Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子等の抗原提示関連分子の細胞表面における発現を負に制御する哺乳類由来の新規タンパク質とその利用
本発明者によってクローニングされたヒトｃ−ＭＩＲは、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスのＫ３，Ｋ５蛋白といったウイルス蛋白の機能類似分子である、免疫抑制機能を持ったヒトホモログ等の哺乳類由来の新規タンパク質であり、その機能解析の結果、抗原提示関連分子であるＢ７−２分子さらにＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面における発現を抑制する免疫抑制作用が認められた。よって、ｃ−ＭＩＲは、このような免疫抑制作用によりヒト免疫系において抗原提示関連分子の発現を調節する因子と考えられ、新たな免疫抑制方法の開発、細胞、臓器移植の際の拒絶反応の抑制、自己免疫疾患の治療、さらに新薬開発などに利用でき、医学上および産業上有用なものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子等の抗原提示関連分子の細胞表面における発現を負に制御する哺乳類由来の新規タンパク質とその利用に関するものである。
【背景技術】
ウイルスは、ヒトに感染し、巧みに免疫学的排除を回避し、持続感染、潜伏感染する。この現象は、ヘルペスウイルスや肝炎ウイルスにてよく認められるが、最近になって、（１）ウイルスの発現する蛋白が、免疫認識に重要な抗原提示関連分子（ＭＨＣ等）の細胞表面における発現を抑制し、（２）これにより、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）によるウイルス認識を逃れ、ウイルスが免疫学的排除を回避し得ることが分かってきた（例えば、文献１：Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０００ Ｓｅｐ：１３（３）：３６５−３７４および文献２：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０００ Ｊｕｎ：７４（１１）：５３００−５３０９参照）。
より具体的には、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）のＫ３，Ｋ５蛋白（それぞれ「ＭＩＲ１」「ＭＩＲ２」ともいう）、およびマウスγヘルペスウイルス−６８（ＭＨＶ−６８）のＫ３蛋白といったウイルス蛋白は、Ｅ３ユビキチンリガーゼとして機能し、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面における発現を負に制御することが分かってきた。これらのウイルス蛋白は、ＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガードメインと呼ばれるリガーゼ活性の触媒部位を共通に有し、このドメインを介してＭＨＣクラスＩ分子をユビキチン化する。このユビキチン化は、ＭＨＣクラスＩ分子の迅速なエンドサイトーシスと分解を誘導する。カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスは、このようなＫ３，Ｋ５蛋白の作用（免疫抑制作用）によってＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面における発現を抑制し、免疫学的排除を巧みに回避する。
上記のように、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス等は、上記Ｋ３，Ｋ５蛋白といったウイルス蛋白による免疫抑制機構を有しているが、本発明者は、上記Ｋ３，Ｋ５蛋白の機能解析を進めるうち、これらウイルス蛋白をコードする遺伝子は哺乳類ゲノムに由来し、これらウイルス蛋白の機能類似分子をコードする遺伝子が哺乳類ゲノム、特にヒトゲノムにも存在しているのではないかと考えた。
そして、もしそのような免疫抑制機能を持ったヒトホモログ等を見出すことができれば、ヒトの免疫調節機構の解明に役立つばかりでなく、例えば免疫抑制を効率良く人為的に行う方法の開発などにも利用でき、さらにこの方法は、細胞、臓器移植の際の拒絶反応の抑制、自己免疫疾患の治療などに応用可能であると考えた。
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、上記Ｋ３，Ｋ５蛋白といったウイルス蛋白の機能類似分子である、免疫抑制機能を持ったヒトホモログ等の哺乳類由来の新規タンパク質を見出し、その利用方法を提供することにある。
【発明の開示】
本発明者は、上記の課題に鑑み、上記Ｋ３，Ｋ５蛋白のヒトホモログをヒトゲノムにて探索した結果、ヒトホモログとして複数の遺伝子・タンパク質を同定した。さらに詳細な機能解析を進めた結果、複数のタンパク質に免疫認識に重要な抗原提示関連分子（Ｂ７−２共刺激分子やＭＨＣクラスＩＩ分子）の細胞表面における発現を抑制する免疫抑制作用が認められ、機能上も上記Ｋ３，Ｋ５蛋白と類似すること等を見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、医学上または産業上有用な方法・物質として、下記Ａ）〜Ｐ）の発明を含むものである。
Ａ） 以下の（ａ）又は（ｂ）記載の哺乳類由来のタンパク質。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６に示される何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６に示される何れかのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗原提示関連分子の細胞表面における発現を負に制御するタンパク質。
Ｂ） 上記Ａ）のタンパク質であって、抗原提示関連分子であるＢ７−２分子の細胞表面における発現を負に制御するタンパク質。
Ｃ） 上記Ｂ）のタンパク質であって、Ｂ７−２分子をユビキチン化するタンパク質。
Ｄ） 上記Ａ）〜Ｃ）の何れかに記載のタンパク質であって、抗原提示関連分子であるＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面における発現を負に制御するタンパク質。
Ｅ） 上記Ａ）〜Ｄ）の何れかに記載のタンパク質であって、ヒト又はマウス由来のＥ３ユビキチンリガーゼであるタンパク質。
Ｆ） 上記Ａ）〜Ｅ）の何れかに記載のタンパク質に対する抗体。
Ｇ） 上記Ａ）〜Ｅ）の何れかに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
Ｈ） 上記Ｇ）の遺伝子であって、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５に示される何れかの塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
Ｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、抗原提示関連分子の細胞表面における発現を負に制御するタンパク質をコードする遺伝子。
Ｊ） 上記Ｇ）〜Ｉ）の何れかの遺伝子を含む組換え発現ベクター。
Ｋ） 上記Ｇ）〜Ｉ）の何れかのの遺伝子が導入された形質転換体。
Ｌ） 上記Ｇ）〜Ｉ）の何れかのの遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いた遺伝子検出器具。
Ｍ） 上記Ａ）〜Ｅ）の何れかに記載のタンパク質、または、上記Ｇ）又はＨ）の遺伝子を含む免疫抑制剤。
Ｎ） 上記Ａ）〜Ｅ）の何れかに記載のタンパク質の作用を調節する物質のスクリーニング方法。
Ｏ） 上記Ａ）〜Ｅ）の何れかに記載のタンパク質と同様に、抗原提示関連分子の細胞表面における発現を負に制御する作用を有する物質のスクリーニング方法。
Ｐ） 下記（１）〜（３）の何れかの物質と、下記（４）〜（７）の何れかの物質とを用いることを特徴とする上記Ｍ）又はＮ）記載のスクリーニング方法。
（１） 上記Ａ）〜Ｅ）の何れかに記載のタンパク質
（２） 上記Ａ）〜Ｅ）の何れかに記載のタンパク質の部分タンパク質であって、全長タンパク質のアミノ酸配列中、少なくともその膜貫通領域を含む部分タンパク質
（３） 上記▲１▼のタンパク質または上記▲２▼の部分タンパク質の改変体
（４） Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子
（５） Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の改変体
（６） Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の部分タンパク質であって、全長タンパク質のアミノ酸配列中、少なくともその膜貫通領域またはその近傍の細胞内領域を含む部分タンパク質
（７） 上記（６）の部分タンパク質の改変体
Ｑ） 上記Ｎ）〜Ｐ）の何れかに記載のスクリーニング方法を用いて得られた免疫疾患治療薬。
本発明は、Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面における発現を負に制御する哺乳類由来の新規タンパク質とその利用に関するものであり、前述したとおり、新たな免疫抑制方法の開発、細胞、臓器移植の際の拒絶反応の抑制、自已免疫疾患の治療、さらに新薬開発などに利用できるほか種々の有用性を有するという効果を奏する。
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるだろう。
【図面の簡単な説明】
図１（ａ）は、本発明のタンパク質ｃ−ＭＩＲのアミノ酸配列を示す図であり、図１（ｂ）は、ｃ−ＭＩＲが抗原提示関連分子の発現を抑制する作用を有するかフローサイトメトリー法によって調べた結果を示す図である。
図２は、ｃ−ＭＩＲを恒常的に発現する細胞を用いて、ｃ−ＭＩＲが抗原提示関連分子の発現を抑制する作用を有するかフローサイトメトリー法によって調べた結果を示す図である。
図３（ａ）〜（ｄ）は、ｃ−ＭＩＲによってＢ７−２分子の発現がどのように抑制されるのかその抑制機構を調べるために、Ｂ７−２分子の蛋白合成、分解、移動を検討した結果を示す図である。
図４（ａ）および図４（ｂ）は、ｃ−ＭＩＲによってＢ７−２分子が速やかにエンドサイトーシスされるかどうかを調べた結果を示す図である。
図５は、Ｂ７−２分子の膜貫通領域および細胞質領域がｃ−ＭＩＲを介したＢ７−２分子のダウンレギュレーションに十分であるかどうかを、キメラ蛋白を用いて調べた結果を示す図である。
図６（ａ）〜（ｃ）は、ｃ−ＭＩＲのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰドメインがＥ３ユビキチンリガーゼ活性を持つかどうかを調べた結果を示す図である。
図７（ａ）〜（ｃ）は、Ｂ７−２分子のユビキチン化が、ｃ−ＭＩＲを介したＢ７−２分子のダウンレギュレーションに不可欠であるかどうかを調べた結果を示す図である。
図８（ａ）〜（ｄ）は、ｃ−ＭＩＲとＢ７−２分子との分子間相互作用がＢ７−２分子のユビキチン化およびそのダウンレギュレーションに不可欠であるかどうかを調べた結果を示す図である。
図９は、ｃ−ＭＩＲの分子機構を説明する図である。
図１０は、本発明のタンパク質ＨＳＰＣ２４０のアミノ酸配列を示す図である。
図１１は、ＨＳＰＣ２４０が抗原提示関連分子の発現を抑制する作用を有するかフローサイトメトリー法によって調べた結果を示す図である。
図１２（ａ）・（ｂ）は、ｃ−ＭＩＲによるＭＨＣクラスＩＩ分子およびＢ７−２分子の発現抑制が抗原提示機能を抑制する結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
（Ｉ）本発明のタンパク質、及びその遺伝子の構造
本発明者は、前記ＫＳＨＶのＫ３，Ｋ５蛋白のヒトホモログの存在について調査検討を進めた結果、Ｋ３，Ｋ５蛋白の機能ドメインであるＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガーモチーフを持ち、二次構造が類似するヒトホモログとして６つの遺伝子・タンパク質を同定した。
配列番号１、３、５、７、９、及び１１には、それぞれ上記６つの遺伝子ｃ−ＭＩＲ、ＨＳＰＣ２４０、４３１７１、ＸＰ−０５５２７６、ＣＡＤ２８５２９、２０４４５の各塩基配列が、そのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域によってコードされる各アミノ酸配列と共に示される。また、上記６つの遺伝子によってそれぞれコードされるタンパク質の各アミノ酸配列が、配列番号２、４、６、８、１０、及び１２に示される。上記ｃ−ＭＩＲおよびＨＳＰＣ２４０については、それぞれ図１（ａ）および図１０にもアミノ酸配列が示される。図１（ａ）中、「ＴＭ１」はｃ−ＭＩＲの第１膜貫通領域と、「ＴＭ２」は第２膜貫通領域と判定された領域である。ＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガーモチーフは、第１膜貫通領域よりもアミノ末端側に存在する。上記ＨＳＰＣ２４０については、そのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガーモチーフが図１０において下線で示される。
上記ｃ−ＭＩＲについて詳細な解析を進めた結果、後の実施例において詳述するように、その作用・性質について以下の知見が得られた。
（１）ｃ−ＭＩＲは、抗原提示関連分子の１つであるＢ７−２共刺激分子（Ｂ７−２分子）をユビキチン化し、その細胞表面における発現を負に制御する。
（２）Ｂ７−２分子のユビキチン化は、Ｂ７−２分子の迅速なエンドサイトーシスとライソゾームにおける分解とを引き起こす。つまり、ｃ−ＭＩＲは、Ｂ７−２分子をユビキチン化し、これにより、Ｂ７−２分子の迅速なエンドサイトーシスと分解とを誘導する。
（３）ｃ−ＭＩＲは、その膜貫通領域を介してＢ７−２分子の膜貫通領域またはその近傍の細胞内領域に結合する。この結合がＢ７−２分子のユビキチン化に不可欠である。
（４）ｃ−ＭＩＲは、さらに、他の抗原提示関連分子であるＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面における発現をも負に制御する。
（５）ｃ−ＭＩＲは、上記Ｋ３，Ｋ５蛋白と同様にＥ３ユビキチンリガーゼとして機能し、そのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガードメインがリガーゼ活性を持つ触媒部位である。
このように、ｃ−ＭＩＲには、Ｂ７−２分子さらにＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面における発現を負に制御する作用、換言すれば、これら抗原提示関連分子の発現を抑制する免疫抑制作用が認められた。よって、ｃ−ＭＩＲは、このような免疫抑制作用によりヒト免疫系において抗原提示関連分子の発現を調節する調節因子と考えられる。
また、ｃ−ＭＩＲの構造類似分子である上記ＨＳＰＣ２４０についても、機能解析の結果、Ｂ７−２分子の細胞表面における発現を負に制御する作用、換言すれば、抗原提示関連分子の発現を抑制する免疫抑制作用が認められた。同様に、ｃ−ＭＩＲの構造類似分子である残り４つの分子についても抗原提示関連分子の発現を抑制する作用を有している可能性が極めて高く、本発明のタンパク質は、抗原提示関連分子の発現を抑制し、このような免疫抑制作用によりヒト免疫系において抗原提示・免疫認識を調節する調節因子ということができる。
さらに、本発明者は、上記ｃ−ＭＩＲおよびＨＳＰＣ２４０のマウスホモログをクローニングする共に、その機能解析を行った。配列番号１３及び１５には、それぞれ上記ｃ−ＭＩＲおよびＨＳＰＣ２４０のマウスホモログの各塩基配列が、そのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域によってコードされる各アミノ酸配列と共に示される。また、上記２つの遺伝子によってそれぞれコードされるタンパク質の各アミノ酸配列が、配列番号１４及び１６に示される。
上記ｃ−ＭＩＲのマウスホモログについて、Ａ２０細胞にその遺伝子を導入し、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子の各発現を調べた結果、ＭＨＣクラスＩＩ分子の特異的抑制が認められた。また、上記ＨＳＰＣ２４０のマウスホモログについて、Ａ２０．２Ｊ細胞にその遺伝子を導入し、Ｂ７−２分子、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子の各発現を調べた結果、Ｂ７−２分子の特異的抑制が認められた。これらの結果より、上記ｃ−ＭＩＲおよびＨＳＰＣ２４０のマウスホモログについてもヒト遺伝子と同様に、抗原提示関連分子のうちの何れかの分子の発現を特異的に抑制する機能を持っていると考えられる。
さらに、ｃ−ＭＩＲによるＭＨＣクラスＩＩ分子およびＢ７−２分子の特異的抑制は、強力に抗原提示機能を抑制することも明らかとなった。それゆえ、ｃ−ＭＩＲは過剰免疫反応を抑制している可能性が示唆される。これらはウイルス免疫回避分子の起源に興味ある視点を与えるものと考えられ、また、これらの生理機能の解明により新たな免疫制御機構が見えてくるものと考えられる。
尚、本発明のタンパク質は、上記８つの分子に限定されるものではなく、その一部が改変された変異タンパク質であってもよい。即ち、本発明のタンパク質には、（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６に示される何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質、のみならず、（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６に示される何れかのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗原提示関連分子の細胞表面における発現を負に制御するタンパク質、も含まれる。
上記「１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のタンパク質は、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質であり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
また、本発明に係るタンパク質は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等によって本発明のタンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。
本発明の遺伝子は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子であり、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５に示される何れかの塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子、およびその塩基配列の一部を改変した改変遺伝子が含まれる。
また、本発明の「遺伝子」には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。ＤＮＡ・ＲＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡ・ＲＮＡは、センス鎖となるコード鎖であっても、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖であってもよい（アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬物として利用できる）。また、本発明の遺伝子配列の一部を利用して得られるｓｉＲＮＡも有用である。
さらに、本発明の「遺伝子」は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
さらに、本発明に係る遺伝子は、上記配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５に示される塩基配列をＯＲＦ領域として有する遺伝子に限定されるものではなく、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子が含まれる。なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
上記ハイブリダイゼーションは、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズし難くなる）。
（ＩＩ）本発明のタンパク質、及びその遺伝子の利用方法（有用性）
Ｂ７−２分子は、抗原提示細胞（樹状細胞、Ｂ細胞等）の表面にてＴ細胞への抗原提示を助け、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間の免疫シナプス形成のモジュレーターとして機能する。免疫シナプス形成はＴ細胞を活性化させる。また、Ｂ７−２分子によるシグナル伝達は、自己免疫疾患の進行に関係している。
本発明のタンパク質は、上記Ｂ７−２分子などの抗原提示関連分子の発現を抑制する免疫抑制作用を有し、ヒト免疫系において免疫認識に重要な抗原提示を調節する調節因子と考えられることから、本発明のタンパク質、及びその遺伝子は、ヒト免疫制御機構の解明に有用なばかりでなく、医学上および産業上種々の利用が可能である。例えば、免疫抑制剤として免疫抑制を効率良く人為的に行う方法の開発などにも利用でき、さらに、細胞、臓器移植の際の拒絶反応の抑制、自己免疫疾患の治療などに本発明のタンパク質・遺伝子は応用可能である。
また、本発明のタンパク質、及びその遺伝子の哺乳類ホモログは、モデル動物を用いた免疫抑制効果を調べる実験等に有用であり、このような哺乳類ホモログも本発明に含まれる。例えば、マウスなどの小動物を用いて拒絶反応モデルを作製し、免疫抑制効果をｉｎ ｖｉｖｏにて検討する実験等に有用である。実際、本発明者は、上記ｃ−ＭＩＲおよびＨＳＰＣ２４０のマウスホモログをクローニングし、その機能解析を行ったところ、前述のとおり、ヒト遺伝子と同様にＢ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を特異的に抑制する機能が認められた。
さらに、本発明のタンパク質、及びその遺伝子は、薬剤の候補分子（創薬ターゲット）のスクリーニングに有用である。例えば、（１）本発明のタンパク質の作用を調節する物質のスクリーニング方法、あるいは、（２）本発明のタンパク質と同様に、Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子等の抗原提示関連分子の細胞表面における発現を負に制御する作用を有する物質のスクリーニング方法、等に利用可能である。上記（１）の本発明のタンパク質の作用を調節する物質とは、例えば、本発明のタンパク質と標的分子（Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子等）との結合を阻害し、本発明のタンパク質の免疫抑制作用を阻害する物質や、あるいは反対に、本発明のタンパク質の免疫抑制作用を高める物質等が挙げられる。このような物質は、免疫疾患の治療薬や診断薬として利用可能であり、そのスクリーニング方法も本発明に含まれる。
本発明のスクリーニング方法としては、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従来公知の種々の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。例えば、上記ｃ−ＭＩＲは、その膜貫通領域を介してＢ７−２分子の膜貫通領域またはその近傍の細胞内領域に結合し、この結合がＢ７−２分子のユビキチン化に不可欠である（後の実施例参照）ことから、試験管内反応系（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｓｙｓｔｅｍ）において、下記（１）〜（３）のいずれかの物質と下記（４）〜（７）のいずれかの物質とを発現させ、両分子の結合を阻害する分子等を候補分子の中からＥＬＩＳＡ法等によって検出するスクリーニング方法などが挙げられる。
（１） 上記ｃ−ＭＩＲなどの本発明のタンパク質
（２） 本発明のタンパク質の部分タンパク質であって、全長タンパク質のアミノ酸配列中、少なくともその膜貫通領域を含む部分タンパク質
（３） 上記（１）のタンパク質または上記（２）の部分タンパク質の改変体
（４） Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子
（５） Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の改変体
（６） Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の部分タンパク質であって、全長タンパク質のアミノ酸配列中、少なくともその膜貫通領域またはその近傍の細胞内領域を含む部分タンパク質
（７） 上記▲６▼の部分タンパク質の改変体
上記「（タンパク質の）改変体」とは、当該タンパク質の１個または数個（好ましくは７個以下、より好ましくは５個以下、さらに好ましくは３個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された改変体をいい、当該タンパク質がＨｉｓやＭｙｃ等のタグによって標識される場合や、当該タンパク質を蛍光タンパク質（ＧＦＰ・ルシフェラーゼ等）または他のタンパク質と融合させる場合、当該タンパク質にリン酸化や糖鎖結合等により修飾を施す場合などをも含む意味で用いている。
勿論、本発明のスクリーニング方法は、上記の方法に限定されるものではなく、ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｓｙｓｔｅｍでのスクリーニングではなく、培養細胞等を用いて細胞内でスクリーニングを行ってもよい。
そのほか、（１）ｃ−ＭＩＲ等の本発明のタンパク質の膜貫通領域や、Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の膜貫通領域またはその近傍の細胞内領域をカラムに固定してこれと結合する物質を検索する方法や、（２）免疫沈降−免疫ブロット法を用いてｃ−ＭＩＲとＢ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子との結合を阻害する物質を検索する方法など、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従来公知の種々の方法を本発明のスクリーニング方法に適用可能である。
さらに、本発明のスクリーニング方法においては、ヒト以外のタンパク質、例えば、マウスホモログやラットホモログ、その他の生物の各ホモログを用いてスクリーニングを行ってもよい。
（ＩＩＩ）本発明の組換え発現ベクター等
本発明の組換え発現ベクターは、前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする本発明の遺伝子を含むものであり、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５に示される何れかの塩基配列を有するｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。
本発明の形質転換体は、前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする本発明の遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、動物個体を含む意味である。対象となる動物は、特に限定されるものではないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどの哺乳動物が例示される。特に、マウスやラット等の齧歯目動物は、実験動物・病態モデル動物として広く用いられており、なかでも近交系が多数作出されており、受精卵の培養、体外受精等の技術が整っているマウスが実験動物・病態モデル動物として好ましく、ノックアウトマウス等は、上記タンパク質ｃ−ＭＩＲやそのホモログの更なる機能解析、これらのタンパク質が関与する病気の診断方法の開発や、その治療方法の開発などに有用である。
本発明の遺伝子検出器具は、本発明の上記遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いている。遺伝子検出器具は、種々の条件下での本発明の遺伝子の発現パターンの検出・測定などに利用できる。本発明の遺伝子検出器具としては、例えば、本発明の遺伝子と特異的にハイブリダイズする上記プローブを基盤（担体）上に固定化したＤＮＡチップ等が挙げられる。
本発明の抗体は、前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得られる抗体である。本発明の抗体は、本発明のタンパク質の検出・測定などに利用でき、その他、診断用・治療用などに利用できる可能性がある。
（ＩＶ）本発明に係る遺伝子、タンパク質等の取得方法
〔ＩＶ−１：遺伝子の取得方法〕
本発明に係る遺伝子を取得する方法は、特に限定されるものではなく、前述の開示された配列情報等に基づいて種々の方法により、上記各遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングすることができる。
例えば、上記各ｃＤＮＡ配列の一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ヒト又はマウスのゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記各ｃＤＮＡ配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。また、上記スクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。
上記スクリーニングによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成およびその塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、本発明に係る遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認することができる。
また、上記プローブの配列を、ヒトｃ−ＭＩＲおよびその類似分子の間で良好に保存されている領域（例えば、ＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガードメイン）の中から選択し、ヒトやマウス、その他の生物のゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、上記ｃ−ＭＩＲと同様の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる可能性が高い。
本発明に係る遺伝子を取得する方法は、上記スクリーニング法以外にも、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法がある。例えば、上記各ｃＤＮＡ配列のうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてヒト又はマウスのゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に係る遺伝子を含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
〔ＩＶ−２：タンパク質の取得方法〕
本発明に係るタンパク質の取得する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、上記各ｃＤＮＡ配列を導入した組換え発現ベクターを作製し、周知の方法により大腸菌や酵母等の微生物又は動物細胞などに組み入れて形質転換体として、そのｃＤＮＡがコードするタンパク質を発現させ精製することで、本発明に係るタンパク質を容易に取得することができる。
尚、このように宿主に外来遺伝子を導入する場合、外来遺伝子の発現のため宿主内で機能するプロモーターを組み入れた発現ベクター及び宿主には様々なものが存在するので、目的に応じたものを選択すればよい。産生されたタンパク質を取り出す方法は、用いた宿主、タンパク質の性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のタンパク質を精製することが可能である。
変異タンパク質を作製する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、部位特異的突然変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ １５２，２７１−２７５（１９９５）他）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製法を用いて、上記各ｃＤＮＡの塩基配列において、１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるように改変を加えることによって作製することができる。また、変異タンパク質の作製には、市販のキット（例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ ストラタジーン社製）を利用してもよい。
上記のように作製された変異タンパク質が、野生型と同様の活性・機能を有する例は既に多数知られており、一方、その活性・機能に異常を来すように変異を導入し変異タンパク質を作製することも既に多く行われている。例えば、後の実施例において作製した変異タンパク質ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲ（ｃ−ＭＩＲのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガー領域に変異を導入したタンパク質）は、標的分子をユビキチン化することができなかった。
〔ＩＶ−３：遺伝子検出器具〕
遺伝子検出器具は、本発明の遺伝子における一部の塩基配列又はその相補配列をプローブとして用いたものである。例えば、基盤（担体）上にオリゴヌクレオチド（プローブ）を固定化してなるＤＮＡチップが挙げられる。ここで「ＤＮＡチップ」とは、主として、合成したオリゴヌクレオチドをプローブに用いる合成型ＤＮＡチップを意味するが、ＰＣＲ産物などのｃＤＮＡをプローブに用いる貼り付け型ＤＮＡマイクロアレイをも包含するものとする。
プローブとして用いる配列は、ｃＤＮＡ配列の中から特徴的な配列を特定する従来公知の方法によって決定することができ、例えば、ＳＡＧＥ：Ｓｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１２６８，１９９７；Ｃｅｌｌ ８８：２４３，１９９７；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４８４，１９９５；Ｎａｔｕｒｅ ３８９：３００，１９９７；米国特許第５，６９５，９３７号）などを挙げることができる。
尚、ＤＮＡチップの製造には、公知の方法を採用すればよい。例えば、オリゴヌクレオチドとして合成オリゴヌクレオチドを使用する場合には、フォトリソグラフィー技術と固相法ＤＮＡ合成技術との組み合わせにより、基盤上で該オリゴヌクレオチドを合成すればよい。一方、オリゴヌクレオチドとしてｃＤＮＡを用いる場合には、アレイ機を用いて基盤上に貼り付ければよい。
また、一般的なＤＮＡチップと同様、パーフェクトマッチプローブ（オリゴヌクレオチド）と、該パーフェクトマッチプローブにおいて一塩基置換されたミスマッチプローブとを配置して遺伝子の検出精度をより向上させてもよい。さらに、異なる遺伝子を並行して検出するために、複数種のオリゴヌクレオチドを同一の基盤上に固定してＤＮＡチップを構成してもよい。
〔ＩＶ−４：組換え発現ベクター及び形質転換体〕
組換え発現ベクターは、本発明の遺伝子を含むものである。ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。
本発明の遺伝子がホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ホスト細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと本発明の遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとしてホスト細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明の遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、本発明に係るタンパク質を融合タンパク質として発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係るタンパク質をＧＦＰ融合タンパク質として発現させてもよい。
上記ホスト細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、ヒト又はマウス由来の細胞をはじめとして、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐａｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、各種哺乳動物（ラット、ウサギ、ブタ、サル等）の培養細胞、あるいは、キイロショウジョウバエ、カイコガ等の昆虫の培養細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
上記発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
〔ＩＶ−５：抗体〕
抗体は、本発明のタンパク質、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得られる抗体である。公知の方法としては、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗらの「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８））、岩崎らの「単クローン抗体ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ，講談社（１９９１）」」に記載の方法が挙げられる。こうして作製した抗体は、本発明のタンパク質の検出に有効である。
以下、本発明のタンパク質であるｃ−ＭＩＲ、さらにＨＳＰＣ２４０について行った機能解析の結果について、図面を参照しながら説明する。
〔実施例１：カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）のＫ３，Ｋ５蛋白の機能・構造ホモログとしてのｃ−ＭＩＲの同定〕
セレーラゲノミクス社のデータベースから、ＫＳＨＶのＫ３，Ｋ５蛋白のヒトホモログを検索した。その結果、アミノ酸配列全体のレベルでは、Ｋ３，Ｋ５蛋白と高い相同性を持つ配列は見つからなかったが、一つのクローンｈＣＰ３６２７９は、Ｋ３，Ｋ５蛋白と、二次構造、ＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガー、および当該ジンクフィンガーの位置が共通していた。ｈＣＰ３６２７９のアミノ末端側の配列がデータベースでは欠けていたので、キャップトラッピング（ｃａｐ−ｔｒａｐｐｉｎｇ）法を用いた５’ＲＡＣＥ解析を行うことにより、ＮＫ細胞株ＹＴＳからｈＣＰ３６２７９の全長アミノ酸配列を決定した。その配列を図１（ａ）に示す（同配列は、配列表の配列番号２にも示される）。図中、下線のＴＭ１、ＴＭ２は、ＰＨＤｈｔｍプログラムによって予測された膜貫通領域であり、他の下線は、ＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガー構造に重要なアミノ酸残基である。ＲＴ−ＰＣＲ解析により、この転写産物は、ＢＪＡＢ細胞および２９３Ｔ細胞においても見出された。
本発明者は、この新規タンパク質を「ｃｅｌｌｕｌａｒ ＭＩＲ（ｃ−ＭＩＲ）」と命名した。そして、このｃ−ＭＩＲとＫ３，Ｋ５蛋白との機能的類似性を調べるため、エレクトロポレーション法によりＨｉｓタグ付のｃ−ＭＩＲを一過性にＢＪＡＢ細胞に発現させ、免疫認識に重要な抗原提示関連分子の細胞表面における発現をｔｗｏ−ｃｏｌｏｒフローサイトメトリー法によって解析した。その結果を図１（ｂ）に示す。
図中、ＭＨＣ Ｉ、ＩＣＡＭ−１、Ｂ７−２は、抗原提示関連分子であり、それぞれＭＨＣクラスＩ分子、ＩＣＡＭ−１分子、Ｂ７−２分子の表面発現レベルを調べた結果である。上記実験では、ＧＦＰ−ｃ−ＭＩＲベクターをＢＪＡＢ細胞にトランスフェクションさせ、導入後２４時間してから上記各分子の表面発現レベルおよびＧＦＰの発現レベルをフローサイトメトリー法によって解析した。図の縦軸はＭＨＣクラスＩ分子、ＩＣＡＭ−１分子、Ｂ７−２分子の表面発現レベルを、横軸はＧＦＰの発現レベルをそれぞれ示す。
同図に示すように、ｃ−ＭＩＲの発現が高くなるにつれてＢ７−２分子の細胞表面における発現は負に制御された（つまり、発現が抑制された）が、ＭＨＣクラスＩ分子およびＩＣＡＭ−１分子の発現は負に制御されなかった。また、Ｆｌａｇタグ付のｃ−ＭＩＲを発現させて調べた場合も、同様の結果が得られた（データ示さず）。
さらにｃ−ＭＩＲの詳細な機能解析のため、ｃ−ＭＩＲを恒常的に過剰発現するようＢＪＡＢ細胞を改変し（この細胞を以下、「ｃ−ＭＩＲ細胞」という）、種々の抗体を用いたフローサイトメトリー法によって抗原提示（免疫認識）関連分子の細胞表面における発現を検討した。その結果を図２に示す。
図中、ＩＣＡＭ−１、Ｂ７−２、ＣｌａｓｓＩ、ＣｌａｓｓＩＩ（ＤＲ）は、抗原提示関連分子であり、それぞれＩＣＡＭ−１分子、Ｂ７−２分子、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）分子の表面発現レベルを調べた結果である。また図中、ｃ−ＭＩＲは、遺伝子導入によりｃ−ＭＩＲを発現させた上記ｃ−ＭＩＲ細胞について調べた結果であり、Ｃｏｎｔは、そのような発現をさせていない対照用のＢＪＡＢ細胞について調べた結果であり、Ｍｅｒｇｅは、両者の結果を重ね合わせたものである（ｃ−ＭＩＲ細胞の結果を白抜きで示す）。
同図に示すように、Ｂ７−２分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面における発現は顕著に負に制御されたが、ＭＨＣクラスＩ分子およびＩＣＡＭ−１分子は負に制御されなかった。このように、新規タンパク質ｃ−ＭＩＲには、Ｂ７−２分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を特異的に抑制する作用が認められた。
〔実施例２：上記ｃ−ＭＩＲはＢ７−２分子の迅速なエンドサイトーシスとライソゾームによる分解を誘導する〕
上記ｃ−ＭＩＲによってＢ７−２分子の発現がどのように抑制されるのかその抑制機構を調べるために、Ｂ７−２分子の蛋白合成、分解、移動を検討した。そのため、ＢＪＡＢ細胞（Ｃｏｎｔ）およびｃ−ＭＩＲ細胞（ｃ−ＭＩＲ）を、３５Ｓメチオニンと３５Ｓシステインとによって３０分間パルス標識した後、所定期間（０ｈ，１ｈ，３ｈ，６ｈ）追跡した。各期間経過後、細胞を溶解し、抗Ｂ７−２抗体（上パネル）または抗ＭＨＣ Ｉ抗体（下パネル）で免疫沈降した結果を図３（ａ）に示す。
Ｂ７−２分子はグリコシル化の程度が高いため、成熟Ｂ７−２分子は未成熟なものよりゆっくりと移動した。一方、成熟ＭＨＣ Ｉ分子は未成熟なものよりゆっくり移動することはなかったが、これはおそらくグリコシル化の程度が低いためと考えられる。また、同図に示すように、追跡開始時（０時）に対照細胞（Ｃｏｎｔ）およびｃ−ＭＩＲ細胞（ｃ−ＭＩＲ）の両細胞で観察された未成熟Ｂ７−２分子の量はほぼ同じであったが、対照細胞（Ｃｏｎｔ）では成熟Ｂ７−２分子の量は６時間まで実質的に減少しなかったのに対して、ｃ−ＭＩＲ細胞（ｃ−ＭＩＲ）では１時間後すでに成熟Ｂ７−２分子の量はかなり少なかった。この結果は、ｃ−ＭＩＲによってＢ７−２分子の急速な分解が誘導されることを示すものである。
標的分子の急速な分解は、ＫＳＨＶのＫ３，Ｋ５蛋白を発現するＢＪＡＢ細胞においても観察され、この分解はライソゾームで起こることが報告されている。そこで、ｃ−ＭＩＲによって誘導されるＢ７−２分子の分解がライソゾームで起こるのかどうかを検討した。実験では、ｃ−ＭＩＲ細胞を１０μＭ ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１で２〜４時間処理した後、抗Ｂ７−２抗体（上パネル）または抗アクチン抗体（下パネル）でイムノブロット解析に供した。その結果を図３（ｂ）に示す。ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１で細胞を処理すると、ｖａｃｕｏｌａｒ Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅを阻害することによりライソゾーム内のｐＨが上がる。その結果、同図に示すように、Ｂ７−２蛋白の発現は安定的に増加した。
さらに、ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１で処理した後、図３（ａ）の実験と同様にパルス追跡（ｐｕｌｓｅ−ｃｈａｓｅ）解析を行うことによって、ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１がＢ７−２分子の分解を阻害する結果が得られた（図３（ｃ）参照：図中「Ｂａｆｉｌｏ＋」はｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１で処理したもの、一方「Ｂａｆｉｌｏ−」は対照用のＤＭＳＯで処理したもの）。これらの結果は、ｃ−ＭＩＲがＢ７−２分子を標的としてライソゾームにて分解させることを示すものである。
次に、Ｂ７−２分子の細胞内動態をＥｎｄｏ−Ｈ（ｅｎｄｏ−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ Ｈ）による消化実験によって調べた。Ｂ７−２分子があるグリカンで修飾されると、Ｅｎｄｏ−Ｈの消化に耐性となるが、それはＢ７−２分子が少なくとも中間ゴルジに到達していることを示している。実験では、ＢＪＡＢ細胞（Ｃｏｎｔ）またはｃ−ＭＩＲ細胞（ｃ−ＭＩＲ）を３５Ｓメチオニンと３５Ｓシステインとによって３０分間パルス標識し、１５〜３０分追跡した。各期間経過後、細胞を０．１％ＳＤＳ含有溶解バッファーにて溶解し、抗Ｂ７−２抗体で免疫沈降した。その後、各サンプルは、Ｅｎｄｏ−Ｈ（＋）またはなし（−）で消化され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された。その結果を図３（ｄ）に示す。図中、★印はＥｎｄｏ−Ｈ耐性のＢ７−２分子を示す。同図に示すように、３０分後、対照細胞およびｃ−ＭＩＲ細胞において、Ｅｎｄｏ−Ｈ耐性のＢ７−２分子の量はほぼ同じであり、Ｂ７−２分子の細胞内動態はＢ７−２分子が中間ゴルジに達するまで影響を受けていないことがこの実験結果より示された。
上記の実験結果より、ｃ−ＭＩＲによってＢ７−２分子のエンドサイトーシスが亢進する可能性が考えられた。この可能性を確かめるため、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）−ｂａｓｅｄエンドサイトーシス解析を行った。その結果を図４（ａ）に示す。
上記実験では、ＢＪＡＢ細胞（Ｃｏｎｔ）およびｃ−ＭＩＲ細胞（ｃ−ＭＩＲ）を４℃にてＰＥ共役抗Ｂ７−２抗体で染色し、非結合抗体除去のためＰＢＳで洗浄した後、３７℃で１０分間または３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞内へ内部化していない抗体を酸性溶液で除去し、内部化した蛍光シグナルをフローサイトメーターで測定した。これらの結果は、同図の「１０」「３０」と記したパネルに示される。蛍光のバックグラウンドレベルを決定するため、ＰＥ共役抗Ｂ７−２抗体で染色後、細胞の表面にある抗体を酸性溶液で除去し、バックグラウンドレベルをフローサイトメーターで測定した。この結果は、同図の「０」と記したパネルに示されると共に、「１０」「３０」のパネルにも太線で示される。「Ｐｒｅ」と記したパネルは、細胞表面にある抗体を除去する前のＢ７−２分子の細胞表面発現レベルを示すものである。
同図に示すように、１０分間インキュベーションすると、ｃ−ＭＩＲ細胞では細胞内部への顕著な蛍光シグナルが観察された。一方、対照細胞では細胞内へのシグナルは観察されなかった。また、３０分間インキュベーション後、ｃ−ＭＩＲ細胞では細胞内への蛍光シグナルに増加は認められず、対照細胞では依然として細胞内へのシグナルは観察されなかった。これらの結果は、ｃ−ＭＩＲによって誘導されるＢ７−２分子の急速なエンドサイトーシスが１０分以内に起こることを示すものである。また、同様の実験をＭＨＣクラスＩ分子（ＭＨＣ Ｉ）について行ったところ、ｃ−ＭＩＲ細胞ではＭＨＣ Ｉのエンドサイトーシスは亢進しなかった（データ示さず）。
さらに、ｃ−ＭＩＲによって誘導されるＢ７−２分子の急速なエンドサイトーシスを確認するため、ｃ−ＭＩＲ細胞および対照細胞を３７℃でＦＩＴＣ標識した抗Ｂ７−２抗体と２時間反応させた後、共焦点顕微鏡によってＢ７−２分子の局在を調べた。その結果を図４（ｂ）に示す。同図に示すように、ｃ−ＭＩＲ細胞では細胞内にＢ７−２分子が観察されたが、対照細胞では観察されなかった。以上の結果は、ｃ−ＭＩＲがＢ７−２分子の迅速なエンドサイトーシスを誘導することを示すものである。
〔実施例３：Ｂ７−２分子の膜貫通領域および細胞質領域が、ｃ−ＭＩＲの標的の特異性に関係している〕
本発明者は、ＫＳＨＶのＫ３，Ｋ５蛋白の機能に関し、ＣＤ８キメラ蛋白を用いた解析によって、標的分子の膜貫通領域および細胞質領域が、Ｋ３，Ｋ５蛋白を介した標的分子のダウンレギュレーション（発現抑制）に十分であることを以前示した。そこで、Ｂ７−２分子の同領域がｃ−ＭＩＲを介したＢ７−２分子のダウンレギュレーションに十分であるか調べるため、ＨＬＡ−Ａ２およびＢ７−２分子についてＣＤ８キメラ蛋白を作製した（これらキメラ蛋白をそれぞれ「ＣＤ８／Ａ２」「ＣＤ８／Ｂ７−２」という）。ＣＤ８／Ａ２、ＣＤ８／Ｂ７−２は、それぞれ、ＣＤ８αの細胞外領域のカルボキシル末端にＨＬＡ−Ａ２分子およびＢ７−２分子の膜貫通領域および細胞質領域を含んでいる。これらのＣＤ８キメラ蛋白を対照用のＢＪＡＢ細胞またはｃ−ＭＩＲ細胞に発現させ、ＣＤ８の細胞表面における発現をフローサイトメトリー法によって調べた。その結果を図５に示す。
ＢＪＡＢ細胞表面にはＣＤ８は発現していないため、上記の実験により標的分子のダウンレギュレーションを良好に検出できる。図５に示すように、いずれのＣＤ８キメラ蛋白も対照用のＢＪＡＢ細胞では効率良く発現した。一方、ｃ−ＭＩＲ細胞ではＣＤ８／Ａ２キメラ蛋白は十分発現したが、ＣＤ８／Ｂ７−２キメラ蛋白は十分な発現が見られなかった。この結果は、Ｂ７−２分子の膜貫通領域および細胞質領域が、ｃ−ＭＩＲの標的の特異性に関与していることを示すものである。
〔実施例４：ｃ−ＭＩＲは、Ｅ３ユビキチンリガーゼとして機能する〕
前述のように、ＫＳＨＶのＫ３，Ｋ５蛋白については、ＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガーがＥ３ユビキチンリガーゼの機能ドメインであることが示されている。そこで、ｃ−ＭＩＲのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガーがＥ３ユビキチンリガーゼ活性を持つかどうか調べるため、Ｋ３蛋白においてそのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガー（８〜５７番目のアミノ酸残基）をｃ−ＭＩＲのもの（７８〜１３７番目のアミノ酸残基）に置換したキメラ蛋白を作製した（このキメラ蛋白を以下「Ｚｎ ＭＩＲ−Ｋ３」という）。そして、このキメラ蛋白がＫ３の標的分子であるＭＨＣ Ｉに対するリガーゼ活性を持ち、その細胞表面における発現を抑制するかどうか調べた。あわせて、ｃ−ＭＩＲのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガー領域に変異を導入し、これをＫ３のＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガーと置換したキメラ蛋白も作製した（このキメラ蛋白を以下「ｍＺｎ ＭＩＲ−Ｋ３」という）。上記の変異とは、亜鉛（Ｚｎ）結合部位の４つのシステイン（８０，８３，１２３，１２５番目）をセリンに置換したものである。これらのキメラ蛋白と野生型のＫ３蛋白をＡ７細胞に発現させ、ＭＨＣ Ｉの表面発現をｔｗｏ−ｃｏｌｏｒフローサイトメトリー法によって調べた。その結果を図６（ａ）に示す。
同図に示すように、Ｚｎ ＭＩＲ−Ｋ３蛋白は、ＭＨＣ Ｉの表面発現を十分ダウンレギュレーションした。ｍＺｎ ＭＩＲ−Ｋ３蛋白では、ＭＨＣ Ｉの表面発現をダウンレギュレーションできなかったため、このダウンレギュレーションはＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰドメイン依存的といえる。この結果は、ｃ−ＭＩＲがＥ３ユビキチンリガーゼ活性を持つことを示すものである。
このことをさらに確かめるため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ自己ユビキチン化解析を行った。具体的には、ｃ−ＭＩＲのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰドメインの野生型または変異型をＧＳＴのカルボキシル末端に融合させ、精製したこのＧＳＴ融合蛋白をＡＴＰ、フリーのユビキチン、Ｅ１、Ｅ２（ＵｂｃＨ５ａ）の混合物を用いて自己ユビキチン化解析に供した。その結果を図６（ｂ）に示す。同図に示すように、野生型のＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰドメインを含むＧＳＴ融合蛋白（図中、ｃ−ＭＩＲ）では、抗ユビキチン抗体（α−Ｕｂｉ）により自己ユビキチン化（ｕｂ−ＧＳＴ）がはっきりと観察されたが、ＧＳＴ単独のもの（図中、ＧＳＴ）および変異型のＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰドメインを含むＧＳＴ融合蛋白（図中、ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲ）では、自己ユビキチン化は観察されなかった。この結果は、ｃ−ＭＩＲのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰドメインがＥ３ユビキチンリガーゼ活性を持つことを示すものである。
さらに、Ｂ７−２分子がｃ−ＭＩＲによってユビキチン化されるか調べるため、ＨＡで標識したユビキチンおよび野生型（ｗｔ）のｃ−ＭＩＲ（または、ＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰドメインを改変した変異型のｃ−ＭＩＲ（ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲ））とＢ７−２分子とを共発現させた。そして、各細胞溶解物を抗Ｂ７−２抗体で免疫沈降した後、抗ＨＡ抗体（上段パネル）または抗Ｂ７−２抗体（中央パネル）を用いたイムノブロット解析に供した。その結果を図６（ｃ）に示す。同図に示すように、野生型のｃ−ＭＩＲ（図中、ｃ−ＭＩＲ）を発現させた場合、抗ＨＡ抗体および抗Ｂ７−２抗体のブロット結果は、ユビキチン化されたＢ７−２（ｕｂ−Ｂ７−２）をはっきりと示したが、野生型のｃ−ＭＩＲを発現させなかった場合（図中、Ｃｏｎｔ）および変異型のｃ−ＭＩＲを発現させた場合（図中、ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲ）では、ユビキチン化は観察されなかった。尚、各細胞溶解物におけるｃ−ＭＩＲおよびｍＺｎ ｃ−ＭＩＲの発現量を確認するため、抗Ｈｉｓ抗体でブロットした結果を下段のパネルに示す。
以上の結果、ｃ−ＭＩＲは、そのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガードメインを介して、Ｂ７−２分子に対するＥ３ユビキチンリガーゼとして機能することが示された。
〔実施例５：ユビキチン化は、ｃ−ＭＩＲを介したＢ７−２分子のダウンレギュレーションに不可欠である〕
これまで、ｃ−ＭＩＲが、▲１▼Ｂ７−２分子の細胞表面における発現の調節因子（モジュレーター）であること、▲２▼Ｂ７−２分子に対する新規Ｅ３ユビキチンリガーゼであることを示した。しかし、ユビキチン化が、Ｂ７−２分子の細胞表面における発現のダウンレギュレーションに不可欠であるかどうかは不明確である。この点を確かめるため、野生型のｃ−ＭＩＲ（ｗｔ−ｃ−ＭＩＲ）とＢ７−２分子をユビキチン化できなかったｍＺｎ ｃ−ＭＩＲ変異体をエレクトロポレーション法によってＢＪＡＢ細胞に一過性に発現させ、ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒフローサイトメトリー法によってＢ７−２分子の細胞表面における発現を調べた。その結果を図７（ａ）に示す。同図に示すように、ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲは、Ｂ７−２分子の発現を抑制しなかった。
次に、ＣＤ８キメラ蛋白を用いて次のような実験を行った。ＫＳＨＶのＫ５蛋白は、標的分子の細胞質に位置するリジン残基をユビキチン化することが知られている。そこで、ｃ−ＭＩＲについても同様であるか調べるため、前述のＣＤ８／Ｂ７−２キメラ蛋白においてＢ７−２分子の細胞質領域に位置するリジン残基のすべてをＰＣＲベースの変異導入法によってアルギニンに改変し、さらに、そのアミノ末端にＦｌａｇタグでエピトープ標識した（このキメラ蛋白を「Ｂ７−ＫＲ」という）。さらに、上記改変を施さないＣＤ８／Ｂ７−２キメラ蛋白についても、Ｆｌａｇタグでエピトープ標識した（このキメラ蛋白を「ｗｔ−Ｂ７」という）。
上記Ｂ７−ＫＲまたはｗｔ−Ｂ７を、ＨＡタグ付のユビキチンおよびｃ−ＭＩＲと共に２９３Ｔ細胞に共発現させ、図６（ｃ）と同様の実験に供した。その結果を図７（ｂ）に示す。同図に示すように、抗ＨＡ抗体および抗Ｆｌａｇ抗体によるブロット解析の結果、ｗｔ−Ｂ７ではｃ−ＭＩＲを介したユビキチン化（図中、ｕｂ−Ｆｌａｇ−ＣＤ８ ｃｈｉｍｅｒａ）が観察されたが、Ｂ７−ＫＲではｃ−ＭＩＲを介したユビキチン化は観察されなかった。
Ｂ７−２分子のユビキチン化と、その発現抑制（ダウンレギュレーション）との関係を調べるため、ｗｔ−Ｂ７およびＢ７−ＫＲをＢＪＡＢ細胞（対照細胞）およびｃ−ＭＩＲ細胞に発現させ、ＣＤ８の表面発現レベルをフローサイトメトリー法により比較した。その結果を図７（ｃ）に示す。同図に示すように、ｗｔ−Ｂ７の発現はｃ−ＭＩＲ細胞において抑制されたが、Ｂ７−ＫＲの発現はｃ−ＭＩＲ細胞において抑制されなかった。この結果は、Ｂ７−２分子の細胞質領域のリジン残基のユビキチン化がそのダウンレギュレーションに必要であることを示すものである。
〔実施例６：分子間の相互作用を通じてのＢ７−２分子の特異的ユビキチン化とダウンレギュレーション〕
Ｅ３ユビキチンリガーゼは、標的分子への結合を通じて機能すると考えられるので、次に、ｃ−ＭＩＲとＢ７−２との分子間相互作用を調べた。図７（ｂ）の実験に用いたｗｔ−Ｂ７と同じ分子であるＣＤ８−Ｂ７とｃ−ＭＩＲとを２９３Ｔ細胞に単独または共発現させた後、その細胞溶解物を抗Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降し、ｃ−ＭＩＲを認識する抗Ｖ５抗体でイムノブロット解析に供した。その結果を図８（ａ）の上段パネルに示す。
同図に示すように、ｃ−ＭＩＲおよびＣＤ８−Ｂ７を共発現させた場合のみ、ｃ−ＭＩＲに対応する特異的バンドが検出されたので、ｃ−ＭＩＲとＢ７−２との分子間相互作用が確認された。また、ＣＤ８キメラ蛋白の発現量、ｃ−ＭＩＲの発現量を、それぞれ抗Ｆｌａｇ抗体（中央パネル）、抗Ｖ５抗体（下段パネル）で確認した。
ところで、ＫＳＨＶのＫ３，Ｋ５蛋白については、その膜貫通領域が標的分子の膜貫通領域との結合を介して特異的ターゲッティングに関与することが報告されている。仮にｃ−ＭＩＲと標的分子との結合が同様であるとすれば、前記ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲ変異体は野生型の膜貫通領域を有しているので、標的分子との結合能を有すると考えられる。この仮説を確かめるため、ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲを図８（ａ）と同じ実験に供した。その結果を図８（ｂ）に示す。同図に示すように、ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲおよびＣＤ８−Ｂ７を共発現させた場合のみ、ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲに対応する特異的バンドが検出された。尚、図８（ａ）（ｂ）の両実験において、ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲおよびＣＤ８−Ｂ７の結合体のほうがｃ−ＭＩＲおよびＣＤ８−Ｂ７の結合体より容易に検出されたが、これは野生型のｃ−ＭＩＲ結合体の不安定性によるものと考えられる。
ｃ−ＭＩＲによるＢ７−２分子の特異的ダウンレギュレーションが分子間の相互作用によるものか調べるため、前記ＣＤ８／Ａ２キメラ蛋白を用いた実験を行った。ＣＤ８／Ａ２キメラ蛋白の細胞表面における発現はｃ−ＭＩＲ細胞においてダウンレギュレートされなかったからである（図５参照）。ＣＤ８／Ａ２はそのアミノ末端にＦｌａｇエピトープタグを持つよう改変された（このキメラ蛋白を「ＣＤ８−Ａ２」という）。そして、ＣＤ８−Ａ２またはＣＤ８−Ｂ７を２９３Ｔ細胞においてｍＺｎ ｃ−ＭＩＲと共発現させ、免疫沈降−イムノブロット法によって分子間相互作用を調べた。尚、このように本実験ではｍＺｎ ｃ−ＭＩＲを用いたが、これはｃ−ＭＩＲ結合体の検出が容易なためである。本実験では、ＣＤ８−Ａ２発現細胞およびＣＤ８−Ｂ７発現細胞の各細胞溶解物を抗ＨＡ抗体または抗Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降し、抗Ｖ５抗体（上段）または抗Ｆｌａｇ抗体（中央）でイムノブロット解析を行った。その結果を図８（ｃ）に示す。両細胞の溶解物について抗Ｖ５抗体でイムノブロット解析を行った結果についてもあわせて下段に示される。
同図に示すように、ＣＤ８−Ｂ７とｍＺｎ ｃ−ＭＩＲとは共沈降したが、ＣＤ８−Ａ２とｍＺｎ ｃ−ＭＩＲとは共沈降しなかった。この結果は、分子間相互作用がｃ−ＭＩＲを介したＢ７−２分子の特異的ダウンレギュレーションに不可欠であることを示すものである。
次に、分子間相互作用とユビキチン化との関係を調べるため、上記ＣＤ８−Ａ２およびＣＤ８−Ｂ７について図７（ｂ）と同様の実験に供した。その結果を図８（ｄ）に示す。同図に示すように、ＣＤ８−Ａ２と比べてＣＤ８−Ｂ７では十分なユビキチン化（ｕｂ−ＣＤ８ ｃｈｉｍｅｒａ）が観察された。この結果は、分子間相互作用がｃ−ＭＩＲを介したユビキチン化およびその後の標的分子のダウンレギュレーションに不可欠であることを示すものである。
以上の実験結果から考えられるｃ−ＭＩＲの分子機構を図９に示す。同図に示すように、ｃ−ＭＩＲはＢ７−２分子と膜貫通部位を介して結合する。その後、ＰＨＤ／ＬＡＰドメイン（ＰＨＤ）に結合しているＥ２ユビキチンコンバーティング酵素（Ｅ２）より、ユビキチン（Ｕｂｉ）がＢ７−２分子の細胞内領域にあるそれぞれのリジン残基（Ｋ）に輸送され、Ｂ７−２分子がユビキチン化される。ユビキチン化されたＢ７−２分子は、細胞表面からエンドサイトーシスされ、ライソゾームへ運ばれ分解される。
〔実施例７：上記ｃ−ＭＩＲの機能的・構造的類似分子ＨＳＰＣ２４０〕
上記ｃ−ＭＩＲと同族の新規ヒトＥ３ユビキチンリガーゼについて探索を行った結果、ｃ−ＭＩＲの構造類似分子として５つの遺伝子・タンパク質を同定した。図１０には、このうちＨＳＰＣ２４０のアミノ酸配列が示される（配列表の配列番号４にも同配列が示される）。図中、下線はＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガーモチーフを示す。このＨＳＰＣ２４０が抗原提示関連分子の発現を抑制するかどうか調べた。具体的には、ＢＪＡＢ細胞にＨＳＰＣ２４０を一過性に発現させ、ＭＨＣクラスＩ分子（ＭＨＣ Ｉ）、ＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ ＩＩ／ＤＲ）分子、ＩＣＡＭ−１分子、Ｂ７−２分子の細胞表面における発現をフローサイトメトリー法により調べた。その結果を図１１に示す。同図に示すように、ＨＳＰＣ２４０の発現によってＢ７−２分子の発現は顕著に抑制されたが、ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ、ＩＣＡＭ−１各分子の発現は抑制されなかった。この結果は、ＨＳＰＣ２４０が、Ｂ７−２分子の細胞表面における発現を特異的に抑制すること、および、ｃ−ＭＩＲと同様に抗原提示関連分子の発現を抑制する作用を持つことを示すものである。
〔実施例８：ｃ−ＭＩＲによるＭＨＣクラスＩＩ分子およびＢ７−２分子の発現抑制は、強力に抗原提示機能を抑制する〕
ｃ−ＭＩＲ発現Ａ２０．２Ｊ細胞を作成し、ＯＶＡ３２３−３３９特異的Ｉ−Ａｄ拘束性Ｔｈ１ ｃｌｏｎｅ，４２−６Ａ用いて、ＯＶＡまたはＯＶＡ３２３−３３９ペプチドに対する抗原提示機能をＩＬ−２の産生を指標に調べた。図１２（ａ）にＯＶＡを用いた結果、図１２（ｂ）にＯＶＡ３２３−３３９ペプチドを用いた結果を示す。点線はコントロール細胞の結果を示し、実線はｃ−ＭＩＲ過剰発現細胞の結果を示す。また、ＯＶＡは２４時間、ペプチドは６時間後にＥＬＩＳＡにて培養上清中のＩＬ−２を測定した。この結果から明らかなように、ＯＶＡまたはＯＶＡ３２３−３３９ペプチドに対する抗原提示機能は著明な抑制が認められた。
【産業上の利用の可能性】
本発明は、Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面における発現を負に制御する哺乳類由来の新規タンパク質とその利用に関するものであり、前述したとおり、新たな免疫抑制方法の開発、細胞、臓器移植の際の拒絶反応の抑制、自己免疫疾患の治療、さらに新薬開発などに利用できるほか種々の有用性を有する。したがって、本発明は、各種医薬品産業等、広く医療の発展に寄与するものと考えられる。
【配列表】
【図２】
【図５】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【技術分野】
本発明は、Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子等の抗原提示関連分子の細胞表面における発現を負に制御する哺乳類由来の新規タンパク質とその利用に関するものである。
【背景技術】
ウイルスは、ヒトに感染し、巧みに免疫学的排除を回避し、持続感染、潜伏感染する。この現象は、ヘルペスウイルスや肝炎ウイルスにてよく認められるが、最近になって、（１）ウイルスの発現する蛋白が、免疫認識に重要な抗原提示関連分子（ＭＨＣ等）の細胞表面における発現を抑制し、（２）これにより、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）によるウイルス認識を逃れ、ウイルスが免疫学的排除を回避し得ることが分かってきた（例えば、文献１：Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０００ Ｓｅｐ：１３（３）：３６５−３７４および文献２：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０００ Ｊｕｎ：７４（１１）：５３００−５３０９参照）。
より具体的には、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）のＫ３，Ｋ５蛋白（それぞれ「ＭＩＲ１」「ＭＩＲ２」ともいう）、およびマウスγヘルペスウイルス−６８（ＭＨＶ−６８）のＫ３蛋白といったウイルス蛋白は、Ｅ３ユビキチンリガーゼとして機能し、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面における発現を負に制御することが分かってきた。これらのウイルス蛋白は、ＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガードメインと呼ばれるリガーゼ活性の触媒部位を共通に有し、このドメインを介してＭＨＣクラスＩ分子をユビキチン化する。このユビキチン化は、ＭＨＣクラスＩ分子の迅速なエンドサイトーシスと分解を誘導する。カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスは、このようなＫ３，Ｋ５蛋白の作用（免疫抑制作用）によってＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面における発現を抑制し、免疫学的排除を巧みに回避する。
上記のように、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス等は、上記Ｋ３，Ｋ５蛋白といったウイルス蛋白による免疫抑制機構を有しているが、本発明者は、上記Ｋ３，Ｋ５蛋白の機能解析を進めるうち、これらウイルス蛋白をコードする遺伝子は哺乳類ゲノムに由来し、これらウイルス蛋白の機能類似分子をコードする遺伝子が哺乳類ゲノム、特にヒトゲノムにも存在しているのではないかと考えた。
そして、もしそのような免疫抑制機能を持ったヒトホモログ等を見出すことができれば、ヒトの免疫調節機構の解明に役立つばかりでなく、例えば免疫抑制を効率良く人為的に行う方法の開発などにも利用でき、さらにこの方法は、細胞、臓器移植の際の拒絶反応の抑制、自己免疫疾患の治療などに応用可能であると考えた。
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、上記Ｋ３，Ｋ５蛋白といったウイルス蛋白の機能類似分子である、免疫抑制機能を持ったヒトホモログ等の哺乳類由来の新規タンパク質を見出し、その利用方法を提供することにある。
【発明の開示】
本発明者は、上記の課題に鑑み、上記Ｋ３，Ｋ５蛋白のヒトホモログをヒトゲノムにて探索した結果、ヒトホモログとして複数の遺伝子・タンパク質を同定した。さらに詳細な機能解析を進めた結果、複数のタンパク質に免疫認識に重要な抗原提示関連分子（Ｂ７−２共刺激分子やＭＨＣクラスＩＩ分子）の細胞表面における発現を抑制する免疫抑制作用が認められ、機能上も上記Ｋ３，Ｋ５蛋白と類似すること等を見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、医学上または産業上有用な方法・物質として、下記Ａ）〜Ｐ）の発明を含むものである。
Ａ） 以下の（ａ）又は（ｂ）記載の哺乳類由来のタンパク質。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６に示される何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６に示される何れかのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗原提示関連分子の細胞表面における発現を負に制御するタンパク質。
Ｂ） 上記Ａ）のタンパク質であって、抗原提示関連分子であるＢ７−２分子の細胞表面における発現を負に制御するタンパク質。
Ｃ） 上記Ｂ）のタンパク質であって、Ｂ７−２分子をユビキチン化するタンパク質。
Ｄ） 上記Ａ）〜Ｃ）の何れかに記載のタンパク質であって、抗原提示関連分子であるＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面における発現を負に制御するタンパク質。
Ｅ） 上記Ａ）〜Ｄ）の何れかに記載のタンパク質であって、ヒト又はマウス由来のＥ３ユビキチンリガーゼであるタンパク質。
Ｆ） 上記Ａ）〜Ｅ）の何れかに記載のタンパク質に対する抗体。
Ｇ） 上記Ａ）〜Ｅ）の何れかに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
Ｈ） 上記Ｇ）の遺伝子であって、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５に示される何れかの塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
Ｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、抗原提示関連分子の細胞表面における発現を負に制御するタンパク質をコードする遺伝子。
Ｊ） 上記Ｇ）〜Ｉ）の何れかの遺伝子を含む組換え発現ベクター。
Ｋ） 上記Ｇ）〜Ｉ）の何れかのの遺伝子が導入された形質転換体。
Ｌ） 上記Ｇ）〜Ｉ）の何れかのの遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いた遺伝子検出器具。
Ｍ） 上記Ａ）〜Ｅ）の何れかに記載のタンパク質、または、上記Ｇ）又はＨ）の遺伝子を含む免疫抑制剤。
Ｎ） 上記Ａ）〜Ｅ）の何れかに記載のタンパク質の作用を調節する物質のスクリーニング方法。
Ｏ） 上記Ａ）〜Ｅ）の何れかに記載のタンパク質と同様に、抗原提示関連分子の細胞表面における発現を負に制御する作用を有する物質のスクリーニング方法。
Ｐ） 下記（１）〜（３）の何れかの物質と、下記（４）〜（７）の何れかの物質とを用いることを特徴とする上記Ｍ）又はＮ）記載のスクリーニング方法。
（１） 上記Ａ）〜Ｅ）の何れかに記載のタンパク質
（２） 上記Ａ）〜Ｅ）の何れかに記載のタンパク質の部分タンパク質であって、全長タンパク質のアミノ酸配列中、少なくともその膜貫通領域を含む部分タンパク質
（３） 上記▲１▼のタンパク質または上記▲２▼の部分タンパク質の改変体
（４） Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子
（５） Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の改変体
（６） Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の部分タンパク質であって、全長タンパク質のアミノ酸配列中、少なくともその膜貫通領域またはその近傍の細胞内領域を含む部分タンパク質
（７） 上記（６）の部分タンパク質の改変体
Ｑ） 上記Ｎ）〜Ｐ）の何れかに記載のスクリーニング方法を用いて得られた免疫疾患治療薬。
本発明は、Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面における発現を負に制御する哺乳類由来の新規タンパク質とその利用に関するものであり、前述したとおり、新たな免疫抑制方法の開発、細胞、臓器移植の際の拒絶反応の抑制、自已免疫疾患の治療、さらに新薬開発などに利用できるほか種々の有用性を有するという効果を奏する。
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるだろう。
【図面の簡単な説明】
図１（ａ）は、本発明のタンパク質ｃ−ＭＩＲのアミノ酸配列を示す図であり、図１（ｂ）は、ｃ−ＭＩＲが抗原提示関連分子の発現を抑制する作用を有するかフローサイトメトリー法によって調べた結果を示す図である。
図２は、ｃ−ＭＩＲを恒常的に発現する細胞を用いて、ｃ−ＭＩＲが抗原提示関連分子の発現を抑制する作用を有するかフローサイトメトリー法によって調べた結果を示す図である。
図３（ａ）〜（ｄ）は、ｃ−ＭＩＲによってＢ７−２分子の発現がどのように抑制されるのかその抑制機構を調べるために、Ｂ７−２分子の蛋白合成、分解、移動を検討した結果を示す図である。
図４（ａ）および図４（ｂ）は、ｃ−ＭＩＲによってＢ７−２分子が速やかにエンドサイトーシスされるかどうかを調べた結果を示す図である。
図５は、Ｂ７−２分子の膜貫通領域および細胞質領域がｃ−ＭＩＲを介したＢ７−２分子のダウンレギュレーションに十分であるかどうかを、キメラ蛋白を用いて調べた結果を示す図である。
図６（ａ）〜（ｃ）は、ｃ−ＭＩＲのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰドメインがＥ３ユビキチンリガーゼ活性を持つかどうかを調べた結果を示す図である。
図７（ａ）〜（ｃ）は、Ｂ７−２分子のユビキチン化が、ｃ−ＭＩＲを介したＢ７−２分子のダウンレギュレーションに不可欠であるかどうかを調べた結果を示す図である。
図８（ａ）〜（ｄ）は、ｃ−ＭＩＲとＢ７−２分子との分子間相互作用がＢ７−２分子のユビキチン化およびそのダウンレギュレーションに不可欠であるかどうかを調べた結果を示す図である。
図９は、ｃ−ＭＩＲの分子機構を説明する図である。
図１０は、本発明のタンパク質ＨＳＰＣ２４０のアミノ酸配列を示す図である。
図１１は、ＨＳＰＣ２４０が抗原提示関連分子の発現を抑制する作用を有するかフローサイトメトリー法によって調べた結果を示す図である。
図１２（ａ）・（ｂ）は、ｃ−ＭＩＲによるＭＨＣクラスＩＩ分子およびＢ７−２分子の発現抑制が抗原提示機能を抑制する結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
（Ｉ）本発明のタンパク質、及びその遺伝子の構造
本発明者は、前記ＫＳＨＶのＫ３，Ｋ５蛋白のヒトホモログの存在について調査検討を進めた結果、Ｋ３，Ｋ５蛋白の機能ドメインであるＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガーモチーフを持ち、二次構造が類似するヒトホモログとして６つの遺伝子・タンパク質を同定した。
配列番号１、３、５、７、９、及び１１には、それぞれ上記６つの遺伝子ｃ−ＭＩＲ、ＨＳＰＣ２４０、４３１７１、ＸＰ−０５５２７６、ＣＡＤ２８５２９、２０４４５の各塩基配列が、そのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域によってコードされる各アミノ酸配列と共に示される。また、上記６つの遺伝子によってそれぞれコードされるタンパク質の各アミノ酸配列が、配列番号２、４、６、８、１０、及び１２に示される。上記ｃ−ＭＩＲおよびＨＳＰＣ２４０については、それぞれ図１（ａ）および図１０にもアミノ酸配列が示される。図１（ａ）中、「ＴＭ１」はｃ−ＭＩＲの第１膜貫通領域と、「ＴＭ２」は第２膜貫通領域と判定された領域である。ＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガーモチーフは、第１膜貫通領域よりもアミノ末端側に存在する。上記ＨＳＰＣ２４０については、そのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガーモチーフが図１０において下線で示される。
上記ｃ−ＭＩＲについて詳細な解析を進めた結果、後の実施例において詳述するように、その作用・性質について以下の知見が得られた。
（１）ｃ−ＭＩＲは、抗原提示関連分子の１つであるＢ７−２共刺激分子（Ｂ７−２分子）をユビキチン化し、その細胞表面における発現を負に制御する。
（２）Ｂ７−２分子のユビキチン化は、Ｂ７−２分子の迅速なエンドサイトーシスとライソゾームにおける分解とを引き起こす。つまり、ｃ−ＭＩＲは、Ｂ７−２分子をユビキチン化し、これにより、Ｂ７−２分子の迅速なエンドサイトーシスと分解とを誘導する。
（３）ｃ−ＭＩＲは、その膜貫通領域を介してＢ７−２分子の膜貫通領域またはその近傍の細胞内領域に結合する。この結合がＢ７−２分子のユビキチン化に不可欠である。
（４）ｃ−ＭＩＲは、さらに、他の抗原提示関連分子であるＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面における発現をも負に制御する。
（５）ｃ−ＭＩＲは、上記Ｋ３，Ｋ５蛋白と同様にＥ３ユビキチンリガーゼとして機能し、そのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガードメインがリガーゼ活性を持つ触媒部位である。
このように、ｃ−ＭＩＲには、Ｂ７−２分子さらにＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面における発現を負に制御する作用、換言すれば、これら抗原提示関連分子の発現を抑制する免疫抑制作用が認められた。よって、ｃ−ＭＩＲは、このような免疫抑制作用によりヒト免疫系において抗原提示関連分子の発現を調節する調節因子と考えられる。
また、ｃ−ＭＩＲの構造類似分子である上記ＨＳＰＣ２４０についても、機能解析の結果、Ｂ７−２分子の細胞表面における発現を負に制御する作用、換言すれば、抗原提示関連分子の発現を抑制する免疫抑制作用が認められた。同様に、ｃ−ＭＩＲの構造類似分子である残り４つの分子についても抗原提示関連分子の発現を抑制する作用を有している可能性が極めて高く、本発明のタンパク質は、抗原提示関連分子の発現を抑制し、このような免疫抑制作用によりヒト免疫系において抗原提示・免疫認識を調節する調節因子ということができる。
さらに、本発明者は、上記ｃ−ＭＩＲおよびＨＳＰＣ２４０のマウスホモログをクローニングする共に、その機能解析を行った。配列番号１３及び１５には、それぞれ上記ｃ−ＭＩＲおよびＨＳＰＣ２４０のマウスホモログの各塩基配列が、そのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域によってコードされる各アミノ酸配列と共に示される。また、上記２つの遺伝子によってそれぞれコードされるタンパク質の各アミノ酸配列が、配列番号１４及び１６に示される。
上記ｃ−ＭＩＲのマウスホモログについて、Ａ２０細胞にその遺伝子を導入し、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子の各発現を調べた結果、ＭＨＣクラスＩＩ分子の特異的抑制が認められた。また、上記ＨＳＰＣ２４０のマウスホモログについて、Ａ２０．２Ｊ細胞にその遺伝子を導入し、Ｂ７−２分子、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子の各発現を調べた結果、Ｂ７−２分子の特異的抑制が認められた。これらの結果より、上記ｃ−ＭＩＲおよびＨＳＰＣ２４０のマウスホモログについてもヒト遺伝子と同様に、抗原提示関連分子のうちの何れかの分子の発現を特異的に抑制する機能を持っていると考えられる。
さらに、ｃ−ＭＩＲによるＭＨＣクラスＩＩ分子およびＢ７−２分子の特異的抑制は、強力に抗原提示機能を抑制することも明らかとなった。それゆえ、ｃ−ＭＩＲは過剰免疫反応を抑制している可能性が示唆される。これらはウイルス免疫回避分子の起源に興味ある視点を与えるものと考えられ、また、これらの生理機能の解明により新たな免疫制御機構が見えてくるものと考えられる。
尚、本発明のタンパク質は、上記８つの分子に限定されるものではなく、その一部が改変された変異タンパク質であってもよい。即ち、本発明のタンパク質には、（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６に示される何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質、のみならず、（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６に示される何れかのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗原提示関連分子の細胞表面における発現を負に制御するタンパク質、も含まれる。
上記「１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のタンパク質は、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質であり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
また、本発明に係るタンパク質は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等によって本発明のタンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。
本発明の遺伝子は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子であり、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５に示される何れかの塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子、およびその塩基配列の一部を改変した改変遺伝子が含まれる。
また、本発明の「遺伝子」には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。ＤＮＡ・ＲＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡ・ＲＮＡは、センス鎖となるコード鎖であっても、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖であってもよい（アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬物として利用できる）。また、本発明の遺伝子配列の一部を利用して得られるｓｉＲＮＡも有用である。
さらに、本発明の「遺伝子」は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
さらに、本発明に係る遺伝子は、上記配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５に示される塩基配列をＯＲＦ領域として有する遺伝子に限定されるものではなく、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子が含まれる。なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
上記ハイブリダイゼーションは、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズし難くなる）。
（ＩＩ）本発明のタンパク質、及びその遺伝子の利用方法（有用性）
Ｂ７−２分子は、抗原提示細胞（樹状細胞、Ｂ細胞等）の表面にてＴ細胞への抗原提示を助け、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間の免疫シナプス形成のモジュレーターとして機能する。免疫シナプス形成はＴ細胞を活性化させる。また、Ｂ７−２分子によるシグナル伝達は、自己免疫疾患の進行に関係している。
本発明のタンパク質は、上記Ｂ７−２分子などの抗原提示関連分子の発現を抑制する免疫抑制作用を有し、ヒト免疫系において免疫認識に重要な抗原提示を調節する調節因子と考えられることから、本発明のタンパク質、及びその遺伝子は、ヒト免疫制御機構の解明に有用なばかりでなく、医学上および産業上種々の利用が可能である。例えば、免疫抑制剤として免疫抑制を効率良く人為的に行う方法の開発などにも利用でき、さらに、細胞、臓器移植の際の拒絶反応の抑制、自己免疫疾患の治療などに本発明のタンパク質・遺伝子は応用可能である。
また、本発明のタンパク質、及びその遺伝子の哺乳類ホモログは、モデル動物を用いた免疫抑制効果を調べる実験等に有用であり、このような哺乳類ホモログも本発明に含まれる。例えば、マウスなどの小動物を用いて拒絶反応モデルを作製し、免疫抑制効果をｉｎ ｖｉｖｏにて検討する実験等に有用である。実際、本発明者は、上記ｃ−ＭＩＲおよびＨＳＰＣ２４０のマウスホモログをクローニングし、その機能解析を行ったところ、前述のとおり、ヒト遺伝子と同様にＢ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を特異的に抑制する機能が認められた。
さらに、本発明のタンパク質、及びその遺伝子は、薬剤の候補分子（創薬ターゲット）のスクリーニングに有用である。例えば、（１）本発明のタンパク質の作用を調節する物質のスクリーニング方法、あるいは、（２）本発明のタンパク質と同様に、Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子等の抗原提示関連分子の細胞表面における発現を負に制御する作用を有する物質のスクリーニング方法、等に利用可能である。上記（１）の本発明のタンパク質の作用を調節する物質とは、例えば、本発明のタンパク質と標的分子（Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子等）との結合を阻害し、本発明のタンパク質の免疫抑制作用を阻害する物質や、あるいは反対に、本発明のタンパク質の免疫抑制作用を高める物質等が挙げられる。このような物質は、免疫疾患の治療薬や診断薬として利用可能であり、そのスクリーニング方法も本発明に含まれる。
本発明のスクリーニング方法としては、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従来公知の種々の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。例えば、上記ｃ−ＭＩＲは、その膜貫通領域を介してＢ７−２分子の膜貫通領域またはその近傍の細胞内領域に結合し、この結合がＢ７−２分子のユビキチン化に不可欠である（後の実施例参照）ことから、試験管内反応系（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｓｙｓｔｅｍ）において、下記（１）〜（３）のいずれかの物質と下記（４）〜（７）のいずれかの物質とを発現させ、両分子の結合を阻害する分子等を候補分子の中からＥＬＩＳＡ法等によって検出するスクリーニング方法などが挙げられる。
（１） 上記ｃ−ＭＩＲなどの本発明のタンパク質
（２） 本発明のタンパク質の部分タンパク質であって、全長タンパク質のアミノ酸配列中、少なくともその膜貫通領域を含む部分タンパク質
（３） 上記（１）のタンパク質または上記（２）の部分タンパク質の改変体
（４） Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子
（５） Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の改変体
（６） Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の部分タンパク質であって、全長タンパク質のアミノ酸配列中、少なくともその膜貫通領域またはその近傍の細胞内領域を含む部分タンパク質
（７） 上記▲６▼の部分タンパク質の改変体
上記「（タンパク質の）改変体」とは、当該タンパク質の１個または数個（好ましくは７個以下、より好ましくは５個以下、さらに好ましくは３個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された改変体をいい、当該タンパク質がＨｉｓやＭｙｃ等のタグによって標識される場合や、当該タンパク質を蛍光タンパク質（ＧＦＰ・ルシフェラーゼ等）または他のタンパク質と融合させる場合、当該タンパク質にリン酸化や糖鎖結合等により修飾を施す場合などをも含む意味で用いている。
勿論、本発明のスクリーニング方法は、上記の方法に限定されるものではなく、ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｓｙｓｔｅｍでのスクリーニングではなく、培養細胞等を用いて細胞内でスクリーニングを行ってもよい。
そのほか、（１）ｃ−ＭＩＲ等の本発明のタンパク質の膜貫通領域や、Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の膜貫通領域またはその近傍の細胞内領域をカラムに固定してこれと結合する物質を検索する方法や、（２）免疫沈降−免疫ブロット法を用いてｃ−ＭＩＲとＢ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子との結合を阻害する物質を検索する方法など、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従来公知の種々の方法を本発明のスクリーニング方法に適用可能である。
さらに、本発明のスクリーニング方法においては、ヒト以外のタンパク質、例えば、マウスホモログやラットホモログ、その他の生物の各ホモログを用いてスクリーニングを行ってもよい。
（ＩＩＩ）本発明の組換え発現ベクター等
本発明の組換え発現ベクターは、前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする本発明の遺伝子を含むものであり、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５に示される何れかの塩基配列を有するｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。
本発明の形質転換体は、前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする本発明の遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、動物個体を含む意味である。対象となる動物は、特に限定されるものではないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどの哺乳動物が例示される。特に、マウスやラット等の齧歯目動物は、実験動物・病態モデル動物として広く用いられており、なかでも近交系が多数作出されており、受精卵の培養、体外受精等の技術が整っているマウスが実験動物・病態モデル動物として好ましく、ノックアウトマウス等は、上記タンパク質ｃ−ＭＩＲやそのホモログの更なる機能解析、これらのタンパク質が関与する病気の診断方法の開発や、その治療方法の開発などに有用である。
本発明の遺伝子検出器具は、本発明の上記遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いている。遺伝子検出器具は、種々の条件下での本発明の遺伝子の発現パターンの検出・測定などに利用できる。本発明の遺伝子検出器具としては、例えば、本発明の遺伝子と特異的にハイブリダイズする上記プローブを基盤（担体）上に固定化したＤＮＡチップ等が挙げられる。
本発明の抗体は、前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得られる抗体である。本発明の抗体は、本発明のタンパク質の検出・測定などに利用でき、その他、診断用・治療用などに利用できる可能性がある。
（ＩＶ）本発明に係る遺伝子、タンパク質等の取得方法
〔ＩＶ−１：遺伝子の取得方法〕
本発明に係る遺伝子を取得する方法は、特に限定されるものではなく、前述の開示された配列情報等に基づいて種々の方法により、上記各遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングすることができる。
例えば、上記各ｃＤＮＡ配列の一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ヒト又はマウスのゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記各ｃＤＮＡ配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。また、上記スクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。
上記スクリーニングによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成およびその塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、本発明に係る遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認することができる。
また、上記プローブの配列を、ヒトｃ−ＭＩＲおよびその類似分子の間で良好に保存されている領域（例えば、ＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガードメイン）の中から選択し、ヒトやマウス、その他の生物のゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、上記ｃ−ＭＩＲと同様の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる可能性が高い。
本発明に係る遺伝子を取得する方法は、上記スクリーニング法以外にも、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法がある。例えば、上記各ｃＤＮＡ配列のうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてヒト又はマウスのゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に係る遺伝子を含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
〔ＩＶ−２：タンパク質の取得方法〕
本発明に係るタンパク質の取得する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、上記各ｃＤＮＡ配列を導入した組換え発現ベクターを作製し、周知の方法により大腸菌や酵母等の微生物又は動物細胞などに組み入れて形質転換体として、そのｃＤＮＡがコードするタンパク質を発現させ精製することで、本発明に係るタンパク質を容易に取得することができる。
尚、このように宿主に外来遺伝子を導入する場合、外来遺伝子の発現のため宿主内で機能するプロモーターを組み入れた発現ベクター及び宿主には様々なものが存在するので、目的に応じたものを選択すればよい。産生されたタンパク質を取り出す方法は、用いた宿主、タンパク質の性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のタンパク質を精製することが可能である。
変異タンパク質を作製する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、部位特異的突然変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ １５２，２７１−２７５（１９９５）他）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製法を用いて、上記各ｃＤＮＡの塩基配列において、１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるように改変を加えることによって作製することができる。また、変異タンパク質の作製には、市販のキット（例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ ストラタジーン社製）を利用してもよい。
上記のように作製された変異タンパク質が、野生型と同様の活性・機能を有する例は既に多数知られており、一方、その活性・機能に異常を来すように変異を導入し変異タンパク質を作製することも既に多く行われている。例えば、後の実施例において作製した変異タンパク質ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲ（ｃ−ＭＩＲのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガー領域に変異を導入したタンパク質）は、標的分子をユビキチン化することができなかった。
〔ＩＶ−３：遺伝子検出器具〕
遺伝子検出器具は、本発明の遺伝子における一部の塩基配列又はその相補配列をプローブとして用いたものである。例えば、基盤（担体）上にオリゴヌクレオチド（プローブ）を固定化してなるＤＮＡチップが挙げられる。ここで「ＤＮＡチップ」とは、主として、合成したオリゴヌクレオチドをプローブに用いる合成型ＤＮＡチップを意味するが、ＰＣＲ産物などのｃＤＮＡをプローブに用いる貼り付け型ＤＮＡマイクロアレイをも包含するものとする。
プローブとして用いる配列は、ｃＤＮＡ配列の中から特徴的な配列を特定する従来公知の方法によって決定することができ、例えば、ＳＡＧＥ：Ｓｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１２６８，１９９７；Ｃｅｌｌ ８８：２４３，１９９７；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４８４，１９９５；Ｎａｔｕｒｅ ３８９：３００，１９９７；米国特許第５，６９５，９３７号）などを挙げることができる。
尚、ＤＮＡチップの製造には、公知の方法を採用すればよい。例えば、オリゴヌクレオチドとして合成オリゴヌクレオチドを使用する場合には、フォトリソグラフィー技術と固相法ＤＮＡ合成技術との組み合わせにより、基盤上で該オリゴヌクレオチドを合成すればよい。一方、オリゴヌクレオチドとしてｃＤＮＡを用いる場合には、アレイ機を用いて基盤上に貼り付ければよい。
また、一般的なＤＮＡチップと同様、パーフェクトマッチプローブ（オリゴヌクレオチド）と、該パーフェクトマッチプローブにおいて一塩基置換されたミスマッチプローブとを配置して遺伝子の検出精度をより向上させてもよい。さらに、異なる遺伝子を並行して検出するために、複数種のオリゴヌクレオチドを同一の基盤上に固定してＤＮＡチップを構成してもよい。
〔ＩＶ−４：組換え発現ベクター及び形質転換体〕
組換え発現ベクターは、本発明の遺伝子を含むものである。ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。
本発明の遺伝子がホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ホスト細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと本発明の遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとしてホスト細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明の遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、本発明に係るタンパク質を融合タンパク質として発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係るタンパク質をＧＦＰ融合タンパク質として発現させてもよい。
上記ホスト細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、ヒト又はマウス由来の細胞をはじめとして、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐａｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、各種哺乳動物（ラット、ウサギ、ブタ、サル等）の培養細胞、あるいは、キイロショウジョウバエ、カイコガ等の昆虫の培養細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
上記発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
〔ＩＶ−５：抗体〕
抗体は、本発明のタンパク質、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得られる抗体である。公知の方法としては、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗらの「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８））、岩崎らの「単クローン抗体ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ，講談社（１９９１）」」に記載の方法が挙げられる。こうして作製した抗体は、本発明のタンパク質の検出に有効である。
以下、本発明のタンパク質であるｃ−ＭＩＲ、さらにＨＳＰＣ２４０について行った機能解析の結果について、図面を参照しながら説明する。
〔実施例１：カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）のＫ３，Ｋ５蛋白の機能・構造ホモログとしてのｃ−ＭＩＲの同定〕
セレーラゲノミクス社のデータベースから、ＫＳＨＶのＫ３，Ｋ５蛋白のヒトホモログを検索した。その結果、アミノ酸配列全体のレベルでは、Ｋ３，Ｋ５蛋白と高い相同性を持つ配列は見つからなかったが、一つのクローンｈＣＰ３６２７９は、Ｋ３，Ｋ５蛋白と、二次構造、ＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガー、および当該ジンクフィンガーの位置が共通していた。ｈＣＰ３６２７９のアミノ末端側の配列がデータベースでは欠けていたので、キャップトラッピング（ｃａｐ−ｔｒａｐｐｉｎｇ）法を用いた５’ＲＡＣＥ解析を行うことにより、ＮＫ細胞株ＹＴＳからｈＣＰ３６２７９の全長アミノ酸配列を決定した。その配列を図１（ａ）に示す（同配列は、配列表の配列番号２にも示される）。図中、下線のＴＭ１、ＴＭ２は、ＰＨＤｈｔｍプログラムによって予測された膜貫通領域であり、他の下線は、ＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガー構造に重要なアミノ酸残基である。ＲＴ−ＰＣＲ解析により、この転写産物は、ＢＪＡＢ細胞および２９３Ｔ細胞においても見出された。
本発明者は、この新規タンパク質を「ｃｅｌｌｕｌａｒ ＭＩＲ（ｃ−ＭＩＲ）」と命名した。そして、このｃ−ＭＩＲとＫ３，Ｋ５蛋白との機能的類似性を調べるため、エレクトロポレーション法によりＨｉｓタグ付のｃ−ＭＩＲを一過性にＢＪＡＢ細胞に発現させ、免疫認識に重要な抗原提示関連分子の細胞表面における発現をｔｗｏ−ｃｏｌｏｒフローサイトメトリー法によって解析した。その結果を図１（ｂ）に示す。
図中、ＭＨＣ Ｉ、ＩＣＡＭ−１、Ｂ７−２は、抗原提示関連分子であり、それぞれＭＨＣクラスＩ分子、ＩＣＡＭ−１分子、Ｂ７−２分子の表面発現レベルを調べた結果である。上記実験では、ＧＦＰ−ｃ−ＭＩＲベクターをＢＪＡＢ細胞にトランスフェクションさせ、導入後２４時間してから上記各分子の表面発現レベルおよびＧＦＰの発現レベルをフローサイトメトリー法によって解析した。図の縦軸はＭＨＣクラスＩ分子、ＩＣＡＭ−１分子、Ｂ７−２分子の表面発現レベルを、横軸はＧＦＰの発現レベルをそれぞれ示す。
同図に示すように、ｃ−ＭＩＲの発現が高くなるにつれてＢ７−２分子の細胞表面における発現は負に制御された（つまり、発現が抑制された）が、ＭＨＣクラスＩ分子およびＩＣＡＭ−１分子の発現は負に制御されなかった。また、Ｆｌａｇタグ付のｃ−ＭＩＲを発現させて調べた場合も、同様の結果が得られた（データ示さず）。
さらにｃ−ＭＩＲの詳細な機能解析のため、ｃ−ＭＩＲを恒常的に過剰発現するようＢＪＡＢ細胞を改変し（この細胞を以下、「ｃ−ＭＩＲ細胞」という）、種々の抗体を用いたフローサイトメトリー法によって抗原提示（免疫認識）関連分子の細胞表面における発現を検討した。その結果を図２に示す。
図中、ＩＣＡＭ−１、Ｂ７−２、ＣｌａｓｓＩ、ＣｌａｓｓＩＩ（ＤＲ）は、抗原提示関連分子であり、それぞれＩＣＡＭ−１分子、Ｂ７−２分子、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）分子の表面発現レベルを調べた結果である。また図中、ｃ−ＭＩＲは、遺伝子導入によりｃ−ＭＩＲを発現させた上記ｃ−ＭＩＲ細胞について調べた結果であり、Ｃｏｎｔは、そのような発現をさせていない対照用のＢＪＡＢ細胞について調べた結果であり、Ｍｅｒｇｅは、両者の結果を重ね合わせたものである（ｃ−ＭＩＲ細胞の結果を白抜きで示す）。
同図に示すように、Ｂ７−２分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面における発現は顕著に負に制御されたが、ＭＨＣクラスＩ分子およびＩＣＡＭ−１分子は負に制御されなかった。このように、新規タンパク質ｃ−ＭＩＲには、Ｂ７−２分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を特異的に抑制する作用が認められた。
〔実施例２：上記ｃ−ＭＩＲはＢ７−２分子の迅速なエンドサイトーシスとライソゾームによる分解を誘導する〕
上記ｃ−ＭＩＲによってＢ７−２分子の発現がどのように抑制されるのかその抑制機構を調べるために、Ｂ７−２分子の蛋白合成、分解、移動を検討した。そのため、ＢＪＡＢ細胞（Ｃｏｎｔ）およびｃ−ＭＩＲ細胞（ｃ−ＭＩＲ）を、３５Ｓメチオニンと３５Ｓシステインとによって３０分間パルス標識した後、所定期間（０ｈ，１ｈ，３ｈ，６ｈ）追跡した。各期間経過後、細胞を溶解し、抗Ｂ７−２抗体（上パネル）または抗ＭＨＣ Ｉ抗体（下パネル）で免疫沈降した結果を図３（ａ）に示す。
Ｂ７−２分子はグリコシル化の程度が高いため、成熟Ｂ７−２分子は未成熟なものよりゆっくりと移動した。一方、成熟ＭＨＣ Ｉ分子は未成熟なものよりゆっくり移動することはなかったが、これはおそらくグリコシル化の程度が低いためと考えられる。また、同図に示すように、追跡開始時（０時）に対照細胞（Ｃｏｎｔ）およびｃ−ＭＩＲ細胞（ｃ−ＭＩＲ）の両細胞で観察された未成熟Ｂ７−２分子の量はほぼ同じであったが、対照細胞（Ｃｏｎｔ）では成熟Ｂ７−２分子の量は６時間まで実質的に減少しなかったのに対して、ｃ−ＭＩＲ細胞（ｃ−ＭＩＲ）では１時間後すでに成熟Ｂ７−２分子の量はかなり少なかった。この結果は、ｃ−ＭＩＲによってＢ７−２分子の急速な分解が誘導されることを示すものである。
標的分子の急速な分解は、ＫＳＨＶのＫ３，Ｋ５蛋白を発現するＢＪＡＢ細胞においても観察され、この分解はライソゾームで起こることが報告されている。そこで、ｃ−ＭＩＲによって誘導されるＢ７−２分子の分解がライソゾームで起こるのかどうかを検討した。実験では、ｃ−ＭＩＲ細胞を１０μＭ ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１で２〜４時間処理した後、抗Ｂ７−２抗体（上パネル）または抗アクチン抗体（下パネル）でイムノブロット解析に供した。その結果を図３（ｂ）に示す。ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１で細胞を処理すると、ｖａｃｕｏｌａｒ Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅを阻害することによりライソゾーム内のｐＨが上がる。その結果、同図に示すように、Ｂ７−２蛋白の発現は安定的に増加した。
さらに、ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１で処理した後、図３（ａ）の実験と同様にパルス追跡（ｐｕｌｓｅ−ｃｈａｓｅ）解析を行うことによって、ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１がＢ７−２分子の分解を阻害する結果が得られた（図３（ｃ）参照：図中「Ｂａｆｉｌｏ＋」はｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１で処理したもの、一方「Ｂａｆｉｌｏ−」は対照用のＤＭＳＯで処理したもの）。これらの結果は、ｃ−ＭＩＲがＢ７−２分子を標的としてライソゾームにて分解させることを示すものである。
次に、Ｂ７−２分子の細胞内動態をＥｎｄｏ−Ｈ（ｅｎｄｏ−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ Ｈ）による消化実験によって調べた。Ｂ７−２分子があるグリカンで修飾されると、Ｅｎｄｏ−Ｈの消化に耐性となるが、それはＢ７−２分子が少なくとも中間ゴルジに到達していることを示している。実験では、ＢＪＡＢ細胞（Ｃｏｎｔ）またはｃ−ＭＩＲ細胞（ｃ−ＭＩＲ）を３５Ｓメチオニンと３５Ｓシステインとによって３０分間パルス標識し、１５〜３０分追跡した。各期間経過後、細胞を０．１％ＳＤＳ含有溶解バッファーにて溶解し、抗Ｂ７−２抗体で免疫沈降した。その後、各サンプルは、Ｅｎｄｏ−Ｈ（＋）またはなし（−）で消化され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された。その結果を図３（ｄ）に示す。図中、★印はＥｎｄｏ−Ｈ耐性のＢ７−２分子を示す。同図に示すように、３０分後、対照細胞およびｃ−ＭＩＲ細胞において、Ｅｎｄｏ−Ｈ耐性のＢ７−２分子の量はほぼ同じであり、Ｂ７−２分子の細胞内動態はＢ７−２分子が中間ゴルジに達するまで影響を受けていないことがこの実験結果より示された。
上記の実験結果より、ｃ−ＭＩＲによってＢ７−２分子のエンドサイトーシスが亢進する可能性が考えられた。この可能性を確かめるため、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）−ｂａｓｅｄエンドサイトーシス解析を行った。その結果を図４（ａ）に示す。
上記実験では、ＢＪＡＢ細胞（Ｃｏｎｔ）およびｃ−ＭＩＲ細胞（ｃ−ＭＩＲ）を４℃にてＰＥ共役抗Ｂ７−２抗体で染色し、非結合抗体除去のためＰＢＳで洗浄した後、３７℃で１０分間または３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞内へ内部化していない抗体を酸性溶液で除去し、内部化した蛍光シグナルをフローサイトメーターで測定した。これらの結果は、同図の「１０」「３０」と記したパネルに示される。蛍光のバックグラウンドレベルを決定するため、ＰＥ共役抗Ｂ７−２抗体で染色後、細胞の表面にある抗体を酸性溶液で除去し、バックグラウンドレベルをフローサイトメーターで測定した。この結果は、同図の「０」と記したパネルに示されると共に、「１０」「３０」のパネルにも太線で示される。「Ｐｒｅ」と記したパネルは、細胞表面にある抗体を除去する前のＢ７−２分子の細胞表面発現レベルを示すものである。
同図に示すように、１０分間インキュベーションすると、ｃ−ＭＩＲ細胞では細胞内部への顕著な蛍光シグナルが観察された。一方、対照細胞では細胞内へのシグナルは観察されなかった。また、３０分間インキュベーション後、ｃ−ＭＩＲ細胞では細胞内への蛍光シグナルに増加は認められず、対照細胞では依然として細胞内へのシグナルは観察されなかった。これらの結果は、ｃ−ＭＩＲによって誘導されるＢ７−２分子の急速なエンドサイトーシスが１０分以内に起こることを示すものである。また、同様の実験をＭＨＣクラスＩ分子（ＭＨＣ Ｉ）について行ったところ、ｃ−ＭＩＲ細胞ではＭＨＣ Ｉのエンドサイトーシスは亢進しなかった（データ示さず）。
さらに、ｃ−ＭＩＲによって誘導されるＢ７−２分子の急速なエンドサイトーシスを確認するため、ｃ−ＭＩＲ細胞および対照細胞を３７℃でＦＩＴＣ標識した抗Ｂ７−２抗体と２時間反応させた後、共焦点顕微鏡によってＢ７−２分子の局在を調べた。その結果を図４（ｂ）に示す。同図に示すように、ｃ−ＭＩＲ細胞では細胞内にＢ７−２分子が観察されたが、対照細胞では観察されなかった。以上の結果は、ｃ−ＭＩＲがＢ７−２分子の迅速なエンドサイトーシスを誘導することを示すものである。
〔実施例３：Ｂ７−２分子の膜貫通領域および細胞質領域が、ｃ−ＭＩＲの標的の特異性に関係している〕
本発明者は、ＫＳＨＶのＫ３，Ｋ５蛋白の機能に関し、ＣＤ８キメラ蛋白を用いた解析によって、標的分子の膜貫通領域および細胞質領域が、Ｋ３，Ｋ５蛋白を介した標的分子のダウンレギュレーション（発現抑制）に十分であることを以前示した。そこで、Ｂ７−２分子の同領域がｃ−ＭＩＲを介したＢ７−２分子のダウンレギュレーションに十分であるか調べるため、ＨＬＡ−Ａ２およびＢ７−２分子についてＣＤ８キメラ蛋白を作製した（これらキメラ蛋白をそれぞれ「ＣＤ８／Ａ２」「ＣＤ８／Ｂ７−２」という）。ＣＤ８／Ａ２、ＣＤ８／Ｂ７−２は、それぞれ、ＣＤ８αの細胞外領域のカルボキシル末端にＨＬＡ−Ａ２分子およびＢ７−２分子の膜貫通領域および細胞質領域を含んでいる。これらのＣＤ８キメラ蛋白を対照用のＢＪＡＢ細胞またはｃ−ＭＩＲ細胞に発現させ、ＣＤ８の細胞表面における発現をフローサイトメトリー法によって調べた。その結果を図５に示す。
ＢＪＡＢ細胞表面にはＣＤ８は発現していないため、上記の実験により標的分子のダウンレギュレーションを良好に検出できる。図５に示すように、いずれのＣＤ８キメラ蛋白も対照用のＢＪＡＢ細胞では効率良く発現した。一方、ｃ−ＭＩＲ細胞ではＣＤ８／Ａ２キメラ蛋白は十分発現したが、ＣＤ８／Ｂ７−２キメラ蛋白は十分な発現が見られなかった。この結果は、Ｂ７−２分子の膜貫通領域および細胞質領域が、ｃ−ＭＩＲの標的の特異性に関与していることを示すものである。
〔実施例４：ｃ−ＭＩＲは、Ｅ３ユビキチンリガーゼとして機能する〕
前述のように、ＫＳＨＶのＫ３，Ｋ５蛋白については、ＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガーがＥ３ユビキチンリガーゼの機能ドメインであることが示されている。そこで、ｃ−ＭＩＲのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガーがＥ３ユビキチンリガーゼ活性を持つかどうか調べるため、Ｋ３蛋白においてそのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガー（８〜５７番目のアミノ酸残基）をｃ−ＭＩＲのもの（７８〜１３７番目のアミノ酸残基）に置換したキメラ蛋白を作製した（このキメラ蛋白を以下「Ｚｎ ＭＩＲ−Ｋ３」という）。そして、このキメラ蛋白がＫ３の標的分子であるＭＨＣ Ｉに対するリガーゼ活性を持ち、その細胞表面における発現を抑制するかどうか調べた。あわせて、ｃ−ＭＩＲのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガー領域に変異を導入し、これをＫ３のＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガーと置換したキメラ蛋白も作製した（このキメラ蛋白を以下「ｍＺｎ ＭＩＲ−Ｋ３」という）。上記の変異とは、亜鉛（Ｚｎ）結合部位の４つのシステイン（８０，８３，１２３，１２５番目）をセリンに置換したものである。これらのキメラ蛋白と野生型のＫ３蛋白をＡ７細胞に発現させ、ＭＨＣ Ｉの表面発現をｔｗｏ−ｃｏｌｏｒフローサイトメトリー法によって調べた。その結果を図６（ａ）に示す。
同図に示すように、Ｚｎ ＭＩＲ−Ｋ３蛋白は、ＭＨＣ Ｉの表面発現を十分ダウンレギュレーションした。ｍＺｎ ＭＩＲ−Ｋ３蛋白では、ＭＨＣ Ｉの表面発現をダウンレギュレーションできなかったため、このダウンレギュレーションはＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰドメイン依存的といえる。この結果は、ｃ−ＭＩＲがＥ３ユビキチンリガーゼ活性を持つことを示すものである。
このことをさらに確かめるため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ自己ユビキチン化解析を行った。具体的には、ｃ−ＭＩＲのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰドメインの野生型または変異型をＧＳＴのカルボキシル末端に融合させ、精製したこのＧＳＴ融合蛋白をＡＴＰ、フリーのユビキチン、Ｅ１、Ｅ２（ＵｂｃＨ５ａ）の混合物を用いて自己ユビキチン化解析に供した。その結果を図６（ｂ）に示す。同図に示すように、野生型のＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰドメインを含むＧＳＴ融合蛋白（図中、ｃ−ＭＩＲ）では、抗ユビキチン抗体（α−Ｕｂｉ）により自己ユビキチン化（ｕｂ−ＧＳＴ）がはっきりと観察されたが、ＧＳＴ単独のもの（図中、ＧＳＴ）および変異型のＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰドメインを含むＧＳＴ融合蛋白（図中、ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲ）では、自己ユビキチン化は観察されなかった。この結果は、ｃ−ＭＩＲのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰドメインがＥ３ユビキチンリガーゼ活性を持つことを示すものである。
さらに、Ｂ７−２分子がｃ−ＭＩＲによってユビキチン化されるか調べるため、ＨＡで標識したユビキチンおよび野生型（ｗｔ）のｃ−ＭＩＲ（または、ＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰドメインを改変した変異型のｃ−ＭＩＲ（ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲ））とＢ７−２分子とを共発現させた。そして、各細胞溶解物を抗Ｂ７−２抗体で免疫沈降した後、抗ＨＡ抗体（上段パネル）または抗Ｂ７−２抗体（中央パネル）を用いたイムノブロット解析に供した。その結果を図６（ｃ）に示す。同図に示すように、野生型のｃ−ＭＩＲ（図中、ｃ−ＭＩＲ）を発現させた場合、抗ＨＡ抗体および抗Ｂ７−２抗体のブロット結果は、ユビキチン化されたＢ７−２（ｕｂ−Ｂ７−２）をはっきりと示したが、野生型のｃ−ＭＩＲを発現させなかった場合（図中、Ｃｏｎｔ）および変異型のｃ−ＭＩＲを発現させた場合（図中、ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲ）では、ユビキチン化は観察されなかった。尚、各細胞溶解物におけるｃ−ＭＩＲおよびｍＺｎ ｃ−ＭＩＲの発現量を確認するため、抗Ｈｉｓ抗体でブロットした結果を下段のパネルに示す。
以上の結果、ｃ−ＭＩＲは、そのＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガードメインを介して、Ｂ７−２分子に対するＥ３ユビキチンリガーゼとして機能することが示された。
〔実施例５：ユビキチン化は、ｃ−ＭＩＲを介したＢ７−２分子のダウンレギュレーションに不可欠である〕
これまで、ｃ−ＭＩＲが、▲１▼Ｂ７−２分子の細胞表面における発現の調節因子（モジュレーター）であること、▲２▼Ｂ７−２分子に対する新規Ｅ３ユビキチンリガーゼであることを示した。しかし、ユビキチン化が、Ｂ７−２分子の細胞表面における発現のダウンレギュレーションに不可欠であるかどうかは不明確である。この点を確かめるため、野生型のｃ−ＭＩＲ（ｗｔ−ｃ−ＭＩＲ）とＢ７−２分子をユビキチン化できなかったｍＺｎ ｃ−ＭＩＲ変異体をエレクトロポレーション法によってＢＪＡＢ細胞に一過性に発現させ、ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒフローサイトメトリー法によってＢ７−２分子の細胞表面における発現を調べた。その結果を図７（ａ）に示す。同図に示すように、ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲは、Ｂ７−２分子の発現を抑制しなかった。
次に、ＣＤ８キメラ蛋白を用いて次のような実験を行った。ＫＳＨＶのＫ５蛋白は、標的分子の細胞質に位置するリジン残基をユビキチン化することが知られている。そこで、ｃ−ＭＩＲについても同様であるか調べるため、前述のＣＤ８／Ｂ７−２キメラ蛋白においてＢ７−２分子の細胞質領域に位置するリジン残基のすべてをＰＣＲベースの変異導入法によってアルギニンに改変し、さらに、そのアミノ末端にＦｌａｇタグでエピトープ標識した（このキメラ蛋白を「Ｂ７−ＫＲ」という）。さらに、上記改変を施さないＣＤ８／Ｂ７−２キメラ蛋白についても、Ｆｌａｇタグでエピトープ標識した（このキメラ蛋白を「ｗｔ−Ｂ７」という）。
上記Ｂ７−ＫＲまたはｗｔ−Ｂ７を、ＨＡタグ付のユビキチンおよびｃ−ＭＩＲと共に２９３Ｔ細胞に共発現させ、図６（ｃ）と同様の実験に供した。その結果を図７（ｂ）に示す。同図に示すように、抗ＨＡ抗体および抗Ｆｌａｇ抗体によるブロット解析の結果、ｗｔ−Ｂ７ではｃ−ＭＩＲを介したユビキチン化（図中、ｕｂ−Ｆｌａｇ−ＣＤ８ ｃｈｉｍｅｒａ）が観察されたが、Ｂ７−ＫＲではｃ−ＭＩＲを介したユビキチン化は観察されなかった。
Ｂ７−２分子のユビキチン化と、その発現抑制（ダウンレギュレーション）との関係を調べるため、ｗｔ−Ｂ７およびＢ７−ＫＲをＢＪＡＢ細胞（対照細胞）およびｃ−ＭＩＲ細胞に発現させ、ＣＤ８の表面発現レベルをフローサイトメトリー法により比較した。その結果を図７（ｃ）に示す。同図に示すように、ｗｔ−Ｂ７の発現はｃ−ＭＩＲ細胞において抑制されたが、Ｂ７−ＫＲの発現はｃ−ＭＩＲ細胞において抑制されなかった。この結果は、Ｂ７−２分子の細胞質領域のリジン残基のユビキチン化がそのダウンレギュレーションに必要であることを示すものである。
〔実施例６：分子間の相互作用を通じてのＢ７−２分子の特異的ユビキチン化とダウンレギュレーション〕
Ｅ３ユビキチンリガーゼは、標的分子への結合を通じて機能すると考えられるので、次に、ｃ−ＭＩＲとＢ７−２との分子間相互作用を調べた。図７（ｂ）の実験に用いたｗｔ−Ｂ７と同じ分子であるＣＤ８−Ｂ７とｃ−ＭＩＲとを２９３Ｔ細胞に単独または共発現させた後、その細胞溶解物を抗Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降し、ｃ−ＭＩＲを認識する抗Ｖ５抗体でイムノブロット解析に供した。その結果を図８（ａ）の上段パネルに示す。
同図に示すように、ｃ−ＭＩＲおよびＣＤ８−Ｂ７を共発現させた場合のみ、ｃ−ＭＩＲに対応する特異的バンドが検出されたので、ｃ−ＭＩＲとＢ７−２との分子間相互作用が確認された。また、ＣＤ８キメラ蛋白の発現量、ｃ−ＭＩＲの発現量を、それぞれ抗Ｆｌａｇ抗体（中央パネル）、抗Ｖ５抗体（下段パネル）で確認した。
ところで、ＫＳＨＶのＫ３，Ｋ５蛋白については、その膜貫通領域が標的分子の膜貫通領域との結合を介して特異的ターゲッティングに関与することが報告されている。仮にｃ−ＭＩＲと標的分子との結合が同様であるとすれば、前記ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲ変異体は野生型の膜貫通領域を有しているので、標的分子との結合能を有すると考えられる。この仮説を確かめるため、ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲを図８（ａ）と同じ実験に供した。その結果を図８（ｂ）に示す。同図に示すように、ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲおよびＣＤ８−Ｂ７を共発現させた場合のみ、ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲに対応する特異的バンドが検出された。尚、図８（ａ）（ｂ）の両実験において、ｍＺｎ ｃ−ＭＩＲおよびＣＤ８−Ｂ７の結合体のほうがｃ−ＭＩＲおよびＣＤ８−Ｂ７の結合体より容易に検出されたが、これは野生型のｃ−ＭＩＲ結合体の不安定性によるものと考えられる。
ｃ−ＭＩＲによるＢ７−２分子の特異的ダウンレギュレーションが分子間の相互作用によるものか調べるため、前記ＣＤ８／Ａ２キメラ蛋白を用いた実験を行った。ＣＤ８／Ａ２キメラ蛋白の細胞表面における発現はｃ−ＭＩＲ細胞においてダウンレギュレートされなかったからである（図５参照）。ＣＤ８／Ａ２はそのアミノ末端にＦｌａｇエピトープタグを持つよう改変された（このキメラ蛋白を「ＣＤ８−Ａ２」という）。そして、ＣＤ８−Ａ２またはＣＤ８−Ｂ７を２９３Ｔ細胞においてｍＺｎ ｃ−ＭＩＲと共発現させ、免疫沈降−イムノブロット法によって分子間相互作用を調べた。尚、このように本実験ではｍＺｎ ｃ−ＭＩＲを用いたが、これはｃ−ＭＩＲ結合体の検出が容易なためである。本実験では、ＣＤ８−Ａ２発現細胞およびＣＤ８−Ｂ７発現細胞の各細胞溶解物を抗ＨＡ抗体または抗Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降し、抗Ｖ５抗体（上段）または抗Ｆｌａｇ抗体（中央）でイムノブロット解析を行った。その結果を図８（ｃ）に示す。両細胞の溶解物について抗Ｖ５抗体でイムノブロット解析を行った結果についてもあわせて下段に示される。
同図に示すように、ＣＤ８−Ｂ７とｍＺｎ ｃ−ＭＩＲとは共沈降したが、ＣＤ８−Ａ２とｍＺｎ ｃ−ＭＩＲとは共沈降しなかった。この結果は、分子間相互作用がｃ−ＭＩＲを介したＢ７−２分子の特異的ダウンレギュレーションに不可欠であることを示すものである。
次に、分子間相互作用とユビキチン化との関係を調べるため、上記ＣＤ８−Ａ２およびＣＤ８−Ｂ７について図７（ｂ）と同様の実験に供した。その結果を図８（ｄ）に示す。同図に示すように、ＣＤ８−Ａ２と比べてＣＤ８−Ｂ７では十分なユビキチン化（ｕｂ−ＣＤ８ ｃｈｉｍｅｒａ）が観察された。この結果は、分子間相互作用がｃ−ＭＩＲを介したユビキチン化およびその後の標的分子のダウンレギュレーションに不可欠であることを示すものである。
以上の実験結果から考えられるｃ−ＭＩＲの分子機構を図９に示す。同図に示すように、ｃ−ＭＩＲはＢ７−２分子と膜貫通部位を介して結合する。その後、ＰＨＤ／ＬＡＰドメイン（ＰＨＤ）に結合しているＥ２ユビキチンコンバーティング酵素（Ｅ２）より、ユビキチン（Ｕｂｉ）がＢ７−２分子の細胞内領域にあるそれぞれのリジン残基（Ｋ）に輸送され、Ｂ７−２分子がユビキチン化される。ユビキチン化されたＢ７−２分子は、細胞表面からエンドサイトーシスされ、ライソゾームへ運ばれ分解される。
〔実施例７：上記ｃ−ＭＩＲの機能的・構造的類似分子ＨＳＰＣ２４０〕
上記ｃ−ＭＩＲと同族の新規ヒトＥ３ユビキチンリガーゼについて探索を行った結果、ｃ−ＭＩＲの構造類似分子として５つの遺伝子・タンパク質を同定した。図１０には、このうちＨＳＰＣ２４０のアミノ酸配列が示される（配列表の配列番号４にも同配列が示される）。図中、下線はＢＫＳ−ＰＨＤ／ＬＡＰジンクフィンガーモチーフを示す。このＨＳＰＣ２４０が抗原提示関連分子の発現を抑制するかどうか調べた。具体的には、ＢＪＡＢ細胞にＨＳＰＣ２４０を一過性に発現させ、ＭＨＣクラスＩ分子（ＭＨＣ Ｉ）、ＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ ＩＩ／ＤＲ）分子、ＩＣＡＭ−１分子、Ｂ７−２分子の細胞表面における発現をフローサイトメトリー法により調べた。その結果を図１１に示す。同図に示すように、ＨＳＰＣ２４０の発現によってＢ７−２分子の発現は顕著に抑制されたが、ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ、ＩＣＡＭ−１各分子の発現は抑制されなかった。この結果は、ＨＳＰＣ２４０が、Ｂ７−２分子の細胞表面における発現を特異的に抑制すること、および、ｃ−ＭＩＲと同様に抗原提示関連分子の発現を抑制する作用を持つことを示すものである。
〔実施例８：ｃ−ＭＩＲによるＭＨＣクラスＩＩ分子およびＢ７−２分子の発現抑制は、強力に抗原提示機能を抑制する〕
ｃ−ＭＩＲ発現Ａ２０．２Ｊ細胞を作成し、ＯＶＡ３２３−３３９特異的Ｉ−Ａｄ拘束性Ｔｈ１ ｃｌｏｎｅ，４２−６Ａ用いて、ＯＶＡまたはＯＶＡ３２３−３３９ペプチドに対する抗原提示機能をＩＬ−２の産生を指標に調べた。図１２（ａ）にＯＶＡを用いた結果、図１２（ｂ）にＯＶＡ３２３−３３９ペプチドを用いた結果を示す。点線はコントロール細胞の結果を示し、実線はｃ−ＭＩＲ過剰発現細胞の結果を示す。また、ＯＶＡは２４時間、ペプチドは６時間後にＥＬＩＳＡにて培養上清中のＩＬ−２を測定した。この結果から明らかなように、ＯＶＡまたはＯＶＡ３２３−３３９ペプチドに対する抗原提示機能は著明な抑制が認められた。
【産業上の利用の可能性】
本発明は、Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面における発現を負に制御する哺乳類由来の新規タンパク質とその利用に関するものであり、前述したとおり、新たな免疫抑制方法の開発、細胞、臓器移植の際の拒絶反応の抑制、自己免疫疾患の治療、さらに新薬開発などに利用できるほか種々の有用性を有する。したがって、本発明は、各種医薬品産業等、広く医療の発展に寄与するものと考えられる。
【配列表】
【図２】
【図５】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）記載の哺乳類由来のタンパク質。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６に示される何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６に示される何れかのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗原提示関連分子の細胞表面における発現を負に制御するタンパク質。
【請求項２】
抗原提示関連分子であるＢ７−２分子の細胞表面における発現を負に制御する請求の範囲１記載のタンパク質。
【請求項３】
Ｂ７−２分子をユビキチン化する請求の範囲２記載のタンパク質。
【請求項４】
抗原提示関連分子であるＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面における発現を負に制御する請求の範囲１〜３の何れか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
ヒト又はマウス由来のＥ３ユビキチンリガーゼである請求の範囲１〜４の何れか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
請求の範囲１〜５の何れか１項に記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項７】
請求の範囲１〜５の何れか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項８】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５に示される何れかの塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する請求の範囲７記載の遺伝子。
【請求項９】
１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、抗原提示関連分子の細胞表面における発現を負に制御するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１０】
請求の範囲７〜９の何れか１項に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項１１】
請求の範囲７〜９の何れか１項に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項１２】
請求の範囲７〜９の何れか１項に記載の遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いた遺伝子検出器具。
【請求項１３】
請求の範囲１〜５の何れか１項に記載のタンパク質、または、請求の範囲７〜９の何れか１項に記載の遺伝子を含む免疫抑制剤。
【請求項１４】
請求の範囲１〜５の何れか１項に記載のタンパク質の作用を調節する物質のスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求の範囲１〜５の何れか１項に記載のタンパク質と同様に、抗原提示関連分子の細胞表面における発現を負に制御する作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項１６】
下記（１）〜（３）の何れかの物質と、下記（４）〜（７）の何れかの物質とを用いることを特徴とする請求の範囲１４又は１５記載のスクリーニング方法。
（１） 請求の範囲１〜５の何れか１項に記載のタンパク質
（２） 請求の範囲１〜５の何れか１項に記載のタンパク質の部分タンパク質であって、全長タンパク質のアミノ酸配列中、少なくともその膜貫通領域を含む部分タンパク質
（３） 上記（１）のタンパク質または上記（２）の部分タンパク質の改変体
（４） Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子
（５） Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の改変体
（６） Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の部分タンパク質であって、全長タンパク質のアミノ酸配列中、少なくともその膜貫通領域またはその近傍の細胞内領域を含む部分タンパク質
（７） 上記（６）の部分タンパク質の改変体
【請求項１７】
請求の範囲１４〜１６の何れか１項に記載のスクリーニング方法を用いて得られた免疫疾患治療薬。
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）記載の哺乳類由来のタンパク質。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６に示される何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６に示される何れかのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗原提示関連分子の細胞表面における発現を負に制御するタンパク質。
【請求項２】
抗原提示関連分子であるＢ７−２分子の細胞表面における発現を負に制御する請求の範囲１記載のタンパク質。
【請求項３】
Ｂ７−２分子をユビキチン化する請求の範囲２記載のタンパク質。
【請求項４】
抗原提示関連分子であるＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面における発現を負に制御する請求の範囲１〜３の何れか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
ヒト又はマウス由来のＥ３ユビキチンリガーゼである請求の範囲１〜４の何れか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
請求の範囲１〜５の何れか１項に記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項７】
請求の範囲１〜５の何れか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項８】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５に示される何れかの塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する請求の範囲７記載の遺伝子。
【請求項９】
１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、抗原提示関連分子の細胞表面における発現を負に制御するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１０】
請求の範囲７〜９の何れか１項に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項１１】
請求の範囲７〜９の何れか１項に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項１２】
請求の範囲７〜９の何れか１項に記載の遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いた遺伝子検出器具。
【請求項１３】
請求の範囲１〜５の何れか１項に記載のタンパク質、または、請求の範囲７〜９の何れか１項に記載の遺伝子を含む免疫抑制剤。
【請求項１４】
請求の範囲１〜５の何れか１項に記載のタンパク質の作用を調節する物質のスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求の範囲１〜５の何れか１項に記載のタンパク質と同様に、抗原提示関連分子の細胞表面における発現を負に制御する作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項１６】
下記（１）〜（３）の何れかの物質と、下記（４）〜（７）の何れかの物質とを用いることを特徴とする請求の範囲１４又は１５記載のスクリーニング方法。
（１） 請求の範囲１〜５の何れか１項に記載のタンパク質
（２） 請求の範囲１〜５の何れか１項に記載のタンパク質の部分タンパク質であって、全長タンパク質のアミノ酸配列中、少なくともその膜貫通領域を含む部分タンパク質
（３） 上記（１）のタンパク質または上記（２）の部分タンパク質の改変体
（４） Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子
（５） Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の改変体
（６） Ｂ７−２分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の部分タンパク質であって、全長タンパク質のアミノ酸配列中、少なくともその膜貫通領域またはその近傍の細胞内領域を含む部分タンパク質
（７） 上記（６）の部分タンパク質の改変体
【請求項１７】
請求の範囲１４〜１６の何れか１項に記載のスクリーニング方法を用いて得られた免疫疾患治療薬。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６１１０６
【国際公開日】平成１６年７月２２日（２００４．７．２２）
【発行日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５６４４６８（Ｐ２００４−５６４４６８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１２１７３
【国際出願日】平成１５年９月２４日（２００３．９．２４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１４年８月２４日 東京大学医科学研究所主催の「あわじ感染症・免疫国際フォーラム」において文章をもって発表
【出願人】（８００００００５７）財団法人新産業創造研究機構 (99)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年７月２２日（２００４．７．２２）
【発行日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１２１７３
【国際出願日】平成１５年９月２４日（２００３．９．２４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１４年８月２４日 東京大学医科学研究所主催の「あわじ感染症・免疫国際フォーラム」において文章をもって発表
【出願人】（８００００００５７）財団法人新産業創造研究機構 (99)
【Ｆターム（参考）】
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