ＮｃＳＡＧ４のネオスポラ病の診断および予防のための使用ならびに発症機序の解析用マーカーとしての使用
本発明は、ネオスポラ病(Neosporosis)の予防のための診断およびワクチン接種を目的とした、遺伝子ＮｃＳＡＧ４、その遺伝子のＲＮＡメッセンジャー、そのヌクレオチド配列またはその断片のいずれかに基づいて設計されたオリゴヌクレオチド、ならびにそれによってコードされるタンパク質ＮｃＳＡＧ４またはその組換え型のいずれか、発現ベクターとそれを含む宿主細胞に関する。本発明はまた、発症機序または中間宿主における慢性感染症の確立に対するワクチンの有効性の解析のための、ネオスポラ原虫(Neospora caninum)ブラディゾイト期の特異的マーカーとしてのその使用にも関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の目的
本発明は、動物の健康の分野で確立され、この記述的報告の表題で表すように、寄生原虫、ネオスポラ原虫(Neospora caninum)によって起こる疾病の診断、発症機序の解析および予防に関する。本発明は、より詳細には、ネオスポラ原虫の遺伝子ＮｃＳＡＧ４に相当するポリヌクレオチド分子、そのＲＮＡメッセンジャーと、それによってコードされる抗原、ブラディゾイト期の特異的タンパク質であるＮｃＳＡＧ４およびオリゴヌクレオチド、組換えベクター、形質転換宿主細胞、ならびに組換えにより発現されるタンパク質、ワクチンを生み出すその有用性に加え、疾病の診断用試薬としてのその使用、疾病の発症機序の研究を可能にする分子技術の開発へのその適用に関する。
【０００２】
背景技術
ネオスポラ病（Neosporosis）
ネオスポラ原虫は、アピコンプレックス門(phylum Apicomplexa)に属する寄生原虫であり、このアピコンプレックス門にはネオスポラ原虫と密接な関係があるトキソプラズマ原虫(Toxoplasma gondii)などの他の重要な寄生性病原体が含まれる。ネオスポラ原虫は、広範囲にわたる哺乳動物種に感染し得るが(Buxton et al. 2002, Trends Parasitol. 18, 546-552)、１９８９年以降、畜牛における流産および新生児死亡の原因となる作用因子であるといわれている(Thilsted and Dubey. 1989. J. Vet. Diagn. Invest. 1, 205-209)。
【０００３】
ウシネオスポラ病（Bovine neosporosis）は、世界中に分布する寄生虫性疾患であり、それを調査したスペイン(Gonzalez et al. 1999. Vet. Rec. 144, 145-150; Pereira Bueno et al. 2003. Vet. Parasitol. 111, 143-152)をはじめとする様々な国では繁殖失敗の最も一般的な原因の１つであると考えられている(Trees et al. 1999. Int. J. Parasitol. 29, 1195-1200; Anderson et al. 2000, Anim. Reprod. Sci. 60-61, 417 431)。妊娠中の雌における最も重要な感染の臨床症状が流産であり、一般的には妊娠３ヶ月から９ヶ月の間、最も一般的には約５〜６ヶ月に起こる。生きて生まれる子ウシ（最大２週間遅れる可能性がある）は神経筋に問題を示す可能性があり、出産後４〜５日目に最初の臨床的症状が現れる。しかしながら、最も一般的には、慢性的に感染している場合でも健康な子ウシは生まれる(Dubey and Lindsay, 1999. Vet. Parasitol. 67, 1-59)。さらに、ネオスポラ病はイヌ、それらの固有宿主にも影響を与え、多発性筋炎、脳炎、麻痺を引き起こし、死をもたらし得る(Lindsay and Dubey, 1989. J. Parasitol. 75, 163-165; Buxton et al. 2002. Trends Parasitol. 18, 546-552)。
【０００４】
ネオスポラ原虫の生活環は、トキソプラズマ原虫と同様に３つの期を包含する。固有宿主によって排泄されたオーシストの摂取により中間宿主に感染する、スポロゾイト（sporozoites）。他方、感染の急性期に関与する急増虫体であり、宿主組織を通じて播種する役割を有する、タキゾイト（tachyzoites）。このプロセスは、宿主が免疫性を発現し、その後慢性期が確立されたときに終わり、寄生生物の増殖は緩慢となり、ブラディゾイト（bradyzoites）内部で組織内シストが形成される。これについては自然および実験感染している数種の神経組織(Dubey et al., 1988, J. Am. Vet. Med. Assoc. 193, 1259-1263; Dubey et al. 1990. J. Am. Vet. Med. Assoc. 197: 1043-1044; Barr et al. 1992. J. Vet Diagn. Invest. 4, 365-367; Kobayashi et al. 2001. J. Parasitol. 87: 434-436)および自然感染したイヌおよび雌ウシの骨格筋組織(Peters et al. 2001. Int. J. Parasitol. 31, 1144-1148)の両方で観察されている。これらのブラディゾイトは再活性化まで組織のシスト内に潜伏している(Antony and Williamson. 2001. New Zeal. Vet. J. 49, 42-47; Buxton et al. 2002. Trends Parasitol. 18, 546-552)。アピコンプレックス(Apicomplexa)群（トキソプラズマ原虫またはネオスポラ原虫など）の寄生生物におけるタキゾイトからブラディゾイトへの転換（またその逆の場合）の基礎となる機構は今日まで分かっていないが、免疫応答が慢性感染症を有する動物における感染の潜伏期および再活性化に影響を及ぼしている可能性があることは示唆されている(Lyons, et al., 2002, Trends Parasitol. 18, 198-201)。
【０００５】
疾病の感染に関しては、最新の研究によって出生後感染の重大性が比較的低いことが示唆され、先天性感染が一生持続することが言及されている(Davison et al. 1999. Int. J. Parasitol. 29, 1683-1689; Hietala and Thurmond. 1999. Int. J. Parasitol. 29. 1669-1676)。先天的伝播は、５０〜９５％にわたる割合で主要な役割を果たし(Wouda et al. 1998. Theriogenology 49, 1311-1316; Pereira-Bueno et al. 2000. in: Hemphill and Gottstein (Eds.) Int. J. Parasitol. 30, 906-909)疾病の播種および維持において極めて重要な役割を果たすものと思われる(Bjorkman et al. 1996. J. Am. Vet. Med. Assoc. 208, 1441-1444; Pare et al. 1996 Can. J. Vet. Res. 60, 133-139; Anderson et al. 1997. J. Am. Vet. Med. Assoc. 210, 5 1169-1172; Schares et al. 1998. Vet. Parasitol. 80, 87-98)。
【０００６】
ネオスポラ原虫抗原（N. caninum anitigens）
ネオスポラ原虫のタキゾイトとブラディゾイトの抗原組成の比較に関しては、１つの研究が行われたが、トキソプラズマ原虫で行った研究（この研究ではいくつかの特定の期の抗原が同定され、特徴付けられる）とは対照的に、タキゾイトまたは両方の期で共有される特異性抗原が同定された(Fuchs et al. 1998. J. Parasitol. 84, 753-758)にすぎず、今日まで、極めて限られた情報しか得られていない。ネオスポラ原虫抗原には２つの表面タンパク質、タキゾイト特有のＮｃＳＡＧ１（Howe et al.によってそれらの遺伝子がクローニングされた(1998. Infect. Immun, 66, 5322-5328)）(Hemphill et al. 1997, Parasitology, 115, 371-380)およびタキゾイトおよびブラディゾイトの両方で発現されるＮｃＳＲＳ２(Hemphill et al. 1996, Parasitol. Res. 82, 497-504)が含まれる。最近になって、ネオスポラ原虫の両表面タンパク質のサブユニットワクチンとしての検証がネズミモデルにおいて行われた(Cannas et al. 2003a. Parasitology 126 (Pt. 4), 303-312)。また、最近寄生生物の両方の期で発現される２つのミクロネームタンパク質、ＮｃＭＩＣ３(Sonda et al. 2000. Mol. Biochem. Parasitol 108, 39-51)およびＮｃＭＩＣ１(Keller et al. 2002. Infect. Immun. 70, 3187-3198)が同定された。さらに、ＮｃＭＩＣ１０およびＮｃＭＩＣ１１と呼ばれるネオスポラ(Neospora)の２つの配列が遺伝子バンクに登録された。これらの配列はトキソプラズマ原虫のタンパク質ＴｇＭＩＣ１０およびＴｇＭＩＣ１１それぞれをコードする配列と極めて類似しているため、それらの配列がミクロネームの２つのタンパク質をコードする可能性が考えられる。クローニングされた他の遺伝子がＮｃＧＲＡ６およびＮｃＧＲＡ７である。これらの遺伝子はネオスポラ原虫タキゾイトの稠密顆粒のタンパク質をコードする遺伝子であり、これらに基づき、疾病診断のためのＥＬＩＳＡが開発された(Lally et al. 1996. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 3, 275-279)。これらのタンパク質の他、ＮｃＮＴＰａｓｅ−Ｉ(Asai et al. 1998 Exp. Parasitol. 90, 277-285)およびＮｃＧＲＡ２(Ellis et al. 2000. Parasitology 120 (Pt 4), 383-390)と呼ばれる、それぞれ２９ｋＤａおよび６７ｋＤａの稠密顆粒由来の他のものが同定され、特徴付けられた。もう一方で、細胞内タキゾイトのミクロネームに存在するタンパク質ＮｃＭＩＣ３(Naguleswaran et al. 2001. Infect. Immun. 69, 6483-6494)の遺伝子をクローニングし、それをワクチン接種目的で使用する組換えタンパク質として発現させた(Cannas et al. 2003b. J. Parasitol. 89 (pt. 1) 44-50)。
【０００７】
最後に、ＮｃＳＵＢ１は唯一クローニングされたネオスポラ原虫の遺伝子であり、酵素を発現する遺伝子である。ＮｃＳＵＢ１はタキゾイトのミクロネームに存在する６５ｋＤａのセリンプロテアーゼ(Louie and Conrad. 1999. Mol. Biochem. Parasitol. 103, 211-223; Louie et al. 2002. J. Parasitol. 88, 1113-1119)であり、ＴｇＳＵＢ１と呼ばれるトキソプラズマ原虫タンパク質と高いアミノ酸同一性を示す。
【０００８】
ネオスポラブラディゾイトの特異性抗原に関しては、in vitroにおいてもin vivoにおいてもブラディゾイトのシストを得ることが難しいことからこれまでに同定されたものはない。しかしながら、トキソプラズマ原虫では、１８ｋＤａのタンパク質に対して向けられたモノクローナル抗体（Ｔ８３Ｂ１）によって認識される表面抗原（ＳＡＧ４／ｐ１８）をはじめとし、特異的ブラディゾイト抗原が記載されている(Tomavo et al. 1991. Infect. Immun. 59, 3750-3753)。トキソプラズマ原虫のこのタンパク質をコードする遺伝子ＴｇＳＡＧ４をOdberg-Ferragut et al.(1996, Mol. Biochem. Parasitol. 83, 237-244)によりクローニングし、特徴付けた。
【０００９】
トキソプラズマ原虫の抗原ＴｇＳＡＧ４はホスファチジルイノシトールグリカン（ＰＩ−Ｇ）によって結合される膜タンパク質である。トキソプラズマ原虫による慢性感染症に関連する緩増期のこの特異的抗原の検出は、最近になってCultrera et al.(2002, Mol. Cell. Probes 16, 31-39)により示されたように重要な診断価値がある。これらの著者は、トキソプラズマ原虫(T. gondi)感染検出のための、ＡＩＤＳ患者の脳脊髄液（トキソプラズマ原虫が致死性脳症を引き起こす可能性がある）における遺伝子ＴｇＳＡＧ４のｍＲＮＡの検出に基づくＲＴ−ＰＣＲを開発した。
【００１０】
ネオスポラ病の診断および予防
従って、疾病の垂直感染が、疾病を持続的に搾取作用により定着させる最大の方法と考えられ、またネオスポラ病が畜牛における流産および新生児死亡の主な原因の１つであるため、付随する経済的損失より、制御は、主として、飼育場内での感染の有病率を下げ、処分と補充のための選択的な手段を確立して感染動物数を減らすことを目的としなければならない。
【００１１】
畜牛における流産の病因診断は複雑で、困難である。病因診断がなされた場合には、９０％を上回るものでは感染性および寄生性因子が該当する（一般に、ネオスポラ原虫が主要な役割を果たす）。ネオスポラ原虫による感染の診断に関しては、検査室診断を実施して流産の病因を確認することが不可欠である（この診断では、血清学的診断技術が主要な役割を果たし、問題の重大性についての初期情報を与える）。成体では、特異的血清抗体の検出により検査室診断が行われる。この種の研究により飼育場内での感染の分布および頻度（群血清陽性率）ならびに感染した群内でのネオスポラ病による流産の危険性（群内血清陽性率）についての非常に有益な情報が提供されるため、これは感染の制御に効果的な手段を確立するのに非常に有用である(Thurmond and Hietala. 1995. Parasitol. 81, 364-367; Pare et al. 1996. Can. J. Vet. Res. 60, 10 133-139)。
【００１２】
従って、動物の健康状態を正確に確認するためには診断の改善が極めて重要である。これに関連して、現在用いられている血清学的技術を検証し、動物の年齢および用いる技術に基づくカットオフポイントの選択などのいくつかの論争中の問題を解明することを目的として数多くの研究が行われてきた(Alvarez-Garcia et al. 2003. Vet. Res. 34, 341-352)。
【００１３】
ネオスポラ原虫に対しては現在いくつかの診断技術が用いられている(Ferre et al. 2003. Res. Adv. Microbiol. 3, 157-167)が、最近の感染症と慢性感染症とを区別することが可能な診断技術はなく、特異的タキゾイトおよびブラディゾイト抗原それぞれを同定することにより、流産という点からより多くの飼育場の未来に関する情報を提供し、疾病の制御を改善する診断技術の開発が可能になる。これらの抗原を組換えタンパク質として発現させ、ネオスポラ病に対する血清学的診断にそれらを使用することにより、非常に有益な新規ツールが提供される。これに関連して、様々な種類の異種発現系で産生された数種類のネオスポラ原虫タンパク質に基づき、ＥＬＩＳＡなどの診断法が開発された(Lally et al. 1996. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 3, 275-279; Louis et al. 1997. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 4(6), 692-699)が、特異的ブラディゾイト抗原に基づいたものはこれまでなかった。さらに、期特異的抗原に対するモノクローナル抗体および単一特異性ポリクローナル血清の開発は、ネオスポラ原虫タキゾイトの６５ｋＤａのタンパク質に対して行われるような競合ＥＬＩＳＡの開発により診断の代替法となる(Baszler et al. 1996. J. Clin. Microbiol. 34(6), 1423-1428)。
【００１４】
他方、畜牛におけるネオスポラ病の薬理学的制御は現在実現不可能であり、ウシ疾病の薬物治療の経験はなく、利用可能なデータは信頼できるものではない。しかしながら、可能な治療の高コスト、起こり得る耐性の発現、食用肉または乳汁への残留物により、制御手段としての化学療法は制限される。従って、群管理のための手段には免疫学的予防を加えるべきである。
【００１５】
これに関連して、ネオスポラ原虫に対するワクチンの調製のために最近行われた調査に死菌ワクチンの評価があり、その結果はさまざまであり、ネズミモデルでは垂直感染からのある種の防御が見られた(Liddell et al., 1999, J. Parasitol. 85: 1072-1075)が、ウシモデルでは見られなかった(Andrianarivo et al. 1999, Int. J. Parasitol. 30: 985-990)。また、ネオスポラ原虫による致死性感染症からの防御免疫応答を刺激することを目的としたマウスにおけるワクチン接種試験では、弱毒分離株に基づく生ワクチンによる免疫処置も利用し(Atkinson et al. 1999. Parasitology 118: 363-370)、また温度感受性突然変異体も利用した(Lindsay et al. 1999. J. Parasitol. 85: 64-67)ところ、決定的でないが信頼できる結果が得られたが、持続感染を受けた動物が発生するという問題を伴った。他方で、サブユニットのワクチンは伝統的なワクチンに優る数多くの利点を示す(Jenkins, 2001. Vet. Parasitol. 101, 291-310)。これらの利点には、生存寄生生物と比較した、組換えタンパク質の安全性および相対的安定性、防御免疫応答を誘導する抗原のみ含むという柔軟性、ならびに大規模生産を確立する能力が含まれる。感染症、流産または感染症の垂直感染の予防のためのネオスポラ原虫抗原に基づくサブユニットワクチンの開発によりその制御のための新しいツールが提供される。差し当たっては、その件についてほとんど研究が行われなかった。タキゾイト特有の抗原または両方の期で共有される抗原（例えば、発現され、原核生物系から精製された、ネズミモデルにおいて脳のネオスポラ病に対する感染防御免疫を誘導するＮｃＭＩＣ３(Cannas et al. 2003. J. Parasitol. 89(1), 44-50)、ならびにタキゾイトの２つの表面タンパク質であるＮｃＳＡＧ１およびＮｃＳＲＳ２をはじめとする組換えタンパク質）を使用し、それらを同じモデルに接種し、組換え抗原およびＤＮＡワクチンとして組み合わせて(Cannas et al. 2003. Parasi
tology 126, 303-312)、良好な結果を得ている。最近になって、ネズミモデルにおいてＮｃＧＲＡ７タンパク質またはＮｃｓＨＳＰ３３タンパク質を発現するプラスミドがＤＮＡワクチンとして使用され、感染の先天的伝播からの部分的防御が得られている(Liddell et al. 2003. J. Parasitol. 89(3), 496-500)。しかしながら、ネオスポラ原虫において記載された最初のものは、この報告の本発明の説明において示されるように、遺伝子ＮｃＳＡＧ４によって生み出されるものであるために、これまでこれらのワクチンの開発はブラディゾイト期の特異的抗原に基づいたものではなかった。
【００１６】
背景において記載したように、各期において特異的に発現される遺伝子を単離することが、この疾病および慢性感染症の確立を決定する分子機構、ならびに感染の再活性化の研究に非常に適しており、疾病の理解および制御が向上する。これに関連して、ネオスポラ原虫におけるＮｃＳＡＧ４遺伝子（トキソプラズマ原虫ブラディゾイト期の特異的タンパク質をコードするＴｇＳＡＧ４遺伝子に相同）を単離し、それをクローニングし、期特異的抗原ＮｃＳＡＧ４の組換えタンパク質として発現させることにより、これに関して本発明の説明において記載されるように、ネオスポラ病の診断に、および疾病の発症機序の解析に非常に有益な解決策が提供され、それをワクチンとして使用することがその制御の代替法となる。
【発明の具体的説明】
【００１７】
遺伝子ＮｃＳＡＧ４のネオスポラ病の診断および予防のための使用ならびに発症機序の解析用マーカーとしての使用
本発明の目的は、ネオスポラ原虫に対する診断およびワクチン接種目的において有用な試薬を提供することである。さらに、本発明は、ネオスポラ病の発症機序の解析を目的とする、主として感染の慢性期の確立研究を目的とする、その再活性化に関するマーカーを提供する。よって、ネオスポラ原虫の遺伝子ＮｃＳＡＧ４（この寄生生物において記載されたブラディゾイト期の最初の特異的遺伝子である）の同定、単離および特性化を可能にした分子テクノロジーを記載している。これに関し、遺伝子ＮｃＳＡＧ４のいくつかのＤＮＡ断片を、トキソプラズマ原虫のタンパク質ＴｇＳＡＧ４のアミノ酸の配列に基づいて設計された４つの変性オリゴヌクレオチド（それらのオリゴヌクレオチドの１つ（配列番号１）がOdberg-Ferragut et al.により記載されている(1996, Mol. Biochem. Parasitol. 82, 237-244)）の組合せを用いてＰＣＲにより増幅する。設計されたそれ以外の３つのオリゴヌクレオチドはＳＡＧ４−２、ＳＡＧ４−３およびＳＡＧ４−４と呼ばれ、配列表において、それぞれ、配列番号２、配列番号３および配列番号４として確認される。得られた配列から別の４つのオリゴヌクレオチドを設計してゲノムウォーキング技術により遺伝子の配列を完成させる。よって、オリゴヌクレオチド１Ｒ５ＳＡＧ４（配列番号５）および２Ｒ５ＳＡＧ４（配列番号６）を使用して５’センスの遺伝子を完成させた。オリゴヌクレオチド１Ｆ３ＳＡＧ４（配列番号７）および２Ｆ３ＳＡＧ４（配列番号８）を使用して３’センスの遺伝子を完成させた。
【００１８】
本発明は、クローニングと制限酵素によるその後の消化のために特別に設計されたオリゴヌクレオチドを用いた、ＰＣＲ増幅によるＮｃＳＡＧ４遺伝子のクローニング法を記載する。このクローニングは、それぞれ、原核生物および真核生物系発現用の２種類のプラスミド、ｐＲＳＥＴおよびｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（いずれもInvitrogen社製）において行う。タンパク質のアミノ末端のシグナルペプチドの領域を排除した成熟タンパク質ＮｃＳＡＧ４の配列およびそのカルボキシ末端の可能性あるシグナルペプチドの領域を排除した成熟タンパク質ＮｃＳＡＧ４の配列に相当するアミノ酸２９〜１４８（両方とも含まれる）をコードするＮｃＳＡＧ４遺伝子の一部をプラスミドｐＲＳＥＴに挿入する。これに関し、遺伝子ＮｃＳＡＧ４の相当する領域を、ネオスポラ原虫のゲノムＤＮＡから、Ｆ８５ＮｃＳＡＧ４（配列番号１３）およびＲｅ４４４ＮｃＳＡＧ４（配列番号１４）と呼ばれる、そのために設計されたオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによって増幅する。この系では、組換えタンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４をファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下で融合タンパク質として発現させる（組換えタンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４のアミノ末端にはアフィニティークロマトグラフィーによる精製を可能にするヒスチジンタグを付ける）。組換えタンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４の生産には、培養培地へのＩＰＴＧ添加によりファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼによる誘導で発現し、組換えタンパク質の発現を可能にする大腸菌(E. coli)由来のrosetta(DE3)pLysS細胞株（Novagen）を使用する。ネオスポラ病の血清学的診断にこの組換えタンパク質を使用することによって、これらのポリペプチドの抗原性に基づく、ＥＬＩＳＡ、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）または他の任意の方法による、本発明の開発において示すように、記載されているウエスタンブロット技術による、感染の異なる期（急性期および慢性期）の鑑別診断に非常に有益な新規ツールが提供される。よって、ネオスポラ原虫による先天性感染を受けた胎児および子ウシ由来の血清において、タンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４に対する抗体（１５％アクリルアミド−ＤＡＴＤゲル中、変性条件下で電気泳動により分離される）が検出される。このことから、ネオスポラ原虫による急性および慢性感染症の鑑別診断の観点からも、さらにワクチンとしてのそれを使用した予防の観点からもこのタンパク質の価値が示される。
【００１９】
組換えタンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４に対するモノクローナル抗体およびポリクローナル単一特異性血清の開発と同様に、そのタンパク質は、それらに基づく競合ＥＬＩＳＡの開発により診断の代替法となる。さらに、本明細書において記載するポリペプチドに対するこれらのモノクローナル抗体または特異的ポリクローナル血清が、前記血清による寄生生物の検出に基づく、免疫組織化学、免疫蛍光測定法または他の任意の方法により動物組織におけるネオスポラ原虫による慢性感染症の診断に使用される。
【００２０】
本発明の一つの目的は、ネオスポラ病、垂直感染および慢性感染症の確立に対するワクチンを提供することである。原核生物における異種遺伝子の発現系は、組換え抗原の大規模生産という利点を提供し、その組換え抗原がサブユニットのワクチンとして使用される。これらのワクチンにはもう１つの利点、すなわち、それらが標識ワクチンとして使用されるという利点があり、それらが生み出す免疫応答は感染した動物において寄生生物によって生じるものとの区別が容易であり、疾病根絶計画において極めて重要である。さらに、これらのワクチンは安全であり、組換えベクター（例えば、ウイルスベクター）に基づくワクチンに優る利点を提供する。しかしながら、後者のワクチンは低用量での免疫感作を可能にする複製という利点を提供する。
【００２１】
それでもなお、サブユニットワクチンとして使用されるこのような種類の組換えタンパク質により、免疫応答、主として体液性免疫応答を誘導する。従って、免疫応答を細胞に基づく応答にも向けるために、この応答に向けられたアジュバントも使用する。もう一方で、細胞に基づく応答を導き、適切なタンパク質フォールディング（protein folding）を確実にするために、ＤＮＡワクチンを使用する。
【００２２】
本発明は、ＮｃＳＡＧ４タンパク質に基づくＤＮＡワクチン（上述の原核生物系で生産される組換えタンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４と組み合わせて、または組み合わせずに使用される）について記載する。これに関し、遺伝子ＮｃＳＡＧ４の完全コード化領域を、その目的で設計されたＦＮｃＳＡＧ４（配列番号１１）およびＲｅＮｃＳＡＧ４（配列番号１２）と呼ばれるオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによって増幅し、それを哺乳動物細胞用発現ベクター、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ内、制限部位Ｂａｍ ＨＩおよびＥｃｏ ＲＩに挿入し、ｐＣＤＡ１０と呼ばれる組換えプラスミドを得、このプラスミドをＤＮＡワクチンとして使用する。
【００２３】
もう一方で、本発明は、慢性感染症に関連するネオスポラ原虫ブラディゾイト期のマーカーとしての遺伝子ＮｃＳＡＧ４の使用について記載する。この遺伝子は、感染動物の組織または体液由来の寄生生物の核酸に基づく、ＤＮＡプローブを用いたＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ、in situ ハイブリダイゼーションまたは他の任意の検出法による、ネオスポラ原虫による慢性感染症の診断に本明細書において記載するヌクレオチド分子を使用することによってマーカーとして使用される。
【００２４】
１Ｆ３ＳＡＧ４（配列番号７）および１Ｒ５ＳＡＧ４（配列番号５）と呼ばれる遺伝子の単離のために設計されたオリゴヌクレオチドに基づく、ＲＴ−ＰＣＲによる、寄生生物における遺伝子ＮｃＳＡＧ４の発現の検出法を詳述する。このＲＴ−ＰＣＲは、中間宿主におけるネオスポラ原虫の期転換マーカーとしてのＮｃＳＡＧ４遺伝子の使用を可能にし、持続感染を受けた動物において慢性感染症の確立を決定する機構および感染の再活性化に関与する機構、ならびにこれらの条件に影響を及ぼす因子の解析に、そして慢性感染症の確立および再活性化からの防御の観点からネオスポラ原虫に対するワクチン製品の有効性を確立するために必要なツールである。さらに、上記プロモーターを用いて作製した遺伝子構築物によってトランスフェクトしたネオスポラ原虫細胞において異種遺伝子を発現させるために遺伝子ＮｃＳＡＧ４のプロモーターを使用することによって、細胞培養物または実験動物において、in vitroおよびin vivo発現系でのタキゾイト期からブラディゾイト期への転換（またその逆の場合）を決定する分子機構の解析が可能になる。
【００２５】
図面の説明
説明を補足し、本発明の特徴をより理解するために、一連の図面を例示的かつ非限定的なものとして後述の記述的報告に添付する。
【実施例】
【００２６】
本発明の方法
次の実施例によりさらに本発明を例示するが、実施例はその範囲を限定するものではなく、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ定義される。
【００２７】
実施例１：遺伝子ＮｃＳＡＧ４の単離と特徴づけ
ネオスポラ原虫の遺伝子ＮｃＳＡＧ４を単離するため、既知ＤＮＡ領域にフランキングしているが未知配列のＤＮＡ断片のＰＣＲによる増幅を可能にするゲノムウォーキングと呼ばれる方法を使用した。
【００２８】
既知配列を増幅するために、４つの変性オリゴヌクレオチドを使用して、記載されているものをトキソプラズマ原虫の遺伝子ＴｇＳＡＧ４をクローニングするように改善した(Odberg-Ferragut et al., Mol. Biochem. Parasitol. 82 (1996) 237-244)。使用したフォワードオリゴヌクレオチドの１つがこれらの著者が記載しているオリゴ１ａ（配列番号１）であり、それ以外の３つのものは、以下の株：ＲＨ（ＡＦ３４０２２４．１）、ＰＬＫ（Ｚ６９３７３．１）、Prugniaud（ＡＦ３４０２２５．１）およびＣＥＰ（ＡＦ３４０２２６．１）のデータベースに存在するトキソプラズマ原虫の遺伝子ＴｇＳＡＧ４によってコードされるアミノ酸配列に基づいて設計した。従って、１つのフォワードオリゴヌクレオチドを設計し、それをＳＡＧ４−２（配列番号２）と呼称し、２つのリバースオリゴヌクレオチドをＳＡＧ−３（配列番号３）およびＳＡＧ４−４（配列番号４）と呼称した。
【００２９】
ＰＣＲを行うために、ネオスポラ原虫タキゾイトから単離したゲノムＤＮＡ０．４μｇを使用した。ゲノムＤＮＡを単離するために、市販のキットを使用説明書に従って使用した（GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation kit, Amersham Biosciences）。使用した陽性対照はその方法により単離されたトキソプラズマ原虫のゲノムＤＮＡであった。使用したＤＮＡポリメラーゼは、Ｃｌ２Ｍｇ（４ｍＭ）、ｄＮＴＰｓ（２００μＭ）および各変性オリゴヌクレオチド４０ｐｍｏｌの存在下、相当するバッファー中、１反応あたり２．５Ｕの酵素ＥｃｏＴａｑ（Ecogen）であった。ＰＣＲ条件は、変性９４℃にて５分、続いて９４℃にて１分、アニーリング１分（この際、温度勾配４３℃〜５６℃をかけた）（図１，レーン４〜９）、７２℃にて１分を４０サイクル、サイクルごとに伸長を１秒延長、最後に伸長７２℃にて１０分とした。使用した陰性対照はＤＮＡを含まない反応の混合物（図１，レーン１）または非感染ＭＡＲＣ−１４５細胞由来のゲノムＤＮＡ（図１，レーン２および３）であった。
【００３０】
ＰＣＲを受けて、融解温度５６℃を使用した際にいくつかの断片が増幅され、それらを１×ＴＢＥの２％アガロースゲルでの電気泳動によりネオスポラ原虫（図１，レーン９）およびトキソプラズマ原虫（図１，レーン１２）のゲノムＤＮＡから分離した（図１）。これらの断片の２つのものが１７５ｐｂのオリゴヌクレオチド１ａとＳＡＧ４−３の組合せ（Ｎｃ１７５）および３１２ｐｂの１ａとＳＡＧ４−４の組合せ（Ｎｃ３１２）の予測サイズに一致している。市販のキット（GenomeGENECLEAN（商標）Turbo nucleic acid purification kit, Q-BIOgene）を製造業者の指示に従って使用して、１×ＴＢＥバッファーの２％アガロースゲルからこれらのＤＮＡ断片を精製し、オリゴヌクレオチド１ａについて配列決定した(Sequencing Service of the Institute of Biomedical Research “Alberto Sols", CSIC-UAM)。得られたヌクレオチド配列を、データベースに存在する、６４ｐｂの断片においてトキソプラズマ原虫の３つの株の遺伝子ＴｇＳＡＧ４の配列と類似性８２％を有するものと比較した(BLASTN-nr, www.ncbi.nlm.nih.gob/blast)。さらに、配列Ｎｃ１７５を異なるオープンリーディングフレームに翻訳し、それをトキソプラズマ原虫のデータベース(TgGI: TIGR Toxoplasma gondii gene index, www.tigr.org/tdb/tgi/tggi)と比較した際に、表面タンパク質として記載されている配列群（ＴＣ２７５４）と類似性６８％であることが分かった。これは上述の株（ＲＨ、ＰＫＬ、PrugniaudおよびＣＥＰ）の遺伝子ＴｇＳＡＧ４の配列によってコードされるタンパク質と一致し、株ＭＥ４９のブラディゾイトの遺伝子ライブラリーにある、記載されているＥＳＴ(Toxoplasma gondii v3, Parasite Consensus EST Data bases)とも一致している。最後に、配列Ｎｃ１７５をネオスポラ原虫のデータベース(NcGI: TIGR Nespora caninum gene index, www.tigr.org/tdb/tgi)と比較したところ、これまでに記載されている配列との類似性はなかった。
【００３１】
一度配列Ｎｃ１７５が単離されると、ネオスポラ原虫のゲノムＤＮＡから、市販のキット（Universal Genome Walker（商標）kit, BD Biosciences Clontech）を使用して、配列Ｎｃ１７５の５’および３’センスにおいてゲノムウォーキング法を用いることにより遺伝子ＮｃＳＡＧ４が同定された。この方法を行うための第１段階が、製造業者の教示に従っての、平滑末端を生じる４つの異なる制限酵素：ＥｃｏＲＢ（１）、Ｄｒａｌ（２）、ＰｖｕII（３）およびＳｔｕＩ（４）でのゲノムＤＮＡの消化（図２，段階１）とその後のアダプターとの結合（図２，段階２）である。次いで、このようにして得た各遺伝子ライブラリーに関しては、アダプター（ＡＰ１およびＡＰ２）と結合しているオリゴヌクレオチドと既知ゲノム配列に基づいて設計された遺伝子の特異的オリゴヌクレオチドを使用してダブルＰＣＲを行う（図２，段階３）。５’センスにおいてゲノムウォーキングを行うために配列Ｎｃ１７５から設計されたオリゴヌクレオチドを１Ｒ５ＳＡＧ４（配列番号５）および２Ｒ５ＳＡＧ４（配列番号６）と呼称し、３’センスにおいてゲノムウォーキングを行うために設計されたオリゴヌクレオチドを１Ｆ３ＳＡＧ３（配列番号７）および２Ｆ３ＳＡＧ４（配列番号８）と呼称した。各ゲノムＤＮＡ遺伝子ライブラリーに対して、長距離熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Advantage（商標） Genomic PCR kit, BD Biosciences Clontech）を製造業者の教示に従って使用して、５’または３’センスそれぞれにおいてゲノムウォーキングを行うためのオリゴヌクレオチドＡＰ１および１Ｒ５ＳＡＧ４または１Ｆ３ＳＡＧ４を用いて、第１のＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９４℃にて２５秒および６８℃にて３分を７サイクル、続いて９４℃にて２５秒および６４℃にて３分を３２サイクル、さらに最終伸長６４℃にて７分間とした。第２のＰＣＲは、第１ＰＣＲの産物の１：５０希釈物から行い、オリゴヌクレオチドＡＰ２と５’または３’センスそれぞれにおいてゲノムウォーキングを行うための２Ｒ５ＳＡＧ４または２Ｆ３ＳＡＧ４を用いて行った。第２のＰＣＲの条件は、９４℃にて２５秒および６８℃にて６分を５サイクル、続いて９４℃にて２５秒および６４℃にて６分を２０サイクル、さらに最終伸長６４℃にて１０分間とした。ゲノムウォーキングによって得たＤＮＡ断片は上記のように精製し、配列決定した（図２，段階４）。
【００３２】
従って、異なる増幅断片の配列を比較することによって、６０１個のヌクレオチドからなる配列（配列番号９）を構築することができた。この配列は、ブラディゾイト期の特異的タンパク質をコードするトキソプラズマ原虫の遺伝子ＴｇＳＡＧ４の配列とのその相同性にちなんでＮｃＳＡＧ４と呼ばれた。さらに、５２２ｐｂのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の存在が確認され、そのＯＲＦはトキソプラズマ原虫におけるその相同配列と類似したサイズを有し、１７３個のアミノ酸からなるタンパク質をコードするもの（配列番号１０）であった。このＯＲＦをコードするアミノ酸の配列をデータベースに存在する配列(BLASTx, www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)と比較したところ、異なるトキソプラズマ原虫株のタンパク質ＴｇＳＡＧ４のものとの類似性が６９％であることが分かった。
【００３３】
実施例２：抗原ＮｃＳＡＧ４の組換えタンパク質としての発現
一度遺伝子ＮｃＳＡＧ４が同定されたら、異種系において、コード領域領域を発現ベクターに挿入して、抗原ＮｃＳＡＧ４を組換えタンパク質として作製した。真核生物系では発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（商標）−Ｃ（Invitrogen）を選択し（図３，パネルＡ）、原核生物系では発現プラスミドｐＲＳＥＴ−Ｃ（Invitrogen）を選択した（図３，パネルＢ）。プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（商標）−Ｃでは、遺伝子ＮｃＳＡＧ４の完全コード化領域を部位ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩに挿入した。これに関し、ネオスポラ原虫のゲノムＤＮＡから、そのために設計されたオリゴヌクレオチド（OligoANALYZER 1.0.2.）を用いてＰＣＲを行った。フォワードオリゴヌクレオチド（その５’末端にＢａｍＨＩの特異的認識部位、続いてＮｃｏＩ部位、その後遺伝子ＮｃＳＡＧ４のＯＲＦの５’末端と同一の配列を含む）をＦＮｃＳＡＧ４（配列番号１１）と呼称した。リバースオリゴヌクレオチド（その５’末端にＥｃｏＲＩの特異的認識部位、続いて遺伝子ＮｃＳＡＧ４のＯＲＦの３’末端に相補的な逆配列を含む）をＲｅＮｃＳＡＧ４（配列番号１２）と呼称した。
【００３４】
原核生物における発現では、末端切断型タンパク質、アミノ酸２９〜１４８（両方とも含まれる）をコードする遺伝子ＮｃＳＡＧ４の一部をプラスミドｐＲＳＥＴ−Ｃの部位ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩに挿入した。これに関して、２つのオリゴヌクレオチドをソフトウェア（OligoANALYZER 1.0.2.）を使用して設計した。フォワードオリゴヌクレオチド（その５’末端にＢａｍＨＩの特異的認識部位、続いて遺伝子ＮｃＳＡＧ４のＯＲＦ、ヌクレオチド８３〜１００と同一の配列を含む）をＦ８５ＮｃＳＡＧ４（配列番号１３）と呼称した。リバースヌクレオチド（その５’末端にＥｃｏＲＩの特異的認識部位、続いて終止コドン（ＴＡＡ）、その後遺伝子ＮｃＳＡＧ４のＯＲＦ、ヌクレオチド３２８〜４４４の相補的逆配列を挿入している）をＲｅ４４４ＮｃＳＡＧ４（配列番号１４）と呼称した。
【００３５】
いずれの場合においてもＰＣＲを行うために、ネオスポラ原虫タキゾイトから単離したゲノムＤＮＡ０．１μｇを反応に使用した。使用したＤＮＡポリメラーゼは、２．５ｍＭのＣｌ２Ｍｇ、ｄＮＴＰｓ（２００μＭ）および各オリゴヌクレオチド４０ｐｍｏｌの存在下、相当するバッファー中最終量２５ｕｌ、１反応あたり１．２５ＵのＥｃｏＳｔａｒｔ（Ecogen）であった。ＰＣＲ条件は、変性９５℃にて７分、続いて９５℃にて３０秒、５３℃にて１分、７２℃にて４分を４０サイクル、サイクルごとに伸長を１秒延長、最後に伸長７２℃にて１０分（１回）とした。ＰＣＲ産物を１×ＴＡＥバッファーの１．５％アガロースゲルに流し、臭化エチジウム（ＢｒＥｔ）で染色し、遺伝子ＮｃＳＡＧ４のＯＲＦについて予測されるサイズに相当する５４２ｐｂ、そして末端切断遺伝子については３８５ｐｂのサイズを観察した。次いで、これらのＤＮＡ断片を精製し、好適なバッファー（バッファーＢ, Roche）中、最終量５０μＬの制限酵素ＢａｍＨＩ（５Ｕ）およびＥｃｏＲＩ（６Ｕ）により水浴中３７℃にて４時間消化した。同時に、同じ条件下で、各プラスミドベクターを消化した。これらのプラスミドは、３７℃での同じ消化反応においてエビアルカリ性ホスファターゼ（ＳＡＰ）酵素２Ｕによる３０分間の消化終了時に処理した。その後、ＳＡＰ酵素をＥＤＴＡ １０ｍＭの存在下で６５℃にて２０分間不活性化した。一度消化が完了したら、プラスミドＤＮＡとＰＣＲ産物の両方を１×ＴＡＥバッファーの１．５％の低融点アガロースゲルに流し、ＢｒＥｔで染色した後、それを精製した。
【００３６】
プラスミドの操作では、Sambrook et al.(1989)によって記載された方法に基本的には従った。一度、消化された各ＤＮＡ断片を精製したら、それを好適なバッファー中、最終量１５μＬの１Ｕの酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ存在下、ベクター−挿入物１：３比で、５０ｎｇの対応するベクター（遺伝子ＮｃＳＡＧ４の完全ＯＲＦの場合にはｐＣＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（ｃ）−Ｃ（Invitrogen）および末端切断遺伝子の場合にはプラスミドｐＲＳＥＴ−Ｃ）と連結した。連結はサーモサイクラーで０．５ｍｌ試験管中（Multi（商標）， Sorenson Bioscience）１２℃にて１８時間を行い、その後、使用するまで−２０℃にて保存した。
【００３７】
一度連結を行えば、それを用いてエレクトロポレーションにより大腸菌ＤＨ５α株の冷凍コンピテント細胞を形質転換した。エレクトロポレーションによる細菌の形質転換では、エレクトロポレーターの製造業者（GenePulser（商標）, Bio-rad）の教示に基本的には従った。予め氷冷しておいた２ｍｍのエレクトロポレーショントレー（Equibio）を使用した。コンピテント菌は５μＬの連結物を添加するまで冷凍しないで氷中に保った。氷中で１分後、それらに２５μＦＤおよび２００Ｏｈｍにて、４〜５秒間、２．５ｋＶのパルスをかけた。形質転換された菌を直ちに５００μＬのＳＯＣ培地（ＭｇＳＯ４ １０ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １０ｍＭおよびグルコース２０ｍＭをＳＯＢ培地に添加したもの、ＳＯＢ培地：バクトトリプトン２％、酵母抽出物０．５％、ＮａＣｌ １０ｍＭおよびＫＣｌ ２．５ｍＭ）に再懸濁し、３７℃にて１時間増殖させ、その後２００μＬの細胞懸濁液を１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（使用したプラスミドが耐性を有する抗生物質）の存在下でＬＢ−寒天培地（１．５％ノーブル寒天(noble gar)）に播種した。好適な培地で３７℃にて１８時間プラークを増殖させた後、プラスミドにより形質転換された菌を選択した。その後のプラスミドＤＮＡの単離のために、各々１０クローンを選択し、１００μｇ／のアンピシリンを含有する液体ＬＢ培地３ｍＬ中で３７℃にて一晩増殖させた。このＤＮＡをアルカリ溶菌法により得、予測サイズのプラスミドに関するクローンを選択するために、続いてそれを１×ＴＡＥバッファーの０．８％アガロースゲルに流した。遺伝子ＮｃＳＡＧ４の完全ＯＲＦをプラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ／（ｃ）−Ｃに挿入することによって構築された、予測サイズ６，０２８ｐｂのプラスミドに関連したプラスミドをｐＣＤＡ（クローンのとおり１〜１０の番号が付けられている）と呼称した。末端切断型遺伝子ＮｃＳＡＧ４、ヌクレオチド８３〜４４４をｐＲＳＥＴ−Ｃ（３，２３５ｐｂ）に挿入することによって得られたプラスミドをｐＲＣ（クローンのとおり１〜１０）と呼称した。制限酵素による特徴づけのため、観察されたサイズに基づき、各々から４クローンを選択した（図４）。従って、得られたプラスミドを好適なバッファー（バッファーＢ，Ｒｏｃｈｅ）中、最終量２０μＬの制限酵素ＢａｍＨＩ（５Ｕ）およびＥｃｏＲＩ（６Ｕ）により水浴中３７℃にて２時間消化した。消化されたプラスミドＤＮＡを０．５％ＴＢＥバッファーの０．８％アガロースゲルで分離したところ、各構築プラスミドにおいて適切なサイズの断片の放出が観察された。その結果、プラスミドｐＣＤＡ５、ｐＣＤＡ６、ｐＣＤＡ９およびｐＣＤＡ１０は５２８ｐｂの断片を放出し（図４，パネルＡ，それぞれレーン１〜４）、プラスミドｐＲＣ６、ｐＲＣ７、ｐＲＣ９およびｐＲＣ１０は３７１ｐｂの断片を放出した（図４，パネルＢ，それぞれレーン３〜６）。さらに、ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（ｃ）−Ｃ（図４，パネルＡ，レーン５および６）およびＰＲＳＥＴ−Ｃ（図４，パネルＢ，レーン１）を切断し、消化の対照として使用した。また、非消化プラスミドｐＲＳＥＴ−Ｃ（図４，パネルＢ，レーン２）もアガロースゲルに流した。市販のオリゴヌクレオチドＴ７を用いてプラスミドｐＣＤＡ１０およびｐＲＣ１０を配列決定し、断片が発現ベクターに適切に挿入されているかを確認した。
【００３８】
組換えタンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４（配列番号１５）は、遺伝子ＮｃＳＡＧ４のＯＲＦによってコードされ、本明細書において記載されている、アミノ末端のシグナルペプチドとカルボキシ末端の可能性あるシグナルペプチドのない成熟タンパク質ＮｃＳＡＧ４のアミノ酸配列に相当するアミノ酸２９〜１４８を包含し、Gerber et al.(1992. JBC 267. 12168-12173)によって見直された判定基準に従って、アミノ末端に、アフィニティークロマトグラフィーによる精製を可能にする６個のヒスチジン、ペプチドＴ７−タグおよびエンテロキナーゼ認識領域をはじめとするアミノ酸のタグが付けられる。図３、パネルＣでは、組換えタンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４のチャートを示す。
【００３９】
組換えタンパク質を原核生物系において発現させるために、大腸菌のRosetta(DE3)pLysS細胞株（Novagen）をプラスミドｐＲＣ１０で製造業者の指示に従って形質転換した。プラスミドｐＲＣ１０で形質転換された細胞をアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）およびクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ−寒天培地に播種し、３７℃にて一晩増殖させた。その翌日、プラークから６コロニーを選択し、同じ選択液体培地３ｍｌ中で３７℃にて一晩増殖させた。その翌日、培養物を同じ増殖培地で１：１０希釈し、Ａ６００が０．９ＯＤに達するまで同じ条件下に保った。その後、組換えタンパク質の発現を１ｍＭ ＩＰＴＧの存在下、２５０ｒｐｍおよび３７℃にて攪拌しながら４時間誘導した。最後に、細胞を３，５００×ｇにて１５分間の遠心分離により集めた。一度上清を除去したら、使用するまで沈殿物を−８０℃にて保存した。
【００４０】
組換えタンパク質の発現について特徴づけするため、前もって集めておいた細胞沈殿物を、Ｔｒｉｓ ２０ｍＭ ｐＨ７．９８中１×のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Novagen）と呼ばれる市販の溶菌液、濃度５ｍＬ／細胞沈殿物１ｇで溶解した。それらを、酵素ベンゾナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ， ｌＵ／ｍＬの１ｘＢｕｇｂｕｓｔｅｒ)の存在下、ゆっくりと攪拌しながらおよび室温で４０分間インキュベートした。次いで、関連タンパク質が存在する場所を証明するために、沈殿物から封入体が存在する可溶性画分を２０，０００×ｇにて１５分間の遠心分離により分離した。封入体はさらに、製造業者の指示に従って洗浄した。最後に、５０μＬ／最初の培養物１ｍＬの割合のローディングバッファーＬａｅｍｍｌｉ １×(Laemmli 1970. Nature 227, 680-685)に溶かしたタンパク質を、１５％アクリルアミド／ＤＡＤＴゲル中、変性条件下での電気泳動により分離した（図５）。タンパク質は、誘導前（図５，レーン１）および誘導後（図５，レーン２）に集めた菌の全抽出物両方と前もって集めておいた上清（図５，レーン３）および沈殿物（図５，レーン４）、さらに洗浄後の封入体（図５，レーン５）より分離した。その結果、大腸菌のRosetta(DE3)pLysS（Novagen）において推定される見かけの分子量が１７．２ｋＤａであり、封入体中に存在する組換えタンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４の発現が確認された。
【００４１】
実施例３：タンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４の免疫原性の判定
組換えタンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４の免疫原性をウエスタンブロットによりネオスポラ原虫に自然感染した動物ウシ由来の血清を用いて判定した（図６）。これらの血清の感染はこれまでＥＬＩＳＡ法や直接免疫蛍光測定法（ＩＦＡＴ）により特異的抗体の高力価によって診断されてきた。タンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４が存在する封入体に対し、０．１×ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ溶液を用いて製造業者の教示のとおり、３回洗浄を行った。次いで、タンパク質を変性条件下での電気泳動により１５％アクリルアミド−ＤＡＴＤゲルで分離し、最後に、予冷転写バッファー（Ｔｒｉｓ ２５ｍＭ、グリシン １９２ｍＭ ｐＨ８．５および２０％メタノール）に浸漬した０．２μｍニトロセルロース膜(Bio.rad)への電気転写を４００ｍＡにて１時間行った。使用したウシ血清は異なる起源のものとした。その意味で、血清は慢性感染症が確立している可能性が高い動物由来のものであり、その血清にはブラディゾイトが出現しており（例えば、先天性感染を受けて生まれた動物由来のものまたは妊娠末期に流産した胎児の体液）、初乳前血清反応陽性を示す。もう一方で、流産しかけている雌ウシ由来の血清を使用して、流産に至らしめるネオスポラ原虫感染の再活性化の可能性を示した。さらに、３頭の子ウシの初乳前血清（ＩＦＡＴではネオスポラ原虫に対して高力価を有する）を使用した（図６，パネルＡおよびＢ，レーン１、２および３）。さらに、腹水（ＩＦＡＴではネオスポラ原虫に対して抗体高力価を有する）、妊娠の第２（図６，パネルＡおよびＢ，レーン４）および第３四半期（図６，パネルＡおよびＢ，レーン５および６）に流産した胎児由来のもの、ネオスポラ原虫に対して血清反応陽性の流産した雌ウシ由来のもの（図６，パネルＡおよびＢ，レーン７および８）を使用した。最後に、流産した他の２頭の雌ウシ由来の血清（ＩＦＡＴではネオスポラ原虫に対して血清反応陽性であり、抗体高力価を有する）を使用した（図６，パネルＡおよびＢ，レーン９および１０）。
【００４２】
技術の対照として、ウエスタンブロットを、同じ血清を用い、in vitroで得られたネオスポラ原虫タキゾイト由来の可溶性抽出物を転写した膜で同じ血清と並行して行った。可溶性抽出物を得るため、またウエスタンブロットを実施するため、上述のプロトコールに基本的には従った(Alvarez et al. 2002. Vet. Parasitol. 107, 17-27)。膜を０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）中３％ＢＳＡでブロックし、室温にて１時間攪拌した。次いで、その膜を３７℃で攪拌しながら、ウシ由来の血清（０．３％ＢＳＡ含有ＴＢＳ−Ｔにより１：２０希釈）とともに２時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔで３回迅速に洗浄した（１５分を１回と５分を２回）後、膜を３７℃で攪拌しながら、ペルオキシダーゼ結合抗ウシＩｇＧのマウスモノクローナル抗体（Hipra）（０．３％ＢＳＡ含有ＴＢＳ−Ｔにより希釈１：２００）とともに１時間インキュベートした。上記条件下でさらに一連の洗浄を行った後、使用直前に調製した基質溶液（２０ｍｌのメタノール、１００ｍｌのＴＢＳおよび０．０６０ｍｌの過酸化水素に溶かした６０ｍｇの４−クロロ−１−ナフトール(4-chloro-1-naphtol)）により、暗所でおよび攪拌下、室温にて１５分間発色させた。
【００４３】
ウエスタンブロットによりネオスポラ原虫による先天性感染を受けた(infected congenially)子ウシ由来の初乳前血清（図６，パネルＡ，レーン１、２および３）において、また妊娠の最後の３分の１で流産した胎児の腹水（図６，パネルＡ，レーン６）において組換えタンパク質に対する明瞭な応答が検出された。これらの動物では、流産した胎児のもの２つを除き（図６，パネルＢ，レーン４および５）、タキゾイト期の免疫優勢抗原に対しての明瞭な応答が認められた（図６，パネルＢ，レーン１〜３および６）。しかしながら、流産した雌ウシでは、明瞭な応答が検出されなかった（図６，パネルＡ，レーン７〜１０）が、タキゾイト期の免疫優勢抗原に対する明瞭な応答があった（図６，パネルＢ，レーン７〜１０）。
【００４４】
これらの結果から、自然感染した動物ではタンパク質ＮｃＳＡＧ４に対する応答が存在することが確認されるため、慢性型の感染が確立されているかもしれない場合、すなわち、タキゾイトからブラディゾイトへの転換が起こる場合には、トキソプラズマ原虫におけるその相同物（ＴｇＳＡＧ４）と同様に、寄生生物のこの緩増期のタンパク質ＮｃＳＡＧ４の特異性も確認される。タキゾイト期が特徴である急性感染症の動物ではｐＲＮｃＳＡＧ４に対する応答はないが、タキゾイト抽出物に対する明瞭な応答を示すことから、ブラディゾイト期のタンパク質ＮｃＳＡＧ４の特異性も確認される。
【００４５】
実施例４：ＲＴ−ＰＣＲによるネオスポラ原虫ブラディゾイト期におけるＮｃＳＡＧ４遺伝子の転写の判定
ネオスポラ原虫のＮｃＳＡＧ４遺伝子の転写の期特異性を証明するため、in vitroで培養したブラディゾイトから抽出される全ＲＮＡから行うＲＴ−ＰＣＲを開発した。細胞培養物においてブラディゾイトを生産するため、Risco-Castillo et al. (2003) J. Parasitol, 刊行物に掲載)により記載された方法に従った。これに関し、ネオスポラ原虫のタキゾイトを宿主−寄生生物比２：１で使用して(Barber et al. 1995. Parasitol. 111, 563-568)、ＭＡＲＣ−１４５細胞の単層を感染させた(Kim et al. 1993. Arch. Virol. 133, 477-483)。感染した細胞の培養物をＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．２）１５ｍＭ、グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１０Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１０μｇ／ｍＬ）、ファンギゾン（２５ｎｇ／ｍＬ）の存在下、１０％ウシ胎児血清を補給したＤＭＥＭ中で維持し、３７℃および５％ＣＯ２にてインキュベートした。
【００４６】
期転換を誘導するため、感染後、感染した培養物を濃度、培養培地中７０μＭのナトリウムニトロプルシエート(sodium nitroprusiate)（ＳＮＰ）で７日間処理し、２日おきに補充した。陰性対照として、タキゾイトの生産のためＳＮＰでは処理しない感染培養物を維持した。タキゾイトとブラディゾイトの混合物は、感染細胞の単層をかき取って集め、ＳＮＰで処理し、４℃にて１５分間、１３５０×ｇにて遠心分離した。ＳＮＰでは処理していない感染培養物で生産されたタキゾイトを同じ手順で集めた。同じ条件下、ＰＢＳで２回洗浄した後、２５Ｇニードルを用いてゾイトを再懸濁し、細胞屑を除去するためにセファデックス（商標）カラム（PD-10, Amersham Biosciences）を用いて精製した。これに関し、５ｍｌのＰＢＳでカラムを平衡化した後、ゾイトの懸濁液を５ｍｌのＰＢＳにより重力によって流した。同量のＰＢＳで２回洗浄した後、ゾイトを４℃にて１５分間、１３５０×ｇにて遠心分離することにより集めた。集めたゾイトは使用するまで−８０℃にて冷凍保存した。
【００４７】
全ＲＮＡの抽出では、上述のように生成した１０７タキゾイトの沈殿物またはタキゾイトとブラディゾイトの混合物を使用した。これに関し、市販のキットNucleoSpin RNA II（BD Biosciences Clontech）を製造業者の教示に従って使用した。得られた全ＲＮＡを、その特性を調べるため１×ＴＡＥバッファーの０．８％アガロースゲルでの電気泳動により分離した。
【００４８】
１つの試験管でＲＴ−ＰＣＲを行うため、各起源、タキゾイトまたはブラディゾイトの全ＲＮＡ １００ｎｇを使用し、“Quiagen（商標）One-step RT-PCR kit”(Qiagen)と呼ばれる市販のキットを製造業者の指示に従って使用した（図７）。これに関し、ＩＲ５ＳＡＧ４（配列番号５）および１Ｆ３ＳＡＧ４（配列番号７）と呼ばれるオリゴヌクレオチドを使用した。ＲＴは５０℃にて３０分間行った。ＰＣＲ条件は、変性９５℃にて１５分、続いて９４℃にて３０秒、６１℃にて１分、７２℃にて１分を４０サイクル、最後に伸長７２℃にて１０分とした。ＰＣＲ産物を０．５×ＴＢＥバッファーの３％高分解能アガロースゲルに流し、臭化エチジウム（ＢｒＥｔ）で染色した。ＲＴ−ＰＣＲの結果として、タキゾイトではＮｃＳＡＧ４のＲＮＡメッセンジャー（ｍＲＮＡ）の転写はなく（図７，レーン２）、ブラディゾイトでは上記ｍＲＮＡが存在している（図７，レーン３）ことが確認された。ＰＣＲの陽性対照として、ネオスポラ原虫タキゾイトから得られたゲノムＤＮＡ １００ｎｇを使用し（図７，レーン４）、ＰＣＲの陰性対照として、サンプルの代わりに超純水を使用した（図７，レーン１）。このことから、トキソプラズマ原虫のその相同なＴｇＳＡＧ４と同様に、ネオスポラ原虫ブラディゾイト期のＮｃＳＡＧ４遺伝子の転写の特異性が確認される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】この報告の実施例１において説明される、ネオスポラ原虫ゲノムの配列Ｎｃ１７５およびＮｃ３１２の増幅を示す。
【図２】この報告の実施例１において説明される、ゲノムウォーキングのスキームを示す。
【図３】この報告の実施例２において説明される、発現プラスミド、パネルＡ．ＰｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ．パネルＢ：ｐＲＳＥＴへの遺伝子ＮｃＳＡＧ４の挿入と、この報告の実施例２において説明される、組換えタンパク質、ｐＲＮｃＳＡＧ４のスキーム（パネルＣ）を示す。
【図４】この報告の実施例２において説明される、制限酵素での消化による組換えプラスミドの選択を示す。 ここで、ＷＭは「分子量標準、low range(Bio Rad)」である。
【図５】この報告の実施例２において説明される、大腸菌における組換えタンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４の発現である。
【図６】この報告の実施例３において説明される、組換えタンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４の免疫原性の特徴づけである。
【図７】この報告の実施例４において説明される、ＲＴ−ＰＣＲによるネオスポラ原虫ブラディゾイト期の遺伝子ＮｃＳＡＧ４の転写の検出である。
【発明の背景】
【０００１】
発明の目的
本発明は、動物の健康の分野で確立され、この記述的報告の表題で表すように、寄生原虫、ネオスポラ原虫(Neospora caninum)によって起こる疾病の診断、発症機序の解析および予防に関する。本発明は、より詳細には、ネオスポラ原虫の遺伝子ＮｃＳＡＧ４に相当するポリヌクレオチド分子、そのＲＮＡメッセンジャーと、それによってコードされる抗原、ブラディゾイト期の特異的タンパク質であるＮｃＳＡＧ４およびオリゴヌクレオチド、組換えベクター、形質転換宿主細胞、ならびに組換えにより発現されるタンパク質、ワクチンを生み出すその有用性に加え、疾病の診断用試薬としてのその使用、疾病の発症機序の研究を可能にする分子技術の開発へのその適用に関する。
【０００２】
背景技術
ネオスポラ病（Neosporosis）
ネオスポラ原虫は、アピコンプレックス門(phylum Apicomplexa)に属する寄生原虫であり、このアピコンプレックス門にはネオスポラ原虫と密接な関係があるトキソプラズマ原虫(Toxoplasma gondii)などの他の重要な寄生性病原体が含まれる。ネオスポラ原虫は、広範囲にわたる哺乳動物種に感染し得るが(Buxton et al. 2002, Trends Parasitol. 18, 546-552)、１９８９年以降、畜牛における流産および新生児死亡の原因となる作用因子であるといわれている(Thilsted and Dubey. 1989. J. Vet. Diagn. Invest. 1, 205-209)。
【０００３】
ウシネオスポラ病（Bovine neosporosis）は、世界中に分布する寄生虫性疾患であり、それを調査したスペイン(Gonzalez et al. 1999. Vet. Rec. 144, 145-150; Pereira Bueno et al. 2003. Vet. Parasitol. 111, 143-152)をはじめとする様々な国では繁殖失敗の最も一般的な原因の１つであると考えられている(Trees et al. 1999. Int. J. Parasitol. 29, 1195-1200; Anderson et al. 2000, Anim. Reprod. Sci. 60-61, 417 431)。妊娠中の雌における最も重要な感染の臨床症状が流産であり、一般的には妊娠３ヶ月から９ヶ月の間、最も一般的には約５〜６ヶ月に起こる。生きて生まれる子ウシ（最大２週間遅れる可能性がある）は神経筋に問題を示す可能性があり、出産後４〜５日目に最初の臨床的症状が現れる。しかしながら、最も一般的には、慢性的に感染している場合でも健康な子ウシは生まれる(Dubey and Lindsay, 1999. Vet. Parasitol. 67, 1-59)。さらに、ネオスポラ病はイヌ、それらの固有宿主にも影響を与え、多発性筋炎、脳炎、麻痺を引き起こし、死をもたらし得る(Lindsay and Dubey, 1989. J. Parasitol. 75, 163-165; Buxton et al. 2002. Trends Parasitol. 18, 546-552)。
【０００４】
ネオスポラ原虫の生活環は、トキソプラズマ原虫と同様に３つの期を包含する。固有宿主によって排泄されたオーシストの摂取により中間宿主に感染する、スポロゾイト（sporozoites）。他方、感染の急性期に関与する急増虫体であり、宿主組織を通じて播種する役割を有する、タキゾイト（tachyzoites）。このプロセスは、宿主が免疫性を発現し、その後慢性期が確立されたときに終わり、寄生生物の増殖は緩慢となり、ブラディゾイト（bradyzoites）内部で組織内シストが形成される。これについては自然および実験感染している数種の神経組織(Dubey et al., 1988, J. Am. Vet. Med. Assoc. 193, 1259-1263; Dubey et al. 1990. J. Am. Vet. Med. Assoc. 197: 1043-1044; Barr et al. 1992. J. Vet Diagn. Invest. 4, 365-367; Kobayashi et al. 2001. J. Parasitol. 87: 434-436)および自然感染したイヌおよび雌ウシの骨格筋組織(Peters et al. 2001. Int. J. Parasitol. 31, 1144-1148)の両方で観察されている。これらのブラディゾイトは再活性化まで組織のシスト内に潜伏している(Antony and Williamson. 2001. New Zeal. Vet. J. 49, 42-47; Buxton et al. 2002. Trends Parasitol. 18, 546-552)。アピコンプレックス(Apicomplexa)群（トキソプラズマ原虫またはネオスポラ原虫など）の寄生生物におけるタキゾイトからブラディゾイトへの転換（またその逆の場合）の基礎となる機構は今日まで分かっていないが、免疫応答が慢性感染症を有する動物における感染の潜伏期および再活性化に影響を及ぼしている可能性があることは示唆されている(Lyons, et al., 2002, Trends Parasitol. 18, 198-201)。
【０００５】
疾病の感染に関しては、最新の研究によって出生後感染の重大性が比較的低いことが示唆され、先天性感染が一生持続することが言及されている(Davison et al. 1999. Int. J. Parasitol. 29, 1683-1689; Hietala and Thurmond. 1999. Int. J. Parasitol. 29. 1669-1676)。先天的伝播は、５０〜９５％にわたる割合で主要な役割を果たし(Wouda et al. 1998. Theriogenology 49, 1311-1316; Pereira-Bueno et al. 2000. in: Hemphill and Gottstein (Eds.) Int. J. Parasitol. 30, 906-909)疾病の播種および維持において極めて重要な役割を果たすものと思われる(Bjorkman et al. 1996. J. Am. Vet. Med. Assoc. 208, 1441-1444; Pare et al. 1996 Can. J. Vet. Res. 60, 133-139; Anderson et al. 1997. J. Am. Vet. Med. Assoc. 210, 5 1169-1172; Schares et al. 1998. Vet. Parasitol. 80, 87-98)。
【０００６】
ネオスポラ原虫抗原（N. caninum anitigens）
ネオスポラ原虫のタキゾイトとブラディゾイトの抗原組成の比較に関しては、１つの研究が行われたが、トキソプラズマ原虫で行った研究（この研究ではいくつかの特定の期の抗原が同定され、特徴付けられる）とは対照的に、タキゾイトまたは両方の期で共有される特異性抗原が同定された(Fuchs et al. 1998. J. Parasitol. 84, 753-758)にすぎず、今日まで、極めて限られた情報しか得られていない。ネオスポラ原虫抗原には２つの表面タンパク質、タキゾイト特有のＮｃＳＡＧ１（Howe et al.によってそれらの遺伝子がクローニングされた(1998. Infect. Immun, 66, 5322-5328)）(Hemphill et al. 1997, Parasitology, 115, 371-380)およびタキゾイトおよびブラディゾイトの両方で発現されるＮｃＳＲＳ２(Hemphill et al. 1996, Parasitol. Res. 82, 497-504)が含まれる。最近になって、ネオスポラ原虫の両表面タンパク質のサブユニットワクチンとしての検証がネズミモデルにおいて行われた(Cannas et al. 2003a. Parasitology 126 (Pt. 4), 303-312)。また、最近寄生生物の両方の期で発現される２つのミクロネームタンパク質、ＮｃＭＩＣ３(Sonda et al. 2000. Mol. Biochem. Parasitol 108, 39-51)およびＮｃＭＩＣ１(Keller et al. 2002. Infect. Immun. 70, 3187-3198)が同定された。さらに、ＮｃＭＩＣ１０およびＮｃＭＩＣ１１と呼ばれるネオスポラ(Neospora)の２つの配列が遺伝子バンクに登録された。これらの配列はトキソプラズマ原虫のタンパク質ＴｇＭＩＣ１０およびＴｇＭＩＣ１１それぞれをコードする配列と極めて類似しているため、それらの配列がミクロネームの２つのタンパク質をコードする可能性が考えられる。クローニングされた他の遺伝子がＮｃＧＲＡ６およびＮｃＧＲＡ７である。これらの遺伝子はネオスポラ原虫タキゾイトの稠密顆粒のタンパク質をコードする遺伝子であり、これらに基づき、疾病診断のためのＥＬＩＳＡが開発された(Lally et al. 1996. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 3, 275-279)。これらのタンパク質の他、ＮｃＮＴＰａｓｅ−Ｉ(Asai et al. 1998 Exp. Parasitol. 90, 277-285)およびＮｃＧＲＡ２(Ellis et al. 2000. Parasitology 120 (Pt 4), 383-390)と呼ばれる、それぞれ２９ｋＤａおよび６７ｋＤａの稠密顆粒由来の他のものが同定され、特徴付けられた。もう一方で、細胞内タキゾイトのミクロネームに存在するタンパク質ＮｃＭＩＣ３(Naguleswaran et al. 2001. Infect. Immun. 69, 6483-6494)の遺伝子をクローニングし、それをワクチン接種目的で使用する組換えタンパク質として発現させた(Cannas et al. 2003b. J. Parasitol. 89 (pt. 1) 44-50)。
【０００７】
最後に、ＮｃＳＵＢ１は唯一クローニングされたネオスポラ原虫の遺伝子であり、酵素を発現する遺伝子である。ＮｃＳＵＢ１はタキゾイトのミクロネームに存在する６５ｋＤａのセリンプロテアーゼ(Louie and Conrad. 1999. Mol. Biochem. Parasitol. 103, 211-223; Louie et al. 2002. J. Parasitol. 88, 1113-1119)であり、ＴｇＳＵＢ１と呼ばれるトキソプラズマ原虫タンパク質と高いアミノ酸同一性を示す。
【０００８】
ネオスポラブラディゾイトの特異性抗原に関しては、in vitroにおいてもin vivoにおいてもブラディゾイトのシストを得ることが難しいことからこれまでに同定されたものはない。しかしながら、トキソプラズマ原虫では、１８ｋＤａのタンパク質に対して向けられたモノクローナル抗体（Ｔ８３Ｂ１）によって認識される表面抗原（ＳＡＧ４／ｐ１８）をはじめとし、特異的ブラディゾイト抗原が記載されている(Tomavo et al. 1991. Infect. Immun. 59, 3750-3753)。トキソプラズマ原虫のこのタンパク質をコードする遺伝子ＴｇＳＡＧ４をOdberg-Ferragut et al.(1996, Mol. Biochem. Parasitol. 83, 237-244)によりクローニングし、特徴付けた。
【０００９】
トキソプラズマ原虫の抗原ＴｇＳＡＧ４はホスファチジルイノシトールグリカン（ＰＩ−Ｇ）によって結合される膜タンパク質である。トキソプラズマ原虫による慢性感染症に関連する緩増期のこの特異的抗原の検出は、最近になってCultrera et al.(2002, Mol. Cell. Probes 16, 31-39)により示されたように重要な診断価値がある。これらの著者は、トキソプラズマ原虫(T. gondi)感染検出のための、ＡＩＤＳ患者の脳脊髄液（トキソプラズマ原虫が致死性脳症を引き起こす可能性がある）における遺伝子ＴｇＳＡＧ４のｍＲＮＡの検出に基づくＲＴ−ＰＣＲを開発した。
【００１０】
ネオスポラ病の診断および予防
従って、疾病の垂直感染が、疾病を持続的に搾取作用により定着させる最大の方法と考えられ、またネオスポラ病が畜牛における流産および新生児死亡の主な原因の１つであるため、付随する経済的損失より、制御は、主として、飼育場内での感染の有病率を下げ、処分と補充のための選択的な手段を確立して感染動物数を減らすことを目的としなければならない。
【００１１】
畜牛における流産の病因診断は複雑で、困難である。病因診断がなされた場合には、９０％を上回るものでは感染性および寄生性因子が該当する（一般に、ネオスポラ原虫が主要な役割を果たす）。ネオスポラ原虫による感染の診断に関しては、検査室診断を実施して流産の病因を確認することが不可欠である（この診断では、血清学的診断技術が主要な役割を果たし、問題の重大性についての初期情報を与える）。成体では、特異的血清抗体の検出により検査室診断が行われる。この種の研究により飼育場内での感染の分布および頻度（群血清陽性率）ならびに感染した群内でのネオスポラ病による流産の危険性（群内血清陽性率）についての非常に有益な情報が提供されるため、これは感染の制御に効果的な手段を確立するのに非常に有用である(Thurmond and Hietala. 1995. Parasitol. 81, 364-367; Pare et al. 1996. Can. J. Vet. Res. 60, 10 133-139)。
【００１２】
従って、動物の健康状態を正確に確認するためには診断の改善が極めて重要である。これに関連して、現在用いられている血清学的技術を検証し、動物の年齢および用いる技術に基づくカットオフポイントの選択などのいくつかの論争中の問題を解明することを目的として数多くの研究が行われてきた(Alvarez-Garcia et al. 2003. Vet. Res. 34, 341-352)。
【００１３】
ネオスポラ原虫に対しては現在いくつかの診断技術が用いられている(Ferre et al. 2003. Res. Adv. Microbiol. 3, 157-167)が、最近の感染症と慢性感染症とを区別することが可能な診断技術はなく、特異的タキゾイトおよびブラディゾイト抗原それぞれを同定することにより、流産という点からより多くの飼育場の未来に関する情報を提供し、疾病の制御を改善する診断技術の開発が可能になる。これらの抗原を組換えタンパク質として発現させ、ネオスポラ病に対する血清学的診断にそれらを使用することにより、非常に有益な新規ツールが提供される。これに関連して、様々な種類の異種発現系で産生された数種類のネオスポラ原虫タンパク質に基づき、ＥＬＩＳＡなどの診断法が開発された(Lally et al. 1996. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 3, 275-279; Louis et al. 1997. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 4(6), 692-699)が、特異的ブラディゾイト抗原に基づいたものはこれまでなかった。さらに、期特異的抗原に対するモノクローナル抗体および単一特異性ポリクローナル血清の開発は、ネオスポラ原虫タキゾイトの６５ｋＤａのタンパク質に対して行われるような競合ＥＬＩＳＡの開発により診断の代替法となる(Baszler et al. 1996. J. Clin. Microbiol. 34(6), 1423-1428)。
【００１４】
他方、畜牛におけるネオスポラ病の薬理学的制御は現在実現不可能であり、ウシ疾病の薬物治療の経験はなく、利用可能なデータは信頼できるものではない。しかしながら、可能な治療の高コスト、起こり得る耐性の発現、食用肉または乳汁への残留物により、制御手段としての化学療法は制限される。従って、群管理のための手段には免疫学的予防を加えるべきである。
【００１５】
これに関連して、ネオスポラ原虫に対するワクチンの調製のために最近行われた調査に死菌ワクチンの評価があり、その結果はさまざまであり、ネズミモデルでは垂直感染からのある種の防御が見られた(Liddell et al., 1999, J. Parasitol. 85: 1072-1075)が、ウシモデルでは見られなかった(Andrianarivo et al. 1999, Int. J. Parasitol. 30: 985-990)。また、ネオスポラ原虫による致死性感染症からの防御免疫応答を刺激することを目的としたマウスにおけるワクチン接種試験では、弱毒分離株に基づく生ワクチンによる免疫処置も利用し(Atkinson et al. 1999. Parasitology 118: 363-370)、また温度感受性突然変異体も利用した(Lindsay et al. 1999. J. Parasitol. 85: 64-67)ところ、決定的でないが信頼できる結果が得られたが、持続感染を受けた動物が発生するという問題を伴った。他方で、サブユニットのワクチンは伝統的なワクチンに優る数多くの利点を示す(Jenkins, 2001. Vet. Parasitol. 101, 291-310)。これらの利点には、生存寄生生物と比較した、組換えタンパク質の安全性および相対的安定性、防御免疫応答を誘導する抗原のみ含むという柔軟性、ならびに大規模生産を確立する能力が含まれる。感染症、流産または感染症の垂直感染の予防のためのネオスポラ原虫抗原に基づくサブユニットワクチンの開発によりその制御のための新しいツールが提供される。差し当たっては、その件についてほとんど研究が行われなかった。タキゾイト特有の抗原または両方の期で共有される抗原（例えば、発現され、原核生物系から精製された、ネズミモデルにおいて脳のネオスポラ病に対する感染防御免疫を誘導するＮｃＭＩＣ３(Cannas et al. 2003. J. Parasitol. 89(1), 44-50)、ならびにタキゾイトの２つの表面タンパク質であるＮｃＳＡＧ１およびＮｃＳＲＳ２をはじめとする組換えタンパク質）を使用し、それらを同じモデルに接種し、組換え抗原およびＤＮＡワクチンとして組み合わせて(Cannas et al. 2003. Parasi
tology 126, 303-312)、良好な結果を得ている。最近になって、ネズミモデルにおいてＮｃＧＲＡ７タンパク質またはＮｃｓＨＳＰ３３タンパク質を発現するプラスミドがＤＮＡワクチンとして使用され、感染の先天的伝播からの部分的防御が得られている(Liddell et al. 2003. J. Parasitol. 89(3), 496-500)。しかしながら、ネオスポラ原虫において記載された最初のものは、この報告の本発明の説明において示されるように、遺伝子ＮｃＳＡＧ４によって生み出されるものであるために、これまでこれらのワクチンの開発はブラディゾイト期の特異的抗原に基づいたものではなかった。
【００１６】
背景において記載したように、各期において特異的に発現される遺伝子を単離することが、この疾病および慢性感染症の確立を決定する分子機構、ならびに感染の再活性化の研究に非常に適しており、疾病の理解および制御が向上する。これに関連して、ネオスポラ原虫におけるＮｃＳＡＧ４遺伝子（トキソプラズマ原虫ブラディゾイト期の特異的タンパク質をコードするＴｇＳＡＧ４遺伝子に相同）を単離し、それをクローニングし、期特異的抗原ＮｃＳＡＧ４の組換えタンパク質として発現させることにより、これに関して本発明の説明において記載されるように、ネオスポラ病の診断に、および疾病の発症機序の解析に非常に有益な解決策が提供され、それをワクチンとして使用することがその制御の代替法となる。
【発明の具体的説明】
【００１７】
遺伝子ＮｃＳＡＧ４のネオスポラ病の診断および予防のための使用ならびに発症機序の解析用マーカーとしての使用
本発明の目的は、ネオスポラ原虫に対する診断およびワクチン接種目的において有用な試薬を提供することである。さらに、本発明は、ネオスポラ病の発症機序の解析を目的とする、主として感染の慢性期の確立研究を目的とする、その再活性化に関するマーカーを提供する。よって、ネオスポラ原虫の遺伝子ＮｃＳＡＧ４（この寄生生物において記載されたブラディゾイト期の最初の特異的遺伝子である）の同定、単離および特性化を可能にした分子テクノロジーを記載している。これに関し、遺伝子ＮｃＳＡＧ４のいくつかのＤＮＡ断片を、トキソプラズマ原虫のタンパク質ＴｇＳＡＧ４のアミノ酸の配列に基づいて設計された４つの変性オリゴヌクレオチド（それらのオリゴヌクレオチドの１つ（配列番号１）がOdberg-Ferragut et al.により記載されている(1996, Mol. Biochem. Parasitol. 82, 237-244)）の組合せを用いてＰＣＲにより増幅する。設計されたそれ以外の３つのオリゴヌクレオチドはＳＡＧ４−２、ＳＡＧ４−３およびＳＡＧ４−４と呼ばれ、配列表において、それぞれ、配列番号２、配列番号３および配列番号４として確認される。得られた配列から別の４つのオリゴヌクレオチドを設計してゲノムウォーキング技術により遺伝子の配列を完成させる。よって、オリゴヌクレオチド１Ｒ５ＳＡＧ４（配列番号５）および２Ｒ５ＳＡＧ４（配列番号６）を使用して５’センスの遺伝子を完成させた。オリゴヌクレオチド１Ｆ３ＳＡＧ４（配列番号７）および２Ｆ３ＳＡＧ４（配列番号８）を使用して３’センスの遺伝子を完成させた。
【００１８】
本発明は、クローニングと制限酵素によるその後の消化のために特別に設計されたオリゴヌクレオチドを用いた、ＰＣＲ増幅によるＮｃＳＡＧ４遺伝子のクローニング法を記載する。このクローニングは、それぞれ、原核生物および真核生物系発現用の２種類のプラスミド、ｐＲＳＥＴおよびｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（いずれもInvitrogen社製）において行う。タンパク質のアミノ末端のシグナルペプチドの領域を排除した成熟タンパク質ＮｃＳＡＧ４の配列およびそのカルボキシ末端の可能性あるシグナルペプチドの領域を排除した成熟タンパク質ＮｃＳＡＧ４の配列に相当するアミノ酸２９〜１４８（両方とも含まれる）をコードするＮｃＳＡＧ４遺伝子の一部をプラスミドｐＲＳＥＴに挿入する。これに関し、遺伝子ＮｃＳＡＧ４の相当する領域を、ネオスポラ原虫のゲノムＤＮＡから、Ｆ８５ＮｃＳＡＧ４（配列番号１３）およびＲｅ４４４ＮｃＳＡＧ４（配列番号１４）と呼ばれる、そのために設計されたオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによって増幅する。この系では、組換えタンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４をファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下で融合タンパク質として発現させる（組換えタンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４のアミノ末端にはアフィニティークロマトグラフィーによる精製を可能にするヒスチジンタグを付ける）。組換えタンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４の生産には、培養培地へのＩＰＴＧ添加によりファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼによる誘導で発現し、組換えタンパク質の発現を可能にする大腸菌(E. coli)由来のrosetta(DE3)pLysS細胞株（Novagen）を使用する。ネオスポラ病の血清学的診断にこの組換えタンパク質を使用することによって、これらのポリペプチドの抗原性に基づく、ＥＬＩＳＡ、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）または他の任意の方法による、本発明の開発において示すように、記載されているウエスタンブロット技術による、感染の異なる期（急性期および慢性期）の鑑別診断に非常に有益な新規ツールが提供される。よって、ネオスポラ原虫による先天性感染を受けた胎児および子ウシ由来の血清において、タンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４に対する抗体（１５％アクリルアミド−ＤＡＴＤゲル中、変性条件下で電気泳動により分離される）が検出される。このことから、ネオスポラ原虫による急性および慢性感染症の鑑別診断の観点からも、さらにワクチンとしてのそれを使用した予防の観点からもこのタンパク質の価値が示される。
【００１９】
組換えタンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４に対するモノクローナル抗体およびポリクローナル単一特異性血清の開発と同様に、そのタンパク質は、それらに基づく競合ＥＬＩＳＡの開発により診断の代替法となる。さらに、本明細書において記載するポリペプチドに対するこれらのモノクローナル抗体または特異的ポリクローナル血清が、前記血清による寄生生物の検出に基づく、免疫組織化学、免疫蛍光測定法または他の任意の方法により動物組織におけるネオスポラ原虫による慢性感染症の診断に使用される。
【００２０】
本発明の一つの目的は、ネオスポラ病、垂直感染および慢性感染症の確立に対するワクチンを提供することである。原核生物における異種遺伝子の発現系は、組換え抗原の大規模生産という利点を提供し、その組換え抗原がサブユニットのワクチンとして使用される。これらのワクチンにはもう１つの利点、すなわち、それらが標識ワクチンとして使用されるという利点があり、それらが生み出す免疫応答は感染した動物において寄生生物によって生じるものとの区別が容易であり、疾病根絶計画において極めて重要である。さらに、これらのワクチンは安全であり、組換えベクター（例えば、ウイルスベクター）に基づくワクチンに優る利点を提供する。しかしながら、後者のワクチンは低用量での免疫感作を可能にする複製という利点を提供する。
【００２１】
それでもなお、サブユニットワクチンとして使用されるこのような種類の組換えタンパク質により、免疫応答、主として体液性免疫応答を誘導する。従って、免疫応答を細胞に基づく応答にも向けるために、この応答に向けられたアジュバントも使用する。もう一方で、細胞に基づく応答を導き、適切なタンパク質フォールディング（protein folding）を確実にするために、ＤＮＡワクチンを使用する。
【００２２】
本発明は、ＮｃＳＡＧ４タンパク質に基づくＤＮＡワクチン（上述の原核生物系で生産される組換えタンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４と組み合わせて、または組み合わせずに使用される）について記載する。これに関し、遺伝子ＮｃＳＡＧ４の完全コード化領域を、その目的で設計されたＦＮｃＳＡＧ４（配列番号１１）およびＲｅＮｃＳＡＧ４（配列番号１２）と呼ばれるオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによって増幅し、それを哺乳動物細胞用発現ベクター、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ内、制限部位Ｂａｍ ＨＩおよびＥｃｏ ＲＩに挿入し、ｐＣＤＡ１０と呼ばれる組換えプラスミドを得、このプラスミドをＤＮＡワクチンとして使用する。
【００２３】
もう一方で、本発明は、慢性感染症に関連するネオスポラ原虫ブラディゾイト期のマーカーとしての遺伝子ＮｃＳＡＧ４の使用について記載する。この遺伝子は、感染動物の組織または体液由来の寄生生物の核酸に基づく、ＤＮＡプローブを用いたＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ、in situ ハイブリダイゼーションまたは他の任意の検出法による、ネオスポラ原虫による慢性感染症の診断に本明細書において記載するヌクレオチド分子を使用することによってマーカーとして使用される。
【００２４】
１Ｆ３ＳＡＧ４（配列番号７）および１Ｒ５ＳＡＧ４（配列番号５）と呼ばれる遺伝子の単離のために設計されたオリゴヌクレオチドに基づく、ＲＴ−ＰＣＲによる、寄生生物における遺伝子ＮｃＳＡＧ４の発現の検出法を詳述する。このＲＴ−ＰＣＲは、中間宿主におけるネオスポラ原虫の期転換マーカーとしてのＮｃＳＡＧ４遺伝子の使用を可能にし、持続感染を受けた動物において慢性感染症の確立を決定する機構および感染の再活性化に関与する機構、ならびにこれらの条件に影響を及ぼす因子の解析に、そして慢性感染症の確立および再活性化からの防御の観点からネオスポラ原虫に対するワクチン製品の有効性を確立するために必要なツールである。さらに、上記プロモーターを用いて作製した遺伝子構築物によってトランスフェクトしたネオスポラ原虫細胞において異種遺伝子を発現させるために遺伝子ＮｃＳＡＧ４のプロモーターを使用することによって、細胞培養物または実験動物において、in vitroおよびin vivo発現系でのタキゾイト期からブラディゾイト期への転換（またその逆の場合）を決定する分子機構の解析が可能になる。
【００２５】
図面の説明
説明を補足し、本発明の特徴をより理解するために、一連の図面を例示的かつ非限定的なものとして後述の記述的報告に添付する。
【実施例】
【００２６】
本発明の方法
次の実施例によりさらに本発明を例示するが、実施例はその範囲を限定するものではなく、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ定義される。
【００２７】
実施例１：遺伝子ＮｃＳＡＧ４の単離と特徴づけ
ネオスポラ原虫の遺伝子ＮｃＳＡＧ４を単離するため、既知ＤＮＡ領域にフランキングしているが未知配列のＤＮＡ断片のＰＣＲによる増幅を可能にするゲノムウォーキングと呼ばれる方法を使用した。
【００２８】
既知配列を増幅するために、４つの変性オリゴヌクレオチドを使用して、記載されているものをトキソプラズマ原虫の遺伝子ＴｇＳＡＧ４をクローニングするように改善した(Odberg-Ferragut et al., Mol. Biochem. Parasitol. 82 (1996) 237-244)。使用したフォワードオリゴヌクレオチドの１つがこれらの著者が記載しているオリゴ１ａ（配列番号１）であり、それ以外の３つのものは、以下の株：ＲＨ（ＡＦ３４０２２４．１）、ＰＬＫ（Ｚ６９３７３．１）、Prugniaud（ＡＦ３４０２２５．１）およびＣＥＰ（ＡＦ３４０２２６．１）のデータベースに存在するトキソプラズマ原虫の遺伝子ＴｇＳＡＧ４によってコードされるアミノ酸配列に基づいて設計した。従って、１つのフォワードオリゴヌクレオチドを設計し、それをＳＡＧ４−２（配列番号２）と呼称し、２つのリバースオリゴヌクレオチドをＳＡＧ−３（配列番号３）およびＳＡＧ４−４（配列番号４）と呼称した。
【００２９】
ＰＣＲを行うために、ネオスポラ原虫タキゾイトから単離したゲノムＤＮＡ０．４μｇを使用した。ゲノムＤＮＡを単離するために、市販のキットを使用説明書に従って使用した（GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation kit, Amersham Biosciences）。使用した陽性対照はその方法により単離されたトキソプラズマ原虫のゲノムＤＮＡであった。使用したＤＮＡポリメラーゼは、Ｃｌ２Ｍｇ（４ｍＭ）、ｄＮＴＰｓ（２００μＭ）および各変性オリゴヌクレオチド４０ｐｍｏｌの存在下、相当するバッファー中、１反応あたり２．５Ｕの酵素ＥｃｏＴａｑ（Ecogen）であった。ＰＣＲ条件は、変性９４℃にて５分、続いて９４℃にて１分、アニーリング１分（この際、温度勾配４３℃〜５６℃をかけた）（図１，レーン４〜９）、７２℃にて１分を４０サイクル、サイクルごとに伸長を１秒延長、最後に伸長７２℃にて１０分とした。使用した陰性対照はＤＮＡを含まない反応の混合物（図１，レーン１）または非感染ＭＡＲＣ−１４５細胞由来のゲノムＤＮＡ（図１，レーン２および３）であった。
【００３０】
ＰＣＲを受けて、融解温度５６℃を使用した際にいくつかの断片が増幅され、それらを１×ＴＢＥの２％アガロースゲルでの電気泳動によりネオスポラ原虫（図１，レーン９）およびトキソプラズマ原虫（図１，レーン１２）のゲノムＤＮＡから分離した（図１）。これらの断片の２つのものが１７５ｐｂのオリゴヌクレオチド１ａとＳＡＧ４−３の組合せ（Ｎｃ１７５）および３１２ｐｂの１ａとＳＡＧ４−４の組合せ（Ｎｃ３１２）の予測サイズに一致している。市販のキット（GenomeGENECLEAN（商標）Turbo nucleic acid purification kit, Q-BIOgene）を製造業者の指示に従って使用して、１×ＴＢＥバッファーの２％アガロースゲルからこれらのＤＮＡ断片を精製し、オリゴヌクレオチド１ａについて配列決定した(Sequencing Service of the Institute of Biomedical Research “Alberto Sols", CSIC-UAM)。得られたヌクレオチド配列を、データベースに存在する、６４ｐｂの断片においてトキソプラズマ原虫の３つの株の遺伝子ＴｇＳＡＧ４の配列と類似性８２％を有するものと比較した(BLASTN-nr, www.ncbi.nlm.nih.gob/blast)。さらに、配列Ｎｃ１７５を異なるオープンリーディングフレームに翻訳し、それをトキソプラズマ原虫のデータベース(TgGI: TIGR Toxoplasma gondii gene index, www.tigr.org/tdb/tgi/tggi)と比較した際に、表面タンパク質として記載されている配列群（ＴＣ２７５４）と類似性６８％であることが分かった。これは上述の株（ＲＨ、ＰＫＬ、PrugniaudおよびＣＥＰ）の遺伝子ＴｇＳＡＧ４の配列によってコードされるタンパク質と一致し、株ＭＥ４９のブラディゾイトの遺伝子ライブラリーにある、記載されているＥＳＴ(Toxoplasma gondii v3, Parasite Consensus EST Data bases)とも一致している。最後に、配列Ｎｃ１７５をネオスポラ原虫のデータベース(NcGI: TIGR Nespora caninum gene index, www.tigr.org/tdb/tgi)と比較したところ、これまでに記載されている配列との類似性はなかった。
【００３１】
一度配列Ｎｃ１７５が単離されると、ネオスポラ原虫のゲノムＤＮＡから、市販のキット（Universal Genome Walker（商標）kit, BD Biosciences Clontech）を使用して、配列Ｎｃ１７５の５’および３’センスにおいてゲノムウォーキング法を用いることにより遺伝子ＮｃＳＡＧ４が同定された。この方法を行うための第１段階が、製造業者の教示に従っての、平滑末端を生じる４つの異なる制限酵素：ＥｃｏＲＢ（１）、Ｄｒａｌ（２）、ＰｖｕII（３）およびＳｔｕＩ（４）でのゲノムＤＮＡの消化（図２，段階１）とその後のアダプターとの結合（図２，段階２）である。次いで、このようにして得た各遺伝子ライブラリーに関しては、アダプター（ＡＰ１およびＡＰ２）と結合しているオリゴヌクレオチドと既知ゲノム配列に基づいて設計された遺伝子の特異的オリゴヌクレオチドを使用してダブルＰＣＲを行う（図２，段階３）。５’センスにおいてゲノムウォーキングを行うために配列Ｎｃ１７５から設計されたオリゴヌクレオチドを１Ｒ５ＳＡＧ４（配列番号５）および２Ｒ５ＳＡＧ４（配列番号６）と呼称し、３’センスにおいてゲノムウォーキングを行うために設計されたオリゴヌクレオチドを１Ｆ３ＳＡＧ３（配列番号７）および２Ｆ３ＳＡＧ４（配列番号８）と呼称した。各ゲノムＤＮＡ遺伝子ライブラリーに対して、長距離熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Advantage（商標） Genomic PCR kit, BD Biosciences Clontech）を製造業者の教示に従って使用して、５’または３’センスそれぞれにおいてゲノムウォーキングを行うためのオリゴヌクレオチドＡＰ１および１Ｒ５ＳＡＧ４または１Ｆ３ＳＡＧ４を用いて、第１のＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９４℃にて２５秒および６８℃にて３分を７サイクル、続いて９４℃にて２５秒および６４℃にて３分を３２サイクル、さらに最終伸長６４℃にて７分間とした。第２のＰＣＲは、第１ＰＣＲの産物の１：５０希釈物から行い、オリゴヌクレオチドＡＰ２と５’または３’センスそれぞれにおいてゲノムウォーキングを行うための２Ｒ５ＳＡＧ４または２Ｆ３ＳＡＧ４を用いて行った。第２のＰＣＲの条件は、９４℃にて２５秒および６８℃にて６分を５サイクル、続いて９４℃にて２５秒および６４℃にて６分を２０サイクル、さらに最終伸長６４℃にて１０分間とした。ゲノムウォーキングによって得たＤＮＡ断片は上記のように精製し、配列決定した（図２，段階４）。
【００３２】
従って、異なる増幅断片の配列を比較することによって、６０１個のヌクレオチドからなる配列（配列番号９）を構築することができた。この配列は、ブラディゾイト期の特異的タンパク質をコードするトキソプラズマ原虫の遺伝子ＴｇＳＡＧ４の配列とのその相同性にちなんでＮｃＳＡＧ４と呼ばれた。さらに、５２２ｐｂのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の存在が確認され、そのＯＲＦはトキソプラズマ原虫におけるその相同配列と類似したサイズを有し、１７３個のアミノ酸からなるタンパク質をコードするもの（配列番号１０）であった。このＯＲＦをコードするアミノ酸の配列をデータベースに存在する配列(BLASTx, www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)と比較したところ、異なるトキソプラズマ原虫株のタンパク質ＴｇＳＡＧ４のものとの類似性が６９％であることが分かった。
【００３３】
実施例２：抗原ＮｃＳＡＧ４の組換えタンパク質としての発現
一度遺伝子ＮｃＳＡＧ４が同定されたら、異種系において、コード領域領域を発現ベクターに挿入して、抗原ＮｃＳＡＧ４を組換えタンパク質として作製した。真核生物系では発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（商標）−Ｃ（Invitrogen）を選択し（図３，パネルＡ）、原核生物系では発現プラスミドｐＲＳＥＴ−Ｃ（Invitrogen）を選択した（図３，パネルＢ）。プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（商標）−Ｃでは、遺伝子ＮｃＳＡＧ４の完全コード化領域を部位ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩに挿入した。これに関し、ネオスポラ原虫のゲノムＤＮＡから、そのために設計されたオリゴヌクレオチド（OligoANALYZER 1.0.2.）を用いてＰＣＲを行った。フォワードオリゴヌクレオチド（その５’末端にＢａｍＨＩの特異的認識部位、続いてＮｃｏＩ部位、その後遺伝子ＮｃＳＡＧ４のＯＲＦの５’末端と同一の配列を含む）をＦＮｃＳＡＧ４（配列番号１１）と呼称した。リバースオリゴヌクレオチド（その５’末端にＥｃｏＲＩの特異的認識部位、続いて遺伝子ＮｃＳＡＧ４のＯＲＦの３’末端に相補的な逆配列を含む）をＲｅＮｃＳＡＧ４（配列番号１２）と呼称した。
【００３４】
原核生物における発現では、末端切断型タンパク質、アミノ酸２９〜１４８（両方とも含まれる）をコードする遺伝子ＮｃＳＡＧ４の一部をプラスミドｐＲＳＥＴ−Ｃの部位ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩに挿入した。これに関して、２つのオリゴヌクレオチドをソフトウェア（OligoANALYZER 1.0.2.）を使用して設計した。フォワードオリゴヌクレオチド（その５’末端にＢａｍＨＩの特異的認識部位、続いて遺伝子ＮｃＳＡＧ４のＯＲＦ、ヌクレオチド８３〜１００と同一の配列を含む）をＦ８５ＮｃＳＡＧ４（配列番号１３）と呼称した。リバースヌクレオチド（その５’末端にＥｃｏＲＩの特異的認識部位、続いて終止コドン（ＴＡＡ）、その後遺伝子ＮｃＳＡＧ４のＯＲＦ、ヌクレオチド３２８〜４４４の相補的逆配列を挿入している）をＲｅ４４４ＮｃＳＡＧ４（配列番号１４）と呼称した。
【００３５】
いずれの場合においてもＰＣＲを行うために、ネオスポラ原虫タキゾイトから単離したゲノムＤＮＡ０．１μｇを反応に使用した。使用したＤＮＡポリメラーゼは、２．５ｍＭのＣｌ２Ｍｇ、ｄＮＴＰｓ（２００μＭ）および各オリゴヌクレオチド４０ｐｍｏｌの存在下、相当するバッファー中最終量２５ｕｌ、１反応あたり１．２５ＵのＥｃｏＳｔａｒｔ（Ecogen）であった。ＰＣＲ条件は、変性９５℃にて７分、続いて９５℃にて３０秒、５３℃にて１分、７２℃にて４分を４０サイクル、サイクルごとに伸長を１秒延長、最後に伸長７２℃にて１０分（１回）とした。ＰＣＲ産物を１×ＴＡＥバッファーの１．５％アガロースゲルに流し、臭化エチジウム（ＢｒＥｔ）で染色し、遺伝子ＮｃＳＡＧ４のＯＲＦについて予測されるサイズに相当する５４２ｐｂ、そして末端切断遺伝子については３８５ｐｂのサイズを観察した。次いで、これらのＤＮＡ断片を精製し、好適なバッファー（バッファーＢ, Roche）中、最終量５０μＬの制限酵素ＢａｍＨＩ（５Ｕ）およびＥｃｏＲＩ（６Ｕ）により水浴中３７℃にて４時間消化した。同時に、同じ条件下で、各プラスミドベクターを消化した。これらのプラスミドは、３７℃での同じ消化反応においてエビアルカリ性ホスファターゼ（ＳＡＰ）酵素２Ｕによる３０分間の消化終了時に処理した。その後、ＳＡＰ酵素をＥＤＴＡ １０ｍＭの存在下で６５℃にて２０分間不活性化した。一度消化が完了したら、プラスミドＤＮＡとＰＣＲ産物の両方を１×ＴＡＥバッファーの１．５％の低融点アガロースゲルに流し、ＢｒＥｔで染色した後、それを精製した。
【００３６】
プラスミドの操作では、Sambrook et al.(1989)によって記載された方法に基本的には従った。一度、消化された各ＤＮＡ断片を精製したら、それを好適なバッファー中、最終量１５μＬの１Ｕの酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ存在下、ベクター−挿入物１：３比で、５０ｎｇの対応するベクター（遺伝子ＮｃＳＡＧ４の完全ＯＲＦの場合にはｐＣＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（ｃ）−Ｃ（Invitrogen）および末端切断遺伝子の場合にはプラスミドｐＲＳＥＴ−Ｃ）と連結した。連結はサーモサイクラーで０．５ｍｌ試験管中（Multi（商標）， Sorenson Bioscience）１２℃にて１８時間を行い、その後、使用するまで−２０℃にて保存した。
【００３７】
一度連結を行えば、それを用いてエレクトロポレーションにより大腸菌ＤＨ５α株の冷凍コンピテント細胞を形質転換した。エレクトロポレーションによる細菌の形質転換では、エレクトロポレーターの製造業者（GenePulser（商標）, Bio-rad）の教示に基本的には従った。予め氷冷しておいた２ｍｍのエレクトロポレーショントレー（Equibio）を使用した。コンピテント菌は５μＬの連結物を添加するまで冷凍しないで氷中に保った。氷中で１分後、それらに２５μＦＤおよび２００Ｏｈｍにて、４〜５秒間、２．５ｋＶのパルスをかけた。形質転換された菌を直ちに５００μＬのＳＯＣ培地（ＭｇＳＯ４ １０ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １０ｍＭおよびグルコース２０ｍＭをＳＯＢ培地に添加したもの、ＳＯＢ培地：バクトトリプトン２％、酵母抽出物０．５％、ＮａＣｌ １０ｍＭおよびＫＣｌ ２．５ｍＭ）に再懸濁し、３７℃にて１時間増殖させ、その後２００μＬの細胞懸濁液を１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（使用したプラスミドが耐性を有する抗生物質）の存在下でＬＢ−寒天培地（１．５％ノーブル寒天(noble gar)）に播種した。好適な培地で３７℃にて１８時間プラークを増殖させた後、プラスミドにより形質転換された菌を選択した。その後のプラスミドＤＮＡの単離のために、各々１０クローンを選択し、１００μｇ／のアンピシリンを含有する液体ＬＢ培地３ｍＬ中で３７℃にて一晩増殖させた。このＤＮＡをアルカリ溶菌法により得、予測サイズのプラスミドに関するクローンを選択するために、続いてそれを１×ＴＡＥバッファーの０．８％アガロースゲルに流した。遺伝子ＮｃＳＡＧ４の完全ＯＲＦをプラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ／（ｃ）−Ｃに挿入することによって構築された、予測サイズ６，０２８ｐｂのプラスミドに関連したプラスミドをｐＣＤＡ（クローンのとおり１〜１０の番号が付けられている）と呼称した。末端切断型遺伝子ＮｃＳＡＧ４、ヌクレオチド８３〜４４４をｐＲＳＥＴ−Ｃ（３，２３５ｐｂ）に挿入することによって得られたプラスミドをｐＲＣ（クローンのとおり１〜１０）と呼称した。制限酵素による特徴づけのため、観察されたサイズに基づき、各々から４クローンを選択した（図４）。従って、得られたプラスミドを好適なバッファー（バッファーＢ，Ｒｏｃｈｅ）中、最終量２０μＬの制限酵素ＢａｍＨＩ（５Ｕ）およびＥｃｏＲＩ（６Ｕ）により水浴中３７℃にて２時間消化した。消化されたプラスミドＤＮＡを０．５％ＴＢＥバッファーの０．８％アガロースゲルで分離したところ、各構築プラスミドにおいて適切なサイズの断片の放出が観察された。その結果、プラスミドｐＣＤＡ５、ｐＣＤＡ６、ｐＣＤＡ９およびｐＣＤＡ１０は５２８ｐｂの断片を放出し（図４，パネルＡ，それぞれレーン１〜４）、プラスミドｐＲＣ６、ｐＲＣ７、ｐＲＣ９およびｐＲＣ１０は３７１ｐｂの断片を放出した（図４，パネルＢ，それぞれレーン３〜６）。さらに、ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（ｃ）−Ｃ（図４，パネルＡ，レーン５および６）およびＰＲＳＥＴ−Ｃ（図４，パネルＢ，レーン１）を切断し、消化の対照として使用した。また、非消化プラスミドｐＲＳＥＴ−Ｃ（図４，パネルＢ，レーン２）もアガロースゲルに流した。市販のオリゴヌクレオチドＴ７を用いてプラスミドｐＣＤＡ１０およびｐＲＣ１０を配列決定し、断片が発現ベクターに適切に挿入されているかを確認した。
【００３８】
組換えタンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４（配列番号１５）は、遺伝子ＮｃＳＡＧ４のＯＲＦによってコードされ、本明細書において記載されている、アミノ末端のシグナルペプチドとカルボキシ末端の可能性あるシグナルペプチドのない成熟タンパク質ＮｃＳＡＧ４のアミノ酸配列に相当するアミノ酸２９〜１４８を包含し、Gerber et al.(1992. JBC 267. 12168-12173)によって見直された判定基準に従って、アミノ末端に、アフィニティークロマトグラフィーによる精製を可能にする６個のヒスチジン、ペプチドＴ７−タグおよびエンテロキナーゼ認識領域をはじめとするアミノ酸のタグが付けられる。図３、パネルＣでは、組換えタンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４のチャートを示す。
【００３９】
組換えタンパク質を原核生物系において発現させるために、大腸菌のRosetta(DE3)pLysS細胞株（Novagen）をプラスミドｐＲＣ１０で製造業者の指示に従って形質転換した。プラスミドｐＲＣ１０で形質転換された細胞をアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）およびクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ−寒天培地に播種し、３７℃にて一晩増殖させた。その翌日、プラークから６コロニーを選択し、同じ選択液体培地３ｍｌ中で３７℃にて一晩増殖させた。その翌日、培養物を同じ増殖培地で１：１０希釈し、Ａ６００が０．９ＯＤに達するまで同じ条件下に保った。その後、組換えタンパク質の発現を１ｍＭ ＩＰＴＧの存在下、２５０ｒｐｍおよび３７℃にて攪拌しながら４時間誘導した。最後に、細胞を３，５００×ｇにて１５分間の遠心分離により集めた。一度上清を除去したら、使用するまで沈殿物を−８０℃にて保存した。
【００４０】
組換えタンパク質の発現について特徴づけするため、前もって集めておいた細胞沈殿物を、Ｔｒｉｓ ２０ｍＭ ｐＨ７．９８中１×のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Novagen）と呼ばれる市販の溶菌液、濃度５ｍＬ／細胞沈殿物１ｇで溶解した。それらを、酵素ベンゾナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ， ｌＵ／ｍＬの１ｘＢｕｇｂｕｓｔｅｒ)の存在下、ゆっくりと攪拌しながらおよび室温で４０分間インキュベートした。次いで、関連タンパク質が存在する場所を証明するために、沈殿物から封入体が存在する可溶性画分を２０，０００×ｇにて１５分間の遠心分離により分離した。封入体はさらに、製造業者の指示に従って洗浄した。最後に、５０μＬ／最初の培養物１ｍＬの割合のローディングバッファーＬａｅｍｍｌｉ １×(Laemmli 1970. Nature 227, 680-685)に溶かしたタンパク質を、１５％アクリルアミド／ＤＡＤＴゲル中、変性条件下での電気泳動により分離した（図５）。タンパク質は、誘導前（図５，レーン１）および誘導後（図５，レーン２）に集めた菌の全抽出物両方と前もって集めておいた上清（図５，レーン３）および沈殿物（図５，レーン４）、さらに洗浄後の封入体（図５，レーン５）より分離した。その結果、大腸菌のRosetta(DE3)pLysS（Novagen）において推定される見かけの分子量が１７．２ｋＤａであり、封入体中に存在する組換えタンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４の発現が確認された。
【００４１】
実施例３：タンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４の免疫原性の判定
組換えタンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４の免疫原性をウエスタンブロットによりネオスポラ原虫に自然感染した動物ウシ由来の血清を用いて判定した（図６）。これらの血清の感染はこれまでＥＬＩＳＡ法や直接免疫蛍光測定法（ＩＦＡＴ）により特異的抗体の高力価によって診断されてきた。タンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４が存在する封入体に対し、０．１×ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ溶液を用いて製造業者の教示のとおり、３回洗浄を行った。次いで、タンパク質を変性条件下での電気泳動により１５％アクリルアミド−ＤＡＴＤゲルで分離し、最後に、予冷転写バッファー（Ｔｒｉｓ ２５ｍＭ、グリシン １９２ｍＭ ｐＨ８．５および２０％メタノール）に浸漬した０．２μｍニトロセルロース膜(Bio.rad)への電気転写を４００ｍＡにて１時間行った。使用したウシ血清は異なる起源のものとした。その意味で、血清は慢性感染症が確立している可能性が高い動物由来のものであり、その血清にはブラディゾイトが出現しており（例えば、先天性感染を受けて生まれた動物由来のものまたは妊娠末期に流産した胎児の体液）、初乳前血清反応陽性を示す。もう一方で、流産しかけている雌ウシ由来の血清を使用して、流産に至らしめるネオスポラ原虫感染の再活性化の可能性を示した。さらに、３頭の子ウシの初乳前血清（ＩＦＡＴではネオスポラ原虫に対して高力価を有する）を使用した（図６，パネルＡおよびＢ，レーン１、２および３）。さらに、腹水（ＩＦＡＴではネオスポラ原虫に対して抗体高力価を有する）、妊娠の第２（図６，パネルＡおよびＢ，レーン４）および第３四半期（図６，パネルＡおよびＢ，レーン５および６）に流産した胎児由来のもの、ネオスポラ原虫に対して血清反応陽性の流産した雌ウシ由来のもの（図６，パネルＡおよびＢ，レーン７および８）を使用した。最後に、流産した他の２頭の雌ウシ由来の血清（ＩＦＡＴではネオスポラ原虫に対して血清反応陽性であり、抗体高力価を有する）を使用した（図６，パネルＡおよびＢ，レーン９および１０）。
【００４２】
技術の対照として、ウエスタンブロットを、同じ血清を用い、in vitroで得られたネオスポラ原虫タキゾイト由来の可溶性抽出物を転写した膜で同じ血清と並行して行った。可溶性抽出物を得るため、またウエスタンブロットを実施するため、上述のプロトコールに基本的には従った(Alvarez et al. 2002. Vet. Parasitol. 107, 17-27)。膜を０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）中３％ＢＳＡでブロックし、室温にて１時間攪拌した。次いで、その膜を３７℃で攪拌しながら、ウシ由来の血清（０．３％ＢＳＡ含有ＴＢＳ−Ｔにより１：２０希釈）とともに２時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔで３回迅速に洗浄した（１５分を１回と５分を２回）後、膜を３７℃で攪拌しながら、ペルオキシダーゼ結合抗ウシＩｇＧのマウスモノクローナル抗体（Hipra）（０．３％ＢＳＡ含有ＴＢＳ−Ｔにより希釈１：２００）とともに１時間インキュベートした。上記条件下でさらに一連の洗浄を行った後、使用直前に調製した基質溶液（２０ｍｌのメタノール、１００ｍｌのＴＢＳおよび０．０６０ｍｌの過酸化水素に溶かした６０ｍｇの４−クロロ−１−ナフトール(4-chloro-1-naphtol)）により、暗所でおよび攪拌下、室温にて１５分間発色させた。
【００４３】
ウエスタンブロットによりネオスポラ原虫による先天性感染を受けた(infected congenially)子ウシ由来の初乳前血清（図６，パネルＡ，レーン１、２および３）において、また妊娠の最後の３分の１で流産した胎児の腹水（図６，パネルＡ，レーン６）において組換えタンパク質に対する明瞭な応答が検出された。これらの動物では、流産した胎児のもの２つを除き（図６，パネルＢ，レーン４および５）、タキゾイト期の免疫優勢抗原に対しての明瞭な応答が認められた（図６，パネルＢ，レーン１〜３および６）。しかしながら、流産した雌ウシでは、明瞭な応答が検出されなかった（図６，パネルＡ，レーン７〜１０）が、タキゾイト期の免疫優勢抗原に対する明瞭な応答があった（図６，パネルＢ，レーン７〜１０）。
【００４４】
これらの結果から、自然感染した動物ではタンパク質ＮｃＳＡＧ４に対する応答が存在することが確認されるため、慢性型の感染が確立されているかもしれない場合、すなわち、タキゾイトからブラディゾイトへの転換が起こる場合には、トキソプラズマ原虫におけるその相同物（ＴｇＳＡＧ４）と同様に、寄生生物のこの緩増期のタンパク質ＮｃＳＡＧ４の特異性も確認される。タキゾイト期が特徴である急性感染症の動物ではｐＲＮｃＳＡＧ４に対する応答はないが、タキゾイト抽出物に対する明瞭な応答を示すことから、ブラディゾイト期のタンパク質ＮｃＳＡＧ４の特異性も確認される。
【００４５】
実施例４：ＲＴ−ＰＣＲによるネオスポラ原虫ブラディゾイト期におけるＮｃＳＡＧ４遺伝子の転写の判定
ネオスポラ原虫のＮｃＳＡＧ４遺伝子の転写の期特異性を証明するため、in vitroで培養したブラディゾイトから抽出される全ＲＮＡから行うＲＴ−ＰＣＲを開発した。細胞培養物においてブラディゾイトを生産するため、Risco-Castillo et al. (2003) J. Parasitol, 刊行物に掲載)により記載された方法に従った。これに関し、ネオスポラ原虫のタキゾイトを宿主−寄生生物比２：１で使用して(Barber et al. 1995. Parasitol. 111, 563-568)、ＭＡＲＣ−１４５細胞の単層を感染させた(Kim et al. 1993. Arch. Virol. 133, 477-483)。感染した細胞の培養物をＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．２）１５ｍＭ、グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１０Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１０μｇ／ｍＬ）、ファンギゾン（２５ｎｇ／ｍＬ）の存在下、１０％ウシ胎児血清を補給したＤＭＥＭ中で維持し、３７℃および５％ＣＯ２にてインキュベートした。
【００４６】
期転換を誘導するため、感染後、感染した培養物を濃度、培養培地中７０μＭのナトリウムニトロプルシエート(sodium nitroprusiate)（ＳＮＰ）で７日間処理し、２日おきに補充した。陰性対照として、タキゾイトの生産のためＳＮＰでは処理しない感染培養物を維持した。タキゾイトとブラディゾイトの混合物は、感染細胞の単層をかき取って集め、ＳＮＰで処理し、４℃にて１５分間、１３５０×ｇにて遠心分離した。ＳＮＰでは処理していない感染培養物で生産されたタキゾイトを同じ手順で集めた。同じ条件下、ＰＢＳで２回洗浄した後、２５Ｇニードルを用いてゾイトを再懸濁し、細胞屑を除去するためにセファデックス（商標）カラム（PD-10, Amersham Biosciences）を用いて精製した。これに関し、５ｍｌのＰＢＳでカラムを平衡化した後、ゾイトの懸濁液を５ｍｌのＰＢＳにより重力によって流した。同量のＰＢＳで２回洗浄した後、ゾイトを４℃にて１５分間、１３５０×ｇにて遠心分離することにより集めた。集めたゾイトは使用するまで−８０℃にて冷凍保存した。
【００４７】
全ＲＮＡの抽出では、上述のように生成した１０７タキゾイトの沈殿物またはタキゾイトとブラディゾイトの混合物を使用した。これに関し、市販のキットNucleoSpin RNA II（BD Biosciences Clontech）を製造業者の教示に従って使用した。得られた全ＲＮＡを、その特性を調べるため１×ＴＡＥバッファーの０．８％アガロースゲルでの電気泳動により分離した。
【００４８】
１つの試験管でＲＴ−ＰＣＲを行うため、各起源、タキゾイトまたはブラディゾイトの全ＲＮＡ １００ｎｇを使用し、“Quiagen（商標）One-step RT-PCR kit”(Qiagen)と呼ばれる市販のキットを製造業者の指示に従って使用した（図７）。これに関し、ＩＲ５ＳＡＧ４（配列番号５）および１Ｆ３ＳＡＧ４（配列番号７）と呼ばれるオリゴヌクレオチドを使用した。ＲＴは５０℃にて３０分間行った。ＰＣＲ条件は、変性９５℃にて１５分、続いて９４℃にて３０秒、６１℃にて１分、７２℃にて１分を４０サイクル、最後に伸長７２℃にて１０分とした。ＰＣＲ産物を０．５×ＴＢＥバッファーの３％高分解能アガロースゲルに流し、臭化エチジウム（ＢｒＥｔ）で染色した。ＲＴ−ＰＣＲの結果として、タキゾイトではＮｃＳＡＧ４のＲＮＡメッセンジャー（ｍＲＮＡ）の転写はなく（図７，レーン２）、ブラディゾイトでは上記ｍＲＮＡが存在している（図７，レーン３）ことが確認された。ＰＣＲの陽性対照として、ネオスポラ原虫タキゾイトから得られたゲノムＤＮＡ １００ｎｇを使用し（図７，レーン４）、ＰＣＲの陰性対照として、サンプルの代わりに超純水を使用した（図７，レーン１）。このことから、トキソプラズマ原虫のその相同なＴｇＳＡＧ４と同様に、ネオスポラ原虫ブラディゾイト期のＮｃＳＡＧ４遺伝子の転写の特異性が確認される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】この報告の実施例１において説明される、ネオスポラ原虫ゲノムの配列Ｎｃ１７５およびＮｃ３１２の増幅を示す。
【図２】この報告の実施例１において説明される、ゲノムウォーキングのスキームを示す。
【図３】この報告の実施例２において説明される、発現プラスミド、パネルＡ．ＰｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ．パネルＢ：ｐＲＳＥＴへの遺伝子ＮｃＳＡＧ４の挿入と、この報告の実施例２において説明される、組換えタンパク質、ｐＲＮｃＳＡＧ４のスキーム（パネルＣ）を示す。
【図４】この報告の実施例２において説明される、制限酵素での消化による組換えプラスミドの選択を示す。 ここで、ＷＭは「分子量標準、low range(Bio Rad)」である。
【図５】この報告の実施例２において説明される、大腸菌における組換えタンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４の発現である。
【図６】この報告の実施例３において説明される、組換えタンパク質ｐＲＮｃＳＡＧ４の免疫原性の特徴づけである。
【図７】この報告の実施例４において説明される、ＲＴ−ＰＣＲによるネオスポラ原虫ブラディゾイト期の遺伝子ＮｃＳＡＧ４の転写の検出である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネオスポラ原虫（Neospora caninum）から単離され、かつ、ＮｃＳＡＧ４遺伝子に相当する、配列番号９によって示される６０１個のヌクレオチドからなる、ポリヌクレオチド分子であって、
１７３個のアミノ酸からなる抗原タンパク質ＮｃＳＡＧ４をコードし、かつ、配列番号１０によって示される、５２２個のヌクレオチドからなるＯＲＦを含んでなる、ポリヌクレオチド分子。
【請求項２】
請求項１に記載のＮｃＳＡＧ４遺伝子のＯＲＦの配列を含んでなる、ポリヌクレオチド分子であって、
配列番号１１および配列番号１２よってそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドＦＮｃＳＡＧ４およびＲｅＮｃＳＡＧ４を用いたＰＣＲによって増幅され、その増幅物の挿入によって発現ベクター、好ましくはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−Ｈｉｓ−Ｃ（Invitrogen）、に含まれてなる、ポリヌクレオチド分子。
【請求項３】
請求項１に記載の遺伝子ＮｃＳＡＧ４のＯＲＦのヌクレオチド８３〜４４４を含む配列を含んでなる、ポリヌクレオチド分子であって、
配列番号１３および配列番号１４よってそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドＦ８５ＮｃＳＡＧ４およびＲｅ４４４ＮｃＳＡＧ４を用いたＰＣＲによって増幅され、その増幅物の挿入によって発現ベクター、好ましくはプラスミドｐＲＳＥＴ−Ｃ、に含まれてなる、ポリヌクレオチド分子。
【請求項４】
請求項１に記載の遺伝子の任意の断片を含む配列、またはこの配列を変化させる化学的、物理的、酵素もしくは他の任意の修飾によって生じる配列を含んでなる、ポリヌクレオチド分子であって、
任意の組換えベクターに含まれてなる、ポリヌクレオチド分子。
【請求項５】
ＰＣＲもしくはＲＴ−ＰＣＲによるネオスポラ原虫の検出にＤＮＡプローブとして使用するための、または請求項１に記載の配列の任意の断片のＰＣＲによる増幅のための、配列番号２、３、４、５、６、７、８、１１、１２、１３および１４によって示されるオリゴヌクレオチドである、ＳＡＧ４−２、ＳＡＧ４−３、ＳＡＧ４−４、１Ｒ５ＳＡＧ４、２Ｒ５ＳＡＧ４、１Ｆ３ＳＡＧ４および２Ｆ３ＳＡＧ４、ＦＮｃＳＡＧ４、ＲｅＮｃＳＡＧ４、Ｆ８５ＮｃＳＡＧ４、Ｒｅ４４４ＮｃＳＡＧ４の使用。
【請求項６】
請求項１〜４に記載の配列番号９のヌクレオチド配列を含んでなる、組換えベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えベクターを用いてトランスフェクトされた、宿主真核生物細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えベクターで形質転換された、宿主原核生物細胞。
【請求項９】
（ａ）請求項１に記載の、配列番号１０によって示されるネオスポラ原虫の抗原タンパク質ＮｃＳＡＧ４；
（ｂ）その化学的または酵素的変化物；
（ｃ）ネオスポラ原虫のタンパク質ＮｃＳＡＧ４の大部分からなるポリペプチドまたは化学的もしくは酵素的に修飾されたそのポリペプチド；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）のタンパク質またはポリペプチドを含む組換えタンパク質
から選択される、実質的に精製または単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
遺伝子ＮｃＳＡＧ４のプロモーターの使用であって、前記プロモーターを用いて調製した遺伝子構築物によってトランスフェクトされたネオスポラ原虫（Neospora caninum）の細胞において異種遺伝子を発現させるための、遺伝子ＮｃＳＡＧ４のプロモーターの使用。
【請求項１１】
寄生生物の核酸に基づく、ＤＮＡプローブを用いたＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ、in situ ハイブリダイゼーションまたは他の任意の検出法による、感染動物の組織または体液由来のネオスポラ原虫による慢性感染症の診断のための、請求項１〜５に記載のポリヌクレオチド分子の使用。
【請求項１２】
該ポリペプチドの抗原性に基づく、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫ブロット法または他の任意の方法による、ネオスポラ原虫による慢性感染症の血清学的診断のための、請求項９に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１３】
競合ＥＬＩＳＡによる、ネオスポラ原虫による慢性感染症の診断のための、請求項９に記載のポリペプチドに対するモノクローナル抗体または特異的ポリクローナル血清の使用。
【請求項１４】
請求項９に記載のポリペプチドに対するモノクローナル抗体または特異的ポリクローナル血清の使用であって、
該血清による寄生生物の検出に基づく、免疫組織化学、免疫蛍光測定法または他の任意の方法による、動物の組織におけるネオスポラ原虫による慢性感染症の診断のための、使用。
【請求項１５】
ネオスポラ病に対するワクチンとして製剤された、
（ａ）請求項９に記載のポリペプチド；
（ｂ）請求項１〜４に記載のポリヌクレオチド分子；
（ｃ）請求項６に記載の組換えベクター；
（ｄ）請求項７に記載のトランスフェクトされた宿主細胞；または
（ｅ）請求項８に記載の形質転換された宿主細胞
を含んでなる、免疫原性組成物。
【請求項１６】
アジュバントまたは１種もしくは数種のサイトカインを含んでなる、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
ネオスポラ病に対するワクチンとして製剤された、
（ａ）請求項９に記載のポリペプチド；
（ｂ）請求項９に記載のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド分子；
（ｃ）請求項６に記載の組換えベクター；
（ｄ）請求項７に記載のトランスフェクトされた宿主細胞；
（ｅ）請求項８に記載の形質転換された宿主細胞
を組合せることを含んでなる、免疫原性組成物の調製法。
【請求項１８】
請求項１５、１６および１７に記載のワクチンとして製剤された免疫原性組成物の入った容器を含んでなる、哺乳動物用ネオスポラ病ワクチン接種キット。
【請求項１】
ネオスポラ原虫（Neospora caninum）から単離され、かつ、ＮｃＳＡＧ４遺伝子に相当する、配列番号９によって示される６０１個のヌクレオチドからなる、ポリヌクレオチド分子であって、
１７３個のアミノ酸からなる抗原タンパク質ＮｃＳＡＧ４をコードし、かつ、配列番号１０によって示される、５２２個のヌクレオチドからなるＯＲＦを含んでなる、ポリヌクレオチド分子。
【請求項２】
請求項１に記載のＮｃＳＡＧ４遺伝子のＯＲＦの配列を含んでなる、ポリヌクレオチド分子であって、
配列番号１１および配列番号１２よってそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドＦＮｃＳＡＧ４およびＲｅＮｃＳＡＧ４を用いたＰＣＲによって増幅され、その増幅物の挿入によって発現ベクター、好ましくはプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−Ｈｉｓ−Ｃ（Invitrogen）、に含まれてなる、ポリヌクレオチド分子。
【請求項３】
請求項１に記載の遺伝子ＮｃＳＡＧ４のＯＲＦのヌクレオチド８３〜４４４を含む配列を含んでなる、ポリヌクレオチド分子であって、
配列番号１３および配列番号１４よってそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドＦ８５ＮｃＳＡＧ４およびＲｅ４４４ＮｃＳＡＧ４を用いたＰＣＲによって増幅され、その増幅物の挿入によって発現ベクター、好ましくはプラスミドｐＲＳＥＴ−Ｃ、に含まれてなる、ポリヌクレオチド分子。
【請求項４】
請求項１に記載の遺伝子の任意の断片を含む配列、またはこの配列を変化させる化学的、物理的、酵素もしくは他の任意の修飾によって生じる配列を含んでなる、ポリヌクレオチド分子であって、
任意の組換えベクターに含まれてなる、ポリヌクレオチド分子。
【請求項５】
ＰＣＲもしくはＲＴ−ＰＣＲによるネオスポラ原虫の検出にＤＮＡプローブとして使用するための、または請求項１に記載の配列の任意の断片のＰＣＲによる増幅のための、配列番号２、３、４、５、６、７、８、１１、１２、１３および１４によって示されるオリゴヌクレオチドである、ＳＡＧ４−２、ＳＡＧ４−３、ＳＡＧ４−４、１Ｒ５ＳＡＧ４、２Ｒ５ＳＡＧ４、１Ｆ３ＳＡＧ４および２Ｆ３ＳＡＧ４、ＦＮｃＳＡＧ４、ＲｅＮｃＳＡＧ４、Ｆ８５ＮｃＳＡＧ４、Ｒｅ４４４ＮｃＳＡＧ４の使用。
【請求項６】
請求項１〜４に記載の配列番号９のヌクレオチド配列を含んでなる、組換えベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えベクターを用いてトランスフェクトされた、宿主真核生物細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えベクターで形質転換された、宿主原核生物細胞。
【請求項９】
（ａ）請求項１に記載の、配列番号１０によって示されるネオスポラ原虫の抗原タンパク質ＮｃＳＡＧ４；
（ｂ）その化学的または酵素的変化物；
（ｃ）ネオスポラ原虫のタンパク質ＮｃＳＡＧ４の大部分からなるポリペプチドまたは化学的もしくは酵素的に修飾されたそのポリペプチド；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）のタンパク質またはポリペプチドを含む組換えタンパク質
から選択される、実質的に精製または単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
遺伝子ＮｃＳＡＧ４のプロモーターの使用であって、前記プロモーターを用いて調製した遺伝子構築物によってトランスフェクトされたネオスポラ原虫（Neospora caninum）の細胞において異種遺伝子を発現させるための、遺伝子ＮｃＳＡＧ４のプロモーターの使用。
【請求項１１】
寄生生物の核酸に基づく、ＤＮＡプローブを用いたＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ、in situ ハイブリダイゼーションまたは他の任意の検出法による、感染動物の組織または体液由来のネオスポラ原虫による慢性感染症の診断のための、請求項１〜５に記載のポリヌクレオチド分子の使用。
【請求項１２】
該ポリペプチドの抗原性に基づく、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫ブロット法または他の任意の方法による、ネオスポラ原虫による慢性感染症の血清学的診断のための、請求項９に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１３】
競合ＥＬＩＳＡによる、ネオスポラ原虫による慢性感染症の診断のための、請求項９に記載のポリペプチドに対するモノクローナル抗体または特異的ポリクローナル血清の使用。
【請求項１４】
請求項９に記載のポリペプチドに対するモノクローナル抗体または特異的ポリクローナル血清の使用であって、
該血清による寄生生物の検出に基づく、免疫組織化学、免疫蛍光測定法または他の任意の方法による、動物の組織におけるネオスポラ原虫による慢性感染症の診断のための、使用。
【請求項１５】
ネオスポラ病に対するワクチンとして製剤された、
（ａ）請求項９に記載のポリペプチド；
（ｂ）請求項１〜４に記載のポリヌクレオチド分子；
（ｃ）請求項６に記載の組換えベクター；
（ｄ）請求項７に記載のトランスフェクトされた宿主細胞；または
（ｅ）請求項８に記載の形質転換された宿主細胞
を含んでなる、免疫原性組成物。
【請求項１６】
アジュバントまたは１種もしくは数種のサイトカインを含んでなる、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
ネオスポラ病に対するワクチンとして製剤された、
（ａ）請求項９に記載のポリペプチド；
（ｂ）請求項９に記載のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド分子；
（ｃ）請求項６に記載の組換えベクター；
（ｄ）請求項７に記載のトランスフェクトされた宿主細胞；
（ｅ）請求項８に記載の形質転換された宿主細胞
を組合せることを含んでなる、免疫原性組成物の調製法。
【請求項１８】
請求項１５、１６および１７に記載のワクチンとして製剤された免疫原性組成物の入った容器を含んでなる、哺乳動物用ネオスポラ病ワクチン接種キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００７−５１６７０５（Ｐ２００７−５１６７０５Ａ）
【公表日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４１９６２（Ｐ２００６−５４１９６２）
【出願日】平成１６年１１月２６日（２００４．１１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００４／０００５２９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５３５０５
【国際公開日】平成１７年６月１６日（２００５．６．１６）
【出願人】（５００４６４７１３）ウニベルシダッド・コンプルテンセ・デ・マドリッド (5)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＤＡＤ ＣＯＭＰＬＵＴＥＮＳＥ ＤＥ ＭＡＤＲＩＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月２６日（２００４．１１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００４／０００５２９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５３５０５
【国際公開日】平成１７年６月１６日（２００５．６．１６）
【出願人】（５００４６４７１３）ウニベルシダッド・コンプルテンセ・デ・マドリッド (5)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＤＡＤ ＣＯＭＰＬＵＴＥＮＳＥ ＤＥ ＭＡＤＲＩＤ
【Ｆターム（参考）】
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