Ｔｏｌｌ様受容体機能を調節するための化合物及び方法
【課題】ＴＬＲ４の機能を調節できる、また、特にエンドトキシン（例えばリポ多糖類（ＬＰＳ））に反応したＴＬＲ４活性化及びシグナル伝達を抑制する化合物及び薬剤を同定すること。
【解決手段】Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達の抑制方法。当該方法は、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質の発現又は生物学的機能を阻害する、治療上有効量の化合物を準備するステップと、かかる処置を必要とする被験者にそれを投与するステップとを有してなる。
【解決手段】Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達の抑制方法。当該方法は、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質の発現又は生物学的機能を阻害する、治療上有効量の化合物を準備するステップと、かかる処置を必要とする被験者にそれを投与するステップとを有してなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＴｏｌｌ様受容体４機能を調節する化合物に関する。本発明は更に、Ｔｏｌｌ様受容体機能を調節する化合物、特にＴｏｌｌ様受容体４とＴｏｌｌ様受容体１４とを含んでなる共受容体複合体により媒介されるシグナル伝達を調節する化合物を同定するのに有用なアッセイ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）スーパーファミリーは、侵入した病原体の認識及び免疫反応の開始において中心的な役割を果たす。各ＴＬＲは、異なる病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識し、シグナル伝達カスケードの活性化を生じさせ、次に、転写制御因子ＮＦ−ｋＢ、更には有糸分裂活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫｓ）、ｐ３８、ｃ−ｊｕｎ、Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）及びｐ４２／４４を活性化する。Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ−４、ＴＬＲ４）はまた、転写制御因子ＩＦＮで制御される因子−３（ＩＲＦ３）（インターフェロン感受性応答エレメント（ＩＳＲＥ）と結合し、インターフェロンβなどの遺伝子のサブセットを誘導する）の活性化を最終的に引き起こす、更なる経路を活性化する。ＴＬＲは、大きなスーパーファミリーのメンバーであり、インターロイキン１受容体（ＩＬ−１Ｒ）／ＴＬＲスーパーファミリーと呼ばれ、またＩＬ−１Ｒ１サブグループ及びＴＩＲドメイン含有アダプターサブグループも含まれる。全ての３つのサブグループは、細胞質のＴｏｌｌ／ＩＬ−１受容体（ＴＩＲ）領域を有し、それはシグナル伝達にとって必須である。ＴＬＲは細胞外のロイシンリッチリピートを有し、一方ＩＬ−１Ｒ１サブグループは細胞外免疫グロブリンドメインを有する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
発明者らは、驚くべきことに、上記のＴｏｌｌ様受容体１４（配列番号１のヒト型のアミノ酸配列、又は、配列番号３のマウス型のアミノ酸配列を含んでなることを特徴とするタンパク質）が、Ｔｏｌｌ様受容体であるＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）の共受容体として作用することを見出した。発明者らは、例えばｓｉＲＮＡにより媒介されるＴＬＲ１４ノックダウンの結果としてのＴＬＲ１４発現の阻害が行われる場合には、エンドトキシンによるＴＬＲ４の活性化に続く、ＴＬＲ４により媒介されるシグナル伝達（ＴＬＲ４の定義された病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ））が、細胞において抑制されることを明らかにしている。
【０００４】
ＴＬＲ４がエンドトキシンにより媒介されるシグナル伝達にとり重要であることは認知されている。エンドトキシンにより媒介される、ＴＬＲ４を介したシグナル伝達は、例えば敗血症（ｓｅｐｔｉｃａｍｉａ）及びセプシス（ｓｅｐｓｉｓ）などの症状を生じさせうる。したがって、ＴＬＲ４の機能を調節できる、また、特にエンドトキシン（例えばリポ多糖類（ＬＰＳ））に反応したＴＬＲ４活性化及びシグナル伝達を抑制する化合物及び薬剤を同定することは望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達の抑制方法の提供に関し、当該方法は、
−配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質の発現又は生物学的機能を阻害する、治療上有効量の化合物を準備するステップと、
−かかる処置を必要とする被験者にそれを投与するステップとを有してなる。
【０００６】
特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を含む上記タンパク質は、Ｔｏｌｌ様受容体１４である。
【０００７】
ヒト型のＴｏｌｌ様受容体１４のアミノ酸配列は過去に同定されている。これは、本願明細書において配列番号１として示される。
【０００８】
本願明細書において定義される「Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）の活性化」とは、ＴＬＲ４が、少なくとも１つの更なる分子と結合するか又は会合して、ＴＬＲ４のＴＩＲドメインにより媒介されるシグナル伝達が生じることを意味する。更に、本明細書で定義される用語「Ｔｏｌｌ様受容体４のシグナル伝達」とは、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化から生じた、少なくとも１つの下流側のシグナル伝達経路の活性化を意味する。典型的には、上記シグナル伝達は、ＴＬＲ４のＴＩＲドメインにより開始される細胞内シグナル伝達カスケードである。ＴＬＲ４により誘発されるシグナル伝達カスケードにより、ＮＦ−ｋＢ、又はインターフェロン調節因子３などの転写制御因子の活性化が生じうる。ＴＬＲ４により媒介されたシグナルは更に、分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫｓ）、ｐ３８、ｃ−ｊｕｎ、Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）及びｐ４２／４４を活性化しうる。
【０００９】
Ｔｏｌｌ様受容体４は、エンドトキシン（例えばグラム陰性細菌に由来するリポ多糖類（ＬＰＳ））に応答して活性化されることが公知である。しかしながら、Ｔｏｌｌ様受容体４はＬＰＳと直接会合しない。むしろＴＬＲ４は、アダプタ分子として分子ＭＤ−２を使用することにより、ＬＰＳの結合を促進する。発明者らは、Ｔｏｌｌ様受容体１４がＬＰＳと結合すると理論づけている。結合されたＬＰＳは次に、ＴＬＲ１４から、予め形成されたＴＬＲ４とＭＤ−２との複合体へ移される。この定義されたＴＬＲ１４の作用機構は、ＣＤ１４に起因するそれと類似している。
【００１０】
したがって、本発明の方法では、ＴＬＲ４により媒介されるシグナル伝達及び免疫系の活性化の抑制が、Ｔｏｌｌ様受容体４とＴｏｌｌ様受容体１４との会合を防止することにより媒介され、それにより、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達は、生じることができない。
【００１１】
特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質（Ｔｏｌｌ様受容体１４）の発現又は生物学的機能を阻害する化合物は、限定されないが、タンパク質、ペプチド、ペプチド擬態物、核酸、ポリヌクレオチド、多糖類、オリゴペプチド、炭水化物、脂質、小分子化合物及び天然の化合物からなる群から少なくとも１つ選択されるものである。
【００１２】
特定の実施形態では、Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する化合物は、抑制性（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）核酸である。かかる核酸は、Ｔｏｌｌ様受容体１４タンパク質の発現を防止する機能を発揮する。適切な抑制性核酸の例としては、限定されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡなどが挙げられる。
【００１３】
本願明細書に定義されるように、「生物学的機能の阻害」という用語は、ＴＬＲ４活性化及びシグナル伝達を生じさせる、少なくとも１つのＴＬＲ１４の活性（例えばＴＬＲ１４がＬＰＳと結合する能力、又はＴＬＲ１４が共受容体としてＴＬＲ４と共に複合体を形成する能力）を防止することを意味する。
【００１４】
特定の更なる実施形態では、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達は、共受容体としてのＴＬＲ１４の、ＴＬＲ４との複合体の形成を阻害し、それによりＴＬＲ４活性化を抑制する、抗体又は同様の結合化合物により阻害される。
【００１５】
特定の実施形態では、上記抗体はＴＬＲ１４、ＴＬＲ４、又はその両方に結合しうる。ＴＬＲ４及び／又はＴＬＲ１４に存在するエピトープに対する抗体の結合は、ＴＬＲ４の活性化及びシグナル伝達阻害を生じさせる。
【００１６】
特定の実施形態では、Ｔｏｌｌ様受容体１４の生物学的機能を阻害する化合物は、可溶化型のＴｏｌｌ様受容体１４である。前記可溶化型のＴｏｌｌ様受容体１４は膜結合型ではなく、また、例えば、配列番号１に記載のＴｏｌｌ様受容体１４タンパク質の細胞外領域を含んでなるアミノ酸残基の全部又は相当数を欠失していてもよい。
【００１７】
特定の実施形態では、この態様の本発明の方法は更に、ＣＤ１４の発現又は生物学的機能を阻害する、治療上有効量の組成物を、被験者に投与するステップを有してなる。
【００１８】
本発明の第２の態様は、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達を抑制するのに用いられる医薬組成物の提供に関し、上記医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容できる希釈剤、賦形剤又は担体と共に、Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する化合物を含んでなる。
【００１９】
特定の実施形態では、Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する上記化合物は、限定されないが、タンパク質、ペプチド、ペプチド擬態物、核酸、ポリヌクレオチド、多糖類、オリゴペプチド、炭水化物、脂質、小分子化合物及び天然の化合物からなる群から選択される少なくとも１つである。
【００２０】
特定の実施形態では、上記医薬組成物は複合薬剤を含んでなってもよく、その第１成分は、Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する化合物であり、前記複合薬剤は、第２成分として、ＣＤ１４の発現又は生物学的機能を阻害する化合物を含んでなる。かかる複合薬剤は、ＬＰＳにより媒介されるＴＬＲ４活性化の全体的な抑制をなしうる。
【００２１】
更なる本発明の態様は、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達により媒介される症状の治療用薬剤の調製への、Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する化合物の使用の提供に関する。
【００２２】
特定の実施形態では、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達により媒介される症状は、敗血症又は感染性ショックである。
【００２３】
本発明の更に他の態様では、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達によって生じる症状の治療用薬剤に用いられる、Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する化合物を含んでなる組成物の提供に関する。
【００２４】
特定の実施形態では、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達により媒介される症状は、敗血症又は感染性ショックである。
【００２５】
更なる様々な態様において、本発明には、ＴＬＲ１４の発現又は生物学的機能を阻害する化合物を同定するためのアッセイ方法も包含される。更に、本発明の更なる態様には、前記アッセイ方法により同定される化合物を含んでなる組成物も包含され、また、ＴＬＲ４活性化及びシグナル伝達の抑制における、前記化合物及び組成物の使用も包含される。
【００２６】
したがって、更に他の本発明の態様は、Ｔｏｌｌ様受容体４と、共受容体としてのＴｏｌｌ様受容体１４との会合を阻害する化合物を同定するためのアッセイ方法の提供に関し、当該方法は、
−Ｔｏｌｌ様受容体４とＴｏｌｌ様受容体１４とを含んでなる第１及び第２の細胞サンプルを準備するステップと、
−上記第１及び第２のサンプルと、上記Ｔｏｌｌ様受容体１４と結合するエンドトキシンとを、上記Ｔｏｌｌ様受容体１４が、エンドトキシンと結合するときにＴｏｌｌ様受容体４と会合できる条件下で、接触させるステップと、
−前記第１のサンプルと、候補調節化合物とを、前記化合物の結合が可能な条件下で接触させるステップと、
−Ｔｏｌｌ様受容体４受容体の複合体の活性化状態を、前記第１と第２のサンプル間での、下流の活性化レベルの比較によってモニタするステップを有してなり、
前記第１のサンプルと前記第２のサンプルとの間での、Ｔｏｌｌ様受容体４のシグナル伝達の減少により、Ｔｏｌｌ様受容体４とＴｏｌｌ様受容体１４との会合の阻害剤としての調節化合物が同定される。
【００２７】
特定の実施形態では、上記調節化合物は、限定されないが、タンパク質、ペプチド、ペプチド擬態物、核酸、ポリヌクレオチド、多糖類、オリゴペプチド、炭水化物、脂質、小分子化合物及び天然の化合物からなる群から選択される、少なくとも１つである。
【００２８】
特定の実施形態では、上記候補化合物は、ＴＬＲ１４受容体の、ＴＬＲ４との複合体結合（ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｉｎｄｉｎｇ）及び会合を抑制する。特定の実施形態では、上記調節化合物は、ＴＬＲ１４発現を抑制する。
【００２９】
特定の実施形態では、ＴＬＲ１４と結合し、ＴＬＲ４受容体を活性化する分子は、リポ多糖（ＬＰＳ）である。
【００３０】
一実施形態では、ＴＬＲ４受容体の下流の活性化は、Ｔｏｌｌ様受容体活性を表すモニタリング標識に基づいてモニタされる。かかる標識の例としては、ＮＦ−κＢの活性化及びＩＲＦ３タンパク質の活性化が挙げられる。
【００３１】
更なる様々な態様において、本発明には、上記の本発明の態様に係るアッセイ方法により同定される、ＴＬＲ１４を阻害する化合物を含んでなる組成物が包含される。
【００３２】
更なる様々な態様において、本発明には、ＴＬＲ４活性化及びシグナル伝達の抑制方法における、上記のアッセイ方法により同定される化合物の使用が包含される。
【００３３】
更なる様々な態様において、本発明には、ＴＬＲ４との共受容体として複合体を形成するＴＬＲ１４の能力を阻害する化合物を同定するための、アッセイ方法が包含される。
【００３４】
更なる態様において、本発明には、共受容体としてのＴｏｌｌ様受容体１４とＴｏｌｌ様受容体４との会合をモニタすることに基づく、ＴＬＲ４の調節化合物を同定するアッセイ方法が包含される。かかるアッセイは、例えばＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）に基づく。その方法は、タンパク質間相互作用における分子動態の定量化において用いられる。
【００３５】
２つの分子の間の会合及び複合体形成をモニタするため、当該分子のうちの１つをフルオロフォアドナー分子で標識し、一方、もう１つをフルオロフォアアクセプタ分子で標識する。２つの分子が相互作用するときに、ドナーの放出がアクセプタ分子へ転移する。これにより、アクセプタ分子から、モニタできる発光が生じる。上記ドナーとアクセプタが近接して存在する（例えば１〜１０ｎｍ）とき、２つの分子は相互作用して、それにより生じる発光がモニタされる。アクセプタ分子からの放出は、ドナーからアクセプタ分子への分子間蛍光共鳴エネルギー転移に起因する。かかるアッセイにおいて使用するフルオロフォア分子の例は、青色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）及び黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）である。
【００３６】
したがって、本発明の更なる態様は、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達の調節化合物として機能する化合物の同定方法の提供に関し、前記方法は、
−Ｔｏｌｌ様受容体４とＴｏｌｌ様受容体１４とを含んでなる第１及び第２の細胞サンプルを準備するステップと、
−第１のフルオロフォア分子でＴｏｌｌ様受容体４を標識し、第２のフルオロフォア分子でＴｏｌｌ様受容体１４を標識するステップと、
−前記第１のサンプルと、Ｔｏｌｌ様受容体４受容体の活性化を生じさせる分子とを接触させるステップと、
−Ｔｏｌｌ様受容体４及び／又はＴｏｌｌ様受容体１４の結合が可能な条件下で、前記第１及び第２のサンプルと候補調節化合物とを接触させるステップと、
−フルオロフォアの蛍光をモニタすることによって、Ｔｏｌｌ様受容体４受容体の結合状態及び／又は活性化をモニタするステップとを有してなり、蛍光の変化により、上記候補調節化合物が、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達の調節化合物として同定される。
【００３７】
特定の実施形態では、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化を生じさせる分子は、エンドトキシン（例えばＬＰＳ）であり、それはＴｏｌｌ様受容体１４と結合し、その結果、Ｔｏｌｌ様受容体１４が共受容体としてＴｏｌｌ様受容体４と複合体を形成して複合体が形成される。
【００３８】
特定の実施形態では、本発明のアッセイ方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイ方法である。
【００３９】
特定の実施形態では、本発明の本態様のアッセイ方法により同定される調節化合物は、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及び／又は下流シグナル伝達を抑制する化合物である。特定の実施形態では、本発明の本態様のアッセイ方法により同定される調節化合物は、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及び／又は下流シグナル伝達を増強する化合物である。
【００４０】
フルオロフォアからの光放出の減少は、ＴＬＲ４受容体活性を阻害又は抑制する候補調節化合物の存在を表す。
【００４１】
特定の実施形態では、上記調節化合物は、Ｔｏｌｌ様受容体１４又はＴｏｌｌ様受容体４のいずれかと結合する、抗体、ペプチド擬態物、ポリペプチド又は小分子であり、この結合により、ＴＬＲ４とＴＬＲ１４との間の複合体形成が防止される。
【００４２】
特定の実施形態では、上記アッセイは、Ｕｌｌｍａｎら、ＰＮＡＳ，ｖｏｌ９１，ｐｐ５４２６−５４３０，Ｊｕｎｅ１９９４にて説明したように、ビーズベースのＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮ技術（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を使用して実施できる。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイは、２つのビーズタイプ（ドナービーズ及びアクセプタビーズ）を含んでなる。ビーズは標的分子と共役でき、ビーズに捕捉された分子との間の相互作用により、１つのビーズから他のビーズへのエネルギー転移がなされ、それにより蛍光／発光シグナルが生じる。好適には、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイシステムによりハイスループットスクリーニングが可能となり、それにより、ＦＲＥＴを応用する本発明のアッセイ方法は、このフォーマットにおいて使用することが可能である。
【００４３】
好適には、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイシステムによりハイスループットスクリーニングが可能となり、それにより、ＦＲＥＴを応用する本発明のアッセイ方法を、ＨＴＳスクリーニング方法で用いることにより、調節化合物の同定を促進させることが可能となる。
【００４４】
ＦＲＥＴベースのアッセイの原理を、ＴＬＲ４とＴＬＲ１４との間で形成される共受容体複合体を崩壊させる候補調節化合物の同定にまで応用することが可能である。
【００４５】
更なる様々な態様において、本発明には、上記の本発明の態様に係るアッセイ方法を使用して同定される調節化合物を含んでなる組成物が包含される。本発明には更に、前記組成物及び前記調節化合物の、Ｔｏｌｌ様受容体４と、共受容体としてのＴｏｌｌ様受容体１４との会合を防止するための方法及び組成物への使用が包含される。
【００４６】
更なる特定の態様において、ＴＬＲ４活性化を測定し、及び／又は、ＴＬＲ４活性化の調節化合物を同定するための様々なアッセイが使用できる。例えば、ＴＬＲ４刺激に関するスクリーニングアッセイが報告されており、そこでは、培養細胞を、２つのプラスミド（１つは、ヒトＴＬＲ４の遺伝子を担持し、もう１つは、ルシフェラーゼ遺伝子の上流側にＮＦκＢと結合するプロモータを担持する検出用プラスミド）でトランスフェクションしている（Ｖｏｇｅｌ，Ｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３ ２７８：２２２５０６）。あるいは、酵母ツーハイブリッドシステムを用いて、ＴＬＲ４活性化をスクリーニングすることもできる。
【００４７】
したがって、本発明の更に別の態様は、Ｔｏｌｌ様受容体４とＴｏｌｌ様受容体１４との会合を崩壊させる調節化合物の同定方法の提供に関し、当該方法は、
−ＴＬＲ４及びＴＬＲ１４を含んでなる第１及び第２の細胞サンプルを準備するステップと、
−第１のフルオロフォア分子でＴＬＲ４を標識し、第２のフルオロフォア分子でＴＬＲ１４を標識するステップと、
−ＴＬＲ１４と結合してＴＬＲ４を活性化し、それによりＴＬＲ４とＴＬＲ１４との会合を生じさせる分子と、前記第１のサンプルと、を接触させるステップと、
−前記第１のサンプルと、候補調節化合物とを、ＴＬＲ１４及び／又はＴＬＲ４への当該調節化合物の結合を可能にする条件下で接触させるステップと、
−フルオロフォアの蛍光をモニタすることによって、ＴＬＲ４受容体の結合状態及び／又は活性化をモニタするステップとを含んでなり、
前記蛍光の変化により、上記候補調節化合物が、ＴＬＲ４とＴＬＲ１４との間に形成される共受容体複合体を崩壊させる機能を発揮するとして同定され、それによりＴＬＲ４受容体の調節化合物としての調節化合物が同定される。
【００４８】
特定の実施形態では、ＴＬＲ４の活性化を生じさせる分子は、エンドトキシン（例えばＬＰＳ）である。典型的には、前記エンドトキシンはＴＬＲ１４と結合し、それにより共受容体複合体としてＴＬＲ１４がＴＬＲ４と会合できる。
【００４９】
フルオロフォアからの光放出の減少は、ＴＬＲ４受容体活性を阻害するか又は抑制する候補調節化合物の存在を示す。
【００５０】
更なる様々な態様において、本発明には、上記の本発明の態様に係るアッセイ方法により同定される調節化合物を含んでなる組成物が包含される。本発明には更に、エンドトキシンにより媒介されるＴＬＲ４のシグナル伝達を防止するための方法への、前記組成物及び調節化合物の使用が包含される。
【００５１】
更なる態様において、本発明には、リポ多糖（ＬＰＳ、エンドトキシン）とＴＬＲ１４との間の結合が、ＦＲＥＴシステムを使用してモニタされる、アッセイ方法が包含される。ＬＰＳ及びＴＬＲ１４の各々は、それぞれ別々であるが相補的な、フルオロフォアのドナー又はアクセプタ分子で標識される。ＴＬＲ１４受容体とＬＰＳとの結合により、ドナーからアクセプタ分子への、分子間蛍光共鳴エネルギー転移に起因するアクセプタ分子からの光の放出がなされる。上記アッセイを用いることにより、ＦＲＥＴシグナル放出が変化するとき、ＬＰＳ／ＴＬＲ１４複合体を崩壊させる調節化合物を同定することができる。本発明の発明者は驚くべきことに、ＴＬＲ１４が機能的に遮断され、又はその発現が抑制されるときに、ＴＬＲ４受容体複合体からの下流シグナルが実質的に抑制されることを観察し、それはすなわち、調節化合物によるＴＬＲ１４発現又は機能の抑制は、リガンドによるＴＬＲ４への結合に続く下流シグナルの減少を生じさせることを示すものである。
【００５２】
更に、選択されたＬＰＳアンタゴニストを用いた第２のレポーター遺伝子アッセイを実施することにより、ＴＬＲ４へのＬＰＳの結合に続くシグナル伝達から生じるシグナルを観察することができる。
【００５３】
セプシス（ｓｅｐｓｉｓ）、感染性ショック及び敗血症（ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ）として公知の症状は、ＬＰＳにより誘発されたＴｏｌｌ様受容体４の活性化から生じる、潜在的に致死性の症状である。したがって発明者らは、例えばセプシス、感染性ショック及び敗血症症状などの治療及び予防のための化合物及び方法への、本発明の有用性を見出した。
【００５４】
したがって、本発明の更なる態様は、敗血症又は感染性ショックの治療及び／又は予防方法の提供に関し、当該方法は、
−Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する、治療上有効量の化合物を準備するステップと、
−かかる処置を必要とする被験者にそれを投与するステップを有してなる。
【００５５】
特定の実施形態では、上記方法は、ＣＤ１４の発現又は生物学的機能を阻害する、治療上有効量の組成物を被験者に投与する更なるステップを有してなる。
【００５６】
更なる本発明の態様は、敗血症又は感染性ショックの治療用薬剤の調製への、Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する化合物の使用の提供に関する。
【００５７】
本発明の更に他の態様は、敗血症又は感染性ショックの治療用薬剤に用いられる、Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する化合物を含んでなる組成物の提供に関する。
【００５８】
敗血症又は感染性ショックの症状は、グラム陰性細菌に由来するエンドトキシン（例えばＬＰＳ）によって生じる。特定の実施形態では、グラム陰性細菌は、限定されないが、ナイセリア メニンジチデス、エシェリチア コリ、シュードモナス アエルジノサ、ハエモフィラ インフルエンザエ、サルモネラ チフィムリウム及びフランシセラ ツラレンシスからなるリストから選択される。
【００５９】
特定の実施形態では、Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する化合物は、限定されないが、タンパク質、ペプチド、ペプチド擬態物、核酸、ポリヌクレオチド、多糖類、オリゴペプチド、炭水化物、脂質、小分子化合物及び天然の化合物からなる群から選択される、少なくとも１つである。
【００６０】
更なる様々な態様において、本発明には、ＴＬＲ１４の発現又は生物学的活性を阻害し、それにより、敗血症の治療及び／又は予防への有用性を有する、化合物を同定するためのアッセイ方法が包含される。
【００６１】
更なる特定の態様において、本発明には、敗血症及び感染性ショックの治療に用いられる、上記の本発明の態様に係るアッセイで同定される抑制性化合物を含んでなる組成物が包含される。
【００６２】
エンドトキシン関連の敗血症及び感染性ショックにおいて、活性化されたＴＬＲ４は重要な役割を果たしうることから、本発明の上記方法において、ＴＬＲ４活性化の阻害剤として同定された試験物質は、エンドトキシン関連の敗血症及び／又は感染性ショックを予防又は治療する際に有用であると考えられる。
【００６３】
すなわち、本発明はまた、本発明のアッセイ方法によって同定される、Ｔｏｌｌ様受容体４活性の活性化を阻害する物質を被験者に投与することによって、被験者の敗血症及び／又は感染性ショックを治療する用途に用いられる、組成物の提供に関する。かかる方法及び組成物を、敗血症及び／又は感染性ショックの徴候を示す被験者に用いてもよい。かかる組成物及び方法はまた、敗血症又は感染性ショックを発症する危険性が高い被験者に対して、予防的に用いることもでき、かかる被験者としては、限定されないが大手術（特に腸領域）を受けている患者、並びに外科的手技を受けている、免疫を抑制された患者が挙げられる。
【００６４】
本発明には更に、かかるアッセイにより同定される、敗血症の治療用化合物の使用が包含される。
【００６５】
エンドトキシンは、リピドＡと多糖類とを含むリポ多糖（ＬＰＳ）複合体を含んでなる。グラム陰性細菌のリポ多糖（エンドトキシン、ＬＰＳ）は、グラム陰性菌による敗血症の際に観察されるような、細胞内及び生理的反応を誘発する。免疫／炎症性系の細胞は、血漿及び膜タンパク質の両方が関与する経路によって、ＬＰＳに反応する。
【００６６】
したがって、ＴＬＲ４により媒介される免疫反応経路を下方制御又は阻害する方法は、ＬＰＳにより媒介される症状（例えば敗血症）の治療方法として、望ましい。本発明は、ＬＰＳにより媒介される症状の治療に用いることができる。
【００６７】
本発明のアッセイ及びそれにより同定される調節化合物は、多くの医療的症状、最も具体的にはエンドトキシン及びＬＰＳにより媒介される症状（例えば敗血症）の治療において、具体的な有用性を発揮する。
【００６８】
したがって、本発明の他の更なる態様は、エンドトキシンによる媒介される症状の治療への使用に適する化合物を同定するためのアッセイ方法の提供に関し、前記アッセイ方法は、−候補化合物を準備するステップと、−上記候補化合物をＴＬＲ４受容体複合体と接触させるステップであって、前記複合体がエンドトキシンと結合したＴＬＲ１４を含んでなるステップと、−受容体複合体のＴＬＲ４及びＴＬＲ１４構成要素と結合したフルオロフォア部分からの光放出をモニタするステップとを有してなり、フルオロフォアからの光放出レベルが調節されることにより、ＴＬＲ４受容体複合体を介したシグナル伝達を抑制する際の、当該化合物の有用性が示される。
【００６９】
一実施形態では、エンドトキシンにより媒介される症状は、敗血症又は感染性ショックである。
【００７０】
他の更なる本発明の態様として、本発明の上記のアッセイ方法によって同定されたＴＬＲ１４抑制性化合物を含んでなる、敗血症の治療又は予防用の組成物が包含される。
【００７１】
発明者らは更に、Ｔｏｌｌ様受容体１４が脳において発現することを観察している。実験用の自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルマウスの皮質及び海馬において、ＴＬＲ１４の発現が示されている。ＴＬＲ１４の発現は、同じモデルの小脳においても観察されている。本明細書で発明者により定義される、ＴＬＲ１４の作用のメカニズムを基礎として、発明者は更に、Ｔｏｌｌ様受容体１４は、脳におけるＴＬＲ４媒介性の炎症性シグナルにおいて、役割を果たすと予想している。したがってＴＬＲ１４は、脳において、エンドトキシン媒介されたＴｏｌｌ様受容体４のシグナル伝達との関係があると考えられる。したがって、更なる様々な態様において、本発明には、脳のＴＬＲ１４の発現又は生物学的機能活性を阻害することによって、かかるＴＬＲ４により媒介されるシグナル伝達を阻害する方法が包含される。したがって、本発明の更なる様々な態様において、エンドトキシンにより媒介される脳におけるＴＬＲ４による炎症性シグナル伝達を抑制するための化合物、組成物、更にはかかる方法における当該化合物及び組成物の使用が包含される。
【００７２】
本発明の他の更なる態様は、Ｔｏｌｌ様受容体４活性化及びシグナル伝達により媒介される、異常な免疫反応を治療する方法の提供に関し、当該方法は、−Ｔｏｌｌ様受容体４とＴｏｌｌ様受容体１４との会合を阻害する化合物を準備するステップと、−治療的有効量の当該化合物を、かかる治療を必要とする被験者に投与するステップとを有してなる。
【００７３】
上記異常な免疫反応とは、あらゆる、免疫により媒介される望ましくない反応であってもよい。特定の実施形態では、上記の異常な免疫反応は、例えば敗血症又は感染性ショックなどの症状を生じさせるものである。特定の実施形態では、上記敗血症は、Ｔｏｌｌ様受容体４への、エンドトキシン（例えばグラム陰性細菌に由来するリポ多糖）の結合に起因するグラム陰性敗血症である。
【００７４】
アッセイ：
本発明には、ＴＬＲ１４タンパク質を活性化する調節化合物を同定するためのアッセイシステム及びスクリーニング方法、更には、ＴＬＲ１４活性化をモニタする方法が包含される。本願明細書の「アッセイシステム」とは、１つ以上の特定の事象を検出及び／又は測定するアッセイを実施し、その結果を分析するために必要な全ての構成要素を含むシステムである。
【００７５】
必須ではないが好ましくは、本発明において使用するスクリーニングアッセイは、ハイスループット又はウルトラスループットのアッセイであって、それにより自動化された費用効果的なスクリーニング手段が提供される。
【００７６】
特に明記しない限り、本願明細書において用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本発明の技術分野の当業者に一般に理解されているとおりの意味で用いられる。
【００７７】
本願明細書全体にわたり、文脈により特定されない限り、用語「含んでなる」若しくは「含有する」、又はその活用形である「含んでなり」若しくは「含んでなること」、「含有し」若しくは「含有すること」などの用語は、記載された整数又は整数の群を包含することを意味し、他のいかなる整数又は整数の群をも除外するものではないものと理解すべきである。
【００７８】
以下の具体的実施形態更には図面を参照しながら本発明を記載するが、それらは説明のためにのみ提供されるものであり、本発明を限定するためのものとして解釈すべきでない。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】ＴＬＲ１４がＬＰＳシグナル伝達を増強することを示す。ヒト星状細胞腫細胞（Ｕ３７３）を、ＮＦ−ｋＢレポーター構築物と共に、５０ｎｇの空のコントロールベクター又はＴＬＲ１４発現プラスミドでトランスフェクションした。２４時間後、細胞を回収する前に、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）により６時間刺激し、レポーター遺伝子活性を分析した。Ｕ３７３を回収する前に、過度に発現したＴＬＲ１４の有無において、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）により刺激し、レポーター遺伝子活性を分析した。非形質導入細胞と比較した結果、ＴＬＲ１４は、ＬＰＳ誘導性のＮＦ−ｋＢレポーター遺伝子の発現を増強することが示された。
【図２】ＴＬＲ１４のノックダウンにより、Ｕ３７３星状細胞腫細胞におけるＬＰＳ誘導性のＩｋＢ分解が打ち消されることを示す。Ｕ３７３を、ＴＬＲ１４（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）に特異的なｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。４８時間後に、ＴＬＲ１４のノックダウンを、ウエスタンブロッティングにより確認した（図２Ａ）。非ターゲティングｓｉＲＮＡをネガティブコントロールとして用いて、ＴＬＲ１４に対するｓｉＲＮＡが特異的であることを確認した。示される時間にわたり、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で細胞を処理し、ＩｋＢ分解をウエスタンブロッティング（図２Ｂ）で測定した。ＴＬＲ１４のｓｉＲＮＡノックダウンにより、ＬＰＳ誘導性のＩｋＢ分解が顕著に減少した。図２（Ａ）及び２（Ｂ）は、２つの別々の実験を表す。
【図３】Ｕ３７３星状細胞腫細胞における、ＬＰＳ誘導性のｐ３８リン酸化に対する、ＴＬＲ１４のｓｉＲＮＡの効果を示す。ネガティブコントロールとして、ＴＬＲ１４（Ｑｉａｇｅｎ社）に特異的なｓｉＲＮＡ、又は非ターゲティングｓｉＲＮＡのいずれかで、Ｕ３７３をトランスフェクションし、ＴＬＲ１４に対するｓｉＲＮＡが特異的であることを確認した。示される時間にわたり、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で細胞を処理し、ｐ３８リン酸化をウエスタンブロッティングで測定した。ＴＬＲ１４のｓｉＲＮＡノックダウンにより、ｐ３８のリン酸化が減少した。
【図４】ＴＬＲ１４をトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞における、ＴＬＲ１４とＬＰＳとの結合を示す。ＨＥＫ２９３細胞を、ＴＬＲ１４によってトランスフェクションした。２４時間後に細胞を溶解させ、室温で１時間、ビオチン化ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）単独、又は非標識ＬＰＳとの組み合わせによりインキュベートした。溶解物を次に、洗浄前に更に１時間、ストレプトアビジンアガロースと共にインキュベートし、ウエスタンブロッティングにより分析した。図４（ａ）においては、５倍過剰の非標識のＬＰＳを含有させた。図４（ｂ）においては、２５倍及び５０倍過剰の非標識のＬＰＳを、コントロールサンプル中に含有させた。
【図５】ＴＬＲ１４のノックダウンにより、ＬＰＳに応答してわずかにＩｋＢ分解が阻害されることを示す。
【図６】ＴＬＲ１４のノックダウンにより、ＴＨＰ１細胞からのＩＬ−６産生及びＴＮＦ−αサイトカイン産生の減少が生じることを示す。
【図７】サイトゾル及び膜画分のウエスタンブロッティングを示す。Ｔはトランスフェクション細胞を示し、一方ＮＴは非トランスフェクション細胞を意味する。
【図８】マウスの脳におけるＴＬＲ１４発現を示すウエスタンブロット分析である。
【図９】ＴＨＰ１細胞における内因性ＴＬＲ１４の局在化を示す。膜、サイトゾル及び全細胞抽出物を、Ｄｏｕｎｃｅ型ホモジナイザーで破砕し、超遠心分離することにより調製した。サンプルを次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングを使用した、ＴＬＲ１４発現の解析に供した。
【図１０】配列番号１として定義されるヒトＴｏｌｌ様受容体１４のアミノ酸配列を示す。
【図１１】可溶化型のＴｏｌｌ様受容体１４の予測アミノ酸配列を示す（配列番号２として定義）。
【図１２】マウス型のＴｏｌｌ様受容体１４のアミノ酸配列を示す（配列番号３と定義）。
【図１３】ヒト型のＴｏｌｌ様受容体４のアミノ酸配列を示す（配列番号４として定義）。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
Ｔｏｌｌ様受容体１４（ＴＬＲ１４）は、ロイシンリッチリピートを含んでなるタンパク質であり、ヒト型の場合、以下に示すように配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【００８１】
【化１】
可溶化型のＴｏｌｌ様受容体１４の予測アミノ酸配列を、配列番号２として示す。
【００８２】
【化２】
マウス型のＴｏｌｌ様受容体１４のアミノ酸配列も定義されている。以下に配列番号３として示す。
【化３】
本発明の特定の実施形態では、配列番号１において定義されるヒト型のＴｏｌｌ様受容体１４を、配列番号３において定義されるマウス型のＴｏｌｌ様受容体１４で置換するのが適当であると考えられる。
【００８３】
ＴＬＲ１４は、配列番号１において定義するように、１２のロイシンリッチリピート、シグナル配列及び推定上の膜貫通領域を含む。ＴＬＲ１４の発現は、脳、肺及び卵巣において観察される。ＴＬＲ１４の発現は、微生物由来の生成物（例えばＬＰＳ）により増強される。
【００８４】
発明者らは、ＴＬＲ１４の過剰発現により、ＬＰＳ誘導性のシグナル伝達が増強され、それにより、転写制御因子ＮＦ−ｋＢの転写及びＩＦＮ制御因子−３（ＩＲＦ３）の活性化が上方制御されることを見出した。またＬＰＳシグナル伝達（ＴＬＲ４媒介）により、分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫｓ）、ｐ３８、ｃ−ｊｕｎ、Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）及びｐ４２／４４が活性化する。
【００８５】
驚くべきことに、発明者らは、Ｔｏｌｌ様受容体１４が、ＴＬＲ４との共受容体として機能することを見出した。理論に拘束されないが、発明者らは、この予想されたＴＬＲ１４の機能として、以下のとおりを考えている：
（ｉ）ＴＬＲ１４の一過性の発現により、ＬＰＳシグナル伝達が増強され、
（ｉｉ）ｓｉＲＮＡによるＴＬＲ１４のノックダウンにより、ＬＰＳシグナル伝達が阻害され、
（ｉｉｉ）ＬＰＳがＴＬＲ１４と結合し、
（ｉｖ）ＴＬＲ１４が膜画分、更には脳において発現し、ＥＡＥモデルマウスにおける炎症において、ＴＬＲ１４の発現レベルの強化が観察され、すなわちＴＬＲ１４が特定の疾患及び炎症症状において上方制御されうることを示唆する。
【００８６】
また、理論に拘束されないが、発明者らは、エンドトキシンにより媒介されるシグナル伝達におけるＴＬＲ１４の関与は、ＴＬＲ１４のエンドトキシン（例えばＬＰＳ）との複合体形成に起因すると予測する。ＴＬＲ１４は、共受容体としてＴＬＲ４と会合する。ＴＬＲ４は、エンドトキシンと直接結合しない。むしろ、ＭＤ−２がエンドトキシンと相互作用し、これがＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を形成し、それによりＴＬＲ４依存性の細胞刺激が生じる。この役割において、ＴＬＲ１４はＣＤ１４と同様の方法で機能し、またそれは膜結合型及び可溶化型として存在することも知られている。すなわち、ＴＬＲ１４から、ＴＬＲ４とＭＤ−２で予め形成された複合体へとＬＰＳが移される。ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対するＬＰＳの結合により、ＰＡＭＰ ＬＰＳによるＴＬＲ４の活性化、更にＴＬＲ４のＴＩＲドメインから生じる下流シグナル伝達を生じさせる。発明者らは、ＴＬＲ１４とＣＤ１４との配列相同性が極めて低いにもかかわらず、それらが構造的な相同性を示すことを見出している。例えば、ＣＤ１４は一連のロイシンリッチリピートを有し、またこの一連のロイシンリッチリピートはＴＬＲ１４の構造中に明らかに存在する。更に、ＣＤ１４は、Ｔｏｌｌ様受容体の外部領域に存在するのと同じソレノイド構造を有する。ＣＤ１４は、ＴＩＲシグナル伝達ドメインを有しないという点で、Ｔｏｌｌ様受容体とは異なる。
【００８７】
ヒトＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）タンパク質のアミノ配列は過去に同定されており、配列番号４として以下に示す。
【００８８】
【化４】
ＴＬＲ４と、共受容体としてのＴＬＲ１４の会合を阻害する調節化合物の同定を可能にする、様々なアッセイ方法を提供するにあたり、本発明では、異常な免疫反応において生じうる、ＴＬＲ４により媒介されるシグナル伝達を阻害、抑制又は下方制御する手段を提供する。かかるＴＬＲ４により媒介されるシグナル伝達は、ＬＰＳのＴＬＲ４への結合に続く敗血症の原因となる。
【００８９】
本発明は更に、ＴＬＲ４により媒介される、及び特にＬＰＳ応答により媒介される、免疫反応を抑制する際に有用性を有する調節化合物の提供に関する。
【００９０】
抗体及び関連する結合化合物：
特定の実施形態では、本発明は、例えばＴＬＲ１４に対するエンドトキシン（例えばＬＰＳ）の結合を防止することによるか、又は、ＴＬＲ１４とＴＬＲ４とが複合体を形成して共受容体複合体を形成することを抗体により防止することによる、ＴＬＲ１４の生物学的機能的な活性の阻害への、抗体及び関連する結合化合物の使用に関する。
【００９１】
特定の実施形態では、ＴＬＲ１４の生物学的機能を阻害する化合物は、抗体、又は抗体に由来する結合化合物である。
【００９２】
「抗体」とは免疫グロブリンであり、天然由来であるか、又は部分的若しくは全部が合成されたものであってもよい。上記の用語はまた、抗体の結合ドメイン、又は抗体の結合ドメインと機能的に相同性を有するいかなるポリペプチド、タンパク質又はペプチドをも包含する。前記ポリペプチド又はタンパク質は天然の給源に由来してもよく、又はそれらは部分的若しくは全体的に合成されたものであってもよい。抗体の例としては、免疫グロブリンアイソタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥなど）、並びにそれらのアイソタイプサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３）が挙げられる。上記の用語は更に、抗原結合ドメインを含んでなる抗体断片も包含し、ゆえに、結合特性を示す（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、断片及び二重特異性抗体。
【００９３】
様々な実施形態では、本発明に使用する抗体はポリクローナル抗体、キメラ抗体又は合成された若しくは合成的な抗体であってもよい。特定の実施形態では、上記抗体はラクダ抗体（特にラクダ重鎖抗体）であってもよい。更に、上記抗体断片は、ラクダ重鎖抗体に由来するドメイン抗体又はナノボディでもよい。特定の実施形態では、上記抗体はサメ抗体又はサメ由来の抗体であってもよい。
【００９４】
特定の実施形態では、上記抗体は「単離された抗体」であり、その意味は、上記抗体が、
（１）通常それとともに存在する少なくとも幾つかのタンパク質を含まず、
（２）同じ給源（例えば同じ種）からの他のタンパク質を実質的に含まず、
（３）異なる種に由来する細胞により発現され、又は、
（４）天然には生じない、ということである。
【００９５】
抗体は多くの方法で修飾できるため、用語「抗体」とは、必要な特異性を有する結合ドメインを有する、あらゆる結合メンバー又は物質を包含するものとして解釈すべきである。本発明の抗体は、モノクローナル抗体、又はその断片、派生物、機能等価物又は相同物であってもよい。上記の用語には、免疫グロブリン結合ドメインを含んでなるあらゆるポリペプチドも包含され、天然由来、又は完全若しくは部分的合成由来であってもよい。したがって、もう１つのポリペプチドと融合した免疫グロブリン結合ドメイン（又は等価物）を含んでなるキメラ分子も包含される。キメラ抗体のクローニング及び発現は、欧州特許出願公開第０１２０６９４号及び欧州特許出願公開第０１２５０２３号の明細書に記載されている。
【００９６】
抗体の定常領域は、いかなる適切な免疫グロブリンサブタイプでもよいが、抗体サブタイプがＩｇＧ１であることが好ましい。しかしながら、別の実施形態では、ヒト免疫グロブリン分子を用いる場合、抗体のサブタイプはクラスＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥであってもよい。かかる抗体は更に、いかなるサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）に属するものであってもよい。
【００９７】
全長抗体の断片は、抗原と結合する機能を発揮できる。かかる結合断片の例としては、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１抗体ドメインを含むＦａｂ断片、単一の抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片（２つのＦａｂ断片の結合を含んでなる二価断片）、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（ＶＨ領域とＶＬ領域がペプチドリンカーにより連結され、それにより２つのドメインが会合し、抗原結合部位を形成する）、又は二重特異的抗体（遺伝子融合によって構築された、多価若しくは多重特異的断片でもよい）が挙げられる。
【００９８】
本発明に用いられる抗体断片又はポリペプチド（例えばＴＬＲ１４又はＴＬＲ４特異的な抗体断片）（後者は、エピトープの位置でＴＬＲ４と結合して、共受容体としてのＴＬＲ１４とＴＬＲ４との複合体の形成を防止する、ＴＬＲ１４の生物学的機能を阻害する抗体の場合である）は全体的には、連続するアミノ酸残基であって、少なくとも５〜７の連続するアミノ酸、通常少なくとも約７〜９の連続するアミノ酸、典型的に少なくとも約９〜１３の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも約２０〜３０若しくはそれ以上の連続するアミノ酸、最も好ましくは少なくとも３０〜４０若しくはそれ以上の連続するアミノ酸である。
【００９９】
かかる抗体若しくはポリペプチドの、又はＴＬＲ１４若しくはＴＬＲ４特異的な抗体断片の「誘導体」とは、タンパク質のアミノ酸配列を変化させることにより修飾される抗体又はポリペプチドを意味し、それらは例えば、タンパク質をコードする核酸の操作、又はタンパク質自体を変化させることによって得られる。天然のアミノ酸配列のかかる派生物は、１つ以上のアミノ酸の挿入、付加、欠失及び／又は置換を含んでもよく、好ましくは、ＴＬＲ１４及び／又はＴＬＲ４の結合活性を有するペプチドが提供される態様である。好ましくは、かかる誘導体は２５個以下、より好ましくは１５個以下、より更に好ましくは１０個以下、より更に好ましくは４個以下、最も好ましくは１又は２個のアミノ酸のみのアミノ酸の挿入、付加、欠失及び／又は置換を含む。
【０１００】
本発明の結合アッセイに用いられる抗体は、多くの技術により調製できる。例えば、ファージディスプレイベースのバイオパニングアッセイなどのコンビナトリアルスクリーニング技術を用いて、ＴＬＲ１４又はＴＬＲ４に存在する結合エピトープに対する結合特性を有するアミノ酸配列を同定できる。かかるファージディスプレイのバイオパニング技術は、ファージディスプレイライブラリを応用するものであり、糸状の微生物の表面における抗体結合断片のディスプレイを介した、免疫選抜を模倣する手順において、適切なエピトープ結合リガンドを同定する方法である。特異的な結合活性を有するファージが選抜される。選抜されたファージはその後、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体の産生において使用できる。
【０１０１】
特定の実施形態では、上記の抗体はモノクローナル抗体であり、それらは、細胞を連続培養して抗体分子を産生させるためのいかなる適切な方法を使用して調製してもよい。適切な方法は当業者に周知であり、例えばケーラー及びミルシテインの方法（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７．１９７５）が挙げられる。更に、キメラ抗体又はＣＤＲ移植抗体も本発明の範囲内に包含される。特定の実施形態では、本発明の抗体は、宿主細胞における組み換えＤＮＡの発現によって調製してもよい。
【０１０２】
特定の実施形態では、上記のモノクローナル抗体はヒト抗体であってもよく、トランスジェニック動物（例えばトランスジェニックマウス）を使用して調製される。それは、ヒト重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子座が選択的に発現され、内在性マウス免疫グロブリン遺伝子の発現を欠失又は抑制されるように遺伝子組み換えがなされ、それにより完全なヒト抗体の産生が行われる。
【０１０３】
特定の実施形態では、上記の抗体はヒト化抗体であってもよい。ヒト化抗体は、例えば、米国特許第５５８５０８９号にて説明されるＷｉｎｔｅｒの方法によって調製できる。ヒト化抗体は、モノクローナル抗体（例えばＴＬＲ１４又はＴＬＲ４特異的な抗体）の超可変領域と、ヒト抗体の定常領域と有する修飾された抗体であってもよい。すなわち、上記結合メンバーはヒト定常領域を含んでなってもよい。超可変領域以外の可変領域は、ヒト抗体の可変領域に由来してもよく、及び／又は、モノクローナル抗体（例えばＴＬＲ１４又はＴＬＲ４特異的な抗体）に由来してもよい。このような場合、全ての可変領域はマウスモノクローナル抗体に由来してもよく、かかる抗体はキメラ化されていると称される。キメラ抗体を調製する方法は公知である。かかる方法としては、例えば米国特許第４８１６３９７号及び第４８１６５６７号（それぞれＢｏｓｓ及びＣａｂｉｌｌｙ）に記載の方法が挙げられる。
【０１０４】
モノクローナル抗体及び他の抗体を取得し、また組み換えＤＮＡ技術を使用して、元の抗体の特性が維持された他の抗体又はキメラ分子を産生することが可能である。かかる技術では、抗体の免疫グロブリン可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲｓ）をコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域、又は定常領域＋フレームワーク領域に導入する操作を行う。例えば、欧州特許出願公開第０１８４１８７号、英国特許出願公開第２１８８６３８Ａ号、又は欧州特許出願公開第０２３９４００号を参照のこと。ハイブリドーマ又は抗体を産生する他の細胞を、遺伝子突然変異又は他の改変のために使用してもよく、その際、産生される抗体の結合特異性が変化してもよく、又は変化しなくてもよい。
【０１０５】
特定の実施形態では、ＴＬＲ１４抑制性化合物が抗体である場合、当該抗体は治療上有効量で被験者に投与される。特定の実施形態では、上記治療上有効量は、１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００ｐｇ／ｋｇ及び５００ｐｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇから選択される範囲で抗体を含有する。
【０１０６】
抗体の産生：
ＴＬＲ１４又はＴＬＲ４に存在するエピトープとの親和性及び結合特性を有する、ＴＬＲ１４の機能的活性を制限する抗体を産生するための具体的方法は、上記のとおりである。
【０１０７】
また本発明の、及び本発明に用いられる抗体又は抗体断片は、化学合成によって、完全に、又は部分的に調製してもよい。抗体は、確立された、標準的な液体、又は好ましくは固相ペプチド合成方法に従い容易に調製でき、それらの一般的説明は一般に利用可能であり、当業者に周知である。更に、それらは溶液中で調製してもよく、又は固相、液相及び溶液中での化学合成の任意の組合せによって調製してもよい。
【０１０８】
本発明への使用に適する抗体又は抗体断片を調製するための他の簡便な方法は、それらをコードする核酸を、発現システム中にて核酸を用いて発現させることである。
【０１０９】
本発明で使用される核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含んでなってもよく、完全に、又は部分的に化学合成されたものであってもよい。好適な態様では、本発明で用いられる核酸は、上記した抗体又は抗体断片をコードする。当業者であれば、本発明の抗体又は抗体断片を十分に提供できる態様で、かかる核酸へ置換、欠失及び／又は付加を決定できる。
【０１１０】
本発明に用いられる抗体又は抗体断片をコードする核酸配列は、利用可能な核酸配列及びクローンが存在する場合には、本願明細書に記載された技術情報及び引用文献、並びに従来技術において公知の技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌら、（１９９２）を参照）を使用して、当業者によって容易に調製できる。これらの技術には、
（ｉ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、かかる核酸（例えばゲノム給源由来）の試料を増幅すること、
（ｉｉ）化学合成、又は
（ｉｉｉ）ｃＤＮＡ配列の調製。抗体断片をコードするＤＮＡは、当業者に公知のあらゆる適切な方法で調製し、使用できる。その方法は、コードＤＮＡを採取し、発現される部分の両側の適切な制限酵素認識部位を同定し、上記ＤＮＡから上記部分を切り出すことにより行われる。上記の部分を更に、市販の標準的な発現システムの適切なプロモータに、作動可能に連結させることができる。他の組換え方法は、適切なＰＣＲプライマーを用いてＤＮＡの関連部分を増幅することである。上記配列への修飾を行うことが可能であり、例えば、部位特異的突然変異導入を用いて、修飾されたペプチドを発現させるか、又は上記核酸の発現に用いる宿主細胞のコドン使用頻度に適合させることができる。
【０１１１】
上記の核酸は、プラスミド、ベクター、上記のような少なくとも１つの核酸を含む転写又は発現カセットの形の構築物として構成させることができる。上記の１つ以上の構築物を導入することにより、上記の構築物を組換え宿主細胞内に含有させてもよい。遺伝子発現は、適当な条件下で核酸を含む組換え宿主細胞を培養することによって、簡便に実施できる。抗体又は抗体断片を発現させて産生させた後、それらを、任意の適切な技術を、適切に使用して、単離及び／又は精製することができる。
【０１１２】
様々な異なる宿主細胞におけるクローニング及びポリペプチドの発現システムは、周知である。好適な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、酵母、昆虫及びバキュロウイルスの細胞系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現技術に利用可能な哺乳動物の細胞系としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒーラ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞などが挙げられる。一般的に好適な細菌宿主は、大腸菌である原核生物（例えば大腸菌）細胞における抗体及び抗体断片の発現は、当該技術において確立されている。培養液中の真核生物細胞における発現技術も、結合メンバーの産生用のオプションとして当業者が利用できる。
【０１１３】
例えば、一般的な抗体産生方法は当該技術分野の当業者に周知であり、例えばＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７、米国特許第４３７６１１０号、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（１９８８）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒなどに記載されている（それらの開示内容を本願明細書に援用する）。
【０１１４】
例えば、組換え抗体分子の調製技術は上記の引用文献、更には欧州特許出願公開第０６２３６７９号及び第０３６８６８４号に記載されている（それらの開示内容を本願明細書に援用する）。
【０１１５】
本発明の特定の実施形態では、抗体の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードするインサートを含んでなる組換え核酸を使用する。定義としては、かかる核酸は、一本鎖のコーディング核酸、前記コーディング核酸及びそれに対して相補的な核酸を含む二本鎖核酸、又はこれらの相補的な（一本鎖）核酸自体を含んでなる。
【０１１６】
更に、抗体の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする核酸は、酵素的に、又は化学的に合成された核酸であってもよく、それらは天然の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメイン、又はそれらの変異体の確実なコーディング配列を有する。
【０１１７】
組み換えＤＮＡ技術を用いて、本発明の抗体を改良することができる。すなわち、キメラ抗体を構築することにより、診断若しくは治療用途において、その免疫原性を減少させることが可能となる。更に、抗体をヒト化するのと同様の技術でＣＤＲ移植を行い、抗体を改変することによって、例えばブタなどのトランスジェニック生物の体内での免疫原性を最小にすることができる。かかる技術の例は、Ｗｉｎｔｅｒの欧州特許出願公開第０２３９４００号に記載されている。
【０１１８】
レシピエントにおける免疫原性を減少させるため、本発明では、ヒト定常ドメインに融合させた形で、抗体の重鎖可変ドメインをコードするインサートを含んでなる組換え核酸を使用できる。同様に、本発明は、ヒト定常ドメインのκ又はλ領域に融合させた形で、抗体の軽鎖可変ドメインをコードするインサートを含んでなる組み換えＤＮＡに関する。
【０１１９】
抗体遺伝子の突然変異導入によって抗体を産生させ、抗体の人工レパートリを生じさせてもよい。この技術により、抗体ライブラリの調製が可能となる。抗体ライブラリはまた、市販品を利用してもよい。ゆえに、本発明では、免疫グロブリン源として免疫グロブリンの人工レパートリ（好ましくは人工ｓｃＦｖレパートリ）を使用して、ＴＬＲ１４又はＴＬＲ４の特性を有する結合分子を同定するのが好適である。
【０１２０】
抗体選抜システム：
免疫グロブリン（ＴＬＲ１４又はＴＬＲ４と結合し、ＴＬＲ１４の生物学的機能を阻害することができ、ゆえに本発明の方法で使用できる）は、当業者に公知のあらゆる技術を使用して同定できる。かかる免疫グロブリンは、免疫グロブリンポリペプチドの人工レパートリを含んでなるライブラリから簡便に分離できる。「レパートリ」とは、核酸のレベルにおいて、１つ以上の鋳型分子のランダム、セミランダム又は誘導されたバリエーションから生じさせ、多数の結合特性を生じさせた、分子のセットのことを指す。レパートリを生じさせるための方法は、従来技術において周知である。
【０１２１】
あらゆるライブラリ選抜システムを、本発明と組み合わせて使用できる。大きいライブラリから所望のメンバーを単離するための選抜プロトコルは、従来技術において公知であり、ファージディスプレイ技術がその典型である。かかるシステム（多様なペプチド配列が糸状バクテリオファージの表面にディスプレイされる）は、抗体断片（及びそれらをコードするヌクレオチド配列）のライブラリの作製に有用であることが見出されており、それにより、標的抗原と結合する特異的な抗体断片のｉｎ ｖｉｔｒｏ選抜及び増幅が可能となる。ＶＨ及びＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列を、それらを大腸菌のペリプラズム誘導するためのリーダー配列をコードする遺伝子断片と連結し、その結果、得られる抗体断片はバクテリオファージの表面に、典型的にはバクテリオファージのコーティングタンパク質（例えば，ｐＩＩＩ又はｐＶＩＩＩ）に融合された形でディスプレイされる。あるいは、抗体断片はλファージのカプシド（ファージ本体）に外部的にディスプレイされる。ファージベースのディスプレイシステムの効果としては、それらが生物学的なシステムであるため、選択されたライブラリのメンバーを、細菌細胞中で、選択されたライブラリのメンバーを含んでなるファージを単に増殖させることにより増幅できることである。更に、ポリペプチドのライブラリのメンバーをコードするヌクレオチド配列がファージ又はファージミドベクターに含まれるため、その塩基配列決定、発現及び更なる遺伝子操作が比較的容易である。
【０１２２】
バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリの構築方法、及びλファージ発現ライブラリの構築方法は周知技術である（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８，５５２−５５４）。特に有利な１つの方法としては、ｓｃＦｖファージ−ライブラリの使用である（例えばＨｕｓｔｏｎら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡを参照のこと）。
【０１２３】
ファージ若しくは他のクローニングされたライブラリの使用の代替としては、選択された標的（例えば本発明においてはＴＬＲ２エピトープ）で免疫された動物のＢ細胞に由来する核酸（好ましくはＲＮＡ）を使用することである。
【０１２４】
Ｖ領域及びＣ領域のｍＲＮＡを単離することにより、抗体断片（例えばＦａｂ又はＦｖ）を細胞内で発現させることができる。簡潔には、ＲＮＡを免疫された動物のＢ細胞（例えば免疫されたマウスの脾臓又はラマの循環Ｂ細胞に由来する）から分離し、ＰＣＲプライマーを用いてＲＮＡプールから選択的にＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡを増幅させる。このようにして得られたＶＨ及びＶＬ配列を連結し、ｓｃＦｖ抗体を構成させる。ＰＣＲプライマー配列は、公開されているＶＨ及びＶＬ配列に基づく配列でもよい。
【０１２５】
ペプチド擬態物：
ペプチドの類縁体（例えばペプチド擬態物）は、鋳型のペプチドの代表的な特性を有する、非ペプチド化合物である。かかるペプチドの類縁体は典型的には、コンピュータによる分子モデリングを使用して開発される。ＴＬＲ１４との親和性及び結合特性を有し、エンドトキシン（例えばＬＰＳ）と結合して、共受容体複合体としてＴＬＲ４と会合するＴＬＲ１４の生物学的機能活性を阻害するペプチドと、構造的に類似するペプチド擬態物を使用して、かかるＴＬＲ１４に対する抑制機能を有すると決定されたポリペプチド及びタンパク質に類似する、予防的及び治療的効果を発揮させてもよい。
【０１２６】
ペプチド擬態物は典型的には、鋳型ペプチドと構造的に類似するが、周知の代替的な結合で、１つ以上のペプチド結合が置換されている。例えば、ＴＬＲ１４エピトープに対する結合特性を有するペプチドを、アミド結合の置換、非ペプチド部分の導入、又は骨格の環化により修飾する。最適には、システインが存在する場合、この残基のチオールをキャッピングして、遊離スルフェート基の損傷を保護する。ペプチドは更に、天然の配列の修飾により、当該ペプチドのプロテアーゼによる攻撃から保護してもよい。
【０１２７】
最適には、本発明のＴＬＲ１４抑制性化合物として使用されるペプチドを、少なくとも１つのＣ末端及び／又は、Ｎ末端のキャッピング、及び／又はシステイン残基のキャッピングを用いて、更に修飾してもよい。更に、本発明に用いられるペプチドを、アセチル基により、Ｎ末端残基のキャッピングを行ってもよい。最適には、本発明のペプチド、及び本発明で用いられるペプチドを、アミド基により、Ｃ末端のキャッピングを行ってもよい。最適には、システインのチオール基を、アセタミドメチレン基でキャッピングする。
【０１２８】
コンビナトリアルライブラリ：
コンビナトリアルライブラリ技術（Ｓｃｈｕｌｔｚ，ＪＳ（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１２：７２９−７４３）により、ポリペプチドの活性（本発明ではＴＬＲ１４の生物学的活性）を調節する能力に関して、非常に膨大な数の異なる物質を試験する効率的な方法が提供される。活性の調節、あるいはそれに関するスクリーニングの前に、試験化合物を、ポリペプチドと相互作用する能力に関して、例えば酵母ツーハイブリッドシステム（ポリペプチドと試験化合物の両方をコードする核酸が、酵母において発現できることが必要）により選抜してもよい。これは、試験物質が実際にポリペプチドの活性を調節する能力を有するかの試験を行う前の、大雑把なスクリーニングとして使用できる。
【０１２９】
本発明のアッセイに添加できる試験物質又は化合物の量は通常、使用する化合物のタイプに応じて、試行錯誤により決定される。典型的には、推定の阻害化合物を約０．０１〜１００ｎＭの濃度、例えば０．１〜１０ｎＭで使用できる。ペプチドが試験物質である場合は、より高い濃度で使用できる。
【０１３０】
抑制性ポリペプチドの産生：
特定の更なる態様において、ＬＰＳと結合して、ＴＬＲ４と複合体形成する、ＴＬＲ１４の生物学的機能を阻害する化合物は、ポリペプチドである。適切なポリペプチドの発現、単離及び精製は、あらゆる適切な技術によって実施できる。
【０１３１】
ポリペプチドを産生する方法は、ポリペプチドの発現を促進する条件下で、当該ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養するステップと、次に培養液から発現されたポリペプチドを回収するステップとを有してなる。当業者であれば、発現されたポリペプチドを精製する手順が、使用する宿主細胞のタイプ、及び、当該ポリペプチドが細胞内型か、膜結合型か又は宿主細胞から分泌される可溶化型であるか、などの要因に応じて変化しうることを認識するであろう。
【０１３２】
いかなる適切な発現システムを使用してもよい。当該ベクターは、本発明のポリペプチド又は断片をコードするＤＮＡを、適切な転写若しくは翻訳調節ヌクレオチド配列（例えば哺乳動物、鳥類、微生物、ウィルス、細菌又は昆虫遺伝子由来）に作動可能に連結された形で含んでなる。制御配列が機能的にＤＮＡ配列と関連しているとき、当該ヌクレオチド配列は作動可能に連結されているという。すなわち、プロモータのヌクレオチド配列がＤＮＡ配列の転写を制御する場合、当該プロモータヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列に作動可能に連結している。一般には、所望の宿主細胞（大腸菌）において複製する能力を付与する複製開始点、及び形質転換体を同定するための選抜遺伝子を、上記発現ベクターに組み込む。
【０１３３】
更に、適当なシグナルペプチド（天然若しくは非相同）をコードする配列を、発現ベクターに組み込んでもよい。シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列を、本発明の核酸配列にインフレームで融合させ、ＤＮＡを最初に転写させ、次にｍＲＮＡを翻訳させてシグナルペプチドを含んでなる融合タンパク質を産生させてもよい。目的の宿主細胞において機能的なシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外への分泌を促進する。シグナルペプチドは、翻訳の間にポリペプチドから切断除去されるが、細胞からのポリペプチドの分泌を可能にする。
【０１３４】
好適なポリペプチドの発現に用いる宿主細胞としては、高等真核生物細胞及び酵母が挙げられる。原核細胞系も適切である。哺乳動物細胞、特にＣＨＯ細胞は、宿主細胞としての用途に特に好適である。哺乳動物、原核生物、酵母、菌類及び昆虫細胞を宿主として用いる際の、適切なクローニング及び発現ベクターは、例えばＰｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８６）（ＩＳＢＮ０４４４９０４０１８）に記載されている。
【０１３５】
小分子：
特定の更なる実施態様において、ＴＬＲ１４の生物学的機能を阻害する化合物は、小分子であってもよい。
【０１３６】
非ペプチド性の「小分子」は通常、多くのｉｎ ｖｉｖｏでの医薬用途において好適である。したがって、ＴＬＲ１４発現又は生物学的機能を阻害するものとして、本発明のアッセイ方法のいずれか１つに従い同定された擬態物、又は擬態化合物を、医薬用途に応じて適宜設計してもよい。周知の薬理学的活性化合物の擬態物を設計することは、「リード」化合物をベースとする医薬開発のための、周知のアプローチである。これは、上記活性化合物の合成が困難若しくは高価である場合、又は、それが特定の投与方法にとり不適当である場合（例えばペプチドは、消化管内のプロテアーゼにより急速に分解する傾向を有するため、経口投与用組成物の活性成分としては不適切である）に好適であると考えられる。擬態物の設計、合成及び試験を用いることにより、多数の分子を、特定の性質に関してランダムスクリーニングする煩雑さを回避できる。
【０１３７】
所定の目的の特性を有する化合物から擬態物を設計する際、幾つかのステップが一般的に採られる。第１に、目的の特性の決定にとり決定的及び／又は重要である化合物の特定部分を決定するステップである。ペプチドの場合、これはペプチドのアミノ酸残基を系統的に変異させること（例えば各残基を順次置換すること）によって実施できる。化合物の活性領域を構成するこれらの部分又は残基は、その「ファルマコフォア」として公知である。
【０１３８】
ファルマコフォアが決定された後、その構造を、その物理的性質に従って、例えばスペクトル解析、Ｘ線回折データ及びＮＭＲなどの様々なソースから得た、例えば立体化学、結合、サイズ及び／又は荷電などのデータを使用してモデル化する。コンピュータ分析、類似性マッピング（原子間の結合よりも、むしろ荷電及び／又はファルマコフォアの量をモデル化する）、及び他の技術を、このモデリングプロセスで使用できる。
【０１３９】
この方法の変法において、リガンドの三次元構造及びその結合パートナーをモデル化する。リガンド及び／又は結合パートナーが結合形態を変化させる場合、これは特に有用であり、そのモデルは擬態物の設計に利用できる。
【０１４０】
次に、ファルマコフォアを模倣する化学基がグラフトされている鋳型分子を選抜する。鋳型分子及びそこにグラフトされた化学基は、当該擬態物が容易に合成でき、薬理学的に許容できると考えられ、ｉｎ ｖｉｖｏで分解されず、一方、リード化合物の生物学的活性が維持されるものを、簡便に選択できる。この方法によって発見された１つ以上の擬態物を次に、それらが目的の特性を有するか否か、又はそれらがそれをどの程度示すかに関してスクリーニングできる。更なる最適化又は変形を実施して、ｉｎ ｖｉｖｏ又は臨床試験のための、１つ以上の最終的な擬態物を得ることができる。
【０１４１】
抑制性核酸分子：
本発明は、ＴＬＲ１４遺伝子産物の発現を抑制する化合物又は組成物を投与することによって、エンドトキシンにより媒介されるＴＬＲ４媒介性のシグナル伝達を抑制する方法を包含する。
【０１４２】
ＴＬＲ１４の発現抑制は、当業者に周知の多くの技術を使用して実施できる。例えば、限定されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡからなる群から選択される抑制性の核酸により、抑制が媒介されうる。
【０１４３】
すなわち、特定の更なる態様では、本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現を遮断する、治療上有効量の抑制性核酸を被験者に投与することによって、ＴＬＲ４媒介性の炎症症状の予防及び／又は治療方法を包含する。
【０１４４】
本願明細書に定義され、ＴＬＲ１４遺伝子の発現に関して用いられる用語「遮断する」び「遮断」とは、Ｔｏｌｌ様受容体１４タンパク質の発現に結びつく少なくとも１つの遺伝子の発現を停止させること（サイレンシング、ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）を意味する。遺伝子サイレンシングとは、遺伝子組み換え以外の機構による、遺伝子発現のスイッチオフのことである。遺伝子サイレンシングは、転写レベルで、又は転写後のレベルで媒介されうる。転写レベルでの遺伝子サイレンシングにより、転写機構が遺伝子に到達できなくなり、それは例えばヒストンの修飾により媒介されうる。転写後の遺伝子サイレンシングにより、遺伝子に由来するｍＲＮＡの破壊が行われ、それにより、活性を有する遺伝子産物、例えばタンパク質（本発明ではＴＬＲ−１４タンパク質）の生成が抑制される。
【０１４５】
したがって、本発明は更に、有効量の、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）剤などの抑制性核酸分子を被験者に投与して（例えばリボ核酸（例えばｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ）、又はその転写鋳型（例えばｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ）を被験者に存在する少なくとも１つの細胞種、組織又は器官に投与して）、ＴＬＲ１４タンパク質の発現を遮断する方法を包含する。
【０１４６】
特定の更なる実施態様において、上記の抑制性核酸分子は、アンチセンスＲＮＡ分子でもよい。アンチセンスとは、遺伝子発現の抑制を行う方法であり、物理的にｍＲＮＡと結合し、ｍＲＮＡからの翻訳を遮断する一本鎖ＲＮＡ断片が用いられる。
【０１４７】
抑制性の核酸として使用するための、適当な核酸を調製する技術は、当業者に周知であり、以下に詳細に記載する。
【０１４８】
本発明の更に別の態様は、ＴＬＲ４媒介性の炎症症状の治療及び／又は予防用の、Ｔｏｌｌ様受容体１４タンパク質の発現を遮断する薬剤の調製への、抑制性核酸の使用の提供に関する。特定の実施形態では、上記ＴＬＲ４媒介性の炎症症状は、敗血症である。
【０１４９】
様々な本発明の態様は、ＴＬＲ１４遺伝子発現のサイレンシングのための抑制性核酸の使用の提供に関する。
【０１５０】
二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）又は転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）と称されるプロセスを介して、強力かつ特異的な遺伝子サイレンシングを誘導する。ＲＮＡｉは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称される、配列特異的な、マルチコンポーネントのヌクレアーゼにより媒介され、それは、サイレンシングトリガーに相同なメッセンジャーＲＮＡを破壊する。ＲＩＳＣは、二本鎖ＲＮＡトリガーに由来する短鎖ＲＮＡ（約２２ヌクレオチド）を含むとして公知である。
【０１５１】
ＲＮＡｉは、哺乳動物細胞系をはじめとする多数の系において、機能損失を解析するための方法の１つの選択肢となっている。大部分の哺乳動物細胞系における遺伝子の特異的なサイレンシングには、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が用いられる。その理由は、大きいｄｓＲＮＡｓ（＞３０塩基対）では、インターフェロン応答が誘発され、非特異的な遺伝子サイレンシングが生じるからである。
【０１５２】
使用されるＲＮＡｉ剤は、小分子のリボ核酸分子（また本明細書では干渉リボ核酸と称す）、すなわちオリゴリボヌクレオチドであり、それらはデュプレックス構造（例えば各々ハイブリダイズした、２つの異なるオリゴリボヌクレオチドか又は単一のリボオリゴヌクレオチド）で存在し、小さいヘアピンを形成してデュプレックス構造を生じさせると考えられる。「オリゴヌクレオチド」とは、約１００ヌクレオチド（ｎｔ）長を超えないリボ核酸を意味し、典型的には、約７５のヌクレオチド長を超えず、特定の実施形態では約７０未満のヌクレオチド長である。本願明細書に記載されているように、本発明に用いられるデュプレックス構造の長さは、典型的には約１５〜３０塩基対であり、好ましくは約１５〜２９塩基対である。
【０１５３】
本願明細書の「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）などのポリヌクレオチド、及び、必要に応じてリボ核酸（ＲＮＡ）を指すこともある。上記の用語はまた、記載されている実施態様に適用できる場合は、一本鎖（センス又はアンチセンス）及び二本鎖ポリヌクレオチドを包含するものと理解すべきである。
【０１５４】
核酸又は遺伝子配列に関する「発現」という用語は、遺伝子の転写、及び（適当な場合は）得られるｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を意味する。すなわち、前後関係から自明のように、タンパク質をコードする配列の発現は、コード配列の転写及び翻訳の結果である。
【０１５５】
「遺伝子発現の阻害」とは、標的遺伝子に由来するタンパク質のレベル及び／又はｍＲＮＡ生成物の不存在（又は観察可能な減少）を指す。「特異性」とは、細胞内の他の遺伝子に対して顕著に影響を与えることなく、標的遺伝子を阻害する能力のことを指す。阻害の有無の確認は、例えば当業者に周知の技術を用いて実施することができ、例えば、ノーザンブロット、逆転写、マイクロアレイによる遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、標識免疫アッセイ（ＲＩＡ）、他のイムノアッセイ、及び蛍光活性化細胞分取法（ＦＡＣＳ）などが挙げられる。細胞系又は生物体全体における、ＲＮＡ媒介性の阻害の際、タンパク質産生物が容易にアッセイされるレポーター遺伝子又は薬剤耐性遺伝子を用いることにより、遺伝子発現を容易にアッセイできる。
【０１５６】
上記のアッセイによってＴＬＲ１４遺伝子の発現量を定量することにより、本発明の処理を受けない細胞と比較し、１０％超、３３％超、５０％超、９０％超、９５％超又は９９％超の程度の阻害が測定できる。活性薬剤の低い投与量、及び活性薬剤の投与後の長時間の経過により、より少ない割合の細胞において阻害が行われる（例えば少なくとも１０％、２０％、５０％、７５％、９０％又は９５％の標的細胞）。細胞内の遺伝子発現の定量により、標的ｍＲＮＡの蓄積又は標的タンパク質の翻訳レベルにおける、同様の阻害の程度が示されうる。例えば、阻害効率は、細胞内の遺伝子産物の量を評価することにより測定できる（すなわち、ｍＲＮＡは抑制性二本鎖ＲＮＡのために使用される領域外のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブにより検出でき、又は、翻訳されたポリペプチドは、その領域のポリペプチド配列を抗原として作製した抗体により検出できる）。
【０１５７】
ＲＮＡｉ：
したがって、上記のように、本発明の一態様は、適切なタイプの細胞において、ＴＬＲ１４の発現を阻害又は抑制するための、ＲＮＡｉの使用方法の提供に関する。「発現の阻害」という用語は、ＴＬＲ１４遺伝子又はコード配列の発現レベルが、コントロールと比較し、少なくとも約２倍、通常少なくとも約５倍（例えば１０倍、１５倍、２０倍、５０倍、１００倍以上）低下又は阻害されることを意味する。特定の実施形態では、標的ＴＬＲ１４遺伝子／コード配列の発現が効果的に阻害される程度まで、ＴＬＲ１４標的遺伝子の発現が低下する。この場合、標的遺伝子の発現の阻害とは、コード配列（例えばゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡなど）のタンパク質などのポリペプチド産生物（本発明ではＴＬＲ１４）への転写又は翻訳が阻害されることを意味する。
【０１５８】
特定の実施形態では、干渉リボ核酸（例えば上記のｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ）であるＲＮＡｉ剤の代わりに、当該ＲＮＡｉ剤は、上記の干渉リボ核酸（例えばｓｈＲＮＡ）をコードするものであってもよい。換言すれば、ＲＮＡｉ剤は、干渉リボ核酸の転写鋳型であってもよい。これらの実施形態では、上記転写鋳型は典型的には干渉リボ核酸をコードするＤＮＡである。ＤＮＡはベクターに存在してもよく、またプラスミドベクター、ウィルスベクターなどの様々なベクターが公知である。
【０１５９】
ＴＬＲ１４を発現する細胞へのＲＮＡｉ剤の投与は、ウィルスベクターによって、又は当業者に公知の他のプロトコルにより実施できる。例えば、上記の核酸をマイクロインジェクション、又はリポソーム融合によって細胞に導入してもよい。例えば、ＲＮＡｉ剤は、標的細胞に直接注入できる。上記ＲＮＡｉ剤は、細胞あたり少なくとも１コピーで送達される量で導入してもよい。上記ＲＮＡｉ剤を高濃度（例えば少なくとも５、１０、１００、５００又は１０００コピー／細胞）で投与することにより、より有効な阻害をなしうる。また、特殊な用途においては低用量が有用である。
【０１６０】
アンチセンス：
また、本発明は、ＴＬＲ１４の発現サイレンシングに用いられるアンチセンス核酸の提供に関する。アンチセンス試薬は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）、特に天然の核酸を化学的に修飾した合成ＯＤＮであってもよく、又はＲＮＡとしてのかかるアンチセンス分子を発現する核酸構築物であってもよい。アンチセンス配列は、標的のＴＬＲ１４遺伝子のｍＲＮＡと相補的で、標的のＴＬＲ１４遺伝子産物の発現を阻害する。
【０１６１】
アンチセンス分子は様々なメカニズム、例えば、ＲＮＡｓｅＨの活性化又は立体障害を通じて、翻訳に利用されるｍＲＮＡの量を減少させることによりにより遺伝子発現を阻害する。１つのアンチセンス分子又はその組合せを投与してもよく、その組合せは複数の異なる配列を含んでなってもよい。アンチセンス分子は、アンチセンス鎖がＲＮＡ分子として生じるように転写方向が調整された適切なベクター中で、標的ＴＬＲ１４遺伝子配列の全て又は一部を発現させることにより、生じさせることができる。あるいは、上記アンチセンス分子は、合成オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは一般に、少なくとも約７、通常少なくとも約１２、好適には少なくとも約１６ヌクレオチド長であり、約５００以下、通常約５０以下、好適には約３５ヌクレオチド長以下であり、そのヌクレオチド長は、阻害効率、特異性、交差反応性の欠如などの要因に依存する。短いオリゴヌクレオチド（７〜８塩基長）が、遺伝子発現を強力かつ選択的に阻害しうることが解明されている（Ｗａｇｎｅｒら、（１９９６），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４０−８４４を参照）。
【０１６２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、公知の方法によって化学的に合成できる（Ｗａｇｎｅｒら、（１９９３）上記、及びＭｉｌｌｉｇａｎら、上記、を参照）。それらの細胞内安定性及び結合親和性を改善するために、好適なオリゴヌクレオチドを基に、天然のリン酸ジエステル構造を化学的に修飾する。多くのかかる修飾が文献に記載され、それらは骨格、糖又は複素環状塩基の化学構造を変化させるものである。
【０１６３】
可溶性タンパク質：
特定の更なる実施態様において、Ｔｏｌｌ様受容体１４の生物学的機能を阻害する化合物は、可溶性タンパク質（典型的には可溶化型のＴＬＲ１４）である。
【０１６４】
可溶性ポリペプチドは、それらが発現された細胞から分泌されうる。一般に、可溶性ポリペプチドは、所望のポリペプチドを発現する完全な細胞を、培地から、例えば遠心分離により分離して、所望のポリペプチドの存在に関して培地（上清）をアッセイすることにより同定できる（また、非可溶性の膜結合型の相対物と区別できる）。培地中のポリペプチドの存在は、ポリペプチドが細胞から分泌され、すなわち可溶化型のタンパク質であることを示す。
【０１６５】
本願明細書に定義される配列番号２のアミノ酸配列は、配列番号１に定義されるＴＬＲ１４の配列の、可溶化型のアミノ酸配列を示し、すなわち、予測された膜内外領域及びＣ末端が除去されている。この可溶化型のＴｏｌｌ様受容体１４は、競争的にＬＰＳと結合することによって、膜結合型Ｔｏｌｌ様受容体１４の生物学的機能を抑制する機能を発揮でき、これにより、膜結合型ＴＬＲ１４とＬＰＳとの会合が減少し、その結果、ＬＰＳにより媒介されたＴｏｌｌ様受容体４の活性化が減少する。発明者らは、この場合、エンドトキシン（例えばＬＰＳ）と会合した可溶化型のＴＬＲ１４は、共受容体としてＴＬＲ４と複合体を形成しないと予想している。
【０１６６】
特定の実施形態では、可溶化型のＴＬＲ１４は、融合タンパク質として提供してもよい。特定の実施形態では、前記融合タンパク質は、ＴＬＲ１４受容体の可溶性部分、典型的にはその細胞外領域若しくは一部分（例えば配列番号２のアミノ酸配列を有する）と、それに結合する第２のペプチドを含んでなる。特定の実施形態では、上記の第２のペプチドは免疫グロブリンに由来し、典型的には免疫グロブリン（典型的にヒト免疫グロブリン）の重鎖に由来するＦｃ受容体結合タンパク質である。融合タンパク質中にＦｃ領域を含ませることにより、治療用タンパク質の循環半減期が延長される。
【０１６７】
可溶性ＴＬＲ１４アミノ酸配列及び免疫グロブリンＦｃ受容体結合部分は、あらゆる適切な方法により結合させてもよく、典型的には共有結合により連結させる。しかしながら、非共有結合を用いてもよい。あるいは、ポリペプチド配列を直接結合してもよく、又は結合部分又はスペーサにより結合してもよい。免疫グロブリンに由来するヒンジ領域などのリンカー部分を用いてもよい。上記のヒンジ領域は、抗原性ポリペプチドを定めるアミノ酸と、免疫複合体のＦｃＲ結合ポリペプチドを定めるアミノ酸とを連結するのみならず、免疫複合体の柔軟性を増加させることにより結合特異性を改善する。典型的には、上記リンカーは主にスペーサとして機能する。典型的には、上記リンカーは、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸を含んでなる。上記のリンカーは、例えば１〜２０個のアミノ酸を含んでなってもよい。最適には、上記のリンカーは、立体障害のないアミノ酸残基（グリシン及びアラニンなど）を含んでなってもよい。リンカー部分の適切な形態を、以下に記載する。
【０１６８】
免疫複合体中の抗原性断片を定めるアミノ酸を、そのＮ（アミノ）末端又はＣ（カルボキシル）末端のリンカー部分に連結させてもよい。適切なコンジュゲート及び結合方法は当業者に周知であり、例えばＦｃポリペプチドのシステイン残基を利用したチオエステル架橋によるコンジュゲーションなどが挙げられる。あるいは、コンジュゲーションは例えば、ヘテロ二官能性架橋剤（スクシンイミジルエステル（例えば、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート又はスクシンイミジルアセチルチオアセテート、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社．Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第５章、５．３節）などの化学的架橋分子）を使用して行ってもよい。
【０１６９】
Ｆｃ結合ポリペプチドへの抗原性断片のコンジュゲーションにおいて有用な更なる技術としては、国際公開第９４／０４６９０号パンフレット及び第９６／２７０１１号パンフレットに記載の技術が挙げられる。
【０１７０】
コンジュゲーションは更に、従来技術において周知の組み換えＤＮＡ技術を用いた、遺伝子的手段によって実施でき、かかる技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ ｅｄ．Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１．１０１−１０４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｊ．Ｗｉｌｅｙ Ｐｒｅｓｓ（２００６）などに開示されている（それらの関連する部分を本願明細書に援用する）。
【０１７１】
複合薬剤：
上記のように、本発明の特定の態様は、複合薬剤に関するものであり、その際の組成物又は方法は、ＴＬＲ１４の生物学的機能活性を阻害する化合物の投与に関連し、それらは、ＣＤ１４活性を抑制するのに有用な、少なくとも１つの更なる治療用化合物と組み合わせて投与される。
【０１７２】
典型的には、第１の治療組成物と第２の治療組成物は、同時に投与される。特定の実施形態では、上記の第１の治療組成物（すなわちＴＬＲ１４の機能活性をアンタゴナイズする化合物）と第２の治療化合物は、一度に投与される。特定の更なる実施態様において、それらは順次投与される。
【０１７３】
特定の実施形態では、上記複合薬剤は、ＴＬＲ１４の機能的阻害剤（例えば抗体、ペプチド、小分子又はペプチド擬態物）を含んでなってもよく、更に以下の少なくとも１つと共に被験者に共投与される：ＣＤ１４阻害剤、サイトカイン阻害剤（限定されないが例えばＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８及びＩＬ−１５の阻害剤）、及び腫瘍壊死因子阻害剤、成長因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、酵素阻害剤、代謝阻害剤、細胞障害剤、又は細胞増殖抑制剤。
【０１７４】
当業者であれば、被験者に対する複合薬剤の投与は、治療薬の投与量を低くすることが可能となり、また関連する治療的効果を被験者に提供することが可能となるため、有利であることを認識するであろう。複合薬剤の投与量が少ないことにより、投与化合物に由来する毒性に対する被験者の曝露レベルも低いものとなる。更に、本発明に係る、複合薬剤の一部として投与される第２の治療化合物は、異なる経路を標的とするため、全体的な治療効果が相乗的に向上すると考えられる。治療効果の向上により、必要となる投与量を低くでき、またそれにより毒性を減少させることができる。
【０１７５】
ＣＤ１４の生物学的機能的な活性を抑制するのに用いられる第２の化合物としては、限定されないが、可溶化型のＣＤ１４、ペプチド阻害剤、小分子、融合タンパク質若しくはリガンド、並びに抗体などが挙げられる。
【０１７６】
医薬組成物：
本発明は、ＴＬＲ１４の発現又は生物学的機能的な活性を阻害する化合物を含んでなる医薬組成物を包含する。本発明に係る、及び本発明に使用される医薬組成物は、活性成分（すなわちＴＬＲ１４の発現又は生物学的活性の阻害剤）に加えて、当業者に周知の薬理学的に許容できる賦形剤、担体、緩衝剤又は他の物質を含んでなってもよい。適切な医薬用の担体としては、例えば水、グリセロール、エタノールなどが挙げられる。
【０１７７】
本発明のモノクローナル抗体又は融合タンパク質は、あらゆる適切な経路を経て、治療を必要とする患者に投与できる。本願明細書において詳述されるように、上記の組成物は、注射又は点滴によって、非経口的に投与されるのが好ましい。好適な非経口投与経路の例としては、限定されないが、静脈内、心臓内、動脈内、腹膜内、筋肉内、経粘膜、腔内、皮下、吸入又は経皮投与経路が挙げられる。
【０１７８】
更なる投与経路としては、局所及び腸内投与（例えば経粘膜（肺内を含む）、経口、鼻腔内、直腸内）が挙げられる。
【０１７９】
上記の製剤は、液体（例えば非リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．８−７．６）を含んでなる）であってもよく、又は凍結乾燥粉末であってもよい。
【０１８０】
特定の実施形態では、上記の組成物は、注射可能な組成物として送達することができる。静脈内、皮内、皮下投与の場合、上記の活性成分を、パイロジェンフリーの、適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する、非経口投与可能な水溶液の形態に調製する。当業者であれば、例えば塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液又は乳酸リンガー注射液などの等張ビヒクルを使用して、適切な溶液を調製できる。
【０１８１】
必要に応じて、防腐剤、安定化剤、緩衝剤、酸化防止剤及び／又は他の添加を含有させてもよい。
【０１８２】
上記の組成物は、血液などの特定の組織に配置させた微小球体、リポソーム、他の微粒子送達システム、又は持続放出製剤を介して投与してもよい。
【０１８３】
本発明に使用できる上記の技術及びプロトコルの例、並びに他の技術及びプロトコルは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、 ２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ ＩＳＢＮ０−９１２７３４−０４−３、及びＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、 Ａｎｓｅｌ，Ｈ．Ｃ．ら、７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ＩＳＢＮ０−６８３３０５−７２−７に記載されており、それらの全開示内容を本願明細書に援用する。
【０１８４】
投与計画において、本発明の組成物の単回投与、又は当該組成物の複数回投与を含めることができる。上記組成物は更に、本発明の融合タンパク質を投与して治療しようとする症状の治療に用いられる他の治療薬及び薬剤と共に、順次、又は別個に投与できる。
【０１８５】
実際の投与量、並びに投与の速度及び時間−経路は、治療対象の性質及び重篤度に依存する。治療の処方（例えば投与量の決定など）は、最終的には一般開業医及び他の医師の責任及び裁量の範囲内で行われ、また典型的には、治療しようとする障害、個々の患者の症状、送達部位、投与方法及び医療関係者公知の他の要因を考慮して行われる。
【０１８６】
特に明記しない限り、本願明細書において用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本発明の技術分野に属する当業者に一般的に理解されている意味で用いられる。
【０１８７】
明細書全体にわたり、文脈による限定がない限り、用語「含んでなる」又は「含有する」、又はその活用形（例えば「含んでなって」又は「含んでなること」、「含有して」又は「含有すること」）は、明記された整数又は整数の群を包含することを意味するが、他のいかなる整数又は整数の群を除外するものではないとして理解されるものとする。
【０１８８】
本明細書で用いられる用語「１つの」及び「上記」などは、文脈から特に限定されない限りは、それが示すものの単数形及び複数形を包含するものとする。すなわち、例えば「活性薬剤」又は「医薬活性薬剤」というときは、単一の活性薬剤、並びに２つ以上の異なる活性薬剤の組み合わせが包含され、一方、「担体」というときは、単一の担体、並びに２つ以上の担体の混合物が包含される。
【０１８９】
本発明の融合タンパク質のポリペプチド成分を記載するための命名法は、従来の慣習に従って行われ、アミノ基（Ｎ）が各アミノ酸残基の左に存在し、カルボキシル基が右側に存在する。
【０１９０】
本明細書で用いられる「アミノ酸」という表記には、天然及び合成アミノ酸、並びに、Ｄ型及びＬ型の、いずれのアミノ酸も包含されるものとする。合成アミノ酸にはまた、化学修飾されたアミノ酸（限定されないが塩、及びアミドなどのアミノ酸誘導体などを含む）が包含される。本発明のポリペプチドに含まれるアミノ酸は、他の化学基によるメチル化、アミド化、アセチル化又は置換により修飾されることができ、それにより、その生物学的活性に悪影響を与えることなく、循環半減期を改変することができる。
【０１９１】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本願明細書において同義的に用いられ、ペプチド結合又は修飾ペプチド結合（例えばアイソスター）により共有結合した、少なくとも２つの一連のアミノ酸を表すものとする。ペプチド又はタンパク質中に含有させるができるアミノ酸の最大数は、特に限定されない。更に、用語「ポリペプチド」は、ペプチドの断片、類縁体及び誘導体を包含し、前記断片、類縁体又は誘導体は、当該断片、誘導体又は類縁体が由来するペプチドと同じ生物学的機能活性を保持している。
【０１９２】
本願明細書の用語「治療上有効量」とは、ＴＬＲ４媒介性の炎症症状を抑制するのに必要となる、本発明の物質、結合化合物、小分子、融合タンパク質又はペプチド擬態物の量を意味する。
【０１９３】
本願明細書の用語「予防上有効量」とは、ＴＬＲ４媒介性の炎症症状（例えば敗血症）の最初の発症、進行又は再発を防止するのに必要となる組成物の量のことを指す。
【０１９４】
本願明細書の用語「治療」、及び関連する用語「治療する」及び「治療すること」とは、ＴＬＲ４又はＴＬＲ１４媒介性の症状又はその少なくとも１つの徴候の、進行、重篤度及び／又は持続期間を減少させることを意味し、上記の減少（又は改善）は、ＴＬＲ４と、共受容体としてのＴＬＲ１４との会合を崩壊させるか又は防止する化合物の投与の結果として生じる。
【０１９５】
したがって、「治療」という用語は、被験者にとり有益なあらゆる療法計画のことを指す。上記の治療は、既存の症状に関するものであってもよく、又は予防的なもの（予防的治療）であってもよい。治療には、治癒的、軽減的又は予防効果が包含されうる。本願明細書における「治療的」及び「予防的」処置とは、それらの最も広義の意味において解釈されるものとする。「治療的」の用語は、必ずしも被験者が完全な回復を遂げるまで治療されることを意味するものではない。同様に、「予防的」とは、必ずしも被験者が最終的に疾患症状に至らないことを意味するものではない。
【０１９６】
本願明細書の用語「被験者」とは、動物（好ましくは哺乳糖物、特にヒト）を指す。特定の実施形態では、上記の被験者は哺乳動物、特にヒトである。用語「被験者」は、本明細書で用いられる用語「患者」と同義である。
【０１９７】
以下の実験技術及びプロトコルを、本発明の実施例において用いる。
【０１９８】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ：
Ｕ３７３細胞を、９６ウェルプレート（ウェルあたり２×１０4細胞）に播き、その翌日、空のベクター又はＴＬＲ１４発現ベクター（５０ｎｇ）、並びに、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ内部コントロールプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社）４０ｎｇと共にＮＦ−ｋＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）８０ｎｇを用いてトランスフェクションした。ＧＥＮＥＪＵＩＣＥ（商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、製造業者の指示に従い、一過的にトランスフェクションした。２４時間後に細胞を、１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で、ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ社）で６時間刺激した。細胞を更に受動的な溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ社）中に添加し、レポーター遺伝子活性をルミノメーターで測定した。データを、コントロールのレベルに対する平均誘導倍率±ＳＤとして表し、代表的な実験の場合は３つの別々の実験（各々３回実験を行う）の最小値として表した。
【０１９９】
ｓｉＲＮＡベースのＴＬＲ１４ノックダウン：
ＴＬＲ１４に対する結合特性を有する市販のｓｉＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社及びＱｉａｇｅｎ社から購入した。ヒト星状細胞腫Ｕ３７３細胞を、５×１０4細胞／ｍｌの濃度で、１０ｃｍのシャーレにおいて準備した。次の日、細胞を、製造業者の指示に従い、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して、ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。４８時間後に細胞から培地を除去し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルバッファを直接プレートに添加した。サンプルを超音波破壊し、５分間ボイルし、１３０００回転／分で１分間遠心分離した。サンプルを次にＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより解析した。ＩｋＢα及びホスホｐ３８に対する抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ社から購入した。ＴＬＲ４抗体はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ社から購入した。
【０２００】
ＴＨＰ１を用いる実験において、Ａｍａｘａベースのトランスフェクションシステム（プログラムＳ−０１９）を使用して、ＴＬＲ１４（Ｑｉａｇｅｎ）に特異的なｓｉＲＮＡにより細胞をトランスフェクションした。７２時間後に、ＴＬＲ１４のノックダウンをウエスタンブロッティングにより確認した。スクランブルしたＱｉａｇｅｎ ｓｉＲＮＡをネガティブコントロールとして使用して、ｓｉＲＮＡがＴＬＲ１４に特異的であったことを確認した。細胞を、示された時間にわたり、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで処理し、ＩｋＢ分解をウエスタンブロッティングで測定した。サイトカイン測定が関係する実験の場合、７２時間後に、細胞を２４時間にわたり１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激した。上清を除去し、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αＥＬＩＳＡｓを実施した。
【０２０１】
ＬＰＳ結合アッセイ：
ＨＥＫ２９３細胞を、１×１０5細胞／ｍｌで、１０ｃｍのプレートに播いた。翌日、細胞をＴＬＲ１４発現プラスミド３μｇによってトランスフェクションした。２４時間後に、１％のＮＰ４０を含んでなる８００μｌのＨｅｐｅｓバッファ中で細胞を溶解させた。細胞可溶化物を、非標識のＬＰＳの有無において、１μｇ／ｍｌの最終濃度のビオチン−ＬＰＳ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）で、室温で１時間インキュベートした。ストレプトアビジン−アガロースビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ社）をＰＢＳで２回洗浄し、サンプルに添加した（４０μｌ／ポイント）。１時間後に、ビーズを溶解緩衝液で３回洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファ２０μｌ中に再懸濁した。タンパク質のサンプルを、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、ニトロセルロース膜へ転写し、ウエスタンブロッティングを行った。得られるブロットを、抗ＴＬＲ１４抗体をプローブとして解析した。
【実施例】
【０２０２】
実施例１：ＬＰＳシグナル伝達へのＴＬＲ１４の関与：
ＬＰＳに反応する星状細胞腫細胞系（Ｕ３７３）において、レポーター遺伝子アッセイを実施した。５０ｎｇの空のコントロールベクター又はＴＬＲ１４プラスミドで、２４時間にわたりトランスフェクションした。細胞を回収する前に、過度に発現されたＴＬＲ１４の有無において、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）により６時間刺激し、レポーター遺伝子活性を分析した。
【０２０３】
図１に示されるように、空のベクターでトランスフェクションした細胞の場合（図１でＥＶと記す）と比較し、ＴＬＲ１４の存在により、ＬＰＳ誘導性のＮＦ−ｋＢレポーター遺伝子発現（刺激の増加（倍）として示す）が増強された。ＬＰＳシグナル伝達を増強するＴＬＲ１４の能力は、ＴＬＲ１４がＴＬＲ４の共受容体として機能しうることを示唆する。
【０２０４】
実施例２：ＴＬＲ１４のｓｉＲＮＡノックダウンによる、ＬＰＳで媒介されるシグナル伝達に対する効果
ＴＬＲ１４がＴＬＲ４のための共受容体として機能するか否かを更に確認するため、ＴＬＲ１４ノックダウンに特異的なｓｉＲＮＡｓを、Ｑｉａｇｅｎ社から購入した。これらのＴＬＲ１４特異的なｓｉＲＮＡｓを用いて、ＬＰＳ誘導性のＩｋＢ分解及びｐ３８リン酸化の効果を評価した。
【０２０５】
ＴＬＲ１４及び非ターゲティングネガティブコントロールｓｉＲＮＡの両方に対するｓｉＲＮＡを、Ｕ３７３ｓ細胞にトランスフェクションし、ＴＬＲ１４のノックダウンを、ウエスタンブロッティングにより確認した。得られた、このノックダウンを確認するウエスタンブロッティングを、図２（Ｂ）及び図３に示す。
【０２０６】
ＬＰＳ誘導性のＩｋＢ分解及びｐ３８リン酸化を、ＴＬＲ１４の細胞レベルを低下させる効果を評価するための読み出し（ｒｅａｄｏｕｔ）として用いた。β−アクチンの発現を、ローディングコントロールとして用いた（それぞれ図２（Ａ）及び図３）。図２（Ａ）は、ＬＰＳ誘導性のＩｋＢ分解がＴＬＲ１４の非存在下で観察されなかったことを示す。同様に、ＬＰＳ誘導性のｐ３８リン酸化は、図３に示すように、ＴＬＲ１４に対するｓｉＲＮＡで処理された細胞において、大きく損なわれた。
【０２０７】
これらの効果が、ＴＬＲ４の非特異的なノックダウンに起因するものではないことを確認するため、ＴＬＲ４抗体をプローブとしてサンプルを解析した。その結果、ＴＬＲ１４に対するｓｉＲＮＡで処理された細胞からのＴＬＲ４減少を示す証拠が得られなかった（結果は示さず）。
【０２０８】
実施例１及び２の結果はしたがって、ＴＬＲ１４がＬＰＳ誘導性の細胞シグナル伝達を増強し、その一方で、ＴＬＲ１４の不存在によりＬＰＳへの通常の反応が損なわれることを明らかに示すものである。したがってＴＬＲ１４は、ＰＡＭＰ（ＬＰＳ）のＴＬＲ４への結合に応答したＴＬＲ４機能にとり必要である。
【０２０９】
実施例３：ＴＬＲ１４に対するＬＰＳの結合の測定
ＬＰＳ結合アッセイを実施し、ＴＬＲ１４へのＬＰＳの結合を測定した。ＨＥＫ２９３細胞を、ＴＬＲ１４でトランスフェクションした。２４時間後に細胞を溶解させ、室温で、ビオチン化ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）又は非標識のＬＰＳで１時間インキュベートした。次にストレプトアビジンアガロースビーズ上でプルダウンアッセイを実施した。
【０２１０】
上記溶解物のウエスタンブロッティングによる分析結果を図４に示す。ウエスタンブロットにより、ビオチン−ＬＰＳとの複合体としてＴＬＲ１４が存在することが明らかとなった。非標識のＬＰＳが含まれることにより、図４に示すように結合が減少し、すなわちこの相互作用が特異的であることを示すものである。図４（ａ）において、５倍過剰の非標識のＬＰＳを含ませ、一方、図４（ｂ）において、コントロールサンプル中に、２５倍過剰及び５０倍過剰の非標識ＬＰＳを含ませた。
【０２１１】
実施例４：ＩｋＢ分解に対する、ＴＬＲ１４ ｓｉＲＮＡノックダウンの効果
ａｍａｘａベースのトランスフェクションシステム（ｐｒｏｇｒａｍ Ｓ−０１９）を使用して、ＴＬＲ１４（Ｑｉａｇｅｎ）に対して特異的なｓｉＲＮＡにより、ＴＨＰ１細胞をトランスフェクションした。
【０２１２】
７２時間後における、ＴＬＲ１４のノックダウンを、ウエスタンブロッティングにより確認した（図５（Ａ））。スクランブルバージョンのＱｉａｇｅｎ ｓｉＲＮＡを用いて、ｓｉＲＮＡがＴＬＲ１４に特異的であることを確認するためのネガティブコントロールとした。示された時間、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで細胞を処理し、ＩｋＢ分解をウエスタンブロットにより測定した（図５（Ｂ）及び図５（Ｃ））。
【０２１３】
ｓｉＲＮＡ媒介されたＴＬＲ１４のノックダウンはゆえに、ＬＰＳによる刺激に応答したＩｋＢ分解をわずかに阻害することを示すものであった。
【０２１４】
実施例５：ＩＬ−６及びＴＮＦ−αサイトカインレベルに対する、ＴＬＲ１４ノックダウンの効果
ａｍａｘａベースのトランスフェクションシステム（ｐｒｏｇｒａｍ Ｓ−０１９）を使用して、ＴＬＲ１４（Ｑｉａｇｅｎ）に対して特異的なｓｉＲＮＡにより、ＴＨＰ１細胞をトランスフェクションした。スクランブルバージョンのＱｉａｇｅｎ ｓｉＲＮＡを用いて、ｓｉＲＮＡがＴＬＲ１４に特異的であることを確認するためのネガティブコントロールとした。７２時間後に、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで細胞を２４時間刺激した。上清を除去し、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αＥＬＩＳＡアッセイを実施した。
【０２１５】
結果を図６に示す。図６（Ａ）はＥＬＩＳＡの結果であり、ＴＬＲ１４のノックダウンによりＴＮＦ−α産生の減少が生じることを示す。図６（Ｂ）は、ＴＬＲ１４のノックダウンによりＩＬ−６サイトカイン産生の減少が生じることを示す。
【０２１６】
実施例６：膜におけるＴＬＲ１４の発現及び局在化
Ｕ３７３脳星状細胞腫細胞を、４μｇのＴＬＲ１４でトランスフェクションした。２時間後に、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで細胞を２時間刺激した。細胞を、サイトゾル及び膜画分に分画した。ウエスタンブロット分析により、膜におけるＴＬＲ１４の発現を確認した。
【０２１７】
図７は、ウエスタンブロッティングの結果を示す。サイトゾル画分を左側に示し、一方、膜画分を右側に示す。ＮＴとは非トランスフェクション細胞を意味し、一方、Ｔはトランスフェクション細胞を意味する。その結果、過剰発現したＴＬＲ１４が膜において局所化することが示された。
【０２１８】
実施例７：マウス脳におけるＴＬＲ１４の発現
野生型（ＷＴと表記）及び自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥと表記）モデル実験マウスから、脳を摘出し、皮質、海馬及び小脳に解剖した。これらの断片のウエスタンブロット分析により、タンパク質レベルでのＴＬＲ１４の発現が確認された。
【０２１９】
図８は、皮質（ゲル左側のカラム１及び２）、海馬（中央のカラム３及び４）及び小脳（右側のカラム５及び６）におけるＴＬＲ１４の発現を意味するバンドを示す、ウエスタンブロッティングを示す。
【０２２０】
特に皮質及び海馬から得たＥＡＥサンプルに関しては、ＴＬＲ１４発現レベルが、ＥＡＥマウスのこれらの領域より高いことを観察することができた。
【０２２１】
実施例８：ＴＨＰ１細胞における内因性ＴＬＲ１４の局在化
ＴＨＰ１細胞を、１ｍｌあたり１×１０5細胞で、１０ｃｍのプレート上に播き、一晩インキュベートした。２４時間後に培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、かき取り、分画バッファ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２５０ｍＭ スクロース、２００ｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ７．５）中に入れた。サンプルを、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザ中で２０ストローク処理し、１００，０００×ｇで１時間遠心分離した。上清（サイトゾル画分）を新しい試験管へ移し、ペレット（膜画分）を、５０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファ［５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ６．８／１０％のグリセロール（体積／体積）／２％のＳＤＳ（重量／体積）／０．１％のブロモフェノールブルー（重量／体積）／５％の２−メルカプトエタノール］中に再懸濁させた。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより分析した。
【０２２２】
ＴＨＰ１細胞の膜及びサイトゾルの画分を調製し、内因性ＴＬＲ１４の局在化を測定した。図９に示すように、超遠心分離後、これらの細胞の膜画分のタンパク質を分離した。ゲル上の膜由来画分に関連するカラムでは、明瞭なバンドが示された。サイトゾルの画分には、同様のバンドは存在しなかった。したがってこの実験の結果は、ＴＬＲ１４が膜結合型受容体のファミリーに属するという説を支持するものである。
【０２２３】
本願明細書で引用される全ての文書は、参照により本願明細書に援用される。本発明に記載される実施形態に対する、本発明の範囲内における様々な修正変更は、当業者にとり自明である。本発明を、具体的な好適な実施形態を参照しながら記載したが、それらは、特許請求された本発明を、かかる具体的な実施形態に過度に限定するものと理解すべきでない。実際、記載された本発明の実施形態の、当業者にとり自明な様々な改変は、本発明の範囲内に包含されるものとする。本願明細書中のいかなる従来技術の引用も、この従来技術が、いかなる国においても一般的知識として認識されていることを、いかなる形でも承認又は示唆することを意味せず、またそのように認識すべきでない。
【技術分野】
【０００１】
本発明はＴｏｌｌ様受容体４機能を調節する化合物に関する。本発明は更に、Ｔｏｌｌ様受容体機能を調節する化合物、特にＴｏｌｌ様受容体４とＴｏｌｌ様受容体１４とを含んでなる共受容体複合体により媒介されるシグナル伝達を調節する化合物を同定するのに有用なアッセイ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）スーパーファミリーは、侵入した病原体の認識及び免疫反応の開始において中心的な役割を果たす。各ＴＬＲは、異なる病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識し、シグナル伝達カスケードの活性化を生じさせ、次に、転写制御因子ＮＦ−ｋＢ、更には有糸分裂活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫｓ）、ｐ３８、ｃ−ｊｕｎ、Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）及びｐ４２／４４を活性化する。Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ−４、ＴＬＲ４）はまた、転写制御因子ＩＦＮで制御される因子−３（ＩＲＦ３）（インターフェロン感受性応答エレメント（ＩＳＲＥ）と結合し、インターフェロンβなどの遺伝子のサブセットを誘導する）の活性化を最終的に引き起こす、更なる経路を活性化する。ＴＬＲは、大きなスーパーファミリーのメンバーであり、インターロイキン１受容体（ＩＬ−１Ｒ）／ＴＬＲスーパーファミリーと呼ばれ、またＩＬ−１Ｒ１サブグループ及びＴＩＲドメイン含有アダプターサブグループも含まれる。全ての３つのサブグループは、細胞質のＴｏｌｌ／ＩＬ−１受容体（ＴＩＲ）領域を有し、それはシグナル伝達にとって必須である。ＴＬＲは細胞外のロイシンリッチリピートを有し、一方ＩＬ−１Ｒ１サブグループは細胞外免疫グロブリンドメインを有する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
発明者らは、驚くべきことに、上記のＴｏｌｌ様受容体１４（配列番号１のヒト型のアミノ酸配列、又は、配列番号３のマウス型のアミノ酸配列を含んでなることを特徴とするタンパク質）が、Ｔｏｌｌ様受容体であるＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）の共受容体として作用することを見出した。発明者らは、例えばｓｉＲＮＡにより媒介されるＴＬＲ１４ノックダウンの結果としてのＴＬＲ１４発現の阻害が行われる場合には、エンドトキシンによるＴＬＲ４の活性化に続く、ＴＬＲ４により媒介されるシグナル伝達（ＴＬＲ４の定義された病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ））が、細胞において抑制されることを明らかにしている。
【０００４】
ＴＬＲ４がエンドトキシンにより媒介されるシグナル伝達にとり重要であることは認知されている。エンドトキシンにより媒介される、ＴＬＲ４を介したシグナル伝達は、例えば敗血症（ｓｅｐｔｉｃａｍｉａ）及びセプシス（ｓｅｐｓｉｓ）などの症状を生じさせうる。したがって、ＴＬＲ４の機能を調節できる、また、特にエンドトキシン（例えばリポ多糖類（ＬＰＳ））に反応したＴＬＲ４活性化及びシグナル伝達を抑制する化合物及び薬剤を同定することは望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達の抑制方法の提供に関し、当該方法は、
−配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質の発現又は生物学的機能を阻害する、治療上有効量の化合物を準備するステップと、
−かかる処置を必要とする被験者にそれを投与するステップとを有してなる。
【０００６】
特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を含む上記タンパク質は、Ｔｏｌｌ様受容体１４である。
【０００７】
ヒト型のＴｏｌｌ様受容体１４のアミノ酸配列は過去に同定されている。これは、本願明細書において配列番号１として示される。
【０００８】
本願明細書において定義される「Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）の活性化」とは、ＴＬＲ４が、少なくとも１つの更なる分子と結合するか又は会合して、ＴＬＲ４のＴＩＲドメインにより媒介されるシグナル伝達が生じることを意味する。更に、本明細書で定義される用語「Ｔｏｌｌ様受容体４のシグナル伝達」とは、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化から生じた、少なくとも１つの下流側のシグナル伝達経路の活性化を意味する。典型的には、上記シグナル伝達は、ＴＬＲ４のＴＩＲドメインにより開始される細胞内シグナル伝達カスケードである。ＴＬＲ４により誘発されるシグナル伝達カスケードにより、ＮＦ−ｋＢ、又はインターフェロン調節因子３などの転写制御因子の活性化が生じうる。ＴＬＲ４により媒介されたシグナルは更に、分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫｓ）、ｐ３８、ｃ−ｊｕｎ、Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）及びｐ４２／４４を活性化しうる。
【０００９】
Ｔｏｌｌ様受容体４は、エンドトキシン（例えばグラム陰性細菌に由来するリポ多糖類（ＬＰＳ））に応答して活性化されることが公知である。しかしながら、Ｔｏｌｌ様受容体４はＬＰＳと直接会合しない。むしろＴＬＲ４は、アダプタ分子として分子ＭＤ−２を使用することにより、ＬＰＳの結合を促進する。発明者らは、Ｔｏｌｌ様受容体１４がＬＰＳと結合すると理論づけている。結合されたＬＰＳは次に、ＴＬＲ１４から、予め形成されたＴＬＲ４とＭＤ−２との複合体へ移される。この定義されたＴＬＲ１４の作用機構は、ＣＤ１４に起因するそれと類似している。
【００１０】
したがって、本発明の方法では、ＴＬＲ４により媒介されるシグナル伝達及び免疫系の活性化の抑制が、Ｔｏｌｌ様受容体４とＴｏｌｌ様受容体１４との会合を防止することにより媒介され、それにより、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達は、生じることができない。
【００１１】
特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質（Ｔｏｌｌ様受容体１４）の発現又は生物学的機能を阻害する化合物は、限定されないが、タンパク質、ペプチド、ペプチド擬態物、核酸、ポリヌクレオチド、多糖類、オリゴペプチド、炭水化物、脂質、小分子化合物及び天然の化合物からなる群から少なくとも１つ選択されるものである。
【００１２】
特定の実施形態では、Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する化合物は、抑制性（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）核酸である。かかる核酸は、Ｔｏｌｌ様受容体１４タンパク質の発現を防止する機能を発揮する。適切な抑制性核酸の例としては、限定されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡなどが挙げられる。
【００１３】
本願明細書に定義されるように、「生物学的機能の阻害」という用語は、ＴＬＲ４活性化及びシグナル伝達を生じさせる、少なくとも１つのＴＬＲ１４の活性（例えばＴＬＲ１４がＬＰＳと結合する能力、又はＴＬＲ１４が共受容体としてＴＬＲ４と共に複合体を形成する能力）を防止することを意味する。
【００１４】
特定の更なる実施形態では、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達は、共受容体としてのＴＬＲ１４の、ＴＬＲ４との複合体の形成を阻害し、それによりＴＬＲ４活性化を抑制する、抗体又は同様の結合化合物により阻害される。
【００１５】
特定の実施形態では、上記抗体はＴＬＲ１４、ＴＬＲ４、又はその両方に結合しうる。ＴＬＲ４及び／又はＴＬＲ１４に存在するエピトープに対する抗体の結合は、ＴＬＲ４の活性化及びシグナル伝達阻害を生じさせる。
【００１６】
特定の実施形態では、Ｔｏｌｌ様受容体１４の生物学的機能を阻害する化合物は、可溶化型のＴｏｌｌ様受容体１４である。前記可溶化型のＴｏｌｌ様受容体１４は膜結合型ではなく、また、例えば、配列番号１に記載のＴｏｌｌ様受容体１４タンパク質の細胞外領域を含んでなるアミノ酸残基の全部又は相当数を欠失していてもよい。
【００１７】
特定の実施形態では、この態様の本発明の方法は更に、ＣＤ１４の発現又は生物学的機能を阻害する、治療上有効量の組成物を、被験者に投与するステップを有してなる。
【００１８】
本発明の第２の態様は、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達を抑制するのに用いられる医薬組成物の提供に関し、上記医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容できる希釈剤、賦形剤又は担体と共に、Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する化合物を含んでなる。
【００１９】
特定の実施形態では、Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する上記化合物は、限定されないが、タンパク質、ペプチド、ペプチド擬態物、核酸、ポリヌクレオチド、多糖類、オリゴペプチド、炭水化物、脂質、小分子化合物及び天然の化合物からなる群から選択される少なくとも１つである。
【００２０】
特定の実施形態では、上記医薬組成物は複合薬剤を含んでなってもよく、その第１成分は、Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する化合物であり、前記複合薬剤は、第２成分として、ＣＤ１４の発現又は生物学的機能を阻害する化合物を含んでなる。かかる複合薬剤は、ＬＰＳにより媒介されるＴＬＲ４活性化の全体的な抑制をなしうる。
【００２１】
更なる本発明の態様は、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達により媒介される症状の治療用薬剤の調製への、Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する化合物の使用の提供に関する。
【００２２】
特定の実施形態では、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達により媒介される症状は、敗血症又は感染性ショックである。
【００２３】
本発明の更に他の態様では、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達によって生じる症状の治療用薬剤に用いられる、Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する化合物を含んでなる組成物の提供に関する。
【００２４】
特定の実施形態では、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達により媒介される症状は、敗血症又は感染性ショックである。
【００２５】
更なる様々な態様において、本発明には、ＴＬＲ１４の発現又は生物学的機能を阻害する化合物を同定するためのアッセイ方法も包含される。更に、本発明の更なる態様には、前記アッセイ方法により同定される化合物を含んでなる組成物も包含され、また、ＴＬＲ４活性化及びシグナル伝達の抑制における、前記化合物及び組成物の使用も包含される。
【００２６】
したがって、更に他の本発明の態様は、Ｔｏｌｌ様受容体４と、共受容体としてのＴｏｌｌ様受容体１４との会合を阻害する化合物を同定するためのアッセイ方法の提供に関し、当該方法は、
−Ｔｏｌｌ様受容体４とＴｏｌｌ様受容体１４とを含んでなる第１及び第２の細胞サンプルを準備するステップと、
−上記第１及び第２のサンプルと、上記Ｔｏｌｌ様受容体１４と結合するエンドトキシンとを、上記Ｔｏｌｌ様受容体１４が、エンドトキシンと結合するときにＴｏｌｌ様受容体４と会合できる条件下で、接触させるステップと、
−前記第１のサンプルと、候補調節化合物とを、前記化合物の結合が可能な条件下で接触させるステップと、
−Ｔｏｌｌ様受容体４受容体の複合体の活性化状態を、前記第１と第２のサンプル間での、下流の活性化レベルの比較によってモニタするステップを有してなり、
前記第１のサンプルと前記第２のサンプルとの間での、Ｔｏｌｌ様受容体４のシグナル伝達の減少により、Ｔｏｌｌ様受容体４とＴｏｌｌ様受容体１４との会合の阻害剤としての調節化合物が同定される。
【００２７】
特定の実施形態では、上記調節化合物は、限定されないが、タンパク質、ペプチド、ペプチド擬態物、核酸、ポリヌクレオチド、多糖類、オリゴペプチド、炭水化物、脂質、小分子化合物及び天然の化合物からなる群から選択される、少なくとも１つである。
【００２８】
特定の実施形態では、上記候補化合物は、ＴＬＲ１４受容体の、ＴＬＲ４との複合体結合（ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｉｎｄｉｎｇ）及び会合を抑制する。特定の実施形態では、上記調節化合物は、ＴＬＲ１４発現を抑制する。
【００２９】
特定の実施形態では、ＴＬＲ１４と結合し、ＴＬＲ４受容体を活性化する分子は、リポ多糖（ＬＰＳ）である。
【００３０】
一実施形態では、ＴＬＲ４受容体の下流の活性化は、Ｔｏｌｌ様受容体活性を表すモニタリング標識に基づいてモニタされる。かかる標識の例としては、ＮＦ−κＢの活性化及びＩＲＦ３タンパク質の活性化が挙げられる。
【００３１】
更なる様々な態様において、本発明には、上記の本発明の態様に係るアッセイ方法により同定される、ＴＬＲ１４を阻害する化合物を含んでなる組成物が包含される。
【００３２】
更なる様々な態様において、本発明には、ＴＬＲ４活性化及びシグナル伝達の抑制方法における、上記のアッセイ方法により同定される化合物の使用が包含される。
【００３３】
更なる様々な態様において、本発明には、ＴＬＲ４との共受容体として複合体を形成するＴＬＲ１４の能力を阻害する化合物を同定するための、アッセイ方法が包含される。
【００３４】
更なる態様において、本発明には、共受容体としてのＴｏｌｌ様受容体１４とＴｏｌｌ様受容体４との会合をモニタすることに基づく、ＴＬＲ４の調節化合物を同定するアッセイ方法が包含される。かかるアッセイは、例えばＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）に基づく。その方法は、タンパク質間相互作用における分子動態の定量化において用いられる。
【００３５】
２つの分子の間の会合及び複合体形成をモニタするため、当該分子のうちの１つをフルオロフォアドナー分子で標識し、一方、もう１つをフルオロフォアアクセプタ分子で標識する。２つの分子が相互作用するときに、ドナーの放出がアクセプタ分子へ転移する。これにより、アクセプタ分子から、モニタできる発光が生じる。上記ドナーとアクセプタが近接して存在する（例えば１〜１０ｎｍ）とき、２つの分子は相互作用して、それにより生じる発光がモニタされる。アクセプタ分子からの放出は、ドナーからアクセプタ分子への分子間蛍光共鳴エネルギー転移に起因する。かかるアッセイにおいて使用するフルオロフォア分子の例は、青色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）及び黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）である。
【００３６】
したがって、本発明の更なる態様は、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達の調節化合物として機能する化合物の同定方法の提供に関し、前記方法は、
−Ｔｏｌｌ様受容体４とＴｏｌｌ様受容体１４とを含んでなる第１及び第２の細胞サンプルを準備するステップと、
−第１のフルオロフォア分子でＴｏｌｌ様受容体４を標識し、第２のフルオロフォア分子でＴｏｌｌ様受容体１４を標識するステップと、
−前記第１のサンプルと、Ｔｏｌｌ様受容体４受容体の活性化を生じさせる分子とを接触させるステップと、
−Ｔｏｌｌ様受容体４及び／又はＴｏｌｌ様受容体１４の結合が可能な条件下で、前記第１及び第２のサンプルと候補調節化合物とを接触させるステップと、
−フルオロフォアの蛍光をモニタすることによって、Ｔｏｌｌ様受容体４受容体の結合状態及び／又は活性化をモニタするステップとを有してなり、蛍光の変化により、上記候補調節化合物が、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達の調節化合物として同定される。
【００３７】
特定の実施形態では、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化を生じさせる分子は、エンドトキシン（例えばＬＰＳ）であり、それはＴｏｌｌ様受容体１４と結合し、その結果、Ｔｏｌｌ様受容体１４が共受容体としてＴｏｌｌ様受容体４と複合体を形成して複合体が形成される。
【００３８】
特定の実施形態では、本発明のアッセイ方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイ方法である。
【００３９】
特定の実施形態では、本発明の本態様のアッセイ方法により同定される調節化合物は、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及び／又は下流シグナル伝達を抑制する化合物である。特定の実施形態では、本発明の本態様のアッセイ方法により同定される調節化合物は、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及び／又は下流シグナル伝達を増強する化合物である。
【００４０】
フルオロフォアからの光放出の減少は、ＴＬＲ４受容体活性を阻害又は抑制する候補調節化合物の存在を表す。
【００４１】
特定の実施形態では、上記調節化合物は、Ｔｏｌｌ様受容体１４又はＴｏｌｌ様受容体４のいずれかと結合する、抗体、ペプチド擬態物、ポリペプチド又は小分子であり、この結合により、ＴＬＲ４とＴＬＲ１４との間の複合体形成が防止される。
【００４２】
特定の実施形態では、上記アッセイは、Ｕｌｌｍａｎら、ＰＮＡＳ，ｖｏｌ９１，ｐｐ５４２６−５４３０，Ｊｕｎｅ１９９４にて説明したように、ビーズベースのＡＬＰＨＡＳＣＲＥＥＮ技術（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を使用して実施できる。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイは、２つのビーズタイプ（ドナービーズ及びアクセプタビーズ）を含んでなる。ビーズは標的分子と共役でき、ビーズに捕捉された分子との間の相互作用により、１つのビーズから他のビーズへのエネルギー転移がなされ、それにより蛍光／発光シグナルが生じる。好適には、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイシステムによりハイスループットスクリーニングが可能となり、それにより、ＦＲＥＴを応用する本発明のアッセイ方法は、このフォーマットにおいて使用することが可能である。
【００４３】
好適には、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイシステムによりハイスループットスクリーニングが可能となり、それにより、ＦＲＥＴを応用する本発明のアッセイ方法を、ＨＴＳスクリーニング方法で用いることにより、調節化合物の同定を促進させることが可能となる。
【００４４】
ＦＲＥＴベースのアッセイの原理を、ＴＬＲ４とＴＬＲ１４との間で形成される共受容体複合体を崩壊させる候補調節化合物の同定にまで応用することが可能である。
【００４５】
更なる様々な態様において、本発明には、上記の本発明の態様に係るアッセイ方法を使用して同定される調節化合物を含んでなる組成物が包含される。本発明には更に、前記組成物及び前記調節化合物の、Ｔｏｌｌ様受容体４と、共受容体としてのＴｏｌｌ様受容体１４との会合を防止するための方法及び組成物への使用が包含される。
【００４６】
更なる特定の態様において、ＴＬＲ４活性化を測定し、及び／又は、ＴＬＲ４活性化の調節化合物を同定するための様々なアッセイが使用できる。例えば、ＴＬＲ４刺激に関するスクリーニングアッセイが報告されており、そこでは、培養細胞を、２つのプラスミド（１つは、ヒトＴＬＲ４の遺伝子を担持し、もう１つは、ルシフェラーゼ遺伝子の上流側にＮＦκＢと結合するプロモータを担持する検出用プラスミド）でトランスフェクションしている（Ｖｏｇｅｌ，Ｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３ ２７８：２２２５０６）。あるいは、酵母ツーハイブリッドシステムを用いて、ＴＬＲ４活性化をスクリーニングすることもできる。
【００４７】
したがって、本発明の更に別の態様は、Ｔｏｌｌ様受容体４とＴｏｌｌ様受容体１４との会合を崩壊させる調節化合物の同定方法の提供に関し、当該方法は、
−ＴＬＲ４及びＴＬＲ１４を含んでなる第１及び第２の細胞サンプルを準備するステップと、
−第１のフルオロフォア分子でＴＬＲ４を標識し、第２のフルオロフォア分子でＴＬＲ１４を標識するステップと、
−ＴＬＲ１４と結合してＴＬＲ４を活性化し、それによりＴＬＲ４とＴＬＲ１４との会合を生じさせる分子と、前記第１のサンプルと、を接触させるステップと、
−前記第１のサンプルと、候補調節化合物とを、ＴＬＲ１４及び／又はＴＬＲ４への当該調節化合物の結合を可能にする条件下で接触させるステップと、
−フルオロフォアの蛍光をモニタすることによって、ＴＬＲ４受容体の結合状態及び／又は活性化をモニタするステップとを含んでなり、
前記蛍光の変化により、上記候補調節化合物が、ＴＬＲ４とＴＬＲ１４との間に形成される共受容体複合体を崩壊させる機能を発揮するとして同定され、それによりＴＬＲ４受容体の調節化合物としての調節化合物が同定される。
【００４８】
特定の実施形態では、ＴＬＲ４の活性化を生じさせる分子は、エンドトキシン（例えばＬＰＳ）である。典型的には、前記エンドトキシンはＴＬＲ１４と結合し、それにより共受容体複合体としてＴＬＲ１４がＴＬＲ４と会合できる。
【００４９】
フルオロフォアからの光放出の減少は、ＴＬＲ４受容体活性を阻害するか又は抑制する候補調節化合物の存在を示す。
【００５０】
更なる様々な態様において、本発明には、上記の本発明の態様に係るアッセイ方法により同定される調節化合物を含んでなる組成物が包含される。本発明には更に、エンドトキシンにより媒介されるＴＬＲ４のシグナル伝達を防止するための方法への、前記組成物及び調節化合物の使用が包含される。
【００５１】
更なる態様において、本発明には、リポ多糖（ＬＰＳ、エンドトキシン）とＴＬＲ１４との間の結合が、ＦＲＥＴシステムを使用してモニタされる、アッセイ方法が包含される。ＬＰＳ及びＴＬＲ１４の各々は、それぞれ別々であるが相補的な、フルオロフォアのドナー又はアクセプタ分子で標識される。ＴＬＲ１４受容体とＬＰＳとの結合により、ドナーからアクセプタ分子への、分子間蛍光共鳴エネルギー転移に起因するアクセプタ分子からの光の放出がなされる。上記アッセイを用いることにより、ＦＲＥＴシグナル放出が変化するとき、ＬＰＳ／ＴＬＲ１４複合体を崩壊させる調節化合物を同定することができる。本発明の発明者は驚くべきことに、ＴＬＲ１４が機能的に遮断され、又はその発現が抑制されるときに、ＴＬＲ４受容体複合体からの下流シグナルが実質的に抑制されることを観察し、それはすなわち、調節化合物によるＴＬＲ１４発現又は機能の抑制は、リガンドによるＴＬＲ４への結合に続く下流シグナルの減少を生じさせることを示すものである。
【００５２】
更に、選択されたＬＰＳアンタゴニストを用いた第２のレポーター遺伝子アッセイを実施することにより、ＴＬＲ４へのＬＰＳの結合に続くシグナル伝達から生じるシグナルを観察することができる。
【００５３】
セプシス（ｓｅｐｓｉｓ）、感染性ショック及び敗血症（ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ）として公知の症状は、ＬＰＳにより誘発されたＴｏｌｌ様受容体４の活性化から生じる、潜在的に致死性の症状である。したがって発明者らは、例えばセプシス、感染性ショック及び敗血症症状などの治療及び予防のための化合物及び方法への、本発明の有用性を見出した。
【００５４】
したがって、本発明の更なる態様は、敗血症又は感染性ショックの治療及び／又は予防方法の提供に関し、当該方法は、
−Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する、治療上有効量の化合物を準備するステップと、
−かかる処置を必要とする被験者にそれを投与するステップを有してなる。
【００５５】
特定の実施形態では、上記方法は、ＣＤ１４の発現又は生物学的機能を阻害する、治療上有効量の組成物を被験者に投与する更なるステップを有してなる。
【００５６】
更なる本発明の態様は、敗血症又は感染性ショックの治療用薬剤の調製への、Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する化合物の使用の提供に関する。
【００５７】
本発明の更に他の態様は、敗血症又は感染性ショックの治療用薬剤に用いられる、Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する化合物を含んでなる組成物の提供に関する。
【００５８】
敗血症又は感染性ショックの症状は、グラム陰性細菌に由来するエンドトキシン（例えばＬＰＳ）によって生じる。特定の実施形態では、グラム陰性細菌は、限定されないが、ナイセリア メニンジチデス、エシェリチア コリ、シュードモナス アエルジノサ、ハエモフィラ インフルエンザエ、サルモネラ チフィムリウム及びフランシセラ ツラレンシスからなるリストから選択される。
【００５９】
特定の実施形態では、Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する化合物は、限定されないが、タンパク質、ペプチド、ペプチド擬態物、核酸、ポリヌクレオチド、多糖類、オリゴペプチド、炭水化物、脂質、小分子化合物及び天然の化合物からなる群から選択される、少なくとも１つである。
【００６０】
更なる様々な態様において、本発明には、ＴＬＲ１４の発現又は生物学的活性を阻害し、それにより、敗血症の治療及び／又は予防への有用性を有する、化合物を同定するためのアッセイ方法が包含される。
【００６１】
更なる特定の態様において、本発明には、敗血症及び感染性ショックの治療に用いられる、上記の本発明の態様に係るアッセイで同定される抑制性化合物を含んでなる組成物が包含される。
【００６２】
エンドトキシン関連の敗血症及び感染性ショックにおいて、活性化されたＴＬＲ４は重要な役割を果たしうることから、本発明の上記方法において、ＴＬＲ４活性化の阻害剤として同定された試験物質は、エンドトキシン関連の敗血症及び／又は感染性ショックを予防又は治療する際に有用であると考えられる。
【００６３】
すなわち、本発明はまた、本発明のアッセイ方法によって同定される、Ｔｏｌｌ様受容体４活性の活性化を阻害する物質を被験者に投与することによって、被験者の敗血症及び／又は感染性ショックを治療する用途に用いられる、組成物の提供に関する。かかる方法及び組成物を、敗血症及び／又は感染性ショックの徴候を示す被験者に用いてもよい。かかる組成物及び方法はまた、敗血症又は感染性ショックを発症する危険性が高い被験者に対して、予防的に用いることもでき、かかる被験者としては、限定されないが大手術（特に腸領域）を受けている患者、並びに外科的手技を受けている、免疫を抑制された患者が挙げられる。
【００６４】
本発明には更に、かかるアッセイにより同定される、敗血症の治療用化合物の使用が包含される。
【００６５】
エンドトキシンは、リピドＡと多糖類とを含むリポ多糖（ＬＰＳ）複合体を含んでなる。グラム陰性細菌のリポ多糖（エンドトキシン、ＬＰＳ）は、グラム陰性菌による敗血症の際に観察されるような、細胞内及び生理的反応を誘発する。免疫／炎症性系の細胞は、血漿及び膜タンパク質の両方が関与する経路によって、ＬＰＳに反応する。
【００６６】
したがって、ＴＬＲ４により媒介される免疫反応経路を下方制御又は阻害する方法は、ＬＰＳにより媒介される症状（例えば敗血症）の治療方法として、望ましい。本発明は、ＬＰＳにより媒介される症状の治療に用いることができる。
【００６７】
本発明のアッセイ及びそれにより同定される調節化合物は、多くの医療的症状、最も具体的にはエンドトキシン及びＬＰＳにより媒介される症状（例えば敗血症）の治療において、具体的な有用性を発揮する。
【００６８】
したがって、本発明の他の更なる態様は、エンドトキシンによる媒介される症状の治療への使用に適する化合物を同定するためのアッセイ方法の提供に関し、前記アッセイ方法は、−候補化合物を準備するステップと、−上記候補化合物をＴＬＲ４受容体複合体と接触させるステップであって、前記複合体がエンドトキシンと結合したＴＬＲ１４を含んでなるステップと、−受容体複合体のＴＬＲ４及びＴＬＲ１４構成要素と結合したフルオロフォア部分からの光放出をモニタするステップとを有してなり、フルオロフォアからの光放出レベルが調節されることにより、ＴＬＲ４受容体複合体を介したシグナル伝達を抑制する際の、当該化合物の有用性が示される。
【００６９】
一実施形態では、エンドトキシンにより媒介される症状は、敗血症又は感染性ショックである。
【００７０】
他の更なる本発明の態様として、本発明の上記のアッセイ方法によって同定されたＴＬＲ１４抑制性化合物を含んでなる、敗血症の治療又は予防用の組成物が包含される。
【００７１】
発明者らは更に、Ｔｏｌｌ様受容体１４が脳において発現することを観察している。実験用の自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルマウスの皮質及び海馬において、ＴＬＲ１４の発現が示されている。ＴＬＲ１４の発現は、同じモデルの小脳においても観察されている。本明細書で発明者により定義される、ＴＬＲ１４の作用のメカニズムを基礎として、発明者は更に、Ｔｏｌｌ様受容体１４は、脳におけるＴＬＲ４媒介性の炎症性シグナルにおいて、役割を果たすと予想している。したがってＴＬＲ１４は、脳において、エンドトキシン媒介されたＴｏｌｌ様受容体４のシグナル伝達との関係があると考えられる。したがって、更なる様々な態様において、本発明には、脳のＴＬＲ１４の発現又は生物学的機能活性を阻害することによって、かかるＴＬＲ４により媒介されるシグナル伝達を阻害する方法が包含される。したがって、本発明の更なる様々な態様において、エンドトキシンにより媒介される脳におけるＴＬＲ４による炎症性シグナル伝達を抑制するための化合物、組成物、更にはかかる方法における当該化合物及び組成物の使用が包含される。
【００７２】
本発明の他の更なる態様は、Ｔｏｌｌ様受容体４活性化及びシグナル伝達により媒介される、異常な免疫反応を治療する方法の提供に関し、当該方法は、−Ｔｏｌｌ様受容体４とＴｏｌｌ様受容体１４との会合を阻害する化合物を準備するステップと、−治療的有効量の当該化合物を、かかる治療を必要とする被験者に投与するステップとを有してなる。
【００７３】
上記異常な免疫反応とは、あらゆる、免疫により媒介される望ましくない反応であってもよい。特定の実施形態では、上記の異常な免疫反応は、例えば敗血症又は感染性ショックなどの症状を生じさせるものである。特定の実施形態では、上記敗血症は、Ｔｏｌｌ様受容体４への、エンドトキシン（例えばグラム陰性細菌に由来するリポ多糖）の結合に起因するグラム陰性敗血症である。
【００７４】
アッセイ：
本発明には、ＴＬＲ１４タンパク質を活性化する調節化合物を同定するためのアッセイシステム及びスクリーニング方法、更には、ＴＬＲ１４活性化をモニタする方法が包含される。本願明細書の「アッセイシステム」とは、１つ以上の特定の事象を検出及び／又は測定するアッセイを実施し、その結果を分析するために必要な全ての構成要素を含むシステムである。
【００７５】
必須ではないが好ましくは、本発明において使用するスクリーニングアッセイは、ハイスループット又はウルトラスループットのアッセイであって、それにより自動化された費用効果的なスクリーニング手段が提供される。
【００７６】
特に明記しない限り、本願明細書において用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本発明の技術分野の当業者に一般に理解されているとおりの意味で用いられる。
【００７７】
本願明細書全体にわたり、文脈により特定されない限り、用語「含んでなる」若しくは「含有する」、又はその活用形である「含んでなり」若しくは「含んでなること」、「含有し」若しくは「含有すること」などの用語は、記載された整数又は整数の群を包含することを意味し、他のいかなる整数又は整数の群をも除外するものではないものと理解すべきである。
【００７８】
以下の具体的実施形態更には図面を参照しながら本発明を記載するが、それらは説明のためにのみ提供されるものであり、本発明を限定するためのものとして解釈すべきでない。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】ＴＬＲ１４がＬＰＳシグナル伝達を増強することを示す。ヒト星状細胞腫細胞（Ｕ３７３）を、ＮＦ−ｋＢレポーター構築物と共に、５０ｎｇの空のコントロールベクター又はＴＬＲ１４発現プラスミドでトランスフェクションした。２４時間後、細胞を回収する前に、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）により６時間刺激し、レポーター遺伝子活性を分析した。Ｕ３７３を回収する前に、過度に発現したＴＬＲ１４の有無において、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）により刺激し、レポーター遺伝子活性を分析した。非形質導入細胞と比較した結果、ＴＬＲ１４は、ＬＰＳ誘導性のＮＦ−ｋＢレポーター遺伝子の発現を増強することが示された。
【図２】ＴＬＲ１４のノックダウンにより、Ｕ３７３星状細胞腫細胞におけるＬＰＳ誘導性のＩｋＢ分解が打ち消されることを示す。Ｕ３７３を、ＴＬＲ１４（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）に特異的なｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。４８時間後に、ＴＬＲ１４のノックダウンを、ウエスタンブロッティングにより確認した（図２Ａ）。非ターゲティングｓｉＲＮＡをネガティブコントロールとして用いて、ＴＬＲ１４に対するｓｉＲＮＡが特異的であることを確認した。示される時間にわたり、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で細胞を処理し、ＩｋＢ分解をウエスタンブロッティング（図２Ｂ）で測定した。ＴＬＲ１４のｓｉＲＮＡノックダウンにより、ＬＰＳ誘導性のＩｋＢ分解が顕著に減少した。図２（Ａ）及び２（Ｂ）は、２つの別々の実験を表す。
【図３】Ｕ３７３星状細胞腫細胞における、ＬＰＳ誘導性のｐ３８リン酸化に対する、ＴＬＲ１４のｓｉＲＮＡの効果を示す。ネガティブコントロールとして、ＴＬＲ１４（Ｑｉａｇｅｎ社）に特異的なｓｉＲＮＡ、又は非ターゲティングｓｉＲＮＡのいずれかで、Ｕ３７３をトランスフェクションし、ＴＬＲ１４に対するｓｉＲＮＡが特異的であることを確認した。示される時間にわたり、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で細胞を処理し、ｐ３８リン酸化をウエスタンブロッティングで測定した。ＴＬＲ１４のｓｉＲＮＡノックダウンにより、ｐ３８のリン酸化が減少した。
【図４】ＴＬＲ１４をトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞における、ＴＬＲ１４とＬＰＳとの結合を示す。ＨＥＫ２９３細胞を、ＴＬＲ１４によってトランスフェクションした。２４時間後に細胞を溶解させ、室温で１時間、ビオチン化ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）単独、又は非標識ＬＰＳとの組み合わせによりインキュベートした。溶解物を次に、洗浄前に更に１時間、ストレプトアビジンアガロースと共にインキュベートし、ウエスタンブロッティングにより分析した。図４（ａ）においては、５倍過剰の非標識のＬＰＳを含有させた。図４（ｂ）においては、２５倍及び５０倍過剰の非標識のＬＰＳを、コントロールサンプル中に含有させた。
【図５】ＴＬＲ１４のノックダウンにより、ＬＰＳに応答してわずかにＩｋＢ分解が阻害されることを示す。
【図６】ＴＬＲ１４のノックダウンにより、ＴＨＰ１細胞からのＩＬ−６産生及びＴＮＦ−αサイトカイン産生の減少が生じることを示す。
【図７】サイトゾル及び膜画分のウエスタンブロッティングを示す。Ｔはトランスフェクション細胞を示し、一方ＮＴは非トランスフェクション細胞を意味する。
【図８】マウスの脳におけるＴＬＲ１４発現を示すウエスタンブロット分析である。
【図９】ＴＨＰ１細胞における内因性ＴＬＲ１４の局在化を示す。膜、サイトゾル及び全細胞抽出物を、Ｄｏｕｎｃｅ型ホモジナイザーで破砕し、超遠心分離することにより調製した。サンプルを次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングを使用した、ＴＬＲ１４発現の解析に供した。
【図１０】配列番号１として定義されるヒトＴｏｌｌ様受容体１４のアミノ酸配列を示す。
【図１１】可溶化型のＴｏｌｌ様受容体１４の予測アミノ酸配列を示す（配列番号２として定義）。
【図１２】マウス型のＴｏｌｌ様受容体１４のアミノ酸配列を示す（配列番号３と定義）。
【図１３】ヒト型のＴｏｌｌ様受容体４のアミノ酸配列を示す（配列番号４として定義）。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
Ｔｏｌｌ様受容体１４（ＴＬＲ１４）は、ロイシンリッチリピートを含んでなるタンパク質であり、ヒト型の場合、以下に示すように配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【００８１】
【化１】
可溶化型のＴｏｌｌ様受容体１４の予測アミノ酸配列を、配列番号２として示す。
【００８２】
【化２】
マウス型のＴｏｌｌ様受容体１４のアミノ酸配列も定義されている。以下に配列番号３として示す。
【化３】
本発明の特定の実施形態では、配列番号１において定義されるヒト型のＴｏｌｌ様受容体１４を、配列番号３において定義されるマウス型のＴｏｌｌ様受容体１４で置換するのが適当であると考えられる。
【００８３】
ＴＬＲ１４は、配列番号１において定義するように、１２のロイシンリッチリピート、シグナル配列及び推定上の膜貫通領域を含む。ＴＬＲ１４の発現は、脳、肺及び卵巣において観察される。ＴＬＲ１４の発現は、微生物由来の生成物（例えばＬＰＳ）により増強される。
【００８４】
発明者らは、ＴＬＲ１４の過剰発現により、ＬＰＳ誘導性のシグナル伝達が増強され、それにより、転写制御因子ＮＦ−ｋＢの転写及びＩＦＮ制御因子−３（ＩＲＦ３）の活性化が上方制御されることを見出した。またＬＰＳシグナル伝達（ＴＬＲ４媒介）により、分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫｓ）、ｐ３８、ｃ−ｊｕｎ、Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）及びｐ４２／４４が活性化する。
【００８５】
驚くべきことに、発明者らは、Ｔｏｌｌ様受容体１４が、ＴＬＲ４との共受容体として機能することを見出した。理論に拘束されないが、発明者らは、この予想されたＴＬＲ１４の機能として、以下のとおりを考えている：
（ｉ）ＴＬＲ１４の一過性の発現により、ＬＰＳシグナル伝達が増強され、
（ｉｉ）ｓｉＲＮＡによるＴＬＲ１４のノックダウンにより、ＬＰＳシグナル伝達が阻害され、
（ｉｉｉ）ＬＰＳがＴＬＲ１４と結合し、
（ｉｖ）ＴＬＲ１４が膜画分、更には脳において発現し、ＥＡＥモデルマウスにおける炎症において、ＴＬＲ１４の発現レベルの強化が観察され、すなわちＴＬＲ１４が特定の疾患及び炎症症状において上方制御されうることを示唆する。
【００８６】
また、理論に拘束されないが、発明者らは、エンドトキシンにより媒介されるシグナル伝達におけるＴＬＲ１４の関与は、ＴＬＲ１４のエンドトキシン（例えばＬＰＳ）との複合体形成に起因すると予測する。ＴＬＲ１４は、共受容体としてＴＬＲ４と会合する。ＴＬＲ４は、エンドトキシンと直接結合しない。むしろ、ＭＤ−２がエンドトキシンと相互作用し、これがＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を形成し、それによりＴＬＲ４依存性の細胞刺激が生じる。この役割において、ＴＬＲ１４はＣＤ１４と同様の方法で機能し、またそれは膜結合型及び可溶化型として存在することも知られている。すなわち、ＴＬＲ１４から、ＴＬＲ４とＭＤ−２で予め形成された複合体へとＬＰＳが移される。ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体に対するＬＰＳの結合により、ＰＡＭＰ ＬＰＳによるＴＬＲ４の活性化、更にＴＬＲ４のＴＩＲドメインから生じる下流シグナル伝達を生じさせる。発明者らは、ＴＬＲ１４とＣＤ１４との配列相同性が極めて低いにもかかわらず、それらが構造的な相同性を示すことを見出している。例えば、ＣＤ１４は一連のロイシンリッチリピートを有し、またこの一連のロイシンリッチリピートはＴＬＲ１４の構造中に明らかに存在する。更に、ＣＤ１４は、Ｔｏｌｌ様受容体の外部領域に存在するのと同じソレノイド構造を有する。ＣＤ１４は、ＴＩＲシグナル伝達ドメインを有しないという点で、Ｔｏｌｌ様受容体とは異なる。
【００８７】
ヒトＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）タンパク質のアミノ配列は過去に同定されており、配列番号４として以下に示す。
【００８８】
【化４】
ＴＬＲ４と、共受容体としてのＴＬＲ１４の会合を阻害する調節化合物の同定を可能にする、様々なアッセイ方法を提供するにあたり、本発明では、異常な免疫反応において生じうる、ＴＬＲ４により媒介されるシグナル伝達を阻害、抑制又は下方制御する手段を提供する。かかるＴＬＲ４により媒介されるシグナル伝達は、ＬＰＳのＴＬＲ４への結合に続く敗血症の原因となる。
【００８９】
本発明は更に、ＴＬＲ４により媒介される、及び特にＬＰＳ応答により媒介される、免疫反応を抑制する際に有用性を有する調節化合物の提供に関する。
【００９０】
抗体及び関連する結合化合物：
特定の実施形態では、本発明は、例えばＴＬＲ１４に対するエンドトキシン（例えばＬＰＳ）の結合を防止することによるか、又は、ＴＬＲ１４とＴＬＲ４とが複合体を形成して共受容体複合体を形成することを抗体により防止することによる、ＴＬＲ１４の生物学的機能的な活性の阻害への、抗体及び関連する結合化合物の使用に関する。
【００９１】
特定の実施形態では、ＴＬＲ１４の生物学的機能を阻害する化合物は、抗体、又は抗体に由来する結合化合物である。
【００９２】
「抗体」とは免疫グロブリンであり、天然由来であるか、又は部分的若しくは全部が合成されたものであってもよい。上記の用語はまた、抗体の結合ドメイン、又は抗体の結合ドメインと機能的に相同性を有するいかなるポリペプチド、タンパク質又はペプチドをも包含する。前記ポリペプチド又はタンパク質は天然の給源に由来してもよく、又はそれらは部分的若しくは全体的に合成されたものであってもよい。抗体の例としては、免疫グロブリンアイソタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥなど）、並びにそれらのアイソタイプサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３）が挙げられる。上記の用語は更に、抗原結合ドメインを含んでなる抗体断片も包含し、ゆえに、結合特性を示す（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、断片及び二重特異性抗体。
【００９３】
様々な実施形態では、本発明に使用する抗体はポリクローナル抗体、キメラ抗体又は合成された若しくは合成的な抗体であってもよい。特定の実施形態では、上記抗体はラクダ抗体（特にラクダ重鎖抗体）であってもよい。更に、上記抗体断片は、ラクダ重鎖抗体に由来するドメイン抗体又はナノボディでもよい。特定の実施形態では、上記抗体はサメ抗体又はサメ由来の抗体であってもよい。
【００９４】
特定の実施形態では、上記抗体は「単離された抗体」であり、その意味は、上記抗体が、
（１）通常それとともに存在する少なくとも幾つかのタンパク質を含まず、
（２）同じ給源（例えば同じ種）からの他のタンパク質を実質的に含まず、
（３）異なる種に由来する細胞により発現され、又は、
（４）天然には生じない、ということである。
【００９５】
抗体は多くの方法で修飾できるため、用語「抗体」とは、必要な特異性を有する結合ドメインを有する、あらゆる結合メンバー又は物質を包含するものとして解釈すべきである。本発明の抗体は、モノクローナル抗体、又はその断片、派生物、機能等価物又は相同物であってもよい。上記の用語には、免疫グロブリン結合ドメインを含んでなるあらゆるポリペプチドも包含され、天然由来、又は完全若しくは部分的合成由来であってもよい。したがって、もう１つのポリペプチドと融合した免疫グロブリン結合ドメイン（又は等価物）を含んでなるキメラ分子も包含される。キメラ抗体のクローニング及び発現は、欧州特許出願公開第０１２０６９４号及び欧州特許出願公開第０１２５０２３号の明細書に記載されている。
【００９６】
抗体の定常領域は、いかなる適切な免疫グロブリンサブタイプでもよいが、抗体サブタイプがＩｇＧ１であることが好ましい。しかしながら、別の実施形態では、ヒト免疫グロブリン分子を用いる場合、抗体のサブタイプはクラスＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥであってもよい。かかる抗体は更に、いかなるサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）に属するものであってもよい。
【００９７】
全長抗体の断片は、抗原と結合する機能を発揮できる。かかる結合断片の例としては、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１抗体ドメインを含むＦａｂ断片、単一の抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片（２つのＦａｂ断片の結合を含んでなる二価断片）、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（ＶＨ領域とＶＬ領域がペプチドリンカーにより連結され、それにより２つのドメインが会合し、抗原結合部位を形成する）、又は二重特異的抗体（遺伝子融合によって構築された、多価若しくは多重特異的断片でもよい）が挙げられる。
【００９８】
本発明に用いられる抗体断片又はポリペプチド（例えばＴＬＲ１４又はＴＬＲ４特異的な抗体断片）（後者は、エピトープの位置でＴＬＲ４と結合して、共受容体としてのＴＬＲ１４とＴＬＲ４との複合体の形成を防止する、ＴＬＲ１４の生物学的機能を阻害する抗体の場合である）は全体的には、連続するアミノ酸残基であって、少なくとも５〜７の連続するアミノ酸、通常少なくとも約７〜９の連続するアミノ酸、典型的に少なくとも約９〜１３の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも約２０〜３０若しくはそれ以上の連続するアミノ酸、最も好ましくは少なくとも３０〜４０若しくはそれ以上の連続するアミノ酸である。
【００９９】
かかる抗体若しくはポリペプチドの、又はＴＬＲ１４若しくはＴＬＲ４特異的な抗体断片の「誘導体」とは、タンパク質のアミノ酸配列を変化させることにより修飾される抗体又はポリペプチドを意味し、それらは例えば、タンパク質をコードする核酸の操作、又はタンパク質自体を変化させることによって得られる。天然のアミノ酸配列のかかる派生物は、１つ以上のアミノ酸の挿入、付加、欠失及び／又は置換を含んでもよく、好ましくは、ＴＬＲ１４及び／又はＴＬＲ４の結合活性を有するペプチドが提供される態様である。好ましくは、かかる誘導体は２５個以下、より好ましくは１５個以下、より更に好ましくは１０個以下、より更に好ましくは４個以下、最も好ましくは１又は２個のアミノ酸のみのアミノ酸の挿入、付加、欠失及び／又は置換を含む。
【０１００】
本発明の結合アッセイに用いられる抗体は、多くの技術により調製できる。例えば、ファージディスプレイベースのバイオパニングアッセイなどのコンビナトリアルスクリーニング技術を用いて、ＴＬＲ１４又はＴＬＲ４に存在する結合エピトープに対する結合特性を有するアミノ酸配列を同定できる。かかるファージディスプレイのバイオパニング技術は、ファージディスプレイライブラリを応用するものであり、糸状の微生物の表面における抗体結合断片のディスプレイを介した、免疫選抜を模倣する手順において、適切なエピトープ結合リガンドを同定する方法である。特異的な結合活性を有するファージが選抜される。選抜されたファージはその後、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体の産生において使用できる。
【０１０１】
特定の実施形態では、上記の抗体はモノクローナル抗体であり、それらは、細胞を連続培養して抗体分子を産生させるためのいかなる適切な方法を使用して調製してもよい。適切な方法は当業者に周知であり、例えばケーラー及びミルシテインの方法（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７．１９７５）が挙げられる。更に、キメラ抗体又はＣＤＲ移植抗体も本発明の範囲内に包含される。特定の実施形態では、本発明の抗体は、宿主細胞における組み換えＤＮＡの発現によって調製してもよい。
【０１０２】
特定の実施形態では、上記のモノクローナル抗体はヒト抗体であってもよく、トランスジェニック動物（例えばトランスジェニックマウス）を使用して調製される。それは、ヒト重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子座が選択的に発現され、内在性マウス免疫グロブリン遺伝子の発現を欠失又は抑制されるように遺伝子組み換えがなされ、それにより完全なヒト抗体の産生が行われる。
【０１０３】
特定の実施形態では、上記の抗体はヒト化抗体であってもよい。ヒト化抗体は、例えば、米国特許第５５８５０８９号にて説明されるＷｉｎｔｅｒの方法によって調製できる。ヒト化抗体は、モノクローナル抗体（例えばＴＬＲ１４又はＴＬＲ４特異的な抗体）の超可変領域と、ヒト抗体の定常領域と有する修飾された抗体であってもよい。すなわち、上記結合メンバーはヒト定常領域を含んでなってもよい。超可変領域以外の可変領域は、ヒト抗体の可変領域に由来してもよく、及び／又は、モノクローナル抗体（例えばＴＬＲ１４又はＴＬＲ４特異的な抗体）に由来してもよい。このような場合、全ての可変領域はマウスモノクローナル抗体に由来してもよく、かかる抗体はキメラ化されていると称される。キメラ抗体を調製する方法は公知である。かかる方法としては、例えば米国特許第４８１６３９７号及び第４８１６５６７号（それぞれＢｏｓｓ及びＣａｂｉｌｌｙ）に記載の方法が挙げられる。
【０１０４】
モノクローナル抗体及び他の抗体を取得し、また組み換えＤＮＡ技術を使用して、元の抗体の特性が維持された他の抗体又はキメラ分子を産生することが可能である。かかる技術では、抗体の免疫グロブリン可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲｓ）をコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域、又は定常領域＋フレームワーク領域に導入する操作を行う。例えば、欧州特許出願公開第０１８４１８７号、英国特許出願公開第２１８８６３８Ａ号、又は欧州特許出願公開第０２３９４００号を参照のこと。ハイブリドーマ又は抗体を産生する他の細胞を、遺伝子突然変異又は他の改変のために使用してもよく、その際、産生される抗体の結合特異性が変化してもよく、又は変化しなくてもよい。
【０１０５】
特定の実施形態では、ＴＬＲ１４抑制性化合物が抗体である場合、当該抗体は治療上有効量で被験者に投与される。特定の実施形態では、上記治療上有効量は、１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００ｐｇ／ｋｇ及び５００ｐｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇから選択される範囲で抗体を含有する。
【０１０６】
抗体の産生：
ＴＬＲ１４又はＴＬＲ４に存在するエピトープとの親和性及び結合特性を有する、ＴＬＲ１４の機能的活性を制限する抗体を産生するための具体的方法は、上記のとおりである。
【０１０７】
また本発明の、及び本発明に用いられる抗体又は抗体断片は、化学合成によって、完全に、又は部分的に調製してもよい。抗体は、確立された、標準的な液体、又は好ましくは固相ペプチド合成方法に従い容易に調製でき、それらの一般的説明は一般に利用可能であり、当業者に周知である。更に、それらは溶液中で調製してもよく、又は固相、液相及び溶液中での化学合成の任意の組合せによって調製してもよい。
【０１０８】
本発明への使用に適する抗体又は抗体断片を調製するための他の簡便な方法は、それらをコードする核酸を、発現システム中にて核酸を用いて発現させることである。
【０１０９】
本発明で使用される核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含んでなってもよく、完全に、又は部分的に化学合成されたものであってもよい。好適な態様では、本発明で用いられる核酸は、上記した抗体又は抗体断片をコードする。当業者であれば、本発明の抗体又は抗体断片を十分に提供できる態様で、かかる核酸へ置換、欠失及び／又は付加を決定できる。
【０１１０】
本発明に用いられる抗体又は抗体断片をコードする核酸配列は、利用可能な核酸配列及びクローンが存在する場合には、本願明細書に記載された技術情報及び引用文献、並びに従来技術において公知の技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌら、（１９９２）を参照）を使用して、当業者によって容易に調製できる。これらの技術には、
（ｉ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、かかる核酸（例えばゲノム給源由来）の試料を増幅すること、
（ｉｉ）化学合成、又は
（ｉｉｉ）ｃＤＮＡ配列の調製。抗体断片をコードするＤＮＡは、当業者に公知のあらゆる適切な方法で調製し、使用できる。その方法は、コードＤＮＡを採取し、発現される部分の両側の適切な制限酵素認識部位を同定し、上記ＤＮＡから上記部分を切り出すことにより行われる。上記の部分を更に、市販の標準的な発現システムの適切なプロモータに、作動可能に連結させることができる。他の組換え方法は、適切なＰＣＲプライマーを用いてＤＮＡの関連部分を増幅することである。上記配列への修飾を行うことが可能であり、例えば、部位特異的突然変異導入を用いて、修飾されたペプチドを発現させるか、又は上記核酸の発現に用いる宿主細胞のコドン使用頻度に適合させることができる。
【０１１１】
上記の核酸は、プラスミド、ベクター、上記のような少なくとも１つの核酸を含む転写又は発現カセットの形の構築物として構成させることができる。上記の１つ以上の構築物を導入することにより、上記の構築物を組換え宿主細胞内に含有させてもよい。遺伝子発現は、適当な条件下で核酸を含む組換え宿主細胞を培養することによって、簡便に実施できる。抗体又は抗体断片を発現させて産生させた後、それらを、任意の適切な技術を、適切に使用して、単離及び／又は精製することができる。
【０１１２】
様々な異なる宿主細胞におけるクローニング及びポリペプチドの発現システムは、周知である。好適な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、酵母、昆虫及びバキュロウイルスの細胞系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現技術に利用可能な哺乳動物の細胞系としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒーラ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞などが挙げられる。一般的に好適な細菌宿主は、大腸菌である原核生物（例えば大腸菌）細胞における抗体及び抗体断片の発現は、当該技術において確立されている。培養液中の真核生物細胞における発現技術も、結合メンバーの産生用のオプションとして当業者が利用できる。
【０１１３】
例えば、一般的な抗体産生方法は当該技術分野の当業者に周知であり、例えばＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７、米国特許第４３７６１１０号、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（１９８８）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒなどに記載されている（それらの開示内容を本願明細書に援用する）。
【０１１４】
例えば、組換え抗体分子の調製技術は上記の引用文献、更には欧州特許出願公開第０６２３６７９号及び第０３６８６８４号に記載されている（それらの開示内容を本願明細書に援用する）。
【０１１５】
本発明の特定の実施形態では、抗体の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードするインサートを含んでなる組換え核酸を使用する。定義としては、かかる核酸は、一本鎖のコーディング核酸、前記コーディング核酸及びそれに対して相補的な核酸を含む二本鎖核酸、又はこれらの相補的な（一本鎖）核酸自体を含んでなる。
【０１１６】
更に、抗体の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする核酸は、酵素的に、又は化学的に合成された核酸であってもよく、それらは天然の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメイン、又はそれらの変異体の確実なコーディング配列を有する。
【０１１７】
組み換えＤＮＡ技術を用いて、本発明の抗体を改良することができる。すなわち、キメラ抗体を構築することにより、診断若しくは治療用途において、その免疫原性を減少させることが可能となる。更に、抗体をヒト化するのと同様の技術でＣＤＲ移植を行い、抗体を改変することによって、例えばブタなどのトランスジェニック生物の体内での免疫原性を最小にすることができる。かかる技術の例は、Ｗｉｎｔｅｒの欧州特許出願公開第０２３９４００号に記載されている。
【０１１８】
レシピエントにおける免疫原性を減少させるため、本発明では、ヒト定常ドメインに融合させた形で、抗体の重鎖可変ドメインをコードするインサートを含んでなる組換え核酸を使用できる。同様に、本発明は、ヒト定常ドメインのκ又はλ領域に融合させた形で、抗体の軽鎖可変ドメインをコードするインサートを含んでなる組み換えＤＮＡに関する。
【０１１９】
抗体遺伝子の突然変異導入によって抗体を産生させ、抗体の人工レパートリを生じさせてもよい。この技術により、抗体ライブラリの調製が可能となる。抗体ライブラリはまた、市販品を利用してもよい。ゆえに、本発明では、免疫グロブリン源として免疫グロブリンの人工レパートリ（好ましくは人工ｓｃＦｖレパートリ）を使用して、ＴＬＲ１４又はＴＬＲ４の特性を有する結合分子を同定するのが好適である。
【０１２０】
抗体選抜システム：
免疫グロブリン（ＴＬＲ１４又はＴＬＲ４と結合し、ＴＬＲ１４の生物学的機能を阻害することができ、ゆえに本発明の方法で使用できる）は、当業者に公知のあらゆる技術を使用して同定できる。かかる免疫グロブリンは、免疫グロブリンポリペプチドの人工レパートリを含んでなるライブラリから簡便に分離できる。「レパートリ」とは、核酸のレベルにおいて、１つ以上の鋳型分子のランダム、セミランダム又は誘導されたバリエーションから生じさせ、多数の結合特性を生じさせた、分子のセットのことを指す。レパートリを生じさせるための方法は、従来技術において周知である。
【０１２１】
あらゆるライブラリ選抜システムを、本発明と組み合わせて使用できる。大きいライブラリから所望のメンバーを単離するための選抜プロトコルは、従来技術において公知であり、ファージディスプレイ技術がその典型である。かかるシステム（多様なペプチド配列が糸状バクテリオファージの表面にディスプレイされる）は、抗体断片（及びそれらをコードするヌクレオチド配列）のライブラリの作製に有用であることが見出されており、それにより、標的抗原と結合する特異的な抗体断片のｉｎ ｖｉｔｒｏ選抜及び増幅が可能となる。ＶＨ及びＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列を、それらを大腸菌のペリプラズム誘導するためのリーダー配列をコードする遺伝子断片と連結し、その結果、得られる抗体断片はバクテリオファージの表面に、典型的にはバクテリオファージのコーティングタンパク質（例えば，ｐＩＩＩ又はｐＶＩＩＩ）に融合された形でディスプレイされる。あるいは、抗体断片はλファージのカプシド（ファージ本体）に外部的にディスプレイされる。ファージベースのディスプレイシステムの効果としては、それらが生物学的なシステムであるため、選択されたライブラリのメンバーを、細菌細胞中で、選択されたライブラリのメンバーを含んでなるファージを単に増殖させることにより増幅できることである。更に、ポリペプチドのライブラリのメンバーをコードするヌクレオチド配列がファージ又はファージミドベクターに含まれるため、その塩基配列決定、発現及び更なる遺伝子操作が比較的容易である。
【０１２２】
バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリの構築方法、及びλファージ発現ライブラリの構築方法は周知技術である（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８，５５２−５５４）。特に有利な１つの方法としては、ｓｃＦｖファージ−ライブラリの使用である（例えばＨｕｓｔｏｎら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡを参照のこと）。
【０１２３】
ファージ若しくは他のクローニングされたライブラリの使用の代替としては、選択された標的（例えば本発明においてはＴＬＲ２エピトープ）で免疫された動物のＢ細胞に由来する核酸（好ましくはＲＮＡ）を使用することである。
【０１２４】
Ｖ領域及びＣ領域のｍＲＮＡを単離することにより、抗体断片（例えばＦａｂ又はＦｖ）を細胞内で発現させることができる。簡潔には、ＲＮＡを免疫された動物のＢ細胞（例えば免疫されたマウスの脾臓又はラマの循環Ｂ細胞に由来する）から分離し、ＰＣＲプライマーを用いてＲＮＡプールから選択的にＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡを増幅させる。このようにして得られたＶＨ及びＶＬ配列を連結し、ｓｃＦｖ抗体を構成させる。ＰＣＲプライマー配列は、公開されているＶＨ及びＶＬ配列に基づく配列でもよい。
【０１２５】
ペプチド擬態物：
ペプチドの類縁体（例えばペプチド擬態物）は、鋳型のペプチドの代表的な特性を有する、非ペプチド化合物である。かかるペプチドの類縁体は典型的には、コンピュータによる分子モデリングを使用して開発される。ＴＬＲ１４との親和性及び結合特性を有し、エンドトキシン（例えばＬＰＳ）と結合して、共受容体複合体としてＴＬＲ４と会合するＴＬＲ１４の生物学的機能活性を阻害するペプチドと、構造的に類似するペプチド擬態物を使用して、かかるＴＬＲ１４に対する抑制機能を有すると決定されたポリペプチド及びタンパク質に類似する、予防的及び治療的効果を発揮させてもよい。
【０１２６】
ペプチド擬態物は典型的には、鋳型ペプチドと構造的に類似するが、周知の代替的な結合で、１つ以上のペプチド結合が置換されている。例えば、ＴＬＲ１４エピトープに対する結合特性を有するペプチドを、アミド結合の置換、非ペプチド部分の導入、又は骨格の環化により修飾する。最適には、システインが存在する場合、この残基のチオールをキャッピングして、遊離スルフェート基の損傷を保護する。ペプチドは更に、天然の配列の修飾により、当該ペプチドのプロテアーゼによる攻撃から保護してもよい。
【０１２７】
最適には、本発明のＴＬＲ１４抑制性化合物として使用されるペプチドを、少なくとも１つのＣ末端及び／又は、Ｎ末端のキャッピング、及び／又はシステイン残基のキャッピングを用いて、更に修飾してもよい。更に、本発明に用いられるペプチドを、アセチル基により、Ｎ末端残基のキャッピングを行ってもよい。最適には、本発明のペプチド、及び本発明で用いられるペプチドを、アミド基により、Ｃ末端のキャッピングを行ってもよい。最適には、システインのチオール基を、アセタミドメチレン基でキャッピングする。
【０１２８】
コンビナトリアルライブラリ：
コンビナトリアルライブラリ技術（Ｓｃｈｕｌｔｚ，ＪＳ（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１２：７２９−７４３）により、ポリペプチドの活性（本発明ではＴＬＲ１４の生物学的活性）を調節する能力に関して、非常に膨大な数の異なる物質を試験する効率的な方法が提供される。活性の調節、あるいはそれに関するスクリーニングの前に、試験化合物を、ポリペプチドと相互作用する能力に関して、例えば酵母ツーハイブリッドシステム（ポリペプチドと試験化合物の両方をコードする核酸が、酵母において発現できることが必要）により選抜してもよい。これは、試験物質が実際にポリペプチドの活性を調節する能力を有するかの試験を行う前の、大雑把なスクリーニングとして使用できる。
【０１２９】
本発明のアッセイに添加できる試験物質又は化合物の量は通常、使用する化合物のタイプに応じて、試行錯誤により決定される。典型的には、推定の阻害化合物を約０．０１〜１００ｎＭの濃度、例えば０．１〜１０ｎＭで使用できる。ペプチドが試験物質である場合は、より高い濃度で使用できる。
【０１３０】
抑制性ポリペプチドの産生：
特定の更なる態様において、ＬＰＳと結合して、ＴＬＲ４と複合体形成する、ＴＬＲ１４の生物学的機能を阻害する化合物は、ポリペプチドである。適切なポリペプチドの発現、単離及び精製は、あらゆる適切な技術によって実施できる。
【０１３１】
ポリペプチドを産生する方法は、ポリペプチドの発現を促進する条件下で、当該ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養するステップと、次に培養液から発現されたポリペプチドを回収するステップとを有してなる。当業者であれば、発現されたポリペプチドを精製する手順が、使用する宿主細胞のタイプ、及び、当該ポリペプチドが細胞内型か、膜結合型か又は宿主細胞から分泌される可溶化型であるか、などの要因に応じて変化しうることを認識するであろう。
【０１３２】
いかなる適切な発現システムを使用してもよい。当該ベクターは、本発明のポリペプチド又は断片をコードするＤＮＡを、適切な転写若しくは翻訳調節ヌクレオチド配列（例えば哺乳動物、鳥類、微生物、ウィルス、細菌又は昆虫遺伝子由来）に作動可能に連結された形で含んでなる。制御配列が機能的にＤＮＡ配列と関連しているとき、当該ヌクレオチド配列は作動可能に連結されているという。すなわち、プロモータのヌクレオチド配列がＤＮＡ配列の転写を制御する場合、当該プロモータヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列に作動可能に連結している。一般には、所望の宿主細胞（大腸菌）において複製する能力を付与する複製開始点、及び形質転換体を同定するための選抜遺伝子を、上記発現ベクターに組み込む。
【０１３３】
更に、適当なシグナルペプチド（天然若しくは非相同）をコードする配列を、発現ベクターに組み込んでもよい。シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列を、本発明の核酸配列にインフレームで融合させ、ＤＮＡを最初に転写させ、次にｍＲＮＡを翻訳させてシグナルペプチドを含んでなる融合タンパク質を産生させてもよい。目的の宿主細胞において機能的なシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外への分泌を促進する。シグナルペプチドは、翻訳の間にポリペプチドから切断除去されるが、細胞からのポリペプチドの分泌を可能にする。
【０１３４】
好適なポリペプチドの発現に用いる宿主細胞としては、高等真核生物細胞及び酵母が挙げられる。原核細胞系も適切である。哺乳動物細胞、特にＣＨＯ細胞は、宿主細胞としての用途に特に好適である。哺乳動物、原核生物、酵母、菌類及び昆虫細胞を宿主として用いる際の、適切なクローニング及び発現ベクターは、例えばＰｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８６）（ＩＳＢＮ０４４４９０４０１８）に記載されている。
【０１３５】
小分子：
特定の更なる実施態様において、ＴＬＲ１４の生物学的機能を阻害する化合物は、小分子であってもよい。
【０１３６】
非ペプチド性の「小分子」は通常、多くのｉｎ ｖｉｖｏでの医薬用途において好適である。したがって、ＴＬＲ１４発現又は生物学的機能を阻害するものとして、本発明のアッセイ方法のいずれか１つに従い同定された擬態物、又は擬態化合物を、医薬用途に応じて適宜設計してもよい。周知の薬理学的活性化合物の擬態物を設計することは、「リード」化合物をベースとする医薬開発のための、周知のアプローチである。これは、上記活性化合物の合成が困難若しくは高価である場合、又は、それが特定の投与方法にとり不適当である場合（例えばペプチドは、消化管内のプロテアーゼにより急速に分解する傾向を有するため、経口投与用組成物の活性成分としては不適切である）に好適であると考えられる。擬態物の設計、合成及び試験を用いることにより、多数の分子を、特定の性質に関してランダムスクリーニングする煩雑さを回避できる。
【０１３７】
所定の目的の特性を有する化合物から擬態物を設計する際、幾つかのステップが一般的に採られる。第１に、目的の特性の決定にとり決定的及び／又は重要である化合物の特定部分を決定するステップである。ペプチドの場合、これはペプチドのアミノ酸残基を系統的に変異させること（例えば各残基を順次置換すること）によって実施できる。化合物の活性領域を構成するこれらの部分又は残基は、その「ファルマコフォア」として公知である。
【０１３８】
ファルマコフォアが決定された後、その構造を、その物理的性質に従って、例えばスペクトル解析、Ｘ線回折データ及びＮＭＲなどの様々なソースから得た、例えば立体化学、結合、サイズ及び／又は荷電などのデータを使用してモデル化する。コンピュータ分析、類似性マッピング（原子間の結合よりも、むしろ荷電及び／又はファルマコフォアの量をモデル化する）、及び他の技術を、このモデリングプロセスで使用できる。
【０１３９】
この方法の変法において、リガンドの三次元構造及びその結合パートナーをモデル化する。リガンド及び／又は結合パートナーが結合形態を変化させる場合、これは特に有用であり、そのモデルは擬態物の設計に利用できる。
【０１４０】
次に、ファルマコフォアを模倣する化学基がグラフトされている鋳型分子を選抜する。鋳型分子及びそこにグラフトされた化学基は、当該擬態物が容易に合成でき、薬理学的に許容できると考えられ、ｉｎ ｖｉｖｏで分解されず、一方、リード化合物の生物学的活性が維持されるものを、簡便に選択できる。この方法によって発見された１つ以上の擬態物を次に、それらが目的の特性を有するか否か、又はそれらがそれをどの程度示すかに関してスクリーニングできる。更なる最適化又は変形を実施して、ｉｎ ｖｉｖｏ又は臨床試験のための、１つ以上の最終的な擬態物を得ることができる。
【０１４１】
抑制性核酸分子：
本発明は、ＴＬＲ１４遺伝子産物の発現を抑制する化合物又は組成物を投与することによって、エンドトキシンにより媒介されるＴＬＲ４媒介性のシグナル伝達を抑制する方法を包含する。
【０１４２】
ＴＬＲ１４の発現抑制は、当業者に周知の多くの技術を使用して実施できる。例えば、限定されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡからなる群から選択される抑制性の核酸により、抑制が媒介されうる。
【０１４３】
すなわち、特定の更なる態様では、本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現を遮断する、治療上有効量の抑制性核酸を被験者に投与することによって、ＴＬＲ４媒介性の炎症症状の予防及び／又は治療方法を包含する。
【０１４４】
本願明細書に定義され、ＴＬＲ１４遺伝子の発現に関して用いられる用語「遮断する」び「遮断」とは、Ｔｏｌｌ様受容体１４タンパク質の発現に結びつく少なくとも１つの遺伝子の発現を停止させること（サイレンシング、ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）を意味する。遺伝子サイレンシングとは、遺伝子組み換え以外の機構による、遺伝子発現のスイッチオフのことである。遺伝子サイレンシングは、転写レベルで、又は転写後のレベルで媒介されうる。転写レベルでの遺伝子サイレンシングにより、転写機構が遺伝子に到達できなくなり、それは例えばヒストンの修飾により媒介されうる。転写後の遺伝子サイレンシングにより、遺伝子に由来するｍＲＮＡの破壊が行われ、それにより、活性を有する遺伝子産物、例えばタンパク質（本発明ではＴＬＲ−１４タンパク質）の生成が抑制される。
【０１４５】
したがって、本発明は更に、有効量の、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）剤などの抑制性核酸分子を被験者に投与して（例えばリボ核酸（例えばｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ）、又はその転写鋳型（例えばｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ）を被験者に存在する少なくとも１つの細胞種、組織又は器官に投与して）、ＴＬＲ１４タンパク質の発現を遮断する方法を包含する。
【０１４６】
特定の更なる実施態様において、上記の抑制性核酸分子は、アンチセンスＲＮＡ分子でもよい。アンチセンスとは、遺伝子発現の抑制を行う方法であり、物理的にｍＲＮＡと結合し、ｍＲＮＡからの翻訳を遮断する一本鎖ＲＮＡ断片が用いられる。
【０１４７】
抑制性の核酸として使用するための、適当な核酸を調製する技術は、当業者に周知であり、以下に詳細に記載する。
【０１４８】
本発明の更に別の態様は、ＴＬＲ４媒介性の炎症症状の治療及び／又は予防用の、Ｔｏｌｌ様受容体１４タンパク質の発現を遮断する薬剤の調製への、抑制性核酸の使用の提供に関する。特定の実施形態では、上記ＴＬＲ４媒介性の炎症症状は、敗血症である。
【０１４９】
様々な本発明の態様は、ＴＬＲ１４遺伝子発現のサイレンシングのための抑制性核酸の使用の提供に関する。
【０１５０】
二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）又は転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）と称されるプロセスを介して、強力かつ特異的な遺伝子サイレンシングを誘導する。ＲＮＡｉは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称される、配列特異的な、マルチコンポーネントのヌクレアーゼにより媒介され、それは、サイレンシングトリガーに相同なメッセンジャーＲＮＡを破壊する。ＲＩＳＣは、二本鎖ＲＮＡトリガーに由来する短鎖ＲＮＡ（約２２ヌクレオチド）を含むとして公知である。
【０１５１】
ＲＮＡｉは、哺乳動物細胞系をはじめとする多数の系において、機能損失を解析するための方法の１つの選択肢となっている。大部分の哺乳動物細胞系における遺伝子の特異的なサイレンシングには、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が用いられる。その理由は、大きいｄｓＲＮＡｓ（＞３０塩基対）では、インターフェロン応答が誘発され、非特異的な遺伝子サイレンシングが生じるからである。
【０１５２】
使用されるＲＮＡｉ剤は、小分子のリボ核酸分子（また本明細書では干渉リボ核酸と称す）、すなわちオリゴリボヌクレオチドであり、それらはデュプレックス構造（例えば各々ハイブリダイズした、２つの異なるオリゴリボヌクレオチドか又は単一のリボオリゴヌクレオチド）で存在し、小さいヘアピンを形成してデュプレックス構造を生じさせると考えられる。「オリゴヌクレオチド」とは、約１００ヌクレオチド（ｎｔ）長を超えないリボ核酸を意味し、典型的には、約７５のヌクレオチド長を超えず、特定の実施形態では約７０未満のヌクレオチド長である。本願明細書に記載されているように、本発明に用いられるデュプレックス構造の長さは、典型的には約１５〜３０塩基対であり、好ましくは約１５〜２９塩基対である。
【０１５３】
本願明細書の「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）などのポリヌクレオチド、及び、必要に応じてリボ核酸（ＲＮＡ）を指すこともある。上記の用語はまた、記載されている実施態様に適用できる場合は、一本鎖（センス又はアンチセンス）及び二本鎖ポリヌクレオチドを包含するものと理解すべきである。
【０１５４】
核酸又は遺伝子配列に関する「発現」という用語は、遺伝子の転写、及び（適当な場合は）得られるｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を意味する。すなわち、前後関係から自明のように、タンパク質をコードする配列の発現は、コード配列の転写及び翻訳の結果である。
【０１５５】
「遺伝子発現の阻害」とは、標的遺伝子に由来するタンパク質のレベル及び／又はｍＲＮＡ生成物の不存在（又は観察可能な減少）を指す。「特異性」とは、細胞内の他の遺伝子に対して顕著に影響を与えることなく、標的遺伝子を阻害する能力のことを指す。阻害の有無の確認は、例えば当業者に周知の技術を用いて実施することができ、例えば、ノーザンブロット、逆転写、マイクロアレイによる遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、標識免疫アッセイ（ＲＩＡ）、他のイムノアッセイ、及び蛍光活性化細胞分取法（ＦＡＣＳ）などが挙げられる。細胞系又は生物体全体における、ＲＮＡ媒介性の阻害の際、タンパク質産生物が容易にアッセイされるレポーター遺伝子又は薬剤耐性遺伝子を用いることにより、遺伝子発現を容易にアッセイできる。
【０１５６】
上記のアッセイによってＴＬＲ１４遺伝子の発現量を定量することにより、本発明の処理を受けない細胞と比較し、１０％超、３３％超、５０％超、９０％超、９５％超又は９９％超の程度の阻害が測定できる。活性薬剤の低い投与量、及び活性薬剤の投与後の長時間の経過により、より少ない割合の細胞において阻害が行われる（例えば少なくとも１０％、２０％、５０％、７５％、９０％又は９５％の標的細胞）。細胞内の遺伝子発現の定量により、標的ｍＲＮＡの蓄積又は標的タンパク質の翻訳レベルにおける、同様の阻害の程度が示されうる。例えば、阻害効率は、細胞内の遺伝子産物の量を評価することにより測定できる（すなわち、ｍＲＮＡは抑制性二本鎖ＲＮＡのために使用される領域外のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブにより検出でき、又は、翻訳されたポリペプチドは、その領域のポリペプチド配列を抗原として作製した抗体により検出できる）。
【０１５７】
ＲＮＡｉ：
したがって、上記のように、本発明の一態様は、適切なタイプの細胞において、ＴＬＲ１４の発現を阻害又は抑制するための、ＲＮＡｉの使用方法の提供に関する。「発現の阻害」という用語は、ＴＬＲ１４遺伝子又はコード配列の発現レベルが、コントロールと比較し、少なくとも約２倍、通常少なくとも約５倍（例えば１０倍、１５倍、２０倍、５０倍、１００倍以上）低下又は阻害されることを意味する。特定の実施形態では、標的ＴＬＲ１４遺伝子／コード配列の発現が効果的に阻害される程度まで、ＴＬＲ１４標的遺伝子の発現が低下する。この場合、標的遺伝子の発現の阻害とは、コード配列（例えばゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡなど）のタンパク質などのポリペプチド産生物（本発明ではＴＬＲ１４）への転写又は翻訳が阻害されることを意味する。
【０１５８】
特定の実施形態では、干渉リボ核酸（例えば上記のｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ）であるＲＮＡｉ剤の代わりに、当該ＲＮＡｉ剤は、上記の干渉リボ核酸（例えばｓｈＲＮＡ）をコードするものであってもよい。換言すれば、ＲＮＡｉ剤は、干渉リボ核酸の転写鋳型であってもよい。これらの実施形態では、上記転写鋳型は典型的には干渉リボ核酸をコードするＤＮＡである。ＤＮＡはベクターに存在してもよく、またプラスミドベクター、ウィルスベクターなどの様々なベクターが公知である。
【０１５９】
ＴＬＲ１４を発現する細胞へのＲＮＡｉ剤の投与は、ウィルスベクターによって、又は当業者に公知の他のプロトコルにより実施できる。例えば、上記の核酸をマイクロインジェクション、又はリポソーム融合によって細胞に導入してもよい。例えば、ＲＮＡｉ剤は、標的細胞に直接注入できる。上記ＲＮＡｉ剤は、細胞あたり少なくとも１コピーで送達される量で導入してもよい。上記ＲＮＡｉ剤を高濃度（例えば少なくとも５、１０、１００、５００又は１０００コピー／細胞）で投与することにより、より有効な阻害をなしうる。また、特殊な用途においては低用量が有用である。
【０１６０】
アンチセンス：
また、本発明は、ＴＬＲ１４の発現サイレンシングに用いられるアンチセンス核酸の提供に関する。アンチセンス試薬は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）、特に天然の核酸を化学的に修飾した合成ＯＤＮであってもよく、又はＲＮＡとしてのかかるアンチセンス分子を発現する核酸構築物であってもよい。アンチセンス配列は、標的のＴＬＲ１４遺伝子のｍＲＮＡと相補的で、標的のＴＬＲ１４遺伝子産物の発現を阻害する。
【０１６１】
アンチセンス分子は様々なメカニズム、例えば、ＲＮＡｓｅＨの活性化又は立体障害を通じて、翻訳に利用されるｍＲＮＡの量を減少させることによりにより遺伝子発現を阻害する。１つのアンチセンス分子又はその組合せを投与してもよく、その組合せは複数の異なる配列を含んでなってもよい。アンチセンス分子は、アンチセンス鎖がＲＮＡ分子として生じるように転写方向が調整された適切なベクター中で、標的ＴＬＲ１４遺伝子配列の全て又は一部を発現させることにより、生じさせることができる。あるいは、上記アンチセンス分子は、合成オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは一般に、少なくとも約７、通常少なくとも約１２、好適には少なくとも約１６ヌクレオチド長であり、約５００以下、通常約５０以下、好適には約３５ヌクレオチド長以下であり、そのヌクレオチド長は、阻害効率、特異性、交差反応性の欠如などの要因に依存する。短いオリゴヌクレオチド（７〜８塩基長）が、遺伝子発現を強力かつ選択的に阻害しうることが解明されている（Ｗａｇｎｅｒら、（１９９６），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４０−８４４を参照）。
【０１６２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、公知の方法によって化学的に合成できる（Ｗａｇｎｅｒら、（１９９３）上記、及びＭｉｌｌｉｇａｎら、上記、を参照）。それらの細胞内安定性及び結合親和性を改善するために、好適なオリゴヌクレオチドを基に、天然のリン酸ジエステル構造を化学的に修飾する。多くのかかる修飾が文献に記載され、それらは骨格、糖又は複素環状塩基の化学構造を変化させるものである。
【０１６３】
可溶性タンパク質：
特定の更なる実施態様において、Ｔｏｌｌ様受容体１４の生物学的機能を阻害する化合物は、可溶性タンパク質（典型的には可溶化型のＴＬＲ１４）である。
【０１６４】
可溶性ポリペプチドは、それらが発現された細胞から分泌されうる。一般に、可溶性ポリペプチドは、所望のポリペプチドを発現する完全な細胞を、培地から、例えば遠心分離により分離して、所望のポリペプチドの存在に関して培地（上清）をアッセイすることにより同定できる（また、非可溶性の膜結合型の相対物と区別できる）。培地中のポリペプチドの存在は、ポリペプチドが細胞から分泌され、すなわち可溶化型のタンパク質であることを示す。
【０１６５】
本願明細書に定義される配列番号２のアミノ酸配列は、配列番号１に定義されるＴＬＲ１４の配列の、可溶化型のアミノ酸配列を示し、すなわち、予測された膜内外領域及びＣ末端が除去されている。この可溶化型のＴｏｌｌ様受容体１４は、競争的にＬＰＳと結合することによって、膜結合型Ｔｏｌｌ様受容体１４の生物学的機能を抑制する機能を発揮でき、これにより、膜結合型ＴＬＲ１４とＬＰＳとの会合が減少し、その結果、ＬＰＳにより媒介されたＴｏｌｌ様受容体４の活性化が減少する。発明者らは、この場合、エンドトキシン（例えばＬＰＳ）と会合した可溶化型のＴＬＲ１４は、共受容体としてＴＬＲ４と複合体を形成しないと予想している。
【０１６６】
特定の実施形態では、可溶化型のＴＬＲ１４は、融合タンパク質として提供してもよい。特定の実施形態では、前記融合タンパク質は、ＴＬＲ１４受容体の可溶性部分、典型的にはその細胞外領域若しくは一部分（例えば配列番号２のアミノ酸配列を有する）と、それに結合する第２のペプチドを含んでなる。特定の実施形態では、上記の第２のペプチドは免疫グロブリンに由来し、典型的には免疫グロブリン（典型的にヒト免疫グロブリン）の重鎖に由来するＦｃ受容体結合タンパク質である。融合タンパク質中にＦｃ領域を含ませることにより、治療用タンパク質の循環半減期が延長される。
【０１６７】
可溶性ＴＬＲ１４アミノ酸配列及び免疫グロブリンＦｃ受容体結合部分は、あらゆる適切な方法により結合させてもよく、典型的には共有結合により連結させる。しかしながら、非共有結合を用いてもよい。あるいは、ポリペプチド配列を直接結合してもよく、又は結合部分又はスペーサにより結合してもよい。免疫グロブリンに由来するヒンジ領域などのリンカー部分を用いてもよい。上記のヒンジ領域は、抗原性ポリペプチドを定めるアミノ酸と、免疫複合体のＦｃＲ結合ポリペプチドを定めるアミノ酸とを連結するのみならず、免疫複合体の柔軟性を増加させることにより結合特異性を改善する。典型的には、上記リンカーは主にスペーサとして機能する。典型的には、上記リンカーは、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸を含んでなる。上記のリンカーは、例えば１〜２０個のアミノ酸を含んでなってもよい。最適には、上記のリンカーは、立体障害のないアミノ酸残基（グリシン及びアラニンなど）を含んでなってもよい。リンカー部分の適切な形態を、以下に記載する。
【０１６８】
免疫複合体中の抗原性断片を定めるアミノ酸を、そのＮ（アミノ）末端又はＣ（カルボキシル）末端のリンカー部分に連結させてもよい。適切なコンジュゲート及び結合方法は当業者に周知であり、例えばＦｃポリペプチドのシステイン残基を利用したチオエステル架橋によるコンジュゲーションなどが挙げられる。あるいは、コンジュゲーションは例えば、ヘテロ二官能性架橋剤（スクシンイミジルエステル（例えば、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート又はスクシンイミジルアセチルチオアセテート、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社．Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第５章、５．３節）などの化学的架橋分子）を使用して行ってもよい。
【０１６９】
Ｆｃ結合ポリペプチドへの抗原性断片のコンジュゲーションにおいて有用な更なる技術としては、国際公開第９４／０４６９０号パンフレット及び第９６／２７０１１号パンフレットに記載の技術が挙げられる。
【０１７０】
コンジュゲーションは更に、従来技術において周知の組み換えＤＮＡ技術を用いた、遺伝子的手段によって実施でき、かかる技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ ｅｄ．Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１．１０１−１０４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｊ．Ｗｉｌｅｙ Ｐｒｅｓｓ（２００６）などに開示されている（それらの関連する部分を本願明細書に援用する）。
【０１７１】
複合薬剤：
上記のように、本発明の特定の態様は、複合薬剤に関するものであり、その際の組成物又は方法は、ＴＬＲ１４の生物学的機能活性を阻害する化合物の投与に関連し、それらは、ＣＤ１４活性を抑制するのに有用な、少なくとも１つの更なる治療用化合物と組み合わせて投与される。
【０１７２】
典型的には、第１の治療組成物と第２の治療組成物は、同時に投与される。特定の実施形態では、上記の第１の治療組成物（すなわちＴＬＲ１４の機能活性をアンタゴナイズする化合物）と第２の治療化合物は、一度に投与される。特定の更なる実施態様において、それらは順次投与される。
【０１７３】
特定の実施形態では、上記複合薬剤は、ＴＬＲ１４の機能的阻害剤（例えば抗体、ペプチド、小分子又はペプチド擬態物）を含んでなってもよく、更に以下の少なくとも１つと共に被験者に共投与される：ＣＤ１４阻害剤、サイトカイン阻害剤（限定されないが例えばＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８及びＩＬ−１５の阻害剤）、及び腫瘍壊死因子阻害剤、成長因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、酵素阻害剤、代謝阻害剤、細胞障害剤、又は細胞増殖抑制剤。
【０１７４】
当業者であれば、被験者に対する複合薬剤の投与は、治療薬の投与量を低くすることが可能となり、また関連する治療的効果を被験者に提供することが可能となるため、有利であることを認識するであろう。複合薬剤の投与量が少ないことにより、投与化合物に由来する毒性に対する被験者の曝露レベルも低いものとなる。更に、本発明に係る、複合薬剤の一部として投与される第２の治療化合物は、異なる経路を標的とするため、全体的な治療効果が相乗的に向上すると考えられる。治療効果の向上により、必要となる投与量を低くでき、またそれにより毒性を減少させることができる。
【０１７５】
ＣＤ１４の生物学的機能的な活性を抑制するのに用いられる第２の化合物としては、限定されないが、可溶化型のＣＤ１４、ペプチド阻害剤、小分子、融合タンパク質若しくはリガンド、並びに抗体などが挙げられる。
【０１７６】
医薬組成物：
本発明は、ＴＬＲ１４の発現又は生物学的機能的な活性を阻害する化合物を含んでなる医薬組成物を包含する。本発明に係る、及び本発明に使用される医薬組成物は、活性成分（すなわちＴＬＲ１４の発現又は生物学的活性の阻害剤）に加えて、当業者に周知の薬理学的に許容できる賦形剤、担体、緩衝剤又は他の物質を含んでなってもよい。適切な医薬用の担体としては、例えば水、グリセロール、エタノールなどが挙げられる。
【０１７７】
本発明のモノクローナル抗体又は融合タンパク質は、あらゆる適切な経路を経て、治療を必要とする患者に投与できる。本願明細書において詳述されるように、上記の組成物は、注射又は点滴によって、非経口的に投与されるのが好ましい。好適な非経口投与経路の例としては、限定されないが、静脈内、心臓内、動脈内、腹膜内、筋肉内、経粘膜、腔内、皮下、吸入又は経皮投与経路が挙げられる。
【０１７８】
更なる投与経路としては、局所及び腸内投与（例えば経粘膜（肺内を含む）、経口、鼻腔内、直腸内）が挙げられる。
【０１７９】
上記の製剤は、液体（例えば非リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．８−７．６）を含んでなる）であってもよく、又は凍結乾燥粉末であってもよい。
【０１８０】
特定の実施形態では、上記の組成物は、注射可能な組成物として送達することができる。静脈内、皮内、皮下投与の場合、上記の活性成分を、パイロジェンフリーの、適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する、非経口投与可能な水溶液の形態に調製する。当業者であれば、例えば塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液又は乳酸リンガー注射液などの等張ビヒクルを使用して、適切な溶液を調製できる。
【０１８１】
必要に応じて、防腐剤、安定化剤、緩衝剤、酸化防止剤及び／又は他の添加を含有させてもよい。
【０１８２】
上記の組成物は、血液などの特定の組織に配置させた微小球体、リポソーム、他の微粒子送達システム、又は持続放出製剤を介して投与してもよい。
【０１８３】
本発明に使用できる上記の技術及びプロトコルの例、並びに他の技術及びプロトコルは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、 ２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ ＩＳＢＮ０−９１２７３４−０４−３、及びＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、 Ａｎｓｅｌ，Ｈ．Ｃ．ら、７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ＩＳＢＮ０−６８３３０５−７２−７に記載されており、それらの全開示内容を本願明細書に援用する。
【０１８４】
投与計画において、本発明の組成物の単回投与、又は当該組成物の複数回投与を含めることができる。上記組成物は更に、本発明の融合タンパク質を投与して治療しようとする症状の治療に用いられる他の治療薬及び薬剤と共に、順次、又は別個に投与できる。
【０１８５】
実際の投与量、並びに投与の速度及び時間−経路は、治療対象の性質及び重篤度に依存する。治療の処方（例えば投与量の決定など）は、最終的には一般開業医及び他の医師の責任及び裁量の範囲内で行われ、また典型的には、治療しようとする障害、個々の患者の症状、送達部位、投与方法及び医療関係者公知の他の要因を考慮して行われる。
【０１８６】
特に明記しない限り、本願明細書において用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本発明の技術分野に属する当業者に一般的に理解されている意味で用いられる。
【０１８７】
明細書全体にわたり、文脈による限定がない限り、用語「含んでなる」又は「含有する」、又はその活用形（例えば「含んでなって」又は「含んでなること」、「含有して」又は「含有すること」）は、明記された整数又は整数の群を包含することを意味するが、他のいかなる整数又は整数の群を除外するものではないとして理解されるものとする。
【０１８８】
本明細書で用いられる用語「１つの」及び「上記」などは、文脈から特に限定されない限りは、それが示すものの単数形及び複数形を包含するものとする。すなわち、例えば「活性薬剤」又は「医薬活性薬剤」というときは、単一の活性薬剤、並びに２つ以上の異なる活性薬剤の組み合わせが包含され、一方、「担体」というときは、単一の担体、並びに２つ以上の担体の混合物が包含される。
【０１８９】
本発明の融合タンパク質のポリペプチド成分を記載するための命名法は、従来の慣習に従って行われ、アミノ基（Ｎ）が各アミノ酸残基の左に存在し、カルボキシル基が右側に存在する。
【０１９０】
本明細書で用いられる「アミノ酸」という表記には、天然及び合成アミノ酸、並びに、Ｄ型及びＬ型の、いずれのアミノ酸も包含されるものとする。合成アミノ酸にはまた、化学修飾されたアミノ酸（限定されないが塩、及びアミドなどのアミノ酸誘導体などを含む）が包含される。本発明のポリペプチドに含まれるアミノ酸は、他の化学基によるメチル化、アミド化、アセチル化又は置換により修飾されることができ、それにより、その生物学的活性に悪影響を与えることなく、循環半減期を改変することができる。
【０１９１】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本願明細書において同義的に用いられ、ペプチド結合又は修飾ペプチド結合（例えばアイソスター）により共有結合した、少なくとも２つの一連のアミノ酸を表すものとする。ペプチド又はタンパク質中に含有させるができるアミノ酸の最大数は、特に限定されない。更に、用語「ポリペプチド」は、ペプチドの断片、類縁体及び誘導体を包含し、前記断片、類縁体又は誘導体は、当該断片、誘導体又は類縁体が由来するペプチドと同じ生物学的機能活性を保持している。
【０１９２】
本願明細書の用語「治療上有効量」とは、ＴＬＲ４媒介性の炎症症状を抑制するのに必要となる、本発明の物質、結合化合物、小分子、融合タンパク質又はペプチド擬態物の量を意味する。
【０１９３】
本願明細書の用語「予防上有効量」とは、ＴＬＲ４媒介性の炎症症状（例えば敗血症）の最初の発症、進行又は再発を防止するのに必要となる組成物の量のことを指す。
【０１９４】
本願明細書の用語「治療」、及び関連する用語「治療する」及び「治療すること」とは、ＴＬＲ４又はＴＬＲ１４媒介性の症状又はその少なくとも１つの徴候の、進行、重篤度及び／又は持続期間を減少させることを意味し、上記の減少（又は改善）は、ＴＬＲ４と、共受容体としてのＴＬＲ１４との会合を崩壊させるか又は防止する化合物の投与の結果として生じる。
【０１９５】
したがって、「治療」という用語は、被験者にとり有益なあらゆる療法計画のことを指す。上記の治療は、既存の症状に関するものであってもよく、又は予防的なもの（予防的治療）であってもよい。治療には、治癒的、軽減的又は予防効果が包含されうる。本願明細書における「治療的」及び「予防的」処置とは、それらの最も広義の意味において解釈されるものとする。「治療的」の用語は、必ずしも被験者が完全な回復を遂げるまで治療されることを意味するものではない。同様に、「予防的」とは、必ずしも被験者が最終的に疾患症状に至らないことを意味するものではない。
【０１９６】
本願明細書の用語「被験者」とは、動物（好ましくは哺乳糖物、特にヒト）を指す。特定の実施形態では、上記の被験者は哺乳動物、特にヒトである。用語「被験者」は、本明細書で用いられる用語「患者」と同義である。
【０１９７】
以下の実験技術及びプロトコルを、本発明の実施例において用いる。
【０１９８】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ：
Ｕ３７３細胞を、９６ウェルプレート（ウェルあたり２×１０4細胞）に播き、その翌日、空のベクター又はＴＬＲ１４発現ベクター（５０ｎｇ）、並びに、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ内部コントロールプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社）４０ｎｇと共にＮＦ−ｋＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）８０ｎｇを用いてトランスフェクションした。ＧＥＮＥＪＵＩＣＥ（商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、製造業者の指示に従い、一過的にトランスフェクションした。２４時間後に細胞を、１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で、ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ社）で６時間刺激した。細胞を更に受動的な溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ社）中に添加し、レポーター遺伝子活性をルミノメーターで測定した。データを、コントロールのレベルに対する平均誘導倍率±ＳＤとして表し、代表的な実験の場合は３つの別々の実験（各々３回実験を行う）の最小値として表した。
【０１９９】
ｓｉＲＮＡベースのＴＬＲ１４ノックダウン：
ＴＬＲ１４に対する結合特性を有する市販のｓｉＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社及びＱｉａｇｅｎ社から購入した。ヒト星状細胞腫Ｕ３７３細胞を、５×１０4細胞／ｍｌの濃度で、１０ｃｍのシャーレにおいて準備した。次の日、細胞を、製造業者の指示に従い、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して、ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。４８時間後に細胞から培地を除去し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルバッファを直接プレートに添加した。サンプルを超音波破壊し、５分間ボイルし、１３０００回転／分で１分間遠心分離した。サンプルを次にＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより解析した。ＩｋＢα及びホスホｐ３８に対する抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ社から購入した。ＴＬＲ４抗体はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ社から購入した。
【０２００】
ＴＨＰ１を用いる実験において、Ａｍａｘａベースのトランスフェクションシステム（プログラムＳ−０１９）を使用して、ＴＬＲ１４（Ｑｉａｇｅｎ）に特異的なｓｉＲＮＡにより細胞をトランスフェクションした。７２時間後に、ＴＬＲ１４のノックダウンをウエスタンブロッティングにより確認した。スクランブルしたＱｉａｇｅｎ ｓｉＲＮＡをネガティブコントロールとして使用して、ｓｉＲＮＡがＴＬＲ１４に特異的であったことを確認した。細胞を、示された時間にわたり、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで処理し、ＩｋＢ分解をウエスタンブロッティングで測定した。サイトカイン測定が関係する実験の場合、７２時間後に、細胞を２４時間にわたり１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激した。上清を除去し、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αＥＬＩＳＡｓを実施した。
【０２０１】
ＬＰＳ結合アッセイ：
ＨＥＫ２９３細胞を、１×１０5細胞／ｍｌで、１０ｃｍのプレートに播いた。翌日、細胞をＴＬＲ１４発現プラスミド３μｇによってトランスフェクションした。２４時間後に、１％のＮＰ４０を含んでなる８００μｌのＨｅｐｅｓバッファ中で細胞を溶解させた。細胞可溶化物を、非標識のＬＰＳの有無において、１μｇ／ｍｌの最終濃度のビオチン−ＬＰＳ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）で、室温で１時間インキュベートした。ストレプトアビジン−アガロースビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ社）をＰＢＳで２回洗浄し、サンプルに添加した（４０μｌ／ポイント）。１時間後に、ビーズを溶解緩衝液で３回洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファ２０μｌ中に再懸濁した。タンパク質のサンプルを、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、ニトロセルロース膜へ転写し、ウエスタンブロッティングを行った。得られるブロットを、抗ＴＬＲ１４抗体をプローブとして解析した。
【実施例】
【０２０２】
実施例１：ＬＰＳシグナル伝達へのＴＬＲ１４の関与：
ＬＰＳに反応する星状細胞腫細胞系（Ｕ３７３）において、レポーター遺伝子アッセイを実施した。５０ｎｇの空のコントロールベクター又はＴＬＲ１４プラスミドで、２４時間にわたりトランスフェクションした。細胞を回収する前に、過度に発現されたＴＬＲ１４の有無において、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）により６時間刺激し、レポーター遺伝子活性を分析した。
【０２０３】
図１に示されるように、空のベクターでトランスフェクションした細胞の場合（図１でＥＶと記す）と比較し、ＴＬＲ１４の存在により、ＬＰＳ誘導性のＮＦ−ｋＢレポーター遺伝子発現（刺激の増加（倍）として示す）が増強された。ＬＰＳシグナル伝達を増強するＴＬＲ１４の能力は、ＴＬＲ１４がＴＬＲ４の共受容体として機能しうることを示唆する。
【０２０４】
実施例２：ＴＬＲ１４のｓｉＲＮＡノックダウンによる、ＬＰＳで媒介されるシグナル伝達に対する効果
ＴＬＲ１４がＴＬＲ４のための共受容体として機能するか否かを更に確認するため、ＴＬＲ１４ノックダウンに特異的なｓｉＲＮＡｓを、Ｑｉａｇｅｎ社から購入した。これらのＴＬＲ１４特異的なｓｉＲＮＡｓを用いて、ＬＰＳ誘導性のＩｋＢ分解及びｐ３８リン酸化の効果を評価した。
【０２０５】
ＴＬＲ１４及び非ターゲティングネガティブコントロールｓｉＲＮＡの両方に対するｓｉＲＮＡを、Ｕ３７３ｓ細胞にトランスフェクションし、ＴＬＲ１４のノックダウンを、ウエスタンブロッティングにより確認した。得られた、このノックダウンを確認するウエスタンブロッティングを、図２（Ｂ）及び図３に示す。
【０２０６】
ＬＰＳ誘導性のＩｋＢ分解及びｐ３８リン酸化を、ＴＬＲ１４の細胞レベルを低下させる効果を評価するための読み出し（ｒｅａｄｏｕｔ）として用いた。β−アクチンの発現を、ローディングコントロールとして用いた（それぞれ図２（Ａ）及び図３）。図２（Ａ）は、ＬＰＳ誘導性のＩｋＢ分解がＴＬＲ１４の非存在下で観察されなかったことを示す。同様に、ＬＰＳ誘導性のｐ３８リン酸化は、図３に示すように、ＴＬＲ１４に対するｓｉＲＮＡで処理された細胞において、大きく損なわれた。
【０２０７】
これらの効果が、ＴＬＲ４の非特異的なノックダウンに起因するものではないことを確認するため、ＴＬＲ４抗体をプローブとしてサンプルを解析した。その結果、ＴＬＲ１４に対するｓｉＲＮＡで処理された細胞からのＴＬＲ４減少を示す証拠が得られなかった（結果は示さず）。
【０２０８】
実施例１及び２の結果はしたがって、ＴＬＲ１４がＬＰＳ誘導性の細胞シグナル伝達を増強し、その一方で、ＴＬＲ１４の不存在によりＬＰＳへの通常の反応が損なわれることを明らかに示すものである。したがってＴＬＲ１４は、ＰＡＭＰ（ＬＰＳ）のＴＬＲ４への結合に応答したＴＬＲ４機能にとり必要である。
【０２０９】
実施例３：ＴＬＲ１４に対するＬＰＳの結合の測定
ＬＰＳ結合アッセイを実施し、ＴＬＲ１４へのＬＰＳの結合を測定した。ＨＥＫ２９３細胞を、ＴＬＲ１４でトランスフェクションした。２４時間後に細胞を溶解させ、室温で、ビオチン化ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）又は非標識のＬＰＳで１時間インキュベートした。次にストレプトアビジンアガロースビーズ上でプルダウンアッセイを実施した。
【０２１０】
上記溶解物のウエスタンブロッティングによる分析結果を図４に示す。ウエスタンブロットにより、ビオチン−ＬＰＳとの複合体としてＴＬＲ１４が存在することが明らかとなった。非標識のＬＰＳが含まれることにより、図４に示すように結合が減少し、すなわちこの相互作用が特異的であることを示すものである。図４（ａ）において、５倍過剰の非標識のＬＰＳを含ませ、一方、図４（ｂ）において、コントロールサンプル中に、２５倍過剰及び５０倍過剰の非標識ＬＰＳを含ませた。
【０２１１】
実施例４：ＩｋＢ分解に対する、ＴＬＲ１４ ｓｉＲＮＡノックダウンの効果
ａｍａｘａベースのトランスフェクションシステム（ｐｒｏｇｒａｍ Ｓ−０１９）を使用して、ＴＬＲ１４（Ｑｉａｇｅｎ）に対して特異的なｓｉＲＮＡにより、ＴＨＰ１細胞をトランスフェクションした。
【０２１２】
７２時間後における、ＴＬＲ１４のノックダウンを、ウエスタンブロッティングにより確認した（図５（Ａ））。スクランブルバージョンのＱｉａｇｅｎ ｓｉＲＮＡを用いて、ｓｉＲＮＡがＴＬＲ１４に特異的であることを確認するためのネガティブコントロールとした。示された時間、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで細胞を処理し、ＩｋＢ分解をウエスタンブロットにより測定した（図５（Ｂ）及び図５（Ｃ））。
【０２１３】
ｓｉＲＮＡ媒介されたＴＬＲ１４のノックダウンはゆえに、ＬＰＳによる刺激に応答したＩｋＢ分解をわずかに阻害することを示すものであった。
【０２１４】
実施例５：ＩＬ−６及びＴＮＦ−αサイトカインレベルに対する、ＴＬＲ１４ノックダウンの効果
ａｍａｘａベースのトランスフェクションシステム（ｐｒｏｇｒａｍ Ｓ−０１９）を使用して、ＴＬＲ１４（Ｑｉａｇｅｎ）に対して特異的なｓｉＲＮＡにより、ＴＨＰ１細胞をトランスフェクションした。スクランブルバージョンのＱｉａｇｅｎ ｓｉＲＮＡを用いて、ｓｉＲＮＡがＴＬＲ１４に特異的であることを確認するためのネガティブコントロールとした。７２時間後に、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで細胞を２４時間刺激した。上清を除去し、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αＥＬＩＳＡアッセイを実施した。
【０２１５】
結果を図６に示す。図６（Ａ）はＥＬＩＳＡの結果であり、ＴＬＲ１４のノックダウンによりＴＮＦ−α産生の減少が生じることを示す。図６（Ｂ）は、ＴＬＲ１４のノックダウンによりＩＬ−６サイトカイン産生の減少が生じることを示す。
【０２１６】
実施例６：膜におけるＴＬＲ１４の発現及び局在化
Ｕ３７３脳星状細胞腫細胞を、４μｇのＴＬＲ１４でトランスフェクションした。２時間後に、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで細胞を２時間刺激した。細胞を、サイトゾル及び膜画分に分画した。ウエスタンブロット分析により、膜におけるＴＬＲ１４の発現を確認した。
【０２１７】
図７は、ウエスタンブロッティングの結果を示す。サイトゾル画分を左側に示し、一方、膜画分を右側に示す。ＮＴとは非トランスフェクション細胞を意味し、一方、Ｔはトランスフェクション細胞を意味する。その結果、過剰発現したＴＬＲ１４が膜において局所化することが示された。
【０２１８】
実施例７：マウス脳におけるＴＬＲ１４の発現
野生型（ＷＴと表記）及び自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥと表記）モデル実験マウスから、脳を摘出し、皮質、海馬及び小脳に解剖した。これらの断片のウエスタンブロット分析により、タンパク質レベルでのＴＬＲ１４の発現が確認された。
【０２１９】
図８は、皮質（ゲル左側のカラム１及び２）、海馬（中央のカラム３及び４）及び小脳（右側のカラム５及び６）におけるＴＬＲ１４の発現を意味するバンドを示す、ウエスタンブロッティングを示す。
【０２２０】
特に皮質及び海馬から得たＥＡＥサンプルに関しては、ＴＬＲ１４発現レベルが、ＥＡＥマウスのこれらの領域より高いことを観察することができた。
【０２２１】
実施例８：ＴＨＰ１細胞における内因性ＴＬＲ１４の局在化
ＴＨＰ１細胞を、１ｍｌあたり１×１０5細胞で、１０ｃｍのプレート上に播き、一晩インキュベートした。２４時間後に培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、かき取り、分画バッファ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２５０ｍＭ スクロース、２００ｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ７．５）中に入れた。サンプルを、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザ中で２０ストローク処理し、１００，０００×ｇで１時間遠心分離した。上清（サイトゾル画分）を新しい試験管へ移し、ペレット（膜画分）を、５０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファ［５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ６．８／１０％のグリセロール（体積／体積）／２％のＳＤＳ（重量／体積）／０．１％のブロモフェノールブルー（重量／体積）／５％の２−メルカプトエタノール］中に再懸濁させた。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより分析した。
【０２２２】
ＴＨＰ１細胞の膜及びサイトゾルの画分を調製し、内因性ＴＬＲ１４の局在化を測定した。図９に示すように、超遠心分離後、これらの細胞の膜画分のタンパク質を分離した。ゲル上の膜由来画分に関連するカラムでは、明瞭なバンドが示された。サイトゾルの画分には、同様のバンドは存在しなかった。したがってこの実験の結果は、ＴＬＲ１４が膜結合型受容体のファミリーに属するという説を支持するものである。
【０２２３】
本願明細書で引用される全ての文書は、参照により本願明細書に援用される。本発明に記載される実施形態に対する、本発明の範囲内における様々な修正変更は、当業者にとり自明である。本発明を、具体的な好適な実施形態を参照しながら記載したが、それらは、特許請求された本発明を、かかる具体的な実施形態に過度に限定するものと理解すべきでない。実際、記載された本発明の実施形態の、当業者にとり自明な様々な改変は、本発明の範囲内に包含されるものとする。本願明細書中のいかなる従来技術の引用も、この従来技術が、いかなる国においても一般的知識として認識されていることを、いかなる形でも承認又は示唆することを意味せず、またそのように認識すべきでない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達を抑制する方法であって、
−配列番号１のアミノ酸配列を有するＴｏｌｌ様受容体１４タンパク質の発現又は生物学的機能を阻害する、治療上有効量の化合物を準備するステップと、
−かかる処置を必要とする被験者にそれを投与するステップとを有してなる方法。
【請求項２】
Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する前記化合物が、タンパク質、ペプチド、ペプチド擬態物、核酸、ポリヌクレオチド、多糖類、オリゴペプチド、炭水化物、脂質、小分子化合物及び天然の化合物からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する前記化合物が、抑制性核酸である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記抑制性核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡからなる群から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記化合物が、Ｔｏｌｌ様受容体４と、共受容体としてのＴｏｌｌ様受容体１４との複合体化を阻害することによって、Ｔｏｌｌ様受容体１４の生物学的機能を阻害する抗体である、請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、Ｔｏｌｌ様受容体１４への結合を阻害して、それによりＴｏｌｌ様受容体４と、共受容体としてのＴｏｌｌ様受容体１４との複合体化を阻害する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が、Ｔｏｌｌ様受容体４への結合を阻害して、それによりＴｏｌｌ様受容体４と、共受容体としてのＴｏｌｌ様受容体１４との複合体化を阻害する、請求項５記載の方法。
【請求項８】
ＣＤ１４の発現又は生物学的機能を阻害する、治療上有効量の組成物を、被験者に投与するステップを更に有してなる、請求項１から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達の抑制に用いられる医薬組成物であって、少なくとも１つの薬学的に許容できる希釈剤、賦形剤若しくは担体に加えて、Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する化合物を含んでなる医薬組成物。
【請求項１０】
Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達により媒介される症状の治療用薬剤の調製への、Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する化合物の使用。
【請求項１１】
Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達により媒介される前記症状が、敗血症又は感染性ショックである、請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達により生じる症状の治療用薬剤に用いられる、Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する化合物を含んでなる組成物。
【請求項１３】
Ｔｏｌｌ様受容体４と、共受容体としてのＴｏｌｌ様受容体１４との会合を阻害する化合物を同定するためのアッセイ方法であって、
−Ｔｏｌｌ様受容体４とＴｏｌｌ様受容体１４とを含んでなる、第１及び第２の細胞サンプルを準備するステップと、
−前記第１及び第２のサンプルと、上記Ｔｏｌｌ様受容体１４と結合するエンドトキシンとを、上記Ｔｏｌｌ様受容体１４が、エンドトキシンと結合するときにＴｏｌｌ様受容体４と会合できる条件下で、接触させるステップと、
−前記第１のサンプルと、候補調節化合物とを、前記化合物の結合が可能な条件下で接触させるステップと、
−Ｔｏｌｌ様受容体４受容体の複合体の活性化状態を、前記第１と第２のサンプル間での、下流の活性化レベルの比較によってモニタするステップを有してなり、
前記第１のサンプルと前記第２のサンプルとの間での、Ｔｏｌｌ様受容体４のシグナル伝達の減少により、Ｔｏｌｌ様受容体４とＴｏｌｌ様受容体１４との会合の阻害剤としての調節化合物が同定される方法。
【請求項１４】
Ｔｏｌｌ様受容体４により媒介されるシグナル伝達の阻害への、請求項１３記載のアッセイ方法により同定される化合物の使用。
【請求項１５】
Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達の阻害用の組成物であって、請求項１３記載のアッセイ方法により同定される化合物を含んでなる組成物。
【請求項１６】
敗血症又は感染性ショックの治療用薬剤の調製への、請求項１３記載のアッセイ方法により同定される化合物の使用。
【請求項１７】
敗血症又は感染性ショックの治療に用いられる組成物であって、請求項１３記載のアッセイ方法により同定される化合物を含んでなる組成物。
【請求項１８】
少なくとも１つの薬学的に許容できる希釈剤、賦形剤又は担体に加えて、請求項１３記載のアッセイ方法により同定される化合物を含んでなる、敗血症又は感染性ショックの治療及び／又は予防用の医薬組成物。
【請求項１９】
敗血症又は感染性ショックの治療及び／又は予防方法であって、
−請求項１３記載のアッセイ方法により同定される、治療上有効量の化合物を準備するステップと、
−治療を必要とする被験者にそれを投与するステップとを含んでなる方法。
【請求項２０】
ＣＤ１４の発現又は生物学的機能を阻害する、治療上有効量の組成物を被験者に投与するステップを更に有してなる、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現を阻害するか、又は、Ｔｏｌｌ様受容体４と共受容体複合体を形成する、Ｔｏｌｌ様受容体１４の生物学的機能を阻害する化合物を同定するためのアッセイ方法であって、
−Ｔｏｌｌ様受容体４とＴｏｌｌ様受容体１４とを含んでなる第１及び第２の細胞サンプルを準備するステップと、
−第１のフルオロフォア分子でＴｏｌｌ様受容体４を標識し、第２のフルオロフォア分子でＴｏｌｌ様受容体１４を標識するステップと、
−前記第１のサンプルと、Ｔｏｌｌ様受容体４を活性化する分子とを接触させるステップと、
−前記第１及び第２のサンプルと候補調節化合物とを、Ｔｏｌｌ様受容体４及び／又はＴｏｌｌ様受容体１４の結合を可能にする条件下で接触させるステップと、
−フルオロフォアの蛍光をモニタすることによって、Ｔｏｌｌ様受容体４受容体の結合状態及び／又は活性化をモニタするステップとを有してなり、蛍光の変化により、前記候補調節化合物が、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達を調節する化合物として同定される方法。
【請求項２２】
Ｔｏｌｌ様受容体４により媒介されるシグナル伝達の阻害への、請求項２１記載のアッセイ方法により同定される化合物の使用。
【請求項２３】
Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達の阻害用の組成物であって、請求項２１記載のアッセイ方法により同定される化合物を含んでなる組成物。
【請求項２４】
敗血症又は感染性ショックの治療用薬剤の調製への、請求項２１記載のアッセイ方法により同定される化合物の使用。
【請求項２５】
敗血症又は感染性ショックの治療に用いられる組成物であって、請求項２１記載のアッセイ方法により同定される化合物を含んでなる組成物。
【請求項２６】
少なくとも１つの薬学的に許容できる希釈剤、賦形剤又は担体に加えて、請求項２１記載のアッセイ方法により同定される化合物を含んでなる、敗血症又は感染性ショックの治療及び／又は予防用の医薬組成物。
【請求項２７】
敗血症又は感染性ショックの治療及び／又は予防方法であって、−請求項１３記載のアッセイ方法により同定される、治療上有効量の化合物を準備するステップと、−治療を必要とする被験者にそれを投与するステップとを有してなる方法。
【請求項２８】
ＣＤ１４の発現又は生物学的機能を阻害する、治療上有効量の組成物を、被験者に投与するステップを更に有してなる、請求項１９記載の方法。
【請求項１】
Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達を抑制する方法であって、
−配列番号１のアミノ酸配列を有するＴｏｌｌ様受容体１４タンパク質の発現又は生物学的機能を阻害する、治療上有効量の化合物を準備するステップと、
−かかる処置を必要とする被験者にそれを投与するステップとを有してなる方法。
【請求項２】
Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する前記化合物が、タンパク質、ペプチド、ペプチド擬態物、核酸、ポリヌクレオチド、多糖類、オリゴペプチド、炭水化物、脂質、小分子化合物及び天然の化合物からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する前記化合物が、抑制性核酸である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記抑制性核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡからなる群から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記化合物が、Ｔｏｌｌ様受容体４と、共受容体としてのＴｏｌｌ様受容体１４との複合体化を阻害することによって、Ｔｏｌｌ様受容体１４の生物学的機能を阻害する抗体である、請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、Ｔｏｌｌ様受容体１４への結合を阻害して、それによりＴｏｌｌ様受容体４と、共受容体としてのＴｏｌｌ様受容体１４との複合体化を阻害する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が、Ｔｏｌｌ様受容体４への結合を阻害して、それによりＴｏｌｌ様受容体４と、共受容体としてのＴｏｌｌ様受容体１４との複合体化を阻害する、請求項５記載の方法。
【請求項８】
ＣＤ１４の発現又は生物学的機能を阻害する、治療上有効量の組成物を、被験者に投与するステップを更に有してなる、請求項１から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達の抑制に用いられる医薬組成物であって、少なくとも１つの薬学的に許容できる希釈剤、賦形剤若しくは担体に加えて、Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する化合物を含んでなる医薬組成物。
【請求項１０】
Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達により媒介される症状の治療用薬剤の調製への、Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する化合物の使用。
【請求項１１】
Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達により媒介される前記症状が、敗血症又は感染性ショックである、請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達により生じる症状の治療用薬剤に用いられる、Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現又は生物学的機能を阻害する化合物を含んでなる組成物。
【請求項１３】
Ｔｏｌｌ様受容体４と、共受容体としてのＴｏｌｌ様受容体１４との会合を阻害する化合物を同定するためのアッセイ方法であって、
−Ｔｏｌｌ様受容体４とＴｏｌｌ様受容体１４とを含んでなる、第１及び第２の細胞サンプルを準備するステップと、
−前記第１及び第２のサンプルと、上記Ｔｏｌｌ様受容体１４と結合するエンドトキシンとを、上記Ｔｏｌｌ様受容体１４が、エンドトキシンと結合するときにＴｏｌｌ様受容体４と会合できる条件下で、接触させるステップと、
−前記第１のサンプルと、候補調節化合物とを、前記化合物の結合が可能な条件下で接触させるステップと、
−Ｔｏｌｌ様受容体４受容体の複合体の活性化状態を、前記第１と第２のサンプル間での、下流の活性化レベルの比較によってモニタするステップを有してなり、
前記第１のサンプルと前記第２のサンプルとの間での、Ｔｏｌｌ様受容体４のシグナル伝達の減少により、Ｔｏｌｌ様受容体４とＴｏｌｌ様受容体１４との会合の阻害剤としての調節化合物が同定される方法。
【請求項１４】
Ｔｏｌｌ様受容体４により媒介されるシグナル伝達の阻害への、請求項１３記載のアッセイ方法により同定される化合物の使用。
【請求項１５】
Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達の阻害用の組成物であって、請求項１３記載のアッセイ方法により同定される化合物を含んでなる組成物。
【請求項１６】
敗血症又は感染性ショックの治療用薬剤の調製への、請求項１３記載のアッセイ方法により同定される化合物の使用。
【請求項１７】
敗血症又は感染性ショックの治療に用いられる組成物であって、請求項１３記載のアッセイ方法により同定される化合物を含んでなる組成物。
【請求項１８】
少なくとも１つの薬学的に許容できる希釈剤、賦形剤又は担体に加えて、請求項１３記載のアッセイ方法により同定される化合物を含んでなる、敗血症又は感染性ショックの治療及び／又は予防用の医薬組成物。
【請求項１９】
敗血症又は感染性ショックの治療及び／又は予防方法であって、
−請求項１３記載のアッセイ方法により同定される、治療上有効量の化合物を準備するステップと、
−治療を必要とする被験者にそれを投与するステップとを含んでなる方法。
【請求項２０】
ＣＤ１４の発現又は生物学的機能を阻害する、治療上有効量の組成物を被験者に投与するステップを更に有してなる、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現を阻害するか、又は、Ｔｏｌｌ様受容体４と共受容体複合体を形成する、Ｔｏｌｌ様受容体１４の生物学的機能を阻害する化合物を同定するためのアッセイ方法であって、
−Ｔｏｌｌ様受容体４とＴｏｌｌ様受容体１４とを含んでなる第１及び第２の細胞サンプルを準備するステップと、
−第１のフルオロフォア分子でＴｏｌｌ様受容体４を標識し、第２のフルオロフォア分子でＴｏｌｌ様受容体１４を標識するステップと、
−前記第１のサンプルと、Ｔｏｌｌ様受容体４を活性化する分子とを接触させるステップと、
−前記第１及び第２のサンプルと候補調節化合物とを、Ｔｏｌｌ様受容体４及び／又はＴｏｌｌ様受容体１４の結合を可能にする条件下で接触させるステップと、
−フルオロフォアの蛍光をモニタすることによって、Ｔｏｌｌ様受容体４受容体の結合状態及び／又は活性化をモニタするステップとを有してなり、蛍光の変化により、前記候補調節化合物が、Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達を調節する化合物として同定される方法。
【請求項２２】
Ｔｏｌｌ様受容体４により媒介されるシグナル伝達の阻害への、請求項２１記載のアッセイ方法により同定される化合物の使用。
【請求項２３】
Ｔｏｌｌ様受容体４の活性化及びシグナル伝達の阻害用の組成物であって、請求項２１記載のアッセイ方法により同定される化合物を含んでなる組成物。
【請求項２４】
敗血症又は感染性ショックの治療用薬剤の調製への、請求項２１記載のアッセイ方法により同定される化合物の使用。
【請求項２５】
敗血症又は感染性ショックの治療に用いられる組成物であって、請求項２１記載のアッセイ方法により同定される化合物を含んでなる組成物。
【請求項２６】
少なくとも１つの薬学的に許容できる希釈剤、賦形剤又は担体に加えて、請求項２１記載のアッセイ方法により同定される化合物を含んでなる、敗血症又は感染性ショックの治療及び／又は予防用の医薬組成物。
【請求項２７】
敗血症又は感染性ショックの治療及び／又は予防方法であって、−請求項１３記載のアッセイ方法により同定される、治療上有効量の化合物を準備するステップと、−治療を必要とする被験者にそれを投与するステップとを有してなる方法。
【請求項２８】
ＣＤ１４の発現又は生物学的機能を阻害する、治療上有効量の組成物を、被験者に投与するステップを更に有してなる、請求項１９記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２０１０−５０６８８５（Ｐ２０１０−５０６８８５Ａ）
【公表日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３２８１４（Ｐ２００９−５３２８１４）
【出願日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６１１８２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４６９０２
【国際公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【出願人】（５９９０４９９４５）ザ・プロウボウスト・フェロウズ・アンド・スカラーズ・オブ・ザ・カレッジ・オブ・ザ・ホリー・アンド・アンデバイデッド・トリニティ・オブ・クイーン・エリザベス・ニア・ダブリン (9)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｐｒｏｖｏｓｔ Ｆｅｌｌｏｗｓ ａｎｄ Ｓｃｈｏｌａｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｌｙ ａｎｄ Ｕｎｄｉｖｉｄｅｄ Ｔｒｉｎｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｅｎ Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｎｅａｒ Ｄｕｂｌｉｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６１１８２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４６９０２
【国際公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【出願人】（５９９０４９９４５）ザ・プロウボウスト・フェロウズ・アンド・スカラーズ・オブ・ザ・カレッジ・オブ・ザ・ホリー・アンド・アンデバイデッド・トリニティ・オブ・クイーン・エリザベス・ニア・ダブリン (9)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｐｒｏｖｏｓｔ Ｆｅｌｌｏｗｓ ａｎｄ Ｓｃｈｏｌａｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｌｙ ａｎｄ Ｕｎｄｉｖｉｄｅｄ Ｔｒｉｎｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｅｎ Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｎｅａｒ Ｄｕｂｌｉｎ
【Ｆターム（参考）】
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