骨形成促進剤
【課題】飲食品、医薬品等の様々な用途に利用することができる骨形成促進剤を提供する。
【解決手段】本発明の骨形成促進剤は、アピシンを有効成分として含有することを特徴とする。好ましくは、骨粗鬆症及び骨折から選ばれる少なくとも一種の治療剤又は予防剤として用いられる。好ましくは、アピシンは、ローヤルゼリーから液体クロマトグラフィーを用いて分離されたものである。
【解決手段】本発明の骨形成促進剤は、アピシンを有効成分として含有することを特徴とする。好ましくは、骨粗鬆症及び骨折から選ばれる少なくとも一種の治療剤又は予防剤として用いられる。好ましくは、アピシンは、ローヤルゼリーから液体クロマトグラフィーを用いて分離されたものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ローヤルゼリーに含有されるアピシン（Ａｐｉｓｉｎ）を有効成分として含有し、骨芽細胞の機能を向上させる骨形成促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、ローヤルゼリーは、羽化後３〜１５日の雌のミツバチが下咽頭腺及び大腮腺から分泌する分泌物を混合して作るゼリー状の物質で、特有のタンパク質、脂肪酸及びミネラル等が含有されていることが知られている。ローヤルゼリーは、血圧降下作用、抗腫瘍作用、抗菌作用等の種々の生理作用を有していることが知られている。よって従来より、ローヤルゼリーは、栄養価の高い健康食品のみならず、医薬品等の用途にも用いられてきた。
【０００３】
ローヤルゼリーエキスはデセン酸をはじめとするローヤルゼリーに特有な脂肪酸、そのエステルからなる脂質、ローヤルゼリーにのみ含有される特殊な水溶性タンパク質、アミノ酸、糖質、ミネラル等を含有している。それらの中で、タンパク質は、ローヤルゼリー中において、１０％以上を占めるものの、詳細な機能及び生理作用に関しては未だ十分に解明されていない。
【０００４】
従来より、ローヤルゼリー中に含まれるタンパク質として、分子量３５０ｋＤの糖タンパク質としてアピシンが知られている（非特許文献１）。アピシンは、ヒト血球系単球細胞株に対する増殖作用を有することが知られている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ミツバチ科学１９（１）：１５−２２（１９９８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、アピシンが骨芽細胞の機能を向上させ、骨形成を促進する作用を発揮することを見出したことによりなされたものである。
本発明の目的とするところは、飲食品、医薬品等の様々な用途に利用することができる骨形成促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、請求項１に記載の骨形成促進剤において、アピシンを有効成分として含有することを特徴とする。
請求項２に記載の発明において、請求項１に記載の骨形成促進剤において、骨粗鬆症及び骨折から選ばれる少なくとも一種の治療剤又は予防剤として用いられることを特徴とする。
【０００８】
請求項３に記載の発明において、請求項１又は請求項２に記載の骨形成促進剤において、前記アピシンは、ローヤルゼリーから液体クロマトグラフィーを用いて分離されたものであることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、飲食品、医薬品等の様々な用途に利用することができる骨形成促進剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】アピシンの骨芽細胞の石灰化促進作用に関する顕微鏡写真を示す。
【図２】アピシンにおける骨芽細胞のヒドロキシアパタイトの産生促進作用に関する試験結果を示す。
【図３】ローヤルゼリーにおける骨芽細胞のヒドロキシアパタイトの産生促進作用に関する試験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の骨形成促進剤を具体化した実施形態を説明する。
本実施形態の骨形成促進剤は、アピシンを有効成分として含有する。アピシンは、ローヤルゼリー中に含まれる水溶性の糖タンパク質であり、２種類の５８ｋＤａのサブユニットが３分子ずつ会合した分子量約３５０ｋＤのヘテロオリゴマータンパク質である。
【００１２】
アピシンは、ローヤルゼリーを原料として入手することができる。原料のローヤルゼリーとしては、生ローヤルゼリー及び生ローヤルゼリーを凍結乾燥処理等により乾燥させて粉末化したローヤルゼリー粉末（ＦＤ−ＲＪ）のいずれも使用することができる。本実施形態において使用される生ローヤルゼリー及び乾燥ローヤルゼリーの産地は、特に限定されないが、例えば中国、台湾、日本等のアジア諸国、ヨーロッパ諸国、北アメリカ諸国、ブラジル等の南アメリカ諸国、オセアニア諸国のいずれでもよい。
【００１３】
アピシンは、分子量約３５０ｋＤの水溶性の糖タンパク質であり、ローヤルゼリーを抽出原料として公知の抽出、分離及び精製方法を用いて抽出・精製することができる。具体的には、抽出原料から溶媒を用いた抽出処理、限外濾過及び透析を用いた分離処理、並びにクロマトグラフィーを用いた分離・精製処理が挙げられる。
【００１４】
抽出処理において、抽出に用いられる溶媒としては、例えば水、親水性有機溶媒、及び水／親水性有機溶媒の混合液が用いられる。これらの中で、アピシンの抽出効率に優れる観点から水が好ましい。水は、抽出効率をより上げるために各種酸の塩類を添加した緩衝液として用いるのが好ましい。緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液、及び酢酸緩衝液が挙げられる。親水性有機溶媒としては、例えば、エタノール、メタノール、イソプロパノール等の低級アルコールのほか、アセトンやメチルエチルケトン等のケトン類、及び酢酸エチルが挙げられる。
【００１５】
クロマトグラフィーとしては、公知のクロマトグラフィー、例えば液体クロマトグラフィー、超臨界流体クロマトグラフィー、及び薄層クロマトグラフィーを用いることができるが、アピシンはタンパク質成分であることから液体クロマトグラフィーが好ましく適用される。液体クロマトグラフィーとしては、例えばカラムクロマトグラフィーを用いることができ、より具体的には高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及びオープンカラムクロマトグラフィーを挙げることができる。クロマトグラフィー担体としては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー（順相・逆相クロマトグラフィー）、吸着クロマトグラフィー、及び分子排斥クロマトグラフィー（ゲル濾過・分子篩クロマトグラフィー）が挙げられる。アピシンは、等電点が４．４〜５．４であり、酸性タンパク質であるため、イオン交換クロマトグラフィーとして陰イオン交換樹脂が好ましく用いられる。陰イオン交換樹脂として、例えばＤＥＡＥセルロース及びＱセファロースが挙げられる。それらを適宜組み合わせて、公知の使用方法でアピシン成分を分離・精製することができる。
【００１６】
本実施形態の骨形成促進剤は、骨芽細胞の骨形成を促進する作用を有する。骨は、常に新陳代謝における破骨細胞と骨芽細胞の働きにより破壊と再構築が行われている。骨芽細胞は、未分化間葉系細胞から分化し、骨基質の有機成分、例えばコラーゲンやオステオカルシン等の骨基質タンパク質を産生し分泌する。骨芽細胞の周りに分泌された有機成分に、カルシウム成分、例えばヒドロキシアパタイト、炭酸カルシウム、及びリン酸カルシウムが沈着し、結晶が成長することにより石灰化が進行する。
【００１７】
骨は、破骨細胞と骨芽細胞の絶妙なバランスのもとに骨の形態及び強度を維持している。しかしながら、加齢及び骨芽細胞を刺激するエストロゲンの低下により、そのバランスが崩れ、骨芽細胞の機能が低下すると骨粗鬆症等の骨疾患が生ずることがある。本実施形態の骨形成促進剤は、ヒドロキシアパタイトの蓄積を促進することにより、骨芽細胞の骨形成における石灰化を促進する作用を発揮する。したがって、本実施形態の骨形成促進剤は、骨粗鬆症の治療剤又は予防剤として好ましく適用することができる。
【００１８】
また、骨折した場合、骨折部分において骨芽細胞が分化及び石灰化を繰り返すことにより、骨折部分が修復し、治癒されることが知られている。したがって、本実施形態の骨形成促進剤を適用することにより、骨折部分の修復を促進し、治癒を早めることが期待される。したがって、本実施形態の骨形成促進剤は、骨折の治癒促進剤として適用できることが期待される。
【００１９】
本実施形態の骨形成促進剤の具体的な配合形態としては、上記の作用効果を得ることを目的とした飲食品、医薬品、及び研究用試薬等として適用することができる。本実施形態の骨形成促進剤を飲食品として適用する場合は、従来品と区別するために、上記作用・効果、例えば骨形成の促進、ヒドロキシアパタイトの蓄積の促進、骨芽細胞の骨形成における石灰化の促進、骨粗鬆症の治療又は予防、骨折の治癒促進等の効果を得ることを目的とする旨の表示を付すことが好ましい。
【００２０】
本実施形態の骨形成促進剤を飲食品に適用する場合、骨形成促進剤を飲食品そのものとして、又は種々の食品素材又は飲料品素材に配合して使用することができる。飲食品の形態としては、特に限定されず、液状、粉末状、ゲル状、固形状のいずれであってもよく、また剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、ドリンク剤のいずれであってもよい。その中でも、吸湿性が抑えられることから、カプセル剤であることが好ましい。前記飲食品としては、その他の成分としてゲル化剤含有食品、糖類、香料、甘味料、油脂、基材、賦形剤、食品添加剤、副素材、増量剤等を適宜配合してもよい。
【００２１】
本実施形態の骨形成促進剤を医薬品として使用する場合は、服用（経口摂取）により投与する場合の他、皮下注射、血管内投与、患部への直接投与等のあらゆる投与方法を採用することが可能である。剤形としては、特に限定されないが、例えば、散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、液剤、注射剤等が挙げられる。また、添加剤として賦形剤、基剤、乳化剤、溶剤、安定剤等を配合してもよい。また、本実施形態の骨形成促進剤を骨形成促進用の試薬の形態で実験用・研究用試薬として適用してもよい。骨芽細胞が関係する生理作用のメカニズムの解明又は各種疾患の治療法等の研究・開発等の分野において、好適に用いられる。
【００２２】
骨形成促進剤の投与量は、特に限定されないが、優れた効能を発揮する観点から、有効成分であるアピシンの濃度として、ローヤルゼリー中に含有されるアピシンの濃度（固形分として約２０質量％）よりも高い濃度（比率）で投与されることが好ましい。
【００２３】
本実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
（１）本実施形態の骨形成促進剤は、優れた骨形成促進作用を発揮する。したがって、骨形成促進作用の発揮を目的とした飲食品、医薬品、及び研究用試薬等の分野に好ましく適用することができる。
【００２４】
（２）好ましくは、骨形成促進剤は、骨粗鬆症及び骨折から選ばれる少なくとも一種の治療剤又は予防剤として用いられる。本実施形態の骨形成促進剤は、特に骨芽細胞の骨組織における石灰化作用を促進する。したがって、本実施形態の骨形成促進剤は、骨芽細胞の機能が関与する骨粗鬆症の改善及び骨折の治癒に好ましく適用することができる。
【００２５】
（３）好ましくは、本実施形態の骨形成促進剤において、有効成分であるアピシンは、天然由来の原料としてローヤルゼリーから液体クロマトグラフィー、例えば陰イオン交換樹脂を用いて分離されたものである。したがって、安全に飲食品、医薬品、及び研究用試薬等の分野に適用することができる。また、ローヤルゼリーをそのまま投与するよりも、高い濃度（比率）でアピシンを投与することができる。
【００２６】
（４）好ましくは、本実施形態の骨形成促進剤において、有効成分であるアピシンの濃度（比率）として、ローヤルゼリー中に含有されるアピシンの濃度（比率）よりも高い濃度で投与される。したがって、骨形成促進に関連するより優れた各種効能を発揮することができる。
【００２７】
なお、上記実施形態は以下のように変更してもよい。
・上記実施形態における有効成分であるアピシンは、ローヤルゼリーから粗抽出されたもの、粗精製されたもの、及び精製されたもののいずれを使用してもよい。
【００２８】
・上記実施形態における有効成分であるアピシンは、好ましくはローヤルゼリーを抽出原料として抽出することにより入手される。しかしながら、天然物からの抽出方法以外に、公知の遺伝子工学的手法によって入手してもよい。遺伝子工学的手法によって本実施形態のアピシンを得るためには、公知のインビトロ（in vitro）タンパク合成系を利用して製造することができる。具体的には、アピシンをコードする塩基配列からなる遺伝子を公知の任意のベクターに組み込み、該ベクターを宿主内に導入して形質転換体を作製し、該形質転換体を培養することによって得ることができる。
【００２９】
・上記実施形態の骨形成促進剤は、ヒトが摂取する飲食品又は医薬品等に対して適用することができるのみならず、家畜等の飼養動物に対する飼料、薬剤等に適用してもよい。
【実施例】
【００３０】
以下に実施例を挙げ、前記実施形態をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本実施例において、アピシンの骨形成促進作用について試験・検討した。
【００３１】
（１）アピシンの調製
中国産の生ローヤルゼリー（生ＲＪ）を蒸留水で２倍希釈し、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．２）に対して分画分子量１００００の透析膜で４８時間透析を行った。その後、遠心分離（１５０００×ｇ、６０分、４℃）し、得られた上清をローヤルゼリー可溶性タンパク質とした。これを、ＤＥＡＥ−セルロファインＡ−５００カラム（生化学工業社製）に添加し、非吸着画分を同緩衝液で溶出させた後、ＮａＣｌ濃度を０〜０．３Ｍまで直線的に増加させることにより吸着画分を溶出させ、ローヤルゼリーから分離した。なお、流速は９０ｍＬ／時間で行い、２８０ｎｍにおける紫外吸収によりタンパク質を検出した。タンパク質の濃度はＤＣプロテインアッセイ（Bio-Rad Laboratories社製）を用いて測定した。上記のように溶出させた画分をアピシン含有画分（アピシン含有率約８０％以上（固形分中））として骨芽細胞様細胞を用いた試験で使用した。尚、中国産の生ローヤルゼリーを凍結乾燥したものを参考例として使用した。
【００３２】
（２）マウス骨芽細胞様細胞
マウス骨芽細胞様細胞は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１株を使用した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１株は、理化学研究所より購入した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１は１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍＬペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むα−ＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。細胞継代は３〜４日毎にトリプシン処理により行った。
【００３３】
（３）マウス骨芽細胞様細胞の骨形成促進作用の検討
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１株を９６ウェルプレート中に５０００細胞／ウェルになるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下でサブコンフルエントの状態になるまで２日間培養した。その後、培養液を２％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭにより２回洗浄し、この培地に置き換えて実験０日とした。試験試料であるアピシン及びローヤルゼリーをα−ＭＥＭに溶解後、フィルターろ過した。アピシンは、培養液中の濃度が２０μｇ／ｍＬ，１００μｇ／ｍＬ，３００μｇ／ｍＬとなるように添加した。ローヤルゼリーは、固形分濃度が１０μｇ／ｍＬ，３０μｇ／ｍＬ，１００μｇ／ｍＬとなるように添加した。骨芽細胞様細胞の分化誘導因子としてビタミンＣ（５０μｇ／ｍＬ）及びβ−グリセロリン酸（５ｍＭ）を各試験試料と同時に添加した。ビタミンＣ及びβ−グリセロリン酸を添加しないものをコントロール群とした。また、ビタミンＣ及びβ−グリセロリン酸のみを添加し、各試験試料を添加しなかったものを０μｇ／ｍＬ群とする。培養液は３日毎に交換し、その都度アピシン又はローヤルゼリーを同量添加した。分化誘導因子添加から１４，２１，２８，３５，４２日目に骨芽細胞様細胞の分化（石灰化）を評価した。石灰化は、ヒドロキシアパタイトの産生をOsteoImage Mineralization Assay kit（Takara社製）により蛍光発色させて蛍光強度（４９２ｎｍ／５２０ｎｍ）を測定するとともに、顕微鏡で写真撮影した。また、石灰化結節をアリザリンレッド染色した後、顕微鏡で写真撮影した。石灰化結節の顕微鏡写真を図１のＡ〜Ｅに示す。ヒドロキシアパタイトの蓄積に関する顕微鏡写真を図１のＦ〜Ｊに示す。アピシンを用いた骨形成促進作用としてヒドロキシアパタイトの蓄積に関する試験結果を図２に示す。ローヤルゼリーを用いた骨形成促進作用としてヒドロキシアパタイトの蓄積に関する試験結果を図３に示す。尚、実験結果はすべて平均±標準偏差で表し、危険率５％以下を有意とした。統計学的解析は分散分析法（Dunnet法）により行った。
【００３４】
（４）結果
図１Ａ，Ｆはコントロール群を示す。図１Ａ，Ｆに示されるように、コントロール群は、石灰化結節及びヒドロキシアパタイトの蓄積が全く確認されなかった。培養液に分化誘導因子としてビタミンＣ及びβ−グリセロリン酸を含む培養液を用いて培養した各細胞群は、２８日目まではいずれの処理群でも極めて微小な石灰化結節の形成しか観察されず、ヒドロキシアパタイトの蓄積もほとんど観察されなかった（データ不添付）。図１Ｂ，Ｇは、３５日目の分化誘導因子のみを添加した０μｇ／ｍＬ群を示す。図１Ｂ，Ｇに示されるように、３５日目にはアリザリンレッドにて染色される小さな粒上の石灰化結節及びヒドロキシアパタイトの蓄積が培養ウェルの端側に観察された。図１Ｃ，Ｈは、３５日目のアピシン２０μｇ／ｍＬ処理群を示す。図１Ｃ，Ｈに示されるように、アピシン２０μｇ／ｍＬ処理群において３５日目で石灰化結節及びヒドロキシアパタイトの蓄積が観察された。アピシン２０μｇ／ｍＬ処理群は、０μｇ／ｍＬ群と比べて、石灰化結節の数は増加し、ヒドロキシアパタイトの蓄積も厚みが増加した。図１Ｄ，Ｉは、３５日目のアピシン１００μｇ／ｍＬ処理群を示す。図１Ｄ，Ｉに示されるように、アピシン１００μｇ／ｍＬ処理群では石灰化結節が大きな塊となって観察され、数も増加するとともに、ヒドロキシアパタイトの蓄積もさらに増大した。図１Ｅ，Ｊは、３５日目のアピシン３００μｇ／ｍＬ処理群を示す。一方、アピシン３００μｇ／ｍＬ処理群では、図１Ｅ，Ｊに示されるように、分化誘導因子を含むにも関わらず、石灰化結節及びヒドロキシアパタイトの蓄積がほとんど確認されなかった。
【００３５】
図２に示されるように、アピシン１００μｇ／ｍＬ処理群において、有意なヒドロキシアパタイトの産生促進作用が認められた。また、図３に示されるように、ローヤルゼリーも濃度依存的にヒドロキシアパタイトの産生を増加させ、ローヤルゼリー１００μｇ／ｍＬにおいて有意なヒドロキシアパタイトの産生促進作用が認められた。
【００３６】
次に、上記実施形態及び別例から把握できる技術的思想について、以下に追記する。（イ）ローヤルゼリー中に含有されるアピシンの濃度よりも高い濃度で投与される前記骨形成促進剤。（ロ）アピシンを有効成分とする骨芽細胞の石灰化促進剤。（ハ）ローヤルゼリーを有効成分として含有する骨形成促進剤又は骨芽細胞の石灰化促進剤。（ニ）ローヤルゼリーを有効成分として含有し、骨粗鬆症及び骨折から選ばれる少なくとも一種の治療剤又は予防剤として用いられる骨形成促進剤又は骨芽細胞の石灰化促進剤。（ハ）及び（ニ）の構成において、ローヤルゼリーを有効成分として含有する場合においても、アピシンと同様に、骨形成促進作用の発揮を目的とした飲食品、医薬品、及び研究用試薬等の分野に好ましく適用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ローヤルゼリーに含有されるアピシン（Ａｐｉｓｉｎ）を有効成分として含有し、骨芽細胞の機能を向上させる骨形成促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、ローヤルゼリーは、羽化後３〜１５日の雌のミツバチが下咽頭腺及び大腮腺から分泌する分泌物を混合して作るゼリー状の物質で、特有のタンパク質、脂肪酸及びミネラル等が含有されていることが知られている。ローヤルゼリーは、血圧降下作用、抗腫瘍作用、抗菌作用等の種々の生理作用を有していることが知られている。よって従来より、ローヤルゼリーは、栄養価の高い健康食品のみならず、医薬品等の用途にも用いられてきた。
【０００３】
ローヤルゼリーエキスはデセン酸をはじめとするローヤルゼリーに特有な脂肪酸、そのエステルからなる脂質、ローヤルゼリーにのみ含有される特殊な水溶性タンパク質、アミノ酸、糖質、ミネラル等を含有している。それらの中で、タンパク質は、ローヤルゼリー中において、１０％以上を占めるものの、詳細な機能及び生理作用に関しては未だ十分に解明されていない。
【０００４】
従来より、ローヤルゼリー中に含まれるタンパク質として、分子量３５０ｋＤの糖タンパク質としてアピシンが知られている（非特許文献１）。アピシンは、ヒト血球系単球細胞株に対する増殖作用を有することが知られている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ミツバチ科学１９（１）：１５−２２（１９９８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、アピシンが骨芽細胞の機能を向上させ、骨形成を促進する作用を発揮することを見出したことによりなされたものである。
本発明の目的とするところは、飲食品、医薬品等の様々な用途に利用することができる骨形成促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、請求項１に記載の骨形成促進剤において、アピシンを有効成分として含有することを特徴とする。
請求項２に記載の発明において、請求項１に記載の骨形成促進剤において、骨粗鬆症及び骨折から選ばれる少なくとも一種の治療剤又は予防剤として用いられることを特徴とする。
【０００８】
請求項３に記載の発明において、請求項１又は請求項２に記載の骨形成促進剤において、前記アピシンは、ローヤルゼリーから液体クロマトグラフィーを用いて分離されたものであることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、飲食品、医薬品等の様々な用途に利用することができる骨形成促進剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】アピシンの骨芽細胞の石灰化促進作用に関する顕微鏡写真を示す。
【図２】アピシンにおける骨芽細胞のヒドロキシアパタイトの産生促進作用に関する試験結果を示す。
【図３】ローヤルゼリーにおける骨芽細胞のヒドロキシアパタイトの産生促進作用に関する試験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の骨形成促進剤を具体化した実施形態を説明する。
本実施形態の骨形成促進剤は、アピシンを有効成分として含有する。アピシンは、ローヤルゼリー中に含まれる水溶性の糖タンパク質であり、２種類の５８ｋＤａのサブユニットが３分子ずつ会合した分子量約３５０ｋＤのヘテロオリゴマータンパク質である。
【００１２】
アピシンは、ローヤルゼリーを原料として入手することができる。原料のローヤルゼリーとしては、生ローヤルゼリー及び生ローヤルゼリーを凍結乾燥処理等により乾燥させて粉末化したローヤルゼリー粉末（ＦＤ−ＲＪ）のいずれも使用することができる。本実施形態において使用される生ローヤルゼリー及び乾燥ローヤルゼリーの産地は、特に限定されないが、例えば中国、台湾、日本等のアジア諸国、ヨーロッパ諸国、北アメリカ諸国、ブラジル等の南アメリカ諸国、オセアニア諸国のいずれでもよい。
【００１３】
アピシンは、分子量約３５０ｋＤの水溶性の糖タンパク質であり、ローヤルゼリーを抽出原料として公知の抽出、分離及び精製方法を用いて抽出・精製することができる。具体的には、抽出原料から溶媒を用いた抽出処理、限外濾過及び透析を用いた分離処理、並びにクロマトグラフィーを用いた分離・精製処理が挙げられる。
【００１４】
抽出処理において、抽出に用いられる溶媒としては、例えば水、親水性有機溶媒、及び水／親水性有機溶媒の混合液が用いられる。これらの中で、アピシンの抽出効率に優れる観点から水が好ましい。水は、抽出効率をより上げるために各種酸の塩類を添加した緩衝液として用いるのが好ましい。緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液、及び酢酸緩衝液が挙げられる。親水性有機溶媒としては、例えば、エタノール、メタノール、イソプロパノール等の低級アルコールのほか、アセトンやメチルエチルケトン等のケトン類、及び酢酸エチルが挙げられる。
【００１５】
クロマトグラフィーとしては、公知のクロマトグラフィー、例えば液体クロマトグラフィー、超臨界流体クロマトグラフィー、及び薄層クロマトグラフィーを用いることができるが、アピシンはタンパク質成分であることから液体クロマトグラフィーが好ましく適用される。液体クロマトグラフィーとしては、例えばカラムクロマトグラフィーを用いることができ、より具体的には高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及びオープンカラムクロマトグラフィーを挙げることができる。クロマトグラフィー担体としては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー（順相・逆相クロマトグラフィー）、吸着クロマトグラフィー、及び分子排斥クロマトグラフィー（ゲル濾過・分子篩クロマトグラフィー）が挙げられる。アピシンは、等電点が４．４〜５．４であり、酸性タンパク質であるため、イオン交換クロマトグラフィーとして陰イオン交換樹脂が好ましく用いられる。陰イオン交換樹脂として、例えばＤＥＡＥセルロース及びＱセファロースが挙げられる。それらを適宜組み合わせて、公知の使用方法でアピシン成分を分離・精製することができる。
【００１６】
本実施形態の骨形成促進剤は、骨芽細胞の骨形成を促進する作用を有する。骨は、常に新陳代謝における破骨細胞と骨芽細胞の働きにより破壊と再構築が行われている。骨芽細胞は、未分化間葉系細胞から分化し、骨基質の有機成分、例えばコラーゲンやオステオカルシン等の骨基質タンパク質を産生し分泌する。骨芽細胞の周りに分泌された有機成分に、カルシウム成分、例えばヒドロキシアパタイト、炭酸カルシウム、及びリン酸カルシウムが沈着し、結晶が成長することにより石灰化が進行する。
【００１７】
骨は、破骨細胞と骨芽細胞の絶妙なバランスのもとに骨の形態及び強度を維持している。しかしながら、加齢及び骨芽細胞を刺激するエストロゲンの低下により、そのバランスが崩れ、骨芽細胞の機能が低下すると骨粗鬆症等の骨疾患が生ずることがある。本実施形態の骨形成促進剤は、ヒドロキシアパタイトの蓄積を促進することにより、骨芽細胞の骨形成における石灰化を促進する作用を発揮する。したがって、本実施形態の骨形成促進剤は、骨粗鬆症の治療剤又は予防剤として好ましく適用することができる。
【００１８】
また、骨折した場合、骨折部分において骨芽細胞が分化及び石灰化を繰り返すことにより、骨折部分が修復し、治癒されることが知られている。したがって、本実施形態の骨形成促進剤を適用することにより、骨折部分の修復を促進し、治癒を早めることが期待される。したがって、本実施形態の骨形成促進剤は、骨折の治癒促進剤として適用できることが期待される。
【００１９】
本実施形態の骨形成促進剤の具体的な配合形態としては、上記の作用効果を得ることを目的とした飲食品、医薬品、及び研究用試薬等として適用することができる。本実施形態の骨形成促進剤を飲食品として適用する場合は、従来品と区別するために、上記作用・効果、例えば骨形成の促進、ヒドロキシアパタイトの蓄積の促進、骨芽細胞の骨形成における石灰化の促進、骨粗鬆症の治療又は予防、骨折の治癒促進等の効果を得ることを目的とする旨の表示を付すことが好ましい。
【００２０】
本実施形態の骨形成促進剤を飲食品に適用する場合、骨形成促進剤を飲食品そのものとして、又は種々の食品素材又は飲料品素材に配合して使用することができる。飲食品の形態としては、特に限定されず、液状、粉末状、ゲル状、固形状のいずれであってもよく、また剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、ドリンク剤のいずれであってもよい。その中でも、吸湿性が抑えられることから、カプセル剤であることが好ましい。前記飲食品としては、その他の成分としてゲル化剤含有食品、糖類、香料、甘味料、油脂、基材、賦形剤、食品添加剤、副素材、増量剤等を適宜配合してもよい。
【００２１】
本実施形態の骨形成促進剤を医薬品として使用する場合は、服用（経口摂取）により投与する場合の他、皮下注射、血管内投与、患部への直接投与等のあらゆる投与方法を採用することが可能である。剤形としては、特に限定されないが、例えば、散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、液剤、注射剤等が挙げられる。また、添加剤として賦形剤、基剤、乳化剤、溶剤、安定剤等を配合してもよい。また、本実施形態の骨形成促進剤を骨形成促進用の試薬の形態で実験用・研究用試薬として適用してもよい。骨芽細胞が関係する生理作用のメカニズムの解明又は各種疾患の治療法等の研究・開発等の分野において、好適に用いられる。
【００２２】
骨形成促進剤の投与量は、特に限定されないが、優れた効能を発揮する観点から、有効成分であるアピシンの濃度として、ローヤルゼリー中に含有されるアピシンの濃度（固形分として約２０質量％）よりも高い濃度（比率）で投与されることが好ましい。
【００２３】
本実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
（１）本実施形態の骨形成促進剤は、優れた骨形成促進作用を発揮する。したがって、骨形成促進作用の発揮を目的とした飲食品、医薬品、及び研究用試薬等の分野に好ましく適用することができる。
【００２４】
（２）好ましくは、骨形成促進剤は、骨粗鬆症及び骨折から選ばれる少なくとも一種の治療剤又は予防剤として用いられる。本実施形態の骨形成促進剤は、特に骨芽細胞の骨組織における石灰化作用を促進する。したがって、本実施形態の骨形成促進剤は、骨芽細胞の機能が関与する骨粗鬆症の改善及び骨折の治癒に好ましく適用することができる。
【００２５】
（３）好ましくは、本実施形態の骨形成促進剤において、有効成分であるアピシンは、天然由来の原料としてローヤルゼリーから液体クロマトグラフィー、例えば陰イオン交換樹脂を用いて分離されたものである。したがって、安全に飲食品、医薬品、及び研究用試薬等の分野に適用することができる。また、ローヤルゼリーをそのまま投与するよりも、高い濃度（比率）でアピシンを投与することができる。
【００２６】
（４）好ましくは、本実施形態の骨形成促進剤において、有効成分であるアピシンの濃度（比率）として、ローヤルゼリー中に含有されるアピシンの濃度（比率）よりも高い濃度で投与される。したがって、骨形成促進に関連するより優れた各種効能を発揮することができる。
【００２７】
なお、上記実施形態は以下のように変更してもよい。
・上記実施形態における有効成分であるアピシンは、ローヤルゼリーから粗抽出されたもの、粗精製されたもの、及び精製されたもののいずれを使用してもよい。
【００２８】
・上記実施形態における有効成分であるアピシンは、好ましくはローヤルゼリーを抽出原料として抽出することにより入手される。しかしながら、天然物からの抽出方法以外に、公知の遺伝子工学的手法によって入手してもよい。遺伝子工学的手法によって本実施形態のアピシンを得るためには、公知のインビトロ（in vitro）タンパク合成系を利用して製造することができる。具体的には、アピシンをコードする塩基配列からなる遺伝子を公知の任意のベクターに組み込み、該ベクターを宿主内に導入して形質転換体を作製し、該形質転換体を培養することによって得ることができる。
【００２９】
・上記実施形態の骨形成促進剤は、ヒトが摂取する飲食品又は医薬品等に対して適用することができるのみならず、家畜等の飼養動物に対する飼料、薬剤等に適用してもよい。
【実施例】
【００３０】
以下に実施例を挙げ、前記実施形態をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本実施例において、アピシンの骨形成促進作用について試験・検討した。
【００３１】
（１）アピシンの調製
中国産の生ローヤルゼリー（生ＲＪ）を蒸留水で２倍希釈し、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．２）に対して分画分子量１００００の透析膜で４８時間透析を行った。その後、遠心分離（１５０００×ｇ、６０分、４℃）し、得られた上清をローヤルゼリー可溶性タンパク質とした。これを、ＤＥＡＥ−セルロファインＡ−５００カラム（生化学工業社製）に添加し、非吸着画分を同緩衝液で溶出させた後、ＮａＣｌ濃度を０〜０．３Ｍまで直線的に増加させることにより吸着画分を溶出させ、ローヤルゼリーから分離した。なお、流速は９０ｍＬ／時間で行い、２８０ｎｍにおける紫外吸収によりタンパク質を検出した。タンパク質の濃度はＤＣプロテインアッセイ（Bio-Rad Laboratories社製）を用いて測定した。上記のように溶出させた画分をアピシン含有画分（アピシン含有率約８０％以上（固形分中））として骨芽細胞様細胞を用いた試験で使用した。尚、中国産の生ローヤルゼリーを凍結乾燥したものを参考例として使用した。
【００３２】
（２）マウス骨芽細胞様細胞
マウス骨芽細胞様細胞は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１株を使用した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１株は、理化学研究所より購入した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１は１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍＬペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むα−ＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。細胞継代は３〜４日毎にトリプシン処理により行った。
【００３３】
（３）マウス骨芽細胞様細胞の骨形成促進作用の検討
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１株を９６ウェルプレート中に５０００細胞／ウェルになるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下でサブコンフルエントの状態になるまで２日間培養した。その後、培養液を２％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭにより２回洗浄し、この培地に置き換えて実験０日とした。試験試料であるアピシン及びローヤルゼリーをα−ＭＥＭに溶解後、フィルターろ過した。アピシンは、培養液中の濃度が２０μｇ／ｍＬ，１００μｇ／ｍＬ，３００μｇ／ｍＬとなるように添加した。ローヤルゼリーは、固形分濃度が１０μｇ／ｍＬ，３０μｇ／ｍＬ，１００μｇ／ｍＬとなるように添加した。骨芽細胞様細胞の分化誘導因子としてビタミンＣ（５０μｇ／ｍＬ）及びβ−グリセロリン酸（５ｍＭ）を各試験試料と同時に添加した。ビタミンＣ及びβ−グリセロリン酸を添加しないものをコントロール群とした。また、ビタミンＣ及びβ−グリセロリン酸のみを添加し、各試験試料を添加しなかったものを０μｇ／ｍＬ群とする。培養液は３日毎に交換し、その都度アピシン又はローヤルゼリーを同量添加した。分化誘導因子添加から１４，２１，２８，３５，４２日目に骨芽細胞様細胞の分化（石灰化）を評価した。石灰化は、ヒドロキシアパタイトの産生をOsteoImage Mineralization Assay kit（Takara社製）により蛍光発色させて蛍光強度（４９２ｎｍ／５２０ｎｍ）を測定するとともに、顕微鏡で写真撮影した。また、石灰化結節をアリザリンレッド染色した後、顕微鏡で写真撮影した。石灰化結節の顕微鏡写真を図１のＡ〜Ｅに示す。ヒドロキシアパタイトの蓄積に関する顕微鏡写真を図１のＦ〜Ｊに示す。アピシンを用いた骨形成促進作用としてヒドロキシアパタイトの蓄積に関する試験結果を図２に示す。ローヤルゼリーを用いた骨形成促進作用としてヒドロキシアパタイトの蓄積に関する試験結果を図３に示す。尚、実験結果はすべて平均±標準偏差で表し、危険率５％以下を有意とした。統計学的解析は分散分析法（Dunnet法）により行った。
【００３４】
（４）結果
図１Ａ，Ｆはコントロール群を示す。図１Ａ，Ｆに示されるように、コントロール群は、石灰化結節及びヒドロキシアパタイトの蓄積が全く確認されなかった。培養液に分化誘導因子としてビタミンＣ及びβ−グリセロリン酸を含む培養液を用いて培養した各細胞群は、２８日目まではいずれの処理群でも極めて微小な石灰化結節の形成しか観察されず、ヒドロキシアパタイトの蓄積もほとんど観察されなかった（データ不添付）。図１Ｂ，Ｇは、３５日目の分化誘導因子のみを添加した０μｇ／ｍＬ群を示す。図１Ｂ，Ｇに示されるように、３５日目にはアリザリンレッドにて染色される小さな粒上の石灰化結節及びヒドロキシアパタイトの蓄積が培養ウェルの端側に観察された。図１Ｃ，Ｈは、３５日目のアピシン２０μｇ／ｍＬ処理群を示す。図１Ｃ，Ｈに示されるように、アピシン２０μｇ／ｍＬ処理群において３５日目で石灰化結節及びヒドロキシアパタイトの蓄積が観察された。アピシン２０μｇ／ｍＬ処理群は、０μｇ／ｍＬ群と比べて、石灰化結節の数は増加し、ヒドロキシアパタイトの蓄積も厚みが増加した。図１Ｄ，Ｉは、３５日目のアピシン１００μｇ／ｍＬ処理群を示す。図１Ｄ，Ｉに示されるように、アピシン１００μｇ／ｍＬ処理群では石灰化結節が大きな塊となって観察され、数も増加するとともに、ヒドロキシアパタイトの蓄積もさらに増大した。図１Ｅ，Ｊは、３５日目のアピシン３００μｇ／ｍＬ処理群を示す。一方、アピシン３００μｇ／ｍＬ処理群では、図１Ｅ，Ｊに示されるように、分化誘導因子を含むにも関わらず、石灰化結節及びヒドロキシアパタイトの蓄積がほとんど確認されなかった。
【００３５】
図２に示されるように、アピシン１００μｇ／ｍＬ処理群において、有意なヒドロキシアパタイトの産生促進作用が認められた。また、図３に示されるように、ローヤルゼリーも濃度依存的にヒドロキシアパタイトの産生を増加させ、ローヤルゼリー１００μｇ／ｍＬにおいて有意なヒドロキシアパタイトの産生促進作用が認められた。
【００３６】
次に、上記実施形態及び別例から把握できる技術的思想について、以下に追記する。（イ）ローヤルゼリー中に含有されるアピシンの濃度よりも高い濃度で投与される前記骨形成促進剤。（ロ）アピシンを有効成分とする骨芽細胞の石灰化促進剤。（ハ）ローヤルゼリーを有効成分として含有する骨形成促進剤又は骨芽細胞の石灰化促進剤。（ニ）ローヤルゼリーを有効成分として含有し、骨粗鬆症及び骨折から選ばれる少なくとも一種の治療剤又は予防剤として用いられる骨形成促進剤又は骨芽細胞の石灰化促進剤。（ハ）及び（ニ）の構成において、ローヤルゼリーを有効成分として含有する場合においても、アピシンと同様に、骨形成促進作用の発揮を目的とした飲食品、医薬品、及び研究用試薬等の分野に好ましく適用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アピシンを有効成分として含有することを特徴とする骨形成促進剤。
【請求項２】
骨粗鬆症及び骨折から選ばれる少なくとも一種の治療剤又は予防剤として用いられることを特徴とする請求項１に記載の骨形成促進剤。
【請求項３】
前記アピシンは、ローヤルゼリーから液体クロマトグラフィーを用いて分離されたものであることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の骨形成促進剤。
【請求項１】
アピシンを有効成分として含有することを特徴とする骨形成促進剤。
【請求項２】
骨粗鬆症及び骨折から選ばれる少なくとも一種の治療剤又は予防剤として用いられることを特徴とする請求項１に記載の骨形成促進剤。
【請求項３】
前記アピシンは、ローヤルゼリーから液体クロマトグラフィーを用いて分離されたものであることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の骨形成促進剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−５６８９１（Ｐ２０１２−５６８９１Ａ）
【公開日】平成２４年３月２２日（２０１２．３．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２０２０６２（Ｐ２０１０−２０２０６２）
【出願日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【出願人】（５９１０４５４７１）アピ株式会社 (59)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月２２日（２０１２．３．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【出願人】（５９１０４５４７１）アピ株式会社 (59)
【Ｆターム（参考）】
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