ＴＮＩＫ阻害剤およびその使用
本発明は、TNIK阻害剤、医薬組成物、TNIK阻害剤による癌患者の治療方法に関する。また本発明は、新規アミノチアゾール誘導体に関する。TNIK阻害剤は、下記式（Ｉ）によって示され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、夫々独立して水素原子または置換基を表す。
【化１】
【化１】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｒａｆ２／Ｎｃｋ相互作用キナーゼ（ＴＮＩＫ）阻害剤により癌患者を治療するための組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、ＴＮＩＫ阻害剤および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関し、癌患者の治療に対して（特に大腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌または乳癌などの固形癌患者に対して）ＴＮＩＫ阻害剤を投与する方法に関する。
また、本発明は新規なアミノチアゾール誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｗｎｔタンパク質は、細胞の運命、増殖、移動および極性の決定などの様々な細胞過程を制御するシグナル伝達経路を活性化する、分泌性糖タンパク質の大きなファミリーである。Ｗｎｔタンパク質はいくつかの経路を介してシグナルを伝達することができ、最もよく特徴が明らかにされているのはβ−カテニンを介する標準経路（Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリング）である。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングの脱調節は、大腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、乳癌およびその他の多くのヒトの癌においてしばしば見出される。
【０００３】
ＴＮＩＫは、ｃ−ＪｕｎのＮ末端キナーゼ経路を活性化し、細胞骨格を調節する、ＳＴＥ２０ファミリーのキナーゼのうちの１つとして公知である。最近、ＴＮＩＫは、２つの大腸癌細胞株のＤＬＤ１およびＨＣＴ−１１６において、抗ＴＣＦ４抗体により共通して免疫沈降される７０のタンパク質のうちの１つとして同定された（非特許文献１）。
【０００４】
下記は、本発明であるＴＮＩＫ阻害剤により癌患者を治療するための組成物および方法の有用性の評価方法についての参照記述である。これらの参照記述はすでに仮出願に記載されているが、仮出願の出願前に本発明者により出願され、仮出願後に公開されたＷＯ２００９／１０４４１３（特許文献１）にも記載されている。本発明の有用性のための下記評価方法の詳細については、本発明の実施例のあとの参照方法に記載されている。
【０００５】
（本発明の有用性の評価方法についての参照記述）
大腸癌の８０％以上は大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子の変異を示し、残りの２分の１はＣＴＮＮＢ１遺伝子における変異を示し、結果としてβ−カテニンの蓄積およびＷｎｔシグナリングの構成的活性化を生じる。β−カテニンは、Ｔ細胞因子（ＴＣＦ）／リンパ球エンハンサー因子（ＬＥＦ）ファミリーＤＮＡ結合タンパク質との複合体の形成によって、およびそれらの標的遺伝子のトランス活性化によって、その腫瘍形成活性を発揮する。ＴＣＦ４は、大腸癌細胞において共通して発現され、大腸の発癌性に関わる、ＴＣＦ／ＬＥＦファミリーのメンバーである。我々は、以前に、２つの大腸癌細胞株（ＤＬＤ１およびＨＣＴ−１１６）において、抗ＴＣＦ４抗体および抗β−カテニン抗体により共通して免疫沈降される７０のタンパク質のうちの１つとしてＴＮＩＫを同定した（非特許文献１）。ＤＬＤ１はＡＰＣ遺伝子における短縮型変異および他方の対立遺伝子の消失を有しており、ＨＣＴ−１１６はＣＴＮＮＢ１遺伝子中にミスセンス変異を有している。ＴＮＩＫは抗ＴＣＦ４抗体または抗β−カテニン抗体による免疫沈降物中に検出されるが、対照のＩｇＧによる免疫沈降物中には検出されない。反対に、β−カテニンタンパク質およびＴＣＦ４タンパク質は抗ＴＮＩＫの抗体により免疫沈降され、ＴＣＦ４タンパク質、β−カテニンタンパク質およびＴＮＩＫタンパク質が大腸癌細胞において複合体を形成することを示す。２−ハイブリッド分析により、ＴＮＩＫは、キナーゼドメインを含む１〜２８９位のアミノ酸を介してＴＣＦ４と相互作用することが明らかにされた。ＴＣＦ４の１００〜２１６位のアミノ酸がＴＮＩＫとの相互作用のために必要であった。
【０００６】
ＴＣＦ４タンパク質はＴＮＩＫ（ＷＴ、野生型）によってリン酸化されるが、キナーゼドメインのＡＴＰ結合ポケット中の保存されたリジン５４残基の置換（Ｋ５４Ｒ）を有するＴＮＩＫの触媒的不活性変異体によってはリン酸化されない。タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）により、ＴＣＦ４のセリン１５４残基がＴＮＩＫ（ＷＴ）によってリン酸化されることが明らかになった。これと一致して、アラニンによるセリン１５４残基の置換（Ｓ１５４Ａ）は、ＴＮＩＫによるＴＣＦ４のリン酸化を消失させた。ＴＣＦ４は、ＴＮＩＫ（ＷＴ）によるＤＬＤ１細胞のトランスフェクションに際してリン酸化されるが、ＴＮＩＫ（Ｋ５４Ｒ）によるトランスフェクションではリン酸化されない。
【０００７】
ＴＮＩＫの自己リン酸化は、ＴＮＩＫの核移行およびＴＣＦ４との相互作用のために必要であると思われる。ＤＬＤ１細胞およびＨＣＴ−１１６細胞を、ＴＮＩＫ（ＷＴ）または触媒的不活性ＴＮＩＫ（Ｋ５４Ｒ）によりトランスフェクションし、イムノブロットおよび免疫蛍光顕微鏡によって分析した。我々は、ＴＮＩＫ（ＷＴ）が自身のセリン７６４残基のリン酸化（ＴＮＩＫｐＳ７６４）を誘導することを明らかにした（抗ＴＮＩＫｐＳ７６４により）。リン酸化されたＴＮＩＫは核の中へと取り込まれるが、Ｋ５４Ｒ置換はＴＮＩＫのリン酸化および核移行を有意に阻害し、ＴＣＦ４と相互作用するＴＮＩＫの量を減少させた。内在性ＴＮＩＫタンパク質は線維状細胞骨格に沿って分布したが、リン酸化されたＴＮＩＫ（ＴＮＩＫｐＳ７６４）は主として核において検出され、ＴＣＦ４と共局在した。ＴＮＩＫｐＳ７６４は大腸癌細胞において検出されるが、形質転換していないＨＥＫ２９３細胞においては検出されなかった。
【０００８】
ＴＮＩＫの発現および局在を、大腸癌の臨床検査標本において検討した。ＴＮＩＫタンパク質の全体的な発現レベルは癌と正常粘膜との間で有意に異ならなかったが、隣接する正常な腸上皮細胞と比較して、癌細胞におけるリン酸化されたＴＮＩＫ（ｐＳ７６４）の発現は増加した。核のＴＮＩＫｐＳ７６４は、大腸癌の浸潤先進部において最も多く検出され、β−カテニンは核および細胞質において蓄積した。
次に、我々は、β−カテニンおよびＴＣＦ４複合体の転写活性に対するＴＮＩＫの効果を調べた。ＨＥＫ２９３細胞およびＨｅＬａ細胞は、野生型のＡＰＣ遺伝子およびＣＴＮＮＢ１遺伝子を有する。Ｎ末端グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）リン酸化部位の欠失によって安定化させたβ−カテニン（β−カテニンΔＮ１３４）によるこれらの細胞の一過性トランスフェクションは、モックトランスフェクションと比較して、標準ＴＣＦ／ＬＥＦのレポーター（ＴＯＰ−ＦＬＡＳＨ）のルシフェラーゼ活性を増加させたが、変異レポーター（ＦＯＰ−ＦＬＡＳＨ）のルシフェラーゼ活性を増加させなかった。血球凝集素（ＨＡ）を標識化した野生型ＴＮＩＫ（ＷＴ）によるコトランスフェクションは、β−カテニンに誘発される転写活性、ならびにＨＥＫ２９３細胞およびＨｅＬａ細胞によるコロニー形成をさらに促進したが、ＴＮＩＫ（Ｋ５４Ｒ）によるコトランスフェクションでは促進しなかった。ＴＮＩＫは、β−カテニンΔＮ１３４の非存在下において、転写活性またはコロニー形成に有意には影響することはなく、ＴＮＩＫの効果がＷｎｔシグナリングの活性化に依存することがわかる。ＴＮＩＫによるＤＬＤ１細胞およびＨＣＴ−１１６細胞の一過性トランスフェクションもまた、それらのＴＣＦ／ＬＥＦの転写活性およびコロニー形成を促進したが、ＴＮＩＫ（Ｋ５４Ｒ）による一過性トランスフェクションは促進しなかった。
【０００９】
これとは反対に、ＴＮＩＫに対する短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（コンストラクト１２および１３）によるＴＮＩＫのノックダウンは、ＨＥＫ２９３細胞およびＨｅＬａ細胞のβ−カテニンΔＮ１３４に誘発されるＴＣＦ／ＬＥＦの転写活性を消失させた。ＴＮＩＫに対する短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）（コンストラクトＴ１、Ｔ２およびＴ３）によるＴＮＩＫのノックダウンは、β−カテニンΔＮ１３４に誘発されたコロニー形成を消失させたが、β−カテニンΔＮ１３４によりコトランスフェクションされなかったＨＥＫ２９３細胞およびＨｅＬａ細胞の増殖には有意に影響しなかった。ＴＮＩＫのノックダウンは、ＤＬＤ１細胞およびＨＣＴ−１１６細胞のＴＣＦ／ＬＥＦの転写活性および増殖を抑制した。体軸インヒビター（ａｘｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）−２（ＡＸＩＮ２）、ｃ−ｍｙｃ（ＭＹＣ）、ｃ−ｊｕｎ（ＪＵＮ）およびマトリリシン（ＭＭＰ７）などの、β−カテニンとＴＣＦ／ＬＥＦの複合体の既知の標的遺伝子の発現は、サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）を除いて、ＴＮＩＫに対するｓｉＲＮＡの一過性トランスフェクションによって有意に減少した。
【００１０】
我々は、次にヒト大腸癌細胞の増殖に対するＴＮＩＫの効果をインビボで検討した（図２）。ＨＣＴ−１１６細胞を免疫不全マウスの横腹に移植した。接種の１週間後に、アテロコラーゲンと混合したＴＮＩＫに対するｓｉＲＮＡ（１２または１３）（Takeshita, F.et al. Efficient delivery of small interfering RNA to bone-metastatic tumors by using atelocollagen in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 102, 12177(2005))を、腫瘍（大きさでは２２４．５±８．９ｍｍ３）の中へ直接注入した。ｓｉＲＮＡ注入の３日後に、いくつかの腫瘍を切り取り、ＴＮＩＫのｍＲＮＡのサイレンシングをリアルタイムＰＣＲによって確認した（図２b）。異種移植片の体積をｓｉＲＮＡ注入後の１８日間モニタリングした（図２a）。我々は、ＴＮＩＫに対するｓｉＲＮＡ（１２または１３）の単回投与後に腫瘍がほとんど完全に退縮することを明らかにした。図２c及び２dは、代表的なマウスおよび切除した腫瘍の外観を示す。ＴＮＩＫに対するｓｉＲＮＡ（１２または１３）により処理した腫瘍は、処理なしの腫瘍（Ｎｏ ｔｒｅａｔ）、アテロコラーゲンのみにより処理した腫瘍（Ａｔｅｌｏ ｏｎｌｙ）、または対照ＲＮＡ（ＸまたはＩＸ）により処理した腫瘍よりも有意に小さかった（図２ｄ）。我々は、他の２つの大腸癌細胞株（ＤＬＤ１およびＷｉＤｒ）において、ＴＮＩＫに対するｓｉＲＮＡの単回投与後に、定着腫瘍が同様に退縮することを観察した（図３および４）。
【００１１】
最後に、ＷｎｔシグナリングにおけるＴＮＩＫの機能的関与をツメガエル属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）胚において検討した。ユニジーン（Ｕｎｉｇｅｎｅ）アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）データベース中に、ヒトＴＮＩＫに相同な登録（仮想タンパク質ＬＯＣ４４３６３３と命名された）があった。キナーゼドメイン（２５〜２８９位のアミノ酸）は、ヒトとツメガエル属との間で高度に保存（９８．９％）されていた。ツメガエル属ＴＮＩＫ（ＸＴＮＩＫ）は母性発現され、発現はオタマジャクシのステージ全体にわたって維持された。腹側帯域におけるＷｎｔシグナリングの異所的活性化は、体軸重複を誘導することが公知である。ＸＴＮＩＫ（ＷＴ）ｍＲＮＡとの共注入は、Ｘβ−カテニンに誘導された二次体軸形成を促進したが、触媒的不活性ＸＴＮＩＫ（Ｋ５４Ｒ）は完全に二次体軸形成を阻害した。ＸＴＮＩＫ（ＷＴ）またはＸＴＮＩＫ（Ｋ５４Ｒ）のみ（Ｘβ−カテニンなし）を注入した胚は、正常に発生した。アニマルキャップ分析において、Ｘβ−カテニンの注入は、Ｗｎｔシグナリングの公知の標的遺伝子のシアモア（Ｓｉａｍｏｉｓ）およびＸｎｒ３の発現を誘導した。ＸＴＮＩＫ（ＷＴ）との共注入は、これらの遺伝子の発現を促進するが、ＸＴＮＩＫ（Ｋ５４Ｒ）はそれらの発現を停止させる。
【００１２】
８細胞ステージ胚の背側割球の中へのＸＴＮＩＫ（Ｋ５４Ｒ）ｍＲＮＡの注入は、ステージ１０での原腸陥入の開始を阻害した。ＸＴＮＩＫ（ＷＴ）を背側に注入した胚は、シアモアおよびＸｎｒ３の発現の著しい増加を示したが、ＸＴＮＩＫ（Ｋ５４Ｒ）はそれらの発現を減少させた。８細胞ステージで背側割球の中へのＸＴＮＩＫ（Ｋ５４Ｒ）ｍＲＮＡの注入を受けた胚は、有意な体軸欠損（Ｗｎｔシグナリングの背側での阻害に起因する典型的な表現型である、頭部および体軸構造の完全な消失）を生じた。
【００１３】
ＸＴＮＩＫに対するアンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチド（ＭＯｓ）（ＭＯ１およびＭＯ３）は、８細胞ステージ胚の腹側帯域の中へ共注入した場合に、Ｘβ−カテニンによって誘導される二次体軸形成を遮断した。この遮断状態は、ＨＡ標識化ＸＴＮＩＫＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）のｍＲＮＡ［ＭＯ１およびＭＯ３によって標的とされる５’ＵＴＲ（５’−非翻訳領域）を欠く］の共注入によって解除された。どちらのＸＴＮＩＫ−ＭＯを背側に注入した胚も、ステージ１０で原腸陥入を開始せず有意に縮小した頭部および体軸構造を有する異常なオタマジャクシへと発生した。ＸＴＮＩＫ−ＭＯｓによって引き起こされた欠損は、ＸＴＮＩＫＯＲＦの共注入によって補完された。ヌクレオチドミスマッチを有する対照ＭＯｓ（５ｍｉｓ−Ｃｏｎｔｒｏｌ−１および５ｍｉｓ−Ｃｏｎｔｒｏｌ−３）を注入した胚は、ＴＮＩＫ−ＭＯ１およびＴＮＩＫ−ＭＯ３で観察された効果を示さなかった。ＸＴＮＩＫ−ＭＯｓによるシアモアおよびＸｎｒ３の発現の減少は、ＸＴＮＩＫＯＲＦの共注入によって回復した。
【００１４】
プロテインキナーゼの合成されたＡＴＰ競合物は、腫瘍学の実務上、具体化して成功している。
【００１５】
例えば、イマチニブ（慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）のＢｃｒ−Ａｂｌ融合キナーゼを遮断する）は、現在ＣＭＬのための第一選択薬である。表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼ阻害剤である、ゲフィチニブおよびエルロチニブは、非小細胞肺癌の治療で用いられている。Ｗｎｔシグナリングは大腸の発癌を押し進める主な力である。ＴＮＩＫは大腸癌において活性化され、大腸癌細胞の増殖は、ＴＮＩＫの発現およびキナーゼ活性に高度に依存した。我々の結果は、ＴＮＩＫを標的とする薬物の開発が実現可能であることを示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】ＷＯ２００９／１０４４１３
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Shitashige M, et al., Gastroenterology ２００８年，１３４：１９６１−７１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明者等は、ＴＮＩＫがＷnt シグナリング経路 における必須のプロティンキナーゼであり、がん、特に固形腫瘍, 例えば、膵臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌または乳癌、なかでも大腸がんの増殖と深くかかわっており、ＴＮＩＫの作用を阻害することで、がん、特に固形腫瘍なかでも大腸がんの増殖を抑制することができることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者等は、当該知見に基づいて、ＴＮＩＫ阻害作用を有する化合物のスクリーニングを行い、下記一般式
【００２０】
【化１】
【００２１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、夫々独立して水素原子または置換基を表す。）で示されるアミノチアゾール誘導体またはその薬学的に許容される塩が、ＴＮＩＫ阻害作用を有することを見出し、当該アミノチアゾール誘導体が、がん細胞の増殖を抑制することを確かめて本発明を完成させた。
【００２２】
下記に図の説明をするが、図２〜４は本発明の有用性の評価方法についての参考図である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は化合物１による大腸癌細胞のβ−カテニン／ＴＣＦ４仲介性転写の阻害を示している。
【図２】（参考図）ＴＮＩＫに対するｓｉＲＮＡによる大腸癌増殖の阻害。ａ：ＨＣＴ−１１６細胞を、ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕヌードマウスへと皮下接種した。発達した腫瘍は処理しないか、またはアテロコラーゲンのみ、対照ＲＮＡ（ＸまたはＩＸ）もしくはＴＮＩＫに対するｓｉＲＮＡ（１２または１３）により処理した。示されるように、腫瘍の体積（１つのグループあたりｎ＝８）をモニタリングした。＃：Ｐ＜０．００１（マン−ホイットニーＵ検定）バー：標準誤差Ｎ．Ｓ．：有意でない。ｂ：ｓｉＲＮＡを注入した腫瘍におけるＴＮＩＫのｍＲＮＡ発現（１つのグループあたりｎ＝３）。ｃ、ｄ：ｓｉＲＮＡの注入１８日後のマウスおよび切除した腫瘍の代表的な外観。カラムは、切除した腫瘍の平均重量を示す（１つのグループあたりｎ＝８）。＄：Ｐ＜０．００５（マン−ホイットニーＵ検定）バー：標準誤差。
【図３】（参考図）ＴＮＩＫに対するｓｉＲＮＡによる大腸腫瘍の増殖阻害および退縮ＤＬＤ１細胞を、０日目にＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕヌードマウスの横腹に接種した。発達した腫瘍（ＤＬＤ１、６４．０±１．９ｍｍ３）を処理しないか、またはアテロコラーゲンのみ、対照ＲＮＡ（ＸまたはＩＸ）もしくはＴＮＩＫに対するｓｉＲＮＡ（１２または１３）により７日目に処理した。ａ：７、９、１３、１６、１９、２２および２５日目に測定した腫瘍体積（１つのグループあたりｎ＝８）。＊：Ｐ＜０．０００１（マン−ホイットニーＵ検定）バー：標準誤差Ｎ．Ｓ．：有意でない。ｂ：ｓｉＲＮＡ注入の３日後にリアルタイムＰＣＲによって決定された腫瘍（１つのグループあたりｎ＝３）におけるＴＮＩＫのｍＲＮＡ発現。ｃ、ｄ：２５日目（ｓｉＲＮＡの注入の１８日後）のマウス（ｃ）および切除した腫瘍（ｄ）の代表的な外観および切除した腫瘍の重量（１つのグループあたりｎ＝８）（ｄ）。＄：Ｐ＜０．００５（マン−ホイットニーＵ検定）バー：標準誤差。
【図４】（参考図）ＴＮＩＫに対するｓｉＲＮＡによる大腸腫瘍の増殖阻害および退縮ＤＬＤ１細胞に替えて、ＷｉＤｒ細胞を用いた場合の(発達した腫瘍 ＷｉＤｒ、９５．９±１．６ｍｍ３）、図３と同様の図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
アミノチアゾール誘導体（Ｉ）における置換基としては夫々以下の置換基をあげることができる。
【００２５】
Ｒ１及びＲ２の置換基としては、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のアシル基、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニル基、置換もしくは非置換のカルバモイル基、置換もしくは非置換のチオカルバモイル基、置換もしくは非置換のスルホニル基、置換もしくは非置換の複素環、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換の芳香族複素環があげられる。
【００２６】
Ｒ３及びＲ４の置換基としては、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のアシル基、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニル基、置換もしくは非置換のカルバモイル基、置換もしくは非置換のチオカルバモイル基、置換もしくは非置換のスルホニル基、置換もしくは非置換の複素環、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換の芳香族複素環があげられる。
【００２７】
Ｒ５及びＲ６の置換基としては、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のシクロアルキル基、置換もしくは非置換の複素環、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換の芳香族複素環があげられる。
【００２８】
アミノチアゾール誘導体（I）またはその薬学的に許容される塩の具体的な化合物としては、以下の化合物またはその薬学的に許容される塩があげられる。
【００２９】
５−（４−アセトアミドベンズアミド）−２−（フェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
５−（３−メチルベンズアミド）−２−（フェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
５−（２−フルオロベンズアミド）−２−（フェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
５−（４−メトキシベンズアミド）−２−（フェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
５−（３−メトキシベンズアミド）−２−（フェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
２−（フェニルアミノ）−５−（２−（チオフェン−２−イル）アセトアミド）チアゾール−４−カルボキサミド
５−（３−メチルブタンアミド）−２−（フェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
５−（２−シクロペンチルアセトアミド）−２−（フェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
２−（ｐ−トルイジノ）−５−（２−フルオロベンズアミド）チアゾール−４−カルボキサミド
２−（ｐ−トルイジノ）−５−（４−アセトアミドベンズアミド）チアゾール−４−カルボキサミド
２−（ｐ−トルイジノ）−５−（２−クロロベンズアミド）チアゾール−４−カルボキサミド
２−（ｐ−トルイジノ）−５−（３−ブロモベンズアミド）チアゾール−４−カルボキサミド
２−（ｐ−トルイジノ）−５−（２，６−ジフルオロベンズアミド）チアゾール−４−カルボキサミド
２−（ｐ−トルイジノ）−５−（３，４−ジメトキシベンズアミド）チアゾール−４−カルボキサミド
２−（ｐ−トルイジノ）−５−（チオフェン−２−カルボキサミド）チアゾール−４−カルボキサミド
２−（ｐ−トルイジノ）−５−（２−エチルブタンアミド）チアゾール−４−カルボキサミド
２−（エチルアミノ）−５−（８−メチル−２−フェニルキノリン−４−カルボキサミド）チアゾール−４−カルボキサミド
【００３０】
本発明のチアゾール誘導体（Ｉ）またはその薬学的に許容される塩は、何れも公知化合物であり、TimTec 社（Delaware, USA）やAurora Fine Chemicals 社（California, USA）等から入手することも可能である。また、チアゾール誘導体（I）またはその薬学的に許容される塩は、以下に例示する方法によっても製造することができる。
【００３１】
なお、以下に示す製造法において、所望の置換基が実施方法の条件下で変化するか、または方法を実施するのに不適切な場合、有機合成化学で通常用いられる方法、例えば、官能基の保護、脱保護（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．，１９９９参照）等の周知慣用の手段を付すことにより容易に製造することができる。
【００３２】
また、必要に応じて置換基導入等の反応工程の順序を適宜変えることもできる。
【００３３】
化合物（I）は、例えば製法１に示す製造法により得ることができる。
【００３４】
【化２】
【００３５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、前記に同じ。）
【００３６】
製法１の原料である化合物（II）および（III）は市販品（例えばAcros Organics 社製品,URL:http://www.acros.com/）として、または公知の方法もしくはそれに準じた方法により得ることができる。
【００３７】
化合物（IV）は、例えば、文献（J. Chem. Soc. 1949, 3001 参照）などに記載の方法に準じて製造することができる。
【００３８】
すなわち、化合物（ＩＩ）および化合物（ＩＩＩ）を酢酸エチルなどの不活性有機溶媒中、反応させることによって化合物（ＩＶ）を得ることができる。
【００３９】
化合物（Ｉ）は、化合物（ＩＶ）から必要に応じて前記のとおり官能基の保護、脱保護を繰り返しながら、有機合成化学で通常用いられるアシル化の条件、あるいはアルキル化の条件に付すことによって得ることができる。
【００４０】
また、必要により、有機合成化学で通常用いられる方法により以下に例示する薬学的に許容される塩を得ることができる。
【００４１】
薬学的に許容される酸付加塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸などの無機酸をともなう塩、またはマレイン酸、フマル酸、コハク酸、クエン酸などの有機酸をともなう塩を含む。
【００４２】
更なる本発明の目的は、下記一般式（I’）により表される新規なアミノチアゾール誘導体を提供することにある。
【００４３】
【化３】
【００４４】
（式中、Ｒ１’、Ｒ２’は、夫々独立して水素原子、ハロゲン原子、水酸基、置換または非置換のアルキル基、Ｃ２−Ｃ４アルケニル基、Ｃ２−Ｃ４アルキニル基、置換または非置換のアルコキシ基、置換または非置換のアミノ基、アシルアミノ基、ニトロ基、置換または非置換のアルコキシカルボニルアミノ基を表わし、Ｒ３’、Ｒ４’は、夫々独立して水素原子、ハロゲン原子、水酸基、置換または非置換のアルキル基、置換または非置換のアルコキシ基、置換または非置換のアミノ基、置換または非置換のアシルアミノ基、置換または非置換のアルキルスルホンアミド基、ニトロ基を表わす。またＹ１、Ｙ２及びＹ３は、夫々独立して窒素原子または炭素原子を表わす。）またはそれらの薬学的に許容される塩。
【００４５】
本発明に用いられる置換基としては、例えば、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子）、置換または非置換のC1−C8のアルキル基、C2−C4アルケニル基（例えば、ビニル、アリル）、C2−C4アルキニル基（例えば、エチニル、プロパルギル）、置換または非置換のC1−C8アルコキシ基、置換または非置換のC1−C4のアシルアミノ基、C1−C2のアルキルスルホンアミド基があげられる。置換または非置換のアミノ基としては、例えば、ジメチルアミノ基、４−メチルピペラジン−１−イル基、２−ヒドロキシエチルアミノ基、２−（ジメチルアミノ）エチルアミノ基、２−モルホリノエチルアミノ基、４−モルホリノ基、２−（ピロリジン−１−イル）エチルアミノ基、（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル基、２−メトキシエチルアミノ基、２−アミノエチルアミノ基、４−（ヒドロキシメチル）ピペリジン−１−イル基、２−（ピペリジン−１−イル）エチルアミノ基、２−（ピリジン−４−イル）エチルアミノ基、または、２−（メチルチオ）エチルアミノ基などがあげられる。置換または非置換のC1−C８アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、ベンジルオキシ基、２−モルホリノエトキシ基、２−（ピロリジン−１−イル）エトキシ基、または、テトラヒドロ−２H−ピラン−４−イルオキシ基などがあげられる。置換または非置換のアシルアミノ基としては、例えば、アセトアミド基、２−ヒドロキシアセトアミド基、２−（ジメチルアミノ）アセトアミド基、２−モルホリノアセトアミド基、２−（ピロリジン−１−イル）アセトアミド基、２−（ピペリジン−１−イル）アセトアミド基、または、２−（４−メチルピペラジン−１−イル）アセトアミド基があげられる。置換または非置換のアルコキシカルボニルアミノ基としては、例えば、置換または非置換のC1−C８アルコキシカルボニルアミノ基（例えば、tert‐ブトキシカルボニルアミノ基）があげられる。
【００４６】
以下に一般的な反応スキームを用いて、本発明のアミノチアゾール誘導体の合成方法を説明する。本発明の化合物（Ｉ’）は、スキーム１−６に従って製造でき、実施例に示されているように、一般的な合成方法と、市販で入手可能な出発原料あるいは市販で入手可能な前駆物質から公知の方法で合成可能な出発原料，又は当業者によって認識される様々なバリエーションから製造することができる。
【００４７】
これらのスキームではしばしば正確な構造を示していることがあるが、有機化学で通常用いられる保護、脱保護によって反応性の官能基を保護することによって式（I’）で示される化合物の誘導体を広く合成することが可能である。例えば、水酸基などは望まない副反応を避けるために、当該分子の他の部分の化学反応の間は一般的にエーテルやエステルに変換する必要がある。これらの水酸基の保護基は容易に取り除くことができ、保護されていない水酸基を得ることが出来る。アミノ基やカルボキシル基なども副反応を避けるために同様に保護される。典型的な保護基と、保護、脱保護の方法はT. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis 3rd Edition, John Wiley and Sons, New York, (1999)に十分に記載されている。
【００４８】
以下のスキーム中で示される各可変部位は本発明の化合物で記述される全ての官能基を参照するものである。式（Ｉ）の化合物の互変異性体および溶媒和物（例えば、水和物）なども本発明に含まれる。
【００４９】
本発明中のいかなる式のいかなる化合物も以下の反応スキームで示される方法や実施例で示される方法に従い、適切な出発物質を選び類似の方法で製造することができる。すなわち、本発明中で開示、例示するどの式のどの化合物も、以下に記載する方法と類似の方法に従い、適当な出発物質と適当な試薬を用い、望ましい置換を行うことにより得ることができる。
【００５０】
式（Ｉ’）の化合物は、概してスキーム１に示されるように５−アミノチアゾール中間体（ＩＩ’）と置換基を有する塩化ベンゾイル（ＩＩＩ’-a）からアミド生成反応によって製造することができる。
【００５１】
【化４】
【００５２】
式中、Ｒ１’, Ｒ２’, Ｒ３’, Ｒ４’, Ｙ１,Ｙ２およびＹ３は、それぞれ式（Ｉ’）と同義である。
【００５３】
置換基を有する安息香酸（ＩＩＩ’-b）を用い、一般的なアミドカップリング反応条件、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）およびジイソプロピルエチルアミンやトリエチルアミンのような塩基などの条件下、同様のアミドカップリング反応を行うことで、式（Ｉ’）の化合物を製造することもできる。
【００５４】
別の方法として、式（Ｉ’）の化合物は、スキーム２に示すように、エステル中間体（ＩＶ’）のアンモニアによる直接的アミノリシスでも製造することができる。
【００５５】
【化５】
【００５６】
式中、Ｒ１’, Ｒ２’, Ｒ３’, Ｒ４’, Ｙ１, Ｙ２, およびＹ３は、それぞれ式（Ｉ’）と同義である。
【００５７】
アミノリシス反応は、ＴＨＦやジオキサンのような溶媒存在下、濃アンモニア水あるいはアンモニアのメタノール溶液と処理することによって行なえる。反応は、封管中、８０−１５０℃に加熱しながら１−２４時間撹拌することによって得られるが、好ましくはマイクロウェーブ合成機を用いた、８０℃で１５０分間のマイクロウェーブ照射により合成することができる。
【００５８】
スキーム１のアミドカップリング反応の原料となる式（ＩＩ’）で表される化合物は、Ｃｏｏｋらの方法(Ｊ. Ｃｈｅｍ. Ｓｏｃ. １９４９, ３００１)と同様な反応を用いることにより製造することができる。例えば、式（ＩＩ’）で表される化合物は下記に示すスキーム３に従い製造できる。
【００５９】
【化６】
【００６０】
式中、Ｒ１’, Ｒ２’, Ｙ１, Ｙ２, およびＹ３は、それぞれ式（Ｉ’）と同義である。
【００６１】
すなわち、チオイソシアネート（Ｖ’）とアミノシアノアセトアミドの混合物を適当な溶媒中、好ましくは酢酸エチルを用いて撹拌し、０．５−２時間加熱還流することで式（ＩＩ’）で表される化合物を得ることができる。
【００６２】
チオイソシアネート（Ｖ’）は市販で入手可能か、対応するアミンをチオホスゲンで処理するような有機合成でよく知られている方法で製造することができる。
置換基を有するアミノチアゾール（ＩＶ’）はスキーム４に示すように、アニリンもしくはアミノヘテロ芳香族化合物（ＶＩＩ’）と２−ハロゲノチアゾール化合物（ＶＩ’）のパラジウム触媒反応によって製造することができる。
【００６３】
【化７】
【００６４】
式中、Ｒ１’, Ｒ２’, Ｒ３’, Ｒ４’, Ｙ１, Ｙ２, およびＹ３は、それぞれ式（Ｉ’）と同義であり、ＸはＣｌ, Ｂｒ, あるいはＩから選択されるハロゲンを表す。
【００６５】
これらのBuckwald/Hartwigタイプ反応は当業者によく知られており、例えばトルエン、ＴＨＦ、あるいはジオキサンなど不活性な溶媒中、トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム（０）、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム（０）、酢酸パラジウム（ＩＩ）などのパラジウム触媒と、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウムなどの塩基、および４，５−ビス(ジフェニルホスフィノ)−９，９−ジメチルキサンテン(XANTPHOS)などの配位子を用い、合成できる。同様なパラジウムカップリング反応として、対応するハロゲノ芳香族／ヘテロ芳香族化合物と対応する２−アミノチアゾール誘導体を用いても、同じ望むアミノチアゾール中間体（ＩＶ’）を製造することができる。
【００６６】
式（ＶＩ’）で表される化合物は下記のスキーム５によって、製造することができる。
【００６７】
【化８】
【００６８】
式中、Ｒ３’およびＲ４’は、それぞれ式（Ｉ’）と同義であり、ＸはＣｌ, Ｂｒ, あるいはＩから選択されるハロゲンを表す。
【００６９】
すなわち式（ＶＩ’）で表される化合物は５−アミノチアゾール中間体（ＶＩＩＩ’）と置換基を有する塩化ベンゾイル（ＩＩＩ’−a）からアミド生成反応によって製造することができる。置換基を有する安息香酸（III’−b）を用い、一般的なアミドカップリング反応条件、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）およびジイソプロピルエチルアミンやトリエチルアミンのような塩基などの条件下、同様のアミドカップリング反応を行うことにより製造することができる。
【００７０】
式（ＶＩＩＩ’）で表される化合物は、下記スキーム６に示すように５−アミノチアゾール−４−カルボン酸エチルエステルから製造することができる。
【００７１】
【化９】
【００７２】
式中、ＸはＣｌ, Ｂｒ, あるいはＩから選択されるハロゲンを表す。
【００７３】
５−アミノチアゾール−４−カルボン酸エチルエステルは、Golankiewiczらの方法に従って製造することができる (Tetrahedron, 41 (24), 5989-5994 (1985))。すなわち、市販のエチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセテートを飽和重曹水中でジチオン酸ナトリウムと処理することによって得られるエチル２−アミノ−２−シアノアセテートを、酢酸ギ酸無水物で処理することで対応するホルムアミド体が生成する。こうして得られる２−シアノ−２−ホルムアミド酢酸エチルをLawesson試薬で処理、続いてNCSやNBSなどのハロゲン化試薬と処理することで、望む化合物を得ることができる。
【００７４】
本発明は、以下にあげる実施例でさらに詳細に記述される。これらの実施例は一例である。上記記述およびこの実施例から、当業者は、本発明の本質的特質を理解でき、その精神および範囲から逸脱することなく本発明を様々な用途および条件に適応させるために、様々な改変や修飾を行なうことが可能である。つまり、本発明は以下に挙げる実施例に限定されるものではなく付属の特許請求の範囲によって定義される。
式（Ｉ’）で示される化合物として、具体的な化合物を表１−１〜表１−２２に示す。
【００７５】
【表１−１】
【００７６】
【表１−２】
【００７７】
【表１−３】
【００７８】
【表１−４】
【００７９】
【表１−５】
【００８０】
【表１−６】
【００８１】
【表１−７】
【００８２】
【表１−８】
【００８３】
【表１−９】
【００８４】
【表１−１０】
【００８５】
【表１−１１】
【００８６】
【表１−１２】
【００８７】
【表１−１３】
【００８８】
【表１−１４】
【００８９】
【表１−１５】
【００９０】
【表１−１６】
【００９１】
【表１−１７】
【００９２】
【表１−１８】
【００９３】
【表１−１９】
【００９４】
【表１−２０】
【００９５】
【表１−２１】
【００９６】
【表１−２２】
【００９７】
アミノチアゾール誘導体（Ｉ）およびアミノチアゾール誘導体（Ｉ’）はＴＮＩＫ抑制効果を示し（試験例１）、所望されない活性を示さない（試験例２）。アミノチアゾール誘導体は、抗腫瘍活性（試験例３）および低毒性を示す。
【００９８】
アミノチアゾール誘導体は、経口投与または点滴注入などの非経口投与のための従来の薬学製剤の形態で、例えば抗腫瘍剤として用いることができる。
【００９９】
経口投与のための製剤は、錠剤、顆粒、粉末、カプセルなどの固形剤、およびシロップなどの液体製剤を含む。これらの製剤は従来の方法によって調製することができる。固形剤は、ラクトース、コーンスターチなどのデンプン、微結晶性セルロースなどの結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルシウムカルボキシメチルセルロース、タルク、ステアリン酸マグネシウムなどのような従来の薬学的担体を用いることによって調製することができる。カプセルは、このように調製した顆粒または粉末をカプセルに包むことによって調製することができる。シロップは、ショ糖、カルボキシメチルセルロースなどを含む水溶液中で、アミノチアゾール誘導体を溶解または懸濁することによって調製できる。
【０１００】
非経口投与のための製剤は、点滴注入などの注入物を含む。注入製剤もまた従来の方法によって調製することができ、等張化剤（例えば、マンニトール、塩化ナトリウム、グルコース、ソルビトール、グリセロール、キシリトール、フルクトース、マルトース、マンノース）、安定化剤（例えば、亜硫酸ナトリウム、アルブミン）、防腐剤（例えば、ベンジルアルコール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル）中に任意で組み入れることができる。
【０１０１】
アミノチアゾール誘導体は、腫瘍（特に大腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌または乳癌などの固形腫瘍）の治療のために効果的である。
【０１０２】
アミノチアゾール誘導体の用量は、疾患の重症度、患者の年齢および体重、投薬形態などに従って変化させることができるが、通常は成人において１日あたり１ｍｇ〜１，０００ｍｇの範囲であり、それは経口経路または非経口経路によって、１回、または２回もしくは３回に分割して投与できる。
【実施例】
【０１０３】
［試験例］
試験例１
【０１０４】
組換えヒトＴＮＩＫ（Ｎ末端セグメント）の調製：
ヒトＴＮＩＫ（ＮＭ＿０１５０２８．１）のキナーゼドメインを含むＮ末端セグメント（ＴＮＩＫ＿Ｎ、残基１〜３１４）をコードするｃＤＮＡを、以下のプライマーを用いて、ＰＣＲによってヒト組織（バイオチェイン（Ｂｉｏｃｈａｉｎ）社）から合成したｃＤＮＡ混合物から増幅した：
【０１０５】
５’−ＡＡＴＴＴＣＡＧＧＧＣＧＣＣＡＴＧＧＣＧＡＧＣＧＡＣＴＣＣＣＣＧＧＣＴＣＧＡＡＧ−３’（［配列番号１］フォワードプライマー、下線を引いたヌクレオチドはＥｈｅＩ部位の位置を示す）；
５’−ＡＴＴＣＧＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＣＣＴＣＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＧＴＴＣＴＡＴ−３’（［配列番号２］リバースプライマー、下線を引いたヌクレオチドはＮｏｔＩ部位の位置を示す）。
【０１０６】
プロテアーゼ切断部位およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ精製タグ（ＧＳＴタグ）を含むバキュロウイルス転写ベクターｐＦａｓｔＢａｃ＿ＧＳＴｂの中へ、このｃＤＮＡをサブクローン化した。このプラスミドを精製し、ｐＦａｓｔＢａｃ＿ＧＳＴｂ−ＴＮＩＫ＿Ｎの挿入をＤＮＡ塩基配列決定によって確認した。次に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞をプラスミドにより形質転換してバック・ツー・バック（Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ）（商標）バキュロウイルス発現系（インビトロジェン社）のための指示に従って、組換えバクミドを調製した。Ｓｆ９細胞を、ＳＦ−９００ＩＩ無血清培地（インビトロジェン社）中で、セルフェクチン（Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ）試薬（インビトロジェン社）を用いて、ｐＦａｓｔＢａｃ＿ＧＳＴｂ−ＴＮＩＫ＿Ｎを含む組換えバクミドによりトランスフェクションした。ウイルス上清をトランスフェクションの７２時間後に培地から回収した。ウイルスは、Ｔフラスコまたはローラーボトル中で、１０％ＦＣＳおよび抗生−抗真菌試薬（インビトロジェン社）を追加したグレース昆虫培地（インビトロジェン社）中で、２７℃で７２時間、活発に増殖中のＳｆ９細胞またはＳｆ２１細胞を感染させることによって、３回増幅した。
【０１０７】
増幅されたＴＮＩＫ＿Ｎウイルスの力価は、バックパック（ＢａｃＰＡＫ）（商標）バキュロウイルス迅速力価キット（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｒａｐｉｄ Ｔｉｔｅｒ ｋｉｔ）（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社）を用いることによって、２．３６ｘ１０８ｐｆｕ／ｍｌと推定した。
【０１０８】
グレース昆虫培地中で対数増殖期にあるＳｆ２１細胞（２×１０６細胞／ｍｌ）に、３．０ＭＯＩで組換えバキュロウイルスを感染させ、２７℃で７２時間ローラーボトル（１ボトルあたり２５０ｍｌの培地）中でインキュベートし、その後に細胞を遠心分離によって回収し、細胞沈殿を冷ＰＢＳにより洗浄し、精製まで−８０℃に保った。以下の精製手順は４℃で行なった。凍結細胞を氷上で解凍し、１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド、２μｇ／ｍｌロイペプチン、２μｇ／ｍｌアプロチニン、１ｍＭ ＮａＦ、１００μＭオルトバナジウム酸ナトリウムおよび１μＭカンタリジンを追加した、溶解バッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ノニデットＰ−４０、５ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ）中で超音波処理によって溶解した。懸濁した溶解物を、２０分間９０００ｇで遠心分離によって清澄にし、上清をグルタチオンセファロースビーズ（ＧＥヘルスケア社）と共に１時間インキュベートした。ビーズをバッファーＨ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡおよび０．０５％Ｂｒｉｊ３５）中で懸濁し、エコノ−パックカラム（Ｅｃｏｎｏ−ｐａｃｋ ｃｏｌｕｍｎ）（バイオラッド（ＢＩＯ−ＲＡＤ）社）中で、バッファーＨ、続いてバッファーＬ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．０５％Ｂｒｉｊ３５）により洗浄した。結合したＴＮＩＫ＿Ｎは、溶出緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロール、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡおよび５ｍＭ還元型グルタチオン）により溶出した。溶出した画分を回収し、ブラッドフォード試薬（バイオラッド社）によってタンパク質濃度を決定した。ＴＮＩＫ＿Ｎ画分をプールし、保存バッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロール、０．０５％Ｂｒｉｊ３５）により平衡化した１０ＤＧカラム（バイオラッド社）を用いて脱塩した。精製したＴＮＩＫ＿Ｎを、４〜２０％のポリアクリルアミドゲルを用いる電気泳動、およびボイジャー（Ｖｏｙａｇｅｒ）−ＤＥ ＲＰ ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ（アプライド・バイオシステムズ社）上のマトリックス支援レーザー脱離イオン化反射型飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析によって特性を評価した。ＴＮＩＫ＿Ｎを分子量およびＭＡＳＣＯＴペプチド質量フィンガープリントによって確認した。
【０１０９】
キナーゼ分析：
キナーゼ分析は３８４ウェルプレート（グライナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ）社）を用いて２０μｌの体積で行った。反応混合物は、化合物または賦形剤（１％ＤＭＳＯ）、０．０８ｎｇ／μｌ ＴＮＩＫ＿Ｎ、１μＭ ＦＩＴＣ標識基質ペプチドのＦＩＴＣ−ｘ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ（［配列番号３］ｘ：ε−アミノカプロン酸）、２０ｍＭヘペス（ｐＨ７．５）、０．０１％トリトンＸ−１００、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５μＭ ＡＴＰおよび２ｍＭ ＤＴＴからなる。ブランクとしては、ＴＮＩＫ＿Ｎを賦形剤（１％ＤＭＳＯ）の反応混合物から除外した。キナーゼ反応は室温で１時間行ない、６０μｌの終結バッファー（１２７ｍＭヘペス（ｐＨ７．５）、２６．７ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％トリトンＸ−１００、１％ＤＭＳＯおよび０．１３％コーティング試薬３（キャリパー・ライフサイエンス（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）社））を添加することによって停止させた。非リン酸化ＦＩＴＣ標識基質ペプチドおよびリン酸化ＦＩＴＣ標識基質ペプチドの量は、モビリティシフトマイクロフルイディックテクノロジー（Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｓｈｉｆｔ Ｍｉｃｒｏ−Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（キャリパーＬＣ３０００システム、キャリパー・ライフサイエンス社）によって検出した。
【０１１０】
ＴＮＩＫ＿Ｎのキナーゼ活性はＰ／（Ｐ＋Ｓ）として定義された（Ｐ：リン酸化ＦＩＴＣ標識基質ペプチドのピーク高；Ｓ：ＦＩＴＣ標識基質ペプチドのピーク高）。
化合物の阻害は以下のように計算した；
阻害（％）＝（１−（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ））×１００
Ａ：化合物ウェルの平均のＰ／（Ｐ＋Ｓ）；
Ｂ：賦形剤ウェルの平均のＰ／（Ｐ＋Ｓ）；
Ｃ：ブランクのウェルの平均のＰ／（Ｐ＋Ｓ）
【０１１１】
キナーゼに対する化合物のＩＣ５０値を対数濃度阻害曲線の回帰分析から計算した。
結果：
試験結果を表２−１〜表２−４中に示す。
【０１１２】
【表２−１】
【０１１３】
【表２−２】
【０１１４】
【表２−３】
【０１１５】
【表２−４】
【０１１６】
試験例２
選択性プロファイリングテスト：
２０のチロシンキナーゼおよび３０のセリン／スレオニンキナーゼに対する化合物１の抑制効果を、クイックスカウト（ＱｕｉｃｋＳｃｏｕｔ）（商標）ＴＫおよびＳＴＫスクリーニングパネル（カルナ・バイオサイエンス（Ｃａｒｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社、神戸、日本）を用いて調べた。化合物１のＩＣ５０値を表３中に示す。この結果は、化合物１が他の５０のキナーゼよりも強力に（ＩＣ５０；９ｎＭ）ＴＮＩＫ＿Ｎを阻害することを明らかにした。
化合物１の選択性プロファイリング
【０１１７】
【表３】
【０１１８】
試験例３
ＴＣＦ／リンパ球エンハンサー因子（ＬＥＦ）レポーター遺伝子分析：
ヒト大腸癌細胞株のＤＬＤ−１およびＨＣＴ−１１６を、ヒューマンサイエンス研究資源バンクおよび米国培養菌保存施設からそれぞれ入手した。ｐＣＩｎｅｏ−ＨＡベクター（プロメガ社）の中へ挿入した全長ヒトＴＮＩＫは、ケンイチ・カリヤ（Ｋｅｎｉｃｈｉ Ｋａｒｉｙａ）博士（琉球大学）から快く贈られた。ＤＬＤ１細胞およびＨＣＴ−１１６細胞を、標準ＴＣＦ／ＬＥＦルシフェラーゼレポーター（ＴＯＰ−ＦＬＡＳＨ）または変異体ＴＣＦ／ＬＥＦルシフェラーゼレポーター（ＦＯＰ−ＦＬＡＳＨ）、ｐｈＲＬ−ＴＫ（プロメガ社）（内部標準）、およびｐＣＩｎｅｏ−ＨＡ−ＴＮＩＫまたはｐＣＩｎｅｏ−ＨＡ（対照プラスミド）により三回コトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後に、化合物１または賦形剤を、０．０７８１２５μＭ、０．１５６２５μＭ、０．３１２５μＭおよび０．６２５μＭの最終濃度で細胞に加えた。続く２４時間後に、レポーター活性を、デュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（プロメガ社）を用いることによって、取扱説明書に従って分析した。テスト結果を図１中に示す。結果を各サンプルのウミシイタケ属の値に対して正規化した。レポーター分析結果は、三回の分析の平均および標準偏差を表わす。化合物１は、濃度依存的様式でＤＬＤ１およびＨＣＴ−１１６においてβ−カテニン／ＴＣＦ４仲介性転写を阻害した。
【０１１９】
［実施例］
以下の実施例は、例を挙げたのみであり、本発明の範囲を限定するものではない。
以下の説明で使用される略語、記号の意味は次の通りである。
【０１２０】
CDCl3: クロロホルム-d
D2O: 重水
DCM: ジクロロメタン
DMA: ジメチルアセトアミド
DMF: ジメチルホルムアミド
DMSO: ジメチルスルホキシド
EtOH: エタノール
EtOAc: 酢酸エチル
HCl: 塩酸
K2CO3: 炭酸カリウム
MeOH: メタノール
MgSO4: 硫酸マグネシウム
NaHCO3:炭酸水素ナトリウム
Na2SO4: 硫酸ナトリウム
NH4Cl: 塩化アンモニウム
NH3: アンモニア
N2: 窒素
POCl3: オキシ塩化リン
THF: テトラヒドロフラン
TFA: トリフルオロ酢酸
Xantphos: 4,5-ビス(ジフェニルホスフィノ)-9,9-ジメチルキサンテン
EDC: 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
HOBT: 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
min.: 分
h or hr(s): 時間
RT or rt: 室温
sat.: 飽和
aq.: 水溶液
TLC: 薄層クロマトグラフィー
HPLC: 高速液体クロマトグラフィー
Prep HPLC: 分取HPLC
LC/MS: 高速液体クロマトグラフ質量分析計
MS: 質量分析計
NMR: 核磁気共鳴
【０１２１】
実施例１−３、５−１６、２０、２６、３４、３６、４６、５２、５４、６１−６３、６５、６６、８１、１２１
【０１２２】
下記表４−１〜表４−５に示す各実施例は、適当な出発物質を用いて下記実施例４の方法に従い合成した。
【０１２３】
【表４−１】
【０１２４】
【表４−２】
【０１２５】
【表４−３】
【０１２６】
【表４−４】
【０１２７】
【表４−５】
【０１２８】
実施例４
５−（４−アセタミドベンズアミド）−２−（４−フルオロフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
(a)５−アミノ−２−（４−フルオロフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０１２９】
【化１０】
【０１３０】
２−アミノ−２−シアノアセタミド（0.25 g, 2.5 mmol）の酢酸エチル懸濁液(7 mL)に４−フルオロフェニルイソチオシアネート(0.386 g, 2.5 mmol)を加え、混合溶液を30分間還流した。溶媒を留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、２％メタノール−DCM溶液で溶出して0.4 g の標記化合物を得た(収率52%)。
【０１３１】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 6.65 (s, 2H), 6.89 (br, 2H), 7.04 (t, 2H J = 8.7 Hz), 7.6-7.7 (m, 2H), 9.56 (s, 1H). LCMS m/z [M+H]+253.0.
【０１３２】
(b)５−（４−アセタミドベンズアミド）−２−（４−フルオロフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０１３３】
【化１１】
【０１３４】
４−アセタミド安息香酸(0.106 g, 0.59 mmol)および触媒量のDMFの乾燥THF溶液(5 mL)に塩化オキザリル(0.06 mL, 0.79 mmol)を0 ℃で加え、混合溶液を室温で２時間撹拌した。溶媒を留去したのち、窒素気流下、残存する塩化オキザリルをトルエンとの共沸により取り除いた。得られた酸塩化物をピリジン(5 mL)に溶解し、0 ℃に冷却した。この溶液に５−アミノ−２−（４−フルオロフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド(0.1 g, 0.39 mmol)のピリジン溶液(5 mL)を0 ℃で加え、混合物を室温で12時間撹拌した。溶媒を留去後、残渣を１M塩酸に懸濁させ、析出した固体を濾取した。固体を水(10 mL)およびエーテル (20 mL)で洗浄し、乾燥させた。粗精製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、３％メタノール−DCM溶液で溶出して38 mgの標記化合物を得た(収率10%)。
【０１３５】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 2.09 (s, 3H), 7.01 (t, 2H, J = 8.7 Hz), 7.7-7.9 (m, 8H), 10.09 (s, 1H), 10.32 (s, 1H), 12.5 (s, 1H). LCMS m/z [M+H]+414.4.
【０１３６】
実施例１７
５−（４−アセタミドベンズアミド）−２−（４−ハイドロキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０１３７】
【化１２】
【０１３８】
５−（４−アセタミドベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド(100 mg, 0.23 mmol)の１，２−ジクロロエタン溶液(10 mL)にBBr3 (587.5 mg, 2.35 mmol)を窒素気流下、0 ℃で加え、混合物を室温で５時間撹拌した。反応混合物に１M塩酸(5ml)を加えて反応を終了させ、有機層を分離、濃縮した。得られた固体を回収し、ヘキサン、エーテルで順に洗浄し、乾燥させて70 mgの標記化合物を得た(収率72%)。
【０１３９】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 2.09 (s, 3H), 6.71 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.51 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.58 (br, 1H), 7.7-7.9 (m, 5H), 9.71 (s, 1H), 10.33 (s, 1H), 12.49 (s, 1H). LCMS m/z [M+H]+412.1.
【０１４０】
実施例１８
tert−ブチル−４−［５−（４−アセタミドベンズアミド）−４−カルバモイルチアゾール−２−イルアミノ］フェニルカーバメート
【０１４１】
【化１３】
【０１４２】
(a)tert−ブチル−４−イソチオシアナートフェニルカーバメート
【０１４３】
【化１４】
【０１４４】
tert−ブチル−４−アミノフェニルカーバメート(0.5 g, 2.4 mmol)およびトリエチルアミン(0.98 mL, 7.2 mmol)のTHF溶液(45 mL)にチオホスゲン(0.2 mL, 2.64 mmol)を0 ℃で滴下し、その後混合物を室温で30分間撹拌した。反応混合物に水を加えて反応を停止し、エーテルで抽出した(2 x 30 mL)。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮して0.5 gの標記化合物(収率83%)を得た。本化合物は更なる精製はせず、そのまま次の反応に用いた。
【０１４５】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 1.50 (s, 9H), 6.50 (s, 1H), 7.14 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.34 (d, 2H, J = 8.4 Hz). LCMS m/z [M+H]+251.2.
【０１４６】
(b) tert-ブチル−４−（５−アミノ−４−カルバモイルチアゾール−２−イルアミノ）フェニルカーバメート
【０１４７】
【化１５】
【０１４８】
２−アミノ−２−シアノアセタミド（0.178 g, 1.8 mmol）の酢酸エチル懸濁液(10 mL)にtert−ブチル−４−イソチオシアナートフェニルカーバメート(0.5 g, 2.0 mmol)を加え、混合溶液を30分間還流した。溶媒を留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、２％メタノール−DCM溶液で溶出して0.4 g の標記化合物を得た(収率57%)。
【０１４９】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 1.46 (s, 9H), 6.62 (s, 2H), 6.88 (s, 2H), 7.3-7.4 (m, 2H), 7.46 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 9.12 (s, 1H), 9.39 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 350.3.
【０１５０】
(c) tert-ブチル−４−［５−（４−アセトアミドベンズアミド）−４−カルバモイルチアゾール−２−イルアミノ］フェニルカーバメート
【０１５１】
【化１６】
【０１５２】
４−アセタミド安息香酸(0.256 g, 1.43 mmol)および触媒量のTHFの乾燥THF溶液(15 mL)に塩化オキザリル(0.25 mL, 2.86 mmol)を0 ℃で加え、混合溶液を室温で２時間撹拌した。溶媒を留去したのち、窒素気流下、残存する塩化オキザリルをトルエンとの共沸により取り除いた。得られた酸塩化物をピリジン(10 mL)に溶解し、0 ℃に冷却した。この溶液にtert-ブチル−４−（５−アミノ−４−カルバモイルチアゾール−２−イルアミノ）フェニルカーバメート(0.4 g, 1.14 mmol)のピリジン溶液(5 mL)を0 ℃で加え、混合物を室温で12時間撹拌した。溶媒を留去後、残渣を１M塩酸に懸濁させ、析出した固体を濾取した。固体を水(10 mL)およびエーテル (20 mL)で洗浄し、乾燥させた。粗精製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、２−５％メタノール−DCM溶液で溶出して125 mgの標記化合物を得た(収率21%)。
【０１５３】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 1.47 (s, 9H), 2.09 (s, 3H), 7.3-7.4 (m, 2H), 7.62 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.72 (s, 1H), 7.8-7.9 (m, 5H), 9.20 (br, 1H), 9.92 (s, 1H), 10.33 (s, 1H), 12.54 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] +511.3.
【０１５４】
実施例６８−６９、７１、７３、７６、８２、９２、９５−９８、１００、１０２、１０４
下記表５−１〜表５−２に示す化合物は、適当な出発物質を用いて上記実施例１８の方法に従い合成した。
【０１５５】
【表５−１】
【０１５６】
【表５−２】
【０１５７】
実施例１９
５−（４−アセトアミドベンズアミド）−２−（４−アミノフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０１５８】
【化１７】
【０１５９】
tert-ブチル−４−［５−（４−アセトアミドベンズアミド）−４−カルバモイルチアゾール−２−イルアミノ］フェニルカーバメート(0.10 g, 19 mmol)を、アルゴン気流下、0 ℃で４M塩酸−１，４−ジオキサン(10 mL)に溶解し、混合物を0 ℃で３時間撹拌した。溶媒を留去後、残留する酸をトルエンとの共沸上流で取り除いた。得られた固体を乾燥させて78 mgの標記化合物を得た (収率98%)。
【０１６０】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 2.07 (s, 3H), 7.29 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 7.7-7.9 (m, 8H), 9.93 (br, 2H), 10.36 (s, 1H), 10.38 (s, 1H), 12.56 (s, 1H). LCMS m/z [M+H]+411.1.
【０１６１】
実施例２１
５−（４−フルオロベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０１６２】
【化１８】
【０１６３】
(a)５−アミノ−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０１６４】
【化１９】
【０１６５】
４−メトキシフェニルイソチオシアナート (1.91 g, 11.53 mmol)および２−アミノ−２−シアノアセタミド（1.20 g, 12.11 mmol）の酢酸エチル懸濁液(16 mL)を80 ℃ で50分間加熱した。反応混合物を室温まで冷却し析出した固体を濾別した。濾液を濃縮して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、２−５％メタノール−クロロホルム溶液で溶出して2.63 g の標記化合物を得た(収率86%)。
【０１６６】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.70 (s, 3H), 6.61 (s, 2H), 6.7-7.0 (m, 4H), 7.51 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 9.34 (s, 1H).
【０１６７】
(b)５−（４−フルオロベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０１６８】
【化２０】
【０１６９】
５−アミノ−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド(920 mg, 3.48 mmol)のピリジン溶液(15 mL)に、0℃で４−フルオロベンゾイルクロリド(0.411 ｍL, 3.48 mmol)を加え、混合物を室温まで戻し、その後室温で１時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、有機層を水（ｘ２）、飽和食塩水で順に洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。得られた固体を回収し、５０％ヘキサン−酢酸エチル溶液で洗浄して、1.04gの標記化合物を得た（収率77%）。
【０１７０】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.73 (s, 3H), 6.88 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.46 (t, 2H, J = 8.8 Hz), 7.6-7.75 (m, 3H), 7.84 (br, 1H), 7.96 (dd, 2H, J = 8.8, 5.2 Hz), 9.89 (s, 1H), 12.58 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 386.9.
【０１７１】
実施例５９、１０５、１１２、１１５
下記表６に示す化合物は、適当な出発物質を用いて上記実施例２１の方法に従い合成した。
【０１７２】
【表６】
【０１７３】
実施例２２
２−（４−メトキシフェニルアミノ）−５−［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ベンズアミド］チアゾール−４−カルボキサミド
【０１７４】
【化２１】
【０１７５】
５−（４−フルオロベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド(50 mg, 0.13 mmol)および１−メチルピペラジン (0.072 ｍL, 0.65 mmol)のN−メチルピロリドン溶液 (0.6 mL)をマイクロウェーブ反応装置で40分間処理した（CEM corp, 180℃）。反応混合物を濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、０−１２％メタノール−クロロホルム溶液で溶出して38 mgの標記化合物を得た(収率63%)。
【０１７６】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 2.23 (s, 3H), 2.3-2.7 (m, 4H), 3.2-3.5 (m, 4H), 3.72 (s, 3H), 6.88 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.08 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.58 (br, 1H), 7.65 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.73 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.76 (br, 1H), 9.82 (s, 1H), 12.39 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 467.0.
【０１７７】
実施例２３−２４、２７−３２、４３、４９、５５−５６、７２、７４−７５、７７−７８、８４、８６−８９、１０６、１１１、１１３
下記表７−１〜表７−６に示される化合物は、適当な出発物質を用いて上記実施例２２の方法に従い合成した。
【０１７８】
【表７−１】
【０１７９】
【表７−２】
【０１８０】
【表７−３】
【０１８１】
【表７−４】
【０１８２】
【表７−５】
【０１８３】
【表７−６】
【０１８４】
実施例２５
５−（４−アセトアミドベンズアミド）−２−（４−アセトアミドフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０１８５】
【化２２】
【０１８６】
５−（４−アセトアミドベンズアミド）−２−（４−アミノフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド(50 mg, 0.12 mmol)のピリジン溶液(2 mL)に、窒素気流下、0 ℃で塩化アセチル(14.4 mg, 0.182 mmol)を加え、その後、混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物を濃縮して得られた残渣を１M塩酸に懸濁させた。析出した固体を濾取し、ヘキサン、メタノールで順に洗浄後、乾燥して52 mgの標記化合物を得た(収率76%)。
【０１８７】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 2.01 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 7.51 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.66 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.73 (s, 1H), 7.8-7.9 (m, 5H), 9.81 (s, 1H), 9.98 (s, 1H), 10.34 (s, 1H), 12.54 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 453.4.
【０１８８】
実施例３３
５−（４−アミノベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０１８９】
【化２３】
【０１９０】
(a)２−（４−メトキシフェニルアミノ）−５−（４−ニトロベンズアミド）チアゾール−４−カルボキサミド
【０１９１】
【化２４】
【０１９２】
4−ニトロベンゾイル クロライド(0.7 g, 3.78 mmol)のピリジン溶液(6 mL) に5−アミノ−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−4−カルボキサミド (1 g, 3.7 mmol) のピリジン溶液 (6 mL)を0 ℃で加え、混合物を12時間室温で攪拌した。溶媒を留去して得られた残渣を水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。有機層を１M 塩酸 (2 x 100 mL)、水 (2 x 50 mL)、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(2x50mL)、水 (50 mL) 次いで食塩水(50 mL)で順次洗浄した。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去して標記化合物0.41 g (収率27%) を得た。得られた化合物を更なる精製をすることなく次の工程に使用した。
【０１９３】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.70 (s, 3H), 6.88 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 7.66 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 7.70 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 8.13 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 8.43 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 9.93 (s, 1H), 12.76 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 414.2.
【０１９４】
(b)５−（４−アミノベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０１９５】
【化２５】
【０１９６】
２−（４−メトキシフェニルアミノ）−５−（４−ニトロベンズアミド）チアゾール−４−カルボキサミド(0.1g, 0.24 mmol)のTHF-EtOH溶液(1:1, 30 mL)に塩化すず(II)2水和物(0.27 g, 1.2 mmol)を室温で加え、その後混合物を５時間還流した。反応混合物を濃縮して得られた残渣を酢酸エチルで希釈した。この溶液に、１M水酸化ナトリウム水溶液を溶液が塩基性(pH = 8−9)になるまで加えた。有機層を分離し、さらに水層を酢酸エチルで抽出した(2 x 50 mL)。得られた有機層を合わせ、セライト濾過した。濾液を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。得られた固体を回収し、ヘキサンで洗浄し、39 mgの標記化合物を得た(収率42%)。
【０１９７】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.72 (s, 3H), 6.03 (s, 2H), 6.65 (d, 2H, J = 8.3 Hz), 6.87 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.53 (s, 1H), 7.58 (d, 2H, J = 8.3 Hz), 7.54 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.70 (s, 1H), 9.78 (s, 1H), 12.25 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 384.0.
【０１９８】
実施例３５
５−（４−ヒドロキシベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０１９９】
【化２６】
【０２００】
(a)４−［４−カルバモイル−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−５−イルカルバモイル］フェニルアセテート
【０２０１】
【化２７】
【０２０２】
４−アセトキシ安息香酸(350 mg, 1.97 mmol) のジクロロメタン懸濁溶液(36 mL)に、塩化オキザリル(0.696 mL, 7.95 mmol)および触媒量のDMFを0 ℃で加え、混合溶液を室温で５時間撹拌した。溶媒を留去したのち、窒素気流下、残存する塩化オキザリルをトルエンとの共沸により取り除いた。得られた酸塩化物を、５−アミノ−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド(350 mg, 1.32 mmol)のピリジン溶液(10 mL)に0 ℃で加え、混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物に氷水を加えて反応を停止し、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で２回洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。得られた残渣を５０％酢酸エチル−ジエチルエーテル溶液に懸濁させて得られた固体を濾取し、５０％酢酸エチル−ジエチルエーテル溶液で洗浄して、382mgの標記化合物を得た(収率68%)。
【０２０３】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 2.32 (s, 3H), 3.73 (s, 3H), 6.89 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.39 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.6-7.7 (m, 3H), 7.84 (br, 1H), 7.94 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 9.90 (s, 1H), 12.59 (s, 1H).
【０２０４】
(b) ５−（４−ヒドロキシベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０２０５】
【化２８】
【０２０６】
４−［４−カルバモイル−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−５−イルカルバモイル］フェニルアセテート(350 mg, 0.821 mmol)の乾燥メタノール溶液(45 mL)に炭酸カリウム(113 mg, 0.821 mmol)を加え、混合物を50℃で20分間撹拌した。反応混合物を0℃に冷却し、水で希釈した。この溶液に２M塩酸(0.5 mL)を加えて酸性にした。生じた固体を濾取し、水で洗浄して250mgの標記化合物を得た(収率79%)。
【０２０７】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.72 (s, 3H), 6.88 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 6.95 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.60 (br, 1H), 7.65 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.7-7.8 (m, 3H), 9.84 (s, 1H), 10.40 (br, 1H), 12.42 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 384.8.
【０２０８】
実施例３７
５−［４−（２−ヒドロキシアセトアミド）ベンズアミド］−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−4−カルボキサミド
【０２０９】
【化２９】
【０２１０】
５−（４−アミノベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−4−カルボキサミド(0.05g, 0.13 mmol)とトリエチルアミン(0.018 mL)のTHF溶液(10 mL)にアセトキシアセチルクロリド (0.016 mL, 0.16 mmol)を0 ℃で滴下し、その後混合物を室温で2時間撹拌した。反応混合物を水で希釈し、酢酸エチルで抽出した(3 x 20 mL)。得られた有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。得られた固体をメタノール(5 mL)に溶解し、炭酸カリウム(30 mg, 0.22 mmol)および触媒量の水を加えた。混合物を室温で1時間撹拌した。溶媒を留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、２％メタノール−DCM溶液で溶出して7 mgの標記化合物を得た(収率9%)。
【０２１１】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.72 (s, 3H), 4.04 (d, 2H, J = 5.8 Hz), 5.7-5.8 (m, 1H), 6.88 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.6-7.7 (m, 3H), 7.80 (s, 1H), 7.85 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.94 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 9.86 (s, 1H), 10.07 (s, 1H), 12.51 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 442.3.
【０２１２】
実施例３８
５−｛４−［２−（ジメチルアミノ）アセトアミド］ベンズアミド｝−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０２１３】
【化３０】
【０２１４】
(a) ５−［４−（２−ブロモアセトアミド）ベンズアミド］−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０２１５】
【化３１】
【０２１６】
５−（４−アミノベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−4−カルボキサミド(0.3 g, 0.78 mmol)とトリエチルアミン(0.213 mL, 1.56 mmol)のTHF溶液(30 mL)にブロモアセチルクロリド (135 mg, 0.86 mmol)を0 ℃で滴下し、その後混合物を室温で４時間撹拌した。反応混合物を水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。得られた固体をメタノールで洗浄後、乾燥させて0.3 gの標記化合物を得た(収率75%)。
【０２１７】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.72 (s, 3H), 4.09 (s, 2H), 6.88 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.6-7.7 (m, 3H), 7.8-7.9 (m, 5H), 9.86 (s, 1H), 10.75 (s, 1H), 12.52 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 506.2.
【０２１８】
(b) ５−｛４−［２−（ジメチルアミノ）アセトアミド］ベンズアミド｝−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０２１９】
【化３２】
【０２２０】
ジメチルアミン(11% メタノール溶液, 0.07 mL, 0.138 mmol)のTHF溶液(10 mL)に炭酸水素ナトリウム (11.5 mg, 0.138 mmol)を加え、混合物を室温で１５分間撹拌した。５−［４−（２−ブロモアセトアミド）ベンズアミド］−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド(70 mg, 0.138 mmol)のTHF溶液をこの溶液に0 ℃でゆっくり加え、混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を留去して得られた残渣に水(10 mL)を加えた。析出した固体を濾取して、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、60％酢酸エチル−ヘキサン溶液で溶出して15 mgの標記化合物を得た(収率23%)。
【０２２１】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 2.28 (s, 6H), 3.12 (s, 2H), 3.72 (s, 3H), 6.88 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.6-7.7 (m, 3H), 7.80 (s, 1H), 7.83 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.90 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 9.86 (s, 1H), 10.11 (s, 1H), 12.51 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 469.3.
【０２２２】
実施例３９−４２
下記表８に示す各化合物は、適当な出発物質を用いて上記実施例３８の方法に従い合成した。
【０２２３】
【表８】
【０２２４】
実施例４４
２−（４−メトキシフェニルアミノ）−５−｛４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル］ベンズアミド｝チアゾール−４−カルボキサミド
【０２２５】
【化３３】
【０２２６】
５−アミノ−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド(50 mg, 0.189 mmol)およびN,N−ジイソプロピルエチルアミン (27 mg, 0.208 mmol)のDMA溶液(2 mL)に４−クロロメチルベンゾイルクロリド(39 mg, 0.208 mmol)を0℃で加え、混合物を室温で撹拌した。２時間後、１−メチルピペラジン(95 mg, 0.946 mmol)を混合物に加え、さらに室温で３時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、有機層を水で２回洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、０−１２％メタノール−クロロホルム溶液で溶出して34 mgの標記化合物を得た(収率37%)。
【０２２７】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 2.17 (s, 3H), 2.2-2.6 (m, 8H), 3.55 (s, 2H), 3.73 (s, 3H), 6.88 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.53 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 7.6-7.7 (m, 3H), 7.83 (br, 1H), 7.85 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 9.88 (s, 1H), 12.56 (s, 1H), LCMS m/z [M+H] + 481.4.
【０２２８】
実施例９９、１０１、１０７、１０９、１１０
下記表９に示す化合物は、適当な出発物質を用いて上記実施例４４の方法に従い合成した。
【０２２９】
【表９】
【０２３０】
実施例４５
２−（４−メトキシフェニルアミノ）−５−｛４−［２−（ピロリジン−１−イル）エトキシ］ベンズアミド｝チアゾール−４−カルボキサミド
【０２３１】
【化３４】
【０２３２】
５−（４−ヒドロキシベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド(50 mg, 013 mmol)および炭酸カリウム(47 mg, 0.34 mmol)のDMF溶液(2 mL)に２−クロロエチルピロリジン塩酸塩(29 mg, 0.17 mmol)を室温で加え、その後混合物を80℃で２時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水で２回洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、０−１２％メタノール−クロロホルム溶液で溶出して16 mgの標記化合物を得た(収率26%)。
【０２３３】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 1.5-1.8 (m, 4H), 2.3-2.6 (m, 4H), 2.7-3.0 (m, 2H), 3.73 (s, 3H), 4.18 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 6.88 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.17 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.63 (br, 1H), 7.66 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.80 (br, 1H), 7.84 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 9.86 (s, 1H), 12.49 (s, 1H), LCMS m/z [M+H] + 482.4.
【０２３４】
実施例５８、６０、１２２
下記表１０に示す化合物は、適当な出発物質を用いて上記実施例４５の方法に従い合成した。
【０２３５】
【表１０】
【０２３６】
実施例４７
５−（４−メトキシベンズアミド）−２−（ピリジン−４−イルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０２３７】
【化３５】
【０２３８】
(a)エチル５−アミノ−２−ブロモチアゾール−４−カルボキシレート
【０２３９】
【化３６】
【０２４０】
N−ブロモスクシンイミド(0.54 g, 3.03 mmol)を、Golankiewiczらの方法(Tetrahedron, 41 (24), 5989-5994 (1985))により製造した５−アミノチアゾール−４−カルボン酸エチルエステル(0.44 g, 2.53 mmol)のアセトニトリル溶液(10 mL)に加え、混合物を３０分間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル(50 mL)で希釈し、5% 炭酸カリウム水溶液 (25 mL)、続いて飽和食塩水 (25mL)で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、１５％酢酸エチル−ヘキサン溶液で溶出して0.37 gの標記化合物を得た(収率58%)。
【０２４１】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 1.38 (t, 3H, J = 7.1 Hz), 4.37 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 6.02 (s, 2H). LCMS m/z [M+H] + 253.1.
【０２４２】
(b)エチル２−ブロモ−５−（４−メトキシベンズアミド）チアゾール−４−カルボキシレート
【０２４３】
【化３７】
【０２４４】
ｐ−アニソイルクロリド(1.87 g, 11 mmol)のピリジン溶液(30 mL)にエチル５−アミノ−２−ブロモチアゾール−４−カルボキシレート(1.5 g, 5.5 mmol)のピリジン溶液(52 mL)を0 ℃で１０分間かけて滴下し、その後混合物を室温で７２時間撹拌した。反応混合物を１M塩酸で希釈し、酢酸エチルで抽出した(4 x 200 mL)。得られた有機層を合わせ、飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、１０％酢酸エチル−ヘキサン溶液で溶出して1.35gの標記化合物を得た(収率58%)。
【０２４５】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 1.45 (t, 3H, J = 7.1 Hz), 3.89 (s, 3H), 4.48 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 7.02 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.96 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 11.72 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 385.2.
【０２４６】
(c)エチル５−（４−メトキシベンズアミド）−２−（ピリジン−４−イルアミノ）チアゾール−４−カルボキシレート
【０２４７】
【化３８】
【０２４８】
エチル２−ブロモ−５−（４−メトキシベンズアミド）チアゾール−４−カルボキシレート(0.2 g, 0.519 mmol)の１，４−ジオキサン溶液(18 mL)にアルゴン気流下、Xantphos (0.060 g, 0.1 mmol)およびPd2 (dba)3 (0.047g, 0.05 mmol)を加えた。さらに炭酸セシウム(0.337g, 1.03 mmol)および４−アミノピリジン(0.048 g, 0.519 mmol)を加え、混合物を５時間還流した。反応混合物をセライト濾過し、そのセライトを酢酸エチルで洗浄した(3 x 5 mL)。濾液を濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、４０％酢酸エチル−ヘキサン溶液で溶出して54 mgの標記化合物を得た(収率26%)。
【０２４９】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 1.38 (t, 3H, J = 7.2 Hz), 3.87 (s, 3H), 4.42 (q, 2H, J = 7.0 Hz), 7.17 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 7.58 (d, 2H, J = 5.6 Hz), 7.92 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 8.39 (d, 2H, J = 5.2 Hz), 10.60 (s, 1H), 11.39 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 399.1.
【０２５０】
(d)５−（４−メトキシベンズアミド）−２−（ピリジン−４−イルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０２５１】
【化３９】
【０２５２】
エチル５−（４−メトキシベンズアミド）−２−（ピリジン−４−イルアミノ）チアゾール−４−カルボキシレート(0.05 g, 0.12 mmol)のTHF溶液(3 mL)に7Mアンモニア−メタノール溶液(7mL)を加え、封管中80 ℃で５時間加熱した。溶媒を留去して得られた固体を集め、エーテルで洗浄後、乾燥して、21 mgの標記化合物を得た(収率45%)。
【０２５３】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.86 (s, 3H), 7.16 (d, 2H, J = 8.3 Hz), 7.6-7.8 (m, 2H), 7.8-8.0 (m, 4H), 8.3-8.4 (m, 2H), 10.50 (s, 1H), 12.58 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 370.4.
【０２５４】
実施例５０、５１、５７
表１１に示す各化合物は、適当な出発物質を用いて実施例４７の方法に従い合成した。
【０２５５】
【表１１】
【０２５６】
実施例４８
２−（４−メトキシフェニルアミノ）−５−｛４−［N−（メチルスルホニル）メチルスルホンアミド］ベンズアミド｝チアゾール−４−カルボキサミド
【０２５７】
【化４０】
【０２５８】
５−（４−アミノベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド(0.150 g, 0.3916 mmol)とトリエチルアミン(0.2 mL, 1.56 mmol)のTHF溶液(10 mL)に塩化メタンスルホニル(0.09 mL, 1.174 mmol)を0℃で滴下し、その後混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物を濃縮した。水を油状残渣に加えて析出した固体を濾取して、100 mgの標記化合物を得た(収率47%)。
【０２５９】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.59 (s, 6H), 3.72 (s, 3H), 6.88 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.6-7.7 (m, 3H), 7.78 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.86 (br, 1H), 7.97 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 9.91 (s, 1H), 12.63 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 540.4.
【０２６０】
実施例５３
２−（４−メトキシフェニルアミノ）−５−［４−（メチルスルホンアミド）ベンズアミド］チアゾール−４−カルボキサミド
【０２６１】
【化４１】
【０２６２】
５−（４−アミノベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド(0.06 g, 0.156 mmol)のTHF溶液(10 mL)に新たに蒸留した塩化メタンスルホニル(0.02 mL, 0.313 mmol)を0℃で滴下し、続いてトリエチルアミン(0.06 mL, 0.468 mmol)を0℃で加えた。混合物を室温で１２時間撹拌した。反応を完結させるため、さらに０．５モル当量の塩化メタンスルホニルおよび１当量のトリエチルアミンを混合物に加え、一晩撹拌した。反応混合物を濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、５０％酢酸エチル−ヘキサン溶液で溶出して11.5 mgの標記化合物を得た(収率15%)。
【０２６３】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 33.12 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 6.87 (d, 2H, J = 8.9 Hz), 7.36 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.64 (br, 2H), 7.65 (d, 4H, J = 9.0 Hz), 7.82 (br, 1H), 7.85 (t, 2H, J = 8.6 Hz), 9.88 (s, 1H), 12.50 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 462.2.
【０２６４】
実施例６４
５−（３−アミノ−４−メチルベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０２６５】
【化４２】
【０２６６】
２−（４−メトキシフェニルアミノ）−５−（４−メチル−３−ニトロベンズアミド）チアゾール−４−カルボキサミド(0.2 g, 0.47 mmol)のTHF-MeOH溶液（1:1, 100 mL）に10％パラジウム／炭素（0.02 g）を室温で加え、その混合物を水素ガス雰囲気化で１２時間撹拌した。反応混合物をセライトで濾過した。濾液を濃縮し、0.165 g (収率89%)の標記化合物を得た。
【０２６７】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 2.12 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 5.25 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.88 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.95 (d, 1H, J = 7.5 Hz), 7.12 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.17 (s, 1H), 7.58 (s, 1H), 7.65 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.75 (s, 1H), 9.83 (s, 1H), 12.34 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 398.2.
【０２６８】
実施例８５、９０、９３、１０８
下記表１２に示す化合物は、適当な出発物質を用いて上記実施例６４の方法に従い合成した。
【０２６９】
【表１２】
【０２７０】
実施例６７
５−（４−メトキシベンズアミド）−２−［４−（２−メトキシエトキシ）フェニルアミノ］チアゾール−４−カルボキサミド
【０２７１】
【化４３】
【０２７２】
（a）１−（２−メトキシエトキシ）−４−ニトロベンゼン
【０２７３】
【化４４】
【０２７４】
１−フルオロ−４−ニトロベンゼン（2.00 g, 14.18 mmol）、２−メトキシエタノール（1.28 g, 16.84 mmol）および水酸化カリウム（1.37 g, 21.07 mmol）のDMSO溶液（30 mL）を６０℃で２０時間加熱した。反応混合物を水（50 mL）で希釈し、酢酸エチルで抽出した（３×１００ mL）。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、１０％酢酸エチル−ヘキサン溶液で溶出して、0.37 g（収率13%）の標記化合物を得た。
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.31 (s, 3H), 3.69 (t, 2H, J = 4.4 Hz), 4.25 (t, 2H, J = 4.1 Hz), 7.16 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 8.20 (d, 2H, J = 9.0 Hz). LCMS m/z [M+H] + 198.4.
【０２７５】
（ｂ）４−（２−メトキシエトキシ）ベンゼンアミン
【０２７６】
【化４５】
【０２７７】
１−（２−メトキシエトキシ）−４−ニトロベンゼン（0.37 g, 1.88 mmol）のTHF-MeOH溶液（1:1, 60 mL）に10％パラジウム／炭素（0.04 g）を室温で加え、その混合物を水素ガス雰囲気化で３時間撹拌した。反応混合物をセライトで濾過した。濾液を濃縮し、0.31 g (収率99%)の標記化合物を得た。
【０２７８】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.28 (s, 3H), 3.57 (t, 2H, J = 4.7 Hz), 3.91 (t, 2H, J = 4.1 Hz), 4.58 (s, 2H), 6.49 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 6.63 (d, 2H, J = 8.4 Hz). LCMS m/z [M+H] + 168.4.
【０２７９】
（ｃ）１−イソチオシアネート−４−（２−メトキシエトキシ）ベンゼン
【０２８０】
【化４６】
【０２８１】
４−（２−メトキシエトキシ）ベンゼンアミン（0.31 g, 1.85 mmol）のDCM溶液（40 mL）にチオカルボニルジイミダゾール（0.39 g, 2.2 mmol）を０℃で加え、２時間撹拌した。反応混合物を濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、１０％酢酸エチル−ヘキサン溶液で溶出して、0.37 g（収率96%）の標記化合物を得た。
【０２８２】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.29 (s, 3H), 3.64 (q, 2H, J = 3.0 Hz), 4.11 (q, 2H, J = 4.4 Hz), 6.99 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 7.38 (d, 2H, J = 9.0 Hz). LCMS m/z [M+H] + 210.4.
【０２８３】
(d)５−アミノ−２−［４−（２−メトキシエトキシ）フェニルアミノ］チアゾール−４−カルボキサミド
【０２８４】
【化４７】
【０２８５】
１−イソチオシアネート−４−（２−メトキシエトキシ）ベンゼン（0.37 g, 1.78 mmol）及び２−アミノ−２−シアノアセトアミド（0.18 g, 1.78 mmol）の酢酸エチル溶液（15 mL）を１時間還流した。反応混合物を濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、１０％MeOH−DCM溶液で溶出して、0.2 g（収率36%）の標記化合物を得た。
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.4 (s, 3H), 3.6-3.7 (m, 2H), 4.0-4.1 (m, 2H), 6.60 (br, 1H), 6.75-6.90 (m, 4H), 7.49 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 9.33 (s, 1H).
【０２８６】
(e)５−（４−メトキシベンズアミド）−２−［４−（２−メトキシエトキシ）フェニルアミノ］チアゾール−４−カルボキサミド
【０２８７】
【化４８】
【０２８８】
ｐ−メトキシベンゾイルクロリド（0.074 g, 0.44 mmol）のピリジン溶液（5 mL）に、５−アミノ−２−［４−（２−メトキシエトキシ）フェニルアミノ］チアゾール−４−カルボキサミド（0.15 g, 0.49 mmol）のピリジン溶液（3 mL）を０℃で加え、混合物を室温まで上昇させ、室温で１２時間撹拌した。反応混合物を濃縮して得られた残渣を酢酸エチルに溶解し、１M塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で順に洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮して、0.026 g（収率12%）の標記化合物を得た。
【０２８９】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.27 (s, 3H), 3.6-3.7 (m, 2H), 3.86 (s, 3H), 4.0-4.1 (m, 2H), 6.88 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.15 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.6-7.7 (m, 3H), 7.79 (s, 1H), 7.85 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 9.86 (s, 1H), 12.49 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 443.4.
【０２９０】
実施例７０
２−（６−アミノピリジン−３−イルアミノ)−５−（４−メトキシベンズアミド）チアゾール−４−カルボキサミド
【０２９１】
【化４９】
【０２９２】
(a) tert-ブチル ５−イソチオシアネートピリジン−２−イルカルバメート
【０２９３】
【化５０】
【０２９４】
撹拌しているtert-ブチル ５−アミノピリジン−２−イルカルバメート（0.35 g, 1.67 mmol）のTHF溶液（20 mL）に、０℃でトリエチルアミン（0.70 mL, 5.02 mmol）とチオホスゲン（0.13 mL, 1.67 mmol）をゆっくり加え、その混合物を室温で４０分間撹拌した。反応混合物に氷水を加えて反応を停止し、ジエチルエーテル（70 mL）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。残留固体を集め、ｎ−ヘキサンで洗浄して、261 mg（収率62%）の標記化合物を得た。
【０２９５】
1 H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 1.53 (s, 9H), 7.4-7.55 (m, 2H), 7.97 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 8.17 (d, 1H, J = 2.4 Hz).
【０２９６】
(b) tert-ブチル ５−（５−アミノ−４−カルバモイルチアゾール−２−イルアミノ）ピリジン−２−イルカルバメート
【０２９７】
【化５１】
【０２９８】
tert-ブチル ５−イソチオシアネートピリジン−２−イルカルバメート (261 mg, 1.04 mmol)および２−アミノ−２−シアノアセトアミド（103 mg, 1.04 mmol）の酢酸エチル溶液（14 mL）を４５分間還流した。反応混合物を室温まで冷却したのち、析出した沈殿をろ別し、濾液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、０％〜９％MeOH−CHCl3溶液で溶出して、219 mg（収率60%）の標記化合物を得た。
【０２９９】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 1.47 (s, 9H), 6.68 (s, 2H), 6.8-7.0 (m, 2H), 7.68 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 8.23 (dd, 1H, J = 8.8, 2.8 Hz), 8.28 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 9.44 (s, 1H), 9.62 (s, 1H).
【０３００】
(c) tert-ブチル ５−［５−（４−メトキシベンズアミド）−４−カルバモイルチアゾール−２−イルアミノ］ピリジン−２−イルカルバメート
【０３０１】
【化５２】
【０３０２】
tert-ブチル ５−（５−アミノ−４−カルバモイルチアゾール−２−イルアミノ）ピリジン−２−イルカルバメート（219 mg, 0.626 mmol）のピリジン溶液（3 mL）に、４−メトキシベンゾイルクロリド（0.089 mL, 0.657 mmol）を０℃で加えた。混合物を室温で１晩撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を留去して得られた固体を集め、酢酸エチル及びジエチルエーテルで洗浄して、219 mg（収率72%）の標記化合物を得た。
【０３０３】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 1.47 (s, 9H), 3.86 (s, 3H), 7.16 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.75-7.85 (m, 2H), 7.87 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 8.35-8.5 (m, 2H), 9.52 (s, 1H), 10.13 (s, 1H), 12.56 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 485.0.
【０３０４】
(d)２−（６−アミノピリジン−３−イルアミノ）−５−（４−メトキシベンズアミド）チアゾール−４−カルボキサミド
【０３０５】
【化５３】
【０３０６】
tert-ブチル ５−［５−（４−メトキシベンズアミド）−４−カルバモイルチアゾール−２−イルアミノ］ピリジン−２−イルカルバメート（100 mg, 0.206 mmol）の１，４−ジオキサン懸濁溶液（5 mL）に４M塩酸−ジオキサン（5 mL）を０℃で加えたのち、室温で１晩撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。油状残留物に酢酸エチルおよび飽和炭酸水素ナトリウムを加えて析出した固体をろ取した。得られた固体を酢酸エチル及び水で洗浄し、50 mg（収率63%）標記化合物を得た。
【０３０７】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.86 (s, 3H), 5.62 (s, 2H), 6.46 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.15 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.58 (br, 1H), 7.76 (br, 1H), 7.85 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.92 (dd, 1H, J = 8.8, 2.8 Hz), 8.10 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 9.59 (s, 1H), 12.48 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 385.4.
【０３０８】
実施例７９
表１３に示す実施例７９は、適当な出発物質を用いて上記実施例７０の方法に従い合成した。
【０３０９】
【表１３】
【０３１０】
実施例８０
５−（３−アミノ−４−メトキシベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０３１１】
【化５４】
【０３１２】
(a)５−（４−メトキシ−３−ニトロベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０３１３】
【化５５】
【０３１４】
４−メトキシ−３−ニトロ安息香酸（112 mg, 0.569 mmol）のDCM懸濁溶液（15 mL）にオキザリルクロリド（0.199 mL, 2.27 mmol）及び触媒量のDMFを０℃で加えた。混合物を室温で４時間撹拌した。溶媒を留去したのち、窒素気流下、残存する塩化オキザリルをトルエンとの共沸により取り除いた。得られた酸塩化物を５−アミノ−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド(100 mg, 0.378 mmol)のピリジン溶液(２ mL)に０℃で加え、混合物を室温で１晩撹拌した。反応混合物に氷水を加えて反応を停止させ、酢酸エチルで希釈した。析出した固体を濾取し、５０％酢酸エチル−ジエチルエーテル溶液で洗浄して、98 mg（収率58%）の標記化合物を得た。
【０３１５】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.73 (s, 3H), 4.04 (s, 3H), 6.88 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.61 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.66 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.68 (br, 1H), 7.86 (br, 1H), 8.13 (dd, 1H, J = 8.8, 2.4 Hz), 8.37 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 9.91 (s, 1H), 12.64 (s, 1H).
【０３１６】
(b) ５−（３−アミノ−４−メトキシベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０３１７】
【化５６】
【０３１８】
５−（４−メトキシ−３−ニトロベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド（50 mg, 0.113 mmol）のエーテル水溶液（12.5 mL, 4:1）にFe (63 mg, 1.13 mmol)およびNH4Cl (3.0 mg, 0.056 mmol)を加え、混合物を１時間還流した。室温まで冷却後、不溶物をセライト濾過し、エタノール及び酢酸エチルで洗浄した。濾液を減圧下で濃縮して得られた固体を酢酸エチルで洗浄して、25 mg（収率54%）の標記化合物を得た。
【０３１９】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.73 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 5.12 (s, 2H), 6.88 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 6.97 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.10 (dd, 1H, J = 8.4, 2.0 Hz), 7.21 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.57 (br, 1H), 7.65 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.74 (br, 1H), 9.83 (s, 1H), 12.31 (s, 1H). LCMS m/z [M+H]+ 414.0.
【０３２０】
実施例８３
５−（３−アミノ−４−フルオロベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０３２１】
【化５７】
【０３２２】
５−（４−フルオロ−３−ニトロベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド（50 mg, 0.116 mmol）のエタノール−水溶液（10：2.5 mL）にFe (65 mg, 1.16 mmol)およびNH4Cl (3.1 mg, 0.058 mmol)を加え、混合物を１時間還流した。室温まで冷却後、不溶物をセライト濾過し、エタノール及び酢酸エチルで洗浄した。濾液を減圧下で濃縮して得られた固体を回収し、酢酸エチルで洗浄して、10 mg（収率21%）の標記化合物を得た。
【０３２３】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ (ppm) 3.73 (s, 3H), 5.59 (s, 2H), 6.88 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.95-7.1 (m, 1H), 7.20 (dd, 1H, J = 10.8, 8.8 Hz), 7.34 (d, 1H, J = 6.4 Hz), 7.61 (br, 1H), 7.65 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.78 (br, 1H), 9.84 (s, 1H), 12.39 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 401.9.
【０３２４】
実施例１１４、１１６
下記表１４に示す化合物は、適当な出発物質を用いて上記実施例８３の方法に従い合成した。
【０３２５】
【表１４】
【０３２６】
実施例９１
表１５に示す実施例９１は、適当な出発物質を用いて下記実施例９４の方法に従い合成した。
【０３２７】
【表１５】
【０３２８】
実施例９４
５−（４−メトキシベンズアミド）−２−[４−（２−プロピニルオキシ）フェニルアミノ]チアゾール−４−カルボキサミド
【０３２９】
【化５８】
【０３３０】
（a）１−ニトロ−４−（２−プロピニルオキシ）ベンゼン
【０３３１】
【化５９】
【０３３２】
４−ニトロフェノール（2.00 g, 14.28 mmol）、プロパギルブロミド（1.33 mL, 15.10 mmol）、０．８M水酸化ナトリウム水溶液（18mL）及びｎ−テトラブチルアンモニウムブロミド（0.46 g, 1.44 mmol）のトルエン溶液（8 mL）を６０℃で２４時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、析出した固体をろ取した。固体をジオキサンに溶解した溶液に水を加えた。生じた固体をろ取し、水で洗浄して、1.75 g（収率68%）の標記化合物を得た。
【０３３３】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 2.58 (s, 1H), 4.79 (d, 2H, J = 1.4 Hz), 7.05 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 8.22 (d, 2H, J = 9.2 Hz).
【０３３４】
(b)４−（２−プロピニルオキシ）ベンゼンアミン
【０３３５】
【化６０】
【０３３６】
１−ニトロ−４−（２−プロピニルオキシ）ベンゼン（1.0 g, 5.6 mmol）のメタノール溶液（25 mL）に10％パラジウム／炭素（0.1 g）を室温で加え、混合物を水素ガス雰囲気化で１６時間撹拌した。反応混合物をセライトで濾過した。濾液を濃縮し、0.65 g (収率78%)の標記化合物を得た。
【０３３７】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 2.50 (s, 1H), 4.59 (s, 2H), 6.48 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 8.62 (d, 2H, J = 9.5 Hz).
【０３３８】
（ｃ）１−イソチアシアネート−４−（２−プロピニルオキシ）ベンゼン
【０３３９】
【化６１】
【０３４０】
４−（２−プロピニルオキシ）ベンゼンアミン（0.45 g, 3.06 mmol）及びトリエチルアミン（0.6 mL, 6.13 mmol）のDCM溶液（25 mL）にチオホスゲン(0.28 mL, 3.67 mmol)を０℃で滴下し、その後混合物を室温で９０分間撹拌した。反応混合物に水を加えて反応を停止し、DCMで抽出した(2 x 100 mL)。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮して0.51 gの標記化合物(収率88%)を得た。
【０３４１】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 2.52 (s, 1H), 4.68 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 6.92 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.17 (d, 2H, J = 8.6 Hz).
【０３４２】
（ｄ）５−アミノ−２−［４−（２−プロピニルオキシ）フェニルアミノ］チアゾール−４−カルボキサミド
【０３４３】
【化６２】
【０３４４】
１−イソチアシアネート−４−（２−プロピニルオキシ）ベンゼン（0.51 g, 2.73 mmol）および２−アミノ−２−シアノアセタミド（0.27 g, 2.73 mmol）の酢酸エチル溶液(15
mL)を３時間還流した。反応混合物を濃縮して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、５％メタノール−DCM溶液で溶出して0.2 g（収率36％）の標記化合物を得た。
【０３４５】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.53 (s, 1H), 3.6-3.7 (m, 2H), 4.0-4.1 (m, 2H), 6.60 (br, 1H), 6.75-6.90 (m, 4H), 7.49 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 9.33 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 289.0.
【０３４６】
（ｅ）５−（４−メトキシベンズアミド）−２−[４−（２−プロピニルオキシ）フェニルアミノ]チアゾール−４−カルボキサミド
【０３４７】
【化６３】
【０３４８】
ｐ−アニソイルクロライド（0.179 g, 1.05 mmol）のピリジン溶液（5 mL）に、０℃で５−アミノ−２−［４−（２−プロピニルオキシ）フェニルアミノ］チアゾール−４−カルボキサミド（0.2 g, 0.70 mmol）のピリジン溶液（5 mL）を加え、混合物を０℃で３時間撹拌した。反応混合物を濃縮して得られた残渣を１M塩酸（10 mL）に溶解し、析出した固体をろ取した。固体を酢酸エチル（10 mL）、メタノール（10 mL）で洗浄し、乾燥して、0.2 g（収率68%）の標記化合物を得た。
【０３４９】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.55 (s, 1H), 3.85 (s, 3H), 4.74 (s, 2H), 6.93 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 7.15 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.6-7.7 (m, 3H), 7.79 (s, 1H), 7.85 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 9.91 (s, 1H), 12.51 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 423.0.
【０３５０】
実施例１０３
５−（３，４−ジアミノベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０３５１】
【化６４】
【０３５２】
（ａ）５−（４−アミノ−３−ニトロベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０３５３】
【化６５】
【０３５４】
５−（４−フルオロ−３−ニトロベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド（35 mg, 0.081 mmol）及び28%アンモニア水（0.7 mL）のDMA溶液（0.3 mL）をマイクロウェーブ反応装置で３０分間処理した（Biotage社製、６０℃）。反応混合物を水で希釈して得られた固体を回収し、水で洗浄して、30 mg（収率86%）標記化合物を得た。
【０３５５】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.73 (s, 3H), 6.88 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.16 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 7.5-7.7 (m, 3H), 7.75-7.9 (m, 2H), 8.02 (br, 2H), 8.55 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 9.86 (s, 1H), 12.55 (s, 1H).
【０３５６】
（ｂ）５−（３，４−ジアミノベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０３５７】
【化６６】
【０３５８】
５−（４−アミノ−３−ニトロベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド（30 mg, 0.070 mmol）のエタノール−水溶液（10-2.5 mL）にFe（39 mg, 0.70 mmol）およびNH4Cl（1.9 mg, 0.035 mmol）を加え、混合物を３時間還流した。室温まで冷却後、不溶物をセライト濾過し、エタノール及び酢酸エチルで洗浄した。濾液を減圧下で濃縮して得られた固体を回収し、酢酸エチル及び水で洗浄して、15 mg（収率52%）の標記化合物を得た。
【０３５９】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) δ 3.72 (s, 3H), 5.35 (br, 2H), 6.61 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 6.88 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.01 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.12 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.51 (br, 1H), 7.64 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.68 (br, 1H), 9.76 (s, 1H), 12.16 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 398.9.
【０３６０】
実施例１１７−１１９、１２３−１２６、１２９
下記表１６−１〜表１６−２に示す化合物は、適当な出発物質を用いて上記実施例１０３の方法に従い合成した。
【０３６１】
【表１６−１】
【０３６２】
【表１６−２】
【０３６３】
実施例１２０
５−［３−アミノ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）ベンズアミド］−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０３６４】
【化６７】
【０３６５】
（ａ）５−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）−３−ニトロベンズアミド］−２−［（４−メトキシフェニル）アミノ］チアゾール−４−カルボキサミド
【０３６６】
【化６８】
【０３６７】
５−（４−フルオロ−３−ニトロベンズアミド）−２−［（４−メトキシフェニル）アミノ］チアゾール−４−カルボキサミド（0.1 g, 0.23 mmol）、エチレングリコール（0.04 mL, 0.69 mmol）及び炭酸カリウム（0.32 g, 2.3 mmol）のNMP溶液（2 mL）をマイクロウェーブ反応装置で４５分間処理した（１２０℃）。反応混合物を水（5 mL）で希釈して得られた固体を回収し、エーテル（20 mL）及び酢酸エチル（20 mL）で順に洗浄して、0.038 g（収率35%）標記化合物を得た。
【０３６８】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.65-3.8 (m, 5H), 4.2-4.4 (m, 2H), 6.88 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.55-7.75 (m, 4H), 7.88 (br, 1H), 8.08 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 8.35 (s, 1H), 9.92 (s, 1H), 12.63 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 474.2.
【０３６９】
（ｂ）５−［３−アミノ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）ベンズアミド］−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０３７０】
【化６９】
【０３７１】
５−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）−３−ニトロベンズアミド］−２−［（４−メトキシフェニル）アミノ］チアゾール−４−カルボキサミド（0.09 g, 0.19 mmol）のTHF-MeOH溶液（1:1, 30 mL）に10％パラジウム／炭素（0.01 g）を室温で加え、その混合物を水素ガス雰囲気化で１２時間撹拌した。反応混合物をセライトで濾過した。濾液を濃縮し、0.005 g (収率6%)の標記化合物を得た。
【０３７２】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.7-3.9 (m, 5H), 3.9-4.1 (m, 2H), 6.88 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 6.95 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.0-7.1 (m, 2H), 7.15 (s, 1H), 7.20 (s, 1H), 7.28 (br, 1H), 7.59 (br, 1H), 7.65 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.76 (br, 1H), 9.85 (s, 1H), 12.32 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 444.4.
【０３７３】
実施例１２８
表１７に示す実施例１２８は、適当な出発物質を用いて上記実施例１２０の方法に従い合成した。
【０３７４】
【表１７】
【０３７５】
実施例１２７
５−［３−アミノ−４−（２−メトキシエトキシ）ベンズアミド］−２−（２−フルオロピリジン−４−イルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０３７６】
【化７０】
【０３７７】
（ａ）４−（２−メトキシエトキシ）−３−ニトロ安息香酸
【０３７８】
【化７１】
【０３７９】
２−メトキシエタノール（0.95 g, 12.5 mmol）のDMF溶液（3 mL）を、NaH（0.64 g, 60%）のDMF懸濁液（3 mL）に０℃でゆっくり加え、混合物を室温で１時間撹拌した。その後、この混合物に４−フルオロ−３−ニトロ安息香酸（1 g, 5.4 mmol）のDMF溶液（4 mL）を０℃で滴下し、室温で１６時間撹拌した。反応混合物に冷１M塩酸を加えて反応を終了させ、酢酸エチル（3x100 mL）で抽出した。合わせた有機層を水、飽和食塩水で順に洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、３０％酢酸エチル−ヘキサン溶液で溶出して、1 g（収率76%）の標記化合物を得た。
【０３８０】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.31 (s, 3H), 3.65-3.75 (m, 2H), 4.3-4.45 (m, 2H), 7.48 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 8.15 (dd, 1H, J = 8.8, 1.8 Hz), 8.33 (d, 1H, J = 1.9 Hz), 13.26 (br, 1H). LCMS m/z [M+H] + 242.2.
【０３８１】
（ｂ）５−［４−（２−メトキシエトキシ）−３−ニトロベンズアミド］−２−（２−フルオロピリジン−４−イルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０３８２】
【化７２】
【０３８３】
４−（２−メトキシエトキシ）−３−ニトロ安息香酸（0.2 g, 0.82 mmol）及び触媒量のDMFの無水DCM溶液（15 mL）に塩化オキザリル(1 mL)を０℃で加え、混合溶液を室温で２時間撹拌した。溶媒を留去したのち、窒素気流下、残存する塩化オキザリルをトルエンとの共沸により取り除いた。得られた酸塩化物をピリジン(15 mL)に溶解し、0 ℃に冷却した。この溶液に５−アミノ−２−［（２−フルオロピリジン−４−イル）アミノ］チアゾール−４−カルボキサミド（0.17 g, 0.066 mmol）のピリジン溶液(10 mL)を０℃で加え、混合物を室温で12時間撹拌した。溶媒を留去後、氷水を残渣に加え、析出した固体を濾取した。固体をメタノールで洗浄して35 mg（収率9%）の標記化合物を得た。
【０３８４】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.2-3.4 (m, 3H), 3.65-3.8 (m, 2H), 4.35-4.5 (m, 2H), 7.44 (br, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.62 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.90 (br, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 8.06 (br, 1H), 8.11 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 8.37 (s, 1H), 10.84 (s, 1H), 12.76 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 477.0.
【０３８５】
（ｃ）５−［３−アミノ−４−（２−メトキシエトキシ）ベンズアミド］−２−（２−フルオロピリジン−４−イルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０３８６】
【化７３】
【０３８７】
５−［４−（２−メトキシエトキシ）−３−ニトロベンズアミド］−２−（２−フルオロピリジン−４−イルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド（0.03 g, 0.063 mmol）のTHF-MeOH溶液（1:1, 40 mL）に10％パラジウム／炭素（0.01 g）を室温で加え、その混合物を水素ガス雰囲気化で１２時間撹拌した。反応混合物をセライトで濾過した。濾液を濃縮し、0.01 g (収率36%)の標記化合物を得た。
【０３８８】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.34 (s, 3H), 3.7-3.8 (m, 2H), 4.25-4.35 (m, 2H), 7.28 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 7.47 (d, 1H, J = 5.1 Hz), 7.5-7.6 (m, 2H), 7.66 (s, 1H), 7.85 (br, 1H), 7.99 (d, 1H, J = 5.7 Hz), 8.03 (br, 1H), 11.03 (s, 1H), 12.61 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 447.5.
【０３８９】
実施例１３０
錠剤の調製：
各々１００ｍｇの５−（４−アセトアミドベンズアミド）−２−（フェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド（化合物１）を含む錠剤は、以下の手順によって得る。
【０３９０】
【表１８】
【０３９１】
手順：
化合物１、コーンスターチおよび微結晶性セルロースを混合し、混合物を、５０重量部の水中に溶解したヒドロキシプロピルセルロースに加え、続いて十分に混練する。混練した混合物は、粒状にするためにふるいにかけ、乾燥し、ステアリン酸マグネシウムと混合し、次に各々が２５０ｍｇの錠剤になるように圧縮する。
【０３９２】
実施例１３１
顆粒剤の調製：
５−（４−アセトアミドベンズアミド）−２−（フェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド（化合物１）を含む顆粒剤を、以下の手順によって得る。
【０３９３】
【表１９】
【０３９４】
手順：
化合物１、ラクトースおよびコーンスターチを混合し、混合物は、１２０重量部の水中に溶解したヒドロキシプロピルセルロースに加え、続いて十分に混練する。混練した混合物を粒状にするために２０メッシュのふるいにかけ、乾燥し、次に大きさを調整して５００ｍｇの顆粒あたり２００ｍｇの化合物１を含む顆粒剤を得た。
【０３９５】
実施例１３２
カプセル剤の調製：
各々が１００ｍｇの５−（４−アセトアミドベンズアミド）−２−（フェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド（化合物１）を含むカプセルを、以下の手順によって得る。
【０３９６】
【表２０】
【０３９７】
手順：
化合物１、ラクトース、コーンスターチおよびステアリン酸マグネシウムを十分に混合し、２００ｍｇの粉末混合物の各々をカプセル化してカプセル剤を得る。
【０３９８】
以下は、背景技術に記載された、本発明の有用性の評価方法についての参照記述の詳細である。
参照方法
方法の要約
免疫沈降、イムノブロット、免疫蛍光顕微鏡、免疫組織化学、質量分析、２−ハイブリッド分析、ルシフェラーゼレポーター分析、コロニー形成、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、体軸形成分析およびアニマルキャップ分析の方法論の詳細は、「詳細な方法」において記載されている。この研究で用いられる抗体は商業的に入手可能である。マウスおよびツメガエル属の実験は、国立がんセンター研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（東京、日本）の、日本の法律によって規定された倫理的要件をすべて満たすガイドラインに従って実行した。信頼できる結果を得るために必要な最少数のマウスを用い、安楽死させた。患者は、研究目的のための材料の収集および使用に権限を与える明文化されたインフォームドコンセントを受けた。実験的プロトコールは、施設内の倫理および組換え安全委員会によって検閲および承認された。
【０３９９】
詳細な方法
【０４００】
細胞株：
ヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３およびヒト大腸癌細胞株ＤＬＤ１は、ヒューマンサイエンス研究資源バンク（Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂａｎｋ）（大阪、日本）から得た。ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａは理研細胞バンク（Ｒｉｋｅｎ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）（筑波、日本）から得た。ヒト大腸癌細胞株のＨＣＴ−１１６およびＷｉＤｒは米国培養菌保存施設（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ロックヴィル、メリーランド）から購入した。
【０４０１】
免疫沈降：
以前に記述されたように、全細胞溶解物を調製した。溶解物を表示された抗体または関連の対照ＩｇＧと共に４℃で一晩インキュベートし、ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）プロテインＧ（ダイナル・バイオテク（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ）社、オスロ、ノルウェー）により沈殿させた。
【０４０２】
イムノブロット分析：
タンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、イモビロンＰメンブレン（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社、ビレリカ、マサチューセッツ）上にブロットした。一晩４℃での一次抗体を用いたインキュベーション後に、ブロットを、関連のホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧ抗体、およびＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社、ジャイルズ、イギリス）により、検出した。ブロットの強度は、ＬＡＳ−３０００スキャナーおよびサイエンス・ラボ（Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂ）２００３ソフトウェア（富士フィルム（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ）社、東京、日本）を用いて定量した。
【０４０３】
質量分析（ＭＳ）：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおけるタンパク質バンドをクマシーブルー染色によって可視化し、以前に記述されたように修飾トリプシン（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社）を用いて消化した。トリプシンペプチドを濃縮し、５００−μｍ ｉ．ｄ．×１ｍｍ ＨｉＱ ｓｉｌ Ｃ１８−３トラッピングカラム（ＫＹＡテクノロジーズ（ＫＹＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社、東京、日本）により脱塩した。次にペプチドを１５０−μｍ ｉ．ｄ．×５ｃｍ Ｃ１８Ｗ−３分離カラム（ＫＹＡ）を用いて、０〜８０％のアセトニトリル勾配（１時間、２００ｎＬ／分）により分画し、ナノスプレーイオン源（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社、フォスターシティー、カリフォルニア）を装備したＱ−スターパルサー−ｉ（Ｑ−Ｓｔａｒ Ｐｕｌｓａｒ−ｉ）質量分析計により分析した。タンパク同定の信頼性は、ＰｒｏＩＤソフトウェア（アプライド・バイオシステムズ社）を用いて、信頼値を計算することによって推定した。
【０４０４】
プラスミド：
ヒトＴＮＩＫ（Ｔｒａｆ２−およびＮｃｋ相互作用キナーゼ）発現コンストラクト［ｐＣＩｎｅｏＨＡ−ＴＮＩＫおよびその変異体（Ｋ５４Ｒ）］は、Ｍ．ウミカワ（Ｕｍｉｋａｗａ）博士およびＫ．カリヤ（Ｋａｒｉｙａ）博士（琉球大学、西原町、日本）によって快く提供された。ＴＮＩＫタンパク質の異なる部分をコードするｃＤＮＡ配列を、ｐＢｉｎｄ（プロメガ社、マディソン、ウイスコンシン）中へサブクローン化した。ヒトＴＣＦ４（Ｔ細胞因子−４）（スプライシング型Ｅ）およびＮＨ２末端の１３４のアミノ酸配列を欠くβ−カテニンｃＤＮＡを、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ４（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）社、セントルイス、ミズーリ）中へサブクローン化した。全長ヒトＴＣＦ４のｃＤＮＡおよびその短縮型をｐＡｃｔ（プロメガ）中へサブクローン化した。ＴＣＦ４Ｓ１５４Ａと称されたＴＣＦ４の変異型は、セリン（Ｓ）１５４残基をアラニン（Ａ）に変化させるために、オリゴＧＧＣＣＣＣＡＴＣＡＣＣＧＧＣＡＣＡＣＡＴＴＧＴＣＴＣＴＡ（［配列番号４］）およびＧＧＧＧＣＡＴＣＣＴＴＧＡＧＧＧＣＴＴＧＴＣＴＡＣＴＣＴＧ（［配列番号５］）により、クィックチェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）変異誘発キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社、ラ・ホーヤ、カリフォルニア）を用いて構築された。全長ヒトＴＣＦ４のｃＤＮＡおよびＴＣＦ４Ｓ１５４ＡのｃＤＮＡを、ｐＥＵ−Ｅ０１−ＭＣＳ（セルフリー・サイエンス（ＣｅｌｌＦｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）社、松山、日本）中へサブクローン化した。
【０４０５】
マンマリアン２−ハイブリッド分析：
ＴＮＩＫタンパク質とＴＣＦ４タンパク質との間の物理的相互作用は、チェックメイトマンマリアン２−ハイブリッドシステム（ＣｈｅｃｋＭａｔｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）（プロメガ社）を用いて、供給業者によって提供される指示に従って評価した。ＨＥＫ２９３細胞を、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００試薬（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社、カールスバード、カリフォルニア）を用いて、ｐＢｉｎｄ、ｐＡｃｔおよびｐＧ５ｌｕｃ（プロメガ社）プラスミドにより三回コトランスフェクションした。
【０４０６】
核タンパク質抽出：
核タンパク質は、ＮＥ−ＰＥＲ核および細胞質抽出試薬（Ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ）（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）社、ロックフォード、イリノイ）を用いて抽出した。
【０４０７】
組換えタンパク質産生：
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質は、ＥＮＤＥＸＴコムギ麦芽発現キット（ＥＮＤＥＸＴ Ｗｈｅａｔ Ｇｅｒｍ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ）（セルフリー・サイエンス社、松山、日本）を用いて合成した。ＨＡ（血球凝集素）標識化組換えＴＮＩＫタンパク質は、ウサギ網状赤血球溶解物（ＴｎＴ Ｔ７クイックカップル転写／翻訳システム（Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ））（プロメガ社、マディソン、ウイスコンシン）を用いて合成した。
【０４０８】
免疫蛍光細胞化学：
カバーグラス（旭テクノグラス（Ａｓａｈｉ Ｔｅｃｈｎｏｇｌａｓｓ）社、東京、日本）上に培養した細胞を、室温で１０分間４％パラホルムアルデヒドにより固定し、０．２％トリトンＸ−１００により透過性にした。１０％正常ブタ血清（ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社、バーリンゲーム、カリフォルニア）によるブロッキング後に、細胞を一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、続いてアレクサフルオル（Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ）−５９４抗マウス抗体およびアレクサフルオル−４８８抗ウサギ抗体（インビトロジェン社）と共にインキュベートした。標本は、レーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ５ ＰＡＳＣＡＬ；カール・ツァイス（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）社、イェーナ、ドイツ）により検査した。
【０４０９】
ＲＮＡ干渉：
２本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｓ）、ＴＮＩＫ−Ｊ−００４５４２−１２（センス：［配列番号６］５’−ＣＧＡＣＡＵＡＣＣＣＡＧＡＣＵＧＡＵＡＵＵ−３’；アンチセンス：［配列番号７］５’−ＰＵＡＵＣＡＧＵＣＵＧＧＧＵＡＵＧＵＣＧＵＵ−３’）およびＴＮＩＫ−Ｊ−００４５４２−１３（センス：［配列番号８］５’−ＧＡＣＣＧＡＡＧＣＵＣＵＵＧＧＵＵＡＣＵＵ−３’；アンチセンス：［配列番号９］５’−ＰＧＵＡＡＣＣＡＡＧＡＧＣＵＵＣＧＧＵＣＵＵ−３’）は、ダーマコン（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）社（シカゴ、イリノイ）によって合成およびアニールされた。２つの対照ＲＮＡ（ＸおよびＩＸ）をダーマコン社から購入した。
次の段落で示される「Ｔ」の文字は、「Ｕ」を意味する。便宜上、ＲＮＡ配列中の「Ｕ」の変わりに、「Ｔ」が用いられることがある。
ヒトＴＮＩＫ（Ｔ１、［配列番号１０］ＡＣＡＣＡＣＴＧＧＴＴＴＣＣＡＴＧＴＡＡＴ；Ｔ２、［配列番号１１］ＡＧＡＧＡＡＧＧＡＡＣＣＴＴＧＡＴＧＡＴＴ；Ｔ３、［配列番号１２］ＡＧＡＡＡＧＡＴＴＴＣＧＧＴＧＧＴＡＡＡＴ）および陰性対照（Ｃ、［配列番号１３］ＧＧＡＡＴＣＴＣＡＴＴＣＧＡＴＧＣＡＴＡＣ）のための、ショアサイレンシング（ＳｕｒｅＳｉｌｅｎｃｉｎｇ）短鎖ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡプラスミドを、スーパー・アレイ・バイオサイエンス（ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社（フレデリック、メリーランド）から購入した。
【０４１０】
ルシフェラーゼレポーター分析：
１対のルシフェラーゼレポーターコンストラクト（ＴＯＰ−ＦＬＡＳＨおよびＦＯＰ−ＦＬＡＳＨ（アップステート（Ｕｐｓｔａｔｅ）社、シャーロッツヴィル、バージニア））を、ＴＣＦ／ＬＥＦ（リンパ球エンハンサー因子）の転写活性の評価のために用いた。細胞を、ルシフェラーゼレポーターのうちの１つおよびｐｈＲＬ−ＴＫ（プロメガ社）により三回一過性トランスフェクションを行なった。ルシフェラーゼ活性を、内部対照としてウミシイタケルシフェラーゼ活性を用いて、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ）（プロメガ社）により測定した。
【０４１１】
コロニー形成分析：
トランスフェクションの２４時間後に、７５０、４００、３００および１０００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ジェネティシン、インビトロジェン社）を、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＤＬＤ１細胞およびＨＣＴ−１１６細胞の培養培地にそれぞれ加えた。細胞は８日間の選択後にギムザ液（和光純薬社（Ｗａｋｏ）、大阪、日本）により染色した。
【０４１２】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ：
全ＲＮＡをＲＮイージーミニキット（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社、バレンシア、カリフォルニア）により調製した。ＤＮａｓｅ Ｉ処理したＲＮＡはランダムプライミングし、スーパースクリプトＩＩ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ）逆転写酵素（インビトロジェン社）を用いて逆転写した。タックマン（ＴａｑＭａｎ）ユニバーサルＰＣＲマスターミックス、ならびにあらかじめデザインしたタックマン遺伝子発現プローブおよびプライマーセットは、アプライド・バイオシステムズ社から購入した。レポーター蛍光の増加として測定された増幅データーは、プリズム（ＰＲＩＳＭ）７０００配列検出システム（アプライド・バイオシステムズ社）を用いて収集した。内部対照［ヒトについてはβ−アクチン（ＡＣＴＢ）またはツメガエル属についてはオルニチンデカルボキシラーゼ（ｏｄｃ）］と比較したｍＲＮＡ発現レベルを、比較閾値サイクル（ＣＴ）方法によって計算した。
【０４１３】
マウス実験：
０．１ｍｌのＰＢＳ中に懸濁した５×１０６のＨＣＴ１１６細胞、ＤＬＤ１細胞またはＷｉＤｒ細胞を、５週令メスＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕヌードマウス（ＳＬＣ社、東京、日本）の横腹へ皮下接種した。１週間後に、発達した腫瘍を、アテロコラーゲン（アテロジーン（ＡｔｅｌｏＧｅｎｅ）；高研（ＫＯＫＥＮ）社、東京、日本）と共にｓｉＲＮＡにより処理した(Takeshita, F. et al. Efficient delivery of small interfering RNA to bone-metastatic tumors by using atelocollagen in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 12177 (2005))。ｓｉＲＮＡの最終濃度は３０μＭであり、アテロコラーゲンの最終濃度は０．５％であった。０．２ｍｌの体積のｓｉＲＮＡ溶液を、各腫瘍へ直接注入した。腫瘍体積は、Ｖ＝Ａ×Ｂ２π／６（式中、ＡおよびＢは最大および最小の寸法を表わす）として決定されたBergers, G. et al. Effects of angiogenesis inhibitors on multistage carcinogenesis in mice. Science 284, 808 (1999)）。
【０４１４】
免疫組織化学：
５０症例の散発性結腸直腸癌を、国立がんセンター病院（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）（東京、日本）の病理アーカイブパネルから選択した。免疫ペルオキシダーゼ染色を、以前に記述されたようなアビジンビオチン複合体法を用いて実行した。
【０４１５】
ツメガエル属の実験：
アフリカツメガエル胚の調製ならびに顕微注入は以前に記述された。卵をインビトロで受精させ、１％チオグリコール酸ナトリウム溶液により脱ゼリーした。胚はニュークープ（Ｎｉｅｗｋｏｏｐ）およびファーバー（Ｆａｂｅｒ）に従ってステージングした。キャッピングしたｍＲＮＡは、インビトロの転写（ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥキット；アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社、オースティン、テキサス）によって合成した。５％フィコールを含むスタインバーグ氏液中で注入を実行した。
ｐＣＳ２−ＦＬＡＧ−ツメガエル属β−カテニン（Ｘβ−カテニン）はＳ．ソコール（Ｓｏｋｏｌ）博士（マウントサイナイ医科大学（Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、ニューヨーク、ニューヨーク州）によって快く提供され、ｐＣＳ２−ｎβ−ＧａｌはＤ．ターナー（Ｔｕｒｎｅｒ）博士、Ｒ．ルップ（Ｒｕｐｐ）博士およびＪ．リー（Ｌｅｅ）博士（フレッドハッチンソンガン研究センター（Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）、シアトル、ワシントン）によって快く提供された。ｐＣＳ２＋−ＭｙｃおよびｐＣＳ２＋−ＨＡは、Ｍ．タイラ（Ｔａｉｒａ）博士（東京大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｋｙｏ）、東京、日本）によって快く提供された。
ＬＯＣ４４３６３３（ＸＴＮＩＫ）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）（アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチド（ＭＯ）のＸＴＮＩＫ−ＭＯ１またはＸＴＮＩＫ−ＭＯ３によって認識される）を、アフリカツメガエルイメージ（ＩＭＡＧＥ）ｃＤＮＡクローンＭＸＬ１７３６−９８３５８４７７（オープン・バイオシステムズ（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社、ハンツヴィル、アラバマ）からＰＣＲ増幅し、ｐＣＳ２＋−Ｍｙｃの中へサブクローン化した（ｐＣＳ−ＸＴＮＩＫ−ＷＴ−Ｍｙｃ）。リジン（Ｋ）５４残基をアルギニン（Ｒ）へ変化させるために、ｐＣＳ−ＸＴＮＩＫ−ＷＴ−Ｍｙｃの変異型（ｐＣＳ−ＸＴＮＩＫ−Ｋ５４Ｒ−Ｍｙｃ）を、［配列番号１４］オリゴのＡＧＧＧＴＣＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＣＡＧＧＧＧＡＴＧおよび［配列番号１５］ＡＡＴＡＧＣＴＧＣＡＡＧＣＴＧＴＣＣＧＧＴＴＴＴＡＡＣによる変異誘発によって構築した。
ＸＴＮＩＫのＯＲＦ配列（ＸＴＮＩＫ−ＭＯ１またはＸＴＮＩＫ−ＭＯ３によって認識されない）を、オリゴの［配列番号１６］ＡＴＧＧＣｃＡＧｔＧＡｔＴＣｔＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＧＣＣＴＧＧＡＴＧＡ（小文字は修飾を示す）および［配列番号１７］ＡＴＣＧＡＴＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＡＡＡＡＧＡＡＣＡＡによる変異誘発によって構築した（ｐＣＳ２−ＸＴＮＩＫＯＲＦ−ＨＡ）。
【０４１６】
アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチド（ＭＯｓ）：
ツメガエル属ＴＮＩＫについてのアンチセンスＭＯ（ＸＴＮＩＫ−ＭＯ１およびＸＴＮＩＫ−ＭＯ３）、および対応する対照ＭＯ［ＸＴＮＩＫ−ＭＯ１およびＸＴＮＩＫ−ＭＯ３の配列内に５つのヌクレオチド置換を保有する（５ｍｉｓ−Ｃｏｎｔｒｏｌｓ−１および５ｍｉｓ−Ｃｏｎｔｒｏｌｓ−３）］は、ジーン・ツールズ（Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ）社（フィロマス、オレゴン）から得た。データベース検索により、アフリカツメガエルにおいて、ＸＴＮＩＫ−ＭＯ１およびＸＴＮＩＫ−ＭＯ３の相補物に対する有意な相同配列が存在しないことが確認された。この研究において用いられるＭＯの配列は、ＸＴＮＩＫ−ＭＯ１（［配列番号１８］;５’−ＧＧＧＡＧＴＣＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＴＴＴＣＣＴＴＴ−３’）、ＸＴＮＩＫ−ＭＯ３（［配列番号１９］;５’−ＣＣＣＣＧＴＴＣＴＴＴＣＣＡＣＣＴＴＧＣＧＧＣＴＧ−３’）および５ｍｉｓ−Ｃｏｎｔｒｏｌ−１（［配列番号２０］;５’−ＧＧＣＡＧＴＧＧＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＴＴＣＧＴＴＴ−３’）および５ｍｉｓ−Ｃｏｎｔｒｏｌ−３（［配列番号２１］;５’−ＣＣＧＣＧＴＴＧＴＴＴＣＧＡＣＣＴＴＣＣＧＣＣＴＧ−３’）であった。
【０４１７】
略語
５’ＵＴＲ、５’−非翻訳領域；ＡＣ、アニマルキャップ；ＡＰＣ、大腸腺腫様ポリポーシス；Ａｔｅｌｏ、アテロコラーゲン；β−Ｃａｔ、β−カテニン；ＣＭＬ、慢性骨髄性白血病；ＣＮＨ、シトロン相同性；Ｃｏｎｔ、対照；ＧＳＫ３β、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β；ＧＳＴ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ；ＨＡ、血球凝集素；ＩＰ、免疫沈降；ＬＥＦ、リンパ球エンハンサー因子；ＭＯ(s)、モルホリノオリゴヌクレオチド；Ｎ．Ｄ．、検出されない；ｎ−βｇａｌ、核のβ−ガラクトシダーゼ；ＮＬＳ、核移行シグナル；Ｎ．Ｓ．、有意でない；ＯＲＦ、オープンリーディングフレーム；ｐＳｅｒ、フォスフォセリン；ＲＴ、逆転写；ｓｈＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ；ＴＣＦ（４）、Ｔ細胞因子（−４）；ＴＮＩＫ、Ｔｒａｆ２−およびＮｃｋ相互作用キナーゼ；ＷＴ、野生型。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｒａｆ２／Ｎｃｋ相互作用キナーゼ（ＴＮＩＫ）阻害剤により癌患者を治療するための組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、ＴＮＩＫ阻害剤および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関し、癌患者の治療に対して（特に大腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌または乳癌などの固形癌患者に対して）ＴＮＩＫ阻害剤を投与する方法に関する。
また、本発明は新規なアミノチアゾール誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｗｎｔタンパク質は、細胞の運命、増殖、移動および極性の決定などの様々な細胞過程を制御するシグナル伝達経路を活性化する、分泌性糖タンパク質の大きなファミリーである。Ｗｎｔタンパク質はいくつかの経路を介してシグナルを伝達することができ、最もよく特徴が明らかにされているのはβ−カテニンを介する標準経路（Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリング）である。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングの脱調節は、大腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、乳癌およびその他の多くのヒトの癌においてしばしば見出される。
【０００３】
ＴＮＩＫは、ｃ−ＪｕｎのＮ末端キナーゼ経路を活性化し、細胞骨格を調節する、ＳＴＥ２０ファミリーのキナーゼのうちの１つとして公知である。最近、ＴＮＩＫは、２つの大腸癌細胞株のＤＬＤ１およびＨＣＴ−１１６において、抗ＴＣＦ４抗体により共通して免疫沈降される７０のタンパク質のうちの１つとして同定された（非特許文献１）。
【０００４】
下記は、本発明であるＴＮＩＫ阻害剤により癌患者を治療するための組成物および方法の有用性の評価方法についての参照記述である。これらの参照記述はすでに仮出願に記載されているが、仮出願の出願前に本発明者により出願され、仮出願後に公開されたＷＯ２００９／１０４４１３（特許文献１）にも記載されている。本発明の有用性のための下記評価方法の詳細については、本発明の実施例のあとの参照方法に記載されている。
【０００５】
（本発明の有用性の評価方法についての参照記述）
大腸癌の８０％以上は大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子の変異を示し、残りの２分の１はＣＴＮＮＢ１遺伝子における変異を示し、結果としてβ−カテニンの蓄積およびＷｎｔシグナリングの構成的活性化を生じる。β−カテニンは、Ｔ細胞因子（ＴＣＦ）／リンパ球エンハンサー因子（ＬＥＦ）ファミリーＤＮＡ結合タンパク質との複合体の形成によって、およびそれらの標的遺伝子のトランス活性化によって、その腫瘍形成活性を発揮する。ＴＣＦ４は、大腸癌細胞において共通して発現され、大腸の発癌性に関わる、ＴＣＦ／ＬＥＦファミリーのメンバーである。我々は、以前に、２つの大腸癌細胞株（ＤＬＤ１およびＨＣＴ−１１６）において、抗ＴＣＦ４抗体および抗β−カテニン抗体により共通して免疫沈降される７０のタンパク質のうちの１つとしてＴＮＩＫを同定した（非特許文献１）。ＤＬＤ１はＡＰＣ遺伝子における短縮型変異および他方の対立遺伝子の消失を有しており、ＨＣＴ−１１６はＣＴＮＮＢ１遺伝子中にミスセンス変異を有している。ＴＮＩＫは抗ＴＣＦ４抗体または抗β−カテニン抗体による免疫沈降物中に検出されるが、対照のＩｇＧによる免疫沈降物中には検出されない。反対に、β−カテニンタンパク質およびＴＣＦ４タンパク質は抗ＴＮＩＫの抗体により免疫沈降され、ＴＣＦ４タンパク質、β−カテニンタンパク質およびＴＮＩＫタンパク質が大腸癌細胞において複合体を形成することを示す。２−ハイブリッド分析により、ＴＮＩＫは、キナーゼドメインを含む１〜２８９位のアミノ酸を介してＴＣＦ４と相互作用することが明らかにされた。ＴＣＦ４の１００〜２１６位のアミノ酸がＴＮＩＫとの相互作用のために必要であった。
【０００６】
ＴＣＦ４タンパク質はＴＮＩＫ（ＷＴ、野生型）によってリン酸化されるが、キナーゼドメインのＡＴＰ結合ポケット中の保存されたリジン５４残基の置換（Ｋ５４Ｒ）を有するＴＮＩＫの触媒的不活性変異体によってはリン酸化されない。タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）により、ＴＣＦ４のセリン１５４残基がＴＮＩＫ（ＷＴ）によってリン酸化されることが明らかになった。これと一致して、アラニンによるセリン１５４残基の置換（Ｓ１５４Ａ）は、ＴＮＩＫによるＴＣＦ４のリン酸化を消失させた。ＴＣＦ４は、ＴＮＩＫ（ＷＴ）によるＤＬＤ１細胞のトランスフェクションに際してリン酸化されるが、ＴＮＩＫ（Ｋ５４Ｒ）によるトランスフェクションではリン酸化されない。
【０００７】
ＴＮＩＫの自己リン酸化は、ＴＮＩＫの核移行およびＴＣＦ４との相互作用のために必要であると思われる。ＤＬＤ１細胞およびＨＣＴ−１１６細胞を、ＴＮＩＫ（ＷＴ）または触媒的不活性ＴＮＩＫ（Ｋ５４Ｒ）によりトランスフェクションし、イムノブロットおよび免疫蛍光顕微鏡によって分析した。我々は、ＴＮＩＫ（ＷＴ）が自身のセリン７６４残基のリン酸化（ＴＮＩＫｐＳ７６４）を誘導することを明らかにした（抗ＴＮＩＫｐＳ７６４により）。リン酸化されたＴＮＩＫは核の中へと取り込まれるが、Ｋ５４Ｒ置換はＴＮＩＫのリン酸化および核移行を有意に阻害し、ＴＣＦ４と相互作用するＴＮＩＫの量を減少させた。内在性ＴＮＩＫタンパク質は線維状細胞骨格に沿って分布したが、リン酸化されたＴＮＩＫ（ＴＮＩＫｐＳ７６４）は主として核において検出され、ＴＣＦ４と共局在した。ＴＮＩＫｐＳ７６４は大腸癌細胞において検出されるが、形質転換していないＨＥＫ２９３細胞においては検出されなかった。
【０００８】
ＴＮＩＫの発現および局在を、大腸癌の臨床検査標本において検討した。ＴＮＩＫタンパク質の全体的な発現レベルは癌と正常粘膜との間で有意に異ならなかったが、隣接する正常な腸上皮細胞と比較して、癌細胞におけるリン酸化されたＴＮＩＫ（ｐＳ７６４）の発現は増加した。核のＴＮＩＫｐＳ７６４は、大腸癌の浸潤先進部において最も多く検出され、β−カテニンは核および細胞質において蓄積した。
次に、我々は、β−カテニンおよびＴＣＦ４複合体の転写活性に対するＴＮＩＫの効果を調べた。ＨＥＫ２９３細胞およびＨｅＬａ細胞は、野生型のＡＰＣ遺伝子およびＣＴＮＮＢ１遺伝子を有する。Ｎ末端グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）リン酸化部位の欠失によって安定化させたβ−カテニン（β−カテニンΔＮ１３４）によるこれらの細胞の一過性トランスフェクションは、モックトランスフェクションと比較して、標準ＴＣＦ／ＬＥＦのレポーター（ＴＯＰ−ＦＬＡＳＨ）のルシフェラーゼ活性を増加させたが、変異レポーター（ＦＯＰ−ＦＬＡＳＨ）のルシフェラーゼ活性を増加させなかった。血球凝集素（ＨＡ）を標識化した野生型ＴＮＩＫ（ＷＴ）によるコトランスフェクションは、β−カテニンに誘発される転写活性、ならびにＨＥＫ２９３細胞およびＨｅＬａ細胞によるコロニー形成をさらに促進したが、ＴＮＩＫ（Ｋ５４Ｒ）によるコトランスフェクションでは促進しなかった。ＴＮＩＫは、β−カテニンΔＮ１３４の非存在下において、転写活性またはコロニー形成に有意には影響することはなく、ＴＮＩＫの効果がＷｎｔシグナリングの活性化に依存することがわかる。ＴＮＩＫによるＤＬＤ１細胞およびＨＣＴ−１１６細胞の一過性トランスフェクションもまた、それらのＴＣＦ／ＬＥＦの転写活性およびコロニー形成を促進したが、ＴＮＩＫ（Ｋ５４Ｒ）による一過性トランスフェクションは促進しなかった。
【０００９】
これとは反対に、ＴＮＩＫに対する短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（コンストラクト１２および１３）によるＴＮＩＫのノックダウンは、ＨＥＫ２９３細胞およびＨｅＬａ細胞のβ−カテニンΔＮ１３４に誘発されるＴＣＦ／ＬＥＦの転写活性を消失させた。ＴＮＩＫに対する短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）（コンストラクトＴ１、Ｔ２およびＴ３）によるＴＮＩＫのノックダウンは、β−カテニンΔＮ１３４に誘発されたコロニー形成を消失させたが、β−カテニンΔＮ１３４によりコトランスフェクションされなかったＨＥＫ２９３細胞およびＨｅＬａ細胞の増殖には有意に影響しなかった。ＴＮＩＫのノックダウンは、ＤＬＤ１細胞およびＨＣＴ−１１６細胞のＴＣＦ／ＬＥＦの転写活性および増殖を抑制した。体軸インヒビター（ａｘｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）−２（ＡＸＩＮ２）、ｃ−ｍｙｃ（ＭＹＣ）、ｃ−ｊｕｎ（ＪＵＮ）およびマトリリシン（ＭＭＰ７）などの、β−カテニンとＴＣＦ／ＬＥＦの複合体の既知の標的遺伝子の発現は、サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）を除いて、ＴＮＩＫに対するｓｉＲＮＡの一過性トランスフェクションによって有意に減少した。
【００１０】
我々は、次にヒト大腸癌細胞の増殖に対するＴＮＩＫの効果をインビボで検討した（図２）。ＨＣＴ−１１６細胞を免疫不全マウスの横腹に移植した。接種の１週間後に、アテロコラーゲンと混合したＴＮＩＫに対するｓｉＲＮＡ（１２または１３）（Takeshita, F.et al. Efficient delivery of small interfering RNA to bone-metastatic tumors by using atelocollagen in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 102, 12177(2005))を、腫瘍（大きさでは２２４．５±８．９ｍｍ３）の中へ直接注入した。ｓｉＲＮＡ注入の３日後に、いくつかの腫瘍を切り取り、ＴＮＩＫのｍＲＮＡのサイレンシングをリアルタイムＰＣＲによって確認した（図２b）。異種移植片の体積をｓｉＲＮＡ注入後の１８日間モニタリングした（図２a）。我々は、ＴＮＩＫに対するｓｉＲＮＡ（１２または１３）の単回投与後に腫瘍がほとんど完全に退縮することを明らかにした。図２c及び２dは、代表的なマウスおよび切除した腫瘍の外観を示す。ＴＮＩＫに対するｓｉＲＮＡ（１２または１３）により処理した腫瘍は、処理なしの腫瘍（Ｎｏ ｔｒｅａｔ）、アテロコラーゲンのみにより処理した腫瘍（Ａｔｅｌｏ ｏｎｌｙ）、または対照ＲＮＡ（ＸまたはＩＸ）により処理した腫瘍よりも有意に小さかった（図２ｄ）。我々は、他の２つの大腸癌細胞株（ＤＬＤ１およびＷｉＤｒ）において、ＴＮＩＫに対するｓｉＲＮＡの単回投与後に、定着腫瘍が同様に退縮することを観察した（図３および４）。
【００１１】
最後に、ＷｎｔシグナリングにおけるＴＮＩＫの機能的関与をツメガエル属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）胚において検討した。ユニジーン（Ｕｎｉｇｅｎｅ）アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）データベース中に、ヒトＴＮＩＫに相同な登録（仮想タンパク質ＬＯＣ４４３６３３と命名された）があった。キナーゼドメイン（２５〜２８９位のアミノ酸）は、ヒトとツメガエル属との間で高度に保存（９８．９％）されていた。ツメガエル属ＴＮＩＫ（ＸＴＮＩＫ）は母性発現され、発現はオタマジャクシのステージ全体にわたって維持された。腹側帯域におけるＷｎｔシグナリングの異所的活性化は、体軸重複を誘導することが公知である。ＸＴＮＩＫ（ＷＴ）ｍＲＮＡとの共注入は、Ｘβ−カテニンに誘導された二次体軸形成を促進したが、触媒的不活性ＸＴＮＩＫ（Ｋ５４Ｒ）は完全に二次体軸形成を阻害した。ＸＴＮＩＫ（ＷＴ）またはＸＴＮＩＫ（Ｋ５４Ｒ）のみ（Ｘβ−カテニンなし）を注入した胚は、正常に発生した。アニマルキャップ分析において、Ｘβ−カテニンの注入は、Ｗｎｔシグナリングの公知の標的遺伝子のシアモア（Ｓｉａｍｏｉｓ）およびＸｎｒ３の発現を誘導した。ＸＴＮＩＫ（ＷＴ）との共注入は、これらの遺伝子の発現を促進するが、ＸＴＮＩＫ（Ｋ５４Ｒ）はそれらの発現を停止させる。
【００１２】
８細胞ステージ胚の背側割球の中へのＸＴＮＩＫ（Ｋ５４Ｒ）ｍＲＮＡの注入は、ステージ１０での原腸陥入の開始を阻害した。ＸＴＮＩＫ（ＷＴ）を背側に注入した胚は、シアモアおよびＸｎｒ３の発現の著しい増加を示したが、ＸＴＮＩＫ（Ｋ５４Ｒ）はそれらの発現を減少させた。８細胞ステージで背側割球の中へのＸＴＮＩＫ（Ｋ５４Ｒ）ｍＲＮＡの注入を受けた胚は、有意な体軸欠損（Ｗｎｔシグナリングの背側での阻害に起因する典型的な表現型である、頭部および体軸構造の完全な消失）を生じた。
【００１３】
ＸＴＮＩＫに対するアンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチド（ＭＯｓ）（ＭＯ１およびＭＯ３）は、８細胞ステージ胚の腹側帯域の中へ共注入した場合に、Ｘβ−カテニンによって誘導される二次体軸形成を遮断した。この遮断状態は、ＨＡ標識化ＸＴＮＩＫＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）のｍＲＮＡ［ＭＯ１およびＭＯ３によって標的とされる５’ＵＴＲ（５’−非翻訳領域）を欠く］の共注入によって解除された。どちらのＸＴＮＩＫ−ＭＯを背側に注入した胚も、ステージ１０で原腸陥入を開始せず有意に縮小した頭部および体軸構造を有する異常なオタマジャクシへと発生した。ＸＴＮＩＫ−ＭＯｓによって引き起こされた欠損は、ＸＴＮＩＫＯＲＦの共注入によって補完された。ヌクレオチドミスマッチを有する対照ＭＯｓ（５ｍｉｓ−Ｃｏｎｔｒｏｌ−１および５ｍｉｓ−Ｃｏｎｔｒｏｌ−３）を注入した胚は、ＴＮＩＫ−ＭＯ１およびＴＮＩＫ−ＭＯ３で観察された効果を示さなかった。ＸＴＮＩＫ−ＭＯｓによるシアモアおよびＸｎｒ３の発現の減少は、ＸＴＮＩＫＯＲＦの共注入によって回復した。
【００１４】
プロテインキナーゼの合成されたＡＴＰ競合物は、腫瘍学の実務上、具体化して成功している。
【００１５】
例えば、イマチニブ（慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）のＢｃｒ−Ａｂｌ融合キナーゼを遮断する）は、現在ＣＭＬのための第一選択薬である。表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼ阻害剤である、ゲフィチニブおよびエルロチニブは、非小細胞肺癌の治療で用いられている。Ｗｎｔシグナリングは大腸の発癌を押し進める主な力である。ＴＮＩＫは大腸癌において活性化され、大腸癌細胞の増殖は、ＴＮＩＫの発現およびキナーゼ活性に高度に依存した。我々の結果は、ＴＮＩＫを標的とする薬物の開発が実現可能であることを示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】ＷＯ２００９／１０４４１３
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Shitashige M, et al., Gastroenterology ２００８年，１３４：１９６１−７１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明者等は、ＴＮＩＫがＷnt シグナリング経路 における必須のプロティンキナーゼであり、がん、特に固形腫瘍, 例えば、膵臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌または乳癌、なかでも大腸がんの増殖と深くかかわっており、ＴＮＩＫの作用を阻害することで、がん、特に固形腫瘍なかでも大腸がんの増殖を抑制することができることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者等は、当該知見に基づいて、ＴＮＩＫ阻害作用を有する化合物のスクリーニングを行い、下記一般式
【００２０】
【化１】
【００２１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、夫々独立して水素原子または置換基を表す。）で示されるアミノチアゾール誘導体またはその薬学的に許容される塩が、ＴＮＩＫ阻害作用を有することを見出し、当該アミノチアゾール誘導体が、がん細胞の増殖を抑制することを確かめて本発明を完成させた。
【００２２】
下記に図の説明をするが、図２〜４は本発明の有用性の評価方法についての参考図である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は化合物１による大腸癌細胞のβ−カテニン／ＴＣＦ４仲介性転写の阻害を示している。
【図２】（参考図）ＴＮＩＫに対するｓｉＲＮＡによる大腸癌増殖の阻害。ａ：ＨＣＴ−１１６細胞を、ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕヌードマウスへと皮下接種した。発達した腫瘍は処理しないか、またはアテロコラーゲンのみ、対照ＲＮＡ（ＸまたはＩＸ）もしくはＴＮＩＫに対するｓｉＲＮＡ（１２または１３）により処理した。示されるように、腫瘍の体積（１つのグループあたりｎ＝８）をモニタリングした。＃：Ｐ＜０．００１（マン−ホイットニーＵ検定）バー：標準誤差Ｎ．Ｓ．：有意でない。ｂ：ｓｉＲＮＡを注入した腫瘍におけるＴＮＩＫのｍＲＮＡ発現（１つのグループあたりｎ＝３）。ｃ、ｄ：ｓｉＲＮＡの注入１８日後のマウスおよび切除した腫瘍の代表的な外観。カラムは、切除した腫瘍の平均重量を示す（１つのグループあたりｎ＝８）。＄：Ｐ＜０．００５（マン−ホイットニーＵ検定）バー：標準誤差。
【図３】（参考図）ＴＮＩＫに対するｓｉＲＮＡによる大腸腫瘍の増殖阻害および退縮ＤＬＤ１細胞を、０日目にＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕヌードマウスの横腹に接種した。発達した腫瘍（ＤＬＤ１、６４．０±１．９ｍｍ３）を処理しないか、またはアテロコラーゲンのみ、対照ＲＮＡ（ＸまたはＩＸ）もしくはＴＮＩＫに対するｓｉＲＮＡ（１２または１３）により７日目に処理した。ａ：７、９、１３、１６、１９、２２および２５日目に測定した腫瘍体積（１つのグループあたりｎ＝８）。＊：Ｐ＜０．０００１（マン−ホイットニーＵ検定）バー：標準誤差Ｎ．Ｓ．：有意でない。ｂ：ｓｉＲＮＡ注入の３日後にリアルタイムＰＣＲによって決定された腫瘍（１つのグループあたりｎ＝３）におけるＴＮＩＫのｍＲＮＡ発現。ｃ、ｄ：２５日目（ｓｉＲＮＡの注入の１８日後）のマウス（ｃ）および切除した腫瘍（ｄ）の代表的な外観および切除した腫瘍の重量（１つのグループあたりｎ＝８）（ｄ）。＄：Ｐ＜０．００５（マン−ホイットニーＵ検定）バー：標準誤差。
【図４】（参考図）ＴＮＩＫに対するｓｉＲＮＡによる大腸腫瘍の増殖阻害および退縮ＤＬＤ１細胞に替えて、ＷｉＤｒ細胞を用いた場合の(発達した腫瘍 ＷｉＤｒ、９５．９±１．６ｍｍ３）、図３と同様の図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
アミノチアゾール誘導体（Ｉ）における置換基としては夫々以下の置換基をあげることができる。
【００２５】
Ｒ１及びＲ２の置換基としては、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のアシル基、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニル基、置換もしくは非置換のカルバモイル基、置換もしくは非置換のチオカルバモイル基、置換もしくは非置換のスルホニル基、置換もしくは非置換の複素環、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換の芳香族複素環があげられる。
【００２６】
Ｒ３及びＲ４の置換基としては、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のアシル基、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニル基、置換もしくは非置換のカルバモイル基、置換もしくは非置換のチオカルバモイル基、置換もしくは非置換のスルホニル基、置換もしくは非置換の複素環、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換の芳香族複素環があげられる。
【００２７】
Ｒ５及びＲ６の置換基としては、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のシクロアルキル基、置換もしくは非置換の複素環、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換の芳香族複素環があげられる。
【００２８】
アミノチアゾール誘導体（I）またはその薬学的に許容される塩の具体的な化合物としては、以下の化合物またはその薬学的に許容される塩があげられる。
【００２９】
５−（４−アセトアミドベンズアミド）−２−（フェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
５−（３−メチルベンズアミド）−２−（フェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
５−（２−フルオロベンズアミド）−２−（フェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
５−（４−メトキシベンズアミド）−２−（フェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
５−（３−メトキシベンズアミド）−２−（フェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
２−（フェニルアミノ）−５−（２−（チオフェン−２−イル）アセトアミド）チアゾール−４−カルボキサミド
５−（３−メチルブタンアミド）−２−（フェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
５−（２−シクロペンチルアセトアミド）−２−（フェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
２−（ｐ−トルイジノ）−５−（２−フルオロベンズアミド）チアゾール−４−カルボキサミド
２−（ｐ−トルイジノ）−５−（４−アセトアミドベンズアミド）チアゾール−４−カルボキサミド
２−（ｐ−トルイジノ）−５−（２−クロロベンズアミド）チアゾール−４−カルボキサミド
２−（ｐ−トルイジノ）−５−（３−ブロモベンズアミド）チアゾール−４−カルボキサミド
２−（ｐ−トルイジノ）−５−（２，６−ジフルオロベンズアミド）チアゾール−４−カルボキサミド
２−（ｐ−トルイジノ）−５−（３，４−ジメトキシベンズアミド）チアゾール−４−カルボキサミド
２−（ｐ−トルイジノ）−５−（チオフェン−２−カルボキサミド）チアゾール−４−カルボキサミド
２−（ｐ−トルイジノ）−５−（２−エチルブタンアミド）チアゾール−４−カルボキサミド
２−（エチルアミノ）−５−（８−メチル−２−フェニルキノリン−４−カルボキサミド）チアゾール−４−カルボキサミド
【００３０】
本発明のチアゾール誘導体（Ｉ）またはその薬学的に許容される塩は、何れも公知化合物であり、TimTec 社（Delaware, USA）やAurora Fine Chemicals 社（California, USA）等から入手することも可能である。また、チアゾール誘導体（I）またはその薬学的に許容される塩は、以下に例示する方法によっても製造することができる。
【００３１】
なお、以下に示す製造法において、所望の置換基が実施方法の条件下で変化するか、または方法を実施するのに不適切な場合、有機合成化学で通常用いられる方法、例えば、官能基の保護、脱保護（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．，１９９９参照）等の周知慣用の手段を付すことにより容易に製造することができる。
【００３２】
また、必要に応じて置換基導入等の反応工程の順序を適宜変えることもできる。
【００３３】
化合物（I）は、例えば製法１に示す製造法により得ることができる。
【００３４】
【化２】
【００３５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、前記に同じ。）
【００３６】
製法１の原料である化合物（II）および（III）は市販品（例えばAcros Organics 社製品,URL:http://www.acros.com/）として、または公知の方法もしくはそれに準じた方法により得ることができる。
【００３７】
化合物（IV）は、例えば、文献（J. Chem. Soc. 1949, 3001 参照）などに記載の方法に準じて製造することができる。
【００３８】
すなわち、化合物（ＩＩ）および化合物（ＩＩＩ）を酢酸エチルなどの不活性有機溶媒中、反応させることによって化合物（ＩＶ）を得ることができる。
【００３９】
化合物（Ｉ）は、化合物（ＩＶ）から必要に応じて前記のとおり官能基の保護、脱保護を繰り返しながら、有機合成化学で通常用いられるアシル化の条件、あるいはアルキル化の条件に付すことによって得ることができる。
【００４０】
また、必要により、有機合成化学で通常用いられる方法により以下に例示する薬学的に許容される塩を得ることができる。
【００４１】
薬学的に許容される酸付加塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸などの無機酸をともなう塩、またはマレイン酸、フマル酸、コハク酸、クエン酸などの有機酸をともなう塩を含む。
【００４２】
更なる本発明の目的は、下記一般式（I’）により表される新規なアミノチアゾール誘導体を提供することにある。
【００４３】
【化３】
【００４４】
（式中、Ｒ１’、Ｒ２’は、夫々独立して水素原子、ハロゲン原子、水酸基、置換または非置換のアルキル基、Ｃ２−Ｃ４アルケニル基、Ｃ２−Ｃ４アルキニル基、置換または非置換のアルコキシ基、置換または非置換のアミノ基、アシルアミノ基、ニトロ基、置換または非置換のアルコキシカルボニルアミノ基を表わし、Ｒ３’、Ｒ４’は、夫々独立して水素原子、ハロゲン原子、水酸基、置換または非置換のアルキル基、置換または非置換のアルコキシ基、置換または非置換のアミノ基、置換または非置換のアシルアミノ基、置換または非置換のアルキルスルホンアミド基、ニトロ基を表わす。またＹ１、Ｙ２及びＹ３は、夫々独立して窒素原子または炭素原子を表わす。）またはそれらの薬学的に許容される塩。
【００４５】
本発明に用いられる置換基としては、例えば、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子）、置換または非置換のC1−C8のアルキル基、C2−C4アルケニル基（例えば、ビニル、アリル）、C2−C4アルキニル基（例えば、エチニル、プロパルギル）、置換または非置換のC1−C8アルコキシ基、置換または非置換のC1−C4のアシルアミノ基、C1−C2のアルキルスルホンアミド基があげられる。置換または非置換のアミノ基としては、例えば、ジメチルアミノ基、４−メチルピペラジン−１−イル基、２−ヒドロキシエチルアミノ基、２−（ジメチルアミノ）エチルアミノ基、２−モルホリノエチルアミノ基、４−モルホリノ基、２−（ピロリジン−１−イル）エチルアミノ基、（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル基、２−メトキシエチルアミノ基、２−アミノエチルアミノ基、４−（ヒドロキシメチル）ピペリジン−１−イル基、２−（ピペリジン−１−イル）エチルアミノ基、２−（ピリジン−４−イル）エチルアミノ基、または、２−（メチルチオ）エチルアミノ基などがあげられる。置換または非置換のC1−C８アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、ベンジルオキシ基、２−モルホリノエトキシ基、２−（ピロリジン−１−イル）エトキシ基、または、テトラヒドロ−２H−ピラン−４−イルオキシ基などがあげられる。置換または非置換のアシルアミノ基としては、例えば、アセトアミド基、２−ヒドロキシアセトアミド基、２−（ジメチルアミノ）アセトアミド基、２−モルホリノアセトアミド基、２−（ピロリジン−１−イル）アセトアミド基、２−（ピペリジン−１−イル）アセトアミド基、または、２−（４−メチルピペラジン−１−イル）アセトアミド基があげられる。置換または非置換のアルコキシカルボニルアミノ基としては、例えば、置換または非置換のC1−C８アルコキシカルボニルアミノ基（例えば、tert‐ブトキシカルボニルアミノ基）があげられる。
【００４６】
以下に一般的な反応スキームを用いて、本発明のアミノチアゾール誘導体の合成方法を説明する。本発明の化合物（Ｉ’）は、スキーム１−６に従って製造でき、実施例に示されているように、一般的な合成方法と、市販で入手可能な出発原料あるいは市販で入手可能な前駆物質から公知の方法で合成可能な出発原料，又は当業者によって認識される様々なバリエーションから製造することができる。
【００４７】
これらのスキームではしばしば正確な構造を示していることがあるが、有機化学で通常用いられる保護、脱保護によって反応性の官能基を保護することによって式（I’）で示される化合物の誘導体を広く合成することが可能である。例えば、水酸基などは望まない副反応を避けるために、当該分子の他の部分の化学反応の間は一般的にエーテルやエステルに変換する必要がある。これらの水酸基の保護基は容易に取り除くことができ、保護されていない水酸基を得ることが出来る。アミノ基やカルボキシル基なども副反応を避けるために同様に保護される。典型的な保護基と、保護、脱保護の方法はT. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis 3rd Edition, John Wiley and Sons, New York, (1999)に十分に記載されている。
【００４８】
以下のスキーム中で示される各可変部位は本発明の化合物で記述される全ての官能基を参照するものである。式（Ｉ）の化合物の互変異性体および溶媒和物（例えば、水和物）なども本発明に含まれる。
【００４９】
本発明中のいかなる式のいかなる化合物も以下の反応スキームで示される方法や実施例で示される方法に従い、適切な出発物質を選び類似の方法で製造することができる。すなわち、本発明中で開示、例示するどの式のどの化合物も、以下に記載する方法と類似の方法に従い、適当な出発物質と適当な試薬を用い、望ましい置換を行うことにより得ることができる。
【００５０】
式（Ｉ’）の化合物は、概してスキーム１に示されるように５−アミノチアゾール中間体（ＩＩ’）と置換基を有する塩化ベンゾイル（ＩＩＩ’-a）からアミド生成反応によって製造することができる。
【００５１】
【化４】
【００５２】
式中、Ｒ１’, Ｒ２’, Ｒ３’, Ｒ４’, Ｙ１,Ｙ２およびＹ３は、それぞれ式（Ｉ’）と同義である。
【００５３】
置換基を有する安息香酸（ＩＩＩ’-b）を用い、一般的なアミドカップリング反応条件、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）およびジイソプロピルエチルアミンやトリエチルアミンのような塩基などの条件下、同様のアミドカップリング反応を行うことで、式（Ｉ’）の化合物を製造することもできる。
【００５４】
別の方法として、式（Ｉ’）の化合物は、スキーム２に示すように、エステル中間体（ＩＶ’）のアンモニアによる直接的アミノリシスでも製造することができる。
【００５５】
【化５】
【００５６】
式中、Ｒ１’, Ｒ２’, Ｒ３’, Ｒ４’, Ｙ１, Ｙ２, およびＹ３は、それぞれ式（Ｉ’）と同義である。
【００５７】
アミノリシス反応は、ＴＨＦやジオキサンのような溶媒存在下、濃アンモニア水あるいはアンモニアのメタノール溶液と処理することによって行なえる。反応は、封管中、８０−１５０℃に加熱しながら１−２４時間撹拌することによって得られるが、好ましくはマイクロウェーブ合成機を用いた、８０℃で１５０分間のマイクロウェーブ照射により合成することができる。
【００５８】
スキーム１のアミドカップリング反応の原料となる式（ＩＩ’）で表される化合物は、Ｃｏｏｋらの方法(Ｊ. Ｃｈｅｍ. Ｓｏｃ. １９４９, ３００１)と同様な反応を用いることにより製造することができる。例えば、式（ＩＩ’）で表される化合物は下記に示すスキーム３に従い製造できる。
【００５９】
【化６】
【００６０】
式中、Ｒ１’, Ｒ２’, Ｙ１, Ｙ２, およびＹ３は、それぞれ式（Ｉ’）と同義である。
【００６１】
すなわち、チオイソシアネート（Ｖ’）とアミノシアノアセトアミドの混合物を適当な溶媒中、好ましくは酢酸エチルを用いて撹拌し、０．５−２時間加熱還流することで式（ＩＩ’）で表される化合物を得ることができる。
【００６２】
チオイソシアネート（Ｖ’）は市販で入手可能か、対応するアミンをチオホスゲンで処理するような有機合成でよく知られている方法で製造することができる。
置換基を有するアミノチアゾール（ＩＶ’）はスキーム４に示すように、アニリンもしくはアミノヘテロ芳香族化合物（ＶＩＩ’）と２−ハロゲノチアゾール化合物（ＶＩ’）のパラジウム触媒反応によって製造することができる。
【００６３】
【化７】
【００６４】
式中、Ｒ１’, Ｒ２’, Ｒ３’, Ｒ４’, Ｙ１, Ｙ２, およびＹ３は、それぞれ式（Ｉ’）と同義であり、ＸはＣｌ, Ｂｒ, あるいはＩから選択されるハロゲンを表す。
【００６５】
これらのBuckwald/Hartwigタイプ反応は当業者によく知られており、例えばトルエン、ＴＨＦ、あるいはジオキサンなど不活性な溶媒中、トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム（０）、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム（０）、酢酸パラジウム（ＩＩ）などのパラジウム触媒と、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウムなどの塩基、および４，５−ビス(ジフェニルホスフィノ)−９，９−ジメチルキサンテン(XANTPHOS)などの配位子を用い、合成できる。同様なパラジウムカップリング反応として、対応するハロゲノ芳香族／ヘテロ芳香族化合物と対応する２−アミノチアゾール誘導体を用いても、同じ望むアミノチアゾール中間体（ＩＶ’）を製造することができる。
【００６６】
式（ＶＩ’）で表される化合物は下記のスキーム５によって、製造することができる。
【００６７】
【化８】
【００６８】
式中、Ｒ３’およびＲ４’は、それぞれ式（Ｉ’）と同義であり、ＸはＣｌ, Ｂｒ, あるいはＩから選択されるハロゲンを表す。
【００６９】
すなわち式（ＶＩ’）で表される化合物は５−アミノチアゾール中間体（ＶＩＩＩ’）と置換基を有する塩化ベンゾイル（ＩＩＩ’−a）からアミド生成反応によって製造することができる。置換基を有する安息香酸（III’−b）を用い、一般的なアミドカップリング反応条件、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）およびジイソプロピルエチルアミンやトリエチルアミンのような塩基などの条件下、同様のアミドカップリング反応を行うことにより製造することができる。
【００７０】
式（ＶＩＩＩ’）で表される化合物は、下記スキーム６に示すように５−アミノチアゾール−４−カルボン酸エチルエステルから製造することができる。
【００７１】
【化９】
【００７２】
式中、ＸはＣｌ, Ｂｒ, あるいはＩから選択されるハロゲンを表す。
【００７３】
５−アミノチアゾール−４−カルボン酸エチルエステルは、Golankiewiczらの方法に従って製造することができる (Tetrahedron, 41 (24), 5989-5994 (1985))。すなわち、市販のエチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセテートを飽和重曹水中でジチオン酸ナトリウムと処理することによって得られるエチル２−アミノ−２−シアノアセテートを、酢酸ギ酸無水物で処理することで対応するホルムアミド体が生成する。こうして得られる２−シアノ−２−ホルムアミド酢酸エチルをLawesson試薬で処理、続いてNCSやNBSなどのハロゲン化試薬と処理することで、望む化合物を得ることができる。
【００７４】
本発明は、以下にあげる実施例でさらに詳細に記述される。これらの実施例は一例である。上記記述およびこの実施例から、当業者は、本発明の本質的特質を理解でき、その精神および範囲から逸脱することなく本発明を様々な用途および条件に適応させるために、様々な改変や修飾を行なうことが可能である。つまり、本発明は以下に挙げる実施例に限定されるものではなく付属の特許請求の範囲によって定義される。
式（Ｉ’）で示される化合物として、具体的な化合物を表１−１〜表１−２２に示す。
【００７５】
【表１−１】
【００７６】
【表１−２】
【００７７】
【表１−３】
【００７８】
【表１−４】
【００７９】
【表１−５】
【００８０】
【表１−６】
【００８１】
【表１−７】
【００８２】
【表１−８】
【００８３】
【表１−９】
【００８４】
【表１−１０】
【００８５】
【表１−１１】
【００８６】
【表１−１２】
【００８７】
【表１−１３】
【００８８】
【表１−１４】
【００８９】
【表１−１５】
【００９０】
【表１−１６】
【００９１】
【表１−１７】
【００９２】
【表１−１８】
【００９３】
【表１−１９】
【００９４】
【表１−２０】
【００９５】
【表１−２１】
【００９６】
【表１−２２】
【００９７】
アミノチアゾール誘導体（Ｉ）およびアミノチアゾール誘導体（Ｉ’）はＴＮＩＫ抑制効果を示し（試験例１）、所望されない活性を示さない（試験例２）。アミノチアゾール誘導体は、抗腫瘍活性（試験例３）および低毒性を示す。
【００９８】
アミノチアゾール誘導体は、経口投与または点滴注入などの非経口投与のための従来の薬学製剤の形態で、例えば抗腫瘍剤として用いることができる。
【００９９】
経口投与のための製剤は、錠剤、顆粒、粉末、カプセルなどの固形剤、およびシロップなどの液体製剤を含む。これらの製剤は従来の方法によって調製することができる。固形剤は、ラクトース、コーンスターチなどのデンプン、微結晶性セルロースなどの結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルシウムカルボキシメチルセルロース、タルク、ステアリン酸マグネシウムなどのような従来の薬学的担体を用いることによって調製することができる。カプセルは、このように調製した顆粒または粉末をカプセルに包むことによって調製することができる。シロップは、ショ糖、カルボキシメチルセルロースなどを含む水溶液中で、アミノチアゾール誘導体を溶解または懸濁することによって調製できる。
【０１００】
非経口投与のための製剤は、点滴注入などの注入物を含む。注入製剤もまた従来の方法によって調製することができ、等張化剤（例えば、マンニトール、塩化ナトリウム、グルコース、ソルビトール、グリセロール、キシリトール、フルクトース、マルトース、マンノース）、安定化剤（例えば、亜硫酸ナトリウム、アルブミン）、防腐剤（例えば、ベンジルアルコール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル）中に任意で組み入れることができる。
【０１０１】
アミノチアゾール誘導体は、腫瘍（特に大腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌または乳癌などの固形腫瘍）の治療のために効果的である。
【０１０２】
アミノチアゾール誘導体の用量は、疾患の重症度、患者の年齢および体重、投薬形態などに従って変化させることができるが、通常は成人において１日あたり１ｍｇ〜１，０００ｍｇの範囲であり、それは経口経路または非経口経路によって、１回、または２回もしくは３回に分割して投与できる。
【実施例】
【０１０３】
［試験例］
試験例１
【０１０４】
組換えヒトＴＮＩＫ（Ｎ末端セグメント）の調製：
ヒトＴＮＩＫ（ＮＭ＿０１５０２８．１）のキナーゼドメインを含むＮ末端セグメント（ＴＮＩＫ＿Ｎ、残基１〜３１４）をコードするｃＤＮＡを、以下のプライマーを用いて、ＰＣＲによってヒト組織（バイオチェイン（Ｂｉｏｃｈａｉｎ）社）から合成したｃＤＮＡ混合物から増幅した：
【０１０５】
５’−ＡＡＴＴＴＣＡＧＧＧＣＧＣＣＡＴＧＧＣＧＡＧＣＧＡＣＴＣＣＣＣＧＧＣＴＣＧＡＡＧ−３’（［配列番号１］フォワードプライマー、下線を引いたヌクレオチドはＥｈｅＩ部位の位置を示す）；
５’−ＡＴＴＣＧＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＣＣＴＣＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＧＴＴＣＴＡＴ−３’（［配列番号２］リバースプライマー、下線を引いたヌクレオチドはＮｏｔＩ部位の位置を示す）。
【０１０６】
プロテアーゼ切断部位およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ精製タグ（ＧＳＴタグ）を含むバキュロウイルス転写ベクターｐＦａｓｔＢａｃ＿ＧＳＴｂの中へ、このｃＤＮＡをサブクローン化した。このプラスミドを精製し、ｐＦａｓｔＢａｃ＿ＧＳＴｂ−ＴＮＩＫ＿Ｎの挿入をＤＮＡ塩基配列決定によって確認した。次に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞をプラスミドにより形質転換してバック・ツー・バック（Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ）（商標）バキュロウイルス発現系（インビトロジェン社）のための指示に従って、組換えバクミドを調製した。Ｓｆ９細胞を、ＳＦ−９００ＩＩ無血清培地（インビトロジェン社）中で、セルフェクチン（Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ）試薬（インビトロジェン社）を用いて、ｐＦａｓｔＢａｃ＿ＧＳＴｂ−ＴＮＩＫ＿Ｎを含む組換えバクミドによりトランスフェクションした。ウイルス上清をトランスフェクションの７２時間後に培地から回収した。ウイルスは、Ｔフラスコまたはローラーボトル中で、１０％ＦＣＳおよび抗生−抗真菌試薬（インビトロジェン社）を追加したグレース昆虫培地（インビトロジェン社）中で、２７℃で７２時間、活発に増殖中のＳｆ９細胞またはＳｆ２１細胞を感染させることによって、３回増幅した。
【０１０７】
増幅されたＴＮＩＫ＿Ｎウイルスの力価は、バックパック（ＢａｃＰＡＫ）（商標）バキュロウイルス迅速力価キット（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｒａｐｉｄ Ｔｉｔｅｒ ｋｉｔ）（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社）を用いることによって、２．３６ｘ１０８ｐｆｕ／ｍｌと推定した。
【０１０８】
グレース昆虫培地中で対数増殖期にあるＳｆ２１細胞（２×１０６細胞／ｍｌ）に、３．０ＭＯＩで組換えバキュロウイルスを感染させ、２７℃で７２時間ローラーボトル（１ボトルあたり２５０ｍｌの培地）中でインキュベートし、その後に細胞を遠心分離によって回収し、細胞沈殿を冷ＰＢＳにより洗浄し、精製まで−８０℃に保った。以下の精製手順は４℃で行なった。凍結細胞を氷上で解凍し、１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド、２μｇ／ｍｌロイペプチン、２μｇ／ｍｌアプロチニン、１ｍＭ ＮａＦ、１００μＭオルトバナジウム酸ナトリウムおよび１μＭカンタリジンを追加した、溶解バッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ノニデットＰ−４０、５ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ）中で超音波処理によって溶解した。懸濁した溶解物を、２０分間９０００ｇで遠心分離によって清澄にし、上清をグルタチオンセファロースビーズ（ＧＥヘルスケア社）と共に１時間インキュベートした。ビーズをバッファーＨ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡおよび０．０５％Ｂｒｉｊ３５）中で懸濁し、エコノ−パックカラム（Ｅｃｏｎｏ−ｐａｃｋ ｃｏｌｕｍｎ）（バイオラッド（ＢＩＯ−ＲＡＤ）社）中で、バッファーＨ、続いてバッファーＬ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．０５％Ｂｒｉｊ３５）により洗浄した。結合したＴＮＩＫ＿Ｎは、溶出緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロール、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡおよび５ｍＭ還元型グルタチオン）により溶出した。溶出した画分を回収し、ブラッドフォード試薬（バイオラッド社）によってタンパク質濃度を決定した。ＴＮＩＫ＿Ｎ画分をプールし、保存バッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロール、０．０５％Ｂｒｉｊ３５）により平衡化した１０ＤＧカラム（バイオラッド社）を用いて脱塩した。精製したＴＮＩＫ＿Ｎを、４〜２０％のポリアクリルアミドゲルを用いる電気泳動、およびボイジャー（Ｖｏｙａｇｅｒ）−ＤＥ ＲＰ ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ（アプライド・バイオシステムズ社）上のマトリックス支援レーザー脱離イオン化反射型飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析によって特性を評価した。ＴＮＩＫ＿Ｎを分子量およびＭＡＳＣＯＴペプチド質量フィンガープリントによって確認した。
【０１０９】
キナーゼ分析：
キナーゼ分析は３８４ウェルプレート（グライナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ）社）を用いて２０μｌの体積で行った。反応混合物は、化合物または賦形剤（１％ＤＭＳＯ）、０．０８ｎｇ／μｌ ＴＮＩＫ＿Ｎ、１μＭ ＦＩＴＣ標識基質ペプチドのＦＩＴＣ−ｘ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ（［配列番号３］ｘ：ε−アミノカプロン酸）、２０ｍＭヘペス（ｐＨ７．５）、０．０１％トリトンＸ−１００、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５μＭ ＡＴＰおよび２ｍＭ ＤＴＴからなる。ブランクとしては、ＴＮＩＫ＿Ｎを賦形剤（１％ＤＭＳＯ）の反応混合物から除外した。キナーゼ反応は室温で１時間行ない、６０μｌの終結バッファー（１２７ｍＭヘペス（ｐＨ７．５）、２６．７ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％トリトンＸ−１００、１％ＤＭＳＯおよび０．１３％コーティング試薬３（キャリパー・ライフサイエンス（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）社））を添加することによって停止させた。非リン酸化ＦＩＴＣ標識基質ペプチドおよびリン酸化ＦＩＴＣ標識基質ペプチドの量は、モビリティシフトマイクロフルイディックテクノロジー（Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｓｈｉｆｔ Ｍｉｃｒｏ−Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（キャリパーＬＣ３０００システム、キャリパー・ライフサイエンス社）によって検出した。
【０１１０】
ＴＮＩＫ＿Ｎのキナーゼ活性はＰ／（Ｐ＋Ｓ）として定義された（Ｐ：リン酸化ＦＩＴＣ標識基質ペプチドのピーク高；Ｓ：ＦＩＴＣ標識基質ペプチドのピーク高）。
化合物の阻害は以下のように計算した；
阻害（％）＝（１−（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ））×１００
Ａ：化合物ウェルの平均のＰ／（Ｐ＋Ｓ）；
Ｂ：賦形剤ウェルの平均のＰ／（Ｐ＋Ｓ）；
Ｃ：ブランクのウェルの平均のＰ／（Ｐ＋Ｓ）
【０１１１】
キナーゼに対する化合物のＩＣ５０値を対数濃度阻害曲線の回帰分析から計算した。
結果：
試験結果を表２−１〜表２−４中に示す。
【０１１２】
【表２−１】
【０１１３】
【表２−２】
【０１１４】
【表２−３】
【０１１５】
【表２−４】
【０１１６】
試験例２
選択性プロファイリングテスト：
２０のチロシンキナーゼおよび３０のセリン／スレオニンキナーゼに対する化合物１の抑制効果を、クイックスカウト（ＱｕｉｃｋＳｃｏｕｔ）（商標）ＴＫおよびＳＴＫスクリーニングパネル（カルナ・バイオサイエンス（Ｃａｒｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社、神戸、日本）を用いて調べた。化合物１のＩＣ５０値を表３中に示す。この結果は、化合物１が他の５０のキナーゼよりも強力に（ＩＣ５０；９ｎＭ）ＴＮＩＫ＿Ｎを阻害することを明らかにした。
化合物１の選択性プロファイリング
【０１１７】
【表３】
【０１１８】
試験例３
ＴＣＦ／リンパ球エンハンサー因子（ＬＥＦ）レポーター遺伝子分析：
ヒト大腸癌細胞株のＤＬＤ−１およびＨＣＴ−１１６を、ヒューマンサイエンス研究資源バンクおよび米国培養菌保存施設からそれぞれ入手した。ｐＣＩｎｅｏ−ＨＡベクター（プロメガ社）の中へ挿入した全長ヒトＴＮＩＫは、ケンイチ・カリヤ（Ｋｅｎｉｃｈｉ Ｋａｒｉｙａ）博士（琉球大学）から快く贈られた。ＤＬＤ１細胞およびＨＣＴ−１１６細胞を、標準ＴＣＦ／ＬＥＦルシフェラーゼレポーター（ＴＯＰ−ＦＬＡＳＨ）または変異体ＴＣＦ／ＬＥＦルシフェラーゼレポーター（ＦＯＰ−ＦＬＡＳＨ）、ｐｈＲＬ−ＴＫ（プロメガ社）（内部標準）、およびｐＣＩｎｅｏ−ＨＡ−ＴＮＩＫまたはｐＣＩｎｅｏ−ＨＡ（対照プラスミド）により三回コトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後に、化合物１または賦形剤を、０．０７８１２５μＭ、０．１５６２５μＭ、０．３１２５μＭおよび０．６２５μＭの最終濃度で細胞に加えた。続く２４時間後に、レポーター活性を、デュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（プロメガ社）を用いることによって、取扱説明書に従って分析した。テスト結果を図１中に示す。結果を各サンプルのウミシイタケ属の値に対して正規化した。レポーター分析結果は、三回の分析の平均および標準偏差を表わす。化合物１は、濃度依存的様式でＤＬＤ１およびＨＣＴ−１１６においてβ−カテニン／ＴＣＦ４仲介性転写を阻害した。
【０１１９】
［実施例］
以下の実施例は、例を挙げたのみであり、本発明の範囲を限定するものではない。
以下の説明で使用される略語、記号の意味は次の通りである。
【０１２０】
CDCl3: クロロホルム-d
D2O: 重水
DCM: ジクロロメタン
DMA: ジメチルアセトアミド
DMF: ジメチルホルムアミド
DMSO: ジメチルスルホキシド
EtOH: エタノール
EtOAc: 酢酸エチル
HCl: 塩酸
K2CO3: 炭酸カリウム
MeOH: メタノール
MgSO4: 硫酸マグネシウム
NaHCO3:炭酸水素ナトリウム
Na2SO4: 硫酸ナトリウム
NH4Cl: 塩化アンモニウム
NH3: アンモニア
N2: 窒素
POCl3: オキシ塩化リン
THF: テトラヒドロフラン
TFA: トリフルオロ酢酸
Xantphos: 4,5-ビス(ジフェニルホスフィノ)-9,9-ジメチルキサンテン
EDC: 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
HOBT: 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
min.: 分
h or hr(s): 時間
RT or rt: 室温
sat.: 飽和
aq.: 水溶液
TLC: 薄層クロマトグラフィー
HPLC: 高速液体クロマトグラフィー
Prep HPLC: 分取HPLC
LC/MS: 高速液体クロマトグラフ質量分析計
MS: 質量分析計
NMR: 核磁気共鳴
【０１２１】
実施例１−３、５−１６、２０、２６、３４、３６、４６、５２、５４、６１−６３、６５、６６、８１、１２１
【０１２２】
下記表４−１〜表４−５に示す各実施例は、適当な出発物質を用いて下記実施例４の方法に従い合成した。
【０１２３】
【表４−１】
【０１２４】
【表４−２】
【０１２５】
【表４−３】
【０１２６】
【表４−４】
【０１２７】
【表４−５】
【０１２８】
実施例４
５−（４−アセタミドベンズアミド）−２−（４−フルオロフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
(a)５−アミノ−２−（４−フルオロフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０１２９】
【化１０】
【０１３０】
２−アミノ−２−シアノアセタミド（0.25 g, 2.5 mmol）の酢酸エチル懸濁液(7 mL)に４−フルオロフェニルイソチオシアネート(0.386 g, 2.5 mmol)を加え、混合溶液を30分間還流した。溶媒を留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、２％メタノール−DCM溶液で溶出して0.4 g の標記化合物を得た(収率52%)。
【０１３１】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 6.65 (s, 2H), 6.89 (br, 2H), 7.04 (t, 2H J = 8.7 Hz), 7.6-7.7 (m, 2H), 9.56 (s, 1H). LCMS m/z [M+H]+253.0.
【０１３２】
(b)５−（４−アセタミドベンズアミド）−２−（４−フルオロフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０１３３】
【化１１】
【０１３４】
４−アセタミド安息香酸(0.106 g, 0.59 mmol)および触媒量のDMFの乾燥THF溶液(5 mL)に塩化オキザリル(0.06 mL, 0.79 mmol)を0 ℃で加え、混合溶液を室温で２時間撹拌した。溶媒を留去したのち、窒素気流下、残存する塩化オキザリルをトルエンとの共沸により取り除いた。得られた酸塩化物をピリジン(5 mL)に溶解し、0 ℃に冷却した。この溶液に５−アミノ−２−（４−フルオロフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド(0.1 g, 0.39 mmol)のピリジン溶液(5 mL)を0 ℃で加え、混合物を室温で12時間撹拌した。溶媒を留去後、残渣を１M塩酸に懸濁させ、析出した固体を濾取した。固体を水(10 mL)およびエーテル (20 mL)で洗浄し、乾燥させた。粗精製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、３％メタノール−DCM溶液で溶出して38 mgの標記化合物を得た(収率10%)。
【０１３５】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 2.09 (s, 3H), 7.01 (t, 2H, J = 8.7 Hz), 7.7-7.9 (m, 8H), 10.09 (s, 1H), 10.32 (s, 1H), 12.5 (s, 1H). LCMS m/z [M+H]+414.4.
【０１３６】
実施例１７
５−（４−アセタミドベンズアミド）−２−（４−ハイドロキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０１３７】
【化１２】
【０１３８】
５−（４−アセタミドベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド(100 mg, 0.23 mmol)の１，２−ジクロロエタン溶液(10 mL)にBBr3 (587.5 mg, 2.35 mmol)を窒素気流下、0 ℃で加え、混合物を室温で５時間撹拌した。反応混合物に１M塩酸(5ml)を加えて反応を終了させ、有機層を分離、濃縮した。得られた固体を回収し、ヘキサン、エーテルで順に洗浄し、乾燥させて70 mgの標記化合物を得た(収率72%)。
【０１３９】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 2.09 (s, 3H), 6.71 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.51 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.58 (br, 1H), 7.7-7.9 (m, 5H), 9.71 (s, 1H), 10.33 (s, 1H), 12.49 (s, 1H). LCMS m/z [M+H]+412.1.
【０１４０】
実施例１８
tert−ブチル−４−［５−（４−アセタミドベンズアミド）−４−カルバモイルチアゾール−２−イルアミノ］フェニルカーバメート
【０１４１】
【化１３】
【０１４２】
(a)tert−ブチル−４−イソチオシアナートフェニルカーバメート
【０１４３】
【化１４】
【０１４４】
tert−ブチル−４−アミノフェニルカーバメート(0.5 g, 2.4 mmol)およびトリエチルアミン(0.98 mL, 7.2 mmol)のTHF溶液(45 mL)にチオホスゲン(0.2 mL, 2.64 mmol)を0 ℃で滴下し、その後混合物を室温で30分間撹拌した。反応混合物に水を加えて反応を停止し、エーテルで抽出した(2 x 30 mL)。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮して0.5 gの標記化合物(収率83%)を得た。本化合物は更なる精製はせず、そのまま次の反応に用いた。
【０１４５】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 1.50 (s, 9H), 6.50 (s, 1H), 7.14 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.34 (d, 2H, J = 8.4 Hz). LCMS m/z [M+H]+251.2.
【０１４６】
(b) tert-ブチル−４−（５−アミノ−４−カルバモイルチアゾール−２−イルアミノ）フェニルカーバメート
【０１４７】
【化１５】
【０１４８】
２−アミノ−２−シアノアセタミド（0.178 g, 1.8 mmol）の酢酸エチル懸濁液(10 mL)にtert−ブチル−４−イソチオシアナートフェニルカーバメート(0.5 g, 2.0 mmol)を加え、混合溶液を30分間還流した。溶媒を留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、２％メタノール−DCM溶液で溶出して0.4 g の標記化合物を得た(収率57%)。
【０１４９】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 1.46 (s, 9H), 6.62 (s, 2H), 6.88 (s, 2H), 7.3-7.4 (m, 2H), 7.46 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 9.12 (s, 1H), 9.39 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 350.3.
【０１５０】
(c) tert-ブチル−４−［５−（４−アセトアミドベンズアミド）−４−カルバモイルチアゾール−２−イルアミノ］フェニルカーバメート
【０１５１】
【化１６】
【０１５２】
４−アセタミド安息香酸(0.256 g, 1.43 mmol)および触媒量のTHFの乾燥THF溶液(15 mL)に塩化オキザリル(0.25 mL, 2.86 mmol)を0 ℃で加え、混合溶液を室温で２時間撹拌した。溶媒を留去したのち、窒素気流下、残存する塩化オキザリルをトルエンとの共沸により取り除いた。得られた酸塩化物をピリジン(10 mL)に溶解し、0 ℃に冷却した。この溶液にtert-ブチル−４−（５−アミノ−４−カルバモイルチアゾール−２−イルアミノ）フェニルカーバメート(0.4 g, 1.14 mmol)のピリジン溶液(5 mL)を0 ℃で加え、混合物を室温で12時間撹拌した。溶媒を留去後、残渣を１M塩酸に懸濁させ、析出した固体を濾取した。固体を水(10 mL)およびエーテル (20 mL)で洗浄し、乾燥させた。粗精製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、２−５％メタノール−DCM溶液で溶出して125 mgの標記化合物を得た(収率21%)。
【０１５３】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 1.47 (s, 9H), 2.09 (s, 3H), 7.3-7.4 (m, 2H), 7.62 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.72 (s, 1H), 7.8-7.9 (m, 5H), 9.20 (br, 1H), 9.92 (s, 1H), 10.33 (s, 1H), 12.54 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] +511.3.
【０１５４】
実施例６８−６９、７１、７３、７６、８２、９２、９５−９８、１００、１０２、１０４
下記表５−１〜表５−２に示す化合物は、適当な出発物質を用いて上記実施例１８の方法に従い合成した。
【０１５５】
【表５−１】
【０１５６】
【表５−２】
【０１５７】
実施例１９
５−（４−アセトアミドベンズアミド）−２−（４−アミノフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０１５８】
【化１７】
【０１５９】
tert-ブチル−４−［５−（４−アセトアミドベンズアミド）−４−カルバモイルチアゾール−２−イルアミノ］フェニルカーバメート(0.10 g, 19 mmol)を、アルゴン気流下、0 ℃で４M塩酸−１，４−ジオキサン(10 mL)に溶解し、混合物を0 ℃で３時間撹拌した。溶媒を留去後、残留する酸をトルエンとの共沸上流で取り除いた。得られた固体を乾燥させて78 mgの標記化合物を得た (収率98%)。
【０１６０】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 2.07 (s, 3H), 7.29 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 7.7-7.9 (m, 8H), 9.93 (br, 2H), 10.36 (s, 1H), 10.38 (s, 1H), 12.56 (s, 1H). LCMS m/z [M+H]+411.1.
【０１６１】
実施例２１
５−（４−フルオロベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０１６２】
【化１８】
【０１６３】
(a)５−アミノ−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０１６４】
【化１９】
【０１６５】
４−メトキシフェニルイソチオシアナート (1.91 g, 11.53 mmol)および２−アミノ−２−シアノアセタミド（1.20 g, 12.11 mmol）の酢酸エチル懸濁液(16 mL)を80 ℃ で50分間加熱した。反応混合物を室温まで冷却し析出した固体を濾別した。濾液を濃縮して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、２−５％メタノール−クロロホルム溶液で溶出して2.63 g の標記化合物を得た(収率86%)。
【０１６６】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.70 (s, 3H), 6.61 (s, 2H), 6.7-7.0 (m, 4H), 7.51 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 9.34 (s, 1H).
【０１６７】
(b)５−（４−フルオロベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０１６８】
【化２０】
【０１６９】
５−アミノ−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド(920 mg, 3.48 mmol)のピリジン溶液(15 mL)に、0℃で４−フルオロベンゾイルクロリド(0.411 ｍL, 3.48 mmol)を加え、混合物を室温まで戻し、その後室温で１時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、有機層を水（ｘ２）、飽和食塩水で順に洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。得られた固体を回収し、５０％ヘキサン−酢酸エチル溶液で洗浄して、1.04gの標記化合物を得た（収率77%）。
【０１７０】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.73 (s, 3H), 6.88 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.46 (t, 2H, J = 8.8 Hz), 7.6-7.75 (m, 3H), 7.84 (br, 1H), 7.96 (dd, 2H, J = 8.8, 5.2 Hz), 9.89 (s, 1H), 12.58 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 386.9.
【０１７１】
実施例５９、１０５、１１２、１１５
下記表６に示す化合物は、適当な出発物質を用いて上記実施例２１の方法に従い合成した。
【０１７２】
【表６】
【０１７３】
実施例２２
２−（４−メトキシフェニルアミノ）−５−［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ベンズアミド］チアゾール−４−カルボキサミド
【０１７４】
【化２１】
【０１７５】
５−（４−フルオロベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド(50 mg, 0.13 mmol)および１−メチルピペラジン (0.072 ｍL, 0.65 mmol)のN−メチルピロリドン溶液 (0.6 mL)をマイクロウェーブ反応装置で40分間処理した（CEM corp, 180℃）。反応混合物を濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、０−１２％メタノール−クロロホルム溶液で溶出して38 mgの標記化合物を得た(収率63%)。
【０１７６】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 2.23 (s, 3H), 2.3-2.7 (m, 4H), 3.2-3.5 (m, 4H), 3.72 (s, 3H), 6.88 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.08 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.58 (br, 1H), 7.65 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.73 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.76 (br, 1H), 9.82 (s, 1H), 12.39 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 467.0.
【０１７７】
実施例２３−２４、２７−３２、４３、４９、５５−５６、７２、７４−７５、７７−７８、８４、８６−８９、１０６、１１１、１１３
下記表７−１〜表７−６に示される化合物は、適当な出発物質を用いて上記実施例２２の方法に従い合成した。
【０１７８】
【表７−１】
【０１７９】
【表７−２】
【０１８０】
【表７−３】
【０１８１】
【表７−４】
【０１８２】
【表７−５】
【０１８３】
【表７−６】
【０１８４】
実施例２５
５−（４−アセトアミドベンズアミド）−２−（４−アセトアミドフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０１８５】
【化２２】
【０１８６】
５−（４−アセトアミドベンズアミド）−２−（４−アミノフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド(50 mg, 0.12 mmol)のピリジン溶液(2 mL)に、窒素気流下、0 ℃で塩化アセチル(14.4 mg, 0.182 mmol)を加え、その後、混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物を濃縮して得られた残渣を１M塩酸に懸濁させた。析出した固体を濾取し、ヘキサン、メタノールで順に洗浄後、乾燥して52 mgの標記化合物を得た(収率76%)。
【０１８７】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 2.01 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 7.51 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.66 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.73 (s, 1H), 7.8-7.9 (m, 5H), 9.81 (s, 1H), 9.98 (s, 1H), 10.34 (s, 1H), 12.54 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 453.4.
【０１８８】
実施例３３
５−（４−アミノベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０１８９】
【化２３】
【０１９０】
(a)２−（４−メトキシフェニルアミノ）−５−（４−ニトロベンズアミド）チアゾール−４−カルボキサミド
【０１９１】
【化２４】
【０１９２】
4−ニトロベンゾイル クロライド(0.7 g, 3.78 mmol)のピリジン溶液(6 mL) に5−アミノ−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−4−カルボキサミド (1 g, 3.7 mmol) のピリジン溶液 (6 mL)を0 ℃で加え、混合物を12時間室温で攪拌した。溶媒を留去して得られた残渣を水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。有機層を１M 塩酸 (2 x 100 mL)、水 (2 x 50 mL)、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(2x50mL)、水 (50 mL) 次いで食塩水(50 mL)で順次洗浄した。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去して標記化合物0.41 g (収率27%) を得た。得られた化合物を更なる精製をすることなく次の工程に使用した。
【０１９３】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.70 (s, 3H), 6.88 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 7.66 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 7.70 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 8.13 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 8.43 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 9.93 (s, 1H), 12.76 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 414.2.
【０１９４】
(b)５−（４−アミノベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０１９５】
【化２５】
【０１９６】
２−（４−メトキシフェニルアミノ）−５−（４−ニトロベンズアミド）チアゾール−４−カルボキサミド(0.1g, 0.24 mmol)のTHF-EtOH溶液(1:1, 30 mL)に塩化すず(II)2水和物(0.27 g, 1.2 mmol)を室温で加え、その後混合物を５時間還流した。反応混合物を濃縮して得られた残渣を酢酸エチルで希釈した。この溶液に、１M水酸化ナトリウム水溶液を溶液が塩基性(pH = 8−9)になるまで加えた。有機層を分離し、さらに水層を酢酸エチルで抽出した(2 x 50 mL)。得られた有機層を合わせ、セライト濾過した。濾液を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。得られた固体を回収し、ヘキサンで洗浄し、39 mgの標記化合物を得た(収率42%)。
【０１９７】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.72 (s, 3H), 6.03 (s, 2H), 6.65 (d, 2H, J = 8.3 Hz), 6.87 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.53 (s, 1H), 7.58 (d, 2H, J = 8.3 Hz), 7.54 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.70 (s, 1H), 9.78 (s, 1H), 12.25 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 384.0.
【０１９８】
実施例３５
５−（４−ヒドロキシベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０１９９】
【化２６】
【０２００】
(a)４−［４−カルバモイル−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−５−イルカルバモイル］フェニルアセテート
【０２０１】
【化２７】
【０２０２】
４−アセトキシ安息香酸(350 mg, 1.97 mmol) のジクロロメタン懸濁溶液(36 mL)に、塩化オキザリル(0.696 mL, 7.95 mmol)および触媒量のDMFを0 ℃で加え、混合溶液を室温で５時間撹拌した。溶媒を留去したのち、窒素気流下、残存する塩化オキザリルをトルエンとの共沸により取り除いた。得られた酸塩化物を、５−アミノ−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド(350 mg, 1.32 mmol)のピリジン溶液(10 mL)に0 ℃で加え、混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物に氷水を加えて反応を停止し、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で２回洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。得られた残渣を５０％酢酸エチル−ジエチルエーテル溶液に懸濁させて得られた固体を濾取し、５０％酢酸エチル−ジエチルエーテル溶液で洗浄して、382mgの標記化合物を得た(収率68%)。
【０２０３】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 2.32 (s, 3H), 3.73 (s, 3H), 6.89 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.39 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.6-7.7 (m, 3H), 7.84 (br, 1H), 7.94 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 9.90 (s, 1H), 12.59 (s, 1H).
【０２０４】
(b) ５−（４−ヒドロキシベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０２０５】
【化２８】
【０２０６】
４−［４−カルバモイル−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−５−イルカルバモイル］フェニルアセテート(350 mg, 0.821 mmol)の乾燥メタノール溶液(45 mL)に炭酸カリウム(113 mg, 0.821 mmol)を加え、混合物を50℃で20分間撹拌した。反応混合物を0℃に冷却し、水で希釈した。この溶液に２M塩酸(0.5 mL)を加えて酸性にした。生じた固体を濾取し、水で洗浄して250mgの標記化合物を得た(収率79%)。
【０２０７】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.72 (s, 3H), 6.88 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 6.95 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.60 (br, 1H), 7.65 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.7-7.8 (m, 3H), 9.84 (s, 1H), 10.40 (br, 1H), 12.42 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 384.8.
【０２０８】
実施例３７
５−［４−（２−ヒドロキシアセトアミド）ベンズアミド］−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−4−カルボキサミド
【０２０９】
【化２９】
【０２１０】
５−（４−アミノベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−4−カルボキサミド(0.05g, 0.13 mmol)とトリエチルアミン(0.018 mL)のTHF溶液(10 mL)にアセトキシアセチルクロリド (0.016 mL, 0.16 mmol)を0 ℃で滴下し、その後混合物を室温で2時間撹拌した。反応混合物を水で希釈し、酢酸エチルで抽出した(3 x 20 mL)。得られた有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。得られた固体をメタノール(5 mL)に溶解し、炭酸カリウム(30 mg, 0.22 mmol)および触媒量の水を加えた。混合物を室温で1時間撹拌した。溶媒を留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、２％メタノール−DCM溶液で溶出して7 mgの標記化合物を得た(収率9%)。
【０２１１】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.72 (s, 3H), 4.04 (d, 2H, J = 5.8 Hz), 5.7-5.8 (m, 1H), 6.88 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.6-7.7 (m, 3H), 7.80 (s, 1H), 7.85 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.94 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 9.86 (s, 1H), 10.07 (s, 1H), 12.51 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 442.3.
【０２１２】
実施例３８
５−｛４−［２−（ジメチルアミノ）アセトアミド］ベンズアミド｝−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０２１３】
【化３０】
【０２１４】
(a) ５−［４−（２−ブロモアセトアミド）ベンズアミド］−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０２１５】
【化３１】
【０２１６】
５−（４−アミノベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−4−カルボキサミド(0.3 g, 0.78 mmol)とトリエチルアミン(0.213 mL, 1.56 mmol)のTHF溶液(30 mL)にブロモアセチルクロリド (135 mg, 0.86 mmol)を0 ℃で滴下し、その後混合物を室温で４時間撹拌した。反応混合物を水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。得られた固体をメタノールで洗浄後、乾燥させて0.3 gの標記化合物を得た(収率75%)。
【０２１７】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.72 (s, 3H), 4.09 (s, 2H), 6.88 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.6-7.7 (m, 3H), 7.8-7.9 (m, 5H), 9.86 (s, 1H), 10.75 (s, 1H), 12.52 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 506.2.
【０２１８】
(b) ５−｛４−［２−（ジメチルアミノ）アセトアミド］ベンズアミド｝−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０２１９】
【化３２】
【０２２０】
ジメチルアミン(11% メタノール溶液, 0.07 mL, 0.138 mmol)のTHF溶液(10 mL)に炭酸水素ナトリウム (11.5 mg, 0.138 mmol)を加え、混合物を室温で１５分間撹拌した。５−［４−（２−ブロモアセトアミド）ベンズアミド］−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド(70 mg, 0.138 mmol)のTHF溶液をこの溶液に0 ℃でゆっくり加え、混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を留去して得られた残渣に水(10 mL)を加えた。析出した固体を濾取して、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、60％酢酸エチル−ヘキサン溶液で溶出して15 mgの標記化合物を得た(収率23%)。
【０２２１】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 2.28 (s, 6H), 3.12 (s, 2H), 3.72 (s, 3H), 6.88 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.6-7.7 (m, 3H), 7.80 (s, 1H), 7.83 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.90 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 9.86 (s, 1H), 10.11 (s, 1H), 12.51 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 469.3.
【０２２２】
実施例３９−４２
下記表８に示す各化合物は、適当な出発物質を用いて上記実施例３８の方法に従い合成した。
【０２２３】
【表８】
【０２２４】
実施例４４
２−（４−メトキシフェニルアミノ）−５−｛４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル］ベンズアミド｝チアゾール−４−カルボキサミド
【０２２５】
【化３３】
【０２２６】
５−アミノ−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド(50 mg, 0.189 mmol)およびN,N−ジイソプロピルエチルアミン (27 mg, 0.208 mmol)のDMA溶液(2 mL)に４−クロロメチルベンゾイルクロリド(39 mg, 0.208 mmol)を0℃で加え、混合物を室温で撹拌した。２時間後、１−メチルピペラジン(95 mg, 0.946 mmol)を混合物に加え、さらに室温で３時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、有機層を水で２回洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、０−１２％メタノール−クロロホルム溶液で溶出して34 mgの標記化合物を得た(収率37%)。
【０２２７】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 2.17 (s, 3H), 2.2-2.6 (m, 8H), 3.55 (s, 2H), 3.73 (s, 3H), 6.88 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.53 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 7.6-7.7 (m, 3H), 7.83 (br, 1H), 7.85 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 9.88 (s, 1H), 12.56 (s, 1H), LCMS m/z [M+H] + 481.4.
【０２２８】
実施例９９、１０１、１０７、１０９、１１０
下記表９に示す化合物は、適当な出発物質を用いて上記実施例４４の方法に従い合成した。
【０２２９】
【表９】
【０２３０】
実施例４５
２−（４−メトキシフェニルアミノ）−５−｛４−［２−（ピロリジン−１−イル）エトキシ］ベンズアミド｝チアゾール−４−カルボキサミド
【０２３１】
【化３４】
【０２３２】
５−（４−ヒドロキシベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド(50 mg, 013 mmol)および炭酸カリウム(47 mg, 0.34 mmol)のDMF溶液(2 mL)に２−クロロエチルピロリジン塩酸塩(29 mg, 0.17 mmol)を室温で加え、その後混合物を80℃で２時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水で２回洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、０−１２％メタノール−クロロホルム溶液で溶出して16 mgの標記化合物を得た(収率26%)。
【０２３３】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 1.5-1.8 (m, 4H), 2.3-2.6 (m, 4H), 2.7-3.0 (m, 2H), 3.73 (s, 3H), 4.18 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 6.88 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.17 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.63 (br, 1H), 7.66 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.80 (br, 1H), 7.84 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 9.86 (s, 1H), 12.49 (s, 1H), LCMS m/z [M+H] + 482.4.
【０２３４】
実施例５８、６０、１２２
下記表１０に示す化合物は、適当な出発物質を用いて上記実施例４５の方法に従い合成した。
【０２３５】
【表１０】
【０２３６】
実施例４７
５−（４−メトキシベンズアミド）−２−（ピリジン−４−イルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０２３７】
【化３５】
【０２３８】
(a)エチル５−アミノ−２−ブロモチアゾール−４−カルボキシレート
【０２３９】
【化３６】
【０２４０】
N−ブロモスクシンイミド(0.54 g, 3.03 mmol)を、Golankiewiczらの方法(Tetrahedron, 41 (24), 5989-5994 (1985))により製造した５−アミノチアゾール−４−カルボン酸エチルエステル(0.44 g, 2.53 mmol)のアセトニトリル溶液(10 mL)に加え、混合物を３０分間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル(50 mL)で希釈し、5% 炭酸カリウム水溶液 (25 mL)、続いて飽和食塩水 (25mL)で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、１５％酢酸エチル−ヘキサン溶液で溶出して0.37 gの標記化合物を得た(収率58%)。
【０２４１】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 1.38 (t, 3H, J = 7.1 Hz), 4.37 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 6.02 (s, 2H). LCMS m/z [M+H] + 253.1.
【０２４２】
(b)エチル２−ブロモ−５−（４−メトキシベンズアミド）チアゾール−４−カルボキシレート
【０２４３】
【化３７】
【０２４４】
ｐ−アニソイルクロリド(1.87 g, 11 mmol)のピリジン溶液(30 mL)にエチル５−アミノ−２−ブロモチアゾール−４−カルボキシレート(1.5 g, 5.5 mmol)のピリジン溶液(52 mL)を0 ℃で１０分間かけて滴下し、その後混合物を室温で７２時間撹拌した。反応混合物を１M塩酸で希釈し、酢酸エチルで抽出した(4 x 200 mL)。得られた有機層を合わせ、飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、１０％酢酸エチル−ヘキサン溶液で溶出して1.35gの標記化合物を得た(収率58%)。
【０２４５】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 1.45 (t, 3H, J = 7.1 Hz), 3.89 (s, 3H), 4.48 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 7.02 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.96 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 11.72 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 385.2.
【０２４６】
(c)エチル５−（４−メトキシベンズアミド）−２−（ピリジン−４−イルアミノ）チアゾール−４−カルボキシレート
【０２４７】
【化３８】
【０２４８】
エチル２−ブロモ−５−（４−メトキシベンズアミド）チアゾール−４−カルボキシレート(0.2 g, 0.519 mmol)の１，４−ジオキサン溶液(18 mL)にアルゴン気流下、Xantphos (0.060 g, 0.1 mmol)およびPd2 (dba)3 (0.047g, 0.05 mmol)を加えた。さらに炭酸セシウム(0.337g, 1.03 mmol)および４−アミノピリジン(0.048 g, 0.519 mmol)を加え、混合物を５時間還流した。反応混合物をセライト濾過し、そのセライトを酢酸エチルで洗浄した(3 x 5 mL)。濾液を濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、４０％酢酸エチル−ヘキサン溶液で溶出して54 mgの標記化合物を得た(収率26%)。
【０２４９】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 1.38 (t, 3H, J = 7.2 Hz), 3.87 (s, 3H), 4.42 (q, 2H, J = 7.0 Hz), 7.17 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 7.58 (d, 2H, J = 5.6 Hz), 7.92 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 8.39 (d, 2H, J = 5.2 Hz), 10.60 (s, 1H), 11.39 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 399.1.
【０２５０】
(d)５−（４−メトキシベンズアミド）−２−（ピリジン−４−イルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０２５１】
【化３９】
【０２５２】
エチル５−（４−メトキシベンズアミド）−２−（ピリジン−４−イルアミノ）チアゾール−４−カルボキシレート(0.05 g, 0.12 mmol)のTHF溶液(3 mL)に7Mアンモニア−メタノール溶液(7mL)を加え、封管中80 ℃で５時間加熱した。溶媒を留去して得られた固体を集め、エーテルで洗浄後、乾燥して、21 mgの標記化合物を得た(収率45%)。
【０２５３】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.86 (s, 3H), 7.16 (d, 2H, J = 8.3 Hz), 7.6-7.8 (m, 2H), 7.8-8.0 (m, 4H), 8.3-8.4 (m, 2H), 10.50 (s, 1H), 12.58 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 370.4.
【０２５４】
実施例５０、５１、５７
表１１に示す各化合物は、適当な出発物質を用いて実施例４７の方法に従い合成した。
【０２５５】
【表１１】
【０２５６】
実施例４８
２−（４−メトキシフェニルアミノ）−５−｛４−［N−（メチルスルホニル）メチルスルホンアミド］ベンズアミド｝チアゾール−４−カルボキサミド
【０２５７】
【化４０】
【０２５８】
５−（４−アミノベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド(0.150 g, 0.3916 mmol)とトリエチルアミン(0.2 mL, 1.56 mmol)のTHF溶液(10 mL)に塩化メタンスルホニル(0.09 mL, 1.174 mmol)を0℃で滴下し、その後混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物を濃縮した。水を油状残渣に加えて析出した固体を濾取して、100 mgの標記化合物を得た(収率47%)。
【０２５９】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.59 (s, 6H), 3.72 (s, 3H), 6.88 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.6-7.7 (m, 3H), 7.78 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.86 (br, 1H), 7.97 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 9.91 (s, 1H), 12.63 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 540.4.
【０２６０】
実施例５３
２−（４−メトキシフェニルアミノ）−５−［４−（メチルスルホンアミド）ベンズアミド］チアゾール−４−カルボキサミド
【０２６１】
【化４１】
【０２６２】
５−（４−アミノベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド(0.06 g, 0.156 mmol)のTHF溶液(10 mL)に新たに蒸留した塩化メタンスルホニル(0.02 mL, 0.313 mmol)を0℃で滴下し、続いてトリエチルアミン(0.06 mL, 0.468 mmol)を0℃で加えた。混合物を室温で１２時間撹拌した。反応を完結させるため、さらに０．５モル当量の塩化メタンスルホニルおよび１当量のトリエチルアミンを混合物に加え、一晩撹拌した。反応混合物を濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、５０％酢酸エチル−ヘキサン溶液で溶出して11.5 mgの標記化合物を得た(収率15%)。
【０２６３】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 33.12 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 6.87 (d, 2H, J = 8.9 Hz), 7.36 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.64 (br, 2H), 7.65 (d, 4H, J = 9.0 Hz), 7.82 (br, 1H), 7.85 (t, 2H, J = 8.6 Hz), 9.88 (s, 1H), 12.50 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 462.2.
【０２６４】
実施例６４
５−（３−アミノ−４−メチルベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０２６５】
【化４２】
【０２６６】
２−（４−メトキシフェニルアミノ）−５−（４−メチル−３−ニトロベンズアミド）チアゾール−４−カルボキサミド(0.2 g, 0.47 mmol)のTHF-MeOH溶液（1:1, 100 mL）に10％パラジウム／炭素（0.02 g）を室温で加え、その混合物を水素ガス雰囲気化で１２時間撹拌した。反応混合物をセライトで濾過した。濾液を濃縮し、0.165 g (収率89%)の標記化合物を得た。
【０２６７】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 2.12 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 5.25 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.88 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.95 (d, 1H, J = 7.5 Hz), 7.12 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.17 (s, 1H), 7.58 (s, 1H), 7.65 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.75 (s, 1H), 9.83 (s, 1H), 12.34 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 398.2.
【０２６８】
実施例８５、９０、９３、１０８
下記表１２に示す化合物は、適当な出発物質を用いて上記実施例６４の方法に従い合成した。
【０２６９】
【表１２】
【０２７０】
実施例６７
５−（４−メトキシベンズアミド）−２−［４−（２−メトキシエトキシ）フェニルアミノ］チアゾール−４−カルボキサミド
【０２７１】
【化４３】
【０２７２】
（a）１−（２−メトキシエトキシ）−４−ニトロベンゼン
【０２７３】
【化４４】
【０２７４】
１−フルオロ−４−ニトロベンゼン（2.00 g, 14.18 mmol）、２−メトキシエタノール（1.28 g, 16.84 mmol）および水酸化カリウム（1.37 g, 21.07 mmol）のDMSO溶液（30 mL）を６０℃で２０時間加熱した。反応混合物を水（50 mL）で希釈し、酢酸エチルで抽出した（３×１００ mL）。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、１０％酢酸エチル−ヘキサン溶液で溶出して、0.37 g（収率13%）の標記化合物を得た。
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.31 (s, 3H), 3.69 (t, 2H, J = 4.4 Hz), 4.25 (t, 2H, J = 4.1 Hz), 7.16 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 8.20 (d, 2H, J = 9.0 Hz). LCMS m/z [M+H] + 198.4.
【０２７５】
（ｂ）４−（２−メトキシエトキシ）ベンゼンアミン
【０２７６】
【化４５】
【０２７７】
１−（２−メトキシエトキシ）−４−ニトロベンゼン（0.37 g, 1.88 mmol）のTHF-MeOH溶液（1:1, 60 mL）に10％パラジウム／炭素（0.04 g）を室温で加え、その混合物を水素ガス雰囲気化で３時間撹拌した。反応混合物をセライトで濾過した。濾液を濃縮し、0.31 g (収率99%)の標記化合物を得た。
【０２７８】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.28 (s, 3H), 3.57 (t, 2H, J = 4.7 Hz), 3.91 (t, 2H, J = 4.1 Hz), 4.58 (s, 2H), 6.49 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 6.63 (d, 2H, J = 8.4 Hz). LCMS m/z [M+H] + 168.4.
【０２７９】
（ｃ）１−イソチオシアネート−４−（２−メトキシエトキシ）ベンゼン
【０２８０】
【化４６】
【０２８１】
４−（２−メトキシエトキシ）ベンゼンアミン（0.31 g, 1.85 mmol）のDCM溶液（40 mL）にチオカルボニルジイミダゾール（0.39 g, 2.2 mmol）を０℃で加え、２時間撹拌した。反応混合物を濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、１０％酢酸エチル−ヘキサン溶液で溶出して、0.37 g（収率96%）の標記化合物を得た。
【０２８２】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.29 (s, 3H), 3.64 (q, 2H, J = 3.0 Hz), 4.11 (q, 2H, J = 4.4 Hz), 6.99 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 7.38 (d, 2H, J = 9.0 Hz). LCMS m/z [M+H] + 210.4.
【０２８３】
(d)５−アミノ−２−［４−（２−メトキシエトキシ）フェニルアミノ］チアゾール−４−カルボキサミド
【０２８４】
【化４７】
【０２８５】
１−イソチオシアネート−４−（２−メトキシエトキシ）ベンゼン（0.37 g, 1.78 mmol）及び２−アミノ−２−シアノアセトアミド（0.18 g, 1.78 mmol）の酢酸エチル溶液（15 mL）を１時間還流した。反応混合物を濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、１０％MeOH−DCM溶液で溶出して、0.2 g（収率36%）の標記化合物を得た。
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.4 (s, 3H), 3.6-3.7 (m, 2H), 4.0-4.1 (m, 2H), 6.60 (br, 1H), 6.75-6.90 (m, 4H), 7.49 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 9.33 (s, 1H).
【０２８６】
(e)５−（４−メトキシベンズアミド）−２−［４−（２−メトキシエトキシ）フェニルアミノ］チアゾール−４−カルボキサミド
【０２８７】
【化４８】
【０２８８】
ｐ−メトキシベンゾイルクロリド（0.074 g, 0.44 mmol）のピリジン溶液（5 mL）に、５−アミノ−２−［４−（２−メトキシエトキシ）フェニルアミノ］チアゾール−４−カルボキサミド（0.15 g, 0.49 mmol）のピリジン溶液（3 mL）を０℃で加え、混合物を室温まで上昇させ、室温で１２時間撹拌した。反応混合物を濃縮して得られた残渣を酢酸エチルに溶解し、１M塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で順に洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮して、0.026 g（収率12%）の標記化合物を得た。
【０２８９】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.27 (s, 3H), 3.6-3.7 (m, 2H), 3.86 (s, 3H), 4.0-4.1 (m, 2H), 6.88 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.15 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.6-7.7 (m, 3H), 7.79 (s, 1H), 7.85 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 9.86 (s, 1H), 12.49 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 443.4.
【０２９０】
実施例７０
２−（６−アミノピリジン−３−イルアミノ)−５−（４−メトキシベンズアミド）チアゾール−４−カルボキサミド
【０２９１】
【化４９】
【０２９２】
(a) tert-ブチル ５−イソチオシアネートピリジン−２−イルカルバメート
【０２９３】
【化５０】
【０２９４】
撹拌しているtert-ブチル ５−アミノピリジン−２−イルカルバメート（0.35 g, 1.67 mmol）のTHF溶液（20 mL）に、０℃でトリエチルアミン（0.70 mL, 5.02 mmol）とチオホスゲン（0.13 mL, 1.67 mmol）をゆっくり加え、その混合物を室温で４０分間撹拌した。反応混合物に氷水を加えて反応を停止し、ジエチルエーテル（70 mL）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で濃縮した。残留固体を集め、ｎ−ヘキサンで洗浄して、261 mg（収率62%）の標記化合物を得た。
【０２９５】
1 H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 1.53 (s, 9H), 7.4-7.55 (m, 2H), 7.97 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 8.17 (d, 1H, J = 2.4 Hz).
【０２９６】
(b) tert-ブチル ５−（５−アミノ−４−カルバモイルチアゾール−２−イルアミノ）ピリジン−２−イルカルバメート
【０２９７】
【化５１】
【０２９８】
tert-ブチル ５−イソチオシアネートピリジン−２−イルカルバメート (261 mg, 1.04 mmol)および２−アミノ−２−シアノアセトアミド（103 mg, 1.04 mmol）の酢酸エチル溶液（14 mL）を４５分間還流した。反応混合物を室温まで冷却したのち、析出した沈殿をろ別し、濾液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、０％〜９％MeOH−CHCl3溶液で溶出して、219 mg（収率60%）の標記化合物を得た。
【０２９９】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 1.47 (s, 9H), 6.68 (s, 2H), 6.8-7.0 (m, 2H), 7.68 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 8.23 (dd, 1H, J = 8.8, 2.8 Hz), 8.28 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 9.44 (s, 1H), 9.62 (s, 1H).
【０３００】
(c) tert-ブチル ５−［５−（４−メトキシベンズアミド）−４−カルバモイルチアゾール−２−イルアミノ］ピリジン−２−イルカルバメート
【０３０１】
【化５２】
【０３０２】
tert-ブチル ５−（５−アミノ−４−カルバモイルチアゾール−２−イルアミノ）ピリジン−２−イルカルバメート（219 mg, 0.626 mmol）のピリジン溶液（3 mL）に、４−メトキシベンゾイルクロリド（0.089 mL, 0.657 mmol）を０℃で加えた。混合物を室温で１晩撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を留去して得られた固体を集め、酢酸エチル及びジエチルエーテルで洗浄して、219 mg（収率72%）の標記化合物を得た。
【０３０３】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 1.47 (s, 9H), 3.86 (s, 3H), 7.16 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.75-7.85 (m, 2H), 7.87 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 8.35-8.5 (m, 2H), 9.52 (s, 1H), 10.13 (s, 1H), 12.56 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 485.0.
【０３０４】
(d)２−（６−アミノピリジン−３−イルアミノ）−５−（４−メトキシベンズアミド）チアゾール−４−カルボキサミド
【０３０５】
【化５３】
【０３０６】
tert-ブチル ５−［５−（４−メトキシベンズアミド）−４−カルバモイルチアゾール−２−イルアミノ］ピリジン−２−イルカルバメート（100 mg, 0.206 mmol）の１，４−ジオキサン懸濁溶液（5 mL）に４M塩酸−ジオキサン（5 mL）を０℃で加えたのち、室温で１晩撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。油状残留物に酢酸エチルおよび飽和炭酸水素ナトリウムを加えて析出した固体をろ取した。得られた固体を酢酸エチル及び水で洗浄し、50 mg（収率63%）標記化合物を得た。
【０３０７】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.86 (s, 3H), 5.62 (s, 2H), 6.46 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.15 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.58 (br, 1H), 7.76 (br, 1H), 7.85 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.92 (dd, 1H, J = 8.8, 2.8 Hz), 8.10 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 9.59 (s, 1H), 12.48 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 385.4.
【０３０８】
実施例７９
表１３に示す実施例７９は、適当な出発物質を用いて上記実施例７０の方法に従い合成した。
【０３０９】
【表１３】
【０３１０】
実施例８０
５−（３−アミノ−４−メトキシベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０３１１】
【化５４】
【０３１２】
(a)５−（４−メトキシ−３−ニトロベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０３１３】
【化５５】
【０３１４】
４−メトキシ−３−ニトロ安息香酸（112 mg, 0.569 mmol）のDCM懸濁溶液（15 mL）にオキザリルクロリド（0.199 mL, 2.27 mmol）及び触媒量のDMFを０℃で加えた。混合物を室温で４時間撹拌した。溶媒を留去したのち、窒素気流下、残存する塩化オキザリルをトルエンとの共沸により取り除いた。得られた酸塩化物を５−アミノ−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド(100 mg, 0.378 mmol)のピリジン溶液(２ mL)に０℃で加え、混合物を室温で１晩撹拌した。反応混合物に氷水を加えて反応を停止させ、酢酸エチルで希釈した。析出した固体を濾取し、５０％酢酸エチル−ジエチルエーテル溶液で洗浄して、98 mg（収率58%）の標記化合物を得た。
【０３１５】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.73 (s, 3H), 4.04 (s, 3H), 6.88 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.61 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.66 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.68 (br, 1H), 7.86 (br, 1H), 8.13 (dd, 1H, J = 8.8, 2.4 Hz), 8.37 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 9.91 (s, 1H), 12.64 (s, 1H).
【０３１６】
(b) ５−（３−アミノ−４−メトキシベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０３１７】
【化５６】
【０３１８】
５−（４−メトキシ−３−ニトロベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド（50 mg, 0.113 mmol）のエーテル水溶液（12.5 mL, 4:1）にFe (63 mg, 1.13 mmol)およびNH4Cl (3.0 mg, 0.056 mmol)を加え、混合物を１時間還流した。室温まで冷却後、不溶物をセライト濾過し、エタノール及び酢酸エチルで洗浄した。濾液を減圧下で濃縮して得られた固体を酢酸エチルで洗浄して、25 mg（収率54%）の標記化合物を得た。
【０３１９】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.73 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 5.12 (s, 2H), 6.88 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 6.97 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.10 (dd, 1H, J = 8.4, 2.0 Hz), 7.21 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.57 (br, 1H), 7.65 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.74 (br, 1H), 9.83 (s, 1H), 12.31 (s, 1H). LCMS m/z [M+H]+ 414.0.
【０３２０】
実施例８３
５−（３−アミノ−４−フルオロベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０３２１】
【化５７】
【０３２２】
５−（４−フルオロ−３−ニトロベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド（50 mg, 0.116 mmol）のエタノール−水溶液（10：2.5 mL）にFe (65 mg, 1.16 mmol)およびNH4Cl (3.1 mg, 0.058 mmol)を加え、混合物を１時間還流した。室温まで冷却後、不溶物をセライト濾過し、エタノール及び酢酸エチルで洗浄した。濾液を減圧下で濃縮して得られた固体を回収し、酢酸エチルで洗浄して、10 mg（収率21%）の標記化合物を得た。
【０３２３】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ (ppm) 3.73 (s, 3H), 5.59 (s, 2H), 6.88 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.95-7.1 (m, 1H), 7.20 (dd, 1H, J = 10.8, 8.8 Hz), 7.34 (d, 1H, J = 6.4 Hz), 7.61 (br, 1H), 7.65 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.78 (br, 1H), 9.84 (s, 1H), 12.39 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 401.9.
【０３２４】
実施例１１４、１１６
下記表１４に示す化合物は、適当な出発物質を用いて上記実施例８３の方法に従い合成した。
【０３２５】
【表１４】
【０３２６】
実施例９１
表１５に示す実施例９１は、適当な出発物質を用いて下記実施例９４の方法に従い合成した。
【０３２７】
【表１５】
【０３２８】
実施例９４
５−（４−メトキシベンズアミド）−２−[４−（２−プロピニルオキシ）フェニルアミノ]チアゾール−４−カルボキサミド
【０３２９】
【化５８】
【０３３０】
（a）１−ニトロ−４−（２−プロピニルオキシ）ベンゼン
【０３３１】
【化５９】
【０３３２】
４−ニトロフェノール（2.00 g, 14.28 mmol）、プロパギルブロミド（1.33 mL, 15.10 mmol）、０．８M水酸化ナトリウム水溶液（18mL）及びｎ−テトラブチルアンモニウムブロミド（0.46 g, 1.44 mmol）のトルエン溶液（8 mL）を６０℃で２４時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、析出した固体をろ取した。固体をジオキサンに溶解した溶液に水を加えた。生じた固体をろ取し、水で洗浄して、1.75 g（収率68%）の標記化合物を得た。
【０３３３】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 2.58 (s, 1H), 4.79 (d, 2H, J = 1.4 Hz), 7.05 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 8.22 (d, 2H, J = 9.2 Hz).
【０３３４】
(b)４−（２−プロピニルオキシ）ベンゼンアミン
【０３３５】
【化６０】
【０３３６】
１−ニトロ−４−（２−プロピニルオキシ）ベンゼン（1.0 g, 5.6 mmol）のメタノール溶液（25 mL）に10％パラジウム／炭素（0.1 g）を室温で加え、混合物を水素ガス雰囲気化で１６時間撹拌した。反応混合物をセライトで濾過した。濾液を濃縮し、0.65 g (収率78%)の標記化合物を得た。
【０３３７】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 2.50 (s, 1H), 4.59 (s, 2H), 6.48 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 8.62 (d, 2H, J = 9.5 Hz).
【０３３８】
（ｃ）１−イソチアシアネート−４−（２−プロピニルオキシ）ベンゼン
【０３３９】
【化６１】
【０３４０】
４−（２−プロピニルオキシ）ベンゼンアミン（0.45 g, 3.06 mmol）及びトリエチルアミン（0.6 mL, 6.13 mmol）のDCM溶液（25 mL）にチオホスゲン(0.28 mL, 3.67 mmol)を０℃で滴下し、その後混合物を室温で９０分間撹拌した。反応混合物に水を加えて反応を停止し、DCMで抽出した(2 x 100 mL)。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮して0.51 gの標記化合物(収率88%)を得た。
【０３４１】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 2.52 (s, 1H), 4.68 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 6.92 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.17 (d, 2H, J = 8.6 Hz).
【０３４２】
（ｄ）５−アミノ−２−［４−（２−プロピニルオキシ）フェニルアミノ］チアゾール−４−カルボキサミド
【０３４３】
【化６２】
【０３４４】
１−イソチアシアネート−４−（２−プロピニルオキシ）ベンゼン（0.51 g, 2.73 mmol）および２−アミノ−２−シアノアセタミド（0.27 g, 2.73 mmol）の酢酸エチル溶液(15
mL)を３時間還流した。反応混合物を濃縮して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、５％メタノール−DCM溶液で溶出して0.2 g（収率36％）の標記化合物を得た。
【０３４５】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.53 (s, 1H), 3.6-3.7 (m, 2H), 4.0-4.1 (m, 2H), 6.60 (br, 1H), 6.75-6.90 (m, 4H), 7.49 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 9.33 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 289.0.
【０３４６】
（ｅ）５−（４−メトキシベンズアミド）−２−[４−（２−プロピニルオキシ）フェニルアミノ]チアゾール−４−カルボキサミド
【０３４７】
【化６３】
【０３４８】
ｐ−アニソイルクロライド（0.179 g, 1.05 mmol）のピリジン溶液（5 mL）に、０℃で５−アミノ−２−［４−（２−プロピニルオキシ）フェニルアミノ］チアゾール−４−カルボキサミド（0.2 g, 0.70 mmol）のピリジン溶液（5 mL）を加え、混合物を０℃で３時間撹拌した。反応混合物を濃縮して得られた残渣を１M塩酸（10 mL）に溶解し、析出した固体をろ取した。固体を酢酸エチル（10 mL）、メタノール（10 mL）で洗浄し、乾燥して、0.2 g（収率68%）の標記化合物を得た。
【０３４９】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.55 (s, 1H), 3.85 (s, 3H), 4.74 (s, 2H), 6.93 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 7.15 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.6-7.7 (m, 3H), 7.79 (s, 1H), 7.85 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 9.91 (s, 1H), 12.51 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 423.0.
【０３５０】
実施例１０３
５−（３，４−ジアミノベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０３５１】
【化６４】
【０３５２】
（ａ）５−（４−アミノ−３−ニトロベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０３５３】
【化６５】
【０３５４】
５−（４−フルオロ−３−ニトロベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド（35 mg, 0.081 mmol）及び28%アンモニア水（0.7 mL）のDMA溶液（0.3 mL）をマイクロウェーブ反応装置で３０分間処理した（Biotage社製、６０℃）。反応混合物を水で希釈して得られた固体を回収し、水で洗浄して、30 mg（収率86%）標記化合物を得た。
【０３５５】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.73 (s, 3H), 6.88 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.16 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 7.5-7.7 (m, 3H), 7.75-7.9 (m, 2H), 8.02 (br, 2H), 8.55 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 9.86 (s, 1H), 12.55 (s, 1H).
【０３５６】
（ｂ）５−（３，４−ジアミノベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０３５７】
【化６６】
【０３５８】
５−（４−アミノ−３−ニトロベンズアミド）−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド（30 mg, 0.070 mmol）のエタノール−水溶液（10-2.5 mL）にFe（39 mg, 0.70 mmol）およびNH4Cl（1.9 mg, 0.035 mmol）を加え、混合物を３時間還流した。室温まで冷却後、不溶物をセライト濾過し、エタノール及び酢酸エチルで洗浄した。濾液を減圧下で濃縮して得られた固体を回収し、酢酸エチル及び水で洗浄して、15 mg（収率52%）の標記化合物を得た。
【０３５９】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) δ 3.72 (s, 3H), 5.35 (br, 2H), 6.61 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 6.88 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.01 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.12 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.51 (br, 1H), 7.64 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.68 (br, 1H), 9.76 (s, 1H), 12.16 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 398.9.
【０３６０】
実施例１１７−１１９、１２３−１２６、１２９
下記表１６−１〜表１６−２に示す化合物は、適当な出発物質を用いて上記実施例１０３の方法に従い合成した。
【０３６１】
【表１６−１】
【０３６２】
【表１６−２】
【０３６３】
実施例１２０
５−［３−アミノ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）ベンズアミド］−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０３６４】
【化６７】
【０３６５】
（ａ）５−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）−３−ニトロベンズアミド］−２−［（４−メトキシフェニル）アミノ］チアゾール−４−カルボキサミド
【０３６６】
【化６８】
【０３６７】
５−（４−フルオロ−３−ニトロベンズアミド）−２−［（４−メトキシフェニル）アミノ］チアゾール−４−カルボキサミド（0.1 g, 0.23 mmol）、エチレングリコール（0.04 mL, 0.69 mmol）及び炭酸カリウム（0.32 g, 2.3 mmol）のNMP溶液（2 mL）をマイクロウェーブ反応装置で４５分間処理した（１２０℃）。反応混合物を水（5 mL）で希釈して得られた固体を回収し、エーテル（20 mL）及び酢酸エチル（20 mL）で順に洗浄して、0.038 g（収率35%）標記化合物を得た。
【０３６８】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.65-3.8 (m, 5H), 4.2-4.4 (m, 2H), 6.88 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.55-7.75 (m, 4H), 7.88 (br, 1H), 8.08 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 8.35 (s, 1H), 9.92 (s, 1H), 12.63 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 474.2.
【０３６９】
（ｂ）５−［３−アミノ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）ベンズアミド］−２−（４−メトキシフェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０３７０】
【化６９】
【０３７１】
５−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）−３−ニトロベンズアミド］−２−［（４−メトキシフェニル）アミノ］チアゾール−４−カルボキサミド（0.09 g, 0.19 mmol）のTHF-MeOH溶液（1:1, 30 mL）に10％パラジウム／炭素（0.01 g）を室温で加え、その混合物を水素ガス雰囲気化で１２時間撹拌した。反応混合物をセライトで濾過した。濾液を濃縮し、0.005 g (収率6%)の標記化合物を得た。
【０３７２】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.7-3.9 (m, 5H), 3.9-4.1 (m, 2H), 6.88 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 6.95 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.0-7.1 (m, 2H), 7.15 (s, 1H), 7.20 (s, 1H), 7.28 (br, 1H), 7.59 (br, 1H), 7.65 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.76 (br, 1H), 9.85 (s, 1H), 12.32 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 444.4.
【０３７３】
実施例１２８
表１７に示す実施例１２８は、適当な出発物質を用いて上記実施例１２０の方法に従い合成した。
【０３７４】
【表１７】
【０３７５】
実施例１２７
５−［３−アミノ−４−（２−メトキシエトキシ）ベンズアミド］−２−（２−フルオロピリジン−４−イルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０３７６】
【化７０】
【０３７７】
（ａ）４−（２−メトキシエトキシ）−３−ニトロ安息香酸
【０３７８】
【化７１】
【０３７９】
２−メトキシエタノール（0.95 g, 12.5 mmol）のDMF溶液（3 mL）を、NaH（0.64 g, 60%）のDMF懸濁液（3 mL）に０℃でゆっくり加え、混合物を室温で１時間撹拌した。その後、この混合物に４−フルオロ−３−ニトロ安息香酸（1 g, 5.4 mmol）のDMF溶液（4 mL）を０℃で滴下し、室温で１６時間撹拌した。反応混合物に冷１M塩酸を加えて反応を終了させ、酢酸エチル（3x100 mL）で抽出した。合わせた有機層を水、飽和食塩水で順に洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、３０％酢酸エチル−ヘキサン溶液で溶出して、1 g（収率76%）の標記化合物を得た。
【０３８０】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.31 (s, 3H), 3.65-3.75 (m, 2H), 4.3-4.45 (m, 2H), 7.48 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 8.15 (dd, 1H, J = 8.8, 1.8 Hz), 8.33 (d, 1H, J = 1.9 Hz), 13.26 (br, 1H). LCMS m/z [M+H] + 242.2.
【０３８１】
（ｂ）５−［４−（２−メトキシエトキシ）−３−ニトロベンズアミド］−２−（２−フルオロピリジン−４−イルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０３８２】
【化７２】
【０３８３】
４−（２−メトキシエトキシ）−３−ニトロ安息香酸（0.2 g, 0.82 mmol）及び触媒量のDMFの無水DCM溶液（15 mL）に塩化オキザリル(1 mL)を０℃で加え、混合溶液を室温で２時間撹拌した。溶媒を留去したのち、窒素気流下、残存する塩化オキザリルをトルエンとの共沸により取り除いた。得られた酸塩化物をピリジン(15 mL)に溶解し、0 ℃に冷却した。この溶液に５−アミノ−２−［（２−フルオロピリジン−４−イル）アミノ］チアゾール−４−カルボキサミド（0.17 g, 0.066 mmol）のピリジン溶液(10 mL)を０℃で加え、混合物を室温で12時間撹拌した。溶媒を留去後、氷水を残渣に加え、析出した固体を濾取した。固体をメタノールで洗浄して35 mg（収率9%）の標記化合物を得た。
【０３８４】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.2-3.4 (m, 3H), 3.65-3.8 (m, 2H), 4.35-4.5 (m, 2H), 7.44 (br, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.62 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.90 (br, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 8.06 (br, 1H), 8.11 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 8.37 (s, 1H), 10.84 (s, 1H), 12.76 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 477.0.
【０３８５】
（ｃ）５−［３−アミノ−４−（２−メトキシエトキシ）ベンズアミド］−２−（２−フルオロピリジン−４−イルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド
【０３８６】
【化７３】
【０３８７】
５−［４−（２−メトキシエトキシ）−３−ニトロベンズアミド］−２−（２−フルオロピリジン−４−イルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド（0.03 g, 0.063 mmol）のTHF-MeOH溶液（1:1, 40 mL）に10％パラジウム／炭素（0.01 g）を室温で加え、その混合物を水素ガス雰囲気化で１２時間撹拌した。反応混合物をセライトで濾過した。濾液を濃縮し、0.01 g (収率36%)の標記化合物を得た。
【０３８８】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.34 (s, 3H), 3.7-3.8 (m, 2H), 4.25-4.35 (m, 2H), 7.28 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 7.47 (d, 1H, J = 5.1 Hz), 7.5-7.6 (m, 2H), 7.66 (s, 1H), 7.85 (br, 1H), 7.99 (d, 1H, J = 5.7 Hz), 8.03 (br, 1H), 11.03 (s, 1H), 12.61 (s, 1H). LCMS m/z [M+H] + 447.5.
【０３８９】
実施例１３０
錠剤の調製：
各々１００ｍｇの５−（４−アセトアミドベンズアミド）−２−（フェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド（化合物１）を含む錠剤は、以下の手順によって得る。
【０３９０】
【表１８】
【０３９１】
手順：
化合物１、コーンスターチおよび微結晶性セルロースを混合し、混合物を、５０重量部の水中に溶解したヒドロキシプロピルセルロースに加え、続いて十分に混練する。混練した混合物は、粒状にするためにふるいにかけ、乾燥し、ステアリン酸マグネシウムと混合し、次に各々が２５０ｍｇの錠剤になるように圧縮する。
【０３９２】
実施例１３１
顆粒剤の調製：
５−（４−アセトアミドベンズアミド）−２−（フェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド（化合物１）を含む顆粒剤を、以下の手順によって得る。
【０３９３】
【表１９】
【０３９４】
手順：
化合物１、ラクトースおよびコーンスターチを混合し、混合物は、１２０重量部の水中に溶解したヒドロキシプロピルセルロースに加え、続いて十分に混練する。混練した混合物を粒状にするために２０メッシュのふるいにかけ、乾燥し、次に大きさを調整して５００ｍｇの顆粒あたり２００ｍｇの化合物１を含む顆粒剤を得た。
【０３９５】
実施例１３２
カプセル剤の調製：
各々が１００ｍｇの５−（４−アセトアミドベンズアミド）−２−（フェニルアミノ）チアゾール−４−カルボキサミド（化合物１）を含むカプセルを、以下の手順によって得る。
【０３９６】
【表２０】
【０３９７】
手順：
化合物１、ラクトース、コーンスターチおよびステアリン酸マグネシウムを十分に混合し、２００ｍｇの粉末混合物の各々をカプセル化してカプセル剤を得る。
【０３９８】
以下は、背景技術に記載された、本発明の有用性の評価方法についての参照記述の詳細である。
参照方法
方法の要約
免疫沈降、イムノブロット、免疫蛍光顕微鏡、免疫組織化学、質量分析、２−ハイブリッド分析、ルシフェラーゼレポーター分析、コロニー形成、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、体軸形成分析およびアニマルキャップ分析の方法論の詳細は、「詳細な方法」において記載されている。この研究で用いられる抗体は商業的に入手可能である。マウスおよびツメガエル属の実験は、国立がんセンター研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（東京、日本）の、日本の法律によって規定された倫理的要件をすべて満たすガイドラインに従って実行した。信頼できる結果を得るために必要な最少数のマウスを用い、安楽死させた。患者は、研究目的のための材料の収集および使用に権限を与える明文化されたインフォームドコンセントを受けた。実験的プロトコールは、施設内の倫理および組換え安全委員会によって検閲および承認された。
【０３９９】
詳細な方法
【０４００】
細胞株：
ヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３およびヒト大腸癌細胞株ＤＬＤ１は、ヒューマンサイエンス研究資源バンク（Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂａｎｋ）（大阪、日本）から得た。ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａは理研細胞バンク（Ｒｉｋｅｎ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）（筑波、日本）から得た。ヒト大腸癌細胞株のＨＣＴ−１１６およびＷｉＤｒは米国培養菌保存施設（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ロックヴィル、メリーランド）から購入した。
【０４０１】
免疫沈降：
以前に記述されたように、全細胞溶解物を調製した。溶解物を表示された抗体または関連の対照ＩｇＧと共に４℃で一晩インキュベートし、ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）プロテインＧ（ダイナル・バイオテク（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ）社、オスロ、ノルウェー）により沈殿させた。
【０４０２】
イムノブロット分析：
タンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、イモビロンＰメンブレン（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社、ビレリカ、マサチューセッツ）上にブロットした。一晩４℃での一次抗体を用いたインキュベーション後に、ブロットを、関連のホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧ抗体、およびＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社、ジャイルズ、イギリス）により、検出した。ブロットの強度は、ＬＡＳ−３０００スキャナーおよびサイエンス・ラボ（Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂ）２００３ソフトウェア（富士フィルム（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ）社、東京、日本）を用いて定量した。
【０４０３】
質量分析（ＭＳ）：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおけるタンパク質バンドをクマシーブルー染色によって可視化し、以前に記述されたように修飾トリプシン（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社）を用いて消化した。トリプシンペプチドを濃縮し、５００−μｍ ｉ．ｄ．×１ｍｍ ＨｉＱ ｓｉｌ Ｃ１８−３トラッピングカラム（ＫＹＡテクノロジーズ（ＫＹＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社、東京、日本）により脱塩した。次にペプチドを１５０−μｍ ｉ．ｄ．×５ｃｍ Ｃ１８Ｗ−３分離カラム（ＫＹＡ）を用いて、０〜８０％のアセトニトリル勾配（１時間、２００ｎＬ／分）により分画し、ナノスプレーイオン源（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社、フォスターシティー、カリフォルニア）を装備したＱ−スターパルサー−ｉ（Ｑ−Ｓｔａｒ Ｐｕｌｓａｒ−ｉ）質量分析計により分析した。タンパク同定の信頼性は、ＰｒｏＩＤソフトウェア（アプライド・バイオシステムズ社）を用いて、信頼値を計算することによって推定した。
【０４０４】
プラスミド：
ヒトＴＮＩＫ（Ｔｒａｆ２−およびＮｃｋ相互作用キナーゼ）発現コンストラクト［ｐＣＩｎｅｏＨＡ−ＴＮＩＫおよびその変異体（Ｋ５４Ｒ）］は、Ｍ．ウミカワ（Ｕｍｉｋａｗａ）博士およびＫ．カリヤ（Ｋａｒｉｙａ）博士（琉球大学、西原町、日本）によって快く提供された。ＴＮＩＫタンパク質の異なる部分をコードするｃＤＮＡ配列を、ｐＢｉｎｄ（プロメガ社、マディソン、ウイスコンシン）中へサブクローン化した。ヒトＴＣＦ４（Ｔ細胞因子−４）（スプライシング型Ｅ）およびＮＨ２末端の１３４のアミノ酸配列を欠くβ−カテニンｃＤＮＡを、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ４（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）社、セントルイス、ミズーリ）中へサブクローン化した。全長ヒトＴＣＦ４のｃＤＮＡおよびその短縮型をｐＡｃｔ（プロメガ）中へサブクローン化した。ＴＣＦ４Ｓ１５４Ａと称されたＴＣＦ４の変異型は、セリン（Ｓ）１５４残基をアラニン（Ａ）に変化させるために、オリゴＧＧＣＣＣＣＡＴＣＡＣＣＧＧＣＡＣＡＣＡＴＴＧＴＣＴＣＴＡ（［配列番号４］）およびＧＧＧＧＣＡＴＣＣＴＴＧＡＧＧＧＣＴＴＧＴＣＴＡＣＴＣＴＧ（［配列番号５］）により、クィックチェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）変異誘発キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社、ラ・ホーヤ、カリフォルニア）を用いて構築された。全長ヒトＴＣＦ４のｃＤＮＡおよびＴＣＦ４Ｓ１５４ＡのｃＤＮＡを、ｐＥＵ−Ｅ０１−ＭＣＳ（セルフリー・サイエンス（ＣｅｌｌＦｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）社、松山、日本）中へサブクローン化した。
【０４０５】
マンマリアン２−ハイブリッド分析：
ＴＮＩＫタンパク質とＴＣＦ４タンパク質との間の物理的相互作用は、チェックメイトマンマリアン２−ハイブリッドシステム（ＣｈｅｃｋＭａｔｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）（プロメガ社）を用いて、供給業者によって提供される指示に従って評価した。ＨＥＫ２９３細胞を、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００試薬（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社、カールスバード、カリフォルニア）を用いて、ｐＢｉｎｄ、ｐＡｃｔおよびｐＧ５ｌｕｃ（プロメガ社）プラスミドにより三回コトランスフェクションした。
【０４０６】
核タンパク質抽出：
核タンパク質は、ＮＥ−ＰＥＲ核および細胞質抽出試薬（Ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ）（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）社、ロックフォード、イリノイ）を用いて抽出した。
【０４０７】
組換えタンパク質産生：
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質は、ＥＮＤＥＸＴコムギ麦芽発現キット（ＥＮＤＥＸＴ Ｗｈｅａｔ Ｇｅｒｍ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ）（セルフリー・サイエンス社、松山、日本）を用いて合成した。ＨＡ（血球凝集素）標識化組換えＴＮＩＫタンパク質は、ウサギ網状赤血球溶解物（ＴｎＴ Ｔ７クイックカップル転写／翻訳システム（Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ））（プロメガ社、マディソン、ウイスコンシン）を用いて合成した。
【０４０８】
免疫蛍光細胞化学：
カバーグラス（旭テクノグラス（Ａｓａｈｉ Ｔｅｃｈｎｏｇｌａｓｓ）社、東京、日本）上に培養した細胞を、室温で１０分間４％パラホルムアルデヒドにより固定し、０．２％トリトンＸ−１００により透過性にした。１０％正常ブタ血清（ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社、バーリンゲーム、カリフォルニア）によるブロッキング後に、細胞を一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、続いてアレクサフルオル（Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ）−５９４抗マウス抗体およびアレクサフルオル−４８８抗ウサギ抗体（インビトロジェン社）と共にインキュベートした。標本は、レーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ５ ＰＡＳＣＡＬ；カール・ツァイス（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）社、イェーナ、ドイツ）により検査した。
【０４０９】
ＲＮＡ干渉：
２本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｓ）、ＴＮＩＫ−Ｊ−００４５４２−１２（センス：［配列番号６］５’−ＣＧＡＣＡＵＡＣＣＣＡＧＡＣＵＧＡＵＡＵＵ−３’；アンチセンス：［配列番号７］５’−ＰＵＡＵＣＡＧＵＣＵＧＧＧＵＡＵＧＵＣＧＵＵ−３’）およびＴＮＩＫ−Ｊ−００４５４２−１３（センス：［配列番号８］５’−ＧＡＣＣＧＡＡＧＣＵＣＵＵＧＧＵＵＡＣＵＵ−３’；アンチセンス：［配列番号９］５’−ＰＧＵＡＡＣＣＡＡＧＡＧＣＵＵＣＧＧＵＣＵＵ−３’）は、ダーマコン（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）社（シカゴ、イリノイ）によって合成およびアニールされた。２つの対照ＲＮＡ（ＸおよびＩＸ）をダーマコン社から購入した。
次の段落で示される「Ｔ」の文字は、「Ｕ」を意味する。便宜上、ＲＮＡ配列中の「Ｕ」の変わりに、「Ｔ」が用いられることがある。
ヒトＴＮＩＫ（Ｔ１、［配列番号１０］ＡＣＡＣＡＣＴＧＧＴＴＴＣＣＡＴＧＴＡＡＴ；Ｔ２、［配列番号１１］ＡＧＡＧＡＡＧＧＡＡＣＣＴＴＧＡＴＧＡＴＴ；Ｔ３、［配列番号１２］ＡＧＡＡＡＧＡＴＴＴＣＧＧＴＧＧＴＡＡＡＴ）および陰性対照（Ｃ、［配列番号１３］ＧＧＡＡＴＣＴＣＡＴＴＣＧＡＴＧＣＡＴＡＣ）のための、ショアサイレンシング（ＳｕｒｅＳｉｌｅｎｃｉｎｇ）短鎖ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡプラスミドを、スーパー・アレイ・バイオサイエンス（ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社（フレデリック、メリーランド）から購入した。
【０４１０】
ルシフェラーゼレポーター分析：
１対のルシフェラーゼレポーターコンストラクト（ＴＯＰ−ＦＬＡＳＨおよびＦＯＰ−ＦＬＡＳＨ（アップステート（Ｕｐｓｔａｔｅ）社、シャーロッツヴィル、バージニア））を、ＴＣＦ／ＬＥＦ（リンパ球エンハンサー因子）の転写活性の評価のために用いた。細胞を、ルシフェラーゼレポーターのうちの１つおよびｐｈＲＬ−ＴＫ（プロメガ社）により三回一過性トランスフェクションを行なった。ルシフェラーゼ活性を、内部対照としてウミシイタケルシフェラーゼ活性を用いて、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ）（プロメガ社）により測定した。
【０４１１】
コロニー形成分析：
トランスフェクションの２４時間後に、７５０、４００、３００および１０００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ジェネティシン、インビトロジェン社）を、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＤＬＤ１細胞およびＨＣＴ−１１６細胞の培養培地にそれぞれ加えた。細胞は８日間の選択後にギムザ液（和光純薬社（Ｗａｋｏ）、大阪、日本）により染色した。
【０４１２】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ：
全ＲＮＡをＲＮイージーミニキット（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社、バレンシア、カリフォルニア）により調製した。ＤＮａｓｅ Ｉ処理したＲＮＡはランダムプライミングし、スーパースクリプトＩＩ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ）逆転写酵素（インビトロジェン社）を用いて逆転写した。タックマン（ＴａｑＭａｎ）ユニバーサルＰＣＲマスターミックス、ならびにあらかじめデザインしたタックマン遺伝子発現プローブおよびプライマーセットは、アプライド・バイオシステムズ社から購入した。レポーター蛍光の増加として測定された増幅データーは、プリズム（ＰＲＩＳＭ）７０００配列検出システム（アプライド・バイオシステムズ社）を用いて収集した。内部対照［ヒトについてはβ−アクチン（ＡＣＴＢ）またはツメガエル属についてはオルニチンデカルボキシラーゼ（ｏｄｃ）］と比較したｍＲＮＡ発現レベルを、比較閾値サイクル（ＣＴ）方法によって計算した。
【０４１３】
マウス実験：
０．１ｍｌのＰＢＳ中に懸濁した５×１０６のＨＣＴ１１６細胞、ＤＬＤ１細胞またはＷｉＤｒ細胞を、５週令メスＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕヌードマウス（ＳＬＣ社、東京、日本）の横腹へ皮下接種した。１週間後に、発達した腫瘍を、アテロコラーゲン（アテロジーン（ＡｔｅｌｏＧｅｎｅ）；高研（ＫＯＫＥＮ）社、東京、日本）と共にｓｉＲＮＡにより処理した(Takeshita, F. et al. Efficient delivery of small interfering RNA to bone-metastatic tumors by using atelocollagen in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 12177 (2005))。ｓｉＲＮＡの最終濃度は３０μＭであり、アテロコラーゲンの最終濃度は０．５％であった。０．２ｍｌの体積のｓｉＲＮＡ溶液を、各腫瘍へ直接注入した。腫瘍体積は、Ｖ＝Ａ×Ｂ２π／６（式中、ＡおよびＢは最大および最小の寸法を表わす）として決定されたBergers, G. et al. Effects of angiogenesis inhibitors on multistage carcinogenesis in mice. Science 284, 808 (1999)）。
【０４１４】
免疫組織化学：
５０症例の散発性結腸直腸癌を、国立がんセンター病院（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）（東京、日本）の病理アーカイブパネルから選択した。免疫ペルオキシダーゼ染色を、以前に記述されたようなアビジンビオチン複合体法を用いて実行した。
【０４１５】
ツメガエル属の実験：
アフリカツメガエル胚の調製ならびに顕微注入は以前に記述された。卵をインビトロで受精させ、１％チオグリコール酸ナトリウム溶液により脱ゼリーした。胚はニュークープ（Ｎｉｅｗｋｏｏｐ）およびファーバー（Ｆａｂｅｒ）に従ってステージングした。キャッピングしたｍＲＮＡは、インビトロの転写（ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥキット；アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社、オースティン、テキサス）によって合成した。５％フィコールを含むスタインバーグ氏液中で注入を実行した。
ｐＣＳ２−ＦＬＡＧ−ツメガエル属β−カテニン（Ｘβ−カテニン）はＳ．ソコール（Ｓｏｋｏｌ）博士（マウントサイナイ医科大学（Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、ニューヨーク、ニューヨーク州）によって快く提供され、ｐＣＳ２−ｎβ−ＧａｌはＤ．ターナー（Ｔｕｒｎｅｒ）博士、Ｒ．ルップ（Ｒｕｐｐ）博士およびＪ．リー（Ｌｅｅ）博士（フレッドハッチンソンガン研究センター（Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）、シアトル、ワシントン）によって快く提供された。ｐＣＳ２＋−ＭｙｃおよびｐＣＳ２＋−ＨＡは、Ｍ．タイラ（Ｔａｉｒａ）博士（東京大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｋｙｏ）、東京、日本）によって快く提供された。
ＬＯＣ４４３６３３（ＸＴＮＩＫ）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）（アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチド（ＭＯ）のＸＴＮＩＫ−ＭＯ１またはＸＴＮＩＫ−ＭＯ３によって認識される）を、アフリカツメガエルイメージ（ＩＭＡＧＥ）ｃＤＮＡクローンＭＸＬ１７３６−９８３５８４７７（オープン・バイオシステムズ（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社、ハンツヴィル、アラバマ）からＰＣＲ増幅し、ｐＣＳ２＋−Ｍｙｃの中へサブクローン化した（ｐＣＳ−ＸＴＮＩＫ−ＷＴ−Ｍｙｃ）。リジン（Ｋ）５４残基をアルギニン（Ｒ）へ変化させるために、ｐＣＳ−ＸＴＮＩＫ−ＷＴ−Ｍｙｃの変異型（ｐＣＳ−ＸＴＮＩＫ−Ｋ５４Ｒ−Ｍｙｃ）を、［配列番号１４］オリゴのＡＧＧＧＴＣＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＣＡＧＧＧＧＡＴＧおよび［配列番号１５］ＡＡＴＡＧＣＴＧＣＡＡＧＣＴＧＴＣＣＧＧＴＴＴＴＡＡＣによる変異誘発によって構築した。
ＸＴＮＩＫのＯＲＦ配列（ＸＴＮＩＫ−ＭＯ１またはＸＴＮＩＫ−ＭＯ３によって認識されない）を、オリゴの［配列番号１６］ＡＴＧＧＣｃＡＧｔＧＡｔＴＣｔＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＧＣＣＴＧＧＡＴＧＡ（小文字は修飾を示す）および［配列番号１７］ＡＴＣＧＡＴＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＡＡＡＡＧＡＡＣＡＡによる変異誘発によって構築した（ｐＣＳ２−ＸＴＮＩＫＯＲＦ−ＨＡ）。
【０４１６】
アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチド（ＭＯｓ）：
ツメガエル属ＴＮＩＫについてのアンチセンスＭＯ（ＸＴＮＩＫ−ＭＯ１およびＸＴＮＩＫ−ＭＯ３）、および対応する対照ＭＯ［ＸＴＮＩＫ−ＭＯ１およびＸＴＮＩＫ−ＭＯ３の配列内に５つのヌクレオチド置換を保有する（５ｍｉｓ−Ｃｏｎｔｒｏｌｓ−１および５ｍｉｓ−Ｃｏｎｔｒｏｌｓ−３）］は、ジーン・ツールズ（Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ）社（フィロマス、オレゴン）から得た。データベース検索により、アフリカツメガエルにおいて、ＸＴＮＩＫ−ＭＯ１およびＸＴＮＩＫ−ＭＯ３の相補物に対する有意な相同配列が存在しないことが確認された。この研究において用いられるＭＯの配列は、ＸＴＮＩＫ−ＭＯ１（［配列番号１８］;５’−ＧＧＧＡＧＴＣＧＣＴＣＧＣＣＡＴＧＴＴＴＣＣＴＴＴ−３’）、ＸＴＮＩＫ−ＭＯ３（［配列番号１９］;５’−ＣＣＣＣＧＴＴＣＴＴＴＣＣＡＣＣＴＴＧＣＧＧＣＴＧ−３’）および５ｍｉｓ−Ｃｏｎｔｒｏｌ−１（［配列番号２０］;５’−ＧＧＣＡＧＴＧＧＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＴＴＣＧＴＴＴ−３’）および５ｍｉｓ−Ｃｏｎｔｒｏｌ−３（［配列番号２１］;５’−ＣＣＧＣＧＴＴＧＴＴＴＣＧＡＣＣＴＴＣＣＧＣＣＴＧ−３’）であった。
【０４１７】
略語
５’ＵＴＲ、５’−非翻訳領域；ＡＣ、アニマルキャップ；ＡＰＣ、大腸腺腫様ポリポーシス；Ａｔｅｌｏ、アテロコラーゲン；β−Ｃａｔ、β−カテニン；ＣＭＬ、慢性骨髄性白血病；ＣＮＨ、シトロン相同性；Ｃｏｎｔ、対照；ＧＳＫ３β、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β；ＧＳＴ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ；ＨＡ、血球凝集素；ＩＰ、免疫沈降；ＬＥＦ、リンパ球エンハンサー因子；ＭＯ(s)、モルホリノオリゴヌクレオチド；Ｎ．Ｄ．、検出されない；ｎ−βｇａｌ、核のβ−ガラクトシダーゼ；ＮＬＳ、核移行シグナル；Ｎ．Ｓ．、有意でない；ＯＲＦ、オープンリーディングフレーム；ｐＳｅｒ、フォスフォセリン；ＲＴ、逆転写；ｓｈＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ；ＴＣＦ（４）、Ｔ細胞因子（−４）；ＴＮＩＫ、Ｔｒａｆ２−およびＮｃｋ相互作用キナーゼ；ＷＴ、野生型。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として下記一般式（Ｉ）
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、独立して水素原子または置換基を表わす）によって表わされる化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、ＴＮＩＫ阻害剤。
【請求項２】
有効成分として請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の有効量を含有する医薬組成物。
【請求項３】
前記治療目的が癌である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
有効成分として請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の有効量を投与することを含む、ＴＮＩＫ阻害剤による癌患者の治療のための方法。
【請求項５】
前記癌が固形癌である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記癌が大腸癌である、請求項４または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記癌が膵臓癌である、請求項４または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記癌が非小細胞肺癌である、請求項４または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記癌が前立腺癌である、請求項４または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記癌が乳癌である、請求項４または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＮＩＫ阻害剤が経口的に投与される、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＮＩＫ阻害剤が静脈内に投与される、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
下記一般式（Ｉ’）
【化２】
（式中、Ｒ１’、Ｒ２’は、夫々独立して水素原子、ハロゲン原子、水酸基、置換または非置換のアルキル基、Ｃ２−Ｃ４アルケニル基、Ｃ２−Ｃ４アルキニル基、置換または非置換のアルコキシ基、置換または非置換のアミノ基、アシルアミノ基、ニトロ基、置換または非置換のアルコキシカルボニルアミノ基を表わし、Ｒ３’、Ｒ４’は、夫々独立して水素原子、ハロゲン原子、水酸基、置換または非置換のアルキル基、置換または非置換のアルコキシ基、置換または非置換のアミノ基、置換または非置換のアシルアミノ基、置換または非置換のアルキルスルホンアミド基、ニトロ基を表わす。またＹ１、Ｙ２及びＹ３は、夫々独立して窒素原子または炭素原子を表わす。）によって表される化合物またはそれらの薬学的に許容される塩。
【請求項１４】
前記Ｒ１’、Ｒ２’は、夫々独立して水素原子、ハロゲン原子、水酸基、置換または非置換のアルキル基、置換または非置換のアルコキシ基、置換または非置換のアミノ基、アシルアミノ基、ニトロ基、置換または非置換のアルコキシカルボニルアミノ基を表わし、Ｒ３’、Ｒ４’は、夫々独立して水素原子、ハロゲン原子、水酸基、置換または非置換のアルキル基、置換または非置換のアルコキシ基、置換または非置換のアミノ基、置換または非置換のアシルアミノ基、置換または非置換のアルキルスルホンアミド基を表わし、またＹ１、Ｙ２及びＹ３は、夫々独立して窒素原子または炭素原子を表わす、請求項１３に記載の化合物またはそれらの薬学的に許容される塩。
【請求項１】
有効成分として下記一般式（Ｉ）
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、独立して水素原子または置換基を表わす）によって表わされる化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、ＴＮＩＫ阻害剤。
【請求項２】
有効成分として請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の有効量を含有する医薬組成物。
【請求項３】
前記治療目的が癌である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
有効成分として請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の有効量を投与することを含む、ＴＮＩＫ阻害剤による癌患者の治療のための方法。
【請求項５】
前記癌が固形癌である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記癌が大腸癌である、請求項４または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記癌が膵臓癌である、請求項４または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記癌が非小細胞肺癌である、請求項４または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記癌が前立腺癌である、請求項４または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記癌が乳癌である、請求項４または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＮＩＫ阻害剤が経口的に投与される、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＮＩＫ阻害剤が静脈内に投与される、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
下記一般式（Ｉ’）
【化２】
（式中、Ｒ１’、Ｒ２’は、夫々独立して水素原子、ハロゲン原子、水酸基、置換または非置換のアルキル基、Ｃ２−Ｃ４アルケニル基、Ｃ２−Ｃ４アルキニル基、置換または非置換のアルコキシ基、置換または非置換のアミノ基、アシルアミノ基、ニトロ基、置換または非置換のアルコキシカルボニルアミノ基を表わし、Ｒ３’、Ｒ４’は、夫々独立して水素原子、ハロゲン原子、水酸基、置換または非置換のアルキル基、置換または非置換のアルコキシ基、置換または非置換のアミノ基、置換または非置換のアシルアミノ基、置換または非置換のアルキルスルホンアミド基、ニトロ基を表わす。またＹ１、Ｙ２及びＹ３は、夫々独立して窒素原子または炭素原子を表わす。）によって表される化合物またはそれらの薬学的に許容される塩。
【請求項１４】
前記Ｒ１’、Ｒ２’は、夫々独立して水素原子、ハロゲン原子、水酸基、置換または非置換のアルキル基、置換または非置換のアルコキシ基、置換または非置換のアミノ基、アシルアミノ基、ニトロ基、置換または非置換のアルコキシカルボニルアミノ基を表わし、Ｒ３’、Ｒ４’は、夫々独立して水素原子、ハロゲン原子、水酸基、置換または非置換のアルキル基、置換または非置換のアルコキシ基、置換または非置換のアミノ基、置換または非置換のアシルアミノ基、置換または非置換のアルキルスルホンアミド基を表わし、またＹ１、Ｙ２及びＹ３は、夫々独立して窒素原子または炭素原子を表わす、請求項１３に記載の化合物またはそれらの薬学的に許容される塩。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１２−５１０４５９（Ｐ２０１２−５１０４５９Ａ）
【公表日】平成２４年５月１０日（２０１２．５．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３８０７１（Ｐ２０１１−５３８０７１）
【出願日】平成２１年１１月３０日（２００９．１１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／００７５９７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６４１１１
【国際公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【出願人】（５１００９７７４７）独立行政法人国立がん研究センター (35)
【出願人】（５０３２８６４２４）カルナバイオサイエンス株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年５月１０日（２０１２．５．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月３０日（２００９．１１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／００７５９７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６４１１１
【国際公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【出願人】（５１００９７７４７）独立行政法人国立がん研究センター (35)
【出願人】（５０３２８６４２４）カルナバイオサイエンス株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
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