ＡＢ−ＤＩＰ、並びにアルツハイマー病の予防及び治療剤
【課題】 細胞内Ａβと結合し、細胞死を誘導する物質を同定すること、及び神経細胞死を制御する方法を開発すること。
【解決手段】 ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質に対する抗体、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸に対するアンチセンス核酸、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸に対するｓｉＲＮＡ、上記核酸を発現することができる組換えベクター、あるいは上記核酸又は上記組換えベクターを含有する形質転換体、の少なくとも１つを含むことを特徴とする細胞死抑制剤。
【解決手段】 ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質に対する抗体、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸に対するアンチセンス核酸、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸に対するｓｉＲＮＡ、上記核酸を発現することができる組換えベクター、あるいは上記核酸又は上記組換えベクターを含有する形質転換体、の少なくとも１つを含むことを特徴とする細胞死抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病の原因であるアミロイドベータタンパク質に関連する神経細胞死を誘導するＡＢ−ＤＩＰ、並びにその制御によるアルツハイマー病の予防及び治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミロイドベータタンパク質（Ａβ）は、神経細胞に対して毒性を発揮する。また、本発明者らは、プレセニリン１トランスジェニックマウスの脳では、老人斑形成を伴わずに神経細胞死が促進されており、神経細胞内Ａβが増大することを報告している（非特許文献１）。これまでの研究では、Ａβにより誘導される酸化ストレス、小胞体ストレスなどによる細胞死、カルシウム調節障害による細胞死、ＥＲＡＢ（小胞体にあるタンパク質でＡβに結合し、細胞障害を起こすタンパク質、endoplasmic-reticulim associated binding proteinの略）を介する細胞死、グリピカン１を介する細胞死などが知られているが、そのメカニズムは十分に明らかとされていない。そのため、神経細胞死のメカニズムやその調節又は制御について解明し、それにより神経細胞死に関連する疾患の治療方法を開発することが望まれている。
【０００３】
【非特許文献１】Yan, S.D.ら、Nature、第389巻、第689-95頁、1997年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、細胞内外Ａβタンパク質と結合し、細胞死を誘導する物質を同定すること、及び神経細胞死を制御する方法を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行い、イーストツーハイブリッド法によりアミロイドベータタンパク質（Ａβ４２）と結合するタンパク質をスクリーニングしたところ、７７６個のアミノ酸からなるタンパク質、すなわちＡβ結合細胞死誘導タンパク質（Aβ-binding death inducing protein；ＡＢ−ＤＩＰ）をコードする新規遺伝子を見出した。また、このＡＢ−ＤＩＰ遺伝子を細胞において強制発現させると細胞死が誘導され、またＡβを同時に発現させた場合には細胞死が増強されることを確認し、さらにＡＢ−ＤＩＰが細胞死に関連するカスパーゼ９による切断を受けて活性型に変換することも確認し、ＡＢ−ＤＩＰを利用して神経細胞死を制御できるという知見を得、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及びそれをコードする核酸
・以下の（ａ）又は（ｂ）のＡＢ−ＤＩＰタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、アミロイドベータタンパク質との結合能を有するタンパク質
・以下の（ａ）又は（ｂ）のＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、アミロイドベータタンパク質との結合能を有するタンパク質
・以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列の２３３番目〜２５６３番目の塩基配列からなる核酸
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列の２３３番目〜２５６３番目の塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アミロイドベータタンパク質との結合能を有するタンパク質をコードする核酸
【０００７】
（２）活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及びそれをコードする核酸
・以下の（ａ）又は（ｂ）の活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１番目〜４９６番目のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１番目〜４９６番目のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、アミロイドベータタンパク質との結合能を有するタンパク質
・以下の（ａ）又は（ｂ）の活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１番目〜４９６番目のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１番目〜４９６番目のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、アミロイドベータタンパク質との結合能を有するタンパク質
・以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列の２３３番目〜１７２０番目の塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列の２３３番目〜１７２０番目の塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アミロイドベータタンパク質との結合能を有するタンパク質をコードする核酸
【０００８】
（３）上記核酸を含む組換えベクター。
（４）上記核酸、又は上記組換えベクターで形質転換された形質転換体。
（５）ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質に対する抗体。
該抗体は、例えば配列番号２の１８２番目〜１９６番目のアミノ酸配列を含む抗原又は７５３番目〜７７６番目のアミノ酸配列を含む抗原を用いて作製することができる。
（６）ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸に対するアンチセンス核酸。
（７）ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸に対する二本鎖ＲＮＡ。
該二本鎖ＲＮＡとしては、配列番号７に示される塩基配列を有するものが挙げられる。
（８）上記形質転換体を培養し、得られる培養物からＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質を採取することを特徴とする、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質の製造方法。
【０００９】
（９）以下の（ａ）〜（ｈ）の少なくとも１つを含むことを特徴とする細胞死誘導剤。
（ａ）請求項１記載のＡＢ−ＤＩＰタンパク質
（ｂ）請求項４記載の活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質
（ｃ）請求項２記載のＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸
（ｄ）請求項５記載の活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸
（ｅ）請求項３記載の核酸
（ｆ）請求項６記載の核酸
（ｇ）請求項７記載の組換えベクター
（ｈ）請求項８記載の形質転換体
上記細胞死誘導剤は、さらに以下の（ｉ）〜（ｍ）の少なくとも１つを含むものであってもよい。
（ｉ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＡβ４２タンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、細胞障害機能を有するタンパク質
（ｊ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＡβ４２タンパク質、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、細胞障害機能を有するタンパク質、をコードする核酸
（ｋ）配列番号３に示される塩基配列からなる核酸、又は、配列番号３に示される塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞障害機能を有するタンパク質をコードする核酸
（ｌ）上記（ｊ）又は（ｋ）のいずれかの核酸を含む組換えベクター
（ｍ）上記（ｊ）若しくは（ｋ）のいずれかの核酸、又は上記（ｌ）の組換えベクターを含有する形質転換体
【００１０】
（１０）以下の（ａ）〜（ｅ）の少なくとも１つを含むことを特徴とする細胞死抑制剤。
（ａ）請求項９又は１０記載の抗体
（ｂ）請求項１１記載のアンチセンス核酸
（ｃ）請求項１２又は１３記載の二本鎖ＲＮＡ
（ｄ）上記（ｂ）又は（ｃ）のいずれかの核酸を発現することができる組換えベクター
（ｅ）上記（ｂ）若しくは（ｃ）のいずれかの核酸、又は上記（ｄ）の組換えベクターを含有する形質転換体
（１１）以下の（ａ）〜（ｅ）の少なくとも１つを含むことを特徴とする細胞死関連疾患の治療剤又は予防剤。
（ａ）請求項９又は１０記載の抗体
（ｂ）請求項１１記載のアンチセンス核酸
（ｃ）請求項１２又は１３記載の二本鎖ＲＮＡ
（ｄ）上記（ｂ）又は（ｃ）のいずれかの核酸を発現することができる組換えベクター
（ｅ）上記（ｂ）若しくは（ｃ）のいずれかの核酸、又は上記（ｄ）の組換えベクターを含有する形質転換体
細胞死関連疾患としては、例えばアルツハイマー病が挙げられる。
【００１１】
（１２）以下の（ａ）〜（ｈ）の少なくとも１つを含むことを特徴とする細胞周期停止剤。
（ａ）請求項１記載のＡＢ−ＤＩＰタンパク質
（ｂ）請求項４記載の活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質
（ｃ）請求項２記載のＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸
（ｄ）請求項５記載の活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸
（ｅ）請求項３記載の核酸
（ｆ）請求項６記載の核酸
（ｇ）請求項７記載の組換えベクター
（ｈ）請求項８記載の形質転換体
（１３）アミロイドベータタンパク質（Ａβ）及びＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質と被検化合物とを接触させ、ＡβとＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質との結合を測定することを含む、ＡβとＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質との結合を阻害又は促進する化合物のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、アミロイドベータタンパク質（Ａβ４２）と結合し、神経細胞死を誘導する新規タンパク質であるＡＢ−ＤＩＰタンパク質及びその活性型、それをコードする遺伝子などが提供される。ＡＢ−ＤＩＰタンパク質を利用することにより細胞死を制御することができるため、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質等は細胞死に関連する疾患の予防又は治療に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明は、アミロイドベータタンパク質４２（Ａβ４２）と結合するＡβ結合細胞死誘導タンパク質（Aβ-binding death inducing protein；ＡＢ−ＤＩＰ）及びその活性型、並びにそれらの用途に関するものであり、上記タンパク質がＡβ４２と結合し、細胞死を誘導する機能を有することに基づいて完成されたものである。
【００１５】
アミロイドベータタンパク質（Ａβ）は、主として４０アミノ酸のＡβ４０と４２アミノ酸のＡβ４２からなる。これらのＡβは神経細胞に対して毒性を有し、また家族性アルツハイマー病患者においてはＡβ４２の量が増大しており、このＡβ４２形態が脳プラーク中に蓄積し、アミロイドの沈着に主要な役割を果たしていることから、Ａβがアルツハイマー病の病因の一つであることが示唆されている（Iwatsuboら、1994 Neuron 13：45-53；Mannら、1996, Am. J. Pathol. 148:1257）。従って、Ａβ４２と結合して細胞死を誘導するＡＢ−ＤＩＰタンパク質を利用して神経細胞死を制御することにより、アルツハイマー病をはじめとする細胞死に関連する疾患を治療又は予防することができる。
【００１６】
本発明においては、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又はその活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質を用いて細胞死を誘導することができる。また、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又はその活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質の発現又は活性を抑制することにより細胞死を抑制することができる。
【００１７】
１．ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及びそれをコードする遺伝子
配列番号１にＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする遺伝子（ＡＢ−ＤＩＰ遺伝子）の塩基配列を、配列番号２にＡＢ−ＤＩＰタンパク質のアミノ酸配列を例示する。ここで、配列番号１の２３３番目〜２５６３番目の塩基配列がＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする領域である。ＡＢ−ＤＩＰタンパク質は、７７６個のアミノ酸残基からなり、以下の特徴ある配列を有するものである（図１）：
カスパーゼ活性化及びリクルートドメイン（Caspase activation and recruitment domain；ＣＡＲＤ）（配列番号２の６−４８）：これはカスパーゼやａｐａｆ−１など多くのアポトーシスに関連するタンパク質に見られる配列である（図１中、下線で示す）
グルタミン（Ｑ）リッチドメイン（Ｎ末端側）（図１中、下線を付したＱである）
核移行シグナル（Nuclear targeting signal；ＮＴＳ）（配列番号２の２３４−２５０）：これにより、このタンパク質の全部又は一部が核へ移行し、何らかの作用を発揮すると考えられる（図１中、イタリック体で示す）
【００１８】
細胞接着配列（Cell attachment sequence）とされるＲＧＤ配列（配列番号２の３１９−３２１）とＲＧＤ結合モチーフと思われるＤＤＭ配列（配列番号２の６８５−６８７）：この存在は、細胞接着に関する機能あるいは分子を不活性化する機能があると思われる（図１中、太字と下線で示す）
カスパーゼ認識切断部位（ＬＥＫＤ）（４９３−４９６）：この存在はカスパーゼの基質となることが示唆される（図１中、太字で示す）
ショウジョウバエの遺伝子において保存されているＤ１ドメイン（配列番号２の５２３−５８１）及びＤ２ドメイン（配列番号２の６９０−７４３）：この領域の機能は不明である。このタンパク質とＣ末端部分のアミノ酸が４５％一致するＤＸＳ６６７３Ｅは伴性劣性遺伝を示す精神発達遅滞をおこす疾患の候補遺伝子との報告がある（図１中、網掛けで示す）。
【００１９】
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質は、アミロイドベータタンパク質（Ａβ４２）との結合能を有する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは１若しくは数個のアミノ酸に置換、欠失、挿入、付加、逆位等の変異が生じてもよい。アミロイドベータタンパク質との結合能は、変異を有するタンパク質と、アミロイドベータタンパク質とを接触させ、それらの結合を当技術分野で公知の方法（例えば免疫沈降法、酵母ツーハイブリッド法など）により測定することによって確認することができる。ここで、アミロイドベータタンパク質（Ａβ４２）のアミノ酸配列を配列番号４に、塩基配列を配列番号３に示す。Ａβ４２は、それらの配列から公知の方法に従って化学合成又は組換え手法により作製することができるし、あるいは公知の手法に従って細胞又は組織から単離してもよい（例えばRoherら、1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10836参照）。また、Ａβ４２は、例えばバイオソース（アメリカ）（Biosource）社などから市販品として入手することも可能である。Ａβ４２は、その機能、すなわち細胞障害機能を維持する限り、Ａβ４２の塩基配列及びアミノ酸配列に変異が含まれていてもよい。ここで「細胞障害機能」とは、細胞の生理的機能に変調をきたすことを意味し、この機能は、細胞周期の変化、細胞増殖能の変化、細胞変性・死により確認することができる。
【００２０】
例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したものも、本発明のアミロイドベータタンパク質との結合能を有するタンパク質に含まれる。さらに具体的には、配列番号２に示されるアミノ酸配列の、例えば配列番号２の１番目〜３４０番目、１番目〜５５０番目、５０番目〜７７６番目、又は３４５番目〜７７６番目のアミノ酸配列を有する変異体は本発明のタンパク質に含まれる。
【００２１】
上記遺伝子は、ヒトの任意の細胞若しくは組織から調製したＤＮＡ又はヒトのｃＤＮＡライブラリーを用いて、上記遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行うことにより調製することができる。
【００２２】
また、一旦遺伝子の塩基配列が確定すると、その後は化学合成によって、この遺伝子を得ることができる。また、部位特異的突然変異誘発法等によって本発明の遺伝子の変異型であって上記機能又は活性を有するものを合成することもできる。なお、遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した市販の変異導入用キットなどを用いて変異の導入が行われる。また、エラー導入ＰＣＲやＤＮＡシャッフリング等の手法により、遺伝子の変異導入やキメラ遺伝子を構築することもできる。エラー導入ＰＣＲ及びＤＮＡシャッフリング手法は、当技術分野で公知の手法であり、例えばエラー導入ＰＣＲについてはChen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 5618-5622を、またＤＮＡシャッフリングについてはStemmer, W. P. 1994, Nature, 370:389-391及びStemmer W. P., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91: 10747-10751を参照されたい。
【００２３】
変異した遺伝子により作製される組換えタンパク質が目的の機能（アミロイドベータタンパク質との結合能）を有するか否かは、変異遺伝子で形質転換体において発現させ、得られる組換えタンパク質の結合能を、上述したように測定することにより確認することができる。
【００２４】
さらに、上記塩基配列からなる核酸の全部又は一部の配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、それぞれの機能又は活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も本発明のＡＢ−ＤＩＰ遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、高い相同性（相同性が６０％以上、好ましくは８０％以上）を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、ナトリウム濃度が１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭであり、温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃での条件をいう。例えばハイブリダイゼーション条件が６５℃であり、洗浄の条件が０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中で６５℃、１０分の場合に、慣例的な手法、例えばサザンブロット、ドットブロットハイブリダイゼーションなどによってハイブリダイズすることが確認された場合には、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするといえる。
また、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質は、リン酸化されたものであってもよい。
【００２５】
本発明においては、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質の活性型をコードする遺伝子（「活性型ＡＢ−ＤＩＰ遺伝子」という）の設計及び合成を行うことができる。活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質とは、ＡＢ−ＤＩＰの全長アミノ酸配列（配列番号２）の１番目〜４９６番目のアミノ酸配列を含むタンパク質断片を指す。この活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質は、ＡＢ−ＤＩＰのカスパーゼによる切断により生じ、約６２ｋＤａの分子量を有する。本明細書中、活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質は、「活性型ＡＢ−ＤＩＰ」、「ＡＢ−ＤＩＰ ｐ６２」、又は単に「ｐ６２」とも称する。また、活性型ＡＢ−ＤＩＰ遺伝子は、配列番号１の２３３番目〜１７２０番目の塩基配列からなる核酸である。
【００２６】
この活性型ＡＢ−ＤＩＰ遺伝子は、該断片をコードする領域の外側の領域であって配列番号１で表される塩基配列の任意の領域の配列に基づいてプライマーを設計し、ＡＢ−ＤＩＰ遺伝子（配列番号１）を鋳型としてＰＣＲを行うことにより得ることができる。また、活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質は、活性型タンパク質のアミノ酸配列に基づいて化学合成により又は遺伝子工学的手法により作製してもよいし、あるいは全長のＡＢ−ＤＩＰタンパク質にカスパーゼ−９を作用させて、その切断により得られる断片として調製してもよい。カスパーゼ−９は、ＭＢＬ（名古屋市）社などから市販品として入手可能である。ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及びＡＢ−ＤＩＰ遺伝子と同様に、活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及び活性型ＡＢ−ＤＩＰ遺伝子の変異体も本発明に包含される。
【００２７】
２．抗体
本発明においては、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質に対する抗体を作製し、使用することができる。本発明において「抗体」とは、抗原であるタンパク質又はその部分ペプチドに結合可能な抗体分子全体又はそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメントなど）を意味し、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいし、さらにはヒト化又はキメラ抗体、一本鎖抗体などであってもよい。本発明において、抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体）は例えば以下の手法により作製することができる。
【００２８】
抗体作製のための免疫原としては、全長のＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質を使用してもよいし、あるいはそれらの部分ペプチドを使用してもよい。部分ペプチドの例としては、限定するものではないが、例えば配列番号２に示されるアミノ酸配列の１８２番目〜１９６番目のアミノ酸配列又は７５３番目〜７７６番目のアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。免疫原は、タンパク質又はその部分ペプチドを緩衝液に溶解して調製し、必要であれば、免疫を効果的に行うためにアジュバント（完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント等）を添加してもよい。
【００２９】
ポリクローナル抗体を作製する場合は、免疫原を、哺乳動物、例えばウサギ、ラット、マウスなどに投与する。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、１〜５回の免疫を行う。その後、最終の免疫日から一定期間経過後に、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ又はＥＩＡ、ＲＩＡ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法などで測定する。
【００３０】
モノクローナル抗体を作製する場合は、免疫原を、ポリクローナル抗体の場合と同様に哺乳動物、例えばウサギ、ラット、マウスなどに投与する。そして、最終の免疫日から一定期間経過後に抗体産生細胞（脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等）を採集し、ミエローマ細胞との細胞融合によりハイブリドーマを作製する。細胞融合は、血清を含まない動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合し、細胞融合促進剤（例えばポリエチレングリコール等）の存在のもとで融合反応を行う。また、エレクトロポレーションを利用した市販の細胞融合装置を用いて細胞融合させることもできる。
【００３１】
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。また、ハイブリドーマの培養上清中に、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質に反応する抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、例えば酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等を採用することができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立する。
【００３２】
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００３３】
さらに、キメラ抗体及びヒト型化抗体は当技術分野で公知の方法を用いて作製することができる（Morrisonら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851-6855; Neubergerら, 1984, Nature, 312: 604-608; Takedaら, 1985, Nature, 314: 452-454）。さらに、一本鎖抗体（Bird, 1988, Science 242: 423-426; Hustonら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; Wardら, 1989, Nature 334: 544-546）、Ｆｖフラグメント（Skerraら, 1988, Science 242: 10381041）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（抗体のペプシン消化により作製）、Ｆａｂフラグメント（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋の還元により作製）も、当技術分野で公知の方法を用いて作製することができる。
【００３４】
上述のようにして得られたＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質に対する抗体は、これらのタンパク質の精製及び検出、並びに後述する細胞死の抑制に使用することができる。
【００３５】
３．アンチセンス核酸
本発明においては、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸に対するアンチセンス核酸を使用することによって、ＡＢ−ＤＩＰ遺伝子又は活性型ＡＢ−ＤＩＰ遺伝子の発現を低減又は抑制することができる。従って、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸に対するアンチセンス核酸を用いて、細胞死を抑制をすることができる。
【００３６】
アンチセンス核酸は、当技術分野で公知の手法に従って設計し、使用することができる（例えば、Frank, B.L.ら、Method in Molecular Biology, 74:37, 1997）。例えば、ＡＢ−ＤＩＰ遺伝子に対するアンチセンス核酸としては、配列番号１に示す塩基配列に対し相補的な配列からなる核酸を例示することができる。ただし、本発明において用いるアンチセンス核酸は、宿主に導入されて、内在性遺伝子の発現を低減又は抑制しうる限り、配列番号１（配列番号１の２３３番目〜２５６３番目の塩基配列）に示す塩基配列に対して完全に相補的な配列である必要はない。また、アンチセンス核酸は、宿主に導入されて、内在性遺伝子の発現（翻訳又は転写）を抑制又は阻害しうる限り、配列番号１に示す塩基配列に対し相補的な配列の一部分であってもよい。例えば、アンチセンス核酸は、長さが約１０〜５０塩基、好ましくは１５〜３０塩基、より好ましくは１８〜２５塩基であり、ＧＣ含量が５０％以上となるように設計する。アンチセンス核酸を設計するためのソフトも公知であり、例えばＨＹＢｓｉｍｕｌａｔｏｒ（日立化成）などを使用することができる。また、アンチセンス核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれでもよいし、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッド核酸であってもよい。
【００３７】
アンチセンス核酸は、設計したアンチセンス核酸をそのまま宿主に導入（投与）してもよいし、あるいは設計したアンチセンス核酸が宿主内で発現されるような核酸又は組換えベクターとして導入（投与）してもよい。このようなアンチセンス核酸の導入又は投与は、遺伝子治療として当技術分野で公知である。
【００３８】
組換えベクターとしてアンチセンス核酸を送達する場合、投与は、公知の任意の手法、例えばキメラウイルスなどの組換え発現ベクターを用いた手法、又はレトロウイルスベクター若しくはアデノ随伴ウイルスベクターを含む種々のウイルスベクターを用いた手法により行うことができる。使用し得るベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルスなどのＲＮＡウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。このような組換えベクターの調製は、当技術分野で公知であり、本明細書においては「５．組換えベクター」の項に記載する。
【００３９】
目的の宿主（組織又は細胞）にアンチセンス核酸を投与するために使用し得る他の遺伝子送達機構には、コロイド分散系、リポソーム誘導系、人工ウイルスエンベロープなどが含まれる。また、アンチセンス核酸の投与のために、例えば巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル、リポソーム等を利用することができる。
【００４０】
４．二本鎖ＲＮＡ
ＲＮＡインターフェアランスとは、内在性遺伝子の配列に対して相補的な配列を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を導入することにより、当該内在性遺伝子のｍＲＮＡが分解されるという細胞内事象として知られている（例えば、Elbashir, SM.ら, Nature 411, 494-498, 2001; Hannon, GJ., Nature 418, 244-251, 2002 (review); Shinagawa, T.ら, Genes Dev. 17: 1340-1345 2003; 国際特許公開第ＷＯ９９／３２６１９号及びＷＯ９９／６１６１３号参照）。従って、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸に対する二本鎖ＲＮＡは、これらのタンパク質の発現（タンパク質への翻訳）を低減又は阻害することができる。従って、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸に対する二本鎖ＲＮＡを用いることにより、細胞死を抑制をすることができる。
【００４１】
二本鎖ＲＮＡは、当技術分野で公知の手法により設計することができる。例えば、配列番号１に示される塩基配列のうち連続した１０〜１００塩基、好ましくは連続した１０〜５０塩基、より好ましくは連続した１０〜３０塩基からなる配列に対して標的化するように二本鎖ＲＮＡを設計しうる。好ましくは、二本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（short-interfering RNA）である。本発明において使用しうる二本鎖ＲＮＡの例としては、限定されるものではないが、配列番号７に示される塩基配列を有するものが挙げられる。
【００４２】
また、二本鎖ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡをそのまま宿主に投与してもよいし、あるいは二本鎖ＲＮＡを発現する組換えベクターを宿主に投与し、該宿主において二本鎖ＲＮＡを発現させてもよい。二本鎖ＲＮＡの送達は、アンチセンス核酸と同様に、「３．アンチセンス核酸」の項に記載のように実施することができる。
【００４３】
５．組換えベクター
本発明の組換えベクターは、適当なベクターにＡＢ−ＤＩＰ遺伝子若しくは活性型ＡＢ−ＤＩＰ遺伝子、又はこれらの遺伝子に対するアンチセンス核酸若しくは二本鎖ＲＮＡを発現するための配列を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明で使用するベクターとしては、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されない。例えば、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどが挙げられる。また、アンチセンス核酸又は二本鎖ＲＮＡを発現するために使用し得るベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルスなどのＲＮＡウイルスのベクターが挙げられる。
【００４４】
プラスミドＤＮＡとしては、放線菌由来のプラスミド（例えばｐＫ４，ｐＲＫ４０１，ｐＲＦ３１等）、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９，ｐＵＣ１８等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３，ＹＥｐ２４，ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。
【００４５】
ベクターに遺伝子（核酸配列）を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００４６】
遺伝子又は核酸配列は、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質若しくは活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質、又はアンチセンス核酸若しくは二本鎖ＲＮＡが発現されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、遺伝子又は核酸配列のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。
【００４７】
６．形質転換体
本発明はまた、上記遺伝子若しくは核酸配列、又は上記組換えベクターを含有する形質転換体を提供する。形質転換体は、上記遺伝子若しくは核酸配列、又は組換えベクターを、目的とするＡＢ−ＤＩＰ若しくは活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又はアンチセンス核酸若しくは二本鎖ＲＮＡが発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、特に限定されるものではなく、例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等の酵母、その他動物細胞又は昆虫細胞が挙げられる。
【００４８】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、遺伝子又は組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。細菌への遺伝子又は組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法（Cohen, S.N.et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110-2114 (1972)）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００４９】
酵母を宿主とする場合は、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されるものではない。酵母への遺伝子又は組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法（Becker, D.M. et al., Methods. Enzymol. 194,182-187(1990)）、スフェロプラスト法（Hinnen, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75,1929-1933 (1978)）、酢酸リチウム法（Itoh, H. J. Bacteriol., 153,163-168 (1983)）等が挙げられる。
【００５０】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ＰＣ１２若しくはＮＧ１０８−１５細胞、又はヒトＦＬ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ若しくはＪｕｒｋａｔ細胞などが用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、β−アクチンプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への遺伝子又は組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。昆虫細胞への遺伝子又は組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００５１】
以上のようにして得られる形質転換体は、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質を生成するものであるため、これらのタンパク質の製造や細胞死の誘導に使用することができる。また、形質転換体は、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質若しくは活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質に対するアンチセンス核酸若しくは二本鎖ＲＮＡを発現するものであるため、これらのタンパク質の発現を低減又は阻害することにより、細胞死の抑制に使用することができる。
【００５２】
７．タンパク質の製造
本発明のＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質は、前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００５３】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
【００５４】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３６〜３７℃で１２〜１４時間行う。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が挙げられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で４０〜４８時間行う。
【００５５】
培養後、本発明のＡＢ−ＤＩＰ又は活性型ＡＢ−ＤＩＰが菌体内又は細胞内に生産される場合には、超音波処理、凍結融解の繰り返し、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより上記タンパク質を採取する。また、当該タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。
【００５６】
８．細胞死誘導剤及び細胞死阻害剤、並びに細胞周期停止剤
ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及び活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質は、アミロイドベータタンパク質（Ａβ４２）と結合して、細胞死を誘導する。従って、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及び活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質の量又は活性を増大する物質、具体的には、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及び活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質、並びに当該タンパク質を生成する遺伝子、組換えベクター及び形質転換体などは、細胞死の誘導剤として使用することができる。
【００５７】
一方、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及び活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質の量又は活性を低減又は抑制することにより、細胞死を抑制することができる。従って、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及び活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質の量又は活性を低減又は抑制する手段、具体的には、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及び活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質に対する抗体、当該タンパク質をコードする核酸に対するアンチセンス核酸又は二本鎖ＲＮＡなどは、細胞死の抑制剤として使用することができる。
【００５８】
また、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及び活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質は、細胞の細胞周期をＧ２／Ｍ期で停止させるものである。従って、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及び活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質の量又は活性を増大する物質、具体的には、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及び活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質、並びに当該タンパク質を生成する遺伝子、組換えベクター及び形質転換体などは、細胞周期の停止のために使用することができる。
【００５９】
本発明において「細胞死」とは、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞の死を意味し、アポトーシスを含む。また「細胞周期」とは、細胞が増殖を開始し、ＤＮＡ複製、染色体の分配、核分裂、細胞質分裂などの事象を経て、２つの娘細胞となるサイクルをいい、Ｇ２／Ｍ期は、ＤＮＡ合成（Ｓ期）を経て、分裂のための準備をし（Ｇ２期）、分裂（Ｍ期）する期間である。本発明において、「細胞」にはあらゆる種類の細胞が含まれる。例えば、神経細胞、神経膠細胞、上皮細胞、筋細胞、間葉系細胞、血球系細胞、臓器特異的細胞などが含まれる。
【００６０】
さらに、アミロイドベータタンパク質（Ａβ４２）は、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及び活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質の細胞死誘導能を増強する機能を有する。従って、細胞死誘導剤に、Ａβタンパク質、Ａβタンパク質をコードする核酸、該核酸を含む組換えベクター、該核酸又は該組換えベクターを含有する形質転換体などを含めることにより、その薬剤により誘導される細胞死が増強される。ここで、アミロイドベータタンパク質（Ａβ４２）のアミノ酸配列を配列番号４に、塩基配列を配列番号３に示す。Ａβ４２は、それらの配列から公知の方法に従って化学合成又は組換え手法により作製することができるし、あるいは公知の手法に従って細胞又は組織から単離してもよい（例えばRoherら、1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10836参照）。また、Ａβ４２は、例えばバイオソース社などから市販品として入手することも可能である。
【００６１】
本発明の細胞死誘導剤及び細胞死阻害剤、並びに細胞周期停止剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で使用することができ、また本発明の細胞死誘導剤、細胞死阻害剤又は細胞周期停止剤を投与した細胞（形質転換体）を投与することも可能である（ｅｘ ｖｉｖｏ）。また投与の対象は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいては、例えば哺乳動物細胞又は組織、特にヒト、マウス、ラット、ウシなどに由来する細胞又は組織であり、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏにおいては、例えば動物、特にヒト、マウス、ラット、ウシなどの哺乳動物である。
【００６２】
例えば、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質、活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質、抗体などを含む薬剤の場合には、その投与量は、投与経路、投与回数、剤形によって異なるが、当技術分野で慣例的な手法を用いて適宜決定することができる。投与経路、投与回数なども当技術分野で公知の方法に従って決定することができる。
【００６３】
上記各種薬剤は、医薬的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、剤形に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。また薬剤は、医薬において通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などを適宜選択し、常法により製造することができる。
【００６４】
また例えば、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質若しくは活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸、それに対するアンチセンス核酸若しくは二本鎖ＲＮＡ、それらを含む組換えベクターなどを含む薬剤の場合にも、その投与量は、投与経路、投与回数、剤形によって異なるが、当技術分野で慣例的な手法を用いて適宜決定することができる。このような薬剤は、核酸を注射により直接投与する方法のほか、該遺伝子が組込まれた組換えベクターを投与する方法が挙げられる。これらの組換えベクターを用いることにより効率よく投与することができる。また、核酸や組換えベクターをリポソームなどのリン脂質小胞、ミセル、ウイルスエンベロープなどに導入し、投与する方法を採用してもよい。
【００６５】
また、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質若しくは活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸、それに対するアンチセンス核酸若しくは二本鎖ＲＮＡ、それらを含む組換えベクターなどを含む薬剤は、被験体から得られた細胞又は組織に導入した後、その細胞又は組織を同じ被験体又は別の被験体に投与することも可能である（ｅｘ ｖｉｖｏ法）。細胞又は組織への導入は、当技術分野で公知の遺伝子導入法（例えば、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション、リポフェクションなど）を用いて行うことができる。
【００６６】
９．細胞死関連疾患の予防剤・治療剤
上記細胞死抑制剤は、細胞死に伴う疾患（細胞死関連疾患）の治療又は予防のために使用することができる。本発明において「細胞死関連疾患」としては、アルツハイマー病、神経変性疾患、自己免疫性疾患、筋萎縮症、その他の臓器障害、癌及び肉腫等が挙げられ、これらの疾患が単独で発症したものでも、複数種類が合併したものでも本発明の予防剤又は治療剤の適用対象となり得る。なお、合併症には上記疾患と他の疾患とが合併したものも含まれる。本発明の予防剤又は治療剤は、経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる。
【００６７】
細胞死関連疾患の予防剤又は治療剤は、使用する対象を特に限定するものではない。例えば、神経系（脳、脊髄等）、血管系（動脈、静脈、心臓等）、呼吸器系（気管、肺等）、消化器系（唾液腺、胃、腸、肝臓、膵臓等）、リンパ系（リンパ節、脾臓、胸腺等）、泌尿器系（腎臓等）、生殖系（精巣、卵巣、子宮等）などの組織に生じる疾患について治療又は予防を特異目的として用いることができる。これらの疾患は、単独であっても、併発したものであっても、上記以外の他の疾病を併発したものであってもよい。
【００６８】
本発明の予防剤又は治療剤を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれのものであってもよく、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本発明の予防剤又は治療剤を非経口投与する場合は、静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐剤などの製剤形態を選択することができ、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。
【００６９】
これらの各種製剤は、医薬において通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などを適宜選択し、常法により製造することができる。
【００７０】
上記各種製剤は、医薬的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、剤形に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。
【００７１】
本発明の予防剤又は治療剤の投与量は、予防剤又は治療剤に含まれる成分の種類、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができる。
【００７２】
本発明の予防剤又は治療剤が核酸又は組換えベクターなどを含み、それを遺伝子治療剤として使用する場合は、核酸を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれた組換えベクターを投与する方法が挙げられる。また例えば核酸や組換えベクターをリポソームなどのリン脂質小胞、ミセル、ウイルスエンベロープなどに導入し、投与する方法を採用することができる。
【００７３】
さらに、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質若しくは活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸、それに対するアンチセンス核酸若しくは二本鎖ＲＮＡ、それらを含む組換えベクターなどを含む薬剤は、被験体から得られた細胞又は組織に導入した後、その細胞又は組織を同じ被験体又は別の被験体に投与することも可能である（ｅｘ ｖｉｖｏ法）。細胞又は組織への導入は、当技術分野で公知の遺伝子導入法（例えば、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション、リポフェクションなど）を用いて行うことができる。
【００７４】
遺伝子治療剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内等の全身投与のほか、中枢神経系組織（脳、脊髄等）、血管系（動脈、静脈、心臓等）、呼吸器系（気管、肺等）、消化器系（唾液腺、胃、腸、肝臓、膵臓等）、リンパ系（リンパ節、脾臓、胸腺等）、泌尿器系（腎臓等）、生殖系（精巣、卵巣、子宮等）などに局所投与を行うことができる。さらに、カテーテル技術、外科的手術等と組み合わせた投与形態をを採用することもできる。遺伝子治療剤の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、通常は、遺伝子の重量にすると成人１日あたり０．０１〜１００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲が適当である。
【００７５】
１０．スクリーニング
本発明のＡＢ−ＤＩＰタンパク質及び活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質は、Ａβと結合して細胞死を誘導するものである。従って、ＡβとＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質との結合を阻害又は促進する化合物は、細胞死を抑制し、細胞死関連疾患の予防又は治療に用いることができる可能性がある。
【００７６】
従って、本発明においては、アミロイドベータタンパク質（Ａβ）及びＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質と被検化合物とを接触させ、ＡβとＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質との結合を測定することを含む、ＡβとＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質との結合を阻害又は促進する化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００７７】
ここで、アミロイドベータタンパク質（Ａβ４２）のアミノ酸配列及びその遺伝子の塩基配列はそれぞれ配列番号４及び３に示している。ここで、接触させるＡβ４２は、その全長タンパク質でもよいし、又は部分ペプチドであってもよい。
【００７８】
接触させる被検化合物は、特に限定されるものではなく、タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成化合物、天然抽出物（細胞抽出物など）、ケミカルライブラリー若しくはペプチドライブラリーなどでありうる。
【００７９】
ＡβとＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質との結合は、当技術分野で公知の方法により測定することができる。例えば、酵母ツーハイブリッド法などを用いて、タンパク質の結合を測定することができる。その結果、ＡβとＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質との結合を促進する化合物は、細胞死誘導を促進する化合物として使用することができる。一方、ＡβとＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質との結合を阻害する化合物は、細胞死誘導を抑制する化合物として使用することができる。このような細胞死誘導を抑制する化合物は、アルツハイマー病の予防又は治療に有効である可能性がある。
【実施例】
【００８０】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００８１】
〔実施例１〕Ａβと結合するタンパク質の発見
（１）ＡＢ−ＤＩＰ ｃＤＮＡのクローニング
Ａβと結合するタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニングは酵母ツーハイブリッド法によって行った。即ち、Ａβ１−４２ ｃＤＮＡ（配列番号３）をＧａｌ−４ ＤＮＡ結合ドメインを有するｐＧＢＫＴ７プラスミドベクター（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のＫｐｎＩ切断部位に挿入した。次に、ヒト胎児脳由来ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック（アメリカ）社）をＧａｌ−４トランス活性化ドメインを有するｐＡＣＴ２プラスミドベクター（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に挿入した。両プラスミドを酵母ＡＨ１０９株（クロンテック）に導入し、アデニン、ヒスチジン、ロイシン、トリプトファンを欠く培地で選択し、β−ガラクトシダーゼ活性を調べた。Ａβと結合するタンパク質が存在する場合には、β−ガラクトシダーゼが活性化されてクロロフェノールで発色するので、そのようなクローンを陽性クローンとした。空ベクター及びｌａｍｉｎのＤＮＡ結合ドメインを有するプラスミド（ｐＧＢＫＴ７−ｌａｍｉｎ）を陰性コントロールとした。
その結果、上記方法により得られた陽性クローンの中からその中にストップコドンを有するｃＤＮＡ断片が得られた。
【００８２】
（２）全長ｃＤＮＡのクローニング
ヒト脾臓由来二本鎖Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）をテンプレートとして５’−及び３’−ＲＡＣＥ（rapid amplification of cDNA ends）を行った。３’−ＲＡＣＥには遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ１）として配列番号１の２０３９−２０６５に対応するGTGACTGAGGAGATGCTATGGGAGTGC（配列番号５）とＡＰ１プライマー（キット添付）を、５’−ＲＡＣＥにはＧＳＰ２として配列番号１の２１５８−２１３２に対応するGTGCTGGTCCACTGTCTTCAATAGGAA（配列番号６）とＡＰ２プライマー（キット添付）を用いた。Ｍａｒａｔｈｏｎ ＲＡＣＥ反応はＴｉｔａｎｉｕｍポリメラーゼを含むＡｄｖａｎｔａｇｅ−２ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｍｉｘを用いて行った。
【００８３】
その結果、５’ＲＡＣＥによって得られた２．１ｋｂの最も長い産物にはＫｏｚａｃ配列が含まれていた。３’ＲＡＣＥはツーハイブリッド法により得られたクローンより長いものは得られなかった。ＲＡＣＥによって得られた産物をＰＵＣ１８ベクターのＳｍａＩサイトに結合し、塩基配列を決定した。次いで、５’端及び３’端の塩基配列をもとにプライマーを設定し、ヒト脾臓由来二本鎖ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法により全長ｃＤＮＡを得た。この遺伝子の塩基配列はＮＣＢＩのデータベースに登録されていた（ｍＲＮＡの登録番号：ＡＫ０７４３１３、タンパク質の登録番号：ＢＡＢ８５０４７）。
【００８４】
この遺伝子は７７６個のアミノ酸残基よりなるタンパク質をコードしていた（図１、配列番号２）。その中には以下の特徴ある配列が見られた：
カスパーゼ活性化及びリクルートドメイン（ＣＡＲＤ）：これはカスパーゼやａｐａｆ−１など多くのアポトーシスに関連するタンパク質に見られる配列である（図１中、下線で示す）
Ｎ末端側にはグルタミン（Ｑ）リッチドメインがあった
核移行シグナル（ＮＴＳ）の存在は、このタンパク質の全部又は一部が核へ移行し、何らかの作用を発揮すると考えられた（図１中、イタリック体で示す）
細胞接着配列とされるＲＧＤ配列とＲＧＤ結合モチーフと思われるＤＤＭ配列の存在は、細胞接着に関する機能あるいは分子を不活性化する機能があると思われた（図１中、太字と下線で示す）
カスパーゼ認識切断部位（ＬＥＫＤ）の存在はカスパーゼの基質となることが示唆された（図１中、太字で示す）
【００８５】
この他ショウジョウバエの遺伝子において保存されているＤ１、Ｄ２ドメインがあったが、その機能は不明である。このタンパク質とＣ末端部分のアミノ酸が４５％一致するＤＸＳ６６７３Ｅは伴性劣性遺伝を示す精神発達遅滞をおこす疾患の候補遺伝子との報告がある（図１中、網掛けで示す）。
【００８６】
本発明者は、このタンパク質がＡβに関連して細胞死を誘導するところから、Ａβ関連細胞死誘導タンパク質（Aβ-related death-inducing protein；ＡＢ−ＤＩＰ）と命名した。
【００８７】
〔実施例２〕ＡＢ−ＤＩＰとＡβが結合することの証明
実施例１に記載のようにして単離したＡＢ−ＤＩＰとＡβが生理的状態で結合していることを示すために免疫沈降を行った。まず、１０％牛胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び５０単位／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培養液（インビトロジェン（アメリカ）社）で培養したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（神経芽細胞としての特徴を有する細胞）に、ＨＡタグをつけたＡβ１−４０（ｐＣＭＶ−ＨＡ−Ａβ４０）又はＡβ１−４２（ｐＣＭＶ−ＨＡ−Ａβ４２）とＭｙｃタグをつけたＡＢ−ＤＩＰ（ｐＣＭＶ−ＨＡ−ＡＢ−ＤＩＰ）をリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により遺伝子導入し、共発現させた。
【００８８】
ＨＡタグをつけたＡβ１−４０（ｐＣＭＶ−ＨＡ−Ａβ４０）又はＡβ１−４２（ｐＣＭＶ−ＨＡ−Ａβ４２）とＭｙｃタグをつけたＡＢ−ＤＩＰ（ｐＣＭＶ−ＨＡ−ＡＢ−ＤＩＰ）は、以下のようにして作製した。ＡＰＰの塩基配列をもとに以下に示す５’プライマーと３’プライマーを設計し、それぞれ制限酵素切断サイトを挿入した：
HA-Abeta42 (KpnI)5'：CGG GTA CCA TGG ATG CAG AAT TCC GAC ATG AC（配列番号７）
HA-Abeta42 (KpnI)3'：GCG GTA CCC GCT ATG ACA ACA CCG CCC ACC AT（配列番号８）
【００８９】
上記プライマーを用いてＰＣＲ増幅し、産物の配列を確認した後精製し、ｐＵＣ１８ベクターにクローニングした。これよりＫｐｎＩによりＡβ４２を切り出し、ｐＣＭＶ−ＨＡベクターのＫｐｎＩ部位にＤＮＡ Ｔ４リガーゼを用いて挿入した。このようにして、ＨＡタグを５’端に結合したＡβ４２のｃＤＮＡが得られた。
【００９０】
ｐＣＭＶ−ＨＡ−Ａβ４０も同様に作製した。Ａβ４０の場合、ＢｇｌＩＩ、ＸｈｏＩ部位を挿入した。用いたプライマーは以下のとおりである：
HA-Abeta40 (BglII)5'：GCA GAT CTC TGA TGC AGA ATT CCG ACA TGA C（配列番号９）
HA-Abeta40 (XhoI)3'：GCC TCG AGT CAG ACA ACA CCG CCC ACC ATG AG（配列番号１０）
【００９１】
３６時間後、細胞をタンパク質分解酵素阻害剤カクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ，Ｒｏｃｈｅ）とフェニルメチルスルホニルフッ素を含むＲＩＰＡ緩衝液で洗った後、スクレーパーで集め、１５秒間の細胞破砕後、４℃で１３，０００回転にて１５分間遠沈した。総タンパク質量はＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ）によって測定した。上澄をプロテインＡ−セファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）と９０分間反応させた後、一晩特異抗体を反応させた。翌朝、免疫複合体を回収し、ＲＩＰＡ緩衝液で３回洗浄後、ＳＤＳに溶解し、沸騰する水の中で５分間変性させ、１２．５％アクリルアミドゲルで電気泳動を行った。そしてＰＶＤＦ膜に転写した後、検出用特異抗体を作用させ、化学発光法により検出した。用いた抗体は、ＡＢ−ＤＩＰ特異的抗体Ｎ２、Ｃ１、抗ＨＡ抗体（Ｓｉｇｍａ）、抗Ａβ抗体６Ｅ１０（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、及び抗Ｍｙｃ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。ＡＢ−ＤＩＰ特異的抗体Ｎ２は、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質に基づいて、ウサギ血清を用いて作製し、ＩｇＧに精製したものであり、ＭＢＬ社に作製を委託した。
【００９２】
その結果、Ｍｙｃ抗体で免疫沈降しＡβ抗体で検出すると、Ａβ４０（図２の下のバンド）とＡβ４２（図２の上のバンド）が共沈することが分った（図２）。これはＮ２抗体で免疫沈降しても同様の結果であった。
【００９３】
次に逆の方法により同様の実験を行った。即ち、Ａβ抗体６Ｅ１０で免疫沈降し、Ｍｙｃ抗体で検出したところ、ＡＢ−ＤＩＰを検出した（図３）。このことから、ＡＢ−ＤＩＰとＡβ１−４０又はＡβ１−４２が結合していることが明らかになった。
【００９４】
〔実施例３〕ＡβはＡＢ−ＤＩＰの中央部分に結合する
ＡβとＡＢ−ＤＩＰの結合をｉｎ ｖｉｖｏで調べるために、ＡＢ−ＤＩＰの部分欠失遺伝子をＰＣＲ増幅し、ｐＣＭＶ−ＭｙｃベクターのＥｃｏＲＩサイトとＳａｌＩサイトに挿入し、ｐＣＭＶ−Ｍｙｃ−１−３４０（ＡＢ−ＤＩＰの１−３４０のみを有する）、ｐＣＭＶ−Ｍｙｃ−３４５−７７６（ＡＢ−ＤＩＰの３４５−７７６のみを有する）、ｐＣＭＶ−Ｍｙｃ−５０−７７６（ＡＢ−ＤＩＰの５０−７７６のみを有する）、ｐＣＭＶ−Ｍｙｃ１−５５０（ＡＢ−ＤＩＰの１−５５０のみを有する）、及びｐＣＭＶ−Ｍｙｃ−２３１−５８９（ＡＢ−ＤＩＰの２３１−５８９のみを有する）を作製した。これらのベクターとｐＣＭＶ−Ａβ４２をＳＹ５Ｙ細胞に同時に発現させ、Ｍｙｃ抗体で免疫沈降し、６Ｅ１０抗体でＡβを検出した。
【００９５】
その結果、Ａβ１−４２は、２３１−５８９のみを有するＡＢ−ＤＩＰ以外のすべてと結合した（図４）。従って、ＡβはＡＢ−ＤＩＰの中央部分とは結合せず、Ｃ末端側とＮ末端側両方に結合サイトがあることが分った。
【００９６】
〔実施例４〕ＡＢ−ＤＩＰによる細胞死誘導確認試験
ＡＢ−ＤＩＰのｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、Ｍｙｃ−ｔａｇを有する発現ベクター（ｐＣＭＶ−Ｍｙｃ）のＥｃｏ−Ｓａｌサイトに挿入し、ｐＣＭＶ−Ｍｙｃ−ＡＢ−ＤＩＰを得た。ＡＢ−ＤＩＰの発現を可視化するために、先ずＥＧＦＰを融合した遺伝子ｐＥＧＦＰＮ１−ＡＢ−ＤＩＰを構築した。そのために、まず全長のＡＢ−ＤＩＰ遺伝子（配列番号１）をｐＣＭＶ−Ｍｙｃ−ＡＢ−ＤＩＰのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩサイトから切り出し、ｐＥＧＦＰＮ１プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩサイトに挿入した。陽性コントロールとして、ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５ＹのＲＮＡからｐ５３特異的プライマーを用いて逆転写ＰＣＲによりｐ５３ ｃＤＮＡ（配列番号１１）をクローニングし、ＥｃｏＲＩ（５’）サイトとＳａｌＩ（３’）サイトで切断し、ｐＥＧＦＰＮ１プラスミドに挿入し、ｐＥＧＦＰＮ１−ｐ５３を得た。
【００９７】
次に、ＡＢ−ＤＩＰを強発現すると細胞がすべて死滅してしまうために、テトラサイクリン（ｔｅｔ）で発現が制御される遺伝子を構築した。そのために、先ずＡＢ−ＤＩＰをｔｅｔオペレーター配列を有するプラスミド（ｐｃＤＮＡ４−Ｔｏ）のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩサイトに挿入し、ｐｃＤＮＡ４−Ｔｏ−ＡＢ−ＤＩＰを得た。ｔｅｔオペレーターの制御（レプレッサー）にはｐｃＤＮＡ６−ＴＲ空ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。そして、ｐｃＤＮＡ４−Ｔｏ−ＡＢ−ＤＩＰとｐｃＤＮＡ６−ＴＲをリポフェクタミン法により１：４の比でＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に導入し、ブラスチシジン（６μｇ／ｍｌ）とゼオシン（１４０μｇ／ｍｌ）で選択し、クローンＮ３を得た。クローンＮ３はドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）の存在下でのみＡＢ−ＤＩＰの発現を示した。
【００９８】
そこで先ずＥＧＦＰ−ＡＢ−ＤＩＰをＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に発現させ、ＥＧＦＰ陽性細胞の生存状態を蛍光顕微鏡で調べた。ＥＧＦＰのみのコントロールベクターを導入した細胞（図５、菱形）は９６時間後も増殖を継続したが、ＥＧＦＰ−ＡＢ−ＤＩＰを導入した細胞（図５、四角）は４８時間後には生存細胞数が減少し、９６時間後には殆どの細胞が死んでしまった。これはＥＧＦＰの発現が低下したのではない証拠に顕微鏡下に細胞の剥離、浮遊、断片化によって確認された。ＥＧＦＰ−ｐ５３を発現する細胞はＡＢ−ＤＩＰとほぼ同等の細胞死を示した（図５、三角）。
【００９９】
また７２時間でＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ｆｌｕｏｓ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてアネキシンＶ染色を行い、アポトーシスのマーカーとされるアネキシンＶ陽性細胞数を数えた。ＥＧＦＰ対照の４６０個に比し、ＡＢ−ＤＩＰのみ発現する細胞は６５３個、ＡＢ−ＤＩＰとｐＣＭＶ−ＨＡ−Ａβ４２の導入によりＡβ１−４２を発現する細胞は７５４個、ｐ５３を発現する細胞は８７７であった。以上より、ＡＢ−ＤＩＰそれ自体の強発現でアポトーシスが誘導されること、Ａβ１−４２の存在下にそのアポトーシスは更に増強されることが分った。
【０１００】
〔実施例５〕ＡＢ−ＤＩＰによる細胞周期停止確認試験
次に、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）でＡＢ−ＤＩＰを発現した時としない時の細胞周期をＦＡＣＳで調べた。細胞周期をＧ２／Ｍ期で停止させることが知られているノコドゾールでＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を処理すると、Ｇ２／Ｍ期の細胞は３５．４％に達した（図６Ｂ）。ＤｏｘでＡＢ−ＤＩＰを発現させた細胞では３２．０％がＧ２／Ｍ期を示した（図６Ｆ）。これに対し、ＳＨ−ＳＹ５Ｙの何もしない対照細胞のそれは１４．６％（図６Ａ）、空ベクターＴｏ／Ｔｒを導入しＤｏｘを加えないもの１７．１％（図６Ｃ）、空ベクターを導入しＤｏｘを加えたもの１６．２％（図６Ｄ）、ＡＢ−ＤＩＰ発現ベクターを導入しＤｏｘを加えないもの２０．６％であった（図６Ｅ）。以上より、ＡＢ−ＤＩＰは細胞周期をＧ２／Ｍ期で止める作用があることが分った。
【０１０１】
〔実施例６〕ＡＢ−ＤＩＰのカスパーゼによる切断
本実施例においては、Ｄｏｘで誘導されるＡＢ−ＤＩＰを安定的に発現する細胞株Ｎ３を用いた。
Ｎ３細胞を小胞体ストレスの誘導剤であるツニカマイシン（和光純薬）、ミトコンドリア呼吸酵素複合体の阻害剤であるロテノン（ＭＰバイオメディカル（アメリカ））で処理したところ、いずれも９７ｋＤａのＡＢ−ＤＩＰに加え６２ｋＤａのＡＢ−ＤＩＰ（ＡＢ−ＤＩＰ ｐ６２）を生じた。また、Ｎ３細胞にｐＣＭＶ−ＨＡ４２を導入し、ＡＢ−ＤＩＰとＡβ１−４２を同時に発現させたときにもＡＢ−ＤＩＰ ｐ６２が生成された（図７）。
【０１０２】
また、抗癌剤であるビンブラスチン（シグマ（アメリカ））、有糸分裂阻害剤であるノコドゾール（シグマ）で処理すると、ｐ６２と９７ＫＤａのＡＢ−ＤＩＰに加え、更に大きい分子量のＡＢ−ＤＩＰを生じた（図７）。この大きいサイズのＡＢ−ＤＩＰはラムダホスファターゼを同時に加えると消失したことから、ＡＢ−ＤＩＰがリン酸化されたものと考えられた。すなわち、図８に示すように、Ｎ３細胞をビンブラスチン（レーン５）、ノコドゾール（レーン７）で処理すると９７ｋＤのＡＢ−ＤＩＰを生じ、このバンドはホスファターゼを一緒に処理することにより消失した（レーン６及び８）ので、これらの処理によりＡＢ−ＤＩＰがリン酸化を受けたと考えられる。また、無処理Ｎ３細胞（レーン１）、Ｎ３＋ホスファターゼ（レーン２）、Ｎ３＋ロテノン（レーン３）、Ｎ３＋ロテノン＋ホスファターゼ（レーン４）では、このようなリン酸化は見られなかった（図８）。従って、細胞死誘導に際しＡＢ−ＤＩＰはリン酸化され、何らかの酵素により限定切断を受け、その結果生じるｐ６２が活性型ＡＢ−ＤＩＰとして生理活性を発揮し、細胞死誘導に関与するものと考えられた。
【０１０３】
そこで、ＡＢ−ＤＩＰの切断酵素の同定を行った。先ず、上記細胞死誘導剤でＮ３細胞を処理するとき同時にカスパーゼ一般の阻害剤であるｚＶＡＤ．ｆｍｋで処理するとアポトーシスの誘導は阻害され、同時にｐ６２の生成も阻害された。また、ＡＢ−ＤＩＰにはＬＥＫＤ（４９３−４９６位）というカスパーゼによる切断配列が含まれることから、何らかのカスパーゼがその切断に関与していると推定された。
【０１０４】
次に、Ｎ３細胞を遠沈し、生理食塩水で洗浄後、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ及びプロテアーゼインヒビターを含む緩衝液に浮遊させ、１５秒間超音波破砕を行い、遠沈後上清を得た。この上清をタンパク質量２００μｇに調整し、各種ヒトリコンビナントカスパーゼ２単位／５０μｌ（ＭＢＬ社）を加え、３０℃にて３時間インキュベートした。その後ＳＤＳバッファーを加えて反応を止め、免疫ブロット法によりｐ６２の生成を調べた。その結果、カスパーゼ−６、−８、−９，−１０を調べたところ、カスパーゼ−９のみがｐ６２を生じた（図９）。
【０１０５】
さらに、ＬＥＫＤに相当する４９６位のアスパラギン酸（Ｄ）をアラニン（Ａ）に置換したＡＢ−ＤＩＰ発現細胞では、これらのカスパーゼによるｐ６２の生成は見られなかった。以上より、ＡＢ−ＤＩＰは何らかのアポトーシスシグナルによりリン酸化され、カスパーゼ−９が結合し、ＬＥＫＤの部位で切断され、活性型ＡＢ−ＤＩＰ（ｐ６２）を生じ、これが核へ移行し細胞死を誘導すると考えられた。このとき細胞内にＡβ１−４２が存在すると、ｐ６２の生成が増強され、細胞死は一層増強されることが分った。
【０１０６】
〔実施例７〕Ａβによる細胞死のｓｉＲＮＡによる阻害試験
（１）ｓｉＲＮＡの構築
ＡＢ−ＤＩＰのスタートコドンから１６０１−１６３１位の２１塩基対の２本鎖ＲＮＡ、5’-AAG CUC GAA AUG GAG AAG GUG-3’（配列番号１２）をｓｉＲＮＡとして選択し、構築した。この配列はヒトゲノムのＢＬＡＳＴサーチにより、ＡＢ−ＤＩＰ以外の遺伝子を阻害しないことを確認した。対照として、ルシフェラーゼ遺伝子のスタートコドンから１５３−１７１位の１８塩基対の5’-CGU ACG CGG AAU ACU UCG-3’（配列番号１３）の２本鎖ＲＮＡ、及び合成スクランブルド２本鎖ＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を用いた。
【０１０７】
（２）ドミナントネガティブＡＢ−ＤＩＰの構築
先ず、ＡＢ−ＤＩＰの各種欠失変異体を構築した。ｐＥＧＦＰ−ＤＭ１（アミノ酸配列１−４８のみを有する）、ｐＥＧＦＰ−ＤＭ２（アミノ酸配列３１−２２３のみを有する）、ｐＥＧＦＰ−ＤＭ３（アミノ酸配列２２４−３２９のみを有する）、ｐＥＧＦＰ−ＤＭ４（アミノ酸配列１２４−３１９と５９２−７７６のみを有する）、ｐＥＧＦＰ−ＤＭ５（アミノ酸配列１−３１９と５９２−７７６のみを有する）は、ｐＥＧＦＰＮ１のプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩサイトに挿入した。ｐＥＧＦＰ−ＤＭ６（アミノ酸配列１−４８７のみを有する）、ｐＥＧＦＰ−ＤＭ７（アミノ酸配列１２４−４９６のみを有する）、ｐＥＧＦＰ−ＤＭ８（アミノ酸配列３８０−７７６のみを有する）は、ｐＥＧＦＰＮ１（クロンテック社）のＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩサイトに挿入した。これらのプラスミドをＰＣＭＶ−Ｍｙｃ−ＡＢ−ＤＩＰ（実施例４参照）と共発現させ、ＡＢ−ＤＩＰの発現を調べた。
【０１０８】
その結果、ＡＢ−ＤＩＰのｓｉＲＮＡはＡＢ−ＤＩＰの発現を著しく抑制した（図１０）。ｐＥＧＦＰ−ＤＭ４を共発現させた時にのみＡＢ−ＤＩＰの発現が著しく抑制された。また、ｐＥＧＦＰ−ＤＭ４はドミナントネガティブに作用すると考えられた。ｐＥＧＦＰ−ＤＭ４はカスパーゼ活性化及びリクルートドメイン（ＣＡＲＤ）、核移行配列（ＮＴＳ）を欠くコンストラクトであった。
【０１０９】
〔実施例８〕細胞外Ａβによる細胞死をＡＢ−ＤＩＰが増強する
ＥＧＦＰN1（「空ベクター」は削除）（クロンテック社）とＥＧＦＰ−ＤＭ４（実施例７）をＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に導入し、これらを安定的に発現する細胞株を樹立した。後者の細胞はＥＧＦＰ−ＤＭ４と命名した。これらの細胞の培養液中に合成Ａβ１−４０又はＡβ１−４２（バイオソース社）を２０μＭの濃度で加え、７２時間後にＭＴＴアッセイ（ロッシュ（ドイツ））により細胞の生存状態を調べた。
【０１１０】
その結果、ＥＧＦＰ空ベクターを発現する細胞にＡβ１−４０又はＡβ１−４２を作用させると、作用させない場合に比し、それぞれ５５．８％又は５７．２％の細胞生存率であった。これに対してＥＧＦＰ−ＤＭ４ではそれぞれ８１％又は７８．８％と上昇した（図１１）。このことは細胞外から作用させたＡβによる細胞死にＡＢ−ＤＩＰが関与していることを示唆している。また、図１１において「Ａｂｅｔａ４２−１」はＡβ１−４２の逆配列であり、活性がないため、対照と同様の結果となる。
【０１１１】
〔実施例９〕細胞内Ａβによる細胞死をＡＢ−ＤＩＰが増強する
ＥＧＦＰにＡβ１−４２を結合させたプラスミドｐＥＧＦＰＮ１−４２を構築した。これをＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にＡＢ−ＤＩＰに対するｓｉＲＮＡと共発現させ、２４、４８及び７２時間後にアネキシンＶ染色によりアポトーシス細胞を定量的に調べた。対照はルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ、合成スクランブルド２本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を用いた。
【０１１２】
その結果、ｐＥＧＦＰＮ１−４２を発現する細胞（ＥＧＦＰ−４２）はＥＧＦＰの空ベクターを発現する細胞（ＥＧＦＰ ｃｏｎｔｒｏｌ）に比し、アネキシンＶ陽性細胞（アポトーシスを示す細胞）は２４、４８及び７８時間後に有意に増加した（図１２）。これに対し、ｐＥＧＦＰＮ１−４２とＡＢ−ＤＩＰに対するｓｉＲＮＡを同時に発現する細胞（ＥＧＦＰ−４２＋ｓｉＡＢ−ＤＩＰ）では４８時間後及び７２時間後のアネキシンＶ陽性細胞は有意に抑制された（図１２）。ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＬｕｃ）及びスクランブルドｓｉＲＮＡ（ｓｉＮｏｎ）にはその抑制作用は見られなった（図１２）。この結果は、細胞内に発現させたＡβ１−４２によるアポトーシスを、ＡＢ−ＤＩＰに対するｓｉＲＮＡが抑制することを示している。
【０１１３】
〔実施例１０〕ＡＢ−ＤＩＰのヒト組織での発現
ヒト各種臓器及びヒト脳の各種部位のＲＮＡを含むＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、ノーザンブロット法によりＡＢ−ＤＩＰの発現を調べた。プローブとしてはＡＢ−ＤＩＰのＣ末部分（２０３９−２５６０塩基対）を用いた。対照としてβ−アクチンを用いた。ハイブリダイゼーションはＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−ｈｙｂ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用い、６８℃で１時間を行った。
【０１１４】
その結果、ＡＢ−ＤＩＰ ｃＤＮＡは３．１ｋｂのバンドとして見られ、脳、心臓、骨格筋をはじめすべての臓器に見られた。また、脳では小脳、大脳皮質、延髄などすべての部位に発現が見られた。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明により、アミロイドベータタンパク質（Ａβ４２）と結合し、神経細胞死を誘導する新規タンパク質であるＡＢ−ＤＩＰタンパク質及びその活性型、それをコードする遺伝子などが提供される。ＡＢ−ＤＩＰタンパク質を利用することにより細胞死を制御することができるため、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質等は細胞死に関連する疾患の予防又は治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】ＡＢ−ＤＩＰタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。下線はＣＡＲＤドメイン（６−４８）を、また下線を付したＱはＮ末端側のグルタミンリッチ領域を、イタリック体は核移行シグナル（２３４−２５０）を、太字及び下線はＲＧＤ（３１９−３２１）及びＤＤＭ（６８５−８８７）を、太字はＬＥＫＤを、網掛けはショウジョウバエ保存領域Ｄ１（５２３−５８１）及びＤ２（６９０−７４３）を表す。
【図２】Ｍｙｃタグを付したＡＢ−ＤＩＰとＡβを共発現させ、ｍｙｃ抗体で免疫沈降し、Ａβ抗体６Ｅ１０でウエスタンブロットを行った結果を示す。
【図３】Ｍｙｃタグを付したＡＢ−ＤＩＰとＡβを共発現させ、Ａβ抗体６Ｅ１０で免疫沈降し、ｍｙｃ抗体でウエスタンブロットを行った結果を示す。
【図４】Ｍｙｃタグを付した各種欠損変異ＡＢ−ＤＩＰとＡβを共発現させ、ｍｙｃ抗体で免疫沈降し、６Ｅ１０抗体でウェスタンブロットを行った結果を示す。
【図５】ＡＢ−ＤＩＰを強発現する細胞はｐ５３を強発現する細胞とほぼ同等の細胞死を引き起こすことを示す。Ａβ４２とＡＢ−ＤＩＰを共発現すると細胞死はやや増強される。
【図６】ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）でＡＢ−ＤＩＰが発現誘導されるＮ３細胞株を用いて細胞周期を調べた結果を示す。
【図７】カスパーゼを活性化させ細胞死を誘導する各種薬剤で細胞を処理すると９７ｋＤのＡＢ−ＤＩＰが６２ｋＤのＡＢ−ＤＩＰ ｐ６２を生じたことを示す。
【図８】Ｎ３細胞を、無処理（レーン１）、又は、Ｎ３＋ホスファターゼ（レーン２）、Ｎ３＋ロテノン（レーン３）、Ｎ３＋ロテノン＋ホスファターゼ（レーン４）、ビンブラスチン（レーン５）、ビンブラスチン＋ホスファターゼ（レーン６）、ノコドゾール（レーン７）若しくはノコドゾール＋ホスファターゼ（レーン８）で処理した場合に生じるＡＢ−ＤＩＰのサイズを調べた結果を示す。
【図９】ＡＢ−ＤＩＰはカスパーゼ９により切断をうけ、ｐ６２を生じたことを示す。
【図１０】ＡＢ−ＤＩＰに対するｓｉＲＮＡがＡＢ−ＤＩＰの発現を著しく抑制したことを示す。
【図１１】Ａβ４０及びＡβ４２による細胞死はＡＢ−ＤＩＰをドミナントネガティブに変異することにより抑制されることを示す。
【図１２】細胞内Ａβ４２発現による細胞死をＡＢ−ＤＩＰのｓｉＲＮＡが有意に抑制することを示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１１７】
配列番号５〜１０、１２及び１３：合成オリゴヌクレオチド
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病の原因であるアミロイドベータタンパク質に関連する神経細胞死を誘導するＡＢ−ＤＩＰ、並びにその制御によるアルツハイマー病の予防及び治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミロイドベータタンパク質（Ａβ）は、神経細胞に対して毒性を発揮する。また、本発明者らは、プレセニリン１トランスジェニックマウスの脳では、老人斑形成を伴わずに神経細胞死が促進されており、神経細胞内Ａβが増大することを報告している（非特許文献１）。これまでの研究では、Ａβにより誘導される酸化ストレス、小胞体ストレスなどによる細胞死、カルシウム調節障害による細胞死、ＥＲＡＢ（小胞体にあるタンパク質でＡβに結合し、細胞障害を起こすタンパク質、endoplasmic-reticulim associated binding proteinの略）を介する細胞死、グリピカン１を介する細胞死などが知られているが、そのメカニズムは十分に明らかとされていない。そのため、神経細胞死のメカニズムやその調節又は制御について解明し、それにより神経細胞死に関連する疾患の治療方法を開発することが望まれている。
【０００３】
【非特許文献１】Yan, S.D.ら、Nature、第389巻、第689-95頁、1997年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、細胞内外Ａβタンパク質と結合し、細胞死を誘導する物質を同定すること、及び神経細胞死を制御する方法を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行い、イーストツーハイブリッド法によりアミロイドベータタンパク質（Ａβ４２）と結合するタンパク質をスクリーニングしたところ、７７６個のアミノ酸からなるタンパク質、すなわちＡβ結合細胞死誘導タンパク質（Aβ-binding death inducing protein；ＡＢ−ＤＩＰ）をコードする新規遺伝子を見出した。また、このＡＢ−ＤＩＰ遺伝子を細胞において強制発現させると細胞死が誘導され、またＡβを同時に発現させた場合には細胞死が増強されることを確認し、さらにＡＢ−ＤＩＰが細胞死に関連するカスパーゼ９による切断を受けて活性型に変換することも確認し、ＡＢ−ＤＩＰを利用して神経細胞死を制御できるという知見を得、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及びそれをコードする核酸
・以下の（ａ）又は（ｂ）のＡＢ−ＤＩＰタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、アミロイドベータタンパク質との結合能を有するタンパク質
・以下の（ａ）又は（ｂ）のＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、アミロイドベータタンパク質との結合能を有するタンパク質
・以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列の２３３番目〜２５６３番目の塩基配列からなる核酸
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列の２３３番目〜２５６３番目の塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アミロイドベータタンパク質との結合能を有するタンパク質をコードする核酸
【０００７】
（２）活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及びそれをコードする核酸
・以下の（ａ）又は（ｂ）の活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１番目〜４９６番目のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１番目〜４９６番目のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、アミロイドベータタンパク質との結合能を有するタンパク質
・以下の（ａ）又は（ｂ）の活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１番目〜４９６番目のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１番目〜４９６番目のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、アミロイドベータタンパク質との結合能を有するタンパク質
・以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列の２３３番目〜１７２０番目の塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列の２３３番目〜１７２０番目の塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アミロイドベータタンパク質との結合能を有するタンパク質をコードする核酸
【０００８】
（３）上記核酸を含む組換えベクター。
（４）上記核酸、又は上記組換えベクターで形質転換された形質転換体。
（５）ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質に対する抗体。
該抗体は、例えば配列番号２の１８２番目〜１９６番目のアミノ酸配列を含む抗原又は７５３番目〜７７６番目のアミノ酸配列を含む抗原を用いて作製することができる。
（６）ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸に対するアンチセンス核酸。
（７）ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸に対する二本鎖ＲＮＡ。
該二本鎖ＲＮＡとしては、配列番号７に示される塩基配列を有するものが挙げられる。
（８）上記形質転換体を培養し、得られる培養物からＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質を採取することを特徴とする、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質の製造方法。
【０００９】
（９）以下の（ａ）〜（ｈ）の少なくとも１つを含むことを特徴とする細胞死誘導剤。
（ａ）請求項１記載のＡＢ−ＤＩＰタンパク質
（ｂ）請求項４記載の活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質
（ｃ）請求項２記載のＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸
（ｄ）請求項５記載の活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸
（ｅ）請求項３記載の核酸
（ｆ）請求項６記載の核酸
（ｇ）請求項７記載の組換えベクター
（ｈ）請求項８記載の形質転換体
上記細胞死誘導剤は、さらに以下の（ｉ）〜（ｍ）の少なくとも１つを含むものであってもよい。
（ｉ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＡβ４２タンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、細胞障害機能を有するタンパク質
（ｊ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＡβ４２タンパク質、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、細胞障害機能を有するタンパク質、をコードする核酸
（ｋ）配列番号３に示される塩基配列からなる核酸、又は、配列番号３に示される塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞障害機能を有するタンパク質をコードする核酸
（ｌ）上記（ｊ）又は（ｋ）のいずれかの核酸を含む組換えベクター
（ｍ）上記（ｊ）若しくは（ｋ）のいずれかの核酸、又は上記（ｌ）の組換えベクターを含有する形質転換体
【００１０】
（１０）以下の（ａ）〜（ｅ）の少なくとも１つを含むことを特徴とする細胞死抑制剤。
（ａ）請求項９又は１０記載の抗体
（ｂ）請求項１１記載のアンチセンス核酸
（ｃ）請求項１２又は１３記載の二本鎖ＲＮＡ
（ｄ）上記（ｂ）又は（ｃ）のいずれかの核酸を発現することができる組換えベクター
（ｅ）上記（ｂ）若しくは（ｃ）のいずれかの核酸、又は上記（ｄ）の組換えベクターを含有する形質転換体
（１１）以下の（ａ）〜（ｅ）の少なくとも１つを含むことを特徴とする細胞死関連疾患の治療剤又は予防剤。
（ａ）請求項９又は１０記載の抗体
（ｂ）請求項１１記載のアンチセンス核酸
（ｃ）請求項１２又は１３記載の二本鎖ＲＮＡ
（ｄ）上記（ｂ）又は（ｃ）のいずれかの核酸を発現することができる組換えベクター
（ｅ）上記（ｂ）若しくは（ｃ）のいずれかの核酸、又は上記（ｄ）の組換えベクターを含有する形質転換体
細胞死関連疾患としては、例えばアルツハイマー病が挙げられる。
【００１１】
（１２）以下の（ａ）〜（ｈ）の少なくとも１つを含むことを特徴とする細胞周期停止剤。
（ａ）請求項１記載のＡＢ−ＤＩＰタンパク質
（ｂ）請求項４記載の活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質
（ｃ）請求項２記載のＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸
（ｄ）請求項５記載の活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸
（ｅ）請求項３記載の核酸
（ｆ）請求項６記載の核酸
（ｇ）請求項７記載の組換えベクター
（ｈ）請求項８記載の形質転換体
（１３）アミロイドベータタンパク質（Ａβ）及びＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質と被検化合物とを接触させ、ＡβとＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質との結合を測定することを含む、ＡβとＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質との結合を阻害又は促進する化合物のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、アミロイドベータタンパク質（Ａβ４２）と結合し、神経細胞死を誘導する新規タンパク質であるＡＢ−ＤＩＰタンパク質及びその活性型、それをコードする遺伝子などが提供される。ＡＢ−ＤＩＰタンパク質を利用することにより細胞死を制御することができるため、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質等は細胞死に関連する疾患の予防又は治療に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明は、アミロイドベータタンパク質４２（Ａβ４２）と結合するＡβ結合細胞死誘導タンパク質（Aβ-binding death inducing protein；ＡＢ−ＤＩＰ）及びその活性型、並びにそれらの用途に関するものであり、上記タンパク質がＡβ４２と結合し、細胞死を誘導する機能を有することに基づいて完成されたものである。
【００１５】
アミロイドベータタンパク質（Ａβ）は、主として４０アミノ酸のＡβ４０と４２アミノ酸のＡβ４２からなる。これらのＡβは神経細胞に対して毒性を有し、また家族性アルツハイマー病患者においてはＡβ４２の量が増大しており、このＡβ４２形態が脳プラーク中に蓄積し、アミロイドの沈着に主要な役割を果たしていることから、Ａβがアルツハイマー病の病因の一つであることが示唆されている（Iwatsuboら、1994 Neuron 13：45-53；Mannら、1996, Am. J. Pathol. 148:1257）。従って、Ａβ４２と結合して細胞死を誘導するＡＢ−ＤＩＰタンパク質を利用して神経細胞死を制御することにより、アルツハイマー病をはじめとする細胞死に関連する疾患を治療又は予防することができる。
【００１６】
本発明においては、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又はその活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質を用いて細胞死を誘導することができる。また、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又はその活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質の発現又は活性を抑制することにより細胞死を抑制することができる。
【００１７】
１．ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及びそれをコードする遺伝子
配列番号１にＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする遺伝子（ＡＢ−ＤＩＰ遺伝子）の塩基配列を、配列番号２にＡＢ−ＤＩＰタンパク質のアミノ酸配列を例示する。ここで、配列番号１の２３３番目〜２５６３番目の塩基配列がＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする領域である。ＡＢ−ＤＩＰタンパク質は、７７６個のアミノ酸残基からなり、以下の特徴ある配列を有するものである（図１）：
カスパーゼ活性化及びリクルートドメイン（Caspase activation and recruitment domain；ＣＡＲＤ）（配列番号２の６−４８）：これはカスパーゼやａｐａｆ−１など多くのアポトーシスに関連するタンパク質に見られる配列である（図１中、下線で示す）
グルタミン（Ｑ）リッチドメイン（Ｎ末端側）（図１中、下線を付したＱである）
核移行シグナル（Nuclear targeting signal；ＮＴＳ）（配列番号２の２３４−２５０）：これにより、このタンパク質の全部又は一部が核へ移行し、何らかの作用を発揮すると考えられる（図１中、イタリック体で示す）
【００１８】
細胞接着配列（Cell attachment sequence）とされるＲＧＤ配列（配列番号２の３１９−３２１）とＲＧＤ結合モチーフと思われるＤＤＭ配列（配列番号２の６８５−６８７）：この存在は、細胞接着に関する機能あるいは分子を不活性化する機能があると思われる（図１中、太字と下線で示す）
カスパーゼ認識切断部位（ＬＥＫＤ）（４９３−４９６）：この存在はカスパーゼの基質となることが示唆される（図１中、太字で示す）
ショウジョウバエの遺伝子において保存されているＤ１ドメイン（配列番号２の５２３−５８１）及びＤ２ドメイン（配列番号２の６９０−７４３）：この領域の機能は不明である。このタンパク質とＣ末端部分のアミノ酸が４５％一致するＤＸＳ６６７３Ｅは伴性劣性遺伝を示す精神発達遅滞をおこす疾患の候補遺伝子との報告がある（図１中、網掛けで示す）。
【００１９】
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質は、アミロイドベータタンパク質（Ａβ４２）との結合能を有する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは１若しくは数個のアミノ酸に置換、欠失、挿入、付加、逆位等の変異が生じてもよい。アミロイドベータタンパク質との結合能は、変異を有するタンパク質と、アミロイドベータタンパク質とを接触させ、それらの結合を当技術分野で公知の方法（例えば免疫沈降法、酵母ツーハイブリッド法など）により測定することによって確認することができる。ここで、アミロイドベータタンパク質（Ａβ４２）のアミノ酸配列を配列番号４に、塩基配列を配列番号３に示す。Ａβ４２は、それらの配列から公知の方法に従って化学合成又は組換え手法により作製することができるし、あるいは公知の手法に従って細胞又は組織から単離してもよい（例えばRoherら、1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10836参照）。また、Ａβ４２は、例えばバイオソース（アメリカ）（Biosource）社などから市販品として入手することも可能である。Ａβ４２は、その機能、すなわち細胞障害機能を維持する限り、Ａβ４２の塩基配列及びアミノ酸配列に変異が含まれていてもよい。ここで「細胞障害機能」とは、細胞の生理的機能に変調をきたすことを意味し、この機能は、細胞周期の変化、細胞増殖能の変化、細胞変性・死により確認することができる。
【００２０】
例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したものも、本発明のアミロイドベータタンパク質との結合能を有するタンパク質に含まれる。さらに具体的には、配列番号２に示されるアミノ酸配列の、例えば配列番号２の１番目〜３４０番目、１番目〜５５０番目、５０番目〜７７６番目、又は３４５番目〜７７６番目のアミノ酸配列を有する変異体は本発明のタンパク質に含まれる。
【００２１】
上記遺伝子は、ヒトの任意の細胞若しくは組織から調製したＤＮＡ又はヒトのｃＤＮＡライブラリーを用いて、上記遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行うことにより調製することができる。
【００２２】
また、一旦遺伝子の塩基配列が確定すると、その後は化学合成によって、この遺伝子を得ることができる。また、部位特異的突然変異誘発法等によって本発明の遺伝子の変異型であって上記機能又は活性を有するものを合成することもできる。なお、遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した市販の変異導入用キットなどを用いて変異の導入が行われる。また、エラー導入ＰＣＲやＤＮＡシャッフリング等の手法により、遺伝子の変異導入やキメラ遺伝子を構築することもできる。エラー導入ＰＣＲ及びＤＮＡシャッフリング手法は、当技術分野で公知の手法であり、例えばエラー導入ＰＣＲについてはChen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 5618-5622を、またＤＮＡシャッフリングについてはStemmer, W. P. 1994, Nature, 370:389-391及びStemmer W. P., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91: 10747-10751を参照されたい。
【００２３】
変異した遺伝子により作製される組換えタンパク質が目的の機能（アミロイドベータタンパク質との結合能）を有するか否かは、変異遺伝子で形質転換体において発現させ、得られる組換えタンパク質の結合能を、上述したように測定することにより確認することができる。
【００２４】
さらに、上記塩基配列からなる核酸の全部又は一部の配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、それぞれの機能又は活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も本発明のＡＢ−ＤＩＰ遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、高い相同性（相同性が６０％以上、好ましくは８０％以上）を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、ナトリウム濃度が１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭであり、温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃での条件をいう。例えばハイブリダイゼーション条件が６５℃であり、洗浄の条件が０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中で６５℃、１０分の場合に、慣例的な手法、例えばサザンブロット、ドットブロットハイブリダイゼーションなどによってハイブリダイズすることが確認された場合には、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするといえる。
また、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質は、リン酸化されたものであってもよい。
【００２５】
本発明においては、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質の活性型をコードする遺伝子（「活性型ＡＢ−ＤＩＰ遺伝子」という）の設計及び合成を行うことができる。活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質とは、ＡＢ−ＤＩＰの全長アミノ酸配列（配列番号２）の１番目〜４９６番目のアミノ酸配列を含むタンパク質断片を指す。この活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質は、ＡＢ−ＤＩＰのカスパーゼによる切断により生じ、約６２ｋＤａの分子量を有する。本明細書中、活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質は、「活性型ＡＢ−ＤＩＰ」、「ＡＢ−ＤＩＰ ｐ６２」、又は単に「ｐ６２」とも称する。また、活性型ＡＢ−ＤＩＰ遺伝子は、配列番号１の２３３番目〜１７２０番目の塩基配列からなる核酸である。
【００２６】
この活性型ＡＢ−ＤＩＰ遺伝子は、該断片をコードする領域の外側の領域であって配列番号１で表される塩基配列の任意の領域の配列に基づいてプライマーを設計し、ＡＢ−ＤＩＰ遺伝子（配列番号１）を鋳型としてＰＣＲを行うことにより得ることができる。また、活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質は、活性型タンパク質のアミノ酸配列に基づいて化学合成により又は遺伝子工学的手法により作製してもよいし、あるいは全長のＡＢ−ＤＩＰタンパク質にカスパーゼ−９を作用させて、その切断により得られる断片として調製してもよい。カスパーゼ−９は、ＭＢＬ（名古屋市）社などから市販品として入手可能である。ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及びＡＢ−ＤＩＰ遺伝子と同様に、活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及び活性型ＡＢ−ＤＩＰ遺伝子の変異体も本発明に包含される。
【００２７】
２．抗体
本発明においては、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質に対する抗体を作製し、使用することができる。本発明において「抗体」とは、抗原であるタンパク質又はその部分ペプチドに結合可能な抗体分子全体又はそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメントなど）を意味し、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいし、さらにはヒト化又はキメラ抗体、一本鎖抗体などであってもよい。本発明において、抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体）は例えば以下の手法により作製することができる。
【００２８】
抗体作製のための免疫原としては、全長のＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質を使用してもよいし、あるいはそれらの部分ペプチドを使用してもよい。部分ペプチドの例としては、限定するものではないが、例えば配列番号２に示されるアミノ酸配列の１８２番目〜１９６番目のアミノ酸配列又は７５３番目〜７７６番目のアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。免疫原は、タンパク質又はその部分ペプチドを緩衝液に溶解して調製し、必要であれば、免疫を効果的に行うためにアジュバント（完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント等）を添加してもよい。
【００２９】
ポリクローナル抗体を作製する場合は、免疫原を、哺乳動物、例えばウサギ、ラット、マウスなどに投与する。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、１〜５回の免疫を行う。その後、最終の免疫日から一定期間経過後に、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ又はＥＩＡ、ＲＩＡ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法などで測定する。
【００３０】
モノクローナル抗体を作製する場合は、免疫原を、ポリクローナル抗体の場合と同様に哺乳動物、例えばウサギ、ラット、マウスなどに投与する。そして、最終の免疫日から一定期間経過後に抗体産生細胞（脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等）を採集し、ミエローマ細胞との細胞融合によりハイブリドーマを作製する。細胞融合は、血清を含まない動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合し、細胞融合促進剤（例えばポリエチレングリコール等）の存在のもとで融合反応を行う。また、エレクトロポレーションを利用した市販の細胞融合装置を用いて細胞融合させることもできる。
【００３１】
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。また、ハイブリドーマの培養上清中に、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質に反応する抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、例えば酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等を採用することができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立する。
【００３２】
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００３３】
さらに、キメラ抗体及びヒト型化抗体は当技術分野で公知の方法を用いて作製することができる（Morrisonら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851-6855; Neubergerら, 1984, Nature, 312: 604-608; Takedaら, 1985, Nature, 314: 452-454）。さらに、一本鎖抗体（Bird, 1988, Science 242: 423-426; Hustonら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; Wardら, 1989, Nature 334: 544-546）、Ｆｖフラグメント（Skerraら, 1988, Science 242: 10381041）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（抗体のペプシン消化により作製）、Ｆａｂフラグメント（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋の還元により作製）も、当技術分野で公知の方法を用いて作製することができる。
【００３４】
上述のようにして得られたＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質に対する抗体は、これらのタンパク質の精製及び検出、並びに後述する細胞死の抑制に使用することができる。
【００３５】
３．アンチセンス核酸
本発明においては、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸に対するアンチセンス核酸を使用することによって、ＡＢ−ＤＩＰ遺伝子又は活性型ＡＢ−ＤＩＰ遺伝子の発現を低減又は抑制することができる。従って、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸に対するアンチセンス核酸を用いて、細胞死を抑制をすることができる。
【００３６】
アンチセンス核酸は、当技術分野で公知の手法に従って設計し、使用することができる（例えば、Frank, B.L.ら、Method in Molecular Biology, 74:37, 1997）。例えば、ＡＢ−ＤＩＰ遺伝子に対するアンチセンス核酸としては、配列番号１に示す塩基配列に対し相補的な配列からなる核酸を例示することができる。ただし、本発明において用いるアンチセンス核酸は、宿主に導入されて、内在性遺伝子の発現を低減又は抑制しうる限り、配列番号１（配列番号１の２３３番目〜２５６３番目の塩基配列）に示す塩基配列に対して完全に相補的な配列である必要はない。また、アンチセンス核酸は、宿主に導入されて、内在性遺伝子の発現（翻訳又は転写）を抑制又は阻害しうる限り、配列番号１に示す塩基配列に対し相補的な配列の一部分であってもよい。例えば、アンチセンス核酸は、長さが約１０〜５０塩基、好ましくは１５〜３０塩基、より好ましくは１８〜２５塩基であり、ＧＣ含量が５０％以上となるように設計する。アンチセンス核酸を設計するためのソフトも公知であり、例えばＨＹＢｓｉｍｕｌａｔｏｒ（日立化成）などを使用することができる。また、アンチセンス核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれでもよいし、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッド核酸であってもよい。
【００３７】
アンチセンス核酸は、設計したアンチセンス核酸をそのまま宿主に導入（投与）してもよいし、あるいは設計したアンチセンス核酸が宿主内で発現されるような核酸又は組換えベクターとして導入（投与）してもよい。このようなアンチセンス核酸の導入又は投与は、遺伝子治療として当技術分野で公知である。
【００３８】
組換えベクターとしてアンチセンス核酸を送達する場合、投与は、公知の任意の手法、例えばキメラウイルスなどの組換え発現ベクターを用いた手法、又はレトロウイルスベクター若しくはアデノ随伴ウイルスベクターを含む種々のウイルスベクターを用いた手法により行うことができる。使用し得るベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルスなどのＲＮＡウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。このような組換えベクターの調製は、当技術分野で公知であり、本明細書においては「５．組換えベクター」の項に記載する。
【００３９】
目的の宿主（組織又は細胞）にアンチセンス核酸を投与するために使用し得る他の遺伝子送達機構には、コロイド分散系、リポソーム誘導系、人工ウイルスエンベロープなどが含まれる。また、アンチセンス核酸の投与のために、例えば巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル、リポソーム等を利用することができる。
【００４０】
４．二本鎖ＲＮＡ
ＲＮＡインターフェアランスとは、内在性遺伝子の配列に対して相補的な配列を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を導入することにより、当該内在性遺伝子のｍＲＮＡが分解されるという細胞内事象として知られている（例えば、Elbashir, SM.ら, Nature 411, 494-498, 2001; Hannon, GJ., Nature 418, 244-251, 2002 (review); Shinagawa, T.ら, Genes Dev. 17: 1340-1345 2003; 国際特許公開第ＷＯ９９／３２６１９号及びＷＯ９９／６１６１３号参照）。従って、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸に対する二本鎖ＲＮＡは、これらのタンパク質の発現（タンパク質への翻訳）を低減又は阻害することができる。従って、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸に対する二本鎖ＲＮＡを用いることにより、細胞死を抑制をすることができる。
【００４１】
二本鎖ＲＮＡは、当技術分野で公知の手法により設計することができる。例えば、配列番号１に示される塩基配列のうち連続した１０〜１００塩基、好ましくは連続した１０〜５０塩基、より好ましくは連続した１０〜３０塩基からなる配列に対して標的化するように二本鎖ＲＮＡを設計しうる。好ましくは、二本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（short-interfering RNA）である。本発明において使用しうる二本鎖ＲＮＡの例としては、限定されるものではないが、配列番号７に示される塩基配列を有するものが挙げられる。
【００４２】
また、二本鎖ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡをそのまま宿主に投与してもよいし、あるいは二本鎖ＲＮＡを発現する組換えベクターを宿主に投与し、該宿主において二本鎖ＲＮＡを発現させてもよい。二本鎖ＲＮＡの送達は、アンチセンス核酸と同様に、「３．アンチセンス核酸」の項に記載のように実施することができる。
【００４３】
５．組換えベクター
本発明の組換えベクターは、適当なベクターにＡＢ−ＤＩＰ遺伝子若しくは活性型ＡＢ−ＤＩＰ遺伝子、又はこれらの遺伝子に対するアンチセンス核酸若しくは二本鎖ＲＮＡを発現するための配列を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明で使用するベクターとしては、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されない。例えば、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどが挙げられる。また、アンチセンス核酸又は二本鎖ＲＮＡを発現するために使用し得るベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルスなどのＲＮＡウイルスのベクターが挙げられる。
【００４４】
プラスミドＤＮＡとしては、放線菌由来のプラスミド（例えばｐＫ４，ｐＲＫ４０１，ｐＲＦ３１等）、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９，ｐＵＣ１８等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３，ＹＥｐ２４，ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。
【００４５】
ベクターに遺伝子（核酸配列）を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００４６】
遺伝子又は核酸配列は、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質若しくは活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質、又はアンチセンス核酸若しくは二本鎖ＲＮＡが発現されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、遺伝子又は核酸配列のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。
【００４７】
６．形質転換体
本発明はまた、上記遺伝子若しくは核酸配列、又は上記組換えベクターを含有する形質転換体を提供する。形質転換体は、上記遺伝子若しくは核酸配列、又は組換えベクターを、目的とするＡＢ−ＤＩＰ若しくは活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又はアンチセンス核酸若しくは二本鎖ＲＮＡが発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、特に限定されるものではなく、例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等の酵母、その他動物細胞又は昆虫細胞が挙げられる。
【００４８】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、遺伝子又は組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。細菌への遺伝子又は組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法（Cohen, S.N.et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110-2114 (1972)）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００４９】
酵母を宿主とする場合は、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されるものではない。酵母への遺伝子又は組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法（Becker, D.M. et al., Methods. Enzymol. 194,182-187(1990)）、スフェロプラスト法（Hinnen, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75,1929-1933 (1978)）、酢酸リチウム法（Itoh, H. J. Bacteriol., 153,163-168 (1983)）等が挙げられる。
【００５０】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ＰＣ１２若しくはＮＧ１０８−１５細胞、又はヒトＦＬ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ若しくはＪｕｒｋａｔ細胞などが用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、β−アクチンプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への遺伝子又は組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。昆虫細胞への遺伝子又は組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００５１】
以上のようにして得られる形質転換体は、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質を生成するものであるため、これらのタンパク質の製造や細胞死の誘導に使用することができる。また、形質転換体は、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質若しくは活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質に対するアンチセンス核酸若しくは二本鎖ＲＮＡを発現するものであるため、これらのタンパク質の発現を低減又は阻害することにより、細胞死の抑制に使用することができる。
【００５２】
７．タンパク質の製造
本発明のＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質は、前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００５３】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
【００５４】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３６〜３７℃で１２〜１４時間行う。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が挙げられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で４０〜４８時間行う。
【００５５】
培養後、本発明のＡＢ−ＤＩＰ又は活性型ＡＢ−ＤＩＰが菌体内又は細胞内に生産される場合には、超音波処理、凍結融解の繰り返し、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより上記タンパク質を採取する。また、当該タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。
【００５６】
８．細胞死誘導剤及び細胞死阻害剤、並びに細胞周期停止剤
ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及び活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質は、アミロイドベータタンパク質（Ａβ４２）と結合して、細胞死を誘導する。従って、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及び活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質の量又は活性を増大する物質、具体的には、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及び活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質、並びに当該タンパク質を生成する遺伝子、組換えベクター及び形質転換体などは、細胞死の誘導剤として使用することができる。
【００５７】
一方、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及び活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質の量又は活性を低減又は抑制することにより、細胞死を抑制することができる。従って、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及び活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質の量又は活性を低減又は抑制する手段、具体的には、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及び活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質に対する抗体、当該タンパク質をコードする核酸に対するアンチセンス核酸又は二本鎖ＲＮＡなどは、細胞死の抑制剤として使用することができる。
【００５８】
また、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及び活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質は、細胞の細胞周期をＧ２／Ｍ期で停止させるものである。従って、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及び活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質の量又は活性を増大する物質、具体的には、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及び活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質、並びに当該タンパク質を生成する遺伝子、組換えベクター及び形質転換体などは、細胞周期の停止のために使用することができる。
【００５９】
本発明において「細胞死」とは、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞の死を意味し、アポトーシスを含む。また「細胞周期」とは、細胞が増殖を開始し、ＤＮＡ複製、染色体の分配、核分裂、細胞質分裂などの事象を経て、２つの娘細胞となるサイクルをいい、Ｇ２／Ｍ期は、ＤＮＡ合成（Ｓ期）を経て、分裂のための準備をし（Ｇ２期）、分裂（Ｍ期）する期間である。本発明において、「細胞」にはあらゆる種類の細胞が含まれる。例えば、神経細胞、神経膠細胞、上皮細胞、筋細胞、間葉系細胞、血球系細胞、臓器特異的細胞などが含まれる。
【００６０】
さらに、アミロイドベータタンパク質（Ａβ４２）は、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質及び活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質の細胞死誘導能を増強する機能を有する。従って、細胞死誘導剤に、Ａβタンパク質、Ａβタンパク質をコードする核酸、該核酸を含む組換えベクター、該核酸又は該組換えベクターを含有する形質転換体などを含めることにより、その薬剤により誘導される細胞死が増強される。ここで、アミロイドベータタンパク質（Ａβ４２）のアミノ酸配列を配列番号４に、塩基配列を配列番号３に示す。Ａβ４２は、それらの配列から公知の方法に従って化学合成又は組換え手法により作製することができるし、あるいは公知の手法に従って細胞又は組織から単離してもよい（例えばRoherら、1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10836参照）。また、Ａβ４２は、例えばバイオソース社などから市販品として入手することも可能である。
【００６１】
本発明の細胞死誘導剤及び細胞死阻害剤、並びに細胞周期停止剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で使用することができ、また本発明の細胞死誘導剤、細胞死阻害剤又は細胞周期停止剤を投与した細胞（形質転換体）を投与することも可能である（ｅｘ ｖｉｖｏ）。また投与の対象は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいては、例えば哺乳動物細胞又は組織、特にヒト、マウス、ラット、ウシなどに由来する細胞又は組織であり、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏにおいては、例えば動物、特にヒト、マウス、ラット、ウシなどの哺乳動物である。
【００６２】
例えば、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質、活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質、抗体などを含む薬剤の場合には、その投与量は、投与経路、投与回数、剤形によって異なるが、当技術分野で慣例的な手法を用いて適宜決定することができる。投与経路、投与回数なども当技術分野で公知の方法に従って決定することができる。
【００６３】
上記各種薬剤は、医薬的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、剤形に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。また薬剤は、医薬において通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などを適宜選択し、常法により製造することができる。
【００６４】
また例えば、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質若しくは活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸、それに対するアンチセンス核酸若しくは二本鎖ＲＮＡ、それらを含む組換えベクターなどを含む薬剤の場合にも、その投与量は、投与経路、投与回数、剤形によって異なるが、当技術分野で慣例的な手法を用いて適宜決定することができる。このような薬剤は、核酸を注射により直接投与する方法のほか、該遺伝子が組込まれた組換えベクターを投与する方法が挙げられる。これらの組換えベクターを用いることにより効率よく投与することができる。また、核酸や組換えベクターをリポソームなどのリン脂質小胞、ミセル、ウイルスエンベロープなどに導入し、投与する方法を採用してもよい。
【００６５】
また、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質若しくは活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸、それに対するアンチセンス核酸若しくは二本鎖ＲＮＡ、それらを含む組換えベクターなどを含む薬剤は、被験体から得られた細胞又は組織に導入した後、その細胞又は組織を同じ被験体又は別の被験体に投与することも可能である（ｅｘ ｖｉｖｏ法）。細胞又は組織への導入は、当技術分野で公知の遺伝子導入法（例えば、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション、リポフェクションなど）を用いて行うことができる。
【００６６】
９．細胞死関連疾患の予防剤・治療剤
上記細胞死抑制剤は、細胞死に伴う疾患（細胞死関連疾患）の治療又は予防のために使用することができる。本発明において「細胞死関連疾患」としては、アルツハイマー病、神経変性疾患、自己免疫性疾患、筋萎縮症、その他の臓器障害、癌及び肉腫等が挙げられ、これらの疾患が単独で発症したものでも、複数種類が合併したものでも本発明の予防剤又は治療剤の適用対象となり得る。なお、合併症には上記疾患と他の疾患とが合併したものも含まれる。本発明の予防剤又は治療剤は、経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる。
【００６７】
細胞死関連疾患の予防剤又は治療剤は、使用する対象を特に限定するものではない。例えば、神経系（脳、脊髄等）、血管系（動脈、静脈、心臓等）、呼吸器系（気管、肺等）、消化器系（唾液腺、胃、腸、肝臓、膵臓等）、リンパ系（リンパ節、脾臓、胸腺等）、泌尿器系（腎臓等）、生殖系（精巣、卵巣、子宮等）などの組織に生じる疾患について治療又は予防を特異目的として用いることができる。これらの疾患は、単独であっても、併発したものであっても、上記以外の他の疾病を併発したものであってもよい。
【００６８】
本発明の予防剤又は治療剤を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれのものであってもよく、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本発明の予防剤又は治療剤を非経口投与する場合は、静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐剤などの製剤形態を選択することができ、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。
【００６９】
これらの各種製剤は、医薬において通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などを適宜選択し、常法により製造することができる。
【００７０】
上記各種製剤は、医薬的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、剤形に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。
【００７１】
本発明の予防剤又は治療剤の投与量は、予防剤又は治療剤に含まれる成分の種類、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができる。
【００７２】
本発明の予防剤又は治療剤が核酸又は組換えベクターなどを含み、それを遺伝子治療剤として使用する場合は、核酸を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれた組換えベクターを投与する方法が挙げられる。また例えば核酸や組換えベクターをリポソームなどのリン脂質小胞、ミセル、ウイルスエンベロープなどに導入し、投与する方法を採用することができる。
【００７３】
さらに、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質若しくは活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸、それに対するアンチセンス核酸若しくは二本鎖ＲＮＡ、それらを含む組換えベクターなどを含む薬剤は、被験体から得られた細胞又は組織に導入した後、その細胞又は組織を同じ被験体又は別の被験体に投与することも可能である（ｅｘ ｖｉｖｏ法）。細胞又は組織への導入は、当技術分野で公知の遺伝子導入法（例えば、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション、リポフェクションなど）を用いて行うことができる。
【００７４】
遺伝子治療剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内等の全身投与のほか、中枢神経系組織（脳、脊髄等）、血管系（動脈、静脈、心臓等）、呼吸器系（気管、肺等）、消化器系（唾液腺、胃、腸、肝臓、膵臓等）、リンパ系（リンパ節、脾臓、胸腺等）、泌尿器系（腎臓等）、生殖系（精巣、卵巣、子宮等）などに局所投与を行うことができる。さらに、カテーテル技術、外科的手術等と組み合わせた投与形態をを採用することもできる。遺伝子治療剤の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、通常は、遺伝子の重量にすると成人１日あたり０．０１〜１００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲が適当である。
【００７５】
１０．スクリーニング
本発明のＡＢ−ＤＩＰタンパク質及び活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質は、Ａβと結合して細胞死を誘導するものである。従って、ＡβとＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質との結合を阻害又は促進する化合物は、細胞死を抑制し、細胞死関連疾患の予防又は治療に用いることができる可能性がある。
【００７６】
従って、本発明においては、アミロイドベータタンパク質（Ａβ）及びＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質と被検化合物とを接触させ、ＡβとＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質との結合を測定することを含む、ＡβとＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質との結合を阻害又は促進する化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００７７】
ここで、アミロイドベータタンパク質（Ａβ４２）のアミノ酸配列及びその遺伝子の塩基配列はそれぞれ配列番号４及び３に示している。ここで、接触させるＡβ４２は、その全長タンパク質でもよいし、又は部分ペプチドであってもよい。
【００７８】
接触させる被検化合物は、特に限定されるものではなく、タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成化合物、天然抽出物（細胞抽出物など）、ケミカルライブラリー若しくはペプチドライブラリーなどでありうる。
【００７９】
ＡβとＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質との結合は、当技術分野で公知の方法により測定することができる。例えば、酵母ツーハイブリッド法などを用いて、タンパク質の結合を測定することができる。その結果、ＡβとＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質との結合を促進する化合物は、細胞死誘導を促進する化合物として使用することができる。一方、ＡβとＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質との結合を阻害する化合物は、細胞死誘導を抑制する化合物として使用することができる。このような細胞死誘導を抑制する化合物は、アルツハイマー病の予防又は治療に有効である可能性がある。
【実施例】
【００８０】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００８１】
〔実施例１〕Ａβと結合するタンパク質の発見
（１）ＡＢ−ＤＩＰ ｃＤＮＡのクローニング
Ａβと結合するタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニングは酵母ツーハイブリッド法によって行った。即ち、Ａβ１−４２ ｃＤＮＡ（配列番号３）をＧａｌ−４ ＤＮＡ結合ドメインを有するｐＧＢＫＴ７プラスミドベクター（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のＫｐｎＩ切断部位に挿入した。次に、ヒト胎児脳由来ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック（アメリカ）社）をＧａｌ−４トランス活性化ドメインを有するｐＡＣＴ２プラスミドベクター（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に挿入した。両プラスミドを酵母ＡＨ１０９株（クロンテック）に導入し、アデニン、ヒスチジン、ロイシン、トリプトファンを欠く培地で選択し、β−ガラクトシダーゼ活性を調べた。Ａβと結合するタンパク質が存在する場合には、β−ガラクトシダーゼが活性化されてクロロフェノールで発色するので、そのようなクローンを陽性クローンとした。空ベクター及びｌａｍｉｎのＤＮＡ結合ドメインを有するプラスミド（ｐＧＢＫＴ７−ｌａｍｉｎ）を陰性コントロールとした。
その結果、上記方法により得られた陽性クローンの中からその中にストップコドンを有するｃＤＮＡ断片が得られた。
【００８２】
（２）全長ｃＤＮＡのクローニング
ヒト脾臓由来二本鎖Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）をテンプレートとして５’−及び３’−ＲＡＣＥ（rapid amplification of cDNA ends）を行った。３’−ＲＡＣＥには遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ１）として配列番号１の２０３９−２０６５に対応するGTGACTGAGGAGATGCTATGGGAGTGC（配列番号５）とＡＰ１プライマー（キット添付）を、５’−ＲＡＣＥにはＧＳＰ２として配列番号１の２１５８−２１３２に対応するGTGCTGGTCCACTGTCTTCAATAGGAA（配列番号６）とＡＰ２プライマー（キット添付）を用いた。Ｍａｒａｔｈｏｎ ＲＡＣＥ反応はＴｉｔａｎｉｕｍポリメラーゼを含むＡｄｖａｎｔａｇｅ−２ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｍｉｘを用いて行った。
【００８３】
その結果、５’ＲＡＣＥによって得られた２．１ｋｂの最も長い産物にはＫｏｚａｃ配列が含まれていた。３’ＲＡＣＥはツーハイブリッド法により得られたクローンより長いものは得られなかった。ＲＡＣＥによって得られた産物をＰＵＣ１８ベクターのＳｍａＩサイトに結合し、塩基配列を決定した。次いで、５’端及び３’端の塩基配列をもとにプライマーを設定し、ヒト脾臓由来二本鎖ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法により全長ｃＤＮＡを得た。この遺伝子の塩基配列はＮＣＢＩのデータベースに登録されていた（ｍＲＮＡの登録番号：ＡＫ０７４３１３、タンパク質の登録番号：ＢＡＢ８５０４７）。
【００８４】
この遺伝子は７７６個のアミノ酸残基よりなるタンパク質をコードしていた（図１、配列番号２）。その中には以下の特徴ある配列が見られた：
カスパーゼ活性化及びリクルートドメイン（ＣＡＲＤ）：これはカスパーゼやａｐａｆ−１など多くのアポトーシスに関連するタンパク質に見られる配列である（図１中、下線で示す）
Ｎ末端側にはグルタミン（Ｑ）リッチドメインがあった
核移行シグナル（ＮＴＳ）の存在は、このタンパク質の全部又は一部が核へ移行し、何らかの作用を発揮すると考えられた（図１中、イタリック体で示す）
細胞接着配列とされるＲＧＤ配列とＲＧＤ結合モチーフと思われるＤＤＭ配列の存在は、細胞接着に関する機能あるいは分子を不活性化する機能があると思われた（図１中、太字と下線で示す）
カスパーゼ認識切断部位（ＬＥＫＤ）の存在はカスパーゼの基質となることが示唆された（図１中、太字で示す）
【００８５】
この他ショウジョウバエの遺伝子において保存されているＤ１、Ｄ２ドメインがあったが、その機能は不明である。このタンパク質とＣ末端部分のアミノ酸が４５％一致するＤＸＳ６６７３Ｅは伴性劣性遺伝を示す精神発達遅滞をおこす疾患の候補遺伝子との報告がある（図１中、網掛けで示す）。
【００８６】
本発明者は、このタンパク質がＡβに関連して細胞死を誘導するところから、Ａβ関連細胞死誘導タンパク質（Aβ-related death-inducing protein；ＡＢ−ＤＩＰ）と命名した。
【００８７】
〔実施例２〕ＡＢ−ＤＩＰとＡβが結合することの証明
実施例１に記載のようにして単離したＡＢ−ＤＩＰとＡβが生理的状態で結合していることを示すために免疫沈降を行った。まず、１０％牛胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び５０単位／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培養液（インビトロジェン（アメリカ）社）で培養したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（神経芽細胞としての特徴を有する細胞）に、ＨＡタグをつけたＡβ１−４０（ｐＣＭＶ−ＨＡ−Ａβ４０）又はＡβ１−４２（ｐＣＭＶ−ＨＡ−Ａβ４２）とＭｙｃタグをつけたＡＢ−ＤＩＰ（ｐＣＭＶ−ＨＡ−ＡＢ−ＤＩＰ）をリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により遺伝子導入し、共発現させた。
【００８８】
ＨＡタグをつけたＡβ１−４０（ｐＣＭＶ−ＨＡ−Ａβ４０）又はＡβ１−４２（ｐＣＭＶ−ＨＡ−Ａβ４２）とＭｙｃタグをつけたＡＢ−ＤＩＰ（ｐＣＭＶ−ＨＡ−ＡＢ−ＤＩＰ）は、以下のようにして作製した。ＡＰＰの塩基配列をもとに以下に示す５’プライマーと３’プライマーを設計し、それぞれ制限酵素切断サイトを挿入した：
HA-Abeta42 (KpnI)5'：CGG GTA CCA TGG ATG CAG AAT TCC GAC ATG AC（配列番号７）
HA-Abeta42 (KpnI)3'：GCG GTA CCC GCT ATG ACA ACA CCG CCC ACC AT（配列番号８）
【００８９】
上記プライマーを用いてＰＣＲ増幅し、産物の配列を確認した後精製し、ｐＵＣ１８ベクターにクローニングした。これよりＫｐｎＩによりＡβ４２を切り出し、ｐＣＭＶ−ＨＡベクターのＫｐｎＩ部位にＤＮＡ Ｔ４リガーゼを用いて挿入した。このようにして、ＨＡタグを５’端に結合したＡβ４２のｃＤＮＡが得られた。
【００９０】
ｐＣＭＶ−ＨＡ−Ａβ４０も同様に作製した。Ａβ４０の場合、ＢｇｌＩＩ、ＸｈｏＩ部位を挿入した。用いたプライマーは以下のとおりである：
HA-Abeta40 (BglII)5'：GCA GAT CTC TGA TGC AGA ATT CCG ACA TGA C（配列番号９）
HA-Abeta40 (XhoI)3'：GCC TCG AGT CAG ACA ACA CCG CCC ACC ATG AG（配列番号１０）
【００９１】
３６時間後、細胞をタンパク質分解酵素阻害剤カクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ，Ｒｏｃｈｅ）とフェニルメチルスルホニルフッ素を含むＲＩＰＡ緩衝液で洗った後、スクレーパーで集め、１５秒間の細胞破砕後、４℃で１３，０００回転にて１５分間遠沈した。総タンパク質量はＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ）によって測定した。上澄をプロテインＡ−セファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）と９０分間反応させた後、一晩特異抗体を反応させた。翌朝、免疫複合体を回収し、ＲＩＰＡ緩衝液で３回洗浄後、ＳＤＳに溶解し、沸騰する水の中で５分間変性させ、１２．５％アクリルアミドゲルで電気泳動を行った。そしてＰＶＤＦ膜に転写した後、検出用特異抗体を作用させ、化学発光法により検出した。用いた抗体は、ＡＢ−ＤＩＰ特異的抗体Ｎ２、Ｃ１、抗ＨＡ抗体（Ｓｉｇｍａ）、抗Ａβ抗体６Ｅ１０（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、及び抗Ｍｙｃ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。ＡＢ−ＤＩＰ特異的抗体Ｎ２は、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質に基づいて、ウサギ血清を用いて作製し、ＩｇＧに精製したものであり、ＭＢＬ社に作製を委託した。
【００９２】
その結果、Ｍｙｃ抗体で免疫沈降しＡβ抗体で検出すると、Ａβ４０（図２の下のバンド）とＡβ４２（図２の上のバンド）が共沈することが分った（図２）。これはＮ２抗体で免疫沈降しても同様の結果であった。
【００９３】
次に逆の方法により同様の実験を行った。即ち、Ａβ抗体６Ｅ１０で免疫沈降し、Ｍｙｃ抗体で検出したところ、ＡＢ−ＤＩＰを検出した（図３）。このことから、ＡＢ−ＤＩＰとＡβ１−４０又はＡβ１−４２が結合していることが明らかになった。
【００９４】
〔実施例３〕ＡβはＡＢ−ＤＩＰの中央部分に結合する
ＡβとＡＢ−ＤＩＰの結合をｉｎ ｖｉｖｏで調べるために、ＡＢ−ＤＩＰの部分欠失遺伝子をＰＣＲ増幅し、ｐＣＭＶ−ＭｙｃベクターのＥｃｏＲＩサイトとＳａｌＩサイトに挿入し、ｐＣＭＶ−Ｍｙｃ−１−３４０（ＡＢ−ＤＩＰの１−３４０のみを有する）、ｐＣＭＶ−Ｍｙｃ−３４５−７７６（ＡＢ−ＤＩＰの３４５−７７６のみを有する）、ｐＣＭＶ−Ｍｙｃ−５０−７７６（ＡＢ−ＤＩＰの５０−７７６のみを有する）、ｐＣＭＶ−Ｍｙｃ１−５５０（ＡＢ−ＤＩＰの１−５５０のみを有する）、及びｐＣＭＶ−Ｍｙｃ−２３１−５８９（ＡＢ−ＤＩＰの２３１−５８９のみを有する）を作製した。これらのベクターとｐＣＭＶ−Ａβ４２をＳＹ５Ｙ細胞に同時に発現させ、Ｍｙｃ抗体で免疫沈降し、６Ｅ１０抗体でＡβを検出した。
【００９５】
その結果、Ａβ１−４２は、２３１−５８９のみを有するＡＢ−ＤＩＰ以外のすべてと結合した（図４）。従って、ＡβはＡＢ−ＤＩＰの中央部分とは結合せず、Ｃ末端側とＮ末端側両方に結合サイトがあることが分った。
【００９６】
〔実施例４〕ＡＢ−ＤＩＰによる細胞死誘導確認試験
ＡＢ−ＤＩＰのｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、Ｍｙｃ−ｔａｇを有する発現ベクター（ｐＣＭＶ−Ｍｙｃ）のＥｃｏ−Ｓａｌサイトに挿入し、ｐＣＭＶ−Ｍｙｃ−ＡＢ−ＤＩＰを得た。ＡＢ−ＤＩＰの発現を可視化するために、先ずＥＧＦＰを融合した遺伝子ｐＥＧＦＰＮ１−ＡＢ−ＤＩＰを構築した。そのために、まず全長のＡＢ−ＤＩＰ遺伝子（配列番号１）をｐＣＭＶ−Ｍｙｃ−ＡＢ−ＤＩＰのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩサイトから切り出し、ｐＥＧＦＰＮ１プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩサイトに挿入した。陽性コントロールとして、ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５ＹのＲＮＡからｐ５３特異的プライマーを用いて逆転写ＰＣＲによりｐ５３ ｃＤＮＡ（配列番号１１）をクローニングし、ＥｃｏＲＩ（５’）サイトとＳａｌＩ（３’）サイトで切断し、ｐＥＧＦＰＮ１プラスミドに挿入し、ｐＥＧＦＰＮ１−ｐ５３を得た。
【００９７】
次に、ＡＢ−ＤＩＰを強発現すると細胞がすべて死滅してしまうために、テトラサイクリン（ｔｅｔ）で発現が制御される遺伝子を構築した。そのために、先ずＡＢ−ＤＩＰをｔｅｔオペレーター配列を有するプラスミド（ｐｃＤＮＡ４−Ｔｏ）のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩサイトに挿入し、ｐｃＤＮＡ４−Ｔｏ−ＡＢ−ＤＩＰを得た。ｔｅｔオペレーターの制御（レプレッサー）にはｐｃＤＮＡ６−ＴＲ空ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。そして、ｐｃＤＮＡ４−Ｔｏ−ＡＢ−ＤＩＰとｐｃＤＮＡ６−ＴＲをリポフェクタミン法により１：４の比でＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に導入し、ブラスチシジン（６μｇ／ｍｌ）とゼオシン（１４０μｇ／ｍｌ）で選択し、クローンＮ３を得た。クローンＮ３はドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）の存在下でのみＡＢ−ＤＩＰの発現を示した。
【００９８】
そこで先ずＥＧＦＰ−ＡＢ−ＤＩＰをＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に発現させ、ＥＧＦＰ陽性細胞の生存状態を蛍光顕微鏡で調べた。ＥＧＦＰのみのコントロールベクターを導入した細胞（図５、菱形）は９６時間後も増殖を継続したが、ＥＧＦＰ−ＡＢ−ＤＩＰを導入した細胞（図５、四角）は４８時間後には生存細胞数が減少し、９６時間後には殆どの細胞が死んでしまった。これはＥＧＦＰの発現が低下したのではない証拠に顕微鏡下に細胞の剥離、浮遊、断片化によって確認された。ＥＧＦＰ−ｐ５３を発現する細胞はＡＢ−ＤＩＰとほぼ同等の細胞死を示した（図５、三角）。
【００９９】
また７２時間でＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ｆｌｕｏｓ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてアネキシンＶ染色を行い、アポトーシスのマーカーとされるアネキシンＶ陽性細胞数を数えた。ＥＧＦＰ対照の４６０個に比し、ＡＢ−ＤＩＰのみ発現する細胞は６５３個、ＡＢ−ＤＩＰとｐＣＭＶ−ＨＡ−Ａβ４２の導入によりＡβ１−４２を発現する細胞は７５４個、ｐ５３を発現する細胞は８７７であった。以上より、ＡＢ−ＤＩＰそれ自体の強発現でアポトーシスが誘導されること、Ａβ１−４２の存在下にそのアポトーシスは更に増強されることが分った。
【０１００】
〔実施例５〕ＡＢ−ＤＩＰによる細胞周期停止確認試験
次に、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）でＡＢ−ＤＩＰを発現した時としない時の細胞周期をＦＡＣＳで調べた。細胞周期をＧ２／Ｍ期で停止させることが知られているノコドゾールでＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を処理すると、Ｇ２／Ｍ期の細胞は３５．４％に達した（図６Ｂ）。ＤｏｘでＡＢ−ＤＩＰを発現させた細胞では３２．０％がＧ２／Ｍ期を示した（図６Ｆ）。これに対し、ＳＨ−ＳＹ５Ｙの何もしない対照細胞のそれは１４．６％（図６Ａ）、空ベクターＴｏ／Ｔｒを導入しＤｏｘを加えないもの１７．１％（図６Ｃ）、空ベクターを導入しＤｏｘを加えたもの１６．２％（図６Ｄ）、ＡＢ−ＤＩＰ発現ベクターを導入しＤｏｘを加えないもの２０．６％であった（図６Ｅ）。以上より、ＡＢ−ＤＩＰは細胞周期をＧ２／Ｍ期で止める作用があることが分った。
【０１０１】
〔実施例６〕ＡＢ−ＤＩＰのカスパーゼによる切断
本実施例においては、Ｄｏｘで誘導されるＡＢ−ＤＩＰを安定的に発現する細胞株Ｎ３を用いた。
Ｎ３細胞を小胞体ストレスの誘導剤であるツニカマイシン（和光純薬）、ミトコンドリア呼吸酵素複合体の阻害剤であるロテノン（ＭＰバイオメディカル（アメリカ））で処理したところ、いずれも９７ｋＤａのＡＢ−ＤＩＰに加え６２ｋＤａのＡＢ−ＤＩＰ（ＡＢ−ＤＩＰ ｐ６２）を生じた。また、Ｎ３細胞にｐＣＭＶ−ＨＡ４２を導入し、ＡＢ−ＤＩＰとＡβ１−４２を同時に発現させたときにもＡＢ−ＤＩＰ ｐ６２が生成された（図７）。
【０１０２】
また、抗癌剤であるビンブラスチン（シグマ（アメリカ））、有糸分裂阻害剤であるノコドゾール（シグマ）で処理すると、ｐ６２と９７ＫＤａのＡＢ−ＤＩＰに加え、更に大きい分子量のＡＢ−ＤＩＰを生じた（図７）。この大きいサイズのＡＢ−ＤＩＰはラムダホスファターゼを同時に加えると消失したことから、ＡＢ−ＤＩＰがリン酸化されたものと考えられた。すなわち、図８に示すように、Ｎ３細胞をビンブラスチン（レーン５）、ノコドゾール（レーン７）で処理すると９７ｋＤのＡＢ−ＤＩＰを生じ、このバンドはホスファターゼを一緒に処理することにより消失した（レーン６及び８）ので、これらの処理によりＡＢ−ＤＩＰがリン酸化を受けたと考えられる。また、無処理Ｎ３細胞（レーン１）、Ｎ３＋ホスファターゼ（レーン２）、Ｎ３＋ロテノン（レーン３）、Ｎ３＋ロテノン＋ホスファターゼ（レーン４）では、このようなリン酸化は見られなかった（図８）。従って、細胞死誘導に際しＡＢ−ＤＩＰはリン酸化され、何らかの酵素により限定切断を受け、その結果生じるｐ６２が活性型ＡＢ−ＤＩＰとして生理活性を発揮し、細胞死誘導に関与するものと考えられた。
【０１０３】
そこで、ＡＢ−ＤＩＰの切断酵素の同定を行った。先ず、上記細胞死誘導剤でＮ３細胞を処理するとき同時にカスパーゼ一般の阻害剤であるｚＶＡＤ．ｆｍｋで処理するとアポトーシスの誘導は阻害され、同時にｐ６２の生成も阻害された。また、ＡＢ−ＤＩＰにはＬＥＫＤ（４９３−４９６位）というカスパーゼによる切断配列が含まれることから、何らかのカスパーゼがその切断に関与していると推定された。
【０１０４】
次に、Ｎ３細胞を遠沈し、生理食塩水で洗浄後、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ及びプロテアーゼインヒビターを含む緩衝液に浮遊させ、１５秒間超音波破砕を行い、遠沈後上清を得た。この上清をタンパク質量２００μｇに調整し、各種ヒトリコンビナントカスパーゼ２単位／５０μｌ（ＭＢＬ社）を加え、３０℃にて３時間インキュベートした。その後ＳＤＳバッファーを加えて反応を止め、免疫ブロット法によりｐ６２の生成を調べた。その結果、カスパーゼ−６、−８、−９，−１０を調べたところ、カスパーゼ−９のみがｐ６２を生じた（図９）。
【０１０５】
さらに、ＬＥＫＤに相当する４９６位のアスパラギン酸（Ｄ）をアラニン（Ａ）に置換したＡＢ−ＤＩＰ発現細胞では、これらのカスパーゼによるｐ６２の生成は見られなかった。以上より、ＡＢ−ＤＩＰは何らかのアポトーシスシグナルによりリン酸化され、カスパーゼ−９が結合し、ＬＥＫＤの部位で切断され、活性型ＡＢ−ＤＩＰ（ｐ６２）を生じ、これが核へ移行し細胞死を誘導すると考えられた。このとき細胞内にＡβ１−４２が存在すると、ｐ６２の生成が増強され、細胞死は一層増強されることが分った。
【０１０６】
〔実施例７〕Ａβによる細胞死のｓｉＲＮＡによる阻害試験
（１）ｓｉＲＮＡの構築
ＡＢ−ＤＩＰのスタートコドンから１６０１−１６３１位の２１塩基対の２本鎖ＲＮＡ、5’-AAG CUC GAA AUG GAG AAG GUG-3’（配列番号１２）をｓｉＲＮＡとして選択し、構築した。この配列はヒトゲノムのＢＬＡＳＴサーチにより、ＡＢ−ＤＩＰ以外の遺伝子を阻害しないことを確認した。対照として、ルシフェラーゼ遺伝子のスタートコドンから１５３−１７１位の１８塩基対の5’-CGU ACG CGG AAU ACU UCG-3’（配列番号１３）の２本鎖ＲＮＡ、及び合成スクランブルド２本鎖ＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を用いた。
【０１０７】
（２）ドミナントネガティブＡＢ−ＤＩＰの構築
先ず、ＡＢ−ＤＩＰの各種欠失変異体を構築した。ｐＥＧＦＰ−ＤＭ１（アミノ酸配列１−４８のみを有する）、ｐＥＧＦＰ−ＤＭ２（アミノ酸配列３１−２２３のみを有する）、ｐＥＧＦＰ−ＤＭ３（アミノ酸配列２２４−３２９のみを有する）、ｐＥＧＦＰ−ＤＭ４（アミノ酸配列１２４−３１９と５９２−７７６のみを有する）、ｐＥＧＦＰ−ＤＭ５（アミノ酸配列１−３１９と５９２−７７６のみを有する）は、ｐＥＧＦＰＮ１のプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩサイトに挿入した。ｐＥＧＦＰ−ＤＭ６（アミノ酸配列１−４８７のみを有する）、ｐＥＧＦＰ−ＤＭ７（アミノ酸配列１２４−４９６のみを有する）、ｐＥＧＦＰ−ＤＭ８（アミノ酸配列３８０−７７６のみを有する）は、ｐＥＧＦＰＮ１（クロンテック社）のＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩサイトに挿入した。これらのプラスミドをＰＣＭＶ−Ｍｙｃ−ＡＢ−ＤＩＰ（実施例４参照）と共発現させ、ＡＢ−ＤＩＰの発現を調べた。
【０１０８】
その結果、ＡＢ−ＤＩＰのｓｉＲＮＡはＡＢ−ＤＩＰの発現を著しく抑制した（図１０）。ｐＥＧＦＰ−ＤＭ４を共発現させた時にのみＡＢ−ＤＩＰの発現が著しく抑制された。また、ｐＥＧＦＰ−ＤＭ４はドミナントネガティブに作用すると考えられた。ｐＥＧＦＰ−ＤＭ４はカスパーゼ活性化及びリクルートドメイン（ＣＡＲＤ）、核移行配列（ＮＴＳ）を欠くコンストラクトであった。
【０１０９】
〔実施例８〕細胞外Ａβによる細胞死をＡＢ−ＤＩＰが増強する
ＥＧＦＰN1（「空ベクター」は削除）（クロンテック社）とＥＧＦＰ−ＤＭ４（実施例７）をＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に導入し、これらを安定的に発現する細胞株を樹立した。後者の細胞はＥＧＦＰ−ＤＭ４と命名した。これらの細胞の培養液中に合成Ａβ１−４０又はＡβ１−４２（バイオソース社）を２０μＭの濃度で加え、７２時間後にＭＴＴアッセイ（ロッシュ（ドイツ））により細胞の生存状態を調べた。
【０１１０】
その結果、ＥＧＦＰ空ベクターを発現する細胞にＡβ１−４０又はＡβ１−４２を作用させると、作用させない場合に比し、それぞれ５５．８％又は５７．２％の細胞生存率であった。これに対してＥＧＦＰ−ＤＭ４ではそれぞれ８１％又は７８．８％と上昇した（図１１）。このことは細胞外から作用させたＡβによる細胞死にＡＢ−ＤＩＰが関与していることを示唆している。また、図１１において「Ａｂｅｔａ４２−１」はＡβ１−４２の逆配列であり、活性がないため、対照と同様の結果となる。
【０１１１】
〔実施例９〕細胞内Ａβによる細胞死をＡＢ−ＤＩＰが増強する
ＥＧＦＰにＡβ１−４２を結合させたプラスミドｐＥＧＦＰＮ１−４２を構築した。これをＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にＡＢ−ＤＩＰに対するｓｉＲＮＡと共発現させ、２４、４８及び７２時間後にアネキシンＶ染色によりアポトーシス細胞を定量的に調べた。対照はルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ、合成スクランブルド２本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を用いた。
【０１１２】
その結果、ｐＥＧＦＰＮ１−４２を発現する細胞（ＥＧＦＰ−４２）はＥＧＦＰの空ベクターを発現する細胞（ＥＧＦＰ ｃｏｎｔｒｏｌ）に比し、アネキシンＶ陽性細胞（アポトーシスを示す細胞）は２４、４８及び７８時間後に有意に増加した（図１２）。これに対し、ｐＥＧＦＰＮ１−４２とＡＢ−ＤＩＰに対するｓｉＲＮＡを同時に発現する細胞（ＥＧＦＰ−４２＋ｓｉＡＢ−ＤＩＰ）では４８時間後及び７２時間後のアネキシンＶ陽性細胞は有意に抑制された（図１２）。ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＬｕｃ）及びスクランブルドｓｉＲＮＡ（ｓｉＮｏｎ）にはその抑制作用は見られなった（図１２）。この結果は、細胞内に発現させたＡβ１−４２によるアポトーシスを、ＡＢ−ＤＩＰに対するｓｉＲＮＡが抑制することを示している。
【０１１３】
〔実施例１０〕ＡＢ−ＤＩＰのヒト組織での発現
ヒト各種臓器及びヒト脳の各種部位のＲＮＡを含むＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、ノーザンブロット法によりＡＢ−ＤＩＰの発現を調べた。プローブとしてはＡＢ−ＤＩＰのＣ末部分（２０３９−２５６０塩基対）を用いた。対照としてβ−アクチンを用いた。ハイブリダイゼーションはＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−ｈｙｂ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用い、６８℃で１時間を行った。
【０１１４】
その結果、ＡＢ−ＤＩＰ ｃＤＮＡは３．１ｋｂのバンドとして見られ、脳、心臓、骨格筋をはじめすべての臓器に見られた。また、脳では小脳、大脳皮質、延髄などすべての部位に発現が見られた。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明により、アミロイドベータタンパク質（Ａβ４２）と結合し、神経細胞死を誘導する新規タンパク質であるＡＢ−ＤＩＰタンパク質及びその活性型、それをコードする遺伝子などが提供される。ＡＢ−ＤＩＰタンパク質を利用することにより細胞死を制御することができるため、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質等は細胞死に関連する疾患の予防又は治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】ＡＢ−ＤＩＰタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。下線はＣＡＲＤドメイン（６−４８）を、また下線を付したＱはＮ末端側のグルタミンリッチ領域を、イタリック体は核移行シグナル（２３４−２５０）を、太字及び下線はＲＧＤ（３１９−３２１）及びＤＤＭ（６８５−８８７）を、太字はＬＥＫＤを、網掛けはショウジョウバエ保存領域Ｄ１（５２３−５８１）及びＤ２（６９０−７４３）を表す。
【図２】Ｍｙｃタグを付したＡＢ−ＤＩＰとＡβを共発現させ、ｍｙｃ抗体で免疫沈降し、Ａβ抗体６Ｅ１０でウエスタンブロットを行った結果を示す。
【図３】Ｍｙｃタグを付したＡＢ−ＤＩＰとＡβを共発現させ、Ａβ抗体６Ｅ１０で免疫沈降し、ｍｙｃ抗体でウエスタンブロットを行った結果を示す。
【図４】Ｍｙｃタグを付した各種欠損変異ＡＢ−ＤＩＰとＡβを共発現させ、ｍｙｃ抗体で免疫沈降し、６Ｅ１０抗体でウェスタンブロットを行った結果を示す。
【図５】ＡＢ−ＤＩＰを強発現する細胞はｐ５３を強発現する細胞とほぼ同等の細胞死を引き起こすことを示す。Ａβ４２とＡＢ−ＤＩＰを共発現すると細胞死はやや増強される。
【図６】ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）でＡＢ−ＤＩＰが発現誘導されるＮ３細胞株を用いて細胞周期を調べた結果を示す。
【図７】カスパーゼを活性化させ細胞死を誘導する各種薬剤で細胞を処理すると９７ｋＤのＡＢ−ＤＩＰが６２ｋＤのＡＢ−ＤＩＰ ｐ６２を生じたことを示す。
【図８】Ｎ３細胞を、無処理（レーン１）、又は、Ｎ３＋ホスファターゼ（レーン２）、Ｎ３＋ロテノン（レーン３）、Ｎ３＋ロテノン＋ホスファターゼ（レーン４）、ビンブラスチン（レーン５）、ビンブラスチン＋ホスファターゼ（レーン６）、ノコドゾール（レーン７）若しくはノコドゾール＋ホスファターゼ（レーン８）で処理した場合に生じるＡＢ−ＤＩＰのサイズを調べた結果を示す。
【図９】ＡＢ−ＤＩＰはカスパーゼ９により切断をうけ、ｐ６２を生じたことを示す。
【図１０】ＡＢ−ＤＩＰに対するｓｉＲＮＡがＡＢ−ＤＩＰの発現を著しく抑制したことを示す。
【図１１】Ａβ４０及びＡβ４２による細胞死はＡＢ−ＤＩＰをドミナントネガティブに変異することにより抑制されることを示す。
【図１２】細胞内Ａβ４２発現による細胞死をＡＢ−ＤＩＰのｓｉＲＮＡが有意に抑制することを示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１１７】
配列番号５〜１０、１２及び１３：合成オリゴヌクレオチド
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＡＢ−ＤＩＰタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、アミロイドベータタンパク質との結合能を有するタンパク質
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、アミロイドベータタンパク質との結合能を有するタンパク質
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列の２３３番目〜２５６３番目の塩基配列からなる核酸
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列の２３３番目〜２５６３番目の塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アミロイドベータタンパク質との結合能を有するタンパク質をコードする核酸
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）の活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１番目〜４９６番目のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１番目〜４９６番目のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、アミロイドベータタンパク質との結合能を有するタンパク質
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）の活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１番目〜４９６番目のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１番目〜４９６番目のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、アミロイドベータタンパク質との結合能を有するタンパク質
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列の２３３番目〜１７２０番目の塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列の２３３番目〜１７２０番目の塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アミロイドベータタンパク質との結合能を有するタンパク質をコードする核酸
【請求項７】
請求項２、３、５又は６記載の核酸を含む組換えベクター。
【請求項８】
請求項２、３、５若しくは６記載の核酸、又は請求項７記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項９】
ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質に対する抗体。
【請求項１０】
配列番号２の１８２番目〜１９６番目のアミノ酸配列を含む抗原又は７５３番目〜７７６番目のアミノ酸配列を含む抗原を用いて作製されたものである、請求項９記載の抗体。
【請求項１１】
ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸に対するアンチセンス核酸。
【請求項１２】
ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸に対する二本鎖ＲＮＡ。
【請求項１３】
配列番号７に示される塩基配列を有するものである、請求項１２記載の二本鎖ＲＮＡ。
【請求項１４】
請求項８記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質を採取することを特徴とする、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質の製造方法。
【請求項１５】
以下の（ａ）〜（ｈ）の少なくとも１つを含むことを特徴とする細胞死誘導剤。
（ａ）請求項１記載のＡＢ−ＤＩＰタンパク質
（ｂ）請求項４記載の活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質
（ｃ）請求項２記載のＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸
（ｄ）請求項５記載の活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸
（ｅ）請求項３記載の核酸
（ｆ）請求項６記載の核酸
（ｇ）請求項７記載の組換えベクター
（ｈ）請求項８記載の形質転換体
【請求項１６】
さらに以下の（ｉ）〜（ｍ）の少なくとも１つを含む、請求項１５記載の細胞死誘導剤。
（ｉ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＡβ４２タンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、細胞障害機能を有するタンパク質
（ｊ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＡβ４２タンパク質、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、細胞障害機能を有するタンパク質、をコードする核酸
（ｋ）配列番号３に示される塩基配列からなる核酸、又は、配列番号３に示される塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞障害機能を有するタンパク質をコードする核酸
（ｌ）上記（ｊ）又は（ｋ）のいずれかの核酸を含む組換えベクター
（ｍ）上記（ｊ）若しくは（ｋ）のいずれかの核酸、又は上記（ｌ）の組換えベクターを含有する形質転換体
【請求項１７】
以下の（ａ）〜（ｅ）の少なくとも１つを含むことを特徴とする細胞死抑制剤。
（ａ）請求項９又は１０記載の抗体
（ｂ）請求項１１記載のアンチセンス核酸
（ｃ）請求項１２又は１３記載の二本鎖ＲＮＡ
（ｄ）上記（ｂ）又は（ｃ）のいずれかの核酸を発現することができる組換えベクター
（ｅ）上記（ｂ）若しくは（ｃ）のいずれかの核酸、又は上記（ｄ）の組換えベクターを含有する形質転換体
【請求項１８】
以下の（ａ）〜（ｅ）の少なくとも１つを含むことを特徴とする細胞死関連疾患の治療剤又は予防剤。
（ａ）請求項９又は１０記載の抗体
（ｂ）請求項１１記載のアンチセンス核酸
（ｃ）請求項１２又は１３記載の二本鎖ＲＮＡ
（ｄ）上記（ｂ）又は（ｃ）のいずれかの核酸を発現することができる組換えベクター
（ｅ）上記（ｂ）若しくは（ｃ）のいずれかの核酸、又は上記（ｄ）の組換えベクターを含有する形質転換体
【請求項１９】
細胞死関連疾患がアルツハイマー病である、請求項１８記載の治療剤又は予防剤。
【請求項２０】
以下の（ａ）〜（ｈ）の少なくとも１つを含むことを特徴とする細胞周期停止剤。
（ａ）請求項１記載のＡＢ−ＤＩＰタンパク質
（ｂ）請求項４記載の活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質
（ｃ）請求項２記載のＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸
（ｄ）請求項５記載の活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸
（ｅ）請求項３記載の核酸
（ｆ）請求項６記載の核酸
（ｇ）請求項７記載の組換えベクター
（ｈ）請求項８記載の形質転換体
【請求項２１】
アミロイドベータタンパク質（Ａβ）及びＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質と被検化合物とを接触させ、ＡβとＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質との結合を測定することを含む、ＡβとＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質との結合を阻害又は促進する化合物のスクリーニング方法。
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＡＢ−ＤＩＰタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、アミロイドベータタンパク質との結合能を有するタンパク質
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、アミロイドベータタンパク質との結合能を有するタンパク質
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列の２３３番目〜２５６３番目の塩基配列からなる核酸
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列の２３３番目〜２５６３番目の塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アミロイドベータタンパク質との結合能を有するタンパク質をコードする核酸
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）の活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１番目〜４９６番目のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１番目〜４９６番目のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、アミロイドベータタンパク質との結合能を有するタンパク質
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）の活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１番目〜４９６番目のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１番目〜４９６番目のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、アミロイドベータタンパク質との結合能を有するタンパク質
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列の２３３番目〜１７２０番目の塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列の２３３番目〜１７２０番目の塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アミロイドベータタンパク質との結合能を有するタンパク質をコードする核酸
【請求項７】
請求項２、３、５又は６記載の核酸を含む組換えベクター。
【請求項８】
請求項２、３、５若しくは６記載の核酸、又は請求項７記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項９】
ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質に対する抗体。
【請求項１０】
配列番号２の１８２番目〜１９６番目のアミノ酸配列を含む抗原又は７５３番目〜７７６番目のアミノ酸配列を含む抗原を用いて作製されたものである、請求項９記載の抗体。
【請求項１１】
ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸に対するアンチセンス核酸。
【請求項１２】
ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸に対する二本鎖ＲＮＡ。
【請求項１３】
配列番号７に示される塩基配列を有するものである、請求項１２記載の二本鎖ＲＮＡ。
【請求項１４】
請求項８記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質を採取することを特徴とする、ＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質の製造方法。
【請求項１５】
以下の（ａ）〜（ｈ）の少なくとも１つを含むことを特徴とする細胞死誘導剤。
（ａ）請求項１記載のＡＢ−ＤＩＰタンパク質
（ｂ）請求項４記載の活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質
（ｃ）請求項２記載のＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸
（ｄ）請求項５記載の活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸
（ｅ）請求項３記載の核酸
（ｆ）請求項６記載の核酸
（ｇ）請求項７記載の組換えベクター
（ｈ）請求項８記載の形質転換体
【請求項１６】
さらに以下の（ｉ）〜（ｍ）の少なくとも１つを含む、請求項１５記載の細胞死誘導剤。
（ｉ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＡβ４２タンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、細胞障害機能を有するタンパク質
（ｊ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＡβ４２タンパク質、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、細胞障害機能を有するタンパク質、をコードする核酸
（ｋ）配列番号３に示される塩基配列からなる核酸、又は、配列番号３に示される塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞障害機能を有するタンパク質をコードする核酸
（ｌ）上記（ｊ）又は（ｋ）のいずれかの核酸を含む組換えベクター
（ｍ）上記（ｊ）若しくは（ｋ）のいずれかの核酸、又は上記（ｌ）の組換えベクターを含有する形質転換体
【請求項１７】
以下の（ａ）〜（ｅ）の少なくとも１つを含むことを特徴とする細胞死抑制剤。
（ａ）請求項９又は１０記載の抗体
（ｂ）請求項１１記載のアンチセンス核酸
（ｃ）請求項１２又は１３記載の二本鎖ＲＮＡ
（ｄ）上記（ｂ）又は（ｃ）のいずれかの核酸を発現することができる組換えベクター
（ｅ）上記（ｂ）若しくは（ｃ）のいずれかの核酸、又は上記（ｄ）の組換えベクターを含有する形質転換体
【請求項１８】
以下の（ａ）〜（ｅ）の少なくとも１つを含むことを特徴とする細胞死関連疾患の治療剤又は予防剤。
（ａ）請求項９又は１０記載の抗体
（ｂ）請求項１１記載のアンチセンス核酸
（ｃ）請求項１２又は１３記載の二本鎖ＲＮＡ
（ｄ）上記（ｂ）又は（ｃ）のいずれかの核酸を発現することができる組換えベクター
（ｅ）上記（ｂ）若しくは（ｃ）のいずれかの核酸、又は上記（ｄ）の組換えベクターを含有する形質転換体
【請求項１９】
細胞死関連疾患がアルツハイマー病である、請求項１８記載の治療剤又は予防剤。
【請求項２０】
以下の（ａ）〜（ｈ）の少なくとも１つを含むことを特徴とする細胞周期停止剤。
（ａ）請求項１記載のＡＢ−ＤＩＰタンパク質
（ｂ）請求項４記載の活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質
（ｃ）請求項２記載のＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸
（ｄ）請求項５記載の活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質をコードする核酸
（ｅ）請求項３記載の核酸
（ｆ）請求項６記載の核酸
（ｇ）請求項７記載の組換えベクター
（ｈ）請求項８記載の形質転換体
【請求項２１】
アミロイドベータタンパク質（Ａβ）及びＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質と被検化合物とを接触させ、ＡβとＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質との結合を測定することを含む、ＡβとＡＢ−ＤＩＰタンパク質又は活性型ＡＢ−ＤＩＰタンパク質との結合を阻害又は促進する化合物のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００６−１６６８７９（Ｐ２００６−１６６８７９Ａ）
【公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３６７７８０（Ｐ２００４−３６７７８０）
【出願日】平成１６年１２月２０日（２００４．１２．２０）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月２０日（２００４．１２．２０）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
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