骨形成を増進するための作用剤および方法
【課題】 造骨細胞の細胞分化を誘導する作用剤および方法、並びに、患者を処置する、骨の質量を維持する、及び／又は、骨の形成及び／又は骨の修復を増進するための作用剤および方法を提供する。
【解決手段】 本発明は、造骨細胞の細胞分化を誘導する作用剤および方法、並びに、患者を処置する、骨の質量を維持する、骨の形成及び／又は骨の修復を増進するための、作用剤および方法の使用を開示する。好適な作用剤としては、オキシステロール、単独あるいは特定のオキシステロール、または骨の形成を助長する既知の他の作用剤との組み合わせが挙げられる。本発明は、さらに、骨の障害の治療のためのオキシステロール含有薬剤、オキシステロールまたは細胞の局所的な注入、及び、骨の修復を促進するための作用剤または細胞を有するインプラントを含む。
【解決手段】 本発明は、造骨細胞の細胞分化を誘導する作用剤および方法、並びに、患者を処置する、骨の質量を維持する、骨の形成及び／又は骨の修復を増進するための、作用剤および方法の使用を開示する。好適な作用剤としては、オキシステロール、単独あるいは特定のオキシステロール、または骨の形成を助長する既知の他の作用剤との組み合わせが挙げられる。本発明は、さらに、骨の障害の治療のためのオキシステロール含有薬剤、オキシステロールまたは細胞の局所的な注入、及び、骨の修復を促進するための作用剤または細胞を有するインプラントを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨の恒常性を維持し、骨の形成を増進する、及び／又は、骨の修復を増進する作用剤と方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
正常な骨再構築は、骨格の完全性を維持するため成人の生涯を通して起こるものであり、破骨細胞による骨の再吸収および造骨細胞による骨の形成を含んでいる。したがって、骨の形成と骨の再吸収との間のバランスに対するいかなる干渉も、骨の恒常性、骨の形成および修復に影響し得る。
【０００３】
造骨細胞は、骨髄ストローマ細胞（骨髄幹細胞；ＭＳＣ）のプールから生じる。これら細胞は、各種の組織内に存在し、骨の骨髄ストローマ内で支配的である。ＭＳＣは、多能的であり、造骨細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、および脂肪細胞に分化し得る。
【０００４】
骨粗鬆症は、初老者における羅病率および死亡率の主要な要因であり、米国健康ケアシステムの年間コストは、少なくとも１００億ドルである。男性も女性も、加齢に伴う骨粗鬆症による骨の減損に苦しんでいる。これら有害な変化は性ホルモンの減少により引き起こされると考えられている。例えば、骨粗鬆症は、閉経後の女性で増加する。
【０００５】
蓄積されている証拠によれば、造骨細胞の数および活性度は、加齢につれて減少するが、この変化の理由は明らかではない。加えて、骨粗鬆症の骨の骨髄では、造骨細胞の形成を犠牲にすると思われる脂肪細胞の形成が増大する。さらに、骨内の脂肪性組織の体積は、普通の被検者では年齢と共に増大し、これは実質的に加齢に伴う骨粗鬆症であって、これは柵状織の骨の減損の程度に平行する、骨の柵状織に隣接した脂肪細胞の数と共に増大する。この観察、そして、同様の観察に基づいて、加齢に伴う骨粗鬆症における骨の減損の原因は、少なくとも部分的には、造骨細胞分化が脂肪細胞経路へ変移するためであることが示唆された。
【０００６】
老人においては骨折の治癒は阻害されており、ＭＳＣ（一般に骨折部位に遊走して新しい骨の形成が生じることを可能にすると考えられる）の数および活性度の減少が実証されている。
【０００７】
現在のところ、骨粗鬆症に対する唯一の処置は、造骨細胞による骨の再吸収を目的にした処置である。このＦＤＡ（食品医薬品庁）認可の治療法には、ビスホスホン酸塩、選択的エストロゲン受容体モジュレータなどのホルモン置換療法、カルシトニン、およびビタミンＤ／カルシウムの補充が含まれる。しかしながら、これらの処置は、骨の質量のごく小さな増加をもたらすだけであり、骨粗鬆症の総合的な防止または治療には十分ではない。
【０００８】
現在、骨粗鬆症の治療に対するＦＤＡ認可の唯一のタンパク質同化作用剤は、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）である。ＰＴＨは現在、造骨細胞のアポトーシスを阻害することによって骨の形成を増大すると考えられている。ＰＴＨは、断続的な注入で骨の質量を増大させ、骨粗鬆症患者の骨折発生率を低減することが判明している。しかしながら、ＰＴＨによる連続的な治療及び／又はその蓄積は、患者に対して全身的な悪影響を及ぼす場合があるため、投与量を厳密に制御しなければならない。加えて、ＰＴＨ治療は、極めて費用が嵩む。したがって、ＰＴＨ治療は、最も重篤な骨粗鬆症患者のためのみに用意されている。
【０００９】
造骨細胞による骨の形成を増進するための他の有力な治療法としては、弗化ナトリウム、および骨にプラスの影響を及ぼす成長因子（例えば、インスリン様成長因子IおよびIIおよびトランスフォーミング成長因子ベータ）が挙げられる。しかしながら、これら因子は、これまでは、望ましくない副作用を有していた。
【００１０】
ヒトの骨関連の障害の治療に幹細胞を使用することも検討されてきた。例えば、骨形成不全は、患者の造骨細胞が、コラーゲンIを適切な形で作らず、結果として、骨の脆化を招く骨格病である。健康な個体からの造骨前駆体幹細胞を罹病した個体に注入することによって、これら患者の骨密度が向上することが示されている。さらに、幹細胞は、個体から単離して、インビトロで膨張させ、刺激して軟骨を形成する軟骨細胞にし、関節炎の関節に再注入して軟骨を再生させることができる。
【００１１】
したがって、骨の恒常性、骨の形成および骨の修復を制御するための作用剤および方法が所望される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、骨の恒常性を維持する、骨の形成を増進する、及び／又は骨の修復を増進するための作用剤と方法に関する。
【００１３】
より詳細には、本発明は、骨の恒常性を維持する、骨の形成を増進する、及び／又は骨の修復を増進する、全身的、及び／又は局所的アプリケーション作用剤を含んでよい。
【００１４】
より詳細には、本発明は、造骨細胞の骨形成を刺激する作用剤の使用を含みうる。本発明は、ＭＳＣの造骨細胞への分化に影響する作用剤の使用を含みうる。本発明で造骨細胞への分化をもたらすのに有効でありうる作用剤としては、２２（Ｒ）−、２２（Ｓ）−、２０（Ｓ）−、および２５−ヒドロキシコレステロールなどの個々のオキシステロール、プレグネノロンのうちの単独またはこれらの組合せが挙げられるが、ただしそれらに限定されない。本発明において有用であり得るオキシステロールの組合せの具体的な例としては、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールと２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールの組合せ、並びに２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールの組合せが挙げられる。本発明は、さらに、造骨細胞分化または骨形成に影響する点で活性を有することが分かっているオキシステロール分子のいかなる部分も含んでよい。本発明は、さらに、造骨細胞分化または骨形成に影響する点で、オキシステロールが、それにおいて活性を有する分子の活性化を含んでよい。本発明はまた、同様の動作機序を介して、親分子と同様に作用するであろう上記のオキシステロールの活性部分、および骨の恒常性にプラスの影響を及ぼすであろう同様の受容体を模倣するよう設計されている他の脂質分子または類縁体（アナログ）を含んでよい。
【００１５】
本発明は、破骨細胞の骨の再吸収を阻害する作用剤の使用を含んでよい。本発明において、破骨細胞の骨の再吸収に影響を与えるのに有用と思われる作用剤としては、ビスホスホン酸塩、選択的エストロゲン受容体モジュレータ、カルシトニン、およびビタミンＤ／カルシウムのサプリメンテーションが挙げられるが、これらに限定されない。本発明はまた、造骨細胞の骨形成を誘導する作用剤の使用を含んでよい。本発明において、有用と思われる作用剤としては、ＰＴＨ、弗化ナトリウム、およびインスリン様成長因子IおよびIIおよびトランスフォーミング成長因子ベータなどの成長因子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
本発明は、骨の恒常性を維持する、骨の形成を増進する、及び／又は骨の修復を増進するための作用剤を全身的に送達する方法または該作用剤による局所的な処置の方法を含んでよい。本発明は、骨骨の恒常性を維持する、骨の形成を増進する、及び／又は骨の修復を増進するための、分化した造骨細胞を全身的に運搬する方法または該造骨細胞による局所的な処置の方法を含んでよい。
【００１７】
本発明の一実施態様では、該方法は、歯根膜炎、歯周再生、歯のインプラント再構築のための歯槽隆線の増大、非癒着骨折の治療においてなど、骨の局所的修復を誘導するのに適用されてよい。本発明の一実施態様では、該方法は、骨粗鬆症などの骨関連の障害を治療するのに応用されてよい。
【００１８】
本発明はまた、骨の形成を誘導しあるいは骨の修復を増進するための物質のコーティングを有する、あるいは該目的のための分化した細胞を播種されている、インプラントを含んでもよい。本発明はまた、骨の形成または骨の修復が所望される部位における該物質または分化した細胞の適用を含んでもよい。例えば、インプラントとしては、骨の形成または骨の修復を刺激することによって、骨折を不動化し、骨の形成を増進し、あるいは、補綴インプラントを安定化するのに使用されるピン、ネジ、および板が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
政府後援
この研究は、米国立衛生研究所／米国立衛生研究所により後援されており、米国立衛生研究所／米国立衛生研究所により グラント番号P60 AG 10415-11 が授与されている。アメリカ合衆国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、骨の恒常性を維持し、骨の形成を増進し、かつ（または）、骨の修復を増進するための作用剤および方法に関する。
【００２１】
より詳細には、本発明は、骨の恒常性を維持し、骨の形成を増進し、かつ（または）、骨の修復を増進するための作用剤の全身的な、かつ（または）、局所的な適用を含んでよい。方法または化合物の、骨の恒常性を維持する能力の、臨床的インデクスは、ＤＥＸＡスキャニングによって評価される身体全体の異なる部位における骨の密度の改善によって立証される。治癒破折における増強された骨の形成は、選択された時間間隔における骨折部位の通常のＸ線検査によってルーティンで評価される。定量的なＣＴスキャニングなどの、上記インデクスを判定するためのより進歩した方法が用いられてよい。
【００２２】
より詳細には、本発明は、造骨細胞の骨形成を刺激する作用剤の使用を含んでよい。本発明は、ＭＳＣの造骨細胞への分化に影響する作用剤の使用を含んでよい。
【００２３】
本発明において有用であると思われる造骨細胞分化に影響する作用剤としては、個々のオキシステロールまたはそれらの組合せが挙げられるが、しかしそれらに限定されない。
【００２４】
オキシステロール。オキシステロールの、造骨性分化および石灰化を誘導し、かつ、脂肪生成性分化を阻害する能力は、骨の恒常性を維持し、骨の形成を誘導し、または骨の修復を誘導する利益をもたらし得る。
【００２５】
オキシステロールは、循環血液内および組織内に存在するコレステロールの酸化誘導体の大きなファミリーを形成する。オキシステロールは、内因性のコレステロール酸化誘導体であり、コレステロールの生合成を制御する点で重要である。オキシステロールは、自動酸化によって脂質の過酸化の二次副産物として、あるいは、その大部分がチトクロ−ムＰ４５０酵素ファミリーのメンバーである特異的なモノオキシゲナーゼの作用によって形成される。オキシステロールは、食事での摂取物から誘導され得る。オキシステロールは、コレステロールの新陳代謝、ステロイドの産生、アポトーシス、アテローム硬化、ネクローシス、炎症、および免疫抑制を含む他の生理学的、及び／又は、病理学的プロセスの制御に関与してきた。
【００２６】
コレステロールの生合成は、最近、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の阻害性効果（これはメバロン酸塩によって逆転可能であるが）によって示されたように、骨髄幹細胞（ＭＳＣ）の分化に関与していることが示された。さらに、オキシステロールは、それらの造骨細胞分化を誘導する能力、および、追加的には、ＭＳＣのインビトロでの石灰化によって立証されたように、造骨性のポテンシャルを有していることが実証された。最後に、オキシステロールは、抗脂肪生成性効果を有し、ＭＳＣの脂肪細胞分化を阻害することが実証された。
【００２７】
オキシステロールの造骨性および抗脂肪生成性効果を示すのに用いられるインビトロモデルは、有効であり、骨形態発生蛋白質（ＢＭＰ）を含む他の化合物の同様の挙動を実証するのに従来用いられてきた。このレポートで使用される骨髄幹細胞（Ｍ２細胞）を含む骨前駆体細胞は、動物およびヒトにインビボで存在するそれらと同様に作用することが示されてきた。これらのインビトロモデルはまた、今まで、ＢＭＰおよびインシュリン様成長因子（ＩＧＦ）などの化合物のインビボ造骨性効果を成功裡に予測することもできた。また、骨器官培養モデルにおけるオキシステロールの造骨性効果が、マウスの新生仔の頭蓋冠を用いて実証された。この器官培養モデルはまた、今まで、ＢＭＰを含む異なる化合物の造骨性効果をインビボに予測するのに成功裡に用いられてきた。したがって、これらの同様な発見に基づいて、オキシステロールは、動物およびヒトにおいて、インビボで造骨性効果を有するであろうことが予測される。これらのインビトロおよび器官培養モデルにおける化合物の造骨性効果の実証が、動物およびヒトにおけるそれらのインビボにおける効果を実証するであろう治験に先立って必要である。
【００２８】
本発明において造骨細胞分化をもたらすのに有用であると考えられる作用剤としては、２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール、２２（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、２０（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、および２５−ヒドロキシコレステロールなどの個々のオキシステロール、プレグネノロンのそれぞれまたは互いに他との組合せが挙げられるが、しかしそれらに限定されない。本発明において有用であると思われるオキシステロールの組合せの具体的な例としては、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールと２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールの組合せ、並びに２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールの組合せが挙げられる。本発明は、さらに、造骨細胞分化または骨形成に影響する点で活性を有することが判明しているオキシステロール分子のいかなる部分でも含んでよい。本発明は、さらに、前記オキシステロール群の、造骨細胞分化または骨形成に影響する活性を有する分子を活性化することを含んでよい。本発明はまた、親分子と同様の動作機序を介して該親分子と同様に作用するであろう上記のオキシステロールの活性部位、および骨の恒常性にプラスの影響を及ぼすであろう同様の受容体を模倣するよう設計されている他の脂質分子または類縁体（アナログ）を含んでよい。
【００２９】
作用の機序。オキシステロールが生理学的に活性を示すためのメカニズムを調べて、オキシステロールが、各種の細胞内経路によって活性を有しかつ影響を受けることが判明した。先ず、オキシステロールの造骨細胞分化に対する影響は、チトクロームＰ４５０阻害剤によって増強されることが実証された。オキシステロールの造骨細胞分化に対する影響はまた、アラキドン酸代謝経路、すなわち、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）およびホスホリパーゼＡ２、およびＥＲＫにおける酵素によっても仲介される。第二に、例えば、細胞内ホスホリパーゼの活性から解放されたアラキドン酸は、造骨細胞分化に対するオキシステロール効果をポジティブにもたらす。第三に、ＣＯＸ酵素によって代謝される、プロスタグランジンＥ２および造骨性プロスタノイドを含むプロスタグランジンは、造骨細胞分化に対するオキシステロール効果をポジティブにもたらす。第四に、細胞外信号制御キナーゼ（ＥＲＫ）の活性度が、オキシステロールによって、増強され、造骨細胞分化および石灰化に相関付けられる。したがって、これらの作用剤またはオキシステロールの作用の機序を刺激する作用剤も、本発明において有用であろう。
【００３０】
さらに、オキシステロールは、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）と呼ばれる核ホルモン受容体に結合されてそれを活性化し、該核ホルモン受容体は、次いで、ＬＸＲによって制御される遺伝子のプロモータ上のコンセンサス結合部位に結合する。追加のオーファン核ホルモン受容体が、オキシステロールの制御効果のいくつかを仲介することができるであろうオキシステロール結合部位用として役立ち得る。本発明は、破骨細胞の骨の再吸収を阻害する作用剤の使用を含んでよい。
【００３１】
本発明は、骨の恒常性を維持する、骨の形成を増進する、及び／又は骨の修復を増進する作用剤の全身的な運搬、及び、該作用剤による局所化された処置の方法を含み得る。
【００３２】
本発明は、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、またはプレグネノロンを含む群から選択された少なくとも一つのオキシステロール、または２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、またはプレグネノロンのうちのいずれか一つの活性部分の治療的に有効な投与量を含有する、骨の障害の処置に使用するための薬物を含む。
【００３３】
治療的に有効な投与量。本発明において有用な作用剤の治療的に有効な投与量は、上記の骨の恒常性、骨の形成、または骨の修復を改善する作用剤の能力によって測定される、患者にプラスの臨床的効果を及ぼす投与量である。各作用剤の治療的に有効な投与量は、マイナスの副作用を最小限度に抑えつつ、所望の臨床的効果が得られるよう調整されてよい。作用剤の投与量は、特定の患者に適した個々の措置および投与量のレベルを決定する際、投与の経路、疾病の重症度、患者の年齢および体重、患者が摂取している他の投薬、および付添い医師によって普通に考えられる他の要因によって、個々の患者について選択されてよい。
【００３４】
一例を挙げると、本発明は、内因性の循環オキシステロールレベルを患者の基底レベル以上に上げる措置を含んでよい。普通の成人では、該レベルは、質量分析法で測定した場合、年齢およびオキシステロールの種類により、およそ１０〜４００ｎｍ／ｍｌである。薬理学分野において通常の技術を有する者であれば、循環オキシステロールレベルを患者の基底レベル以上に上げるための投与量および経路を決定することができよう。
【００３５】
投与形態。投与形態に含まれる作用剤の治療的に有効な投与量は、選択された作用剤の種類および投与の経路を考えて選択されてよい。投与形態は、薬理学分野において通常の技術を有する者には既知の、患者に対する投与を促進するためのアドジュタントおよび薬学的に受容できるキャリヤを含む他の不活性の成分と組み合わされた作用剤を含んでよい。一実施形態においては、投与形態は、消費された時、人体において作用剤のレベルが上がる結果となる経口的な調合剤（例えば、液体、カプセル、キャプレットなど）であってよい。経口的な調合剤は、希釈剤、結合剤、タイムレリース剤（time release agent）、潤滑剤およびディスイニグラント（disinigrant）を含むキャリヤを含んでよい。
【００３６】
投与形態は、経皮的適用に適した局所的な調合剤（例えば、ローション、クリーム、軟膏剤、経皮パッチなど）で提供されてよい。投与形態はまた、例えば、皮下適用（スローレリースカプセル内など）、静脈内適用、腹腔内適用、筋肉内適用、または呼吸による適用に適した調合剤で提供されてよい。
【００３７】
投与形態には、作用剤の一つまたは組合せのいずれも、含まれてよい。別法として、作用剤の組合せが、別個の投与形態で、患者に投与されてよい。少なくとも二つの処置用作用剤が患者に加えられるよう、作用剤の組合せが同時的に投与されてよい。
【００３８】
追加的作用剤。本発明は、骨の恒常性を維持し、骨の形成を増進し、かつ（または）、骨の修復を増進するため、少なくとも一つの最初の作用剤と独立的にあるいは相乗効果的に作用する追加的作用剤による処置を含んでよい。
【００３９】
追加的作用剤は、オキシステロールが造骨細胞分化を増進する機序経路を刺激する作用剤であってよい。したがって、本発明において、単独で、あるいは、オキシステロールと組み合わせて、有用と思われる類の作用剤としては、ＳＫＦ５２５Ａなど、チトクロームＰ４５０阻害剤が挙げられるが、しかしそれらに限定されない。本発明で有用な他の類の作用剤としては、ホスホリパーゼ活性化剤、あるいはアラキドン酸が挙げられる。本発明で有用な他の類の作用剤としては、ＣＯＸ酵素活性化剤、あるいはプロスタグランジンあるいは造骨性プロスタノイドが挙げられる。本発明で有用な他の類の作用剤としては、ＥＲＫ活性化剤が挙げられる。
【００４０】
本発明は、オキシステロールと骨の形成、修復または恒常性に影響する他の治療法による処置の組合せを含んでよい。例えば、オキシステロールと、ビスホスホン酸塩、エストロゲン受容体モジュレータ、カルシトニン、およびビタミンＤ／カルシウム補充などのホルモン治療処置、ＰＴＨ（Ｆｏｒｔｅｏまたはテリパラチド、Eli Lily、など）、弗化ナトリウム、およびインスリン様成長因子IおよびIIおよびトランスフォーミング成長因子ベータなどの骨にプラスの影響を及ぼす成長因子との組合せが挙げられる。当業者であれば、標準の治療投与パラメータを用いて、治療のそれぞれに対する一般に認められた投与量を決定することは、可能であろう。
【００４１】
本発明は、骨の恒常性を維持する、骨の形成を増進する、及び／又は、骨の修復を増進する分化した造骨細胞の全身的な運搬、または、該造骨細胞による局所化された処置の方法を含んでよい。この処置は、上記のように、患者に対して、単独で、あるいは、他の作用剤（複数も可）の投与と組み合わせて行われてよい。図１は、本発明による一方法のフロー図である。この方法のこの実施形態では、患者、あるいは、細胞ドナーから、哺乳類の間葉幹細胞が収集され得る（１００）。該細胞は、次いで、少なくとも一つの作用剤で処置されて、該細胞の造骨細胞分化を誘導し得る（１０２）。該細胞は、次いで、患者に対して、全身的に、あるいは、骨の恒常性、骨の形成、または、骨の修復が望まれる選択された部位において、投与され得る（１０４）。追加的に、患者は、骨の恒常性、骨の形成、または、骨の修復をもたらす少なくとも一つの第二の作用剤により、局所的に、あるいは全身的に、処置され得る（１０６）。
【００４２】
本発明のこの態様においては、ＭＳＣは、アルカリ性ホスファターゼの活性度、カルシウムの取込み、石灰化またはオステオカルシンのｍＲＮＡ発現、あるいは、造骨細胞分化の他の指標の増大のうちのいずれか一つによって測定される造骨細胞分化を刺激する作用剤（複数も可）により処置されてよい。本発明の一実施形態では、ＭＳＣ細胞が、患者から収集され、少なくとも一つのオキシステロールにより処置され、そして、造骨細胞が患者に投与される。
【００４３】
本発明は、造骨細胞的に分化したＭＳＣを患者に対して全身的に投与する工程を含んでよい。
【００４４】
本発明は、造骨細胞的に分化したＭＳＣを、患者の身体の選択された場所に配置する処置を含んでよい。本発明の一実施形態では、細胞が、骨の恒常性、形成、及び／又は、修復が望まれる場所に注入されてよい。
【００４５】
本発明の一実施態様では、作用剤および方法は、治療に、あるいは、骨粗鬆症などの骨関連の障害の進行を遅らせる処置に応用されてよいが、それらに限定されない。
【００４６】
本発明の一実施態様では、作用剤および方法は、歯根膜炎、歯周再生、歯のインプラント再構築のための歯槽隆線の増大、非癒着骨折の治療、膝／臀部／関節部位の修理または置換外科において、細胞または作用剤の、外科的あるいは骨折部位への適用処置に応用されてよいが、それに限定されない。
【００４７】
図２は、本発明の２つの実施形態を示す。図２Ａでは、本発明は、人体で使用のためのインプラント（２００）であって、表面（２０１）を有する基質を含み、該インプラントの少なくとも該表面は、少なくとも一つのオキシステロール（２０３）を、骨形成を誘導するのに十分な量で含み、あるいは、インプラントは、骨形成または骨修復の増強を誘導するための造骨細胞分化が可能な哺乳類の細胞、または、造骨細胞の哺乳類細胞、または、それらの組合せを含むインプラントを含んでよい。例えば、インプラントとしては、骨の除去、骨折または他の骨の損傷の部位（２０４）の形成または修復を刺激することによって、骨折を不動化し、骨の形成を増進し、あるいは、補綴インプラントを安定化するのに使用される、骨（２０２）の近傍に、あるいはそれと接触して配置され得る、ピン、ネジ、板または補綴関節が挙げられる。
【００４８】
図２Ｂに示すように、本発明は、骨の形成、または、骨の修復が望まれる、骨の除去、骨折または他の骨の損傷の部位（２０４）において、骨（２０２）の近傍に、あるいはそれと接触して、少なくとも一つの作用剤または分化した細胞（２０６）を適用する処置を含んでよい。
【実施例】
【００４９】
材料：Sigma (St. Louis, MO, U.S.A.) から入手したオキシステロール、ベータグリセロ燐酸塩（βＧＰ）、硝酸銀、オイルレッドＯ、Irvine Scientific (Santa Ana, CA, U.S.A.) から入手したＲＰＭＩ １６４０、α改変基本培地（α−ＭＥＭ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、及びHyclone (Logan, UT, U.S.A.) から入手した牛の胎児の血清。BIOMOL Research Labs (Plymouth Meeting, PA, U.S.A.) から購入したＰＤ９８０５９、Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, U.S.A.) から購入したＴＯ−９０１３１７、ＳＣ−５６０、ＮＳ−３９８、Ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ、及びＦｌｕｒｂｉｐｒｏｆｅｎ、Calbiochem (La Jolla, CA, U.S.A.) から購入したＡＣＡ及びＡＡＣＯＣＦ３、R&D Systems (Minneapolis, MN, U.S.A.) から購入したヒトの組換え体ＢＭＰ２。New England Biolabs (Beverly, MA, U.S.A.) から入手したリン酸エステル化され、かつ、未変性のＥＲＫに対する抗体、および、三共（東京、日本）から得たトログリタゾン。
【００５０】
細胞：American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, U.S.A.) から入手したＭ２−１０Ｂ４マウス骨髄ストローマ細胞ラインは、（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ｘＣ３Ｈ／ＨｅＪ）Ｆ１マウスの骨の骨髄ストローマ細胞に由来するものであり、ヒトおよびマウスの骨髄造血を長期培養において支持し（ＡＴＣＣによる）、かつ、造骨細胞および脂肪細胞に分化する能力を有している。これら細胞は、特記なき場合、１０％の加熱不活性化ＦＢＳを含有し、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン（全てIrvine Scientific製）を補充したＲＰＭＩ １６４０中で培養した。
【００５１】
ATCCからＭＣ３Ｔ３−Ｅ１マウス前造骨細胞ラインを購入し、１０％の加熱不活性化ＦＢＳおよび上記のサプリメントを含むα−ＭＥＭ内で培養した。
【００５２】
Kristina Bostrom博士（UCLA）の好意により提供されたＣ３Ｈ−１０Ｔ１／２マウス多能性胎仔線維芽細胞を、１０％の加熱不活性化ＦＢＳおよび上記のサプリメントを含むＤＭＥＭ内で培養した。初生マウスの骨髄ストローマ細胞を、４〜６ヶ月令の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊのマウスから分離し、前に報告したように培養して増殖させた。ここで、Parhami, F. et al., J. Bone Miner. Res. 14, 2067-2078 (1999) の全開示を引用により組み込む。
【００５３】
アルカリ性ホスファターゼ活性度検定：全細胞抽出液に対して、比色定量のアルカリ性ホスファターゼ活性度（ＡＬＰ）検定を上記のように行った。
【００５４】
von KossaおよびオイルレッドＯ染色−細胞単層内の基質石灰化が、上記のように、硝酸銀染色により検出された。脂肪細胞の検出のため、オイルレッドＯ染色を上記のように行った。
【００５５】
45Ｃａ取込み検定−細胞単層内の基質石灰化を、上記のように、45Ｃａ取込み検定を用いて数量化した。
【００５６】
ウェスタンブロット分析−処置の後、溶解緩衝液内で細胞を溶解し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ蛋白質検定 (Hercules, CA, U.S.A.) を用いて、蛋白質の濃度を測定し、上記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。未変性で、かつ、リン酸エステル化されたＥＲＫについて、上記のように調査を行った。
【００５７】
ＲＮＡ単離およびノーザンブロット分析−適切な実験条件下での細胞の処置の後、Stratagene (La Jolla, CA, U.S.A.) 製のＲＮＡ単離キットを用いて、全ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡ（１０ｍｇ）を、１％のアガロース／ホルムアルデヒドゲルに流し、Duralon-UV メンブレン (Stratagene, CA, U.S.A.) に転写し、紫外線で架橋した。メンブレンは、それぞれ、Geneka Biotechnology (Montreal, Quebec, Canada) およびMaxim Biotech (San Francisco, CA, U.S.A.) から入手した32Ｐ標識化マウスのオステオカルシンｃＤＮＡプローブ、マウスリポタンパク質（ＬＰＬ）、マウス脂肪細胞蛋白質２（ａＰ２）ＰＣＲ産生プローブ、ヒトの２８Ｓまたは１８Ｓ ｒＲＮＡプローブにより、６０℃、オーバーナイトでハイブリダイズした。Invitrogen (Carlsbad, CA, U.S.A.) により合成されたプライマーセットを用いて、下記の仕様により、ＰＣＲ生成物を産生した。マウスのａＰ２遺伝子（アクセス番号Ｍ１３２６１）；センス（７５−９５）５’−ＣＣＡＧＧＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡ−３’、アンチセンス（３６２−３８３）５’−ＣＡＧＣＡＣＴＣＡＣＣＣＡＣＴＴＣＴＴＴＣ−３’、３０９塩基対のＰＣＲ生成物を産生。マウスのＬＰＬ（アクセス番号ＸＭ １３４１９３）；センス（１０３８−１０５８）５’−ＧＡＡＴＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＣＡＧＣＡ−３’、アンチセンス（１８１６−１８３６）５’−ＴＧＧＧＣＣＡＴＴＡＧＡＴＴＣＣＴＣＡＣ−３’
、７９９塩基対のＰＣＲ生成物を産生。ＰＣＲ生成物は、ゲル精製し、UCLA配列決定コアで配列決定したところ、それらの各ＧｅｎＢａｎｋのエントリーに対する最高の類似度が示された。ハイブリッド形成後、室温で、２Ｘ ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳによりブロットを２度洗浄し、次いで、０．５Ｘ ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳにより６０℃で２度洗浄し、Ｘ線フィルムに曝露した。濃度測定により、遺伝子発現誘導の程度を判定した。
【００５８】
統計解析−ＳｔａｔＶｉｅｗ ４．５プログラムを用いて、コンピュータ補助統計解析を行った。ＡＮＯＶＡおよびフィッシャーの最小有意差法（ＰＬＳＤ）有意性試験によりｐ値を計算した。ｐ＜０．０５の値が有意であると考えられた。
【００５９】
例Ａ：ＭＳＣ（骨髄幹細胞）におけるオキシステロールの造骨効果。
【００６０】
試験１：コンフルエンス状態のＭ２細胞を、１０％の牛の胎児の血清（ＦＢＳ）、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸塩および３ｍＭのベータグリセロ燐酸塩（βＧＰ）を添加したＲＰＭＩ １６４０からなる造骨性培地中でコントロールビヒクル（Ｃ）または１０μＭのオキシステロールで処置した。インキュベーションの３日後、細胞ホモジェネート内のアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性度を、比色定量検定により測定した。５回の実験の代表例からの結果を、４重測定の平均値±ＳＤとして報告し、蛋白質濃度に対して基準化して示す（* Ｃ対オキシステロール処置細胞ではｐ＜０．０１）。図３Ａは、Ｍ２細胞内アルカリ性ホスファターゼの活性度に対する各種のオキシステロールの影響を表わす棒グラフである。
【００６１】
コンフルエンス状態のＭ２細胞を、造骨性培地中で、コントロールビヒクル（Ｃ）または指示された濃度の２２Ｒと２０Ｓのオキシステロールの組合せで処置した。３日後、ＡＬＰの活性度を上記のように測定した。４回の実験の代表例からの結果を４重測定の平均値±ＳＤとして報告し、蛋白質濃度に対して基準化して示す（* Ｃ対オキシステロールではｐ＜０．０１）。図３Ｂは、Ｍ２細胞内アルカリ性ホスファターゼの活性度に対する各種の投与量におけるオキシステロールの組合せの影響を表わす棒グラフである。
【００６２】
コンフルエンス状態のＭ２細胞を、造骨性培地中で、コントロールビヒクル（Ｃ）または単独または組合せの５μＭのオキシステロールで指示通りに処置した。１４日後、von Kossa 染色により、石灰化（黒色に見える）を同定した。図３Ｃは、各種の条件に曝露されたＭ２細胞のvon Kossa 染色状況を表わしたものである。
【００６３】
Ｍ２細胞を、コントロールビヒクル（Ｃ）または増大濃度の２２Ｒと２０Ｓのオキシステロールの組合せで処置した。１４日後、45Ｃａ取込み検定により、培養物における基質石灰化を数量化した。４回の実験の代表例からの結果を、４重測定の平均値±ＳＤとして報告し、蛋白質濃度に対して基準化して示す（* Ｃ対オキシステロール処置培養物ではｐ＜０．０１）。図３Ｄは、Ｍ２細胞内のカルシウムの取込みに対する各種の投与量におけるオキシステロールの組合せの影響を表わす棒グラフである。
【００６４】
コンフルエンス状態のＭ２細胞を、造骨性培地内で、コントロールビヒクル（Ｃ）または２２Ｒと２０Ｓのオキシステロールの組合せ（各５μＭ）で処置した。４日および８日後、重複サンプルからの全ＲＮＡを単離し、ノーザンブロッティングにより、上記のようにオステオカルシン（Ｏｓｃ）および２８ＳのｒＲＮＡ発現について分析した。図３Ｅは、４日または８日間、コントロールまたはオキシステロールの組合せに曝露したＭ２細胞内のオステオカルシンｍＲＮＡについてのノーザンブロッティングのラジオグラムである。図３Ｆは、４日または８日間、コントロールまたはオキシステロールの組合せに曝露したＭ２細胞内のオステオカルシンｍＲＮＡの相対デンソメトリック単位を表わす棒グラフである。ノーザンブロットの濃度測定分析からのデータを、重複サンプルの平均値として、２８Ｓ ｒＲＮＡに対して基準化して（Ｆ）に示す。
【００６５】
試験１の結果：ＭＳＣの培養では、アルカリ性ホスファターゼの活性の刺激、オステオカルシンの遺伝子発現および細胞コロニーの石灰化が、造骨細胞表現型への分化の増大の指標である。特異的なオキシステロール、すなわち、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール（２２Ｒ）、２０（Ｓ）ヒドロキシコレステロール（２０Ｓ）、および２２（Ｓ）ヒドロキシコレステロール（２２Ｓ）が、多能性Ｍ２−１０Ｂ４マウスのＭＳＣ（Ｍ２）において、アルカリ性ホスファターゼの活性、造骨性分化の初期マーカー、を誘導した。７−ケトコレステロール（７Ｋ）は、これらの細胞において、アルカリ性ホスファターゼの活性を誘導しなかった。
【００６６】
アルカリ性ホスファターゼの活性の誘導は、０．５〜１０μＭの濃度では、投与量および時間の両方に依存しており、２０Ｓ＞２２Ｓ＞２２Ｒの作用強度が示された。これらオキシステロールに４時間曝露し、次いで、オキシステロールのない造骨性培地と置換したところ、Ｍ２細胞内に、アルカリ性ホスファターゼの活性が十分誘導された（培養４日後の測定）。
【００６７】
０．５〜１０μＭの濃度における個々のオキシステロール（２２Ｒ、２０Ｓおよび２２Ｓ）では、１４日間の処置後も、石灰化またはオステオカルシンの遺伝子発現を誘導させることができなかった（データ示さず）。しかしながら、アルカリ性ホスファターゼの活性（図３Ｂ）、健全な石灰化（図３ＣおよびＤ）およびオステオカルシンの遺伝子発現（図３ＥおよびＦ）は、２２Ｒ＋２０Ｓまたは２２Ｓ＋２０Ｓオキシステロールの組合せによって、Ｍ２培養中で全て誘導された。
【００６８】
試験２：１０％の牛の胎児の血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ培地中で、Ｍ２細胞を成長させた。該細胞を、コンフルエンス状態で、５％のＦＢＳ＋５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸塩および３ｍＭのベータグリセロ燐酸塩を含むＲＰＭＩ内で処置して、造骨細胞分化を誘導させた。該細胞を、成長培地＋１０〜Ｍのトログリタゾン内で処置することによって、脂肪生成性分化を誘導させた。細胞に、ビヒクル（Ｃ）またはオキシステロール、すなわち、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール；２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール；または７ケトコレステロールを、各種の投与量（μＭ）で加える処理を行った。細胞は常に９０％コンフルエンス状態で処置した。４日後、全細胞溶菌液内で、アルカリ性ホスファターゼの活性度を測定し、蛋白質に対して基準化した。別法として、ＭＳＣ培養物を調製し、上記のようにオキシステロールで処置した。細胞は９０％コンフルエンス状態で、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールと２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールとの組合せ（各５μＭ）により、４〜９６時間処置した。オキシステロールを除去し、オキシステロールを含まない新鮮な培地を合計９６持続時間かけて添加した。全細胞抽出液内でアルカリ性ホスファターゼの活性度を測定し、蛋白質に対して基準化した。
【００６９】
試験２の結果：図４Ａは、４日間曝露後の、Ｍ２細胞に対する各種のオキシステロールの、各種の投与量における影響を表わす棒グラフである。オキシステロールは、アルカリ性ホスファターゼの活性、造骨細胞分化の初期マーカー、を誘導した。
【００７０】
図４Ｂは、２４時間の処置後の、Ｍ２細胞に対する各種のオキシステロールの、各種の投与量における影響を表わす棒グラフである。細胞は、９０％コンフルエンス状態で、ビヒクル（Ｃ）、あるいは、オキシステロール２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールまたは２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール（各５μＭ）により、単独であるいは組み合わせて処置した。２４時間後、細胞をリンスし、培地をオキシステロール非含有培地に置換した。４日後、全細胞抽出液内でアルカリ性ホスファターゼの活性度を測定し、蛋白質に対して基準化した。オキシステロールによる僅か２４時間の処置後、アルカリ性ホスファターゼの活性は数倍誘導された。
【００７１】
図４Ｃは、オキシステロールによる処置の持続時間のＭ２細胞に対する影響を表わす棒グラフである。オキシステロール（２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールおよび２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールの組合せ（各５μＭ）による処置で、４〜９６時間の処置後、処置後４日で測定したところ、アルカリ性ホスファターゼの活性が誘導されていた。
【００７２】
図４Ｄは、各種の投与量のオキシステロールの組合せのＭ２細胞に対する影響を表わす棒グラフである。組合せオキシステロールのＭ２細胞に対する影響は、アルカリ性ホスファターゼの活性の誘導についてはその投与量に依存していた。
【００７３】
図４Ｅは、各種の投与量のオキシステロールの組合せのＭ２細胞に対する影響を表わす棒グラフである。２２Ｒおよび２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールの組合せ投与量による処置。１０日後、45Ｃａ取込みを測定して、骨の鉱物形成を評価し、蛋白質に対して基準化した。組合せオキシステロールのＭ２細胞に対する影響は、骨の鉱物形成の誘導についても同様にその投与量に依存していた。
【００７４】
実施例Ｂ：オキシステロールの影響に対するチトクロームＰ４５０の妨害。Ｍ２細胞は、９０％コンフルエンス状態で、ビヒクル（Ｃ）、あるいは、オキシステロール２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールまたは２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール（５μＭまたは１μＭ）により、チトクロームＰ４５０阻害剤（ＳＫＦ５２５Ａ １０μＭ（＋））の欠如あるいは存在下で、処置した。ＭＳＣ培養物も、９０％コンフルエンス状態で、ビヒクル（Ｃ）、あるいは、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール（２μＭ）により、チトクロームＰ４５０活性化剤（ベンジルイミダゾール５０μＭ）またはＳＫＦ５２５Ａ（１０μＭ）の欠如あるいは存在下で、処置した。４日後、全細胞抽出液内でアルカリ性ホスファターゼの活性度を測定し、蛋白質に対して基準化した。
【００７５】
実施例Ｂの結果：図５Ａは、オキシステロールおよびチトクロームＰ４５０阻害剤ＳＫＦ５２５Ａの骨髄ストローマ細胞に対する影響を表わす棒グラフである。４日後、全細胞抽出液内でアルカリ性ホスファターゼの活性度を測定し、蛋白質に対して基準化した。チトクロームＰ４５０阻害剤の使用は、オキシステロールの造骨性影響を増強し、オキシステロールが、チトクロームＰ４５０酵素によって代謝され、妨害されることを示唆した。
【００７６】
図５Ｂは、オキシステロールおよびチトクロームＰ４５０活性化剤ベンジルイミダゾールおよび阻害剤ＳＫＦ５２５ＡのＭ２細胞に対する影響を表わす棒グラフである。チトクロームＰ４５０酵素、ベンジルイミダゾールによる処置では、恐らくオキシステロールの分解が増進されて、オキシステロールの影響が妨害された。
【００７７】
例Ｄ：オキシステロールによるＭＳＣ内における脂肪生成の妨害。ＭＳＣを含む脂肪細胞祖先の脂肪生成は、配位子結合による活性化の際、脂肪細胞の特異的な遺伝子の転写を制御する、転写因子ペルオキシソーム繁殖体で活性化された受容体γ（ＰＰＡＲγ）により制御される。
【００７８】
試験１：９０％コンフルエンス状態でのＭ２細胞を、ビヒクル（Ｃ）、ＰＰＡＲγ祖先活性化剤、１０μＭのトログリタゾン（Ｔｒｏ）単独で、あるいは、１０μＭのオキシステロール２０Ｓ、２２Ｒ、または２５Ｓ−ヒドロキシコレステロールと組み合わせて処置した。８日後、脂肪細胞を、オイルレッドＯ染色により同定し、位相差顕微鏡下で計数し数量化した。図６Ａは、ＭＳＣの脂肪生成の低減に対するオキシステロールの影響を表わす棒グラフである。造骨性オキシステロールは、ＭＳＣ培養物における脂肪生成を妨害した。
【００７９】
試験２：（Ａ）コンフルエンス状態でのＭ２細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で、コントロールビヒクルまたは１０μＭのトログリタゾン（Ｔｒｏ）により、１０μＭの２０Ｓまたは２２Ｓオキシステロールの不在あるいは存在下で、処置した。１０日後、脂肪細胞をオイルレッドＯ染色により描出し、光顕微鏡により、数量化した（（Ｂ）参照）。４回の実験の代表例から得られた結果を、４重測定の平均値ＳＤとして報告して示す（Ｔｒｏ対Ｔｒｏ＋２０ＳおよびＴｒｏ＋２２Ｓではｐ＜０．００１）。（Ｃ）Ｍ２細胞を、コンフルエンス状態で、１０μＭのＴｒｏにより、単独で、あるいは、１０μＭの２０Ｓオキシステロールと組み合わせて処置した。１０日後、全ＲＮＡを単離し、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、脂肪細胞のＰ２遺伝子（ａＰ２）または１８Ｓ ｒＲＮＡの発現について、ノーザンブロッティングにより、上記のように（参考）分析した。ノーザンブロットの濃度測定分析からのデータを、重複サンプルの平均値として、１８Ｓ ｒＲＮＡに対して基準化して（Ｄ）に示す。
【００８０】
図７：Ａ）脂肪細胞をオイルレッドＯ染色により描出したＭ２細胞培養物の写真であり；Ｂ）は、各処置グループ内のフィールド当りの脂肪細胞数を表わす棒グラフであり；Ｃ）は、コントロール試料または処置試料に曝露したＭ２細胞内のリポタンパク質リパーゼ、脂肪細胞のＰ２遺伝子または１８Ｓ ｒＲＮＡについてのノーザンブロッティングのラジオグラムであり；Ｄ）は、コントロール試料または処置試料に曝露したＭ２細胞内のリポタンパク質リパーゼ、脂肪細胞Ｐ２遺伝子ｍＲＮＡの相対デンソメトリック単位を表わす棒グラフである。
【００８１】
脂肪生成を誘導させるため、Ｔｒｏ（ＰＰＡＲγ活性化剤、トログリタゾン（Ｔｒｏ））により処置したＭ２細胞内では、２０Ｓ、２２Ｓ、および２２Ｒが、単独であるいは組合せによって、脂肪生成を妨害した。これらオキシステロールの相対的な抗脂肪生成性作用強度は、Ｍ２細胞内で、アルカリ性ホスファターゼの活性を刺激する際の、２０Ｓ＞２２Ｓ＞２２Ｒによる、それらの相対的な作用強度と同様であった。７Ｋは、その造骨性の影響の欠如と同様、Ｍ２細胞内で、脂肪生成を妨害することもできなかった（データ示さず）。脂肪生成の妨害は、２０Ｓによる脂肪生成性遺伝子リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）および脂肪細胞Ｐ２遺伝子（ａＰ２）の発現の妨害によっても評価された（図７ＣおよびＤ）。これらオキシステロールの脂肪生成に対する妨害効果も、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１/２および初生マウスのＭＳＣを用いて実証され、これらにおいては、Ｔｒｏあるいはデキサメタゾンおよびイソブチルメチルキサンチンからなる反応混液のいずれかによって、脂肪生成が誘導された。
【００８２】
実施例Ｅ：オキシステロール効果の機序。肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）は、ある種の細胞応答を部分的にオキシステロールに仲介する核ホルモン受容体である。ＬＸＲαは、組織特異的な方法で発現するが、ＬＸＲβは、偏在的に発現する。ノーザンブロット分析により、我々は、Ｍ２細胞のコンフルエントな培養中で、ＬＸＲβの発現を実証したが、ＬＸＲαのそれは実証しなかった（データ示さず）。造骨性オキシステロールの効果を仲介する上でＬＸＲが果たし得る役割を評価するために、我々は、薬理学的なＬＸＲ配位子ＴＯ−９０１３１７（ＴＯ）によるＬＸＲβの活性化が、Ｍ２細胞内で２２Ｒおよび２０Ｓによって発揮されたのと同じ効果を有していたかどうかを検査した。
【００８３】
試験１：１〜１０μＭのＴＯにより、Ｍ２細胞内でアルカリ性ホスファターゼの活性の投与量に依存する阻害が生じた（Ｃ：１８±２；１０μＭで使用された配位子：２２Ｒ＝４５±５；２０Ｓ＝１４０±１２；およびＴＯ＝３±０．５活性度単位/ｍｇ蛋白質±ＳＤ；Ｃ対全配位子ではｐ＜０．０１）。さらに、ＴＯ処置では、１０日後に、オステオカルシンの遺伝子発現または石灰化が、誘導されなかった。したがって、Ｍ２細胞に対するオキシステロールの造骨性効果は、これまでは、非ＬＸＲオキシステロール配位子２２Ｓの強力な造骨性活性およびＬＸＲ配位子ＴＯに応答する造骨性効果の欠如によって示唆されるように、ＬＸＲベータ受容体から独立しているように見られる。
【００８４】
試験２：９０％コンフルエンス状態でのＭＳＣ細胞を、ビヒクル（Ｃ）または２つの無関係なＬＸＲ配位子（１〜４μＭのＴＯおよびＧＬ）、または２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール（１０μＭ）により処置した。４日後、アルカリ性ホスファターゼの活性度を全細胞溶菌液内で測定し、蛋白質に対して基準化した。図８は、ＭＳＣの造骨細胞分化の妨害に対するＬＸＲ活性化剤の影響を示す棒グラフである。ＬＸＲベータは、ＭＳＣ内に存在するが、上記のオキシステロールの造骨性効果は、ＬＸＲの特異的な活性化剤による処置により、これら細胞の造骨細胞分化および石灰化が妨害された以上、ＬＸＲベータによるものとは見られない。
【００８５】
実施例Ｆ：ＭＳＣにおけるオキシステロールの造骨性活性の機序。間葉細胞の造骨細胞への分化が、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）の活性によって制御される。ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２は、共に、造骨性細胞に存在し、それぞれ、骨の恒常性および修復に主要に関与するように見られる。ＣＯＸによる、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を含む、アラキドン酸のプロスタグランジンへの代謝は、これら酵素の造骨性効果を仲介する。ＣＯＸ生成物およびＢＭＰ２は、相補的かつ相加的な造骨性効果を有する。
【００８６】
（Ａ）コンフルエンス状態でのＭ２細胞を、上述のように造骨性培地中で、コントロールビヒクル（Ｃ）または１０μＭのＣＯＸ−１阻害剤ＳＣ−５６０（ＳＣ）により４時間前処置した。次いで、２２Ｒおよび２０Ｓオキシステロール（各ＲＳ、２．５μＭ）の組合せを、ＳＣの存在または欠如下で、指示通りに添加した。３日後、上述のようにＡＬＰ活性度を測定した。３回の実験の代表例からのデータを、４重測定の平均値±ＳＤとして報告し、蛋白質濃度に対して基準化して示す（ＲＳ対ＲＳ＋ＳＣではｐ＜０．００１）。（Ｂ）Ｍ２細胞を、（Ａ）で述べたように処置し、１０日後、培養物内の基質の石灰化を、上述のように45Ｃａ取込み検定により数量化した。３回の実験の代表例からの結果を、４重測定の平均値±ＳＤとして報告し、蛋白質濃度に対して基準化して示す。（Ｃ）Ｍ２細胞を、上述のように２０μＭのＳＣにより４時間前処置し、その後にＳＣの存在または欠如下でＲＳを添加した。８日後、全ＲＮＡを単離し、前述のようにノーザンブロッティングによりオステオカルシン（Ｏｓｃ）および１８Ｓ ｒＲＮＡの発現について分析した。ノーザンブロットの濃度測定分析からのデータを、重複サンプルの平均値として、１８Ｓ ｒＲＮＡに対して基準化して（Ｄ）に示す。（Ｅ）コンフルエンス状態でのＭ２細胞を、造骨性培地中で、コントロールビヒクル（Ｃ）、またはＰＬＡ2妨害ＡＣＡ（２５μＭ）およびＡＡＣＯＣＦ３（ＡＡＣ、２０μＭ）により２時間前処置した。次いで、２２Ｒおよび２０Ｓオキシステロール（ＲＳ、２．５μＭ）の組合せを、阻害剤の存在または欠如下で指示通りに添加した。３日後、上述のようにＡＬＰ活性度を測定した。３回の実験の代表例からのデータを、４重測定の平均値±ＳＤとして報告し、蛋白質濃度に対して基準化して示す（ＲＳ対ＲＳ＋ＡＣＡおよびＲＳ＋ＡＡＣではｐ＜０．０１）。（Ｆ）Ｍ２細胞を、（Ｅ）で述べたように処置した。１０日後、培養物内の基質の石灰化を、前述のように、45Ｃａ取込み検定により数量化した。３回の実験の代表例からの結果を、４重測定の平均値±ＳＤとして報告し、蛋白質濃度に対して基準化して示す（ＲＳ対ＲＳ＋ＡＣＡおよびＲＳ＋ＡＡＣではｐ＜０．０１）。
【００８７】
図９：Ａ）は、ＣＯＸ−１阻害剤またはオキシステロール処置の、Ｍ２細胞内のアルカリ性ホスファターゼの活性度に対する影響を表わす棒グラフであり；Ｂ）は、ＣＯＸ−１阻害剤またはオキシステロール処置の、Ｍ２細胞内のカルシウム取込みに対する影響を表わす棒グラフであり；Ｃ）は、ＣＯＸ−１阻害剤またはオキシステロール処置に曝露されたＭ２細胞内のオステオクラスチンまたは１８Ｓ ｒＲＮＡについてのノーザンブロッティングのラジオグラムであり；Ｄ）は、ＣＯＸ−１阻害剤またはオキシステロール処置に曝露されたＭ２細胞内のオステオクラスチンｍＲＮＡの相対デンソメトリック単位を表わす棒グラフであり；Ｅ）は、Ｍ２細胞内のアルカリ性ホスファターゼの活性度に対するＰＬＡ2阻害剤またはオキシステロール処置の影響を表わす棒グラフであり；また、Ｆ）は、Ｍ２細胞内のカルシウム取込みに対するＰＬＡ2阻害剤またはオキシステロール処置の影響を表わす棒グラフである。
【００８８】
牛の胎児の血清（これは我々の実験条件に一致する）の存在下、培養物内のＭ２細胞は、造骨性分化の全ての段階で、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２両方のｍＲＮＡを発現する。骨形成におけるＣＯＸの役割と一致する我々の研究は、１〜２０μＭのＣＯＸ−１選択的阻害剤ＳＣ−５６０が、２０Ｒ＋２０Ｓおよび２２Ｓ＋２０Ｓオキシステロール組合せの造骨性効果を相当に阻害することを示した。ＳＣ−５６０は、オキシステロール誘導のアルカリ性ホスファターゼ活性（図９Ａ）、石灰化（図９Ｂ）、およびオステオカルシンの遺伝子発現（図９Ｃおよび図９Ｄ）を阻害した。ＳＣ−５６０ほど有効ではないが、１〜１０μＭの無毒性の投与量での、非選択的ＣＯＸ阻害剤、ＩｂｕｐｒｏｆｅｎおよびＦｌｕｒｉｐｒｏｆｉｎも、２０Ｒ＋２０Ｓのオキシステロールの組合せの造骨性効果を相当に、２５〜３０％阻害した。対照的に、選択的ＣＯＸ−２阻害剤、ＮＳ−３９８は、２０μＭの最高の無毒性の投与量で、無視できる阻害効果しか有さなかった。さらに、オキシステロールの組合せの、アルカリ性ホスファターゼの活性（図９Ｅ）および石灰化（図９Ｆ）に対する造骨性効果も、一般のホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）阻害剤ＡＣＡによって、また、選択的サイトゾルＰＬＡ２阻害剤、ＡＡＣＯＣＦ３によって阻害された。ＰＬＡ２の活性化は、細胞性リン脂質からアラキドン酸を遊離させ、ＣＯＸ酵素によるプロスタグランジンへの、別の代謝に利用できるようにする。さらに、レスキュー実験では、ＣＯＸ−１およびＰＬＡ２阻害剤の、オキシステロール誘導のアルカリ性ホスファターゼ活性に対する影響は、されぞれ１μＭのＰＧＥ２および２５μＭのアラキドン酸の添加により逆転することが示された（データ示さず）。アラキドン酸のオキシステロール刺激代謝の以前の報告と一致して、本結果は、ＭＳＣにおけるオキシステロールの造骨性活性は、ＰＬＡ２誘導のアラキドン酸遊離の活性化、およびＣＯＸ経路による造骨性プロスタノイドへのその代謝によって、部分的に仲介されることを示唆している。
【００８９】
実施例Ｇ：ＭＳＣの応答をオキシステロールに仲介する際のＥＲＫの役割。細胞外信号制御キナーゼ（ＥＲＫ）の経路は、骨前駆体細胞の造骨細胞分化と以前に関連した別の主要な信号伝達経路である。ＥＲＫの維持された活性化は、ヒトのＭＳＣ５２の造骨性分化を仲介し、ヒトの造骨細胞におけるＥＲＫの活性化は、結果として、造骨性分化のマスターレギュレータであるＣｂｆａ１の発現およびＤＮＡ結合活性のアップレギュレーションを生じる。さらに、ＥＲＫの活性化は、ヒトの成長、分化、および造骨細胞の適切な働きにとって重要であるように思える。
【００９０】
（Ａ）コンフルエンス状態でのＭ２細胞を、１％のＦＢＳを含むＲＰＭＩにより、４時間前処置した後、コントロールビヒクルまたは５μＭの２０Ｓオキシステロールにより、１、４、または８時間処置した。次に、全細胞抽出液を調製し、前述のように、特異的な抗体を用いて、未変性またはリン酸エステル化したＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のレベルについて分析した。４回の実験の代表例からのデータを示し、各処置を重複サンプルで示す。（Ｂ）コンフルエンス状態でのＭ２細胞を、上記のように、造骨性培地中で、コントロールビヒクル（Ｃ）または２０μＭのＰＤ９８０５９（ＰＤ）により２時間前処置した。次いで、２２Ｒおよび２０Ｓオキシステロール（各ＲＳ、５μＭ）の組合せを、適切なウェルに指示通りに添加した。インキュベーションの１０日後、基質の石灰化を、前述のように45Ｃａ取込み検定により数量化した。３回の実験の代表例からのデータを、４重測定の平均値±ＳＤとして報告し、蛋白質濃度に対して基準化して示す（ＲＳ対ＲＳ＋ＰＤではｐ＜０．０１）。（Ｃ）コンフルエンス状態でのＭ２細胞を、５％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で、２０μＭのＰＤ９８０５９（ＰＤ）により２時間前処置した。次いで該細胞をコントロールビヒクル（Ｃ）、１０μＭのトログリタゾン（Ｔｒｏ）、または１０μＭの２０Ｓまたは２２Ｓオキシステロールにより、単独であるいは組合せて、指示通りに処置した。１０日後、脂肪細胞をオイルレッドＯ染色により描出し、光顕微鏡により前述のように数量化した。３回の実験の代表例からのデータを、４重測定の平均値±ＳＤとして報告する。
【００９１】
図１０：Ａ）は、コントロールまたはオキシステロール処置に曝露したＭ２細胞内に発現したｐＥＲＫまたはＥＲＫに対するウェスタンブロットであり；Ｂ）は、Ｍ２細胞内のカルシウム取込みに対するＰＤ９８０５９またはオキシステロール処置の影響を表わす棒グラフであり；Ｃ）は、各処置グループにおけるフィールド当りの脂肪細胞数を表わす棒グラフである。
【００９２】
興味深いことに、単独であるいは２２Ｒオキシステロールと組み合わせて使用した２０Ｓオキシステロールは、Ｍ２細胞内で、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２の維持された活性化を生じた（図１０Ａ）。阻害剤ＰＤ９８０５９によるＥＲＫ経路の阻害は、オキシステロール誘導の石灰化を阻害した（図１０Ｂ）が、Ｍ２細胞培養物内で、アルカリ性ホスファターゼの活性あるいはオステオカルシンのｍＲＮＡ発現を阻害しなかった（データ示さず）。これらの結果は、維持されたＥＲＫ活性化が、オキシステロールのある特異的な、しかし全てではない、造骨性効果を制御する上で重要であることを示唆している。
【００９３】
実施例Ｈ：２０Ｓと２２Ｒまたは２２Ｓのいずれかとの組合せも、マウス多能性胎仔線維芽Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２細胞内で、マウスの頭蓋冠の前造骨ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞内で、また、初生マウスのＭＳＣ内で、アルカリ性ホスファターゼの活性および石灰化の刺激により評価された造骨性効果を生じた。
【００９４】
骨髄ストローマ細胞の造骨性活性度に対する刺激性効果を有したオキシステロールの他の組合せは、２２Ｒ＋プレグネノロン、２０Ｓ＋プレグネノロン、（共に５μＭ）、であった。プレグネノロンは、ＰＸＲと呼ばれる別の核ホルモン受容体の活性化剤である。しかしながら、アルカリ性ホスファターゼの活性および鉱物形成の両方を含む骨髄ストローマ細胞の健全な造骨性活性度を一貫して誘導した最も効果的な組合せのオキシステロールは、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールと組み合わせた２２Ｒまたは２２Ｓであった。
【００９５】
実施例１：７日齢のＣＤ１の仔からの頭蓋冠を外科的に抽出し（処置当り６個）、２２Ｒ＋２０Ｓ（各５μＭ）の存在または欠如下で、２％の牛の胎児の血清を含むＢＧＪ培地中で培養した。次いで、該頭蓋冠を調製し、薄片化した。骨領域（ＢＡｒ）と組織領域（ＴＡｒ）を、頭蓋冠切片のＨ＆Ｅ染色頭頂骨のディジタル画像により判定した。頭蓋冠当り、８〜１０画像を捕獲し、各画像を、切片全体が映像されるまで、頭蓋冠の長さに沿って一視野進めた。分析の領域は、側筋付着部から伸びて、矢状縫合領域（除外した）以外の頭蓋冠切片全体を含んだ。頭頂骨の横断面を冠状および人字縫合から略等距離で、また、各個体ごとに同じ一般的領域で撮影した。この領域の切片を分析したが、その理由は、それらが冠状および人字領域からの縫合組織をほとんどあるいは全く含んでいなかったからである。ＢＡｒは、細胞過形成ではなく、基本的な層状のコラーゲンパターンを示す桃色染色組織と定義された。ＴＡｒは、背側ライニング細胞層と腹側ライニング細胞層との間の組織の領域と定義され、ＢＡｒ並びに未分化の細胞組織および基質を含んでいた。空隙領域については、別個の判定を行ったが、この領域は、ＢＡｒ内の骨髄腔と定義され、ＢＡｒ測定値から引いてから、ＢＡｒ％ＴＡｒの計算を行った。個体間のＴＡｒの差を考慮して、ＢＡｒは、測定した全ＴＡｒのパーセントとして報告する。組織形態計測的なデータ（連続量）を、一方向ＡＮＯＶＡを用い、次いで、コントロール対ＳｔｕｄｅｎｔのｔテストおよびＤｕｎｎｅｔｔテストを行って評価した。０．０５のｐ値を用いてグループ間の有意差を表現した。結果は平均値±ＳＤで表される。
【００９６】
結果。図１１は、２２Ｒ＋２０Ｓオキシステロール組合せの、マウス頭蓋冠骨形成に対する影響を表わす表である。組合せオキシステロールで処置した頭蓋冠内の骨形成では、コントロールビヒクルで処置したものと比べて、２０％の増進が観察され、組合せオキシステロールの造骨性活性をさらにex vivoで支持した。図１２は、ビヒクル（Ａ）または２２Ｒ＋２０Ｓオキシステロールで処置した頭蓋冠の代表的な切片である。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】本発明による一方法のフローチャートを表わす。
【図２】本発明の二つの実施形態を表わす。
【図３Ａ】Ｍ２細胞内アルカリ性ホスファターゼの活性度に対する各種のオキシステロールの影響を表わす棒グラフである。
【図３Ｂ】Ｍ２細胞内アルカリ性ホスファターゼの活性度に対する各種の投与量におけるオキシステロールの組合せの影響を表わす棒グラフである。
【図３Ｃ】各種の条件に曝露されたＭ２細胞のvon Kossa 染色状況を表わしたものである。
【図３Ｄ】Ｍ２細胞内のカルシウムの取込みに対する各種の投与量におけるオキシステロールの組合せの影響を表わす棒グラフである。
【図３Ｅ】４日または８日間、コントロールまたはオキシステロールの組合せに曝露したＭ２細胞内のオステオカルシンｍＲＮＡについてのノーザンブロッティングのラジオグラムである。
【図３Ｆ】４日または８日間、コントロールまたはオキシステロールの組合せに曝露したＭ２細胞内のオステオカルシンｍＲＮＡの相対デンソメトリック単位を表わす棒グラフである。
【図４Ａ】Ｍ２細胞に対する各種のオキシステロールの、各種の投与量における影響を表わす棒グラフである。
【図４Ｂ】Ｍ２細胞に対する各種のオキシステロールの、各種の投与量における影響を表わす棒グラフである。
【図４Ｃ】オキシステロールによる処置の持続時間のＭ２細胞に対する影響を表わす棒グラフである。
【図４Ｄ】各種の投与量のオキシステロールの組合せのＭ２細胞に対する影響を表わす棒グラフである。
【図４Ｅ】各種の投与量のオキシステロールの組合せのＭ２細胞に対する影響を表わす棒グラフである。
【図５Ａ】オキシステロールおよびチトクロームＰ４５０阻害剤ＳＫＦ５２５ＡのＭ２細胞に対する影響を表わす棒グラフである。
【図５Ｂ】オキシステロールおよびチトクロームＰ４５０活性化剤ベンジルイミダゾールおよび阻害剤ＳＫＦ５２５ＡのＭ２細胞に対する影響を表わす棒グラフである。
【図６】Ｍ２細胞の脂肪生成の低減に対するオキシステロールの影響を表わす棒グラフである。
【図７Ａ】脂肪細胞をオイルレッドＯ染色により描出したＭ２細胞培養物の写真である。
【図７Ｂ】各処置グループ内のフィールド当りの脂肪細胞数を表わす棒グラフである。
【図７Ｃ】コントロール試料または処置試料に曝露したＭ２細胞内のリポタンパク質リパーゼ、脂肪細胞のＰ２遺伝子または１８Ｓ ｒＲＮＡについてのノーザンブロッティングのラジオグラムである。
【図７Ｄ】コントロール試料または処置試料に曝露したＭ２細胞内のリポタンパク質リパーゼ、脂肪細胞Ｐ２遺伝子ｍＲＮＡの相対デンソメトリック単位を表わす棒グラフである。
【図８】Ｍ２細胞に対する合成ＬＸＲ活性化剤の影響を示す棒グラフである。
【図９Ａ】ＣＯＸ−１阻害剤またはオキシステロール処置の、Ｍ２細胞内のアルカリ性ホスファターゼの活性度に対する影響を表わす棒グラフである。
【図９Ｂ】ＣＯＸ−１阻害剤またはオキシステロール処置の、Ｍ２細胞内のカルシウム取込みに対する影響を表わす棒グラフである。
【図９Ｃ】ＣＯＸ−１阻害剤またはオキシステロール処置に曝露されたＭ２細胞内のオステオクラスチンまたは１８Ｓ ｒＲＮＡについてのノーザンブロッティングのラジオグラムである。
【図９Ｄ】ＣＯＸ−１阻害剤またはオキシステロール処置に曝露されたＭ２細胞内のオステオクラスチンｍＲＮＡの相対デンソメトリック単位を表わす棒グラフである。
【図９Ｅ】Ｍ２細胞内のアルカリ性ホスファターゼの活性度に対するＰＬＡ2阻害剤またはオキシステロール処置の影響を表わす棒グラフである。
【図９Ｆ】Ｍ２細胞内のカルシウム取込みに対するＰＬＡ2阻害剤またはオキシステロール処置の影響を表わす棒グラフである。
【図１０Ａ】コントロールまたはオキシステロール処置に曝露したＭ２細胞内に発現したｐＥＲＫまたはＥＲＫに対するウェスタンブロットである。
【図１０Ｂ】Ｍ２細胞内のカルシウム取込みに対するＰＤ９８０５９またはオキシステロール処置の影響を表わす棒グラフである。
【図１０Ｃ】各処置グループにおけるフィールド当りの脂肪細胞数を表わす棒グラフである。
【図１１】２２Ｒ＋２０Ｓオキシステロール組合せの、マウス頭蓋冠骨形成に対する影響を表わす表である。
【図１２】ビヒクル（Ａ）または２２Ｒ＋２０Ｓオキシステロール（Ｂ）で処置した頭蓋冠の代表的な切片である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨の恒常性を維持し、骨の形成を増進する、及び／又は、骨の修復を増進する作用剤と方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
正常な骨再構築は、骨格の完全性を維持するため成人の生涯を通して起こるものであり、破骨細胞による骨の再吸収および造骨細胞による骨の形成を含んでいる。したがって、骨の形成と骨の再吸収との間のバランスに対するいかなる干渉も、骨の恒常性、骨の形成および修復に影響し得る。
【０００３】
造骨細胞は、骨髄ストローマ細胞（骨髄幹細胞；ＭＳＣ）のプールから生じる。これら細胞は、各種の組織内に存在し、骨の骨髄ストローマ内で支配的である。ＭＳＣは、多能的であり、造骨細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、および脂肪細胞に分化し得る。
【０００４】
骨粗鬆症は、初老者における羅病率および死亡率の主要な要因であり、米国健康ケアシステムの年間コストは、少なくとも１００億ドルである。男性も女性も、加齢に伴う骨粗鬆症による骨の減損に苦しんでいる。これら有害な変化は性ホルモンの減少により引き起こされると考えられている。例えば、骨粗鬆症は、閉経後の女性で増加する。
【０００５】
蓄積されている証拠によれば、造骨細胞の数および活性度は、加齢につれて減少するが、この変化の理由は明らかではない。加えて、骨粗鬆症の骨の骨髄では、造骨細胞の形成を犠牲にすると思われる脂肪細胞の形成が増大する。さらに、骨内の脂肪性組織の体積は、普通の被検者では年齢と共に増大し、これは実質的に加齢に伴う骨粗鬆症であって、これは柵状織の骨の減損の程度に平行する、骨の柵状織に隣接した脂肪細胞の数と共に増大する。この観察、そして、同様の観察に基づいて、加齢に伴う骨粗鬆症における骨の減損の原因は、少なくとも部分的には、造骨細胞分化が脂肪細胞経路へ変移するためであることが示唆された。
【０００６】
老人においては骨折の治癒は阻害されており、ＭＳＣ（一般に骨折部位に遊走して新しい骨の形成が生じることを可能にすると考えられる）の数および活性度の減少が実証されている。
【０００７】
現在のところ、骨粗鬆症に対する唯一の処置は、造骨細胞による骨の再吸収を目的にした処置である。このＦＤＡ（食品医薬品庁）認可の治療法には、ビスホスホン酸塩、選択的エストロゲン受容体モジュレータなどのホルモン置換療法、カルシトニン、およびビタミンＤ／カルシウムの補充が含まれる。しかしながら、これらの処置は、骨の質量のごく小さな増加をもたらすだけであり、骨粗鬆症の総合的な防止または治療には十分ではない。
【０００８】
現在、骨粗鬆症の治療に対するＦＤＡ認可の唯一のタンパク質同化作用剤は、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）である。ＰＴＨは現在、造骨細胞のアポトーシスを阻害することによって骨の形成を増大すると考えられている。ＰＴＨは、断続的な注入で骨の質量を増大させ、骨粗鬆症患者の骨折発生率を低減することが判明している。しかしながら、ＰＴＨによる連続的な治療及び／又はその蓄積は、患者に対して全身的な悪影響を及ぼす場合があるため、投与量を厳密に制御しなければならない。加えて、ＰＴＨ治療は、極めて費用が嵩む。したがって、ＰＴＨ治療は、最も重篤な骨粗鬆症患者のためのみに用意されている。
【０００９】
造骨細胞による骨の形成を増進するための他の有力な治療法としては、弗化ナトリウム、および骨にプラスの影響を及ぼす成長因子（例えば、インスリン様成長因子IおよびIIおよびトランスフォーミング成長因子ベータ）が挙げられる。しかしながら、これら因子は、これまでは、望ましくない副作用を有していた。
【００１０】
ヒトの骨関連の障害の治療に幹細胞を使用することも検討されてきた。例えば、骨形成不全は、患者の造骨細胞が、コラーゲンIを適切な形で作らず、結果として、骨の脆化を招く骨格病である。健康な個体からの造骨前駆体幹細胞を罹病した個体に注入することによって、これら患者の骨密度が向上することが示されている。さらに、幹細胞は、個体から単離して、インビトロで膨張させ、刺激して軟骨を形成する軟骨細胞にし、関節炎の関節に再注入して軟骨を再生させることができる。
【００１１】
したがって、骨の恒常性、骨の形成および骨の修復を制御するための作用剤および方法が所望される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、骨の恒常性を維持する、骨の形成を増進する、及び／又は骨の修復を増進するための作用剤と方法に関する。
【００１３】
より詳細には、本発明は、骨の恒常性を維持する、骨の形成を増進する、及び／又は骨の修復を増進する、全身的、及び／又は局所的アプリケーション作用剤を含んでよい。
【００１４】
より詳細には、本発明は、造骨細胞の骨形成を刺激する作用剤の使用を含みうる。本発明は、ＭＳＣの造骨細胞への分化に影響する作用剤の使用を含みうる。本発明で造骨細胞への分化をもたらすのに有効でありうる作用剤としては、２２（Ｒ）−、２２（Ｓ）−、２０（Ｓ）−、および２５−ヒドロキシコレステロールなどの個々のオキシステロール、プレグネノロンのうちの単独またはこれらの組合せが挙げられるが、ただしそれらに限定されない。本発明において有用であり得るオキシステロールの組合せの具体的な例としては、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールと２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールの組合せ、並びに２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールの組合せが挙げられる。本発明は、さらに、造骨細胞分化または骨形成に影響する点で活性を有することが分かっているオキシステロール分子のいかなる部分も含んでよい。本発明は、さらに、造骨細胞分化または骨形成に影響する点で、オキシステロールが、それにおいて活性を有する分子の活性化を含んでよい。本発明はまた、同様の動作機序を介して、親分子と同様に作用するであろう上記のオキシステロールの活性部分、および骨の恒常性にプラスの影響を及ぼすであろう同様の受容体を模倣するよう設計されている他の脂質分子または類縁体（アナログ）を含んでよい。
【００１５】
本発明は、破骨細胞の骨の再吸収を阻害する作用剤の使用を含んでよい。本発明において、破骨細胞の骨の再吸収に影響を与えるのに有用と思われる作用剤としては、ビスホスホン酸塩、選択的エストロゲン受容体モジュレータ、カルシトニン、およびビタミンＤ／カルシウムのサプリメンテーションが挙げられるが、これらに限定されない。本発明はまた、造骨細胞の骨形成を誘導する作用剤の使用を含んでよい。本発明において、有用と思われる作用剤としては、ＰＴＨ、弗化ナトリウム、およびインスリン様成長因子IおよびIIおよびトランスフォーミング成長因子ベータなどの成長因子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
本発明は、骨の恒常性を維持する、骨の形成を増進する、及び／又は骨の修復を増進するための作用剤を全身的に送達する方法または該作用剤による局所的な処置の方法を含んでよい。本発明は、骨骨の恒常性を維持する、骨の形成を増進する、及び／又は骨の修復を増進するための、分化した造骨細胞を全身的に運搬する方法または該造骨細胞による局所的な処置の方法を含んでよい。
【００１７】
本発明の一実施態様では、該方法は、歯根膜炎、歯周再生、歯のインプラント再構築のための歯槽隆線の増大、非癒着骨折の治療においてなど、骨の局所的修復を誘導するのに適用されてよい。本発明の一実施態様では、該方法は、骨粗鬆症などの骨関連の障害を治療するのに応用されてよい。
【００１８】
本発明はまた、骨の形成を誘導しあるいは骨の修復を増進するための物質のコーティングを有する、あるいは該目的のための分化した細胞を播種されている、インプラントを含んでもよい。本発明はまた、骨の形成または骨の修復が所望される部位における該物質または分化した細胞の適用を含んでもよい。例えば、インプラントとしては、骨の形成または骨の修復を刺激することによって、骨折を不動化し、骨の形成を増進し、あるいは、補綴インプラントを安定化するのに使用されるピン、ネジ、および板が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
政府後援
この研究は、米国立衛生研究所／米国立衛生研究所により後援されており、米国立衛生研究所／米国立衛生研究所により グラント番号P60 AG 10415-11 が授与されている。アメリカ合衆国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、骨の恒常性を維持し、骨の形成を増進し、かつ（または）、骨の修復を増進するための作用剤および方法に関する。
【００２１】
より詳細には、本発明は、骨の恒常性を維持し、骨の形成を増進し、かつ（または）、骨の修復を増進するための作用剤の全身的な、かつ（または）、局所的な適用を含んでよい。方法または化合物の、骨の恒常性を維持する能力の、臨床的インデクスは、ＤＥＸＡスキャニングによって評価される身体全体の異なる部位における骨の密度の改善によって立証される。治癒破折における増強された骨の形成は、選択された時間間隔における骨折部位の通常のＸ線検査によってルーティンで評価される。定量的なＣＴスキャニングなどの、上記インデクスを判定するためのより進歩した方法が用いられてよい。
【００２２】
より詳細には、本発明は、造骨細胞の骨形成を刺激する作用剤の使用を含んでよい。本発明は、ＭＳＣの造骨細胞への分化に影響する作用剤の使用を含んでよい。
【００２３】
本発明において有用であると思われる造骨細胞分化に影響する作用剤としては、個々のオキシステロールまたはそれらの組合せが挙げられるが、しかしそれらに限定されない。
【００２４】
オキシステロール。オキシステロールの、造骨性分化および石灰化を誘導し、かつ、脂肪生成性分化を阻害する能力は、骨の恒常性を維持し、骨の形成を誘導し、または骨の修復を誘導する利益をもたらし得る。
【００２５】
オキシステロールは、循環血液内および組織内に存在するコレステロールの酸化誘導体の大きなファミリーを形成する。オキシステロールは、内因性のコレステロール酸化誘導体であり、コレステロールの生合成を制御する点で重要である。オキシステロールは、自動酸化によって脂質の過酸化の二次副産物として、あるいは、その大部分がチトクロ−ムＰ４５０酵素ファミリーのメンバーである特異的なモノオキシゲナーゼの作用によって形成される。オキシステロールは、食事での摂取物から誘導され得る。オキシステロールは、コレステロールの新陳代謝、ステロイドの産生、アポトーシス、アテローム硬化、ネクローシス、炎症、および免疫抑制を含む他の生理学的、及び／又は、病理学的プロセスの制御に関与してきた。
【００２６】
コレステロールの生合成は、最近、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の阻害性効果（これはメバロン酸塩によって逆転可能であるが）によって示されたように、骨髄幹細胞（ＭＳＣ）の分化に関与していることが示された。さらに、オキシステロールは、それらの造骨細胞分化を誘導する能力、および、追加的には、ＭＳＣのインビトロでの石灰化によって立証されたように、造骨性のポテンシャルを有していることが実証された。最後に、オキシステロールは、抗脂肪生成性効果を有し、ＭＳＣの脂肪細胞分化を阻害することが実証された。
【００２７】
オキシステロールの造骨性および抗脂肪生成性効果を示すのに用いられるインビトロモデルは、有効であり、骨形態発生蛋白質（ＢＭＰ）を含む他の化合物の同様の挙動を実証するのに従来用いられてきた。このレポートで使用される骨髄幹細胞（Ｍ２細胞）を含む骨前駆体細胞は、動物およびヒトにインビボで存在するそれらと同様に作用することが示されてきた。これらのインビトロモデルはまた、今まで、ＢＭＰおよびインシュリン様成長因子（ＩＧＦ）などの化合物のインビボ造骨性効果を成功裡に予測することもできた。また、骨器官培養モデルにおけるオキシステロールの造骨性効果が、マウスの新生仔の頭蓋冠を用いて実証された。この器官培養モデルはまた、今まで、ＢＭＰを含む異なる化合物の造骨性効果をインビボに予測するのに成功裡に用いられてきた。したがって、これらの同様な発見に基づいて、オキシステロールは、動物およびヒトにおいて、インビボで造骨性効果を有するであろうことが予測される。これらのインビトロおよび器官培養モデルにおける化合物の造骨性効果の実証が、動物およびヒトにおけるそれらのインビボにおける効果を実証するであろう治験に先立って必要である。
【００２８】
本発明において造骨細胞分化をもたらすのに有用であると考えられる作用剤としては、２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール、２２（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、２０（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、および２５−ヒドロキシコレステロールなどの個々のオキシステロール、プレグネノロンのそれぞれまたは互いに他との組合せが挙げられるが、しかしそれらに限定されない。本発明において有用であると思われるオキシステロールの組合せの具体的な例としては、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールと２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールの組合せ、並びに２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールの組合せが挙げられる。本発明は、さらに、造骨細胞分化または骨形成に影響する点で活性を有することが判明しているオキシステロール分子のいかなる部分でも含んでよい。本発明は、さらに、前記オキシステロール群の、造骨細胞分化または骨形成に影響する活性を有する分子を活性化することを含んでよい。本発明はまた、親分子と同様の動作機序を介して該親分子と同様に作用するであろう上記のオキシステロールの活性部位、および骨の恒常性にプラスの影響を及ぼすであろう同様の受容体を模倣するよう設計されている他の脂質分子または類縁体（アナログ）を含んでよい。
【００２９】
作用の機序。オキシステロールが生理学的に活性を示すためのメカニズムを調べて、オキシステロールが、各種の細胞内経路によって活性を有しかつ影響を受けることが判明した。先ず、オキシステロールの造骨細胞分化に対する影響は、チトクロームＰ４５０阻害剤によって増強されることが実証された。オキシステロールの造骨細胞分化に対する影響はまた、アラキドン酸代謝経路、すなわち、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）およびホスホリパーゼＡ２、およびＥＲＫにおける酵素によっても仲介される。第二に、例えば、細胞内ホスホリパーゼの活性から解放されたアラキドン酸は、造骨細胞分化に対するオキシステロール効果をポジティブにもたらす。第三に、ＣＯＸ酵素によって代謝される、プロスタグランジンＥ２および造骨性プロスタノイドを含むプロスタグランジンは、造骨細胞分化に対するオキシステロール効果をポジティブにもたらす。第四に、細胞外信号制御キナーゼ（ＥＲＫ）の活性度が、オキシステロールによって、増強され、造骨細胞分化および石灰化に相関付けられる。したがって、これらの作用剤またはオキシステロールの作用の機序を刺激する作用剤も、本発明において有用であろう。
【００３０】
さらに、オキシステロールは、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）と呼ばれる核ホルモン受容体に結合されてそれを活性化し、該核ホルモン受容体は、次いで、ＬＸＲによって制御される遺伝子のプロモータ上のコンセンサス結合部位に結合する。追加のオーファン核ホルモン受容体が、オキシステロールの制御効果のいくつかを仲介することができるであろうオキシステロール結合部位用として役立ち得る。本発明は、破骨細胞の骨の再吸収を阻害する作用剤の使用を含んでよい。
【００３１】
本発明は、骨の恒常性を維持する、骨の形成を増進する、及び／又は骨の修復を増進する作用剤の全身的な運搬、及び、該作用剤による局所化された処置の方法を含み得る。
【００３２】
本発明は、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、またはプレグネノロンを含む群から選択された少なくとも一つのオキシステロール、または２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、またはプレグネノロンのうちのいずれか一つの活性部分の治療的に有効な投与量を含有する、骨の障害の処置に使用するための薬物を含む。
【００３３】
治療的に有効な投与量。本発明において有用な作用剤の治療的に有効な投与量は、上記の骨の恒常性、骨の形成、または骨の修復を改善する作用剤の能力によって測定される、患者にプラスの臨床的効果を及ぼす投与量である。各作用剤の治療的に有効な投与量は、マイナスの副作用を最小限度に抑えつつ、所望の臨床的効果が得られるよう調整されてよい。作用剤の投与量は、特定の患者に適した個々の措置および投与量のレベルを決定する際、投与の経路、疾病の重症度、患者の年齢および体重、患者が摂取している他の投薬、および付添い医師によって普通に考えられる他の要因によって、個々の患者について選択されてよい。
【００３４】
一例を挙げると、本発明は、内因性の循環オキシステロールレベルを患者の基底レベル以上に上げる措置を含んでよい。普通の成人では、該レベルは、質量分析法で測定した場合、年齢およびオキシステロールの種類により、およそ１０〜４００ｎｍ／ｍｌである。薬理学分野において通常の技術を有する者であれば、循環オキシステロールレベルを患者の基底レベル以上に上げるための投与量および経路を決定することができよう。
【００３５】
投与形態。投与形態に含まれる作用剤の治療的に有効な投与量は、選択された作用剤の種類および投与の経路を考えて選択されてよい。投与形態は、薬理学分野において通常の技術を有する者には既知の、患者に対する投与を促進するためのアドジュタントおよび薬学的に受容できるキャリヤを含む他の不活性の成分と組み合わされた作用剤を含んでよい。一実施形態においては、投与形態は、消費された時、人体において作用剤のレベルが上がる結果となる経口的な調合剤（例えば、液体、カプセル、キャプレットなど）であってよい。経口的な調合剤は、希釈剤、結合剤、タイムレリース剤（time release agent）、潤滑剤およびディスイニグラント（disinigrant）を含むキャリヤを含んでよい。
【００３６】
投与形態は、経皮的適用に適した局所的な調合剤（例えば、ローション、クリーム、軟膏剤、経皮パッチなど）で提供されてよい。投与形態はまた、例えば、皮下適用（スローレリースカプセル内など）、静脈内適用、腹腔内適用、筋肉内適用、または呼吸による適用に適した調合剤で提供されてよい。
【００３７】
投与形態には、作用剤の一つまたは組合せのいずれも、含まれてよい。別法として、作用剤の組合せが、別個の投与形態で、患者に投与されてよい。少なくとも二つの処置用作用剤が患者に加えられるよう、作用剤の組合せが同時的に投与されてよい。
【００３８】
追加的作用剤。本発明は、骨の恒常性を維持し、骨の形成を増進し、かつ（または）、骨の修復を増進するため、少なくとも一つの最初の作用剤と独立的にあるいは相乗効果的に作用する追加的作用剤による処置を含んでよい。
【００３９】
追加的作用剤は、オキシステロールが造骨細胞分化を増進する機序経路を刺激する作用剤であってよい。したがって、本発明において、単独で、あるいは、オキシステロールと組み合わせて、有用と思われる類の作用剤としては、ＳＫＦ５２５Ａなど、チトクロームＰ４５０阻害剤が挙げられるが、しかしそれらに限定されない。本発明で有用な他の類の作用剤としては、ホスホリパーゼ活性化剤、あるいはアラキドン酸が挙げられる。本発明で有用な他の類の作用剤としては、ＣＯＸ酵素活性化剤、あるいはプロスタグランジンあるいは造骨性プロスタノイドが挙げられる。本発明で有用な他の類の作用剤としては、ＥＲＫ活性化剤が挙げられる。
【００４０】
本発明は、オキシステロールと骨の形成、修復または恒常性に影響する他の治療法による処置の組合せを含んでよい。例えば、オキシステロールと、ビスホスホン酸塩、エストロゲン受容体モジュレータ、カルシトニン、およびビタミンＤ／カルシウム補充などのホルモン治療処置、ＰＴＨ（Ｆｏｒｔｅｏまたはテリパラチド、Eli Lily、など）、弗化ナトリウム、およびインスリン様成長因子IおよびIIおよびトランスフォーミング成長因子ベータなどの骨にプラスの影響を及ぼす成長因子との組合せが挙げられる。当業者であれば、標準の治療投与パラメータを用いて、治療のそれぞれに対する一般に認められた投与量を決定することは、可能であろう。
【００４１】
本発明は、骨の恒常性を維持する、骨の形成を増進する、及び／又は、骨の修復を増進する分化した造骨細胞の全身的な運搬、または、該造骨細胞による局所化された処置の方法を含んでよい。この処置は、上記のように、患者に対して、単独で、あるいは、他の作用剤（複数も可）の投与と組み合わせて行われてよい。図１は、本発明による一方法のフロー図である。この方法のこの実施形態では、患者、あるいは、細胞ドナーから、哺乳類の間葉幹細胞が収集され得る（１００）。該細胞は、次いで、少なくとも一つの作用剤で処置されて、該細胞の造骨細胞分化を誘導し得る（１０２）。該細胞は、次いで、患者に対して、全身的に、あるいは、骨の恒常性、骨の形成、または、骨の修復が望まれる選択された部位において、投与され得る（１０４）。追加的に、患者は、骨の恒常性、骨の形成、または、骨の修復をもたらす少なくとも一つの第二の作用剤により、局所的に、あるいは全身的に、処置され得る（１０６）。
【００４２】
本発明のこの態様においては、ＭＳＣは、アルカリ性ホスファターゼの活性度、カルシウムの取込み、石灰化またはオステオカルシンのｍＲＮＡ発現、あるいは、造骨細胞分化の他の指標の増大のうちのいずれか一つによって測定される造骨細胞分化を刺激する作用剤（複数も可）により処置されてよい。本発明の一実施形態では、ＭＳＣ細胞が、患者から収集され、少なくとも一つのオキシステロールにより処置され、そして、造骨細胞が患者に投与される。
【００４３】
本発明は、造骨細胞的に分化したＭＳＣを患者に対して全身的に投与する工程を含んでよい。
【００４４】
本発明は、造骨細胞的に分化したＭＳＣを、患者の身体の選択された場所に配置する処置を含んでよい。本発明の一実施形態では、細胞が、骨の恒常性、形成、及び／又は、修復が望まれる場所に注入されてよい。
【００４５】
本発明の一実施態様では、作用剤および方法は、治療に、あるいは、骨粗鬆症などの骨関連の障害の進行を遅らせる処置に応用されてよいが、それらに限定されない。
【００４６】
本発明の一実施態様では、作用剤および方法は、歯根膜炎、歯周再生、歯のインプラント再構築のための歯槽隆線の増大、非癒着骨折の治療、膝／臀部／関節部位の修理または置換外科において、細胞または作用剤の、外科的あるいは骨折部位への適用処置に応用されてよいが、それに限定されない。
【００４７】
図２は、本発明の２つの実施形態を示す。図２Ａでは、本発明は、人体で使用のためのインプラント（２００）であって、表面（２０１）を有する基質を含み、該インプラントの少なくとも該表面は、少なくとも一つのオキシステロール（２０３）を、骨形成を誘導するのに十分な量で含み、あるいは、インプラントは、骨形成または骨修復の増強を誘導するための造骨細胞分化が可能な哺乳類の細胞、または、造骨細胞の哺乳類細胞、または、それらの組合せを含むインプラントを含んでよい。例えば、インプラントとしては、骨の除去、骨折または他の骨の損傷の部位（２０４）の形成または修復を刺激することによって、骨折を不動化し、骨の形成を増進し、あるいは、補綴インプラントを安定化するのに使用される、骨（２０２）の近傍に、あるいはそれと接触して配置され得る、ピン、ネジ、板または補綴関節が挙げられる。
【００４８】
図２Ｂに示すように、本発明は、骨の形成、または、骨の修復が望まれる、骨の除去、骨折または他の骨の損傷の部位（２０４）において、骨（２０２）の近傍に、あるいはそれと接触して、少なくとも一つの作用剤または分化した細胞（２０６）を適用する処置を含んでよい。
【実施例】
【００４９】
材料：Sigma (St. Louis, MO, U.S.A.) から入手したオキシステロール、ベータグリセロ燐酸塩（βＧＰ）、硝酸銀、オイルレッドＯ、Irvine Scientific (Santa Ana, CA, U.S.A.) から入手したＲＰＭＩ １６４０、α改変基本培地（α−ＭＥＭ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、及びHyclone (Logan, UT, U.S.A.) から入手した牛の胎児の血清。BIOMOL Research Labs (Plymouth Meeting, PA, U.S.A.) から購入したＰＤ９８０５９、Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, U.S.A.) から購入したＴＯ−９０１３１７、ＳＣ−５６０、ＮＳ−３９８、Ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ、及びＦｌｕｒｂｉｐｒｏｆｅｎ、Calbiochem (La Jolla, CA, U.S.A.) から購入したＡＣＡ及びＡＡＣＯＣＦ３、R&D Systems (Minneapolis, MN, U.S.A.) から購入したヒトの組換え体ＢＭＰ２。New England Biolabs (Beverly, MA, U.S.A.) から入手したリン酸エステル化され、かつ、未変性のＥＲＫに対する抗体、および、三共（東京、日本）から得たトログリタゾン。
【００５０】
細胞：American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, U.S.A.) から入手したＭ２−１０Ｂ４マウス骨髄ストローマ細胞ラインは、（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ｘＣ３Ｈ／ＨｅＪ）Ｆ１マウスの骨の骨髄ストローマ細胞に由来するものであり、ヒトおよびマウスの骨髄造血を長期培養において支持し（ＡＴＣＣによる）、かつ、造骨細胞および脂肪細胞に分化する能力を有している。これら細胞は、特記なき場合、１０％の加熱不活性化ＦＢＳを含有し、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン（全てIrvine Scientific製）を補充したＲＰＭＩ １６４０中で培養した。
【００５１】
ATCCからＭＣ３Ｔ３−Ｅ１マウス前造骨細胞ラインを購入し、１０％の加熱不活性化ＦＢＳおよび上記のサプリメントを含むα−ＭＥＭ内で培養した。
【００５２】
Kristina Bostrom博士（UCLA）の好意により提供されたＣ３Ｈ−１０Ｔ１／２マウス多能性胎仔線維芽細胞を、１０％の加熱不活性化ＦＢＳおよび上記のサプリメントを含むＤＭＥＭ内で培養した。初生マウスの骨髄ストローマ細胞を、４〜６ヶ月令の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊのマウスから分離し、前に報告したように培養して増殖させた。ここで、Parhami, F. et al., J. Bone Miner. Res. 14, 2067-2078 (1999) の全開示を引用により組み込む。
【００５３】
アルカリ性ホスファターゼ活性度検定：全細胞抽出液に対して、比色定量のアルカリ性ホスファターゼ活性度（ＡＬＰ）検定を上記のように行った。
【００５４】
von KossaおよびオイルレッドＯ染色−細胞単層内の基質石灰化が、上記のように、硝酸銀染色により検出された。脂肪細胞の検出のため、オイルレッドＯ染色を上記のように行った。
【００５５】
45Ｃａ取込み検定−細胞単層内の基質石灰化を、上記のように、45Ｃａ取込み検定を用いて数量化した。
【００５６】
ウェスタンブロット分析−処置の後、溶解緩衝液内で細胞を溶解し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ蛋白質検定 (Hercules, CA, U.S.A.) を用いて、蛋白質の濃度を測定し、上記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。未変性で、かつ、リン酸エステル化されたＥＲＫについて、上記のように調査を行った。
【００５７】
ＲＮＡ単離およびノーザンブロット分析−適切な実験条件下での細胞の処置の後、Stratagene (La Jolla, CA, U.S.A.) 製のＲＮＡ単離キットを用いて、全ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡ（１０ｍｇ）を、１％のアガロース／ホルムアルデヒドゲルに流し、Duralon-UV メンブレン (Stratagene, CA, U.S.A.) に転写し、紫外線で架橋した。メンブレンは、それぞれ、Geneka Biotechnology (Montreal, Quebec, Canada) およびMaxim Biotech (San Francisco, CA, U.S.A.) から入手した32Ｐ標識化マウスのオステオカルシンｃＤＮＡプローブ、マウスリポタンパク質（ＬＰＬ）、マウス脂肪細胞蛋白質２（ａＰ２）ＰＣＲ産生プローブ、ヒトの２８Ｓまたは１８Ｓ ｒＲＮＡプローブにより、６０℃、オーバーナイトでハイブリダイズした。Invitrogen (Carlsbad, CA, U.S.A.) により合成されたプライマーセットを用いて、下記の仕様により、ＰＣＲ生成物を産生した。マウスのａＰ２遺伝子（アクセス番号Ｍ１３２６１）；センス（７５−９５）５’−ＣＣＡＧＧＧＡＧＡＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡ−３’、アンチセンス（３６２−３８３）５’−ＣＡＧＣＡＣＴＣＡＣＣＣＡＣＴＴＣＴＴＴＣ−３’、３０９塩基対のＰＣＲ生成物を産生。マウスのＬＰＬ（アクセス番号ＸＭ １３４１９３）；センス（１０３８−１０５８）５’−ＧＡＡＴＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＣＡＧＣＡ−３’、アンチセンス（１８１６−１８３６）５’−ＴＧＧＧＣＣＡＴＴＡＧＡＴＴＣＣＴＣＡＣ−３’
、７９９塩基対のＰＣＲ生成物を産生。ＰＣＲ生成物は、ゲル精製し、UCLA配列決定コアで配列決定したところ、それらの各ＧｅｎＢａｎｋのエントリーに対する最高の類似度が示された。ハイブリッド形成後、室温で、２Ｘ ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳによりブロットを２度洗浄し、次いで、０．５Ｘ ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳにより６０℃で２度洗浄し、Ｘ線フィルムに曝露した。濃度測定により、遺伝子発現誘導の程度を判定した。
【００５８】
統計解析−ＳｔａｔＶｉｅｗ ４．５プログラムを用いて、コンピュータ補助統計解析を行った。ＡＮＯＶＡおよびフィッシャーの最小有意差法（ＰＬＳＤ）有意性試験によりｐ値を計算した。ｐ＜０．０５の値が有意であると考えられた。
【００５９】
例Ａ：ＭＳＣ（骨髄幹細胞）におけるオキシステロールの造骨効果。
【００６０】
試験１：コンフルエンス状態のＭ２細胞を、１０％の牛の胎児の血清（ＦＢＳ）、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸塩および３ｍＭのベータグリセロ燐酸塩（βＧＰ）を添加したＲＰＭＩ １６４０からなる造骨性培地中でコントロールビヒクル（Ｃ）または１０μＭのオキシステロールで処置した。インキュベーションの３日後、細胞ホモジェネート内のアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性度を、比色定量検定により測定した。５回の実験の代表例からの結果を、４重測定の平均値±ＳＤとして報告し、蛋白質濃度に対して基準化して示す（* Ｃ対オキシステロール処置細胞ではｐ＜０．０１）。図３Ａは、Ｍ２細胞内アルカリ性ホスファターゼの活性度に対する各種のオキシステロールの影響を表わす棒グラフである。
【００６１】
コンフルエンス状態のＭ２細胞を、造骨性培地中で、コントロールビヒクル（Ｃ）または指示された濃度の２２Ｒと２０Ｓのオキシステロールの組合せで処置した。３日後、ＡＬＰの活性度を上記のように測定した。４回の実験の代表例からの結果を４重測定の平均値±ＳＤとして報告し、蛋白質濃度に対して基準化して示す（* Ｃ対オキシステロールではｐ＜０．０１）。図３Ｂは、Ｍ２細胞内アルカリ性ホスファターゼの活性度に対する各種の投与量におけるオキシステロールの組合せの影響を表わす棒グラフである。
【００６２】
コンフルエンス状態のＭ２細胞を、造骨性培地中で、コントロールビヒクル（Ｃ）または単独または組合せの５μＭのオキシステロールで指示通りに処置した。１４日後、von Kossa 染色により、石灰化（黒色に見える）を同定した。図３Ｃは、各種の条件に曝露されたＭ２細胞のvon Kossa 染色状況を表わしたものである。
【００６３】
Ｍ２細胞を、コントロールビヒクル（Ｃ）または増大濃度の２２Ｒと２０Ｓのオキシステロールの組合せで処置した。１４日後、45Ｃａ取込み検定により、培養物における基質石灰化を数量化した。４回の実験の代表例からの結果を、４重測定の平均値±ＳＤとして報告し、蛋白質濃度に対して基準化して示す（* Ｃ対オキシステロール処置培養物ではｐ＜０．０１）。図３Ｄは、Ｍ２細胞内のカルシウムの取込みに対する各種の投与量におけるオキシステロールの組合せの影響を表わす棒グラフである。
【００６４】
コンフルエンス状態のＭ２細胞を、造骨性培地内で、コントロールビヒクル（Ｃ）または２２Ｒと２０Ｓのオキシステロールの組合せ（各５μＭ）で処置した。４日および８日後、重複サンプルからの全ＲＮＡを単離し、ノーザンブロッティングにより、上記のようにオステオカルシン（Ｏｓｃ）および２８ＳのｒＲＮＡ発現について分析した。図３Ｅは、４日または８日間、コントロールまたはオキシステロールの組合せに曝露したＭ２細胞内のオステオカルシンｍＲＮＡについてのノーザンブロッティングのラジオグラムである。図３Ｆは、４日または８日間、コントロールまたはオキシステロールの組合せに曝露したＭ２細胞内のオステオカルシンｍＲＮＡの相対デンソメトリック単位を表わす棒グラフである。ノーザンブロットの濃度測定分析からのデータを、重複サンプルの平均値として、２８Ｓ ｒＲＮＡに対して基準化して（Ｆ）に示す。
【００６５】
試験１の結果：ＭＳＣの培養では、アルカリ性ホスファターゼの活性の刺激、オステオカルシンの遺伝子発現および細胞コロニーの石灰化が、造骨細胞表現型への分化の増大の指標である。特異的なオキシステロール、すなわち、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール（２２Ｒ）、２０（Ｓ）ヒドロキシコレステロール（２０Ｓ）、および２２（Ｓ）ヒドロキシコレステロール（２２Ｓ）が、多能性Ｍ２−１０Ｂ４マウスのＭＳＣ（Ｍ２）において、アルカリ性ホスファターゼの活性、造骨性分化の初期マーカー、を誘導した。７−ケトコレステロール（７Ｋ）は、これらの細胞において、アルカリ性ホスファターゼの活性を誘導しなかった。
【００６６】
アルカリ性ホスファターゼの活性の誘導は、０．５〜１０μＭの濃度では、投与量および時間の両方に依存しており、２０Ｓ＞２２Ｓ＞２２Ｒの作用強度が示された。これらオキシステロールに４時間曝露し、次いで、オキシステロールのない造骨性培地と置換したところ、Ｍ２細胞内に、アルカリ性ホスファターゼの活性が十分誘導された（培養４日後の測定）。
【００６７】
０．５〜１０μＭの濃度における個々のオキシステロール（２２Ｒ、２０Ｓおよび２２Ｓ）では、１４日間の処置後も、石灰化またはオステオカルシンの遺伝子発現を誘導させることができなかった（データ示さず）。しかしながら、アルカリ性ホスファターゼの活性（図３Ｂ）、健全な石灰化（図３ＣおよびＤ）およびオステオカルシンの遺伝子発現（図３ＥおよびＦ）は、２２Ｒ＋２０Ｓまたは２２Ｓ＋２０Ｓオキシステロールの組合せによって、Ｍ２培養中で全て誘導された。
【００６８】
試験２：１０％の牛の胎児の血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ培地中で、Ｍ２細胞を成長させた。該細胞を、コンフルエンス状態で、５％のＦＢＳ＋５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸塩および３ｍＭのベータグリセロ燐酸塩を含むＲＰＭＩ内で処置して、造骨細胞分化を誘導させた。該細胞を、成長培地＋１０〜Ｍのトログリタゾン内で処置することによって、脂肪生成性分化を誘導させた。細胞に、ビヒクル（Ｃ）またはオキシステロール、すなわち、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール；２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール；または７ケトコレステロールを、各種の投与量（μＭ）で加える処理を行った。細胞は常に９０％コンフルエンス状態で処置した。４日後、全細胞溶菌液内で、アルカリ性ホスファターゼの活性度を測定し、蛋白質に対して基準化した。別法として、ＭＳＣ培養物を調製し、上記のようにオキシステロールで処置した。細胞は９０％コンフルエンス状態で、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールと２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールとの組合せ（各５μＭ）により、４〜９６時間処置した。オキシステロールを除去し、オキシステロールを含まない新鮮な培地を合計９６持続時間かけて添加した。全細胞抽出液内でアルカリ性ホスファターゼの活性度を測定し、蛋白質に対して基準化した。
【００６９】
試験２の結果：図４Ａは、４日間曝露後の、Ｍ２細胞に対する各種のオキシステロールの、各種の投与量における影響を表わす棒グラフである。オキシステロールは、アルカリ性ホスファターゼの活性、造骨細胞分化の初期マーカー、を誘導した。
【００７０】
図４Ｂは、２４時間の処置後の、Ｍ２細胞に対する各種のオキシステロールの、各種の投与量における影響を表わす棒グラフである。細胞は、９０％コンフルエンス状態で、ビヒクル（Ｃ）、あるいは、オキシステロール２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールまたは２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール（各５μＭ）により、単独であるいは組み合わせて処置した。２４時間後、細胞をリンスし、培地をオキシステロール非含有培地に置換した。４日後、全細胞抽出液内でアルカリ性ホスファターゼの活性度を測定し、蛋白質に対して基準化した。オキシステロールによる僅か２４時間の処置後、アルカリ性ホスファターゼの活性は数倍誘導された。
【００７１】
図４Ｃは、オキシステロールによる処置の持続時間のＭ２細胞に対する影響を表わす棒グラフである。オキシステロール（２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールおよび２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールの組合せ（各５μＭ）による処置で、４〜９６時間の処置後、処置後４日で測定したところ、アルカリ性ホスファターゼの活性が誘導されていた。
【００７２】
図４Ｄは、各種の投与量のオキシステロールの組合せのＭ２細胞に対する影響を表わす棒グラフである。組合せオキシステロールのＭ２細胞に対する影響は、アルカリ性ホスファターゼの活性の誘導についてはその投与量に依存していた。
【００７３】
図４Ｅは、各種の投与量のオキシステロールの組合せのＭ２細胞に対する影響を表わす棒グラフである。２２Ｒおよび２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールの組合せ投与量による処置。１０日後、45Ｃａ取込みを測定して、骨の鉱物形成を評価し、蛋白質に対して基準化した。組合せオキシステロールのＭ２細胞に対する影響は、骨の鉱物形成の誘導についても同様にその投与量に依存していた。
【００７４】
実施例Ｂ：オキシステロールの影響に対するチトクロームＰ４５０の妨害。Ｍ２細胞は、９０％コンフルエンス状態で、ビヒクル（Ｃ）、あるいは、オキシステロール２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールまたは２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール（５μＭまたは１μＭ）により、チトクロームＰ４５０阻害剤（ＳＫＦ５２５Ａ １０μＭ（＋））の欠如あるいは存在下で、処置した。ＭＳＣ培養物も、９０％コンフルエンス状態で、ビヒクル（Ｃ）、あるいは、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール（２μＭ）により、チトクロームＰ４５０活性化剤（ベンジルイミダゾール５０μＭ）またはＳＫＦ５２５Ａ（１０μＭ）の欠如あるいは存在下で、処置した。４日後、全細胞抽出液内でアルカリ性ホスファターゼの活性度を測定し、蛋白質に対して基準化した。
【００７５】
実施例Ｂの結果：図５Ａは、オキシステロールおよびチトクロームＰ４５０阻害剤ＳＫＦ５２５Ａの骨髄ストローマ細胞に対する影響を表わす棒グラフである。４日後、全細胞抽出液内でアルカリ性ホスファターゼの活性度を測定し、蛋白質に対して基準化した。チトクロームＰ４５０阻害剤の使用は、オキシステロールの造骨性影響を増強し、オキシステロールが、チトクロームＰ４５０酵素によって代謝され、妨害されることを示唆した。
【００７６】
図５Ｂは、オキシステロールおよびチトクロームＰ４５０活性化剤ベンジルイミダゾールおよび阻害剤ＳＫＦ５２５ＡのＭ２細胞に対する影響を表わす棒グラフである。チトクロームＰ４５０酵素、ベンジルイミダゾールによる処置では、恐らくオキシステロールの分解が増進されて、オキシステロールの影響が妨害された。
【００７７】
例Ｄ：オキシステロールによるＭＳＣ内における脂肪生成の妨害。ＭＳＣを含む脂肪細胞祖先の脂肪生成は、配位子結合による活性化の際、脂肪細胞の特異的な遺伝子の転写を制御する、転写因子ペルオキシソーム繁殖体で活性化された受容体γ（ＰＰＡＲγ）により制御される。
【００７８】
試験１：９０％コンフルエンス状態でのＭ２細胞を、ビヒクル（Ｃ）、ＰＰＡＲγ祖先活性化剤、１０μＭのトログリタゾン（Ｔｒｏ）単独で、あるいは、１０μＭのオキシステロール２０Ｓ、２２Ｒ、または２５Ｓ−ヒドロキシコレステロールと組み合わせて処置した。８日後、脂肪細胞を、オイルレッドＯ染色により同定し、位相差顕微鏡下で計数し数量化した。図６Ａは、ＭＳＣの脂肪生成の低減に対するオキシステロールの影響を表わす棒グラフである。造骨性オキシステロールは、ＭＳＣ培養物における脂肪生成を妨害した。
【００７９】
試験２：（Ａ）コンフルエンス状態でのＭ２細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で、コントロールビヒクルまたは１０μＭのトログリタゾン（Ｔｒｏ）により、１０μＭの２０Ｓまたは２２Ｓオキシステロールの不在あるいは存在下で、処置した。１０日後、脂肪細胞をオイルレッドＯ染色により描出し、光顕微鏡により、数量化した（（Ｂ）参照）。４回の実験の代表例から得られた結果を、４重測定の平均値ＳＤとして報告して示す（Ｔｒｏ対Ｔｒｏ＋２０ＳおよびＴｒｏ＋２２Ｓではｐ＜０．００１）。（Ｃ）Ｍ２細胞を、コンフルエンス状態で、１０μＭのＴｒｏにより、単独で、あるいは、１０μＭの２０Ｓオキシステロールと組み合わせて処置した。１０日後、全ＲＮＡを単離し、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、脂肪細胞のＰ２遺伝子（ａＰ２）または１８Ｓ ｒＲＮＡの発現について、ノーザンブロッティングにより、上記のように（参考）分析した。ノーザンブロットの濃度測定分析からのデータを、重複サンプルの平均値として、１８Ｓ ｒＲＮＡに対して基準化して（Ｄ）に示す。
【００８０】
図７：Ａ）脂肪細胞をオイルレッドＯ染色により描出したＭ２細胞培養物の写真であり；Ｂ）は、各処置グループ内のフィールド当りの脂肪細胞数を表わす棒グラフであり；Ｃ）は、コントロール試料または処置試料に曝露したＭ２細胞内のリポタンパク質リパーゼ、脂肪細胞のＰ２遺伝子または１８Ｓ ｒＲＮＡについてのノーザンブロッティングのラジオグラムであり；Ｄ）は、コントロール試料または処置試料に曝露したＭ２細胞内のリポタンパク質リパーゼ、脂肪細胞Ｐ２遺伝子ｍＲＮＡの相対デンソメトリック単位を表わす棒グラフである。
【００８１】
脂肪生成を誘導させるため、Ｔｒｏ（ＰＰＡＲγ活性化剤、トログリタゾン（Ｔｒｏ））により処置したＭ２細胞内では、２０Ｓ、２２Ｓ、および２２Ｒが、単独であるいは組合せによって、脂肪生成を妨害した。これらオキシステロールの相対的な抗脂肪生成性作用強度は、Ｍ２細胞内で、アルカリ性ホスファターゼの活性を刺激する際の、２０Ｓ＞２２Ｓ＞２２Ｒによる、それらの相対的な作用強度と同様であった。７Ｋは、その造骨性の影響の欠如と同様、Ｍ２細胞内で、脂肪生成を妨害することもできなかった（データ示さず）。脂肪生成の妨害は、２０Ｓによる脂肪生成性遺伝子リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）および脂肪細胞Ｐ２遺伝子（ａＰ２）の発現の妨害によっても評価された（図７ＣおよびＤ）。これらオキシステロールの脂肪生成に対する妨害効果も、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１/２および初生マウスのＭＳＣを用いて実証され、これらにおいては、Ｔｒｏあるいはデキサメタゾンおよびイソブチルメチルキサンチンからなる反応混液のいずれかによって、脂肪生成が誘導された。
【００８２】
実施例Ｅ：オキシステロール効果の機序。肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）は、ある種の細胞応答を部分的にオキシステロールに仲介する核ホルモン受容体である。ＬＸＲαは、組織特異的な方法で発現するが、ＬＸＲβは、偏在的に発現する。ノーザンブロット分析により、我々は、Ｍ２細胞のコンフルエントな培養中で、ＬＸＲβの発現を実証したが、ＬＸＲαのそれは実証しなかった（データ示さず）。造骨性オキシステロールの効果を仲介する上でＬＸＲが果たし得る役割を評価するために、我々は、薬理学的なＬＸＲ配位子ＴＯ−９０１３１７（ＴＯ）によるＬＸＲβの活性化が、Ｍ２細胞内で２２Ｒおよび２０Ｓによって発揮されたのと同じ効果を有していたかどうかを検査した。
【００８３】
試験１：１〜１０μＭのＴＯにより、Ｍ２細胞内でアルカリ性ホスファターゼの活性の投与量に依存する阻害が生じた（Ｃ：１８±２；１０μＭで使用された配位子：２２Ｒ＝４５±５；２０Ｓ＝１４０±１２；およびＴＯ＝３±０．５活性度単位/ｍｇ蛋白質±ＳＤ；Ｃ対全配位子ではｐ＜０．０１）。さらに、ＴＯ処置では、１０日後に、オステオカルシンの遺伝子発現または石灰化が、誘導されなかった。したがって、Ｍ２細胞に対するオキシステロールの造骨性効果は、これまでは、非ＬＸＲオキシステロール配位子２２Ｓの強力な造骨性活性およびＬＸＲ配位子ＴＯに応答する造骨性効果の欠如によって示唆されるように、ＬＸＲベータ受容体から独立しているように見られる。
【００８４】
試験２：９０％コンフルエンス状態でのＭＳＣ細胞を、ビヒクル（Ｃ）または２つの無関係なＬＸＲ配位子（１〜４μＭのＴＯおよびＧＬ）、または２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール（１０μＭ）により処置した。４日後、アルカリ性ホスファターゼの活性度を全細胞溶菌液内で測定し、蛋白質に対して基準化した。図８は、ＭＳＣの造骨細胞分化の妨害に対するＬＸＲ活性化剤の影響を示す棒グラフである。ＬＸＲベータは、ＭＳＣ内に存在するが、上記のオキシステロールの造骨性効果は、ＬＸＲの特異的な活性化剤による処置により、これら細胞の造骨細胞分化および石灰化が妨害された以上、ＬＸＲベータによるものとは見られない。
【００８５】
実施例Ｆ：ＭＳＣにおけるオキシステロールの造骨性活性の機序。間葉細胞の造骨細胞への分化が、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）の活性によって制御される。ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２は、共に、造骨性細胞に存在し、それぞれ、骨の恒常性および修復に主要に関与するように見られる。ＣＯＸによる、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を含む、アラキドン酸のプロスタグランジンへの代謝は、これら酵素の造骨性効果を仲介する。ＣＯＸ生成物およびＢＭＰ２は、相補的かつ相加的な造骨性効果を有する。
【００８６】
（Ａ）コンフルエンス状態でのＭ２細胞を、上述のように造骨性培地中で、コントロールビヒクル（Ｃ）または１０μＭのＣＯＸ−１阻害剤ＳＣ−５６０（ＳＣ）により４時間前処置した。次いで、２２Ｒおよび２０Ｓオキシステロール（各ＲＳ、２．５μＭ）の組合せを、ＳＣの存在または欠如下で、指示通りに添加した。３日後、上述のようにＡＬＰ活性度を測定した。３回の実験の代表例からのデータを、４重測定の平均値±ＳＤとして報告し、蛋白質濃度に対して基準化して示す（ＲＳ対ＲＳ＋ＳＣではｐ＜０．００１）。（Ｂ）Ｍ２細胞を、（Ａ）で述べたように処置し、１０日後、培養物内の基質の石灰化を、上述のように45Ｃａ取込み検定により数量化した。３回の実験の代表例からの結果を、４重測定の平均値±ＳＤとして報告し、蛋白質濃度に対して基準化して示す。（Ｃ）Ｍ２細胞を、上述のように２０μＭのＳＣにより４時間前処置し、その後にＳＣの存在または欠如下でＲＳを添加した。８日後、全ＲＮＡを単離し、前述のようにノーザンブロッティングによりオステオカルシン（Ｏｓｃ）および１８Ｓ ｒＲＮＡの発現について分析した。ノーザンブロットの濃度測定分析からのデータを、重複サンプルの平均値として、１８Ｓ ｒＲＮＡに対して基準化して（Ｄ）に示す。（Ｅ）コンフルエンス状態でのＭ２細胞を、造骨性培地中で、コントロールビヒクル（Ｃ）、またはＰＬＡ2妨害ＡＣＡ（２５μＭ）およびＡＡＣＯＣＦ３（ＡＡＣ、２０μＭ）により２時間前処置した。次いで、２２Ｒおよび２０Ｓオキシステロール（ＲＳ、２．５μＭ）の組合せを、阻害剤の存在または欠如下で指示通りに添加した。３日後、上述のようにＡＬＰ活性度を測定した。３回の実験の代表例からのデータを、４重測定の平均値±ＳＤとして報告し、蛋白質濃度に対して基準化して示す（ＲＳ対ＲＳ＋ＡＣＡおよびＲＳ＋ＡＡＣではｐ＜０．０１）。（Ｆ）Ｍ２細胞を、（Ｅ）で述べたように処置した。１０日後、培養物内の基質の石灰化を、前述のように、45Ｃａ取込み検定により数量化した。３回の実験の代表例からの結果を、４重測定の平均値±ＳＤとして報告し、蛋白質濃度に対して基準化して示す（ＲＳ対ＲＳ＋ＡＣＡおよびＲＳ＋ＡＡＣではｐ＜０．０１）。
【００８７】
図９：Ａ）は、ＣＯＸ−１阻害剤またはオキシステロール処置の、Ｍ２細胞内のアルカリ性ホスファターゼの活性度に対する影響を表わす棒グラフであり；Ｂ）は、ＣＯＸ−１阻害剤またはオキシステロール処置の、Ｍ２細胞内のカルシウム取込みに対する影響を表わす棒グラフであり；Ｃ）は、ＣＯＸ−１阻害剤またはオキシステロール処置に曝露されたＭ２細胞内のオステオクラスチンまたは１８Ｓ ｒＲＮＡについてのノーザンブロッティングのラジオグラムであり；Ｄ）は、ＣＯＸ−１阻害剤またはオキシステロール処置に曝露されたＭ２細胞内のオステオクラスチンｍＲＮＡの相対デンソメトリック単位を表わす棒グラフであり；Ｅ）は、Ｍ２細胞内のアルカリ性ホスファターゼの活性度に対するＰＬＡ2阻害剤またはオキシステロール処置の影響を表わす棒グラフであり；また、Ｆ）は、Ｍ２細胞内のカルシウム取込みに対するＰＬＡ2阻害剤またはオキシステロール処置の影響を表わす棒グラフである。
【００８８】
牛の胎児の血清（これは我々の実験条件に一致する）の存在下、培養物内のＭ２細胞は、造骨性分化の全ての段階で、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２両方のｍＲＮＡを発現する。骨形成におけるＣＯＸの役割と一致する我々の研究は、１〜２０μＭのＣＯＸ−１選択的阻害剤ＳＣ−５６０が、２０Ｒ＋２０Ｓおよび２２Ｓ＋２０Ｓオキシステロール組合せの造骨性効果を相当に阻害することを示した。ＳＣ−５６０は、オキシステロール誘導のアルカリ性ホスファターゼ活性（図９Ａ）、石灰化（図９Ｂ）、およびオステオカルシンの遺伝子発現（図９Ｃおよび図９Ｄ）を阻害した。ＳＣ−５６０ほど有効ではないが、１〜１０μＭの無毒性の投与量での、非選択的ＣＯＸ阻害剤、ＩｂｕｐｒｏｆｅｎおよびＦｌｕｒｉｐｒｏｆｉｎも、２０Ｒ＋２０Ｓのオキシステロールの組合せの造骨性効果を相当に、２５〜３０％阻害した。対照的に、選択的ＣＯＸ−２阻害剤、ＮＳ−３９８は、２０μＭの最高の無毒性の投与量で、無視できる阻害効果しか有さなかった。さらに、オキシステロールの組合せの、アルカリ性ホスファターゼの活性（図９Ｅ）および石灰化（図９Ｆ）に対する造骨性効果も、一般のホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）阻害剤ＡＣＡによって、また、選択的サイトゾルＰＬＡ２阻害剤、ＡＡＣＯＣＦ３によって阻害された。ＰＬＡ２の活性化は、細胞性リン脂質からアラキドン酸を遊離させ、ＣＯＸ酵素によるプロスタグランジンへの、別の代謝に利用できるようにする。さらに、レスキュー実験では、ＣＯＸ−１およびＰＬＡ２阻害剤の、オキシステロール誘導のアルカリ性ホスファターゼ活性に対する影響は、されぞれ１μＭのＰＧＥ２および２５μＭのアラキドン酸の添加により逆転することが示された（データ示さず）。アラキドン酸のオキシステロール刺激代謝の以前の報告と一致して、本結果は、ＭＳＣにおけるオキシステロールの造骨性活性は、ＰＬＡ２誘導のアラキドン酸遊離の活性化、およびＣＯＸ経路による造骨性プロスタノイドへのその代謝によって、部分的に仲介されることを示唆している。
【００８９】
実施例Ｇ：ＭＳＣの応答をオキシステロールに仲介する際のＥＲＫの役割。細胞外信号制御キナーゼ（ＥＲＫ）の経路は、骨前駆体細胞の造骨細胞分化と以前に関連した別の主要な信号伝達経路である。ＥＲＫの維持された活性化は、ヒトのＭＳＣ５２の造骨性分化を仲介し、ヒトの造骨細胞におけるＥＲＫの活性化は、結果として、造骨性分化のマスターレギュレータであるＣｂｆａ１の発現およびＤＮＡ結合活性のアップレギュレーションを生じる。さらに、ＥＲＫの活性化は、ヒトの成長、分化、および造骨細胞の適切な働きにとって重要であるように思える。
【００９０】
（Ａ）コンフルエンス状態でのＭ２細胞を、１％のＦＢＳを含むＲＰＭＩにより、４時間前処置した後、コントロールビヒクルまたは５μＭの２０Ｓオキシステロールにより、１、４、または８時間処置した。次に、全細胞抽出液を調製し、前述のように、特異的な抗体を用いて、未変性またはリン酸エステル化したＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のレベルについて分析した。４回の実験の代表例からのデータを示し、各処置を重複サンプルで示す。（Ｂ）コンフルエンス状態でのＭ２細胞を、上記のように、造骨性培地中で、コントロールビヒクル（Ｃ）または２０μＭのＰＤ９８０５９（ＰＤ）により２時間前処置した。次いで、２２Ｒおよび２０Ｓオキシステロール（各ＲＳ、５μＭ）の組合せを、適切なウェルに指示通りに添加した。インキュベーションの１０日後、基質の石灰化を、前述のように45Ｃａ取込み検定により数量化した。３回の実験の代表例からのデータを、４重測定の平均値±ＳＤとして報告し、蛋白質濃度に対して基準化して示す（ＲＳ対ＲＳ＋ＰＤではｐ＜０．０１）。（Ｃ）コンフルエンス状態でのＭ２細胞を、５％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で、２０μＭのＰＤ９８０５９（ＰＤ）により２時間前処置した。次いで該細胞をコントロールビヒクル（Ｃ）、１０μＭのトログリタゾン（Ｔｒｏ）、または１０μＭの２０Ｓまたは２２Ｓオキシステロールにより、単独であるいは組合せて、指示通りに処置した。１０日後、脂肪細胞をオイルレッドＯ染色により描出し、光顕微鏡により前述のように数量化した。３回の実験の代表例からのデータを、４重測定の平均値±ＳＤとして報告する。
【００９１】
図１０：Ａ）は、コントロールまたはオキシステロール処置に曝露したＭ２細胞内に発現したｐＥＲＫまたはＥＲＫに対するウェスタンブロットであり；Ｂ）は、Ｍ２細胞内のカルシウム取込みに対するＰＤ９８０５９またはオキシステロール処置の影響を表わす棒グラフであり；Ｃ）は、各処置グループにおけるフィールド当りの脂肪細胞数を表わす棒グラフである。
【００９２】
興味深いことに、単独であるいは２２Ｒオキシステロールと組み合わせて使用した２０Ｓオキシステロールは、Ｍ２細胞内で、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２の維持された活性化を生じた（図１０Ａ）。阻害剤ＰＤ９８０５９によるＥＲＫ経路の阻害は、オキシステロール誘導の石灰化を阻害した（図１０Ｂ）が、Ｍ２細胞培養物内で、アルカリ性ホスファターゼの活性あるいはオステオカルシンのｍＲＮＡ発現を阻害しなかった（データ示さず）。これらの結果は、維持されたＥＲＫ活性化が、オキシステロールのある特異的な、しかし全てではない、造骨性効果を制御する上で重要であることを示唆している。
【００９３】
実施例Ｈ：２０Ｓと２２Ｒまたは２２Ｓのいずれかとの組合せも、マウス多能性胎仔線維芽Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２細胞内で、マウスの頭蓋冠の前造骨ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞内で、また、初生マウスのＭＳＣ内で、アルカリ性ホスファターゼの活性および石灰化の刺激により評価された造骨性効果を生じた。
【００９４】
骨髄ストローマ細胞の造骨性活性度に対する刺激性効果を有したオキシステロールの他の組合せは、２２Ｒ＋プレグネノロン、２０Ｓ＋プレグネノロン、（共に５μＭ）、であった。プレグネノロンは、ＰＸＲと呼ばれる別の核ホルモン受容体の活性化剤である。しかしながら、アルカリ性ホスファターゼの活性および鉱物形成の両方を含む骨髄ストローマ細胞の健全な造骨性活性度を一貫して誘導した最も効果的な組合せのオキシステロールは、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールと組み合わせた２２Ｒまたは２２Ｓであった。
【００９５】
実施例１：７日齢のＣＤ１の仔からの頭蓋冠を外科的に抽出し（処置当り６個）、２２Ｒ＋２０Ｓ（各５μＭ）の存在または欠如下で、２％の牛の胎児の血清を含むＢＧＪ培地中で培養した。次いで、該頭蓋冠を調製し、薄片化した。骨領域（ＢＡｒ）と組織領域（ＴＡｒ）を、頭蓋冠切片のＨ＆Ｅ染色頭頂骨のディジタル画像により判定した。頭蓋冠当り、８〜１０画像を捕獲し、各画像を、切片全体が映像されるまで、頭蓋冠の長さに沿って一視野進めた。分析の領域は、側筋付着部から伸びて、矢状縫合領域（除外した）以外の頭蓋冠切片全体を含んだ。頭頂骨の横断面を冠状および人字縫合から略等距離で、また、各個体ごとに同じ一般的領域で撮影した。この領域の切片を分析したが、その理由は、それらが冠状および人字領域からの縫合組織をほとんどあるいは全く含んでいなかったからである。ＢＡｒは、細胞過形成ではなく、基本的な層状のコラーゲンパターンを示す桃色染色組織と定義された。ＴＡｒは、背側ライニング細胞層と腹側ライニング細胞層との間の組織の領域と定義され、ＢＡｒ並びに未分化の細胞組織および基質を含んでいた。空隙領域については、別個の判定を行ったが、この領域は、ＢＡｒ内の骨髄腔と定義され、ＢＡｒ測定値から引いてから、ＢＡｒ％ＴＡｒの計算を行った。個体間のＴＡｒの差を考慮して、ＢＡｒは、測定した全ＴＡｒのパーセントとして報告する。組織形態計測的なデータ（連続量）を、一方向ＡＮＯＶＡを用い、次いで、コントロール対ＳｔｕｄｅｎｔのｔテストおよびＤｕｎｎｅｔｔテストを行って評価した。０．０５のｐ値を用いてグループ間の有意差を表現した。結果は平均値±ＳＤで表される。
【００９６】
結果。図１１は、２２Ｒ＋２０Ｓオキシステロール組合せの、マウス頭蓋冠骨形成に対する影響を表わす表である。組合せオキシステロールで処置した頭蓋冠内の骨形成では、コントロールビヒクルで処置したものと比べて、２０％の増進が観察され、組合せオキシステロールの造骨性活性をさらにex vivoで支持した。図１２は、ビヒクル（Ａ）または２２Ｒ＋２０Ｓオキシステロールで処置した頭蓋冠の代表的な切片である。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】本発明による一方法のフローチャートを表わす。
【図２】本発明の二つの実施形態を表わす。
【図３Ａ】Ｍ２細胞内アルカリ性ホスファターゼの活性度に対する各種のオキシステロールの影響を表わす棒グラフである。
【図３Ｂ】Ｍ２細胞内アルカリ性ホスファターゼの活性度に対する各種の投与量におけるオキシステロールの組合せの影響を表わす棒グラフである。
【図３Ｃ】各種の条件に曝露されたＭ２細胞のvon Kossa 染色状況を表わしたものである。
【図３Ｄ】Ｍ２細胞内のカルシウムの取込みに対する各種の投与量におけるオキシステロールの組合せの影響を表わす棒グラフである。
【図３Ｅ】４日または８日間、コントロールまたはオキシステロールの組合せに曝露したＭ２細胞内のオステオカルシンｍＲＮＡについてのノーザンブロッティングのラジオグラムである。
【図３Ｆ】４日または８日間、コントロールまたはオキシステロールの組合せに曝露したＭ２細胞内のオステオカルシンｍＲＮＡの相対デンソメトリック単位を表わす棒グラフである。
【図４Ａ】Ｍ２細胞に対する各種のオキシステロールの、各種の投与量における影響を表わす棒グラフである。
【図４Ｂ】Ｍ２細胞に対する各種のオキシステロールの、各種の投与量における影響を表わす棒グラフである。
【図４Ｃ】オキシステロールによる処置の持続時間のＭ２細胞に対する影響を表わす棒グラフである。
【図４Ｄ】各種の投与量のオキシステロールの組合せのＭ２細胞に対する影響を表わす棒グラフである。
【図４Ｅ】各種の投与量のオキシステロールの組合せのＭ２細胞に対する影響を表わす棒グラフである。
【図５Ａ】オキシステロールおよびチトクロームＰ４５０阻害剤ＳＫＦ５２５ＡのＭ２細胞に対する影響を表わす棒グラフである。
【図５Ｂ】オキシステロールおよびチトクロームＰ４５０活性化剤ベンジルイミダゾールおよび阻害剤ＳＫＦ５２５ＡのＭ２細胞に対する影響を表わす棒グラフである。
【図６】Ｍ２細胞の脂肪生成の低減に対するオキシステロールの影響を表わす棒グラフである。
【図７Ａ】脂肪細胞をオイルレッドＯ染色により描出したＭ２細胞培養物の写真である。
【図７Ｂ】各処置グループ内のフィールド当りの脂肪細胞数を表わす棒グラフである。
【図７Ｃ】コントロール試料または処置試料に曝露したＭ２細胞内のリポタンパク質リパーゼ、脂肪細胞のＰ２遺伝子または１８Ｓ ｒＲＮＡについてのノーザンブロッティングのラジオグラムである。
【図７Ｄ】コントロール試料または処置試料に曝露したＭ２細胞内のリポタンパク質リパーゼ、脂肪細胞Ｐ２遺伝子ｍＲＮＡの相対デンソメトリック単位を表わす棒グラフである。
【図８】Ｍ２細胞に対する合成ＬＸＲ活性化剤の影響を示す棒グラフである。
【図９Ａ】ＣＯＸ−１阻害剤またはオキシステロール処置の、Ｍ２細胞内のアルカリ性ホスファターゼの活性度に対する影響を表わす棒グラフである。
【図９Ｂ】ＣＯＸ−１阻害剤またはオキシステロール処置の、Ｍ２細胞内のカルシウム取込みに対する影響を表わす棒グラフである。
【図９Ｃ】ＣＯＸ−１阻害剤またはオキシステロール処置に曝露されたＭ２細胞内のオステオクラスチンまたは１８Ｓ ｒＲＮＡについてのノーザンブロッティングのラジオグラムである。
【図９Ｄ】ＣＯＸ−１阻害剤またはオキシステロール処置に曝露されたＭ２細胞内のオステオクラスチンｍＲＮＡの相対デンソメトリック単位を表わす棒グラフである。
【図９Ｅ】Ｍ２細胞内のアルカリ性ホスファターゼの活性度に対するＰＬＡ2阻害剤またはオキシステロール処置の影響を表わす棒グラフである。
【図９Ｆ】Ｍ２細胞内のカルシウム取込みに対するＰＬＡ2阻害剤またはオキシステロール処置の影響を表わす棒グラフである。
【図１０Ａ】コントロールまたはオキシステロール処置に曝露したＭ２細胞内に発現したｐＥＲＫまたはＥＲＫに対するウェスタンブロットである。
【図１０Ｂ】Ｍ２細胞内のカルシウム取込みに対するＰＤ９８０５９またはオキシステロール処置の影響を表わす棒グラフである。
【図１０Ｃ】各処置グループにおけるフィールド当りの脂肪細胞数を表わす棒グラフである。
【図１１】２２Ｒ＋２０Ｓオキシステロール組合せの、マウス頭蓋冠骨形成に対する影響を表わす表である。
【図１２】ビヒクル（Ａ）または２２Ｒ＋２０Ｓオキシステロール（Ｂ）で処置した頭蓋冠の代表的な切片である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の間葉幹細胞の造骨細胞分化を誘導する方法であって、少なくとも一つのオキシステロールにより哺乳類の間葉細胞を処置する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
該少なくとも一つのオキシステロールが、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、プレグネノロン、及び、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、及びプレグネノロンのうちの任意の一つの活性部分を含む群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該少なくとも一つのオキシステロールが、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、または２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、を含む群から選択されるオキシステロールの組合せであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
さらに、副甲状腺ホルモン、弗化ナトリウム、インスリン様成長因子I、インスリン様成長因子IIまたはトランスフォーミング成長因子ベータを含む群から選択される少なくとも一つの二次作用剤により、該哺乳類の間葉細胞を処置する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
さらに、チトクロームＰ４５０阻害剤、ホスホリパーゼ活性化剤、アラキドン酸、ＣＯＸ酵素活性化剤、造骨性プロスタノイドまたはＥＲＫ活性化剤を含む群から選択される少なくとも一つの二次作用剤により、該哺乳類の間葉細胞を処置する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
哺乳類の細胞を刺激して、未処置の細胞における生物学的マーカーのレベルより高いレベルの造骨細胞分化の生物学的マーカーを発現させる方法であって、哺乳類の細胞を、選択された投与量の少なくとも一つのオキシステロールに曝露する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
該少なくとも一つのオキシステロールが、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、プレグネノロン、及び、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、及びプレグネノロンのうちの任意の一つの活性部分を含む群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該少なくとも一つのオキシステロールが、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、または２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、を含む群から選択されるオキシステロールの組合せであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
さらに、副甲状腺ホルモン、弗化ナトリウム、インスリン様成長因子I、インスリン様成長因子IIまたはトランスフォーミング成長因子ベータを含む群から選択される少なくとも一つの二次作用剤により、該哺乳類の間葉細胞を処置する工程を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、チトクロームＰ４５０阻害剤、ホスホリパーゼ活性化剤、アラキドン酸、ＣＯＸ酵素活性化剤、造骨性プロスタノイドまたはＥＲＫ活性化剤を含む群から選択される少なくとも一つの二次作用剤により、該哺乳類の間葉細胞を処置する工程を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
該生物学的マーカーが、アルカリ性ホスファターゼの活性度、カルシウムの取込み、石灰化またはオステオカルシンのｍＲＮＡの発現のうちの少なくとも一つの増大であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
該哺乳類の細胞が、間葉幹細胞、骨前駆体細胞または頭蓋冠器官培養細胞を含む群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳類の間葉幹細胞の脂肪細胞分化を阻害する方法であって、少なくとも一つのオキシステロールにより、哺乳類の間葉細胞を処置する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
該少なくとも一つのオキシステロールが、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、プレグネノロン、及び、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、及びプレグネノロンのうちの任意の一つの活性部分を含む群から選択されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
患者を処置して骨髄ストローマ細胞の造骨細胞への分化を増大させる方法であって、少なくとも一つのオキシステロールを、治療的に有効な投与量で、有効な投与形態で、選択された間隔で、投与して、骨組織に存在する造骨細胞の数を増大させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
該少なくとも一つのオキシステロールが、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、プレグネノロン、及び、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、及びプレグネノロンのうちの任意の一つの活性部分を含む群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
該少なくとも一つのオキシステロールが、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、または２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、を含む群から選択されるオキシステロールの組合せであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
さらに、副甲状腺ホルモン、弗化ナトリウム、インスリン様成長因子I、インスリン様成長因子IIまたはトランスフォーミング成長因子ベータを含む群から選択される少なくとも一つの二次作用剤により、該患者を処置する工程を含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
患者を処置して骨の形成を誘導する方法であって、少なくとも一つのオキシステロールを、治療的に有効な投与量で、有効な投与形態で、選択された間隔で、投与して、骨の質量を増大させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
該少なくとも一つのオキシステロールが、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、プレグネノロン、及び、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、及びプレグネノロンのうちの任意の一つの活性部分を含む群から選択されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
該少なくとも一つのオキシステロールが、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、または２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、を含む群から選択されるオキシステロールの組合せであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
さらに、副甲状腺ホルモン、弗化ナトリウム、インスリン様成長因子I、インスリン様成長因子IIまたはトランスフォーミング成長因子ベータを含む群から選択される少なくとも一つの二次作用剤により、治療的に有効な投与量で、該患者を処置する工程を含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
さらに、ビスホスホン酸塩、選択的エストロゲン受容体モジュレータ、カルシトニン、またはビタミンＤおよびカルシウムを含む群から選択される少なくとも一つの二次作用剤により、治療的に有効な投与量で、患者を処置する工程を含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
骨粗鬆症の臨床的な症候を示す患者を処置する方法であって、少なくとも一つのオキシステロールを、治療的に有効な投与量で、有効な投与形態で、選択された間隔で、投与して、骨粗鬆症の症候を寛解する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
該少なくとも一つのオキシステロールが、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、プレグネノロン、及び、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、及びプレグネノロンのうちの任意の一つの活性部分を含む群から選択されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
該少なくとも一つのオキシステロールが、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、または２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、を含む群から選択されるオキシステロールの組合せであることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
さらに、副甲状腺ホルモン、弗化ナトリウム、インスリン様成長因子I、インスリン様成長因子IIまたはトランスフォーミング成長因子ベータを含む群から選択される少なくとも一つの二次作用剤により、治療的に有効な投与量で、該患者を処置する工程を含むことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
さらに、ビスホスホン酸塩、選択的エストロゲン受容体モジュレータ、カルシトニン、またはビタミンＤおよびカルシウムを含む群から選択される少なくとも一つの二次作用剤により、治療的に有効な投与量で、患者を処置する工程を含むことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
患者を処置して、骨の形成を誘導する方法であって、
哺乳類の間葉幹細胞を収集する工程；
該哺乳類の間葉細胞を少なくとも一つの作用剤により処置する工程であって、該少なくとも一つの作用剤は、該間葉幹細胞を誘導して、少なくとも一つの造骨細胞分化の細胞マーカーを発現させることを特徴とする工程；及び
該患者に該分化した細胞を投与する工程
を含む方法。
【請求項３０】
該少なくとも一つのオキシステロールが、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、プレグネノロン、及び、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、及びプレグネノロンのうちの任意の一つの活性部分を含む群から選択されることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
該少なくとも一つのオキシステロールが、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、または２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、を含む群から選択されるオキシステロールの組合せであることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
さらに、少なくとも一つのオキシステロールを、治療的に有効な投与量で、有効な投与形態で、選択された間隔で、投与する工程を含むことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
さらに、副甲状腺ホルモン、弗化ナトリウム、インスリン様成長因子I、インスリン様成長因子IIまたはトランスフォーミング成長因子ベータを含む群から選択される少なくとも一つの二次作用剤により、治療的に有効な投与量で、該患者を処置する工程を含むことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
さらに、ビスホスホン酸塩、選択的エストロゲン受容体モジュレータ、カルシトニン、またはビタミンＤおよびカルシウムを含む群から選択される少なくとも一つの二次作用剤により、治療的に有効な投与量で、患者を処置する工程を含むことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
さらに、該分化した細胞を該患者に全身的な注入によって投与する工程を含むことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
さらに、該分化した細胞を骨の形成が望まれる選択された部位への該細胞の適用によって該患者に投与する工程を含むことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
ヒトの身体内で使用するためのインプラントであって、表面を有する基体を含み、該インプラントの少なくとも該表面が、周辺の骨組織内に骨形成を誘導するのに十分な量の少なくとも一つのオキシステロールを含むことを特徴とするインプラント。
【請求項３８】
該基体は、ピン、ネジ、板、または補綴関節の形に形成されていることを特徴とする請求項３７に記載のインプラント。
【請求項３９】
ヒトの身体内で使用するためのインプラントであって、表面を有する基体を含み、該インプラントの少なくとも該表面が、造骨細胞分化が可能な哺乳類細胞を含むことを特徴とするインプラント。
【請求項４０】
ヒトの身体内で使用するためのインプラントであって、表面を有する基体を含み、該インプラントの少なくとも該表面は、造骨細胞の哺乳類細胞を含むことを特徴とするインプラント。
【請求項４１】
骨の障害の処置に使用するための薬物であって、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、プレグネノロン、及び、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、及びプレグネノロンのうちの任意の一つの活性部分を含む群から選択される少なくとも一つのオキシステロールを治療的に有効な投与量含有することを特徴とする薬物。
【請求項１】
哺乳類の間葉幹細胞の造骨細胞分化を誘導する方法であって、少なくとも一つのオキシステロールにより哺乳類の間葉細胞を処置する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
該少なくとも一つのオキシステロールが、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、プレグネノロン、及び、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、及びプレグネノロンのうちの任意の一つの活性部分を含む群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該少なくとも一つのオキシステロールが、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、または２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、を含む群から選択されるオキシステロールの組合せであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
さらに、副甲状腺ホルモン、弗化ナトリウム、インスリン様成長因子I、インスリン様成長因子IIまたはトランスフォーミング成長因子ベータを含む群から選択される少なくとも一つの二次作用剤により、該哺乳類の間葉細胞を処置する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
さらに、チトクロームＰ４５０阻害剤、ホスホリパーゼ活性化剤、アラキドン酸、ＣＯＸ酵素活性化剤、造骨性プロスタノイドまたはＥＲＫ活性化剤を含む群から選択される少なくとも一つの二次作用剤により、該哺乳類の間葉細胞を処置する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
哺乳類の細胞を刺激して、未処置の細胞における生物学的マーカーのレベルより高いレベルの造骨細胞分化の生物学的マーカーを発現させる方法であって、哺乳類の細胞を、選択された投与量の少なくとも一つのオキシステロールに曝露する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
該少なくとも一つのオキシステロールが、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、プレグネノロン、及び、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、及びプレグネノロンのうちの任意の一つの活性部分を含む群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該少なくとも一つのオキシステロールが、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、または２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、を含む群から選択されるオキシステロールの組合せであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
さらに、副甲状腺ホルモン、弗化ナトリウム、インスリン様成長因子I、インスリン様成長因子IIまたはトランスフォーミング成長因子ベータを含む群から選択される少なくとも一つの二次作用剤により、該哺乳類の間葉細胞を処置する工程を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、チトクロームＰ４５０阻害剤、ホスホリパーゼ活性化剤、アラキドン酸、ＣＯＸ酵素活性化剤、造骨性プロスタノイドまたはＥＲＫ活性化剤を含む群から選択される少なくとも一つの二次作用剤により、該哺乳類の間葉細胞を処置する工程を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
該生物学的マーカーが、アルカリ性ホスファターゼの活性度、カルシウムの取込み、石灰化またはオステオカルシンのｍＲＮＡの発現のうちの少なくとも一つの増大であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
該哺乳類の細胞が、間葉幹細胞、骨前駆体細胞または頭蓋冠器官培養細胞を含む群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳類の間葉幹細胞の脂肪細胞分化を阻害する方法であって、少なくとも一つのオキシステロールにより、哺乳類の間葉細胞を処置する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
該少なくとも一つのオキシステロールが、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、プレグネノロン、及び、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、及びプレグネノロンのうちの任意の一つの活性部分を含む群から選択されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
患者を処置して骨髄ストローマ細胞の造骨細胞への分化を増大させる方法であって、少なくとも一つのオキシステロールを、治療的に有効な投与量で、有効な投与形態で、選択された間隔で、投与して、骨組織に存在する造骨細胞の数を増大させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
該少なくとも一つのオキシステロールが、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、プレグネノロン、及び、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、及びプレグネノロンのうちの任意の一つの活性部分を含む群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
該少なくとも一つのオキシステロールが、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、または２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、を含む群から選択されるオキシステロールの組合せであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
さらに、副甲状腺ホルモン、弗化ナトリウム、インスリン様成長因子I、インスリン様成長因子IIまたはトランスフォーミング成長因子ベータを含む群から選択される少なくとも一つの二次作用剤により、該患者を処置する工程を含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
患者を処置して骨の形成を誘導する方法であって、少なくとも一つのオキシステロールを、治療的に有効な投与量で、有効な投与形態で、選択された間隔で、投与して、骨の質量を増大させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
該少なくとも一つのオキシステロールが、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、プレグネノロン、及び、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、及びプレグネノロンのうちの任意の一つの活性部分を含む群から選択されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
該少なくとも一つのオキシステロールが、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、または２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、を含む群から選択されるオキシステロールの組合せであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
さらに、副甲状腺ホルモン、弗化ナトリウム、インスリン様成長因子I、インスリン様成長因子IIまたはトランスフォーミング成長因子ベータを含む群から選択される少なくとも一つの二次作用剤により、治療的に有効な投与量で、該患者を処置する工程を含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
さらに、ビスホスホン酸塩、選択的エストロゲン受容体モジュレータ、カルシトニン、またはビタミンＤおよびカルシウムを含む群から選択される少なくとも一つの二次作用剤により、治療的に有効な投与量で、患者を処置する工程を含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
骨粗鬆症の臨床的な症候を示す患者を処置する方法であって、少なくとも一つのオキシステロールを、治療的に有効な投与量で、有効な投与形態で、選択された間隔で、投与して、骨粗鬆症の症候を寛解する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
該少なくとも一つのオキシステロールが、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、プレグネノロン、及び、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、及びプレグネノロンのうちの任意の一つの活性部分を含む群から選択されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
該少なくとも一つのオキシステロールが、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、または２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、を含む群から選択されるオキシステロールの組合せであることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
さらに、副甲状腺ホルモン、弗化ナトリウム、インスリン様成長因子I、インスリン様成長因子IIまたはトランスフォーミング成長因子ベータを含む群から選択される少なくとも一つの二次作用剤により、治療的に有効な投与量で、該患者を処置する工程を含むことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
さらに、ビスホスホン酸塩、選択的エストロゲン受容体モジュレータ、カルシトニン、またはビタミンＤおよびカルシウムを含む群から選択される少なくとも一つの二次作用剤により、治療的に有効な投与量で、患者を処置する工程を含むことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
患者を処置して、骨の形成を誘導する方法であって、
哺乳類の間葉幹細胞を収集する工程；
該哺乳類の間葉細胞を少なくとも一つの作用剤により処置する工程であって、該少なくとも一つの作用剤は、該間葉幹細胞を誘導して、少なくとも一つの造骨細胞分化の細胞マーカーを発現させることを特徴とする工程；及び
該患者に該分化した細胞を投与する工程
を含む方法。
【請求項３０】
該少なくとも一つのオキシステロールが、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、プレグネノロン、及び、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、及びプレグネノロンのうちの任意の一つの活性部分を含む群から選択されることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
該少なくとも一つのオキシステロールが、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、または２０Ｓ−ヒドロキシコレステロールと２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、を含む群から選択されるオキシステロールの組合せであることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
さらに、少なくとも一つのオキシステロールを、治療的に有効な投与量で、有効な投与形態で、選択された間隔で、投与する工程を含むことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
さらに、副甲状腺ホルモン、弗化ナトリウム、インスリン様成長因子I、インスリン様成長因子IIまたはトランスフォーミング成長因子ベータを含む群から選択される少なくとも一つの二次作用剤により、治療的に有効な投与量で、該患者を処置する工程を含むことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
さらに、ビスホスホン酸塩、選択的エストロゲン受容体モジュレータ、カルシトニン、またはビタミンＤおよびカルシウムを含む群から選択される少なくとも一つの二次作用剤により、治療的に有効な投与量で、患者を処置する工程を含むことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
さらに、該分化した細胞を該患者に全身的な注入によって投与する工程を含むことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
さらに、該分化した細胞を骨の形成が望まれる選択された部位への該細胞の適用によって該患者に投与する工程を含むことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
ヒトの身体内で使用するためのインプラントであって、表面を有する基体を含み、該インプラントの少なくとも該表面が、周辺の骨組織内に骨形成を誘導するのに十分な量の少なくとも一つのオキシステロールを含むことを特徴とするインプラント。
【請求項３８】
該基体は、ピン、ネジ、板、または補綴関節の形に形成されていることを特徴とする請求項３７に記載のインプラント。
【請求項３９】
ヒトの身体内で使用するためのインプラントであって、表面を有する基体を含み、該インプラントの少なくとも該表面が、造骨細胞分化が可能な哺乳類細胞を含むことを特徴とするインプラント。
【請求項４０】
ヒトの身体内で使用するためのインプラントであって、表面を有する基体を含み、該インプラントの少なくとも該表面は、造骨細胞の哺乳類細胞を含むことを特徴とするインプラント。
【請求項４１】
骨の障害の処置に使用するための薬物であって、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、プレグネノロン、及び、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、及びプレグネノロンのうちの任意の一つの活性部分を含む群から選択される少なくとも一つのオキシステロールを治療的に有効な投与量含有することを特徴とする薬物。
【図１】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ｂ】
【図７Ｄ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｄ】
【図９Ｅ】
【図９Ｆ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ｂ】
【図７Ｄ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｄ】
【図９Ｅ】
【図９Ｆ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【公表番号】特表２００６−５０３８１９（Ｐ２００６−５０３８１９Ａ）
【公表日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５３１９２１（Ｐ２００４−５３１９２１）
【出願日】平成１５年８月２８日（２００３．８．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２７１０５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０１９８８４
【国際公開日】平成１６年３月１１日（２００４．３．１１）
【出願人】（５０００２７９３２）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア (39)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年８月２８日（２００３．８．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２７１０５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０１９８８４
【国際公開日】平成１６年３月１１日（２００４．３．１１）
【出願人】（５０００２７９３２）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア (39)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]