ＢＢＢ−特異的タンパク質およびその断片を同定する方法
【課題】 ＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片を同定できる方法を提供する。
【解決手段】 脳毛細血管の内皮細胞中のＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片の存在を同定する方法において、脳から単離した新鮮な脳毛細血管の内皮を通常の方法による酵素消化により前精製処理し、得られた消化物を存在する赤血球とアポトーシス細胞を実質的に破壊し脳毛細血管の内皮細胞の少なくとも７０％を生きている状態で維持する溶血性緩衝液で処理し、脳毛細血管の内皮細胞とサブトラクション法に用いる組織からサブトラクション法のｃＤＮＡライブラリーを調製し、一以上のディファレンシャル・ハイブリダイゼーションによりｃＤＮＡのサブトラクション法を実施し、サブトラクション法のｃＤＮＡライブラリーからのクローンを、それら個々の発現型に関するディファレンシャル・ハイブリダイゼーションによって照合し、サブトラクション法のｃＤＮＡライブラリーからのＢＢＢ−特異的タンパク質についてｃＤＮＡ配列を完成し、調査したクローンの発現パターンを、新鮮な培養した脳毛細血管の内皮細胞間で比較し、それにより、ＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片の存在を同定する。
【解決手段】 脳毛細血管の内皮細胞中のＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片の存在を同定する方法において、脳から単離した新鮮な脳毛細血管の内皮を通常の方法による酵素消化により前精製処理し、得られた消化物を存在する赤血球とアポトーシス細胞を実質的に破壊し脳毛細血管の内皮細胞の少なくとも７０％を生きている状態で維持する溶血性緩衝液で処理し、脳毛細血管の内皮細胞とサブトラクション法に用いる組織からサブトラクション法のｃＤＮＡライブラリーを調製し、一以上のディファレンシャル・ハイブリダイゼーションによりｃＤＮＡのサブトラクション法を実施し、サブトラクション法のｃＤＮＡライブラリーからのクローンを、それら個々の発現型に関するディファレンシャル・ハイブリダイゼーションによって照合し、サブトラクション法のｃＤＮＡライブラリーからのＢＢＢ−特異的タンパク質についてｃＤＮＡ配列を完成し、調査したクローンの発現パターンを、新鮮な培養した脳毛細血管の内皮細胞間で比較し、それにより、ＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片の存在を同定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳毛細血管内皮細胞（brain microvessel endothelial cells；ＢＭＥＣ）中のＢＢＢ−特異的タンパク質（ＢＢＢ＝blood brain barrier）またはその断片を同定する方法に関する。また、本発明は、この方法で得られるタンパク質またはその断片にも関する。さらに、本発明は、この方法で得られる遺伝子と転写物との双方にも関する。
【背景技術】
【０００２】
脳の毛細血管の内皮細胞は、血液と器官としての脳との間に選択的透過性を有する関門、すなわち、血液脳関門（ＢＢＢ）を形成する。毛細血管の個々の内皮細胞は、管腔の周囲に配置され、円筒形の管状腔を構成する。個々の内皮細胞と内皮細胞に結合する他の種類の細胞との間が密接に接合することによって、多数の物質が規制されることなく受動的にこの細胞層を通過することが防止される。
【０００３】
脳は、その機能を維持するため、安定な内部環境に高度に依存している。安定な内部環境は、血液脳関門によって保証されている。これは、血液と脳との間の物質交換も制御している。特異的な輸送体が、この交換を仲介している。上記関門の形成は、脳の毛細血管の内皮細胞（brain micro-vessel endothelial cells、ＢＭＥＣ）における特異的タンパク質の発現により、高度に分化した細胞型である他の内皮細胞との比較によって認められている。血液脳関門に特異的なタンパク質は、既に知られている。例えば、グルコース輸送体であるＧＬＵＴ−１は、ＢＭＥＣに特異的であって、脳のエネルギー補給を保証している。
【０００４】
血液脳関門の選択的透過能の性質によっては、中枢神経系の多様な疾患の治療が困難になる場合がある。これは、多数の医薬が血液脳関門を通過することが難しく、脳におけるそれらが作用する場所に低濃度でしか到達できないからである。そのため、脳で作用する医薬を開発するためには、血液脳関門の機能モードとそこに含まれるタンパク質を知ることが非常に重要である。特に問題とされるのは、上記タンパク質の知識を得ることである。上記タンパク質は、他の種類の細胞と比較して脳毛細血管の内皮細胞が顕著に多量または顕著に少量を生産するか、またはスプライシング変異により生じるか、あるいは特異的な転写後修飾を生じる。
【０００５】
脳毛細血管の内皮細胞の研究は、様々な問題を伴っている。第１に、ヒトの脳におけるタンパク質発現を研究するためには、利用できる脳の材料が充分ではない。これは、とりわけ倫理的な理由が大きい。また、普遍的な情報とするには、脳を収集する特定の個人による違いが一般に大きすぎる。例えば、年齢、性別、体重、人種その他の原因により違いが生じる。さらに、検査材料は、死後の数時間以内に除去されなければならない。この期間を過ぎると、酵素的な劣化と変性処理によって、細胞中のタンパク質組成に顕著な変化が起きるからである。加えて、脳毛細血管の内皮細胞のタンパク質発現に関する従来の方法による研究では、直接研究するために充分な純度の検査材料を得ることができなかった。公知の方法に従い脳毛細血管の内皮細胞を単離する際に、一般に他の種類の細胞と混合したものが得られ、そのような試料によるタンパク質発現パターンの研究では、その結果を脳毛細血管の内皮細胞のみに起因させるには充分ではない。
【０００６】
【非特許文献１】アルツチュル，エス・エフ（Altschul, S.F.）, ギシュ，ダブリュー（Gish, W.）, ミラー，ダブリュー（Miller, W.）,マイヤーズ，イー・ダブリュー（Myers, E.W.）,およびリップマン，ディー・ジェイ（Lipman, D.J.）(1990): “ベイシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール（Basic local alignment search tool）”, J. Mol. Biol. 215, 403-410.
【非特許文献２】バーンボイム，エイチ・シー（Birnboim, H.C.）およびドリー，ジェイ（Doly, J.） (1979): “組み替えプラスミドＤＮＡをスクリーニングするための迅速なアルカリ抽出操作（A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA）”, Nucl. Acids Res. 7: 1513-1522.
【非特許文献３】クセルゾ外（Cserzo et al.） (1997): “原核生物の細胞膜タンパク質における膜内外α−へリックスの予測；高密度配列表面法（Prediction of transmembrane alpha-helices in procariotic membrane proteins: the dense alignment surface method）”, Prot. Eng. 10: 673-676.
【非特許文献４】デリールスニジュデル，ダブリュー（Deleersnijder, W.）, ホン，ジー（Hong, G.）, コルトブリンズ，アール（Cortvrindt, R.）, ポイリエル，シー（ Poirier, C.）, チルザノウスキー，ピー（Tylzanowski, P.）, ピトイス，ケイ（Pittois, K.）, バン，マーク，イー（Van Marck, E.）, およびメルガエルト，ジェイ（Merregaert, J.） (1996): “ｃＤＮＡライブラリーのサブトラクション法を用いる軟骨−骨原性分化のマーカーの単離。膜内在性タンパク質の新規な多重遺伝子族に属する遺伝子の分子クローニングと特徴付け（Isolation of markers for chondro-osteogenic differentiation using cDNA library subtraction. Molecular cloning and characterization of a gene belonging to a novel multigene family of integral membrane proteins）”, J. Biol. Chem. 271, 19475-19482.
【非特許文献５】カワマタ，エイチ（Kawamata, H.）, ナカシロ，ケイ（Nakashiro, K.）, ウチダ，ディー（Uchida, D.）, ヒノ，エス（Hino, S.）, オモテハラ，エフ（Omotehara, F.）, ヨシダ，エイチ（Yoshida, H.）, およびサトー，エム（Sato M. ）(1998): “ヒトの唾液腺ガン細胞における新規な抗ガン剤、ベスナリノンを用いる治療におけるＴＳＣ−２２の誘発（Induction of TSC-22 by treatment with a new anti-cancer drug, vesnarinone, in a human salivary gland cancer cell）”, Brit. J. Cancer 77: 71-78.
【非特許文献６】ケスター，エイチ・エイ（Kester, H.A.）, ブランチェロット，シー（Blanchelot, C.）, デン・ヘルトグ，ジェイ（den Hertog, J.）, バン・デル・サグ，ピー・ティー（van der Saag, P.T.）, およびバン・デル・ブルグ，ビー（van der Burg, B.） (1999): “形質転換成長因子βで刺激されたクローン２２は、ホモまたはヘテロの二量体化が可能なロイシン・ジッパー・タンパク質群の一つであって、転写抑制活性を有する（Transforming growth factor-β-stimulated clone-22 is a member of a family of leucine zipper proteins that can homo- and hetrodimerize and has transcriptional repressor activity）”, J. Biol. Chem. 274: 27439-27447.
【非特許文献７】リー，ジェイ・ワイ（Li, J.Y.）, ボード，アール・ジェイ（Boado, R.J.）, およびパルドリッジ，ダブリュー・エム（Pardridge, W.M.） (2001): “血液脳関門のゲノム学（Blood-brain barrier genomics）”, J. Cereb. Blood Flow Metabol. 21, 61-68.
【非特許文献８】マービン，ケイ・ダブリュー（Marvin, K.W.）, フジモト，ダブリュー（Fujimoto, W.）, ジェッテン，エイ・エム（Jetten, A.M.） (1995): “ＰＭＰ２２関連遺伝子に伴う新生鱗状細胞の同定と特徴付け（Identification and characterization of a novel squamous cell-associated gene related to PMP22）”, J. Biol. Chem. 270, 28910-28916.
【非特許文献９】ピアソン，ダブリュー・アール（Pearson, W.R.）およびリップマン，ディー・ジェイ（Lipman, D.J.） (1988): “生物学的配列解析の改良されたツール（Improved Tools for Biological Sequence Analysis）”, PNAS 85, 2444-2448.
【非特許文献１０】サムブロック，ジェイ（Sambrook, J.）, フリッチュ，イー・エフ（Fritsch, E.F.）, およびマニアティス・ティー（Maniatis, T.）, 分子クローニング：実験マニュアル（in Molecular Clonin: A Laboratory Manual.）Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3 (1989).
【非特許文献１１】セボールド，イー（Sebald, E.）, クルーガー，アール（Krueger, R.）, キング，エル・エム（King, L.M.）, コーン，ディー・エイチ（Cohn, D.H.）, およびクラコウ・ディー（Krakow, D.） (2003): “軟骨ｃＤＮＡライブラリから、ＡＤＰリボシル化類似因子遺伝子群の新規構成要素の単離（Isolation of a new member of the ADP-ribosylation like factor gene family, ARL8, from a cartilage cDNA library）”, Gene 311: 147-151.
【非特許文献１２】シェブチェンコ・エイ（Shevchenko A.）, スニャエブ，エス（Sunyaev S.）, ロボダ・エイ（Loboda A.）, シェブチェンコ・エイ（Shevchenko A.）, ボーク・ピー（Bork P.）, エンス・ダブリュー（Ens W.）およびスタンディング・ケイ・ジー（Standing K.G.） (2001); “ＭＡＬＤＩ四極飛行時間法マススペクトルとＢＬＡＳＴ相同性調査による非配列ゲノムを伴う組織のプロテオームの図表化（Charting the Proteomes of Organisms with Unsequenced Genomes by MALDI-Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry and BLAST Homology Searching）”; Anal. Chem. 73: 1917-1926.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片を、あいまいな部分がないように同定できる方法を提供することである。この方法は、脳毛細血管の内皮細胞のＢＢＢ−特異的タンパク質および遺伝子を同定するために特に適している。さらに、この方法は、簡便かつ穏やかに実施できる。その上、本発明の方法は、タンパク質またはその断片に対して選択的である。タンパク質またはその断片は、脳毛細血管の内皮細胞で主にまたは選択的に生産され、対照組織および結合している種類の細胞では生産されない。さらに、本発明の方法で同定されたタンパク質およびその断片は、血液脳関門の機能不全を伴う疾患の診断マーカーとして適している。その上、本発明の方法で同定されたタンパク質およびその断片は、血液脳関門の機能不全を伴う疾患の治療のための医薬の生産に適している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に従い、上記目的は、脳毛細血管の内皮細胞中のＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片の存在を同定する方法であって、ａ）脳から単離した新鮮な脳毛細血管の内皮細胞を、通常の方法で酵素消化により前精製処理し、ｂ）工程ａ）で得られた消化物を、存在する赤血球とアポトーシス細胞を実質的に破壊し、脳毛細血管の内皮細胞の少なくとも７０％を生きている状態で維持する溶血性緩衝液で処理し、ｃ）工程ｂ）で得られた生成物を、任意にさらに精製処理し、ｄ）脳毛細血管の内皮細胞とサブトラクション法に用いる組織から、サブトラクション法のｃＤＮＡライブラリーを調製し、ｅ）一もしくはそれ以上のディファレンシャル・ハイブリダイゼーションにより、ｃＤＮＡについてサブトラクション法を実施し、ｆ）上記サブトラクション法のｃＤＮＡライブラリーからのクローンを、それら個々の発現パターンに関するディファレンシャル・ハイブリダイゼーションによって照合し、ｇ）上記サブトラクション法のｃＤＮＡライブラリーからのＢＢＢ−特異的タンパク質についてｃＤＮＡ配列を完成し、ｈ）調査したクローンの発現パターンを、新鮮な培養した脳毛細血管の内皮細胞間で比較し、それにより、ＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片の存在を同定することを特徴とする方法により達成された。
【０００９】
さらに本発明は、脳毛細血管の内皮細胞中のＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片の存在を同定する方法であって、ａ）脳から単離した新鮮な脳毛細血管の内皮細胞を、通常の方法で酵素消化により前精製処理し、ｂ）工程ａ）で得られた消化物を、存在する赤血球とアポトーシス細胞を実質的に破壊し、脳毛細血管の内皮細胞の少なくとも７０％を生きている状態で維持する溶血性緩衝液で処理し、ｃ）工程ｂ）で得られた生成物を、任意にさらに精製処理し、ｄ）工程ｃ）で得られた生成物を、適当な緩衝液に溶解し、ｅ）等電点電気泳動を実施し、ｆ）等電点電気泳動からの試料を、分子量に従って二次元分離し、ｇ）相違点を同定して、単離し、ｈ）工程ｇ）の単離物について、質量スペクトル分析を実施し、ｉ）特異性のデータベース分析により、その評価を行うことを特徴とする方法に関する。
【００１０】
本発明に従う方法では、ＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片を、あいまいな部分がなく、高い信頼性で同定することができる。本発明は、この方法で単離したタンパク質に加えて、それらのタンパク質をコードする転写物と遺伝子との双方にも関する。特に本発明は、この方法で単離された配列番号５、１４、１９、２３、２７、３３、５３の配列を有するタンパク質にも関する。
【００１１】
さらに本発明は、血液脳関門の機能不全による疾患を診断または治療するための薬剤または医薬を生産するため、本発明の方法で同定されたタンパク質およびその断片のそれぞれを使用することに関する。
【発明の効果】
【００１２】
驚くべきことに、上記処理工程の組み合わせによって、脳毛細血管の内皮細胞におけるＢＢＢ−特異的タンパク質をあいまいな部分がなく同定できることが判明した。本発明に従い単離したタンパク質は、ＢＢＢに特異的である。本発明に従い単離したタンパク質は、そのＢＢＢ特異性により、ＢＢＢにおいて、ＢＢＢに対して機能する。この機能とは、例えば、関門機能、搬送機能、ＢＢＢの栄養補給に関連する機能、密着結合タンパク質としての機能、酵素活性その他である。このようにして、これらのタンパク質の存在を同定することから始めて、ＢＢＢにおけるそれらの特異的な機能を推定で特定することが可能である。これにより、ＢＢＢを通して物質を選択的に搬送できるとの事実に基づき、全く新規な治療上の概念に到達することが可能になる。さらに、本発明に従う方法で同定されたタンパク質は、特に、治療上の介入の被検になり得る。本発明に従う方法により初めて、脳に関する疾患に対する治療の概念を発展させることができる。さらに、以上のように説明した方法に従い同定されるタンパク質の変化の検出は、ＢＢＢの機能不全に基づく疾患の診断に採用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
培養したＢＭＥＣに代えて、新鮮な状態で単離したＢＭＥＣ（一次細胞）の使用は、本発明に従う方法において、特に重要である。驚くべきことに、培養しているＢＭＥＣが非常に迅速に脱分化すること、言い換えると、それらのＢＢＢとしての性質が非常に早く失われることが観察された。さらに、脳毛細血管の内皮細胞を培養すると、血液脳関門に特異的なタンパク質の発現は、ほんの数次の継代後に、強力なダウンレギュレーションを起こして、完全に消えてしまう。このような状況では、ＢＭＥＣに特異的なタンパク質について、信頼性の高い単離と同定は不可能である。そのほかに、純粋な生きた細胞を単離して、細胞の特殊性を保証し、好ましくない作用や、アポトーシス（細胞消滅）による結果であるかのように偽る作用を防止する必要がある。
【００１４】
本発明に従う方法では、生きている生体の個々の器官から、手術により脳物質を除去する。その方法では、ヒト生体からの脳の試料も、例えば、脳手術により得ることができる。ただし、完全な脳またはその一部を生体から除去するのは、死の直後が好ましく、有利でもある。脳の除去は、死後１時間以内が好ましく、３０分以内がより好ましく、１５分以内がさらに好ましく、５分以内がさらにまた好ましい。脳は、様々な動物、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマその他から除去できる。最近では、ブタの脳が、脳毛細血管の内皮細胞の分析に関してヒトの脳の良好なモデルとなり、それらの結果をヒトに移しやすいことが知られている。
【００１５】
ブタの脳は、解剖学的および形態学的な観点で、ヒトの脳に非常に類似している。さらに、タンパク質と核酸との双方の段階で、ヒトとブタとの間の配列の相同性は、一般に非常に高い。そのため、ブタの材料で得られた結果は、高い信頼性を伴って、ヒトに移すことができ、その逆も可能である。このように、ヒトとブタとは、ヒトとマウスやラットのような古典的な生体モデルよりも、系統発生学的に、より密接な関係があることが知られている。
【００１６】
驚くべきことに、低張性溶血性緩衝液は、赤血球を溶血するだけではなく、一般に細胞死を招き、低張性ショックによってアポトーシス細胞を破裂させることが判明している。本発明に従う方法で使用する溶血性緩衝液は、脳毛細血管の内皮細胞を、少なくとも７０％、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上維持する。さらに、溶血性緩衝液は、非毒性であり、かつ生理的な領域にｐＨ値を有する必要がある。本発明に従い使用する低張性緩衝液は、イオン強度が０．１〜０．２Ｍであり、一価および二価のアニオンおよびカチオンをそれぞれ含み、７．０〜８．０のｐＨ領域に緩衝能を有する。含まれる全ての物質が、細胞に対して無毒である。よって、健全な細胞は、短時間緩衝液中に存在するだけで損傷を受けることはない。０．１〜０．２Ｍのイオン強度を有する低張性緩衝液は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、アンモニウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、塩素イオンおよび硫酸イオンに加えて、グルコースを含み、７．０〜８．０のｐＨ領域に緩衝能を有することが好ましい。これにより、赤血球と他の活力が異なる細胞との混合物から、脳毛細血管の生きた内皮細胞に富んだ部分を選択することが可能になる。本発明に従い使用する緩衝液は、７．５のｐＨ値において、下記の組成を有することが好ましい。
【００１７】
イオン／物質：最小濃度（ｍＭ）〜最大濃度（ｍＭ）
Ｎａ＋：３０．０〜６０．０
Ｋ＋：５．０〜７．５
ＮＨ４＋：８０．０〜１００．０
Ｃａ２＋：１．０〜２．０
Ｍｇ２＋：６．０〜９．０
Ｃｌ−：１２５．０〜１７５．０
ＨＣＯ３−：４．５〜６．５
Ｈ２ＰＯ４−：０．５〜２．５
ＳＯ４２−：０．３〜０．６
ＨＰＯ４２−：０．４〜０．７
グルコース：１．５〜３．０
【００１８】
使用する溶血性緩衝液は、下記の組成を有することがさらに好ましい。
【００１９】
ＮａＣｌ：３０ｍＭ〜５０ｍＭ
ＫＣｌ：４．５ｍＭ〜５．５ｍＭ
ＮＨ４Ｃｌ：８０ｍＭ〜１００ｍＭ
ＣａＣｌ２：１．０ｍＭ〜２．０ｍＭ
ＭｇＣｌ２：０．６ｍＭ〜０．８ｍＭ
ＭｇＳＯ４：０．３ｍＭ〜０．６ｍＭ
ＮａＨＣＯ３：４．５ｍＭ〜６．５ｍＭ
ＮａＨ２ＰＯ４：０．２ｍＭ〜０．４５ｍＭ
Ｎａ２ＨＰＯ４：０．４ｍＭ〜０．６５ｍＭ
ＫＨ２ＰＯ４：０．１ｍＭ〜０．１５ｍＭ
グルコース：１．５ｍＭ〜３．０ｍＭ
【００２０】
緩衝液は、下記の組成を有することが特に好ましい。
【００２１】
ＮａＣｌ：３９ｍＭ
ＫＣｌ：５．１ｍＭ
ＮＨ４Ｃｌ：８８ｍＭ
ＣａＣｌ２：１．６ｍＭ
ＭｇＣｌ２：０．６９ｍＭ
ＭｇＳＯ４：０．４６ｍＭ
ＮａＨＣＯ３：５．６ｍＭ
ＮａＨ２ＰＯ４：０．３３ｍＭ
Ｎａ２ＨＰＯ４：０．５３ｍＭ
ＫＨ２ＰＯ４：０．１２ｍＭ
グルコース：２．２４ｍＭ
【００２２】
上記のような溶血性緩衝液は、通常は、リンパ球およびリンパ球からのＲＮＡをそれぞれ単離するため、最初にここで赤血球を溶血するために使用されている。現在に至るまで、本発明に従う緩衝液の組成や、緩衝液をアポトーシス細胞の溶血に使用することは、いずれも報告されていない。アポトーシスにおいてより強力に発現される遺伝子の転写物を同時に増幅することなく、ＢＢＢ−特異的転写物を増幅するため、アポトーシス細胞の選択的な溶血は、本発明において重要な意味を有する。細胞を単離する他の方法では、アポトーシスの問題は、単離した細胞を培養することで回避している。しかし、脳毛細血管の内皮細胞は、培養中にその性質が変化し、別の遺伝子発現パターンに移行する。それゆえ、本発明に従う最終的な溶血工程を経て細胞を調製する方法により、脳毛細血管の新鮮な内皮細胞を充分な量で単離することが初めて可能になる。
【００２３】
生体から脳の除去後、脳は実際的な方法で適切な緩衝液中に移し、可能な限り迅速に、冷却しながら次の処置の実験室まで搬送する。単離すべき脳毛細血管の内皮細胞は、主に灰白質に位置している。さらに細胞の精製処理を行う前に、灰白質を残りの脳の部分から機械的に切断することが有利な方法である。そのため、最初に髄膜を剥がし、灰白質を削り落とし、小さな断片に切り詰め、適当な培地に移す。適当な培地とは、例えば、Ｍ１９９培地（Gibco/BRL, Grand Island, NY）やアールの緩衝液（Earle’s buffer）である。実際的な方法では、さらに精製を行う前に、得られた灰白質の質量を決定する。
【００２４】
アールの緩衝液（ｐＨ：７．３）
ＮａＣｌ：１１７．２ｍＭ
ＫＣｌ：５．３ ｍＭ
ＮａＨ２ＰＯ４×２Ｈ２Ｏ：１．０ｍＭ
ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ：０．８１ｍＭ
ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ：１．８ｍＭ
グルコース×Ｈ２Ｏ：５．６ｍＭ
【００２５】
本発明に従い、脳毛細血管の内皮細胞の前精製処理は、以下に述べる少なくとも二段階の酵素処理工程を経て脳物質を消化することにより実施する。第１の酵素処理工程では、脳物質を酵素のディスパーゼ（dispase）を用いて消化する。ディスパーゼによる消化は、神経組織の崩壊を起こす。灰白質１グラム当たり５ｍｇのディスパーゼが、量として特に適していることが証明されている。実際的な方法では、ディスパーゼによる消化は、Ｍ１９９培地中で行われる。ただし、他の培地や緩衝液にも、この反応に適しているものがある。同様に調製したディスパーゼ溶液を灰白質の試料に加え、懸濁液を攪拌しながら３７℃でインキュベートする。インキュベート時間は、２乃至４時間、好ましくは３時間が特に有利であることが証明されている。個々の場合における酵素濃度、使用する溶媒と培地のそれぞれ、およびインキュベート時間は、脳毛細血管を取り巻き結合している物質を可能な限り多量に劣化させて崩壊させるように選択すべきである。ただし、同時に条件は、各酵素処理工程において、単離すべき脳毛細血管の内皮細胞に影響が及び、細胞が死ぬ割合を可能な限り少なくし、細胞が損傷を受ける可能性を可能な限り少なくするように調節すべきでもある。
【００２６】
この点に関して、結果として生じる剪断力を可能な限り小さくしておくことが重要である。これは、例えば、脳のかたまりの酵素消化を、攪拌ボトル中でゆっくり連続的に混合することで実現できる。
【００２７】
最初の精製工程におけるディスパーゼ消化の後、デキストラン溶液中での遠心分離により脳毛細血管を得る。この目的のために、従来技術で公知の方法を採用できる。ディパーゼ消化による一定量の細胞懸濁液を、当量の１５％デキストラン溶液と混合し、１０分間振盪し、角度を固定したローター内で、１０℃、８６５０×ｇにて約１０分間遠心分離する方法が最適であることが実証されている。遠心分離後、上澄みを除去し、沈殿物に対して第２の酵素処理を行う。
【００２８】
第２の酵素処理工程では、遠心分離の沈殿物をコラゲナーゼＤ（collagenase D）で消化する。コラゲナーゼＤは、特に、基部の膜を溶解する。実際的な方法では、少なくとも一つのプロテアーゼ阻害剤を第２の酵素処理工程で添加する。この目的のためのプロテアーゼ阻害剤としては、ｐ−トシル−Ｌ−リシン−クロロメチルケトンナトリウム（ＴＬＣＫ）が特に適している。実際的な方法では、第２の酵素処理工程を、３７℃で約１時間攪拌することにより実施する。第２の酵素処理工程では、少なくとも一つのデオキシリボヌクレアーゼ（DNAse）、例えば、ベンゾナーゼ（benzonase）を使用することが特に適していることも実証されている。このようにして、死んだ細胞の消化の間に、放出されたＤＮＡが劣化し、それとは別に懸濁液の粘度を増加させる。
【００２９】
第２の酵素処理工程後、パーコール（Percoll）密度勾配遠心分離による第２の精製処理工程を実施する。密度勾配は、例えば、９．９１ｍｌのパーコール、０．７２ｍｌの１０倍濃度Ｍ１９９培地および１９．３７ｍｌのアールの緩衝液を混合し、超遠心分離機の角度固定ローター内で、４℃にて３７２００×ｇで１時間遠心分離することにより調製できる。第２の酵素処理工程からの細胞懸濁液は、例えば、低速遠心分離、上澄みの除去、遠心分離沈殿物の再懸濁を複数回繰り返すことにより洗浄（例えば、加えた酵素を除去）する。直前の遠心分離工程後、沈殿物を少量の液体、例えば、６ｍｌのＭ１９９培地に取り、超遠心分離機のスイングアウトローター内で、４℃にて１４００×ｇで１０分間遠心分離する。パーコール密度勾配遠心分離では、懸濁した細胞物質が、その密度に従って分離される。通常は、ここに明確に区別される３種のバンドが生じる。最低の密度を有する第１の上方のバンドは、細胞の破片や断片を含む。第２の中間のバンドは、他と比較して、単離すべき脳毛細血管の内皮細胞を含む。最も高い密度を有する第３の低位バンドには、とりわけ赤血球が集まっている。
【００３０】
脳毛細血管の内皮細胞を含む第２のバンドを単離し、本発明に従う次の精製処理を行う。単離は、針を用いてバンドを取り出すか、好ましくは、ピペットで吸い出すことにより実施できる。
【００３１】
脳毛細血管の内皮細胞に到達する前に、パーコール密度勾配遠心分離で得られた第二のバンドの物質が、他の種類の細胞、主に赤血球とアポトーシス細胞を多数含むとの問題がある。現在まで、これらの汚染細胞を脳毛細血管の内皮細胞から穏やかな条件下で分離することは不可能であった。この問題は、驚くべきことに、リンパ球の単離に普通に用いられている溶血性緩衝液を用いて、脳毛細血管の内皮細胞をさらに精製することにより解決できることが判明した。ここで、溶血性緩衝液の組成、処理の継続時間、および処理温度は、赤血球とアポトーシス細胞がほぼ完全に破壊され、脳毛細血管の内皮細胞の大部分が生き残るように選択する。この緩衝液の利点と特徴は、既に述べた通りである。
【００３２】
下記の成分を含む溶血性緩衝液が、本発明に適していることが実証されている。
【００３３】
ＮａＣｌ：３０ｍＭ〜５０ｍＭ
ＫＣｌ：４．５ｍＭ〜５．５ｍＭ
ＮＨ４Ｃｌ：８０ｍＭ〜１００ｍＭ
ＣａＣｌ２：１．０ｍＭ〜２．０ｍＭ
ＭｇＣｌ２：０．６ｍＭ〜０．８ｍＭ
ＭｇＳＯ４：０．３ｍＭ〜０．６ｍＭ
ＮａＨＣＯ３：４．５ｍＭ〜６．５ｍＭ
ＮａＨ２ＰＯ４：０．２ｍＭ〜０．４５ｍＭ
Ｎａ２ＨＰＯ４：０．４ｍＭ〜０．６５ｍＭ
ＫＨ２ＰＯ４：０．１ｍＭ〜０．１５ｍＭ
グルコース：１．５ｍＭ〜３．０ｍＭ
【００３４】
下記の組成を有する溶血性緩衝液は、特に適している。
【００３５】
ＮａＣｌ：３９ｍＭ
ＫＣｌ：５．１ｍＭ
ＮＨ４Ｃｌ：８８ｍＭ
ＣａＣｌ２：１．６ｍＭ
ＭｇＣｌ２：０．６９ｍＭ
ＭｇＳＯ４：０．４６ｍＭ
ＮａＨＣＯ３：５．６ｍＭ
ＮａＨ２ＰＯ４：０．３３ｍＭ
Ｎａ２ＨＰＯ４：０．５３ｍＭ
ＫＨ２ＰＯ４：０．１２ｍＭ
グルコース：２．２４ｍＭ
【００３６】
溶血性緩衝液を添加後、懸濁液を混合し、低速遠心分離により繰り返して洗浄し、適当な培地および緩衝液、例えば、それぞれＭ１９９またはアールの緩衝液、に再懸濁する。精製した脳毛細血管の内皮細胞は、遠心分離で集める。
【００３７】
精製した脳毛細血管の内皮細胞は、ここで、ＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片の存在を同定するため、二つの異なる経路で処理することができる。すなわち、一方はタンパク質による経路であり、他方はゲノムによる経路である。それぞれの場合で、異なるタンパク質、その断片および転写物が、それぞれ、同定および単離することができる。以下において、双方の経路をより詳細に説明する。
【００３８】
［２次元ディファレンシャルゲル電気泳動によるＢＢＢ−特異的タンパク質の同定］
遺伝子生成物の直接的な２次元比較により、脳毛細血管の内皮細胞の完全な所見が得られる。本発明に従い、対照組織を全ての電気泳動で使用する。対照組織は、血液脳関門に特異的な転写物とタンパク質とをそれぞれ選択的に同定することを可能にする組織である。原則として、全ての内皮細胞、例えば、同じ組織の大血管や小血管の内皮細胞や、他の組織（例、心臓、肺、腎臓、肝臓、大動脈他）からの内皮細胞を、対照組織として使用できる。また、培養により得られる脱分化したＢＭＥＣを用いることもできる。ただし、脳毛細血管の内皮細胞に対する対照組織は、別の種類の内皮細胞を用いることが好ましい。大動脈からの内皮細胞が好ましく用いられる。大動脈の内皮細胞は、関門機能を全く示さない。それに加えて、小血管を大血管と比較できるとの利点もある。さらにまた、別の大血管の内皮細胞を用いることもできる。他の条件、例えば、ｐＨ値、成長培地、成長因子（例、サイトカイン）に関して異なる条件で培養した脳毛細血管の内皮細胞も、対照組織として適している。同定したタンパク質の生理学的な意味は、個々の対照組織に対して、脳毛細血管の内皮細胞について知られている性質から判断することができる。本発明では、二種類の明確な細胞型が好ましく使用される。一方は、関門機能を伴う細胞型である新鮮に単離されたＢＭＥＣであり、他方は、ＢＭＥＣに類似する内皮細胞でありながら、関門機能を示さない大動脈からの内皮細胞である。特に、ブタの組織を使用することで、これらの細胞について詳細なタンパク質地図を作製できる。
【００３９】
［試料調製］
最初に、調製した細胞および調製物に含まれる赤血球の部分の活力を決定する必要がある。活力の決定には、懸濁した細胞２０μｌを取り、フルオレセイン二酢酸が機能する溶液（アールの緩衝液中２４μＭ）４μｌおよびヨウ化プロピジウムが機能する溶液（アールの緩衝液中７０μＭ）２μｌを加える。懸濁液を混合して、３７℃で１０分間インキュベートする。細胞を蛍光顕微鏡で確認し、損傷した細胞に対する生きた細胞の比率を決定する。生きた細胞は、緑の蛍光（励起：４５０ｎｍ、放射：５１５ｎｍ）により認識することができる。一方、損傷した細胞は、核を起源とする赤い蛍光（励起：４８８ｎｍ、放射：６１５ｎｍ）により認識される。赤血球の部分は、ベンジジンが機能する溶液（１５ｍＭの塩酸ベンジジン、１２％（ｖ／ｖ）の酢酸、２％（ｖ／ｖ）の過酸化水素）２０μｌを２０μｌの細胞懸濁液に加えることで決定される。試料は混合し、２５℃で５分間インキュベートする。次に、一滴分の細胞をピペットで顕微鏡のスライドに吸い出し、カバーガラスで覆う。この試験では、透過型顕微鏡に青いクリスタルガラスを観察することにより、赤血球が確認できる。赤血球に対する内皮細胞の比率を、計数することにより決定する。生存細胞が９５％以上との生存率と、赤血球の汚染率が５％未満であることを条件に、細胞を次の２次元ゲル電気泳動に使用することができる。
【００４０】
新鮮に単離し、沈殿した細胞の湿潤重量を決定し、５倍容量（例えば、細胞１００ｍｇに緩衝液５００μｌ）のｐＨ６．８の緩衝液Ａ（ＰＩＰＥＳを１０ｍＭ、ＮａＣｌを１００ｍＭ、ＭｇＣｌ２を３ｍＭ、ショ糖を３００ｍＭ、ＥＤＴＡを５ｍＭ、ＰＭＳＦを１ｍＭ、ジギトニンを１５０μＭ）に注意深く再懸濁する。次に、細胞懸濁液をわずかに振盪しながら、氷冷下で２０分間インキュベートする。続いて、遠心分離（４８０×ｇ、４℃、１０分間）を行い、細胞を沈殿させる。上澄みを除去し、次の使用まで−２０℃で保管する。
【００４１】
沈殿を再び、元の湿潤重量の５倍容量のｐＨ７．４の緩衝液Ｂ（ＰＩＰＥＳを１０ｍＭ 、ＮａＣｌを１００ｍＭ、ＭｇＣｌ２を３ｍＭ、ショ糖を３００ｍＭ、ＥＤＴＡを５ｍＭ 、ＰＭＳＦを１ｍＭ、Triton X−１００を０．５％（ｖ／ｖ））に再懸濁し、氷冷下で激しく振盪しながら、３０分間インキュベートする。そして、試料を１０分間の遠心分離（５０００×ｇ、４℃）で沈殿させ、上澄みを除去し、次の使用まで−２０℃で保管する。
【００４２】
さらに沈殿を、元の湿潤重量の１．７倍容量のｐＨ７．４の緩衝液（ＰＩＰＥＳを１０ｍＭ、ＮａＣｌを１０ｍＭ、ＭｇＣｌ２を１ｍＭ、ＰＭＳＦを１ｍＭ、TWEEN-40を１％ （ｖ／ｖ）、デオキシコール酸塩を０．５％（ｗ／ｖ））に再懸濁し、ドーンス（Dounce）ホモジナイザーに移し、５回作動させて破壊する。次に、試料を２ｍｌの反応チューブに再び移し、超音波浴中で１分間インキュベートする。さらに、試料を遠心分離（６７８０×ｇ、４℃、１０分間）で沈殿させ、上澄みを除去し、沈殿を次の使用まで−２０℃で保管する。
【００４３】
沈殿を、その量に応じて２００〜５００リットルのｐＨ８．０の緩衝液（トリスを５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２を１ｍＭ）に再懸濁し、窒素で急速凍結する。その後、試料を超音波浴中で解凍し、引き続き、５〜１０μｌのベンゾナーゼ（２５Ｕ／μｌ）を加え、粘性のある液状でなく均一な状態になるまでインキュベートする。そして、７倍容量の５％（ｗ／ｖ）ＳＴＳ溶液を加え、試料を９０℃で２０分間加熱する。さらに、１０分間の遠心分離（７０００×ｇ、２０℃）を行い不溶性の成分を除去する。上澄みを取り出し、次の使用まで−２０℃で保管する。今回は、沈殿を廃棄してもよい。
【００４４】
上澄みを解凍し、その量に応じて組み合わせて混合する。試料に含まれる洗浄剤を除去するため、試料を１００％アセトン（−３０℃で保管）と２０対８０の比率で混合する。完全に混合後、析出物を少なくとも１時間、−３０℃でインキュベートする。そして、析出したタンパク質を、１５分間、１００００×ｇ、４℃で沈殿させる。上澄みを注ぎだして捨てる。
【００４５】
引き続き、沈殿物を８０％（ｖ／ｖ）アセトン（−３０℃に冷却）で洗浄し、再度、−３０℃でインキュベートする。新たな遠心分離（１５分間、１００００×ｇ、４℃）の後、上澄みを捨て、沈殿を可能な限り少量のソリュビリゼイション緩衝液Ｉ（尿素を７Ｍ、チオ尿素を２Ｍ、ＣＨＡＰＳを４％（ｗ／ｖ））またはII（尿素を８Ｍ、ＣＨＡＰＳを４％（ｗ／ｖ））再懸濁し、試料のタンパク質含量を決定する。この結果により、タンパク質を決定するため、ロティカント（Ｒｏｔｈ）一部と二回蒸留水２部を混合し、直ちに機能する溶液として、不溶性の成分を襞の付いたフィルターで除去する。検量曲線のため、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をソリュビリゼイション緩衝液ＩおよびIIでそれぞれ希釈した液を調製する。ここで、検量溶液のため、濃度を０．２ｍｇ／ｍｌ、０．４ ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌおよび１．０ｍｇ／ｍｌに調整する。それぞれ２０μｌの検量溶液、試料および対照液（ソリュビリゼイション緩衝液ＩおよびII）を１．５ｍｌの反応容器に入れ、ロティカント機能液１ｍｌを加える。ここの反応容器を直ちに反転させて混合する。次に、試料を２５℃で２０分間インキュベートする。試料を１ｍｌのキュベットに移した後、５６０ｎｍの吸収を分光光度計で測定する。試料のタンパク質含量は、検量曲線を調製することで決定できる。
試料の残存する上澄みは、次の使用まで−８℃で保管する。
【００４６】
［等電点電気泳動］
１２種類の電気泳動ゲルのため、４．５ｍｌのソリュビリゼイション緩衝液ＩまたはII（ｐＨ勾配：４．５〜５．５）に２．５ｍｇの試料を溶解したものに、１．１２５ｍｌの電気泳動緩衝液Ｉ（尿素を７Ｍ、チオ尿素を２Ｍ、ＣＨＡＰＳを４％（ｗ／ｖ）、ＤＴＴを９１ｍＭ、ＩＰＧ緩衝液を２．５％）およびII（尿素を８Ｍ、ＣＨＡＰＳを４％（ｗ／ｖ）、２．５％ＩＰＧ緩衝液を９１ｍＭ、ｐＨ勾配：４．５〜５．５）それぞれを加え、超音波浴で１分間処理し、卓上遠心分離機（２００００×ｇ）で５分間遠心分離する。ｐＨ勾配（３．５〜４．５、４．０〜５．０、４．５〜５．５、５．０〜６．０、５．５〜６．７、６．０〜９．０）は、２４ｃｍ長のゲル（Immobiline DryStrip; Amersham Biosciences）として使用する。使用するｐＨ勾配のため、適当なＩＰＧ緩衝液を使用する。
【００４７】
続いて、それぞれの試料４５０μｌを再水化器に吸い出し、二組のピンセットを用いて、インモービリン・ドライストリップ（Immobiline DryStrip）電気泳動ゲルを、ゲル側を下に、気泡が生じないようにしながら溶液の上に置く。ゲルは、パラフィンオイルで覆う。再水化時間は、少なくとも１２時間から、最大で１６時間である。６．０〜９．０のｐＨ勾配で、試料をカップに入れる。そのｐＨ勾配で、試料に代えて、ゲル片を、ソリュビリゼイション緩衝液Ｉ（４．５ｍｌ）と電気泳動緩衝液Ｉ（１．１２５ｍｌ）とのそれぞれの混合物で再水化する。再水化後、それぞれのゲル片を、２４ｃｍのストリップ・ホルダーに移し、さらにカップに入れる。試料カップは、直接、陰極の前に置く。それぞれ２００μｇのタンパク質を含む試料を、ピペットで試料カップに吸い出し、パラフィンオイルで覆ったインモービリン・ドライストリップ・ゲルを重ねる。
【００４８】
電気泳動片は二回蒸留水で湿らせ、それぞれのゲルの末端に置く。次に、これらの試験片に対して電極をつなげる。その後、試料を入れたストリップ・ホルダー６種類のそれぞれを、対応するｐＨ勾配（第１表参照）を有するＥＴＴＡＮ ＩＰＧｐｈｏｒ電気泳動装置（Amersham Biosciences）で電気泳動する。電気泳動が完了後、試験片をピンセットで除き、次の使用まで−８０℃で保管する。
【００４９】
第１表
（等電点電気泳動のプログラム）
────────────────────────────────────────
プログラム １
────────────────────────────────────────
Ｓ１ ５００Ｖ 直線的勾配 １ｈ
Ｓ２ ５００Ｖ 段階的勾配 １ｈ
Ｓ３ １０００Ｖ 段階的勾配 １ｈ
Ｓ４ ８０００Ｖ 直線的勾配 １ｈ
Ｓ５ ８０００Ｖ 段階的勾配 ８８ｋＶｈ
────────────────────────────────────────
プログラム ２
────────────────────────────────────────
Ｓ１ ５００Ｖ 直線的勾配 ０．５ｈ
Ｓ２ ５００Ｖ 段階的勾配 ０．５ｈ
Ｓ３ １０００Ｖ 直線的勾配 ０．５ｈ
Ｓ４ １０００Ｖ 段階的勾配 ０，５ｈ
Ｓ５ ４０００Ｖ 直線的勾配 １．０ｈ
Ｓ６ ４０００Ｖ 段階的勾配 ０．５ｈ
Ｓ７ ８０００Ｖ 直線的勾配 ０．５ｈ
Ｓ８ ８０００Ｖ 段階的勾配 １０５ｋＶｈ
────────────────────────────────────────
【００５０】
プログラム１は、ｐＨ勾配３．５〜４．５、４．０〜５．０、４．５〜５．５、５．０〜６．０および５．５〜６．７で使用する。プログラム２は、ｐＨ勾配６．０〜９．０のゲルで使用する。
【００５１】
［ＳＤＳ電気泳動］
必要なアクリルアミド１２．５％（ｗ／ｖ）の濃度を有する２次元用ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを作成する。
【００５２】
ゲルを展開する装置は、マニュアル（Amersham Biosciences）に従って組み立て、ｐＨ８．８の置換用緩衝液（トリスを０．３７５Ｍ、グリセロールを５０％（ｖ／ｖ）、ブロモフェノールブルーを０．００２％（ｗ／ｖ））を指定された容器に充填する。
【００５３】
ｐＨ８．８のゲル重合溶液（アクリルアミドを１２．１７％（ｗ／ｖ）、ビスアクリルアミドを０．３３％（ｗ／ｖ）、トリスを０．３７５Ｍ、ＳＤＳを０．１％（ｗ／ｖ）、ペルオキソ二硫酸アンモニウムを０．０５％（ｗ／ｖ））を先細のノズルが付いた容器中で混合し、次に、超音波浴中で５分間ガスを抜く。そして、ＴＥＭＥＤを０．０４％（ｖ／ｖ）加えることで、重合反応を開始させる。直ちに容器をスタンドに立て、チューブでゲル展開装置に接続する。ゲル溶液は、ゲルカセットの底辺の約３ｃｍ下に到達するまで、装置に流入させる。そして、置換緩衝液の容器のプラグを塞ぎ、カセットのガラス端の下約２ｃｍに上昇するまで、緩衝液でゲル溶液を置き換える。展開したゲルは、完全に重合するまで、ｎ−ブタノールで飽和した水で覆う。
【００５４】
電気泳動したゲルを、それぞれ一つずつ−８０℃の冷凍庫から取り出し、平衡チューブに移す。タンパク質をセル内で電気泳動し、ｐＨ８．８の還元用緩衝液（尿素を６Ｍ、トリスを５０ｍＭ、グリセロールを３０％（ｖ／ｖ）、ＳＤＳを４％（ｗ／ｖ）、ＤＴＴを６５ｍＭ）１５ｍｌを加え、２５℃で１５分間、それぞれ振盪して、還元する。次に、還元用緩衝液を捨て、ヨードアセトアミドを含むアルキル化緩衝液（尿素を６Ｍ、トリスを５０ｍＭ、グリセロールを３０％（ｖ／ｖ）、ＳＤＳを４％（ｗ／ｖ）、ヨードアセトアミドを２６０ｍＭ）１５ｍｌを加えることで、タンパク質をアルキル化する。再び、振盪しながら、２５℃で１５分間インキュベートする。続いて、緩衝液を再び捨てて、ゲル片をチューブから除く。ピンセットを用いて、ゲルをＳＤＳゲルの上に置き、ｐＨ８．３の液体アガロース溶液（アガロースを０．５％（ｗ／ｖ）、トリスを２５ｍＭ、グリシンを１９２ｍＭ、ＳＤＳを０．１％（ｗ／ｖ））２ｍｌで覆い、それにより固定する。電気泳動用箱ＥＴＴＡＮ ＤＡＬＴ ＩＩ（Amershal Biosciences）を、ｐＨ８．３の二次元展開緩衝液（トリスを２５ｍＭ、グリシンを１９２ｍＭ、ＳＤＳを０．１％（ｗ／ｖ））１０リットルで充填し、ＰＡＡゲルを装置に入れ、そして、電気泳動を実施する。ここで、最初のＰＡＡゲル当たり５Ｗの一定の力を５０分間設定する。温度は、２０℃で一定である。次に、力をゲル当たり５５Ｗ、ただし最大でも１８０Ｗまで増加させ、青い対照色素（ブロモフェノールブルー）がゲルの最低末端に到達するまで電気泳動を継続する。電気泳動を停止して、ゲルを除く。ゲル（酢酸を７％（ｖ／ｖ）、メタノール１０％（ｖ／ｖ））４００ｍｌ当たり、それぞれトレイに置き、ガラスプレートからゲルを除いてトレイに移す。固定のため、ゲルを振盪しながら、２５℃で３０分間インキュベートする。一方で、シプロルビイ（SyproRuby）染色溶液４００ｍｌを黒いトレイに置き、インキュベーション時間の経過後、固定したゲルを染色溶液に移す。振盪しながら１６時間染色後、４００ｍｌの固定液中で１５分間脱染色し、読み取りのため、４７３ｎｍの励起波長、５７５ｎｍの放射波長、１００μｍの解像度および１６ビットのグラデーションで、ＦＬＡ５００スキャナー（Fuji）で走査する。次に、ゲルをプラスチックホイルで覆い、次の使用まで４℃で保管する。
【００５５】
［ディファレンシャルスポットの同定］
タンパク質のディファレンシャルスポットの同定は、最初にｐＨ勾配（３．５〜４．５、４．０〜５．０、４．５〜５．５、５．０〜６．０、５．５〜６．７、６．０〜９．０）毎に１０種類のゲルを、調製した新鮮なＢＭＥＣとＡＯＥＣ（Aorta Endothelial Cells）からの１０種類のゲルと共に調製して、走査する。ゲルは、次に、Ｚ３評価ソフト（Compugen）を使用して比較し、ディファレンシャルスポットに印を付ける。ここで、１００ピクセルの最小スポットサイズをフィルターで集める。ＢＭＥＣＳ中で多量（三倍量またはそれ以上）または特異的であるタンパク質を切り出し、０．２ｍｌの反応容器に移す。切り出したスポットにラベルを付け、次の使用まで−８０℃で保管する。
【００５６】
［タンパク質試料の加水分解と質量スペクトル分析］
ゲルマトリックス中に固定した、切り出したタンパク質を、−８０℃の冷凍庫から取り出し、１００μｌの二回蒸留水を加えて洗浄する。ここで、個々のバッチを振盪しながら２５℃で２０分間インキュベートし、次に上澄みをピペットで吸い出して捨てる。この操作を二回繰り返す。次に、５０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル１００μｌで二回多い、振盪しながらそれぞれ２５℃で１５分間インキュベートする。再び上澄みを捨てる。ゲルの一片は、１００％アセトニトリル１００μｌを加えて完全に脱水し、振盪しながら２５℃で１５分間インキュベートする。上澄みを除去後、ゲル片を５分間空気乾燥する。その後、再びゲル片を加水分解緩衝液（（ＮＨ４）２ＣＯ３を５０ｍＭＪ、トリプシンＶを２５ｎｇ〜５０ｎｇ／１５μｌ）１５μｌで再水化処理し、膨潤させる。３７℃で１８時間インキュベートすることで、タンパク質を加水分解する。マトリックス・アシステッド・レーザー・デソープション・イオニゼイション（ＭＡＬＤＩ）法によりペプチドのフィンガープリントを調製するため、加水分解物を０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸で酸処理する。使用したＺｉｐＴｉｐ−Ｃ１８ピペットチップは、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル１０μｌでそれぞれ３回脱水し、続いて、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸１０μｌで平衡させることにより調製した。試料の適用は、加水分解調製物の上澄みを７回から１０回吸い上げることにより行う。次に、ＺｉｐＴｉｐを、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸１０μｌで洗浄する。ペプチドは、次に、三回から四回ピペットでＭＡＬＤＩ測定担体に移すことで、マトリックス（α−シアノ桂皮酸、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸）で直接溶出する。担体上の試料を乾燥後、最初に試料をＭＡＬＤＩフィンガープリントで質量スペクトルを測定して、分析する。ここで、試料をＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＰＲＯ（PerSpective Biosystems）ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析機で、２００００Ｖの加速電圧、７５％のグリッド電圧、０．０２％のグリッドワイヤー、２２０ｎｓの遅延時間での正の反射モードで測定する。ここで、７００〜３５００Ｄａの質量については、マス・ウィンドウを使用する。
【００５７】
個々のタンパク質スポットについて得られた質量リストは、データベース分析に採用する。ここで、３種の異なるプログラム、Ｍａｓｃｏｔ、ＭＳＦｉｔおよびＰｒｏｆｏｕｎｄを使用する。
【００５８】
良好な質量フィンガープリントが存在するにもかかわらず、データベース同定が不可能であるタンパク質スポットは、アミノ酸配列上方が得られるＥＳＩ質量分析機を使用する。
【００５９】
そのため、加水分解後、加水分解調製物を０．２％（ｖ／ｖ）ギ酸１５μｌで酸処理し、振盪しながら３０分間インキュベートする。一方、ＺｉｐＴｉｐ−Ｃ１８ピペットチップ（MilliPore）は、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル１０μｌでそれぞれ３回再水化処理し、続いて０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸１０μｌでそれぞれ３回平衡処理する。試料の調製は、加水分解調製物の上澄みを７回から１０回吸い出すことにより実施する。次に、ＺｉｐＴｉｐを、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸で洗浄する。引き続いて、０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸で２回洗浄することにより緩衝液を交換し、５０％（ｖ／ｖ）エタノール２μｌで５回から７回吸い出すことによりペプチドを溶出する。
【００６０】
得られるペプチド混合物は、直接分析するか、あるいはＥＳＩ質量分析機と組み合わせた液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を用いて分析できる。
【００６１】
直接分析には、１μｌの溶出した試料を中空の針（Protana）に充填する。ここで最初に、８５０〜１０００Ｖのイオンスプレイ電圧、２０ｐｓｉのカーテンガス圧、４０〜５０Ｖの分解電圧、２４５Ｖの電気泳動電圧、２０００〜２１０００Ｖの多チャンネルプレート電圧での概観スペクトルを陽極モードで測定する。その際の走査領域は、１００〜１６００または４１０〜１６００Ｔｈである。スペクトル中に検出されたペプチドは、衝突により断片化が誘導されている。
【００６２】
この目的では、個々のペプチドの生成物のイオンスペクトルは、８５０〜１０００Ｖのイオンスプレイ電圧、２０〜４０ｐｓｉのカーテンガス圧、４０〜５０Ｖの分解電圧、２４５Ｖの電気泳動電圧、０．７〜１．０ａｍｕの４極解像度、１５〜５０Ｖの衝突エネルギーおよび２１００〜２４００Ｖの多チャンネルプレート電圧で記録する。ここで、走査範囲は、５０〜１６００Ｔｈである。
【００６３】
ナノＨＰＬＣとＥＳＩ質量スペクトル分析機との組み合わせでは、最初に２μｌの試料と共に、２０μｌ／分の流量で０．１％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸を、逆相（ＲＰ）プレカラムに入れる。クロマトグラフィーによるペプチドの分離は、ＲＰ−Ｃ１８カラム（LC packings）を用いて、出発条件（ギ酸を０．０５％（ｖ／ｖ）、アセトニトリルを１０％（ｖ／ｖ））から最終条件（ギ酸を０．０５％（ｖ／ｖ）、アセトニトリルを７６％（ｖ／ｖ））まで勾配を伴って３５分間実施する。ＨＰＬＣと質量スペクトル分析機との組み合わせは、中空の針（New Objective）を用いて実施する。質量スペクトル分析機の設定は、ＬＣの実施中に二つの実験が実施できるように選択する。ここで設定するパラメーターは、イオンスプレイ電圧（１８００〜２２００Ｖ）以外は、前述したこれまでの設定に対応する。概観スペクトルと生成物イオンスペクトルとは、実施中に交互に記録する。生成物イオンスペクトルの設定は、概観スペクトルにおいて、２倍、３倍または４倍に電荷があり１０ｃｐｓよりも大きな最も強い二つのシグナルを、衝突に誘発された断片化によって引き続き分析できるように設定する。個々で走査範囲は、４５０〜１６００Ｔｈである。得られたスペクトルの評価は、３段階で実施する。
【００６４】
Ａ）対応するペプチドのアミノ酸配列に関する情報を含む生成物イオンスペクトルは、最初にソフトフェアープログラムＭＡＳＣＯＴ（Matrix Sciences）を用いて、公表されているデータベースと完全に照合する。そのようにして、ペプチドがタンパク質と一致しない場合は、
Ｂ）最初に生成物イオンスペクトルから、装置の製造会社のソフトフェアー・ツールを用いて自動的に配列を決定する。そのように得られたアミノ酸配列を、シェブチェンコ（Shevchenko）他の方法に従うＭＳＢｌａｓｔを用いて、公表されたデータベースと照合する。それでもタンパク質が同定できない場合は、
Ｃ）生成物イオンスペクトルを手動で評価し、得られたアミノ酸配列を、ｂｌａｓｔまたはＦＡＳＴＡを用いて、公表されたデータベースと照合する。
【００６５】
以上の方法に従うと、ＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片を、脳毛細血管の内皮細胞から選択的に同定できる。最初に説明した手順は、当業者であれば容易な、ありふれた変化を伴っている。例えば、以下に述べるように処理工程を変化させることができる。
【００６６】
消化方法として、当業者に公知のタンパク質を得るための他の方法を採用できる。それらの方法は、一般的な文献（例えば、２Ｄプロテオーム・アナリシス・プロトコル（2D Proteome Analysis Protocols））に記載されている。
等電点電気泳動では、もちろん他の製造会社からの電気泳動ゲルをいずれも採用できる。同様に、異なる長さや異なるｐＨ勾配も採用できる。
２次元分離でも、もちろん他の製造会社のゲルシステムをいずれも採用できる。別のゲルサイズの使用も可能である。
一般的な原則に従えば、当業者に公知の他のプロテアーゼを、ペプチドパターンの調製に使用できる。
他の種類あるいは他の製造会社の質量スペクトル分析機にも、ペプチドの質量と新規なアミノ酸配列の決定のために使用できる。
質量スペクトル分析条件は、ペプチド質量の決定および新規なアミノ酸配列のため、試料に対応して、機械と機能とを変化させることができる。
【００６７】
（タンパク質のウェスタンブロット）
最初にタンパク質を前述したように１２．５％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、続いてニトロセルロース膜上に移す。ここで、ワットマン（Whatman）紙（Schleicher & Schull）を７枚、分離ゲルの大きさに合わせて切り、それぞれを異なる緩衝液に浸す。
【００６８】
陽極緩衝液Ｉ（トリス塩基を３００ｍＭ、メタノールを２０％（ｖ／ｖ））中の２枚の紙を、血液検査装置（BioRad）の陽極上に、気泡が生じないように置き、陽極緩衝液II（トリス塩基を２５ｍＭ、メタノールを２０％（ｖ／ｖ））中の二枚の紙を重ねる。ニトロセルロース膜は、同様に陽極緩衝液IIに浸し、その上に置き、さらにポリアクリルアミドゲルを重ねる。最後に、さらに三枚の紙を陽極緩衝液（トリスを２５ｍＭ、アミノカプロン酸を４０ｍＭ、ＳＤＳを０．１％（ｗ／ｖ）、メタノールを２０％）に浸して、適用する。装置を閉じて、最大２５Ｖ、２．５ｍＡ／ｃｍ２ゲルで１時間、タンパク質の移動を起こす。
【００６９】
次にタンパク質の免疫化学的な染色を、ウサギの多クローン性抗血清を用いて実施した。
ここで、膜をＴＢＳＴ緩衝液（トリス塩基を１０ｍＭ、塩化ナトリウムを１５０ｍＭ、トゥウィーン２０を０．０５％（ｖ／ｖ）、ｐＨ：８．０）中で洗浄し、続いて、遊離の結合部位をＢｌｏｔｔｏ（トリス塩基を１０ｍＭ、塩化ナトリウムを１５０ｍＭ、トゥウィーン２０を０．０５％（ｖ／ｖ）、スキムミルクパウダーを５％（ｗ／ｖ）、ｐＨ：８．０）で飽和させる。最初の抗体のインキュベーションは、ＴＢＳＴ緩衝液中のＲＴ（抗−ＥＭＰ１−抗体（ウサギ）１：４０００，抗−ＴＫＡ−１−抗体（ウサギ）１：４０００）で２時間実施し、ＴＢＳＴ緩衝液で三回洗浄する。結合した抗体は、アルカリ性ホスファターゼに結合した第２抗体と共に、ＴＢＳＴ緩衝液中のＲＴ（抗−ウサギ−ＩｇＧ−抗体（ヤギ）、１：５０００）で１時間インキュベートすることにより検出される。ＴＢＳＴ緩衝液で二回洗浄後、ＡＰ緩衝液（トリス塩基を１００ｍＭ、塩化ナトリウムを１００ｍＭ、塩化マグネシウムを５ｍＭ、ｐＨ：９．５）でインキュベートすることにより、膜をアルカリ性のｐＨ値に再緩衝する。発色反応の基質として、ＡＰ緩衝液中の塩化ニトロテトラゾリウムブルー０．０１６％（ｗ／ｖ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート二ナトリウム塩を使用した。
【００７０】
以下において、ゲノム上の経路による脳毛細血管の内皮細胞におけるＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片の同定について、説明する。
【００７１】
［ｃＤＮＡサブトラクション法によるＢＢＢ特異的転写物の同定］
細胞または組織の特異的タンパク質の選択的同定は、ディファレンシャル法で実施する。これは、様々な組織および細胞の消化物の二次元ゲルをそれぞれ比較し、続いて組織と細胞の種類それぞれに特異的なタンパク質を決定することにより、タンパク質レベルで実施することができる。タンパク質の物理的性質（サイズ、溶解性）と独立させるため、転写レベルでディファレンシャル法を実施して特異的なタンパク質を同定することもできる。加えてサブトラクションＲＮＡ法を用いると、組織と細胞物質の必要量がそれぞれ少なくて良く、有利である。
【００７２】
ＢＢＢ−特異的タンパク質を同定するため、出発物質として新鮮に単離されたＢＭＥＣを使用することがきわめて重要である。これまで説明した最も良い方法は、腎臓のＲＮＡに対する脳の毛細管のＲＮＡのサブトラクションに基づく結果である（リー他、２００１年）。ここで、ＢＭＥＣに隣接する脳毛細血管は、周皮細胞や星状細胞のような他の細胞型を含むことが問題である。さらに、サブトラクション組織として、腎臓は非常に不均質である。すなわち、腎臓は多数の細胞型からなり、そこで内皮細胞はほんの一部でしかない。本発明に従うサブトラクション組織を利用すると、血管脳関門に特異的な転写物とタンパク質のそれぞれに選択的な同定が可能になる。基本的には、あらゆる内皮細胞が対照組織として使用できる。例えば、同じ組織の大血管または小血管の内皮細胞、あるいは他の組織（例、心臓、肺、腎臓、肝臓、大動脈他）の内皮細胞を対照組織として使用できる。また、培養により得られる脱分化ＢＭＥＣを用いることもできる。ただし、脳毛細血管の内皮細胞に対しては、他の内皮細胞型を対照組織として用いることが好ましい。好ましく用いられるのは、大動脈の内皮細胞であり、これは関門機能を示さない。これには、加えて、小血管を大血管と比較できるとの利点もある。さらに、他の大血管内皮細胞も使用できる。別に適した比較組織は、別の条件で培養した脳毛細血管の内皮細胞である。別の条件とは、ｐＨ値、成長培地、成長因子（例、サイトカイン）に関して異なる条件である。同定した標的の生理学的な意味は、個々の対照組織に対して、脳毛細血管の内皮細胞の公知の性質から判断することができる。本発明では、二種類の明確な細胞型が好ましく使用される。一方は、関門機能を伴う細胞型である新鮮に単離されたＢＭＥＣであり、他方は、ＢＭＥＣに類似する内皮細胞でありながら、関門機能を示さない大動脈からの内皮細胞である。この研究経路は、転写物とタンパク質の双方を同定することを可能にして、従来よりも大幅に選択的な血液脳関門の形成に寄与するはずである。
【００７３】
［サブトラクション法によるｃＤＮＡライブラリーの調製］
トリゾール（Trizol、Invitrogen）を用い、製造会社の説明書に従って、細胞から全ＲＮＡを単離した。引き続き、変性アガロースゲル上で全ＲＮＡの純度を確認する。ＲＮＡの単離のため、１ｍｌのトリゾール中、１００ｍｇの組織と１０ｃｍ２の融合成長細胞それぞれを、機械的にホモジナイズして、引き続きホモジネートをＲＴで５分間インキュベートする。その後、トリゾール（Invitrogen）１ｍｌ中のクロロホルム０．２ｍｌを加え、ボルテックス（Vortex）で１５秒間混合し、ＲＴで３分間インキュベートする。４℃にて１２０００×ｇで１５分間遠心分離して、相分離させる。その後、上部の水相を新鮮な容器に移す。トリゾール１ｍｌ中のイソプロパノール０．５ｍｌを加え、攪拌後、ＲＴで１０分間インキュベートする。４℃にて１２０００×ｇで１０分間遠心分離して、ＲＮＡを沈降させ、７５％エタノールで二回洗浄し、空気乾燥し、ＤＥＰＣ処理水に溶解する。濃度は、分光光度計で決定し、品質は変性アガロースゲルで確認する。
【００７４】
全ＲＮＡから始めて、製造会社の説明書に従い、ダイナビーズ（Dynal）を用いてｍＲＮＡの割合を高める。
【００７５】
（ｍＲＮＡの濃縮）
全ＲＮＡ７５μｇを、６５℃で２分間変性し、直ちに二倍量の結合緩衝液中のダイナビーズ・オリゴ（ｄＴ）２５（Dynal）２００μｌを加え、攪拌しながら５分間インキュベートする。磁気分離の上澄みを捨て、ダイナビーズを洗浄用緩衝液で二回洗浄する。ポリＡ＋−ＲＮＡは、ｐＨ７．５の１０ｍＭトリス−塩酸２０μｌを用いて８５℃で２分間、最後に溶出する。
【００７６】
サブトラクション法のｃＤＮＡライブラリーの調製は、市販のＰＣＲサブトラクション・キットで実施できる。例えば、クローンテック（Clontech）社のＰＣＲ選択ｃＤＮＡサブトラクションキッドを、製造会社の説明書に従い使用できる。
【００７７】
ここで、ＢＭＥＣ（テスター）およびＡＯＥＣ（ドライバー）からのｍＲＮＡそれぞれ２ｍｇを、ＡＭＶ逆転写酵素により、オリゴ（ｄＴ）アダプタープライマーから直接開始して、一本鎖ｃＤＮＡに転写する。次に、第２鎖の合成を酵素混合物（ＤＮＡポリメラーゼＩ、リボヌクレアーゼＨおよびＤＮＡリガーゼ）を用いて１６℃で２時間実施し、続いて、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを加え、１６℃で３０分間さらにインキュベートする。このようにして調製した二本鎖ｃＤＮＡは、フェノール／クロロホルム抽出で精製し、エタノールで沈降させる。
【００７８】
後述するアダプターの連結反応に適した末端を導入するためと共に、より均一なサイズのｃＤＮＡ断片を生じるために、ここで、ＲｓａＩによる制限分解を実施する。このように調製した二本鎖ｃＤＮＡ断片は、フェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈降により精製する。ｃＤＮＡの合成および制限分解の生成物は、ゲル電気泳動で純度を検査する。
【００７９】
後述するＰＣＲによる増幅のため、ここで、アダプター１および２Ｒを、酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼと共に、テスターｃＤＮＡのＲｓａＩ末端に加える。連結反応は、ＰＣＲで確認する。
【００８０】
実際のサブトラクションは、二種類のハイブリダイゼーションにより行う。第１のハイブリダイゼーションでは、一つのバッチでＢＭＥＣアダプター１のｃＤＮＡがＡＯＥＣｃＤＮＡとハイブリダイズして、もう一つのバッチでＢＭＥＣアダプター２ＲのｃＤＮＡがＡＯＥＣｃＤＮＡとハイブリダイズする。第２のハイブリダイゼーションでは、第１のハイブリダイゼーションからのバッチの双方を併せて、ＡＯＥＣから新たに変性したｃＤＮＡとハイブリダイズさせる。
【００８１】
ハイブリダイゼーションの生成物は、最終的に、第１のＰＣＲ反応の鋳型として使用する。ここで、双方のアダプター１および２Ｒの共通領域からのオリゴヌクレオチドは、プライマーとして機能する。
【００８２】
この最初のＰＣＲの生産混合物は、ここでは、入れ子式のＰＣＲの鋳型として使用した。ここで、互いに配置した二種類のプライマーは、双方のアダプター１および２Ｒの特異的領域からそれぞれ得られる。この第２のＰＣＲは、特異性を増加させる。
【００８３】
サブトラクションの有効性は、ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）のための比較用ＰＣＲで確認する。ＢＭＥＣおよびＡＯＥＣからの非サブトラクション法による二種類のｃＤＮＡと比較して、顕著により多くのＰＣＲが循環した後においてのみ、サブトラクション法によるｃＤＮＡと共に生成物が形成される。典型的なハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨは、全ての組織と細胞型において比較できる程度まで発現する。それゆえ、サブトラクション法によるハイブリダイゼーションでは、異なる表現型の遺伝子が豊富ではないが、転写物の量がサブトラクション法ｃＤＮＡ（正および逆のサブトラクションのいずれ）において、サブトラクション前のＢＭＥＣおよびＡＯＥＣからのｃＤＮＡと比較すると顕著に減少する。これは、サブトラクション前のｃＤＮＡとそれぞれのサブトラクション法ｃＤＮＡの双方を、ＧＡＰＤＨ特異的プライマーでＰＣＲに使用することで実験的に確認する。サブトラクション法のｃＤＮＡによる最初の生成物の形成は、二つの非サブトラクションｃＤＮＡと比較すると、追加の１６サイクル後においてのみ得られる。そのため、ハイブリダイゼーションにおいて、少なくとも要素が５００００に増幅する。この増幅で、ＢＢＢ−特異的転写物の選択的同定が容易になり、単離した配列の第１の有効性も示す。
【００８４】
第２のＰＣＲの生成物は、ｐＴ−Ａｄｖベクター（Clontech）でクローン化し、大腸菌のキモコンペンテント（chemocompetent）ＴＯＰ１０Ｆ’（Clontech）を形質転換する。第２のＰＣＲの生成物は、ｐＴ−Ａｄｖプラスミドベクター（Clontech）でクローン化する。このベクターは、５’末端のｄＴ残基が重複しており、３’ｄＡ残基と適合できる。これは、例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによりＰＣＲ生成物に結合できることを意味する。これと対照システムとは、いずれもＰＣＲ生成物を高い効率で直接クローン化できる。形質転換を大腸菌のキモコンペンテント（chemocompetent）ＴＯＰ１０Ｆ’（Clontech）で実施することは、文献（サムブルック他、１９８９年）に記載がある。
【００８５】
［ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション］
サブトラクション法によるｃＤＮＡライブラリーからのクローンは、ＢＭＥＣ対ＡＯＥＣの発現として、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーションにより確証する。ここでは、ＰＣＲに選択的なディファレンシャル・スクリーニング・キット（Clontech）を使用する。逆サブトラクション・プローブは、上記の製造会社の説明書に従い、クローンテック（Clontech）社のＰＣＲ選択的ｃＤＮＡサブトラクション・キットを用いて調製した。ここで、ＢＭＥＣはドライバー、ＡＯＥＣはテスターとして機能する。
【００８６】
製造会社の説明書に従い、クローンの液体培地を９６の窪みがあるマイクロ滴定プレートに接種する。これらは、プライマー・アダプター１および２Ｒの挿入を増幅するための鋳型として用いる。液体培地の残りには、グリセロールを加え、永久培地として凍結する。ＰＣＲ生成物は、ゲル電気泳動により確認する。２００塩基対よりも大きい、それぞれ１μｌの生成物を、二つの同一のハイボンドＮ（HybondN）膜上に滴下し、紫外光を用いて固定する。製造会社の説明書から離れて、９２クローンを有する二つのフィルターのみをハイブリダイズする。それぞれは、ＢＭＥＣ特異的な転写物が豊富な正にサブトラクションしたプローブがあるフィルターと、ＡＯＥＣ特異的な転写物が豊富な逆にサブトラクションしたプローブがある他のフィルターである。ＢＭＥＣおよびＡＯＥＣそれぞれからのｃＤＮＡがある別の二つのフィルターのハイブリダイゼーションは省略する。これは、そこから関連性が高い付加的な情報を集めることができないためである。代わりに、ＢＭＥＣおよびＡＯＥＣからのＲＮＡを、ノーザンブロット解析とＲＴ−ＰＣＲ実験における解析（後述）において、発現パターンの調製のために使用する。サブトラクション法によるｃＤＮＡライブラリーの９２クローンは、製造会社による２種類の負の対照と共に、フィルターに適用する。製造会社の説明書に加えて、ＢＭＥＣおよびＡＯＥＣで同じように強く発現さされるハウスキーピング遺伝子のＰＣＲ生成物の一つを、ＢＨＳマーカー（Apolipoprotein A1）のためのＰＣＲ生成物と同様にスポットする。ＢＨＳマーカーは、ＡＯＥＣよりもＢＭＥＣで強く発現する正の対照である。
【００８７】
ハイブリダイゼーションは、製造会社が説明するように、エクスプレスＨｙｂ溶液（Clontech）を用いて７２℃で同等の活性を有するプローブを用いて実施する。続いて、フィルターを厳重に洗浄する。通常の厳格な条件を採用する。好ましくは、フィルターを６８℃で２０分間、２回、０．５％ＳＤＳ中の０．２×ＳＳＣで厳密に洗浄する。信号強度は、ホスフォイメージャー（ＦＬＡ−５０００、Ｆｕｊｉ）を用いて、フイルム上での異なる時間による露光で決定する。ＢＭＥＣにおいて、ＡＯＥＣよりも約５倍の信号強度を示すクローンを、ディファレンシャルに発現したものとして区別し、さらに処理する。
【００８８】
正のクローンの永久培地から液体培地を接種して、キアーゲン（Quiagen）カラムを用いる標準的な方法（バーンボイムおよびドリー、１９７９年）に従い、プラスミドＤＮＡを単離する。プラスミドの挿入は、普遍的なプライマーを用いて配列させ、任意に遺伝子に特異的なプライマーを加えて用いる。ＤＮＡ配列から得られたデータベースは、アルゴリズムのＢＬＡＳＴ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)およびＦＡＳＴＡ(http://www.ebi.ac.uk/fasta33)を用いて相同性を調査する。
【００８９】
［ＢＢＢ−特異的転写物の検証：発現パターン］
関連する正のクローンから、ＢＭＥＣ、ＡＯＥＣおよび９種の他の組織において、発現パターンを生じさせる。これは、ＲＴ−ＰＣＴおよび／またはノーザンブロット解析により実施する。
【００９０】
ＲＴ−ＰＣＲ実験では、全ＲＮＡを出発物質としてランダムに開始することでｃＤＮＡを調製する。使用する全ての酵素とランダム・ヘキサマーは、インビトロゲン社製である。ここで、５μｌのデオキシリボヌクレアーゼＩ、１０倍量の緩衝液および５μｍｌのデオキシリボヌクレアーゼＩを、ヌクレアーゼ・フリーの水４０μｌ中の全ＲＮＡ１０μｇに加え、２５℃で１５分間インキュベートする。続いて、２５ｍＭのＥＤＴＡ５μｌを加え、６５℃で１５分間、酵素を熱で不活性にする。調製物から２５μｌを除き、１００μｌまで、ヌクレアーゼ・フリーの水を加え、−ＲＴ対照として−８０℃で保管する。８μｌのランダム・プライマー（１００ｎｇ／μｌ）、３μｌのｄＮＴＰ混合物（それぞれ１０ｍＭ）および２μｌのヌクレアーゼ・フリーの水を、デオキシリボヌクレアーゼＩの消化物から残っている２５μｌの全ＲＮＡに加える。ここで、６５℃で５分間、ＲＮＡの２次構造を崩壊させ、その後、直ちに試料を氷の上に置く。１０μｌの５倍ストランド用緩衝液、６μｌのＤＴＴ（１００ｍＭ）および３μｌのＲＮａｓｅＯＵＴを加える。プライマーがアニーリングするまで、２５℃で１０分間インキュベートし、引き続いて、温度を４２℃に２分間調節する。３μｌのスーパースクリプトII逆転転写酵素を加え、４２℃で５０分間インキュベートする。次に、７０℃で１５分間、酵素を熱で不活性にする。３μｌのリボヌクレアーゼＨを加え、３７℃で２０分間インキュベートし、ｃＤＮＡからの全ＲＮＡを分解する。最後に、ヌクレアーゼ・フリーの水を加えて１００μｌとして、ｃＤＮＡを８０℃で保管する。ｃＤＮＡの品質は、ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）と１８ＳのｒＲＮＡをそれぞれ用いるＰＣＲで確認する。ここで、異なる組織と細胞のそれぞれからｃＤＮＡについて、比較できる程度の量で生成物が生じることが期待される。調製したｃＤＮＡ細胞は、それぞれの場合で、転写の発現パターンを調製するために使用され、研究される。
【００９１】
発現パターンの調製のためのノーザンブロット解析では、細胞と組織それぞれからの全ＲＮＡを、そのサイズに従い変性ゲルで分離し、ナイロン膜に移す。ここで、放射性物質で標識した遺伝子に特異的なプローブとハイブリッド形成する。６．０ｇのアガロースを、２９０ｍｌのＤＥＰＣ処理した水に加熱しながら溶解する。次に、６０℃の水浴で６０℃まで冷却し、４０ｍｌの１０倍ＭＯＰＳ緩衝液（ＭＯＰＳを２００ｍＭ、酢酸ナトリウムを５０ｍＭ、ＥＤＴＡを１０ｍＭ）と７０ｍｌのホルムアルデヒドを加える。最後に、ビック・ポケット・フォーマー（１２ライン）のマキシゲル（maxigel）をフューム・フードに展開し、放置することで固形化する。それぞれ１０μｌ中の全ＲＮＡ１０μｇを、４０μｌの試料緩衝液（脱イオンホルムアミドを５００μｌ、ホルムアルデヒドを１６０μｌ、１０倍のＭＯＰＳを１００μｌ、ＤＥＰＣ処理した水を２４０μｌ）で１５分間、６５℃で変性し、続いて氷の上に移す。ここで、１０μｌのローディング緩衝液（グリセロールを５００μｌ、ＥＤＴＡを５００ｍＭ、１０％ブロモフェノールブルーを２５μｌ、ＤＥＥＰＣ処理した水を４７３μｌ）を加え、試料を１倍ＭＯＰＳ緩衝液で覆ったゲルに適用する。電気泳動を２５０Ｖで３〜４時間実施する。その後、ゲルを最初に水の中で１０分間回転させ、次に１０倍のＳＳＣの中で３０分間回転させる。ゲルの大きさに合わせて注文しておいたハイボンドＸＬフィルターを１０倍ＳＳＣ中で１５分間振盪する。
【００９２】
ブロットの組み立て（底部から上部へ）は、塩橋（１０倍ＳＳＣを入れた緩衝液容器中に浸漬）、ゲル、フィルター、５ ３ＭＭ（予め１０倍ＳＳＣに浸漬）、約７ｃｍの緑色のタオル（セルロースの布）、ガラス板、約０．５ｋｇの重りである。ブロッティングは、１６〜２０時間実施する。その後、ブロットを分解し、ハイボンドＸＬフィルターを、２倍ＳＳＣで１０分間洗浄する。ＲＮＡは、ここで７００００μＪ／ｃｍ２の紫外線架橋結合によりハイボンドフィルター上に固定される。さらに、フィルターを染色溶液（０．３Ｍ酢酸ナトリウム１リットル中のメチレンブルー３００ｍｇ）中で１分間染色し、ＲＮＡを可視化する。さらに２分間水洗して、背景を脱色する。染色したフィルターを写真で解析する。引き続いてフィルターを３ＭＭ紙の間で乾燥し、サランラップで覆い、−２０℃で保管する。
【００９３】
ハイブリダイゼーションは、放射性元素で標識したｃＤＮＡプローブ（Rediprime II、 Amersham）を用いて実施する。このプローブは、製造会社の説明書に従い、エクスプレスＨｙｂ溶液（Clontech）を用いて、プローブカント（ProbeQuant）Ｇ−５０カラム（Amersham）で予め精製してある。ホスフォイメージャーＦＬＡ−５０００（Fuji）を用いてハイブリダイゼーションを最初に確認後、バイオマックスＭＳフイルム（Kodak）上でオートラジオグラフを調製する。
【００９４】
［ｃＤＮＡ配列の完成］
様々なｃＤＮＡライブラリーとＲＡＣＥ−ＰＣＲ実験をスクリーニングすることで、サブトラクション法による関連するｃＤＮＡライブラリーから、ＢＢＢ−特異的クローンの完全なｃＤＮＡ配列を決定する。
【００９５】
ｃＤＮＡライブラリーは、製造会社の明細書に従い、λＴｒｉｐｌＥｘ２ベクター内のＳＭＡＲＴｃＤＮＡライブラリー組み立てキット（Clontech）を用いて、ブタのＢＭＥＣから構築する。ここで、最初に、前述したように、トリゾール（Invitrogen）から全ＲＮＡを単離する。そして、ダイナビーズ（Dynal）を用いて、そこからポリＡ＋−ＲＮＡを濃縮する。ライブラリーの調製では、ＢＭＥＣからのポリＡ＋−ＲＮＡを２μｇ用いる。最後に、製造会社の説明書に従い、ファージ抽出物ギガパックIIIゴールド（Stratagene）を用いて、インビトロで連結反応を進行させる。ＢＭＥＣのｃＤＮＡライブラリーの独立ファージの数は、１３０万ｐｆｕに達する。そのうち９９％以上は、ブルー／ホワイト試験（サムブルック他、１９８９年）を実施した組み換え体であった。挿入物の少なくとも半分は、１ｋｂを越える大きさを有していた。完全なライブラリーの増幅後、滴定量は、約１５０ｍｌの全量において約２×１０１０ｐｆｕ／ｍｌであった。このファージの溶解生成物は、ＤＭＳＯ７（ｖ／ｖ）％に調整し、−８０℃で保管する。説明したファージのライブラリーは、製造会社の説明書（Clontech ClonCapture cDNA Selection Kit）に従い、プラスミド・ライブラリーに変換する。この説明書では、大腸菌ＢＭ２５．８が、２００万ｐｆｕのファージ・ライブラリーで感染されている。この細菌株は、Ｃｒｅレコンビナーゼを発現する。Ｃｒｅレコンビナーゼは、λＴｒｉｐｌＥｘ２ベクターのｌｏｘＰサイトを認識し、それにより転換を可能にする。ここで、プラスミド中のラムダ・ファージの転換は、インビボでの削除と、それに続く完全なプラスミドの環状化によって行われる。得られるプラスミドは、次に、安定した状態で大腸菌から抜け出る。プラスミドは、感染したＢＭ２５．８のプレート培地から、ヌクレオボンド・プラスミド・キット（Clontech）を用いて調製される。
【００９６】
ｃＤＮＡプラスミドのライブラリーをクローンキャプチャー（ClonCapture）でスクリーニングするため、ビオチンを加えたｃＤＮＡプローブを用いる。ここで、ＲｅｃＡｇａ仲介する反応で、プラスミドが挿入された同じ配列を有するＤＮＡの三重構造が形成される。このように選択されたプラスミドは、磁石ビーズに結合したストレプトアビジンを用いて単離でき、形質転換に使用できる。そのような濃縮物からのクローンは、さらにコロニーのハイブリダイゼーションでスクリーニングされ、プラスミドＤＮＡが単離され、そこから生じる正のクローンにつなげる。
【００９７】
クローンキャプチャー（ClonCapture）による正のクローンの単離は、製造会社の説明書（Clontech）に正確に従って実施する。プローブの調製では、最初に、遺伝子に特異的なプライマーを有するＰＣＲを適当なプラスミドに最適化する。これにより、一つの生成物のみが形成される。このために、プライマーは、互いの融点が１℃よりも異ならず、プライマーの二量体や安定なループを形成しないように設計する。アニーリング温度は、以下の式で計算される融点よりも２〜５℃低い、比較的高めの温度となるように選択する。
Ｔｍ＝［（Ｇ＋Ｃ）×４］＋［（Ａ＋Ｔ）×２］
これにより、ゲル電気泳動による対照の唯一のバンドにおいて、特異的な生成物が形成される。この生成物から、滅菌したパスツールピペットを用いて、アガロースゲルから一片を取り、滅菌した水２００μｌに移す。７０℃で３０分間、回転させながらインキュベートすることにより、ＤＮＡをゲル片から溶出させ、プローブ調製の鋳型として用いる。この鋳型を用いる対照反応を、ビオチン−２１−ｄＵＴＰを用いる場合と用いない場合とで実施し、アガロースゲルで分析する。これは、ビオチンがＰＣＲを阻害するからである。対照反応が成功すれば、ここでビオチンを加えたプローブが、［α３２Ｐ］ｄＣＴＰを１０μＣｉ加えた調製用のＰＣＲ中で調製される。２０サイクル後、調製物の５μｌをアガロースゲルで検査し、可能ならばさらに５サイクルを加える。続いてＰＣＲ生成物を、製造会社の説明書に従い、ヌクレオスピン・エクストラクション・キット（Clontech）で精製し、３５μｌの溶出用緩衝液で溶出する。そこから２μｌをゲル電気泳動で分析し、生成物を分光光度計で定量する。ビオチン添加の対照とするため、純粋なＰＣＲ生成物２μｌを、１５μｌの磁気ビーズに加え、インキュベーション前の信号をガイガー・カウンターで確認する。わずかに振盪しながら３０分間インキュベート後、磁気ビーズを磁石で分離し、上澄みを再びガイガー・カウンターで定量する（インキュベート後の信号）。ビオチン添加に成功すると、インキュベーション前の信号は、インキュベーション後の信号よりも２〜四倍強くなる。
【００９８】
５０（２００ｂｐ）〜１００（６００ｂｐ）ｎｇを捕獲するため、水中のビオチンを加えたＰＣＲ生成物は、１００℃で５分間変性し、その後、直ちに氷の上に移す。ここで、プラスミドＤＮＡ以外の全ての成分を加える。ここでは、プローブ５０ｎｇに対して、ＲｅｃＡタンパク質２μｇを用いる。３７℃で１５分間インキュベーション後、１μｇのプラスミド・ライブラリーを加えて、さらに３７℃で２０分間インキュベートする。一方、磁気ビーズ１５μｌをニシンの精子ＤＮＡで非特異的に飽和させ、捕獲のための精製用に調製する。ＥｃｏＲ Ｖで解裂したλ−ＤＮＡを捕獲用調製物に加え、プロテイナーゼＫによる消化を３７℃で１０分間行う。この反応は、最後にＰＭＳＦを加えて停止し、捕獲用調製物を磁気ビーズで精製する。単離したプラスミドを１００μｌの溶出用緩衝液で溶出し、沈降させ、さらに１０μｌの水に溶解する。
【００９９】
クローンキャプチャーで濃縮したプラスミド・ライブラリー２μｌで、電気適応能がある大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、ＬＢ−Ａｍｐプレートから取り出す。正のクローンは、標準的な方法に従い放射性物質で標識したプローブ（ビオチン添加の場合と同じ増幅標識）を用いるコロニー・ハイブリダイゼーションにより同定する。このように得られたクローンは、コロニーＰＣＲでさらに検証する。そのため、上記増幅標識（amplicon）とそれよりも下流に位置する他のプライマーからのプライマーを用いる。クローンキャプチャーのプローブとして用いた増幅標識からの双方のプライマーを選択することは、避けるべきである。これにより、コロニーＰＣＲ（ＰＣＲは、ＤＮＡに代えて、個々のコロニーからの細菌を使用することで実施する）を行う際に、生成物の形成が細胞内のプラスミドでは起こらず、汚染したプローブにより起こることを回避する。それゆえ、少なくとも一つのプライマーを増幅標識の外側に、最も好ましくは３’側から配置すべきである。すなわち、この配列は、知られており、かつｃＤＮＡライブラリーにおける全ての正のクローンに含まれているからである。正のクローンのプラスミドＤＮＡは、標準的な方法（バーンボイムおよびドリー、１９７９年）に従い、キアーゲン社のカラムを用いて単離し、鎖末端法（サンガー他、１９７７年）に従い配列を決定する。配列の決定には、製造会社の説明書に従い、「ＡＢＩプリズム・ビッグダイ・ターミネーター・サイクル・シークエンシング・レディ・リアクション・キット、バージョン２．０（Applied Biosystms）」を使用できる。配列決定反応の生成物は、「ＡＢＩプリズム３１０ジェネティック・アナライザー（Applied Biosystems）」で分析する。
【０１００】
ＲＡＣＡ−ＰＣＲ（フローマン他、１９８８年）は、未知のｃＤＮＡ配列の決定に利用できる。具体的には、ｃＤＮＡ合成により既知の配列部分から開始し、引き続き、第２のＰＣＲプライマーをアニーリングするため既知の合成末端を導入する。
【０１０１】
５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲは、製造会社の説明書に従い、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅用５’ＲＡＣＥシステムのバージョン２．０（Invitrogen）を用いて実施する。ここで、最初にｃＤＮＡプライマリー鎖を、遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ１）とＢＭＥＣの全ＲＮＡ１μｌを用いて合成する。ｃＤＮＡをガラスＭＡＸカラムで精製後、第２段階として、酵素末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用いて、オリゴ−ｄＣ−テイルを付ける。最初のＰＣＲは、さらに遺伝子特異的なプライマー（ＧＳＰ２）と短縮したアンカープライマーとを用いて、テイルを付けたｃＤＮＡ５μｌ上に置く。アンカープライマーは、オリゴ−ｄＣ−テイルに結合している。ＰＣＲの特異性は、第２の入れ子式のＰＣＲにより増加する。これは、短縮した普遍的な増幅プライマーと第３の遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ３）を用いて、最初のＰＣＲからのＰＣＲ生成物を１：１００希釈したもの５μｌ上で実施される。それぞれひとつだけのプライマーのバッチと水を制御したバッチは、第２のＰＣＲの対照として機能する。ゲル電気泳動解析後、第２のＰＣＲの生成物は、出来る限りクローン化する。これにより、ｐＧＥＭ−ＴｅａｓｙシステムII（Promega）を用いる連結反応と、電気適応能があるＤＨ５αの形質転換を実施する。得られるクローンは、コロニーＰＣＲを持ちおいて検査し、プラスミドＤＮＡを調製し、最後に実際に知られている方法で配列を決定する。
【０１０２】
３’ＲＡＣＥ−ＰＣＲは、製造会社の説明書に従い、ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅用３’ＲＡＣＥシステム（Intvitrogen）を用いて実施できる。３’ＲＡＣＥ−ＰＣＲにおいて、ｃＤＮＡプライマリー鎖の合成は、オリゴ−ｄＴアダプタープライマーを用いて、ＢＭＥＣの全ＲＮＡ５μｇに関して実施する。最初のＰＣＲでは、ｃＤＮＡ２μｌを、遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ１）および短縮した普遍的な増幅プライマーと共に用いる。半入れ子式の第２のＰＣＲは、遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ２）および短縮した普遍的な増幅プライマーを、５’ＲＡＣＥで説明した対照と共に用いて実施する。生成物をクローン化し、既に述べたように配列を決定する。
【０１０３】
以上述べた方法に従い、ＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片は、脳毛細血管の内皮細胞で選択的に同定することができる。以上述べた手順は、当業者に自明のありふれた変更が可能である。例えば、以下に述べるように処理工程を変化させることができる。
【０１０４】
単離したＢＭＥＣを散布し、第１の培地を新鮮なＢＭＥＣに代えて、サブトラクション法におけるテスターとして使用できる。
別のサブトラクション法の組織（ドライバー）として、例えば、培養（少なくとも２継代）により脱分化したＢＭＥＣを選択できる。
【０１０５】
ＲＮＡとｍＲＮＡそれぞれを、ＲＮＡが損なわれておらず、ｍＲＮＡが逆転写によりｃＤＮＡに転写できることを条件に、当業者に公知の他の方法に従って調製できる。
サブトラクション法によるＰＣＲ生成物を、ポリメラーゼによる３’ｄＡ残基および平滑末端の双方を用いるか、あるいは制限分解後、それぞれ適切なベクターシステムでクローン化できる。形質転換は、別の大腸菌株を用いて実施できる。大腸菌株は、化学的および電気的な適応能がある細胞であれば、この分野で良く知られている細胞を用いることができる。
【０１０６】
ディファレンシャルハイブリダイゼーションの工程は、任意であるが、推奨される。ここで他の好ましい膜（例、陽極電荷が負荷された、あるいは負荷されていないナイロン膜）や他のハイブリダイゼーション溶液を用いることもできる。膜の厳格な洗浄は他の温度でも、あるいは他の溶液を用いても（例えば、より低温とより低塩量、およびより高温とより高塩量、例、Ｔ＝５０〜７０℃、０．５〜０．０５×ＳＳＣ／０．１％５ＤＳ）、それぞれ実施できる。
表現型は、それぞれのｃＤＮＡを用いて、定量的ＰＣＲ（同時ＰＣＲ）によっても決定できる。実際的な方法では、定量的ＰＣＲを、オプティコン（MJ Research）を用いて実施する。反応を実施するため、キアーゲン社の「クアンティテキストＳＹＢＲグリーンＰＣＲキット」を使用する。ここで、ＰＣＲの条件は、前述したものが採用される。定量において、溶出液系列を一つずつ、ＢＭＥＣｃＤＮＡから調製できる。説明書は、使用したＲＮＡと当量のピコグラム単位である。それぞれの場合に、相対的な定量を実施するためには、目的物質の計算上の量を、１８ＳｒＲＮＡの計算上の量で割っておく。最後に、試料（例、ＢＭＥＣ）を１００％に設定し、他の全ての試料をそれと参照する。
【０１０７】
ｃＤＮＡは、他のシステムを用いて生産することもできる。ノーザンブロット解析は、他の適当なプローブとハイブリダイゼーション／洗浄溶液を用いて実施できる。
ｃＤＮＡは、既知の重複配列を用いてデータベース検索により展開できる。実験的には、求めている転写物が生じている細胞と組織それぞれの他のｃＤＮＡライブラリーを、様々なシステムによりスクリーニングできる。求めている転写物が生じている細胞と組織それぞれのＲＮＡをＲＡＣＥ−ＰＣＲそれぞれに採用できる（サムブロック、１９８９年参照）。ＲＡＣＥ−ＰＣＲでは、当業者に公知の他の適当なシステムも使用できる。
【０１０８】
この方法で同定したタンパク質または断片は、血液脳関門に特異性を有しており、それが本発明の主題にもなっている。血液脳関門に対するタンパク質または断片の特異性に関する知識により、現在では、タンパク質の機能を選択的に発見することが可能になった。機能の決定は、通常、利用可能なデータベース、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、既知の配列データとの比較により行われる。同定したタンパク質の特異性に関する知識は、血液脳関門での発現の選択的調節を可能にし、これにより病理学的な条件を特別に扱うことができる。
【０１０９】
そのようにして、それぞれのＢＢＢ−特異的タンパク質についてのアゴニストとアンタゴニストを、それらの活性を選択的に調節するように展開できる。それらのタンパク質の発現は、例えば、遺伝子転移やアンチセンスＲＮＡにより直接調節することもできる。特に治療において有効な方法は、「トロイの木馬」医薬への展開である。この医薬は、同定した担体によって、ＢＢＢを通過する活性を有する分子と結合させる。あるいは、いわゆるプロドラッグである内皮細胞のＢＢＢ−特異的酵素で変性した物質、およびこれにより得られる治療上の効果が可能になる。
【０１１０】
ＢＢＢ−特異的タンパク質は、多面的な機能を満足する。例えば、それらは、養分の供給（例えば、グルコース担体であるＧＬＵＴ１）に機能し、あるいは、接触タンパク質（例えば、強固な結合タンパク質であるＺＯ−１）として機能する。さらに、それらは、酵素活性（例、グルタミルトランスフェラーゼＧＧＴ）を有するか、あるいはアミノ酸の搬送担体として機能する。
【０１１１】
［虚血におけるＢＢＢ−特異的タンパク質の発現］
本発明に従い同定されたＢＢＢ−特異的タンパク質の発現反応を、虚血に関して調べた。このために調製した内皮細胞は、洗浄後、再懸濁し、フランク他（２０００年）が説明したように、コラーゲンでコートした細胞培地のボトルに散布した。細胞の培養は、二酸化炭素中、３７℃のインキュベートで行い、二酸化炭素量は５％に一定化した。細胞が集合体を形成後、トリプシン溶液の処理で細胞を剥がし、そのために準備しておいたトランスウェル（transwell）皿（４４ｃｍ２、Corning）に分けた。上記条件で細胞を３日培養後、トランスウェルバッチを皿に移した。皿の底には、Ｃ６−グリオーム細胞（市販品、例えば、ＡＴＣＣから購入可能）を増殖させておいた。二つの細胞型を、ヒドロコルチゾンを加えた共有培地で、さらに２日培養した。培地の交換は、虚血の発現実験のために行った。最初に、新しい培地を、０．２％の酸素、９４．２％の窒素および５％の二酸化炭素で燻蒸する。新しい培地は、グルコースを全く含まない。引き続き、０．２％の酸素、９４．２％の窒素および５％の二酸化炭素を有する二酸化炭素インキュベーター内で、細胞を３７℃で２４時間保管した。培地の交換は、対照実験のためにも実施した。最初に培地を、２１％の酸素、７４％の窒素および５％の二酸化炭素で燻蒸した。培地は、グルコースを含む。これらの条件で細胞をさらに２４時間培養した。次に、それぞれのタンパク質の発現を、前述したように定量的に決定した。
【実施例】
【０１１２】
ここで、血液脳関門において、以下のタンパク質を本発明の方法で同定した。
［第１例：Ｓ１２９＝ＩＴＭ２Ａの同定］
上記のようにブタの脳から単離した新鮮なＢＭＥＣを、コラーゲンＧ（Biochrom）上の雄牛の血清（ＰＡＡ）１０（ｖ／ｖ）％を加えたＭ１９９培地（Sigma）で精製または培養した。培養したＢＭＥＣから全ＲＮＡを、前述したように、初代の培地（Ｐ０）とそれぞれＴ７５細胞からの継代（Ｐ１〜３）から単離した。新鮮なＢＭＥＣとＰ０〜３を比較する発現パターンは、それぞれの場合でｇＡＰＤＨと１８ｓのｒＲＮＡに関する個々の遺伝子に特異的なプライマーを用いて調製した。この例および以下の例で説明するクローンが得られた。
【０１１３】
サブトラクション法によるクローンＳ１２９は、正プローブと共にディファレンシャルスクリーンに用いる逆プローブと比較して、５倍よりも強い信号を示すため、配列決定に選択される。クローンＳ１２９の配列は、配列番号１に示されている。このＳ１２９の配列により、Ｉｔｍ２Ａが明白に同定された。
最初にＩｔｍ２Ａの発現パターンを、前述したプライマーＩｔｍ２ａ．ｓ２（５’ＡＣＣ ＴＣＣ ＡＴＴ ＧＴＴ ＡＴＧ ＣＣＴ ＣＣＴ Ａ３’＝配列番号２）およびＩｔｍ２ａ．ａｓ２（５’ＧＦＦ ＧＣＣ ＴＣＴ ＣＡＣ ＴＣＴ ＴＧＡ ＣＡＧ Ａ３’＝配列番号３）を用いて調製し、ＧＡＰＤＨを対照として用いた。発現パターンは、ＲＴ−ＰＣＲ（描写せず）で得られた。
【０１１４】
半定量的発現パターンは、Ｉｔｍ２ＡがＢＭＥＣ内で、ＡＯＥＣ内よりも強く発現することを示している。これにより、ディファレンシャルハイブリダイゼーションの結果が確認される。さらに、ＢＭＥＣでの発現は、皮質（脳）での発現よりも明らかに強く、脳のＢＭＥＣへの特異性を示唆している。心臓においてのみ強い発現が観察されることから、筋肉における前述した発現と関連させることができるかもしれない。発現パターンは、ノーザンブロット解析により検証できる。ここで、ブタのＩｔｍ２Ａのコード領域（図１のａ）は、プローブとして利用する。
ノーザンブロットにおいて、ＢＭＥＣの特異性は、さらに明確である。ＢＭＥＣでのそのような発現、およびそこからＢＢＢでの発現は、これまで記述されていない。
【０１１５】
さらに、第２に、ＢＭＥＣにおいてさらに小さな転写物をノーザンブロットで認識できる。これを特徴づけるため、５’と３’の非コード領域と共にコード領域を、ＢＭＥＣにおいて、ＲＴ−ＰＣＲとＲＡＣＥ−ＰＣＲをそれぞれ用いて調査した。ここで、Ｉｔｍ２Ａには二つの３’非コード領域が存在し、短い方が交互のポリアデニル化信号により形成されていることが、配列の解析により明らかとなった。このようなことは、Ｉｔｍ２Ａについて、今日まで記述されていなかった。おそらく、転写の頻度、およびそれによるタンパク質の量が、二つの異なる３’領域によって、異なる安定性により調節されている。説明した実験は、ブタのＩｔｍ２Ａについて完全なｃＤＮＡ配列（完全なＣＤＳ１１９〜９１０）を与える（配列番号４＋配列番号５）。
【０１１６】
虚血症状において標的となるＩｔｍ２Ａ／Ｓ１９の発現は、前述した一般的な実験装置に従い検査した。ここで、ＢＭＥＣで標的となるｓ１２９は、虚血における発現が顕著に減少していることが明らかとなった。これは、虚血症状に関する疾患、例えば、脳卒中、心筋梗塞、合併症（例、グリア芽腫）を伴う腫瘍に、Ｉｔｍ２Ａが関与していることを示している。決定した発現パターンは、一方で、これらの疾患の診断マーカーとして標的を利用することを可能にし、他方で、上記疾患を根本的に治療するため標的を治療的に利用することも可能にする。虚血においてＩｔｍ２Ａの発現パターンを、１００％までの対照と比較したものを図１のｂに示す。ＢＭＥＣは、方法の部分で説明したように、虚血症状（ischemia）において一度、通常の条件（control）で一度、培養した。続いて、双方の試料で標的の発現を１８ＳのｒＲＮＡと比較して測定した。得られた値は１００％までを対照として、そこから虚血試料を引用した。
【０１１７】
ＢＢＢにおけるＩｔｍ２Ａの可能性のある役割について参考になる点を得るため、培養したＢＭＥＣにおける発現パターンを、既知のＢＢＢマーカーとＧＡＰＤＨのそれぞれとの比較で調査した。結果を図２に示す。これらのデータは、既知のＢＢＢマーカーについて説明されていたように、Ｉｔｍ２Ａの前に発現が急速に低下することを示している。しかし、ＧＡＰＤＨのようなハウスキーピング遺伝子は、調節を全く示さない。
【０１１８】
データは、ＢＢＢにおけるＩｔｍ２Ａの機能を明確に示している。軟骨細胞とＴ細胞との分化において、タンパク質の役割を検討すると、Ｉｔｍ２Ａは、ＢＢＢにおける内皮細胞の特定の分化状態にも対応することが結論として得られる。Ｉｔｍ２Ａは主に原形質膜に位置しているため、細胞のある状態によっては、おそらく、同質または異質の多量体を形成することにより、ここで受容体として機能しているように思われる。そのような受容体の細胞外部分は、分泌された分子または他の細胞の表面分子に結合し、受容体複合体の細胞内部分は、そのようなモデル、例えば、結合効果による分子配座の変化により、信号を変換でき、そして、細胞の応答を標的とする信号カスケードにおける信号は、それらの性質を変化させる。
【０１１９】
Ｉｔｍ２Ａは、デリールスニジュデル他（１９９６年）により、マウスの顆のｃＤＮＡライブラリーのディファレンシャルスクリーンによって、最初に発見された。タンパク質のコードは２６３アミノ酸からなり、II型の膜内在性タンパク質を示す。潜在性のグリコシル化部位を、顕在的なロイシン・ジッパーと共に有する。６つのエクソンからなる遺伝子は、骨形成組織で最も強く発現し、軟骨／骨分化の標識を示す。Ｉｔｍ２Ａは、三つの構成要素からなる新たな遺伝子ファミリーの一員である。ヒトとマウスとの間では、ファミリーの個々の構成員は、それぞれ高度に遺伝子が保存されている。個々の構成員の間での遺伝子の保存は、約４０％程度の量である。ここで、主にＣ−末端が保存されているが、Ｎ−末端は保存されていない。ロイシン・ジッパーの刺激は、Ｉｔｍ２Ａについてのみ発見されている。他方、このファミリーのタンパク質は、既知の配列による刺激を含んでいない。
【０１２０】
［第２例：Ｓ２３１の同定］
正プローブを逆プローブと比較するディファレンシャルスクリーンにおいて、サブストラクションクローンＳ２３１は、５倍よりも高い強度のシグナルを示し、それにより配列から選択された。クローンＳ２３１の配列は、配列番号６に示す。ＢＬＡＳＴ相同性調査により、配列Ｓ２３１は、ＥＭＰ１に対して最も高い相同性を示した。
【０１２１】
最初に、Ｓ２３１についての発現パターンを、前述したように、プライマーＳ２３１．５（５’ＣＣＡ ＴＡＡ ＣＴＣ ＴＴＴ ＣＡＣ ＧＣＡ ＡＣＴ Ｇ３’＝配列番号７）およびＳ２３１．１Ｒ（５’ＡＣＡ ＡＣＡ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＴＧ ＧＣＴ ＧＴＴ Ｔ３’＝配列番号８）を用いて調製した。ＧＡＰＤＨは、対照として使用した（図３参照）。
【０１２２】
この半定量的表現パターンは、Ｓ２３１は、ＡＯＥＣ内でよりも、ＢＭＥＣ内での方が、より強く発現されていることを示し、それゆえ、ディファレンシャルハイブリダイゼーションの結果が確認される。その上、ＢＭＥＣでの発現は、皮質（脳）におけるものよりも明らかに強く、脳におけるＢＭＥＣの特異性についての手がかりになっている。心臓においてのみ強い発現が見られるが、肺、結腸または脳では弱いだけである。ただし、この組織について、強い発現が文献に記載されている（ラットでは脳のみ）。これは、Ｓ２３１が実際にブタからのＥＭＰ１を表現しているのか、それとも、この遺伝子ファミリーの他のメンバーなのかとの疑問を提示している。
【０１２３】
これを明確にするため、ＢＭＥＣのｃＤＮＡライブラリー（λＴｒｉｐｌＥｘ２）を、Ｓ２３１をプローブ（放射性活性物質で標識した標準的な方法）として用いてスクリーニングした。いくつかのクローンを単離し、そのうち最大の二つのクローンを、それぞれ、５’末端から部分的に配列を決定した。いずれの配列も再びＥＭＰ１との高い相同性を示した。ここで、それぞれの場合における重複は、３’側の非コード領域に位置していた。
【０１２４】
Ｓ２３１が本当にブタのＥＭＰ１に関するものであるのか研究するため、ＲＴ−ＰＣＲを、ＢＭＥＣについて、ヒトのＥＭＰ１のコード領域から得られたプライマーｈｓＥＭＰ１．ｓ１（５’ ＧＧＴ ＡＴＴ ＧＣＴ ＧＧＣ ＴＧＧ ＴＡＴ ＣＴＴ Ｔ３’＝配列番号９）およびｈｓＥＭＰ１．ａｓ１ （５’ ＡＴＧ ＴＡＧ ＧＡＡ ＴＡＧ ＣＣＧ ＴＧＧ ＴＧＡ Ｔ３’＝配列番号１０）を用いて実施した。得られた生成物（ｓｓＥＭＰ１）はクローン化し、配列を決定した。その配列から、プライマーｓｓＥＭＰ１．１（５’ ＧＧＴ ＣＴＴ ＴＧＴ ＧＴＴ ＣＣＡ ＧＣＴ ＣＴＴ Ｃ３’＝配列番号１１）が得られた。第２のプライマーｓｓＥＭＰ１．１Ｒ（５’ ＴＴＣ ＴＣＡ ＧＧＡ ＣＣＡ ＧＡＴ ＡＧＡ ＧＡＡ ＣＧ３’＝配列番号１２）は、ヒトのＥＭＰ１のコード配列と、ブタからのＥＳＴ・Ｆ２３１１６との絶対的な一致部分から得られた。これら二つのプライマーｓｓＥＭＰ１．１／ｓｓＥＭＰ１．１Ｒを用いて、前述したように発現パターンを調製した（図４参照）。
【０１２５】
クローンＳ２３１およびＳＳＥＭＰ１からのプライマーに関する発現パターンは、実際に類似しているが、決して同一ではない。それゆえ、Ｓ２３１は、ｐｍｐ−２２／ｅｍｐ／ｍｐ２０遺伝子ファミリーの他のメンバーを示していることが仮定できる。
双方の発現パターンは、ノーザンブロット解析により解明された。ここで、クローンＳ２３１（図５のＡ）とＰＣＲ生成物ｈｓＥＭＰ１．ｓ１／ｈｓＥＭＰ１．ａｓ１（ＥＭＰ１）（図５のＢ）は、それぞれプローブ（図５参照）として使用した。
ノーザンブロットにおいて、ＢＭＥＣの特異性はさらに明確になる。ＢＭＥＣにおける発現、その結果、ＢＢＢにおける発現は、いずれもこれまで報告されていない。
【０１２６】
ノーザンブロットにおいて注目すべきは、叢（ただし、ここでは約２〜３倍量のＲＮＡを適用）および結腸における強い発現である。一方、ＲＴ−ＰＣＲによる発現は、心臓において強い。さらに、ＢＭＥＣの二種類の転写物の比率は、使用するプローブに応じて、明確に異なる。Ｓ２３１を用いると、小さな転写物に対する大きな転写物の比率は、ほぼ同じである。ＥＭＰ１をプルーブとして用いると、小さな転写物の方が顕著に強いことを示す。
【０１２７】
文献におけるＥＭＰ１の発現データを比較すると、ブタのＳ２３１はヒトやマウスのＥＭＰ１とは異なる転写物のサイズを有しており、さらに、異なる種のＥＭＰ１に関して、文献データにより、発現パターンが部分的かつ強く異なることが明らかとなる。転写物の段階での不一致は、ここで説明するＳ２３１がＥＭＰ１を表すのではなく、Ｓ２３１に相当するこの遺伝子ファミリーの他のメンバーを表していることを示している。おそらく、ヒトにおいては一つの遺伝子ＥＭＰ１のみが存在し、これが二種類のプロモーターにより制御されている。しかし、ブタにおいて、この機能は二つの異なる遺伝子であるＥＭＰ１とＳ２３１とが引き継いでいる。
【０１２８】
ブタのＳ２３１の完全なコード領域を得るために、ＢＭＥＣのｃＤＮＡライブラリーを、ＥＭＰ１をクローンキャプチャー・プローブとして、ｐＴｒｉｐｌＥｘ２でスクリーニングする。ここで、幾つかの完全なコード領域を含む正のクローンを単離した。これらは配列を決定し、そこから、タンパク質配列を導いた（配列番号１３および配列番号１４）。
ブタのＳ２３１とヒトのＥＭＰ１との同一性は、アミノ酸配列のレベルで７８％程度でしかなく、マウスに対しては７６％である。この結果も、Ｓ２３１はＥＭＰを表さないとの論理を支持する。すなわち、通常のタンパク質は、ヒトとブタとの間で８５〜９５％の同一性を有しているからである（図７参照）。
【０１２９】
ＢＢＢにおけるＳ２３１の積極的な役割について、手がかりを得るため、培養したＢＭＥＣにおける発現パターンを、第１例（図８参照）で説明したように、既知のＢＢＢマーカーとＧＡＰＤＨとのそれぞれと比較しながら研究した。これらのデータは、既知のＢＢＢマーカーで説明されているように、Ｓ２３１の発現の急速な減少を示す。しかし、ＧＡＰＤＨのようなハウスキーピング遺伝子は、制御を示さない。
【０１３０】
Ｓ２３１について既に説明した方法で実施したウェスタンブロット解析の結果、ＲＮＡレベルで得られた結果を確認した。ＢＭＥＣでは、ＡＯＥＣとは異なり、強いタンパク質の発現が認められる。その上、ウェスタンブロットの結果は、Ｓ２３１は、主に膜分画に存在することを示している。培養したＢＭＥＣにおいて発現は低下するが、低分子量のタンパク質はより多くの量が検出できる。これは、おそらく、Ｓ２３１の二つの異なるホモおよびヘテロダイマーが原因となっている。ウェスタンブロットは図６に示す。
データは、明らかにＢＢＢにおけるＳ２３１の機能を示している。他の細胞型の分化におけるタンパク質について既に述べたような役割を検討すれば、Ｓ２３１はＢＢＢの内皮細胞の特異的な分化状態に対応し、おそらく細胞付着分子またはチャネル（最も強く保存される膜領域）を示している。
【０１３１】
［第３例：Ｓ０１２の同定］
正プローブを逆プローブと比較するディファレンシャルスクリーンにおいて、サブストラクションクローンＳ０１２は、５倍よりも高い強度のシグナルを示し、それにより配列から選択された。クローンＳ０１２の配列は、配列番号１５に示す。配列に基づき、Ｓ０１２は、ヒトの仮定的なタンパク質であるＦＬＪ１３４４８と明らかに一致した。
【０１３２】
最初に、Ｓ０１２について、プライマーＳ０１２．ｓ１（５’ＧＴＡ ＴＣＧ ＧＧＡ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＡＴ ＴＡＣ Ａ３’＝配列番号１６）およびＳ０１２．ａｓ１（５’ＣＣＣ ＧＡＧ ＧＴＡ ＴＡＴ ＴＴＧ ＴＴＴ ＣＴＧ Ｇ３’＝配列番号１７）を既に述べたように用いて、発現パターンを調製した。ＧＡＰＤＨは、対照として使用した（発現パターンは示さず）。
【０１３３】
この半定量的な発現パターンは、Ｓ０１２はＢＭＥＣ中で、ＡＯＥＣ中よりも、より強く発現することを示し、その結果、ディファレンシャルハイブリダイゼーションの結果が確認できる。その上、ＢＭＥＣにおける発現は、皮質（脳）におけるものよりも明らかに強く、これが脳におけるＢＭＥＣの特異性についての手がかりになっている。心臓においてのみ強い発現が見られる。ブタのＳ０１２／ＦＬＪ１３４４８のｃＤＮＡ全長は、５’と３’のＲＡＣＥ−ＰＣＲを重ねることにより得られ、タンパク質配列と共に、配列番号１８および配列番号１９に示す。
【０１３４】
発現パターンは、ノーザンブロット解析により確認した。全長クローンＦＬＪ１３４４８／Ｓ０１２（配列番号：１８）は、このためのプローブとして用いた（図９参照）。
ノーザンブロットにおいて、ＢＭＥＣの特異性は、より明確になる。ＢＭＥＣおよびそれによるＢＢＢでの発現については、これまで報告されていない。
Ｓ０１２は、ヒトの仮定的タンパク質ＦＬＪ１３４４８と同じであり、対応するマウスのもの（ＸＭ １２９７２４）と相同である。ヒト、ネズミおよびブタのＦＬＪ１３４４８／Ｓ０１２の相同性の比較を図１０に示す。シグナルペプチドとして機能するペプチドおよび開裂するペプチドは、それぞれの場合、イタリックで印刷されている。
【０１３５】
Ｎ末端の６０アミノ酸の低い保存性と、Ｃ末端の高い相同性のそれぞれは、驚異的である。おそらく、Ｎ末端は、細胞内のタンパク質の正確な位置に対応するシグナルペプチドを示している。生命情報科学の研究結果は、細胞内のタンパク質のミトコンドリアにおける位置を示している。タンパク質の機能は、強く保存されているＣ末端に依存している。
ＢＢＢにおけるＦＬＪ１３４４８／Ｓ０１２の積極的な役割について手がかりを得るため、第１例（図１１参照）で説明したように、培養したＢＭＥＣにおいて、既知のＢＢＢマーカーとＧＡＰＤＨとの比較により、発現パターンを研究した。
これらのデータは、明らかにＢＢＢにおけるＦＬＪ１３４４８／Ｓ０１２の役割を示す。培養したＢＭＥＣにおける発現の強い低下は、細胞の分化状態に伴うＦＬＪ１３４４８／Ｓ０１２の調節を示している。
【０１３６】
［第４例：ＮＳＥ２の同定］
試料材料を［２次元ディファレンシャルゲル電気泳動によるＢＢＢ−特異的タンパク質の同定］の項で説明したように調製した。
【０１３７】
ディファレンシャルスポット１．１．０．１．１０．３７に、ＭＡＬＤＩ・ＴＯＦ分析を行った結果、以下のペプチド分子量が得られた：８６１．４９９；８７８．４７；９７５．５０；１０５６．６１；１１３２．５３；１１９８．７１；１２１６．７１；１２２７．５３；１３４７．６９；１４３０．７６；１４３８．６９；１５１６．７１；１６２３．７９；１７９０．８７；１７９６．８１；１９３５．９３；１９５４．０５；２０８１．０２；２２３１．０７；２３７５．０８；２５７７．０９；２６１３．１。
【０１３８】
スポット１．１．０．１．１０．３７は、ＮＣＢＩデータベースにおける詳細なデータベース分析により、ＮＳＥ３であることが同定された。ヒトのＮＳＥ２は、計算上の分子量が３４．５ｋＤａで、ｐＩ値が５．４であり、いずれも２次元ゲルにおいてスポット１．１．０．１．１０．３７が観察された位置と良く一致している。下線を付したペプチド分子量は、ヒトの配列と同じであると思われるものに割り当てている。図１２は、ペプチド分子量が、ヒトのタンパク質の配列をカバーする部分を表している。
【０１３９】
最初に、ＮＳＥ２について、プライマーｓｓＮＳＥ２．ｓ１（５’ＣＧＣ ＧＴＧ ＧＴＧ ＡＡＴ ＧＡＴ ＣＴＧ ＴＡ３’＝配列番号２０）およびｓｓＮＳＥ２．ａｓ１（５’ＣＴＣ ＣＡＴ ＧＡＴ ＣＡＧ ＧＴＣ ＣＴＣ ＣＡＧ３’＝配列番号２１）を既に述べたように用いて、発現パターンを調製した。ＧＡＰＤＨは、対照として使用した。
この半定量的な発現パターンは、ＮＳＥ２の発現は心臓で最も高く、ＢＭＥＣおよび皮質（示さず）がこれに次ぐことを示している。この結果は、ノーザンブロット分析（図１３参照）により確認された。ハイブリダイゼーションでは、３’ＲＡＣＥ−ＰＣＲで得られたブタのＮＳＥ２の部分的ｃＤＮＡ配列（配列番号２２および配列番号２３）を使用した（ＣＤＳ１〜１９２は部分的にＣ末端部分をコードする）。
【０１４０】
ＢＢＢにおけるＮＳＥ２の積極的な役割について手がかりを得るため、第１例で説明したように、培養したＢＭＥＣにおいて、既知のＢＢＢマーカーとＧＡＰＤＨとの比較から、発現パターンを研究した。結果は、図１４に示す。これらのデータは、ＮＳＥ２の発現の急速な減少を示し、それゆえ、ＢＢＢにおけるＮＳＥ２の機能を示す。
図１５は、ヒトのＮＳＥ２とＮＳＥ１との相同性の比較を示す。
【０１４１】
ホスホリラーゼ活性部位は、通常のフォントで示している。下線部は、チロシンキナーゼ部位と見なされる（プロサイト・パターン・マッチＰＳ００１０９）。ここで、活性残基は、太字で示している。図１６は、ＮＳＥ２におけるＰＥＳＴ部位の分配を示す。ＰＥＳＴ配列は、タンパク質中のＰｒｏ、Ｇｌｕ、ＳｅｒおよびＴｈｒが豊富な領域であって、これらのタンパク質のユビキチン制御における細胞内の短い半減期に対応する。ＲＥＳＴ領域（明るい灰色）における幾つかのＳｅｒまたはＴｈｒ残基によるホスホリラーゼ活性は、ユビキチン・プロテアソーム経路による処理認識において重要である。
【０１４２】
ヒトＮＳＥ２の８１〜１６３位は、ＮＬＰ／Ｐ６０ファミリー（ｐｆａｍ領域００８７７．４）と相同性を示す。ＮＬＰ／Ｐ６０ファミリーは、幾つかのリポタンパク質で発見されているが、機能は明らかではない。
さらに、この目的物は、虚血の諸症状についても研究した。ここで、虚血において、ＢＭＥＣにおけるＮＳＥ２の発現として、ＮＳＥ２が減少することが明らかになった（図１７参照）。このことは、虚血状態に伴う症状、例えば、卒中、心筋梗塞および腫瘍に伴う症状、例えば、グリア芽細胞に、ＮＳＥ２が関与していることを示す。その上、ＮＳＥ２の発現を制御することで、原因についての根本的な治療も可能になる。
【０１４３】
［第５例：ＤＲＧ−１の同定］
試料材料を［２次元ディファレンシャルゲル電気泳動によるＢＢＢ−特異的タンパク質の同定］の項で説明したように調製した。
【０１４４】
ディファレンシャルスポット１．１．０．１．１１．１２に、ＭＡＬＤＩ・ＴＯＦ分析を行った結果、以下のペプチド分子量が得られた：７８９．４５；８８０．４７；８９０．５０；９４８．４９；１２０４．６８；１２１７．６４；１２８９．５８；１４２８．７０；１５１７．７９；１５７３．７３；１７５３．９１；２０１７．０８。
【０１４５】
スポット１．１．０．１．１１．１２は、ＮＣＢＩデータベースにおける詳細なデータベース分析により、取得番号ＣＡＢ６６６１９に相当する仮説的なタンパク質であることが同定された。同じタンパク質は、データベースの他の記載では、ドーパミン応答性タンパク質ＤＲＧ−１、ＬＹＳＴ相互作用タンパク質ＬＩＰ５およびＨＳＰＣ２２８として記録されている。仮定的タンパク質ＣＡＢ６６６１９／ＤＲＧ−１は、計算上の分子量が３３．８ｋＤａで、ｐＩ値が６．１であり、いずれも２次元ゲルにおいてスポット１．１．０．１．１１．１２が観察された位置と良く一致している。下線を付したペプチド分子量は、ヒトの配列と同じであると思われるものに割り当てている。図１６は、ペプチド分子量が、ヒトのタンパク質の配列をカバーする部分を表している。
【０１４６】
ヒト（ＣＡＢ６６６１９）とマウス（ＸＰ−１２５５０８）との相同性の比較から、非常に高い相同性が、特にａａ１〜１８０領域において認められる。生命情報科学の研究結果は、膜内外の領域を示し、Ｎ末端部分が細胞内に位置していることを示している。細胞内領域は保存性が高いホスホリラーゼ部位を示し、ヒトの配列（図１９参照）では、グリコシル化部位が細胞外であることが予想される。
【０１４７】
最初に、既に説明したようにＣＡＢ６６６１９．ｓ１（５’ＣＧＡ ＧＡＣ ＣＣＴ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＡＣ３’＝配列番号２４）およびＣＡＢ６６６１９．ａｓ１（５’ＣＴＧ ＧＴＧ ＴＡＴ ＴＡＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＣＧＴ ＧＴＧ３’＝-配列番号２５）を用いて、ＤＲＧ−１の発現パターンを調製した。ＧＡＰＤＨは、対照として用いた。
半定量的な発現パターン（図２０、ノーザンブロット解析で確認した）は、ブタのＤＲＧ−１は、ＢＭＥＣでの発現が、ＡＯＥＣでの発現よりも弱いことを示している。これは、２次元ゲルでの結果と全くは反対である。一般に、ＤＲＧ−１は、実際に強度が異なって発現し、非常にユビキチン的である。それゆえ、２次元ゲルで起きた相違は、ＢＭＥＣにおけるＤＲＧ−１の特別な転写後の修飾によるはずである。このような相違は、例えば、予想されるホスホリラーゼ部位で起こり得る。細胞特異的なホスホリラーゼ活性は、そのようにして、タンパク質の活性を決定できる。
【０１４８】
ＢＢＢにおけるＤＲＧ−１の積極的な役割について手がかりを得るため、第１例（図２１参照）で説明したように、培養したＢＭＥＣにおける発現パターンを、既知のＢＢＢマーカーおよびＧＡＰＤＨとそれぞれ比較することにより研究した。これらのデータは、ＤＲＧ−１の発現の明確な減少を示し、それゆえ、ＢＢＢにおけるＤＲＧ−１の機能を示している。
配列番号２６および２７は、ブタのＤＲＧ−１の部分的ｃＤＮＡ配列を示している（ＣＤＳ１−５８５、中央の部分）
【０１４９】
［第６例：ＴＫＡ−１の同定］
試料材料を［２次元ディファレンシャルゲル電気泳動によるＢＢＢ−特異的タンパク質の同定］の項で説明したように調製した。
【０１５０】
ディファレンシャルスポット１．１．０．１．６．３０に、ＭＡＬＤＩ・ＴＯＦ分析を行った結果、以下のペプチド分子量が得られた：７７６．４４；８４７．４７；９００．５０；９１６．４６；９７６．５２；１０４８．５８；１０８５．６１；１１２７．６６；１１３７．５５；１１６７．６７；１１８０．６８；１２１２．６９；１２３４．６９；１２９１．６７；１３０１．６７；１３０３．６９；１３３８．７２；１３５０．７０；１３７０．６５；１４１９．７０；１４２３．７７；１４３４．７９；１４４０．７９；１４５６．７６；１４６６．７６；１４６７．７１；１４８３．７７；１５４７．７８；１５５８．８５；１６６５．９０；１７１４．９６；１７１６．９０；１７４０．８０；１７６２．９０；１８３８．９２；１８９７．９９；２０２５．１１；２０５４．０６；２２３４．１５；２２４３．２０；２２４４．１８。
【０１５１】
スポット１．１．０．１．６．３０は、ＮＣＢＩデータベースにおける詳細なデータベース分析により、ＴＫＡ−１であることが同定された。下線を付したペプチド分子量は、ヒトの配列と同じであると思われるものに割り当てている。図２２は、ペプチド分子量が、ヒトのタンパク質の配列をカバーする部分を表している。
データベースにおいて、ＴＫＡ−１の３種類の形態が見いだされ、以下に述べる計算上の分子量とｐＩ値を有している：ＣＡＡ９０５１１：４９．３ｋＤＡ／ｐＩ６．７；ＢＡＡ３３２１６：３７．４ｋＤＡ／ｐＩ７．９；ＡＡＢ５３０４２：、３６．２ｋＤＡ／ｐＩ８．２。 ２次元ゲルでの位置は、明らかに大きな形態を示している。ＢＡＡ３３２１６の形態は、ここで明確に実験的に見いだされた。すなわち、取得番号ＡＡＢ５３０４２のタンパク質では、ペプチドＤＧＳＡＷＫＱＤＰＦＱ（図２２における斜字）が失われている。ただし、ＭＡＬＤＩ分析では、トリプシン断片において部分的に（下線部が）認められた。
【０１５２】
ヒト、マウスおよびラットにおけるＴＫＡ−１配列の比較の結果、高い配列保存性が明らかとなる。ＴＫＡ−１は、タンパク質−タンパク質相互作用を調節する二つのＰＤＺ領域を有している。これらのＰＤＺ領域に、幾つかの活性ホスホリラーゼ活性部位が位置している。これにより他のタンパク質との相互作用を調節することができる。また、Ｎ−グリコシル化部位も保存されている。
【０１５３】
最初に、ＴＫＡ−１の発現パターンを、プライマーｓｓＳＬＣ９Ａ３Ｒ２．ｓ１（５’ＡＡＡ ＡＧＧ ＣＣＣ ＣＣＡ ＧＧＧ ＴＴＡ ＣＧ３’＝配列番号２８）およびｓｓＳＬＣ９Ａ３Ｒ２．ａｓ１（５’ＧＧＡ ＧＴＧ ＧＧＣ ＡＧＣ ＡＧＧ ＴＧＡ ＧＣ３’＝配列番号２９）を用いて調製した。ＧＡＰＤＨは、対照として用いた。
【０１５４】
配列パターンは、ノーザンブロット解析で確認した。ここで、二種類のプライマーｓｓＴＫＡ−１ｃｔｇ．ｓ１（５’ＴＴＡ ＡＣＣ ＴＧＣ ＡＣＡ ＧＣＧ ＡＣＡ ＡＧＴ３’＝配列番号３０）およびｓｓＴＫＡ−１ｃｔｇ．ａｓ１（５’ＴＴＧ ＣＴＧ ＡＡＧ ＡＴＣ ＴＣＡ ＣＧＣ ＴＴＣ３’＝配列番号３１）間の５５０ｂｐのＰＣＲ生成物ｓｓＴＫＡ−１．ｃｔｇを、プローブとして用いた。ＧＡＰＤＨは、対照として用いた。
【０１５５】
ノーザンブロット（図２３）は、ＴＫＡ−１がＢＭＥＣにおいて最も強く発現し、ＢＭＥＣにおいて３種類の異なる転写物を生じることを示している。発現型は、肺において比較的強い。ただし、ここで、小さな転写物は、完全に失われている。現在まで、ＴＫＡ−１とＢＢＢあるいは内皮細胞との関係について、説明している文献は存在していない。
【０１５６】
ＢＢＢにおけるＴＫＡ−１の積極的な役割について手がかりを得るため、実施例１（図２４参照）で説明したように、既知のＢＢＢマーカーおよびＧＡＰＤＨとそれぞれ比較することにより、培養したＢＭＥＣにおける発現パターンを研究した。これらのデータは、ＴＫＡ−１の明確な減少を示し、それゆえＢＢＢにおけるＴＫＡ−１の機能を指摘している。
【０１５７】
虚血における発現に関して、目的とするＴＫＡ−１について、既に述べたように研究した。ここで、虚血において、ＢＭＥＣの発現に関してこの目的物が強く減少することが示された。このことは、虚血状態に伴う症状、例えば、卒中、心筋梗塞および腫瘍に伴う症状、例えば、グリア芽細胞に、ＴＫＡ−１が関与していることを示す。ＴＫＡ−１の発現を研究することで、これらの疾患における診断上のマーカーを使用することが可能になる。目的とするＴＫＡ−１は、既に充分に説明した疾患に対する根本的な治療の出発点として適している。
【０１５８】
虚血において、ＢＭＥＣにおけるＴＫＡ−１の発現パターンを、対照と比較したものを図２５に示す。ＢＭＥＣは、一度虚血条件（ischemia）で培養し、さらに一度、方法の部分で説明したように通常の条件（control）で培養する。引き続き、双方の試料で目的物の発現を、１８ＳのｒＲＮＡとの相対的な関係で測定した。得られた値は、対照を１００％として、虚血試料ではそれを参照した。
【０１５９】
ＴＫＡ−１のウェスタンブロット解析の結果により、ＲＮＡレベルで得られた結果を確認した。ＢＭＥＣでは、タンパク質の強い発現が認められるが、ＡＯＥＣでは希である。その上、ウェスタンブロットでは、ＴＫＡが第１に膜を伴い、かつ核内に存在することを示している。培養したＢＭＥＣでは、発現が非常に急速に減少し、最初の世代を過ぎるともはや検出できなくなる。ＴＫＡ−１のウェスタンブロット解析を図２６に示す。
配列番号３２および配列番号３３は、ブタのＴＫＡ−１の部分的なｃＤＮＡ配列を示している（ＣＤＳ１〜７４１は、部分的にＣ末端部分をコードしている）。
【０１６０】
［第７例：Ｓ０６４／ＡＲＬ８の同定］
正プローブを逆プローブと比較するディファレンシャルスクリーンにおいて、サブストラクションクローンＳ０６４は、５倍よりも高い強度のシグナルを示し、それにより配列から選択された。クローンＳ０６４の配列は、配列番号３５に示す。この配列に基づくと、Ｓ０６４を既知の遺伝子と照合することができない。ＢＬＡＳＴ調査の結果から、ＤＫＦＺのｃＤＮＡクローンｐ４３４０１３１７に対して有意な相同性が認められる。ただし、ｐ４３４０１３１７は、明確なコード領域を含んでいない。
【０１６１】
対応するタンパク質を同定するため、ブタのＢＭＥＣからのｃＤＮＡライブラリーを、サブストラクション法のクローンＳ０６４でスクリーニングした。ここで、二つの独立したクローンが同定された。長い方のクローンＳ０６４．３の配列を配列番号３６に示す。ＢＬＡＳＴ調査の結果では、この配列も既知の遺伝子と照合することができない。
【０１６２】
ただし、クローンＳ０６４．３の配列は、ヒトゲノムの相同性比較により、領域１０ｐ１２に位置している可能性がある。この遺伝子座の同じ方向における次の遺伝子は、ＡＤＰ−リボシル化−８因子類似（ＡＲＬ８）である。Ｓ０６４がＡＲＬ８の新たな３’末端を示しているかどうかを確認するため、結合ＰＣＲを実施した。ここで、プライマーｈｓＡＲＬ８．ｓ１（５’ＴＡＡ ＴＧＣ ＡＧＧ ＧＡＡ ＡＡＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＴＣＴ３’、配列番号３７）およびＳ０６４．３Ｒ（５’ＡＡＣ ＣＡＡ ＧＡＧ ＡＣＡ ＴＧＴ ＴＧＧ ＣＡＣ Ｔ３’、配列番号３８）を、一段ＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＢＭＥＣのＲＮＡと共に用いた。生成物の特異性を調べるために、一段ＲＴ−ＰＣＲの生成物を１：１０００に希釈し、プライマーｈｓＡＲＬ８．ｓ２（５’ＡＴＡ ＧＣＡ ＴＴＧ ＡＣＡ ＧＧＧ ＡＡＣ ＧＡＣ Ｔ３’、配列番号３９）およびＳ０６４．ＧＳＰ２（５’ＣＴＧ ＣＴＡ ＧＡＴ ＴＣＡ ＡＧＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＧＣ３’、配列番号４０）と共に、入れ子式のＰＣＲで用いた。ここで得られた生成物は、クローン化し、配列を決定した。得られた配列により、サブストラクション法のクローンＳ０６４が、遺伝子ＡＲＬ８を表していることが明確に確認される。
【０１６３】
ＡＲＬ８を完全にコードするｃＤＮＡ配列は、一段ＲＴ−ＰＣＲを利用し、ＢＭＥＣのＲＮＡとプライマーＳ０６４ｃｄｓ．ｓ１（５’ＣＴＣ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＧＧ ＣＴＧ ＡＴＣ ＴＴＣ３’、配列番号４１）およびＳ０６４ｃｄｓ．ａｓ１（５’ＡＴＣ ＴＣＡ ＣＡＣ ＣＡＡ ＴＣＣ ＧＧＧ ＡＧＧ Ｔ３’、配列番号４２）を用いて得ることができた。ブタのＡＲＬ８のコード配列は配列番号４３に、それによりコードされるタンパク質を配列番号４４に示す。この高度な配列保存性は、このタンパク質の非常に有用な役割を指摘している。ＡＲＬ８（ブタ）のｃＤＮＡ配列は、ヒトおよびマウスの対応する配列のコード領域と比較して、それぞれ９５％および９２％の相同性を有している。
【０１６４】
Ｓ０６４について、説明したように、プライマーＳ０６４．ｓ１（５’ＡＡＧ ＣＣＴ ＧＡＡ ＧＣＴ ＴＧＡ ＴＧＧ ＡＴＡ Ａ３’、配列番号４５）およびＳ０６４．ａｓ１（５’ＣＡＡ ＴＴＡ ＣＡＧ ＣＴＴ ＴＧＣ ＴＣＣ ＴＧＴ Ｇ３’、配列番号４６）を用いて、発現パターンを調製した。１８ＳのｒＲＮＡは、対照として用いた。いずれのプライマーＳ０６４ｃｄｓ．ｓ１／ａｓ１も、ヒトとブタとの高い相同性（例えば、結合ＰＣＲの生成物）のため、ヒトの配列に由来させた。一般的なプライマー設計における次の手順として、完全なコード領域を二つのプライマーで挟むことを行った。その方法では、プライマーＳ０６４ｃｄｓ．ｓ１が７〜９位においてＡＴＧ開始コドンを含み、プライマーＳ０６４ｃｄｓ．ａｓ１の２２位が終止コドンの最初の塩基を示す。発現パターンを図２７に示す。
【０１６５】
発現パターンは、ＡＲＬ８のコー路領域からの別のプライマー対ＡＲＬ８ｃｄｓ．ｓ１（５’ＡＴＡ ＧＣＡ ＴＴＧ ＡＣＡ ＧＧＧ ＡＡＣ ＧＡＣ Ｔ３’、配列番号４７）およびＡＲＬ８ｃｄｓ．ａｓ１（５’ＧＡＡ ＣＴＧ ＡＧＧ ＧＴＧ ＡＧＧ ＴＡＴ ＴＴＧ Ｇ３’、配列番号４８）を用いて繰り返した。発現パターンを図２８に示す。
【０１６６】
さらに、発現パターンをノーザンブロット解析で確認した。ここで、クローンＳ０６４をプローブとして用いた。結果を図２９に示す。
これら三種類の実験は、ＢＢＢ、すなわち脳血管関門についてＡＲＬ８の非常に高い特異性を示す。ＢＭＥＣおよびＢＢＢにおけるそれぞれの発現は、これまで報告されていない。ここで示される高い特異性は、ＢＢＢにおけるＡＲＬ８の非常に重要な役割を示している。
【０１６７】
ＢＢＢにおけるＡＲＬ８の運動機能に対して手がかりを得るため、発現パターンを培養したＢＭＥＣにおいて調べ、既知のＢＢＢマーカーと比較した。結果を図３０に示す。
データは、培養したＢＭＥＣにおいてＡＲＬ８の発現の急速な減少を示し、それゆえ、ＢＢＢにおけるＡＲＬ８の活性作用を指摘している。
【０１６８】
ＡＲＬ８は、調節ＧＴＰ加水分解酵素のＲＡＳ超ファミリーに属している。これらは、細胞成長因子の転移、細胞骨格の構築、細胞膜輸送（エキソサイトーシスおよびエンドサイトーシス）のような複数の処理に含まれている。ＡＲＬ８は、最初に、セボールド他により２００３年に報告された。ただし、彼らは、大人の脳での発現を示すことができなかった。この例は、ＢＢＢにおけるＡＲＬ８の実際の発現を最初に示す。この結果は、ＡＲＬ８は、ＢＢＢの内皮細胞の特異的な分化状態に依存し、それにより、ＢＢＢの機能に寄与していることを示している。
【０１６９】
［第８例：５Ｇ９／ＰＮＯＶ１の同定］
正プローブを逆プローブと比較するディファレンシャルスクリーンにおいて、サブストラクションクローン５Ｇ９は、５倍よりも高い強度のシグナルを示し、それにより配列から選択された。クローン５Ｇ９の配列は、配列番号４９に示す。この配列に基づくと、５Ｇ９は、新規なタンパク質ＨＳＮＯＶ１（ＡＡＨ３９１９５）をコードするヒトの転写物（ＮＣＢＩデータベースの番号ＢＣ０３９１９５）に対応させることができた。ｍＲＮＡ分子について説明したこのデータベースの記述では、オープンリーディングフレームとその結果として生じる仮定的なタンパク質をアノタチオンと同定している。これは、実験データによるものではなく、コンピューター・ベースの予測である。得られるタンパク質は、既知のタンパク質と類似性を示すことなく、それゆえ、新規なタンパク質と呼ぶことができた。
【０１７０】
５Ｇ９の発現パターンを、既に述べたように、プライマー５Ｇ９．１（５’ＴＧＴ ＡＴＡ ＴＧＴ ＧＧＧ ＡＣＡ ＧＣＣ ＡＴＣ Ａ３’、配列番号５０）および５Ｇ９．１Ｒ（５’ＧＴＣ ＣＧＡ ＧＣＡ ＧＧＡ ＴＡＴ ＡＣＴ ＴＣＣ Ａ３’配列 番号５１）を用いて調製した。１８ＳのｒＲＮＡを参照として使用した。発現パターンの決定に用いるプライマー対は、一般的な原則に従い入手した。すなわち、プライマーの融点は５５〜７５℃であり、二つのプライマーの融点はほぼ同じ値であり、１８〜２６塩基対の長さであり、至適ＧＣ含率が４０〜６０％であり、ヘアピンループを避け、ホモおよびヘテロダイマーの形成を避け、生成物のサイズが１００〜３００ｂｐであるようにした。発現パターンを図３１に示す。
【０１７１】
発現パターンは、５Ｇ９が、主にＢＢＢ、結腸および腎臓で形成されることを示している。脳では、発現がＢＭＥＣに特異的であるように見える。ＢＭＥＣおよびＢＢＢにおけるそれぞれの発現は、これまでに報告されていない。
ブタの対応するタンパク質を同定するため、クローン５Ｇ９の配列から出発して、ブタの完全なｃＤＮＡであるＰＮＯＶ１を、５’および３’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ（配列番号５２）を用いて単離した。この４８０〜１４６６位の転写物は、配列番号５３のタンパク質をコードしている。ＨＳＮＯＶ１とＰＮＯＶ１との相同性の比較を図３２に示す。
【０１７２】
ＨＳＮＯＶ１とＰＮＯＶ１との相同性は、９４％である。ただし、ＰＮＯＶ１は、ＨＳＮＯＶ１と比較して、Ｎ末端が４７アミノ酸だけ短い。ＨＳＮＯＶＩにおけるこの部分の配列は、後に切断されるシグナル配列を意味している可能性がある。
タンパク質ＨＳＮＩＯＶ１は、他の既知のタンパク質と有意な相同性を全く示さない。生命情報科学の研究結果は、８つの細胞間領域の存在を示している（図３３参照）。
【０１７３】
さらに、いくつかの領域（例えば、インタープロ領域ｉｐｒ００２６５７）が発見され、輸送体としての機能が示された。
これらのデータは、ＰＮＯＶ１／ＨＳＮＯＶ１がＢＢＢにおける新規な輸送体であることを示しているようである。同様のことは、多くの物質に対する高い輸送活性を有している二つの組織、結腸および腎臓でも起きる。
【０１７４】
［第９例：５Ｅ７／ＴＳＣ−２２の同定］
正プローブを逆プローブと比較するディファレンシャルスクリーンにおいて、サブストラクションクローン５Ｅ７は、５倍よりも高い強度のシグナルを示し、それにより配列から選択された。クローン５Ｅ７の配列は、配列番号５４に示す。この配列に基づき、５Ｅ７は、形質転換成長因子ベータ刺激タンパク質ＴＳＣ２２であると明確に同定された。
【０１７５】
クローン５Ｅ７は、転写物ＴＳＣ−２２の３’末端を示す。ブタの完全なｃＤＮＡを得るため、５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲを実施した。このＰＣＲ生成物をクローン化し、配列を決定した。ブタのＴＳＣ−２２からの完全なｃＤＮＡ配列を、配列番号５５に示す。ここでコード領域は、２４３〜６７７位に位置している。これに対応するタンパク質を、配列番号５６に示す。ブタのタンパク質は、既に明らかとなったヒトのタンパク質ＴＳＣ−２２と１００％相同であって、これは、このタンパク質の特別な重要性を示している。
【０１７６】
５Ｅ７について、説明したノーザンブロット分析により、発現パターンを調製した。ここで、サブトラクション法のクローン５Ｅ７をプローブとして利用した（図３４参照）。
実験結果は、全脳と比較して、ＢＭＥＣにおいてＴＳＣ−２の強い発現を示した。これにより、血液脳関門における特異性が示された。ＢＭＥＣおよびＢＢＢのそれぞれにおける発現は、これまで報告されていない。
【０１７７】
ＢＢＢにおけるＴＳＣ−２２の積極的な役割について手がかりを得るため、培養したＢＭＥＣにおいて、既知のＢＢＢマーカーおよび１８ＳのｒＲＮＡとの比較により、発現パターンを調べた。定量的なＰＣＲのため、プライマー５Ｅ７．１（５’ＡＡＧ ＡＧＧ ＴＧＴ ＧＧＣ ＴＴＧ ＴＣＴ ＴＴＴ Ａ３’、配列番号５７）および５Ｅ７．１Ｒ（５’ＴＴＴ ＴＴＣ ＡＡＡ ＧＴＡ ＴＴＣ ＡＡＣ ＣＡＧ ＣＴＣ３’、配列番号５８）を用いた。結果を図３５に示す。
【０１７８】
データは、培養したＢＭＥＣにおけるＴＳＣ−２２の発現の急速な減少を示しており、それゆえ、ＢＢＢにおけるＴＳＣ−２２の役割を明確に示している。ＴＳＣ−２２に関して、培養したＢＭＥＣにおける発現の強い減少は、細胞の分化状態に関係している。
虚血状態のＢＭＥＣにおけるＴＳＣ−２２の発現は、同様に研究した。結果を図３６に示す。
【０１７９】
目的とするＴＳＣ−２２は、虚血状態のＢＭＥＣにおいて、その発現が強く縮小する。これは、虚血の症状を伴う疾患に、ＴＳＣ−２２が積極的に機能的な役割をすることを実現可能にする。これらの疾患には、卒中、心筋梗塞および腫瘍に伴う症状、例えば、グリア芽細胞が属する。ＴＳＣ−２２の発現の研究結果は、これにより、これらの疾患の診断上のマーカーとして利用することができる。この知識に基づき、ＢＢＢの機能不全に伴う疾患について、治療上の概念を展開することができる。
【０１８０】
ＴＳＣ−２２は、ロイシン・ジッパー（ケスター他、１９９９年）を伴う転写因子群に属している。特に、ＴＧＦ−ベータのシグナル転移に関し（カワマタ他、１９９８年）、それゆえ、細胞成長と細胞分化における役割を示す。
この結果は、ＴＳＣ−２２がＢＭＥＣの分化状態において共通の応答であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】ａはＩｔｍ２Ａのノーザンブロット解析であり、ｂは虚血状態のＢＭＥＣにおけるＩｔｍ２Ａの発現である。
【図２】培養したＢＭＥＣにおけるＩｔｍ２Ａの発現パターンである（Ｍ：１００ｂｐマーカー）。
【図３】Ｓ２３１の発現パターンである（Ｍ：１００ｂｐラダー）。
【図４】ｓｓＥＭＰ１の発現パターンである（Ｍ：１００ｂｐラダー）。
【図５】Ｓ２３１（Ａ）およびＥＭＰ１（Ｂ）を、それぞれプローブとしてハイブリダイズさせたノーザンブロット解析である。
【図６】Ｓ２３１のウェスタンブロット解析である。
【図７】ヒトとネズミのＥＭＰ１並びにブタのＳ２３１の相同性比較であり、膜領域はハイライトの薄い色で、Ｎ−グリコシル化部位は明るい灰色で示す。
【図８】培養細胞におけるＳ２３１の発現パターンである（Ｍ：１００ｂｐマーカー）。
【図９】ＦＬＪ１３４４８／Ｓ０１２の全長をプローブとしてハイブリダイズしたノーザンブロットである。
【図１０】ヒト、ネズミおよびブタのＦＬＪ１３４４８／Ｓ０１２の相同性比較であり、それぞれの場合、ペプチドはシグナルペプチドとして機能し、開裂する。その部分は、斜字で表されている。
【図１１】培養細胞におけるブタのＦＬＪ１３４４８／Ｓ０１２の発現パターンである（Ｍ：１００ｂｐマーカー）。
【図１２】ヒトのタンパク質のＮＳＥ２アミノ酸配列であり、マスフィンガープリント法で同定されたペプチドは、太字の下線を付けたフォントで示されている。
【図１３】配列番号２２をプローブとしてハイブリダイズしたＮＳＥ２のノーザンブロットである。
【図１４】培養細胞におけるＮＳＥ２の発現パターン（Ｍ：１００ｂｐマーカー）。
【図１５】ヒトのＮＳＥ２とＮＳＥ１との相同性の比較であり、ホスホリラーゼ活性部位は淡いフォントで示され、チロシンキナーゼ活性領域（プロサイト・パターン・マッチＰＳ００１０９）は下線が引かれ、そこで活性残基は太字で示されている。
【図１６】ＮＳＥ２のＰＥＳＴ領域の分配であり、ＰＥＳＴ配列はタンパク質中のＰｒｏ、Ｇｌｕ、ＳｅｒおよびＴｈｒが豊富な領域であり、それらは細胞中のそれらのタンパク質の短い半減期に対応し、それらはそれらのタンパク質のユビキチン化を制御し、ＰＥＳＴ領域（淡い色）におけるＳｅｒまたはＴｈｒ残基のホスホリル化は、ユビキチン・プロテアゾーム経路の認識と処理に重要である。
【図１７】虚血状態におけるＢＭＥＣ中のＮＳＥ２の発現である。
【図１８】ヒトのタンパク質ＤＲＧ−１（ＣＡＢ６６６１９）のアミノ酸配列であり、マスフィンガープリント法で同定されたペプチドは、太字の下線を付けたフォントで示している。
【図１９】ヒトおよびネズミのＤＲＧ−１の相同性比較は、９０％の同一性と９４％の相同性をそれぞれ示しており、ホスホリラーゼ活性部位、保存されていないグリコシル化活性部位および膜内外の領域は、淡いフォントで示され、Ｎ−末端は細胞内に位置している。
【図２０】ＤＲＧ−１の発現パターンである（Ｍ：１００ｂｐマーカー）。
【図２１】培養した細胞におけるＤＲＧ−１の発現パターンである（Ｍ：１００ｂｐマーカー）。
【図２２】ヒトのタンパク質ＴＫＡ−１のアミノ酸配列であり、マスフィンガープリント法で同定されたペプチドは、太字の下線を付けたフォントで示している。
【図２３】ｓｓＴＫＡ−１．ｃｔｇをプローブとしてハイブリダイズしたノーザンブロットである。
【図２４】培養した細胞におけるＴＫＡ−１の発現パターンである（Ｍ：１００ｂｐマーカー）。
【図２５】虚血状態のＢＭＥＣ中でのＴＫＡ−１の発現である。
【図２６】ＴＫＡ−１のウェスタンブロット解析である。
【図２７】Ｓ０６４の発現パターンである。
【図２８】ＡＲＬ８の発現パターンである。
【図２９】Ｓ０６４をプローブとしてハイブリダイズした、多組織のブロットである。
【図３０】培養したＢＭＥＣにおけるＳ０６４／ＡＲＬ８の発現である。
【図３１】５Ｇ９の発現パターンである。
【図３２】ＨＳＮＯＶ１とＰＮＯＶ１との相同性比較である。
【図３３】タンパク質ＨＳＮＯＶ１の配列において、膜内外領域の予測である。
【図３４】５Ｅ７をプローブとしてハイブリダイズした、多組織のブロットである。
【図３５】培養したＢＭＥＣにおけるＴＳＣ−２２の発現パターンである。
【図３６】虚血状態のＢＭＥＣにおけるＴＳＣ−２２の減少した発現率である。
【配列表】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳毛細血管内皮細胞（brain microvessel endothelial cells；ＢＭＥＣ）中のＢＢＢ−特異的タンパク質（ＢＢＢ＝blood brain barrier）またはその断片を同定する方法に関する。また、本発明は、この方法で得られるタンパク質またはその断片にも関する。さらに、本発明は、この方法で得られる遺伝子と転写物との双方にも関する。
【背景技術】
【０００２】
脳の毛細血管の内皮細胞は、血液と器官としての脳との間に選択的透過性を有する関門、すなわち、血液脳関門（ＢＢＢ）を形成する。毛細血管の個々の内皮細胞は、管腔の周囲に配置され、円筒形の管状腔を構成する。個々の内皮細胞と内皮細胞に結合する他の種類の細胞との間が密接に接合することによって、多数の物質が規制されることなく受動的にこの細胞層を通過することが防止される。
【０００３】
脳は、その機能を維持するため、安定な内部環境に高度に依存している。安定な内部環境は、血液脳関門によって保証されている。これは、血液と脳との間の物質交換も制御している。特異的な輸送体が、この交換を仲介している。上記関門の形成は、脳の毛細血管の内皮細胞（brain micro-vessel endothelial cells、ＢＭＥＣ）における特異的タンパク質の発現により、高度に分化した細胞型である他の内皮細胞との比較によって認められている。血液脳関門に特異的なタンパク質は、既に知られている。例えば、グルコース輸送体であるＧＬＵＴ−１は、ＢＭＥＣに特異的であって、脳のエネルギー補給を保証している。
【０００４】
血液脳関門の選択的透過能の性質によっては、中枢神経系の多様な疾患の治療が困難になる場合がある。これは、多数の医薬が血液脳関門を通過することが難しく、脳におけるそれらが作用する場所に低濃度でしか到達できないからである。そのため、脳で作用する医薬を開発するためには、血液脳関門の機能モードとそこに含まれるタンパク質を知ることが非常に重要である。特に問題とされるのは、上記タンパク質の知識を得ることである。上記タンパク質は、他の種類の細胞と比較して脳毛細血管の内皮細胞が顕著に多量または顕著に少量を生産するか、またはスプライシング変異により生じるか、あるいは特異的な転写後修飾を生じる。
【０００５】
脳毛細血管の内皮細胞の研究は、様々な問題を伴っている。第１に、ヒトの脳におけるタンパク質発現を研究するためには、利用できる脳の材料が充分ではない。これは、とりわけ倫理的な理由が大きい。また、普遍的な情報とするには、脳を収集する特定の個人による違いが一般に大きすぎる。例えば、年齢、性別、体重、人種その他の原因により違いが生じる。さらに、検査材料は、死後の数時間以内に除去されなければならない。この期間を過ぎると、酵素的な劣化と変性処理によって、細胞中のタンパク質組成に顕著な変化が起きるからである。加えて、脳毛細血管の内皮細胞のタンパク質発現に関する従来の方法による研究では、直接研究するために充分な純度の検査材料を得ることができなかった。公知の方法に従い脳毛細血管の内皮細胞を単離する際に、一般に他の種類の細胞と混合したものが得られ、そのような試料によるタンパク質発現パターンの研究では、その結果を脳毛細血管の内皮細胞のみに起因させるには充分ではない。
【０００６】
【非特許文献１】アルツチュル，エス・エフ（Altschul, S.F.）, ギシュ，ダブリュー（Gish, W.）, ミラー，ダブリュー（Miller, W.）,マイヤーズ，イー・ダブリュー（Myers, E.W.）,およびリップマン，ディー・ジェイ（Lipman, D.J.）(1990): “ベイシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール（Basic local alignment search tool）”, J. Mol. Biol. 215, 403-410.
【非特許文献２】バーンボイム，エイチ・シー（Birnboim, H.C.）およびドリー，ジェイ（Doly, J.） (1979): “組み替えプラスミドＤＮＡをスクリーニングするための迅速なアルカリ抽出操作（A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA）”, Nucl. Acids Res. 7: 1513-1522.
【非特許文献３】クセルゾ外（Cserzo et al.） (1997): “原核生物の細胞膜タンパク質における膜内外α−へリックスの予測；高密度配列表面法（Prediction of transmembrane alpha-helices in procariotic membrane proteins: the dense alignment surface method）”, Prot. Eng. 10: 673-676.
【非特許文献４】デリールスニジュデル，ダブリュー（Deleersnijder, W.）, ホン，ジー（Hong, G.）, コルトブリンズ，アール（Cortvrindt, R.）, ポイリエル，シー（ Poirier, C.）, チルザノウスキー，ピー（Tylzanowski, P.）, ピトイス，ケイ（Pittois, K.）, バン，マーク，イー（Van Marck, E.）, およびメルガエルト，ジェイ（Merregaert, J.） (1996): “ｃＤＮＡライブラリーのサブトラクション法を用いる軟骨−骨原性分化のマーカーの単離。膜内在性タンパク質の新規な多重遺伝子族に属する遺伝子の分子クローニングと特徴付け（Isolation of markers for chondro-osteogenic differentiation using cDNA library subtraction. Molecular cloning and characterization of a gene belonging to a novel multigene family of integral membrane proteins）”, J. Biol. Chem. 271, 19475-19482.
【非特許文献５】カワマタ，エイチ（Kawamata, H.）, ナカシロ，ケイ（Nakashiro, K.）, ウチダ，ディー（Uchida, D.）, ヒノ，エス（Hino, S.）, オモテハラ，エフ（Omotehara, F.）, ヨシダ，エイチ（Yoshida, H.）, およびサトー，エム（Sato M. ）(1998): “ヒトの唾液腺ガン細胞における新規な抗ガン剤、ベスナリノンを用いる治療におけるＴＳＣ−２２の誘発（Induction of TSC-22 by treatment with a new anti-cancer drug, vesnarinone, in a human salivary gland cancer cell）”, Brit. J. Cancer 77: 71-78.
【非特許文献６】ケスター，エイチ・エイ（Kester, H.A.）, ブランチェロット，シー（Blanchelot, C.）, デン・ヘルトグ，ジェイ（den Hertog, J.）, バン・デル・サグ，ピー・ティー（van der Saag, P.T.）, およびバン・デル・ブルグ，ビー（van der Burg, B.） (1999): “形質転換成長因子βで刺激されたクローン２２は、ホモまたはヘテロの二量体化が可能なロイシン・ジッパー・タンパク質群の一つであって、転写抑制活性を有する（Transforming growth factor-β-stimulated clone-22 is a member of a family of leucine zipper proteins that can homo- and hetrodimerize and has transcriptional repressor activity）”, J. Biol. Chem. 274: 27439-27447.
【非特許文献７】リー，ジェイ・ワイ（Li, J.Y.）, ボード，アール・ジェイ（Boado, R.J.）, およびパルドリッジ，ダブリュー・エム（Pardridge, W.M.） (2001): “血液脳関門のゲノム学（Blood-brain barrier genomics）”, J. Cereb. Blood Flow Metabol. 21, 61-68.
【非特許文献８】マービン，ケイ・ダブリュー（Marvin, K.W.）, フジモト，ダブリュー（Fujimoto, W.）, ジェッテン，エイ・エム（Jetten, A.M.） (1995): “ＰＭＰ２２関連遺伝子に伴う新生鱗状細胞の同定と特徴付け（Identification and characterization of a novel squamous cell-associated gene related to PMP22）”, J. Biol. Chem. 270, 28910-28916.
【非特許文献９】ピアソン，ダブリュー・アール（Pearson, W.R.）およびリップマン，ディー・ジェイ（Lipman, D.J.） (1988): “生物学的配列解析の改良されたツール（Improved Tools for Biological Sequence Analysis）”, PNAS 85, 2444-2448.
【非特許文献１０】サムブロック，ジェイ（Sambrook, J.）, フリッチュ，イー・エフ（Fritsch, E.F.）, およびマニアティス・ティー（Maniatis, T.）, 分子クローニング：実験マニュアル（in Molecular Clonin: A Laboratory Manual.）Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3 (1989).
【非特許文献１１】セボールド，イー（Sebald, E.）, クルーガー，アール（Krueger, R.）, キング，エル・エム（King, L.M.）, コーン，ディー・エイチ（Cohn, D.H.）, およびクラコウ・ディー（Krakow, D.） (2003): “軟骨ｃＤＮＡライブラリから、ＡＤＰリボシル化類似因子遺伝子群の新規構成要素の単離（Isolation of a new member of the ADP-ribosylation like factor gene family, ARL8, from a cartilage cDNA library）”, Gene 311: 147-151.
【非特許文献１２】シェブチェンコ・エイ（Shevchenko A.）, スニャエブ，エス（Sunyaev S.）, ロボダ・エイ（Loboda A.）, シェブチェンコ・エイ（Shevchenko A.）, ボーク・ピー（Bork P.）, エンス・ダブリュー（Ens W.）およびスタンディング・ケイ・ジー（Standing K.G.） (2001); “ＭＡＬＤＩ四極飛行時間法マススペクトルとＢＬＡＳＴ相同性調査による非配列ゲノムを伴う組織のプロテオームの図表化（Charting the Proteomes of Organisms with Unsequenced Genomes by MALDI-Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry and BLAST Homology Searching）”; Anal. Chem. 73: 1917-1926.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片を、あいまいな部分がないように同定できる方法を提供することである。この方法は、脳毛細血管の内皮細胞のＢＢＢ−特異的タンパク質および遺伝子を同定するために特に適している。さらに、この方法は、簡便かつ穏やかに実施できる。その上、本発明の方法は、タンパク質またはその断片に対して選択的である。タンパク質またはその断片は、脳毛細血管の内皮細胞で主にまたは選択的に生産され、対照組織および結合している種類の細胞では生産されない。さらに、本発明の方法で同定されたタンパク質およびその断片は、血液脳関門の機能不全を伴う疾患の診断マーカーとして適している。その上、本発明の方法で同定されたタンパク質およびその断片は、血液脳関門の機能不全を伴う疾患の治療のための医薬の生産に適している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に従い、上記目的は、脳毛細血管の内皮細胞中のＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片の存在を同定する方法であって、ａ）脳から単離した新鮮な脳毛細血管の内皮細胞を、通常の方法で酵素消化により前精製処理し、ｂ）工程ａ）で得られた消化物を、存在する赤血球とアポトーシス細胞を実質的に破壊し、脳毛細血管の内皮細胞の少なくとも７０％を生きている状態で維持する溶血性緩衝液で処理し、ｃ）工程ｂ）で得られた生成物を、任意にさらに精製処理し、ｄ）脳毛細血管の内皮細胞とサブトラクション法に用いる組織から、サブトラクション法のｃＤＮＡライブラリーを調製し、ｅ）一もしくはそれ以上のディファレンシャル・ハイブリダイゼーションにより、ｃＤＮＡについてサブトラクション法を実施し、ｆ）上記サブトラクション法のｃＤＮＡライブラリーからのクローンを、それら個々の発現パターンに関するディファレンシャル・ハイブリダイゼーションによって照合し、ｇ）上記サブトラクション法のｃＤＮＡライブラリーからのＢＢＢ−特異的タンパク質についてｃＤＮＡ配列を完成し、ｈ）調査したクローンの発現パターンを、新鮮な培養した脳毛細血管の内皮細胞間で比較し、それにより、ＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片の存在を同定することを特徴とする方法により達成された。
【０００９】
さらに本発明は、脳毛細血管の内皮細胞中のＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片の存在を同定する方法であって、ａ）脳から単離した新鮮な脳毛細血管の内皮細胞を、通常の方法で酵素消化により前精製処理し、ｂ）工程ａ）で得られた消化物を、存在する赤血球とアポトーシス細胞を実質的に破壊し、脳毛細血管の内皮細胞の少なくとも７０％を生きている状態で維持する溶血性緩衝液で処理し、ｃ）工程ｂ）で得られた生成物を、任意にさらに精製処理し、ｄ）工程ｃ）で得られた生成物を、適当な緩衝液に溶解し、ｅ）等電点電気泳動を実施し、ｆ）等電点電気泳動からの試料を、分子量に従って二次元分離し、ｇ）相違点を同定して、単離し、ｈ）工程ｇ）の単離物について、質量スペクトル分析を実施し、ｉ）特異性のデータベース分析により、その評価を行うことを特徴とする方法に関する。
【００１０】
本発明に従う方法では、ＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片を、あいまいな部分がなく、高い信頼性で同定することができる。本発明は、この方法で単離したタンパク質に加えて、それらのタンパク質をコードする転写物と遺伝子との双方にも関する。特に本発明は、この方法で単離された配列番号５、１４、１９、２３、２７、３３、５３の配列を有するタンパク質にも関する。
【００１１】
さらに本発明は、血液脳関門の機能不全による疾患を診断または治療するための薬剤または医薬を生産するため、本発明の方法で同定されたタンパク質およびその断片のそれぞれを使用することに関する。
【発明の効果】
【００１２】
驚くべきことに、上記処理工程の組み合わせによって、脳毛細血管の内皮細胞におけるＢＢＢ−特異的タンパク質をあいまいな部分がなく同定できることが判明した。本発明に従い単離したタンパク質は、ＢＢＢに特異的である。本発明に従い単離したタンパク質は、そのＢＢＢ特異性により、ＢＢＢにおいて、ＢＢＢに対して機能する。この機能とは、例えば、関門機能、搬送機能、ＢＢＢの栄養補給に関連する機能、密着結合タンパク質としての機能、酵素活性その他である。このようにして、これらのタンパク質の存在を同定することから始めて、ＢＢＢにおけるそれらの特異的な機能を推定で特定することが可能である。これにより、ＢＢＢを通して物質を選択的に搬送できるとの事実に基づき、全く新規な治療上の概念に到達することが可能になる。さらに、本発明に従う方法で同定されたタンパク質は、特に、治療上の介入の被検になり得る。本発明に従う方法により初めて、脳に関する疾患に対する治療の概念を発展させることができる。さらに、以上のように説明した方法に従い同定されるタンパク質の変化の検出は、ＢＢＢの機能不全に基づく疾患の診断に採用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
培養したＢＭＥＣに代えて、新鮮な状態で単離したＢＭＥＣ（一次細胞）の使用は、本発明に従う方法において、特に重要である。驚くべきことに、培養しているＢＭＥＣが非常に迅速に脱分化すること、言い換えると、それらのＢＢＢとしての性質が非常に早く失われることが観察された。さらに、脳毛細血管の内皮細胞を培養すると、血液脳関門に特異的なタンパク質の発現は、ほんの数次の継代後に、強力なダウンレギュレーションを起こして、完全に消えてしまう。このような状況では、ＢＭＥＣに特異的なタンパク質について、信頼性の高い単離と同定は不可能である。そのほかに、純粋な生きた細胞を単離して、細胞の特殊性を保証し、好ましくない作用や、アポトーシス（細胞消滅）による結果であるかのように偽る作用を防止する必要がある。
【００１４】
本発明に従う方法では、生きている生体の個々の器官から、手術により脳物質を除去する。その方法では、ヒト生体からの脳の試料も、例えば、脳手術により得ることができる。ただし、完全な脳またはその一部を生体から除去するのは、死の直後が好ましく、有利でもある。脳の除去は、死後１時間以内が好ましく、３０分以内がより好ましく、１５分以内がさらに好ましく、５分以内がさらにまた好ましい。脳は、様々な動物、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマその他から除去できる。最近では、ブタの脳が、脳毛細血管の内皮細胞の分析に関してヒトの脳の良好なモデルとなり、それらの結果をヒトに移しやすいことが知られている。
【００１５】
ブタの脳は、解剖学的および形態学的な観点で、ヒトの脳に非常に類似している。さらに、タンパク質と核酸との双方の段階で、ヒトとブタとの間の配列の相同性は、一般に非常に高い。そのため、ブタの材料で得られた結果は、高い信頼性を伴って、ヒトに移すことができ、その逆も可能である。このように、ヒトとブタとは、ヒトとマウスやラットのような古典的な生体モデルよりも、系統発生学的に、より密接な関係があることが知られている。
【００１６】
驚くべきことに、低張性溶血性緩衝液は、赤血球を溶血するだけではなく、一般に細胞死を招き、低張性ショックによってアポトーシス細胞を破裂させることが判明している。本発明に従う方法で使用する溶血性緩衝液は、脳毛細血管の内皮細胞を、少なくとも７０％、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上維持する。さらに、溶血性緩衝液は、非毒性であり、かつ生理的な領域にｐＨ値を有する必要がある。本発明に従い使用する低張性緩衝液は、イオン強度が０．１〜０．２Ｍであり、一価および二価のアニオンおよびカチオンをそれぞれ含み、７．０〜８．０のｐＨ領域に緩衝能を有する。含まれる全ての物質が、細胞に対して無毒である。よって、健全な細胞は、短時間緩衝液中に存在するだけで損傷を受けることはない。０．１〜０．２Ｍのイオン強度を有する低張性緩衝液は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、アンモニウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、塩素イオンおよび硫酸イオンに加えて、グルコースを含み、７．０〜８．０のｐＨ領域に緩衝能を有することが好ましい。これにより、赤血球と他の活力が異なる細胞との混合物から、脳毛細血管の生きた内皮細胞に富んだ部分を選択することが可能になる。本発明に従い使用する緩衝液は、７．５のｐＨ値において、下記の組成を有することが好ましい。
【００１７】
イオン／物質：最小濃度（ｍＭ）〜最大濃度（ｍＭ）
Ｎａ＋：３０．０〜６０．０
Ｋ＋：５．０〜７．５
ＮＨ４＋：８０．０〜１００．０
Ｃａ２＋：１．０〜２．０
Ｍｇ２＋：６．０〜９．０
Ｃｌ−：１２５．０〜１７５．０
ＨＣＯ３−：４．５〜６．５
Ｈ２ＰＯ４−：０．５〜２．５
ＳＯ４２−：０．３〜０．６
ＨＰＯ４２−：０．４〜０．７
グルコース：１．５〜３．０
【００１８】
使用する溶血性緩衝液は、下記の組成を有することがさらに好ましい。
【００１９】
ＮａＣｌ：３０ｍＭ〜５０ｍＭ
ＫＣｌ：４．５ｍＭ〜５．５ｍＭ
ＮＨ４Ｃｌ：８０ｍＭ〜１００ｍＭ
ＣａＣｌ２：１．０ｍＭ〜２．０ｍＭ
ＭｇＣｌ２：０．６ｍＭ〜０．８ｍＭ
ＭｇＳＯ４：０．３ｍＭ〜０．６ｍＭ
ＮａＨＣＯ３：４．５ｍＭ〜６．５ｍＭ
ＮａＨ２ＰＯ４：０．２ｍＭ〜０．４５ｍＭ
Ｎａ２ＨＰＯ４：０．４ｍＭ〜０．６５ｍＭ
ＫＨ２ＰＯ４：０．１ｍＭ〜０．１５ｍＭ
グルコース：１．５ｍＭ〜３．０ｍＭ
【００２０】
緩衝液は、下記の組成を有することが特に好ましい。
【００２１】
ＮａＣｌ：３９ｍＭ
ＫＣｌ：５．１ｍＭ
ＮＨ４Ｃｌ：８８ｍＭ
ＣａＣｌ２：１．６ｍＭ
ＭｇＣｌ２：０．６９ｍＭ
ＭｇＳＯ４：０．４６ｍＭ
ＮａＨＣＯ３：５．６ｍＭ
ＮａＨ２ＰＯ４：０．３３ｍＭ
Ｎａ２ＨＰＯ４：０．５３ｍＭ
ＫＨ２ＰＯ４：０．１２ｍＭ
グルコース：２．２４ｍＭ
【００２２】
上記のような溶血性緩衝液は、通常は、リンパ球およびリンパ球からのＲＮＡをそれぞれ単離するため、最初にここで赤血球を溶血するために使用されている。現在に至るまで、本発明に従う緩衝液の組成や、緩衝液をアポトーシス細胞の溶血に使用することは、いずれも報告されていない。アポトーシスにおいてより強力に発現される遺伝子の転写物を同時に増幅することなく、ＢＢＢ−特異的転写物を増幅するため、アポトーシス細胞の選択的な溶血は、本発明において重要な意味を有する。細胞を単離する他の方法では、アポトーシスの問題は、単離した細胞を培養することで回避している。しかし、脳毛細血管の内皮細胞は、培養中にその性質が変化し、別の遺伝子発現パターンに移行する。それゆえ、本発明に従う最終的な溶血工程を経て細胞を調製する方法により、脳毛細血管の新鮮な内皮細胞を充分な量で単離することが初めて可能になる。
【００２３】
生体から脳の除去後、脳は実際的な方法で適切な緩衝液中に移し、可能な限り迅速に、冷却しながら次の処置の実験室まで搬送する。単離すべき脳毛細血管の内皮細胞は、主に灰白質に位置している。さらに細胞の精製処理を行う前に、灰白質を残りの脳の部分から機械的に切断することが有利な方法である。そのため、最初に髄膜を剥がし、灰白質を削り落とし、小さな断片に切り詰め、適当な培地に移す。適当な培地とは、例えば、Ｍ１９９培地（Gibco/BRL, Grand Island, NY）やアールの緩衝液（Earle’s buffer）である。実際的な方法では、さらに精製を行う前に、得られた灰白質の質量を決定する。
【００２４】
アールの緩衝液（ｐＨ：７．３）
ＮａＣｌ：１１７．２ｍＭ
ＫＣｌ：５．３ ｍＭ
ＮａＨ２ＰＯ４×２Ｈ２Ｏ：１．０ｍＭ
ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ：０．８１ｍＭ
ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ：１．８ｍＭ
グルコース×Ｈ２Ｏ：５．６ｍＭ
【００２５】
本発明に従い、脳毛細血管の内皮細胞の前精製処理は、以下に述べる少なくとも二段階の酵素処理工程を経て脳物質を消化することにより実施する。第１の酵素処理工程では、脳物質を酵素のディスパーゼ（dispase）を用いて消化する。ディスパーゼによる消化は、神経組織の崩壊を起こす。灰白質１グラム当たり５ｍｇのディスパーゼが、量として特に適していることが証明されている。実際的な方法では、ディスパーゼによる消化は、Ｍ１９９培地中で行われる。ただし、他の培地や緩衝液にも、この反応に適しているものがある。同様に調製したディスパーゼ溶液を灰白質の試料に加え、懸濁液を攪拌しながら３７℃でインキュベートする。インキュベート時間は、２乃至４時間、好ましくは３時間が特に有利であることが証明されている。個々の場合における酵素濃度、使用する溶媒と培地のそれぞれ、およびインキュベート時間は、脳毛細血管を取り巻き結合している物質を可能な限り多量に劣化させて崩壊させるように選択すべきである。ただし、同時に条件は、各酵素処理工程において、単離すべき脳毛細血管の内皮細胞に影響が及び、細胞が死ぬ割合を可能な限り少なくし、細胞が損傷を受ける可能性を可能な限り少なくするように調節すべきでもある。
【００２６】
この点に関して、結果として生じる剪断力を可能な限り小さくしておくことが重要である。これは、例えば、脳のかたまりの酵素消化を、攪拌ボトル中でゆっくり連続的に混合することで実現できる。
【００２７】
最初の精製工程におけるディスパーゼ消化の後、デキストラン溶液中での遠心分離により脳毛細血管を得る。この目的のために、従来技術で公知の方法を採用できる。ディパーゼ消化による一定量の細胞懸濁液を、当量の１５％デキストラン溶液と混合し、１０分間振盪し、角度を固定したローター内で、１０℃、８６５０×ｇにて約１０分間遠心分離する方法が最適であることが実証されている。遠心分離後、上澄みを除去し、沈殿物に対して第２の酵素処理を行う。
【００２８】
第２の酵素処理工程では、遠心分離の沈殿物をコラゲナーゼＤ（collagenase D）で消化する。コラゲナーゼＤは、特に、基部の膜を溶解する。実際的な方法では、少なくとも一つのプロテアーゼ阻害剤を第２の酵素処理工程で添加する。この目的のためのプロテアーゼ阻害剤としては、ｐ−トシル−Ｌ−リシン−クロロメチルケトンナトリウム（ＴＬＣＫ）が特に適している。実際的な方法では、第２の酵素処理工程を、３７℃で約１時間攪拌することにより実施する。第２の酵素処理工程では、少なくとも一つのデオキシリボヌクレアーゼ（DNAse）、例えば、ベンゾナーゼ（benzonase）を使用することが特に適していることも実証されている。このようにして、死んだ細胞の消化の間に、放出されたＤＮＡが劣化し、それとは別に懸濁液の粘度を増加させる。
【００２９】
第２の酵素処理工程後、パーコール（Percoll）密度勾配遠心分離による第２の精製処理工程を実施する。密度勾配は、例えば、９．９１ｍｌのパーコール、０．７２ｍｌの１０倍濃度Ｍ１９９培地および１９．３７ｍｌのアールの緩衝液を混合し、超遠心分離機の角度固定ローター内で、４℃にて３７２００×ｇで１時間遠心分離することにより調製できる。第２の酵素処理工程からの細胞懸濁液は、例えば、低速遠心分離、上澄みの除去、遠心分離沈殿物の再懸濁を複数回繰り返すことにより洗浄（例えば、加えた酵素を除去）する。直前の遠心分離工程後、沈殿物を少量の液体、例えば、６ｍｌのＭ１９９培地に取り、超遠心分離機のスイングアウトローター内で、４℃にて１４００×ｇで１０分間遠心分離する。パーコール密度勾配遠心分離では、懸濁した細胞物質が、その密度に従って分離される。通常は、ここに明確に区別される３種のバンドが生じる。最低の密度を有する第１の上方のバンドは、細胞の破片や断片を含む。第２の中間のバンドは、他と比較して、単離すべき脳毛細血管の内皮細胞を含む。最も高い密度を有する第３の低位バンドには、とりわけ赤血球が集まっている。
【００３０】
脳毛細血管の内皮細胞を含む第２のバンドを単離し、本発明に従う次の精製処理を行う。単離は、針を用いてバンドを取り出すか、好ましくは、ピペットで吸い出すことにより実施できる。
【００３１】
脳毛細血管の内皮細胞に到達する前に、パーコール密度勾配遠心分離で得られた第二のバンドの物質が、他の種類の細胞、主に赤血球とアポトーシス細胞を多数含むとの問題がある。現在まで、これらの汚染細胞を脳毛細血管の内皮細胞から穏やかな条件下で分離することは不可能であった。この問題は、驚くべきことに、リンパ球の単離に普通に用いられている溶血性緩衝液を用いて、脳毛細血管の内皮細胞をさらに精製することにより解決できることが判明した。ここで、溶血性緩衝液の組成、処理の継続時間、および処理温度は、赤血球とアポトーシス細胞がほぼ完全に破壊され、脳毛細血管の内皮細胞の大部分が生き残るように選択する。この緩衝液の利点と特徴は、既に述べた通りである。
【００３２】
下記の成分を含む溶血性緩衝液が、本発明に適していることが実証されている。
【００３３】
ＮａＣｌ：３０ｍＭ〜５０ｍＭ
ＫＣｌ：４．５ｍＭ〜５．５ｍＭ
ＮＨ４Ｃｌ：８０ｍＭ〜１００ｍＭ
ＣａＣｌ２：１．０ｍＭ〜２．０ｍＭ
ＭｇＣｌ２：０．６ｍＭ〜０．８ｍＭ
ＭｇＳＯ４：０．３ｍＭ〜０．６ｍＭ
ＮａＨＣＯ３：４．５ｍＭ〜６．５ｍＭ
ＮａＨ２ＰＯ４：０．２ｍＭ〜０．４５ｍＭ
Ｎａ２ＨＰＯ４：０．４ｍＭ〜０．６５ｍＭ
ＫＨ２ＰＯ４：０．１ｍＭ〜０．１５ｍＭ
グルコース：１．５ｍＭ〜３．０ｍＭ
【００３４】
下記の組成を有する溶血性緩衝液は、特に適している。
【００３５】
ＮａＣｌ：３９ｍＭ
ＫＣｌ：５．１ｍＭ
ＮＨ４Ｃｌ：８８ｍＭ
ＣａＣｌ２：１．６ｍＭ
ＭｇＣｌ２：０．６９ｍＭ
ＭｇＳＯ４：０．４６ｍＭ
ＮａＨＣＯ３：５．６ｍＭ
ＮａＨ２ＰＯ４：０．３３ｍＭ
Ｎａ２ＨＰＯ４：０．５３ｍＭ
ＫＨ２ＰＯ４：０．１２ｍＭ
グルコース：２．２４ｍＭ
【００３６】
溶血性緩衝液を添加後、懸濁液を混合し、低速遠心分離により繰り返して洗浄し、適当な培地および緩衝液、例えば、それぞれＭ１９９またはアールの緩衝液、に再懸濁する。精製した脳毛細血管の内皮細胞は、遠心分離で集める。
【００３７】
精製した脳毛細血管の内皮細胞は、ここで、ＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片の存在を同定するため、二つの異なる経路で処理することができる。すなわち、一方はタンパク質による経路であり、他方はゲノムによる経路である。それぞれの場合で、異なるタンパク質、その断片および転写物が、それぞれ、同定および単離することができる。以下において、双方の経路をより詳細に説明する。
【００３８】
［２次元ディファレンシャルゲル電気泳動によるＢＢＢ−特異的タンパク質の同定］
遺伝子生成物の直接的な２次元比較により、脳毛細血管の内皮細胞の完全な所見が得られる。本発明に従い、対照組織を全ての電気泳動で使用する。対照組織は、血液脳関門に特異的な転写物とタンパク質とをそれぞれ選択的に同定することを可能にする組織である。原則として、全ての内皮細胞、例えば、同じ組織の大血管や小血管の内皮細胞や、他の組織（例、心臓、肺、腎臓、肝臓、大動脈他）からの内皮細胞を、対照組織として使用できる。また、培養により得られる脱分化したＢＭＥＣを用いることもできる。ただし、脳毛細血管の内皮細胞に対する対照組織は、別の種類の内皮細胞を用いることが好ましい。大動脈からの内皮細胞が好ましく用いられる。大動脈の内皮細胞は、関門機能を全く示さない。それに加えて、小血管を大血管と比較できるとの利点もある。さらにまた、別の大血管の内皮細胞を用いることもできる。他の条件、例えば、ｐＨ値、成長培地、成長因子（例、サイトカイン）に関して異なる条件で培養した脳毛細血管の内皮細胞も、対照組織として適している。同定したタンパク質の生理学的な意味は、個々の対照組織に対して、脳毛細血管の内皮細胞について知られている性質から判断することができる。本発明では、二種類の明確な細胞型が好ましく使用される。一方は、関門機能を伴う細胞型である新鮮に単離されたＢＭＥＣであり、他方は、ＢＭＥＣに類似する内皮細胞でありながら、関門機能を示さない大動脈からの内皮細胞である。特に、ブタの組織を使用することで、これらの細胞について詳細なタンパク質地図を作製できる。
【００３９】
［試料調製］
最初に、調製した細胞および調製物に含まれる赤血球の部分の活力を決定する必要がある。活力の決定には、懸濁した細胞２０μｌを取り、フルオレセイン二酢酸が機能する溶液（アールの緩衝液中２４μＭ）４μｌおよびヨウ化プロピジウムが機能する溶液（アールの緩衝液中７０μＭ）２μｌを加える。懸濁液を混合して、３７℃で１０分間インキュベートする。細胞を蛍光顕微鏡で確認し、損傷した細胞に対する生きた細胞の比率を決定する。生きた細胞は、緑の蛍光（励起：４５０ｎｍ、放射：５１５ｎｍ）により認識することができる。一方、損傷した細胞は、核を起源とする赤い蛍光（励起：４８８ｎｍ、放射：６１５ｎｍ）により認識される。赤血球の部分は、ベンジジンが機能する溶液（１５ｍＭの塩酸ベンジジン、１２％（ｖ／ｖ）の酢酸、２％（ｖ／ｖ）の過酸化水素）２０μｌを２０μｌの細胞懸濁液に加えることで決定される。試料は混合し、２５℃で５分間インキュベートする。次に、一滴分の細胞をピペットで顕微鏡のスライドに吸い出し、カバーガラスで覆う。この試験では、透過型顕微鏡に青いクリスタルガラスを観察することにより、赤血球が確認できる。赤血球に対する内皮細胞の比率を、計数することにより決定する。生存細胞が９５％以上との生存率と、赤血球の汚染率が５％未満であることを条件に、細胞を次の２次元ゲル電気泳動に使用することができる。
【００４０】
新鮮に単離し、沈殿した細胞の湿潤重量を決定し、５倍容量（例えば、細胞１００ｍｇに緩衝液５００μｌ）のｐＨ６．８の緩衝液Ａ（ＰＩＰＥＳを１０ｍＭ、ＮａＣｌを１００ｍＭ、ＭｇＣｌ２を３ｍＭ、ショ糖を３００ｍＭ、ＥＤＴＡを５ｍＭ、ＰＭＳＦを１ｍＭ、ジギトニンを１５０μＭ）に注意深く再懸濁する。次に、細胞懸濁液をわずかに振盪しながら、氷冷下で２０分間インキュベートする。続いて、遠心分離（４８０×ｇ、４℃、１０分間）を行い、細胞を沈殿させる。上澄みを除去し、次の使用まで−２０℃で保管する。
【００４１】
沈殿を再び、元の湿潤重量の５倍容量のｐＨ７．４の緩衝液Ｂ（ＰＩＰＥＳを１０ｍＭ 、ＮａＣｌを１００ｍＭ、ＭｇＣｌ２を３ｍＭ、ショ糖を３００ｍＭ、ＥＤＴＡを５ｍＭ 、ＰＭＳＦを１ｍＭ、Triton X−１００を０．５％（ｖ／ｖ））に再懸濁し、氷冷下で激しく振盪しながら、３０分間インキュベートする。そして、試料を１０分間の遠心分離（５０００×ｇ、４℃）で沈殿させ、上澄みを除去し、次の使用まで−２０℃で保管する。
【００４２】
さらに沈殿を、元の湿潤重量の１．７倍容量のｐＨ７．４の緩衝液（ＰＩＰＥＳを１０ｍＭ、ＮａＣｌを１０ｍＭ、ＭｇＣｌ２を１ｍＭ、ＰＭＳＦを１ｍＭ、TWEEN-40を１％ （ｖ／ｖ）、デオキシコール酸塩を０．５％（ｗ／ｖ））に再懸濁し、ドーンス（Dounce）ホモジナイザーに移し、５回作動させて破壊する。次に、試料を２ｍｌの反応チューブに再び移し、超音波浴中で１分間インキュベートする。さらに、試料を遠心分離（６７８０×ｇ、４℃、１０分間）で沈殿させ、上澄みを除去し、沈殿を次の使用まで−２０℃で保管する。
【００４３】
沈殿を、その量に応じて２００〜５００リットルのｐＨ８．０の緩衝液（トリスを５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２を１ｍＭ）に再懸濁し、窒素で急速凍結する。その後、試料を超音波浴中で解凍し、引き続き、５〜１０μｌのベンゾナーゼ（２５Ｕ／μｌ）を加え、粘性のある液状でなく均一な状態になるまでインキュベートする。そして、７倍容量の５％（ｗ／ｖ）ＳＴＳ溶液を加え、試料を９０℃で２０分間加熱する。さらに、１０分間の遠心分離（７０００×ｇ、２０℃）を行い不溶性の成分を除去する。上澄みを取り出し、次の使用まで−２０℃で保管する。今回は、沈殿を廃棄してもよい。
【００４４】
上澄みを解凍し、その量に応じて組み合わせて混合する。試料に含まれる洗浄剤を除去するため、試料を１００％アセトン（−３０℃で保管）と２０対８０の比率で混合する。完全に混合後、析出物を少なくとも１時間、−３０℃でインキュベートする。そして、析出したタンパク質を、１５分間、１００００×ｇ、４℃で沈殿させる。上澄みを注ぎだして捨てる。
【００４５】
引き続き、沈殿物を８０％（ｖ／ｖ）アセトン（−３０℃に冷却）で洗浄し、再度、−３０℃でインキュベートする。新たな遠心分離（１５分間、１００００×ｇ、４℃）の後、上澄みを捨て、沈殿を可能な限り少量のソリュビリゼイション緩衝液Ｉ（尿素を７Ｍ、チオ尿素を２Ｍ、ＣＨＡＰＳを４％（ｗ／ｖ））またはII（尿素を８Ｍ、ＣＨＡＰＳを４％（ｗ／ｖ））再懸濁し、試料のタンパク質含量を決定する。この結果により、タンパク質を決定するため、ロティカント（Ｒｏｔｈ）一部と二回蒸留水２部を混合し、直ちに機能する溶液として、不溶性の成分を襞の付いたフィルターで除去する。検量曲線のため、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をソリュビリゼイション緩衝液ＩおよびIIでそれぞれ希釈した液を調製する。ここで、検量溶液のため、濃度を０．２ｍｇ／ｍｌ、０．４ ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌおよび１．０ｍｇ／ｍｌに調整する。それぞれ２０μｌの検量溶液、試料および対照液（ソリュビリゼイション緩衝液ＩおよびII）を１．５ｍｌの反応容器に入れ、ロティカント機能液１ｍｌを加える。ここの反応容器を直ちに反転させて混合する。次に、試料を２５℃で２０分間インキュベートする。試料を１ｍｌのキュベットに移した後、５６０ｎｍの吸収を分光光度計で測定する。試料のタンパク質含量は、検量曲線を調製することで決定できる。
試料の残存する上澄みは、次の使用まで−８℃で保管する。
【００４６】
［等電点電気泳動］
１２種類の電気泳動ゲルのため、４．５ｍｌのソリュビリゼイション緩衝液ＩまたはII（ｐＨ勾配：４．５〜５．５）に２．５ｍｇの試料を溶解したものに、１．１２５ｍｌの電気泳動緩衝液Ｉ（尿素を７Ｍ、チオ尿素を２Ｍ、ＣＨＡＰＳを４％（ｗ／ｖ）、ＤＴＴを９１ｍＭ、ＩＰＧ緩衝液を２．５％）およびII（尿素を８Ｍ、ＣＨＡＰＳを４％（ｗ／ｖ）、２．５％ＩＰＧ緩衝液を９１ｍＭ、ｐＨ勾配：４．５〜５．５）それぞれを加え、超音波浴で１分間処理し、卓上遠心分離機（２００００×ｇ）で５分間遠心分離する。ｐＨ勾配（３．５〜４．５、４．０〜５．０、４．５〜５．５、５．０〜６．０、５．５〜６．７、６．０〜９．０）は、２４ｃｍ長のゲル（Immobiline DryStrip; Amersham Biosciences）として使用する。使用するｐＨ勾配のため、適当なＩＰＧ緩衝液を使用する。
【００４７】
続いて、それぞれの試料４５０μｌを再水化器に吸い出し、二組のピンセットを用いて、インモービリン・ドライストリップ（Immobiline DryStrip）電気泳動ゲルを、ゲル側を下に、気泡が生じないようにしながら溶液の上に置く。ゲルは、パラフィンオイルで覆う。再水化時間は、少なくとも１２時間から、最大で１６時間である。６．０〜９．０のｐＨ勾配で、試料をカップに入れる。そのｐＨ勾配で、試料に代えて、ゲル片を、ソリュビリゼイション緩衝液Ｉ（４．５ｍｌ）と電気泳動緩衝液Ｉ（１．１２５ｍｌ）とのそれぞれの混合物で再水化する。再水化後、それぞれのゲル片を、２４ｃｍのストリップ・ホルダーに移し、さらにカップに入れる。試料カップは、直接、陰極の前に置く。それぞれ２００μｇのタンパク質を含む試料を、ピペットで試料カップに吸い出し、パラフィンオイルで覆ったインモービリン・ドライストリップ・ゲルを重ねる。
【００４８】
電気泳動片は二回蒸留水で湿らせ、それぞれのゲルの末端に置く。次に、これらの試験片に対して電極をつなげる。その後、試料を入れたストリップ・ホルダー６種類のそれぞれを、対応するｐＨ勾配（第１表参照）を有するＥＴＴＡＮ ＩＰＧｐｈｏｒ電気泳動装置（Amersham Biosciences）で電気泳動する。電気泳動が完了後、試験片をピンセットで除き、次の使用まで−８０℃で保管する。
【００４９】
第１表
（等電点電気泳動のプログラム）
────────────────────────────────────────
プログラム １
────────────────────────────────────────
Ｓ１ ５００Ｖ 直線的勾配 １ｈ
Ｓ２ ５００Ｖ 段階的勾配 １ｈ
Ｓ３ １０００Ｖ 段階的勾配 １ｈ
Ｓ４ ８０００Ｖ 直線的勾配 １ｈ
Ｓ５ ８０００Ｖ 段階的勾配 ８８ｋＶｈ
────────────────────────────────────────
プログラム ２
────────────────────────────────────────
Ｓ１ ５００Ｖ 直線的勾配 ０．５ｈ
Ｓ２ ５００Ｖ 段階的勾配 ０．５ｈ
Ｓ３ １０００Ｖ 直線的勾配 ０．５ｈ
Ｓ４ １０００Ｖ 段階的勾配 ０，５ｈ
Ｓ５ ４０００Ｖ 直線的勾配 １．０ｈ
Ｓ６ ４０００Ｖ 段階的勾配 ０．５ｈ
Ｓ７ ８０００Ｖ 直線的勾配 ０．５ｈ
Ｓ８ ８０００Ｖ 段階的勾配 １０５ｋＶｈ
────────────────────────────────────────
【００５０】
プログラム１は、ｐＨ勾配３．５〜４．５、４．０〜５．０、４．５〜５．５、５．０〜６．０および５．５〜６．７で使用する。プログラム２は、ｐＨ勾配６．０〜９．０のゲルで使用する。
【００５１】
［ＳＤＳ電気泳動］
必要なアクリルアミド１２．５％（ｗ／ｖ）の濃度を有する２次元用ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを作成する。
【００５２】
ゲルを展開する装置は、マニュアル（Amersham Biosciences）に従って組み立て、ｐＨ８．８の置換用緩衝液（トリスを０．３７５Ｍ、グリセロールを５０％（ｖ／ｖ）、ブロモフェノールブルーを０．００２％（ｗ／ｖ））を指定された容器に充填する。
【００５３】
ｐＨ８．８のゲル重合溶液（アクリルアミドを１２．１７％（ｗ／ｖ）、ビスアクリルアミドを０．３３％（ｗ／ｖ）、トリスを０．３７５Ｍ、ＳＤＳを０．１％（ｗ／ｖ）、ペルオキソ二硫酸アンモニウムを０．０５％（ｗ／ｖ））を先細のノズルが付いた容器中で混合し、次に、超音波浴中で５分間ガスを抜く。そして、ＴＥＭＥＤを０．０４％（ｖ／ｖ）加えることで、重合反応を開始させる。直ちに容器をスタンドに立て、チューブでゲル展開装置に接続する。ゲル溶液は、ゲルカセットの底辺の約３ｃｍ下に到達するまで、装置に流入させる。そして、置換緩衝液の容器のプラグを塞ぎ、カセットのガラス端の下約２ｃｍに上昇するまで、緩衝液でゲル溶液を置き換える。展開したゲルは、完全に重合するまで、ｎ−ブタノールで飽和した水で覆う。
【００５４】
電気泳動したゲルを、それぞれ一つずつ−８０℃の冷凍庫から取り出し、平衡チューブに移す。タンパク質をセル内で電気泳動し、ｐＨ８．８の還元用緩衝液（尿素を６Ｍ、トリスを５０ｍＭ、グリセロールを３０％（ｖ／ｖ）、ＳＤＳを４％（ｗ／ｖ）、ＤＴＴを６５ｍＭ）１５ｍｌを加え、２５℃で１５分間、それぞれ振盪して、還元する。次に、還元用緩衝液を捨て、ヨードアセトアミドを含むアルキル化緩衝液（尿素を６Ｍ、トリスを５０ｍＭ、グリセロールを３０％（ｖ／ｖ）、ＳＤＳを４％（ｗ／ｖ）、ヨードアセトアミドを２６０ｍＭ）１５ｍｌを加えることで、タンパク質をアルキル化する。再び、振盪しながら、２５℃で１５分間インキュベートする。続いて、緩衝液を再び捨てて、ゲル片をチューブから除く。ピンセットを用いて、ゲルをＳＤＳゲルの上に置き、ｐＨ８．３の液体アガロース溶液（アガロースを０．５％（ｗ／ｖ）、トリスを２５ｍＭ、グリシンを１９２ｍＭ、ＳＤＳを０．１％（ｗ／ｖ））２ｍｌで覆い、それにより固定する。電気泳動用箱ＥＴＴＡＮ ＤＡＬＴ ＩＩ（Amershal Biosciences）を、ｐＨ８．３の二次元展開緩衝液（トリスを２５ｍＭ、グリシンを１９２ｍＭ、ＳＤＳを０．１％（ｗ／ｖ））１０リットルで充填し、ＰＡＡゲルを装置に入れ、そして、電気泳動を実施する。ここで、最初のＰＡＡゲル当たり５Ｗの一定の力を５０分間設定する。温度は、２０℃で一定である。次に、力をゲル当たり５５Ｗ、ただし最大でも１８０Ｗまで増加させ、青い対照色素（ブロモフェノールブルー）がゲルの最低末端に到達するまで電気泳動を継続する。電気泳動を停止して、ゲルを除く。ゲル（酢酸を７％（ｖ／ｖ）、メタノール１０％（ｖ／ｖ））４００ｍｌ当たり、それぞれトレイに置き、ガラスプレートからゲルを除いてトレイに移す。固定のため、ゲルを振盪しながら、２５℃で３０分間インキュベートする。一方で、シプロルビイ（SyproRuby）染色溶液４００ｍｌを黒いトレイに置き、インキュベーション時間の経過後、固定したゲルを染色溶液に移す。振盪しながら１６時間染色後、４００ｍｌの固定液中で１５分間脱染色し、読み取りのため、４７３ｎｍの励起波長、５７５ｎｍの放射波長、１００μｍの解像度および１６ビットのグラデーションで、ＦＬＡ５００スキャナー（Fuji）で走査する。次に、ゲルをプラスチックホイルで覆い、次の使用まで４℃で保管する。
【００５５】
［ディファレンシャルスポットの同定］
タンパク質のディファレンシャルスポットの同定は、最初にｐＨ勾配（３．５〜４．５、４．０〜５．０、４．５〜５．５、５．０〜６．０、５．５〜６．７、６．０〜９．０）毎に１０種類のゲルを、調製した新鮮なＢＭＥＣとＡＯＥＣ（Aorta Endothelial Cells）からの１０種類のゲルと共に調製して、走査する。ゲルは、次に、Ｚ３評価ソフト（Compugen）を使用して比較し、ディファレンシャルスポットに印を付ける。ここで、１００ピクセルの最小スポットサイズをフィルターで集める。ＢＭＥＣＳ中で多量（三倍量またはそれ以上）または特異的であるタンパク質を切り出し、０．２ｍｌの反応容器に移す。切り出したスポットにラベルを付け、次の使用まで−８０℃で保管する。
【００５６】
［タンパク質試料の加水分解と質量スペクトル分析］
ゲルマトリックス中に固定した、切り出したタンパク質を、−８０℃の冷凍庫から取り出し、１００μｌの二回蒸留水を加えて洗浄する。ここで、個々のバッチを振盪しながら２５℃で２０分間インキュベートし、次に上澄みをピペットで吸い出して捨てる。この操作を二回繰り返す。次に、５０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル１００μｌで二回多い、振盪しながらそれぞれ２５℃で１５分間インキュベートする。再び上澄みを捨てる。ゲルの一片は、１００％アセトニトリル１００μｌを加えて完全に脱水し、振盪しながら２５℃で１５分間インキュベートする。上澄みを除去後、ゲル片を５分間空気乾燥する。その後、再びゲル片を加水分解緩衝液（（ＮＨ４）２ＣＯ３を５０ｍＭＪ、トリプシンＶを２５ｎｇ〜５０ｎｇ／１５μｌ）１５μｌで再水化処理し、膨潤させる。３７℃で１８時間インキュベートすることで、タンパク質を加水分解する。マトリックス・アシステッド・レーザー・デソープション・イオニゼイション（ＭＡＬＤＩ）法によりペプチドのフィンガープリントを調製するため、加水分解物を０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸で酸処理する。使用したＺｉｐＴｉｐ−Ｃ１８ピペットチップは、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル１０μｌでそれぞれ３回脱水し、続いて、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸１０μｌで平衡させることにより調製した。試料の適用は、加水分解調製物の上澄みを７回から１０回吸い上げることにより行う。次に、ＺｉｐＴｉｐを、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸１０μｌで洗浄する。ペプチドは、次に、三回から四回ピペットでＭＡＬＤＩ測定担体に移すことで、マトリックス（α−シアノ桂皮酸、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸）で直接溶出する。担体上の試料を乾燥後、最初に試料をＭＡＬＤＩフィンガープリントで質量スペクトルを測定して、分析する。ここで、試料をＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＰＲＯ（PerSpective Biosystems）ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析機で、２００００Ｖの加速電圧、７５％のグリッド電圧、０．０２％のグリッドワイヤー、２２０ｎｓの遅延時間での正の反射モードで測定する。ここで、７００〜３５００Ｄａの質量については、マス・ウィンドウを使用する。
【００５７】
個々のタンパク質スポットについて得られた質量リストは、データベース分析に採用する。ここで、３種の異なるプログラム、Ｍａｓｃｏｔ、ＭＳＦｉｔおよびＰｒｏｆｏｕｎｄを使用する。
【００５８】
良好な質量フィンガープリントが存在するにもかかわらず、データベース同定が不可能であるタンパク質スポットは、アミノ酸配列上方が得られるＥＳＩ質量分析機を使用する。
【００５９】
そのため、加水分解後、加水分解調製物を０．２％（ｖ／ｖ）ギ酸１５μｌで酸処理し、振盪しながら３０分間インキュベートする。一方、ＺｉｐＴｉｐ−Ｃ１８ピペットチップ（MilliPore）は、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル１０μｌでそれぞれ３回再水化処理し、続いて０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸１０μｌでそれぞれ３回平衡処理する。試料の調製は、加水分解調製物の上澄みを７回から１０回吸い出すことにより実施する。次に、ＺｉｐＴｉｐを、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸で洗浄する。引き続いて、０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸で２回洗浄することにより緩衝液を交換し、５０％（ｖ／ｖ）エタノール２μｌで５回から７回吸い出すことによりペプチドを溶出する。
【００６０】
得られるペプチド混合物は、直接分析するか、あるいはＥＳＩ質量分析機と組み合わせた液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を用いて分析できる。
【００６１】
直接分析には、１μｌの溶出した試料を中空の針（Protana）に充填する。ここで最初に、８５０〜１０００Ｖのイオンスプレイ電圧、２０ｐｓｉのカーテンガス圧、４０〜５０Ｖの分解電圧、２４５Ｖの電気泳動電圧、２０００〜２１０００Ｖの多チャンネルプレート電圧での概観スペクトルを陽極モードで測定する。その際の走査領域は、１００〜１６００または４１０〜１６００Ｔｈである。スペクトル中に検出されたペプチドは、衝突により断片化が誘導されている。
【００６２】
この目的では、個々のペプチドの生成物のイオンスペクトルは、８５０〜１０００Ｖのイオンスプレイ電圧、２０〜４０ｐｓｉのカーテンガス圧、４０〜５０Ｖの分解電圧、２４５Ｖの電気泳動電圧、０．７〜１．０ａｍｕの４極解像度、１５〜５０Ｖの衝突エネルギーおよび２１００〜２４００Ｖの多チャンネルプレート電圧で記録する。ここで、走査範囲は、５０〜１６００Ｔｈである。
【００６３】
ナノＨＰＬＣとＥＳＩ質量スペクトル分析機との組み合わせでは、最初に２μｌの試料と共に、２０μｌ／分の流量で０．１％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸を、逆相（ＲＰ）プレカラムに入れる。クロマトグラフィーによるペプチドの分離は、ＲＰ−Ｃ１８カラム（LC packings）を用いて、出発条件（ギ酸を０．０５％（ｖ／ｖ）、アセトニトリルを１０％（ｖ／ｖ））から最終条件（ギ酸を０．０５％（ｖ／ｖ）、アセトニトリルを７６％（ｖ／ｖ））まで勾配を伴って３５分間実施する。ＨＰＬＣと質量スペクトル分析機との組み合わせは、中空の針（New Objective）を用いて実施する。質量スペクトル分析機の設定は、ＬＣの実施中に二つの実験が実施できるように選択する。ここで設定するパラメーターは、イオンスプレイ電圧（１８００〜２２００Ｖ）以外は、前述したこれまでの設定に対応する。概観スペクトルと生成物イオンスペクトルとは、実施中に交互に記録する。生成物イオンスペクトルの設定は、概観スペクトルにおいて、２倍、３倍または４倍に電荷があり１０ｃｐｓよりも大きな最も強い二つのシグナルを、衝突に誘発された断片化によって引き続き分析できるように設定する。個々で走査範囲は、４５０〜１６００Ｔｈである。得られたスペクトルの評価は、３段階で実施する。
【００６４】
Ａ）対応するペプチドのアミノ酸配列に関する情報を含む生成物イオンスペクトルは、最初にソフトフェアープログラムＭＡＳＣＯＴ（Matrix Sciences）を用いて、公表されているデータベースと完全に照合する。そのようにして、ペプチドがタンパク質と一致しない場合は、
Ｂ）最初に生成物イオンスペクトルから、装置の製造会社のソフトフェアー・ツールを用いて自動的に配列を決定する。そのように得られたアミノ酸配列を、シェブチェンコ（Shevchenko）他の方法に従うＭＳＢｌａｓｔを用いて、公表されたデータベースと照合する。それでもタンパク質が同定できない場合は、
Ｃ）生成物イオンスペクトルを手動で評価し、得られたアミノ酸配列を、ｂｌａｓｔまたはＦＡＳＴＡを用いて、公表されたデータベースと照合する。
【００６５】
以上の方法に従うと、ＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片を、脳毛細血管の内皮細胞から選択的に同定できる。最初に説明した手順は、当業者であれば容易な、ありふれた変化を伴っている。例えば、以下に述べるように処理工程を変化させることができる。
【００６６】
消化方法として、当業者に公知のタンパク質を得るための他の方法を採用できる。それらの方法は、一般的な文献（例えば、２Ｄプロテオーム・アナリシス・プロトコル（2D Proteome Analysis Protocols））に記載されている。
等電点電気泳動では、もちろん他の製造会社からの電気泳動ゲルをいずれも採用できる。同様に、異なる長さや異なるｐＨ勾配も採用できる。
２次元分離でも、もちろん他の製造会社のゲルシステムをいずれも採用できる。別のゲルサイズの使用も可能である。
一般的な原則に従えば、当業者に公知の他のプロテアーゼを、ペプチドパターンの調製に使用できる。
他の種類あるいは他の製造会社の質量スペクトル分析機にも、ペプチドの質量と新規なアミノ酸配列の決定のために使用できる。
質量スペクトル分析条件は、ペプチド質量の決定および新規なアミノ酸配列のため、試料に対応して、機械と機能とを変化させることができる。
【００６７】
（タンパク質のウェスタンブロット）
最初にタンパク質を前述したように１２．５％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、続いてニトロセルロース膜上に移す。ここで、ワットマン（Whatman）紙（Schleicher & Schull）を７枚、分離ゲルの大きさに合わせて切り、それぞれを異なる緩衝液に浸す。
【００６８】
陽極緩衝液Ｉ（トリス塩基を３００ｍＭ、メタノールを２０％（ｖ／ｖ））中の２枚の紙を、血液検査装置（BioRad）の陽極上に、気泡が生じないように置き、陽極緩衝液II（トリス塩基を２５ｍＭ、メタノールを２０％（ｖ／ｖ））中の二枚の紙を重ねる。ニトロセルロース膜は、同様に陽極緩衝液IIに浸し、その上に置き、さらにポリアクリルアミドゲルを重ねる。最後に、さらに三枚の紙を陽極緩衝液（トリスを２５ｍＭ、アミノカプロン酸を４０ｍＭ、ＳＤＳを０．１％（ｗ／ｖ）、メタノールを２０％）に浸して、適用する。装置を閉じて、最大２５Ｖ、２．５ｍＡ／ｃｍ２ゲルで１時間、タンパク質の移動を起こす。
【００６９】
次にタンパク質の免疫化学的な染色を、ウサギの多クローン性抗血清を用いて実施した。
ここで、膜をＴＢＳＴ緩衝液（トリス塩基を１０ｍＭ、塩化ナトリウムを１５０ｍＭ、トゥウィーン２０を０．０５％（ｖ／ｖ）、ｐＨ：８．０）中で洗浄し、続いて、遊離の結合部位をＢｌｏｔｔｏ（トリス塩基を１０ｍＭ、塩化ナトリウムを１５０ｍＭ、トゥウィーン２０を０．０５％（ｖ／ｖ）、スキムミルクパウダーを５％（ｗ／ｖ）、ｐＨ：８．０）で飽和させる。最初の抗体のインキュベーションは、ＴＢＳＴ緩衝液中のＲＴ（抗−ＥＭＰ１−抗体（ウサギ）１：４０００，抗−ＴＫＡ−１−抗体（ウサギ）１：４０００）で２時間実施し、ＴＢＳＴ緩衝液で三回洗浄する。結合した抗体は、アルカリ性ホスファターゼに結合した第２抗体と共に、ＴＢＳＴ緩衝液中のＲＴ（抗−ウサギ−ＩｇＧ−抗体（ヤギ）、１：５０００）で１時間インキュベートすることにより検出される。ＴＢＳＴ緩衝液で二回洗浄後、ＡＰ緩衝液（トリス塩基を１００ｍＭ、塩化ナトリウムを１００ｍＭ、塩化マグネシウムを５ｍＭ、ｐＨ：９．５）でインキュベートすることにより、膜をアルカリ性のｐＨ値に再緩衝する。発色反応の基質として、ＡＰ緩衝液中の塩化ニトロテトラゾリウムブルー０．０１６％（ｗ／ｖ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート二ナトリウム塩を使用した。
【００７０】
以下において、ゲノム上の経路による脳毛細血管の内皮細胞におけるＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片の同定について、説明する。
【００７１】
［ｃＤＮＡサブトラクション法によるＢＢＢ特異的転写物の同定］
細胞または組織の特異的タンパク質の選択的同定は、ディファレンシャル法で実施する。これは、様々な組織および細胞の消化物の二次元ゲルをそれぞれ比較し、続いて組織と細胞の種類それぞれに特異的なタンパク質を決定することにより、タンパク質レベルで実施することができる。タンパク質の物理的性質（サイズ、溶解性）と独立させるため、転写レベルでディファレンシャル法を実施して特異的なタンパク質を同定することもできる。加えてサブトラクションＲＮＡ法を用いると、組織と細胞物質の必要量がそれぞれ少なくて良く、有利である。
【００７２】
ＢＢＢ−特異的タンパク質を同定するため、出発物質として新鮮に単離されたＢＭＥＣを使用することがきわめて重要である。これまで説明した最も良い方法は、腎臓のＲＮＡに対する脳の毛細管のＲＮＡのサブトラクションに基づく結果である（リー他、２００１年）。ここで、ＢＭＥＣに隣接する脳毛細血管は、周皮細胞や星状細胞のような他の細胞型を含むことが問題である。さらに、サブトラクション組織として、腎臓は非常に不均質である。すなわち、腎臓は多数の細胞型からなり、そこで内皮細胞はほんの一部でしかない。本発明に従うサブトラクション組織を利用すると、血管脳関門に特異的な転写物とタンパク質のそれぞれに選択的な同定が可能になる。基本的には、あらゆる内皮細胞が対照組織として使用できる。例えば、同じ組織の大血管または小血管の内皮細胞、あるいは他の組織（例、心臓、肺、腎臓、肝臓、大動脈他）の内皮細胞を対照組織として使用できる。また、培養により得られる脱分化ＢＭＥＣを用いることもできる。ただし、脳毛細血管の内皮細胞に対しては、他の内皮細胞型を対照組織として用いることが好ましい。好ましく用いられるのは、大動脈の内皮細胞であり、これは関門機能を示さない。これには、加えて、小血管を大血管と比較できるとの利点もある。さらに、他の大血管内皮細胞も使用できる。別に適した比較組織は、別の条件で培養した脳毛細血管の内皮細胞である。別の条件とは、ｐＨ値、成長培地、成長因子（例、サイトカイン）に関して異なる条件である。同定した標的の生理学的な意味は、個々の対照組織に対して、脳毛細血管の内皮細胞の公知の性質から判断することができる。本発明では、二種類の明確な細胞型が好ましく使用される。一方は、関門機能を伴う細胞型である新鮮に単離されたＢＭＥＣであり、他方は、ＢＭＥＣに類似する内皮細胞でありながら、関門機能を示さない大動脈からの内皮細胞である。この研究経路は、転写物とタンパク質の双方を同定することを可能にして、従来よりも大幅に選択的な血液脳関門の形成に寄与するはずである。
【００７３】
［サブトラクション法によるｃＤＮＡライブラリーの調製］
トリゾール（Trizol、Invitrogen）を用い、製造会社の説明書に従って、細胞から全ＲＮＡを単離した。引き続き、変性アガロースゲル上で全ＲＮＡの純度を確認する。ＲＮＡの単離のため、１ｍｌのトリゾール中、１００ｍｇの組織と１０ｃｍ２の融合成長細胞それぞれを、機械的にホモジナイズして、引き続きホモジネートをＲＴで５分間インキュベートする。その後、トリゾール（Invitrogen）１ｍｌ中のクロロホルム０．２ｍｌを加え、ボルテックス（Vortex）で１５秒間混合し、ＲＴで３分間インキュベートする。４℃にて１２０００×ｇで１５分間遠心分離して、相分離させる。その後、上部の水相を新鮮な容器に移す。トリゾール１ｍｌ中のイソプロパノール０．５ｍｌを加え、攪拌後、ＲＴで１０分間インキュベートする。４℃にて１２０００×ｇで１０分間遠心分離して、ＲＮＡを沈降させ、７５％エタノールで二回洗浄し、空気乾燥し、ＤＥＰＣ処理水に溶解する。濃度は、分光光度計で決定し、品質は変性アガロースゲルで確認する。
【００７４】
全ＲＮＡから始めて、製造会社の説明書に従い、ダイナビーズ（Dynal）を用いてｍＲＮＡの割合を高める。
【００７５】
（ｍＲＮＡの濃縮）
全ＲＮＡ７５μｇを、６５℃で２分間変性し、直ちに二倍量の結合緩衝液中のダイナビーズ・オリゴ（ｄＴ）２５（Dynal）２００μｌを加え、攪拌しながら５分間インキュベートする。磁気分離の上澄みを捨て、ダイナビーズを洗浄用緩衝液で二回洗浄する。ポリＡ＋−ＲＮＡは、ｐＨ７．５の１０ｍＭトリス−塩酸２０μｌを用いて８５℃で２分間、最後に溶出する。
【００７６】
サブトラクション法のｃＤＮＡライブラリーの調製は、市販のＰＣＲサブトラクション・キットで実施できる。例えば、クローンテック（Clontech）社のＰＣＲ選択ｃＤＮＡサブトラクションキッドを、製造会社の説明書に従い使用できる。
【００７７】
ここで、ＢＭＥＣ（テスター）およびＡＯＥＣ（ドライバー）からのｍＲＮＡそれぞれ２ｍｇを、ＡＭＶ逆転写酵素により、オリゴ（ｄＴ）アダプタープライマーから直接開始して、一本鎖ｃＤＮＡに転写する。次に、第２鎖の合成を酵素混合物（ＤＮＡポリメラーゼＩ、リボヌクレアーゼＨおよびＤＮＡリガーゼ）を用いて１６℃で２時間実施し、続いて、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを加え、１６℃で３０分間さらにインキュベートする。このようにして調製した二本鎖ｃＤＮＡは、フェノール／クロロホルム抽出で精製し、エタノールで沈降させる。
【００７８】
後述するアダプターの連結反応に適した末端を導入するためと共に、より均一なサイズのｃＤＮＡ断片を生じるために、ここで、ＲｓａＩによる制限分解を実施する。このように調製した二本鎖ｃＤＮＡ断片は、フェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈降により精製する。ｃＤＮＡの合成および制限分解の生成物は、ゲル電気泳動で純度を検査する。
【００７９】
後述するＰＣＲによる増幅のため、ここで、アダプター１および２Ｒを、酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼと共に、テスターｃＤＮＡのＲｓａＩ末端に加える。連結反応は、ＰＣＲで確認する。
【００８０】
実際のサブトラクションは、二種類のハイブリダイゼーションにより行う。第１のハイブリダイゼーションでは、一つのバッチでＢＭＥＣアダプター１のｃＤＮＡがＡＯＥＣｃＤＮＡとハイブリダイズして、もう一つのバッチでＢＭＥＣアダプター２ＲのｃＤＮＡがＡＯＥＣｃＤＮＡとハイブリダイズする。第２のハイブリダイゼーションでは、第１のハイブリダイゼーションからのバッチの双方を併せて、ＡＯＥＣから新たに変性したｃＤＮＡとハイブリダイズさせる。
【００８１】
ハイブリダイゼーションの生成物は、最終的に、第１のＰＣＲ反応の鋳型として使用する。ここで、双方のアダプター１および２Ｒの共通領域からのオリゴヌクレオチドは、プライマーとして機能する。
【００８２】
この最初のＰＣＲの生産混合物は、ここでは、入れ子式のＰＣＲの鋳型として使用した。ここで、互いに配置した二種類のプライマーは、双方のアダプター１および２Ｒの特異的領域からそれぞれ得られる。この第２のＰＣＲは、特異性を増加させる。
【００８３】
サブトラクションの有効性は、ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）のための比較用ＰＣＲで確認する。ＢＭＥＣおよびＡＯＥＣからの非サブトラクション法による二種類のｃＤＮＡと比較して、顕著により多くのＰＣＲが循環した後においてのみ、サブトラクション法によるｃＤＮＡと共に生成物が形成される。典型的なハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨは、全ての組織と細胞型において比較できる程度まで発現する。それゆえ、サブトラクション法によるハイブリダイゼーションでは、異なる表現型の遺伝子が豊富ではないが、転写物の量がサブトラクション法ｃＤＮＡ（正および逆のサブトラクションのいずれ）において、サブトラクション前のＢＭＥＣおよびＡＯＥＣからのｃＤＮＡと比較すると顕著に減少する。これは、サブトラクション前のｃＤＮＡとそれぞれのサブトラクション法ｃＤＮＡの双方を、ＧＡＰＤＨ特異的プライマーでＰＣＲに使用することで実験的に確認する。サブトラクション法のｃＤＮＡによる最初の生成物の形成は、二つの非サブトラクションｃＤＮＡと比較すると、追加の１６サイクル後においてのみ得られる。そのため、ハイブリダイゼーションにおいて、少なくとも要素が５００００に増幅する。この増幅で、ＢＢＢ−特異的転写物の選択的同定が容易になり、単離した配列の第１の有効性も示す。
【００８４】
第２のＰＣＲの生成物は、ｐＴ−Ａｄｖベクター（Clontech）でクローン化し、大腸菌のキモコンペンテント（chemocompetent）ＴＯＰ１０Ｆ’（Clontech）を形質転換する。第２のＰＣＲの生成物は、ｐＴ−Ａｄｖプラスミドベクター（Clontech）でクローン化する。このベクターは、５’末端のｄＴ残基が重複しており、３’ｄＡ残基と適合できる。これは、例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによりＰＣＲ生成物に結合できることを意味する。これと対照システムとは、いずれもＰＣＲ生成物を高い効率で直接クローン化できる。形質転換を大腸菌のキモコンペンテント（chemocompetent）ＴＯＰ１０Ｆ’（Clontech）で実施することは、文献（サムブルック他、１９８９年）に記載がある。
【００８５】
［ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション］
サブトラクション法によるｃＤＮＡライブラリーからのクローンは、ＢＭＥＣ対ＡＯＥＣの発現として、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーションにより確証する。ここでは、ＰＣＲに選択的なディファレンシャル・スクリーニング・キット（Clontech）を使用する。逆サブトラクション・プローブは、上記の製造会社の説明書に従い、クローンテック（Clontech）社のＰＣＲ選択的ｃＤＮＡサブトラクション・キットを用いて調製した。ここで、ＢＭＥＣはドライバー、ＡＯＥＣはテスターとして機能する。
【００８６】
製造会社の説明書に従い、クローンの液体培地を９６の窪みがあるマイクロ滴定プレートに接種する。これらは、プライマー・アダプター１および２Ｒの挿入を増幅するための鋳型として用いる。液体培地の残りには、グリセロールを加え、永久培地として凍結する。ＰＣＲ生成物は、ゲル電気泳動により確認する。２００塩基対よりも大きい、それぞれ１μｌの生成物を、二つの同一のハイボンドＮ（HybondN）膜上に滴下し、紫外光を用いて固定する。製造会社の説明書から離れて、９２クローンを有する二つのフィルターのみをハイブリダイズする。それぞれは、ＢＭＥＣ特異的な転写物が豊富な正にサブトラクションしたプローブがあるフィルターと、ＡＯＥＣ特異的な転写物が豊富な逆にサブトラクションしたプローブがある他のフィルターである。ＢＭＥＣおよびＡＯＥＣそれぞれからのｃＤＮＡがある別の二つのフィルターのハイブリダイゼーションは省略する。これは、そこから関連性が高い付加的な情報を集めることができないためである。代わりに、ＢＭＥＣおよびＡＯＥＣからのＲＮＡを、ノーザンブロット解析とＲＴ−ＰＣＲ実験における解析（後述）において、発現パターンの調製のために使用する。サブトラクション法によるｃＤＮＡライブラリーの９２クローンは、製造会社による２種類の負の対照と共に、フィルターに適用する。製造会社の説明書に加えて、ＢＭＥＣおよびＡＯＥＣで同じように強く発現さされるハウスキーピング遺伝子のＰＣＲ生成物の一つを、ＢＨＳマーカー（Apolipoprotein A1）のためのＰＣＲ生成物と同様にスポットする。ＢＨＳマーカーは、ＡＯＥＣよりもＢＭＥＣで強く発現する正の対照である。
【００８７】
ハイブリダイゼーションは、製造会社が説明するように、エクスプレスＨｙｂ溶液（Clontech）を用いて７２℃で同等の活性を有するプローブを用いて実施する。続いて、フィルターを厳重に洗浄する。通常の厳格な条件を採用する。好ましくは、フィルターを６８℃で２０分間、２回、０．５％ＳＤＳ中の０．２×ＳＳＣで厳密に洗浄する。信号強度は、ホスフォイメージャー（ＦＬＡ−５０００、Ｆｕｊｉ）を用いて、フイルム上での異なる時間による露光で決定する。ＢＭＥＣにおいて、ＡＯＥＣよりも約５倍の信号強度を示すクローンを、ディファレンシャルに発現したものとして区別し、さらに処理する。
【００８８】
正のクローンの永久培地から液体培地を接種して、キアーゲン（Quiagen）カラムを用いる標準的な方法（バーンボイムおよびドリー、１９７９年）に従い、プラスミドＤＮＡを単離する。プラスミドの挿入は、普遍的なプライマーを用いて配列させ、任意に遺伝子に特異的なプライマーを加えて用いる。ＤＮＡ配列から得られたデータベースは、アルゴリズムのＢＬＡＳＴ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)およびＦＡＳＴＡ(http://www.ebi.ac.uk/fasta33)を用いて相同性を調査する。
【００８９】
［ＢＢＢ−特異的転写物の検証：発現パターン］
関連する正のクローンから、ＢＭＥＣ、ＡＯＥＣおよび９種の他の組織において、発現パターンを生じさせる。これは、ＲＴ−ＰＣＴおよび／またはノーザンブロット解析により実施する。
【００９０】
ＲＴ−ＰＣＲ実験では、全ＲＮＡを出発物質としてランダムに開始することでｃＤＮＡを調製する。使用する全ての酵素とランダム・ヘキサマーは、インビトロゲン社製である。ここで、５μｌのデオキシリボヌクレアーゼＩ、１０倍量の緩衝液および５μｍｌのデオキシリボヌクレアーゼＩを、ヌクレアーゼ・フリーの水４０μｌ中の全ＲＮＡ１０μｇに加え、２５℃で１５分間インキュベートする。続いて、２５ｍＭのＥＤＴＡ５μｌを加え、６５℃で１５分間、酵素を熱で不活性にする。調製物から２５μｌを除き、１００μｌまで、ヌクレアーゼ・フリーの水を加え、−ＲＴ対照として−８０℃で保管する。８μｌのランダム・プライマー（１００ｎｇ／μｌ）、３μｌのｄＮＴＰ混合物（それぞれ１０ｍＭ）および２μｌのヌクレアーゼ・フリーの水を、デオキシリボヌクレアーゼＩの消化物から残っている２５μｌの全ＲＮＡに加える。ここで、６５℃で５分間、ＲＮＡの２次構造を崩壊させ、その後、直ちに試料を氷の上に置く。１０μｌの５倍ストランド用緩衝液、６μｌのＤＴＴ（１００ｍＭ）および３μｌのＲＮａｓｅＯＵＴを加える。プライマーがアニーリングするまで、２５℃で１０分間インキュベートし、引き続いて、温度を４２℃に２分間調節する。３μｌのスーパースクリプトII逆転転写酵素を加え、４２℃で５０分間インキュベートする。次に、７０℃で１５分間、酵素を熱で不活性にする。３μｌのリボヌクレアーゼＨを加え、３７℃で２０分間インキュベートし、ｃＤＮＡからの全ＲＮＡを分解する。最後に、ヌクレアーゼ・フリーの水を加えて１００μｌとして、ｃＤＮＡを８０℃で保管する。ｃＤＮＡの品質は、ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）と１８ＳのｒＲＮＡをそれぞれ用いるＰＣＲで確認する。ここで、異なる組織と細胞のそれぞれからｃＤＮＡについて、比較できる程度の量で生成物が生じることが期待される。調製したｃＤＮＡ細胞は、それぞれの場合で、転写の発現パターンを調製するために使用され、研究される。
【００９１】
発現パターンの調製のためのノーザンブロット解析では、細胞と組織それぞれからの全ＲＮＡを、そのサイズに従い変性ゲルで分離し、ナイロン膜に移す。ここで、放射性物質で標識した遺伝子に特異的なプローブとハイブリッド形成する。６．０ｇのアガロースを、２９０ｍｌのＤＥＰＣ処理した水に加熱しながら溶解する。次に、６０℃の水浴で６０℃まで冷却し、４０ｍｌの１０倍ＭＯＰＳ緩衝液（ＭＯＰＳを２００ｍＭ、酢酸ナトリウムを５０ｍＭ、ＥＤＴＡを１０ｍＭ）と７０ｍｌのホルムアルデヒドを加える。最後に、ビック・ポケット・フォーマー（１２ライン）のマキシゲル（maxigel）をフューム・フードに展開し、放置することで固形化する。それぞれ１０μｌ中の全ＲＮＡ１０μｇを、４０μｌの試料緩衝液（脱イオンホルムアミドを５００μｌ、ホルムアルデヒドを１６０μｌ、１０倍のＭＯＰＳを１００μｌ、ＤＥＰＣ処理した水を２４０μｌ）で１５分間、６５℃で変性し、続いて氷の上に移す。ここで、１０μｌのローディング緩衝液（グリセロールを５００μｌ、ＥＤＴＡを５００ｍＭ、１０％ブロモフェノールブルーを２５μｌ、ＤＥＥＰＣ処理した水を４７３μｌ）を加え、試料を１倍ＭＯＰＳ緩衝液で覆ったゲルに適用する。電気泳動を２５０Ｖで３〜４時間実施する。その後、ゲルを最初に水の中で１０分間回転させ、次に１０倍のＳＳＣの中で３０分間回転させる。ゲルの大きさに合わせて注文しておいたハイボンドＸＬフィルターを１０倍ＳＳＣ中で１５分間振盪する。
【００９２】
ブロットの組み立て（底部から上部へ）は、塩橋（１０倍ＳＳＣを入れた緩衝液容器中に浸漬）、ゲル、フィルター、５ ３ＭＭ（予め１０倍ＳＳＣに浸漬）、約７ｃｍの緑色のタオル（セルロースの布）、ガラス板、約０．５ｋｇの重りである。ブロッティングは、１６〜２０時間実施する。その後、ブロットを分解し、ハイボンドＸＬフィルターを、２倍ＳＳＣで１０分間洗浄する。ＲＮＡは、ここで７００００μＪ／ｃｍ２の紫外線架橋結合によりハイボンドフィルター上に固定される。さらに、フィルターを染色溶液（０．３Ｍ酢酸ナトリウム１リットル中のメチレンブルー３００ｍｇ）中で１分間染色し、ＲＮＡを可視化する。さらに２分間水洗して、背景を脱色する。染色したフィルターを写真で解析する。引き続いてフィルターを３ＭＭ紙の間で乾燥し、サランラップで覆い、−２０℃で保管する。
【００９３】
ハイブリダイゼーションは、放射性元素で標識したｃＤＮＡプローブ（Rediprime II、 Amersham）を用いて実施する。このプローブは、製造会社の説明書に従い、エクスプレスＨｙｂ溶液（Clontech）を用いて、プローブカント（ProbeQuant）Ｇ−５０カラム（Amersham）で予め精製してある。ホスフォイメージャーＦＬＡ−５０００（Fuji）を用いてハイブリダイゼーションを最初に確認後、バイオマックスＭＳフイルム（Kodak）上でオートラジオグラフを調製する。
【００９４】
［ｃＤＮＡ配列の完成］
様々なｃＤＮＡライブラリーとＲＡＣＥ−ＰＣＲ実験をスクリーニングすることで、サブトラクション法による関連するｃＤＮＡライブラリーから、ＢＢＢ−特異的クローンの完全なｃＤＮＡ配列を決定する。
【００９５】
ｃＤＮＡライブラリーは、製造会社の明細書に従い、λＴｒｉｐｌＥｘ２ベクター内のＳＭＡＲＴｃＤＮＡライブラリー組み立てキット（Clontech）を用いて、ブタのＢＭＥＣから構築する。ここで、最初に、前述したように、トリゾール（Invitrogen）から全ＲＮＡを単離する。そして、ダイナビーズ（Dynal）を用いて、そこからポリＡ＋−ＲＮＡを濃縮する。ライブラリーの調製では、ＢＭＥＣからのポリＡ＋−ＲＮＡを２μｇ用いる。最後に、製造会社の説明書に従い、ファージ抽出物ギガパックIIIゴールド（Stratagene）を用いて、インビトロで連結反応を進行させる。ＢＭＥＣのｃＤＮＡライブラリーの独立ファージの数は、１３０万ｐｆｕに達する。そのうち９９％以上は、ブルー／ホワイト試験（サムブルック他、１９８９年）を実施した組み換え体であった。挿入物の少なくとも半分は、１ｋｂを越える大きさを有していた。完全なライブラリーの増幅後、滴定量は、約１５０ｍｌの全量において約２×１０１０ｐｆｕ／ｍｌであった。このファージの溶解生成物は、ＤＭＳＯ７（ｖ／ｖ）％に調整し、−８０℃で保管する。説明したファージのライブラリーは、製造会社の説明書（Clontech ClonCapture cDNA Selection Kit）に従い、プラスミド・ライブラリーに変換する。この説明書では、大腸菌ＢＭ２５．８が、２００万ｐｆｕのファージ・ライブラリーで感染されている。この細菌株は、Ｃｒｅレコンビナーゼを発現する。Ｃｒｅレコンビナーゼは、λＴｒｉｐｌＥｘ２ベクターのｌｏｘＰサイトを認識し、それにより転換を可能にする。ここで、プラスミド中のラムダ・ファージの転換は、インビボでの削除と、それに続く完全なプラスミドの環状化によって行われる。得られるプラスミドは、次に、安定した状態で大腸菌から抜け出る。プラスミドは、感染したＢＭ２５．８のプレート培地から、ヌクレオボンド・プラスミド・キット（Clontech）を用いて調製される。
【００９６】
ｃＤＮＡプラスミドのライブラリーをクローンキャプチャー（ClonCapture）でスクリーニングするため、ビオチンを加えたｃＤＮＡプローブを用いる。ここで、ＲｅｃＡｇａ仲介する反応で、プラスミドが挿入された同じ配列を有するＤＮＡの三重構造が形成される。このように選択されたプラスミドは、磁石ビーズに結合したストレプトアビジンを用いて単離でき、形質転換に使用できる。そのような濃縮物からのクローンは、さらにコロニーのハイブリダイゼーションでスクリーニングされ、プラスミドＤＮＡが単離され、そこから生じる正のクローンにつなげる。
【００９７】
クローンキャプチャー（ClonCapture）による正のクローンの単離は、製造会社の説明書（Clontech）に正確に従って実施する。プローブの調製では、最初に、遺伝子に特異的なプライマーを有するＰＣＲを適当なプラスミドに最適化する。これにより、一つの生成物のみが形成される。このために、プライマーは、互いの融点が１℃よりも異ならず、プライマーの二量体や安定なループを形成しないように設計する。アニーリング温度は、以下の式で計算される融点よりも２〜５℃低い、比較的高めの温度となるように選択する。
Ｔｍ＝［（Ｇ＋Ｃ）×４］＋［（Ａ＋Ｔ）×２］
これにより、ゲル電気泳動による対照の唯一のバンドにおいて、特異的な生成物が形成される。この生成物から、滅菌したパスツールピペットを用いて、アガロースゲルから一片を取り、滅菌した水２００μｌに移す。７０℃で３０分間、回転させながらインキュベートすることにより、ＤＮＡをゲル片から溶出させ、プローブ調製の鋳型として用いる。この鋳型を用いる対照反応を、ビオチン−２１−ｄＵＴＰを用いる場合と用いない場合とで実施し、アガロースゲルで分析する。これは、ビオチンがＰＣＲを阻害するからである。対照反応が成功すれば、ここでビオチンを加えたプローブが、［α３２Ｐ］ｄＣＴＰを１０μＣｉ加えた調製用のＰＣＲ中で調製される。２０サイクル後、調製物の５μｌをアガロースゲルで検査し、可能ならばさらに５サイクルを加える。続いてＰＣＲ生成物を、製造会社の説明書に従い、ヌクレオスピン・エクストラクション・キット（Clontech）で精製し、３５μｌの溶出用緩衝液で溶出する。そこから２μｌをゲル電気泳動で分析し、生成物を分光光度計で定量する。ビオチン添加の対照とするため、純粋なＰＣＲ生成物２μｌを、１５μｌの磁気ビーズに加え、インキュベーション前の信号をガイガー・カウンターで確認する。わずかに振盪しながら３０分間インキュベート後、磁気ビーズを磁石で分離し、上澄みを再びガイガー・カウンターで定量する（インキュベート後の信号）。ビオチン添加に成功すると、インキュベーション前の信号は、インキュベーション後の信号よりも２〜四倍強くなる。
【００９８】
５０（２００ｂｐ）〜１００（６００ｂｐ）ｎｇを捕獲するため、水中のビオチンを加えたＰＣＲ生成物は、１００℃で５分間変性し、その後、直ちに氷の上に移す。ここで、プラスミドＤＮＡ以外の全ての成分を加える。ここでは、プローブ５０ｎｇに対して、ＲｅｃＡタンパク質２μｇを用いる。３７℃で１５分間インキュベーション後、１μｇのプラスミド・ライブラリーを加えて、さらに３７℃で２０分間インキュベートする。一方、磁気ビーズ１５μｌをニシンの精子ＤＮＡで非特異的に飽和させ、捕獲のための精製用に調製する。ＥｃｏＲ Ｖで解裂したλ−ＤＮＡを捕獲用調製物に加え、プロテイナーゼＫによる消化を３７℃で１０分間行う。この反応は、最後にＰＭＳＦを加えて停止し、捕獲用調製物を磁気ビーズで精製する。単離したプラスミドを１００μｌの溶出用緩衝液で溶出し、沈降させ、さらに１０μｌの水に溶解する。
【００９９】
クローンキャプチャーで濃縮したプラスミド・ライブラリー２μｌで、電気適応能がある大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、ＬＢ−Ａｍｐプレートから取り出す。正のクローンは、標準的な方法に従い放射性物質で標識したプローブ（ビオチン添加の場合と同じ増幅標識）を用いるコロニー・ハイブリダイゼーションにより同定する。このように得られたクローンは、コロニーＰＣＲでさらに検証する。そのため、上記増幅標識（amplicon）とそれよりも下流に位置する他のプライマーからのプライマーを用いる。クローンキャプチャーのプローブとして用いた増幅標識からの双方のプライマーを選択することは、避けるべきである。これにより、コロニーＰＣＲ（ＰＣＲは、ＤＮＡに代えて、個々のコロニーからの細菌を使用することで実施する）を行う際に、生成物の形成が細胞内のプラスミドでは起こらず、汚染したプローブにより起こることを回避する。それゆえ、少なくとも一つのプライマーを増幅標識の外側に、最も好ましくは３’側から配置すべきである。すなわち、この配列は、知られており、かつｃＤＮＡライブラリーにおける全ての正のクローンに含まれているからである。正のクローンのプラスミドＤＮＡは、標準的な方法（バーンボイムおよびドリー、１９７９年）に従い、キアーゲン社のカラムを用いて単離し、鎖末端法（サンガー他、１９７７年）に従い配列を決定する。配列の決定には、製造会社の説明書に従い、「ＡＢＩプリズム・ビッグダイ・ターミネーター・サイクル・シークエンシング・レディ・リアクション・キット、バージョン２．０（Applied Biosystms）」を使用できる。配列決定反応の生成物は、「ＡＢＩプリズム３１０ジェネティック・アナライザー（Applied Biosystems）」で分析する。
【０１００】
ＲＡＣＡ−ＰＣＲ（フローマン他、１９８８年）は、未知のｃＤＮＡ配列の決定に利用できる。具体的には、ｃＤＮＡ合成により既知の配列部分から開始し、引き続き、第２のＰＣＲプライマーをアニーリングするため既知の合成末端を導入する。
【０１０１】
５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲは、製造会社の説明書に従い、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅用５’ＲＡＣＥシステムのバージョン２．０（Invitrogen）を用いて実施する。ここで、最初にｃＤＮＡプライマリー鎖を、遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ１）とＢＭＥＣの全ＲＮＡ１μｌを用いて合成する。ｃＤＮＡをガラスＭＡＸカラムで精製後、第２段階として、酵素末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用いて、オリゴ−ｄＣ−テイルを付ける。最初のＰＣＲは、さらに遺伝子特異的なプライマー（ＧＳＰ２）と短縮したアンカープライマーとを用いて、テイルを付けたｃＤＮＡ５μｌ上に置く。アンカープライマーは、オリゴ−ｄＣ−テイルに結合している。ＰＣＲの特異性は、第２の入れ子式のＰＣＲにより増加する。これは、短縮した普遍的な増幅プライマーと第３の遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ３）を用いて、最初のＰＣＲからのＰＣＲ生成物を１：１００希釈したもの５μｌ上で実施される。それぞれひとつだけのプライマーのバッチと水を制御したバッチは、第２のＰＣＲの対照として機能する。ゲル電気泳動解析後、第２のＰＣＲの生成物は、出来る限りクローン化する。これにより、ｐＧＥＭ−ＴｅａｓｙシステムII（Promega）を用いる連結反応と、電気適応能があるＤＨ５αの形質転換を実施する。得られるクローンは、コロニーＰＣＲを持ちおいて検査し、プラスミドＤＮＡを調製し、最後に実際に知られている方法で配列を決定する。
【０１０２】
３’ＲＡＣＥ−ＰＣＲは、製造会社の説明書に従い、ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅用３’ＲＡＣＥシステム（Intvitrogen）を用いて実施できる。３’ＲＡＣＥ−ＰＣＲにおいて、ｃＤＮＡプライマリー鎖の合成は、オリゴ−ｄＴアダプタープライマーを用いて、ＢＭＥＣの全ＲＮＡ５μｇに関して実施する。最初のＰＣＲでは、ｃＤＮＡ２μｌを、遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ１）および短縮した普遍的な増幅プライマーと共に用いる。半入れ子式の第２のＰＣＲは、遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ２）および短縮した普遍的な増幅プライマーを、５’ＲＡＣＥで説明した対照と共に用いて実施する。生成物をクローン化し、既に述べたように配列を決定する。
【０１０３】
以上述べた方法に従い、ＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片は、脳毛細血管の内皮細胞で選択的に同定することができる。以上述べた手順は、当業者に自明のありふれた変更が可能である。例えば、以下に述べるように処理工程を変化させることができる。
【０１０４】
単離したＢＭＥＣを散布し、第１の培地を新鮮なＢＭＥＣに代えて、サブトラクション法におけるテスターとして使用できる。
別のサブトラクション法の組織（ドライバー）として、例えば、培養（少なくとも２継代）により脱分化したＢＭＥＣを選択できる。
【０１０５】
ＲＮＡとｍＲＮＡそれぞれを、ＲＮＡが損なわれておらず、ｍＲＮＡが逆転写によりｃＤＮＡに転写できることを条件に、当業者に公知の他の方法に従って調製できる。
サブトラクション法によるＰＣＲ生成物を、ポリメラーゼによる３’ｄＡ残基および平滑末端の双方を用いるか、あるいは制限分解後、それぞれ適切なベクターシステムでクローン化できる。形質転換は、別の大腸菌株を用いて実施できる。大腸菌株は、化学的および電気的な適応能がある細胞であれば、この分野で良く知られている細胞を用いることができる。
【０１０６】
ディファレンシャルハイブリダイゼーションの工程は、任意であるが、推奨される。ここで他の好ましい膜（例、陽極電荷が負荷された、あるいは負荷されていないナイロン膜）や他のハイブリダイゼーション溶液を用いることもできる。膜の厳格な洗浄は他の温度でも、あるいは他の溶液を用いても（例えば、より低温とより低塩量、およびより高温とより高塩量、例、Ｔ＝５０〜７０℃、０．５〜０．０５×ＳＳＣ／０．１％５ＤＳ）、それぞれ実施できる。
表現型は、それぞれのｃＤＮＡを用いて、定量的ＰＣＲ（同時ＰＣＲ）によっても決定できる。実際的な方法では、定量的ＰＣＲを、オプティコン（MJ Research）を用いて実施する。反応を実施するため、キアーゲン社の「クアンティテキストＳＹＢＲグリーンＰＣＲキット」を使用する。ここで、ＰＣＲの条件は、前述したものが採用される。定量において、溶出液系列を一つずつ、ＢＭＥＣｃＤＮＡから調製できる。説明書は、使用したＲＮＡと当量のピコグラム単位である。それぞれの場合に、相対的な定量を実施するためには、目的物質の計算上の量を、１８ＳｒＲＮＡの計算上の量で割っておく。最後に、試料（例、ＢＭＥＣ）を１００％に設定し、他の全ての試料をそれと参照する。
【０１０７】
ｃＤＮＡは、他のシステムを用いて生産することもできる。ノーザンブロット解析は、他の適当なプローブとハイブリダイゼーション／洗浄溶液を用いて実施できる。
ｃＤＮＡは、既知の重複配列を用いてデータベース検索により展開できる。実験的には、求めている転写物が生じている細胞と組織それぞれの他のｃＤＮＡライブラリーを、様々なシステムによりスクリーニングできる。求めている転写物が生じている細胞と組織それぞれのＲＮＡをＲＡＣＥ−ＰＣＲそれぞれに採用できる（サムブロック、１９８９年参照）。ＲＡＣＥ−ＰＣＲでは、当業者に公知の他の適当なシステムも使用できる。
【０１０８】
この方法で同定したタンパク質または断片は、血液脳関門に特異性を有しており、それが本発明の主題にもなっている。血液脳関門に対するタンパク質または断片の特異性に関する知識により、現在では、タンパク質の機能を選択的に発見することが可能になった。機能の決定は、通常、利用可能なデータベース、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、既知の配列データとの比較により行われる。同定したタンパク質の特異性に関する知識は、血液脳関門での発現の選択的調節を可能にし、これにより病理学的な条件を特別に扱うことができる。
【０１０９】
そのようにして、それぞれのＢＢＢ−特異的タンパク質についてのアゴニストとアンタゴニストを、それらの活性を選択的に調節するように展開できる。それらのタンパク質の発現は、例えば、遺伝子転移やアンチセンスＲＮＡにより直接調節することもできる。特に治療において有効な方法は、「トロイの木馬」医薬への展開である。この医薬は、同定した担体によって、ＢＢＢを通過する活性を有する分子と結合させる。あるいは、いわゆるプロドラッグである内皮細胞のＢＢＢ−特異的酵素で変性した物質、およびこれにより得られる治療上の効果が可能になる。
【０１１０】
ＢＢＢ−特異的タンパク質は、多面的な機能を満足する。例えば、それらは、養分の供給（例えば、グルコース担体であるＧＬＵＴ１）に機能し、あるいは、接触タンパク質（例えば、強固な結合タンパク質であるＺＯ−１）として機能する。さらに、それらは、酵素活性（例、グルタミルトランスフェラーゼＧＧＴ）を有するか、あるいはアミノ酸の搬送担体として機能する。
【０１１１】
［虚血におけるＢＢＢ−特異的タンパク質の発現］
本発明に従い同定されたＢＢＢ−特異的タンパク質の発現反応を、虚血に関して調べた。このために調製した内皮細胞は、洗浄後、再懸濁し、フランク他（２０００年）が説明したように、コラーゲンでコートした細胞培地のボトルに散布した。細胞の培養は、二酸化炭素中、３７℃のインキュベートで行い、二酸化炭素量は５％に一定化した。細胞が集合体を形成後、トリプシン溶液の処理で細胞を剥がし、そのために準備しておいたトランスウェル（transwell）皿（４４ｃｍ２、Corning）に分けた。上記条件で細胞を３日培養後、トランスウェルバッチを皿に移した。皿の底には、Ｃ６−グリオーム細胞（市販品、例えば、ＡＴＣＣから購入可能）を増殖させておいた。二つの細胞型を、ヒドロコルチゾンを加えた共有培地で、さらに２日培養した。培地の交換は、虚血の発現実験のために行った。最初に、新しい培地を、０．２％の酸素、９４．２％の窒素および５％の二酸化炭素で燻蒸する。新しい培地は、グルコースを全く含まない。引き続き、０．２％の酸素、９４．２％の窒素および５％の二酸化炭素を有する二酸化炭素インキュベーター内で、細胞を３７℃で２４時間保管した。培地の交換は、対照実験のためにも実施した。最初に培地を、２１％の酸素、７４％の窒素および５％の二酸化炭素で燻蒸した。培地は、グルコースを含む。これらの条件で細胞をさらに２４時間培養した。次に、それぞれのタンパク質の発現を、前述したように定量的に決定した。
【実施例】
【０１１２】
ここで、血液脳関門において、以下のタンパク質を本発明の方法で同定した。
［第１例：Ｓ１２９＝ＩＴＭ２Ａの同定］
上記のようにブタの脳から単離した新鮮なＢＭＥＣを、コラーゲンＧ（Biochrom）上の雄牛の血清（ＰＡＡ）１０（ｖ／ｖ）％を加えたＭ１９９培地（Sigma）で精製または培養した。培養したＢＭＥＣから全ＲＮＡを、前述したように、初代の培地（Ｐ０）とそれぞれＴ７５細胞からの継代（Ｐ１〜３）から単離した。新鮮なＢＭＥＣとＰ０〜３を比較する発現パターンは、それぞれの場合でｇＡＰＤＨと１８ｓのｒＲＮＡに関する個々の遺伝子に特異的なプライマーを用いて調製した。この例および以下の例で説明するクローンが得られた。
【０１１３】
サブトラクション法によるクローンＳ１２９は、正プローブと共にディファレンシャルスクリーンに用いる逆プローブと比較して、５倍よりも強い信号を示すため、配列決定に選択される。クローンＳ１２９の配列は、配列番号１に示されている。このＳ１２９の配列により、Ｉｔｍ２Ａが明白に同定された。
最初にＩｔｍ２Ａの発現パターンを、前述したプライマーＩｔｍ２ａ．ｓ２（５’ＡＣＣ ＴＣＣ ＡＴＴ ＧＴＴ ＡＴＧ ＣＣＴ ＣＣＴ Ａ３’＝配列番号２）およびＩｔｍ２ａ．ａｓ２（５’ＧＦＦ ＧＣＣ ＴＣＴ ＣＡＣ ＴＣＴ ＴＧＡ ＣＡＧ Ａ３’＝配列番号３）を用いて調製し、ＧＡＰＤＨを対照として用いた。発現パターンは、ＲＴ−ＰＣＲ（描写せず）で得られた。
【０１１４】
半定量的発現パターンは、Ｉｔｍ２ＡがＢＭＥＣ内で、ＡＯＥＣ内よりも強く発現することを示している。これにより、ディファレンシャルハイブリダイゼーションの結果が確認される。さらに、ＢＭＥＣでの発現は、皮質（脳）での発現よりも明らかに強く、脳のＢＭＥＣへの特異性を示唆している。心臓においてのみ強い発現が観察されることから、筋肉における前述した発現と関連させることができるかもしれない。発現パターンは、ノーザンブロット解析により検証できる。ここで、ブタのＩｔｍ２Ａのコード領域（図１のａ）は、プローブとして利用する。
ノーザンブロットにおいて、ＢＭＥＣの特異性は、さらに明確である。ＢＭＥＣでのそのような発現、およびそこからＢＢＢでの発現は、これまで記述されていない。
【０１１５】
さらに、第２に、ＢＭＥＣにおいてさらに小さな転写物をノーザンブロットで認識できる。これを特徴づけるため、５’と３’の非コード領域と共にコード領域を、ＢＭＥＣにおいて、ＲＴ−ＰＣＲとＲＡＣＥ−ＰＣＲをそれぞれ用いて調査した。ここで、Ｉｔｍ２Ａには二つの３’非コード領域が存在し、短い方が交互のポリアデニル化信号により形成されていることが、配列の解析により明らかとなった。このようなことは、Ｉｔｍ２Ａについて、今日まで記述されていなかった。おそらく、転写の頻度、およびそれによるタンパク質の量が、二つの異なる３’領域によって、異なる安定性により調節されている。説明した実験は、ブタのＩｔｍ２Ａについて完全なｃＤＮＡ配列（完全なＣＤＳ１１９〜９１０）を与える（配列番号４＋配列番号５）。
【０１１６】
虚血症状において標的となるＩｔｍ２Ａ／Ｓ１９の発現は、前述した一般的な実験装置に従い検査した。ここで、ＢＭＥＣで標的となるｓ１２９は、虚血における発現が顕著に減少していることが明らかとなった。これは、虚血症状に関する疾患、例えば、脳卒中、心筋梗塞、合併症（例、グリア芽腫）を伴う腫瘍に、Ｉｔｍ２Ａが関与していることを示している。決定した発現パターンは、一方で、これらの疾患の診断マーカーとして標的を利用することを可能にし、他方で、上記疾患を根本的に治療するため標的を治療的に利用することも可能にする。虚血においてＩｔｍ２Ａの発現パターンを、１００％までの対照と比較したものを図１のｂに示す。ＢＭＥＣは、方法の部分で説明したように、虚血症状（ischemia）において一度、通常の条件（control）で一度、培養した。続いて、双方の試料で標的の発現を１８ＳのｒＲＮＡと比較して測定した。得られた値は１００％までを対照として、そこから虚血試料を引用した。
【０１１７】
ＢＢＢにおけるＩｔｍ２Ａの可能性のある役割について参考になる点を得るため、培養したＢＭＥＣにおける発現パターンを、既知のＢＢＢマーカーとＧＡＰＤＨのそれぞれとの比較で調査した。結果を図２に示す。これらのデータは、既知のＢＢＢマーカーについて説明されていたように、Ｉｔｍ２Ａの前に発現が急速に低下することを示している。しかし、ＧＡＰＤＨのようなハウスキーピング遺伝子は、調節を全く示さない。
【０１１８】
データは、ＢＢＢにおけるＩｔｍ２Ａの機能を明確に示している。軟骨細胞とＴ細胞との分化において、タンパク質の役割を検討すると、Ｉｔｍ２Ａは、ＢＢＢにおける内皮細胞の特定の分化状態にも対応することが結論として得られる。Ｉｔｍ２Ａは主に原形質膜に位置しているため、細胞のある状態によっては、おそらく、同質または異質の多量体を形成することにより、ここで受容体として機能しているように思われる。そのような受容体の細胞外部分は、分泌された分子または他の細胞の表面分子に結合し、受容体複合体の細胞内部分は、そのようなモデル、例えば、結合効果による分子配座の変化により、信号を変換でき、そして、細胞の応答を標的とする信号カスケードにおける信号は、それらの性質を変化させる。
【０１１９】
Ｉｔｍ２Ａは、デリールスニジュデル他（１９９６年）により、マウスの顆のｃＤＮＡライブラリーのディファレンシャルスクリーンによって、最初に発見された。タンパク質のコードは２６３アミノ酸からなり、II型の膜内在性タンパク質を示す。潜在性のグリコシル化部位を、顕在的なロイシン・ジッパーと共に有する。６つのエクソンからなる遺伝子は、骨形成組織で最も強く発現し、軟骨／骨分化の標識を示す。Ｉｔｍ２Ａは、三つの構成要素からなる新たな遺伝子ファミリーの一員である。ヒトとマウスとの間では、ファミリーの個々の構成員は、それぞれ高度に遺伝子が保存されている。個々の構成員の間での遺伝子の保存は、約４０％程度の量である。ここで、主にＣ−末端が保存されているが、Ｎ−末端は保存されていない。ロイシン・ジッパーの刺激は、Ｉｔｍ２Ａについてのみ発見されている。他方、このファミリーのタンパク質は、既知の配列による刺激を含んでいない。
【０１２０】
［第２例：Ｓ２３１の同定］
正プローブを逆プローブと比較するディファレンシャルスクリーンにおいて、サブストラクションクローンＳ２３１は、５倍よりも高い強度のシグナルを示し、それにより配列から選択された。クローンＳ２３１の配列は、配列番号６に示す。ＢＬＡＳＴ相同性調査により、配列Ｓ２３１は、ＥＭＰ１に対して最も高い相同性を示した。
【０１２１】
最初に、Ｓ２３１についての発現パターンを、前述したように、プライマーＳ２３１．５（５’ＣＣＡ ＴＡＡ ＣＴＣ ＴＴＴ ＣＡＣ ＧＣＡ ＡＣＴ Ｇ３’＝配列番号７）およびＳ２３１．１Ｒ（５’ＡＣＡ ＡＣＡ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＴＧ ＧＣＴ ＧＴＴ Ｔ３’＝配列番号８）を用いて調製した。ＧＡＰＤＨは、対照として使用した（図３参照）。
【０１２２】
この半定量的表現パターンは、Ｓ２３１は、ＡＯＥＣ内でよりも、ＢＭＥＣ内での方が、より強く発現されていることを示し、それゆえ、ディファレンシャルハイブリダイゼーションの結果が確認される。その上、ＢＭＥＣでの発現は、皮質（脳）におけるものよりも明らかに強く、脳におけるＢＭＥＣの特異性についての手がかりになっている。心臓においてのみ強い発現が見られるが、肺、結腸または脳では弱いだけである。ただし、この組織について、強い発現が文献に記載されている（ラットでは脳のみ）。これは、Ｓ２３１が実際にブタからのＥＭＰ１を表現しているのか、それとも、この遺伝子ファミリーの他のメンバーなのかとの疑問を提示している。
【０１２３】
これを明確にするため、ＢＭＥＣのｃＤＮＡライブラリー（λＴｒｉｐｌＥｘ２）を、Ｓ２３１をプローブ（放射性活性物質で標識した標準的な方法）として用いてスクリーニングした。いくつかのクローンを単離し、そのうち最大の二つのクローンを、それぞれ、５’末端から部分的に配列を決定した。いずれの配列も再びＥＭＰ１との高い相同性を示した。ここで、それぞれの場合における重複は、３’側の非コード領域に位置していた。
【０１２４】
Ｓ２３１が本当にブタのＥＭＰ１に関するものであるのか研究するため、ＲＴ−ＰＣＲを、ＢＭＥＣについて、ヒトのＥＭＰ１のコード領域から得られたプライマーｈｓＥＭＰ１．ｓ１（５’ ＧＧＴ ＡＴＴ ＧＣＴ ＧＧＣ ＴＧＧ ＴＡＴ ＣＴＴ Ｔ３’＝配列番号９）およびｈｓＥＭＰ１．ａｓ１ （５’ ＡＴＧ ＴＡＧ ＧＡＡ ＴＡＧ ＣＣＧ ＴＧＧ ＴＧＡ Ｔ３’＝配列番号１０）を用いて実施した。得られた生成物（ｓｓＥＭＰ１）はクローン化し、配列を決定した。その配列から、プライマーｓｓＥＭＰ１．１（５’ ＧＧＴ ＣＴＴ ＴＧＴ ＧＴＴ ＣＣＡ ＧＣＴ ＣＴＴ Ｃ３’＝配列番号１１）が得られた。第２のプライマーｓｓＥＭＰ１．１Ｒ（５’ ＴＴＣ ＴＣＡ ＧＧＡ ＣＣＡ ＧＡＴ ＡＧＡ ＧＡＡ ＣＧ３’＝配列番号１２）は、ヒトのＥＭＰ１のコード配列と、ブタからのＥＳＴ・Ｆ２３１１６との絶対的な一致部分から得られた。これら二つのプライマーｓｓＥＭＰ１．１／ｓｓＥＭＰ１．１Ｒを用いて、前述したように発現パターンを調製した（図４参照）。
【０１２５】
クローンＳ２３１およびＳＳＥＭＰ１からのプライマーに関する発現パターンは、実際に類似しているが、決して同一ではない。それゆえ、Ｓ２３１は、ｐｍｐ−２２／ｅｍｐ／ｍｐ２０遺伝子ファミリーの他のメンバーを示していることが仮定できる。
双方の発現パターンは、ノーザンブロット解析により解明された。ここで、クローンＳ２３１（図５のＡ）とＰＣＲ生成物ｈｓＥＭＰ１．ｓ１／ｈｓＥＭＰ１．ａｓ１（ＥＭＰ１）（図５のＢ）は、それぞれプローブ（図５参照）として使用した。
ノーザンブロットにおいて、ＢＭＥＣの特異性はさらに明確になる。ＢＭＥＣにおける発現、その結果、ＢＢＢにおける発現は、いずれもこれまで報告されていない。
【０１２６】
ノーザンブロットにおいて注目すべきは、叢（ただし、ここでは約２〜３倍量のＲＮＡを適用）および結腸における強い発現である。一方、ＲＴ−ＰＣＲによる発現は、心臓において強い。さらに、ＢＭＥＣの二種類の転写物の比率は、使用するプローブに応じて、明確に異なる。Ｓ２３１を用いると、小さな転写物に対する大きな転写物の比率は、ほぼ同じである。ＥＭＰ１をプルーブとして用いると、小さな転写物の方が顕著に強いことを示す。
【０１２７】
文献におけるＥＭＰ１の発現データを比較すると、ブタのＳ２３１はヒトやマウスのＥＭＰ１とは異なる転写物のサイズを有しており、さらに、異なる種のＥＭＰ１に関して、文献データにより、発現パターンが部分的かつ強く異なることが明らかとなる。転写物の段階での不一致は、ここで説明するＳ２３１がＥＭＰ１を表すのではなく、Ｓ２３１に相当するこの遺伝子ファミリーの他のメンバーを表していることを示している。おそらく、ヒトにおいては一つの遺伝子ＥＭＰ１のみが存在し、これが二種類のプロモーターにより制御されている。しかし、ブタにおいて、この機能は二つの異なる遺伝子であるＥＭＰ１とＳ２３１とが引き継いでいる。
【０１２８】
ブタのＳ２３１の完全なコード領域を得るために、ＢＭＥＣのｃＤＮＡライブラリーを、ＥＭＰ１をクローンキャプチャー・プローブとして、ｐＴｒｉｐｌＥｘ２でスクリーニングする。ここで、幾つかの完全なコード領域を含む正のクローンを単離した。これらは配列を決定し、そこから、タンパク質配列を導いた（配列番号１３および配列番号１４）。
ブタのＳ２３１とヒトのＥＭＰ１との同一性は、アミノ酸配列のレベルで７８％程度でしかなく、マウスに対しては７６％である。この結果も、Ｓ２３１はＥＭＰを表さないとの論理を支持する。すなわち、通常のタンパク質は、ヒトとブタとの間で８５〜９５％の同一性を有しているからである（図７参照）。
【０１２９】
ＢＢＢにおけるＳ２３１の積極的な役割について、手がかりを得るため、培養したＢＭＥＣにおける発現パターンを、第１例（図８参照）で説明したように、既知のＢＢＢマーカーとＧＡＰＤＨとのそれぞれと比較しながら研究した。これらのデータは、既知のＢＢＢマーカーで説明されているように、Ｓ２３１の発現の急速な減少を示す。しかし、ＧＡＰＤＨのようなハウスキーピング遺伝子は、制御を示さない。
【０１３０】
Ｓ２３１について既に説明した方法で実施したウェスタンブロット解析の結果、ＲＮＡレベルで得られた結果を確認した。ＢＭＥＣでは、ＡＯＥＣとは異なり、強いタンパク質の発現が認められる。その上、ウェスタンブロットの結果は、Ｓ２３１は、主に膜分画に存在することを示している。培養したＢＭＥＣにおいて発現は低下するが、低分子量のタンパク質はより多くの量が検出できる。これは、おそらく、Ｓ２３１の二つの異なるホモおよびヘテロダイマーが原因となっている。ウェスタンブロットは図６に示す。
データは、明らかにＢＢＢにおけるＳ２３１の機能を示している。他の細胞型の分化におけるタンパク質について既に述べたような役割を検討すれば、Ｓ２３１はＢＢＢの内皮細胞の特異的な分化状態に対応し、おそらく細胞付着分子またはチャネル（最も強く保存される膜領域）を示している。
【０１３１】
［第３例：Ｓ０１２の同定］
正プローブを逆プローブと比較するディファレンシャルスクリーンにおいて、サブストラクションクローンＳ０１２は、５倍よりも高い強度のシグナルを示し、それにより配列から選択された。クローンＳ０１２の配列は、配列番号１５に示す。配列に基づき、Ｓ０１２は、ヒトの仮定的なタンパク質であるＦＬＪ１３４４８と明らかに一致した。
【０１３２】
最初に、Ｓ０１２について、プライマーＳ０１２．ｓ１（５’ＧＴＡ ＴＣＧ ＧＧＡ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＡＴ ＴＡＣ Ａ３’＝配列番号１６）およびＳ０１２．ａｓ１（５’ＣＣＣ ＧＡＧ ＧＴＡ ＴＡＴ ＴＴＧ ＴＴＴ ＣＴＧ Ｇ３’＝配列番号１７）を既に述べたように用いて、発現パターンを調製した。ＧＡＰＤＨは、対照として使用した（発現パターンは示さず）。
【０１３３】
この半定量的な発現パターンは、Ｓ０１２はＢＭＥＣ中で、ＡＯＥＣ中よりも、より強く発現することを示し、その結果、ディファレンシャルハイブリダイゼーションの結果が確認できる。その上、ＢＭＥＣにおける発現は、皮質（脳）におけるものよりも明らかに強く、これが脳におけるＢＭＥＣの特異性についての手がかりになっている。心臓においてのみ強い発現が見られる。ブタのＳ０１２／ＦＬＪ１３４４８のｃＤＮＡ全長は、５’と３’のＲＡＣＥ−ＰＣＲを重ねることにより得られ、タンパク質配列と共に、配列番号１８および配列番号１９に示す。
【０１３４】
発現パターンは、ノーザンブロット解析により確認した。全長クローンＦＬＪ１３４４８／Ｓ０１２（配列番号：１８）は、このためのプローブとして用いた（図９参照）。
ノーザンブロットにおいて、ＢＭＥＣの特異性は、より明確になる。ＢＭＥＣおよびそれによるＢＢＢでの発現については、これまで報告されていない。
Ｓ０１２は、ヒトの仮定的タンパク質ＦＬＪ１３４４８と同じであり、対応するマウスのもの（ＸＭ １２９７２４）と相同である。ヒト、ネズミおよびブタのＦＬＪ１３４４８／Ｓ０１２の相同性の比較を図１０に示す。シグナルペプチドとして機能するペプチドおよび開裂するペプチドは、それぞれの場合、イタリックで印刷されている。
【０１３５】
Ｎ末端の６０アミノ酸の低い保存性と、Ｃ末端の高い相同性のそれぞれは、驚異的である。おそらく、Ｎ末端は、細胞内のタンパク質の正確な位置に対応するシグナルペプチドを示している。生命情報科学の研究結果は、細胞内のタンパク質のミトコンドリアにおける位置を示している。タンパク質の機能は、強く保存されているＣ末端に依存している。
ＢＢＢにおけるＦＬＪ１３４４８／Ｓ０１２の積極的な役割について手がかりを得るため、第１例（図１１参照）で説明したように、培養したＢＭＥＣにおいて、既知のＢＢＢマーカーとＧＡＰＤＨとの比較により、発現パターンを研究した。
これらのデータは、明らかにＢＢＢにおけるＦＬＪ１３４４８／Ｓ０１２の役割を示す。培養したＢＭＥＣにおける発現の強い低下は、細胞の分化状態に伴うＦＬＪ１３４４８／Ｓ０１２の調節を示している。
【０１３６】
［第４例：ＮＳＥ２の同定］
試料材料を［２次元ディファレンシャルゲル電気泳動によるＢＢＢ−特異的タンパク質の同定］の項で説明したように調製した。
【０１３７】
ディファレンシャルスポット１．１．０．１．１０．３７に、ＭＡＬＤＩ・ＴＯＦ分析を行った結果、以下のペプチド分子量が得られた：８６１．４９９；８７８．４７；９７５．５０；１０５６．６１；１１３２．５３；１１９８．７１；１２１６．７１；１２２７．５３；１３４７．６９；１４３０．７６；１４３８．６９；１５１６．７１；１６２３．７９；１７９０．８７；１７９６．８１；１９３５．９３；１９５４．０５；２０８１．０２；２２３１．０７；２３７５．０８；２５７７．０９；２６１３．１。
【０１３８】
スポット１．１．０．１．１０．３７は、ＮＣＢＩデータベースにおける詳細なデータベース分析により、ＮＳＥ３であることが同定された。ヒトのＮＳＥ２は、計算上の分子量が３４．５ｋＤａで、ｐＩ値が５．４であり、いずれも２次元ゲルにおいてスポット１．１．０．１．１０．３７が観察された位置と良く一致している。下線を付したペプチド分子量は、ヒトの配列と同じであると思われるものに割り当てている。図１２は、ペプチド分子量が、ヒトのタンパク質の配列をカバーする部分を表している。
【０１３９】
最初に、ＮＳＥ２について、プライマーｓｓＮＳＥ２．ｓ１（５’ＣＧＣ ＧＴＧ ＧＴＧ ＡＡＴ ＧＡＴ ＣＴＧ ＴＡ３’＝配列番号２０）およびｓｓＮＳＥ２．ａｓ１（５’ＣＴＣ ＣＡＴ ＧＡＴ ＣＡＧ ＧＴＣ ＣＴＣ ＣＡＧ３’＝配列番号２１）を既に述べたように用いて、発現パターンを調製した。ＧＡＰＤＨは、対照として使用した。
この半定量的な発現パターンは、ＮＳＥ２の発現は心臓で最も高く、ＢＭＥＣおよび皮質（示さず）がこれに次ぐことを示している。この結果は、ノーザンブロット分析（図１３参照）により確認された。ハイブリダイゼーションでは、３’ＲＡＣＥ−ＰＣＲで得られたブタのＮＳＥ２の部分的ｃＤＮＡ配列（配列番号２２および配列番号２３）を使用した（ＣＤＳ１〜１９２は部分的にＣ末端部分をコードする）。
【０１４０】
ＢＢＢにおけるＮＳＥ２の積極的な役割について手がかりを得るため、第１例で説明したように、培養したＢＭＥＣにおいて、既知のＢＢＢマーカーとＧＡＰＤＨとの比較から、発現パターンを研究した。結果は、図１４に示す。これらのデータは、ＮＳＥ２の発現の急速な減少を示し、それゆえ、ＢＢＢにおけるＮＳＥ２の機能を示す。
図１５は、ヒトのＮＳＥ２とＮＳＥ１との相同性の比較を示す。
【０１４１】
ホスホリラーゼ活性部位は、通常のフォントで示している。下線部は、チロシンキナーゼ部位と見なされる（プロサイト・パターン・マッチＰＳ００１０９）。ここで、活性残基は、太字で示している。図１６は、ＮＳＥ２におけるＰＥＳＴ部位の分配を示す。ＰＥＳＴ配列は、タンパク質中のＰｒｏ、Ｇｌｕ、ＳｅｒおよびＴｈｒが豊富な領域であって、これらのタンパク質のユビキチン制御における細胞内の短い半減期に対応する。ＲＥＳＴ領域（明るい灰色）における幾つかのＳｅｒまたはＴｈｒ残基によるホスホリラーゼ活性は、ユビキチン・プロテアソーム経路による処理認識において重要である。
【０１４２】
ヒトＮＳＥ２の８１〜１６３位は、ＮＬＰ／Ｐ６０ファミリー（ｐｆａｍ領域００８７７．４）と相同性を示す。ＮＬＰ／Ｐ６０ファミリーは、幾つかのリポタンパク質で発見されているが、機能は明らかではない。
さらに、この目的物は、虚血の諸症状についても研究した。ここで、虚血において、ＢＭＥＣにおけるＮＳＥ２の発現として、ＮＳＥ２が減少することが明らかになった（図１７参照）。このことは、虚血状態に伴う症状、例えば、卒中、心筋梗塞および腫瘍に伴う症状、例えば、グリア芽細胞に、ＮＳＥ２が関与していることを示す。その上、ＮＳＥ２の発現を制御することで、原因についての根本的な治療も可能になる。
【０１４３】
［第５例：ＤＲＧ−１の同定］
試料材料を［２次元ディファレンシャルゲル電気泳動によるＢＢＢ−特異的タンパク質の同定］の項で説明したように調製した。
【０１４４】
ディファレンシャルスポット１．１．０．１．１１．１２に、ＭＡＬＤＩ・ＴＯＦ分析を行った結果、以下のペプチド分子量が得られた：７８９．４５；８８０．４７；８９０．５０；９４８．４９；１２０４．６８；１２１７．６４；１２８９．５８；１４２８．７０；１５１７．７９；１５７３．７３；１７５３．９１；２０１７．０８。
【０１４５】
スポット１．１．０．１．１１．１２は、ＮＣＢＩデータベースにおける詳細なデータベース分析により、取得番号ＣＡＢ６６６１９に相当する仮説的なタンパク質であることが同定された。同じタンパク質は、データベースの他の記載では、ドーパミン応答性タンパク質ＤＲＧ−１、ＬＹＳＴ相互作用タンパク質ＬＩＰ５およびＨＳＰＣ２２８として記録されている。仮定的タンパク質ＣＡＢ６６６１９／ＤＲＧ−１は、計算上の分子量が３３．８ｋＤａで、ｐＩ値が６．１であり、いずれも２次元ゲルにおいてスポット１．１．０．１．１１．１２が観察された位置と良く一致している。下線を付したペプチド分子量は、ヒトの配列と同じであると思われるものに割り当てている。図１６は、ペプチド分子量が、ヒトのタンパク質の配列をカバーする部分を表している。
【０１４６】
ヒト（ＣＡＢ６６６１９）とマウス（ＸＰ−１２５５０８）との相同性の比較から、非常に高い相同性が、特にａａ１〜１８０領域において認められる。生命情報科学の研究結果は、膜内外の領域を示し、Ｎ末端部分が細胞内に位置していることを示している。細胞内領域は保存性が高いホスホリラーゼ部位を示し、ヒトの配列（図１９参照）では、グリコシル化部位が細胞外であることが予想される。
【０１４７】
最初に、既に説明したようにＣＡＢ６６６１９．ｓ１（５’ＣＧＡ ＧＡＣ ＣＣＴ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＡＣ３’＝配列番号２４）およびＣＡＢ６６６１９．ａｓ１（５’ＣＴＧ ＧＴＧ ＴＡＴ ＴＡＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＣＧＴ ＧＴＧ３’＝-配列番号２５）を用いて、ＤＲＧ−１の発現パターンを調製した。ＧＡＰＤＨは、対照として用いた。
半定量的な発現パターン（図２０、ノーザンブロット解析で確認した）は、ブタのＤＲＧ−１は、ＢＭＥＣでの発現が、ＡＯＥＣでの発現よりも弱いことを示している。これは、２次元ゲルでの結果と全くは反対である。一般に、ＤＲＧ−１は、実際に強度が異なって発現し、非常にユビキチン的である。それゆえ、２次元ゲルで起きた相違は、ＢＭＥＣにおけるＤＲＧ−１の特別な転写後の修飾によるはずである。このような相違は、例えば、予想されるホスホリラーゼ部位で起こり得る。細胞特異的なホスホリラーゼ活性は、そのようにして、タンパク質の活性を決定できる。
【０１４８】
ＢＢＢにおけるＤＲＧ−１の積極的な役割について手がかりを得るため、第１例（図２１参照）で説明したように、培養したＢＭＥＣにおける発現パターンを、既知のＢＢＢマーカーおよびＧＡＰＤＨとそれぞれ比較することにより研究した。これらのデータは、ＤＲＧ−１の発現の明確な減少を示し、それゆえ、ＢＢＢにおけるＤＲＧ−１の機能を示している。
配列番号２６および２７は、ブタのＤＲＧ−１の部分的ｃＤＮＡ配列を示している（ＣＤＳ１−５８５、中央の部分）
【０１４９】
［第６例：ＴＫＡ−１の同定］
試料材料を［２次元ディファレンシャルゲル電気泳動によるＢＢＢ−特異的タンパク質の同定］の項で説明したように調製した。
【０１５０】
ディファレンシャルスポット１．１．０．１．６．３０に、ＭＡＬＤＩ・ＴＯＦ分析を行った結果、以下のペプチド分子量が得られた：７７６．４４；８４７．４７；９００．５０；９１６．４６；９７６．５２；１０４８．５８；１０８５．６１；１１２７．６６；１１３７．５５；１１６７．６７；１１８０．６８；１２１２．６９；１２３４．６９；１２９１．６７；１３０１．６７；１３０３．６９；１３３８．７２；１３５０．７０；１３７０．６５；１４１９．７０；１４２３．７７；１４３４．７９；１４４０．７９；１４５６．７６；１４６６．７６；１４６７．７１；１４８３．７７；１５４７．７８；１５５８．８５；１６６５．９０；１７１４．９６；１７１６．９０；１７４０．８０；１７６２．９０；１８３８．９２；１８９７．９９；２０２５．１１；２０５４．０６；２２３４．１５；２２４３．２０；２２４４．１８。
【０１５１】
スポット１．１．０．１．６．３０は、ＮＣＢＩデータベースにおける詳細なデータベース分析により、ＴＫＡ−１であることが同定された。下線を付したペプチド分子量は、ヒトの配列と同じであると思われるものに割り当てている。図２２は、ペプチド分子量が、ヒトのタンパク質の配列をカバーする部分を表している。
データベースにおいて、ＴＫＡ−１の３種類の形態が見いだされ、以下に述べる計算上の分子量とｐＩ値を有している：ＣＡＡ９０５１１：４９．３ｋＤＡ／ｐＩ６．７；ＢＡＡ３３２１６：３７．４ｋＤＡ／ｐＩ７．９；ＡＡＢ５３０４２：、３６．２ｋＤＡ／ｐＩ８．２。 ２次元ゲルでの位置は、明らかに大きな形態を示している。ＢＡＡ３３２１６の形態は、ここで明確に実験的に見いだされた。すなわち、取得番号ＡＡＢ５３０４２のタンパク質では、ペプチドＤＧＳＡＷＫＱＤＰＦＱ（図２２における斜字）が失われている。ただし、ＭＡＬＤＩ分析では、トリプシン断片において部分的に（下線部が）認められた。
【０１５２】
ヒト、マウスおよびラットにおけるＴＫＡ−１配列の比較の結果、高い配列保存性が明らかとなる。ＴＫＡ−１は、タンパク質−タンパク質相互作用を調節する二つのＰＤＺ領域を有している。これらのＰＤＺ領域に、幾つかの活性ホスホリラーゼ活性部位が位置している。これにより他のタンパク質との相互作用を調節することができる。また、Ｎ−グリコシル化部位も保存されている。
【０１５３】
最初に、ＴＫＡ−１の発現パターンを、プライマーｓｓＳＬＣ９Ａ３Ｒ２．ｓ１（５’ＡＡＡ ＡＧＧ ＣＣＣ ＣＣＡ ＧＧＧ ＴＴＡ ＣＧ３’＝配列番号２８）およびｓｓＳＬＣ９Ａ３Ｒ２．ａｓ１（５’ＧＧＡ ＧＴＧ ＧＧＣ ＡＧＣ ＡＧＧ ＴＧＡ ＧＣ３’＝配列番号２９）を用いて調製した。ＧＡＰＤＨは、対照として用いた。
【０１５４】
配列パターンは、ノーザンブロット解析で確認した。ここで、二種類のプライマーｓｓＴＫＡ−１ｃｔｇ．ｓ１（５’ＴＴＡ ＡＣＣ ＴＧＣ ＡＣＡ ＧＣＧ ＡＣＡ ＡＧＴ３’＝配列番号３０）およびｓｓＴＫＡ−１ｃｔｇ．ａｓ１（５’ＴＴＧ ＣＴＧ ＡＡＧ ＡＴＣ ＴＣＡ ＣＧＣ ＴＴＣ３’＝配列番号３１）間の５５０ｂｐのＰＣＲ生成物ｓｓＴＫＡ−１．ｃｔｇを、プローブとして用いた。ＧＡＰＤＨは、対照として用いた。
【０１５５】
ノーザンブロット（図２３）は、ＴＫＡ−１がＢＭＥＣにおいて最も強く発現し、ＢＭＥＣにおいて３種類の異なる転写物を生じることを示している。発現型は、肺において比較的強い。ただし、ここで、小さな転写物は、完全に失われている。現在まで、ＴＫＡ−１とＢＢＢあるいは内皮細胞との関係について、説明している文献は存在していない。
【０１５６】
ＢＢＢにおけるＴＫＡ−１の積極的な役割について手がかりを得るため、実施例１（図２４参照）で説明したように、既知のＢＢＢマーカーおよびＧＡＰＤＨとそれぞれ比較することにより、培養したＢＭＥＣにおける発現パターンを研究した。これらのデータは、ＴＫＡ−１の明確な減少を示し、それゆえＢＢＢにおけるＴＫＡ−１の機能を指摘している。
【０１５７】
虚血における発現に関して、目的とするＴＫＡ−１について、既に述べたように研究した。ここで、虚血において、ＢＭＥＣの発現に関してこの目的物が強く減少することが示された。このことは、虚血状態に伴う症状、例えば、卒中、心筋梗塞および腫瘍に伴う症状、例えば、グリア芽細胞に、ＴＫＡ−１が関与していることを示す。ＴＫＡ−１の発現を研究することで、これらの疾患における診断上のマーカーを使用することが可能になる。目的とするＴＫＡ−１は、既に充分に説明した疾患に対する根本的な治療の出発点として適している。
【０１５８】
虚血において、ＢＭＥＣにおけるＴＫＡ−１の発現パターンを、対照と比較したものを図２５に示す。ＢＭＥＣは、一度虚血条件（ischemia）で培養し、さらに一度、方法の部分で説明したように通常の条件（control）で培養する。引き続き、双方の試料で目的物の発現を、１８ＳのｒＲＮＡとの相対的な関係で測定した。得られた値は、対照を１００％として、虚血試料ではそれを参照した。
【０１５９】
ＴＫＡ−１のウェスタンブロット解析の結果により、ＲＮＡレベルで得られた結果を確認した。ＢＭＥＣでは、タンパク質の強い発現が認められるが、ＡＯＥＣでは希である。その上、ウェスタンブロットでは、ＴＫＡが第１に膜を伴い、かつ核内に存在することを示している。培養したＢＭＥＣでは、発現が非常に急速に減少し、最初の世代を過ぎるともはや検出できなくなる。ＴＫＡ−１のウェスタンブロット解析を図２６に示す。
配列番号３２および配列番号３３は、ブタのＴＫＡ−１の部分的なｃＤＮＡ配列を示している（ＣＤＳ１〜７４１は、部分的にＣ末端部分をコードしている）。
【０１６０】
［第７例：Ｓ０６４／ＡＲＬ８の同定］
正プローブを逆プローブと比較するディファレンシャルスクリーンにおいて、サブストラクションクローンＳ０６４は、５倍よりも高い強度のシグナルを示し、それにより配列から選択された。クローンＳ０６４の配列は、配列番号３５に示す。この配列に基づくと、Ｓ０６４を既知の遺伝子と照合することができない。ＢＬＡＳＴ調査の結果から、ＤＫＦＺのｃＤＮＡクローンｐ４３４０１３１７に対して有意な相同性が認められる。ただし、ｐ４３４０１３１７は、明確なコード領域を含んでいない。
【０１６１】
対応するタンパク質を同定するため、ブタのＢＭＥＣからのｃＤＮＡライブラリーを、サブストラクション法のクローンＳ０６４でスクリーニングした。ここで、二つの独立したクローンが同定された。長い方のクローンＳ０６４．３の配列を配列番号３６に示す。ＢＬＡＳＴ調査の結果では、この配列も既知の遺伝子と照合することができない。
【０１６２】
ただし、クローンＳ０６４．３の配列は、ヒトゲノムの相同性比較により、領域１０ｐ１２に位置している可能性がある。この遺伝子座の同じ方向における次の遺伝子は、ＡＤＰ−リボシル化−８因子類似（ＡＲＬ８）である。Ｓ０６４がＡＲＬ８の新たな３’末端を示しているかどうかを確認するため、結合ＰＣＲを実施した。ここで、プライマーｈｓＡＲＬ８．ｓ１（５’ＴＡＡ ＴＧＣ ＡＧＧ ＧＡＡ ＡＡＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＴＣＴ３’、配列番号３７）およびＳ０６４．３Ｒ（５’ＡＡＣ ＣＡＡ ＧＡＧ ＡＣＡ ＴＧＴ ＴＧＧ ＣＡＣ Ｔ３’、配列番号３８）を、一段ＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＢＭＥＣのＲＮＡと共に用いた。生成物の特異性を調べるために、一段ＲＴ−ＰＣＲの生成物を１：１０００に希釈し、プライマーｈｓＡＲＬ８．ｓ２（５’ＡＴＡ ＧＣＡ ＴＴＧ ＡＣＡ ＧＧＧ ＡＡＣ ＧＡＣ Ｔ３’、配列番号３９）およびＳ０６４．ＧＳＰ２（５’ＣＴＧ ＣＴＡ ＧＡＴ ＴＣＡ ＡＧＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＧＣ３’、配列番号４０）と共に、入れ子式のＰＣＲで用いた。ここで得られた生成物は、クローン化し、配列を決定した。得られた配列により、サブストラクション法のクローンＳ０６４が、遺伝子ＡＲＬ８を表していることが明確に確認される。
【０１６３】
ＡＲＬ８を完全にコードするｃＤＮＡ配列は、一段ＲＴ−ＰＣＲを利用し、ＢＭＥＣのＲＮＡとプライマーＳ０６４ｃｄｓ．ｓ１（５’ＣＴＣ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＧＧ ＣＴＧ ＡＴＣ ＴＴＣ３’、配列番号４１）およびＳ０６４ｃｄｓ．ａｓ１（５’ＡＴＣ ＴＣＡ ＣＡＣ ＣＡＡ ＴＣＣ ＧＧＧ ＡＧＧ Ｔ３’、配列番号４２）を用いて得ることができた。ブタのＡＲＬ８のコード配列は配列番号４３に、それによりコードされるタンパク質を配列番号４４に示す。この高度な配列保存性は、このタンパク質の非常に有用な役割を指摘している。ＡＲＬ８（ブタ）のｃＤＮＡ配列は、ヒトおよびマウスの対応する配列のコード領域と比較して、それぞれ９５％および９２％の相同性を有している。
【０１６４】
Ｓ０６４について、説明したように、プライマーＳ０６４．ｓ１（５’ＡＡＧ ＣＣＴ ＧＡＡ ＧＣＴ ＴＧＡ ＴＧＧ ＡＴＡ Ａ３’、配列番号４５）およびＳ０６４．ａｓ１（５’ＣＡＡ ＴＴＡ ＣＡＧ ＣＴＴ ＴＧＣ ＴＣＣ ＴＧＴ Ｇ３’、配列番号４６）を用いて、発現パターンを調製した。１８ＳのｒＲＮＡは、対照として用いた。いずれのプライマーＳ０６４ｃｄｓ．ｓ１／ａｓ１も、ヒトとブタとの高い相同性（例えば、結合ＰＣＲの生成物）のため、ヒトの配列に由来させた。一般的なプライマー設計における次の手順として、完全なコード領域を二つのプライマーで挟むことを行った。その方法では、プライマーＳ０６４ｃｄｓ．ｓ１が７〜９位においてＡＴＧ開始コドンを含み、プライマーＳ０６４ｃｄｓ．ａｓ１の２２位が終止コドンの最初の塩基を示す。発現パターンを図２７に示す。
【０１６５】
発現パターンは、ＡＲＬ８のコー路領域からの別のプライマー対ＡＲＬ８ｃｄｓ．ｓ１（５’ＡＴＡ ＧＣＡ ＴＴＧ ＡＣＡ ＧＧＧ ＡＡＣ ＧＡＣ Ｔ３’、配列番号４７）およびＡＲＬ８ｃｄｓ．ａｓ１（５’ＧＡＡ ＣＴＧ ＡＧＧ ＧＴＧ ＡＧＧ ＴＡＴ ＴＴＧ Ｇ３’、配列番号４８）を用いて繰り返した。発現パターンを図２８に示す。
【０１６６】
さらに、発現パターンをノーザンブロット解析で確認した。ここで、クローンＳ０６４をプローブとして用いた。結果を図２９に示す。
これら三種類の実験は、ＢＢＢ、すなわち脳血管関門についてＡＲＬ８の非常に高い特異性を示す。ＢＭＥＣおよびＢＢＢにおけるそれぞれの発現は、これまで報告されていない。ここで示される高い特異性は、ＢＢＢにおけるＡＲＬ８の非常に重要な役割を示している。
【０１６７】
ＢＢＢにおけるＡＲＬ８の運動機能に対して手がかりを得るため、発現パターンを培養したＢＭＥＣにおいて調べ、既知のＢＢＢマーカーと比較した。結果を図３０に示す。
データは、培養したＢＭＥＣにおいてＡＲＬ８の発現の急速な減少を示し、それゆえ、ＢＢＢにおけるＡＲＬ８の活性作用を指摘している。
【０１６８】
ＡＲＬ８は、調節ＧＴＰ加水分解酵素のＲＡＳ超ファミリーに属している。これらは、細胞成長因子の転移、細胞骨格の構築、細胞膜輸送（エキソサイトーシスおよびエンドサイトーシス）のような複数の処理に含まれている。ＡＲＬ８は、最初に、セボールド他により２００３年に報告された。ただし、彼らは、大人の脳での発現を示すことができなかった。この例は、ＢＢＢにおけるＡＲＬ８の実際の発現を最初に示す。この結果は、ＡＲＬ８は、ＢＢＢの内皮細胞の特異的な分化状態に依存し、それにより、ＢＢＢの機能に寄与していることを示している。
【０１６９】
［第８例：５Ｇ９／ＰＮＯＶ１の同定］
正プローブを逆プローブと比較するディファレンシャルスクリーンにおいて、サブストラクションクローン５Ｇ９は、５倍よりも高い強度のシグナルを示し、それにより配列から選択された。クローン５Ｇ９の配列は、配列番号４９に示す。この配列に基づくと、５Ｇ９は、新規なタンパク質ＨＳＮＯＶ１（ＡＡＨ３９１９５）をコードするヒトの転写物（ＮＣＢＩデータベースの番号ＢＣ０３９１９５）に対応させることができた。ｍＲＮＡ分子について説明したこのデータベースの記述では、オープンリーディングフレームとその結果として生じる仮定的なタンパク質をアノタチオンと同定している。これは、実験データによるものではなく、コンピューター・ベースの予測である。得られるタンパク質は、既知のタンパク質と類似性を示すことなく、それゆえ、新規なタンパク質と呼ぶことができた。
【０１７０】
５Ｇ９の発現パターンを、既に述べたように、プライマー５Ｇ９．１（５’ＴＧＴ ＡＴＡ ＴＧＴ ＧＧＧ ＡＣＡ ＧＣＣ ＡＴＣ Ａ３’、配列番号５０）および５Ｇ９．１Ｒ（５’ＧＴＣ ＣＧＡ ＧＣＡ ＧＧＡ ＴＡＴ ＡＣＴ ＴＣＣ Ａ３’配列 番号５１）を用いて調製した。１８ＳのｒＲＮＡを参照として使用した。発現パターンの決定に用いるプライマー対は、一般的な原則に従い入手した。すなわち、プライマーの融点は５５〜７５℃であり、二つのプライマーの融点はほぼ同じ値であり、１８〜２６塩基対の長さであり、至適ＧＣ含率が４０〜６０％であり、ヘアピンループを避け、ホモおよびヘテロダイマーの形成を避け、生成物のサイズが１００〜３００ｂｐであるようにした。発現パターンを図３１に示す。
【０１７１】
発現パターンは、５Ｇ９が、主にＢＢＢ、結腸および腎臓で形成されることを示している。脳では、発現がＢＭＥＣに特異的であるように見える。ＢＭＥＣおよびＢＢＢにおけるそれぞれの発現は、これまでに報告されていない。
ブタの対応するタンパク質を同定するため、クローン５Ｇ９の配列から出発して、ブタの完全なｃＤＮＡであるＰＮＯＶ１を、５’および３’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ（配列番号５２）を用いて単離した。この４８０〜１４６６位の転写物は、配列番号５３のタンパク質をコードしている。ＨＳＮＯＶ１とＰＮＯＶ１との相同性の比較を図３２に示す。
【０１７２】
ＨＳＮＯＶ１とＰＮＯＶ１との相同性は、９４％である。ただし、ＰＮＯＶ１は、ＨＳＮＯＶ１と比較して、Ｎ末端が４７アミノ酸だけ短い。ＨＳＮＯＶＩにおけるこの部分の配列は、後に切断されるシグナル配列を意味している可能性がある。
タンパク質ＨＳＮＩＯＶ１は、他の既知のタンパク質と有意な相同性を全く示さない。生命情報科学の研究結果は、８つの細胞間領域の存在を示している（図３３参照）。
【０１７３】
さらに、いくつかの領域（例えば、インタープロ領域ｉｐｒ００２６５７）が発見され、輸送体としての機能が示された。
これらのデータは、ＰＮＯＶ１／ＨＳＮＯＶ１がＢＢＢにおける新規な輸送体であることを示しているようである。同様のことは、多くの物質に対する高い輸送活性を有している二つの組織、結腸および腎臓でも起きる。
【０１７４】
［第９例：５Ｅ７／ＴＳＣ−２２の同定］
正プローブを逆プローブと比較するディファレンシャルスクリーンにおいて、サブストラクションクローン５Ｅ７は、５倍よりも高い強度のシグナルを示し、それにより配列から選択された。クローン５Ｅ７の配列は、配列番号５４に示す。この配列に基づき、５Ｅ７は、形質転換成長因子ベータ刺激タンパク質ＴＳＣ２２であると明確に同定された。
【０１７５】
クローン５Ｅ７は、転写物ＴＳＣ−２２の３’末端を示す。ブタの完全なｃＤＮＡを得るため、５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲを実施した。このＰＣＲ生成物をクローン化し、配列を決定した。ブタのＴＳＣ−２２からの完全なｃＤＮＡ配列を、配列番号５５に示す。ここでコード領域は、２４３〜６７７位に位置している。これに対応するタンパク質を、配列番号５６に示す。ブタのタンパク質は、既に明らかとなったヒトのタンパク質ＴＳＣ−２２と１００％相同であって、これは、このタンパク質の特別な重要性を示している。
【０１７６】
５Ｅ７について、説明したノーザンブロット分析により、発現パターンを調製した。ここで、サブトラクション法のクローン５Ｅ７をプローブとして利用した（図３４参照）。
実験結果は、全脳と比較して、ＢＭＥＣにおいてＴＳＣ−２の強い発現を示した。これにより、血液脳関門における特異性が示された。ＢＭＥＣおよびＢＢＢのそれぞれにおける発現は、これまで報告されていない。
【０１７７】
ＢＢＢにおけるＴＳＣ−２２の積極的な役割について手がかりを得るため、培養したＢＭＥＣにおいて、既知のＢＢＢマーカーおよび１８ＳのｒＲＮＡとの比較により、発現パターンを調べた。定量的なＰＣＲのため、プライマー５Ｅ７．１（５’ＡＡＧ ＡＧＧ ＴＧＴ ＧＧＣ ＴＴＧ ＴＣＴ ＴＴＴ Ａ３’、配列番号５７）および５Ｅ７．１Ｒ（５’ＴＴＴ ＴＴＣ ＡＡＡ ＧＴＡ ＴＴＣ ＡＡＣ ＣＡＧ ＣＴＣ３’、配列番号５８）を用いた。結果を図３５に示す。
【０１７８】
データは、培養したＢＭＥＣにおけるＴＳＣ−２２の発現の急速な減少を示しており、それゆえ、ＢＢＢにおけるＴＳＣ−２２の役割を明確に示している。ＴＳＣ−２２に関して、培養したＢＭＥＣにおける発現の強い減少は、細胞の分化状態に関係している。
虚血状態のＢＭＥＣにおけるＴＳＣ−２２の発現は、同様に研究した。結果を図３６に示す。
【０１７９】
目的とするＴＳＣ−２２は、虚血状態のＢＭＥＣにおいて、その発現が強く縮小する。これは、虚血の症状を伴う疾患に、ＴＳＣ−２２が積極的に機能的な役割をすることを実現可能にする。これらの疾患には、卒中、心筋梗塞および腫瘍に伴う症状、例えば、グリア芽細胞が属する。ＴＳＣ−２２の発現の研究結果は、これにより、これらの疾患の診断上のマーカーとして利用することができる。この知識に基づき、ＢＢＢの機能不全に伴う疾患について、治療上の概念を展開することができる。
【０１８０】
ＴＳＣ−２２は、ロイシン・ジッパー（ケスター他、１９９９年）を伴う転写因子群に属している。特に、ＴＧＦ−ベータのシグナル転移に関し（カワマタ他、１９９８年）、それゆえ、細胞成長と細胞分化における役割を示す。
この結果は、ＴＳＣ−２２がＢＭＥＣの分化状態において共通の応答であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】ａはＩｔｍ２Ａのノーザンブロット解析であり、ｂは虚血状態のＢＭＥＣにおけるＩｔｍ２Ａの発現である。
【図２】培養したＢＭＥＣにおけるＩｔｍ２Ａの発現パターンである（Ｍ：１００ｂｐマーカー）。
【図３】Ｓ２３１の発現パターンである（Ｍ：１００ｂｐラダー）。
【図４】ｓｓＥＭＰ１の発現パターンである（Ｍ：１００ｂｐラダー）。
【図５】Ｓ２３１（Ａ）およびＥＭＰ１（Ｂ）を、それぞれプローブとしてハイブリダイズさせたノーザンブロット解析である。
【図６】Ｓ２３１のウェスタンブロット解析である。
【図７】ヒトとネズミのＥＭＰ１並びにブタのＳ２３１の相同性比較であり、膜領域はハイライトの薄い色で、Ｎ−グリコシル化部位は明るい灰色で示す。
【図８】培養細胞におけるＳ２３１の発現パターンである（Ｍ：１００ｂｐマーカー）。
【図９】ＦＬＪ１３４４８／Ｓ０１２の全長をプローブとしてハイブリダイズしたノーザンブロットである。
【図１０】ヒト、ネズミおよびブタのＦＬＪ１３４４８／Ｓ０１２の相同性比較であり、それぞれの場合、ペプチドはシグナルペプチドとして機能し、開裂する。その部分は、斜字で表されている。
【図１１】培養細胞におけるブタのＦＬＪ１３４４８／Ｓ０１２の発現パターンである（Ｍ：１００ｂｐマーカー）。
【図１２】ヒトのタンパク質のＮＳＥ２アミノ酸配列であり、マスフィンガープリント法で同定されたペプチドは、太字の下線を付けたフォントで示されている。
【図１３】配列番号２２をプローブとしてハイブリダイズしたＮＳＥ２のノーザンブロットである。
【図１４】培養細胞におけるＮＳＥ２の発現パターン（Ｍ：１００ｂｐマーカー）。
【図１５】ヒトのＮＳＥ２とＮＳＥ１との相同性の比較であり、ホスホリラーゼ活性部位は淡いフォントで示され、チロシンキナーゼ活性領域（プロサイト・パターン・マッチＰＳ００１０９）は下線が引かれ、そこで活性残基は太字で示されている。
【図１６】ＮＳＥ２のＰＥＳＴ領域の分配であり、ＰＥＳＴ配列はタンパク質中のＰｒｏ、Ｇｌｕ、ＳｅｒおよびＴｈｒが豊富な領域であり、それらは細胞中のそれらのタンパク質の短い半減期に対応し、それらはそれらのタンパク質のユビキチン化を制御し、ＰＥＳＴ領域（淡い色）におけるＳｅｒまたはＴｈｒ残基のホスホリル化は、ユビキチン・プロテアゾーム経路の認識と処理に重要である。
【図１７】虚血状態におけるＢＭＥＣ中のＮＳＥ２の発現である。
【図１８】ヒトのタンパク質ＤＲＧ−１（ＣＡＢ６６６１９）のアミノ酸配列であり、マスフィンガープリント法で同定されたペプチドは、太字の下線を付けたフォントで示している。
【図１９】ヒトおよびネズミのＤＲＧ−１の相同性比較は、９０％の同一性と９４％の相同性をそれぞれ示しており、ホスホリラーゼ活性部位、保存されていないグリコシル化活性部位および膜内外の領域は、淡いフォントで示され、Ｎ−末端は細胞内に位置している。
【図２０】ＤＲＧ−１の発現パターンである（Ｍ：１００ｂｐマーカー）。
【図２１】培養した細胞におけるＤＲＧ−１の発現パターンである（Ｍ：１００ｂｐマーカー）。
【図２２】ヒトのタンパク質ＴＫＡ−１のアミノ酸配列であり、マスフィンガープリント法で同定されたペプチドは、太字の下線を付けたフォントで示している。
【図２３】ｓｓＴＫＡ−１．ｃｔｇをプローブとしてハイブリダイズしたノーザンブロットである。
【図２４】培養した細胞におけるＴＫＡ−１の発現パターンである（Ｍ：１００ｂｐマーカー）。
【図２５】虚血状態のＢＭＥＣ中でのＴＫＡ−１の発現である。
【図２６】ＴＫＡ−１のウェスタンブロット解析である。
【図２７】Ｓ０６４の発現パターンである。
【図２８】ＡＲＬ８の発現パターンである。
【図２９】Ｓ０６４をプローブとしてハイブリダイズした、多組織のブロットである。
【図３０】培養したＢＭＥＣにおけるＳ０６４／ＡＲＬ８の発現である。
【図３１】５Ｇ９の発現パターンである。
【図３２】ＨＳＮＯＶ１とＰＮＯＶ１との相同性比較である。
【図３３】タンパク質ＨＳＮＯＶ１の配列において、膜内外領域の予測である。
【図３４】５Ｅ７をプローブとしてハイブリダイズした、多組織のブロットである。
【図３５】培養したＢＭＥＣにおけるＴＳＣ−２２の発現パターンである。
【図３６】虚血状態のＢＭＥＣにおけるＴＳＣ−２２の減少した発現率である。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳毛細血管の内皮細胞中のＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片の存在を同定する方法であって、
ａ）脳から単離した新鮮な脳毛細血管の内皮を、通常の方法で酵素消化により前精製処理し、
ｂ）工程ａ）で得られた消化物を、存在する赤血球とアポトーシス細胞を実質的に破壊し、脳毛細血管の内皮細胞の少なくとも７０％を生きている状態で維持する溶血性緩衝液で処理し、
ｃ）工程ｂ）で得られた生成物を、任意にさらに精製処理し、
ｄ）脳毛細血管の内皮細胞とサブトラクション法に用いる組織から、サブトラクション法のｃＤＮＡライブラリーを調製し、
ｅ）一もしくはそれ以上のディファレンシャル・ハイブリダイゼーションにより、ｃＤＮＡについてサブトラクション法を実施し、
ｆ）上記サブトラクション法のｃＤＮＡライブラリーからのクローンを、それら個々の発現型に関するディファレンシャル・ハイブリダイゼーションによって照合し、
ｇ）上記サブトラクション法のｃＤＮＡライブラリーからのＢＢＢ−特異的タンパク質についてｃＤＮＡ配列を完成し、
ｈ）調査したクローンの発現パターンを、新鮮な培養した脳毛細血管の内皮細胞間で比較し、それにより、ＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片の存在を同定する
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
工程ｂ）の溶血性緩衝液が、下記の組成からなることを特徴とする請求項１に従う方法：
Ｎａ＋：３０．０ｍＭ〜６０．０ｍＭ；
Ｋ＋：５．０ｍＭ〜７．５ｍＭ；
ＮＨ４＋：８０．０ｍＭ〜１００．０ｍＭ；
Ｃａ２＋：１．０ｍＭ〜２．０ｍＭ；
Ｍｇ２＋：６．０ｍＭ〜９．０ｍＭ；
Ｃｌ−：１２５．０ｍＭ〜１７５．０ｍＭ；
ＨＣＯ３−：４．５ｍＭ〜６．５ｍＭ；
Ｈ２ＰＯ４−：０．５ｍＭ〜２．５ｍＭ；
ＳＯ４２−：０．３ｍＭ〜０．６ｍＭ；
ＨＰＯ４２−：０．４ｍＭ〜０．７ｍＭ；および
グルコース：１．５ｍＭ〜３．０ｍＭ。
【請求項３】
溶血性緩衝液が、下記の組成からなることを特徴とする請求項２に従う方法：
ＮａＣｌ：３０ｍＭ〜５０ｍＭ；
ＫＣｌ：４．５ｍＭ〜５．５ｍＭ；
ＮＨ４Ｃｌ：８０ｍＭ〜１００ｍＭ；
ＣａＣｌ２：１．０ｍＭ〜２．０ｍＭ；
ＭｇＣｌ２：０．６ｍＭ〜０．８ｍＭ；
ＭｇＳＯ４：０．３ｍＭ〜０．６ｍＭ；
ＮａＨＣＯ３：４．５ｍＭ〜６．５ｍＭ；
ＮａＨ２ＰＯ４：０．２ｍＭ〜０．４５ｍＭ；
Ｎａ２ＨＰＯ４：０．４ｍＭ〜０．６５ｍＭ；
ＫＨ２ＰＯ４：０．１ｍＭ〜０．１５ｍＭ；および
グルコース：１．５ｍＭ〜３．０ｍＭ。
【請求項４】
工程ｄ）のサブトラクション法に用いる組織が、大動脈内皮細胞であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に従う方法。
【請求項５】
工程ｉ）における完全なｃＤＮＡ配列を、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングとＲＡＣＥ−ＰＣＲ法により調製することを特徴とする請求項１乃４のいずれか一項に従う方法。
【請求項６】
脳毛細血管の内皮細胞がヒトまたはブタ由来であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に従う方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか一項に従う方法により得られるＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片。
【請求項８】
配列番号５、配列番号１４、配列番号１９または配列番号５３から選ばれる配列を有することを特徴とする請求項７に従うタンパク質。
【請求項９】
脳毛細血管の内皮細胞中のＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片の存在を同定する方法であって、
ａ）脳から単離した新鮮な脳毛細血管の内皮細胞を、通常の方法で酵素消化により前精製処理し、
ｂ）工程ａ）で得られた消化物を、存在する赤血球とアポトーシス細胞を実質的に破壊し、脳毛細血管の内皮細胞の少なくとも７０％を生きている状態で維持する溶血性緩衝液で処理し、
ｃ）工程ｂ）で得られた生成物を、任意にさらに精製処理し、
ｄ）工程ｃ）で得られた生成物を、適当な緩衝液に溶解し、
ｅ）等電点電気泳動を実施し、
ｆ）等電点電気泳動からの試料を、分子量に従って二次元分離し、
ｇ）相違点を同定して、単離し、
ｈ）工程ｇ）の単離物について、質量スペクトル分析を実施し、
ｉ）特異性のデータベース分析により、その評価を構築する
ことを特徴とする方法。
【請求項１０】
工程ｂ）の溶血性緩衝液が、下記の組成からなることを特徴とする請求項９に従う方法：
Ｎａ＋：３０．０ｍＭ〜６０．０ｍＭ；
Ｋ＋：５．０ｍＭ〜７．５ｍＭ；
ＮＨ４＋：８０．０ｍＭ〜１００．０ｍＭ；
Ｃａ２＋：１．０ｍＭ〜２．０ｍＭ；
Ｍｇ２＋：６．０ｍＭ〜９．０ｍＭ；
Ｃｌ−：１２５．０ｍＭ〜１７５．０ｍＭ；
ＨＣＯ３−：４．５ｍＭ〜６．５ｍＭ；
Ｈ２ＰＯ４−：０．５ｍＭ〜２．５ｍＭ；
ＳＯ４２−：０．３ｍＭ〜０．６ｍＭ；
ＨＰＯ４２−：０．４ｍＭ〜０．７ｍＭ；および
グルコース：１．５ｍＭ〜３．０ｍＭ。
【請求項１１】
溶血性緩衝液が、下記の組成からなることを特徴とする請求項１０に従う方法：
ＮａＣｌ：３０ｍＭ〜５０ｍＭ；
ＫＣｌ：４．５ｍＭ〜５．５ｍＭ；
ＮＨ４Ｃｌ：８０ｍＭ〜１００ｍＭ；
ＣａＣｌ２：１．０ｍＭ〜２．０ｍＭ；
ＭｇＣｌ２：０．６ｍＭ〜０．８ｍＭ；
ＭｇＳＯ４：０．３ｍＭ〜０．６ｍＭ；
ＮａＨＣＯ３：４．５ｍＭ〜６．５ｍＭ；
ＮａＨ２ＰＯ４：０．２ｍＭ〜０．４５ｍＭ；
Ｎａ２ＨＰＯ４：０．４ｍＭ〜０．６５ｍＭ；
ＫＨ２ＰＯ４：０．１ｍＭ〜０．１５ｍＭ；および
グルコース：１．５ｍＭ〜３．０ｍＭ。
【請求項１２】
請求項９乃至１１のいずれか一項に従う方法により得られるＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片。
【請求項１３】
配列番号２３、配列番号２７、配列番号３３から選ばれる配列を有することを特徴とする請求項１２に従うタンパク質。
【請求項１４】
血液脳関門を通して物質を搬送するための医薬を調製するための、請求項７、８、１２、１３のいずれか一項に従うタンパク質の使用。
【請求項１５】
血液脳関門の機能不全に基づく疾患を診断または治療するための薬品または医薬を調製するための、請求項７、８、１２、１３のいずれか一項に従うタンパク質の使用。
【請求項１６】
請求項７、８、１２、１３のいずれか一項に従うタンパク質を含むことを特徴とする血液脳関門の機能不全に基づく疾患を診断するための薬品。
【請求項１７】
請求項７、８、１２、１３のいずれか一項に従うタンパク質を含むことを特徴とする血液脳関門の機能不全に基づく疾患治療剤。
【請求項１８】
虚血性の病状を伴う疾患の診断のための薬品を調製するための、配列番号４、配列番号６、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３５、配列番号３６、配列番号４３、配列番号４９、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５５から選択される一もしくはそれ以上のＤＮＡ配列の使用。
【請求項１９】
脳卒中、心筋梗塞または腫瘍を伴う病状の診断のための請求項１８に従う使用。
【請求項２０】
前記ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の発現を制御することにより、診断を実施することを特徴とする請求項１８または１９のいずれか一つに従う使用。
【請求項１】
脳毛細血管の内皮細胞中のＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片の存在を同定する方法であって、
ａ）脳から単離した新鮮な脳毛細血管の内皮を、通常の方法で酵素消化により前精製処理し、
ｂ）工程ａ）で得られた消化物を、存在する赤血球とアポトーシス細胞を実質的に破壊し、脳毛細血管の内皮細胞の少なくとも７０％を生きている状態で維持する溶血性緩衝液で処理し、
ｃ）工程ｂ）で得られた生成物を、任意にさらに精製処理し、
ｄ）脳毛細血管の内皮細胞とサブトラクション法に用いる組織から、サブトラクション法のｃＤＮＡライブラリーを調製し、
ｅ）一もしくはそれ以上のディファレンシャル・ハイブリダイゼーションにより、ｃＤＮＡについてサブトラクション法を実施し、
ｆ）上記サブトラクション法のｃＤＮＡライブラリーからのクローンを、それら個々の発現型に関するディファレンシャル・ハイブリダイゼーションによって照合し、
ｇ）上記サブトラクション法のｃＤＮＡライブラリーからのＢＢＢ−特異的タンパク質についてｃＤＮＡ配列を完成し、
ｈ）調査したクローンの発現パターンを、新鮮な培養した脳毛細血管の内皮細胞間で比較し、それにより、ＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片の存在を同定する
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
工程ｂ）の溶血性緩衝液が、下記の組成からなることを特徴とする請求項１に従う方法：
Ｎａ＋：３０．０ｍＭ〜６０．０ｍＭ；
Ｋ＋：５．０ｍＭ〜７．５ｍＭ；
ＮＨ４＋：８０．０ｍＭ〜１００．０ｍＭ；
Ｃａ２＋：１．０ｍＭ〜２．０ｍＭ；
Ｍｇ２＋：６．０ｍＭ〜９．０ｍＭ；
Ｃｌ−：１２５．０ｍＭ〜１７５．０ｍＭ；
ＨＣＯ３−：４．５ｍＭ〜６．５ｍＭ；
Ｈ２ＰＯ４−：０．５ｍＭ〜２．５ｍＭ；
ＳＯ４２−：０．３ｍＭ〜０．６ｍＭ；
ＨＰＯ４２−：０．４ｍＭ〜０．７ｍＭ；および
グルコース：１．５ｍＭ〜３．０ｍＭ。
【請求項３】
溶血性緩衝液が、下記の組成からなることを特徴とする請求項２に従う方法：
ＮａＣｌ：３０ｍＭ〜５０ｍＭ；
ＫＣｌ：４．５ｍＭ〜５．５ｍＭ；
ＮＨ４Ｃｌ：８０ｍＭ〜１００ｍＭ；
ＣａＣｌ２：１．０ｍＭ〜２．０ｍＭ；
ＭｇＣｌ２：０．６ｍＭ〜０．８ｍＭ；
ＭｇＳＯ４：０．３ｍＭ〜０．６ｍＭ；
ＮａＨＣＯ３：４．５ｍＭ〜６．５ｍＭ；
ＮａＨ２ＰＯ４：０．２ｍＭ〜０．４５ｍＭ；
Ｎａ２ＨＰＯ４：０．４ｍＭ〜０．６５ｍＭ；
ＫＨ２ＰＯ４：０．１ｍＭ〜０．１５ｍＭ；および
グルコース：１．５ｍＭ〜３．０ｍＭ。
【請求項４】
工程ｄ）のサブトラクション法に用いる組織が、大動脈内皮細胞であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に従う方法。
【請求項５】
工程ｉ）における完全なｃＤＮＡ配列を、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングとＲＡＣＥ−ＰＣＲ法により調製することを特徴とする請求項１乃４のいずれか一項に従う方法。
【請求項６】
脳毛細血管の内皮細胞がヒトまたはブタ由来であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に従う方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか一項に従う方法により得られるＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片。
【請求項８】
配列番号５、配列番号１４、配列番号１９または配列番号５３から選ばれる配列を有することを特徴とする請求項７に従うタンパク質。
【請求項９】
脳毛細血管の内皮細胞中のＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片の存在を同定する方法であって、
ａ）脳から単離した新鮮な脳毛細血管の内皮細胞を、通常の方法で酵素消化により前精製処理し、
ｂ）工程ａ）で得られた消化物を、存在する赤血球とアポトーシス細胞を実質的に破壊し、脳毛細血管の内皮細胞の少なくとも７０％を生きている状態で維持する溶血性緩衝液で処理し、
ｃ）工程ｂ）で得られた生成物を、任意にさらに精製処理し、
ｄ）工程ｃ）で得られた生成物を、適当な緩衝液に溶解し、
ｅ）等電点電気泳動を実施し、
ｆ）等電点電気泳動からの試料を、分子量に従って二次元分離し、
ｇ）相違点を同定して、単離し、
ｈ）工程ｇ）の単離物について、質量スペクトル分析を実施し、
ｉ）特異性のデータベース分析により、その評価を構築する
ことを特徴とする方法。
【請求項１０】
工程ｂ）の溶血性緩衝液が、下記の組成からなることを特徴とする請求項９に従う方法：
Ｎａ＋：３０．０ｍＭ〜６０．０ｍＭ；
Ｋ＋：５．０ｍＭ〜７．５ｍＭ；
ＮＨ４＋：８０．０ｍＭ〜１００．０ｍＭ；
Ｃａ２＋：１．０ｍＭ〜２．０ｍＭ；
Ｍｇ２＋：６．０ｍＭ〜９．０ｍＭ；
Ｃｌ−：１２５．０ｍＭ〜１７５．０ｍＭ；
ＨＣＯ３−：４．５ｍＭ〜６．５ｍＭ；
Ｈ２ＰＯ４−：０．５ｍＭ〜２．５ｍＭ；
ＳＯ４２−：０．３ｍＭ〜０．６ｍＭ；
ＨＰＯ４２−：０．４ｍＭ〜０．７ｍＭ；および
グルコース：１．５ｍＭ〜３．０ｍＭ。
【請求項１１】
溶血性緩衝液が、下記の組成からなることを特徴とする請求項１０に従う方法：
ＮａＣｌ：３０ｍＭ〜５０ｍＭ；
ＫＣｌ：４．５ｍＭ〜５．５ｍＭ；
ＮＨ４Ｃｌ：８０ｍＭ〜１００ｍＭ；
ＣａＣｌ２：１．０ｍＭ〜２．０ｍＭ；
ＭｇＣｌ２：０．６ｍＭ〜０．８ｍＭ；
ＭｇＳＯ４：０．３ｍＭ〜０．６ｍＭ；
ＮａＨＣＯ３：４．５ｍＭ〜６．５ｍＭ；
ＮａＨ２ＰＯ４：０．２ｍＭ〜０．４５ｍＭ；
Ｎａ２ＨＰＯ４：０．４ｍＭ〜０．６５ｍＭ；
ＫＨ２ＰＯ４：０．１ｍＭ〜０．１５ｍＭ；および
グルコース：１．５ｍＭ〜３．０ｍＭ。
【請求項１２】
請求項９乃至１１のいずれか一項に従う方法により得られるＢＢＢ−特異的タンパク質またはその断片。
【請求項１３】
配列番号２３、配列番号２７、配列番号３３から選ばれる配列を有することを特徴とする請求項１２に従うタンパク質。
【請求項１４】
血液脳関門を通して物質を搬送するための医薬を調製するための、請求項７、８、１２、１３のいずれか一項に従うタンパク質の使用。
【請求項１５】
血液脳関門の機能不全に基づく疾患を診断または治療するための薬品または医薬を調製するための、請求項７、８、１２、１３のいずれか一項に従うタンパク質の使用。
【請求項１６】
請求項７、８、１２、１３のいずれか一項に従うタンパク質を含むことを特徴とする血液脳関門の機能不全に基づく疾患を診断するための薬品。
【請求項１７】
請求項７、８、１２、１３のいずれか一項に従うタンパク質を含むことを特徴とする血液脳関門の機能不全に基づく疾患治療剤。
【請求項１８】
虚血性の病状を伴う疾患の診断のための薬品を調製するための、配列番号４、配列番号６、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３５、配列番号３６、配列番号４３、配列番号４９、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５５から選択される一もしくはそれ以上のＤＮＡ配列の使用。
【請求項１９】
脳卒中、心筋梗塞または腫瘍を伴う病状の診断のための請求項１８に従う使用。
【請求項２０】
前記ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の発現を制御することにより、診断を実施することを特徴とする請求項１８または１９のいずれか一つに従う使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【公表番号】特表２００６−５１７１８１（Ｐ２００６−５１７１８１Ａ）
【公表日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５３８８７６（Ｐ２００４−５３８８７６）
【出願日】平成１５年９月８日（２００３．９．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／００９９６８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２９６３１
【国際公開日】平成１６年４月８日（２００４．４．８）
【出願人】（５０５０９０４７０）フランクゲン・ビオテクノロギー・アーゲー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＦｒａｎｋＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年９月８日（２００３．９．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／００９９６８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２９６３１
【国際公開日】平成１６年４月８日（２００４．４．８）
【出願人】（５０５０９０４７０）フランクゲン・ビオテクノロギー・アーゲー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＦｒａｎｋＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
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