ＲＮＡへの選択的な５’ライゲーションによるタグの付加
本発明は、５’末端の特定の化学的な部分が異なる所望のクラスのＲＮＡ分子に選択的に５’ライゲーションによりタグを付加するための、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ、キャッピング酵素、デキャッピング酵素、核酸に対するピロホスファターゼおよびＲＮＡリガーゼ、ならびに他の酵素を使用する新規な組成物、キットおよび方法を提供する。５’にタグが付加されたＲＮＡ分子は、種々の用途に使用するタグが付加された第一鎖ｃＤＮＡ、二本鎖ｃＤＮＡ、およびセンスＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを合成するために用いることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加するための方法であって、
（ｉ）５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡを含有しているサンプルであって、５’一リン酸基を有するＲＮＡおよび／またはキャッピングされたＲＮＡおよび／または５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡをさらに含有していることを含んでいるサンプル、
（ｉｉ）ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ、
（ｉｉｉ）タグを示すアクセプタのオリゴヌクレオチド、および
（ｉｖ）ＲＮＡリガーゼ
を提供する工程（Ａ）、
該５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、該サンプルを該ＲＮＡ５’ポリホスファターゼと接触させる工程（Ｂ）、ならびに
該アクセプタのオリゴヌクレオチドの３’末端が、キャッピングされたＲＮＡではなく、該５’一リン酸基を有するＲＮＡに連結されて、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｂ）からのサンプルを該アクセプタのオリゴヌクレオチドおよび該ＲＮＡリガーゼと接触させる工程（Ｃ）
を包含している、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記工程（Ａ）にて提供されたサンプルが５’一リン酸基を有するＲＮＡをさらに含有しているが、前記アクセプタのオリゴヌクレオチドは、前記工程（Ｂ）にて前記５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡから変換された５’一リン酸基を有するＲＮＡにのみ連結され、工程（Ａ）にて提供されたサンプル中に既に存在する該５’一リン酸基を有するＲＮＡには連結されない、方法であり、
ＲＮＡ５’モノホスファターゼを提供するサブ工程、
該サンプル中の該５’一リン酸基を有するＲＮＡが５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、該サンプルを該ＲＮＡ５’モノホスファターゼと工程（Ｂ）の前に接触させるサブ工程、ならびに
該ＲＮＡ５’モノホスファターゼを不活性化または除去するサブ工程
をさらに包含している、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、
前記サンプル中のキャッピングされたＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加する工程をさらに包含しており、
核酸に対するピロホスファターゼまたはデキャッピング酵素を提供するサブ工程、ならびに
該サンプル中の該キャッピングされたＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換され、これによって、前記工程（Ａ）にて提供されたサンプル中に含有されているキャッピングされたＲＮＡにも前記工程（Ｃ）にて５’ライゲーションによりタグが付加される条件で十分な時間にわたって、前記工程（Ｂ）からのサンプルを該核酸に対するピロホスファターゼまたは該デキャッピング酵素と工程（Ｃ）の前に接触させるサブ工程
をさらに包含している、方法。
【請求項４】
サンプル中のキャッピングされたＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加するための方法であって、
（ｉ）キャッピングされたＲＮＡを含有しており、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡおよび／または５’一リン酸基を有するＲＮＡ、および／または５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡを必要に応じて含有しているサンプル、
（ｉｉ）ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ、
（ｉｉｉ）ＲＮＡ５’モノホスファターゼ、
（ｉｖ）核酸に対するピロホスファターゼまたはデキャッピング酵素、
（ｖ）アクセプタのオリゴヌクレオチド、および
（ｖｉ）ＲＮＡリガーゼ
を提供する工程（Ａ）、
該５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、該サンプルを該ＲＮＡ５’ポリホスファターゼと接触させる工程（Ｂ）、
該５’一リン酸基を有するＲＮＡが５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｂ）からのサンプルを該ＲＮＡ５’モノホスファターゼと接触させる工程（Ｃ）、
該ＲＮＡ５’モノホスファターゼを不活性化または除去する工程（Ｄ）、
工程（Ｄ）の後のサンプル中の該キャッピングされたＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｄ）の後のサンプルを該核酸に対するピロホスファターゼまたは該デキャッピング酵素と接触させる工程（Ｅ）、ならびに
該アクセプタのオリゴヌクレオチドの３’末端が、工程（Ｅ）にて生成された５’一リン酸基を有するＲＮＡの５’末端に連結され、工程（Ｂ）にて５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡから変換された５’一リン酸基を有するＲＮＡまたは工程（Ａ）にて提供されたサンプル中に既に存在する５’一リン酸基を有するＲＮＡには連結されずに、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡがキャッピングされたＲＮＡから生成される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｅ）からのサンプルを該アクセプタのオリゴヌクレオチドおよび該ＲＮＡリガーゼと接触させる工程（Ｆ）
を包含している、方法。
【請求項５】
キャッピングされたＲＮＡおよび／または５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加するための方法であって、
（ｉ）キャッピングされたＲＮＡおよび／または５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡを含有しているサンプル、
（ｉｉ）核酸に対するピロホスファターゼ、
（ｉｉｉ）アクセプタのオリゴヌクレオチド、および
（ｉｖ）ＲＮＡリガーゼ
を提供する工程（Ａ）、
該キャッピングされたＲＮＡおよび該５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、アルカリホスファターゼと接触されていない該サンプルを該核酸に対するピロホスファターゼと接触させる工程（Ｂ）、ならびに
該アクセプタのオリゴヌクレオチドの３’末端が、該５’一リン酸基を有するＲＮＡの５’末端に連結されて、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｂ）からのサンプルを該アクセプタのオリゴヌクレオチドおよび該ＲＮＡリガーゼと接触させる工程（Ｃ）
を包含している、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、
前記工程（Ａ）にて提供されたサンプルが５’一リン酸基を有するＲＮＡをさらに含有しているが、前記アクセプタのオリゴヌクレオチドが、前記工程（Ｂ）にて、前記キャッピングされたＲＮＡから、および／または前記５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡから、変換された５’一リン酸基を有するＲＮＡにのみ連結され、該工程（Ａ）にて提供されたサンプル中に既に存在する該５’一リン酸基を有するＲＮＡには連結されない、方法であり、
ＲＮＡ５’モノホスファターゼを提供するサブ工程、
該サンプル中の該５’一リン酸基を有するＲＮＡが５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、該サンプルを該ＲＮＡ５’モノホスファターゼと工程（Ｂ）の前に接触させるサブ工程、ならびに
該ＲＮＡ５’モノホスファターゼを不活性化または除去するサブ工程
をさらに包含している、方法。
【請求項７】
サンプル中の５’一リン酸基を有するＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加することなく、該サンプル中の５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加するための方法であって、
（ｉ）５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡおよび５’一リン酸基を有するＲＮＡを含有しているサンプル、
（ｉｉ）キャッピング酵素、
（ｉｉｉ）ＲＮＡ５’モノホスファターゼまたはアルカリホスファターゼ、
（ｉｖ）核酸に対するピロホスファターゼまたはデキャッピング酵素、
（ｖ）アクセプタのオリゴヌクレオチド、ならびに
（ｖｉ）ＲＮＡリガーゼ
を提供する工程（Ａ）、
該５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡがキャッピングされたＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、該サンプルを該キャッピング酵素と接触させる工程（Ｂ）、
５’一リン酸基を有するＲＮＡが５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｂ）からのサンプルを該ＲＮＡ５’モノホスファターゼまたは該アルカリホスファターゼと接触させる工程（Ｃ）、
工程（Ｃ）にて用いたＲＮＡ５’モノホスファターゼまたはアルカリホスファターゼを不活性化または除去する工程（Ｄ）、
該キャッピングされたＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｄ）の後のサンプルを該核酸に対するピロホスファターゼまたは該デキャッピング酵素と接触させる工程（Ｅ）、ならびに
該アクセプタのオリゴヌクレオチドの３’末端が、該５’一リン酸基を有するＲＮＡの５’末端に連結されて、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｅ）からのサンプルを該アクセプタのオリゴヌクレオチドおよび該ＲＮＡリガーゼと接触させる工程（Ｆ）
を包含している、方法。
【請求項８】
前記工程（Ａ）にて提供されたサンプルが、キャッピングされたＲＮＡをさらに含有しており、
前記５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが、工程（Ａ）のサンプルに提供された該キャッピングされたＲＮＡ、および前記工程（Ｂ）にてキャッピングされた、サンプル中の前記５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡの両方から生成される、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
サンプル中の５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加することなく、サンプル中のキャッピングされたＲＮＡおよび５’一リン酸基を有するＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加するための方法であって、
（ｉ）キャッピングされたＲＮＡ、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡおよび５’一リン酸基を有するＲＮＡを少なくとも含有しているサンプル、
（ｉｉ）デキャッピング酵素、
（ｉｉｉ）アクセプタのオリゴヌクレオチド、および
（ｉｖ）ＲＮＡリガーゼ
を提供する工程（Ａ）、
該キャッピングされたＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、該サンプルを該デキャッピング酵素と接触させる工程（Ｂ）、ならびに
該アクセプタのオリゴヌクレオチドの３’末端が該５’一リン酸基を有するＲＮＡの５’末端に連結されて、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｂ）からのサンプルを該アクセプタのオリゴヌクレオチドおよび該ＲＮＡリガーゼと接触させる工程（Ｃ）
を包含している、方法。
【請求項１０】
５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡまたは５’一リン酸基を有するＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加することなく、サンプル中のキャッピングされたＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加するための方法であって、
（ｉ）キャッピングされたＲＮＡ、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡ、５’一リン酸基を有するＲＮＡ、および／または５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡを含有しているサンプル、
（ｉｉ）ＲＮＡ５’モノホスファターゼまたはアルカリホスファターゼ、
（ｉｉｉ）デキャッピング酵素、
（ｉｖ）アクセプタのオリゴヌクレオチド、および
（ｖ）ＲＮＡリガーゼ
を提供する工程（Ａ）、
該ＲＮＡ５’モノホスファターゼまたは該アルカリホスファターゼが活性化され、ＲＮＡ５’モノホスファターゼまたはアルカリホスファターゼが触媒する反応が完了され得る条件で十分な時間にわたって、該サンプルをＲＮＡ５’モノホスファターゼまたはアルカリホスファターゼと接触させる工程（Ｂ）
工程（Ｂ）にて用いたＲＮＡ５’モノホスファターゼまたはアルカリホスファターゼを不活性化または除去する工程（Ｃ）、
該キャッピングされたＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｃ）からのサンプルを該デキャッピング酵素と接触させる工程（Ｄ）、
該アクセプタのオリゴヌクレオチドの３’末端が、工程（Ｄ）にて、該キャッピングされたＲＮＡから生成された該５’一リン酸基を有するＲＮＡの５’末端に連結されて、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｄ）からのサンプルを該アクセプタのオリゴヌクレオチドおよび該ＲＮＡリガーゼと接触させる工程（Ｅ）
を包含している、方法。
【請求項１１】
ポリＡポリメラーゼおよびＡＴＰを提供する工程、ならびに
ポリ（Ａ）テールが前記サンプル中のＲＮＡ分子の３’末端に付加されて、ポリ（Ａ）テールを有するＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、該サンプルを該ポリＡポリメラーゼおよび該ＡＴＰと接触させる工程
をさらに包含している、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、
前記サンプルが、第１のタイプの細胞、第１の状態の細胞、または第１の環境からの細胞に由来するＲＮＡを含有している第１のサンプルを含んでおり、
該第１のサンプルから生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡから、第２のタイプの細胞、第２の状態の細胞、または第２の環境からの細胞に由来する第２のサンプル中にも存在するＲＮＡを除き、これにより、第１のサンプル中のみに存在するが、第２のサンプル中には存在しないＲＮＡに由来する５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ分子の集団を生成することをさらに包含している、方法であり、
第１のサンプルから生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、および第２のタイプの細胞、第２の条件の細胞、または第２の環境からの細胞に由来するＲＮＡを含有している第２のサンプルを提供する工程（ｉ）、
第２のサンプル中のＲＮＡを逆転写することによって第一鎖ｃＤＮＡを調製する工程（ｉｉ）、
第１のサンプルから生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡと第２のサンプルからのＲＮＡから調製された第一鎖ｃＤＮＡとの間に、ハイブリダイズした複合体が形成される条件で十分な時間にわたって、第１のサンプルから生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを第２のサンプルからのＲＮＡから調製された第一鎖ｃＤＮＡとアニールさせる工程（ｉｉｉ）、ならびに、
該ｃＤＮＡがアニールしたＲＮＡが消化され、第１のサンプル中にのみ存在するが、第２のサンプル中には存在しないＲＮＡに由来する５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡからなる、除かれた５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、ハイブリダイズした複合体をＲＮａｓｅＨによって処理する工程（ｉｖ）
を包含している方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、
前記第１のサンプル中のＲＮＡから前記５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを生成するために前記工程（Ａ）にて提供された前記アクセプタのオリゴヌクレオチドが、親和性分子を含んでおり、
該親和性分子に結合可能な親和性に基づき結合する物質が付着している固体表面を提供する工程、ならびに
該第１のサンプルからの該５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが、該親和性に基づき結合する物質が付着している固体表面に結合されて、第１のサンプル中のＲＮＡに由来する５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが該固体表面に捕捉される条件で十分な時間にわたって、第１のサンプルから生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを該固体表面と、前記工程（ｉｖ）の前または後のどちらか一方において接触させる工程
をさらに包含している、方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法であって、
前記５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡから第一鎖ｃＤＮＡを合成する工程をさらに包含している、方法であり、
ＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼを提供する工程、および
５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡに対して相補的な第一鎖ｃＤＮＡが合成される条件で十分な時間にわたって、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡをＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼと接触させる工程
をさらに包含しており、
５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡに対して相補的な、第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーを提供する工程、ならびに
５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡに対して相補的なｃＤＮＡが合成される条件で十分な時間にわたって、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーおよびＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼと接触させる工程をさらに包含していることを含んでおり、
例えば、該第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーが配列を含んでおり、該配列の少なくとも３’末端は、
（１）インビボにおける細胞またはインビトロのどちらかにおいて、前記サンプル中のＲＮＡの３’末端または５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡの３’末端に転写後に付加されたホモポリマーの配列に対して相補的な配列、
（２）１つ以上のＲＮＡ分子の３’末端における公知の配列に対して相補的な配列、
（３）１つ以上のＲＮＡ分子の１つ以上の内部配列に対して相補的な配列、
（４）全ての可能な配列の集合であって、各配列がランダムである集合、
（５）ポリ（Ａ）テールに対して相補的な配列であって、
該ポリ（Ａ）テールが、オリゴ（ｄＴ）ｎの配列、オリゴ（ｄＵ）ｎの配列、オリゴ（Ｕ）ｎの配列、オリゴ（ｄＴ）ｎＸのアンカー配列、オリゴ（ｄＵ）ｎＸのアンカー配列、およびオリゴ（Ｕ）ｎＸのアンカー配列の中から選択される、配列、ならびに、
（６）該サンプル中のＲＮＡの３’末端または５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡの３’末端に付加されたオリゴヌクレオチドのタグに対して相補的な配列、
からなる群より選択される配列を示し、ならびに／あるいは
該第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーが、特定の５’配列をさらに示し、
該特定の５’配列は、該第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーの３’末端に示される配列の５’であり、該特定の５’配列に対して相補的な特定の３’配列を示す第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのテンプレートとして機能することができ、該第二鎖ｃＤＮＡの特異的なプライミングのための部位を提供する、方法。
【請求項１５】
ＲＮａｓｅＨおよびＲＮａｓｅＩを提供する工程、ならびに
ＲＮＡが消化される条件で十分な時間にわたって、前記第一鎖ｃＤＮＡを含有しているサンプルをＲＮａｓｅＨおよびＲＮａｓｅＩと接触させる工程
をさらに包含している、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の方法であって、
ＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼを提供する工程、および
二本鎖ｃＤＮＡが合成される条件で十分な時間にわたって、前記第一鎖ｃＤＮＡをＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼと接触させる工程
をさらに包含している、方法であり、
前記工程（Ａ）にて提供された前記アクセプタのオリゴヌクレオチドに対して相補的な該第一鎖ｃＤＮＡの一部に対して相補的な第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーおよび該ＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼを提供する工程、ならびに、
二本鎖ｃＤＮＡが合成される条件で十分な時間にわたって、第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーおよびＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼを第一鎖ｃＤＮＡと接触させる工程をさらに包含していることを含んでおり、
ＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼが、第一鎖ｃＤＮＡを合成するために提供されたＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼと同一であるか、またはＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼが、第一鎖ｃＤＮＡを合成するために提供されたＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼと異なる、方法。
【請求項１７】
請求項１９に記載の方法であって、
前記アクセプタのオリゴヌクレオチドの５’部分、前記第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーの５’部分または前記第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーの５’部分が、ＲＮＡポリメラーゼ用の二本鎖プロモータの一鎖に関する配列を示し、
該ＲＮＡポリメラーゼ用の二本鎖プロモータを用いてＲＮＡを合成し得るＲＮＡポリメラーゼを提供する工程、および
ＲＮＡが合成される条件で十分な時間にわたって、前記二本鎖ｃＤＮＡを該ＲＮＡポリメラーゼと接触させる工程
をさらに包含しており、
該ＲＮＡポリメラーゼ用の二本鎖プロモータの一鎖に関する配列が、該アクセプタのオリゴヌクレオチド、該第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーまたは該第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーにおいて示される、方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法であって、
前記アクセプタのオリゴヌクレオチド、第一鎖ｃＤＮＡのプライマー、または第二鎖ｃＤＮＡのプライマーが、親和性分子を含んでいるか、または該親和性分子に連結されており、
該親和性分子に特異的に結合可能な親和性に基づき結合する物質によって共有結合的または非共有結合的にコーティングされた固体表面を提供する工程、ならびに、
該親和性分子が、該固体表面に連結された親和性に基づき結合する物質と結合される条件で十分な時間にわたって、該親和性分子に化学的に連結された、該アクセプタのオリゴヌクレオチド、該第一鎖ｃＤＮＡのプライマーまたは該第二鎖ｃＤＮＡのプライマーを、該アクセプタのオリゴヌクレオチド、該第一鎖ｃＤＮＡのプライマーまたは該第二鎖ｃＤＮＡのプライマーが関与する工程の前または後のどちらか一方において、接触させる工程
をさらに包含している、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、
合成された、前記５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、前記第一鎖ｃＤＮＡまたは前記第二鎖ｃＤＮＡのそれぞれが前記親和性分子を含んでおり、
該親和性分子を含んでいる、該５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、該第一鎖ｃＤＮＡまたは該第二鎖ｃＤＮＡが、該親和性分子を前記固定表面に結合されることによって捕捉、単離または精製される、方法であり、
該親和性分子を含んでいる、該５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、該第一鎖ｃＤＮＡまたは該第二鎖ｃＤＮＡを該固体表面と、該親和性分子と該固体表面に付着した前記親和性に基づき結合する物質との結合が促進される試薬の存在下および該結合が促進される条件において接触させて、該親和性分子を含んでいる、該５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、該第一鎖ｃＤＮＡまたは該第二鎖ｃＤＮＡを該表面に結合させ、これによって、該親和性分子を含んでいる、該５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、該第一鎖ｃＤＮＡまたは該第二鎖ｃＤＮＡを捕捉、単離または精製する工程を包含しており、
該親和性分子がビオチンであり、該親和性に基づき結合する物質がアビジンまたはストレプトアビジンであるか、該親和性分子がジゴキシゲニンであり、親和性に基づき結合する物質がジゴキシゲニンに特異的に結合する抗体であることを含んでいる、方法。
【請求項２０】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットであって、
ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ（ＲＰＰ）と、
ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（ＲＭＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）；核酸に対するピロホスファターゼ；デキャッピング酵素；キャッピング酵素；リガーゼ；アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド；ポリＡポリメラーゼ；ポリＵポリメラーゼ；ＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼ（ＲＴ）；第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマー；ＲＮａｓｅＨ；第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマー；ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）；５’エキソリボヌクレアーゼ（Ｘｒｎ）；ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）；および５’三リン酸基または５’二リン酸基を有するＲＮＡ分子であって、これらの基のβまたはγのリン酸が標識されているもの、からなる群より選択される少なくとも１つの他の成分と
を備えているか、あるいは
ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（ＲＭＰ）と、
ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、シュリンプのアルカリホスファターゼ、またはアークティックのアルカリホスファターゼ；核酸に対するピロホスファターゼ；デキャッピング酵素；キャッピング酵素；ＲＮＡリガーゼ；アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド；ポリＡポリメラーゼ；ＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼ（ＲＴ）；第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマー；ＲＮａｓｅＨ；第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマー；ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）；５’エキソリボヌクレアーゼ；ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）；および５’三リン酸基または５’二リン酸基を有するＲＮＡ分子であって、これらの基のβまたはγのリン酸が標識されているもの、からなる群より選択される少なくとも１つの他の成分とを備えており、
該ＲＰＰが、アルミニウム誘導性のＲＰＰ、E. coliのＲＰＰＩ、およびShigellaのＲＰＰＩの中から選択され、少なくとも１つの他の成分は、キットに備えられている場合、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ１（ＲＭＰ１）であるＲＭＰ；ＡＰＥＸ（登録商標）アルカリホスファターゼ、シュリンプのアルカリホスファターゼおよびアークティックのアルカリホスファターゼの中から選択されるＡＰ；タバコ酸性ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）である核酸に対するピロホスファターゼ；酵母のデキャッピング酵素、哺乳動物のデキャッピング酵素、Arabidopsis thalianaのデキャッピング酵素、ポックスウイルスのデキャッピング酵素およびワクシニアウイルスのデキャッピング酵素の中から選択されるデキャッピング酵素；ポックスウイルスのキャッピング酵素、Saccharomyces cerevisiaeのキャッピング酵素およびＳＣＲＩＰＴＣＡＰ（登録商標）キャッピング酵素の中から選択されるキャッピング酵素；Ｔ４ＲＮＡリガーゼおよびバクテリオファージＴＳ２１２６のＲＮＡリガーゼの中から選択されるＲＮＡリガーゼ；E. coliのポリＡポリメラーゼおよびSaccharomyces cerevisiaeのポリＡポリメラーゼの中から選択されるポリＡポリメラーゼ；ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＲＴ、ＡＭＶ ＲＴおよびＭＭＬＶ ＲＴの中から選択されるＲＴ；E. coliのＲＮａｓｅＨおよびＨＹＢＲＩＤＡＳＥ（登録商標）ＲＮａｓｅＨの中から選択されるＲＮａｓｅＨ；Ｔ７型のＲＮＡＰ、Ｔ７ＲＮＡＰ、Ｔ３ＲＮＡＰおよびＳＰ６ＲＮＡＰの中から選択されるＲＮＡＰ；ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（登録商標）５’−ホスフェート依存的エキソヌクレアーゼおよびSaccharomyces cerevisaeのＸｒｎＩエキソリボヌクレアーゼ（ＸｒｎＩ）の中から選択される５’エキソリボヌクレアーゼ；またはＴ４ＰＮＫであるＰＮＫ、からなる群より選択される、ことを含んでいる、
キット。
【請求項２１】
サンプル中の２’ＯＭｅ−ＲＮＡ分子の３’末端にポリ（Ａ）テールを付加するための方法であって、
２’−ＯＭｅ基は、該ＲＮＡ分子の３’末端のヌクレオチドに存在し、
少なくとも１つのモノヌクレオチド−５’−ホスフェート残基（５’−ＸＭＰ）が２’ＯＭｅ−ＲＮＡ分子の３’末端に連結される条件で十分な時間にわたって、該サンプルを、アデニル化されたモノヌクレオチド（Ａ５’ｐｐ５’Ｘ）およびＴ４ＲＮＡリガーゼとインキュベートする工程（ａ）、ならびに、
少なくとも１つのモノヌクレオチド−５’−ホスフェート残基（５’−ＸＭＰ）が３’末端に連結された２’ＯＭｅＲＮＡ分子の３’末端にポリ（Ａ）テールが付加される条件で十分な時間にわたって、工程（ａ）からのサンプルをポリメラーゼおよびＡＴＰと工程（ａ）の後に接触させる工程（ｂ）
を包含している、方法。
【請求項２２】
ホモポリヌクレオチドのテールを、サンプル中の目的のＲＮＡ分子の３’末端に付加するための方法であって、
ライゲーションのドナーであるアデニル化された５’−モノヌクレオチド（Ａ５’ｐｐ５’Ｘ）からの５’−モノヌクレオチド（５’−ＸＭＰ）残基が、複数回、連続的にライゲーションによって移動された結果として、ホモポリマーのテール（ポリ（Ｘ）テール）が目的のＲＮＡ分子の３’末端に付加される条件で十分な時間にわたって、サンプルを、過剰なモル濃度のアデニル化された５’−モノヌクレオチド（Ａ５’ｐｐ５’Ｘ）およびＴ４ＲＮＡリガーゼとインキュベートする工程を包含している、方法。
【請求項１】
サンプル中の５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加するための方法であって、
（ｉ）５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡを含有しているサンプルであって、５’一リン酸基を有するＲＮＡおよび／またはキャッピングされたＲＮＡおよび／または５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡをさらに含有していることを含んでいるサンプル、
（ｉｉ）ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ、
（ｉｉｉ）タグを示すアクセプタのオリゴヌクレオチド、および
（ｉｖ）ＲＮＡリガーゼ
を提供する工程（Ａ）、
該５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、該サンプルを該ＲＮＡ５’ポリホスファターゼと接触させる工程（Ｂ）、ならびに
該アクセプタのオリゴヌクレオチドの３’末端が、キャッピングされたＲＮＡではなく、該５’一リン酸基を有するＲＮＡに連結されて、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｂ）からのサンプルを該アクセプタのオリゴヌクレオチドおよび該ＲＮＡリガーゼと接触させる工程（Ｃ）
を包含している、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記工程（Ａ）にて提供されたサンプルが５’一リン酸基を有するＲＮＡをさらに含有しているが、前記アクセプタのオリゴヌクレオチドは、前記工程（Ｂ）にて前記５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡから変換された５’一リン酸基を有するＲＮＡにのみ連結され、工程（Ａ）にて提供されたサンプル中に既に存在する該５’一リン酸基を有するＲＮＡには連結されない、方法であり、
ＲＮＡ５’モノホスファターゼを提供するサブ工程、
該サンプル中の該５’一リン酸基を有するＲＮＡが５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、該サンプルを該ＲＮＡ５’モノホスファターゼと工程（Ｂ）の前に接触させるサブ工程、ならびに
該ＲＮＡ５’モノホスファターゼを不活性化または除去するサブ工程
をさらに包含している、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、
前記サンプル中のキャッピングされたＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加する工程をさらに包含しており、
核酸に対するピロホスファターゼまたはデキャッピング酵素を提供するサブ工程、ならびに
該サンプル中の該キャッピングされたＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換され、これによって、前記工程（Ａ）にて提供されたサンプル中に含有されているキャッピングされたＲＮＡにも前記工程（Ｃ）にて５’ライゲーションによりタグが付加される条件で十分な時間にわたって、前記工程（Ｂ）からのサンプルを該核酸に対するピロホスファターゼまたは該デキャッピング酵素と工程（Ｃ）の前に接触させるサブ工程
をさらに包含している、方法。
【請求項４】
サンプル中のキャッピングされたＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加するための方法であって、
（ｉ）キャッピングされたＲＮＡを含有しており、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡおよび／または５’一リン酸基を有するＲＮＡ、および／または５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡを必要に応じて含有しているサンプル、
（ｉｉ）ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ、
（ｉｉｉ）ＲＮＡ５’モノホスファターゼ、
（ｉｖ）核酸に対するピロホスファターゼまたはデキャッピング酵素、
（ｖ）アクセプタのオリゴヌクレオチド、および
（ｖｉ）ＲＮＡリガーゼ
を提供する工程（Ａ）、
該５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、該サンプルを該ＲＮＡ５’ポリホスファターゼと接触させる工程（Ｂ）、
該５’一リン酸基を有するＲＮＡが５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｂ）からのサンプルを該ＲＮＡ５’モノホスファターゼと接触させる工程（Ｃ）、
該ＲＮＡ５’モノホスファターゼを不活性化または除去する工程（Ｄ）、
工程（Ｄ）の後のサンプル中の該キャッピングされたＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｄ）の後のサンプルを該核酸に対するピロホスファターゼまたは該デキャッピング酵素と接触させる工程（Ｅ）、ならびに
該アクセプタのオリゴヌクレオチドの３’末端が、工程（Ｅ）にて生成された５’一リン酸基を有するＲＮＡの５’末端に連結され、工程（Ｂ）にて５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡから変換された５’一リン酸基を有するＲＮＡまたは工程（Ａ）にて提供されたサンプル中に既に存在する５’一リン酸基を有するＲＮＡには連結されずに、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡがキャッピングされたＲＮＡから生成される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｅ）からのサンプルを該アクセプタのオリゴヌクレオチドおよび該ＲＮＡリガーゼと接触させる工程（Ｆ）
を包含している、方法。
【請求項５】
キャッピングされたＲＮＡおよび／または５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加するための方法であって、
（ｉ）キャッピングされたＲＮＡおよび／または５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡを含有しているサンプル、
（ｉｉ）核酸に対するピロホスファターゼ、
（ｉｉｉ）アクセプタのオリゴヌクレオチド、および
（ｉｖ）ＲＮＡリガーゼ
を提供する工程（Ａ）、
該キャッピングされたＲＮＡおよび該５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、アルカリホスファターゼと接触されていない該サンプルを該核酸に対するピロホスファターゼと接触させる工程（Ｂ）、ならびに
該アクセプタのオリゴヌクレオチドの３’末端が、該５’一リン酸基を有するＲＮＡの５’末端に連結されて、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｂ）からのサンプルを該アクセプタのオリゴヌクレオチドおよび該ＲＮＡリガーゼと接触させる工程（Ｃ）
を包含している、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、
前記工程（Ａ）にて提供されたサンプルが５’一リン酸基を有するＲＮＡをさらに含有しているが、前記アクセプタのオリゴヌクレオチドが、前記工程（Ｂ）にて、前記キャッピングされたＲＮＡから、および／または前記５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡから、変換された５’一リン酸基を有するＲＮＡにのみ連結され、該工程（Ａ）にて提供されたサンプル中に既に存在する該５’一リン酸基を有するＲＮＡには連結されない、方法であり、
ＲＮＡ５’モノホスファターゼを提供するサブ工程、
該サンプル中の該５’一リン酸基を有するＲＮＡが５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、該サンプルを該ＲＮＡ５’モノホスファターゼと工程（Ｂ）の前に接触させるサブ工程、ならびに
該ＲＮＡ５’モノホスファターゼを不活性化または除去するサブ工程
をさらに包含している、方法。
【請求項７】
サンプル中の５’一リン酸基を有するＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加することなく、該サンプル中の５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加するための方法であって、
（ｉ）５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡおよび５’一リン酸基を有するＲＮＡを含有しているサンプル、
（ｉｉ）キャッピング酵素、
（ｉｉｉ）ＲＮＡ５’モノホスファターゼまたはアルカリホスファターゼ、
（ｉｖ）核酸に対するピロホスファターゼまたはデキャッピング酵素、
（ｖ）アクセプタのオリゴヌクレオチド、ならびに
（ｖｉ）ＲＮＡリガーゼ
を提供する工程（Ａ）、
該５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡがキャッピングされたＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、該サンプルを該キャッピング酵素と接触させる工程（Ｂ）、
５’一リン酸基を有するＲＮＡが５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｂ）からのサンプルを該ＲＮＡ５’モノホスファターゼまたは該アルカリホスファターゼと接触させる工程（Ｃ）、
工程（Ｃ）にて用いたＲＮＡ５’モノホスファターゼまたはアルカリホスファターゼを不活性化または除去する工程（Ｄ）、
該キャッピングされたＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｄ）の後のサンプルを該核酸に対するピロホスファターゼまたは該デキャッピング酵素と接触させる工程（Ｅ）、ならびに
該アクセプタのオリゴヌクレオチドの３’末端が、該５’一リン酸基を有するＲＮＡの５’末端に連結されて、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｅ）からのサンプルを該アクセプタのオリゴヌクレオチドおよび該ＲＮＡリガーゼと接触させる工程（Ｆ）
を包含している、方法。
【請求項８】
前記工程（Ａ）にて提供されたサンプルが、キャッピングされたＲＮＡをさらに含有しており、
前記５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが、工程（Ａ）のサンプルに提供された該キャッピングされたＲＮＡ、および前記工程（Ｂ）にてキャッピングされた、サンプル中の前記５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡの両方から生成される、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
サンプル中の５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加することなく、サンプル中のキャッピングされたＲＮＡおよび５’一リン酸基を有するＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加するための方法であって、
（ｉ）キャッピングされたＲＮＡ、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡおよび５’一リン酸基を有するＲＮＡを少なくとも含有しているサンプル、
（ｉｉ）デキャッピング酵素、
（ｉｉｉ）アクセプタのオリゴヌクレオチド、および
（ｉｖ）ＲＮＡリガーゼ
を提供する工程（Ａ）、
該キャッピングされたＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、該サンプルを該デキャッピング酵素と接触させる工程（Ｂ）、ならびに
該アクセプタのオリゴヌクレオチドの３’末端が該５’一リン酸基を有するＲＮＡの５’末端に連結されて、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｂ）からのサンプルを該アクセプタのオリゴヌクレオチドおよび該ＲＮＡリガーゼと接触させる工程（Ｃ）
を包含している、方法。
【請求項１０】
５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡまたは５’一リン酸基を有するＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加することなく、サンプル中のキャッピングされたＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加するための方法であって、
（ｉ）キャッピングされたＲＮＡ、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡ、５’一リン酸基を有するＲＮＡ、および／または５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡを含有しているサンプル、
（ｉｉ）ＲＮＡ５’モノホスファターゼまたはアルカリホスファターゼ、
（ｉｉｉ）デキャッピング酵素、
（ｉｖ）アクセプタのオリゴヌクレオチド、および
（ｖ）ＲＮＡリガーゼ
を提供する工程（Ａ）、
該ＲＮＡ５’モノホスファターゼまたは該アルカリホスファターゼが活性化され、ＲＮＡ５’モノホスファターゼまたはアルカリホスファターゼが触媒する反応が完了され得る条件で十分な時間にわたって、該サンプルをＲＮＡ５’モノホスファターゼまたはアルカリホスファターゼと接触させる工程（Ｂ）
工程（Ｂ）にて用いたＲＮＡ５’モノホスファターゼまたはアルカリホスファターゼを不活性化または除去する工程（Ｃ）、
該キャッピングされたＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｃ）からのサンプルを該デキャッピング酵素と接触させる工程（Ｄ）、
該アクセプタのオリゴヌクレオチドの３’末端が、工程（Ｄ）にて、該キャッピングされたＲＮＡから生成された該５’一リン酸基を有するＲＮＡの５’末端に連結されて、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｄ）からのサンプルを該アクセプタのオリゴヌクレオチドおよび該ＲＮＡリガーゼと接触させる工程（Ｅ）
を包含している、方法。
【請求項１１】
ポリＡポリメラーゼおよびＡＴＰを提供する工程、ならびに
ポリ（Ａ）テールが前記サンプル中のＲＮＡ分子の３’末端に付加されて、ポリ（Ａ）テールを有するＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、該サンプルを該ポリＡポリメラーゼおよび該ＡＴＰと接触させる工程
をさらに包含している、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、
前記サンプルが、第１のタイプの細胞、第１の状態の細胞、または第１の環境からの細胞に由来するＲＮＡを含有している第１のサンプルを含んでおり、
該第１のサンプルから生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡから、第２のタイプの細胞、第２の状態の細胞、または第２の環境からの細胞に由来する第２のサンプル中にも存在するＲＮＡを除き、これにより、第１のサンプル中のみに存在するが、第２のサンプル中には存在しないＲＮＡに由来する５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ分子の集団を生成することをさらに包含している、方法であり、
第１のサンプルから生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、および第２のタイプの細胞、第２の条件の細胞、または第２の環境からの細胞に由来するＲＮＡを含有している第２のサンプルを提供する工程（ｉ）、
第２のサンプル中のＲＮＡを逆転写することによって第一鎖ｃＤＮＡを調製する工程（ｉｉ）、
第１のサンプルから生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡと第２のサンプルからのＲＮＡから調製された第一鎖ｃＤＮＡとの間に、ハイブリダイズした複合体が形成される条件で十分な時間にわたって、第１のサンプルから生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを第２のサンプルからのＲＮＡから調製された第一鎖ｃＤＮＡとアニールさせる工程（ｉｉｉ）、ならびに、
該ｃＤＮＡがアニールしたＲＮＡが消化され、第１のサンプル中にのみ存在するが、第２のサンプル中には存在しないＲＮＡに由来する５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡからなる、除かれた５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、ハイブリダイズした複合体をＲＮａｓｅＨによって処理する工程（ｉｖ）
を包含している方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、
前記第１のサンプル中のＲＮＡから前記５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを生成するために前記工程（Ａ）にて提供された前記アクセプタのオリゴヌクレオチドが、親和性分子を含んでおり、
該親和性分子に結合可能な親和性に基づき結合する物質が付着している固体表面を提供する工程、ならびに
該第１のサンプルからの該５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが、該親和性に基づき結合する物質が付着している固体表面に結合されて、第１のサンプル中のＲＮＡに由来する５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが該固体表面に捕捉される条件で十分な時間にわたって、第１のサンプルから生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを該固体表面と、前記工程（ｉｖ）の前または後のどちらか一方において接触させる工程
をさらに包含している、方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法であって、
前記５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡから第一鎖ｃＤＮＡを合成する工程をさらに包含している、方法であり、
ＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼを提供する工程、および
５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡに対して相補的な第一鎖ｃＤＮＡが合成される条件で十分な時間にわたって、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡをＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼと接触させる工程
をさらに包含しており、
５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡに対して相補的な、第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーを提供する工程、ならびに
５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡに対して相補的なｃＤＮＡが合成される条件で十分な時間にわたって、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーおよびＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼと接触させる工程をさらに包含していることを含んでおり、
例えば、該第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーが配列を含んでおり、該配列の少なくとも３’末端は、
（１）インビボにおける細胞またはインビトロのどちらかにおいて、前記サンプル中のＲＮＡの３’末端または５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡの３’末端に転写後に付加されたホモポリマーの配列に対して相補的な配列、
（２）１つ以上のＲＮＡ分子の３’末端における公知の配列に対して相補的な配列、
（３）１つ以上のＲＮＡ分子の１つ以上の内部配列に対して相補的な配列、
（４）全ての可能な配列の集合であって、各配列がランダムである集合、
（５）ポリ（Ａ）テールに対して相補的な配列であって、
該ポリ（Ａ）テールが、オリゴ（ｄＴ）ｎの配列、オリゴ（ｄＵ）ｎの配列、オリゴ（Ｕ）ｎの配列、オリゴ（ｄＴ）ｎＸのアンカー配列、オリゴ（ｄＵ）ｎＸのアンカー配列、およびオリゴ（Ｕ）ｎＸのアンカー配列の中から選択される、配列、ならびに、
（６）該サンプル中のＲＮＡの３’末端または５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡの３’末端に付加されたオリゴヌクレオチドのタグに対して相補的な配列、
からなる群より選択される配列を示し、ならびに／あるいは
該第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーが、特定の５’配列をさらに示し、
該特定の５’配列は、該第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーの３’末端に示される配列の５’であり、該特定の５’配列に対して相補的な特定の３’配列を示す第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのテンプレートとして機能することができ、該第二鎖ｃＤＮＡの特異的なプライミングのための部位を提供する、方法。
【請求項１５】
ＲＮａｓｅＨおよびＲＮａｓｅＩを提供する工程、ならびに
ＲＮＡが消化される条件で十分な時間にわたって、前記第一鎖ｃＤＮＡを含有しているサンプルをＲＮａｓｅＨおよびＲＮａｓｅＩと接触させる工程
をさらに包含している、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の方法であって、
ＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼを提供する工程、および
二本鎖ｃＤＮＡが合成される条件で十分な時間にわたって、前記第一鎖ｃＤＮＡをＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼと接触させる工程
をさらに包含している、方法であり、
前記工程（Ａ）にて提供された前記アクセプタのオリゴヌクレオチドに対して相補的な該第一鎖ｃＤＮＡの一部に対して相補的な第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーおよび該ＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼを提供する工程、ならびに、
二本鎖ｃＤＮＡが合成される条件で十分な時間にわたって、第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーおよびＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼを第一鎖ｃＤＮＡと接触させる工程をさらに包含していることを含んでおり、
ＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼが、第一鎖ｃＤＮＡを合成するために提供されたＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼと同一であるか、またはＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼが、第一鎖ｃＤＮＡを合成するために提供されたＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼと異なる、方法。
【請求項１７】
請求項１９に記載の方法であって、
前記アクセプタのオリゴヌクレオチドの５’部分、前記第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーの５’部分または前記第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーの５’部分が、ＲＮＡポリメラーゼ用の二本鎖プロモータの一鎖に関する配列を示し、
該ＲＮＡポリメラーゼ用の二本鎖プロモータを用いてＲＮＡを合成し得るＲＮＡポリメラーゼを提供する工程、および
ＲＮＡが合成される条件で十分な時間にわたって、前記二本鎖ｃＤＮＡを該ＲＮＡポリメラーゼと接触させる工程
をさらに包含しており、
該ＲＮＡポリメラーゼ用の二本鎖プロモータの一鎖に関する配列が、該アクセプタのオリゴヌクレオチド、該第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーまたは該第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーにおいて示される、方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法であって、
前記アクセプタのオリゴヌクレオチド、第一鎖ｃＤＮＡのプライマー、または第二鎖ｃＤＮＡのプライマーが、親和性分子を含んでいるか、または該親和性分子に連結されており、
該親和性分子に特異的に結合可能な親和性に基づき結合する物質によって共有結合的または非共有結合的にコーティングされた固体表面を提供する工程、ならびに、
該親和性分子が、該固体表面に連結された親和性に基づき結合する物質と結合される条件で十分な時間にわたって、該親和性分子に化学的に連結された、該アクセプタのオリゴヌクレオチド、該第一鎖ｃＤＮＡのプライマーまたは該第二鎖ｃＤＮＡのプライマーを、該アクセプタのオリゴヌクレオチド、該第一鎖ｃＤＮＡのプライマーまたは該第二鎖ｃＤＮＡのプライマーが関与する工程の前または後のどちらか一方において、接触させる工程
をさらに包含している、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、
合成された、前記５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、前記第一鎖ｃＤＮＡまたは前記第二鎖ｃＤＮＡのそれぞれが前記親和性分子を含んでおり、
該親和性分子を含んでいる、該５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、該第一鎖ｃＤＮＡまたは該第二鎖ｃＤＮＡが、該親和性分子を前記固定表面に結合されることによって捕捉、単離または精製される、方法であり、
該親和性分子を含んでいる、該５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、該第一鎖ｃＤＮＡまたは該第二鎖ｃＤＮＡを該固体表面と、該親和性分子と該固体表面に付着した前記親和性に基づき結合する物質との結合が促進される試薬の存在下および該結合が促進される条件において接触させて、該親和性分子を含んでいる、該５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、該第一鎖ｃＤＮＡまたは該第二鎖ｃＤＮＡを該表面に結合させ、これによって、該親和性分子を含んでいる、該５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、該第一鎖ｃＤＮＡまたは該第二鎖ｃＤＮＡを捕捉、単離または精製する工程を包含しており、
該親和性分子がビオチンであり、該親和性に基づき結合する物質がアビジンまたはストレプトアビジンであるか、該親和性分子がジゴキシゲニンであり、親和性に基づき結合する物質がジゴキシゲニンに特異的に結合する抗体であることを含んでいる、方法。
【請求項２０】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットであって、
ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ（ＲＰＰ）と、
ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（ＲＭＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）；核酸に対するピロホスファターゼ；デキャッピング酵素；キャッピング酵素；リガーゼ；アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド；ポリＡポリメラーゼ；ポリＵポリメラーゼ；ＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼ（ＲＴ）；第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマー；ＲＮａｓｅＨ；第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマー；ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）；５’エキソリボヌクレアーゼ（Ｘｒｎ）；ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）；および５’三リン酸基または５’二リン酸基を有するＲＮＡ分子であって、これらの基のβまたはγのリン酸が標識されているもの、からなる群より選択される少なくとも１つの他の成分と
を備えているか、あるいは
ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（ＲＭＰ）と、
ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、シュリンプのアルカリホスファターゼ、またはアークティックのアルカリホスファターゼ；核酸に対するピロホスファターゼ；デキャッピング酵素；キャッピング酵素；ＲＮＡリガーゼ；アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド；ポリＡポリメラーゼ；ＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼ（ＲＴ）；第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマー；ＲＮａｓｅＨ；第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマー；ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）；５’エキソリボヌクレアーゼ；ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）；および５’三リン酸基または５’二リン酸基を有するＲＮＡ分子であって、これらの基のβまたはγのリン酸が標識されているもの、からなる群より選択される少なくとも１つの他の成分とを備えており、
該ＲＰＰが、アルミニウム誘導性のＲＰＰ、E. coliのＲＰＰＩ、およびShigellaのＲＰＰＩの中から選択され、少なくとも１つの他の成分は、キットに備えられている場合、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ１（ＲＭＰ１）であるＲＭＰ；ＡＰＥＸ（登録商標）アルカリホスファターゼ、シュリンプのアルカリホスファターゼおよびアークティックのアルカリホスファターゼの中から選択されるＡＰ；タバコ酸性ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）である核酸に対するピロホスファターゼ；酵母のデキャッピング酵素、哺乳動物のデキャッピング酵素、Arabidopsis thalianaのデキャッピング酵素、ポックスウイルスのデキャッピング酵素およびワクシニアウイルスのデキャッピング酵素の中から選択されるデキャッピング酵素；ポックスウイルスのキャッピング酵素、Saccharomyces cerevisiaeのキャッピング酵素およびＳＣＲＩＰＴＣＡＰ（登録商標）キャッピング酵素の中から選択されるキャッピング酵素；Ｔ４ＲＮＡリガーゼおよびバクテリオファージＴＳ２１２６のＲＮＡリガーゼの中から選択されるＲＮＡリガーゼ；E. coliのポリＡポリメラーゼおよびSaccharomyces cerevisiaeのポリＡポリメラーゼの中から選択されるポリＡポリメラーゼ；ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＲＴ、ＡＭＶ ＲＴおよびＭＭＬＶ ＲＴの中から選択されるＲＴ；E. coliのＲＮａｓｅＨおよびＨＹＢＲＩＤＡＳＥ（登録商標）ＲＮａｓｅＨの中から選択されるＲＮａｓｅＨ；Ｔ７型のＲＮＡＰ、Ｔ７ＲＮＡＰ、Ｔ３ＲＮＡＰおよびＳＰ６ＲＮＡＰの中から選択されるＲＮＡＰ；ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（登録商標）５’−ホスフェート依存的エキソヌクレアーゼおよびSaccharomyces cerevisaeのＸｒｎＩエキソリボヌクレアーゼ（ＸｒｎＩ）の中から選択される５’エキソリボヌクレアーゼ；またはＴ４ＰＮＫであるＰＮＫ、からなる群より選択される、ことを含んでいる、
キット。
【請求項２１】
サンプル中の２’ＯＭｅ−ＲＮＡ分子の３’末端にポリ（Ａ）テールを付加するための方法であって、
２’−ＯＭｅ基は、該ＲＮＡ分子の３’末端のヌクレオチドに存在し、
少なくとも１つのモノヌクレオチド−５’−ホスフェート残基（５’−ＸＭＰ）が２’ＯＭｅ−ＲＮＡ分子の３’末端に連結される条件で十分な時間にわたって、該サンプルを、アデニル化されたモノヌクレオチド（Ａ５’ｐｐ５’Ｘ）およびＴ４ＲＮＡリガーゼとインキュベートする工程（ａ）、ならびに、
少なくとも１つのモノヌクレオチド−５’−ホスフェート残基（５’−ＸＭＰ）が３’末端に連結された２’ＯＭｅＲＮＡ分子の３’末端にポリ（Ａ）テールが付加される条件で十分な時間にわたって、工程（ａ）からのサンプルをポリメラーゼおよびＡＴＰと工程（ａ）の後に接触させる工程（ｂ）
を包含している、方法。
【請求項２２】
ホモポリヌクレオチドのテールを、サンプル中の目的のＲＮＡ分子の３’末端に付加するための方法であって、
ライゲーションのドナーであるアデニル化された５’−モノヌクレオチド（Ａ５’ｐｐ５’Ｘ）からの５’−モノヌクレオチド（５’−ＸＭＰ）残基が、複数回、連続的にライゲーションによって移動された結果として、ホモポリマーのテール（ポリ（Ｘ）テール）が目的のＲＮＡ分子の３’末端に付加される条件で十分な時間にわたって、サンプルを、過剰なモル濃度のアデニル化された５’−モノヌクレオチド（Ａ５’ｐｐ５’Ｘ）およびＴ４ＲＮＡリガーゼとインキュベートする工程を包含している、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１１−５２１６２５（Ｐ２０１１−５２１６２５Ａ）
【公表日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０７７１１（Ｐ２０１１−５０７７１１）
【出願日】平成２１年５月４日（２００９．５．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４２７２３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３５２１２
【国際公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【出願人】（５１０２９１５９６）エピセンター テクノロジーズ コーポレーション (2)
【氏名又は名称原語表記】ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】７２６ Ｐｏｓｔ Ｒｏａｄ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１３，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月４日（２００９．５．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４２７２３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３５２１２
【国際公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【出願人】（５１０２９１５９６）エピセンター テクノロジーズ コーポレーション (2)
【氏名又は名称原語表記】ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】７２６ Ｐｏｓｔ Ｒｏａｄ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１３，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
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