ２０はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ２４はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ２８はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
であるグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体を含む。
【００２３】
別の態様において、本発明は上に述べたように、
Ｘ１１はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ、
Ｘ１６はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ、
Ｘ２０はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ、
Ｘ２４はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ、
Ｘ２８はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ、
であるグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体を含む。
【００２４】
さらに別の態様において、本発明は上に述べたようにＧＬＰ−２類似体が野生型ＧＬＰ−２（１−３３）に対し少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有し、ｉｎ ｖｉｖｏにおける腸の質量増大の原因となる生物活性を有するグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体を含む。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は上に述べたようにＧＬＰ−２類似体が位置Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４および／またはＸ２８における１以上の置換（即ち、上で述べられた野生型配列に比較して１以上の置換）および／または前記置換のうちの１以上と位置Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７および／またはＸ１０における１以上の置換との組み合わせを有するグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体を含む。
【００２６】
さらに別の態様において、本発明は位置Ｘ１０における置換がＬｅｕ、Ｎｌｅ、またはＭｅｔ（Ｏ）またはＭｅｔ（Ｏ）２のような酸化的に安定なＭｅｔ−置換アミノ酸であるグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体を含む。従って、既に述べた置換に加え、またはそれとは別に、このＧＬＰ−２類似体は位置Ｘ１０にＬｅｕ、Ｎｌｅ、またはＭｅｔ（Ｏ）またはＭｅｔ（Ｏ）２のような酸化的に安定なＭｅｔ−置換アミノ酸を有し得る。
【００２７】
本発明の幾つかの態様において、このＧＬＰ−２類似体は適用の際のバックグラウンドに設定された配列を有する野生型ＧＬＰ−２（１−３３）に対し少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性、さらに好ましくは少なくとも６３％の同一性、さらに好ましくは少なくとも６６％の同一性、さらになお好ましくは少なくとも６９％の同一性を有する。
【００２８】
ＧＬＰ−２ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」とは、最大のパーセント配列同一性を達成するように配列を整列し、かつ必要であればギャップを導入し、かついずれの保存された置換も配列同一性の一部として考慮しなかった後の、野生型ＧＬＰ−２配列のアミノ酸残基と同一な候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。配列の整列は、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２または整列ソフトウェアのような公表されているソフトウェアを用いた公知の方法を用いることにより、熟練者によって行なうことができる。整列プログラムについては、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０（１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄ ｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭ Ｅ，ｈｔｍｌ）またはＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４６，２４，３６，１９９７）およびｈｔｔｐ：／／ｍｏｌｂｉｏｌ．ｓｏｔｏｎ．ａｃ．ｕｋ／ｃｏｍｐｕｔｅ／ａｌｉｑｎ．ｈｔｍｌを参照のこと。
【００２９】
ここで用いられ、かつ本発明に従ったパーセンテージ配列同一性はこれらのプログラムを初期設定で用いることにより決定された。さらに一般的には、熟練者は比較される配列の完全長を超えた最大の整列を達成するために必要ないずれのアルゴリズムをも含む、整列決定のための適切なパラメーターを容易に決定することができる。
【００３０】
本発明の別の態様において、上に述べたＧＬＰ−２類似体は位置Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４、Ｘ２８、Ｘ３１、Ｘ３２および／またはＸ３３に１を超える置換（即ち、上で述べられた野生型配列に比較して１を超える置換）を含む。
【００３１】
本発明のさらに別の態様において、上に述べたＧＬＰ−２類似体はＸ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４、Ｘ２８がＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＶａｌから選択される１以上の置換、および位置Ｘ３１、Ｘ３２およびＸ３３の任意の欠失、または医薬的に許容される塩またはその誘導体を含む。
【００３２】
本発明のさらに別の態様において、上に述べたＧＬＰ−２類似体はＸ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４および／またはＸ２８における１以上の位置において置換（即ち、上で述べられた野生型配列に比較した置換）を含む。
【００３３】
本発明の好ましい態様において、上に述べたＧＬＰ−２類似体は本明細書中の表１または表２に開示されたものであるか、または医薬的に許容される塩またはその誘導体である。
【００３４】
本発明の好ましい態様において、上に述べたＧＬＰ−２類似体は一般式ＩＩＩ、
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｘ８−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｘ１１−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘ２０−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘ２４−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘ２８−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−ＮＨ２；
により表され、
【００３５】
式中、
Ｒ１は水素、Ｃ１−４アルキル（例えばメチル）、アセチル、ホルミル、ベンゾイルまたはトリフルオロアセチルであり、
Ｘ８はＡｓｐまたはＳｅｒ、好ましくはＡｓｐ、
Ｘ１１はＳｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、ＬｙｓまたはＡｓｎ、
Ｘ１５はＧｌｕまたはＡｓｐ、好ましくはＧｌｕ、
Ｘ１６はＳｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｕ、
Ｘ２０はＳｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｕ、
Ｘ２４はＳｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｕ、および
Ｘ２８はＳｅｒ、Ａｌａ、ＧｌｎまたはＧｌｕ、または医薬的に許容される塩またはその誘導体である。
【００３６】
本発明の興味深い化合物（式Ｉ）を以下の表に記載する。ここにおいて、前記の化合物は式ＩＩＩにおいてＲ１として記述したようにＮ−末端において修飾され得て、かつ医薬的に許容される塩またはその誘導体を含む。
【００３７】
【表１】
【００３８】
本発明のさらなる化合物は以下の表１に示される。
【００３９】
本発明は、結腸に比した小腸において優先的な増殖促進活性を有する化合物を提供する。特に、ここに記載した実験は、野生型ＧＬＰ−２の位置Ｘ１１および／またはＸ１６および／またはＡｓｎ２０および／またはＸ２４および／またはＸ２８におけるある置換が、試験動物に投与した際に結腸質量の増大に比べて小腸の重量を優先的に増大させることを示している。これらの発見は、例証された化合物が小腸における増大した増殖促進効果を有するが結腸における効果は少ないことが有利である状況、または小腸が傷害されかつ結腸は傷害されていない状況の治療に有用であり得ることを意味する。
【００４０】
従って、小腸の増殖を優先的に起こす化合物は一般的に野生型ＧＬＰ−２の位置１１、１６、２０、２４および／またはＸ２８に１以上の置換（即ち、上で述べられた野生型配列に比較して）を含む。このような化合物は選択的に結腸よりも小腸の増殖を起こし得る。それ故にこれらは小腸に影響するかまたは関連する状態において使用され得る。
【００４１】
好ましくは、このような小腸選択的化合物はＸ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４、および／またはＸ２８のうちの１を超える位置に置換（即ち、上で述べられた野生型配列に比較して）を含む。従ってこの小腸選択的化合物はＸ１１がＳｅｒ、Ｘ１６がＡｌａ、Ｘ２０、Ｘ２４がＡｌａ、Ｘ２８がＡｌａ、Ｘ３１がＩｌｅ、Ｘ３２がＴｈｒおよびＸ３３がＡｓｐである１を超える置換を含み得る。位置Ｘ３１、Ｘ３２およびＸ３３のアミノ酸残基は任意に欠失され得る。
【００４２】
小腸選択的化合物において、Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４およびＸ２８はそれぞれ独立してＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。
【００４３】
例えば、Ｘ１１およびＸ１６はそれぞれ独立してＡｌａまたはＳｅｒであり得て、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８は独立してＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。
【００４４】
例えば、Ｘ１１およびＸ１６は両者ともＡｌａであり得て、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８は独立してＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。
【００４５】
例えば、Ｘ１１およびＸ１６は両者ともＡｌａであり得て、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８の全ては独立してＡｌａまたはＳｅｒであり得る。
【００４６】
これらの一般的基準に当てはまらないその他の残基の組み合わせもまた小腸選択性を提供し得ることが認められ得る。
【００４７】
位置Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４およびＸ２８における好ましい残基の組み合わせは、Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ； Ａｌａ／Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ； Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ａｌａ； Ａｌａ／Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ａｌａ； Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ； Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ａｒｇ／Ａｌａ／Ａｌａ； Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ａｌａ； Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａを含む。
【００４８】
小腸において上皮の増殖を優先的に刺激する例証された化合物は、ＺＰ２２６４、ＺＰ２２６８、ＺＰ２２４２、ＺＰ２２７２、ＺＰ２４１１、ＺＰ２３８０、ＺＰ２３８４、ＺＰ２３９８、ＺＰ２４１７、ＺＰ２４２３、ＺＰ２３８５、ＺＰ２３９９、ＺＰ２４１８、ＺＰ２３８１、ＺＰ２４２０およびＺＰ２３９７を含む。
【００４９】
本発明はまた、結腸に比した胃における優先的な増殖促進活性を有する化合物にも及ぶ。それ故にこれらは胃に影響するかまたは関連する状態において使用され得る。
【００５０】
好ましくは、このような胃選択的化合物はＸ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４、および／またはＸ２８のうちの１を超える位置に置換（即ち、上で述べられた野生型配列に比較して）を含む。位置Ｘ３１、Ｘ３２およびＸ３３のアミノ酸残基は任意に欠失され得る。
【００５１】
例えば、胃選択的化合物において、
Ｘ１１はＬｅｕ、ＰｈｅまたはＬｙｓであり得る。
Ｘ１６はＬｅｕ、ＰｈｅまたはＬｙｓであり得る。
Ｘ２０はＡｌａまたはＳｅｒであり得る。
Ｘ２４はＡｌａ、ＳｅｒまたはＬｙｓであり得る。
Ｘ２８はＡｌａ、ＳｅｒまたはＬｙｓであり得る。
【００５２】
例えば、Ｘ１１およびＸ１６は独立してＬｅｕまたはＰｈｅであり得て、Ｘ２４およびＸ２８は独立してＬｙｓまたはＳｅｒであり得て、かつＸ２０はＳｅｒであり得る。
【００５３】
例えば、Ｘ１１およびＸ１６は独立してＬｅｕまたはＰｈｅであり得て、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８はＳｅｒであり得る。
【００５４】
これらの一般的基準に当てはまらないその他の残基の組み合わせもまた胃選択性を提供し得ることが認められ得る。
【００５５】
位置Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４およびＸ２８における好ましい残基の組み合わせは、Ｌｙｓ／Ｌｙｓ／Ｌｙｓ／Ｌｙｓ／Ｌｙｓ； Ｐｈｅ／Ｐｈｅ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ； Ｌｅｕ／Ｌｅｕ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ； およびＬｅｕ／Ｌｅｕ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒを含む。
【００５６】
胃において上皮の増殖を優先的に刺激する例示された化合物は、ＺＰ２４００、ＺＰ２４１２、ＺＰ２３９６、ＺＰ２３９５、ＺＰ２３９４およびＺＰ２４０１を含む。
【００５７】
好ましくは、このＧＬＰ−２類似体は以下の実施例７に述べる分解試験の少なくとも１つにおける最初の純度に対し少なくとも７０％の観察された純度を維持する。それに加えまたはそれとは別に、０．１ Ｍ ＨＣｌ溶液中における最初の純度に対し１２日後に少なくとも６０％の観察された純度を維持し得る。それに加えまたはそれとは別に、０．１ Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３溶液中における最初の純度に対し６日後に少なくとも７０％の観察された純度を維持し得る。
【００５８】
本発明の別の局面は、少なくとも１ｎＭのＥＣ５０を有し、それ故にＧＬＰ−２アゴニストとして定義される上に述べたＧＬＰ−２類似体に関する。本化合物は実施例９に述べたように分析された。図５に、ＺＰ２２６４のＥＣ５０をＧＬＰ−２アゴニストの例として示す。
【００５９】
さらなる局面において、本発明はここで定義されるＧＬＰ−２類似体、またはその塩または誘導体の、担体との混合物を含む組成物を提供する。好ましい態様において組成物は医薬的に許容される組成物であり、かつ担体は医薬的に許容される担体である。ＧＬＰ−２ペプチド類似体はＧＬＰ−２類似体の医薬的に許容される酸付加塩であり得る。
【００６０】
１つの態様において、本発明は前記のＧＬＰ−２類似体が注射または点滴による投与に適した液体として処方されるか、または緩慢に放出されるように処方された医薬組成物としての、ここで定義されるＧＬＰ−２類似体の使用に関する。
【００６１】
さらなる局面において、本発明はここで定義されるＧＬＰ−２類似体またはその塩を、治療における使用のために提供する。
【００６２】
本発明はさらに、胃および腸関連疾患を治療および／または予防する薬剤の製剤のための、上に述べられたＧＬＰ−２類似体の使用も提供する。
【００６３】
好ましい態様において本発明は、腸機能に欠陥のある新生児、骨粗鬆症、およびＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ）により媒介される状態の治療のような、胃および腸関連疾患を治療および／または予防する薬剤の製剤のためのＧＬＰ−２類似体またはその塩または誘導体の使用に関する。例として胃および腸関連疾患は、潰瘍、ゾリンジャー・エリソン症候群、胃炎、消化障害、吸収不良症候群、短消化管症候群（ｓｈｏｒｔ−ｇｕｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、カルデサック症候群（ｃｕｌ−ｄｅ−ｓａｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性結腸炎）、セリアックスプルー（例えばグルテン誘導性腸疾患またはセリアック病）、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症スプルー、腸炎、下痢を伴う過敏性腸症候群、小腸損傷、および短腸症候群を含む。
【００６４】
別の好ましい態様において、本発明は前記の胃および腸関連疾患が放射線性腸炎、感染性または後感染性腸炎、または有毒剤またはその他の化学療法剤による小腸損傷である際の、上に述べたＧＬＰ−２類似体の使用に関する。
【００６５】
本発明はさらに、化学療法または放射線治療における副作用を治療および／または予防する薬剤の製剤のための、ここで定義されるＧＬＰ−２類似体の使用を提供する。
【００６６】
前記の化学療法および／または放射線の副作用は、下痢、腹部けいれん、嘔吐、または化学療法による治療に起因する腸上皮の構造的および機能的損傷である。
【００６７】
本発明はさらに新生児、骨粗鬆症、およびＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ）により媒介される状態を治療する薬剤の製剤のための、ここで定義されるＧＬＰ−２類似体の使用を提供する。
【００６８】
本発明はまた、それぞれが任意に医薬的に許容される担体と組み合わされる癌化学療法薬剤および本発明のＧＬＰ−２類似体を含む治療キットを提供する。この２つの治療剤は別々の投与のために別々に包装され得る（例えば別々のバイアルで）か、または１つの組成物として提供され得る。従って本発明はさらに、医薬的に許容される担体と組み合わされた癌化学療法薬剤および本発明のＧＬＰ−２類似体を含む医薬組成物を提供する。
【００６９】
胃腸粘膜新生物、または胃腸粘膜新生物の増大したリスクを有する患者にとって、胃腸粘膜新生物の刺激または悪化のような副作用のリスクを減少または抑止するための化合物の選択が望まれ得る。例えば、結腸新生物（良性または悪性にかかわらず）、または結腸新生物発生のリスクを有する患者を治療する化合物を選択する際、非選択性化合物または小腸より結腸に選択性のある化合物よりも、結腸より小腸に選択性のある化合物を選択することがより適切であり得る。
【００７０】
他の局面において、本発明は栄養障害、例えば消耗症候群、悪液質、食欲不振のような状態を治療および／または予防する薬剤の製剤のためのＧＬＰ−２類似体の使用を提供する。
【００７１】
さらなる局面において、本発明はここで定義されるＧＬＰ−２誘導体をコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する。
【００７２】
さらなる局面において、本発明はその発現を誘導する配列と任意に組み合わされた上記の核酸配列を含む発現ベクター、およびこの発現ベクターにより形質転換されたホスト細胞を提供する。このホスト細胞は好ましくはＧＬＰ−２類似体を発現および分泌することができる。尚、さらなる局面において、本発明はＧＬＰ−２類似体の発現に適切な状態の下でホスト細胞を培養すること、およびそれにより産生されたＧＬＰ−２類似体を精製することを含む、ＧＬＰ−２類似体の産生方法を提供する。
【００７３】
本発明はさらに、治療における使用のための本発明の核酸、本発明の発現ベクター、またはＧＬＰ−２類似体を発現および分泌できる本発明のホスト細胞を提供する。この核酸、発現ベクターおよびホスト細胞は、ＧＬＰ−２類似体それ自体により治療され得るここに記述されたいずれの疾患の治療にも使用され得ることが理解され得る。従って本発明のＧＬＰ−２類似体を含む治療組成物、または本発明のＧＬＰ−２類似体の投与についての参考文献は、文脈がそれ以外のものを要求していない限り、本発明の核酸、発現ベクター、またはホスト細胞の投与を包含するものとして解釈されなければならない。
【００７４】
本発明は１つの態様において、胃または腸関連疾患の治療および／または予防、または化学療法または放射線治療による副作用の治療および／または予防、または新生児、骨粗鬆症、またはＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）により媒介される状態を治療する薬剤の製剤における、ここで定義される核酸分子、発現ベクター、またはホスト細胞の使用に関する。
【００７５】
さらなる局面において、本発明は患者の必要性に応じ、効果的な量の本発明の核酸、発現ベクターまたはホスト細胞を投与することによる胃および腸関連疾患の治療法を提供する。胃および腸関連疾患の例は上記の通りである。
【００７６】
さらなる局面において、本発明は患者の必要性に応じ、化学療法または放射線治療による副作用の治療および／または予防する方法を提供する。この方法は効果的な量の本発明の核酸、発現ベクターまたはホスト細胞の投与を含む。
【００７７】
さらなる局面において、本発明は患者の必要性に応じ、栄養障害、例えば消耗症候群、悪液質、食欲不振のような状態を治療または予防する方法を提供する。この方法は効果的な量の本発明の核酸、発現ベクターまたはホスト細胞の投与を含む。
【００７８】
ここで本発明の態様は実施例として、付随する図への参照に限定されることなく更に詳しく記述され得る。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】リファレンス化合物投与後の溶媒コントロールに対する小腸質量の相対的変化。［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２および化合物ＺＰ２２６４、ＺＰ２２６６−ＺＰ２２６８を８００ｎｍｏｌ／ｋｇ、１日１回、３日間投与した。相対的小腸質量は溶媒を投与された動物の小腸質量を１００％として示す。★：溶媒投与に対しＰ＜０．０５。＄：［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２投与に対しＰ＜０．０５。
【００８０】
【図２】リファレンス化合物投与後の溶媒コントロールに対する小腸質量の相対的変化。［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２および化合物ＺＰ２２４２、ＺＰ２２６９およびＺＰ２２７２を８００ｎｍｏｌ／ｋｇ、１日１回、３日間投与した。相対的小腸質量は溶媒を投与された動物の小腸質量を１００％として示す。★：溶媒投与に対しＰ＜０．０５。＄：［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２投与に対しＰ＜０．０５。
【００８１】
【図３】［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２投与動物に化合物ＺＰ２２６４、ＺＰ２２６６−ＺＰ２２６８を８００ｎｍｏｌ／ｋｇ、１日１回、３日間投与した後の、小腸質量／結腸質量の比の変化。相対的小腸（ＳＩ）質量は溶媒を投与された動物の小腸質量を１００％として示す。＄：［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２ 投与に対しＰ＜０．０５。
【００８２】
【図４】［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２投与動物に化合物ＺＰ２２４２、ＺＰ２２６９、ＺＰ２２７２およびＺＰ２２７１を８００ｎｍｏｌ／ｋｇ、１日１回、３日間投与した後の、小腸質量／結腸質量の比の変化。相対的小腸（ＳＩ）質量は［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２を投与された動物の小腸質量を１００％として示す。＄：［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２投与に対しＰ＜０．０５。
【００８３】
【図５】ＢＨＫ−２１細胞に遺伝子組み換え的に発現されたＧＬＰ−２レセプターに対するＺＰ２２６４のアゴニズムのｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング。ＺＰ２２６４のＩＣ ５０は、アゴニストと定義されるために十分な範囲の３．５５Ｅ−１２であった。
【００８４】
【図６】小腸選択性化合物であるＺＰ化合物の小腸／結腸感受性指数。
【図７】胃選択性化合物であるＺＰ化合物の胃／結腸感受性指数。
【００８５】
【図８】非選択性化合物であるＺＰ化合物の小腸／結腸感受性指数。
【００８６】
発明の詳細な説明
定義
他に特定されない限り、以下の定義は上の記述において使用された特定の用語のために提供されるものである。
【００８７】
本明細書およびクレーム中の全般にわたり自然アミノ酸に対する従来のワンレターおよびスリーレターコードが使用され、同様にサルコシン（Ｓａｒ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、およびα−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）のようなその他のα−アミノ酸に対し一般的に許容されるスリーレターコードも使用される。本発明のペプチドの全てのアミノ酸残基は好ましくはＬ−配置であるが、Ｄ−配置アミノ酸もまた存在し得る。
【００８８】
ここで使用される「保存された置換」は、天然のヒトＧＬＰ−２ペプチド配列のある位置に属するアミノ酸残基が、下の表で定義されるような同じグループ（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、１、２、３）に属するアミノ酸残基と交換されていることを意味する。
【００８９】
【表２】
【００９０】
ここで使用される「保存されていない置換」は、天然のヒトＧＬＰ−２配列のアミノ酸残基のその他の置換、例えば非タンパク質アミノ酸（Ｓａｒ、Ｎｌｅ、Ａｉｂ）による置換または同じグループに属していないアミノ酸による置換のような置換を意味する。
【００９１】
結果としてのアルファヘリックスの片側のｈｙｄｒｏｐｈｏｐｈａｔｉｃプロファイルを記述するため、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）１５７，１０５−１３２）により記述された個々のアミノ酸についての疎水性親水性指標（ｈｐｉｘ）が選択された。本発明において、関心のあるヘリックスの概要はアミノ酸位置Ｘ１１−Ｘ１６−Ｘ２０−Ｘ２４−Ｘ２８により示される。
【００９２】
個々のアミノ酸の疎水性親水性指標（ＨＰＩ）は、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）１５７，１０５−１３２）により導入および定義された疎水性親水性指標、ＨＰＩを用いて記述される。
【００９３】
個々のアミノ酸に対するＨＰＩ値は以下の通りである。
アミノ酸 ＨＰＩ値
Ｉ ４．５
Ｖ ４．２
Ｌ ３．８
Ｆ ２．８
Ｃ ２．５
Ｍ １．９
Ａ １．８
Ｇ −０．４
Ｔ −０．７
Ｗ −０．９
Ｓ −０．８
Ｙ −１．３
Ｐ −１．６
Ｈ −３．２
Ｅ −３．５
Ｑ −３．５
Ｄ −３．５
Ｎ −３．５
Ｋ −３．９
Ｒ −４．５
【００９４】
式Ｉの残基Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４、Ｘ２８の結果としてのハイドロファティシティ（ｈｙｄｒｏｐｈａｔｉｃｉｔｙ）プロファイル（ＨＰＰ）は、ＨＰＰ＝Σｈｐｉｘ１１＋ｈｐｉｘ１６＋ｈｐｉＸ２０＋ｈｐｉＸ２４＋ｈｐｉＸ２８
ＨＰＰ≧−１０
ＨＰＰ≧−４
ＨＰＰ≧０
として計算される。
【００９５】
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４、およびＹ５は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｉｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＭｅｔまたはＰｈｅの群から独立して選択できる。Ｙ３は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｉｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｈｅ、Ｖａｌ、ＭｅｔまたはＰｈｅの群から選択できる。
【００９６】
小腸選択性化合物については、ＨＰＰ≧−１０、−４または０という全体的な基準の中で、位置１１および１６のＨＰＩは独立して−０．８≦ＨＰＩ≦３．８であることが望まれ得る。例えばＨＰＩ＝１．８のような、−０．８≦ＨＰＩ≦２．８である。
【００９７】
位置２０、２４および２８については、ＨＰＩは独立して−０．８≦ＨＰＩ２０，２４，２８≦１．８であることが望まれ得る。例えばＨＰＩ２０，２４，２８＝−０．８のような、−０．８≦ＨＰＩ２０，２４，２８≦１．８である。
【００９８】
従って、Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４およびＸ２８の各位置の残基は独立してＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。
【００９９】
例えば、Ｘ１１およびＸ１６はそれぞれ独立してＡｌａまたはＳｅｒ、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８はＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。例えばＸ１１およびＸ１６はＡｌａ、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８はＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。
【０１００】
位置Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４およびＸ２８における好ましい組み合わせは、Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ａｌａ／Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／ＳｅｒおよびＡｌａ／Ａｌａ／Ｇｌｙ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒを含み得る。
【０１０１】
胃選択性化合物については、ＨＰＰ≧−１０、−４または０という全体的な基準の中で、位置１１および１６のＨＰＩは独立して−３．９≦ＨＰＩ１１，１６≦３．８であることが望まれ得る。例えばＨＰＩ１１，１６は２．８≦ＨＰＩ１１，１６≦３．８であり得るか、またはＨＰＩ１１，１６は−３．９であり得る。
【０１０２】
位置２０、２４および２８については、ＨＰＩは独立して−３．９≦ＨＰＩ２０，２４，２８≦１．８であることが望まれ得る。例えばＨＰＩ２０，２４，２８は−０．８≦ＨＰＩ２０，２４，２８≦１．８であり得るか、またはＨＰＩ２０，２４，２８は−３．９であり得る。
【０１０３】
従って、位置Ｘ１１の残基は、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＬｙｓであり得る。
【０１０４】
位置Ｘ１６の残基は、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、ＬｙｓまたはＴｈｒであり得る。
【０１０５】
位置Ｘ２０の残基は、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。
【０１０６】
位置Ｘ２４の残基は、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。
【０１０７】
位置Ｘ２８の残基は、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。
【０１０８】
例えば、Ｘ１１およびＸ１６は独立してＬｅｕまたはＰｈｅであり得て、Ｘ２４およびＸ２８は独立してＡｌａまたはＳｅｒであり得る。
【０１０９】
本発明の好ましい化合物は、特に腸および胃の増殖の原因となる少なくとも１つのＧＬＰ−２生物活性を有する。これは例えば実施例に記載されているような、試験動物をＧＬＰ−２類似体で処理するか、またはＧＬＰ−２に接触させた後で小腸質量またはその一部を判定するｉｎ ｖｉｖｏアッセイにより評価される。
【０１１０】
本発明のＧＬＰ−２類似体は上で定義されたように、天然ＧＬＰ−２に比較して１以上のアミノ酸置換、欠失、反転、または付加を有する。この定義はまた、同義語であるＧＬＰ−２ミメティクスおよび／またはＧＬＰ−２アゴニストも含む。さらに、本発明の類似体はそのアミノ酸側基、α−炭素原子、末端アミノ基、または末端カルボン酸基の１つ以上にさらなる化学修飾を有し得る。化学修飾は、化学成分の付加、新しい結合の創造、および化学成分の除去を含むがこれらに限定されない。アミノ酸側基の修飾は、リジンε−アミノ基のアシル化、アルギニン、ヒスチジン、またはリジンのＮ−アルキル化、グルタミン酸の、またはアスパラギン酸のカルボン酸基のアルキル化、およびグルタミンまたはアスパラギンの脱アミドを含むがこれらに限定されない。末端アミノ基の修飾は、デスアミノ、Ｎ−低級アルキル、Ｎ−ジ低級アルキル、およびＮ−アシル修飾を含むがこれらに限定されない。末端カルボキシ基の修飾は、アミド、低級アルキルアミド、ジアルキルアミド、および低級アルキルエステル修飾を含むがこれらに限定されない。ここで、低級アルキルは好ましくはＣ１−Ｃ４アルキルである。さらに、１つ以上の側基、または末端基は、当業のペプチド化学者に公知の保護基によって保護され得る。アミノ酸のα−炭素はモノ−またはジ−メチル化され得る。
【０１１１】
それらが存在する際、酸化的に安定なＭｅｔ−置換アミノ酸はＭｅｔ（Ｏ）（メチオニンスルホキシド）、Ｍｅｔ（Ｏ）２（メチオニンスルホン）、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｘ（ＧｌｕまたはＧｌｎ）、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、および好ましくはＬｅｕ、Ｎｌｅ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、およびＧｌｙからなる群から選択されるものを意味する。
【０１１２】
本発明のペプチドはまた、塩またはその他の誘導体の形で提供され得ることが理解されなければならない。塩は、酸付加塩および塩基性塩のような医薬的に許容される塩を含む。酸付加塩の例は、塩酸塩、クエン酸塩、および酢酸塩を含む。塩基性塩の例は、Ｒ３およびＲ４が独立して任意にＣ１−６−アルキルに置換されるか、任意にＣ２−６−アルケニルに置換されるか、任意にアリールに置換されるか、または任意にヘテロアリールに置換される際に、陽イオンがナトリウムおよびカリウムのようなアルカリ金属、カルシウムのようなアルカリ土類金属、およびアンモニウムイオン＋Ｎ（Ｒ３）３（Ｒ４）から選択される塩を含む。その他の医薬的に許容される塩の例は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，１７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄ．Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｅｄ．），Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８５およびより最近の版、および Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに記載されている。
【０１１３】
本発明のＧＬＰ−２類似体のその他の誘導体は、Ｍｎ２＋およびＺｎ２＋のような金属イオンとの配位化合物、ｉｎ ｖｉｖｏでの加水分解性エステルのようなエステル、遊離酸または塩基、水和物、プロドラッグ、または脂質を含む。エステルは化合物中に存在する水酸基またはカルボン酸基と適切なカルボン酸またはアルコール反応パートナーとの間で、公知の方法を用いて形成される。化合物のプロドラッグとしての誘導体は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて親化合物の１つへ変換できる。一般的には、化合物のプロドラッグの形においては、少なくとも１つの生物活性が減少され得て、これは化合物またはその代謝産物の放出のためのプロドラッグの変換により活性化される。プロドラッグの例は、ｉｎ ｓｉｔｕでの放出活性化合物では除去され得るか、またはｉｎ ｖｉｖｏでの薬剤のクリアランスを阻害するために役立つ保護基の使用を含む。
【０１１４】
Ｚ１およびＺ２が存在する際、これらはそれぞれに独立して３−２０または４−２０アミノ酸残基、例えば４−１５の範囲、さらに好ましくは４−１０の範囲特に４−７アミノ酸残基の範囲、例えば６アミノ酸残基のような４、５、６、または７アミノ酸残基のペプチド配列を示す。ペプチド配列Ｚ中のそれぞれのアミノ酸残基は独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｏｒｎから選択され得る。好ましくは、アミノ酸残基はＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ、およびＭｅｔ、同様に国際公開第０１／０４１５６号で定義される式Ｉ内のアミノ酸、例えばＤｂｕ（２，４−ジアミノ酪酸）またはＤｐｒ（２，３−ジアミノプロパン酸）、さらに好ましくはＧｌｕ、Ｌｙｓ、およびＭｅｔ、特にＬｙｓから選択される。上記のアミノ酸はＤ−またはＬ−配置のいずれかを有し得るが、好ましくは上記のアミノ酸はＬ−配置を有する。特に好ましい配列Ｚは、４、５、または６の連続したリジン残基、および特に６の連続したリジン残基である。典型的な配列Ｚは国際公開第０１／０４１５６号に示されている。
【０１１５】
ある態様において、Ｚ１は存在しない。このような場合、Ｚ２は存在してもしなくてもよい。
【０１１６】
少なくとも１ ｎＭのＥＣ５０を有するＧＬＰ−２類似体は、ＧＬＰ−２アゴニストと定義される。
【０１１７】
本発明は以下の実験部分においてさらに記述されるペプチドを含む。
【０１１８】
特に好ましい本発明の化合物はＺＰ２２６４、ＺＰ２２６７、ＺＰ２２６８およびＺＰ２２７０を含む。
【０１１９】
安定性試験
熟練者は、例えば以下の記述に基づき、ＧＬＰ−２類似体の分解産物を検出するための適切な方法（例えば定量法）をデザインすることができる。分解は所定のＧＬＰ−２類似体いずれにおいても、同一性およびアミノ酸の位置、およびｐＨ、溶液および温度の状態に依存し、酸化、加水分解および脱アミドとして起こり得る。化合物は、ストレスとなる条件下（即ち、分解の原因となるような状態）でインキュベートし、続いて未変化のペプチドの含量を分析することによる化学的安定性に従い順位付けられる。さらに、ストレスとなる条件下で得られた主要な分解産物について得られた知識は、その後のいずれの分析法開発にも重要となり得る。
【０１２０】
ＧＬＰ類似体検出のための定量アッセイ
熟練者はまた、ＧＬＰ類似体の哺乳類への投与後の吸収、分布、代謝および排泄を調査するため、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞システムでの機能試験の一部として、複雑な環境または溶液（例えば血漿、尿、組織破砕物、細胞破砕物、唾液または類似物）中のＧＬＰ類似体を検出するための方法（例えば定量法）をデザインできる。
【０１２１】
１つの態様において、定量アッセイはＧＬＰ類似体に対して作られた抗体またはその断片に基づくことができる。免疫された動物から得られた抗体は定量アッセイに使用できる。１つの例において、マルチウェルプレート中に固定された分子の一部に親和性を有する第１抗体を用いて直接サンドウィッチＥＬＩＳＡを用意することができる。その後サンプルをウェルへアプライすると、ＧＬＰ類似体は第一抗体により捕捉される。捕捉されたＧＬＰ類似体はその後、ＧＬＰ類似体の別の部分に親和性を有する第二抗体により認識される。第二抗体は酵素（西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはベータガラクトシダーゼ）または放射性同位元素により標識できる。捕捉されたＧＬＰ類似体の量はその後、発色基質の添加、または放射線放出の直接カウント、またはシンチレーションにより検出できる。また捕捉されたＧＬＰ類似体の量は、第二抗体に親和性を有する標識抗体の添加により間接的に検出できる。サンプル中の濃度は既知の量のＧＬＰ類似体を含んだ外部の検量線から得られる反応により測定できる。またこの抗体は、ＧＬＰ類似体に特異的な抗体をマルチウェルプレートに固定化し、サンプルを予め濃度が決定された標識ＧＬＰ類似体と共にウェル中でインキュベートすることによる直接競合免疫アッセイを準備するために使用できる。標識は酵素、フルオロフォア、放射性同位元素、またはビオチンであることができ、例えば酵素に特異的な基質（例えば比色定量の、蛍光定量の、または化学発光の）、シンチレーション、または酵素に結合したアビジンの使用およびそれに続く上記の検出法により検出できる。結合した標識ＧＬＰ類似体の量は適切な方法により検出でき、かつサンプル中に存在するＧＬＰ類似体の濃度は、上で述べたように外部検量線から得られた反応に由来する。
【０１２２】
他の態様において、定量アッセイは液体クロマトグラフィータンデム質量分析法に基づくことができる。このようなセットアップにおいて、研究されるべきＧＬＰ類似体に特異的な断片からの反応は、不活性ガス（ＨｅまたはＡｒ）との衝突により誘導される親化合物の断片化においてモニターされる。断片化に先立ち、サンプル成分は逆相クロマトグラフィーにより分離することができるか、あるいはサンプルは直接質量分析計中に注入できる。サンプルは、それが適切であれば前処理（即ち、プロテアーゼ阻害剤の添加、タンパク質沈殿、固相抽出、免疫親和性抽出など）される。上に述べたように、外部の検量線から得られる反応に由来するサンプル中に存在するＧＬＰ類似体の濃度は、可能性としてＧＬＰ類似体と類似の内部標準物質を用いた補正の後に研究される。
【０１２３】
特異的抗体の産生
ＧＬＰ類似体に対する特異的抗体またはその断片は哺乳類において誘導することができ、かつ血清より精製できる。ＧＬＰ類似体または断片は直接アジュバントと共にウサギ、マウスまたはその他の哺乳類の免疫に使用できるか、またはＧＬＰ類似体またはその断片は担体分子（即ち、キーホールリンペットヘモシアニン、卵白アルブミン、アルブミンなど）に化学的に結合できアジュバントと共に注射できる。抗体の親和性および選択性を良くするため、注射は２−４週間の間隔で、延長された期間繰り返すことができる。ポリクローナル抗体は血清から直接回収できる。モノクローナル抗体を得るため、免疫動物、好ましくはマウスから分離されたＢ細胞は抗体産生ハイブリドーマを形成するために腫瘍細胞と融合されなければならない。適切なクローンおよび抗体のスクリーニングと選択は、固定化されたＧＬＰ類似体またはそのペプチドの使用とそれに続く標識抗体による検出により行うことができる。あるいは、スクリーニングと選択は、固定化された抗体とそれに続く標識ＧＬＰ類似体またはその断片による検出に基づき行うことができる。全てのケースにおいて標識は放射性同位元素、酵素、フルオロフォア、またはビオチンであり得て、例えば酵素に特異的な基質（例えば比色定量の、蛍光定量の、または化学発光の）、シンチレーション、または酵素に結合したアビジンの使用およびそれに続く記述された検出法により検出できる。
【０１２４】
ＧＬＰ−２類似体の合成
本発明の類似体は固相または液相のペプチド合成により合成されることが好ましい。この状況において、国際公開第９８／１１１２５号および、とりわけＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）の中のＦｉｅｌｄｓ，ＧＢ ｅｔ ａｌ．，２００２，“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、およびここでの実施例が参考となる。
【０１２５】
従ってＧＬＰ−２類似体は例えば、
【０１２６】
（ａ）ペプチドを固相または液相のペプチド合成により合成し、その合成ペプチドを回収により得ること、または
【０１２７】
（ｂ）ペプチドが天然アミノ酸から構成される場合、そのペプチドをコードする核酸コンストラクトをホスト細胞内で発現させ、ホスト細胞培養から発現産物を回収すること、または
【０１２８】
（ｃ）ペプチドが天然アミノ酸から構成される場合、そのペプチドをコードする核酸コンストラクトの無細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現を達成し、発現産物を回収すること、または
【０１２９】
ペプチドの断片を得るため（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の方法を組み合わせ、続いてペプチドを得るため断片を連結し、ペプチドを回収することを含む方法、を含む多数の方法により合成され得る。
【０１３０】
従って、本発明の幾つかの類似体にとっては、遺伝子工学技術の活用が有利であり得る。これはペプチドが十分に大きく（または融合コンストラクトとして産生され）、かつそのペプチドが生体中でＲＮＡから翻訳される天然アミノ酸のみを含む際に事例となり得る。
【０１３１】
組み換え遺伝子技術の目的のためには、本発明のペプチドをコードする核酸断片は重要な化学産物である。従って、本発明のさらなる局面は、ペプチドが好ましくは天然アミノ酸から構成される本発明のＧＬＰ−２誘導体をコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する。本発明の核酸断片はＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片のいずれかである。
【０１３２】
本発明の核酸断片は通常クローニングまたは発現ベクターを形成するため適切なベクターに挿入され得て、このような新規のベクターもまた本発明の一部である。本発明のこれらのベクターの構築に関する詳細は、以下、細胞および微生物の形質転換に関連して考察される。ベクターは目的および応用のタイプに応じ、プラスミド、ファージ、コスミド、ミニ染色体、またはウィルスであることができるが、ある細胞に一過性にのみ発現されるネイキッドＤＮＡもまた重要なベクターである。本発明の好ましいクローニングベクターおよび発現ベクター（プラスミドベクター）は自律複製でき、それにより高レベル発現、または後のクローニングのための高レベル複製を目的とした高コピー数を可能にする。
【０１３３】
本発明のベクターの一般的な概要は５’から３’への方向における機能的結合において以下の特徴、即ち本発明の核酸断片の発現を駆動するためのプロモーター、任意に分泌を可能にする（細胞外相（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈａｓｅ）へ、またはそれが適用される際には周辺質内へ）リーダーペプチドまたは複数の用途、例えば混合性の分泌のためのリーダーペプチドをコードする核酸配列、精製タグおよびペプチドの補正またはポリペプチド断片の膜への融合を目的とした酵素による整形（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｔｒｉｍｍｉｎｇ）、本発明のペプチドをコードする核酸断片、および任意に、転写終結区をコードする核酸配列を含む。産生菌種または細胞株中で発現ベクターを操作する際には形質転換細胞の遺伝的安定の目的のため、ホスト細胞中に導入されたベクターはホスト細胞のゲノムに組み込まれることが好ましい。
【０１３４】
本発明のベクターは、ホスト細胞を形質転換して本発明の修飾ペプチドを産生するために使用される。
本発明の一部でもあるこのような形質転換細胞は、本発明の核酸断片およびベクターの増殖のために使用されるか、または組み換え型の本発明のペプチドの産生のために使用される培養細胞または細胞株であることができる。
【０１３５】
本発明の好ましい形質転換細胞は細菌（エシェリキア（例えば結腸菌）、バチルス（例えば枯草菌）、サルモネラ、またはマイコバクテリウム（好ましくはウシ型弱毒結核菌のような非病原性のもの）などの種）、酵母（出芽酵母など）、および原生動物のような微生物である。また、形質転換細胞は多細胞生物由来、即ち真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、または哺乳類細胞であり得る。ヒト由来の細胞もまた興味深い（細胞株およびベクターについての下記の考察を参照）。クローニングおよび／または最適化された発現の目的のために、形質転換細胞は本発明の核酸断片を複製する能力のあることが好ましい。核酸断片を発現する細胞は本発明の有用な態様として好ましく、それらは本発明のペプチドをスモールスケールまたはラージスケールで調整するために使用できる。
【０１３６】
形質転換細胞によって本発明のペプチドを産生する際、発現産物が培養液中に排出されるかまたは形質転換細胞の表面に輸送されることは必須ではないが好都合である。
【０１３７】
効果的な産生細胞が同定された際、それ自体に基づいた、本発明のベクターを有しかつペプチドをコードする核酸断片を発現する安定化細胞株を樹立することが好ましい。
【０１３８】
一般に、ホスト細胞に適合する種由来のレプリコンおよび制御配列を含むプラスミドベクターは、ホスト細胞との関連において使用される。通常、ベクターは複製部位を有し、同様に形質転換細胞における表現型の選択を可能にする標識配列を有する。例えば結腸菌は一般に結腸菌種由来の（例えばＢｏｌｉｖａｒ ｅｔ ａｌ．，１９７７を参照のこと）ｐＢＲ３２２（しかし、その他にも多数の有用なプラスミドが存在する）を用いて形質転換される。ｐＢＲ３２２プラスミドはアンピシリンおよびテトラサイクリンの耐性遺伝子を含んでおり、そのために形質転換細胞の同定を容易にする。ｐＢＲプラスミド、またはその他の微生物プラスミドまたはファージは、発現のために原核微生物により使用することのできるプロモーターを含むか、あるいはプロモーターを含むように改変されていなければならない。
【０１３９】
これらの原核生物組み換えＤＮＡ構築において最も一般的に使用されるプロモーターは、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーターシステム（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９７８；ｌｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９７７； Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９７９）、およびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９７９；ＥＰ００３６７７６Ａ）を含む。これらは最も一般的に使用されるが、その他の微生物プロモーターも発見されかつ利用されており、当業者がそれらをプラスミドベクターに機能的に連結することを可能にするヌクレオチド配列に関する詳細は公表されている（Ｓｉｅｂｗｅｎｌｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９８０）。
【０１４０】
原核生物に加え、酵母培養のような真核微生物もまた使用され、そのプロモーターもまた発現を駆動することができなければならない。真核微生物の多数の種が利用可能であるが、中でも出芽酵母、または一般のパン酵母が最も一般的に使用される。出芽酵母内での発現には、例えばＹＲｐ７プラスミドが一般的に使用される（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．，１９７９；Ｋｉｎｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９７９；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０）。このプラスミドは予め、トリプトファン中で増殖できない変異酵母種、例えばＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，１９７７）に対して選択マーカーを提供するｔｒｐ１遺伝子を含んでいる。酵母ホスト細胞ゲノムの特徴である破壊されたｔｒｐ１は、トリプトファン非存在下での増殖により形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。
【０１４１】
酵母ベクターにおける適切なプロモーター配列は３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８０）、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸脱炭酸酵素、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、およびグルコキナーゼのようなその他の糖分解酵素（Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９６８；Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９７８）のためのプロモーターを含む。適切な発現プラスミドの構築において、これらの遺伝子に付随する終止配列もまた、ｍＲＮＡのポリアデニル化および終止を提供するための発現が望まれるベクターの３’配列に連結される。
【０１４２】
増殖条件により制御される転写のさらなる利点を有するその他のプロモーターは、アルコール脱水素酵素２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に付随する分解酵素、および前述のグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、およびマルトースおよびガラクトース利用原因酵素のためのプロモーター領域である。酵母適合性のプロモーター、複製開始点および終結配列を含むいずれのプラスミドベクターも適切である。
【０１４３】
微生物に加え、多細胞生物由来細胞の培養もまたホストとして試用され得る。原理的にはこのような細胞培養のいずれもが、脊椎動物培養または無脊椎動物培養由来にかかわらず機能する。しかしながら脊椎動物細胞への関心は最も高く、近年脊椎動物の培養における増殖（組織培養）は日常的な方法となりつつある（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９７３）。このように有用なホスト細胞株の例として、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、およびＷ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７ ２９３、ヨトウガ（ＳＦ）細胞（完全な発現システムとして、ｉ．ａ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１０００ リサーチパークウェイ、メリデン、コネチカット ０６４５０、米国、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（私書箱 ２３１２、９７０４ ＣＨ フローニンゲン、オランダ）から市販されているキイロショウジョウバエ細胞株Ｓ２、およびＭＤＣＫ細胞株が挙げられる。
【０１４４】
このような細胞のための発現ベクターは通常（必要であれば）複製開始点、発現されるべき遺伝子の前に位置するプロモーター、必要ないずれかのリボゾーム結合部位に加え、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列を含む。
【０１４５】
哺乳類細胞での使用において、発現ベクターの制御機能はしばしばウィルス性の材料により提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターはポリオーマウィルス、アデノウィルス２、および最も頻繁にはシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）由来である。ＳＶ４０ウィルスの初期および後期プロモーターは、両者共に断片としてＳＶ４０ウィルス性複製開始点を含むウィルスより容易に得られることから特に有用である（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９７８）。比較的小さな、または大きなＳＶ４０断片もまた使用され得て、ここに提供されたものはウィルス性複製開始点に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位に及ぶ約２５０ ｂｐの配列に含まれる。さらに、プロモーターおよび望まれる遺伝子配列に通常付随する制御配列を利用することも可能かつしばしば望まれることであり、提供されたこのような制御配列はホスト細胞システムに適合する。
【０１４６】
複製開始点は、ＳＶ４０またはその他のウィルス（例えばポリオーマウィルス、アデノウィルス、ＶＳＶ、ＢＰＶ）から由来し得るような、外部からの開始点を含むベクターの構築またはホスト細胞の染色体複製メカニズムにより提供され得る。ベクターがホスト細胞染色体に取り込まれるのであれば、しばしば後者が十分である。
【０１４７】
組み換え体産生の過程において十分な収量を得るためには、ペプチドとアフィニティータグ（精製を容易にするための）として役立つ融合パートナーとの融合および／またはペプチドの複数反復を有することにより、この類似体を融合タンパク質として調整することが有利であり得る。これらの方法はペプチダーゼのための適切な切断部位の存在を必要とするが、熟練者は基礎となる遺伝的コンストラクトをどのように作製するかを知り得る。
【０１４８】
組み換え調整の後、本発明のペプチドは多段階クロマトグラフィー（イオン交換、サイズ排除、およびアフィニティークロマトグラフィー法）を含む公知の方法により精製できる。
【０１４９】
また、天然アミノ酸を含むペプチドはｉｎ ｖｉｔｒｏの無細胞システムにより調整できる。これは、ペプチドが想定されたホスト細胞に有毒であり得る場合に特に好都合である。従って、本発明は本発明のペプチドを調整するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏ無細胞翻訳／発現の利用もまた企図する。この状況において、例えばＡｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．（２１３０ウッドワード、オースティン、テキサス７８７４４−１８３２、米国）からの市販のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳キット、材料、および技術文書が参考となる。
【０１５０】
最後に、利用可能な方法は言うまでもなく、例えば半合成の類似体を調整するために組み合わせることができる。このようなセットアップにおいて、ペプチド断片は少なくとも２つの異なった工程または方法の使用により調整され、最終ペプチド産物を得るための断片の連結がそれに続く。
【０１５１】
医薬組成物および投与
本発明のＧＬＰ−２類似体またはその塩または誘導体は、保存または投与のために調整された医薬組成物として処方され得て、これは治療上効果的な量の本発明のＧＬＰ−２類似体ペプチドまたはその塩または誘導体を医薬的に許容される担体中に含む。
【０１５２】
本発明の化合物の治療上効果的な量は、投与経路、治療される哺乳類の型、および検討中の特定の哺乳類の身体的特徴に依存し得る。この量を決定するための、これらの要素およびその関連性は医学当業者に周知である。この量および投与方法は、ペプチドの大腸への送達に最適な効率を達成するため調整できるが、医学当業者に周知の要素である体重、食餌、併用される薬剤、およびその他の要素に依存し得る。
【０１５３】
胃および腸関連疾患を治療または予防するために効果的な量のＧＬＰ−２類似体またはその塩が存在する医薬組成物の提供は、本発明の範囲内である。
【０１５４】
本発明の化合物の酸性成分を有する医薬的に許容される塩は、有機または無機塩基を用いて形成できる。塩基により形成される適切な塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩のような金属塩、例えばナトリウム、カリウム、またはマグネシウム塩；モルホリン、チオモルホリン、ピペリジン、ピロリジン、モノ−、ジ−、またはトリ−低級アルキルアミン（例えば、エチル−ｔｅｒｔ−ブチル−、ジエチル−、ジイソプロピル−、トリエチル−、トリブチル−、またはジメチルプロピルアミン）、またはモノ−、ジ−、またはトリヒドロキシ低級アルキルアミン（例えば、モノ−、ジ−、またはトリエタノールアミン）により形成されるようなアンモニア塩および有機アミン塩を含む。内部塩もまた形成され得る。同様に、本発明の化合物が塩基成分を含む際、塩は有機および無機酸を用いて形成できる。例えば、塩は下記の酸、即ち酢酸、プロピオン酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、マロン酸、マンデル酸、リンゴ酸、フタル酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、メタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、およびカンファースルホン酸、同様にその他の公知の医薬的に許容される酸から形成できる。アミノ酸付加塩もまた、リジン、グリシン、またはフェニルアラニンのようなアミノ酸により形成できる。
【０１５５】
医学当業者にとって明らかであるように、本発明のペプチドまたは医薬組成物の「治療上効果的な量」とは、年齢、体重、および治療される哺乳類の種、使用される特定の化合物、特定の投与方法、および望まれる効果、および治療上の指示に依存して変化し得る。この量を決定するための、これらの要素およびそれらの関連性は医学分野において公知であるため、治療上有効な量のレベル、ここに述べられた腸および胃関連疾患の予防および／または治療において望まれる結果を達成するために必要な量の決定、同様にここに開示されたその他の医学的指示は、熟練者の領域であり得る。
【０１５６】
ここで用いられる「治療上有効な量」とは、所定の状態または病態による症状を減少させる量、および好ましくはその状態または病態を有する個体の生理反応を正常化させる量である。症状の減少または生理反応の正常化は当業における日常的方法を用いて決定でき、所定の状態または病態により変化し得る。１つの局面において、１以上のＧＬＰ−２類似体または１以上のＧＬＰ−２類似体を含む医薬組成物の治療上効果的な量は、測定できる生理的パラメーターを、その状態または病態を持たない個体のパラメーターに対し実質的に同じ値（好ましくはその値の＋３０％以内、さらに好ましくは＋２０％以内まで、およびさらに尚好ましくは＋１０％以内まで）に回復させる量である。
【０１５７】
本発明の１つの態様において、本発明の化合物または医薬組成物の投与は低用量レベルから開始され、腸および胃関連疾患のような関連する医学的徴候の予防／治療に望まれる効果が達成されるまで増大される。これが治療上効果的な量として定義され得る。本発明のペプチドに関しては単独または医薬組成物の一部として、この量は体重当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇないし１０ｍｇ／ｋｇのような、体重当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇ、例えば体重当たり１０−１００μｇ／ｋｇであり得る。
【０１５８】
治療に使用するために選択されたＧＬＰ−２類似体は、医薬的に許容されかつ選択された投与経路によるペプチドの送達に適切な担体と共に処方される。本発明の目的のための末梢の非経口投与は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内の投与経路を含む。本発明で使用される特定の化合物は、経口、経直腸、経鼻、または経下気道経路による投与も許容され得る。これらはいわゆる非−非経口経路（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｒｏｕｔｅ）である。本医薬組成物は、本発明のＧＬＰ−２類似体またはその塩または誘導体、および医薬的に許容される担体を含む。医薬的に許容される適切な担体は希釈剤、賦形剤等のような、ペプチドを基礎とする薬剤に従来から用いられているものである。治療に使用するための医薬的に許容される担体は医薬分野において公知であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ．１９８５）に記載されている。例えば、わずかに酸性、または生理的なｐＨの滅菌生理食塩水およびリン酸緩衝食塩水が使用され得る。ｐＨ緩衝剤はリン酸、クエン酸、酢酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、重炭酸アンモニウム、ジエタノールアミン、好ましい緩衝液としてのヒスチジン、アルギニン、リジン、または酢酸塩またはそれらの混合物であり得る。好ましい緩衝液の範囲は、ｐＨ４−８、ｐＨ６．５−８、さらに好ましくはｐＨ７−７．５である。パラ、メタ、およびオルトクレゾール、メチル−およびプロピルパラベン、フェノール、ベンジルアルコール、安息香酸ナトリウム、安息香酸、安息香酸ベンジル、ソルビン酸、プロパン酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルのような保存料がこの医薬組成物中に提供され得る。アスコルビン酸、メチオニン、トリプトファン、ＥＤＴＡ、アスパラギン、リジン、アルギニン、グルタミンおよびグリシンのような、酸化、脱アミド、異性化、ラセミ化、環化、ペプチドの加水分解を防ぐ安定剤がこの医薬組成物中に提供され得る。ドデシル硫酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、シクロデキストリンのような、凝集、繊維形成および沈殿を防ぐ安定剤がこの医薬組成物中に提供され得る。エタノール、酢酸または酢酸塩およびそれらの塩のような可溶化のための、または凝集を防ぐための有機修飾剤がこの医薬組成物中に提供され得る。塩、例えば塩化ナトリウム、または最も好ましい炭水化物、例えばデキストロース、マンニトール、乳糖、トレハロース、ショ糖またはそれらの混合物のような等張性供給物（ｉｓｏｔｏｎｉｃｉｔｙ ｍａｋｅｒｓ）がこの医薬組成物中に提供され得る。
【０１５９】
Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、ＳＤＳ、ポロクサマー、例えばプルロニックＦ−６８、プルロニックＦ−１２７のような界面活性剤がこの医薬組成物中に提供され得る。色素および香味料までもがこの医薬組成物中に提供され得る。他の態様において、ＧＬＰ−２ペプチド類似体の医薬的に許容される酸付加塩が提供される。懸濁剤が使用され得る。エタノール、第３級ブタノール、２−プロパノール、エタノール、グリセロール、ポリエチレングリコールのような有機修飾剤が、凍結乾燥製品の凍結乾燥のための薬理的処方において提供され得る。増量剤、および塩、例えば塩化ナトリウム、炭水化物、例えばデキストロース、マンニトール、乳糖、トレハロース、ショ糖またはそれらの混合物、アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン酸塩のような等張性供給物（ｉｓｏｔｏｎｉｃｉｔｙ ｍａｋｅｒｓ）、またはシステイン、レシチンまたはヒト血清アルブミン、またはそれらの混合物のような賦形剤が、凍結乾燥のためにこの医薬組成物中に提供され得る。
【０１６０】
本発明の医薬組成物は経口投与のための錠剤、カプセル剤またはエリキシル剤、直腸投与のための坐薬、注射投与のための好ましくは無菌溶液、無菌粉末または懸濁液等として処方されかつ使用され得る。投与の用量および方法は最適な効率を達成するため調整できるが、体重、食餌、併用される薬剤、およびその他の要素としての、医学当業者が認識し得るこれらの要素に依存し得る。
【０１６１】
投与が静脈内投与および皮下投与のように非経口で、例えば毎日投与される際、注射用医薬組成物は従来の形、水溶液または懸濁液のいずれか、凍結乾燥剤、使用直前の再構成または注射に先立つ液体への懸濁に適切な固形剤、または乳剤として調整できる。
【０１６２】
凍結乾燥製品の再構成のための希釈液は上記のリストからの適切な緩衝液、水、生理食塩水、デキストロース、マンニトール、乳糖、トレハロース、ショ糖、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウム、システイン塩酸塩、またはＴｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、ポロクサマー、例えばプルロニックＦ−６８またはプルロニックＦ−１２７のような界面活性剤、ポリエチレングリコール、および／またはパラ、メタ、およびオルトクレゾール、メチル−およびプロピルパラベン、フェノール、ベンジルアルコール、安息香酸ナトリウム、安息香酸、安息香酸ベンジル、ソルビン酸、プロパン酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルのような保存料、および／またはエタノール、酢酸、クエン酸、乳酸またはそれらの塩のような有機修飾剤を加えた注射用の水であり得る。
【０１６３】
さらに、所望されれば、この注射用医薬組成物は湿潤剤、またはｐＨ緩衝剤のような無毒の補助物質を微量含み得る。吸収促進製剤（例えば、リポソーム、界面活性剤および有機酸）が利用され得る。
【０１６４】
本発明の１つの態様において、この化合物は、例えば完全非経口栄養を受けている患者（例えば新生児、または悪液質または食欲不振を患う患者）に液体栄養補助剤として使用する際の点滴による投与のため、または例えば皮下、腹腔内、または静脈内への注射による投与のために処方され、従って無菌で発熱物質を含まない形の、かつ生理的に許容されるｐＨ、例えばわずかに酸性または生理的ｐＨに適宜緩衝された水溶液として利用される。筋肉内投与のための処方は溶液、または植物油、例えばキャノーラ油、コーン油、または大豆油への懸濁液に基づき得る。これらの油を基礎とした処方は、抗酸化物質例えばＢＨＡ（ブチル化ヒドロキシアニソール）およびＢＨＴ（ブチル化ヒドロキシトルエン）により安定化され得る。
【０１６５】
従って、本ペプチド化合物は蒸留水または生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、５％デキストロース溶液または油のような溶媒において投与され得る。ＧＬＰ−２類似体の溶解度は、所望されれば界面活性剤および乳化剤のような溶解度賦活薬の取り込みにより増強され得る。
【０１６６】
ＧＬＰ−２類似体の作用が望まれる場で緩慢に放出されるように、注射液に水性の担体または溶媒を、ＧＬＰ−２類似体を注射部位またはそれに近い部位に蓄えるために役立つ量のゼラチンと共に補うことができる。ヒアルロン酸のような別のゲル化剤も持続性薬剤として有用であり得る。
【０１６７】
本発明の１つの態様における処方は溶液中に、ａ．最終濃度が０．５ｍＭから３００ｍＭ、好ましくは３から２００ｍＭ、最も好ましくは２０から１００ｍＭになるよう水に溶解したＬ−ヒスチジン、ｂ．３５０ｍＭまで、好ましくは３０から３００ｍＭ、最も好ましくは１００ｍＭから２３０ｍＭのマンニトール、およびｃ．２００ｍＭまで、好ましくは０．０５から１００ｍＭ、最も好ましくは０．５から５０ｍＭの酢酸を含む。適切な量の治療化合物が、１から１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５から５０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは１０から３０ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう添加される。最終ｐＨは４から８、好ましくは６．５から７．５、最も好ましくは６．７から７．３に調整される。得られた溶液は目的の重量に調節され、滅菌フィルターを通した後、薬剤としての使用のためバイアル中に適切な分量で分注される。この処方は更に、液体製品または凍結乾燥製品へと加工される。
【０１６８】
本発明の別の態様における処方は溶液中に、ａ．最終濃度が０．５ｍＭから３００ｍＭ、好ましくは３から２００ｍＭ、最も好ましくは２０から１００ｍＭのＬ−ヒスチジンになるよう水に溶解したＬ−ヒスチジン、ｂ．２００ｍＭまで、好ましくは０．５から１００ｍＭ、最も好ましくは５ｍＭから５０ｍＭのＬ−アルギニン、ｃ．３５０ｍＭまで、好ましくは３０から３００ｍＭ、最も好ましくは１００から２３０ｍＭのマンニトール、およびｄ．２００ｍＭまで、好ましくは０．０５から１００ｍＭ、最も好ましくは０．５から５０ｍＭの酢酸を含む。適切な量の治療化合物が、１から１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５から５０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは１０から３０ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう添加される。最終ｐＨは４から８、好ましくは６．５から７．５、最も好ましくは６．７から７．３に調整される。得られた溶液は目的の重量に調節され、滅菌フィルターを通した後、薬剤としての使用のためバイアル中に適切な分量で分注される。この処方は更に、液体製品または凍結乾燥製品へと加工される。
【０１６９】
さらに本発明の別の態様における処方は溶液中に、ａ．最終濃度が２００ｍＭまで、好ましくは３から１００ｍＭ、最も好ましくは５から５０ｍＭのＬ−ヒスチジンになるよう水に溶解したＬ−ヒスチジン、ｂ．２００ｍＭまで、好ましくは０．５から１００ｍＭ、最も好ましくは５ｍＭから５０ｍＭのＬ−アルギニン、ｃ．３５０ｍＭまで、好ましくは３０から３００ｍＭ、最も好ましくは１００から２３０ｍＭのマンニトール、およびｄ．２００ｍＭまで、好ましくは０．０５から１００ｍＭ、最も好ましくは０．５から５０ｍＭの酢酸を含む。
【０１７０】
適切な量の治療化合物が、１から１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５から５０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは１０から３０ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう添加される。
【０１７１】
最終ｐＨは４から８、好ましくは６．５から７．５、最も好ましくは６．７から７．３に調整される。得られた溶液は目的の重量に調節され、滅菌フィルターを通した後、薬剤としての使用のためバイアル中に適切な分量で分注される。この処方は更に、液体製品または凍結乾燥製品へと加工される。
【０１７２】
尚、さらに本発明の別の態様における処方は溶液中に、ａ．最終濃度が．０．５から３００ｍＭまで、好ましくは３から２００ｍＭ、最も好ましくは２０から１００ｍＭのＬ−ヒスチジンになるよう水に溶解したＬ−ヒスチジン、ｂ．２００ｍＭまで、好ましくは０．５から１００ｍＭ、最も好ましくは５ｍＭから５０ｍＭのＬ−アルギニン、ｃ．３５０ｍＭまで、好ましくは３０から３００ｍＭ、最も好ましくは１００から２３０ｍＭのマンニトール、およびｄ．２００ｍＭまで、好ましくは０．０５から１００ｍＭ、最も好ましくは０．５から５０ｍＭの酢酸を含む。
【０１７３】
適切な量の治療化合物が、１から１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５から５０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは１０から３０ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう添加される。
【０１７４】
最終ｐＨは４から８、好ましくは６．５から７．５、最も好ましくは６．７から７．３に調整される。得られた溶液は目的の重量に調節され、滅菌フィルターを通した後、薬剤としての使用のためバイアル中に適切な分量で分注される。この処方は更に、液体製品または凍結乾燥製品へと加工される。
【０１７５】
尚、さらに本発明の別の態様における処方は溶液中に、ａ．最終濃度が２００ｍＭまで、好ましくは３から１００ｍＭ、最も好ましくは５から５０ｍＭのＬ−ヒスチジンになるよう水に溶解したＬ−ヒスチジン、ｂ．２００ｍＭまで、好ましくは０．５から１００ｍＭ、最も好ましくは５ｍＭから５０ｍＭのＬ−アルギニン、ｃ．３５０ｍＭまで、好ましくは３０から３００ｍＭ、最も好ましくは１００から２３０ｍＭのマンニトール、およびｄ．２００ｍＭまで、好ましくは０．０５から１００ｍＭ、最も好ましくは０．５から５０ｍＭの酢酸を含む。
【０１７６】
適切な量の治療化合物が、１から１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５から５０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは１０から３０ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう添加される。
【０１７７】
最終ｐＨは４から８、好ましくは６．５から７．５、最も好ましくは６．７から７．３に調整される。得られた溶液は目的の重量に調節され、滅菌フィルターを通した後、薬剤としての使用のためバイアル中に適切な分量で分注される。この処方は更に、液体製品または凍結乾燥製品へと加工される。
【０１７８】
尚、さらに本発明の別の態様において処方は、ａ．最終濃度が２００ｍＭまで、好ましくは０．５から１００ｍＭ、最も好ましくは５から５０ｍＭのＬ−ヒスチジンになるよう水に溶解したＮ−アセテート、ｂ．３５０ｍＭまで、好ましくは３０から３００ｍＭ、最も好ましくは１００から２３０ｍＭのマンニトールを含む。
【０１７９】
適切な量の治療化合物が、１から１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５から５０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは１０から３０ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう添加される。
【０１８０】
最終ｐＨは４から８、好ましくは６．５から７．５、最も好ましくは６．７から７．３に調整される。得られた溶液は目的の重量に調節され、滅菌フィルターを通した後、薬剤としての使用のためバイアル中に適切な分量で分注される。この処方は更に、液体製品または凍結乾燥製品へと加工される。
【０１８１】
本発明のＧＬＰ−２類似体はまた、ＧＬＰ−２ペプチド類似体の延長性かつ持続性の投与のための徐放注入手段として処方され得る。このような持続放出処方は、身体の外部に置くパッチの形であり得る。持続放出処方の例は、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、シアル酸、ケイ酸塩、コラーゲン、リポソーム等のような生体適合性ポリマーの複合体を含む。持続放出処方は、本発明のＧＬＰ−２類似体の高い局所濃度の提供が望まれる際に特に関心が持たれ得る。
【０１８２】
このＧＬＰ−２類似体は、腸栄養性（ｉｎｔｅｓｔｉｎｏｔｒｏｐｈｉｃ）の量のペプチドを、単位用量または複数回用量のいずれかで含む無菌充填バイアルまたはアンプルの形で利用され得る。このバイアルまたはアンプルは、ＧＬＰ−２類似体および望ましい担体を直ちに投与できる処方で含み得る。また、このバイアルまたはアンプルは、ＧＬＰ−２ペプチドを滅菌水またはリン酸緩衝食塩水のような適切な担体中で再構成するために適切な、凍結乾燥型のような形で含み得る。
【０１８３】
ＧＬＰ−２類似体は、注射用処方の代替物としての他経路による投与のために処方され得る。錠剤、カプセル剤等のような経口製剤は、標準的な製薬業務に従い処方できる。本発明によると、ＧＬＰ−２類似体は小腸組織の増殖が有益である個体の治療のために投与される。
【０１８４】
経鼻製剤は、キトサンまたはＴｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、ポロクサマー、例えばプルロニックＦ−６８またはプルロニックＦ−１２７、Ｂｒｉｊ ３５、Ｂｒｉｊ ７２、クレモフォールＥＬ等の界面活性剤のような賦活薬の添加により処方できる。
【０１８５】
本発明のペプチド化合物は単独、または抗炎症作用を有する化合物と組み合わせて使用され得る。理論には制約されず、このような組み合わせの治療は本ペプチド類似体の有益な治療効果を強化するであろうことが想像される。
【０１８６】
言うまでもなく、患者を治療するための最も適切な投与量および投与計画は、治療されるべき疾患および状態、および患者の体重およびその他のパラメーターにより異なる。特定の理論による制約を意図せず、μｇ／ｋｇ範囲における投与量、および比較的短いか長い期間または治療頻度は、特に小腸質量の統計的に有意な増大のように治療上有用な結果を生み出し得ることが期待される。幾つかの例において、治療上の投与計画は最初の治療の休止に続いて起こる組織退縮を防ぐための維持量の投与を含み得る。本発明により得られる結果によりヒトへの使用における最も適切な投与量の規模および投与計画が導かれ得て、かつ適切に計画された治験により確認され得る。
【０１８７】
効果的な量および治療プロトコルは、実験動物において低用量から開始し、その効果をモニターしながら用量を増やしていき、同様に投与計画も系統的に変化させるという従来の方法により決定され得る。所定の患者に対する最適な投与量を決定する際には医師により多数の要素が考慮され得る。このような考慮は熟練者に公知である。本発明によるＧＬＰ−２ペプチドのヒトに対する量は、１つの態様において約１０μｇ／ｋｇ体重／日から約１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約５０μｇ／ｋｇ／日から約５ｍｇ／ｋｇ／日、および最も好ましくは約１００μｇ／ｋｇ／日から１ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。
【０１８８】
医学的状態
本発明のペプチドは、ここに述べられた効果的な量のＧＬＰ−２類似体またはその塩の投与による、食道の上部消化管を含む胃−腸関連疾患を患う個体の予防および治療のための薬剤として有用である。胃および腸関連疾患は、いずれの病因にもよる潰瘍（例えば、消化性潰瘍、ゾリンジャー・エリソン症候群、薬物誘導性潰瘍、感染またはその他の病原体に関連する潰瘍）、消化疾患、吸収不良症候群、短腸症候群、カルデサック症候群（ｃｕｌ−ｄｅ−ｓａｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性結腸炎）、セリアックスプルー（例えばグルテン誘導性腸疾患またはセリアック病）、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症スプルー、および化学療法および／または放射線血液療法誘導性の粘膜炎および下痢を含む。
【０１８９】
胃腸粘膜新生物、または胃腸粘膜新生物の増大したリスクを有する患者にとって、胃腸粘膜新生物の刺激または悪化のような副作用のリスクを減少または抑止するための化合物の選択が望まれ得る。例えば、結腸新生物（良性または悪性にかかわらず）、または結腸新生物発生のリスクを有する患者を治療する化合物を選択する際、非選択性化合物または小腸より結腸に選択性のある化合物よりも、結腸より小腸に選択性のある化合物を選択することがより適切であり得る。
【０１９０】
一般には上で述べたように、増大した小腸質量、および結果としてのおよび／または維持されている正常な小腸粘膜構造および機能が有益である個体は、本ＧＬＰ−２類似体による治療の候補である。ＧＬＰ−２類似体により治療され得る特定の状態は、熱からアルファグリアジンへの有毒反応に起因し、グルテン誘導性腸疾患またはセリアック病の結果となり得て、かつ小腸絨毛の有意な減少により特徴付けられるセリアックスプルー、感染に起因し、絨毛の部分的な平坦化により特徴付けられる熱帯性スプルー、一般的な可変性の免疫不全または低ガンマグロブリン血症の患者に一般的に見られ、絨毛の高さの有意な減少により特徴付けられる低ガンマグロブリン血症スプルーを含む様々な形のスプルーを含む。ＧＬＰ−２類似体による治療の治療的有効性は、絨毛の形態を調べるための腸内生検、栄養吸収の生化学的評価、腸透過性の非侵襲的な決定、患者の体重増加、またはこれらの状態に付随する症状の寛解によりモニターされ得る。本発明のＧＬＰ−２類似体は、いずれの病因にもよる潰瘍（例えば、消化性潰瘍、ゾリンジャー・エリソン症候群、薬物誘導性潰瘍、感染またはその他の病原体に関連する潰瘍）を含む胃関連疾患の予防または治療のための薬剤として有用であり得る。
【０１９１】
それに加えて本発明のＧＬＰ−２類似体により治療され得るその他の状態、またはＧＬＰ−２類似体が予防的に有用である状態は、前記の放射線性腸炎、感染性または後感染性腸炎、および癌化学療法剤または有毒剤による小腸損傷を含む。
【０１９２】
ＧＬＰ−２類似体はまた、栄養障害、例えば悪液質および食欲不振の治療に使用され得る。
【０１９３】
本発明の特定の態様は、本ペプチドを腸損傷および機能不全の予防および／または治療のために使用することに関わる。小腸粘膜の幹細胞はその増殖の割合が速いため、化学療法による細胞傷害性効果に影響されやすい（Ｋｅｅｆｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｕｔ ２０００；４７：６３２−７）。本ＧＬＰ−２ペプチドアゴニストの投与は小腸陰窩における栄養効果を増強し、かつ化学療法および／または放射線療法により損傷された腸上皮と置き換えるための新しい細胞を迅速に供給する。本ペプチド投与により達成される最終的な目標は、化学療法を受けている患者の胃腸損傷に関わる罹患率を減少させ、より侵襲的な化学療法、放射線および化学療法と放射線療法の組み合わせへの耐性を増大させることである。本発明に従い、併用される予防的または治療的処置が、放射線療法を受けているか、または受けようとしている患者に提供され得る。
【０１９４】
抗癌化学療法の後に起こる胃腸粘膜炎は次第に寛解するものの、一旦起こると基本的には治療できないことからますます問題となっている。一般に使用されている細胞増殖抑制性の癌治療剤５−ＦＵおよびイリノテカンを用いて行われた研究により、これらの薬剤による効果的な化学療法は主に小腸の完全な構造および機能に影響を与えるが、結腸への影響は少なく、主に粘液形成の増大として反応することが示された（Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．１８（９）：１０９５−１１００，２００３；Ｔａｍａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ ｌｎｔ Ｍｅｄ Ｒｅｓ．３１（１）：６−１６，２００３）。この潜在的に重要な治療応用は、５−ＦＵ、アルトレタミン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クリサンタスペース（Ｃｒｉｓａｎｔａｓｐａｓｅ）、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、リポソーマルドキソルビシン、ロイコボリン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、テモゾロミド、チオテパ、チオグアニン（Ｔｉｏｇｕａｎｉｎｅ／Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クリサンタスペース（Ｃｒｉｓａｎｔａｓｐａｓｅ）、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、リポソーマルドキソルビシン、ロイコボリン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、テモゾロミド、チオテパ、チオグアニン（Ｔｉｏｇｕａｎｉｎｅ／Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンのような現在使用されている化学療法剤に応用し得るが、これらに限定されない。
【０１９５】
本ペプチドは、効果的な量のＧＬＰ−２類似体またはその塩の投与による新生児を治療するための方法に使用され得ることが想定される。未発達な腸が原因の、摂食により起こる新生児の合併症は本ペプチドアゴニストの使用によって克服され得る。
【０１９６】
別の態様において、本発明は患者の必要に応じた効果的な量のＧＬＰ−２類似体またはその塩を投与することにより、ＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ）により媒介される状態を治療する方法について述べる。このような疾患はＤＰＰ−ＩＶ酵素が過剰発現された状態を含む。
【０１９７】
上に述べたように１つの態様において、この医薬組成物は前記のＧＬＰ−２類似体またはその塩またはその誘導体が徐放されるように処方され得る。
【０１９８】
本ペプチドは、効果的な量のＧＬＰ−２類似体またはその塩の投与により新生児を治療するための方法に使用され得ることが想定される。未発達な腸のために、摂食により起こる新生児の合併症は本ペプチドアゴニストの使用により克服され得る。
【０１９９】
別の態様において、本発明は患者の必要に応じた効果的な量のＧＬＰ−２類似体またはその塩を投与することにより、ＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ）により媒介される状態を治療する方法について述べる。このような疾患はＤＰＰ−ＩＶ酵素が過剰発現された状態を含む。
【実施例】
【０２００】
以下の実施例は本発明の好ましい局面を例証するために提供され、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【０２０１】
一般的なペプチド合成
装置および合成ストラテジー
ペプチドは、側鎖官能性のためのＮ−α−アミノ保護基としての９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）および適切な一般保護基を用いた濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中でバッチ式に合成された。
【０２０２】
溶媒
溶媒のＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｒｉｅｄｅｌ ｄｅ−Ｈａｅｎ、ドイツ）は強力な陽イオン交換樹脂を充填したカラム（Ｌｅｗａｔｉｔ Ｓ １００ＭＢ／Ｈ強酸、バイエルＡＧ Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ、ドイツ）を通して精製し、遊離アミンについては、遊離アミンが存在すると黄色（Ｄｈｂｔ−Ｏ−アニオン）を呈する３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ−ＯＨ）の添加によって使用前に分析した。溶媒のＤＣＭ（ジクロロメタン、分析グレード、Ｒｉｅｄｅｌ ｄｅ−Ｈａｅｎ、ドイツ）は、精製せず直接使用した。アセトニトリル（ＨＰＬＣ−グレード、Ｌａｂ−Ｓｃａｎ、ダブリン、アイルランド）は、精製せず直接使用した。
【０２０３】
アミノ酸
Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸は側鎖が保護された適切な形でＡｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ（ＡＣＴ）より購入した。
【０２０４】
共役試薬
共役試薬のジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＧ）は、Ｒｉｅｄｅｌ ｄｅ−Ｈａｅｎ、ドイツ、から購入した。
【０２０５】
固体支持体
ペプチドは０．２２−０．３１ｍｍｏｌ／ｇのＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ樹脂上で合成した。ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ−Ｒａｍ、ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）Ｆｍｏｃ（Ｒａｐｐ ｐｏｌｙｍｅｒｅ、ドイツ）はＣ−末端がアミド化されたペプチドが好ましい場合に使用したが、ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＰＨＢ、ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＰＨＢ Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＦｍｏｃはＣ−末端が遊離カルボン酸であることが好ましい場合に使用した。
【０２０６】
触媒およびその他の試薬
ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）はＡｌｄｒｉｃｈ、ドイツから、ピペリジンおよびピリジンはＲｉｅｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ、フランクフルト、ドイツから、エタンジチオールはＲｉｅｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ、フランクフルト、ドイツから購入した。３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ−ＯＨ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（ＨＯＡｔ）はＦｌｕｋａ、スイスから入手した。無水酢酸はＦｌｕｋａから入手した。
【０２０７】
共役方法
アミノ酸は、ｉｎ ｓｉｔｕで産生されたＨＯＢｔまたはＨＯＡｔエステルとして共役され、ＤＭＦ中でＤＩＣを用い、適切なＮ−α−保護アミノ酸およびＨＯＢｔまたはＨＯＡｔから作られた。
【０２０８】
Ｎ−α−アミノ保護基（Ｆｍｏｃ）の脱保護
Ｆｍｏｃ基の脱保護は、ＤＭＦ中での２０％ピペリジンによる処理（１ｘ５および１ｘ１０分）、続くＤＭＦによる洗浄（５ｘ１５ｍｌ、各５分）により行った。洗浄はＤＭＦ廃液中にＤｈｂｔ−ＯＨを加えた後、黄色が検出されなくなるまで行った。
【０２０９】
ＨＯＢｔ−エステルの共役
３当量のＮ−α−保護アミノ酸を３当量のＨＯＢｔおよび３当量のＤＩＣと共にＤＭＦに溶解し、次いで樹脂に加えた。
【０２１０】
酸によるペプチドの樹脂からの切断
ペプチドは、９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ、フランクフルト、ドイツ）水ｖ／ｖまたは９５％ＴＦＡおよび５％エタンジチオールｖ／ｖにより室温で２時間処理し、樹脂から切断した。濾過した樹脂は９５％ＴＦＡ水で洗浄し、濾過物および洗浄液は減圧下で蒸発させた。残渣はエーテルで洗浄し、酢酸水から凍結乾燥した。未精製の凍結乾燥物は高速液体クロマトグラフィーにより分析し、マススペクトロメトリー（ＭＳ）により同定した。
【０２１１】
ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂（ＰＥＧ−ＰＳ）上におけるバッチ式ペプチド合成
ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂（１ｇ、０．２３−０．２４ｍｍｏｌ／ｇ）を、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に配置した。樹脂はＤＭＦ（１５ｍｌ）中で膨潤させ、リンカーＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ上、または樹脂ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）Ｆｍｏｃ上の最初のアミノ酸上のいずれかに存在する最初のＦｍｏｃ基を除去するため、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンで処理した。樹脂を排出し、ＤＭＦ廃液中にＤｈｂｔ−ＯＨを加えた後黄色が検出されなくなるまで、ＤＭＦにより洗浄した。配列に従ったアミノ酸は、上に述べたように予めＦｍｏｃ保護されたＨＯＢｔエステル（３当量）として共役させた。共役は他に記載のない限り２時間継続した。樹脂を排出し、過剰の試薬を除くためにＤＭＦで洗浄した（５ｘ１５ｍｌ、各５分）。全てのアシル化は、上に述べたようにニンヒドリン試験によって調べた。合成が完了した後、ペプチド−樹脂はＤＭＦ（３ｘ１５ｍｌ、各５分）、ＤＣＭ（３ｘ１５ｍｌ、各１分）および最後にジエチルエーテル（３ｘ１５ｍｌ、各１分）で洗浄し、真空乾燥した。ペプチドは先に述べたように樹脂から切断し、未精製のペプチド産物は以下に述べるように分析、および精製した。
【０２１２】
ＨＰＬＣの条件
勾配ＨＰＬＣ分析は、ＨＰ １１００ Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙポンプ、ＨＰ １１００オートサンプラー、ＨＰ １１００カラムサーモスタット、およびＨＰ １１００多波長検出器から成る、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ＨＰ １１００ ＨＰＬＣシステムを用いて行った。機器の制御およびデータの取得には、ＬＣソフトウェア（ｒｅｖ． Ａ．０６．０１）のためのＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎを使用した。以下のカラムおよびＨＰＬＣバッファーシステムを使用した。
【０２１３】
カラム：ＶＹＤＡＣ ２３８ＴＰ５４１５、Ｃ−１８、５ｍｍ、３００Å １５０ｘ４．６ｍｍ
緩衝液：Ａ：ＭＱＶ中の０．１％ＴＦＡ；Ｂ：０．０８５％ＴＦＡ、１０％ＭＱＶ、９０％ＭｅＣＮ
勾配：０−１．５分 ０％Ｂ
１．５−２５分 ５０％Ｂ
２５−３０分 １００％Ｂ
３０−３５分 １００％Ｂ
３５−４０分 ０％Ｂ
フロー １ｍｌ／分、乾燥温度４０℃、ＵＶ検出：Ｉ＝２１５ｎｍ
【０２１４】
未精製ペプチドのＨＰＬＣ精製
未精製のペプチド産物はＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＶＩＳＩＯＮ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにて精製した。機器の制御およびデータの取得には、ＶＩＳＩＯＮ ３．０ソフトウェアを使用した。以下のカラムおよびＨＰＬＣバッファーシステムを使用した。
カラム：Ｋｒｏｍａｓｉｌ ＫＲ １００Å、１０ｍｍ Ｃ−８、２５０ｘ５０．８ｍｍ
バッファーシステム：緩衝液：Ａ：ＭＱＶ中の０．１％ＴＦＡ；Ｂ：０．０８５％ＴＦＡ、１０％ＭＱＶ、９０％ＭｅＣＮ
勾配：０−３７分 ０−４０％Ｂ
フロー ３５ｍｌ／分、ＵＶ検出：Ｉ＝２１５ｎｍおよび２８０ｎｍ
【０２１５】
質量分析法
ペプチドは、１ないし１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう、ｓｕｐｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔメタノール（Ｌａｂｓｃａｎ、ダブリン、アイルランド）、ミリＱ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ベッドフォード、マサチューセッツ）、およびギ酸（Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット、ドイツ）（５０：５０：０．１ｖ／ｖ／ｖ）に溶解した。ペプチド溶液（２０ｍｌ）はＬＣＴ質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）を用いたＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる陽極性モードで、＋／−０．１ｍ／ｚの精度にて分析した。
【０２１６】
一般的合成方法
全ての合成において、乾燥ＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｓ−Ｒａｍ樹脂（１ｇ、０．２２−０．３１ｍｍｏｌ／ｇ）は濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に配置した。樹脂はＤＭＦ（１５ｍｌ）中で膨潤させ、樹脂上のプロトン化していないアミノ基の存在を確保するためＤＭＦ中の２０％ピペリジンで処理した。樹脂を排出し、ＤＭＦ廃液中にＤｈｂｔ−ＯＨを加えた後黄色が検出されなくなるまで、ＤＭＦにより洗浄した。配列に従ったアミノ酸は、上に述べたように予めＦｍｏｃ保護されたＨＯＢｔエステル（３当量）として共役させた。共役は他に記載のない限り２時間継続した。樹脂を排出し、過剰の試薬を除くためにＤＭＦで洗浄した（５ｘ１５ｍｌ、各５分）。全てのアシル化は、ニンヒドリン試験を８０℃で行なうことにより調べた。合成が完了した後、ペプチド−樹脂はＤＭＦ（３ｘ１５ｍｌ、各５分）、ＤＣＭ（３ｘ１５ｍｌ、各１分）および最後にジエチルエーテル（３ｘ１５ｍｌ、各１分）で洗浄し、真空乾燥した。その後ペプチドは上に述べたように樹脂から切断し、凍結乾燥した。
【０２１７】
上に述べたように、調製用ＨＰＬＣを用いた精製の後ペプチド産物を回収し、ペプチドの同一性をＥＳ−ＭＳにより確認した。この方法は、以下においてさらに例証される全てのペプチドの合成に使用した。
【０２１８】
合成された化合物
上記の手法を用いて、１８０９から１８６１までの化合物およびリファレンス化合物１５５９（Ｈ−［Ｇｌｙ２］ｈＧＬＰ−２−ＯＨ）を上に述べた方法により合成した（表１）。
【０２１９】
【表３】
【０２２０】
実施例１．化合物２２６４の合成
ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ上の、
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−ＮＨ２
【０２２１】
乾燥ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ（０．２ｍｍｏｌ／ｇ、１ｇ）を濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に配置し、「ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂上のバッチ式ペプチド合成」として記述したように、Ｎ−末端のヒスチジンの共役が終了するまで処理した。全ての共役はオーバーナイトで継続した。アシル化は先に述べたように調べた。合成およびＮ−末端のＦｍｏｃ基の脱保護が完了した後、ペプチドを上に述べたように樹脂から切断した。先に述べたように調整用ＨＰＬＣを用いて精製した後、４１３ｍｇのペプチド産物を９３％を超える純度で回収し、ペプチドの同一性をＭＳ（実測Ｍ ３４８８．１３、算出Ｍ ３４８７．７９）により確認した。
【０２２２】
実施例２．化合物２２６８の合成
ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ上の、
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−ＮＨ２
【０２２３】
乾燥ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ（０．２ｍｍｏｌ／ｇ、１ ｇ）を濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に配置し、「ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂上のバッチ式ペプチド合成」として記述したように、Ｎ−末端のヒスチジンの共役が終了するまで処理した。全ての共役はオーバーナイトで継続した。アシル化は先に述べたように調べた。合成およびＮ−末端のＦｍｏｃ基の脱保護が完了した後、ペプチドを上に述べたように樹脂から切断した。先に述べたように調整用ＨＰＬＣを用いて精製した後、１３２ ｍｇのペプチド産物を９１％を超える純度で回収し、ペプチドの同一性をＭＳ（実測Ｍ ３５３５．８８、算出Ｍ ３５３５．７７）により確認した。
【０２２４】
実施例３．化合物２２６４（Ｌｙｓ６）の合成
ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｆｍｏｃ上の、
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ ＮＨ２
【０２２５】
乾燥ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｆｍｏｃ（０．２４ｍｍｏｌ／ｇ、１ｇ）を濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に配置し、「ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂上のバッチ式ペプチド合成」として記述したように、Ｎ−末端のヒスチジンの共役が終了するまで処理した。全ての共役はオーバーナイトで継続した。アシル化は先に述べたように調べた。合成およびＮ−末端のＦｍｏｃ基の脱保護が完了した後、ペプチドを上に述べたように樹脂から切断した。先に述べたように調整用ＨＰＬＣを用いて精製した後、ペプチド産物を９０％を超える純度で回収し、ペプチドの同一性をＭＳ（実測Ｍ ４２５６．４０、算出Ｍ ４２５６．３６）により確認した。
【０２２６】
実施例４． 化合物２２６８（Ｌｙｓ６）の合成
ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｆｍｏｃ上の、
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ ＮＨ２
【０２２７】
乾燥ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｆｍｏｃ（０．２４ｍｍｏｌ／ｇ、１ｇ）を濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に配置し、「ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂上のバッチ式ペプチド合成」として記述したように、Ｎ−末端のヒスチジンの共役が終了するまで処理した。全ての共役はオーバーナイトで継続した。アシル化は先に述べたように調べた。合成およびＮ−末端のＦｍｏｃ基の脱保護が完了した後、ペプチドを上に述べたように樹脂から切断した。先に述べたように調整用ＨＰＬＣを用いて精製した後、ペプチド産物を９０％を超える純度で回収し、ペプチドの同一性をＭＳ（実測Ｍ ４３０４．１０、算出Ｍ ４３０４．３４）により確認した。
【０２２８】
実施例５． 化合物２２６４ Ａ（酢酸塩）の合成
トリフルオロ酢酸塩から化合物２２６４の酢酸塩への対イオン交換。未精製の合成ペプチド産物の精製に使用したＨＰＬＣ緩衝液中に存在するトリフルオロ酢酸（０．１％ ｖ／ｖ）により、化合物２２６４の精製合成ペプチド産物をトリフルオロ酢酸塩として分離した。
【０２２９】
トリフルオロ酢酸塩を酢酸塩に対イオン交換するため、ペプチド溶液を酢酸塩型の強塩基イオン交換樹脂を充填したカラム（Ｄｏｗｅｘ １ｘ８）に通した。化合物２２６４Ｔを水に溶解した。この溶液を酢酸塩型の強塩基イオン交換樹脂を充填したカラム（Ｄｏｗｅｘ １ｘ８、容量１．３３ｍｅｑ／ｍｌ樹脂）に通した。樹脂を水で洗浄し、溶出液を集め、純度が９０％を超える酢酸塩になるよう凍結乾燥した。
【０２３０】
実施例６．化合物２２６４Ｃ（塩化物）の合成
トリフルオロ酢酸塩（Ｔｆａ）から化合物２２６４Ｃの塩化物（Ｃｌ−）への対イオン交換。化合物２２６４Ｔを０．１Ｍの塩酸に溶解し、その溶解液を凍結乾燥した。その残留物（ｒｅｍａｎｅｎｃｅ）を水に溶解し、純度が９０％を超える塩化物になるよう再び凍結乾燥した。
【０２３１】
さらなる選択的ＧＬＰ−２類似化合物を表２に示す。
【表４Ａ】
【０２３２】
【表４Ｂ】
【０２３３】
【表４Ｃ】
【０２３４】
実施例７．相対的化学安定性試験
表３に示した化合物を名目上濃度（ｎｏｍｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）が０．５ｍＭになるように０．１Ｍ ＨＣｌに溶解した。サンプルは遮光下、４０℃で７日間インキュベートした後、名目上濃度（ｎｏｍｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）が０．２ｍｇ／ｍＬになるよう希釈した。主要ピークの回収率をＲＰ−ＨＰＬＣにより分析し、主要ピークの質量による同一性の確認をＬＣ−ＭＳにより分析した。化合物は０．２ｍｇ／ｍＬの名目上濃度（ｎｏｍｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）において、ミリＱ水およびＭｅＣＮ中の０．１％ＴＦＡの移動相と共に、３μｍ、１１０Å、３ｘ１５０ｍｍのＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム上で、３９分を超える２５％から４８％ＭｅＣＮの段階的な実行によるＲＰ−ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳにより分析した。流速は０．４００ｍＬ／ｍｉｎであった。カラム乾燥温度は５０℃、オートサンプラー温度は４℃であり、ＵＶ検出は２２０ｎｍにおいて測定した。
【０２３５】
純度の回収率の結果を表３に示す。
【０２３６】
【表５】
＊分析用ＲＰ−ＨＰＬＣでの洗浄相における溶出。実施例７に示した改変した分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ法による反復データ。
【０２３７】
この分析法により４つの化合物（ＺＰ２２６４、ＺＰ２２６７、ＺＰ２２６８およびＺＰ２２７２）が後に洗浄相から溶出され、この４つの化合物について以下に述べる改変された方法による実験が反復して行われた。
【０２３８】
実施例８．相対的化学安定性試験
表４に示した化合物を名目上濃度（ｎｏｍｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）が０．２５ｍＭになるように０．１Ｍ ＨＣｌに溶解した。サンプルは遮光下、４０℃で２日間インキュベートした後、名目上濃度（ｎｏｍｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）が０．２ｍｇ／ｍＬになるよう希釈した。主要ピークの回収率をＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。化合物は０．２ｍｇ／ｍＬの名目上濃度（ｎｏｍｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）において、ミリＱ水およびＭｅＣＮ中の０．１％ ＴＦＡの移動相と共に、３μｍ、１１０Å、３ｘ１５０ｍｍのＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム上で、３９分を超える２５％から８０％ＭｅＣＮの段階的な実行によるＲＰ−ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳにより分析した。流速は０．４００ｍＬ／ｍｉｎであった。カラム乾燥温度は５０℃、オートサンプラー温度は４℃であり、ＵＶ検出は２２０ｎｍにおいて測定した。
【０２３９】
純度の回収率の結果を表４に示す。
【０２４０】
【表６】
【０２４１】
実施例９．ＧＬＰ−２類似体の、ＢＨＫ−２１細胞に遺伝子組み換え的に発現されたＧＬＰ−２レセプターに対するアゴニズムのｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング＊）
スクリーニングはＧＬＰ−２レセプターおよびＣＲＥ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子コンストラクトを一過性にトランスフェクトしたＢＨＫ−２１細胞を用いて行なった。用量反応曲線およびＥＣ５０値は１０ｆＭから１０ｎＭまでの７濃度および各濃度につき３点を用いて決定した。全ての試験プレートにコントロールペプチドを使用した。
＊）この試験はＡＭＲＩ（ブダペスト、ハンガリー）により行なわれた。
【０２４２】
材料および方法
使用した材料および細胞：
ＮｕｎｃまたはＧｒｅｉｎｅｒ 組織培養フラスコ
ＮｕｎｃまたはＧｒｅｉｎｅｒ １０ｃｍ ＴＣ ペトリ皿（Ｎｕｎｃ １７２９３１）
ＮｕｎｃまたはＧｒｅｉｎｅｒ 娘プレート（ｄａｕｇｈｔｅｒ ｐｌａｔｅｓ）用９６−ウェルプレート（Ｎｕｎｃ １６７００８）
ＢＨＫ−２１（Ｃ１３）細胞
白 ９６−ウェルプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ６００５６８０）希釈用深底ウェルプレート（Ｎｕｎｃ ２７８７５２）
グラスゴー ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ Ｇ５１５４）
フェノールレッド非含有 ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ ３１０５３−０２８）
ウシ胎血清（ＦＣＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ Ｚｅａｌａｎｄバッチ）
非必須アミノ酸（１００ｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ １１１４０−０３５）
２０ＯｍＭ グルタミン（１００ｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ ２５０３０−０２４）
ペニシリン／ストレプトマイシン（１００ｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ １５１４０−１２２）
ピルビン酸ナトリウム（１００ｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ １１３６０−０３９）
Ｄ−ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ １４１９０−０９４）
１ｘトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ ２５３００−０５４）
【０２４３】
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ ３１９８５−０４７）
リポフェクタミン ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １１６６８−０２７）
ＣＲＥ−ｌｕｃ ベクター（Ｚｅａｌａｎｄ バッチ）
ｈＧＬＰ２Ｒ ベクター（Ｚｅａｌａｎｄ バッチ）
１０％（ｗ／ｖ）無菌ＢＳＡ添加ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ ０５４８８）
１ＯｍＭ（２０Ｏｘ）ＩＢＭＸ添加ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ Ｉ５８７９）
ＬｕｃＬｉｔｅ キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ６０１６９１１）
Ｔｏｐｓｅａｌ−Ａ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ６００５１８５）
【０２４４】
培地および緩衝液
ＢＨＫ−２１（Ｃ１３）細胞用増殖培地：
グラスゴーＭＥＭ＋２ｍＭグルタミン（１：１００）＋１０％ＦＣＳ＋１％ 非必須アミノ酸＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム（１：１００）．
【０２４５】
ＢＨＫ−２１（Ｃ１３）細胞用の抗生剤非含有トランスフェクション培地：
グラスゴーＭＥＭ＋２ｍＭグルタミン（１：１００）＋１％非必須アミノ酸＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム（１：１００）
【０２４６】
ＢＨＫ−２１（Ｃ１３）細胞用の後トランスフェクション培地：
グラスゴーＭＥＭ＋２ｍＭグルタミン（１：１００）＋０．２％ＦＣＳ＋１％非必須アミノ酸＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム（１：１００）
【０２４７】
コーティング溶液：
Ｄ−ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ
【０２４８】
ペプチド溶解緩衝液：
Ｄ−ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ
【０２４９】
刺激用緩衝液：
フェノールレッド非含有ＤＭＥＭ＋２ｍＭグルタミン（１：１００）＋５０μＭ ＩＢＭＸ＋０．３％ＢＳＡ
【０２５０】
トランスフェクションしたＢＨＫ２１（Ｃ１３）細胞上のペプチドのスクリーニング方法
ＢＨＫ−２１細胞は１０ｃｍ ＴＣ−ペトリ皿に撒き、７０−８０％の培養密度まで増殖させた。次いで、培地を無血清のトランスフェクション用培地に交換した。ＤＮＡ（７．５μｇのｈＧＬＰ−２レセプターベクターおよび７．５μｇのＣＲＥ−ルシフェラーゼベクター）およびリポフェクタミン２０００をＯｐｔｉ ＭＥＭで希釈し組み合わせ、２０−３０分後に細胞に加えた。細胞は３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で４時間インキュベート、トリプシン処理の後、９６−ウェルプレートに１ウェル当たり３５，０００細胞を再び撒いた。細胞は導入遺伝子を発現させるため、完全増殖倍地中でオーバーナイトでインキュベートした。希釈したＧＬＰ−２類似体溶液の調整のために使用した全てのプレートは、予め１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝食塩水で２時間コートし、オーバーナイトで乾燥させた。ＧＬＰ−２類似体は２５０μＭになるようＰＢＳ／０．１％ ＢＳＡに溶解し、フェノールレッドおよび血清を含まず、ホスホジエステラーゼ阻害剤および０．３％ＢＳＡを含む培地（刺激用緩衝液）中に、１０μＭおよび１００ｎＭの各２段階で希釈した。その後ＧＬＰ−２類似体は、１０ｎＭから１０ｆＭへと下る濃度になるよう、同刺激用緩衝液で連続的に希釈した。基線となる活性は刺激用緩衝液のみで制御した。これらの溶液は３７℃になるよう予め３０分間加温した。細胞は加温（３７℃）した刺激用緩衝液で洗浄し、１００μｌの加温したペプチド希釈液およびコントロールと共に３７℃、５％ＣＯ２において５時間インキュベートした。ＬｕｃＬｉｔｅ酵素基質／溶解緩衝液はインキュベーションの終了直前に調整した。１００μｌのＬｕｃＬｉｔｅ基質を各ウェルに加え、発光を適切なカウンター（例えば、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ ＩＩ）にて測定した。ＥＣ５０値は、４パラメータロジスティック方程式（Ｍｉｃｒｏｃａｌ Ｏｒｉｇｉｎ ５．０またはＧｒａｐｈＰａｄ ４）を用いてフィッティングした生データに由来する。
【０２５１】
結果を表５に示す。
【０２５２】
【表７】
【０２５３】
結論：この結果は、試験された全ての化合物はＧＬＰ−２アゴニストであることを明白に示している。
【０２５４】
実施例１０．ｉｎ ｖｉｖｏ試験（雄Ｃ５７ＢＬマウスにおいて決定された腸増殖刺激）
本化合物（ＺＰ２２６４、ＺＰ２２６６、ＺＰ２２６７、ＺＰ２２６８、ＺＰ２２４２、ＺＰ２２６９、ＺＰ２２７０、ＺＰ２２７２およびＺＰ２２４２）の結腸質量に比し小腸質量を選択的に刺激する能力を、雄Ｃ５７ＢＬマウスにおいて決定した。マウスのそれぞれのグループ（ｎ＝６−１０）に、８００ｎｍｏｌ／ｋｇの各化合物を１日１回、３日連続で皮下投与した。比較のため、動物の他のグループに等モル量の［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２（ＺＰ１５５９）、または溶媒（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）のいずれかを同じ投薬計画にて投与した。化合物の最後の量が投与されてから２４時間後にマウスを屠殺し、小腸（幽門から盲腸まで）および結腸（腸末端から盲腸まで）を空にして秤量した。
【０２５５】
体重（ＢＷ）のわずかな違いを補正するため、小腸（ＳＩ）および結腸の臓器質量はＢＷに相対的に表した。非選択性化合物である［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２については、食道、胃、小腸および結腸いずれにおいても胃腸増殖を刺激すること、およびこの化合物により誘導される増殖パターンの違いについての評価が報告されており、化合物Ｘの小腸−結腸感受性指数は以下のように算出される。
【０２５６】
（ＳＩ／Ｃｏｌｏｎ）ｘ／（ＳＩ／Ｃｏｌｏｎ）［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２％
【０２５７】
１．１０以上の小腸−結腸感受性を有する化合物は、相対的に小腸選択性であると考えられる。
【０２５８】
【表８】
【０２５９】
【表９】
【０２６０】
結果
本発明による試験化合物の効果は、結腸質量に対して選択的に小腸質量を増大させるペプチドの能力に基づき決定した。リファレンス化合物［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２およびＺＰ２２６４、ＺＰ２２６６、ＺＰ２２６７、ＺＰ２２６８、ＺＰ２２４２、ＺＰ２２６９およびＺＰ２２７２の投与後の、溶媒コントロールに対する相対的小腸質量を図１および２に示した。リファレンス化合物［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２の小腸質量の結腸質量に対する比への効果に対する試験化合物の同効果を図３および４に示した。［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２を投与された動物の結腸質量に対する小腸質量の比を１００％に標準化した。リファレンス化合物［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２の小腸−結腸感受性指数に対して算出された試験化合物の同指数に基づいた、小腸選択性の試験化合物を表６に示した。［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２を投与された動物の小腸−結腸感受性指数は１に標準化した。リファレンス化合物［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２に対する試験化合物の小腸および結腸質量に対する効果を表７に示した。［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２を投与された動物の結腸質量および小腸質量を１００％に標準化した。
【０２６１】
実施例１１．ｉｎ ｖｉｖｏ試験（雄Ｃ５７ＢＬマウスにおいて決定された腸増殖刺激）
雄Ｃ５７ＢＬマウスにおいて、さらなる化合物の結腸質量に比し小腸質量を選択的に刺激する能力を決定した。１日当たり２００ｎｍｏｌ／ｋｇの各化合物を投与すること以外は、上記実施例１０と同様のプロトコルを用いた。従って、マウスのそれぞれのグループ（ｎ＝６−１０）に、２００ｎｍｏｌ／ｋｇの各化合物を１日１回、３日連続で皮下投与した。動物の他のグループに等モル量の［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２（リファレンス化合物）、または溶媒（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４；ネガティブコントロール）のいずれかを同じ投薬計画にて投与した。化合物の最後の量が投与されてから２４時間後にマウスを屠殺し、胃、小腸および結腸を空にして秤量した。
【０２６２】
図６に示すように、本発明による化合物ＺＰ２３８０、ＺＰ２３８１、ＺＰ２３８４、ＺＰ２３８５、ＺＰ２３９７、ＺＰ２３９８、ＺＰ２３９９、ＺＰ２４１１、ＺＰ２４１７、ＺＰ２４１８、ＺＰ２４２０、ＺＰ２４２３は、結腸質量に比し小腸質量を選択的に刺激する能力を有する。
【０２６３】
実施例１２．ｉｎ ｖｉｖｏ試験（雄Ｃ５７ＢＬマウスにおいて決定された胃増殖刺激）
本発明による試験化合物の効果は、溶媒コントロールに対して選択的に胃質量を増大させるペプチドの能力に基づき決定した。本化合物（ＺＰ２３９５、ＺＰ２３９６、ＺＰ２４００、ＺＰ２４１２、ＺＰ２３９４、およびＺＰ２４０１）の結腸質量に比し胃質量を選択的に刺激する能力を、雄Ｃ５７ＢＬマウスにおいて決定した。マウスのそれぞれのグループ（ｎ＝６−１０）に、２００ｎｍｏｌ／ｋｇの各化合物を１日１回、３日連続で皮下投与した。比較のため、動物の他のグループに等モル量の［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２、または溶媒（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）のいずれかを同じ投薬計画にて投与した。化合物の最後の量が投与されてから２４時間後にマウスを屠殺し、胃および小腸（幽門から回盲部まで）を空にして秤量した。体重（ＢＷ）のわずかな違いを補正するため、胃の臓器質量はＢＷに相対的に表した。図７は、化合物ＺＰ２３９５、ＺＰ２３９６、ＺＰ２４００、ＺＰ２４１２、ＺＰ２４１４、ＺＰ２４１６、ＺＰ２３９４、およびＺＰ２４０１が、結腸質量に比し胃質量を選択的に刺激する能力を有することを示している。
【０２６４】
幾つかのＺＰ化合物は体重に比した胃質量を増加させたが、リファレンス化合物の［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２が胃質量を刺激することは報告されていない（図７）。［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２に比較して、ＺＰ化合物により誘導された胃における増殖パターンの差異を評価するため、化合物Ｘの胃−結腸感受性指数を以下のように算出した。
【０２６５】
（胃／結腸）ｘ／胃／（結腸）［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２％
【０２６６】
１．０５以上の胃／結腸感受性を有する化合物は、相対的に胃選択性であると考えられる。
【０２６７】
化合物ＺＰ２２６７、ＺＰ２３８６、ＺＰ２４０４、ＺＰ２４１３、ＺＰ１４１５、ＺＰ２４０２、ＺＰ２４０３、ＺＰ２３８２、ＺＰ２２６６、ＺＰ２３７８、ＺＰ２４１４、ＺＰ２４１６、ＺＰ２４２４、ＺＰ２３７９、ＺＰ２２６９は小腸，結腸、または胃に非選択性である（図８）。
【０２６８】
実施例１０から１２において得られたデータの要約を表８に示す。
【０２６９】
【表１０】
【０２７０】
ＧＬＰ−２レセプターの特異性
所定のレセプターに対して基質が達成するとみられる生物学的特異性の機序は、水素結合、疎水性、静電性結合等に基づいた、基質とレセプターの間の様々な相互作用に関わる。
【０２７１】
我々の構造および活性の関連性についての研究の間に、ＧＬＰ−２配列の位置１１、１６、２０、２４および２８の残基がＧＬＰ−２レセプターの認識および結合に深く関わっていることが示された。従って、これら特定位置のアミノ酸パターンの変化によりＧＬＰ−２類似体は３つの異なったグループ、小腸−、胃−、および非特異的ペプチドに分類される。ＧＬＰ−２類似体のレセプター特異性は、位置１１、１６、２０、２４および２８のアミノ酸の疎水性および水素結合のポテンシャルに依存することが明らかになった。
【０２７２】
実施例１３．小腸特異性におけるＨＰＩの効果
小腸／結腸感受性指数により小腸選択性であるＧＬＰ−２ペプチドのＨＰＩデータを表９に示した。
【０２７３】
【表１１】
【０２７４】
データは小腸特異的ＧＬＰ−２類似体の個々の位置１１、１６、２０、２４および２８のＨＰＩ間隔が、位置１１および１６については独立して少なくとも−０．８≦ＨＰＩ≦３．８または、好ましくは−０．８≦ＨＰＩ≦２．８またはさらに好ましくはＨＰＩ＝１．８でなければならないことを示している。
【０２７５】
位置２０、２４および２８については、ＨＰＩ間隔は個々の位置が独立して少なくとも−０．８≦ＨＰＩ２０，２４，２８≦１．８または好ましくは−０．８≦ＨＰＩ２０≦１．８およびさらに好ましくはＨＰＩ２４，２８＝−０．８でなければならない。
【０２７６】
ＨＰＩ間隔により小腸選択性ペプチドの可能性のあるアミノ酸置換パターンを表１０に示した。
【０２７７】
【表１２】
【０２７８】
従って、Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４およびＸ２８は独立してＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。特に、Ｘ１１およびＸ１６はそれぞれ独立してＡｌａまたはＳｅｒ、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８は独立してＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。例えば、Ｘ１１およびＸ１６は両者ともＡｌａであり得て、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８は独立してＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。
【０２７９】
実施例１４．胃特異性におけるＨＰＩの効果
胃／小腸感受性指数により胃特異的であるＧＬＰ−２ペプチドのＨＰＩデータを表１１に示した。
【０２８０】
【表１３】
【０２８１】
データは胃特異的ＧＬＰ−２類似体の個々の位置１１、１６、２０、２４および２８のＨＰＩ間隔が、位置１１および１６については独立して少なくとも−３．９≦ＨＰＩ１１，１６≦３．８または、好ましくは２．８≦ＨＰＩ１１，１６≦３．８またはＨＰＩ１１，１６＝−３．９、および位置２０、２４および２８については、ＨＰＩは独立して少なくとも−３．９≦ＨＰＩ２０，２４，２８≦１．８または好ましくは−０．８≦ＨＰＩ２０，２４，２８≦１．８またはＨＰＩ２０，２４，２８＝−３．９でなければならないことを示している。
【０２８２】
ＨＰＩ間隔により可能性のあるアミノ酸置換パターンを表１２に示した。
【０２８３】
【表１４】
【０２８４】
従って、胃特異的化合物Ｘ１１はＬｅｕ、ＰｈｅまたはＬｙｓであり得る。Ｘ１６ はＬｅｕ、ＰｈｅまたはＬｙｓであり得る。Ｘ２０はＡｌａまたはＳｅｒであり得る。Ｘ２４はＡｌａ、ＳｅｒまたはＬｙｓであり得る。Ｘ２８はＡｌａ、ＳｅｒまたはＬｙｓであり得る。
【０２８５】
例えば、Ｘ１１およびＸ１６は独立してＬｅｕまたはＰｈｅであり得て、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８はＳｅｒであり得る。
【０２８６】
レセプター特異性における水素結合ポテンシャル（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）（ＨＢＰ）の効果
先に述べたように、ＧＬＰ−２類似体のレセプター特異性は上記の位置１１、１６、２０、２４および２８の水素結合のポテンシャルにより支配されることもまた明らかになった。
【０２８７】
水素結合ポテンシャル（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）（ＨＢＰ）は、個々のアミノ酸についてＷ．Ｄ．Ｓｔｅｉｎ，“Ｔｈｅ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｃｒｏｓｓ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ”；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｎ．Ｙ．１９６７，ｐｐ６５−１２５により紹介および定義され、これは所定のアミノ酸側鎖が水素結合を形成する能力を提供している。
【０２８８】
個々のアミノ酸に対するＨＢＰを表１３に示す。
【０２８９】
【表１５】
【０２９０】
実施例１５．胃特異性における水素結合ポテンシャル（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）（ＨＢＰ）の効果
胃特異的類似体の例を表１４に示す。
【０２９１】
【表１６】
【０２９２】
この表によると、胃特異的ＧＬＰ−２類似体の個々の位置１１、１６、２０、２４および２８のＨＢＰ間隔が、全ての位置につき独立して少なくとも０≦ＨＢＰ１１，１６，２０，２４，２８≦２でなければならない。ＨＢＰ間隔に従い、可能性のあるアミノ酸置換パターンを表１５に示す。
【０２９３】
【表１７】
【０２９４】
好ましい胃特異的類似体は、位置１１および１６がＨＢＰ１１，１６，＝０、かつ位置２０、２４および２８が独立して０≦ＨＢＰ２０，２４，２８≦２のＨＢＰ間隔を有するＧＬＰ−２類似体である。
【０２９５】
幾つかの胃特異的ＧＬＰ−２類似体を以下に示す。
Ｘ１１はＬｅｕ、ＰｈｅまたはＬｙｓであり得る。
Ｘ１６はＬｅｕ、ＰｈｅまたはＬｙｓであり得る。
Ｘ２０はＡｌａまたはＳｅｒであり得る。
Ｘ２４はＡｌａ、ＳｅｒまたはＬｙｓであり得る。
Ｘ２８はＡｌａ、ＳｅｒまたはＬｙｓであり得る。
【０２９６】
例えば、Ｘ１１およびＸ１６は独立してＬｅｕまたはＰｈｅであり得て、Ｘ２４およびＸ２８は独立してＬｙｓまたはＳｅｒであり得て、Ｘ２０はＳｅｒであり得る。
【０２９７】
例えば、Ｘ１１およびＸ１６は独立してＬｅｕまたはＰｈｅであり得て、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８はＳｅｒであり得る。
【０２９８】
実施例１６．小腸特異性における水素結合ポテンシャル（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）（ＨＢＰ）の効果
小腸特異的ＧＬＰ−２類似体は、上で特に言及した位置１１、１６、２０、２４および２８の水素結合のポテンシャルのようなパラメーターに支配されることもまた明らかになった。個々のアミノ酸のＨＢＰを表１６に示す。
【０２９９】
【表１８】
【０３００】
この表によると、小腸特異的ＧＬＰ−２類似体の個々の位置１１、１６、２０、２４および２８のＨＢＰ間隔が、全ての位置につき独立して少なくとも０≦ＨＢＰ１１，１６，２０，２４，２８≦２でなければならない。
【０３０１】
好ましい類似体においては、位置１１および１６のＨＢＰ間隔がＨＢＰ１１，１６＝０、および位置２０、２４、および２８のＨＢＰ間隔が独立して０≦ＨＢＰ２０，２４，２８≦２である。
【０３０２】
さらに好ましい、小腸特異性を示すＧＬＰ−２類似体は、位置１１および１６がＨＢＰ１１，１６＝０、ＨＢＰ２０＝０−２、およびＨＢＰ２４，２８＝２のＨＢＰ間隔を有するペプチドである。
これに従い、幾つかの置換パターンを表１７に示す。
【０３０３】
【表１９】
【０３０４】
従って、小腸選択性化合物において、Ｘ１１、Ｘ１６；Ｘ２０、Ｘ２４およびＸ２８はそれぞれ独立してＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。例えば、Ｘ１１およびＸ１６はそれぞれ独立してＡｌａまたはＳｅｒ、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８はそれぞれ独立してＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。例えば、Ｘ１１およびＸ１６は共にＡｌａであり得て、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８は独立してＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。
【０３０５】
本発明は上に述べた典型的な態様と共に記述されているが、多数の同等な改変および変化はそれが開示された際当業者には明らかであり得る。従って、説明された本発明の典型的な態様は例示的であり限定的ではないとみなされる。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、記述された態様には様々な変更が成され得る。ここに引用された全ての文献は明白に参照により組み入れられたものとする。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選択的グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）類似体およびその医学的使用、例えば胃および腸関連疾患の予防または治療、および、化学療法および／または放射線療法の胃腸に関連した副作用の寛解に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＬＰ−２は、腸の腸管内分泌Ｌ細胞および脳幹の特定領域におけるプログルカゴンの特定の翻訳後プロセシングに由来する３３アミノ酸のペプチドであり、栄養素の摂取に反応して、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、オキシントモジュリン、およびグリセンチンと共に分泌される。
【０００３】
ＧＬＰ−２は陰窩における幹細胞増殖刺激および絨毛のアポトーシスの阻害を通じ、小腸粘膜上皮の有意な増殖を誘導する（Ｄｒｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９６，９３：７９１１−６）。ＧＬＰ−２はまた、結腸に対する増殖効果も有する。ＧＬＰ−２はまた、胃排出および胃酸分泌を阻害し（Ｗｏｊｄｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．１９９９，８４：２５１３−７）、腸のバリア機能を増強し（Ｂｅｎｊａｍｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｕｔ．２０００，４７：１１２−９．）、グルコース輸送体の発現増加を通じた腸ヘキソース輸送を刺激し（Ｃｈｅｅｓｅｍａｎ，．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９７，Ｒ１９６５−７１．）、かつ腸血流を増大させる（Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００３，１２５，１３６−４７）。
【０００４】
ＧＬＰ−２は、クラスＩＩグルカゴンセクレチンファミリーに属する単一のＧタンパク質共役型レセプターに結合する。ＧＬＰ−２レセプターは小腸、結腸および胃、ＧＬＰ−２に反応することが知られている場に発現する（Ｙｕｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２０００，１１９：７４４−５５）。しかしながら、胃腸管内におけるＧＬＰ−２レセプターからの刺激に対する標的細胞は良く分かっておらず、かつＧＬＰ−２レセプターに共役する下流の細胞内メディエーターは良く理解されていない。
【０００５】
小腸におけるＧＬＰ−２の実証された特異的かつ有益な効果は、腸疾患または傷害の治療にＧＬＰ−２を使用することへの大きな関心を引き起こした（Ｓｉｎｃｌａｉｒ ａｎｄ Ｄｒｕｃｋｅｒ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２００５：３５７−６５）。さらに、化学療法誘導性腸炎、虚血再灌流障害、デキストラン硫酸誘導性結腸炎、および炎症性腸疾患の遺伝的モデルを含む腸傷害の多数の前臨床モデルにおいて、ＧＬＰ−２が粘膜上皮損傷を防止または減少させることが示されてきた（Ｓｉｎｃｌａｉｒ ａｎｄ Ｄｒｕｃｋｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２００５：３５７−６５）。
【０００６】
さらに、胃におけるＧＬＰ−２ＲのｍＲＮＡ発現（Ｙｕｓｔａ ｅｔ ａｌ．，２０００）、およびＧＬＰ−２が腸の運動性および胃酸分泌を低下させるという観察（Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）の両者は共に、胃が直接的または間接的にＧＬＰ−２に反応するということの十分な証拠を提供している。それにもかかわらず、ＧＬＰ−２またはＧＬＰ−２類似体の、胃内面の損傷を特徴とする状態における使用についてはまだ探求されていない。
【０００７】
ＧＬＰ−２は、Ｈ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ｌｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ｌｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−ｌｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−ｌｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−ＯＨ、の配列を有する３３アミノ酸ペプチドとして分泌される。酵素ＤＰＰ ＩＶによりＮＨ２末端の位置２のアラニン（Ａ）において迅速に切断され、不活性型のヒトＧＬＰ−２（３−３３）となる。腎クリアランスに加え、この迅速なＧＬＰ−２（１−３３）の分解によってペプチドの半減期は７分間となる（Ｔａｖａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２７８：Ｅ１３４−Ｅ１３９，２０００）。
【０００８】
米国特許第５，９９４，５００号（Ｄｒｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．）に、ＧＬＰ−２のアンタゴニストおよびその胃腸組織の増殖における効果について記載されている。このアンタゴニストは過形成の治療または低形成の誘導に使用するための医薬品として処方されることが提案されており、米国特許第５，９９４，５００号では、ＧＬＰ−２の構造は置換および欠失のような変異により変化させられている。
【０００９】
米国特許第６，１８４，２０８号、５，７８９，３７９号、および６，１８４，２０１号は、ＧＬＰ−２類似体およびその医学的使用を開示している。これらの類似体は全てヒトＧＬＰ−２の置換および／または欠失により得られたものである。
【００１０】
ＤａＣａｍｂｒａら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０００，３９，８８８８−８８９４）は、ＧＬＰ−２活性の構造的な決定要因について記載している。このような決定要因の例として、ＧＬＰ−２レセプターの結合および活性化に決定的であると言われるＰｈｅ６およびＴｈｒ５が挙げられる。
【００１１】
国際公開第９７／３９０３１号に、ＧＬＰ−２類似体である［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２が開示されている。ここでは位置２のアラニン（Ａ）は、ＤＰＰ ＩＶによる切断に抵抗性のペプチドを作製するためグリシンに置換されており、このアラニンの置換によりペプチドの安定性および効力が増大されることが示されている。この特許出願は、ＧＬＰ−２類似体が腸上皮粘膜の炎症および破壊を伴う疾患に対しどのように使用され得るかについて記述している。これらの疾患には、広範囲の小腸切除、炎症性腸疾患、化学療法および／または放射線誘導性腸炎、および虚血性傷害が含まれる。
【００１２】
国際公開第０２／０６６５１１号は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期が延長されたＧＬＰ−２類似体と、それを薬剤として炎症性腸疾患のような胃腸疾患の治療に使用することについて記載している。
【００１３】
国際公開第０１／４１７７９号は、化学療法誘導性のアポトーシスの阻害および小腸上皮細胞の生存を促進するため、前処置としてｈ［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２を使用することについて記載している。
【００１４】
ここに引用した全ての参考文献は、その全体が参照によって明確に組み入れられたものとする。
【００１５】
これまでに様々な疾患の治療におけるＧＬＰ−２またはＧＬＰ−２類似体の使用が多くの科学者により提案されてきた。しかしながらなお、改良され、小腸に選択性のあるＧＬＰ−２類似体が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は大まかには、野生型ＧＬＰ−２に比し１つ以上の置換を含み、結腸に対する小腸選択性が増大した性質、ｉｎ ｖｉｖｏにおける改善された生物活性、および／または改善された化学的安定性（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏでの安定性アッセイにより評価された）を有し得るＧＬＰ−２類似体に関する。さらに詳しくは、本発明の好ましいＧＬＰ−２類似体は、野生型ＧＬＰ−２配列の位置８、１１、１２、１３、１６、１７、１８、２０、２１、２４および／または２８のうち１以上における保存されていない置換と位置２（導入部で述べたように）および位置３、５、７および１０のうち１以上におけるさらなる保存されたまたはされていない置換との任意の組み合わせ、および／または野生型ＧＬＰ−２配列の位置３１から３３に対応する１以上のアミノ酸の置換または欠失、およびＮ−末端またはＣ−末端の安定化ペプチド配列の任意の付加を含む。さらに本発明のＧＬＰ−２類似体は、位置９、１４、および１５に対応するアミノ酸の１以上の保存された置換を含み得る。改善された化学的安定性および／または生物活性を有し得るＧＬＰ−２類似体の提供と同様に、本発明はまた、特に野生型ＧＬＰ−２の位置Ａｓｎ１１および／またはＡｓｎ１６および／またはＡｒｇ２０および／またはＡｓｎ２４および／またはＧｌｎ２８の１つ以上に修飾を含むことにより、結腸に比した小腸、またはその逆における腸の優先的な増殖促進活性を有する化合物の提供にも関する。
【００１７】
従って、１つの局面において本発明は一般式Ｉ
Ｒ１−Ｚ１−Ｈｉｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘ２４−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘ２８−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｚ２−Ｒ２
により表され、
【００１８】
式中、
Ｒ１は水素、Ｃ１−４アルキル（例えばメチル）、アセチル、ホルミル、ベンゾイルまたはトリフルオロアセチルであり、
Ｘ２はＧｌｙ、ＡｌａまたはＳａｒ、
Ｘ３はＧｌｕまたはＡｓｐ、
Ｘ５はＳｅｒまたはＴｈｒ、
Ｘ６はＰｈｅまたはＰｒｏまたは保存された置換、
Ｘ７はＳｅｒまたはＴｈｒ、
Ｘ８はＡｓｐまたはＳｅｒまたは保存された置換、
Ｘ９はＧｌｕまたはＡｓｐまたは保存された置換、
Ｘ１０はＭｅｔ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅまたは酸化的に安定なＭｅｔ−置換アミノ酸、
Ｘ１１はＹ１、
Ｘ１２はＴｈｒまたはＬｙｓまたは保存された置換、
Ｘ１３はＩｌｅ、ＧｌｕまたはＧｌｎまたは保存された置換、
Ｘ１４はＬｅｕ、ＭｅｔまたはＮｌｅまたは保存された置換、
Ｘ１５はＡｓｐまたはＧｌｕまたは保存された置換、
Ｘ１６はＹ２、
Ｘ１７はＬｅｕまたはＧｌｕまたは保存された置換、
Ｘ１８はＡｌａまたはＡｉｂまたは保存されていない置換、
Ｘ１９はＡｌａまたはＴｈｒまたは保存された置換、
Ｘ２０はＹ３、
Ｘ２１はＡｓｐまたはＨｅまたは保存された置換、
Ｘ２４はＹ４、
Ｘ２８はＹ５、
Ｘ３１はＰｒｏ、Ｉｌｅまたは欠失、
Ｘ３２はＴｈｒまたは欠失、
Ｘ３３はＡｓｐ、Ａｓｎまたは欠失、
Ｒ２はＮＨ２またはＯＨであり、
式中、
Ｚ１およびＺ２は独立して存在しないかまたはＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＭｅｔおよびＯｒｎからなる群から選択される１から１０アミノ酸単位のペプチド配列であり、かつ式ＩのＸ１１，Ｘ１６，Ｘ２０，Ｘ２４，Ｘ２８残基のハイドロファティシティ（ｈｙｄｒｏｐｈａｔｉｃｉｔｙ）プロファイル（ＨＰＰ）は、
ＨＰＰ＝Σｈｐｉｘ１１＋ｈｐｉｘ１６＋ｈｐｉＸ２０＋ｈｐｉＸ２４＋ｈｐｉＸ２８は≧−１０であり、
式中、
Ｘ２０がＡｒｇの場合Ｘ１１はＳｅｒであり、Ｘ１６がＡｌａ、Ｘ２４がＡｌａ、Ｘ２８がＡｌａ、およびＺ２がＬｙｓまたは医薬的に許容される塩またはその誘導体である条件下で、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４、およびＹ５は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＭｅｔおよびＰｈｅからなる群から個々に選択でき、かつ
Ｙ３は、Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ｇｌｎ，Ｈｉｓ，Ａｒｇ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｍｅｔ ｏｒ Ｐｈｅからなる群から選択できるＧＬＰ−２類似体を提供する。１つの態様において、本発明は上に述べたようにＨＰＰが≧−４であるグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体を提供する。
【００１９】
別の態様において、本発明は上に述べたようにＨＰＰが≧０であるグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体を含む。
【００２０】
別の局面において、本発明は一般式ＩＩ
Ｒ１−Ｚ１−Ｈｉｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ａｌａ−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘ２４−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘ２８−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｚ２−Ｒ２
により表され、
【００２１】
式中、
Ｒ１は水素、Ｃ１−４アルキル（例えばメチル）、アセチル、ホルミル、ベンゾイルまたはトリフルオロアセチルであり、
Ｘ２はＧｌｙ、ＡｌａまたはＳａｒ、
Ｘ３はＧｌｕまたはＡｓｐ、
Ｘ５はＳｅｒまたはＴｈｒ、
Ｘ６はＰｈｅまたはＰｒｏ、
Ｘ７はＳｅｒまたはＴｈｒ、
Ｘ８はＡｓｐまたはＳｅｒ、
Ｘ９はＧｌｕまたはＡｓｐ、
Ｘ１０はＭｅｔ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅまたは酸化的に安定なＭｅｔ−置換アミノ酸、
Ｘ１１はＡｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ１２はＴｈｒまたはＬｙｓ、
Ｘ１３はＩｌｅ、ＧｌｕまたはＧｌｎ、
Ｘ１４はＬｅｕ、ＭｅｔまたはＮｌｅ、
Ｘ１５はＡｓｐまたはＧｌｕ、
Ｘ１６はＡｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ１７はＬｅｕまたはＧｌｕ、
Ｘ１８はＡｌａまたはＡｉｂ、
Ｘ１９はＡｌａまたはＴｈｒ、
Ｘ２０はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ２１はＡｓｐまたはＩｌｅ、
Ｘ２４はＡｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ２８はＡｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ３１はＰｒｏ、Ｉｌｅまたは欠失、
Ｘ３２はＴｈｒまたは欠失、
Ｘ３３はＡｓｐ、Ａｓｎまたは欠失、
Ｒ２はＮＨ２またはＯＨであり、
Ｘ２０がＡｒｇの場合Ｘ１１はＳｅｒであり、Ｘ１６がＡｌａ、Ｘ２４がＡｌａ、Ｘ２８がＡｌａ、およびＺ２がＬｙｓである条件下で、
Ｚ１およびＺ２は独立して存在しないかまたはＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＭｅｔおよびＯｒｎからなる群から選択される１から１０アミノ酸単位のペプチド配列であるか、または医薬的に許容される塩またはその誘導体であるグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体を提供する。
【００２２】
１つの態様において、本発明は上に述べたように、
Ｘ１１はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ１６はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ２０はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ２４はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ２８はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
であるグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体を含む。
【００２３】
別の態様において、本発明は上に述べたように、
Ｘ１１はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ、
Ｘ１６はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ、
Ｘ２０はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ、
Ｘ２４はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ、
Ｘ２８はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ、
であるグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体を含む。
【００２４】
さらに別の態様において、本発明は上に述べたようにＧＬＰ−２類似体が野生型ＧＬＰ−２（１−３３）に対し少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有し、ｉｎ ｖｉｖｏにおける腸の質量増大の原因となる生物活性を有するグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体を含む。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は上に述べたようにＧＬＰ−２類似体が位置Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４および／またはＸ２８における１以上の置換（即ち、上で述べられた野生型配列に比較して１以上の置換）および／または前記置換のうちの１以上と位置Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７および／またはＸ１０における１以上の置換との組み合わせを有するグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体を含む。
【００２６】
さらに別の態様において、本発明は位置Ｘ１０における置換がＬｅｕ、Ｎｌｅ、またはＭｅｔ（Ｏ）またはＭｅｔ（Ｏ）２のような酸化的に安定なＭｅｔ−置換アミノ酸であるグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体を含む。従って、既に述べた置換に加え、またはそれとは別に、このＧＬＰ−２類似体は位置Ｘ１０にＬｅｕ、Ｎｌｅ、またはＭｅｔ（Ｏ）またはＭｅｔ（Ｏ）２のような酸化的に安定なＭｅｔ−置換アミノ酸を有し得る。
【００２７】
本発明の幾つかの態様において、このＧＬＰ−２類似体は適用の際のバックグラウンドに設定された配列を有する野生型ＧＬＰ−２（１−３３）に対し少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性、さらに好ましくは少なくとも６３％の同一性、さらに好ましくは少なくとも６６％の同一性、さらになお好ましくは少なくとも６９％の同一性を有する。
【００２８】
ＧＬＰ−２ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」とは、最大のパーセント配列同一性を達成するように配列を整列し、かつ必要であればギャップを導入し、かついずれの保存された置換も配列同一性の一部として考慮しなかった後の、野生型ＧＬＰ−２配列のアミノ酸残基と同一な候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。配列の整列は、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２または整列ソフトウェアのような公表されているソフトウェアを用いた公知の方法を用いることにより、熟練者によって行なうことができる。整列プログラムについては、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０（１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄ ｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭ Ｅ，ｈｔｍｌ）またはＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４６，２４，３６，１９９７）およびｈｔｔｐ：／／ｍｏｌｂｉｏｌ．ｓｏｔｏｎ．ａｃ．ｕｋ／ｃｏｍｐｕｔｅ／ａｌｉｑｎ．ｈｔｍｌを参照のこと。
【００２９】
ここで用いられ、かつ本発明に従ったパーセンテージ配列同一性はこれらのプログラムを初期設定で用いることにより決定された。さらに一般的には、熟練者は比較される配列の完全長を超えた最大の整列を達成するために必要ないずれのアルゴリズムをも含む、整列決定のための適切なパラメーターを容易に決定することができる。
【００３０】
本発明の別の態様において、上に述べたＧＬＰ−２類似体は位置Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４、Ｘ２８、Ｘ３１、Ｘ３２および／またはＸ３３に１を超える置換（即ち、上で述べられた野生型配列に比較して１を超える置換）を含む。
【００３１】
本発明のさらに別の態様において、上に述べたＧＬＰ−２類似体はＸ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４、Ｘ２８がＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＶａｌから選択される１以上の置換、および位置Ｘ３１、Ｘ３２およびＸ３３の任意の欠失、または医薬的に許容される塩またはその誘導体を含む。
【００３２】
本発明のさらに別の態様において、上に述べたＧＬＰ−２類似体はＸ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４および／またはＸ２８における１以上の位置において置換（即ち、上で述べられた野生型配列に比較した置換）を含む。
【００３３】
本発明の好ましい態様において、上に述べたＧＬＰ−２類似体は本明細書中の表１または表２に開示されたものであるか、または医薬的に許容される塩またはその誘導体である。
【００３４】
本発明の好ましい態様において、上に述べたＧＬＰ−２類似体は一般式ＩＩＩ、
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｘ８−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｘ１１−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘ２０−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘ２４−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘ２８−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−ＮＨ２；
により表され、
【００３５】
式中、
Ｒ１は水素、Ｃ１−４アルキル（例えばメチル）、アセチル、ホルミル、ベンゾイルまたはトリフルオロアセチルであり、
Ｘ８はＡｓｐまたはＳｅｒ、好ましくはＡｓｐ、
Ｘ１１はＳｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、ＬｙｓまたはＡｓｎ、
Ｘ１５はＧｌｕまたはＡｓｐ、好ましくはＧｌｕ、
Ｘ１６はＳｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｕ、
Ｘ２０はＳｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｕ、
Ｘ２４はＳｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｕ、および
Ｘ２８はＳｅｒ、Ａｌａ、ＧｌｎまたはＧｌｕ、または医薬的に許容される塩またはその誘導体である。
【００３６】
本発明の興味深い化合物（式Ｉ）を以下の表に記載する。ここにおいて、前記の化合物は式ＩＩＩにおいてＲ１として記述したようにＮ−末端において修飾され得て、かつ医薬的に許容される塩またはその誘導体を含む。
【００３７】
【表１】
【００３８】
本発明のさらなる化合物は以下の表１に示される。
【００３９】
本発明は、結腸に比した小腸において優先的な増殖促進活性を有する化合物を提供する。特に、ここに記載した実験は、野生型ＧＬＰ−２の位置Ｘ１１および／またはＸ１６および／またはＡｓｎ２０および／またはＸ２４および／またはＸ２８におけるある置換が、試験動物に投与した際に結腸質量の増大に比べて小腸の重量を優先的に増大させることを示している。これらの発見は、例証された化合物が小腸における増大した増殖促進効果を有するが結腸における効果は少ないことが有利である状況、または小腸が傷害されかつ結腸は傷害されていない状況の治療に有用であり得ることを意味する。
【００４０】
従って、小腸の増殖を優先的に起こす化合物は一般的に野生型ＧＬＰ−２の位置１１、１６、２０、２４および／またはＸ２８に１以上の置換（即ち、上で述べられた野生型配列に比較して）を含む。このような化合物は選択的に結腸よりも小腸の増殖を起こし得る。それ故にこれらは小腸に影響するかまたは関連する状態において使用され得る。
【００４１】
好ましくは、このような小腸選択的化合物はＸ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４、および／またはＸ２８のうちの１を超える位置に置換（即ち、上で述べられた野生型配列に比較して）を含む。従ってこの小腸選択的化合物はＸ１１がＳｅｒ、Ｘ１６がＡｌａ、Ｘ２０、Ｘ２４がＡｌａ、Ｘ２８がＡｌａ、Ｘ３１がＩｌｅ、Ｘ３２がＴｈｒおよびＸ３３がＡｓｐである１を超える置換を含み得る。位置Ｘ３１、Ｘ３２およびＸ３３のアミノ酸残基は任意に欠失され得る。
【００４２】
小腸選択的化合物において、Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４およびＸ２８はそれぞれ独立してＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。
【００４３】
例えば、Ｘ１１およびＸ１６はそれぞれ独立してＡｌａまたはＳｅｒであり得て、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８は独立してＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。
【００４４】
例えば、Ｘ１１およびＸ１６は両者ともＡｌａであり得て、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８は独立してＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。
【００４５】
例えば、Ｘ１１およびＸ１６は両者ともＡｌａであり得て、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８の全ては独立してＡｌａまたはＳｅｒであり得る。
【００４６】
これらの一般的基準に当てはまらないその他の残基の組み合わせもまた小腸選択性を提供し得ることが認められ得る。
【００４７】
位置Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４およびＸ２８における好ましい残基の組み合わせは、Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ； Ａｌａ／Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ； Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ａｌａ； Ａｌａ／Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ａｌａ； Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ； Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ａｒｇ／Ａｌａ／Ａｌａ； Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ａｌａ； Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａを含む。
【００４８】
小腸において上皮の増殖を優先的に刺激する例証された化合物は、ＺＰ２２６４、ＺＰ２２６８、ＺＰ２２４２、ＺＰ２２７２、ＺＰ２４１１、ＺＰ２３８０、ＺＰ２３８４、ＺＰ２３９８、ＺＰ２４１７、ＺＰ２４２３、ＺＰ２３８５、ＺＰ２３９９、ＺＰ２４１８、ＺＰ２３８１、ＺＰ２４２０およびＺＰ２３９７を含む。
【００４９】
本発明はまた、結腸に比した胃における優先的な増殖促進活性を有する化合物にも及ぶ。それ故にこれらは胃に影響するかまたは関連する状態において使用され得る。
【００５０】
好ましくは、このような胃選択的化合物はＸ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４、および／またはＸ２８のうちの１を超える位置に置換（即ち、上で述べられた野生型配列に比較して）を含む。位置Ｘ３１、Ｘ３２およびＸ３３のアミノ酸残基は任意に欠失され得る。
【００５１】
例えば、胃選択的化合物において、
Ｘ１１はＬｅｕ、ＰｈｅまたはＬｙｓであり得る。
Ｘ１６はＬｅｕ、ＰｈｅまたはＬｙｓであり得る。
Ｘ２０はＡｌａまたはＳｅｒであり得る。
Ｘ２４はＡｌａ、ＳｅｒまたはＬｙｓであり得る。
Ｘ２８はＡｌａ、ＳｅｒまたはＬｙｓであり得る。
【００５２】
例えば、Ｘ１１およびＸ１６は独立してＬｅｕまたはＰｈｅであり得て、Ｘ２４およびＸ２８は独立してＬｙｓまたはＳｅｒであり得て、かつＸ２０はＳｅｒであり得る。
【００５３】
例えば、Ｘ１１およびＸ１６は独立してＬｅｕまたはＰｈｅであり得て、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８はＳｅｒであり得る。
【００５４】
これらの一般的基準に当てはまらないその他の残基の組み合わせもまた胃選択性を提供し得ることが認められ得る。
【００５５】
位置Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４およびＸ２８における好ましい残基の組み合わせは、Ｌｙｓ／Ｌｙｓ／Ｌｙｓ／Ｌｙｓ／Ｌｙｓ； Ｐｈｅ／Ｐｈｅ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ； Ｌｅｕ／Ｌｅｕ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ； およびＬｅｕ／Ｌｅｕ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒを含む。
【００５６】
胃において上皮の増殖を優先的に刺激する例示された化合物は、ＺＰ２４００、ＺＰ２４１２、ＺＰ２３９６、ＺＰ２３９５、ＺＰ２３９４およびＺＰ２４０１を含む。
【００５７】
好ましくは、このＧＬＰ−２類似体は以下の実施例７に述べる分解試験の少なくとも１つにおける最初の純度に対し少なくとも７０％の観察された純度を維持する。それに加えまたはそれとは別に、０．１ Ｍ ＨＣｌ溶液中における最初の純度に対し１２日後に少なくとも６０％の観察された純度を維持し得る。それに加えまたはそれとは別に、０．１ Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３溶液中における最初の純度に対し６日後に少なくとも７０％の観察された純度を維持し得る。
【００５８】
本発明の別の局面は、少なくとも１ｎＭのＥＣ５０を有し、それ故にＧＬＰ−２アゴニストとして定義される上に述べたＧＬＰ−２類似体に関する。本化合物は実施例９に述べたように分析された。図５に、ＺＰ２２６４のＥＣ５０をＧＬＰ−２アゴニストの例として示す。
【００５９】
さらなる局面において、本発明はここで定義されるＧＬＰ−２類似体、またはその塩または誘導体の、担体との混合物を含む組成物を提供する。好ましい態様において組成物は医薬的に許容される組成物であり、かつ担体は医薬的に許容される担体である。ＧＬＰ−２ペプチド類似体はＧＬＰ−２類似体の医薬的に許容される酸付加塩であり得る。
【００６０】
１つの態様において、本発明は前記のＧＬＰ−２類似体が注射または点滴による投与に適した液体として処方されるか、または緩慢に放出されるように処方された医薬組成物としての、ここで定義されるＧＬＰ−２類似体の使用に関する。
【００６１】
さらなる局面において、本発明はここで定義されるＧＬＰ−２類似体またはその塩を、治療における使用のために提供する。
【００６２】
本発明はさらに、胃および腸関連疾患を治療および／または予防する薬剤の製剤のための、上に述べられたＧＬＰ−２類似体の使用も提供する。
【００６３】
好ましい態様において本発明は、腸機能に欠陥のある新生児、骨粗鬆症、およびＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ）により媒介される状態の治療のような、胃および腸関連疾患を治療および／または予防する薬剤の製剤のためのＧＬＰ−２類似体またはその塩または誘導体の使用に関する。例として胃および腸関連疾患は、潰瘍、ゾリンジャー・エリソン症候群、胃炎、消化障害、吸収不良症候群、短消化管症候群（ｓｈｏｒｔ−ｇｕｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、カルデサック症候群（ｃｕｌ−ｄｅ−ｓａｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性結腸炎）、セリアックスプルー（例えばグルテン誘導性腸疾患またはセリアック病）、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症スプルー、腸炎、下痢を伴う過敏性腸症候群、小腸損傷、および短腸症候群を含む。
【００６４】
別の好ましい態様において、本発明は前記の胃および腸関連疾患が放射線性腸炎、感染性または後感染性腸炎、または有毒剤またはその他の化学療法剤による小腸損傷である際の、上に述べたＧＬＰ−２類似体の使用に関する。
【００６５】
本発明はさらに、化学療法または放射線治療における副作用を治療および／または予防する薬剤の製剤のための、ここで定義されるＧＬＰ−２類似体の使用を提供する。
【００６６】
前記の化学療法および／または放射線の副作用は、下痢、腹部けいれん、嘔吐、または化学療法による治療に起因する腸上皮の構造的および機能的損傷である。
【００６７】
本発明はさらに新生児、骨粗鬆症、およびＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ）により媒介される状態を治療する薬剤の製剤のための、ここで定義されるＧＬＰ−２類似体の使用を提供する。
【００６８】
本発明はまた、それぞれが任意に医薬的に許容される担体と組み合わされる癌化学療法薬剤および本発明のＧＬＰ−２類似体を含む治療キットを提供する。この２つの治療剤は別々の投与のために別々に包装され得る（例えば別々のバイアルで）か、または１つの組成物として提供され得る。従って本発明はさらに、医薬的に許容される担体と組み合わされた癌化学療法薬剤および本発明のＧＬＰ−２類似体を含む医薬組成物を提供する。
【００６９】
胃腸粘膜新生物、または胃腸粘膜新生物の増大したリスクを有する患者にとって、胃腸粘膜新生物の刺激または悪化のような副作用のリスクを減少または抑止するための化合物の選択が望まれ得る。例えば、結腸新生物（良性または悪性にかかわらず）、または結腸新生物発生のリスクを有する患者を治療する化合物を選択する際、非選択性化合物または小腸より結腸に選択性のある化合物よりも、結腸より小腸に選択性のある化合物を選択することがより適切であり得る。
【００７０】
他の局面において、本発明は栄養障害、例えば消耗症候群、悪液質、食欲不振のような状態を治療および／または予防する薬剤の製剤のためのＧＬＰ−２類似体の使用を提供する。
【００７１】
さらなる局面において、本発明はここで定義されるＧＬＰ−２誘導体をコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する。
【００７２】
さらなる局面において、本発明はその発現を誘導する配列と任意に組み合わされた上記の核酸配列を含む発現ベクター、およびこの発現ベクターにより形質転換されたホスト細胞を提供する。このホスト細胞は好ましくはＧＬＰ−２類似体を発現および分泌することができる。尚、さらなる局面において、本発明はＧＬＰ−２類似体の発現に適切な状態の下でホスト細胞を培養すること、およびそれにより産生されたＧＬＰ−２類似体を精製することを含む、ＧＬＰ−２類似体の産生方法を提供する。
【００７３】
本発明はさらに、治療における使用のための本発明の核酸、本発明の発現ベクター、またはＧＬＰ−２類似体を発現および分泌できる本発明のホスト細胞を提供する。この核酸、発現ベクターおよびホスト細胞は、ＧＬＰ−２類似体それ自体により治療され得るここに記述されたいずれの疾患の治療にも使用され得ることが理解され得る。従って本発明のＧＬＰ−２類似体を含む治療組成物、または本発明のＧＬＰ−２類似体の投与についての参考文献は、文脈がそれ以外のものを要求していない限り、本発明の核酸、発現ベクター、またはホスト細胞の投与を包含するものとして解釈されなければならない。
【００７４】
本発明は１つの態様において、胃または腸関連疾患の治療および／または予防、または化学療法または放射線治療による副作用の治療および／または予防、または新生児、骨粗鬆症、またはＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）により媒介される状態を治療する薬剤の製剤における、ここで定義される核酸分子、発現ベクター、またはホスト細胞の使用に関する。
【００７５】
さらなる局面において、本発明は患者の必要性に応じ、効果的な量の本発明の核酸、発現ベクターまたはホスト細胞を投与することによる胃および腸関連疾患の治療法を提供する。胃および腸関連疾患の例は上記の通りである。
【００７６】
さらなる局面において、本発明は患者の必要性に応じ、化学療法または放射線治療による副作用の治療および／または予防する方法を提供する。この方法は効果的な量の本発明の核酸、発現ベクターまたはホスト細胞の投与を含む。
【００７７】
さらなる局面において、本発明は患者の必要性に応じ、栄養障害、例えば消耗症候群、悪液質、食欲不振のような状態を治療または予防する方法を提供する。この方法は効果的な量の本発明の核酸、発現ベクターまたはホスト細胞の投与を含む。
【００７８】
ここで本発明の態様は実施例として、付随する図への参照に限定されることなく更に詳しく記述され得る。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】リファレンス化合物投与後の溶媒コントロールに対する小腸質量の相対的変化。［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２および化合物ＺＰ２２６４、ＺＰ２２６６−ＺＰ２２６８を８００ｎｍｏｌ／ｋｇ、１日１回、３日間投与した。相対的小腸質量は溶媒を投与された動物の小腸質量を１００％として示す。★：溶媒投与に対しＰ＜０．０５。＄：［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２投与に対しＰ＜０．０５。
【００８０】
【図２】リファレンス化合物投与後の溶媒コントロールに対する小腸質量の相対的変化。［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２および化合物ＺＰ２２４２、ＺＰ２２６９およびＺＰ２２７２を８００ｎｍｏｌ／ｋｇ、１日１回、３日間投与した。相対的小腸質量は溶媒を投与された動物の小腸質量を１００％として示す。★：溶媒投与に対しＰ＜０．０５。＄：［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２投与に対しＰ＜０．０５。
【００８１】
【図３】［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２投与動物に化合物ＺＰ２２６４、ＺＰ２２６６−ＺＰ２２６８を８００ｎｍｏｌ／ｋｇ、１日１回、３日間投与した後の、小腸質量／結腸質量の比の変化。相対的小腸（ＳＩ）質量は溶媒を投与された動物の小腸質量を１００％として示す。＄：［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２ 投与に対しＰ＜０．０５。
【００８２】
【図４】［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２投与動物に化合物ＺＰ２２４２、ＺＰ２２６９、ＺＰ２２７２およびＺＰ２２７１を８００ｎｍｏｌ／ｋｇ、１日１回、３日間投与した後の、小腸質量／結腸質量の比の変化。相対的小腸（ＳＩ）質量は［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２を投与された動物の小腸質量を１００％として示す。＄：［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２投与に対しＰ＜０．０５。
【００８３】
【図５】ＢＨＫ−２１細胞に遺伝子組み換え的に発現されたＧＬＰ−２レセプターに対するＺＰ２２６４のアゴニズムのｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング。ＺＰ２２６４のＩＣ ５０は、アゴニストと定義されるために十分な範囲の３．５５Ｅ−１２であった。
【００８４】
【図６】小腸選択性化合物であるＺＰ化合物の小腸／結腸感受性指数。
【図７】胃選択性化合物であるＺＰ化合物の胃／結腸感受性指数。
【００８５】
【図８】非選択性化合物であるＺＰ化合物の小腸／結腸感受性指数。
【００８６】
発明の詳細な説明
定義
他に特定されない限り、以下の定義は上の記述において使用された特定の用語のために提供されるものである。
【００８７】
本明細書およびクレーム中の全般にわたり自然アミノ酸に対する従来のワンレターおよびスリーレターコードが使用され、同様にサルコシン（Ｓａｒ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、およびα−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）のようなその他のα−アミノ酸に対し一般的に許容されるスリーレターコードも使用される。本発明のペプチドの全てのアミノ酸残基は好ましくはＬ−配置であるが、Ｄ−配置アミノ酸もまた存在し得る。
【００８８】
ここで使用される「保存された置換」は、天然のヒトＧＬＰ−２ペプチド配列のある位置に属するアミノ酸残基が、下の表で定義されるような同じグループ（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、１、２、３）に属するアミノ酸残基と交換されていることを意味する。
【００８９】
【表２】
【００９０】
ここで使用される「保存されていない置換」は、天然のヒトＧＬＰ−２配列のアミノ酸残基のその他の置換、例えば非タンパク質アミノ酸（Ｓａｒ、Ｎｌｅ、Ａｉｂ）による置換または同じグループに属していないアミノ酸による置換のような置換を意味する。
【００９１】
結果としてのアルファヘリックスの片側のｈｙｄｒｏｐｈｏｐｈａｔｉｃプロファイルを記述するため、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）１５７，１０５−１３２）により記述された個々のアミノ酸についての疎水性親水性指標（ｈｐｉｘ）が選択された。本発明において、関心のあるヘリックスの概要はアミノ酸位置Ｘ１１−Ｘ１６−Ｘ２０−Ｘ２４−Ｘ２８により示される。
【００９２】
個々のアミノ酸の疎水性親水性指標（ＨＰＩ）は、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）１５７，１０５−１３２）により導入および定義された疎水性親水性指標、ＨＰＩを用いて記述される。
【００９３】
個々のアミノ酸に対するＨＰＩ値は以下の通りである。
アミノ酸 ＨＰＩ値
Ｉ ４．５
Ｖ ４．２
Ｌ ３．８
Ｆ ２．８
Ｃ ２．５
Ｍ １．９
Ａ １．８
Ｇ −０．４
Ｔ −０．７
Ｗ −０．９
Ｓ −０．８
Ｙ −１．３
Ｐ −１．６
Ｈ −３．２
Ｅ −３．５
Ｑ −３．５
Ｄ −３．５
Ｎ −３．５
Ｋ −３．９
Ｒ −４．５
【００９４】
式Ｉの残基Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４、Ｘ２８の結果としてのハイドロファティシティ（ｈｙｄｒｏｐｈａｔｉｃｉｔｙ）プロファイル（ＨＰＰ）は、ＨＰＰ＝Σｈｐｉｘ１１＋ｈｐｉｘ１６＋ｈｐｉＸ２０＋ｈｐｉＸ２４＋ｈｐｉＸ２８
ＨＰＰ≧−１０
ＨＰＰ≧−４
ＨＰＰ≧０
として計算される。
【００９５】
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４、およびＹ５は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｉｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＭｅｔまたはＰｈｅの群から独立して選択できる。Ｙ３は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｉｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｈｅ、Ｖａｌ、ＭｅｔまたはＰｈｅの群から選択できる。
【００９６】
小腸選択性化合物については、ＨＰＰ≧−１０、−４または０という全体的な基準の中で、位置１１および１６のＨＰＩは独立して−０．８≦ＨＰＩ≦３．８であることが望まれ得る。例えばＨＰＩ＝１．８のような、−０．８≦ＨＰＩ≦２．８である。
【００９７】
位置２０、２４および２８については、ＨＰＩは独立して−０．８≦ＨＰＩ２０，２４，２８≦１．８であることが望まれ得る。例えばＨＰＩ２０，２４，２８＝−０．８のような、−０．８≦ＨＰＩ２０，２４，２８≦１．８である。
【００９８】
従って、Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４およびＸ２８の各位置の残基は独立してＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。
【００９９】
例えば、Ｘ１１およびＸ１６はそれぞれ独立してＡｌａまたはＳｅｒ、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８はＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。例えばＸ１１およびＸ１６はＡｌａ、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８はＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。
【０１００】
位置Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４およびＸ２８における好ましい組み合わせは、Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ａｌａ／Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／ＳｅｒおよびＡｌａ／Ａｌａ／Ｇｌｙ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒを含み得る。
【０１０１】
胃選択性化合物については、ＨＰＰ≧−１０、−４または０という全体的な基準の中で、位置１１および１６のＨＰＩは独立して−３．９≦ＨＰＩ１１，１６≦３．８であることが望まれ得る。例えばＨＰＩ１１，１６は２．８≦ＨＰＩ１１，１６≦３．８であり得るか、またはＨＰＩ１１，１６は−３．９であり得る。
【０１０２】
位置２０、２４および２８については、ＨＰＩは独立して−３．９≦ＨＰＩ２０，２４，２８≦１．８であることが望まれ得る。例えばＨＰＩ２０，２４，２８は−０．８≦ＨＰＩ２０，２４，２８≦１．８であり得るか、またはＨＰＩ２０，２４，２８は−３．９であり得る。
【０１０３】
従って、位置Ｘ１１の残基は、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＬｙｓであり得る。
【０１０４】
位置Ｘ１６の残基は、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、ＬｙｓまたはＴｈｒであり得る。
【０１０５】
位置Ｘ２０の残基は、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。
【０１０６】
位置Ｘ２４の残基は、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。
【０１０７】
位置Ｘ２８の残基は、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。
【０１０８】
例えば、Ｘ１１およびＸ１６は独立してＬｅｕまたはＰｈｅであり得て、Ｘ２４およびＸ２８は独立してＡｌａまたはＳｅｒであり得る。
【０１０９】
本発明の好ましい化合物は、特に腸および胃の増殖の原因となる少なくとも１つのＧＬＰ−２生物活性を有する。これは例えば実施例に記載されているような、試験動物をＧＬＰ−２類似体で処理するか、またはＧＬＰ−２に接触させた後で小腸質量またはその一部を判定するｉｎ ｖｉｖｏアッセイにより評価される。
【０１１０】
本発明のＧＬＰ−２類似体は上で定義されたように、天然ＧＬＰ−２に比較して１以上のアミノ酸置換、欠失、反転、または付加を有する。この定義はまた、同義語であるＧＬＰ−２ミメティクスおよび／またはＧＬＰ−２アゴニストも含む。さらに、本発明の類似体はそのアミノ酸側基、α−炭素原子、末端アミノ基、または末端カルボン酸基の１つ以上にさらなる化学修飾を有し得る。化学修飾は、化学成分の付加、新しい結合の創造、および化学成分の除去を含むがこれらに限定されない。アミノ酸側基の修飾は、リジンε−アミノ基のアシル化、アルギニン、ヒスチジン、またはリジンのＮ−アルキル化、グルタミン酸の、またはアスパラギン酸のカルボン酸基のアルキル化、およびグルタミンまたはアスパラギンの脱アミドを含むがこれらに限定されない。末端アミノ基の修飾は、デスアミノ、Ｎ−低級アルキル、Ｎ−ジ低級アルキル、およびＮ−アシル修飾を含むがこれらに限定されない。末端カルボキシ基の修飾は、アミド、低級アルキルアミド、ジアルキルアミド、および低級アルキルエステル修飾を含むがこれらに限定されない。ここで、低級アルキルは好ましくはＣ１−Ｃ４アルキルである。さらに、１つ以上の側基、または末端基は、当業のペプチド化学者に公知の保護基によって保護され得る。アミノ酸のα−炭素はモノ−またはジ−メチル化され得る。
【０１１１】
それらが存在する際、酸化的に安定なＭｅｔ−置換アミノ酸はＭｅｔ（Ｏ）（メチオニンスルホキシド）、Ｍｅｔ（Ｏ）２（メチオニンスルホン）、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｘ（ＧｌｕまたはＧｌｎ）、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、および好ましくはＬｅｕ、Ｎｌｅ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、およびＧｌｙからなる群から選択されるものを意味する。
【０１１２】
本発明のペプチドはまた、塩またはその他の誘導体の形で提供され得ることが理解されなければならない。塩は、酸付加塩および塩基性塩のような医薬的に許容される塩を含む。酸付加塩の例は、塩酸塩、クエン酸塩、および酢酸塩を含む。塩基性塩の例は、Ｒ３およびＲ４が独立して任意にＣ１−６−アルキルに置換されるか、任意にＣ２−６−アルケニルに置換されるか、任意にアリールに置換されるか、または任意にヘテロアリールに置換される際に、陽イオンがナトリウムおよびカリウムのようなアルカリ金属、カルシウムのようなアルカリ土類金属、およびアンモニウムイオン＋Ｎ（Ｒ３）３（Ｒ４）から選択される塩を含む。その他の医薬的に許容される塩の例は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，１７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄ．Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｅｄ．），Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８５およびより最近の版、および Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに記載されている。
【０１１３】
本発明のＧＬＰ−２類似体のその他の誘導体は、Ｍｎ２＋およびＺｎ２＋のような金属イオンとの配位化合物、ｉｎ ｖｉｖｏでの加水分解性エステルのようなエステル、遊離酸または塩基、水和物、プロドラッグ、または脂質を含む。エステルは化合物中に存在する水酸基またはカルボン酸基と適切なカルボン酸またはアルコール反応パートナーとの間で、公知の方法を用いて形成される。化合物のプロドラッグとしての誘導体は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて親化合物の１つへ変換できる。一般的には、化合物のプロドラッグの形においては、少なくとも１つの生物活性が減少され得て、これは化合物またはその代謝産物の放出のためのプロドラッグの変換により活性化される。プロドラッグの例は、ｉｎ ｓｉｔｕでの放出活性化合物では除去され得るか、またはｉｎ ｖｉｖｏでの薬剤のクリアランスを阻害するために役立つ保護基の使用を含む。
【０１１４】
Ｚ１およびＺ２が存在する際、これらはそれぞれに独立して３−２０または４−２０アミノ酸残基、例えば４−１５の範囲、さらに好ましくは４−１０の範囲特に４−７アミノ酸残基の範囲、例えば６アミノ酸残基のような４、５、６、または７アミノ酸残基のペプチド配列を示す。ペプチド配列Ｚ中のそれぞれのアミノ酸残基は独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｏｒｎから選択され得る。好ましくは、アミノ酸残基はＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ、およびＭｅｔ、同様に国際公開第０１／０４１５６号で定義される式Ｉ内のアミノ酸、例えばＤｂｕ（２，４−ジアミノ酪酸）またはＤｐｒ（２，３−ジアミノプロパン酸）、さらに好ましくはＧｌｕ、Ｌｙｓ、およびＭｅｔ、特にＬｙｓから選択される。上記のアミノ酸はＤ−またはＬ−配置のいずれかを有し得るが、好ましくは上記のアミノ酸はＬ−配置を有する。特に好ましい配列Ｚは、４、５、または６の連続したリジン残基、および特に６の連続したリジン残基である。典型的な配列Ｚは国際公開第０１／０４１５６号に示されている。
【０１１５】
ある態様において、Ｚ１は存在しない。このような場合、Ｚ２は存在してもしなくてもよい。
【０１１６】
少なくとも１ ｎＭのＥＣ５０を有するＧＬＰ−２類似体は、ＧＬＰ−２アゴニストと定義される。
【０１１７】
本発明は以下の実験部分においてさらに記述されるペプチドを含む。
【０１１８】
特に好ましい本発明の化合物はＺＰ２２６４、ＺＰ２２６７、ＺＰ２２６８およびＺＰ２２７０を含む。
【０１１９】
安定性試験
熟練者は、例えば以下の記述に基づき、ＧＬＰ−２類似体の分解産物を検出するための適切な方法（例えば定量法）をデザインすることができる。分解は所定のＧＬＰ−２類似体いずれにおいても、同一性およびアミノ酸の位置、およびｐＨ、溶液および温度の状態に依存し、酸化、加水分解および脱アミドとして起こり得る。化合物は、ストレスとなる条件下（即ち、分解の原因となるような状態）でインキュベートし、続いて未変化のペプチドの含量を分析することによる化学的安定性に従い順位付けられる。さらに、ストレスとなる条件下で得られた主要な分解産物について得られた知識は、その後のいずれの分析法開発にも重要となり得る。
【０１２０】
ＧＬＰ類似体検出のための定量アッセイ
熟練者はまた、ＧＬＰ類似体の哺乳類への投与後の吸収、分布、代謝および排泄を調査するため、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞システムでの機能試験の一部として、複雑な環境または溶液（例えば血漿、尿、組織破砕物、細胞破砕物、唾液または類似物）中のＧＬＰ類似体を検出するための方法（例えば定量法）をデザインできる。
【０１２１】
１つの態様において、定量アッセイはＧＬＰ類似体に対して作られた抗体またはその断片に基づくことができる。免疫された動物から得られた抗体は定量アッセイに使用できる。１つの例において、マルチウェルプレート中に固定された分子の一部に親和性を有する第１抗体を用いて直接サンドウィッチＥＬＩＳＡを用意することができる。その後サンプルをウェルへアプライすると、ＧＬＰ類似体は第一抗体により捕捉される。捕捉されたＧＬＰ類似体はその後、ＧＬＰ類似体の別の部分に親和性を有する第二抗体により認識される。第二抗体は酵素（西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはベータガラクトシダーゼ）または放射性同位元素により標識できる。捕捉されたＧＬＰ類似体の量はその後、発色基質の添加、または放射線放出の直接カウント、またはシンチレーションにより検出できる。また捕捉されたＧＬＰ類似体の量は、第二抗体に親和性を有する標識抗体の添加により間接的に検出できる。サンプル中の濃度は既知の量のＧＬＰ類似体を含んだ外部の検量線から得られる反応により測定できる。またこの抗体は、ＧＬＰ類似体に特異的な抗体をマルチウェルプレートに固定化し、サンプルを予め濃度が決定された標識ＧＬＰ類似体と共にウェル中でインキュベートすることによる直接競合免疫アッセイを準備するために使用できる。標識は酵素、フルオロフォア、放射性同位元素、またはビオチンであることができ、例えば酵素に特異的な基質（例えば比色定量の、蛍光定量の、または化学発光の）、シンチレーション、または酵素に結合したアビジンの使用およびそれに続く上記の検出法により検出できる。結合した標識ＧＬＰ類似体の量は適切な方法により検出でき、かつサンプル中に存在するＧＬＰ類似体の濃度は、上で述べたように外部検量線から得られた反応に由来する。
【０１２２】
他の態様において、定量アッセイは液体クロマトグラフィータンデム質量分析法に基づくことができる。このようなセットアップにおいて、研究されるべきＧＬＰ類似体に特異的な断片からの反応は、不活性ガス（ＨｅまたはＡｒ）との衝突により誘導される親化合物の断片化においてモニターされる。断片化に先立ち、サンプル成分は逆相クロマトグラフィーにより分離することができるか、あるいはサンプルは直接質量分析計中に注入できる。サンプルは、それが適切であれば前処理（即ち、プロテアーゼ阻害剤の添加、タンパク質沈殿、固相抽出、免疫親和性抽出など）される。上に述べたように、外部の検量線から得られる反応に由来するサンプル中に存在するＧＬＰ類似体の濃度は、可能性としてＧＬＰ類似体と類似の内部標準物質を用いた補正の後に研究される。
【０１２３】
特異的抗体の産生
ＧＬＰ類似体に対する特異的抗体またはその断片は哺乳類において誘導することができ、かつ血清より精製できる。ＧＬＰ類似体または断片は直接アジュバントと共にウサギ、マウスまたはその他の哺乳類の免疫に使用できるか、またはＧＬＰ類似体またはその断片は担体分子（即ち、キーホールリンペットヘモシアニン、卵白アルブミン、アルブミンなど）に化学的に結合できアジュバントと共に注射できる。抗体の親和性および選択性を良くするため、注射は２−４週間の間隔で、延長された期間繰り返すことができる。ポリクローナル抗体は血清から直接回収できる。モノクローナル抗体を得るため、免疫動物、好ましくはマウスから分離されたＢ細胞は抗体産生ハイブリドーマを形成するために腫瘍細胞と融合されなければならない。適切なクローンおよび抗体のスクリーニングと選択は、固定化されたＧＬＰ類似体またはそのペプチドの使用とそれに続く標識抗体による検出により行うことができる。あるいは、スクリーニングと選択は、固定化された抗体とそれに続く標識ＧＬＰ類似体またはその断片による検出に基づき行うことができる。全てのケースにおいて標識は放射性同位元素、酵素、フルオロフォア、またはビオチンであり得て、例えば酵素に特異的な基質（例えば比色定量の、蛍光定量の、または化学発光の）、シンチレーション、または酵素に結合したアビジンの使用およびそれに続く記述された検出法により検出できる。
【０１２４】
ＧＬＰ−２類似体の合成
本発明の類似体は固相または液相のペプチド合成により合成されることが好ましい。この状況において、国際公開第９８／１１１２５号および、とりわけＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）の中のＦｉｅｌｄｓ，ＧＢ ｅｔ ａｌ．，２００２，“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、およびここでの実施例が参考となる。
【０１２５】
従ってＧＬＰ−２類似体は例えば、
【０１２６】
（ａ）ペプチドを固相または液相のペプチド合成により合成し、その合成ペプチドを回収により得ること、または
【０１２７】
（ｂ）ペプチドが天然アミノ酸から構成される場合、そのペプチドをコードする核酸コンストラクトをホスト細胞内で発現させ、ホスト細胞培養から発現産物を回収すること、または
【０１２８】
（ｃ）ペプチドが天然アミノ酸から構成される場合、そのペプチドをコードする核酸コンストラクトの無細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現を達成し、発現産物を回収すること、または
【０１２９】
ペプチドの断片を得るため（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の方法を組み合わせ、続いてペプチドを得るため断片を連結し、ペプチドを回収することを含む方法、を含む多数の方法により合成され得る。
【０１３０】
従って、本発明の幾つかの類似体にとっては、遺伝子工学技術の活用が有利であり得る。これはペプチドが十分に大きく（または融合コンストラクトとして産生され）、かつそのペプチドが生体中でＲＮＡから翻訳される天然アミノ酸のみを含む際に事例となり得る。
【０１３１】
組み換え遺伝子技術の目的のためには、本発明のペプチドをコードする核酸断片は重要な化学産物である。従って、本発明のさらなる局面は、ペプチドが好ましくは天然アミノ酸から構成される本発明のＧＬＰ−２誘導体をコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する。本発明の核酸断片はＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片のいずれかである。
【０１３２】
本発明の核酸断片は通常クローニングまたは発現ベクターを形成するため適切なベクターに挿入され得て、このような新規のベクターもまた本発明の一部である。本発明のこれらのベクターの構築に関する詳細は、以下、細胞および微生物の形質転換に関連して考察される。ベクターは目的および応用のタイプに応じ、プラスミド、ファージ、コスミド、ミニ染色体、またはウィルスであることができるが、ある細胞に一過性にのみ発現されるネイキッドＤＮＡもまた重要なベクターである。本発明の好ましいクローニングベクターおよび発現ベクター（プラスミドベクター）は自律複製でき、それにより高レベル発現、または後のクローニングのための高レベル複製を目的とした高コピー数を可能にする。
【０１３３】
本発明のベクターの一般的な概要は５’から３’への方向における機能的結合において以下の特徴、即ち本発明の核酸断片の発現を駆動するためのプロモーター、任意に分泌を可能にする（細胞外相（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈａｓｅ）へ、またはそれが適用される際には周辺質内へ）リーダーペプチドまたは複数の用途、例えば混合性の分泌のためのリーダーペプチドをコードする核酸配列、精製タグおよびペプチドの補正またはポリペプチド断片の膜への融合を目的とした酵素による整形（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｔｒｉｍｍｉｎｇ）、本発明のペプチドをコードする核酸断片、および任意に、転写終結区をコードする核酸配列を含む。産生菌種または細胞株中で発現ベクターを操作する際には形質転換細胞の遺伝的安定の目的のため、ホスト細胞中に導入されたベクターはホスト細胞のゲノムに組み込まれることが好ましい。
【０１３４】
本発明のベクターは、ホスト細胞を形質転換して本発明の修飾ペプチドを産生するために使用される。
本発明の一部でもあるこのような形質転換細胞は、本発明の核酸断片およびベクターの増殖のために使用されるか、または組み換え型の本発明のペプチドの産生のために使用される培養細胞または細胞株であることができる。
【０１３５】
本発明の好ましい形質転換細胞は細菌（エシェリキア（例えば結腸菌）、バチルス（例えば枯草菌）、サルモネラ、またはマイコバクテリウム（好ましくはウシ型弱毒結核菌のような非病原性のもの）などの種）、酵母（出芽酵母など）、および原生動物のような微生物である。また、形質転換細胞は多細胞生物由来、即ち真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、または哺乳類細胞であり得る。ヒト由来の細胞もまた興味深い（細胞株およびベクターについての下記の考察を参照）。クローニングおよび／または最適化された発現の目的のために、形質転換細胞は本発明の核酸断片を複製する能力のあることが好ましい。核酸断片を発現する細胞は本発明の有用な態様として好ましく、それらは本発明のペプチドをスモールスケールまたはラージスケールで調整するために使用できる。
【０１３６】
形質転換細胞によって本発明のペプチドを産生する際、発現産物が培養液中に排出されるかまたは形質転換細胞の表面に輸送されることは必須ではないが好都合である。
【０１３７】
効果的な産生細胞が同定された際、それ自体に基づいた、本発明のベクターを有しかつペプチドをコードする核酸断片を発現する安定化細胞株を樹立することが好ましい。
【０１３８】
一般に、ホスト細胞に適合する種由来のレプリコンおよび制御配列を含むプラスミドベクターは、ホスト細胞との関連において使用される。通常、ベクターは複製部位を有し、同様に形質転換細胞における表現型の選択を可能にする標識配列を有する。例えば結腸菌は一般に結腸菌種由来の（例えばＢｏｌｉｖａｒ ｅｔ ａｌ．，１９７７を参照のこと）ｐＢＲ３２２（しかし、その他にも多数の有用なプラスミドが存在する）を用いて形質転換される。ｐＢＲ３２２プラスミドはアンピシリンおよびテトラサイクリンの耐性遺伝子を含んでおり、そのために形質転換細胞の同定を容易にする。ｐＢＲプラスミド、またはその他の微生物プラスミドまたはファージは、発現のために原核微生物により使用することのできるプロモーターを含むか、あるいはプロモーターを含むように改変されていなければならない。
【０１３９】
これらの原核生物組み換えＤＮＡ構築において最も一般的に使用されるプロモーターは、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーターシステム（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９７８；ｌｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９７７； Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９７９）、およびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９７９；ＥＰ００３６７７６Ａ）を含む。これらは最も一般的に使用されるが、その他の微生物プロモーターも発見されかつ利用されており、当業者がそれらをプラスミドベクターに機能的に連結することを可能にするヌクレオチド配列に関する詳細は公表されている（Ｓｉｅｂｗｅｎｌｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９８０）。
【０１４０】
原核生物に加え、酵母培養のような真核微生物もまた使用され、そのプロモーターもまた発現を駆動することができなければならない。真核微生物の多数の種が利用可能であるが、中でも出芽酵母、または一般のパン酵母が最も一般的に使用される。出芽酵母内での発現には、例えばＹＲｐ７プラスミドが一般的に使用される（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．，１９７９；Ｋｉｎｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９７９；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０）。このプラスミドは予め、トリプトファン中で増殖できない変異酵母種、例えばＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，１９７７）に対して選択マーカーを提供するｔｒｐ１遺伝子を含んでいる。酵母ホスト細胞ゲノムの特徴である破壊されたｔｒｐ１は、トリプトファン非存在下での増殖により形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。
【０１４１】
酵母ベクターにおける適切なプロモーター配列は３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８０）、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸脱炭酸酵素、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、およびグルコキナーゼのようなその他の糖分解酵素（Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９６８；Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９７８）のためのプロモーターを含む。適切な発現プラスミドの構築において、これらの遺伝子に付随する終止配列もまた、ｍＲＮＡのポリアデニル化および終止を提供するための発現が望まれるベクターの３’配列に連結される。
【０１４２】
増殖条件により制御される転写のさらなる利点を有するその他のプロモーターは、アルコール脱水素酵素２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に付随する分解酵素、および前述のグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、およびマルトースおよびガラクトース利用原因酵素のためのプロモーター領域である。酵母適合性のプロモーター、複製開始点および終結配列を含むいずれのプラスミドベクターも適切である。
【０１４３】
微生物に加え、多細胞生物由来細胞の培養もまたホストとして試用され得る。原理的にはこのような細胞培養のいずれもが、脊椎動物培養または無脊椎動物培養由来にかかわらず機能する。しかしながら脊椎動物細胞への関心は最も高く、近年脊椎動物の培養における増殖（組織培養）は日常的な方法となりつつある（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９７３）。このように有用なホスト細胞株の例として、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、およびＷ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７ ２９３、ヨトウガ（ＳＦ）細胞（完全な発現システムとして、ｉ．ａ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１０００ リサーチパークウェイ、メリデン、コネチカット ０６４５０、米国、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（私書箱 ２３１２、９７０４ ＣＨ フローニンゲン、オランダ）から市販されているキイロショウジョウバエ細胞株Ｓ２、およびＭＤＣＫ細胞株が挙げられる。
【０１４４】
このような細胞のための発現ベクターは通常（必要であれば）複製開始点、発現されるべき遺伝子の前に位置するプロモーター、必要ないずれかのリボゾーム結合部位に加え、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列を含む。
【０１４５】
哺乳類細胞での使用において、発現ベクターの制御機能はしばしばウィルス性の材料により提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターはポリオーマウィルス、アデノウィルス２、および最も頻繁にはシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）由来である。ＳＶ４０ウィルスの初期および後期プロモーターは、両者共に断片としてＳＶ４０ウィルス性複製開始点を含むウィルスより容易に得られることから特に有用である（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９７８）。比較的小さな、または大きなＳＶ４０断片もまた使用され得て、ここに提供されたものはウィルス性複製開始点に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位に及ぶ約２５０ ｂｐの配列に含まれる。さらに、プロモーターおよび望まれる遺伝子配列に通常付随する制御配列を利用することも可能かつしばしば望まれることであり、提供されたこのような制御配列はホスト細胞システムに適合する。
【０１４６】
複製開始点は、ＳＶ４０またはその他のウィルス（例えばポリオーマウィルス、アデノウィルス、ＶＳＶ、ＢＰＶ）から由来し得るような、外部からの開始点を含むベクターの構築またはホスト細胞の染色体複製メカニズムにより提供され得る。ベクターがホスト細胞染色体に取り込まれるのであれば、しばしば後者が十分である。
【０１４７】
組み換え体産生の過程において十分な収量を得るためには、ペプチドとアフィニティータグ（精製を容易にするための）として役立つ融合パートナーとの融合および／またはペプチドの複数反復を有することにより、この類似体を融合タンパク質として調整することが有利であり得る。これらの方法はペプチダーゼのための適切な切断部位の存在を必要とするが、熟練者は基礎となる遺伝的コンストラクトをどのように作製するかを知り得る。
【０１４８】
組み換え調整の後、本発明のペプチドは多段階クロマトグラフィー（イオン交換、サイズ排除、およびアフィニティークロマトグラフィー法）を含む公知の方法により精製できる。
【０１４９】
また、天然アミノ酸を含むペプチドはｉｎ ｖｉｔｒｏの無細胞システムにより調整できる。これは、ペプチドが想定されたホスト細胞に有毒であり得る場合に特に好都合である。従って、本発明は本発明のペプチドを調整するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏ無細胞翻訳／発現の利用もまた企図する。この状況において、例えばＡｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．（２１３０ウッドワード、オースティン、テキサス７８７４４−１８３２、米国）からの市販のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳キット、材料、および技術文書が参考となる。
【０１５０】
最後に、利用可能な方法は言うまでもなく、例えば半合成の類似体を調整するために組み合わせることができる。このようなセットアップにおいて、ペプチド断片は少なくとも２つの異なった工程または方法の使用により調整され、最終ペプチド産物を得るための断片の連結がそれに続く。
【０１５１】
医薬組成物および投与
本発明のＧＬＰ−２類似体またはその塩または誘導体は、保存または投与のために調整された医薬組成物として処方され得て、これは治療上効果的な量の本発明のＧＬＰ−２類似体ペプチドまたはその塩または誘導体を医薬的に許容される担体中に含む。
【０１５２】
本発明の化合物の治療上効果的な量は、投与経路、治療される哺乳類の型、および検討中の特定の哺乳類の身体的特徴に依存し得る。この量を決定するための、これらの要素およびその関連性は医学当業者に周知である。この量および投与方法は、ペプチドの大腸への送達に最適な効率を達成するため調整できるが、医学当業者に周知の要素である体重、食餌、併用される薬剤、およびその他の要素に依存し得る。
【０１５３】
胃および腸関連疾患を治療または予防するために効果的な量のＧＬＰ−２類似体またはその塩が存在する医薬組成物の提供は、本発明の範囲内である。
【０１５４】
本発明の化合物の酸性成分を有する医薬的に許容される塩は、有機または無機塩基を用いて形成できる。塩基により形成される適切な塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩のような金属塩、例えばナトリウム、カリウム、またはマグネシウム塩；モルホリン、チオモルホリン、ピペリジン、ピロリジン、モノ−、ジ−、またはトリ−低級アルキルアミン（例えば、エチル−ｔｅｒｔ−ブチル−、ジエチル−、ジイソプロピル−、トリエチル−、トリブチル−、またはジメチルプロピルアミン）、またはモノ−、ジ−、またはトリヒドロキシ低級アルキルアミン（例えば、モノ−、ジ−、またはトリエタノールアミン）により形成されるようなアンモニア塩および有機アミン塩を含む。内部塩もまた形成され得る。同様に、本発明の化合物が塩基成分を含む際、塩は有機および無機酸を用いて形成できる。例えば、塩は下記の酸、即ち酢酸、プロピオン酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、マロン酸、マンデル酸、リンゴ酸、フタル酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、メタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、およびカンファースルホン酸、同様にその他の公知の医薬的に許容される酸から形成できる。アミノ酸付加塩もまた、リジン、グリシン、またはフェニルアラニンのようなアミノ酸により形成できる。
【０１５５】
医学当業者にとって明らかであるように、本発明のペプチドまたは医薬組成物の「治療上効果的な量」とは、年齢、体重、および治療される哺乳類の種、使用される特定の化合物、特定の投与方法、および望まれる効果、および治療上の指示に依存して変化し得る。この量を決定するための、これらの要素およびそれらの関連性は医学分野において公知であるため、治療上有効な量のレベル、ここに述べられた腸および胃関連疾患の予防および／または治療において望まれる結果を達成するために必要な量の決定、同様にここに開示されたその他の医学的指示は、熟練者の領域であり得る。
【０１５６】
ここで用いられる「治療上有効な量」とは、所定の状態または病態による症状を減少させる量、および好ましくはその状態または病態を有する個体の生理反応を正常化させる量である。症状の減少または生理反応の正常化は当業における日常的方法を用いて決定でき、所定の状態または病態により変化し得る。１つの局面において、１以上のＧＬＰ−２類似体または１以上のＧＬＰ−２類似体を含む医薬組成物の治療上効果的な量は、測定できる生理的パラメーターを、その状態または病態を持たない個体のパラメーターに対し実質的に同じ値（好ましくはその値の＋３０％以内、さらに好ましくは＋２０％以内まで、およびさらに尚好ましくは＋１０％以内まで）に回復させる量である。
【０１５７】
本発明の１つの態様において、本発明の化合物または医薬組成物の投与は低用量レベルから開始され、腸および胃関連疾患のような関連する医学的徴候の予防／治療に望まれる効果が達成されるまで増大される。これが治療上効果的な量として定義され得る。本発明のペプチドに関しては単独または医薬組成物の一部として、この量は体重当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇないし１０ｍｇ／ｋｇのような、体重当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇ、例えば体重当たり１０−１００μｇ／ｋｇであり得る。
【０１５８】
治療に使用するために選択されたＧＬＰ−２類似体は、医薬的に許容されかつ選択された投与経路によるペプチドの送達に適切な担体と共に処方される。本発明の目的のための末梢の非経口投与は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内の投与経路を含む。本発明で使用される特定の化合物は、経口、経直腸、経鼻、または経下気道経路による投与も許容され得る。これらはいわゆる非−非経口経路（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｒｏｕｔｅ）である。本医薬組成物は、本発明のＧＬＰ−２類似体またはその塩または誘導体、および医薬的に許容される担体を含む。医薬的に許容される適切な担体は希釈剤、賦形剤等のような、ペプチドを基礎とする薬剤に従来から用いられているものである。治療に使用するための医薬的に許容される担体は医薬分野において公知であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ．１９８５）に記載されている。例えば、わずかに酸性、または生理的なｐＨの滅菌生理食塩水およびリン酸緩衝食塩水が使用され得る。ｐＨ緩衝剤はリン酸、クエン酸、酢酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、重炭酸アンモニウム、ジエタノールアミン、好ましい緩衝液としてのヒスチジン、アルギニン、リジン、または酢酸塩またはそれらの混合物であり得る。好ましい緩衝液の範囲は、ｐＨ４−８、ｐＨ６．５−８、さらに好ましくはｐＨ７−７．５である。パラ、メタ、およびオルトクレゾール、メチル−およびプロピルパラベン、フェノール、ベンジルアルコール、安息香酸ナトリウム、安息香酸、安息香酸ベンジル、ソルビン酸、プロパン酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルのような保存料がこの医薬組成物中に提供され得る。アスコルビン酸、メチオニン、トリプトファン、ＥＤＴＡ、アスパラギン、リジン、アルギニン、グルタミンおよびグリシンのような、酸化、脱アミド、異性化、ラセミ化、環化、ペプチドの加水分解を防ぐ安定剤がこの医薬組成物中に提供され得る。ドデシル硫酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、シクロデキストリンのような、凝集、繊維形成および沈殿を防ぐ安定剤がこの医薬組成物中に提供され得る。エタノール、酢酸または酢酸塩およびそれらの塩のような可溶化のための、または凝集を防ぐための有機修飾剤がこの医薬組成物中に提供され得る。塩、例えば塩化ナトリウム、または最も好ましい炭水化物、例えばデキストロース、マンニトール、乳糖、トレハロース、ショ糖またはそれらの混合物のような等張性供給物（ｉｓｏｔｏｎｉｃｉｔｙ ｍａｋｅｒｓ）がこの医薬組成物中に提供され得る。
【０１５９】
Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、ＳＤＳ、ポロクサマー、例えばプルロニックＦ−６８、プルロニックＦ−１２７のような界面活性剤がこの医薬組成物中に提供され得る。色素および香味料までもがこの医薬組成物中に提供され得る。他の態様において、ＧＬＰ−２ペプチド類似体の医薬的に許容される酸付加塩が提供される。懸濁剤が使用され得る。エタノール、第３級ブタノール、２−プロパノール、エタノール、グリセロール、ポリエチレングリコールのような有機修飾剤が、凍結乾燥製品の凍結乾燥のための薬理的処方において提供され得る。増量剤、および塩、例えば塩化ナトリウム、炭水化物、例えばデキストロース、マンニトール、乳糖、トレハロース、ショ糖またはそれらの混合物、アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン酸塩のような等張性供給物（ｉｓｏｔｏｎｉｃｉｔｙ ｍａｋｅｒｓ）、またはシステイン、レシチンまたはヒト血清アルブミン、またはそれらの混合物のような賦形剤が、凍結乾燥のためにこの医薬組成物中に提供され得る。
【０１６０】
本発明の医薬組成物は経口投与のための錠剤、カプセル剤またはエリキシル剤、直腸投与のための坐薬、注射投与のための好ましくは無菌溶液、無菌粉末または懸濁液等として処方されかつ使用され得る。投与の用量および方法は最適な効率を達成するため調整できるが、体重、食餌、併用される薬剤、およびその他の要素としての、医学当業者が認識し得るこれらの要素に依存し得る。
【０１６１】
投与が静脈内投与および皮下投与のように非経口で、例えば毎日投与される際、注射用医薬組成物は従来の形、水溶液または懸濁液のいずれか、凍結乾燥剤、使用直前の再構成または注射に先立つ液体への懸濁に適切な固形剤、または乳剤として調整できる。
【０１６２】
凍結乾燥製品の再構成のための希釈液は上記のリストからの適切な緩衝液、水、生理食塩水、デキストロース、マンニトール、乳糖、トレハロース、ショ糖、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウム、システイン塩酸塩、またはＴｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、ポロクサマー、例えばプルロニックＦ−６８またはプルロニックＦ−１２７のような界面活性剤、ポリエチレングリコール、および／またはパラ、メタ、およびオルトクレゾール、メチル−およびプロピルパラベン、フェノール、ベンジルアルコール、安息香酸ナトリウム、安息香酸、安息香酸ベンジル、ソルビン酸、プロパン酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルのような保存料、および／またはエタノール、酢酸、クエン酸、乳酸またはそれらの塩のような有機修飾剤を加えた注射用の水であり得る。
【０１６３】
さらに、所望されれば、この注射用医薬組成物は湿潤剤、またはｐＨ緩衝剤のような無毒の補助物質を微量含み得る。吸収促進製剤（例えば、リポソーム、界面活性剤および有機酸）が利用され得る。
【０１６４】
本発明の１つの態様において、この化合物は、例えば完全非経口栄養を受けている患者（例えば新生児、または悪液質または食欲不振を患う患者）に液体栄養補助剤として使用する際の点滴による投与のため、または例えば皮下、腹腔内、または静脈内への注射による投与のために処方され、従って無菌で発熱物質を含まない形の、かつ生理的に許容されるｐＨ、例えばわずかに酸性または生理的ｐＨに適宜緩衝された水溶液として利用される。筋肉内投与のための処方は溶液、または植物油、例えばキャノーラ油、コーン油、または大豆油への懸濁液に基づき得る。これらの油を基礎とした処方は、抗酸化物質例えばＢＨＡ（ブチル化ヒドロキシアニソール）およびＢＨＴ（ブチル化ヒドロキシトルエン）により安定化され得る。
【０１６５】
従って、本ペプチド化合物は蒸留水または生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、５％デキストロース溶液または油のような溶媒において投与され得る。ＧＬＰ−２類似体の溶解度は、所望されれば界面活性剤および乳化剤のような溶解度賦活薬の取り込みにより増強され得る。
【０１６６】
ＧＬＰ−２類似体の作用が望まれる場で緩慢に放出されるように、注射液に水性の担体または溶媒を、ＧＬＰ−２類似体を注射部位またはそれに近い部位に蓄えるために役立つ量のゼラチンと共に補うことができる。ヒアルロン酸のような別のゲル化剤も持続性薬剤として有用であり得る。
【０１６７】
本発明の１つの態様における処方は溶液中に、ａ．最終濃度が０．５ｍＭから３００ｍＭ、好ましくは３から２００ｍＭ、最も好ましくは２０から１００ｍＭになるよう水に溶解したＬ−ヒスチジン、ｂ．３５０ｍＭまで、好ましくは３０から３００ｍＭ、最も好ましくは１００ｍＭから２３０ｍＭのマンニトール、およびｃ．２００ｍＭまで、好ましくは０．０５から１００ｍＭ、最も好ましくは０．５から５０ｍＭの酢酸を含む。適切な量の治療化合物が、１から１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５から５０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは１０から３０ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう添加される。最終ｐＨは４から８、好ましくは６．５から７．５、最も好ましくは６．７から７．３に調整される。得られた溶液は目的の重量に調節され、滅菌フィルターを通した後、薬剤としての使用のためバイアル中に適切な分量で分注される。この処方は更に、液体製品または凍結乾燥製品へと加工される。
【０１６８】
本発明の別の態様における処方は溶液中に、ａ．最終濃度が０．５ｍＭから３００ｍＭ、好ましくは３から２００ｍＭ、最も好ましくは２０から１００ｍＭのＬ−ヒスチジンになるよう水に溶解したＬ−ヒスチジン、ｂ．２００ｍＭまで、好ましくは０．５から１００ｍＭ、最も好ましくは５ｍＭから５０ｍＭのＬ−アルギニン、ｃ．３５０ｍＭまで、好ましくは３０から３００ｍＭ、最も好ましくは１００から２３０ｍＭのマンニトール、およびｄ．２００ｍＭまで、好ましくは０．０５から１００ｍＭ、最も好ましくは０．５から５０ｍＭの酢酸を含む。適切な量の治療化合物が、１から１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５から５０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは１０から３０ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう添加される。最終ｐＨは４から８、好ましくは６．５から７．５、最も好ましくは６．７から７．３に調整される。得られた溶液は目的の重量に調節され、滅菌フィルターを通した後、薬剤としての使用のためバイアル中に適切な分量で分注される。この処方は更に、液体製品または凍結乾燥製品へと加工される。
【０１６９】
さらに本発明の別の態様における処方は溶液中に、ａ．最終濃度が２００ｍＭまで、好ましくは３から１００ｍＭ、最も好ましくは５から５０ｍＭのＬ−ヒスチジンになるよう水に溶解したＬ−ヒスチジン、ｂ．２００ｍＭまで、好ましくは０．５から１００ｍＭ、最も好ましくは５ｍＭから５０ｍＭのＬ−アルギニン、ｃ．３５０ｍＭまで、好ましくは３０から３００ｍＭ、最も好ましくは１００から２３０ｍＭのマンニトール、およびｄ．２００ｍＭまで、好ましくは０．０５から１００ｍＭ、最も好ましくは０．５から５０ｍＭの酢酸を含む。
【０１７０】
適切な量の治療化合物が、１から１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５から５０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは１０から３０ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう添加される。
【０１７１】
最終ｐＨは４から８、好ましくは６．５から７．５、最も好ましくは６．７から７．３に調整される。得られた溶液は目的の重量に調節され、滅菌フィルターを通した後、薬剤としての使用のためバイアル中に適切な分量で分注される。この処方は更に、液体製品または凍結乾燥製品へと加工される。
【０１７２】
尚、さらに本発明の別の態様における処方は溶液中に、ａ．最終濃度が．０．５から３００ｍＭまで、好ましくは３から２００ｍＭ、最も好ましくは２０から１００ｍＭのＬ−ヒスチジンになるよう水に溶解したＬ−ヒスチジン、ｂ．２００ｍＭまで、好ましくは０．５から１００ｍＭ、最も好ましくは５ｍＭから５０ｍＭのＬ−アルギニン、ｃ．３５０ｍＭまで、好ましくは３０から３００ｍＭ、最も好ましくは１００から２３０ｍＭのマンニトール、およびｄ．２００ｍＭまで、好ましくは０．０５から１００ｍＭ、最も好ましくは０．５から５０ｍＭの酢酸を含む。
【０１７３】
適切な量の治療化合物が、１から１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５から５０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは１０から３０ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう添加される。
【０１７４】
最終ｐＨは４から８、好ましくは６．５から７．５、最も好ましくは６．７から７．３に調整される。得られた溶液は目的の重量に調節され、滅菌フィルターを通した後、薬剤としての使用のためバイアル中に適切な分量で分注される。この処方は更に、液体製品または凍結乾燥製品へと加工される。
【０１７５】
尚、さらに本発明の別の態様における処方は溶液中に、ａ．最終濃度が２００ｍＭまで、好ましくは３から１００ｍＭ、最も好ましくは５から５０ｍＭのＬ−ヒスチジンになるよう水に溶解したＬ−ヒスチジン、ｂ．２００ｍＭまで、好ましくは０．５から１００ｍＭ、最も好ましくは５ｍＭから５０ｍＭのＬ−アルギニン、ｃ．３５０ｍＭまで、好ましくは３０から３００ｍＭ、最も好ましくは１００から２３０ｍＭのマンニトール、およびｄ．２００ｍＭまで、好ましくは０．０５から１００ｍＭ、最も好ましくは０．５から５０ｍＭの酢酸を含む。
【０１７６】
適切な量の治療化合物が、１から１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５から５０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは１０から３０ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう添加される。
【０１７７】
最終ｐＨは４から８、好ましくは６．５から７．５、最も好ましくは６．７から７．３に調整される。得られた溶液は目的の重量に調節され、滅菌フィルターを通した後、薬剤としての使用のためバイアル中に適切な分量で分注される。この処方は更に、液体製品または凍結乾燥製品へと加工される。
【０１７８】
尚、さらに本発明の別の態様において処方は、ａ．最終濃度が２００ｍＭまで、好ましくは０．５から１００ｍＭ、最も好ましくは５から５０ｍＭのＬ−ヒスチジンになるよう水に溶解したＮ−アセテート、ｂ．３５０ｍＭまで、好ましくは３０から３００ｍＭ、最も好ましくは１００から２３０ｍＭのマンニトールを含む。
【０１７９】
適切な量の治療化合物が、１から１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５から５０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは１０から３０ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう添加される。
【０１８０】
最終ｐＨは４から８、好ましくは６．５から７．５、最も好ましくは６．７から７．３に調整される。得られた溶液は目的の重量に調節され、滅菌フィルターを通した後、薬剤としての使用のためバイアル中に適切な分量で分注される。この処方は更に、液体製品または凍結乾燥製品へと加工される。
【０１８１】
本発明のＧＬＰ−２類似体はまた、ＧＬＰ−２ペプチド類似体の延長性かつ持続性の投与のための徐放注入手段として処方され得る。このような持続放出処方は、身体の外部に置くパッチの形であり得る。持続放出処方の例は、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、シアル酸、ケイ酸塩、コラーゲン、リポソーム等のような生体適合性ポリマーの複合体を含む。持続放出処方は、本発明のＧＬＰ−２類似体の高い局所濃度の提供が望まれる際に特に関心が持たれ得る。
【０１８２】
このＧＬＰ−２類似体は、腸栄養性（ｉｎｔｅｓｔｉｎｏｔｒｏｐｈｉｃ）の量のペプチドを、単位用量または複数回用量のいずれかで含む無菌充填バイアルまたはアンプルの形で利用され得る。このバイアルまたはアンプルは、ＧＬＰ−２類似体および望ましい担体を直ちに投与できる処方で含み得る。また、このバイアルまたはアンプルは、ＧＬＰ−２ペプチドを滅菌水またはリン酸緩衝食塩水のような適切な担体中で再構成するために適切な、凍結乾燥型のような形で含み得る。
【０１８３】
ＧＬＰ−２類似体は、注射用処方の代替物としての他経路による投与のために処方され得る。錠剤、カプセル剤等のような経口製剤は、標準的な製薬業務に従い処方できる。本発明によると、ＧＬＰ−２類似体は小腸組織の増殖が有益である個体の治療のために投与される。
【０１８４】
経鼻製剤は、キトサンまたはＴｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、ポロクサマー、例えばプルロニックＦ−６８またはプルロニックＦ−１２７、Ｂｒｉｊ ３５、Ｂｒｉｊ ７２、クレモフォールＥＬ等の界面活性剤のような賦活薬の添加により処方できる。
【０１８５】
本発明のペプチド化合物は単独、または抗炎症作用を有する化合物と組み合わせて使用され得る。理論には制約されず、このような組み合わせの治療は本ペプチド類似体の有益な治療効果を強化するであろうことが想像される。
【０１８６】
言うまでもなく、患者を治療するための最も適切な投与量および投与計画は、治療されるべき疾患および状態、および患者の体重およびその他のパラメーターにより異なる。特定の理論による制約を意図せず、μｇ／ｋｇ範囲における投与量、および比較的短いか長い期間または治療頻度は、特に小腸質量の統計的に有意な増大のように治療上有用な結果を生み出し得ることが期待される。幾つかの例において、治療上の投与計画は最初の治療の休止に続いて起こる組織退縮を防ぐための維持量の投与を含み得る。本発明により得られる結果によりヒトへの使用における最も適切な投与量の規模および投与計画が導かれ得て、かつ適切に計画された治験により確認され得る。
【０１８７】
効果的な量および治療プロトコルは、実験動物において低用量から開始し、その効果をモニターしながら用量を増やしていき、同様に投与計画も系統的に変化させるという従来の方法により決定され得る。所定の患者に対する最適な投与量を決定する際には医師により多数の要素が考慮され得る。このような考慮は熟練者に公知である。本発明によるＧＬＰ−２ペプチドのヒトに対する量は、１つの態様において約１０μｇ／ｋｇ体重／日から約１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約５０μｇ／ｋｇ／日から約５ｍｇ／ｋｇ／日、および最も好ましくは約１００μｇ／ｋｇ／日から１ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。
【０１８８】
医学的状態
本発明のペプチドは、ここに述べられた効果的な量のＧＬＰ−２類似体またはその塩の投与による、食道の上部消化管を含む胃−腸関連疾患を患う個体の予防および治療のための薬剤として有用である。胃および腸関連疾患は、いずれの病因にもよる潰瘍（例えば、消化性潰瘍、ゾリンジャー・エリソン症候群、薬物誘導性潰瘍、感染またはその他の病原体に関連する潰瘍）、消化疾患、吸収不良症候群、短腸症候群、カルデサック症候群（ｃｕｌ−ｄｅ−ｓａｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性結腸炎）、セリアックスプルー（例えばグルテン誘導性腸疾患またはセリアック病）、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症スプルー、および化学療法および／または放射線血液療法誘導性の粘膜炎および下痢を含む。
【０１８９】
胃腸粘膜新生物、または胃腸粘膜新生物の増大したリスクを有する患者にとって、胃腸粘膜新生物の刺激または悪化のような副作用のリスクを減少または抑止するための化合物の選択が望まれ得る。例えば、結腸新生物（良性または悪性にかかわらず）、または結腸新生物発生のリスクを有する患者を治療する化合物を選択する際、非選択性化合物または小腸より結腸に選択性のある化合物よりも、結腸より小腸に選択性のある化合物を選択することがより適切であり得る。
【０１９０】
一般には上で述べたように、増大した小腸質量、および結果としてのおよび／または維持されている正常な小腸粘膜構造および機能が有益である個体は、本ＧＬＰ−２類似体による治療の候補である。ＧＬＰ−２類似体により治療され得る特定の状態は、熱からアルファグリアジンへの有毒反応に起因し、グルテン誘導性腸疾患またはセリアック病の結果となり得て、かつ小腸絨毛の有意な減少により特徴付けられるセリアックスプルー、感染に起因し、絨毛の部分的な平坦化により特徴付けられる熱帯性スプルー、一般的な可変性の免疫不全または低ガンマグロブリン血症の患者に一般的に見られ、絨毛の高さの有意な減少により特徴付けられる低ガンマグロブリン血症スプルーを含む様々な形のスプルーを含む。ＧＬＰ−２類似体による治療の治療的有効性は、絨毛の形態を調べるための腸内生検、栄養吸収の生化学的評価、腸透過性の非侵襲的な決定、患者の体重増加、またはこれらの状態に付随する症状の寛解によりモニターされ得る。本発明のＧＬＰ−２類似体は、いずれの病因にもよる潰瘍（例えば、消化性潰瘍、ゾリンジャー・エリソン症候群、薬物誘導性潰瘍、感染またはその他の病原体に関連する潰瘍）を含む胃関連疾患の予防または治療のための薬剤として有用であり得る。
【０１９１】
それに加えて本発明のＧＬＰ−２類似体により治療され得るその他の状態、またはＧＬＰ−２類似体が予防的に有用である状態は、前記の放射線性腸炎、感染性または後感染性腸炎、および癌化学療法剤または有毒剤による小腸損傷を含む。
【０１９２】
ＧＬＰ−２類似体はまた、栄養障害、例えば悪液質および食欲不振の治療に使用され得る。
【０１９３】
本発明の特定の態様は、本ペプチドを腸損傷および機能不全の予防および／または治療のために使用することに関わる。小腸粘膜の幹細胞はその増殖の割合が速いため、化学療法による細胞傷害性効果に影響されやすい（Ｋｅｅｆｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｕｔ ２０００；４７：６３２−７）。本ＧＬＰ−２ペプチドアゴニストの投与は小腸陰窩における栄養効果を増強し、かつ化学療法および／または放射線療法により損傷された腸上皮と置き換えるための新しい細胞を迅速に供給する。本ペプチド投与により達成される最終的な目標は、化学療法を受けている患者の胃腸損傷に関わる罹患率を減少させ、より侵襲的な化学療法、放射線および化学療法と放射線療法の組み合わせへの耐性を増大させることである。本発明に従い、併用される予防的または治療的処置が、放射線療法を受けているか、または受けようとしている患者に提供され得る。
【０１９４】
抗癌化学療法の後に起こる胃腸粘膜炎は次第に寛解するものの、一旦起こると基本的には治療できないことからますます問題となっている。一般に使用されている細胞増殖抑制性の癌治療剤５−ＦＵおよびイリノテカンを用いて行われた研究により、これらの薬剤による効果的な化学療法は主に小腸の完全な構造および機能に影響を与えるが、結腸への影響は少なく、主に粘液形成の増大として反応することが示された（Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．１８（９）：１０９５−１１００，２００３；Ｔａｍａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ ｌｎｔ Ｍｅｄ Ｒｅｓ．３１（１）：６−１６，２００３）。この潜在的に重要な治療応用は、５−ＦＵ、アルトレタミン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クリサンタスペース（Ｃｒｉｓａｎｔａｓｐａｓｅ）、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、リポソーマルドキソルビシン、ロイコボリン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、テモゾロミド、チオテパ、チオグアニン（Ｔｉｏｇｕａｎｉｎｅ／Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クリサンタスペース（Ｃｒｉｓａｎｔａｓｐａｓｅ）、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、リポソーマルドキソルビシン、ロイコボリン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、テモゾロミド、チオテパ、チオグアニン（Ｔｉｏｇｕａｎｉｎｅ／Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンのような現在使用されている化学療法剤に応用し得るが、これらに限定されない。
【０１９５】
本ペプチドは、効果的な量のＧＬＰ−２類似体またはその塩の投与による新生児を治療するための方法に使用され得ることが想定される。未発達な腸が原因の、摂食により起こる新生児の合併症は本ペプチドアゴニストの使用によって克服され得る。
【０１９６】
別の態様において、本発明は患者の必要に応じた効果的な量のＧＬＰ−２類似体またはその塩を投与することにより、ＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ）により媒介される状態を治療する方法について述べる。このような疾患はＤＰＰ−ＩＶ酵素が過剰発現された状態を含む。
【０１９７】
上に述べたように１つの態様において、この医薬組成物は前記のＧＬＰ−２類似体またはその塩またはその誘導体が徐放されるように処方され得る。
【０１９８】
本ペプチドは、効果的な量のＧＬＰ−２類似体またはその塩の投与により新生児を治療するための方法に使用され得ることが想定される。未発達な腸のために、摂食により起こる新生児の合併症は本ペプチドアゴニストの使用により克服され得る。
【０１９９】
別の態様において、本発明は患者の必要に応じた効果的な量のＧＬＰ−２類似体またはその塩を投与することにより、ＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ）により媒介される状態を治療する方法について述べる。このような疾患はＤＰＰ−ＩＶ酵素が過剰発現された状態を含む。
【実施例】
【０２００】
以下の実施例は本発明の好ましい局面を例証するために提供され、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【０２０１】
一般的なペプチド合成
装置および合成ストラテジー
ペプチドは、側鎖官能性のためのＮ−α−アミノ保護基としての９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）および適切な一般保護基を用いた濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中でバッチ式に合成された。
【０２０２】
溶媒
溶媒のＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｒｉｅｄｅｌ ｄｅ−Ｈａｅｎ、ドイツ）は強力な陽イオン交換樹脂を充填したカラム（Ｌｅｗａｔｉｔ Ｓ １００ＭＢ／Ｈ強酸、バイエルＡＧ Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ、ドイツ）を通して精製し、遊離アミンについては、遊離アミンが存在すると黄色（Ｄｈｂｔ−Ｏ−アニオン）を呈する３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ−ＯＨ）の添加によって使用前に分析した。溶媒のＤＣＭ（ジクロロメタン、分析グレード、Ｒｉｅｄｅｌ ｄｅ−Ｈａｅｎ、ドイツ）は、精製せず直接使用した。アセトニトリル（ＨＰＬＣ−グレード、Ｌａｂ−Ｓｃａｎ、ダブリン、アイルランド）は、精製せず直接使用した。
【０２０３】
アミノ酸
Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸は側鎖が保護された適切な形でＡｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ（ＡＣＴ）より購入した。
【０２０４】
共役試薬
共役試薬のジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＧ）は、Ｒｉｅｄｅｌ ｄｅ−Ｈａｅｎ、ドイツ、から購入した。
【０２０５】
固体支持体
ペプチドは０．２２−０．３１ｍｍｏｌ／ｇのＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ樹脂上で合成した。ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ−Ｒａｍ、ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）Ｆｍｏｃ（Ｒａｐｐ ｐｏｌｙｍｅｒｅ、ドイツ）はＣ−末端がアミド化されたペプチドが好ましい場合に使用したが、ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＰＨＢ、ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＰＨＢ Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＦｍｏｃはＣ−末端が遊離カルボン酸であることが好ましい場合に使用した。
【０２０６】
触媒およびその他の試薬
ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）はＡｌｄｒｉｃｈ、ドイツから、ピペリジンおよびピリジンはＲｉｅｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ、フランクフルト、ドイツから、エタンジチオールはＲｉｅｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ、フランクフルト、ドイツから購入した。３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ−ＯＨ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（ＨＯＡｔ）はＦｌｕｋａ、スイスから入手した。無水酢酸はＦｌｕｋａから入手した。
【０２０７】
共役方法
アミノ酸は、ｉｎ ｓｉｔｕで産生されたＨＯＢｔまたはＨＯＡｔエステルとして共役され、ＤＭＦ中でＤＩＣを用い、適切なＮ−α−保護アミノ酸およびＨＯＢｔまたはＨＯＡｔから作られた。
【０２０８】
Ｎ−α−アミノ保護基（Ｆｍｏｃ）の脱保護
Ｆｍｏｃ基の脱保護は、ＤＭＦ中での２０％ピペリジンによる処理（１ｘ５および１ｘ１０分）、続くＤＭＦによる洗浄（５ｘ１５ｍｌ、各５分）により行った。洗浄はＤＭＦ廃液中にＤｈｂｔ−ＯＨを加えた後、黄色が検出されなくなるまで行った。
【０２０９】
ＨＯＢｔ−エステルの共役
３当量のＮ−α−保護アミノ酸を３当量のＨＯＢｔおよび３当量のＤＩＣと共にＤＭＦに溶解し、次いで樹脂に加えた。
【０２１０】
酸によるペプチドの樹脂からの切断
ペプチドは、９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ、フランクフルト、ドイツ）水ｖ／ｖまたは９５％ＴＦＡおよび５％エタンジチオールｖ／ｖにより室温で２時間処理し、樹脂から切断した。濾過した樹脂は９５％ＴＦＡ水で洗浄し、濾過物および洗浄液は減圧下で蒸発させた。残渣はエーテルで洗浄し、酢酸水から凍結乾燥した。未精製の凍結乾燥物は高速液体クロマトグラフィーにより分析し、マススペクトロメトリー（ＭＳ）により同定した。
【０２１１】
ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂（ＰＥＧ−ＰＳ）上におけるバッチ式ペプチド合成
ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂（１ｇ、０．２３−０．２４ｍｍｏｌ／ｇ）を、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に配置した。樹脂はＤＭＦ（１５ｍｌ）中で膨潤させ、リンカーＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ上、または樹脂ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）Ｆｍｏｃ上の最初のアミノ酸上のいずれかに存在する最初のＦｍｏｃ基を除去するため、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンで処理した。樹脂を排出し、ＤＭＦ廃液中にＤｈｂｔ−ＯＨを加えた後黄色が検出されなくなるまで、ＤＭＦにより洗浄した。配列に従ったアミノ酸は、上に述べたように予めＦｍｏｃ保護されたＨＯＢｔエステル（３当量）として共役させた。共役は他に記載のない限り２時間継続した。樹脂を排出し、過剰の試薬を除くためにＤＭＦで洗浄した（５ｘ１５ｍｌ、各５分）。全てのアシル化は、上に述べたようにニンヒドリン試験によって調べた。合成が完了した後、ペプチド−樹脂はＤＭＦ（３ｘ１５ｍｌ、各５分）、ＤＣＭ（３ｘ１５ｍｌ、各１分）および最後にジエチルエーテル（３ｘ１５ｍｌ、各１分）で洗浄し、真空乾燥した。ペプチドは先に述べたように樹脂から切断し、未精製のペプチド産物は以下に述べるように分析、および精製した。
【０２１２】
ＨＰＬＣの条件
勾配ＨＰＬＣ分析は、ＨＰ １１００ Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙポンプ、ＨＰ １１００オートサンプラー、ＨＰ １１００カラムサーモスタット、およびＨＰ １１００多波長検出器から成る、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ＨＰ １１００ ＨＰＬＣシステムを用いて行った。機器の制御およびデータの取得には、ＬＣソフトウェア（ｒｅｖ． Ａ．０６．０１）のためのＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎを使用した。以下のカラムおよびＨＰＬＣバッファーシステムを使用した。
【０２１３】
カラム：ＶＹＤＡＣ ２３８ＴＰ５４１５、Ｃ−１８、５ｍｍ、３００Å １５０ｘ４．６ｍｍ
緩衝液：Ａ：ＭＱＶ中の０．１％ＴＦＡ；Ｂ：０．０８５％ＴＦＡ、１０％ＭＱＶ、９０％ＭｅＣＮ
勾配：０−１．５分 ０％Ｂ
１．５−２５分 ５０％Ｂ
２５−３０分 １００％Ｂ
３０−３５分 １００％Ｂ
３５−４０分 ０％Ｂ
フロー １ｍｌ／分、乾燥温度４０℃、ＵＶ検出：Ｉ＝２１５ｎｍ
【０２１４】
未精製ペプチドのＨＰＬＣ精製
未精製のペプチド産物はＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＶＩＳＩＯＮ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにて精製した。機器の制御およびデータの取得には、ＶＩＳＩＯＮ ３．０ソフトウェアを使用した。以下のカラムおよびＨＰＬＣバッファーシステムを使用した。
カラム：Ｋｒｏｍａｓｉｌ ＫＲ １００Å、１０ｍｍ Ｃ−８、２５０ｘ５０．８ｍｍ
バッファーシステム：緩衝液：Ａ：ＭＱＶ中の０．１％ＴＦＡ；Ｂ：０．０８５％ＴＦＡ、１０％ＭＱＶ、９０％ＭｅＣＮ
勾配：０−３７分 ０−４０％Ｂ
フロー ３５ｍｌ／分、ＵＶ検出：Ｉ＝２１５ｎｍおよび２８０ｎｍ
【０２１５】
質量分析法
ペプチドは、１ないし１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう、ｓｕｐｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔメタノール（Ｌａｂｓｃａｎ、ダブリン、アイルランド）、ミリＱ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ベッドフォード、マサチューセッツ）、およびギ酸（Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット、ドイツ）（５０：５０：０．１ｖ／ｖ／ｖ）に溶解した。ペプチド溶液（２０ｍｌ）はＬＣＴ質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）を用いたＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる陽極性モードで、＋／−０．１ｍ／ｚの精度にて分析した。
【０２１６】
一般的合成方法
全ての合成において、乾燥ＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｓ−Ｒａｍ樹脂（１ｇ、０．２２−０．３１ｍｍｏｌ／ｇ）は濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に配置した。樹脂はＤＭＦ（１５ｍｌ）中で膨潤させ、樹脂上のプロトン化していないアミノ基の存在を確保するためＤＭＦ中の２０％ピペリジンで処理した。樹脂を排出し、ＤＭＦ廃液中にＤｈｂｔ−ＯＨを加えた後黄色が検出されなくなるまで、ＤＭＦにより洗浄した。配列に従ったアミノ酸は、上に述べたように予めＦｍｏｃ保護されたＨＯＢｔエステル（３当量）として共役させた。共役は他に記載のない限り２時間継続した。樹脂を排出し、過剰の試薬を除くためにＤＭＦで洗浄した（５ｘ１５ｍｌ、各５分）。全てのアシル化は、ニンヒドリン試験を８０℃で行なうことにより調べた。合成が完了した後、ペプチド−樹脂はＤＭＦ（３ｘ１５ｍｌ、各５分）、ＤＣＭ（３ｘ１５ｍｌ、各１分）および最後にジエチルエーテル（３ｘ１５ｍｌ、各１分）で洗浄し、真空乾燥した。その後ペプチドは上に述べたように樹脂から切断し、凍結乾燥した。
【０２１７】
上に述べたように、調製用ＨＰＬＣを用いた精製の後ペプチド産物を回収し、ペプチドの同一性をＥＳ−ＭＳにより確認した。この方法は、以下においてさらに例証される全てのペプチドの合成に使用した。
【０２１８】
合成された化合物
上記の手法を用いて、１８０９から１８６１までの化合物およびリファレンス化合物１５５９（Ｈ−［Ｇｌｙ２］ｈＧＬＰ−２−ＯＨ）を上に述べた方法により合成した（表１）。
【０２１９】
【表３】
【０２２０】
実施例１．化合物２２６４の合成
ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ上の、
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−ＮＨ２
【０２２１】
乾燥ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ（０．２ｍｍｏｌ／ｇ、１ｇ）を濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に配置し、「ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂上のバッチ式ペプチド合成」として記述したように、Ｎ−末端のヒスチジンの共役が終了するまで処理した。全ての共役はオーバーナイトで継続した。アシル化は先に述べたように調べた。合成およびＮ−末端のＦｍｏｃ基の脱保護が完了した後、ペプチドを上に述べたように樹脂から切断した。先に述べたように調整用ＨＰＬＣを用いて精製した後、４１３ｍｇのペプチド産物を９３％を超える純度で回収し、ペプチドの同一性をＭＳ（実測Ｍ ３４８８．１３、算出Ｍ ３４８７．７９）により確認した。
【０２２２】
実施例２．化合物２２６８の合成
ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ上の、
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−ＮＨ２
【０２２３】
乾燥ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ（０．２ｍｍｏｌ／ｇ、１ ｇ）を濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に配置し、「ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂上のバッチ式ペプチド合成」として記述したように、Ｎ−末端のヒスチジンの共役が終了するまで処理した。全ての共役はオーバーナイトで継続した。アシル化は先に述べたように調べた。合成およびＮ−末端のＦｍｏｃ基の脱保護が完了した後、ペプチドを上に述べたように樹脂から切断した。先に述べたように調整用ＨＰＬＣを用いて精製した後、１３２ ｍｇのペプチド産物を９１％を超える純度で回収し、ペプチドの同一性をＭＳ（実測Ｍ ３５３５．８８、算出Ｍ ３５３５．７７）により確認した。
【０２２４】
実施例３．化合物２２６４（Ｌｙｓ６）の合成
ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｆｍｏｃ上の、
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ ＮＨ２
【０２２５】
乾燥ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｆｍｏｃ（０．２４ｍｍｏｌ／ｇ、１ｇ）を濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に配置し、「ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂上のバッチ式ペプチド合成」として記述したように、Ｎ−末端のヒスチジンの共役が終了するまで処理した。全ての共役はオーバーナイトで継続した。アシル化は先に述べたように調べた。合成およびＮ−末端のＦｍｏｃ基の脱保護が完了した後、ペプチドを上に述べたように樹脂から切断した。先に述べたように調整用ＨＰＬＣを用いて精製した後、ペプチド産物を９０％を超える純度で回収し、ペプチドの同一性をＭＳ（実測Ｍ ４２５６．４０、算出Ｍ ４２５６．３６）により確認した。
【０２２６】
実施例４． 化合物２２６８（Ｌｙｓ６）の合成
ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｆｍｏｃ上の、
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ ＮＨ２
【０２２７】
乾燥ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｆｍｏｃ（０．２４ｍｍｏｌ／ｇ、１ｇ）を濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に配置し、「ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂上のバッチ式ペプチド合成」として記述したように、Ｎ−末端のヒスチジンの共役が終了するまで処理した。全ての共役はオーバーナイトで継続した。アシル化は先に述べたように調べた。合成およびＮ−末端のＦｍｏｃ基の脱保護が完了した後、ペプチドを上に述べたように樹脂から切断した。先に述べたように調整用ＨＰＬＣを用いて精製した後、ペプチド産物を９０％を超える純度で回収し、ペプチドの同一性をＭＳ（実測Ｍ ４３０４．１０、算出Ｍ ４３０４．３４）により確認した。
【０２２８】
実施例５． 化合物２２６４ Ａ（酢酸塩）の合成
トリフルオロ酢酸塩から化合物２２６４の酢酸塩への対イオン交換。未精製の合成ペプチド産物の精製に使用したＨＰＬＣ緩衝液中に存在するトリフルオロ酢酸（０．１％ ｖ／ｖ）により、化合物２２６４の精製合成ペプチド産物をトリフルオロ酢酸塩として分離した。
【０２２９】
トリフルオロ酢酸塩を酢酸塩に対イオン交換するため、ペプチド溶液を酢酸塩型の強塩基イオン交換樹脂を充填したカラム（Ｄｏｗｅｘ １ｘ８）に通した。化合物２２６４Ｔを水に溶解した。この溶液を酢酸塩型の強塩基イオン交換樹脂を充填したカラム（Ｄｏｗｅｘ １ｘ８、容量１．３３ｍｅｑ／ｍｌ樹脂）に通した。樹脂を水で洗浄し、溶出液を集め、純度が９０％を超える酢酸塩になるよう凍結乾燥した。
【０２３０】
実施例６．化合物２２６４Ｃ（塩化物）の合成
トリフルオロ酢酸塩（Ｔｆａ）から化合物２２６４Ｃの塩化物（Ｃｌ−）への対イオン交換。化合物２２６４Ｔを０．１Ｍの塩酸に溶解し、その溶解液を凍結乾燥した。その残留物（ｒｅｍａｎｅｎｃｅ）を水に溶解し、純度が９０％を超える塩化物になるよう再び凍結乾燥した。
【０２３１】
さらなる選択的ＧＬＰ−２類似化合物を表２に示す。
【表４Ａ】
【０２３２】
【表４Ｂ】
【０２３３】
【表４Ｃ】
【０２３４】
実施例７．相対的化学安定性試験
表３に示した化合物を名目上濃度（ｎｏｍｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）が０．５ｍＭになるように０．１Ｍ ＨＣｌに溶解した。サンプルは遮光下、４０℃で７日間インキュベートした後、名目上濃度（ｎｏｍｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）が０．２ｍｇ／ｍＬになるよう希釈した。主要ピークの回収率をＲＰ−ＨＰＬＣにより分析し、主要ピークの質量による同一性の確認をＬＣ−ＭＳにより分析した。化合物は０．２ｍｇ／ｍＬの名目上濃度（ｎｏｍｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）において、ミリＱ水およびＭｅＣＮ中の０．１％ＴＦＡの移動相と共に、３μｍ、１１０Å、３ｘ１５０ｍｍのＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム上で、３９分を超える２５％から４８％ＭｅＣＮの段階的な実行によるＲＰ−ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳにより分析した。流速は０．４００ｍＬ／ｍｉｎであった。カラム乾燥温度は５０℃、オートサンプラー温度は４℃であり、ＵＶ検出は２２０ｎｍにおいて測定した。
【０２３５】
純度の回収率の結果を表３に示す。
【０２３６】
【表５】
＊分析用ＲＰ−ＨＰＬＣでの洗浄相における溶出。実施例７に示した改変した分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ法による反復データ。
【０２３７】
この分析法により４つの化合物（ＺＰ２２６４、ＺＰ２２６７、ＺＰ２２６８およびＺＰ２２７２）が後に洗浄相から溶出され、この４つの化合物について以下に述べる改変された方法による実験が反復して行われた。
【０２３８】
実施例８．相対的化学安定性試験
表４に示した化合物を名目上濃度（ｎｏｍｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）が０．２５ｍＭになるように０．１Ｍ ＨＣｌに溶解した。サンプルは遮光下、４０℃で２日間インキュベートした後、名目上濃度（ｎｏｍｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）が０．２ｍｇ／ｍＬになるよう希釈した。主要ピークの回収率をＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。化合物は０．２ｍｇ／ｍＬの名目上濃度（ｎｏｍｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）において、ミリＱ水およびＭｅＣＮ中の０．１％ ＴＦＡの移動相と共に、３μｍ、１１０Å、３ｘ１５０ｍｍのＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム上で、３９分を超える２５％から８０％ＭｅＣＮの段階的な実行によるＲＰ−ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳにより分析した。流速は０．４００ｍＬ／ｍｉｎであった。カラム乾燥温度は５０℃、オートサンプラー温度は４℃であり、ＵＶ検出は２２０ｎｍにおいて測定した。
【０２３９】
純度の回収率の結果を表４に示す。
【０２４０】
【表６】
【０２４１】
実施例９．ＧＬＰ−２類似体の、ＢＨＫ−２１細胞に遺伝子組み換え的に発現されたＧＬＰ−２レセプターに対するアゴニズムのｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング＊）
スクリーニングはＧＬＰ−２レセプターおよびＣＲＥ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子コンストラクトを一過性にトランスフェクトしたＢＨＫ−２１細胞を用いて行なった。用量反応曲線およびＥＣ５０値は１０ｆＭから１０ｎＭまでの７濃度および各濃度につき３点を用いて決定した。全ての試験プレートにコントロールペプチドを使用した。
＊）この試験はＡＭＲＩ（ブダペスト、ハンガリー）により行なわれた。
【０２４２】
材料および方法
使用した材料および細胞：
ＮｕｎｃまたはＧｒｅｉｎｅｒ 組織培養フラスコ
ＮｕｎｃまたはＧｒｅｉｎｅｒ １０ｃｍ ＴＣ ペトリ皿（Ｎｕｎｃ １７２９３１）
ＮｕｎｃまたはＧｒｅｉｎｅｒ 娘プレート（ｄａｕｇｈｔｅｒ ｐｌａｔｅｓ）用９６−ウェルプレート（Ｎｕｎｃ １６７００８）
ＢＨＫ−２１（Ｃ１３）細胞
白 ９６−ウェルプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ６００５６８０）希釈用深底ウェルプレート（Ｎｕｎｃ ２７８７５２）
グラスゴー ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ Ｇ５１５４）
フェノールレッド非含有 ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ ３１０５３−０２８）
ウシ胎血清（ＦＣＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ Ｚｅａｌａｎｄバッチ）
非必須アミノ酸（１００ｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ １１１４０−０３５）
２０ＯｍＭ グルタミン（１００ｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ ２５０３０−０２４）
ペニシリン／ストレプトマイシン（１００ｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ １５１４０−１２２）
ピルビン酸ナトリウム（１００ｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ １１３６０−０３９）
Ｄ−ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ １４１９０−０９４）
１ｘトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ ２５３００−０５４）
【０２４３】
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ ３１９８５−０４７）
リポフェクタミン ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １１６６８−０２７）
ＣＲＥ−ｌｕｃ ベクター（Ｚｅａｌａｎｄ バッチ）
ｈＧＬＰ２Ｒ ベクター（Ｚｅａｌａｎｄ バッチ）
１０％（ｗ／ｖ）無菌ＢＳＡ添加ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ ０５４８８）
１ＯｍＭ（２０Ｏｘ）ＩＢＭＸ添加ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ Ｉ５８７９）
ＬｕｃＬｉｔｅ キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ６０１６９１１）
Ｔｏｐｓｅａｌ−Ａ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ６００５１８５）
【０２４４】
培地および緩衝液
ＢＨＫ−２１（Ｃ１３）細胞用増殖培地：
グラスゴーＭＥＭ＋２ｍＭグルタミン（１：１００）＋１０％ＦＣＳ＋１％ 非必須アミノ酸＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム（１：１００）．
【０２４５】
ＢＨＫ−２１（Ｃ１３）細胞用の抗生剤非含有トランスフェクション培地：
グラスゴーＭＥＭ＋２ｍＭグルタミン（１：１００）＋１％非必須アミノ酸＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム（１：１００）
【０２４６】
ＢＨＫ−２１（Ｃ１３）細胞用の後トランスフェクション培地：
グラスゴーＭＥＭ＋２ｍＭグルタミン（１：１００）＋０．２％ＦＣＳ＋１％非必須アミノ酸＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム（１：１００）
【０２４７】
コーティング溶液：
Ｄ−ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ
【０２４８】
ペプチド溶解緩衝液：
Ｄ−ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ
【０２４９】
刺激用緩衝液：
フェノールレッド非含有ＤＭＥＭ＋２ｍＭグルタミン（１：１００）＋５０μＭ ＩＢＭＸ＋０．３％ＢＳＡ
【０２５０】
トランスフェクションしたＢＨＫ２１（Ｃ１３）細胞上のペプチドのスクリーニング方法
ＢＨＫ−２１細胞は１０ｃｍ ＴＣ−ペトリ皿に撒き、７０−８０％の培養密度まで増殖させた。次いで、培地を無血清のトランスフェクション用培地に交換した。ＤＮＡ（７．５μｇのｈＧＬＰ−２レセプターベクターおよび７．５μｇのＣＲＥ−ルシフェラーゼベクター）およびリポフェクタミン２０００をＯｐｔｉ ＭＥＭで希釈し組み合わせ、２０−３０分後に細胞に加えた。細胞は３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で４時間インキュベート、トリプシン処理の後、９６−ウェルプレートに１ウェル当たり３５，０００細胞を再び撒いた。細胞は導入遺伝子を発現させるため、完全増殖倍地中でオーバーナイトでインキュベートした。希釈したＧＬＰ−２類似体溶液の調整のために使用した全てのプレートは、予め１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝食塩水で２時間コートし、オーバーナイトで乾燥させた。ＧＬＰ−２類似体は２５０μＭになるようＰＢＳ／０．１％ ＢＳＡに溶解し、フェノールレッドおよび血清を含まず、ホスホジエステラーゼ阻害剤および０．３％ＢＳＡを含む培地（刺激用緩衝液）中に、１０μＭおよび１００ｎＭの各２段階で希釈した。その後ＧＬＰ−２類似体は、１０ｎＭから１０ｆＭへと下る濃度になるよう、同刺激用緩衝液で連続的に希釈した。基線となる活性は刺激用緩衝液のみで制御した。これらの溶液は３７℃になるよう予め３０分間加温した。細胞は加温（３７℃）した刺激用緩衝液で洗浄し、１００μｌの加温したペプチド希釈液およびコントロールと共に３７℃、５％ＣＯ２において５時間インキュベートした。ＬｕｃＬｉｔｅ酵素基質／溶解緩衝液はインキュベーションの終了直前に調整した。１００μｌのＬｕｃＬｉｔｅ基質を各ウェルに加え、発光を適切なカウンター（例えば、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ ＩＩ）にて測定した。ＥＣ５０値は、４パラメータロジスティック方程式（Ｍｉｃｒｏｃａｌ Ｏｒｉｇｉｎ ５．０またはＧｒａｐｈＰａｄ ４）を用いてフィッティングした生データに由来する。
【０２５１】
結果を表５に示す。
【０２５２】
【表７】
【０２５３】
結論：この結果は、試験された全ての化合物はＧＬＰ−２アゴニストであることを明白に示している。
【０２５４】
実施例１０．ｉｎ ｖｉｖｏ試験（雄Ｃ５７ＢＬマウスにおいて決定された腸増殖刺激）
本化合物（ＺＰ２２６４、ＺＰ２２６６、ＺＰ２２６７、ＺＰ２２６８、ＺＰ２２４２、ＺＰ２２６９、ＺＰ２２７０、ＺＰ２２７２およびＺＰ２２４２）の結腸質量に比し小腸質量を選択的に刺激する能力を、雄Ｃ５７ＢＬマウスにおいて決定した。マウスのそれぞれのグループ（ｎ＝６−１０）に、８００ｎｍｏｌ／ｋｇの各化合物を１日１回、３日連続で皮下投与した。比較のため、動物の他のグループに等モル量の［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２（ＺＰ１５５９）、または溶媒（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）のいずれかを同じ投薬計画にて投与した。化合物の最後の量が投与されてから２４時間後にマウスを屠殺し、小腸（幽門から盲腸まで）および結腸（腸末端から盲腸まで）を空にして秤量した。
【０２５５】
体重（ＢＷ）のわずかな違いを補正するため、小腸（ＳＩ）および結腸の臓器質量はＢＷに相対的に表した。非選択性化合物である［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２については、食道、胃、小腸および結腸いずれにおいても胃腸増殖を刺激すること、およびこの化合物により誘導される増殖パターンの違いについての評価が報告されており、化合物Ｘの小腸−結腸感受性指数は以下のように算出される。
【０２５６】
（ＳＩ／Ｃｏｌｏｎ）ｘ／（ＳＩ／Ｃｏｌｏｎ）［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２％
【０２５７】
１．１０以上の小腸−結腸感受性を有する化合物は、相対的に小腸選択性であると考えられる。
【０２５８】
【表８】
【０２５９】
【表９】
【０２６０】
結果
本発明による試験化合物の効果は、結腸質量に対して選択的に小腸質量を増大させるペプチドの能力に基づき決定した。リファレンス化合物［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２およびＺＰ２２６４、ＺＰ２２６６、ＺＰ２２６７、ＺＰ２２６８、ＺＰ２２４２、ＺＰ２２６９およびＺＰ２２７２の投与後の、溶媒コントロールに対する相対的小腸質量を図１および２に示した。リファレンス化合物［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２の小腸質量の結腸質量に対する比への効果に対する試験化合物の同効果を図３および４に示した。［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２を投与された動物の結腸質量に対する小腸質量の比を１００％に標準化した。リファレンス化合物［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２の小腸−結腸感受性指数に対して算出された試験化合物の同指数に基づいた、小腸選択性の試験化合物を表６に示した。［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２を投与された動物の小腸−結腸感受性指数は１に標準化した。リファレンス化合物［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２に対する試験化合物の小腸および結腸質量に対する効果を表７に示した。［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２を投与された動物の結腸質量および小腸質量を１００％に標準化した。
【０２６１】
実施例１１．ｉｎ ｖｉｖｏ試験（雄Ｃ５７ＢＬマウスにおいて決定された腸増殖刺激）
雄Ｃ５７ＢＬマウスにおいて、さらなる化合物の結腸質量に比し小腸質量を選択的に刺激する能力を決定した。１日当たり２００ｎｍｏｌ／ｋｇの各化合物を投与すること以外は、上記実施例１０と同様のプロトコルを用いた。従って、マウスのそれぞれのグループ（ｎ＝６−１０）に、２００ｎｍｏｌ／ｋｇの各化合物を１日１回、３日連続で皮下投与した。動物の他のグループに等モル量の［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２（リファレンス化合物）、または溶媒（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４；ネガティブコントロール）のいずれかを同じ投薬計画にて投与した。化合物の最後の量が投与されてから２４時間後にマウスを屠殺し、胃、小腸および結腸を空にして秤量した。
【０２６２】
図６に示すように、本発明による化合物ＺＰ２３８０、ＺＰ２３８１、ＺＰ２３８４、ＺＰ２３８５、ＺＰ２３９７、ＺＰ２３９８、ＺＰ２３９９、ＺＰ２４１１、ＺＰ２４１７、ＺＰ２４１８、ＺＰ２４２０、ＺＰ２４２３は、結腸質量に比し小腸質量を選択的に刺激する能力を有する。
【０２６３】
実施例１２．ｉｎ ｖｉｖｏ試験（雄Ｃ５７ＢＬマウスにおいて決定された胃増殖刺激）
本発明による試験化合物の効果は、溶媒コントロールに対して選択的に胃質量を増大させるペプチドの能力に基づき決定した。本化合物（ＺＰ２３９５、ＺＰ２３９６、ＺＰ２４００、ＺＰ２４１２、ＺＰ２３９４、およびＺＰ２４０１）の結腸質量に比し胃質量を選択的に刺激する能力を、雄Ｃ５７ＢＬマウスにおいて決定した。マウスのそれぞれのグループ（ｎ＝６−１０）に、２００ｎｍｏｌ／ｋｇの各化合物を１日１回、３日連続で皮下投与した。比較のため、動物の他のグループに等モル量の［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２、または溶媒（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）のいずれかを同じ投薬計画にて投与した。化合物の最後の量が投与されてから２４時間後にマウスを屠殺し、胃および小腸（幽門から回盲部まで）を空にして秤量した。体重（ＢＷ）のわずかな違いを補正するため、胃の臓器質量はＢＷに相対的に表した。図７は、化合物ＺＰ２３９５、ＺＰ２３９６、ＺＰ２４００、ＺＰ２４１２、ＺＰ２４１４、ＺＰ２４１６、ＺＰ２３９４、およびＺＰ２４０１が、結腸質量に比し胃質量を選択的に刺激する能力を有することを示している。
【０２６４】
幾つかのＺＰ化合物は体重に比した胃質量を増加させたが、リファレンス化合物の［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２が胃質量を刺激することは報告されていない（図７）。［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２に比較して、ＺＰ化合物により誘導された胃における増殖パターンの差異を評価するため、化合物Ｘの胃−結腸感受性指数を以下のように算出した。
【０２６５】
（胃／結腸）ｘ／胃／（結腸）［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ−２％
【０２６６】
１．０５以上の胃／結腸感受性を有する化合物は、相対的に胃選択性であると考えられる。
【０２６７】
化合物ＺＰ２２６７、ＺＰ２３８６、ＺＰ２４０４、ＺＰ２４１３、ＺＰ１４１５、ＺＰ２４０２、ＺＰ２４０３、ＺＰ２３８２、ＺＰ２２６６、ＺＰ２３７８、ＺＰ２４１４、ＺＰ２４１６、ＺＰ２４２４、ＺＰ２３７９、ＺＰ２２６９は小腸，結腸、または胃に非選択性である（図８）。
【０２６８】
実施例１０から１２において得られたデータの要約を表８に示す。
【０２６９】
【表１０】
【０２７０】
ＧＬＰ−２レセプターの特異性
所定のレセプターに対して基質が達成するとみられる生物学的特異性の機序は、水素結合、疎水性、静電性結合等に基づいた、基質とレセプターの間の様々な相互作用に関わる。
【０２７１】
我々の構造および活性の関連性についての研究の間に、ＧＬＰ−２配列の位置１１、１６、２０、２４および２８の残基がＧＬＰ−２レセプターの認識および結合に深く関わっていることが示された。従って、これら特定位置のアミノ酸パターンの変化によりＧＬＰ−２類似体は３つの異なったグループ、小腸−、胃−、および非特異的ペプチドに分類される。ＧＬＰ−２類似体のレセプター特異性は、位置１１、１６、２０、２４および２８のアミノ酸の疎水性および水素結合のポテンシャルに依存することが明らかになった。
【０２７２】
実施例１３．小腸特異性におけるＨＰＩの効果
小腸／結腸感受性指数により小腸選択性であるＧＬＰ−２ペプチドのＨＰＩデータを表９に示した。
【０２７３】
【表１１】
【０２７４】
データは小腸特異的ＧＬＰ−２類似体の個々の位置１１、１６、２０、２４および２８のＨＰＩ間隔が、位置１１および１６については独立して少なくとも−０．８≦ＨＰＩ≦３．８または、好ましくは−０．８≦ＨＰＩ≦２．８またはさらに好ましくはＨＰＩ＝１．８でなければならないことを示している。
【０２７５】
位置２０、２４および２８については、ＨＰＩ間隔は個々の位置が独立して少なくとも−０．８≦ＨＰＩ２０，２４，２８≦１．８または好ましくは−０．８≦ＨＰＩ２０≦１．８およびさらに好ましくはＨＰＩ２４，２８＝−０．８でなければならない。
【０２７６】
ＨＰＩ間隔により小腸選択性ペプチドの可能性のあるアミノ酸置換パターンを表１０に示した。
【０２７７】
【表１２】
【０２７８】
従って、Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４およびＸ２８は独立してＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。特に、Ｘ１１およびＸ１６はそれぞれ独立してＡｌａまたはＳｅｒ、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８は独立してＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。例えば、Ｘ１１およびＸ１６は両者ともＡｌａであり得て、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８は独立してＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。
【０２７９】
実施例１４．胃特異性におけるＨＰＩの効果
胃／小腸感受性指数により胃特異的であるＧＬＰ−２ペプチドのＨＰＩデータを表１１に示した。
【０２８０】
【表１３】
【０２８１】
データは胃特異的ＧＬＰ−２類似体の個々の位置１１、１６、２０、２４および２８のＨＰＩ間隔が、位置１１および１６については独立して少なくとも−３．９≦ＨＰＩ１１，１６≦３．８または、好ましくは２．８≦ＨＰＩ１１，１６≦３．８またはＨＰＩ１１，１６＝−３．９、および位置２０、２４および２８については、ＨＰＩは独立して少なくとも−３．９≦ＨＰＩ２０，２４，２８≦１．８または好ましくは−０．８≦ＨＰＩ２０，２４，２８≦１．８またはＨＰＩ２０，２４，２８＝−３．９でなければならないことを示している。
【０２８２】
ＨＰＩ間隔により可能性のあるアミノ酸置換パターンを表１２に示した。
【０２８３】
【表１４】
【０２８４】
従って、胃特異的化合物Ｘ１１はＬｅｕ、ＰｈｅまたはＬｙｓであり得る。Ｘ１６ はＬｅｕ、ＰｈｅまたはＬｙｓであり得る。Ｘ２０はＡｌａまたはＳｅｒであり得る。Ｘ２４はＡｌａ、ＳｅｒまたはＬｙｓであり得る。Ｘ２８はＡｌａ、ＳｅｒまたはＬｙｓであり得る。
【０２８５】
例えば、Ｘ１１およびＸ１６は独立してＬｅｕまたはＰｈｅであり得て、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８はＳｅｒであり得る。
【０２８６】
レセプター特異性における水素結合ポテンシャル（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）（ＨＢＰ）の効果
先に述べたように、ＧＬＰ−２類似体のレセプター特異性は上記の位置１１、１６、２０、２４および２８の水素結合のポテンシャルにより支配されることもまた明らかになった。
【０２８７】
水素結合ポテンシャル（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）（ＨＢＰ）は、個々のアミノ酸についてＷ．Ｄ．Ｓｔｅｉｎ，“Ｔｈｅ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｃｒｏｓｓ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ”；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｎ．Ｙ．１９６７，ｐｐ６５−１２５により紹介および定義され、これは所定のアミノ酸側鎖が水素結合を形成する能力を提供している。
【０２８８】
個々のアミノ酸に対するＨＢＰを表１３に示す。
【０２８９】
【表１５】
【０２９０】
実施例１５．胃特異性における水素結合ポテンシャル（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）（ＨＢＰ）の効果
胃特異的類似体の例を表１４に示す。
【０２９１】
【表１６】
【０２９２】
この表によると、胃特異的ＧＬＰ−２類似体の個々の位置１１、１６、２０、２４および２８のＨＢＰ間隔が、全ての位置につき独立して少なくとも０≦ＨＢＰ１１，１６，２０，２４，２８≦２でなければならない。ＨＢＰ間隔に従い、可能性のあるアミノ酸置換パターンを表１５に示す。
【０２９３】
【表１７】
【０２９４】
好ましい胃特異的類似体は、位置１１および１６がＨＢＰ１１，１６，＝０、かつ位置２０、２４および２８が独立して０≦ＨＢＰ２０，２４，２８≦２のＨＢＰ間隔を有するＧＬＰ−２類似体である。
【０２９５】
幾つかの胃特異的ＧＬＰ−２類似体を以下に示す。
Ｘ１１はＬｅｕ、ＰｈｅまたはＬｙｓであり得る。
Ｘ１６はＬｅｕ、ＰｈｅまたはＬｙｓであり得る。
Ｘ２０はＡｌａまたはＳｅｒであり得る。
Ｘ２４はＡｌａ、ＳｅｒまたはＬｙｓであり得る。
Ｘ２８はＡｌａ、ＳｅｒまたはＬｙｓであり得る。
【０２９６】
例えば、Ｘ１１およびＸ１６は独立してＬｅｕまたはＰｈｅであり得て、Ｘ２４およびＸ２８は独立してＬｙｓまたはＳｅｒであり得て、Ｘ２０はＳｅｒであり得る。
【０２９７】
例えば、Ｘ１１およびＸ１６は独立してＬｅｕまたはＰｈｅであり得て、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８はＳｅｒであり得る。
【０２９８】
実施例１６．小腸特異性における水素結合ポテンシャル（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）（ＨＢＰ）の効果
小腸特異的ＧＬＰ−２類似体は、上で特に言及した位置１１、１６、２０、２４および２８の水素結合のポテンシャルのようなパラメーターに支配されることもまた明らかになった。個々のアミノ酸のＨＢＰを表１６に示す。
【０２９９】
【表１８】
【０３００】
この表によると、小腸特異的ＧＬＰ−２類似体の個々の位置１１、１６、２０、２４および２８のＨＢＰ間隔が、全ての位置につき独立して少なくとも０≦ＨＢＰ１１，１６，２０，２４，２８≦２でなければならない。
【０３０１】
好ましい類似体においては、位置１１および１６のＨＢＰ間隔がＨＢＰ１１，１６＝０、および位置２０、２４、および２８のＨＢＰ間隔が独立して０≦ＨＢＰ２０，２４，２８≦２である。
【０３０２】
さらに好ましい、小腸特異性を示すＧＬＰ−２類似体は、位置１１および１６がＨＢＰ１１，１６＝０、ＨＢＰ２０＝０−２、およびＨＢＰ２４，２８＝２のＨＢＰ間隔を有するペプチドである。
これに従い、幾つかの置換パターンを表１７に示す。
【０３０３】
【表１９】
【０３０４】
従って、小腸選択性化合物において、Ｘ１１、Ｘ１６；Ｘ２０、Ｘ２４およびＸ２８はそれぞれ独立してＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。例えば、Ｘ１１およびＸ１６はそれぞれ独立してＡｌａまたはＳｅｒ、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８はそれぞれ独立してＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。例えば、Ｘ１１およびＸ１６は共にＡｌａであり得て、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８は独立してＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり得る。
【０３０５】
本発明は上に述べた典型的な態様と共に記述されているが、多数の同等な改変および変化はそれが開示された際当業者には明らかであり得る。従って、説明された本発明の典型的な態様は例示的であり限定的ではないとみなされる。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、記述された態様には様々な変更が成され得る。ここに引用された全ての文献は明白に参照により組み入れられたものとする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉ
Ｒ１−Ｚ１−Ｈｉｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘ２４−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘ２８−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｚ２−Ｒ２
（式中、
Ｒ１は水素、Ｃ１−４アルキル（例えばメチル）、アセチル、ホルミル、ベンゾイルまたはトリフルオロアセチルであり、
Ｘ２はＧｌｙ、ＡｌａまたはＳａｒ、
Ｘ３はＧｌｕまたはＡｓｐ、
Ｘ５はＳｅｒまたはＴｈｒ、
Ｘ６はＰｈｅまたはＰｒｏまたは保存された置換、
Ｘ７はＳｅｒまたはＴｈｒ、
Ｘ８はＡｓｐまたはＳｅｒまたは保存された置換、
Ｘ９はＧｌｕまたはＡｓｐまたは保存された置換、
Ｘ１０はＭｅｔ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅまたは酸化的に安定なＭｅｔ−置換アミノ酸、
Ｘ１１はＹ１、
Ｘ１２はＴｈｒまたはＬｙｓまたは保存された置換、
Ｘ１３はＩｌｅ、ＧｌｕまたはＧｌｎまたは保存された置換、
Ｘ１４はＬｅｕ、ＭｅｔまたはＮｌｅまたは保存された置換、
Ｘ１５はＡｓｐまたはＧｌｕまたは保存された置換、
Ｘ１６はＹ２、
Ｘ１７はＬｅｕまたはＧｌｕまたは保存された置換、
Ｘ１８はＡｌａまたはＡｉｂまたは保存されていない置換、
Ｘ１９はＡｌａまたはＴｈｒまたは保存された置換、
Ｘ２０はＹ３、
Ｘ２１はＡｓｐまたはＨｅまたは保存された置換、
Ｘ２４はＹ４、
Ｘ２８はＹ５、
Ｘ３１はＰｒｏ、Ｉｌｅまたは欠失、
Ｘ３２はＴｈｒまたは欠失、
Ｘ３３はＡｓｐ、Ａｓｎまたは欠失、
Ｒ２はＮＨ２またはＯＨであり、
式中、
Ｚ１およびＺ２は独立して存在しないかまたはＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＭｅｔおよびＯｒｎからなる群から選択される１から１０アミノ酸単位のペプチド配列であり、かつ式ＩのＸ１１，Ｘ１６，Ｘ２０，Ｘ２４，Ｘ２８残基のハイドロファティシティ（ｈｙｄｒｏｐｈａｔｉｃｉｔｙ）プロファイル（ＨＰＰ）は、
ＨＰＰ＝Σｈｐｉｘ１１＋ｈｐｉｘ１６＋ｈｐｉＸ２０＋ｈｐｉＸ２４＋ｈｐｉＸ２８ は≧−１０であり、
式中、
Ｘ２０がＡｒｇの場合Ｘ１１はＳｅｒであり、Ｘ１６がＡｌａ、Ｘ２４がＡｌａ、Ｘ２８がＡｌａ、およびＺ２がＬｙｓまたは医薬的に許容される塩またはその誘導体である条件下で、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４、およびＹ５は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＭｅｔおよびＰｈｅからなる群から個々に選択でき、かつ
Ｙ３ は、Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ｇｌｎ，Ｈｉｓ，Ａｒｇ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｍｅｔ ｏｒ Ｐｈｅからなる群から選択できる）で表されるグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体。
【請求項２】
ＨＰＰが≧−４である、請求項１に記載のグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体。
【請求項３】
ＨＰＰが≧０である、請求項１に記載のグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体。
【請求項４】
一般式ＩＩ
Ｒ１−Ｚ１−Ｈｉｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ａｌａ−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘ２４−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘ２８−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｚ２−Ｒ２
（式中、
Ｒ１は水素、Ｃ１−４アルキル（例えばメチル）、アセチル、ホルミル、ベンゾイルまたはトリフルオロアセチルであり、
Ｘ２はＧｌｙ、ＡｌａまたはＳａｒ、
Ｘ３はＧｌｕまたはＡｓｐ、
Ｘ５はＳｅｒまたはＴｈｒ、
Ｘ６はＰｈｅまたはＰｒｏ、
Ｘ７はＳｅｒまたはＴｈｒ、
Ｘ８はＡｓｐまたはＳｅｒ、
Ｘ９はＧｌｕまたはＡｓｐ、
Ｘ１０はＭｅｔ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅまたは酸化的に安定なＭｅｔ−置換アミノ酸、
Ｘ１１はＡｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ１２はＴｈｒまたはＬｙｓ、
Ｘ１３はＩｌｅ、ＧｌｕまたはＧｌｎ、
Ｘ１４はＬｅｕ、ＭｅｔまたはＮｌｅ、
Ｘ１５はＡｓｐまたはＧｌｕ、
Ｘ１６はＡｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ１７はＬｅｕまたはＧｌｕ、
Ｘ１８はＡｌａまたはＡｉｂ、
Ｘ１９はＡｌａまたはＴｈｒ、
Ｘ２０はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ２１はＡｓｐまたはＩｌｅ、
Ｘ２４はＡｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ２８はＡｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ３１はＰｒｏ、Ｉｌｅまたは欠失、
Ｘ３２はＴｈｒまたは欠失、
Ｘ３３はＡｓｐ、Ａｓｎまたは欠失、
Ｒ２はＮＨ２またはＯＨであり、
Ｘ２０がＡｒｇの場合Ｘ１１はＳｅｒであり、Ｘ１６がＡｌａ、Ｘ２４がＡｌａ、Ｘ２８がＡｌａ、およびＺ２がＬｙｓである条件下で、
Ｚ１およびＺ２は独立して存在しないかまたはＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＭｅｔおよびＯｒｎからなる群から選択される１から１０アミノ酸単位のペプチド配列であるか、または医薬的に許容される塩またはその誘導体）で表されるグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体。
【請求項５】
Ｘ１１はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ１６はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ２０はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ２４はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ２８はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
である、請求項４に記載のＧＬＰグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体。
【請求項６】
Ｘ１１はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ、
Ｘ１６はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ、
Ｘ２０はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ、
Ｘ２４はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ、
Ｘ２８はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ、
である、請求項４に記載のＧＬＰグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体。
【請求項７】
ＧＬＰ−２類似体が野生型ＧＬＰ−２（１−３３）に対し少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有し、かつｉｎ ｖｉｖｏにおける腸の質量増大の原因となる生物活性を有する請求項１から６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項８】
ＧＬＰ−２類似体が位置Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４および／またはＸ２８における１以上の置換および／または前記置換のうちの１以上と位置Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７および／またはＸ１０における１以上の置換との組み合わせを有する、請求項１から７のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項９】
前記の位置Ｘ１０における置換がＬｅｕ、Ｎｌｅ、またはＭｅｔ（Ｏ）またはＭｅｔ（Ｏ）２のような酸化的に安定なＭｅｔ−置換アミノ酸である、請求項１または４に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項１０】
一般式ＩＩＩ
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｘ８−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｘ１１−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘ２０−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘ２４−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘ２８−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−ＮＨ２
（式中、
Ｒ１は水素、Ｃ１−４アルキル（例えばメチル）、アセチル、ホルミル、ベンゾイルまたはトリフルオロアセチルであり、
Ｘ８はＡｓｐまたはＳｅｒ、好ましくはＡｓｐ、
Ｘ１１はＳｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、ＬｙｓまたはＡｓｎ、
Ｘ１５はＧｌｕまたはＡｓｐ、好ましくはＧｌｕ、
Ｘ１６はＳｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｕ、
Ｘ２０はＳｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｕ、
Ｘ２４はＳｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｕ、および
Ｘ２８はＳｅｒ、Ａｌａ、ＧｌｎまたはＧｌｕ、または医薬的に許容される塩またはその誘導体）により定義されるＧＬＰ−２類似体。
【請求項１１】
表１および表２に開示された、請求項１から１０のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体またはその薬理学的に許容される塩または誘導体。
【請求項１２】
配列
２２６３ ＨＧＥＧＳＦＳＤＥＬＳＴＩＬＥＳＬＡＡＳＤＦＩＳＷＬＩＳＴＫＩＴＤ−ＮＨ２
２２６４ ＨＧＥＧＳＦＳＤＥＬＡＴＩＬＥＡＬＡＡＡＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ−ＮＨ２
２２６６ ＨＧＥＧＳＦＳＤＥＬＥＴＩＬＥＥＬＡＡＥＤＦＩＥＷＬＩＥＴＫＩＴＤ−ＮＨ２
２２６７ ＨＧＥＧＳＦＳＤＥＬＳＴＩＬＥＳＬＡＡＡＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ−ＮＨ２
２２６８ ＨＧＥＧＳＦＳＤＥＬＡＴＩＬＥＡＬＡＡＳＤＦＩＳＷＬＩＳＴＫＩＴＤ−ＮＨ２
２２６９ ＨＧＥＧＳＦＳＤＥＬＫＴＩＬＥＳＬＡＡＡＤＦＩＥＷＬＩＱＴＫＩＴＤ−ＮＨ２
２２７０ ＨＧＥＧＳＦＳＤＥＬＮＴＩＬＥＳＬＡＡＳＤＦＩＳＷＬＩＳＴＫＩＴＤ−ＮＨ２
２２７２ ＨＧＥＧＳＦＳＤＥＬＡＴＩＬＥＳＬＡＡＡＤＦＩＳＷＬＩＡＴＫＩＴＤ−ＮＨ２
２２４２ ＨＧＥＧＳＦＳＳＥＬＳＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫ−ＯＨ
で表される、請求項１１に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項１３】
位置Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４、Ｘ２８、Ｘ３１、Ｘ３２および／またはＸ３３に１を超える置換を有する、請求項１から１２のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項１４】
Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４、Ｘ２８がＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＶａｌから選択される１以上の置換、および位置Ｘ３１、Ｘ３２およびＸ３３の任意の欠失、または医薬的に許容される塩またはその誘導体を含む、請求項１３記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項１５】
位置Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４および／またはＸ２８のうち１以上の位置に置換を有する、請求項１から９のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項１６】
Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４およびＸ２８がそれぞれ独立してＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙおよびＴｈｒから選択され、かつ該類似体が結腸に比し小腸に対して優先的な増殖促進活性を有する、請求項１、４、または１０に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項１７】
Ｘ１１およびＸ１６がそれぞれ独立してＡｌａおよびＳｅｒから選択され、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８が独立してＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙおよびＴｈｒから選択される、請求項１６に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項１８】
Ｘ１１およびＸ１６が両者ともＡｌａであり、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８は独立してＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙおよびＴｈｒから選択される、請求項１７に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項１９】
Ｘ１１およびＸ１６が両者ともＡｌａであり、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８が独立してＡｌａおよびＳｅｒから選択される、請求項１７に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項２０】
位置Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４およびＸ２８の残基が、以下の組み合わせＳｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ； Ａｌａ／Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ａｌａ； Ａｌａ／Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ａｌａ； Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ； Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ａｒｇ／Ａｌａ／Ａｌａ； Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ａｌａ； Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ のうち１つを含む、請求項１６に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項２１】
ＺＰ２２６４、ＺＰ２２６８、ＺＰ２２４２、ＺＰ２２７２、ＺＰ２４１１、ＺＰ２３８０、ＺＰ２３８４、ＺＰ２３９８、ＺＰ２４１７、ＺＰ２４２３、ＺＰ２３８５、ＺＰ２３９９、ＺＰ２４１８、ＺＰ２３８１、ＺＰ２４２０またはＺＰ２３９７である、請求項１６に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項２２】
Ｘ１１がＬｅｕ、ＰｈｅおよびＬｙｓから選択され、
Ｘ１６がＬｅｕ、ＰｈｅおよびＬｙｓから選択され、
Ｘ２０がＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＧｌｙおよびＴｈｒから選択され、
Ｘ２４がＡｌａおよびＳｅｒから選択され、
Ｘ２８がＡｌａ、ＳｅｒまたはＬｙｓから選択され、かつ該類似体が結腸に比し胃において優先的な増殖促進活性を有する、請求項１、４、または１０に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項２３】
Ｘ１１およびＸ１６が独立してＬｅｕおよびＰｈｅから選択され、Ｘ２４およびＸ２８が独立してＬｙｓおよびＳｅｒから選択され、かつＸ２０がＳｅｒである、請求項２２に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項２４】
Ｘ１１およびＸ１６が独立してＬｅｕおよびＰｈｅから選択され、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８がＳｅｒである、請求項２３に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項２５】
位置Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４およびＸ２８の残基が、以下の組み合わせ
Ｌｙｓ／Ｌｙｓ／Ｌｙｓ／Ｌｙｓ／Ｌｙｓ； Ｐｈｅ／Ｐｈｅ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ； Ｌｅｕ／Ｌｅｕ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ； Ｌｅｕ／Ｌｅｕ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ のうち１つを含む、請求項２２に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項２６】
ＺＰ２４００、ＺＰ２４１２、ＺＰ２３９６、ＺＰ２３９４、ＺＰ２４０１またはＺＰ２３９５である、請求項２２に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項２７】
小腸特異的ＧＬＰ−２類似体の個々の位置１１、１６、２０、２４および２８のＨＢＰ間隔が、全ての位置につき独立して少なくとも０≦ＨＢＰ１１，１６，２０，２４，２８≦２でなければならない、請求項１から２６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項２８】
位置１１および１６がＨＢＰ１１，１６，＝０、かつ位置２０、２４および２８が独立して ０≦ＨＢＰ２０，２４，２８≦２のＨＢＰ間隔を有する、請求項２７に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項２９】
胃特異的ＧＬＰ−２類似体の個々の位置１１、１６、２０、２４および２８のＨＢＰ間隔が、全ての位置につき独立して少なくとも０≦ＨＢＰ１１，１６，２０，２４，２８≦２でなけらばならない、請求項１から２６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項３０】
位置１１および１６のＨＢＰ間隔がＨＢＰ１１，１６，＝０、かつ位置２０、２４および２８のＨＢＰ間隔が独立して ０≦ＨＢＰ２０，２４，２８≦２である、請求項２９に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項３１】
治療に用いられる、請求項１から３０のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項３２】
請求項１から３１のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体、またはその塩または誘導体を、担体との混合物として含む医薬組成物。
【請求項３３】
該ＧＬＰ−２類似体が医薬的に許容される酸付加塩である、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記のＧＬＰ−２類似体が注射または点滴による投与に適した液体として処方されるか、または緩慢に放出されるように処方された、請求項３２または３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
胃および腸関連疾患を治療および／または予防する薬剤の製剤のための、請求項１から２６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体の使用。
【請求項３６】
該胃および腸関連疾患が、潰瘍、ゾリンジャー・エリソン症候群、消化障害、吸収不良症候群、短消化管症候群（ｓｈｏｒｔ−ｇｕｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、カルデサック症候群（ｃｕｌ−ｄｅ−ｓａｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、炎症性腸疾患、セリアックスプルー（例えばグルテン誘導性腸疾患またはセリアック病）、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症スプルー、腸炎、局所性腸炎（クローン病）、潰瘍性結腸炎、小腸損傷、または短腸症候群である、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
該胃および腸関連疾患が放射線性腸炎、感染性または後感染性腸炎、または有毒剤またはその他の化学療法剤による小腸損傷である、請求項３５に記載の使用。
【請求項３８】
化学療法または放射線治療における副作用を治療および／または予防する薬剤の製剤のための、請求項１から２６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体の使用。
【請求項３９】
該化学療法の副作用が下痢、腹部けいれん、嘔吐、および化学療法による治療に起因する腸上皮の構造的および機能的損傷である、請求項３９に記載の使用。
【請求項４０】
新生児、骨粗鬆症、またはＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）により媒介される状態を治療する薬剤の製剤のための、請求項１から２６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体の使用。
【請求項４１】
栄養障害に関わる状態を治療および／または予防する薬剤の製剤のための、請求項１から２６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体の使用。
【請求項４２】
該栄養障害に関わる状態が悪液質または食欲不振である、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
請求項１から２６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体をコードする核酸配列を含む核酸分子。
【請求項４４】
請求項４０に記載の核酸配列を、その発現を導く制御配列と組み合わせて含む発現ベクター。
【請求項４５】
請求項３４に記載の発現ベクターにより形質転換されたホスト細胞。
【請求項４６】
該ＧＬＰ−２類似体の発現に適した条件下で請求項４１に記載のホスト細胞を培養すること、およびそれにより産生されたＧＬＰ−２類似体を精製することを含む、請求項１から２６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体の産生方法。
【請求項４７】
請求項４３に記載の核酸分子、請求項４４に記載の発現ベクター、または請求項４１に記載のホスト細胞の治療における使用。
【請求項４８】
胃および腸関連疾患を治療および／または予防するための、または化学療法または放射線治療における副作用を治療および／または予防するための、または新生児、骨粗鬆症、またはＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）により媒介される状態を治療するための薬剤の製剤における、請求項４３に記載の核酸分子、請求項４０に記載の発現ベクター、または請求項４５に記載のホスト細胞の使用。
【請求項４９】
効果的な量の請求項１から２６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体、請求項４３に記載の核酸分子、請求項４４に記載の発現ベクター、または請求項４５に記載のホスト細胞を投与することによる、患者の必要性に応じて胃および腸関連疾患を治療する方法。
【請求項５０】
該胃および腸関連疾患が、潰瘍、ゾリンジャー・エリソン症候群、消化障害、吸収不良症候群、短消化管症候群（ｓｈｏｒｔ−ｇｕｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、カルデサック症候群（ｃｕｌ−ｄｅ−ｓａｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、炎症性腸疾患、セリアックスプルー（例えばグルテン誘導性腸疾患またはセリアック病）、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症スプルー、腸炎、局所性腸炎（クローン病）、潰瘍性結腸炎、小腸損傷、または短腸症候群である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
該胃および腸関連疾患が放射線性腸炎、感染性または後感染性腸炎、または有毒剤またはその他の化学療法剤による小腸損傷である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
効果的な量の請求項１から２６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体、請求項４３に記載の核酸分子、請求項４４に記載の発現ベクター、または請求項４５に記載のホスト細胞を投与することを含む、患者の必要性に応じて化学療法または放射線治療における副作用を治療または予防する方法。
【請求項５３】
該化学療法の副作用が下痢、腹部けいれん、嘔吐、または化学療法による治療に起因する腸上皮の構造的および機能的損傷である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
効果的な量の請求項１から２６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体、請求項４３に記載の核酸分子、請求項４４に記載の発現ベクター、または請求項４５に記載のホスト細胞を投与することを含む、患者の必要性に応じて新生児疾患、肥満、骨粗鬆症、またはＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）により媒介される状態を治療する方法。
【請求項５５】
癌化学療法薬剤および請求項１から２６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体、請求項４３に記載の核酸分子、請求項４４に記載の発現ベクター、または請求項４５に記載のホスト細胞それぞれを任意に医薬的に許容される担体と組み合わせて含む治療キット。
【請求項５６】
癌化学療法薬剤および請求項１から２６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体、請求項４３に記載の核酸分子、請求項４４に記載の発現ベクター、または請求項４５に記載のホスト細胞を医薬的に許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項１】
一般式Ｉ
Ｒ１−Ｚ１−Ｈｉｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘ２４−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘ２８−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｚ２−Ｒ２
（式中、
Ｒ１は水素、Ｃ１−４アルキル（例えばメチル）、アセチル、ホルミル、ベンゾイルまたはトリフルオロアセチルであり、
Ｘ２はＧｌｙ、ＡｌａまたはＳａｒ、
Ｘ３はＧｌｕまたはＡｓｐ、
Ｘ５はＳｅｒまたはＴｈｒ、
Ｘ６はＰｈｅまたはＰｒｏまたは保存された置換、
Ｘ７はＳｅｒまたはＴｈｒ、
Ｘ８はＡｓｐまたはＳｅｒまたは保存された置換、
Ｘ９はＧｌｕまたはＡｓｐまたは保存された置換、
Ｘ１０はＭｅｔ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅまたは酸化的に安定なＭｅｔ−置換アミノ酸、
Ｘ１１はＹ１、
Ｘ１２はＴｈｒまたはＬｙｓまたは保存された置換、
Ｘ１３はＩｌｅ、ＧｌｕまたはＧｌｎまたは保存された置換、
Ｘ１４はＬｅｕ、ＭｅｔまたはＮｌｅまたは保存された置換、
Ｘ１５はＡｓｐまたはＧｌｕまたは保存された置換、
Ｘ１６はＹ２、
Ｘ１７はＬｅｕまたはＧｌｕまたは保存された置換、
Ｘ１８はＡｌａまたはＡｉｂまたは保存されていない置換、
Ｘ１９はＡｌａまたはＴｈｒまたは保存された置換、
Ｘ２０はＹ３、
Ｘ２１はＡｓｐまたはＨｅまたは保存された置換、
Ｘ２４はＹ４、
Ｘ２８はＹ５、
Ｘ３１はＰｒｏ、Ｉｌｅまたは欠失、
Ｘ３２はＴｈｒまたは欠失、
Ｘ３３はＡｓｐ、Ａｓｎまたは欠失、
Ｒ２はＮＨ２またはＯＨであり、
式中、
Ｚ１およびＺ２は独立して存在しないかまたはＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＭｅｔおよびＯｒｎからなる群から選択される１から１０アミノ酸単位のペプチド配列であり、かつ式ＩのＸ１１，Ｘ１６，Ｘ２０，Ｘ２４，Ｘ２８残基のハイドロファティシティ（ｈｙｄｒｏｐｈａｔｉｃｉｔｙ）プロファイル（ＨＰＰ）は、
ＨＰＰ＝Σｈｐｉｘ１１＋ｈｐｉｘ１６＋ｈｐｉＸ２０＋ｈｐｉＸ２４＋ｈｐｉＸ２８ は≧−１０であり、
式中、
Ｘ２０がＡｒｇの場合Ｘ１１はＳｅｒであり、Ｘ１６がＡｌａ、Ｘ２４がＡｌａ、Ｘ２８がＡｌａ、およびＺ２がＬｙｓまたは医薬的に許容される塩またはその誘導体である条件下で、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４、およびＹ５は、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＭｅｔおよびＰｈｅからなる群から個々に選択でき、かつ
Ｙ３ は、Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ｇｌｎ，Ｈｉｓ，Ａｒｇ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｍｅｔ ｏｒ Ｐｈｅからなる群から選択できる）で表されるグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体。
【請求項２】
ＨＰＰが≧−４である、請求項１に記載のグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体。
【請求項３】
ＨＰＰが≧０である、請求項１に記載のグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体。
【請求項４】
一般式ＩＩ
Ｒ１−Ｚ１−Ｈｉｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ａｌａ−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘ２４−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘ２８−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｚ２−Ｒ２
（式中、
Ｒ１は水素、Ｃ１−４アルキル（例えばメチル）、アセチル、ホルミル、ベンゾイルまたはトリフルオロアセチルであり、
Ｘ２はＧｌｙ、ＡｌａまたはＳａｒ、
Ｘ３はＧｌｕまたはＡｓｐ、
Ｘ５はＳｅｒまたはＴｈｒ、
Ｘ６はＰｈｅまたはＰｒｏ、
Ｘ７はＳｅｒまたはＴｈｒ、
Ｘ８はＡｓｐまたはＳｅｒ、
Ｘ９はＧｌｕまたはＡｓｐ、
Ｘ１０はＭｅｔ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅまたは酸化的に安定なＭｅｔ−置換アミノ酸、
Ｘ１１はＡｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ１２はＴｈｒまたはＬｙｓ、
Ｘ１３はＩｌｅ、ＧｌｕまたはＧｌｎ、
Ｘ１４はＬｅｕ、ＭｅｔまたはＮｌｅ、
Ｘ１５はＡｓｐまたはＧｌｕ、
Ｘ１６はＡｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ１７はＬｅｕまたはＧｌｕ、
Ｘ１８はＡｌａまたはＡｉｂ、
Ｘ１９はＡｌａまたはＴｈｒ、
Ｘ２０はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ２１はＡｓｐまたはＩｌｅ、
Ｘ２４はＡｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ２８はＡｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ３１はＰｒｏ、Ｉｌｅまたは欠失、
Ｘ３２はＴｈｒまたは欠失、
Ｘ３３はＡｓｐ、Ａｓｎまたは欠失、
Ｒ２はＮＨ２またはＯＨであり、
Ｘ２０がＡｒｇの場合Ｘ１１はＳｅｒであり、Ｘ１６がＡｌａ、Ｘ２４がＡｌａ、Ｘ２８がＡｌａ、およびＺ２がＬｙｓである条件下で、
Ｚ１およびＺ２は独立して存在しないかまたはＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＭｅｔおよびＯｒｎからなる群から選択される１から１０アミノ酸単位のペプチド配列であるか、または医薬的に許容される塩またはその誘導体）で表されるグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体。
【請求項５】
Ｘ１１はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ１６はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ２０はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ２４はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
Ｘ２８はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ、
である、請求項４に記載のＧＬＰグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体。
【請求項６】
Ｘ１１はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ、
Ｘ１６はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ、
Ｘ２０はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ、
Ｘ２４はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ、
Ｘ２８はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ、
である、請求項４に記載のＧＬＰグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体。
【請求項７】
ＧＬＰ−２類似体が野生型ＧＬＰ−２（１−３３）に対し少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有し、かつｉｎ ｖｉｖｏにおける腸の質量増大の原因となる生物活性を有する請求項１から６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項８】
ＧＬＰ−２類似体が位置Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４および／またはＸ２８における１以上の置換および／または前記置換のうちの１以上と位置Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７および／またはＸ１０における１以上の置換との組み合わせを有する、請求項１から７のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項９】
前記の位置Ｘ１０における置換がＬｅｕ、Ｎｌｅ、またはＭｅｔ（Ｏ）またはＭｅｔ（Ｏ）２のような酸化的に安定なＭｅｔ−置換アミノ酸である、請求項１または４に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項１０】
一般式ＩＩＩ
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｘ８−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｘ１１−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘ２０−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘ２４−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｘ２８−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−ＮＨ２
（式中、
Ｒ１は水素、Ｃ１−４アルキル（例えばメチル）、アセチル、ホルミル、ベンゾイルまたはトリフルオロアセチルであり、
Ｘ８はＡｓｐまたはＳｅｒ、好ましくはＡｓｐ、
Ｘ１１はＳｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、ＬｙｓまたはＡｓｎ、
Ｘ１５はＧｌｕまたはＡｓｐ、好ましくはＧｌｕ、
Ｘ１６はＳｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｕ、
Ｘ２０はＳｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｕ、
Ｘ２４はＳｅｒ、ＡｌａまたはＧｌｕ、および
Ｘ２８はＳｅｒ、Ａｌａ、ＧｌｎまたはＧｌｕ、または医薬的に許容される塩またはその誘導体）により定義されるＧＬＰ−２類似体。
【請求項１１】
表１および表２に開示された、請求項１から１０のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体またはその薬理学的に許容される塩または誘導体。
【請求項１２】
配列
２２６３ ＨＧＥＧＳＦＳＤＥＬＳＴＩＬＥＳＬＡＡＳＤＦＩＳＷＬＩＳＴＫＩＴＤ−ＮＨ２
２２６４ ＨＧＥＧＳＦＳＤＥＬＡＴＩＬＥＡＬＡＡＡＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ−ＮＨ２
２２６６ ＨＧＥＧＳＦＳＤＥＬＥＴＩＬＥＥＬＡＡＥＤＦＩＥＷＬＩＥＴＫＩＴＤ−ＮＨ２
２２６７ ＨＧＥＧＳＦＳＤＥＬＳＴＩＬＥＳＬＡＡＡＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤ−ＮＨ２
２２６８ ＨＧＥＧＳＦＳＤＥＬＡＴＩＬＥＡＬＡＡＳＤＦＩＳＷＬＩＳＴＫＩＴＤ−ＮＨ２
２２６９ ＨＧＥＧＳＦＳＤＥＬＫＴＩＬＥＳＬＡＡＡＤＦＩＥＷＬＩＱＴＫＩＴＤ−ＮＨ２
２２７０ ＨＧＥＧＳＦＳＤＥＬＮＴＩＬＥＳＬＡＡＳＤＦＩＳＷＬＩＳＴＫＩＴＤ−ＮＨ２
２２７２ ＨＧＥＧＳＦＳＤＥＬＡＴＩＬＥＳＬＡＡＡＤＦＩＳＷＬＩＡＴＫＩＴＤ−ＮＨ２
２２４２ ＨＧＥＧＳＦＳＳＥＬＳＴＩＬＤＡＬＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＡＴＫＩＴＤＫ−ＯＨ
で表される、請求項１１に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項１３】
位置Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４、Ｘ２８、Ｘ３１、Ｘ３２および／またはＸ３３に１を超える置換を有する、請求項１から１２のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項１４】
Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４、Ｘ２８がＩｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＶａｌから選択される１以上の置換、および位置Ｘ３１、Ｘ３２およびＸ３３の任意の欠失、または医薬的に許容される塩またはその誘導体を含む、請求項１３記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項１５】
位置Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４および／またはＸ２８のうち１以上の位置に置換を有する、請求項１から９のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項１６】
Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４およびＸ２８がそれぞれ独立してＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙおよびＴｈｒから選択され、かつ該類似体が結腸に比し小腸に対して優先的な増殖促進活性を有する、請求項１、４、または１０に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項１７】
Ｘ１１およびＸ１６がそれぞれ独立してＡｌａおよびＳｅｒから選択され、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８が独立してＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙおよびＴｈｒから選択される、請求項１６に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項１８】
Ｘ１１およびＸ１６が両者ともＡｌａであり、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８は独立してＡｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙおよびＴｈｒから選択される、請求項１７に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項１９】
Ｘ１１およびＸ１６が両者ともＡｌａであり、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８が独立してＡｌａおよびＳｅｒから選択される、請求項１７に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項２０】
位置Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４およびＸ２８の残基が、以下の組み合わせＳｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ； Ａｌａ／Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ａｌａ； Ａｌａ／Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ａｌａ； Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ； Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ａｒｇ／Ａｌａ／Ａｌａ； Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ａｌａ； Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ のうち１つを含む、請求項１６に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項２１】
ＺＰ２２６４、ＺＰ２２６８、ＺＰ２２４２、ＺＰ２２７２、ＺＰ２４１１、ＺＰ２３８０、ＺＰ２３８４、ＺＰ２３９８、ＺＰ２４１７、ＺＰ２４２３、ＺＰ２３８５、ＺＰ２３９９、ＺＰ２４１８、ＺＰ２３８１、ＺＰ２４２０またはＺＰ２３９７である、請求項１６に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項２２】
Ｘ１１がＬｅｕ、ＰｈｅおよびＬｙｓから選択され、
Ｘ１６がＬｅｕ、ＰｈｅおよびＬｙｓから選択され、
Ｘ２０がＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＧｌｙおよびＴｈｒから選択され、
Ｘ２４がＡｌａおよびＳｅｒから選択され、
Ｘ２８がＡｌａ、ＳｅｒまたはＬｙｓから選択され、かつ該類似体が結腸に比し胃において優先的な増殖促進活性を有する、請求項１、４、または１０に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項２３】
Ｘ１１およびＸ１６が独立してＬｅｕおよびＰｈｅから選択され、Ｘ２４およびＸ２８が独立してＬｙｓおよびＳｅｒから選択され、かつＸ２０がＳｅｒである、請求項２２に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項２４】
Ｘ１１およびＸ１６が独立してＬｅｕおよびＰｈｅから選択され、かつＸ２０、Ｘ２４およびＸ２８がＳｅｒである、請求項２３に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項２５】
位置Ｘ１１、Ｘ１６、Ｘ２０、Ｘ２４およびＸ２８の残基が、以下の組み合わせ
Ｌｙｓ／Ｌｙｓ／Ｌｙｓ／Ｌｙｓ／Ｌｙｓ； Ｐｈｅ／Ｐｈｅ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ； Ｌｅｕ／Ｌｅｕ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ／Ｓｅｒ； Ｌｅｕ／Ｌｅｕ／Ａｌａ／Ａｌａ／Ａｌａ のうち１つを含む、請求項２２に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項２６】
ＺＰ２４００、ＺＰ２４１２、ＺＰ２３９６、ＺＰ２３９４、ＺＰ２４０１またはＺＰ２３９５である、請求項２２に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項２７】
小腸特異的ＧＬＰ−２類似体の個々の位置１１、１６、２０、２４および２８のＨＢＰ間隔が、全ての位置につき独立して少なくとも０≦ＨＢＰ１１，１６，２０，２４，２８≦２でなければならない、請求項１から２６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項２８】
位置１１および１６がＨＢＰ１１，１６，＝０、かつ位置２０、２４および２８が独立して ０≦ＨＢＰ２０，２４，２８≦２のＨＢＰ間隔を有する、請求項２７に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項２９】
胃特異的ＧＬＰ−２類似体の個々の位置１１、１６、２０、２４および２８のＨＢＰ間隔が、全ての位置につき独立して少なくとも０≦ＨＢＰ１１，１６，２０，２４，２８≦２でなけらばならない、請求項１から２６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項３０】
位置１１および１６のＨＢＰ間隔がＨＢＰ１１，１６，＝０、かつ位置２０、２４および２８のＨＢＰ間隔が独立して ０≦ＨＢＰ２０，２４，２８≦２である、請求項２９に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項３１】
治療に用いられる、請求項１から３０のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体。
【請求項３２】
請求項１から３１のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体、またはその塩または誘導体を、担体との混合物として含む医薬組成物。
【請求項３３】
該ＧＬＰ−２類似体が医薬的に許容される酸付加塩である、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記のＧＬＰ−２類似体が注射または点滴による投与に適した液体として処方されるか、または緩慢に放出されるように処方された、請求項３２または３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
胃および腸関連疾患を治療および／または予防する薬剤の製剤のための、請求項１から２６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体の使用。
【請求項３６】
該胃および腸関連疾患が、潰瘍、ゾリンジャー・エリソン症候群、消化障害、吸収不良症候群、短消化管症候群（ｓｈｏｒｔ−ｇｕｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、カルデサック症候群（ｃｕｌ−ｄｅ−ｓａｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、炎症性腸疾患、セリアックスプルー（例えばグルテン誘導性腸疾患またはセリアック病）、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症スプルー、腸炎、局所性腸炎（クローン病）、潰瘍性結腸炎、小腸損傷、または短腸症候群である、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
該胃および腸関連疾患が放射線性腸炎、感染性または後感染性腸炎、または有毒剤またはその他の化学療法剤による小腸損傷である、請求項３５に記載の使用。
【請求項３８】
化学療法または放射線治療における副作用を治療および／または予防する薬剤の製剤のための、請求項１から２６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体の使用。
【請求項３９】
該化学療法の副作用が下痢、腹部けいれん、嘔吐、および化学療法による治療に起因する腸上皮の構造的および機能的損傷である、請求項３９に記載の使用。
【請求項４０】
新生児、骨粗鬆症、またはＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）により媒介される状態を治療する薬剤の製剤のための、請求項１から２６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体の使用。
【請求項４１】
栄養障害に関わる状態を治療および／または予防する薬剤の製剤のための、請求項１から２６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体の使用。
【請求項４２】
該栄養障害に関わる状態が悪液質または食欲不振である、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
請求項１から２６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体をコードする核酸配列を含む核酸分子。
【請求項４４】
請求項４０に記載の核酸配列を、その発現を導く制御配列と組み合わせて含む発現ベクター。
【請求項４５】
請求項３４に記載の発現ベクターにより形質転換されたホスト細胞。
【請求項４６】
該ＧＬＰ−２類似体の発現に適した条件下で請求項４１に記載のホスト細胞を培養すること、およびそれにより産生されたＧＬＰ−２類似体を精製することを含む、請求項１から２６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体の産生方法。
【請求項４７】
請求項４３に記載の核酸分子、請求項４４に記載の発現ベクター、または請求項４１に記載のホスト細胞の治療における使用。
【請求項４８】
胃および腸関連疾患を治療および／または予防するための、または化学療法または放射線治療における副作用を治療および／または予防するための、または新生児、骨粗鬆症、またはＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）により媒介される状態を治療するための薬剤の製剤における、請求項４３に記載の核酸分子、請求項４０に記載の発現ベクター、または請求項４５に記載のホスト細胞の使用。
【請求項４９】
効果的な量の請求項１から２６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体、請求項４３に記載の核酸分子、請求項４４に記載の発現ベクター、または請求項４５に記載のホスト細胞を投与することによる、患者の必要性に応じて胃および腸関連疾患を治療する方法。
【請求項５０】
該胃および腸関連疾患が、潰瘍、ゾリンジャー・エリソン症候群、消化障害、吸収不良症候群、短消化管症候群（ｓｈｏｒｔ−ｇｕｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、カルデサック症候群（ｃｕｌ−ｄｅ−ｓａｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、炎症性腸疾患、セリアックスプルー（例えばグルテン誘導性腸疾患またはセリアック病）、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症スプルー、腸炎、局所性腸炎（クローン病）、潰瘍性結腸炎、小腸損傷、または短腸症候群である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
該胃および腸関連疾患が放射線性腸炎、感染性または後感染性腸炎、または有毒剤またはその他の化学療法剤による小腸損傷である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
効果的な量の請求項１から２６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体、請求項４３に記載の核酸分子、請求項４４に記載の発現ベクター、または請求項４５に記載のホスト細胞を投与することを含む、患者の必要性に応じて化学療法または放射線治療における副作用を治療または予防する方法。
【請求項５３】
該化学療法の副作用が下痢、腹部けいれん、嘔吐、または化学療法による治療に起因する腸上皮の構造的および機能的損傷である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
効果的な量の請求項１から２６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体、請求項４３に記載の核酸分子、請求項４４に記載の発現ベクター、または請求項４５に記載のホスト細胞を投与することを含む、患者の必要性に応じて新生児疾患、肥満、骨粗鬆症、またはＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）により媒介される状態を治療する方法。
【請求項５５】
癌化学療法薬剤および請求項１から２６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体、請求項４３に記載の核酸分子、請求項４４に記載の発現ベクター、または請求項４５に記載のホスト細胞それぞれを任意に医薬的に許容される担体と組み合わせて含む治療キット。
【請求項５６】
癌化学療法薬剤および請求項１から２６のいずれか１項に記載のＧＬＰ−２類似体、請求項４３に記載の核酸分子、請求項４４に記載の発現ベクター、または請求項４５に記載のホスト細胞を医薬的に許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１０−５０９１９７（Ｐ２０１０−５０９１９７Ａ）
【公表日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３５１３２（Ｐ２００９−５３５１３２）
【出願日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００４２７３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０５６１５５
【国際公開日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【出願人】（５０２４５３０４５）ジーランド ファーマ アクティーゼルスカブ (13)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００４２７３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０５６１５５
【国際公開日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【出願人】（５０２４５３０４５）ジーランド ファーマ アクティーゼルスカブ (13)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]