４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン一水和物
本発明は、ＺＤ６４７４一水和物、ＺＤ６４７４一水和物の調製方法、ＺＤ６４７４一水和物を活性成分として含む医薬組成物、ヒトのような温血動物における抗血管新生および／または血管透過性減少効果の産生において使用するための医薬の製造におけるＺＤ６４７４一水和物の使用、およびヒトのような温血動物における癌のような血管新生および／または血管透過性の増加に伴う疾病状態の治療法におけるＺＤ６４７４一水和物の使用、に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＺＤ６４７４の新規な形態に関する。更に具体的には、本発明は、ＺＤ６４７４一水和物、ＺＤ６４７４一水和物の調製方法、ＺＤ６４７４一水和物を活性成分として含む医薬組成物、ヒトのような温血動物における抗血管新生および／または血管透過性減少効果の産生において使用するための医薬の製造におけるＺＤ６４７４一水和物の使用、およびヒトのような温血動物における癌のような血管新生および／または増加した血管透過性に伴う疾病状態の治療方法におけるＺＤ６４７４一水和物の使用に関する。
【０００２】
正常な血管新生は、胚発生、創傷治癒および雌性の性機能のいくつかの要素を含む様々な過程において重要な役割を果たす。好ましくないまたは病的な血管新生は、糖尿病性網膜症、乾癬、癌、関節リウマチ、アテローム、カポジ肉腫および血管腫を含む疾病状態に関連する（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ，１９９５，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１６：５７−６６；Ｆｏｌｋｍａｎ，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １：２７−３１）。血管透過性の変化は、正常および病的な生理学的過程の両方において役割を果たす考えられる（Ｃｕｌｌｉｎａｎ−Ｂｏｖｅ ｅｔ ａｌ，１９９３，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３３：８２９−８３７；Ｓｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９３，Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２：３０３−３２４）。酸性および塩基性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏで内皮細胞増殖促進活性を持ついくつかのポリペプチドが同定されている。その受容体の制限された発現によって、ＶＥＧＦの増殖因子活性は、ＦＧＦのそれとは対照的に、内皮細胞に対して相対的に特異的である。最近の証拠は、ＶＥＧＦが、正常なおよび病的な血管新生の両方（Ｊａｋｅｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９３，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３３：８４８−８５９；Ｋｏｌｃｈ ｅｔ ａｌ，１９９５，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，３６：１３９−１５５）、並びに血管透過性（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２００１７−２００２４）にとって重要な刺激物質であることを示している。抗体でＶＥＧＦを捕捉することによるＶＥＧＦ作用の拮抗作用は、腫瘍の増殖を阻害することができる（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：８４１−８４４）。
【０００３】
受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫｓ）は、細胞の細胞膜を横切る生化学的シグナルの伝達において重要である。これらの膜貫通分子は、細胞膜中のセグメントを介して細胞内チロシンキナーゼ領域と結合した、細胞外リガンド結合領域から特徴的に構成される。リガンドの受容体への結合は、受容体およびその他の細胞内分子上のチロシン残基のリン酸化を導く、受容体関連チロシンキナーゼ活性を刺激する。チロシンのリン酸化におけるこれらの変化により、様々な細胞応答を導くシグナルカスケードが開始する。今日まで、アミノ酸配列の相同性によって定義される少なくとも１９個の異なるＲＴＫサブファミリーが同定されている。これらのサブファミリーの一つは、現時点では、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ受容体、Ｆｌｔ−１、キナーゼ挿入領域含有受容体、ＫＤＲ（Ｆｌｋ−１とも呼ばれる）、およびもう一つのｆｍｓ様チロシンキナーゼ受容体、Ｆｌｔ−４によって構成される。これらの関連するＲＴＫの二つ、Ｆｌｔ−１およびＫＤＲは、ＶＥＧＦに高い親和性で結合することが示されている（Ｄｅ Ｖｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：９８９−９９１；Ｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９９２，１８７：１５７９−１５８６）。ＶＥＧＦの、異種細胞で発現されるこれらの受容体への結合は、細胞タンパク質のチロシンのリン酸化状態およびカルシウムフラックスの変化に関与する。
【０００４】
ＶＥＧＦは、血管形成および血管新生のための重要な刺激物質である。このサイトカインは、内皮細胞の増殖、プロテアーゼの発現および遊走、並びに毛細管を形成するためのその後の細胞の組織化を誘導することによって、血管発芽表現型を誘発する（Ｋｅｃｋ，Ｐ．Ｊ．，Ｈａｕｓｅｒ，Ｓ．Ｄ．，Ｋｒｉｖｉ，Ｇ．，Ｓａｎｚｏ，Ｋ．，Ｗａｒｒｅｎ，Ｔ．，Ｆｅｄｅｒ，Ｊ．，ａｎｄ Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｄ．Ｔ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ），２４６：１３０９−１３１２，１９８９；Ｌａｍｏｒｅａｕｘ，Ｗ．Ｊ．，Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｍ．Ｅ．，Ｒｅｉｎｅｒ，Ａ．，Ｈａｓｔｙ，Ｋ．Ａ．，ａｎｄ Ｃｈａｒｌｅｓ，Ｓ．Ｔ．，Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．，５５：２９−４２，１９９８；Ｐｅｐｐｅｒ，Ｍ．Ｓ．，Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ，Ｒ．，Ｍａｎｄｒｏｉｔａ，Ｓ．Ｊ．，Ｏｒｃｉ，Ｌ．ａｎｄ Ｖａｓｓａｌｌｉ，Ｊ．Ｄ．，Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ，４９：１３８−１６２，１９９６）。更に、ＶＥＧＦは、病的血管新生の特徴である超透過性の未熟な血管ネットワークの形成を促進する著しい血管透過性を誘導する（Ｄｖｏｒａｋ Ｈ．Ｆ．，Ｄｅｔｍａｒ，Ｍ．，Ｃｌａｆｆｅｙ，Ｋ．Ｐ．，Ｎａｇｙ，Ｊ．Ａ．，ｖａｎ ｄｅ Ｗａｔｅｒ，Ｌ．，ａｎｄ Ｓｅｎｇｅｒ，Ｄ．Ｒ．，（Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０７：２３３−２３５，１９９５；Ｂａｔｅｓ，Ｄ．Ｏ．，Ｈｅａｌｄ，Ｒ．Ｉ．，Ｃｕｒｒｙ，Ｆ．Ｅ．ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄ．），５３３：２６３−２７２，２００１）。
【０００５】
ＫＤＲ単独の活性化は、内皮細胞の増殖、遊走、および生存を含むＶＥＧＦに対する全ての主要な表現型応答、並びに血管透過性の誘導を促進するために十分であることが示されている（Ｍｅｙｅｒ，Ｍ．，Ｃｌａｕｓｓ，Ｍ．，Ｌｅｐｐｌｅ−Ｗｉｅｎｈｕｅｓ，Ａ．，Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．，Ａｕｇｕｓｔｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｚｉｃｈｅ，Ｍ．，Ｌａｎｚ，Ｃ．，Ｂｕｔｔｎｅｒ，Ｍ．，Ｒｚｉｈａ，Ｈ−Ｊ．，ａｎｄ Ｄｅｈｉｏ，Ｃ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１８：３６３−３７４，１９９９；Ｚｅｎｇ，Ｈ．，Ｓａｎｙａｌ，Ｓ．ａｎｄ Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ｄ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：３２７１４−３２７１９，２００１；Ｇｉｌｌｅ，Ｈ．，Ｋｏｗａｌｓｋｉ，Ｊ．，Ｌｉ，Ｂ．，ＬｅＣｏｕｔｅｒ，Ｊ．，Ｍｏｆｆａｔ，Ｂ，Ｚｉｏｎｃｈｅｃｋ，Ｔ．Ｆ．，Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｎ．ａｎｄ Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：３２２２−３２３０，２００１）。
【０００６】
ＶＥＧＦの効果を阻害する化合物は、癌（白血病、多発性骨髄腫およびリンパ腫を含む）、糖尿病、乾癬、関節リウマチ、カポジ肉腫、血管腫、急性および慢性腎症、アテローム、動脈再狭窄、自己免疫性疾患、急性炎症、過剰な瘢痕形成および癒着、子宮内膜症、リンパ浮腫、機能障害性子宮出血および黄斑変性症を含む網膜血管の増殖に伴う眼疾患のような血管新生および／または血管透過性の増加に伴う疾病状態の治療において価値がある。
【０００７】
ＶＥＧＦ受容体型チロシンキナーゼの阻害剤であるキナゾリン誘導体は、国際特許出願公開ＷＯ９８／１３３５４およびＷＯ０１／３２６５１に記載されている。ＷＯ９８／１３３５４およびＷＯ０１／３２６５１において、ＶＥＧＦ受容体型チロシンキナーゼ（ＶＥＧＦ ＲＴＫ）に対する活性を保有し、一方、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）受容体型チロシンキナーゼ（ＥＧＦ ＲＴＫ）に対するある程度の活性を保有する化合物が記載されている。
【０００８】
ＺＤ６４７４は、４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン：
【０００９】
【化１】
【００１０】
である。
ＺＤ６４７４は、ＷＯ９８／１３３５４の広い開示の範囲内に入り、そしてＷＯ０１／３２６５１中で例示されている。ＺＤ６４７４は、ＶＥＧＦ ＲＴＫの強力な阻害剤であり、そして更にＥＧＦ ＲＴＫに対してもある程度の活性を有する。ＺＤ６４７４は、一日一回の経口投与後のモデルの範囲において抗腫瘍活性の広いスペクトルを発揮することが示されている（Ｗｅｄｇｅ Ｓ．Ｒ．，Ｏｇｉｌｖｉｅ Ｄ．Ｊ．，Ｄｕｋｅｓ Ｍ．ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．２００１；４２：ａｂｓｔｒａｃｔ ３１２６）。
【００１１】
ＷＯ０１／３２６５１は、ＺＤ６４７４の調製を記載する。
ＷＯ０１／３２６５１の実施例２ａにおいて、ＺＤ６４７４の塩酸塩が調製され、そして単離される。
【００１２】
ＷＯ０１／３２６５１の実施例２ｂにおいて、ＺＤ６４７４遊離塩基が調製され、そして単離される。単離工程中で、生成物を乾燥するために硫酸マグネシウムが使用される。単離されたＺＤ６４７４遊離塩基の元素分析は、これが水を含有していないことを示す。言い換えれば、単離されたＺＤ６４７４遊離塩基は、無水の形態である。
【００１３】
ＷＯ０１／３２６５１の実施例２ｃにおいて、ＺＤ６４７４の塩酸塩が調製され、そして単離される。一つの側面において、単離されたＺＤ６４７４の塩酸塩は、ジメチルスルホキシド中に溶解され、そして固体の炭酸カリウムの添加によって、ＺＤ６４７４遊離塩基に（ジメチルスルホキシド溶液中で）変換される。ジメチルスルホキシド溶液中のＺＤ６４７４遊離塩基は、無水の形態である。次いでジメチルスルホキシド溶液中のＺＤ６４７４遊離塩基は、トリフルオロ酢酸の添加によってＺＤ６４７４のトリフルオロ酢酸塩に変換される。
【００１４】
ＷＯ０１／３２６５１の実施例２ｃのもう一つの側面において、ＺＤ６４７４遊離塩基は、固体として単離される。まず、単離されたＺＤ６４７４の塩酸塩を、塩化メチレン中に懸濁し、そして懸濁液を飽和の水性炭酸水素ナトリウムで洗浄して、塩化メチレン中のＺＤ６４７４遊離塩基の溶液を得ることによって、ＺＤ６４７４遊離塩基に変換する。次いでＺＤ６４７４遊離塩基の塩化メチレン溶液を、硫酸マグネシウムを使用して乾燥させ、そして揮発性物質をエバポレーションによって除去する。この方法を、本出願の実施例１のように繰返し、そしてＺＤ６４７４遊離塩基を、結晶の無水の形態で得る。
【００１５】
したがって、ＷＯ０１／３２６５１は、ＺＤ６４７４の塩酸塩およびＺＤ６４７４遊離塩基の両方を開示する。ＷＯ０１／３２６５１の実施例において、固体として得られたＺＤ６４７４遊離塩基は、無水の形態である。
【００１６】
ＺＤ６４７４の塩酸塩およびＺＤ６４７４遊離塩基の無水の形態を調製するためにＷＯ０１／３２６５１中に記載された方法は、ＷＯ０３／０３９５５１、ＷＯ２００４／０１４３８３、ＷＯ２００４／０１４４２６、ＷＯ２００４／０３２９３７、ＷＯ２００４／０７１３９７およびＷＯ２００５／００４８７０のような、ＺＤ６４７４を含む組合せ療法に関連する出願公開中でも更に記載されおよび／または参照される。
【００１７】
疑義の回避のために、これ以降使用される用語“ＺＤ６４７４”は、特に明記しない限り、ＺＤ６４７４遊離塩基を指す。
ＺＤ６４７４の無水の形態は、ＷＯ０１／３２６５１に記載されている方法を使用して調製してもよい。ＺＤ６４７４遊離塩基の無水の形態を調製および単離するための別の方法は、本出願の実施例２中に記載される。
【００１８】
ＺＤ６４７４の無水の形態は、周囲条件下では結晶の固体である。示差走査熱量（ＤＳＣ）分析を、本明細書中で以下に記載される方法にしたがってＺＤ６４７４の無水の形態に対して行った結果、溶融の開始温度が２３０℃〜２４０℃間にある大きくかつ鋭い吸熱を示す（図１）。ＤＳＣの開始および／またはピーク温度の値が、機械によってまたは試料によってわずかに変化してもよいので、引用された値は絶対値として解釈されるべきでないことは、理解されるであろう。
【００１９】
熱重量（ＴＧＡ）分析を、本明細書中で以下に記載される方法にしたがってＺＤ６４７４の無水の形態に対して行った結果、溶融前に対する重量の喪失はないことを示す（図１）。これは、ＺＤ６４７４の無水の形態の指標である。
【００２０】
カールフィッシャー分析を、本明細書中で以下に記載される方法にしたがってＺＤ６４７４の無水の形態に対して行った結果、０．０１〜０．２３重量％の数字を得る。これは、ＺＤ６４７４の無水の形態の指標である。
【００２１】
ＺＤ６４７４の無水の形態は、ＣｕＫα照射を使用して測定した以下に示す２シータ値の少なくとも一つを与えることにおいて特徴づけられる：１５．０°および２１．４°。ＺＤ６４７４の無水の形態は、図２に示すようなＣｕＫαのＸ線粉末回折パターンを与えることにおいて特徴付けられる。１０個の最も顕著なピークを、表１に示す。
【００２２】
【表１】
【００２３】
動的水蒸気吸着（ＤＶＳ）分析を、本明細書中に以下に記載される方法にしたがって行った結果、ＺＤ６４７４の無水の形態は非吸湿性であることを示す（図３）。９５％の相対湿度において、ＺＤ６４７４の無水の形態は、０．６３重量％のみの水を吸収したことから、ＺＤ６４７４の水和された形態への変換は起こらなかったことが示唆される。したがって、ＺＤ６４７４の無水の形態は、ＤＶＳの時間尺度では動力学的に安定である。
【００２４】
医薬的に活性な化合物の別の安定した形態を同定することが望ましい。医薬的に活性な化合物の別の安定した形態、例えば別の安定した結晶の形態は、商業規模の製剤および加工において好都合である。例えば、安定な結晶の形態は、製剤工程における他の形態への変換について低い危険性を提供し、これは、最終製剤の特性の予測可能性を提供する。
【００２５】
本発明は、ＺＤ６４７４の無水の形態と異なる形態のような、そしてある種の環境において改良された固体状態の特性を有するＺＤ６４７４の別の形態の同定に関する。例えば、一つの側面において、本発明は、水性の系および／または高い湿度の環境において特に有用なＺＤ６４７４の別の形態の同定に関する。
【００２６】
ＺＤ６４７４の別の形態の一つの例は、ＺＤ６４７４の水和された形態である。ＷＯ０１／３２６５１において、そこに記載されている化合物が、例えば水和された形態のような非溶媒化された形態と同様、溶媒化された形態でも存在することができることを記述する。
【００２７】
ＷＯ０１／３２６５１において、その中に記載されている特別な化合物の特別な水和物が、予期されないおよび／または利益のある特性を保有するであろうことは、どこにも記述されていない。
【００２８】
我々は、ＺＤ６４７４の一水和物の形態が、周囲温度および湿度においてＺＤ６４７４の好都合に安定な結晶の形態であることをここで発見した。ＺＤ６４７４の結晶の一水和物の形態は、水性懸濁液製剤、および／または高湿度環境のような水性の環境下での使用に特に適している。更に、ＺＤ６４７４の結晶の一水和物の形態は、製造が簡単である。例えば、ＺＤ６４７４のこの形態は、約３０−４０℃の温度で、大量の脱水を伴わずに、ラージスケール（製剤中の流動層乾燥のような）で容易に乾燥させてもよく、それは、水和の危険性を伴わずに湿式顆粒化してもよく、そしてそれは、湿度の範囲で保存しよもよい。更に、ＺＤ６４７４の結晶の一水和物の調製方法は、特定の水溶性不純物の容易な除去も可能にする。
【００２９】
本発明によれば、ＺＤ６４７４一水和物が提供される。ＺＤ６４７４一水和物は、容易に結晶化し、高度に結晶性であり、そして非吸湿性である（ＤＶＳ測定による）。
結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物は、ＣｕＫα照射を使って測定された以下の２つのシータ値の少なくとも一つを与えることによって特徴付けられる：１０．８°および２１．０°。結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物は、実質的に図４に示すようなＸ線粉末回折パターンを与えることにおいて特徴付けられる。１０個の最も顕著なピークを、以下の表２に示す：
【００３０】
【表２】
【００３１】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、少なくとも一つの特異的ピークを約２シータ＝１０．８°で持つＸ線粉末回折パターンを有する。
【００３２】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、少なくとも一つの特異的ピークを約２シータ＝２１．０°で持つＸ線粉末回折パターンを有する。
【００３３】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、少なくとも二つの特異的ピークを約２シータ＝１０．８°および２１．０°で持つＸ線粉末回折パターンを有する。
【００３４】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、特異的ピークを、約２シータ＝１０．８、２１．０、１８．４、１１．９、１８．９、１８．１、２２．１、１１．４、２０．１および２４．０°で持つＸ線粉末回折パターンを有する。
【００３５】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、図４に示したＸ線粉末回折パターンと実質的に同一のＸ線粉末回折パターンを有する。
【００３６】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、少なくとも一つの特異的ピークを２シータ＝１０．８°±０．５°２シータに持つＸ線粉末回折パターンを有する。
【００３７】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、少なくとも一つの特異的ピークを２シータ＝２１．０°±０．５°２シータにで持つＸ線粉末回折パターンを有する。
【００３８】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、少なくとも二つの特異的ピークを２シータ＝１０．８°および２１．０°で持つＸ線粉末回折パターンを有し、ここにおいて、前記の値は、±０．５°２シータにあってよい。
【００３９】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、特異的ピークを２シータ＝１０．８、２１．０、１８．４、１１．９、１８．９、１８．１、２２．１、１１．４、２０．１および２４．０°に持つＸ線粉末回折パターンを有し、ここにおいて、前記の値は、±０．５°２シータにあってよい。
【００４０】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、少なくとも一つの特異的ピークを、２シータ＝１０．８°に持つＸ線粉末回折パターンを有する。
【００４１】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、少なくとも一つの特異的ピークを、２シータ＝２１．０°に持つＸ線粉末回折パターンを有する。
【００４２】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、少なくとも二つの特異的ピークを、２シータ＝１０．８°および２１．０°に持つＸ線粉末回折パターンを有する。
【００４３】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、特異的ピークを、２シータ＝１０．８、２１．０、１８．４、１１．９、１８．９、１８．１、２２．１、１１．４、２０．１および２４．０°に持つＸ線粉末回折パターンを有する。
【００４４】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、図４に示されたＸ線粉末回折パターンを有する。
結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物をＸ線粉末回折ピークで定義している前の段落において、ピークの正確な位置（即ち、引用された２シータの角の値（angle values）)を示すために、表現「約２シータ＝・・・で」の中で使用される、用語「約・・・で」は、絶対値として解釈されるべきではない。なぜなら、当業者によって認識されるものであるように、ある機械と別の機械の間で、ある試料と別の試料との間で、または使用された測定条件の僅かな変化の結果として、ピークの正確な位置は、僅かに変化するかもしれないからである。一つに態様において、約２シータ＝１０．８°は、２シータ＝１０．８±０．５°を、別の態様において、２シータ＝１０．８±０．２°を、そして更なる態様において、２シータ＝１０．８±０．１°を意味する。前の段落において、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が、図４に示したＸ線粉末回折パターンと、“実質的に”同一のＸ線粉末回折パターンを与えることも記述される。この文脈における用語“実質的に”の使用は、ある機械と別の機械の間で、ある試料と別の試料の間で、または使用される測定条件の僅かな変化の結果として、Ｘ線粉末回析パターンの２シータ角の値が僅かに変化するかもしれないことを示すことも意図されており、したがって、図に示されたピークの位置は、やはり絶対値として解釈されるべきではないことが認識されるべきである。
【００４５】
ＤＳＣ分析（詳細は本明細書中で以下に与えられる）を、ＺＤ６４７４一水和物に対して行った結果、５０℃〜１２０℃の間に開始温度を持つ脱水による大きく幅広な吸熱（ＺＤ６４７４の無水の形態を製造するための）、並びに２３０℃〜２４０℃の間に開始温度を持つＺＤ６４７４の無水の形態の溶融による大きく狭い吸熱を示す（図５）。
【００４６】
ＴＧＡ分析（詳細は本明細書中で以下に与えられる）を、ＺＤ６４７４一水和物に対して行った結果、６９℃〜１１１℃間で約３．７％の重量喪失を示し（図５）、これは、ＺＤ６４７４一水和物からの水和水の喪失分に相当する。ＴＧＡの温度の値が、ある機械と別の機械の間で、またはある試料と別の試料の間で僅かに変化してもよいものであり、したがって、引用された値が絶対値として解釈されるべきでないことが理解されるであろう。
【００４７】
カールフィッシャー分析（詳細は本明細書中で以下に与えられる）を、ＺＤ６４７４一水和物に対して行って、そして約３．９％の数字を得て、これは、全ての重量喪失が水の喪失によることを示唆する。当業者が認識するものであるように、ＺＤ６４７４一水和物中の水の重量パーセントは、３．６５％である。
【００４８】
動的水蒸気吸着（ＤＶＳ）分析（詳細は本明細書中で以下に与えられる）を、ＺＤ６４７４一水和物に対して行って、そしてＺＤ６４７４一水和物が非吸湿性であることが示される（図６）。ＤＶＳ分析は、ＺＤ６４７４一水和物が、２５℃および０％相対湿度における乾燥中に、ＺＤ６４７４の無水の形態に実質的に変換されないこと（５％より少ない）を示す。２５℃で０％相対湿度におけるＺＤ６４７４一水和物の保存における重量変化のパーセントのプロット（図７）は、一旦表面の水分が除去されると、重量喪失の速度が極端に遅くなることを示す。４０℃で０％相対湿度におけるＺＤ６４７４一水和物の保存における重量変化のパーセントのプロット（図８）は、この温度における、より速い重量喪失の速度を示しているが、この環境における水和された化合物としてなお驚くほど遅い。したがって、ＺＤ６４７４一水和物は、ＤＶＳの時間尺度において動力学的に安定である。
【００４９】
スラリーの実験を、本出願の実施例３に記載したように（そしてＺｈｕ，Ｈ．Ｊ．，Ｙｕｅｎ，Ｃ．，Ｇｒａｎｔ，Ｄ．Ｊ．Ｗ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，（１９９６）１３５（１，２）１５１−１６０中に記載されているように）、ＺＤ６４７４一水和物が最も安定な結晶の形態で存在する条件を同定するために行った。これらの実験は、２５℃において、ＺＤ６４７４の無水の形態が、相対湿度３０％以下で、熱力学的に安定な形態であることを示す。２５℃において、ＺＤ６４７４一水和物は、相対湿度４０％以上で、熱力学的に安定な形態である。したがって、２５℃および相対湿度５０％において、ＺＤ６４７４一水和物は最も安定した形態である。
【００５０】
本発明がＺＤ６４７４一水和物の結晶の形態に関する、と記述されている場合、結晶化度の程度は、都合よくは約６０％より大きく、更に好都合には約８０％より大きく、好ましくは約９０％より大きく、そして更に好ましくは約９５％より大きい。最も好ましい結晶化度の程度は、約９８％より大きい。
【００５１】
疑義の回避のために、用語“周囲条件”によって、我々は、周囲温度および湿度を意味する。用語“周囲温度”によって、我々は、１５〜３０℃の範囲の温度、特に約２５℃の温度を意味する。用語“周囲湿度”によって、我々は、約４５〜６０％の相対湿度を意味する。用語“相対湿度”によって、我々は、空気が飽和された場合に存在する水分の量に対する、大気中に存在する水分の量（％）を意味する。当業者によって認識されるものであるように、相対湿度は、水分含有量および温度の関数である。
【００５２】
ＺＤ６４７４一水和物の結晶の形態は、図４に示すＸ線粉末回折パターンと実質的に同一のＸ線粉末回折パターンを与え、そして表２に示す１０個の最も顕著なピーク（角度２シータ値）を実質的に有する。Ｘ線粉末回折パターンの２シータ値が、ある機械と別の機械の間で、または、ある試料と別の試料との間で僅かに変化してもよく、したがって引用された値が、絶対的と解釈されるべきではないことは理解されるであろう。
【００５３】
測定条件（使用する装置または機械のような）に依存して、一つまたはそれ以上の測定変動を有するＸ線粉末回折パターンが得られてもよいことは、知られている。特に、Ｘ線粉末回折パターンの強度が、測定条件（例えば好ましい配向）に依存して変動してもよいことが一般的に知られている。したがって、本発明のＺＤ６４７４一水和物の形態が、図４に示すＸ線粉末回折パターンと同一のＸ線粉末回折パターンを与える結晶に制約されず、そして図４に示すものと実質的に同一のＸ線粉末回折パターンを与えるいずれの結晶も、本発明の範囲内であることは理解されるべきである。Ｘ線粉末回折の技術分野に属する当業者は、Ｘ線粉末回折パターンの実質的な同一性を判断することが可能である。
【００５４】
Ｘ線粉末回折の技術分野に属する当業者は、ピークの相対強度が、例えば、試料の分析に影響を与え得る、３０ミクロンより大きい粒子および非統一性の縦横比によって影響され得ることを認識するであろう。当業者は、反射の位置が、回折計中に位置する試料の正確な高さおよび回折計のゼロ校正によって影響され得ることを更に認識するであろう。また、試料の表面の平面性も小さな影響力を有する。したがって、与えられた回折パターンのデータは、絶対値として解釈されるべきではない（Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｒ ＆ Ｓｎｙｄｅｒ，Ｒ．Ｌ．‘Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｘ−Ｒａｙ Ｐｏｗｄｅｒ Ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｒｙ’Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９６；Ｂｕｎｎ，Ｃ．Ｗ．（１９４８），Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ；Ｋｌｕｇ，Ｈ．Ｐ．＆ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｌ．Ｅ．（１９７４），Ｘ−Ｒａｙ Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）。
【００５５】
一般的に、Ｘ線粉末回折法の回折角の測定誤差は、±０．５° ２シータまたはそれより小さく、例えば±０．２° ２シータ或いは理想的には±０．１° ２シータであり、そして測定誤差のそのような程度は、図２および４のＸ線粉末回折パターンを考察する時、そして表１および２を解釈する時、に考慮されるべきである。更に、強度が、実験条件および試料調製（例えば好ましい配向）に依存して変動しうることは理解されるべきである。
【００５６】
疑義の回避のために、用語“ＺＤ６４７４遊離塩基”は、それぞれの及びあらゆる形態のＺＤ６４７４遊離塩基を指し、一方“ＺＤ６４７４無水物”は、ＺＤ６４７４遊離塩基の特定の無水の形態を指し、そして“ＺＤ６４７４一水和物”は、ＺＤ６４７４遊離塩基の特定の一水和物の形態を指す。
【００５７】
本発明の更なる側面によれば、医薬的に受容可能な賦形剤または担体と共同して、本明細書中で先に定義したＺＤ６４７４一水和物を含む医薬組成物が提供される。
組成物は、経口投与、（例えば錠剤、ロゼンジ、硬質または軟質カプセル、水性または油性懸濁液、乳液、分散性粉末または顆粒、シロップまたはエリキシルとして）、吸入による投与（例えば微細に分割された粉末または液体エアゾールとして）、通気による投与（例えば微細に分割された粉末として）、非経口注射（例えば静脈内、皮下、筋肉内、血管内または注入投与のための滅菌溶液、懸濁液或いは乳液として）、局所投与（例えばクリーム、軟膏、ゲル、或いは水性または油性溶液若しくは懸濁液として）、または直腸投与（例えば座薬として）のために適した形態であってもよい。好ましくは、ＺＤ６４７４一水和物は、経口的に投与される。一般的に、上記の組成物は、慣用的な賦形剤を使用した慣用的な方法で調製してもよい。
【００５８】
本発明の組成物は、好都合には単位剤形で与えられる。ＺＤ６４７４一水和物は、温血動物の身体面積１平方メートル当り１０〜５００ｍｇの範囲の単位投与で、例えばヒトにおいて約０．３〜１５ｍｇ／ｋｇで、通常、温血動物に投与されるであろう。単位薬量の範囲は、例えば、０．３〜１５ｍｇ／ｋｇ、例えば０．５〜５ｍｇ／ｋｇの範囲が想定され、そしてこれは、通常治療的に有効な投与量である。錠剤またはカプセルのような単位投与剤形は、通常例えば２５〜５００ｍｇの活性成分を含有すであろう。好ましくは、０．５〜５ｍｇ／ｋｇの範囲での日量が使用される。特定の疾病状態の治療的または予防的処置のために必要な投与量の規模は、治療される宿主、投与の経路および治療される病気の重度によって必然的に変化するであろう。したがって、いずれかの特定の患者を治療している医師が、最適投与量を決定してもよい。
【００５９】
本発明の更なる側面によれば、治療によるヒトまたは動物の身体の処置方法において使用するための、本明細書中で先に定義したＺＤ６４７４一水和物が提供される。
本発明の更なる特徴は、医薬として使用するための、本明細書中で先に定義したＺＤ６４７４一水和物であり、都合よくはヒトのような温血動物における抗血管新生および／または血管透過性の減少効果を産生するための医薬として使用するための、本明細書中で先に定義したＺＤ６４７４一水和物である。
【００６０】
したがって、本発明の更なる側面によれば、ヒトのような温血動物における抗血管新生および／または血管透過性の減少効果の産生において使用するための医薬の製造における、本明細書中で先に定義したＺＤ６４７４一水和物の使用が提供される。
【００６１】
本発明の更なる特徴によれば、ヒトのような温血動物における抗血管新生および／または血管透過性の減少効果を産生するための方法であって、このような治療を必要とする前記動物に、有効量の本明細書中で先に定義したＺＤ６４７４一水和物を投与することを含む方法が提供される。
【００６２】
ＺＤ６４７４一水和物は、抗血管新生および／または血管透過性減少剤であり、そして単独の療法として適用してもよいし、或いはＺＤ６４７４一水和物に加えて、一つ以上の他の物質および／または治療を含んでもよい。このような連合治療は、治療の個々の成分の同時、連続または別個投与によって達成してもよい。内科的腫瘍学の分野において、癌患者それぞれを治療するために、異なった治療形態の組合せを使用することは、通常の実務である。内科的腫瘍学において、このような連合治療のＺＤ６４７４一水和物以外の他の要素（諸要素）は、外科手術、放射線療法または化学療法であってもよい。このような化学療法は、治療剤の以下の三つの主要なカテゴリーを含んでもよい：
（ｉ）血管内皮増殖因子の影響を阻害するもののような、他の抗血管新生剤（例えば抗血管内皮細胞増殖因子抗体ベバシズマブ［アバスチンＴＭ］、および本明細書中で先に定義したものとは異なった機構によって働くもの（例えばリノマイド、インテグリンαｖβ３機能の阻害剤およびアンジオスタチン、ラゾキシン、サリドマイド）、および血管標的剤（例えばリン酸コンブレタスタチン、並びに国際特許出願ＷＯ００／４０５２９、ＷＯ００／４１６６９、ＷＯ０１／９２２２４、ＷＯ０２／０４４３４およびＷＯ０２／０８２１３中に開示される化合物、並びにその文書の全ての開示が本明細書中に参考文献として援用される国際特許出願ＷＯ９９／０２１６６中に記載される血管損傷剤（例えばＮ−アセチルコルチノール（ａｃｅｔｙｌｃｏｌｃｈｉｎｏｌ）−Ｏ−リン酸））を含む）；
（ｉｉ）抗エストロゲン剤（例えばタモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェンおよびヨードキシフェン）；エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（例えばフルベストラント）、プロゲストーゲン（例えば酢酸メゲストロール）、アロマターゼ阻害剤（例えばアナストロゾール、レトロゾール、ボラゾールおよびエキセメスタン）、抗プロゲストーゲン剤、抗アンドロゲン剤（例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、酢酸シプロテロン）、ＬＨＲＨアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば酢酸ゴセレリン、リュープロリド、ブセレリン）、５α−レダクターゼの阻害剤（例えばフィナステリド）のような細胞増殖抑制剤、抗浸潤剤（例えばマリマスタットのようなメタロプロテイナーゼ阻害剤およびウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体機能の阻害剤）、並びに増殖因子機能の阻害剤（このような増殖因子は、例えば血小板由来増殖因子および肝細胞増殖因子を含む）、このような阻害剤は、増殖因子抗体、増殖因子受容体抗体（例えば抗ｅｒｂｂ２抗体トラスツズマブ［ハーセプチンＴＭ］および抗ｅｒｂｂ１抗体セツキシマブ［Ｃ２２５］）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば上皮細胞増殖因子ファミリーの阻害剤（例えば、Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ゲフィチニブ、ＺＤ１８３９）、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミン（エルロチニブ、ＯＳＩ−７７４）および６−アクリルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ＣＩ１０３３）のようなＥＧＦＲファミリーのチロシンキナーゼ阻害剤）およびセリン／トレオニンキナーゼ阻害剤）；並びに
（ｉｉｉ）代謝拮抗剤（例えばメトトレキセートのような抗葉酸拮抗剤、５−フルオロウラシルのようなフルオロピリミジン、テガフール、プリン、およびアデノシン類似体、シトシンアラビノシド）；抗腫瘍性抗生物質（例えばアドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシンおよびイダルビシンのようなアントラサイクリン、マイトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシン、およびミトラマイシン）；白金誘導体（例えばシスプラチン、カルボプラチン）；アルキル化剤（例えばナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロランブシル、ブスルファン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソ尿素、チオテパ）；抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビンのようなビンカアルカロイド、並びにタキソール、タキソテールのようなタキソイド）；トポイソメラーゼ阻害剤（例えばエトポシドおよびテニポシドのようなエピポドフィロトキシン、アムサクリン、トポテカン、カンプトテシン、そして更にイリノテカン）；更に酵素（例えばアスパラギナーゼ）；並びにチミジル酸シンターゼ阻害剤（例えばラルチトレキセド）のような、内科的腫瘍学において使用されるような抗増殖性／抗悪性腫瘍剤およびこれらの組合せ；
を包含してもよく、そして化学療法剤の更なる種類は：
（ｉｖ）生物学的応答調節因子（例えばインターフェロン）；
（ｖ）抗体（例えばエドレコロマブ）；
（ｖｉ）アンチセンス療法、ＩＳＩＳ２５０３、抗ｒａｓアンチセンスのような上記に収載した標的に向けられるもの；
（ｖｉｉ）例えば異常ｐ５３或いは異常ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２のような異常遺伝子を置換えるアプローチ、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼまたは細菌性ニトロレダクターゼ酵素を使用するもののようなＧＤＥＰＴ（遺伝子特異的酵素プロドラッグ療法）アプローチ、および多剤耐性遺伝子療法のような化学療法または放射線療法に対する患者の許容性を増加させるアプローチを含む遺伝子療法的アプローチ；並びに
（ｖｉｉｉ）例えばインターロイキン２、インターロイキン４または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子のようなサイトカインによるトランスフェクションのような患者の腫瘍細胞の免疫原性を増加するためのｅｘ−ｖｉｖｏおよびｉｎ−ｖｉｖｏアプローチ、Ｔ細胞アネルギーを減少させるアプローチ、サイトカインでトランスフェクトされた樹状細胞のようなトランスフェクトされた免疫細胞を使用するアプローチ、サイトカインでトランスフェクトされた腫瘍細胞系を使用するアプローチおよび抗イディオタイプ抗体を使用するアプローチを含む免疫療法アプローチ；
を含む。
【００６３】
例えば、このような連合治療は、本明細書中で先に定義したＺＤ６４７４一水和物およびＮ−アセチルコルチノール−Ｏ−リン酸（ＷＯ９９／０２１６６の実施例１）のような、ＷＯ９９／０２１６６に記載されている血管標的剤の、同時、連続または別個投与によって達成してもよい。
【００６４】
ＷＯ０１／７４３６０から、抗血管新生剤を、抗高血圧剤と組合せることができることが知られる。本発明のＺＤ６４７４一水和物も、更に抗高血圧剤と組合わせて投与することができる。抗高血圧剤は、血圧を低下させる薬剤である（例えば、本明細書中に参照により援用されるＷＯ０１／７４３６０を参照されたい）。
【００６５】
したがって、本発明によれば、有効な量の本明細書中で先に定義したＺＤ６４７４一水和物および抗高血圧剤の組合せの、ヒトのような温血動物への投与を含む、血管新生を伴う疾病状態の治療の方法が提供される。
【００６６】
本発明の更なる特徴によれば、ヒトのような温血動物における、血管新生を伴う疾病状態の治療のための医薬の製造において使用するための、本明細書中で先に定義したＺＤ６４７４一水和物および抗高血圧剤の組合せの使用が提供される。
【００６７】
本発明の更なる特徴によれば、ヒトのような温血動物における、血管新生を伴う疾病状態の治療のための、本明細書中で先に定義したＺＤ６４７４一水和物および抗高血圧剤を含む医薬組成物が提供される。
【００６８】
本発明の更なる側面によれば、ヒトのような温血動物における、抗血管新生および／または血管透過性減少効果を産生するための方法が提供され、これは、有効な量の本明細書中で先に定義したＺＤ６４７４一水和物および抗高血圧剤を、前記の動物に投与することを含む。
【００６９】
本発明の更なる側面によれば、ヒトのような温血動物における、抗血管新生および／または血管透過性減少効果を産生するための医薬の製造のための、本明細書中で先に定義したＺＤ６４７４一水和物および抗高血圧剤の組合せの使用が提供される。
【００７０】
好ましい抗高血圧剤は、カルシウムチャネルブロッカー、アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥ阻害剤）、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト（Ａ−ＩＩアンタゴニスト）、利尿剤、ベータ−アドレナリン受容体ブロッカー（β−ブロッカー）、血管拡張剤およびアルファ−アドレナリン受容体ブロッカー（α−ブロッカー）である。特別な抗高血圧剤は、カルシウムチャネルブロッカー、アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥ阻害剤）、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト（Ａ−ＩＩアンタゴニスト）およびベータ−アドレナリン受容体ブロッカー（β−ブロッカー）であり、特にカルシウムチャネルブロッカーである。
【００７１】
先に記述したように、ＺＤ６４７４一水和物は、その抗血管新生および／または血管透過性低下効果のために興味あるものである。ＺＤ６４７４一水和物は、癌、糖尿病、乾癬、関節リウマチ、カポジ肉腫、血管腫、リンパ浮腫、急性および慢性腎症、アテローム、動脈再狭窄、自己免疫性疾病、急性炎症、過剰な瘢痕形成および癒着、子宮内膜症、機能障害性子宮出血、および加齢性黄斑変性症を含む網膜血管の増殖に伴う眼病を含む広い範囲の疾病状態において有用であることが予測される。癌は、いずれの組織に影響する場合があり、そして白血病、多発性骨髄腫およびリンパ腫を含む。特に本発明のこのような化合物は、例えば結腸、乳房、前立腺、肺および皮膚の原発性および再発性固形腫瘍の増殖を、好都合に遅延することが予測される。更に特に、この本発明のような化合物は、白血病、多発性骨髄腫およびリンパ腫を含むＶＥＧＦに伴ういずれの形態の癌を、そして更に例えば、ＶＥＧＦに伴う原発性および再発性固形腫瘍、特に、例えば結腸、乳房、前立腺、肺、脳 外陰部および皮膚のある種の腫瘍を含むその増殖並びに伝播がＶＥＧＦに有意に依存する腫瘍の増殖を、阻害することが予測される。
【００７２】
その治療薬における使用に加えて、本明細書において定義されたＺＤ６４７４一水和物は、更に新しい治療剤のための探求の一部としての、ネコ、イヌ、ウサギ、サル、ラットおよびマウスのような実験室動物におけるＶＥＧＦ受容体型チロシンキナーゼ活性の阻害剤の効果の評価のためのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの試験系の開発および標準化における薬理学的道具としても有用である。
【００７３】
ＷＯ０１／３２６５１に記載され、そしてＺＤ６４７４を試験するために使用されたアッセイは、以下のとおりである：
（ａ）Ｉｎ ｖｉｔｒｏの受容体型チロシンキナーゼ阻害試験
このアッセイは、試験化合物のチロシンキナーゼ活性を阻害する能力を決定する。ＶＥＧＦまたは上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）受容体の細胞質領域をコードするＤＮＡは、全遺伝子合成（Ｅｄｗａｒｄｓ Ｍ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂ ５（３），１９−２５，１９８７）またはクローニングによって得ることができる。次いでこれらを、適した発現系中で発現して、チロシンキナーゼ活性を持つポリペプチドを得ることができる。例えば、昆虫細胞中の組換えタンパク質の発現によって得られたＶＥＧＦおよびＥＧＦ受容体細胞質領域は、本来のチロシンキナーゼ活性を示すことが見出された。ＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ５１６０２）の場合、Ｓｈｉｂｕｙａら（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９０，５： ５１９−５２４）によって記載された、メチオニン７８３に始まり終結コドンを含む細胞質領域の殆んどをコードする１．７ｋｂのＤＮＡ断片を、ｃＤＮＡから単離し、そしてバキュロウイルストランスプラントベクター（例えばｐＡｃＹＭ１（Ｔｈｅ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ，Ｌ．Ａ．Ｋｉｎｇ ａｎｄ Ｒ．Ｄ．Ｐｏｓｓｅｅ，Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，１９９２を参照されたい）またはｐＡｃ３６０或いはｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能））にクローンした。この組換えコンストラクトを、ウイルスＤＮＡ（例えばＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ）と共に昆虫細胞（例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ２１（Ｓｆ２１））中にコトランスフェクションして、組換えバキュロウイルスを調製した。（組換えＤＮＡ分子の構築のための方法並びに組替えバキュロウイルスの調製および使用の詳細は、標準的なテキスト、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ，１９９２，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ中に見出すことができる）。アッセイにおいて使用するための他のチロシンキナーゼに対しては、メチオニン８０６（ＫＤＲ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｌ０４９４７）およびメチオニン６６８（ＥＧＦ受容体、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ００５８８）から出発する細胞質断片をクローンし、そして同様な方法で発現させることができる。
【００７４】
ｃＦｌｔチロシンキナーゼ活性の発現のために、Ｓｆ２１細胞を、プラーク的に純粋なｃＦｌｔ組換えウイルスで、感染多重度３で感染させ、そして４８時間後に回収した。回収した細胞を、氷冷のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１０ｍＭのｐＨ７．４のリン酸ナトリウム、１３８ｍＭの塩化ナトリウム、２．７ｍＭの塩化カリウム）で洗浄し、次いで氷冷のＨＮＴＧ／ＰＭＳＦ（２０ｍＭのｐＨ７．５のＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１０％ｖ／ｖのグリセロール、１％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、１．５ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのエチレングリコール−ビス（βアミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）；ＰＭＳＦは、新しく調製したメタノール中の１００ｍＭの溶液から使用の直前に加えた）中に、１千万の細胞当り１ｍｌのＨＮＴＧ／ＰＭＳＦを使用して再懸濁した。懸濁液を、１０分間１３，０００ｒｐｍで４℃で遠心し、上清（ストック酵素）を除去し、そして小分けして−７０℃で保存した。それぞれの新しいバッチのストック酵素を、酵素希釈液（１００ｍＭのｐＨ７．４のＨｅｐｅｓ、０．２ｍＭのオルトバナデートナトリウム、０．１％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、０．２ｍＭのジチオトレイトール）で希釈することによってアッセイ中で滴定した。典型的なバッチのために、ストック酵素を、その１に対して酵素希釈液２０００で希釈し、そして５０μｌの希釈酵素液をそれぞれのアッセイのウェルで使用した。
【００７５】
基質溶液のストックを、チロシンを含有するランダムコポリマー、例えばポリ（Ｇｌｕ，Ａｌａ，Ｔｙｒ）６：３：１（Ｓｉｇｍａ Ｐ３８９９）から調製し、ＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍｌのストックとして−２０℃で保存し、そしてプレート被覆のためにその１に対してＰＢＳ ５００で希釈した。
【００７６】
アッセイの１日前、１００μｌの希釈された基質溶液を、アッセイプレート（Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェル免疫プレート）の全てのウェルに分注し、これを密封し、そして４℃で一晩放置した。
【００７７】
アッセイの日、基質溶液を廃棄し、そしてアッセイプレートのウェルを、ＰＢＳＴ（０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ）で１回、そして５０ｍＭのｐＨ７．４のＨｅｐｅｓで１回洗浄した。
【００７８】
試験化合物を１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈し、そして２５μｌの希釈された化合物を、洗浄されたアッセイプレートのウェルに移した。“全”対照ウェルは、化合物の代わりに１０％のＤＭＳＯを含有していた。２５マイクロリットルの、８μＭのアデノシン−５’−三リン酸（ＡＴＰ）を含有する４０ｍＭの塩化マンガン（ＩＩ）を、ＡＴＰを含まない塩化マンガン（ＩＩ）を含有する“ブランク”対照ウェルを除く全ての試験ウェルに加えた。反応を開始させるために、５０μｌの新しく希釈した酵素をそれぞれのウェルに加え、そしてプレートを室温で２０分間インキュベートした。次いで液体を廃棄し、そしてウェルを２回ＰＢＳＴで洗浄した。０．５％ｗ／ｖのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳＴで１対６０００に希釈された、１００マイクロリットルのマウスＩｇＧ抗ホスホチロシン抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．製品０５−３２１）を、それぞれのウェルに加え、そしてプレートを１時間室温でインキュベートしてから、液体を廃棄し、そしてウェルを２回ＰＢＳＴで洗浄した。０．５重量／容量％のＢＳＡを含有するＰＢＳＴで１対５００に希釈された、１００マイクロリットルの西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に連結したヒツジ抗マウスＩｇ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ製品ＮＸＡ ９３１）を加え、そしてプレートを１時間室温でインキュベートしてから、液体を廃棄し、そしてウェルを２回ＰＢＳＴで洗浄した。５０ｍｌの新しく調製した５０ｍＭのｐＨ５．０のリン酸−クエン酸緩衝液＋０．０３％の過ホウ酸ナトリウム（１００ｍｌの蒸留水当り、１個の、過ホウ酸ナトリウムを伴うリン酸−クエン酸緩衝液（ＰＣＳＢ）のカプセル（Ｓｉｇｍａ Ｐ４９２２）で製造）中の、１個の５０ｍｇのＡＢＴＳ錠剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ １２０４ ５２１）を使用して、新しく調製した１００マイクロリットルの２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）溶液を、それぞれのウェルに加えた。次いで、プレート読取り分光光度計を使用して４０５ｎｍで測定したときの“全”対照ウェルの光学密度値が約１．０となるまで、プレートを２０−６０分間室温でインキュベートした。“ブランク”（ＡＴＰなし）および“全”（化合物なし）対照の値を使用して、酵素活性を５０％阻害する試験化合物の希釈範囲を決定した。
【００７９】
（ｂ）Ｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＵＶＥＣ増殖アッセイ
このアッセイは、試験化合物の、増殖因子により刺激されたヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖を阻害する能力を決定する。
【００８０】
ＨＵＶＥＣ細胞を、ＭＣＤＢ １３１（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）＋７．５％ｖ／ｖのウシ胎児血清（ＦＣＳ）中で単離し、そしてＭＣＤＢ １３１＋２％ｖ／ｖ ＦＣＳ＋３μｇ／ｍｌのヘパリン＋１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン中、１０００細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに入れた（２〜８継代で）。最低４時間後、これに適当な増殖因子（即ち３ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、３ｎｇ／ｍｌのＥＧＦまたは０．３ｎｇ／ｍｌのβ−ＦＧＦ）および化合物を投与した。次いで培養物を、４日間３７℃で７．５％の二酸化炭素でインキュベートした。４日目に、培養物を、１μＣｉ／ウェルのトリチウム化したチミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ製品ＴＲＡ ６１）でパルス標識し、そして４時間インキュベートした。細胞を９６ウェルプレート回収器（Ｔｏｍｔｅｋ）を使用して回収し、そして次いでトリチウムの組込みをベータプレートカウンターでアッセイした。ｃｐｍで表示される放射能の細胞への組込みを使用して、化合物による増殖因子により刺激された細胞増殖の阻害を測定した。
【００８１】
（ｃ）Ｉｎ ｖｉｖｏの固形腫瘍疾病モデル
この試験は、固形腫瘍の成長を阻害する化合物の能力を測定する。
５０％（ｖ／ｖ）マトリゲルを含む無血清培養培地１００μｌ中の１×１０６のＣａＬｕ−６細胞／マウスの皮下注射によって、ＣａＬｕ−６異種移植腫瘍を、メスの胸腺欠損Swiss ｎｕ／ｎｕマウスの側腹部に確立した。細胞移植の１０日後、比較可能な平均体積のグループを達成するように、マウスを８−１０匹のグループに割り当てた。腫瘍をノギスを使用して測定し、そして体積を：（ｌ×ｗ）×√（ｌ×ｗ）×（π／６）として計算した。ここで、ｌは、最長直径であり、そしてｗは、最長直径と垂直な直径である。試験化合物を、最低２１日毎日１回経口投与し、そして対照マウスには、化合物の希釈液を投与した。腫瘍を週２回測定した。成長阻害のレベルを、処理グループに対する対照グループの平均腫瘍体積の比較によって計算し、そして統計的有意性をスチューデントｔ−検定および／またはＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定を使用して決定した。化合物処理の阻害効果は、ｐ＜０．０５である場合に、有意と考えた。
【００８２】
本発明の化合物の毒物プロファイルは、例えば、本明細書中で以下に記載されるようなラットの１４日の研究を使用して評価することができる。
（ｄ）ラットにおける１４日の毒性試験
この試験は、大腿骨遠位端および脛骨近位端の大腿骨骨端成長板における肥大化領域の増加における化合物の活性を測定し、そして他の組織の病理組織学的変化の評価を可能にする。
【００８３】
血管新生は、長骨の伸長における軟骨内骨化に必須の現象であり、そして成長板の血管浸潤は、肥大化軟骨細胞によるＶＥＧＦ産生に依存することが示唆されている。肥大化軟骨細胞領域の拡大および血管新生の阻害が、例えば（ｉ）マウス中の可溶性ＶＥＧＦ受容体キメラタンパク質（Ｆｌｔ−（１−３）−ＩｇＧ）（Ｇｅｒｂｅｒ，Ｈ−Ｐ．，Ｖｕ，Ｔ．Ｈ．，Ｒｙａｎ，Ａ．Ｍ．，Ｋｏｗａｌｓｋｉ，Ｊ．，Ｗｅｒｂ，Ｚ．ａｎｄ Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．ＶＥＧＦ ｃｏｕｐｌｅｓ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ，ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｄｕｒｉｎｇ ｅｎｄｏｃｈｏｎｄｒａｌ ｂｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，５：６２３−６２８，１９９９）および（ｉｉ）カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓ ｍｏｎｋｙ）の組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナルＩｇＧ１抗体（Ｒｙａｎ，Ａ．Ｍ．，Ｅｐｐｌｅｒ，Ｄ．Ｂ．，Ｈａｇｌｅｒ，Ｋ．Ｅ．，Ｂｒｕｎｅｒ，Ｒ．Ｈ．，Ｔｈｏｍｆｏｒｄ，Ｐ．Ｊ．，Ｈａｌｌ，Ｒ．Ｌ．，Ｓｈｏｐｐ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ Ｏ’Ｎｉｅｌｌ，Ｃ．Ａ．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓａｆｅｔｙ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｈｕＭＡｂＶＥＧＦ，ａｎ ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｈｕｍａｎｉｓｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｔｏｘ．Ｐａｔｈ．，２７：７８−８６，１９９９）のようなＶＥＧＦを特異的に捕捉する薬剤による処理の後に証明されている。
【００８４】
したがって、ＶＥＧＦ受容体型チロシンキナーゼ活性の阻害剤は、更に軟骨の血管透過も阻害し、そして成長中の動物の大腿遠位および脛骨近位端の大腿骨骨端成長板における肥大化領域を増加するはずである。
【００８５】
化合物は、最初、脱イオン水中のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレートの１％（ｖ／ｖ）溶液中、４℃で一晩（少なくとも１５時間）ボールミルによる懸濁によって調合した。化合物を、投与直前の撹拌によって再懸濁した。Ｙｏｕｎｇ Ａｌｄｅｒｌｅｙ Ｐａｒｋラット（Ｗｉｓｔａｒ由来、体重１３５−１５０ｇ、生後４〜８週、グループ当り５−６匹）に、化合物（０．２５ｍｌ／１００ｇ体重で）またはベヒクルを、一日一回、連続１４日間強制経口によって投与した。１５日目に、ラットを、増加する濃度の二酸化炭素を使用して人道的に終結させ、そして死後処理を行った。大腿骨−脛骨関節を含む範囲の組織を収集し、そして標準的な組織学的技術によって加工して、パラフィンワックス切片を製造した。組織学的切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、そして光学顕微鏡によって組織病理学の検査を行った。大腿遠位および脛骨近位端の大腿骨骨端成長板面積を、大腿骨および脛骨の切片において形態計測的画像分析によって測定した。肥大化の領域の増加を、処理グループに対する対照グループの平均骨端成長板面積の比較によって決定し、そして統計的有意性を、片側スチューデントｔ検定を使用して決定した。化合物処理の阻害効果は、ｐ＜０．０５である場合に、有意であると考えた。
【００８６】
ＷＯ０１／３２６５１中に開示されているように、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）によって試験されたＺＤ６４７４（ＷＯ０１／３２６５１の実施例２に記載されている方法によって調製）は、以下の結果：
（ａ）１．６μＭのＦｌｔ−ＩＣ５０
０．０４μＭのＫＤＲ−ＩＣ５０
０．５μＭのＥＧＦＲ−ＩＣ５０
（ｂ）０．０６のＶＥＧＦ−ＩＣ５０
０．１７μＭのＥＧＦ−ＩＣ５０
＞３μＭの基底−ＩＣ５０；
（ｃ）５０ｍｇ／ｋｇにおける腫瘍成長の７８％阻害；ｐ＜０．００１（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定）；
（ｄ）メスのラットにおける１００ｍｇ／ｋｇ／日における骨端増殖板肥大化の７５％増加；ｐ＜０．００１（片側スチューデントｔ検定）；
を与えた。
【００８７】
本明細書中で先に定義したＺＤ６４７４一水和物は、化学的に関連する化合物の調製に適用可能であることが知られているいずれの方法によって調製してもよい。このような方法は、本発明の更なる特徴として提供され、そして本明細書中で以下に記載される。必要な出発物質は、有機化学の標準的な方法によって得てもよい。ＺＤ６４７４の無水の形態は、ＷＯ０１／３２６５１に記載されている方法のいずれによって調製してもよく、特にＷＯ０１／３２６５１の実施例２ｂおよび２ｃを参照されたい。別の方法として、必要な出発物質は、有機化学者にとって通常の技術の範囲内である、例示されたものと類似の方法によって得ることが可能である。
【００８８】
以下の方法は、本発明の更なる特徴を構成する。
ＺＤ６４７４一水和物の合成
（ａ）このような方法は、本発明の更なる側面を提供し、そして例えば：
（ｉ）ＺＤ６４７４遊離塩基を水性有機溶媒混合物中に溶解して、溶液を形成し；
（ｉｉ）自発的結晶化が起こることを可能にし；そして
（ｉｉｉ）このようにして形成された結晶の固体を単離すること；
の工程を含む。
【００８９】
（ｂ）別のこのような方法は、本発明の更なる側面を提供し、そして例えば：
（ｉ）ＺＤ６４７４遊離塩基を水性有機溶媒混合物中に溶解して、溶液を形成し；
（ｉｉ）ＺＤ６４７４一水和物の種結晶を加えて、ＺＤ６４７４一水和物の結晶化を開始させ；そして
（ｉｉｉ）このようにして形成された結晶の固体を単離すること；
の工程を含む。
【００９０】
上記の（ａ）および（ｂ）の（ｉ）の部分のために、使用される有機溶媒は、いずれの非溶媒和溶媒でもよい。用語“非溶媒和溶媒”によって、我々は、ＺＤ６４７４と結晶溶媒和物を形成しない溶媒を意味する。更に具体的には、有機溶媒は、約０．４〜１．０、特に約０．５〜０．９５の水分活性を与えるような量の水を含む。用語“水分活性”によって、我々は、基質が、特定の相対湿度における周囲の大気と平衡にある場合に存在量の少数としての、基質（例えば溶媒）中の利用可能な水を意味する。言い換えれば、基質の周囲の７０％の平衡相対湿度は、基質が、０．７０の水分活性を有することを意味する。例えば、上記の（ａ）および（ｂ）の（ｉ）の部分に関して、有機溶媒は、テトラヒドロフランのようなエーテルでもよい。特に、テトラヒドロフランは、５〜１０容量％、特に１０％の水を含有して、水性有機溶媒混合物を提供してもよい。言い換えれば、混合物は、９５〜９０容量％、特に９０％のテトラヒドロフラン、および５〜１０容量％、特に１０％の水を含有してもよい。
【００９１】
（ａ）および（ｂ）の（ｉ）の部分のために、混合物を、必要な場合、溶解が起こるまで加熱還流してもよい。別の方法として、混合物を、実質的に全ての固体物質の溶解が起こることを条件として、例えば溶媒混合物の還流温度より低い温度で加熱してもよい。少量の不溶性物質を、温めた混合物の濾過によって除去してもよいことは、認識されるものであろう。
【００９２】
上記の（ａ）および（ｂ）において、そのようにして形成された結晶の固体は、いずれの慣用的な方法、例えば濾過によって単離してもよい。次いで単離された結晶の固体は、乾燥させてもよい。例えば、結晶の固体を加湿せずに乾燥する場合、適した乾燥温度は、約２０〜３０℃、特に約２５℃である。結晶の固体が加湿を伴って乾燥される場合、乾燥温度は、約３０〜５０℃、特に約４０℃である。
【００９３】
本発明は、本明細書中で以下に、次の限定されない実施例、データおよび図によって例示され、ここでは、他に記述しない限り：−
（ｉ）エバポレーションは、真空中でロータリーエバポレーターによって行い、そしてワークアップ手順は、乾燥剤のような残留固体の濾過による除去後に行った；
（ｉｉ）収率は、例示のみのために与えられ、そして必ずしも達成し得る最大値ではない；
（ｉｉｉ）融点は、未補正であり、そしてＭｅｔｔｌｅｒ ＤＳＣ８２０ｅを使用して決定した；
（ｉｖ）最終生成物の構造は、核（一般的にプロトン）磁気共鳴（ＮＭＲ）および質量スペクトル技術によって確認した；プロトン磁気共鳴の化学シフト値は、デルタスケールで測定され、そしてピーク多重度は、次のように示される：ｓ,シングレット；ｄ,ダブレット；ｔ,トリプレット；ｍ,マルチプレット；ｂｒ,ブロード；ｑ,カルテット；ｑｕｉｎ,クインテット；全ての試料を、示した溶媒中でＢｒｕｋｅｒ ＤＰＸ４００ＭＨｚで、３００Ｋで、１６スキャン、１０秒のパルス繰返し時間で行った；
（ｖ）中間体は、一般的に完全には特徴づけされず、そして純度は、ＮＭＲ分析によって評価した；そして
（ｖｉ）以下の略語：
ＲＨ 相対湿度
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＩＰＡ イソプロパノール
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＤＳＣ 示差走査熱量測定法
ＴＧＡ 熱重量分析
ｖ／ｖ 容量／容量比
ｗ／ｗ 重量／重量比
を使用した。
【００９４】
実施例１：ＷＯ０１／３２６５１の実施例２ｃのＺＤ６４７４遊離塩基の単離工程の繰返し
上記で議論したように、ＷＯ０１／３２６５１の実施例２ｃにおいて、ＺＤ６４７４遊離塩基は、固体として単離されている。ＷＯ０１／３２６５１の実施例２ｃにおいて、ＺＤ６４７４の塩酸塩は、塩酸塩を塩化メチレン中に懸濁し、そして懸濁液を飽和水性炭酸水素ナトリウムで洗浄して、塩化メチレン中にＺＤ６４７４遊離塩基の溶液を得ることによってＺＤ６４７４遊離塩基に変換されている。次いでＺＤ６４７４遊離塩基の塩化メチレン中の溶液を、硫酸マグネシウムを使用して乾燥し、そして揮発性物質をエバポレーションによって除去している。
【００９５】
本出願のこの実施例において、ＷＯ０１／３２６５１の実施例２ｃの単離工程を、ＺＤ６４７４遊離塩基の塩化メチレン中の溶液（水洗される）が得られた段階から繰返した。当業者が認識するものであるように、ＺＤ６４７４遊離塩基の塩化メチレン中の溶液を調製するための単離工程に先だって使用された工程は、特定の単離工程によって得られるＺＤ６４７４の形態と無関係である。更に、いずれの中和工程（諸工程）も、得られるＺＤ６４７４の形態に影響しない。
【００９６】
ＺＤ６４７４（２５０．５ｍｇ）の試料を、Ｗｈｅａｔｏｎの使い捨てガラス製シンチレーションバイアル中に入れ、そしてジクロロメタン（１０ｍｌ）を加えた。バイアルに蓋をし、そして混合物を１０分間穏やかに回転させて、固体を溶解した。次いで水（５ｍｌ）を溶液に加え、そして混合物を３０秒間激しく振盪した。混合物を２分間静置させ、そして次いでジクロロメタン層をガラス製ピペットで除去し、そして別のガラス製シンチレーションバイアルに入れた。硫酸マグネシウムを溶液に加え、そして混合物を回転させて、固体を十分に分散させた。固体がもはや一緒に凝集せず、掻き回すことによって微細な分散物が形成されるまで、硫酸マグネシウムの添加を継続した。混合物を一晩静置した。次いで硫酸マグネシウムを濾過によって除去し、そしてジクロロメタン（１ｍｌ）で洗浄した。濾液および洗浄液をあわせ、そしてエバポレーションして、微細な白色の結晶の固体を得た。次いでこの物質をＸＲＰＤによって（本明細書中で以下に記載される方法によって）分析した。ＸＲＰＤの波形（図９）は、物質がＺＤ６４７４の無水の形態であることを示す（図２参照）。当業者が認識するように、ピークの高さのいずれの差も、好ましい結晶配向によるものである。
【００９７】
実施例２：ＺＤ６４７４無水物の調製
ＺＤ６４７４遊離塩基を、ＷＯ０１／３２６５１の実施例２ｂに記載されている方法によって調製した。ＺＤ６４７４遊離塩基（１０ｇ）を、テトラヒドロフラン（５０ｍｌ）、水（２５ｍｌ）および酢酸ｎ−ブチル（４０ｍｌ）中に懸濁し、そして懸濁物を加熱還流して、溶液を得た。水相を分離し、そして有機相を濾過し、そしてテトラヒドロフラン（５ｍｌ）で洗浄した。酢酸ｎ−ブチル（６０ｍｌ）を加え、そして混合物を、１０６℃の内容物温度が達成されるまで常圧で蒸留した。得られたＺＤ６４７４のスラリーを冷却し、そして固体を濾過によって単離し、酢酸エチル（２０ｍｌ）で洗浄し、そして乾燥させて、ＺＤ６４７４無水物（９．２ｇ、９２％）を得た；ＮＭＲスペクトル（ピリジン−ｄ５）１．４９（２Ｈ，ｍ），１．７５−１．９０（５Ｈ，ｍ），２．１５（３Ｈ，ｓ），２．７６（２Ｈ，ｍ），３．６３（３Ｈ，ｓ），３．９７（２Ｈ，ｄ），７．３８（１Ｈ，ｄｄｄ），７．４９（１Ｈ，ｄｄ），７．６４（１Ｈ，ｓ），７．８８（１Ｈ，ｔ），７．８９（１Ｈ，ｓ），９．０１（１Ｈ，ｓ），１０．３７（１Ｈ，ｓ）；質量スペクトル ＭＨ＋ ４７５。
【００９８】
実施例３：ＺＤ６４７４の異なった相対湿度において最も適した形態を探求するための特定の水分活性における水性イソプロパノール中のスラリー実験
ＺＤ６４７４無水物（５０ｍｇ）およびＺＤ６４７４一水和物（５０ｍｇ）を、０．３、０．４および０．５の水分活性（それぞれ３０％相対湿度、４０％相対湿度および５０％相対湿度に対応）を有する異なった比のイソプロパノール／水中で、２４時間かけて２５℃でスラリー化した。次いで得られた物質を濾過して取出し、そして空気乾燥させた。これらの実験は、２５℃において、ＺＤ６４７４無水物は、≦３０％相対湿度において熱力学的に安定形態であり、そしてＺＤ６４７４一水和物は、≧４０％相対湿度において熱力学的に安定な形態であることを示した。
【００９９】
実施例４：ＺＤ６４７４一水和物の調製
ＺＤ６４７４遊離塩基を、ＷＯ０１／３２６５１の実施例２ｂに記載されている方法によって調製した。ＺＤ６４７４遊離塩基（１０．０６ｇ）を、水性テトラヒドロフラン（９０％テトラヒドロフラン／１０％水、ｖ／ｖ）に周囲温度で加えた。混合物を撹拌し、そして全ての固体が溶解するまで４０℃に温めた。更なるＺＤ６４７４遊離塩基（１．４４ｇ）を混合物に４２℃で加え、そして混合物を２０分間撹拌して、透明な溶液を得た。溶液を５０℃に温め、そしてこの温度で４時間撹拌した。次いで溶液を室温に冷却し、そして１２日間撹拌して、スラリーを得た。得られた固体を真空（６００〜７００ｍｂａｒ）下で濾過し、そして真空（２００ｍｂａｒ）下の空気中で１時間乾燥させた。カールフィッシャー分析を、乾燥したＺＤ６４７４生成物に対して、本明細書中で以下に記載される方法によって行い、そして３．９０４％の数値を得て、これは、ＺＤ６４７４一水和物と一致した；ＮＭＲスペクトル（ピリジン−ｄ５）１．４９（２Ｈ，ｍ），１．７５−１．９０（５Ｈ，ｍ），２．１５（３Ｈ，ｓ），２．７６（２Ｈ，ｍ），３．６３（３Ｈ，ｓ），３．９７（２Ｈ，ｄ），７．３８（１Ｈ，ｄｄｄ），７．４９（１Ｈ，ｄｄ），７．６４（１Ｈ，ｓ），７．８８（１Ｈ，ｔ），７．８９（１Ｈ，ｓ），９．０１（１Ｈ，ｓ），１０．３７（１Ｈ，ｓ）；質量スペクトル ＭＨ＋ ４７５。
【０１００】
実施例５：ＺＤ６４７４一水和物の別の調製方法
これは、３０℃に設定された温度制御されたガラス製反応容器中で調製した。容器に、無水のＺＤ６４７４を入れた。これに、３相対体積のテトラヒドロフラン（安定化された）および７相対体積の純水を加えた（即ち、３リットルのＴＨＦおよび７リットルの水が１ｋｇのＺＤ６４７４に対して使用されるものである）。内容物を撹拌して、クリーム色のスラリーを形成させた。反応のターンオーバーは、典型的には１時間以内であるが、しかし１時間後に少量のスラリーの試料を採取し、濾過し、次いで粉末ＸＲＤスペクトルを取って、これを確認することができる。固体を分割ブフナー漏斗上で濾過することによって単離した。反応容器を２相対体積の水で洗浄した。次いで反応容器の洗浄液をブフナー漏斗のフィルターケーキの置換洗浄液として使用した。更なる洗浄を、反応容器に加えた更なる２相対体積の水を使用して行い、これを再びフィルターケーキを洗浄するために使用した。
【０１０１】
固体を真空オーブンに移し、そして周囲温度で乾燥するまで乾燥させた。乾燥中に固体は、規則的にスラリー化した。乾燥は非常に遅く、典型的には、３５０ｇのバッチを乾燥するのに約２週間を要した。
【０１０２】
実施例６：ＺＤ６４７４一水和物の別の調製方法
ＺＤ６４７４遊離塩基を、ＷＯ０１／３２６５１の実施例２ｂに記載されている方法によって調製する。ＺＤ６４７４遊離塩基（１０．０６ｇ）を、温度制御されたガラス製反応容器中の水性テトラヒドロフラン（９０％テトラヒドロフラン／１０％水、ｖ／ｖ）に周囲温度で加える。混合物を撹拌し、そして全ての固体が溶解するまで４０℃に温める。更なるＺＤ６４７４遊離塩基（１．４４ｇ）を混合物に４２℃で加え、そして混合物を２０分間撹拌して、透明な溶液を得る。溶液をこの時点で濾過（ｓｃｒｅｅｎｅｄ）してもよい。次いで溶液を５０℃に温め、そしてこの温度で４時間撹拌する。次いで溶液を室温に冷却し、そして１日間撹拌して、スラリーを得る。次いで少量のスラリーを採取し、濾過し、そして粉末ＸＲＤスペクトルを得る。ＸＲＤスペクトルが、全ての無水のＺＤ６４７４が一水和物に変換されていることを示した場合、これを、以下に詳述するように単離する。ＸＲＤスペクトルが、無水のＺＤ６４７４およびＺＤ６４７４一水和物の混合物を示す場合、溶液を更に４時間周囲温度で、理想的には約２０℃で撹拌し、そして次いで再試験する。ＸＲＤスペクトルが、主として全て無水のＺＤ６４７４を示す場合、ＺＤ６４７４一水和物の結晶（理論的最終収量の０．１−１重量％）を播種し、そして溶液を、更に４時間周囲温度で、理想的には約２０℃で撹拌し、そして次いで再試験することができる。全ての無水のＺＤ６４７４が、ＺＤ６４７４一水和物に変換されるまで、この方法を繰返すことができる。
【０１０３】
固体は、分割ブフナー漏斗上の濾過によって単離される。反応容器を２相対体積の水で洗浄する。次いで反応容器の洗浄液を、ブフナー漏斗のフィルターケーキの置換洗浄液として使用する。更なる洗浄を、反応容器に加えた更なる２相対体積の水を使用して行い、これを再びフィルターケーキを洗浄するために使用する。
【０１０４】
固体を真空オーブンに移し、そして周囲温度で乾燥するまで乾燥する。乾燥中に固体は、規則的にスラリー化する。乾燥は非常に遅く、典型的には、３５０ｇのバッチを乾燥するのに約２週間を要する。
【０１０５】
使用した技術の詳細
Ｘ線粉末回折
【０１０６】
【表３】
【０１０７】
分析装置：Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｄ５０００、石英を使用して校正。
Ｘ線粉末回折スペクトルを、結晶のＺＤ６４７４物質の試料を、Ｓｉｅｍｅｎｓの単一ケイ素結晶（ＳＳＣ）ウエファーのマウント上にマウントし、そして顕微鏡用スライドの補助により試料を薄層に広げることによって決定した。試料を、毎分３０回転で回転させ（計数統計を改善するため）、そして１．５４０６オングストロームの波長を持つＣｕＫα照射を使用する、４０ｋＶおよび４０ｍＡで操作される銅精密長焦点管によって発生するＸ線で照射した。視準を合わせたＸ線源を、Ｖ２０に設定した自動可変発散スリットを通過させ、そして反射した照射を、２ｍｍの散乱線防止スリットおよび０．２ｍｍの検出スリットを通して導いた。試料を、シータ−シータモードにおいて２度〜４０度の２シータの範囲にわたって、０．０２度の２シータの増分当り（連続走査モード）１秒間暴露した。試験時間は、３１分４１秒であった。装置は、シンチレーションカウンターを検出器として備えていた。制御およびデータ収集は、Ｄｉｆｆｒａｃｔ＋ソフトウェアで操作されるＤｅｌｌ Ｏｐｔｉｐｌｅｘ ６８６ ＮＴ４．０ワークステーションによった。Ｘ線粉末回折の技術分野の当業者は、ピークの相対強度が、例えば試料の分析に影響してもよい、大きさが３０ミクロンより上の粒子、および非統一性の縦横比によって影響されうることを認識するであろう。当業者は、反射の位置が、回折計中に位置する試料の正確な高さ、および回折計のゼロ校正によって影響されうることを更に認識するであろう。更に、試料の表面の平面性も小さな影響を有してもよい。したがって、与えられた回折パターンのデータは、絶対値として解釈されるべきではない。
【０１０８】
動的水蒸気吸着
分析装置：Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ Ｓｙｓｔｅｍｓの動的水蒸気吸着分析器、塩化ナトリウムのような飽和塩溶液で校正。
【０１０９】
規定された温度の石英ホルダー中に含有された約５ｍｇの物質を、次の相対湿度（ＲＨ）：０、２０、４０、６０、８０、９５、８０、６０、４０、２０、０％ＲＨで、２００ｍｌ／分の窒素流量で加湿された窒素に、デュプリケートでかけた。
【０１１０】
特定の相対湿度における物質の重量を、これが、１０分間にわたり平均された毎分当りの変化が、０．００２重量％の重量基準に対して安定となるまで、ｉｎ−ｓｉｔｕの秤を使用して定期的にモニターした。重量がなお変化している場合、これを、重量が安定するまで、特定の相対湿度に留めた（最大時間１２時間まで）。
【０１１１】
示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）
分析装置：Ｍｅｔｔｌｅｒ ＤＳＣ８２０ｅ
ＤＳＣを、熱流束（ｈｅａｔ ｒｅｆｌｕｘ）型ＤＳＣによって、インジウム金属を標準校正に使用して行った。典型的には、穴の開いた蓋を備えた４０μｌのアルミニウムパン中に含有された５ｍｇより少ない物質を、２５℃〜３２５℃の範囲の温度にわたって、毎分１０℃の一定の加熱速度で加熱した。窒素を使用した置換ガスを使用した−毎分１００ｍｌの流量。ＤＳＣの更なる情報関しては、読者は：ＤＳＣ／ＴＧＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ １９８６ Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ＆ Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ａｌｌｙｎ ａｎｄ Ｂａｃｏｎ ＩＳＢＮ００２０５０８６８５３を参照されたい。
【０１１２】
熱重量分析（ＴＧＡ）
分析装置：Ｍｅｔｔｌｅｒ ＴＧ８５１、標準校正用分銅を使用して重量を校正。
典型的には、７０μｌのａｌｏｘ（酸化アルミニウム）坩堝中に含有された３〜１２ｍｇの物質を、２５℃〜３２５℃の範囲の温度にわたって、毎分１０℃の一定の加熱速度で加熱し、その間ｉｎ−ｓｉｔｕの秤を使用して定期的に重量をモニターした。ヘリウムを使用する置換ガスを使用した−毎分５０ｍｌの流量。
【０１１３】
ＴＧＡの更なる情報関しては、読者は：ＤＳＣ／ＴＧＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ（１９８６）Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ＆ Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ａｌｌｙｎ ａｎｄ Ｂａｃｏｎ ＩＳＢＮ００２０５０８６８５３を参照されたい。
【０１１４】
カールフィッシャー水含有率
分析装置：Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ水分計ＣＡ−０５
典型的には、約５０ｍｇの物質を使用した。
【０１１５】
カールフィッシャー水含有率の測定の更なる情報に関しては、読者は：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９６）ｂｙ Ｓｋｏｏｇ，Ｗｅｓｔ ａｎｄ Ｈｏｌｌｅｒ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｒｏｏｋｓ／Ｃｏｌｅ ＩＳＢＮ０−０３−００５９３８−０を参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】図１は、温度℃を横軸に、そして熱流量／％重量喪失を縦軸にプロットしたＺＤ６４７４無水物のＤＳＣおよびＴＧＡの熱記録である。上部のプロットはＴＧＡのプロットであり、そして下部のプロットはＤＳＣのプロットである。ｙ軸上のＴＧＡプロットのスケールは、グラフに示すように２ｍｇであり、そしてｙ軸上のＤＳＣプロットのスケールは、グラフに示すように１０ｍＷである。
【図２】図２は、２シータ値を横軸にプロットし、そして相対線強度（カウント数）を縦軸にプロットした、ＺＤ６４７４無水物のＸ線粉末回折パターンである。
【図３】図３は、標的相対湿度（％）を横軸に、そして質量の変化（％）を縦軸に持つ、２５℃におけるＺＤ６４７４無水物のＤＶＳ等温プロットであり、ここにおいて、菱型はサイクル１の吸着を表し、四角はサイクル１の脱着を表し、三角はサイクル２の吸着を表し、そして四角は、サイクル２の脱着を表す。
【図４】図４は、２シータ値を横軸にプロットし、そして相対線強度（カウント数）を縦軸にプロットした、ＺＤ６４７４一水和物のＸ線粉末回折パターンである。
【図５】図５は、温度℃を横軸に、そして熱流量／％重量喪失を縦軸にプロットしたＺＤ６４７４一水和物のＤＳＣおよびＴＧＡの熱記録である。上部のプロットはＴＧＡのプロットであり、そして下部のプロットはＤＳＣのプロットである。ｙ軸上のＴＧＡプロットのスケールはグラフに示すように２ｍｇであり、そしてｙ軸上のＤＳＣプロットのスケールはグラフに示すように１０ｍＷである。
【図６】図６は、標的相対湿度（％）を横軸に持ち、そして質量の変化（％）を縦軸に持つ、２５℃におけるＺＤ６４７４一水和物のＤＶＳ等温プロットであり、ここにおいて、菱型はサイクル１の吸着を表し、四角はサイクル１の脱着を表し、三角はサイクル２の吸着を表し、そして四角は、サイクル２の脱着を表す。
【図７】図７は、分の時間を横軸に、そして質量の変化（初期重量の％）を縦軸に持つ、０％相対湿度および２５℃におけるＺＤ６４７４一水和物のＤＶＳ等温プロットである。
【図８】図８は、分の時間を横軸に、そして質量の変化（初期重量の％）を縦軸に持つ、０％相対湿度および４０℃におけるＺＤ６４７４一水和物のＤＶＳ等温プロットである。
【図９】図９は、２シータ値を横軸にプロットし、そして相対線強度（カウント数）を縦軸にプロットした、本出願の実施例１において形成されたＺＤ６４７４無水物のＸ線粉末回折パターンである。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＺＤ６４７４の新規な形態に関する。更に具体的には、本発明は、ＺＤ６４７４一水和物、ＺＤ６４７４一水和物の調製方法、ＺＤ６４７４一水和物を活性成分として含む医薬組成物、ヒトのような温血動物における抗血管新生および／または血管透過性減少効果の産生において使用するための医薬の製造におけるＺＤ６４７４一水和物の使用、およびヒトのような温血動物における癌のような血管新生および／または増加した血管透過性に伴う疾病状態の治療方法におけるＺＤ６４７４一水和物の使用に関する。
【０００２】
正常な血管新生は、胚発生、創傷治癒および雌性の性機能のいくつかの要素を含む様々な過程において重要な役割を果たす。好ましくないまたは病的な血管新生は、糖尿病性網膜症、乾癬、癌、関節リウマチ、アテローム、カポジ肉腫および血管腫を含む疾病状態に関連する（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ，１９９５，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１６：５７−６６；Ｆｏｌｋｍａｎ，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １：２７−３１）。血管透過性の変化は、正常および病的な生理学的過程の両方において役割を果たす考えられる（Ｃｕｌｌｉｎａｎ−Ｂｏｖｅ ｅｔ ａｌ，１９９３，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３３：８２９−８３７；Ｓｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９３，Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２：３０３−３２４）。酸性および塩基性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏで内皮細胞増殖促進活性を持ついくつかのポリペプチドが同定されている。その受容体の制限された発現によって、ＶＥＧＦの増殖因子活性は、ＦＧＦのそれとは対照的に、内皮細胞に対して相対的に特異的である。最近の証拠は、ＶＥＧＦが、正常なおよび病的な血管新生の両方（Ｊａｋｅｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９３，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３３：８４８−８５９；Ｋｏｌｃｈ ｅｔ ａｌ，１９９５，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，３６：１３９−１５５）、並びに血管透過性（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２００１７−２００２４）にとって重要な刺激物質であることを示している。抗体でＶＥＧＦを捕捉することによるＶＥＧＦ作用の拮抗作用は、腫瘍の増殖を阻害することができる（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：８４１−８４４）。
【０００３】
受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫｓ）は、細胞の細胞膜を横切る生化学的シグナルの伝達において重要である。これらの膜貫通分子は、細胞膜中のセグメントを介して細胞内チロシンキナーゼ領域と結合した、細胞外リガンド結合領域から特徴的に構成される。リガンドの受容体への結合は、受容体およびその他の細胞内分子上のチロシン残基のリン酸化を導く、受容体関連チロシンキナーゼ活性を刺激する。チロシンのリン酸化におけるこれらの変化により、様々な細胞応答を導くシグナルカスケードが開始する。今日まで、アミノ酸配列の相同性によって定義される少なくとも１９個の異なるＲＴＫサブファミリーが同定されている。これらのサブファミリーの一つは、現時点では、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ受容体、Ｆｌｔ−１、キナーゼ挿入領域含有受容体、ＫＤＲ（Ｆｌｋ−１とも呼ばれる）、およびもう一つのｆｍｓ様チロシンキナーゼ受容体、Ｆｌｔ−４によって構成される。これらの関連するＲＴＫの二つ、Ｆｌｔ−１およびＫＤＲは、ＶＥＧＦに高い親和性で結合することが示されている（Ｄｅ Ｖｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：９８９−９９１；Ｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９９２，１８７：１５７９−１５８６）。ＶＥＧＦの、異種細胞で発現されるこれらの受容体への結合は、細胞タンパク質のチロシンのリン酸化状態およびカルシウムフラックスの変化に関与する。
【０００４】
ＶＥＧＦは、血管形成および血管新生のための重要な刺激物質である。このサイトカインは、内皮細胞の増殖、プロテアーゼの発現および遊走、並びに毛細管を形成するためのその後の細胞の組織化を誘導することによって、血管発芽表現型を誘発する（Ｋｅｃｋ，Ｐ．Ｊ．，Ｈａｕｓｅｒ，Ｓ．Ｄ．，Ｋｒｉｖｉ，Ｇ．，Ｓａｎｚｏ，Ｋ．，Ｗａｒｒｅｎ，Ｔ．，Ｆｅｄｅｒ，Ｊ．，ａｎｄ Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｄ．Ｔ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ），２４６：１３０９−１３１２，１９８９；Ｌａｍｏｒｅａｕｘ，Ｗ．Ｊ．，Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｍ．Ｅ．，Ｒｅｉｎｅｒ，Ａ．，Ｈａｓｔｙ，Ｋ．Ａ．，ａｎｄ Ｃｈａｒｌｅｓ，Ｓ．Ｔ．，Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．，５５：２９−４２，１９９８；Ｐｅｐｐｅｒ，Ｍ．Ｓ．，Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ，Ｒ．，Ｍａｎｄｒｏｉｔａ，Ｓ．Ｊ．，Ｏｒｃｉ，Ｌ．ａｎｄ Ｖａｓｓａｌｌｉ，Ｊ．Ｄ．，Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ，４９：１３８−１６２，１９９６）。更に、ＶＥＧＦは、病的血管新生の特徴である超透過性の未熟な血管ネットワークの形成を促進する著しい血管透過性を誘導する（Ｄｖｏｒａｋ Ｈ．Ｆ．，Ｄｅｔｍａｒ，Ｍ．，Ｃｌａｆｆｅｙ，Ｋ．Ｐ．，Ｎａｇｙ，Ｊ．Ａ．，ｖａｎ ｄｅ Ｗａｔｅｒ，Ｌ．，ａｎｄ Ｓｅｎｇｅｒ，Ｄ．Ｒ．，（Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０７：２３３−２３５，１９９５；Ｂａｔｅｓ，Ｄ．Ｏ．，Ｈｅａｌｄ，Ｒ．Ｉ．，Ｃｕｒｒｙ，Ｆ．Ｅ．ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄ．），５３３：２６３−２７２，２００１）。
【０００５】
ＫＤＲ単独の活性化は、内皮細胞の増殖、遊走、および生存を含むＶＥＧＦに対する全ての主要な表現型応答、並びに血管透過性の誘導を促進するために十分であることが示されている（Ｍｅｙｅｒ，Ｍ．，Ｃｌａｕｓｓ，Ｍ．，Ｌｅｐｐｌｅ−Ｗｉｅｎｈｕｅｓ，Ａ．，Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．，Ａｕｇｕｓｔｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｚｉｃｈｅ，Ｍ．，Ｌａｎｚ，Ｃ．，Ｂｕｔｔｎｅｒ，Ｍ．，Ｒｚｉｈａ，Ｈ−Ｊ．，ａｎｄ Ｄｅｈｉｏ，Ｃ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１８：３６３−３７４，１９９９；Ｚｅｎｇ，Ｈ．，Ｓａｎｙａｌ，Ｓ．ａｎｄ Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ｄ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：３２７１４−３２７１９，２００１；Ｇｉｌｌｅ，Ｈ．，Ｋｏｗａｌｓｋｉ，Ｊ．，Ｌｉ，Ｂ．，ＬｅＣｏｕｔｅｒ，Ｊ．，Ｍｏｆｆａｔ，Ｂ，Ｚｉｏｎｃｈｅｃｋ，Ｔ．Ｆ．，Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｎ．ａｎｄ Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：３２２２−３２３０，２００１）。
【０００６】
ＶＥＧＦの効果を阻害する化合物は、癌（白血病、多発性骨髄腫およびリンパ腫を含む）、糖尿病、乾癬、関節リウマチ、カポジ肉腫、血管腫、急性および慢性腎症、アテローム、動脈再狭窄、自己免疫性疾患、急性炎症、過剰な瘢痕形成および癒着、子宮内膜症、リンパ浮腫、機能障害性子宮出血および黄斑変性症を含む網膜血管の増殖に伴う眼疾患のような血管新生および／または血管透過性の増加に伴う疾病状態の治療において価値がある。
【０００７】
ＶＥＧＦ受容体型チロシンキナーゼの阻害剤であるキナゾリン誘導体は、国際特許出願公開ＷＯ９８／１３３５４およびＷＯ０１／３２６５１に記載されている。ＷＯ９８／１３３５４およびＷＯ０１／３２６５１において、ＶＥＧＦ受容体型チロシンキナーゼ（ＶＥＧＦ ＲＴＫ）に対する活性を保有し、一方、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）受容体型チロシンキナーゼ（ＥＧＦ ＲＴＫ）に対するある程度の活性を保有する化合物が記載されている。
【０００８】
ＺＤ６４７４は、４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン：
【０００９】
【化１】
【００１０】
である。
ＺＤ６４７４は、ＷＯ９８／１３３５４の広い開示の範囲内に入り、そしてＷＯ０１／３２６５１中で例示されている。ＺＤ６４７４は、ＶＥＧＦ ＲＴＫの強力な阻害剤であり、そして更にＥＧＦ ＲＴＫに対してもある程度の活性を有する。ＺＤ６４７４は、一日一回の経口投与後のモデルの範囲において抗腫瘍活性の広いスペクトルを発揮することが示されている（Ｗｅｄｇｅ Ｓ．Ｒ．，Ｏｇｉｌｖｉｅ Ｄ．Ｊ．，Ｄｕｋｅｓ Ｍ．ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．２００１；４２：ａｂｓｔｒａｃｔ ３１２６）。
【００１１】
ＷＯ０１／３２６５１は、ＺＤ６４７４の調製を記載する。
ＷＯ０１／３２６５１の実施例２ａにおいて、ＺＤ６４７４の塩酸塩が調製され、そして単離される。
【００１２】
ＷＯ０１／３２６５１の実施例２ｂにおいて、ＺＤ６４７４遊離塩基が調製され、そして単離される。単離工程中で、生成物を乾燥するために硫酸マグネシウムが使用される。単離されたＺＤ６４７４遊離塩基の元素分析は、これが水を含有していないことを示す。言い換えれば、単離されたＺＤ６４７４遊離塩基は、無水の形態である。
【００１３】
ＷＯ０１／３２６５１の実施例２ｃにおいて、ＺＤ６４７４の塩酸塩が調製され、そして単離される。一つの側面において、単離されたＺＤ６４７４の塩酸塩は、ジメチルスルホキシド中に溶解され、そして固体の炭酸カリウムの添加によって、ＺＤ６４７４遊離塩基に（ジメチルスルホキシド溶液中で）変換される。ジメチルスルホキシド溶液中のＺＤ６４７４遊離塩基は、無水の形態である。次いでジメチルスルホキシド溶液中のＺＤ６４７４遊離塩基は、トリフルオロ酢酸の添加によってＺＤ６４７４のトリフルオロ酢酸塩に変換される。
【００１４】
ＷＯ０１／３２６５１の実施例２ｃのもう一つの側面において、ＺＤ６４７４遊離塩基は、固体として単離される。まず、単離されたＺＤ６４７４の塩酸塩を、塩化メチレン中に懸濁し、そして懸濁液を飽和の水性炭酸水素ナトリウムで洗浄して、塩化メチレン中のＺＤ６４７４遊離塩基の溶液を得ることによって、ＺＤ６４７４遊離塩基に変換する。次いでＺＤ６４７４遊離塩基の塩化メチレン溶液を、硫酸マグネシウムを使用して乾燥させ、そして揮発性物質をエバポレーションによって除去する。この方法を、本出願の実施例１のように繰返し、そしてＺＤ６４７４遊離塩基を、結晶の無水の形態で得る。
【００１５】
したがって、ＷＯ０１／３２６５１は、ＺＤ６４７４の塩酸塩およびＺＤ６４７４遊離塩基の両方を開示する。ＷＯ０１／３２６５１の実施例において、固体として得られたＺＤ６４７４遊離塩基は、無水の形態である。
【００１６】
ＺＤ６４７４の塩酸塩およびＺＤ６４７４遊離塩基の無水の形態を調製するためにＷＯ０１／３２６５１中に記載された方法は、ＷＯ０３／０３９５５１、ＷＯ２００４／０１４３８３、ＷＯ２００４／０１４４２６、ＷＯ２００４／０３２９３７、ＷＯ２００４／０７１３９７およびＷＯ２００５／００４８７０のような、ＺＤ６４７４を含む組合せ療法に関連する出願公開中でも更に記載されおよび／または参照される。
【００１７】
疑義の回避のために、これ以降使用される用語“ＺＤ６４７４”は、特に明記しない限り、ＺＤ６４７４遊離塩基を指す。
ＺＤ６４７４の無水の形態は、ＷＯ０１／３２６５１に記載されている方法を使用して調製してもよい。ＺＤ６４７４遊離塩基の無水の形態を調製および単離するための別の方法は、本出願の実施例２中に記載される。
【００１８】
ＺＤ６４７４の無水の形態は、周囲条件下では結晶の固体である。示差走査熱量（ＤＳＣ）分析を、本明細書中で以下に記載される方法にしたがってＺＤ６４７４の無水の形態に対して行った結果、溶融の開始温度が２３０℃〜２４０℃間にある大きくかつ鋭い吸熱を示す（図１）。ＤＳＣの開始および／またはピーク温度の値が、機械によってまたは試料によってわずかに変化してもよいので、引用された値は絶対値として解釈されるべきでないことは、理解されるであろう。
【００１９】
熱重量（ＴＧＡ）分析を、本明細書中で以下に記載される方法にしたがってＺＤ６４７４の無水の形態に対して行った結果、溶融前に対する重量の喪失はないことを示す（図１）。これは、ＺＤ６４７４の無水の形態の指標である。
【００２０】
カールフィッシャー分析を、本明細書中で以下に記載される方法にしたがってＺＤ６４７４の無水の形態に対して行った結果、０．０１〜０．２３重量％の数字を得る。これは、ＺＤ６４７４の無水の形態の指標である。
【００２１】
ＺＤ６４７４の無水の形態は、ＣｕＫα照射を使用して測定した以下に示す２シータ値の少なくとも一つを与えることにおいて特徴づけられる：１５．０°および２１．４°。ＺＤ６４７４の無水の形態は、図２に示すようなＣｕＫαのＸ線粉末回折パターンを与えることにおいて特徴付けられる。１０個の最も顕著なピークを、表１に示す。
【００２２】
【表１】
【００２３】
動的水蒸気吸着（ＤＶＳ）分析を、本明細書中に以下に記載される方法にしたがって行った結果、ＺＤ６４７４の無水の形態は非吸湿性であることを示す（図３）。９５％の相対湿度において、ＺＤ６４７４の無水の形態は、０．６３重量％のみの水を吸収したことから、ＺＤ６４７４の水和された形態への変換は起こらなかったことが示唆される。したがって、ＺＤ６４７４の無水の形態は、ＤＶＳの時間尺度では動力学的に安定である。
【００２４】
医薬的に活性な化合物の別の安定した形態を同定することが望ましい。医薬的に活性な化合物の別の安定した形態、例えば別の安定した結晶の形態は、商業規模の製剤および加工において好都合である。例えば、安定な結晶の形態は、製剤工程における他の形態への変換について低い危険性を提供し、これは、最終製剤の特性の予測可能性を提供する。
【００２５】
本発明は、ＺＤ６４７４の無水の形態と異なる形態のような、そしてある種の環境において改良された固体状態の特性を有するＺＤ６４７４の別の形態の同定に関する。例えば、一つの側面において、本発明は、水性の系および／または高い湿度の環境において特に有用なＺＤ６４７４の別の形態の同定に関する。
【００２６】
ＺＤ６４７４の別の形態の一つの例は、ＺＤ６４７４の水和された形態である。ＷＯ０１／３２６５１において、そこに記載されている化合物が、例えば水和された形態のような非溶媒化された形態と同様、溶媒化された形態でも存在することができることを記述する。
【００２７】
ＷＯ０１／３２６５１において、その中に記載されている特別な化合物の特別な水和物が、予期されないおよび／または利益のある特性を保有するであろうことは、どこにも記述されていない。
【００２８】
我々は、ＺＤ６４７４の一水和物の形態が、周囲温度および湿度においてＺＤ６４７４の好都合に安定な結晶の形態であることをここで発見した。ＺＤ６４７４の結晶の一水和物の形態は、水性懸濁液製剤、および／または高湿度環境のような水性の環境下での使用に特に適している。更に、ＺＤ６４７４の結晶の一水和物の形態は、製造が簡単である。例えば、ＺＤ６４７４のこの形態は、約３０−４０℃の温度で、大量の脱水を伴わずに、ラージスケール（製剤中の流動層乾燥のような）で容易に乾燥させてもよく、それは、水和の危険性を伴わずに湿式顆粒化してもよく、そしてそれは、湿度の範囲で保存しよもよい。更に、ＺＤ６４７４の結晶の一水和物の調製方法は、特定の水溶性不純物の容易な除去も可能にする。
【００２９】
本発明によれば、ＺＤ６４７４一水和物が提供される。ＺＤ６４７４一水和物は、容易に結晶化し、高度に結晶性であり、そして非吸湿性である（ＤＶＳ測定による）。
結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物は、ＣｕＫα照射を使って測定された以下の２つのシータ値の少なくとも一つを与えることによって特徴付けられる：１０．８°および２１．０°。結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物は、実質的に図４に示すようなＸ線粉末回折パターンを与えることにおいて特徴付けられる。１０個の最も顕著なピークを、以下の表２に示す：
【００３０】
【表２】
【００３１】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、少なくとも一つの特異的ピークを約２シータ＝１０．８°で持つＸ線粉末回折パターンを有する。
【００３２】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、少なくとも一つの特異的ピークを約２シータ＝２１．０°で持つＸ線粉末回折パターンを有する。
【００３３】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、少なくとも二つの特異的ピークを約２シータ＝１０．８°および２１．０°で持つＸ線粉末回折パターンを有する。
【００３４】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、特異的ピークを、約２シータ＝１０．８、２１．０、１８．４、１１．９、１８．９、１８．１、２２．１、１１．４、２０．１および２４．０°で持つＸ線粉末回折パターンを有する。
【００３５】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、図４に示したＸ線粉末回折パターンと実質的に同一のＸ線粉末回折パターンを有する。
【００３６】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、少なくとも一つの特異的ピークを２シータ＝１０．８°±０．５°２シータに持つＸ線粉末回折パターンを有する。
【００３７】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、少なくとも一つの特異的ピークを２シータ＝２１．０°±０．５°２シータにで持つＸ線粉末回折パターンを有する。
【００３８】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、少なくとも二つの特異的ピークを２シータ＝１０．８°および２１．０°で持つＸ線粉末回折パターンを有し、ここにおいて、前記の値は、±０．５°２シータにあってよい。
【００３９】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、特異的ピークを２シータ＝１０．８、２１．０、１８．４、１１．９、１８．９、１８．１、２２．１、１１．４、２０．１および２４．０°に持つＸ線粉末回折パターンを有し、ここにおいて、前記の値は、±０．５°２シータにあってよい。
【００４０】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、少なくとも一つの特異的ピークを、２シータ＝１０．８°に持つＸ線粉末回折パターンを有する。
【００４１】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、少なくとも一つの特異的ピークを、２シータ＝２１．０°に持つＸ線粉末回折パターンを有する。
【００４２】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、少なくとも二つの特異的ピークを、２シータ＝１０．８°および２１．０°に持つＸ線粉末回折パターンを有する。
【００４３】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、特異的ピークを、２シータ＝１０．８、２１．０、１８．４、１１．９、１８．９、１８．１、２２．１、１１．４、２０．１および２４．０°に持つＸ線粉末回折パターンを有する。
【００４４】
本発明によれば、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が提供され、ここにおいて、一水和物は、図４に示されたＸ線粉末回折パターンを有する。
結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物をＸ線粉末回折ピークで定義している前の段落において、ピークの正確な位置（即ち、引用された２シータの角の値（angle values）)を示すために、表現「約２シータ＝・・・で」の中で使用される、用語「約・・・で」は、絶対値として解釈されるべきではない。なぜなら、当業者によって認識されるものであるように、ある機械と別の機械の間で、ある試料と別の試料との間で、または使用された測定条件の僅かな変化の結果として、ピークの正確な位置は、僅かに変化するかもしれないからである。一つに態様において、約２シータ＝１０．８°は、２シータ＝１０．８±０．５°を、別の態様において、２シータ＝１０．８±０．２°を、そして更なる態様において、２シータ＝１０．８±０．１°を意味する。前の段落において、結晶の形態のＺＤ６４７４一水和物が、図４に示したＸ線粉末回折パターンと、“実質的に”同一のＸ線粉末回折パターンを与えることも記述される。この文脈における用語“実質的に”の使用は、ある機械と別の機械の間で、ある試料と別の試料の間で、または使用される測定条件の僅かな変化の結果として、Ｘ線粉末回析パターンの２シータ角の値が僅かに変化するかもしれないことを示すことも意図されており、したがって、図に示されたピークの位置は、やはり絶対値として解釈されるべきではないことが認識されるべきである。
【００４５】
ＤＳＣ分析（詳細は本明細書中で以下に与えられる）を、ＺＤ６４７４一水和物に対して行った結果、５０℃〜１２０℃の間に開始温度を持つ脱水による大きく幅広な吸熱（ＺＤ６４７４の無水の形態を製造するための）、並びに２３０℃〜２４０℃の間に開始温度を持つＺＤ６４７４の無水の形態の溶融による大きく狭い吸熱を示す（図５）。
【００４６】
ＴＧＡ分析（詳細は本明細書中で以下に与えられる）を、ＺＤ６４７４一水和物に対して行った結果、６９℃〜１１１℃間で約３．７％の重量喪失を示し（図５）、これは、ＺＤ６４７４一水和物からの水和水の喪失分に相当する。ＴＧＡの温度の値が、ある機械と別の機械の間で、またはある試料と別の試料の間で僅かに変化してもよいものであり、したがって、引用された値が絶対値として解釈されるべきでないことが理解されるであろう。
【００４７】
カールフィッシャー分析（詳細は本明細書中で以下に与えられる）を、ＺＤ６４７４一水和物に対して行って、そして約３．９％の数字を得て、これは、全ての重量喪失が水の喪失によることを示唆する。当業者が認識するものであるように、ＺＤ６４７４一水和物中の水の重量パーセントは、３．６５％である。
【００４８】
動的水蒸気吸着（ＤＶＳ）分析（詳細は本明細書中で以下に与えられる）を、ＺＤ６４７４一水和物に対して行って、そしてＺＤ６４７４一水和物が非吸湿性であることが示される（図６）。ＤＶＳ分析は、ＺＤ６４７４一水和物が、２５℃および０％相対湿度における乾燥中に、ＺＤ６４７４の無水の形態に実質的に変換されないこと（５％より少ない）を示す。２５℃で０％相対湿度におけるＺＤ６４７４一水和物の保存における重量変化のパーセントのプロット（図７）は、一旦表面の水分が除去されると、重量喪失の速度が極端に遅くなることを示す。４０℃で０％相対湿度におけるＺＤ６４７４一水和物の保存における重量変化のパーセントのプロット（図８）は、この温度における、より速い重量喪失の速度を示しているが、この環境における水和された化合物としてなお驚くほど遅い。したがって、ＺＤ６４７４一水和物は、ＤＶＳの時間尺度において動力学的に安定である。
【００４９】
スラリーの実験を、本出願の実施例３に記載したように（そしてＺｈｕ，Ｈ．Ｊ．，Ｙｕｅｎ，Ｃ．，Ｇｒａｎｔ，Ｄ．Ｊ．Ｗ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，（１９９６）１３５（１，２）１５１−１６０中に記載されているように）、ＺＤ６４７４一水和物が最も安定な結晶の形態で存在する条件を同定するために行った。これらの実験は、２５℃において、ＺＤ６４７４の無水の形態が、相対湿度３０％以下で、熱力学的に安定な形態であることを示す。２５℃において、ＺＤ６４７４一水和物は、相対湿度４０％以上で、熱力学的に安定な形態である。したがって、２５℃および相対湿度５０％において、ＺＤ６４７４一水和物は最も安定した形態である。
【００５０】
本発明がＺＤ６４７４一水和物の結晶の形態に関する、と記述されている場合、結晶化度の程度は、都合よくは約６０％より大きく、更に好都合には約８０％より大きく、好ましくは約９０％より大きく、そして更に好ましくは約９５％より大きい。最も好ましい結晶化度の程度は、約９８％より大きい。
【００５１】
疑義の回避のために、用語“周囲条件”によって、我々は、周囲温度および湿度を意味する。用語“周囲温度”によって、我々は、１５〜３０℃の範囲の温度、特に約２５℃の温度を意味する。用語“周囲湿度”によって、我々は、約４５〜６０％の相対湿度を意味する。用語“相対湿度”によって、我々は、空気が飽和された場合に存在する水分の量に対する、大気中に存在する水分の量（％）を意味する。当業者によって認識されるものであるように、相対湿度は、水分含有量および温度の関数である。
【００５２】
ＺＤ６４７４一水和物の結晶の形態は、図４に示すＸ線粉末回折パターンと実質的に同一のＸ線粉末回折パターンを与え、そして表２に示す１０個の最も顕著なピーク（角度２シータ値）を実質的に有する。Ｘ線粉末回折パターンの２シータ値が、ある機械と別の機械の間で、または、ある試料と別の試料との間で僅かに変化してもよく、したがって引用された値が、絶対的と解釈されるべきではないことは理解されるであろう。
【００５３】
測定条件（使用する装置または機械のような）に依存して、一つまたはそれ以上の測定変動を有するＸ線粉末回折パターンが得られてもよいことは、知られている。特に、Ｘ線粉末回折パターンの強度が、測定条件（例えば好ましい配向）に依存して変動してもよいことが一般的に知られている。したがって、本発明のＺＤ６４７４一水和物の形態が、図４に示すＸ線粉末回折パターンと同一のＸ線粉末回折パターンを与える結晶に制約されず、そして図４に示すものと実質的に同一のＸ線粉末回折パターンを与えるいずれの結晶も、本発明の範囲内であることは理解されるべきである。Ｘ線粉末回折の技術分野に属する当業者は、Ｘ線粉末回折パターンの実質的な同一性を判断することが可能である。
【００５４】
Ｘ線粉末回折の技術分野に属する当業者は、ピークの相対強度が、例えば、試料の分析に影響を与え得る、３０ミクロンより大きい粒子および非統一性の縦横比によって影響され得ることを認識するであろう。当業者は、反射の位置が、回折計中に位置する試料の正確な高さおよび回折計のゼロ校正によって影響され得ることを更に認識するであろう。また、試料の表面の平面性も小さな影響力を有する。したがって、与えられた回折パターンのデータは、絶対値として解釈されるべきではない（Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｒ ＆ Ｓｎｙｄｅｒ，Ｒ．Ｌ．‘Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｘ−Ｒａｙ Ｐｏｗｄｅｒ Ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｒｙ’Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９６；Ｂｕｎｎ，Ｃ．Ｗ．（１９４８），Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ；Ｋｌｕｇ，Ｈ．Ｐ．＆ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｌ．Ｅ．（１９７４），Ｘ−Ｒａｙ Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）。
【００５５】
一般的に、Ｘ線粉末回折法の回折角の測定誤差は、±０．５° ２シータまたはそれより小さく、例えば±０．２° ２シータ或いは理想的には±０．１° ２シータであり、そして測定誤差のそのような程度は、図２および４のＸ線粉末回折パターンを考察する時、そして表１および２を解釈する時、に考慮されるべきである。更に、強度が、実験条件および試料調製（例えば好ましい配向）に依存して変動しうることは理解されるべきである。
【００５６】
疑義の回避のために、用語“ＺＤ６４７４遊離塩基”は、それぞれの及びあらゆる形態のＺＤ６４７４遊離塩基を指し、一方“ＺＤ６４７４無水物”は、ＺＤ６４７４遊離塩基の特定の無水の形態を指し、そして“ＺＤ６４７４一水和物”は、ＺＤ６４７４遊離塩基の特定の一水和物の形態を指す。
【００５７】
本発明の更なる側面によれば、医薬的に受容可能な賦形剤または担体と共同して、本明細書中で先に定義したＺＤ６４７４一水和物を含む医薬組成物が提供される。
組成物は、経口投与、（例えば錠剤、ロゼンジ、硬質または軟質カプセル、水性または油性懸濁液、乳液、分散性粉末または顆粒、シロップまたはエリキシルとして）、吸入による投与（例えば微細に分割された粉末または液体エアゾールとして）、通気による投与（例えば微細に分割された粉末として）、非経口注射（例えば静脈内、皮下、筋肉内、血管内または注入投与のための滅菌溶液、懸濁液或いは乳液として）、局所投与（例えばクリーム、軟膏、ゲル、或いは水性または油性溶液若しくは懸濁液として）、または直腸投与（例えば座薬として）のために適した形態であってもよい。好ましくは、ＺＤ６４７４一水和物は、経口的に投与される。一般的に、上記の組成物は、慣用的な賦形剤を使用した慣用的な方法で調製してもよい。
【００５８】
本発明の組成物は、好都合には単位剤形で与えられる。ＺＤ６４７４一水和物は、温血動物の身体面積１平方メートル当り１０〜５００ｍｇの範囲の単位投与で、例えばヒトにおいて約０．３〜１５ｍｇ／ｋｇで、通常、温血動物に投与されるであろう。単位薬量の範囲は、例えば、０．３〜１５ｍｇ／ｋｇ、例えば０．５〜５ｍｇ／ｋｇの範囲が想定され、そしてこれは、通常治療的に有効な投与量である。錠剤またはカプセルのような単位投与剤形は、通常例えば２５〜５００ｍｇの活性成分を含有すであろう。好ましくは、０．５〜５ｍｇ／ｋｇの範囲での日量が使用される。特定の疾病状態の治療的または予防的処置のために必要な投与量の規模は、治療される宿主、投与の経路および治療される病気の重度によって必然的に変化するであろう。したがって、いずれかの特定の患者を治療している医師が、最適投与量を決定してもよい。
【００５９】
本発明の更なる側面によれば、治療によるヒトまたは動物の身体の処置方法において使用するための、本明細書中で先に定義したＺＤ６４７４一水和物が提供される。
本発明の更なる特徴は、医薬として使用するための、本明細書中で先に定義したＺＤ６４７４一水和物であり、都合よくはヒトのような温血動物における抗血管新生および／または血管透過性の減少効果を産生するための医薬として使用するための、本明細書中で先に定義したＺＤ６４７４一水和物である。
【００６０】
したがって、本発明の更なる側面によれば、ヒトのような温血動物における抗血管新生および／または血管透過性の減少効果の産生において使用するための医薬の製造における、本明細書中で先に定義したＺＤ６４７４一水和物の使用が提供される。
【００６１】
本発明の更なる特徴によれば、ヒトのような温血動物における抗血管新生および／または血管透過性の減少効果を産生するための方法であって、このような治療を必要とする前記動物に、有効量の本明細書中で先に定義したＺＤ６４７４一水和物を投与することを含む方法が提供される。
【００６２】
ＺＤ６４７４一水和物は、抗血管新生および／または血管透過性減少剤であり、そして単独の療法として適用してもよいし、或いはＺＤ６４７４一水和物に加えて、一つ以上の他の物質および／または治療を含んでもよい。このような連合治療は、治療の個々の成分の同時、連続または別個投与によって達成してもよい。内科的腫瘍学の分野において、癌患者それぞれを治療するために、異なった治療形態の組合せを使用することは、通常の実務である。内科的腫瘍学において、このような連合治療のＺＤ６４７４一水和物以外の他の要素（諸要素）は、外科手術、放射線療法または化学療法であってもよい。このような化学療法は、治療剤の以下の三つの主要なカテゴリーを含んでもよい：
（ｉ）血管内皮増殖因子の影響を阻害するもののような、他の抗血管新生剤（例えば抗血管内皮細胞増殖因子抗体ベバシズマブ［アバスチンＴＭ］、および本明細書中で先に定義したものとは異なった機構によって働くもの（例えばリノマイド、インテグリンαｖβ３機能の阻害剤およびアンジオスタチン、ラゾキシン、サリドマイド）、および血管標的剤（例えばリン酸コンブレタスタチン、並びに国際特許出願ＷＯ００／４０５２９、ＷＯ００／４１６６９、ＷＯ０１／９２２２４、ＷＯ０２／０４４３４およびＷＯ０２／０８２１３中に開示される化合物、並びにその文書の全ての開示が本明細書中に参考文献として援用される国際特許出願ＷＯ９９／０２１６６中に記載される血管損傷剤（例えばＮ−アセチルコルチノール（ａｃｅｔｙｌｃｏｌｃｈｉｎｏｌ）−Ｏ−リン酸））を含む）；
（ｉｉ）抗エストロゲン剤（例えばタモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェンおよびヨードキシフェン）；エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（例えばフルベストラント）、プロゲストーゲン（例えば酢酸メゲストロール）、アロマターゼ阻害剤（例えばアナストロゾール、レトロゾール、ボラゾールおよびエキセメスタン）、抗プロゲストーゲン剤、抗アンドロゲン剤（例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、酢酸シプロテロン）、ＬＨＲＨアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば酢酸ゴセレリン、リュープロリド、ブセレリン）、５α−レダクターゼの阻害剤（例えばフィナステリド）のような細胞増殖抑制剤、抗浸潤剤（例えばマリマスタットのようなメタロプロテイナーゼ阻害剤およびウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体機能の阻害剤）、並びに増殖因子機能の阻害剤（このような増殖因子は、例えば血小板由来増殖因子および肝細胞増殖因子を含む）、このような阻害剤は、増殖因子抗体、増殖因子受容体抗体（例えば抗ｅｒｂｂ２抗体トラスツズマブ［ハーセプチンＴＭ］および抗ｅｒｂｂ１抗体セツキシマブ［Ｃ２２５］）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば上皮細胞増殖因子ファミリーの阻害剤（例えば、Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ゲフィチニブ、ＺＤ１８３９）、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミン（エルロチニブ、ＯＳＩ−７７４）および６−アクリルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ＣＩ１０３３）のようなＥＧＦＲファミリーのチロシンキナーゼ阻害剤）およびセリン／トレオニンキナーゼ阻害剤）；並びに
（ｉｉｉ）代謝拮抗剤（例えばメトトレキセートのような抗葉酸拮抗剤、５−フルオロウラシルのようなフルオロピリミジン、テガフール、プリン、およびアデノシン類似体、シトシンアラビノシド）；抗腫瘍性抗生物質（例えばアドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシンおよびイダルビシンのようなアントラサイクリン、マイトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシン、およびミトラマイシン）；白金誘導体（例えばシスプラチン、カルボプラチン）；アルキル化剤（例えばナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロランブシル、ブスルファン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソ尿素、チオテパ）；抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビンのようなビンカアルカロイド、並びにタキソール、タキソテールのようなタキソイド）；トポイソメラーゼ阻害剤（例えばエトポシドおよびテニポシドのようなエピポドフィロトキシン、アムサクリン、トポテカン、カンプトテシン、そして更にイリノテカン）；更に酵素（例えばアスパラギナーゼ）；並びにチミジル酸シンターゼ阻害剤（例えばラルチトレキセド）のような、内科的腫瘍学において使用されるような抗増殖性／抗悪性腫瘍剤およびこれらの組合せ；
を包含してもよく、そして化学療法剤の更なる種類は：
（ｉｖ）生物学的応答調節因子（例えばインターフェロン）；
（ｖ）抗体（例えばエドレコロマブ）；
（ｖｉ）アンチセンス療法、ＩＳＩＳ２５０３、抗ｒａｓアンチセンスのような上記に収載した標的に向けられるもの；
（ｖｉｉ）例えば異常ｐ５３或いは異常ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２のような異常遺伝子を置換えるアプローチ、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼまたは細菌性ニトロレダクターゼ酵素を使用するもののようなＧＤＥＰＴ（遺伝子特異的酵素プロドラッグ療法）アプローチ、および多剤耐性遺伝子療法のような化学療法または放射線療法に対する患者の許容性を増加させるアプローチを含む遺伝子療法的アプローチ；並びに
（ｖｉｉｉ）例えばインターロイキン２、インターロイキン４または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子のようなサイトカインによるトランスフェクションのような患者の腫瘍細胞の免疫原性を増加するためのｅｘ−ｖｉｖｏおよびｉｎ−ｖｉｖｏアプローチ、Ｔ細胞アネルギーを減少させるアプローチ、サイトカインでトランスフェクトされた樹状細胞のようなトランスフェクトされた免疫細胞を使用するアプローチ、サイトカインでトランスフェクトされた腫瘍細胞系を使用するアプローチおよび抗イディオタイプ抗体を使用するアプローチを含む免疫療法アプローチ；
を含む。
【００６３】
例えば、このような連合治療は、本明細書中で先に定義したＺＤ６４７４一水和物およびＮ−アセチルコルチノール−Ｏ−リン酸（ＷＯ９９／０２１６６の実施例１）のような、ＷＯ９９／０２１６６に記載されている血管標的剤の、同時、連続または別個投与によって達成してもよい。
【００６４】
ＷＯ０１／７４３６０から、抗血管新生剤を、抗高血圧剤と組合せることができることが知られる。本発明のＺＤ６４７４一水和物も、更に抗高血圧剤と組合わせて投与することができる。抗高血圧剤は、血圧を低下させる薬剤である（例えば、本明細書中に参照により援用されるＷＯ０１／７４３６０を参照されたい）。
【００６５】
したがって、本発明によれば、有効な量の本明細書中で先に定義したＺＤ６４７４一水和物および抗高血圧剤の組合せの、ヒトのような温血動物への投与を含む、血管新生を伴う疾病状態の治療の方法が提供される。
【００６６】
本発明の更なる特徴によれば、ヒトのような温血動物における、血管新生を伴う疾病状態の治療のための医薬の製造において使用するための、本明細書中で先に定義したＺＤ６４７４一水和物および抗高血圧剤の組合せの使用が提供される。
【００６７】
本発明の更なる特徴によれば、ヒトのような温血動物における、血管新生を伴う疾病状態の治療のための、本明細書中で先に定義したＺＤ６４７４一水和物および抗高血圧剤を含む医薬組成物が提供される。
【００６８】
本発明の更なる側面によれば、ヒトのような温血動物における、抗血管新生および／または血管透過性減少効果を産生するための方法が提供され、これは、有効な量の本明細書中で先に定義したＺＤ６４７４一水和物および抗高血圧剤を、前記の動物に投与することを含む。
【００６９】
本発明の更なる側面によれば、ヒトのような温血動物における、抗血管新生および／または血管透過性減少効果を産生するための医薬の製造のための、本明細書中で先に定義したＺＤ６４７４一水和物および抗高血圧剤の組合せの使用が提供される。
【００７０】
好ましい抗高血圧剤は、カルシウムチャネルブロッカー、アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥ阻害剤）、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト（Ａ−ＩＩアンタゴニスト）、利尿剤、ベータ−アドレナリン受容体ブロッカー（β−ブロッカー）、血管拡張剤およびアルファ−アドレナリン受容体ブロッカー（α−ブロッカー）である。特別な抗高血圧剤は、カルシウムチャネルブロッカー、アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥ阻害剤）、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト（Ａ−ＩＩアンタゴニスト）およびベータ−アドレナリン受容体ブロッカー（β−ブロッカー）であり、特にカルシウムチャネルブロッカーである。
【００７１】
先に記述したように、ＺＤ６４７４一水和物は、その抗血管新生および／または血管透過性低下効果のために興味あるものである。ＺＤ６４７４一水和物は、癌、糖尿病、乾癬、関節リウマチ、カポジ肉腫、血管腫、リンパ浮腫、急性および慢性腎症、アテローム、動脈再狭窄、自己免疫性疾病、急性炎症、過剰な瘢痕形成および癒着、子宮内膜症、機能障害性子宮出血、および加齢性黄斑変性症を含む網膜血管の増殖に伴う眼病を含む広い範囲の疾病状態において有用であることが予測される。癌は、いずれの組織に影響する場合があり、そして白血病、多発性骨髄腫およびリンパ腫を含む。特に本発明のこのような化合物は、例えば結腸、乳房、前立腺、肺および皮膚の原発性および再発性固形腫瘍の増殖を、好都合に遅延することが予測される。更に特に、この本発明のような化合物は、白血病、多発性骨髄腫およびリンパ腫を含むＶＥＧＦに伴ういずれの形態の癌を、そして更に例えば、ＶＥＧＦに伴う原発性および再発性固形腫瘍、特に、例えば結腸、乳房、前立腺、肺、脳 外陰部および皮膚のある種の腫瘍を含むその増殖並びに伝播がＶＥＧＦに有意に依存する腫瘍の増殖を、阻害することが予測される。
【００７２】
その治療薬における使用に加えて、本明細書において定義されたＺＤ６４７４一水和物は、更に新しい治療剤のための探求の一部としての、ネコ、イヌ、ウサギ、サル、ラットおよびマウスのような実験室動物におけるＶＥＧＦ受容体型チロシンキナーゼ活性の阻害剤の効果の評価のためのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの試験系の開発および標準化における薬理学的道具としても有用である。
【００７３】
ＷＯ０１／３２６５１に記載され、そしてＺＤ６４７４を試験するために使用されたアッセイは、以下のとおりである：
（ａ）Ｉｎ ｖｉｔｒｏの受容体型チロシンキナーゼ阻害試験
このアッセイは、試験化合物のチロシンキナーゼ活性を阻害する能力を決定する。ＶＥＧＦまたは上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）受容体の細胞質領域をコードするＤＮＡは、全遺伝子合成（Ｅｄｗａｒｄｓ Ｍ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂ ５（３），１９−２５，１９８７）またはクローニングによって得ることができる。次いでこれらを、適した発現系中で発現して、チロシンキナーゼ活性を持つポリペプチドを得ることができる。例えば、昆虫細胞中の組換えタンパク質の発現によって得られたＶＥＧＦおよびＥＧＦ受容体細胞質領域は、本来のチロシンキナーゼ活性を示すことが見出された。ＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ５１６０２）の場合、Ｓｈｉｂｕｙａら（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９０，５： ５１９−５２４）によって記載された、メチオニン７８３に始まり終結コドンを含む細胞質領域の殆んどをコードする１．７ｋｂのＤＮＡ断片を、ｃＤＮＡから単離し、そしてバキュロウイルストランスプラントベクター（例えばｐＡｃＹＭ１（Ｔｈｅ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ，Ｌ．Ａ．Ｋｉｎｇ ａｎｄ Ｒ．Ｄ．Ｐｏｓｓｅｅ，Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，１９９２を参照されたい）またはｐＡｃ３６０或いはｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能））にクローンした。この組換えコンストラクトを、ウイルスＤＮＡ（例えばＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ）と共に昆虫細胞（例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ２１（Ｓｆ２１））中にコトランスフェクションして、組換えバキュロウイルスを調製した。（組換えＤＮＡ分子の構築のための方法並びに組替えバキュロウイルスの調製および使用の詳細は、標準的なテキスト、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ，１９９２，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ中に見出すことができる）。アッセイにおいて使用するための他のチロシンキナーゼに対しては、メチオニン８０６（ＫＤＲ，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｌ０４９４７）およびメチオニン６６８（ＥＧＦ受容体、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ００５８８）から出発する細胞質断片をクローンし、そして同様な方法で発現させることができる。
【００７４】
ｃＦｌｔチロシンキナーゼ活性の発現のために、Ｓｆ２１細胞を、プラーク的に純粋なｃＦｌｔ組換えウイルスで、感染多重度３で感染させ、そして４８時間後に回収した。回収した細胞を、氷冷のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１０ｍＭのｐＨ７．４のリン酸ナトリウム、１３８ｍＭの塩化ナトリウム、２．７ｍＭの塩化カリウム）で洗浄し、次いで氷冷のＨＮＴＧ／ＰＭＳＦ（２０ｍＭのｐＨ７．５のＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１０％ｖ／ｖのグリセロール、１％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、１．５ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのエチレングリコール−ビス（βアミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）；ＰＭＳＦは、新しく調製したメタノール中の１００ｍＭの溶液から使用の直前に加えた）中に、１千万の細胞当り１ｍｌのＨＮＴＧ／ＰＭＳＦを使用して再懸濁した。懸濁液を、１０分間１３，０００ｒｐｍで４℃で遠心し、上清（ストック酵素）を除去し、そして小分けして−７０℃で保存した。それぞれの新しいバッチのストック酵素を、酵素希釈液（１００ｍＭのｐＨ７．４のＨｅｐｅｓ、０．２ｍＭのオルトバナデートナトリウム、０．１％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、０．２ｍＭのジチオトレイトール）で希釈することによってアッセイ中で滴定した。典型的なバッチのために、ストック酵素を、その１に対して酵素希釈液２０００で希釈し、そして５０μｌの希釈酵素液をそれぞれのアッセイのウェルで使用した。
【００７５】
基質溶液のストックを、チロシンを含有するランダムコポリマー、例えばポリ（Ｇｌｕ，Ａｌａ，Ｔｙｒ）６：３：１（Ｓｉｇｍａ Ｐ３８９９）から調製し、ＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍｌのストックとして−２０℃で保存し、そしてプレート被覆のためにその１に対してＰＢＳ ５００で希釈した。
【００７６】
アッセイの１日前、１００μｌの希釈された基質溶液を、アッセイプレート（Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェル免疫プレート）の全てのウェルに分注し、これを密封し、そして４℃で一晩放置した。
【００７７】
アッセイの日、基質溶液を廃棄し、そしてアッセイプレートのウェルを、ＰＢＳＴ（０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ）で１回、そして５０ｍＭのｐＨ７．４のＨｅｐｅｓで１回洗浄した。
【００７８】
試験化合物を１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈し、そして２５μｌの希釈された化合物を、洗浄されたアッセイプレートのウェルに移した。“全”対照ウェルは、化合物の代わりに１０％のＤＭＳＯを含有していた。２５マイクロリットルの、８μＭのアデノシン−５’−三リン酸（ＡＴＰ）を含有する４０ｍＭの塩化マンガン（ＩＩ）を、ＡＴＰを含まない塩化マンガン（ＩＩ）を含有する“ブランク”対照ウェルを除く全ての試験ウェルに加えた。反応を開始させるために、５０μｌの新しく希釈した酵素をそれぞれのウェルに加え、そしてプレートを室温で２０分間インキュベートした。次いで液体を廃棄し、そしてウェルを２回ＰＢＳＴで洗浄した。０．５％ｗ／ｖのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳＴで１対６０００に希釈された、１００マイクロリットルのマウスＩｇＧ抗ホスホチロシン抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．製品０５−３２１）を、それぞれのウェルに加え、そしてプレートを１時間室温でインキュベートしてから、液体を廃棄し、そしてウェルを２回ＰＢＳＴで洗浄した。０．５重量／容量％のＢＳＡを含有するＰＢＳＴで１対５００に希釈された、１００マイクロリットルの西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に連結したヒツジ抗マウスＩｇ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ製品ＮＸＡ ９３１）を加え、そしてプレートを１時間室温でインキュベートしてから、液体を廃棄し、そしてウェルを２回ＰＢＳＴで洗浄した。５０ｍｌの新しく調製した５０ｍＭのｐＨ５．０のリン酸−クエン酸緩衝液＋０．０３％の過ホウ酸ナトリウム（１００ｍｌの蒸留水当り、１個の、過ホウ酸ナトリウムを伴うリン酸−クエン酸緩衝液（ＰＣＳＢ）のカプセル（Ｓｉｇｍａ Ｐ４９２２）で製造）中の、１個の５０ｍｇのＡＢＴＳ錠剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ １２０４ ５２１）を使用して、新しく調製した１００マイクロリットルの２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）溶液を、それぞれのウェルに加えた。次いで、プレート読取り分光光度計を使用して４０５ｎｍで測定したときの“全”対照ウェルの光学密度値が約１．０となるまで、プレートを２０−６０分間室温でインキュベートした。“ブランク”（ＡＴＰなし）および“全”（化合物なし）対照の値を使用して、酵素活性を５０％阻害する試験化合物の希釈範囲を決定した。
【００７９】
（ｂ）Ｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＵＶＥＣ増殖アッセイ
このアッセイは、試験化合物の、増殖因子により刺激されたヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖を阻害する能力を決定する。
【００８０】
ＨＵＶＥＣ細胞を、ＭＣＤＢ １３１（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）＋７．５％ｖ／ｖのウシ胎児血清（ＦＣＳ）中で単離し、そしてＭＣＤＢ １３１＋２％ｖ／ｖ ＦＣＳ＋３μｇ／ｍｌのヘパリン＋１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン中、１０００細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに入れた（２〜８継代で）。最低４時間後、これに適当な増殖因子（即ち３ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、３ｎｇ／ｍｌのＥＧＦまたは０．３ｎｇ／ｍｌのβ−ＦＧＦ）および化合物を投与した。次いで培養物を、４日間３７℃で７．５％の二酸化炭素でインキュベートした。４日目に、培養物を、１μＣｉ／ウェルのトリチウム化したチミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ製品ＴＲＡ ６１）でパルス標識し、そして４時間インキュベートした。細胞を９６ウェルプレート回収器（Ｔｏｍｔｅｋ）を使用して回収し、そして次いでトリチウムの組込みをベータプレートカウンターでアッセイした。ｃｐｍで表示される放射能の細胞への組込みを使用して、化合物による増殖因子により刺激された細胞増殖の阻害を測定した。
【００８１】
（ｃ）Ｉｎ ｖｉｖｏの固形腫瘍疾病モデル
この試験は、固形腫瘍の成長を阻害する化合物の能力を測定する。
５０％（ｖ／ｖ）マトリゲルを含む無血清培養培地１００μｌ中の１×１０６のＣａＬｕ−６細胞／マウスの皮下注射によって、ＣａＬｕ−６異種移植腫瘍を、メスの胸腺欠損Swiss ｎｕ／ｎｕマウスの側腹部に確立した。細胞移植の１０日後、比較可能な平均体積のグループを達成するように、マウスを８−１０匹のグループに割り当てた。腫瘍をノギスを使用して測定し、そして体積を：（ｌ×ｗ）×√（ｌ×ｗ）×（π／６）として計算した。ここで、ｌは、最長直径であり、そしてｗは、最長直径と垂直な直径である。試験化合物を、最低２１日毎日１回経口投与し、そして対照マウスには、化合物の希釈液を投与した。腫瘍を週２回測定した。成長阻害のレベルを、処理グループに対する対照グループの平均腫瘍体積の比較によって計算し、そして統計的有意性をスチューデントｔ−検定および／またはＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定を使用して決定した。化合物処理の阻害効果は、ｐ＜０．０５である場合に、有意と考えた。
【００８２】
本発明の化合物の毒物プロファイルは、例えば、本明細書中で以下に記載されるようなラットの１４日の研究を使用して評価することができる。
（ｄ）ラットにおける１４日の毒性試験
この試験は、大腿骨遠位端および脛骨近位端の大腿骨骨端成長板における肥大化領域の増加における化合物の活性を測定し、そして他の組織の病理組織学的変化の評価を可能にする。
【００８３】
血管新生は、長骨の伸長における軟骨内骨化に必須の現象であり、そして成長板の血管浸潤は、肥大化軟骨細胞によるＶＥＧＦ産生に依存することが示唆されている。肥大化軟骨細胞領域の拡大および血管新生の阻害が、例えば（ｉ）マウス中の可溶性ＶＥＧＦ受容体キメラタンパク質（Ｆｌｔ−（１−３）−ＩｇＧ）（Ｇｅｒｂｅｒ，Ｈ−Ｐ．，Ｖｕ，Ｔ．Ｈ．，Ｒｙａｎ，Ａ．Ｍ．，Ｋｏｗａｌｓｋｉ，Ｊ．，Ｗｅｒｂ，Ｚ．ａｎｄ Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．ＶＥＧＦ ｃｏｕｐｌｅｓ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ，ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｄｕｒｉｎｇ ｅｎｄｏｃｈｏｎｄｒａｌ ｂｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，５：６２３−６２８，１９９９）および（ｉｉ）カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓ ｍｏｎｋｙ）の組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナルＩｇＧ１抗体（Ｒｙａｎ，Ａ．Ｍ．，Ｅｐｐｌｅｒ，Ｄ．Ｂ．，Ｈａｇｌｅｒ，Ｋ．Ｅ．，Ｂｒｕｎｅｒ，Ｒ．Ｈ．，Ｔｈｏｍｆｏｒｄ，Ｐ．Ｊ．，Ｈａｌｌ，Ｒ．Ｌ．，Ｓｈｏｐｐ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ Ｏ’Ｎｉｅｌｌ，Ｃ．Ａ．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓａｆｅｔｙ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｈｕＭＡｂＶＥＧＦ，ａｎ ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｈｕｍａｎｉｓｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｔｏｘ．Ｐａｔｈ．，２７：７８−８６，１９９９）のようなＶＥＧＦを特異的に捕捉する薬剤による処理の後に証明されている。
【００８４】
したがって、ＶＥＧＦ受容体型チロシンキナーゼ活性の阻害剤は、更に軟骨の血管透過も阻害し、そして成長中の動物の大腿遠位および脛骨近位端の大腿骨骨端成長板における肥大化領域を増加するはずである。
【００８５】
化合物は、最初、脱イオン水中のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレートの１％（ｖ／ｖ）溶液中、４℃で一晩（少なくとも１５時間）ボールミルによる懸濁によって調合した。化合物を、投与直前の撹拌によって再懸濁した。Ｙｏｕｎｇ Ａｌｄｅｒｌｅｙ Ｐａｒｋラット（Ｗｉｓｔａｒ由来、体重１３５−１５０ｇ、生後４〜８週、グループ当り５−６匹）に、化合物（０．２５ｍｌ／１００ｇ体重で）またはベヒクルを、一日一回、連続１４日間強制経口によって投与した。１５日目に、ラットを、増加する濃度の二酸化炭素を使用して人道的に終結させ、そして死後処理を行った。大腿骨−脛骨関節を含む範囲の組織を収集し、そして標準的な組織学的技術によって加工して、パラフィンワックス切片を製造した。組織学的切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、そして光学顕微鏡によって組織病理学の検査を行った。大腿遠位および脛骨近位端の大腿骨骨端成長板面積を、大腿骨および脛骨の切片において形態計測的画像分析によって測定した。肥大化の領域の増加を、処理グループに対する対照グループの平均骨端成長板面積の比較によって決定し、そして統計的有意性を、片側スチューデントｔ検定を使用して決定した。化合物処理の阻害効果は、ｐ＜０．０５である場合に、有意であると考えた。
【００８６】
ＷＯ０１／３２６５１中に開示されているように、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）によって試験されたＺＤ６４７４（ＷＯ０１／３２６５１の実施例２に記載されている方法によって調製）は、以下の結果：
（ａ）１．６μＭのＦｌｔ−ＩＣ５０
０．０４μＭのＫＤＲ−ＩＣ５０
０．５μＭのＥＧＦＲ−ＩＣ５０
（ｂ）０．０６のＶＥＧＦ−ＩＣ５０
０．１７μＭのＥＧＦ−ＩＣ５０
＞３μＭの基底−ＩＣ５０；
（ｃ）５０ｍｇ／ｋｇにおける腫瘍成長の７８％阻害；ｐ＜０．００１（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定）；
（ｄ）メスのラットにおける１００ｍｇ／ｋｇ／日における骨端増殖板肥大化の７５％増加；ｐ＜０．００１（片側スチューデントｔ検定）；
を与えた。
【００８７】
本明細書中で先に定義したＺＤ６４７４一水和物は、化学的に関連する化合物の調製に適用可能であることが知られているいずれの方法によって調製してもよい。このような方法は、本発明の更なる特徴として提供され、そして本明細書中で以下に記載される。必要な出発物質は、有機化学の標準的な方法によって得てもよい。ＺＤ６４７４の無水の形態は、ＷＯ０１／３２６５１に記載されている方法のいずれによって調製してもよく、特にＷＯ０１／３２６５１の実施例２ｂおよび２ｃを参照されたい。別の方法として、必要な出発物質は、有機化学者にとって通常の技術の範囲内である、例示されたものと類似の方法によって得ることが可能である。
【００８８】
以下の方法は、本発明の更なる特徴を構成する。
ＺＤ６４７４一水和物の合成
（ａ）このような方法は、本発明の更なる側面を提供し、そして例えば：
（ｉ）ＺＤ６４７４遊離塩基を水性有機溶媒混合物中に溶解して、溶液を形成し；
（ｉｉ）自発的結晶化が起こることを可能にし；そして
（ｉｉｉ）このようにして形成された結晶の固体を単離すること；
の工程を含む。
【００８９】
（ｂ）別のこのような方法は、本発明の更なる側面を提供し、そして例えば：
（ｉ）ＺＤ６４７４遊離塩基を水性有機溶媒混合物中に溶解して、溶液を形成し；
（ｉｉ）ＺＤ６４７４一水和物の種結晶を加えて、ＺＤ６４７４一水和物の結晶化を開始させ；そして
（ｉｉｉ）このようにして形成された結晶の固体を単離すること；
の工程を含む。
【００９０】
上記の（ａ）および（ｂ）の（ｉ）の部分のために、使用される有機溶媒は、いずれの非溶媒和溶媒でもよい。用語“非溶媒和溶媒”によって、我々は、ＺＤ６４７４と結晶溶媒和物を形成しない溶媒を意味する。更に具体的には、有機溶媒は、約０．４〜１．０、特に約０．５〜０．９５の水分活性を与えるような量の水を含む。用語“水分活性”によって、我々は、基質が、特定の相対湿度における周囲の大気と平衡にある場合に存在量の少数としての、基質（例えば溶媒）中の利用可能な水を意味する。言い換えれば、基質の周囲の７０％の平衡相対湿度は、基質が、０．７０の水分活性を有することを意味する。例えば、上記の（ａ）および（ｂ）の（ｉ）の部分に関して、有機溶媒は、テトラヒドロフランのようなエーテルでもよい。特に、テトラヒドロフランは、５〜１０容量％、特に１０％の水を含有して、水性有機溶媒混合物を提供してもよい。言い換えれば、混合物は、９５〜９０容量％、特に９０％のテトラヒドロフラン、および５〜１０容量％、特に１０％の水を含有してもよい。
【００９１】
（ａ）および（ｂ）の（ｉ）の部分のために、混合物を、必要な場合、溶解が起こるまで加熱還流してもよい。別の方法として、混合物を、実質的に全ての固体物質の溶解が起こることを条件として、例えば溶媒混合物の還流温度より低い温度で加熱してもよい。少量の不溶性物質を、温めた混合物の濾過によって除去してもよいことは、認識されるものであろう。
【００９２】
上記の（ａ）および（ｂ）において、そのようにして形成された結晶の固体は、いずれの慣用的な方法、例えば濾過によって単離してもよい。次いで単離された結晶の固体は、乾燥させてもよい。例えば、結晶の固体を加湿せずに乾燥する場合、適した乾燥温度は、約２０〜３０℃、特に約２５℃である。結晶の固体が加湿を伴って乾燥される場合、乾燥温度は、約３０〜５０℃、特に約４０℃である。
【００９３】
本発明は、本明細書中で以下に、次の限定されない実施例、データおよび図によって例示され、ここでは、他に記述しない限り：−
（ｉ）エバポレーションは、真空中でロータリーエバポレーターによって行い、そしてワークアップ手順は、乾燥剤のような残留固体の濾過による除去後に行った；
（ｉｉ）収率は、例示のみのために与えられ、そして必ずしも達成し得る最大値ではない；
（ｉｉｉ）融点は、未補正であり、そしてＭｅｔｔｌｅｒ ＤＳＣ８２０ｅを使用して決定した；
（ｉｖ）最終生成物の構造は、核（一般的にプロトン）磁気共鳴（ＮＭＲ）および質量スペクトル技術によって確認した；プロトン磁気共鳴の化学シフト値は、デルタスケールで測定され、そしてピーク多重度は、次のように示される：ｓ,シングレット；ｄ,ダブレット；ｔ,トリプレット；ｍ,マルチプレット；ｂｒ,ブロード；ｑ,カルテット；ｑｕｉｎ,クインテット；全ての試料を、示した溶媒中でＢｒｕｋｅｒ ＤＰＸ４００ＭＨｚで、３００Ｋで、１６スキャン、１０秒のパルス繰返し時間で行った；
（ｖ）中間体は、一般的に完全には特徴づけされず、そして純度は、ＮＭＲ分析によって評価した；そして
（ｖｉ）以下の略語：
ＲＨ 相対湿度
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＩＰＡ イソプロパノール
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＤＳＣ 示差走査熱量測定法
ＴＧＡ 熱重量分析
ｖ／ｖ 容量／容量比
ｗ／ｗ 重量／重量比
を使用した。
【００９４】
実施例１：ＷＯ０１／３２６５１の実施例２ｃのＺＤ６４７４遊離塩基の単離工程の繰返し
上記で議論したように、ＷＯ０１／３２６５１の実施例２ｃにおいて、ＺＤ６４７４遊離塩基は、固体として単離されている。ＷＯ０１／３２６５１の実施例２ｃにおいて、ＺＤ６４７４の塩酸塩は、塩酸塩を塩化メチレン中に懸濁し、そして懸濁液を飽和水性炭酸水素ナトリウムで洗浄して、塩化メチレン中にＺＤ６４７４遊離塩基の溶液を得ることによってＺＤ６４７４遊離塩基に変換されている。次いでＺＤ６４７４遊離塩基の塩化メチレン中の溶液を、硫酸マグネシウムを使用して乾燥し、そして揮発性物質をエバポレーションによって除去している。
【００９５】
本出願のこの実施例において、ＷＯ０１／３２６５１の実施例２ｃの単離工程を、ＺＤ６４７４遊離塩基の塩化メチレン中の溶液（水洗される）が得られた段階から繰返した。当業者が認識するものであるように、ＺＤ６４７４遊離塩基の塩化メチレン中の溶液を調製するための単離工程に先だって使用された工程は、特定の単離工程によって得られるＺＤ６４７４の形態と無関係である。更に、いずれの中和工程（諸工程）も、得られるＺＤ６４７４の形態に影響しない。
【００９６】
ＺＤ６４７４（２５０．５ｍｇ）の試料を、Ｗｈｅａｔｏｎの使い捨てガラス製シンチレーションバイアル中に入れ、そしてジクロロメタン（１０ｍｌ）を加えた。バイアルに蓋をし、そして混合物を１０分間穏やかに回転させて、固体を溶解した。次いで水（５ｍｌ）を溶液に加え、そして混合物を３０秒間激しく振盪した。混合物を２分間静置させ、そして次いでジクロロメタン層をガラス製ピペットで除去し、そして別のガラス製シンチレーションバイアルに入れた。硫酸マグネシウムを溶液に加え、そして混合物を回転させて、固体を十分に分散させた。固体がもはや一緒に凝集せず、掻き回すことによって微細な分散物が形成されるまで、硫酸マグネシウムの添加を継続した。混合物を一晩静置した。次いで硫酸マグネシウムを濾過によって除去し、そしてジクロロメタン（１ｍｌ）で洗浄した。濾液および洗浄液をあわせ、そしてエバポレーションして、微細な白色の結晶の固体を得た。次いでこの物質をＸＲＰＤによって（本明細書中で以下に記載される方法によって）分析した。ＸＲＰＤの波形（図９）は、物質がＺＤ６４７４の無水の形態であることを示す（図２参照）。当業者が認識するように、ピークの高さのいずれの差も、好ましい結晶配向によるものである。
【００９７】
実施例２：ＺＤ６４７４無水物の調製
ＺＤ６４７４遊離塩基を、ＷＯ０１／３２６５１の実施例２ｂに記載されている方法によって調製した。ＺＤ６４７４遊離塩基（１０ｇ）を、テトラヒドロフラン（５０ｍｌ）、水（２５ｍｌ）および酢酸ｎ−ブチル（４０ｍｌ）中に懸濁し、そして懸濁物を加熱還流して、溶液を得た。水相を分離し、そして有機相を濾過し、そしてテトラヒドロフラン（５ｍｌ）で洗浄した。酢酸ｎ−ブチル（６０ｍｌ）を加え、そして混合物を、１０６℃の内容物温度が達成されるまで常圧で蒸留した。得られたＺＤ６４７４のスラリーを冷却し、そして固体を濾過によって単離し、酢酸エチル（２０ｍｌ）で洗浄し、そして乾燥させて、ＺＤ６４７４無水物（９．２ｇ、９２％）を得た；ＮＭＲスペクトル（ピリジン−ｄ５）１．４９（２Ｈ，ｍ），１．７５−１．９０（５Ｈ，ｍ），２．１５（３Ｈ，ｓ），２．７６（２Ｈ，ｍ），３．６３（３Ｈ，ｓ），３．９７（２Ｈ，ｄ），７．３８（１Ｈ，ｄｄｄ），７．４９（１Ｈ，ｄｄ），７．６４（１Ｈ，ｓ），７．８８（１Ｈ，ｔ），７．８９（１Ｈ，ｓ），９．０１（１Ｈ，ｓ），１０．３７（１Ｈ，ｓ）；質量スペクトル ＭＨ＋ ４７５。
【００９８】
実施例３：ＺＤ６４７４の異なった相対湿度において最も適した形態を探求するための特定の水分活性における水性イソプロパノール中のスラリー実験
ＺＤ６４７４無水物（５０ｍｇ）およびＺＤ６４７４一水和物（５０ｍｇ）を、０．３、０．４および０．５の水分活性（それぞれ３０％相対湿度、４０％相対湿度および５０％相対湿度に対応）を有する異なった比のイソプロパノール／水中で、２４時間かけて２５℃でスラリー化した。次いで得られた物質を濾過して取出し、そして空気乾燥させた。これらの実験は、２５℃において、ＺＤ６４７４無水物は、≦３０％相対湿度において熱力学的に安定形態であり、そしてＺＤ６４７４一水和物は、≧４０％相対湿度において熱力学的に安定な形態であることを示した。
【００９９】
実施例４：ＺＤ６４７４一水和物の調製
ＺＤ６４７４遊離塩基を、ＷＯ０１／３２６５１の実施例２ｂに記載されている方法によって調製した。ＺＤ６４７４遊離塩基（１０．０６ｇ）を、水性テトラヒドロフラン（９０％テトラヒドロフラン／１０％水、ｖ／ｖ）に周囲温度で加えた。混合物を撹拌し、そして全ての固体が溶解するまで４０℃に温めた。更なるＺＤ６４７４遊離塩基（１．４４ｇ）を混合物に４２℃で加え、そして混合物を２０分間撹拌して、透明な溶液を得た。溶液を５０℃に温め、そしてこの温度で４時間撹拌した。次いで溶液を室温に冷却し、そして１２日間撹拌して、スラリーを得た。得られた固体を真空（６００〜７００ｍｂａｒ）下で濾過し、そして真空（２００ｍｂａｒ）下の空気中で１時間乾燥させた。カールフィッシャー分析を、乾燥したＺＤ６４７４生成物に対して、本明細書中で以下に記載される方法によって行い、そして３．９０４％の数値を得て、これは、ＺＤ６４７４一水和物と一致した；ＮＭＲスペクトル（ピリジン−ｄ５）１．４９（２Ｈ，ｍ），１．７５−１．９０（５Ｈ，ｍ），２．１５（３Ｈ，ｓ），２．７６（２Ｈ，ｍ），３．６３（３Ｈ，ｓ），３．９７（２Ｈ，ｄ），７．３８（１Ｈ，ｄｄｄ），７．４９（１Ｈ，ｄｄ），７．６４（１Ｈ，ｓ），７．８８（１Ｈ，ｔ），７．８９（１Ｈ，ｓ），９．０１（１Ｈ，ｓ），１０．３７（１Ｈ，ｓ）；質量スペクトル ＭＨ＋ ４７５。
【０１００】
実施例５：ＺＤ６４７４一水和物の別の調製方法
これは、３０℃に設定された温度制御されたガラス製反応容器中で調製した。容器に、無水のＺＤ６４７４を入れた。これに、３相対体積のテトラヒドロフラン（安定化された）および７相対体積の純水を加えた（即ち、３リットルのＴＨＦおよび７リットルの水が１ｋｇのＺＤ６４７４に対して使用されるものである）。内容物を撹拌して、クリーム色のスラリーを形成させた。反応のターンオーバーは、典型的には１時間以内であるが、しかし１時間後に少量のスラリーの試料を採取し、濾過し、次いで粉末ＸＲＤスペクトルを取って、これを確認することができる。固体を分割ブフナー漏斗上で濾過することによって単離した。反応容器を２相対体積の水で洗浄した。次いで反応容器の洗浄液をブフナー漏斗のフィルターケーキの置換洗浄液として使用した。更なる洗浄を、反応容器に加えた更なる２相対体積の水を使用して行い、これを再びフィルターケーキを洗浄するために使用した。
【０１０１】
固体を真空オーブンに移し、そして周囲温度で乾燥するまで乾燥させた。乾燥中に固体は、規則的にスラリー化した。乾燥は非常に遅く、典型的には、３５０ｇのバッチを乾燥するのに約２週間を要した。
【０１０２】
実施例６：ＺＤ６４７４一水和物の別の調製方法
ＺＤ６４７４遊離塩基を、ＷＯ０１／３２６５１の実施例２ｂに記載されている方法によって調製する。ＺＤ６４７４遊離塩基（１０．０６ｇ）を、温度制御されたガラス製反応容器中の水性テトラヒドロフラン（９０％テトラヒドロフラン／１０％水、ｖ／ｖ）に周囲温度で加える。混合物を撹拌し、そして全ての固体が溶解するまで４０℃に温める。更なるＺＤ６４７４遊離塩基（１．４４ｇ）を混合物に４２℃で加え、そして混合物を２０分間撹拌して、透明な溶液を得る。溶液をこの時点で濾過（ｓｃｒｅｅｎｅｄ）してもよい。次いで溶液を５０℃に温め、そしてこの温度で４時間撹拌する。次いで溶液を室温に冷却し、そして１日間撹拌して、スラリーを得る。次いで少量のスラリーを採取し、濾過し、そして粉末ＸＲＤスペクトルを得る。ＸＲＤスペクトルが、全ての無水のＺＤ６４７４が一水和物に変換されていることを示した場合、これを、以下に詳述するように単離する。ＸＲＤスペクトルが、無水のＺＤ６４７４およびＺＤ６４７４一水和物の混合物を示す場合、溶液を更に４時間周囲温度で、理想的には約２０℃で撹拌し、そして次いで再試験する。ＸＲＤスペクトルが、主として全て無水のＺＤ６４７４を示す場合、ＺＤ６４７４一水和物の結晶（理論的最終収量の０．１−１重量％）を播種し、そして溶液を、更に４時間周囲温度で、理想的には約２０℃で撹拌し、そして次いで再試験することができる。全ての無水のＺＤ６４７４が、ＺＤ６４７４一水和物に変換されるまで、この方法を繰返すことができる。
【０１０３】
固体は、分割ブフナー漏斗上の濾過によって単離される。反応容器を２相対体積の水で洗浄する。次いで反応容器の洗浄液を、ブフナー漏斗のフィルターケーキの置換洗浄液として使用する。更なる洗浄を、反応容器に加えた更なる２相対体積の水を使用して行い、これを再びフィルターケーキを洗浄するために使用する。
【０１０４】
固体を真空オーブンに移し、そして周囲温度で乾燥するまで乾燥する。乾燥中に固体は、規則的にスラリー化する。乾燥は非常に遅く、典型的には、３５０ｇのバッチを乾燥するのに約２週間を要する。
【０１０５】
使用した技術の詳細
Ｘ線粉末回折
【０１０６】
【表３】
【０１０７】
分析装置：Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｄ５０００、石英を使用して校正。
Ｘ線粉末回折スペクトルを、結晶のＺＤ６４７４物質の試料を、Ｓｉｅｍｅｎｓの単一ケイ素結晶（ＳＳＣ）ウエファーのマウント上にマウントし、そして顕微鏡用スライドの補助により試料を薄層に広げることによって決定した。試料を、毎分３０回転で回転させ（計数統計を改善するため）、そして１．５４０６オングストロームの波長を持つＣｕＫα照射を使用する、４０ｋＶおよび４０ｍＡで操作される銅精密長焦点管によって発生するＸ線で照射した。視準を合わせたＸ線源を、Ｖ２０に設定した自動可変発散スリットを通過させ、そして反射した照射を、２ｍｍの散乱線防止スリットおよび０．２ｍｍの検出スリットを通して導いた。試料を、シータ−シータモードにおいて２度〜４０度の２シータの範囲にわたって、０．０２度の２シータの増分当り（連続走査モード）１秒間暴露した。試験時間は、３１分４１秒であった。装置は、シンチレーションカウンターを検出器として備えていた。制御およびデータ収集は、Ｄｉｆｆｒａｃｔ＋ソフトウェアで操作されるＤｅｌｌ Ｏｐｔｉｐｌｅｘ ６８６ ＮＴ４．０ワークステーションによった。Ｘ線粉末回折の技術分野の当業者は、ピークの相対強度が、例えば試料の分析に影響してもよい、大きさが３０ミクロンより上の粒子、および非統一性の縦横比によって影響されうることを認識するであろう。当業者は、反射の位置が、回折計中に位置する試料の正確な高さ、および回折計のゼロ校正によって影響されうることを更に認識するであろう。更に、試料の表面の平面性も小さな影響を有してもよい。したがって、与えられた回折パターンのデータは、絶対値として解釈されるべきではない。
【０１０８】
動的水蒸気吸着
分析装置：Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ Ｓｙｓｔｅｍｓの動的水蒸気吸着分析器、塩化ナトリウムのような飽和塩溶液で校正。
【０１０９】
規定された温度の石英ホルダー中に含有された約５ｍｇの物質を、次の相対湿度（ＲＨ）：０、２０、４０、６０、８０、９５、８０、６０、４０、２０、０％ＲＨで、２００ｍｌ／分の窒素流量で加湿された窒素に、デュプリケートでかけた。
【０１１０】
特定の相対湿度における物質の重量を、これが、１０分間にわたり平均された毎分当りの変化が、０．００２重量％の重量基準に対して安定となるまで、ｉｎ−ｓｉｔｕの秤を使用して定期的にモニターした。重量がなお変化している場合、これを、重量が安定するまで、特定の相対湿度に留めた（最大時間１２時間まで）。
【０１１１】
示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）
分析装置：Ｍｅｔｔｌｅｒ ＤＳＣ８２０ｅ
ＤＳＣを、熱流束（ｈｅａｔ ｒｅｆｌｕｘ）型ＤＳＣによって、インジウム金属を標準校正に使用して行った。典型的には、穴の開いた蓋を備えた４０μｌのアルミニウムパン中に含有された５ｍｇより少ない物質を、２５℃〜３２５℃の範囲の温度にわたって、毎分１０℃の一定の加熱速度で加熱した。窒素を使用した置換ガスを使用した−毎分１００ｍｌの流量。ＤＳＣの更なる情報関しては、読者は：ＤＳＣ／ＴＧＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ １９８６ Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ＆ Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ａｌｌｙｎ ａｎｄ Ｂａｃｏｎ ＩＳＢＮ００２０５０８６８５３を参照されたい。
【０１１２】
熱重量分析（ＴＧＡ）
分析装置：Ｍｅｔｔｌｅｒ ＴＧ８５１、標準校正用分銅を使用して重量を校正。
典型的には、７０μｌのａｌｏｘ（酸化アルミニウム）坩堝中に含有された３〜１２ｍｇの物質を、２５℃〜３２５℃の範囲の温度にわたって、毎分１０℃の一定の加熱速度で加熱し、その間ｉｎ−ｓｉｔｕの秤を使用して定期的に重量をモニターした。ヘリウムを使用する置換ガスを使用した−毎分５０ｍｌの流量。
【０１１３】
ＴＧＡの更なる情報関しては、読者は：ＤＳＣ／ＴＧＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ（１９８６）Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ＆ Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ａｌｌｙｎ ａｎｄ Ｂａｃｏｎ ＩＳＢＮ００２０５０８６８５３を参照されたい。
【０１１４】
カールフィッシャー水含有率
分析装置：Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ水分計ＣＡ−０５
典型的には、約５０ｍｇの物質を使用した。
【０１１５】
カールフィッシャー水含有率の測定の更なる情報に関しては、読者は：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９６）ｂｙ Ｓｋｏｏｇ，Ｗｅｓｔ ａｎｄ Ｈｏｌｌｅｒ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｒｏｏｋｓ／Ｃｏｌｅ ＩＳＢＮ０−０３−００５９３８−０を参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】図１は、温度℃を横軸に、そして熱流量／％重量喪失を縦軸にプロットしたＺＤ６４７４無水物のＤＳＣおよびＴＧＡの熱記録である。上部のプロットはＴＧＡのプロットであり、そして下部のプロットはＤＳＣのプロットである。ｙ軸上のＴＧＡプロットのスケールは、グラフに示すように２ｍｇであり、そしてｙ軸上のＤＳＣプロットのスケールは、グラフに示すように１０ｍＷである。
【図２】図２は、２シータ値を横軸にプロットし、そして相対線強度（カウント数）を縦軸にプロットした、ＺＤ６４７４無水物のＸ線粉末回折パターンである。
【図３】図３は、標的相対湿度（％）を横軸に、そして質量の変化（％）を縦軸に持つ、２５℃におけるＺＤ６４７４無水物のＤＶＳ等温プロットであり、ここにおいて、菱型はサイクル１の吸着を表し、四角はサイクル１の脱着を表し、三角はサイクル２の吸着を表し、そして四角は、サイクル２の脱着を表す。
【図４】図４は、２シータ値を横軸にプロットし、そして相対線強度（カウント数）を縦軸にプロットした、ＺＤ６４７４一水和物のＸ線粉末回折パターンである。
【図５】図５は、温度℃を横軸に、そして熱流量／％重量喪失を縦軸にプロットしたＺＤ６４７４一水和物のＤＳＣおよびＴＧＡの熱記録である。上部のプロットはＴＧＡのプロットであり、そして下部のプロットはＤＳＣのプロットである。ｙ軸上のＴＧＡプロットのスケールはグラフに示すように２ｍｇであり、そしてｙ軸上のＤＳＣプロットのスケールはグラフに示すように１０ｍＷである。
【図６】図６は、標的相対湿度（％）を横軸に持ち、そして質量の変化（％）を縦軸に持つ、２５℃におけるＺＤ６４７４一水和物のＤＶＳ等温プロットであり、ここにおいて、菱型はサイクル１の吸着を表し、四角はサイクル１の脱着を表し、三角はサイクル２の吸着を表し、そして四角は、サイクル２の脱着を表す。
【図７】図７は、分の時間を横軸に、そして質量の変化（初期重量の％）を縦軸に持つ、０％相対湿度および２５℃におけるＺＤ６４７４一水和物のＤＶＳ等温プロットである。
【図８】図８は、分の時間を横軸に、そして質量の変化（初期重量の％）を縦軸に持つ、０％相対湿度および４０℃におけるＺＤ６４７４一水和物のＤＶＳ等温プロットである。
【図９】図９は、２シータ値を横軸にプロットし、そして相対線強度（カウント数）を縦軸にプロットした、本出願の実施例１において形成されたＺＤ６４７４無水物のＸ線粉末回折パターンである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＺＤ６４７４一水和物。
【請求項２】
少なくとも一つの特異的ピークを約２−シータ＝１０．８°に持つＸ線粉末回折パターンを有する、結晶形態の、請求項1に記載のＺＤ６４７４一水和物。
【請求項３】
少なくとも一つの特異的ピークを約２−シータ＝２１．０°に持つＸ線粉末回折パターンを有する、結晶形態の、請求項1に記載のＺＤ６４７４一水和物。
【請求項４】
少なくとも二つの特異的ピークを約２−シータ＝１０．８°および２１．０°に持つＸ線粉末回折パターンを有する、結晶形態の、請求項1に記載のＺＤ６４７４一水和物。
【請求項５】
特異的ピークを約２−シータ＝１０．８、２１．０、１８．４、１１．９、１８．９、１８．１、２２．１、１１．４、２０．１および２４．０°に持つＸ線粉末回折パターンを有する、結晶形態の、請求項1に記載のＺＤ６４７４一水和物。
【請求項６】
図４に示すＸ線粉末回折パターンと実質的に同一のＸ線粉末回折パターンを有する、結晶形態の、請求項1に記載のＺＤ６４７４一水和物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＺＤ６４７４一水和物を、医薬的に受容可能な賦形剤または担体と共に含む医薬組成物。
【請求項８】
（ｉ）ＺＤ６４７４遊離塩基を、水性有機溶媒混合物中に溶解して、溶液を形成し；
（ｉｉ）自発的な結晶化が起こることを可能にし；そして
（ｉｉｉ）このようにして形成された結晶の固体を単離すること；
を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の結晶形態のＺＤ６４７４一水和物の調製方法。
【請求項９】
前記水性有機溶媒混合物が、９０容量％のテトラヒドロフランおよび１０容量％の水を含む、請求項８に記載の結晶形態のＺＤ６４７４一水和物の調製方法。
【請求項１０】
ヒトのような温血動物における抗血管新生および／または血管透過性減少効果の産生において使用するための医薬の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＺＤ６４７４一水和物の使用。
【請求項１１】
ヒトのような温血動物において抗血管新生および／または血管透過性減少効果を産生するための方法であって、そのような治療を必要とする前記動物に、有効な量の請求項１〜６のいずれか１項に記載のＺＤ６４７４一水和物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１】
ＺＤ６４７４一水和物。
【請求項２】
少なくとも一つの特異的ピークを約２−シータ＝１０．８°に持つＸ線粉末回折パターンを有する、結晶形態の、請求項1に記載のＺＤ６４７４一水和物。
【請求項３】
少なくとも一つの特異的ピークを約２−シータ＝２１．０°に持つＸ線粉末回折パターンを有する、結晶形態の、請求項1に記載のＺＤ６４７４一水和物。
【請求項４】
少なくとも二つの特異的ピークを約２−シータ＝１０．８°および２１．０°に持つＸ線粉末回折パターンを有する、結晶形態の、請求項1に記載のＺＤ６４７４一水和物。
【請求項５】
特異的ピークを約２−シータ＝１０．８、２１．０、１８．４、１１．９、１８．９、１８．１、２２．１、１１．４、２０．１および２４．０°に持つＸ線粉末回折パターンを有する、結晶形態の、請求項1に記載のＺＤ６４７４一水和物。
【請求項６】
図４に示すＸ線粉末回折パターンと実質的に同一のＸ線粉末回折パターンを有する、結晶形態の、請求項1に記載のＺＤ６４７４一水和物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＺＤ６４７４一水和物を、医薬的に受容可能な賦形剤または担体と共に含む医薬組成物。
【請求項８】
（ｉ）ＺＤ６４７４遊離塩基を、水性有機溶媒混合物中に溶解して、溶液を形成し；
（ｉｉ）自発的な結晶化が起こることを可能にし；そして
（ｉｉｉ）このようにして形成された結晶の固体を単離すること；
を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の結晶形態のＺＤ６４７４一水和物の調製方法。
【請求項９】
前記水性有機溶媒混合物が、９０容量％のテトラヒドロフランおよび１０容量％の水を含む、請求項８に記載の結晶形態のＺＤ６４７４一水和物の調製方法。
【請求項１０】
ヒトのような温血動物における抗血管新生および／または血管透過性減少効果の産生において使用するための医薬の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＺＤ６４７４一水和物の使用。
【請求項１１】
ヒトのような温血動物において抗血管新生および／または血管透過性減少効果を産生するための方法であって、そのような治療を必要とする前記動物に、有効な量の請求項１〜６のいずれか１項に記載のＺＤ６４７４一水和物を投与することを含む、前記方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００９−５１００４０（Ｐ２００９−５１００４０Ａ）
【公表日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３２８６７（Ｐ２００８−５３２８６７）
【出願日】平成１８年９月２７日（２００６．９．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００３５９４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３６７１７
【国際公開日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【出願人】（３０００２２６４１）アストラゼネカ アクチボラグ (581)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２７日（２００６．９．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００３５９４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３６７１７
【国際公開日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【出願人】（３０００２２６４１）アストラゼネカ アクチボラグ (581)
【Ｆターム（参考）】
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