ＨＩＶに感染したと同定された人を治療する方法が開示される。ＨＩＶに暴露された疑いのある人を治療する方法が開示される。開示されたいくつかの方法は、ＦａｓＬ発現を阻害するのに有効な量のｐ３８阻害剤を人に投与する工程を含む。開示されたいくつかの方法は、ＨＩＶ複製を阻害するのに有効な量のｐ３８阻害剤を人に投与する工程を含む。開示されたいくつかの方法は、Ｔ細胞活性化を阻害することなしに、ＨＩＶ複製を阻害するのに有効な量のｐ３８阻害剤を人に投与する工程を含む。開示されたいくつかの方法は、ｐ３８阻害剤と組み合わせて一つ又はそれより多い抗−ＨＩＶ化合物を人に投与する工程を含む。ＦａｓＬ発現のＮｅｆ媒介性アップ制御を阻害する化合物を同定する方法が開示される。ｐ３８経路を阻害する化合物を同定する方法が開示される。

【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の分野
本発明は、抗ＨＩＶ組成物としてｐ３８キナーゼ阻害剤を含む組成物及びＨＩＶ感染を治療及び予防するためのそのような組成物の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）は、ＡＩＤＳに必須の感染因子であり、現在、世界の主要な健康の問題の一つである。合衆国のみにおいて、毎年４０，０００を超える新たなＨＩＶ感染がある。世界的には、確立された市場経済を有する国で現在１２０万を超える感染を有するが、開発途上国においては、４５０万に近い感染が見積もられ、２０００万人を超える人がすでにＡＩＤＳで死んでいる。ＨＩＶに関してワクチンを開発するための最近の努力は、顕著な欲求不満に遭遇してきた。広範囲に中和する抗体の応答を誘導できる免疫原（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）はまだない。多大なエネルギーがＨＩＶの非ヒト霊長類モデルにおいて防御を誘導する細胞性の方法（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｔｈｏｄｓ）の開発に注がれてきた。しかしながら、非ヒト霊長類研究におけるウイルスの逃亡（ｅｓｃａｐｅ）及び予測されないハプロタイプに基づく防御性応答の問題が、ワクチンのデザインに対するチャレンジを提供する。少なくとも数年間はワクチンが市販されないであろうから、この制御不可能な感染のためのさらに新規な治療剤に関する多大な要求が存在するようである。
【０００３】
従って、ＨＩＶ感染を治療するための新規な戦略の開発は、高い優先事項である。現在５４を超えるドラッグがＨＩＶ及びＡＩＤＳ関連の病気（ａｉｌｍｅｎｔｓ）を治療することに関してＦＤＡの認可を有する。しかしながら、歴史的には、ＨＩＶ遺伝子を標的とする経口により送達可能な化合物の大部分が、ウイルスのｐｏｌ遺伝子複合体内の２つの酵素を標的とする。融合阻害剤の開発における最近の進歩は、なおその上にエンベロープ遺伝子産物を含むためにＨＩＶ標的物を広げてきた。これらの薬剤の何れかの長期の使用に関連した顕著な毒性が関心事である。さらなる関心事は、激しく（ｈｅａｖｉｌｙ）治療された人でさえ基本的なＨＩＶウイルス感染をクリアーすること及びウイルスの複製を妨害することができないらしいことである。即ち、時がたてば（ｏｖｅｒ ｔｉｍｅ）大部分の治療された人がさらなる治療を必要とすると信じられている。理論上は、ウイルスにより利用される宿主の細胞経路を標的とする新たな治療法を開発することは、ウイルスのさらに重要且つ貴重な障害を負わせることができた。特定の利益は、そのような宿主の経路がＨＩＶの現在標的とされていない病原性遺伝子産物を干渉したか否かである。
【０００４】
ヒト免疫不全ウイルスタイプ１のゲノムは、２つの構造遺伝子セグメント（ｇａｇ及びｅｎｖ）とレトロウイルスファミリーの蛋白質分解メンバーに類似の酵素遺伝子複合体ｐｏｌを含む。ＨＩＶ−１は、ウイルスのライフサイクルにおいて種々の役割を有し且つウイルスの病原性において関係する多数の制御遺伝子及びアクセサリー遺伝子もコードする。この点に関して、制御不可能な（ｄｉｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ）アポトーシスは、ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）の感染の間に重度のＣＤ４^＋リンパ球減少症（ｌｙｍｐｈｏｐｅｎｉａ）を導く主要な病理的事象であると考えられる。アポトーシスは、細胞がそれ自身の死において活性な当事者であるような正常な生理条件下で起こる細胞死の状態である。細胞が受けるアポトーシスは、特徴的な形態的及び生化学的特徴を示す。ＨＩＶに誘導されたアポトーシスは、Ｆａｓ／ＦａｓＬアポトーシス経路を含むのと含まない両方が報告された。ＣＤ９５（ＡＰＯ−１／Ｆａｓ）は様々な組織上で発現されるＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであるが、ＴＮＦファミリーのタイプＩＩ膜貫通蛋白質である、そのリガンド（ＣＤ９５Ｌ）の発現は、少数の細胞タイプ、例えば、Ｔ細胞、マクロファージ及び精巣の細胞に、より限定される。ＦａｓＬは休止細胞には存在しないが、活性化されたＴ細胞はＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌ経路を用いてアポトーシスを経る。厳密には、どのＨＩＶ遺伝子が如何にしてＦａｓ／ＦａｓＬ経路を通してアポトーシスを活性化するかが調査の重要な話題である。ウイルス遺伝子産物、ｖｐｒ，ｎｅｆ，ｔａｔ及びｅｎｖの全てが、ＨＩＶ感染の幾つかのモデルシステムにおいて、多様な程度（ｖａｒｙｉｎｇ ｅｘｔｅｎｔ）にアポトーシスを推進すると報告されており、そしてこれらの遺伝子産物の４つ全てが傍観者の細胞致死において変化する程度に関係した（ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ）。ｅｎｖ遺伝子産物はウイルスの侵入及び親和性（ｔｒｏｐｉｓｍ）に重要であるが、ｔａｔ，ｖｐｒ及びｎｅｆ遺伝子産物の全ては、ウイルスの複製に直接関係性を有するとも暗示された。ｔａｔは高いレベルのウイルスの転写に絶対的に必要であるが、ＮｅｆはＳＩＶモデルシステムにおいて高いウイルス負荷及びウイルスの病原性の誘導に決定的であることが示された。
【０００５】
ＨＩＶ感染を治療するためのさらなるドラッグ及び方法に関する要求が残されている。
【０００６】
発明の概要
本発明は、ＨＩＶに感染したと同定された人を治療する方法に関する。当該方法は、ＦａｓＬ発現を阻害するのに有効な量のｐ３８阻害剤を上記の人に投与する工程を含む。
【０００７】
本発明は、さらに、ＨＩＶに暴露された疑いの有る人を治療する方法に関する。当該方法は、ＦａｓＬ発現を阻害するのに有効な量のｐ３８阻害剤を上記の人に投与する工程を含む。
【０００８】
本発明は、さらに、ＨＩＶに感染したと同定された人を治療する方法に関する。当該方法は、Ｔ細胞の活性化を阻害することなく、ＨＩＶ複製を阻害するのに有効な量のｐ３８阻害剤を上記の人に投与する工程を含む。
【０００９】
本発明は、さらに、ＨＩＶに暴露された疑いのある人を治療する方法に関する。当該方法は、Ｔ細胞の活性化を阻害することなく、ＨＩＶ複製を阻害するのに有効な量のｐ３８阻害剤を上記の人に投与する工程を含む。
【００１０】
本発明は、ＦａｓＬ発現をＨＩＶ感染細胞において阻害する方法を提供し、細胞内でＦａｓＬ発現を阻害するのに十分な量のｐ３８阻害剤をＨＩＶ感染細胞に送達する工程を含む。
【００１１】
本発明は、ＨＩＶ感染細胞内でＨＩＶの複製を阻害する方法を提供し、ＨＩＶの複製を阻害するのに十分でＴ細胞活性化を阻害しない量のｐ３８阻害剤をＨＩＶ感染細胞に送達する工程を含む。
【００１２】
本発明は、さらに、ＦａｓＬ発現のＮｅｆ媒介性アップ制御を阻害する化合物を同定する方法に関する。当該方法は、細胞内でＦａｓＬ発現をアップ制御するＮｅｆ発現細胞を試験化合物に接触させる工程を含む試験アッセイを実施することを含む。ＦａｓＬ発現のレベルを測定し、そして試験化合物不在下でのレベルと比較する。
【００１３】
本発明は、さらに、抗−ＨＩＶ活性を有する化合物を同定する方法に関する。当該方法は、細胞内でＦａｓＬ発現をアップ制御するＮｅｆ発現細胞を試験化合物に接触させる工程を含む試験アッセイを実施することを含む。ＦａｓＬ発現のレベルを測定し、そして試験化合物不在下でのレベルと比較する。
【００１４】
本発明は、さらに、ｐ３８経路を阻害する化合物を同定する方法に関する。当該方法は、細胞内でＦａｓＬ発現をアップ制御するＮｅｆ発現細胞を試験化合物に接触させる工程を含む試験アッセイを実施することを含む。ＦａｓＬ発現のレベルを測定し、そして試験化合物不在下でのレベルと比較する。
【００１５】
本発明は、さらに、ＪＮＫ経路を阻害する化合物を同定する方法に関する。当該方法は、細胞内でＦａｓＬ発現をアップ制御するＮｅｆ発現細胞を試験化合物に接触させる工程を含む試験アッセイを実施することを含む。ＦａｓＬ発現のレベルを測定し、そして試験化合物不在下でのレベルと比較する。
【００１６】
好ましい態様の説明
定義
本明細書において使用される用語「ＨＩＶ感染細胞においてＦａｓＬ発現のＮｅｆ媒介性アップ制御を阻害するのに有効な量」及び「ＨＩＶ感染細胞においてＦａｓＬ発現を阻害するのに有効な量」は、ＦａｓＬをほとんど発現しない人のＨＩＶ感染Ｔ細胞をもたらす人に投与されたｐ３８阻害剤の量を意味する。そのような量を決定するためには、ｐ３８阻害剤化合物による処理の前及び後の処理に続いて、ＨＩＶ感染Ｔ細胞上に存在するＦａｓＬの量を計数できる。ＦａｓＬ発現は、患者から採取された血液サンプルを用いて、フローサイトメトリーを含む幾多の日常的方法論により定量することができる。ＦａｓＬ発現のダウン変調は、感染又はそれによる兆候の重度の軽減に寄与する。
【００１７】
本明細書において使用される用語「ＨＩＶの複製を阻害するのに有効な量」は、低下したレベルのＨＩＶ複製をもたらす人に投与されたｐ３８阻害剤の量であって、即ち、その人において検出可能なウイルスの量の低下をもたらし、即ち、ウイルス力価又はウイルス負荷の低下をもたらす。ＨＩＶ複製を阻害するのに有効な量を決定するためには、その人のウイルス負荷を、ｐ３８阻害剤化合物による処理の前及び後の処理に続いて、決定することができる。ＨＩＶ複製のレベルは、幾多の日常的な方法論により定量することができ、例えば：ｐ３８阻害剤の投与の前と後のサンプル中のウイルス粒子の実数を定量すること、ｐ３８阻害剤の投与の前と後のサンプル中に存在するＨＩＶ抗原、例えばｐ２４のレベルを定量すること、及びｐ３８阻害剤の投与の前と後のサンプル中の逆転写酵素又はＨＩＶプロテアーゼの活性のレベルを定量することを含む。ＨＩＶ複製の阻害は、感染又はそれによる兆候の重度の軽減に寄与する。
【００１８】
本明細書において使用される用語「Ｔ細胞の活性化の阻害なし」は、Ｔ細胞が活性化される能力の低下の不在を意味する。従って、用語「Ｔ細胞の活性化の阻害なしにＨＩＶ複製を阻害するのに有効な量」は、ｐ３８阻害の量又はＨＩＶ複製を阻害するがＴ細胞活性化は阻害しない量を意味する。Ｔ細胞の活性化の阻害の不在を決定するためには、Ｔ細胞が患者において活性化されるようになる能力を、ｐ３８阻害剤の投与の前と後に決定する。標準及び日常的な方法を用いることにより、Ｔ細胞の活性化、例えば、ＳＥＢスーパー抗原と接触させたＰＢＭＣによるＩＬ−２生産のレベルを決定してよい。Ｔ細胞活性化の阻害の不在は、免疫が損なわれた（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）かもしれない患者に、彼らの免疫システムを阻害しない利点を提供し、そして即ち、ＨＩＶ感染及びＡＲＣ及びＡＩＤＳの患者が特に感受性であり得る日和見感染（ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）のようなあらゆる他の感染因子に良好に抵抗させ得るようにする利点を提供する。
【００１９】
注釈されるとおり、ＦａｓＬ発現のレベル、ＨＩＶ複製のレベル及びＴ細胞活性化のレベルを、よく知られた技術を用いて日常的に決定することができる。幾つかの技術は、本明細書又はＷａｄｓｗｏｒｔｈ ＳＡ，ｅｔ ａｌ．１９９９ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２９１（２）：６８０−６８７に開示されており、引用により本明細書に編入される。一般に、ＦａｓＬ発現又はＨＩＶ複製の阻害に関する閾値は、処理されたｐ３８阻害剤が、未処理よりも少なくとも１０％低く、好ましくは未処理よりも少なくとも２５％低い。一般に、Ｔ細胞の阻害の不在に関する閾値は、処理されたｐ３８阻害剤におけるＴ細胞活性化が、未処理におけるＴ細胞活性化のそれの１０％以内、好ましくは、未処理におけるＴ細胞活性化のそれの２０％以内である。
【００２０】
ｐ３８ ＭＡＰキナーゼとしても知られるｐ３８キナーゼ（本明細書においては２つの用語が交換可能に使用される）は、ストレスに対する応答において通常は活性化されるキナーゼである。
【００２１】
本明細書において使用される用語「ｐ３８阻害剤」、「ｐ３８キナーゼ阻害剤」、及び「ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤」は、交換可能に使用されて、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性を阻害できる化合物を意味する。当該化合物は、小分子、大分子、ペプチド、オリゴヌクレオチド、等であり得る。化合物がｐ３８キナーゼ阻害剤であるか否かの決定は、当業者の範囲内である。化合物がｐ３８キナーゼ阻害剤であるか否かを如何にして決定するかの一例は、ｐ３８キナーゼ蛋白質を単離することである。当該蛋白質は、ｐ３８キナーゼが天然において発現される細胞か又はそれがオリゴヌクレオチドのトランスフェクションにより又はｐ３８ ＭＡＰキナーゼ蛋白質の発現を指示するウイルスの感染により過剰発現される細胞から単離することができる。さらに、ｐ３８は組換え発現させることもできる。当該蛋白質を単離する際、当業者は、有力なｐ３８キナーゼ阻害剤の存在又は不在下でキナーゼの活性を測定することができる。申し立てられた（ａｌｌｅｇｅｄ）阻害剤の存在下の方が、不在下よりもキナーゼ活性が低ければ、その阻害剤はｐ３８キナーゼ阻害剤である。
【００２２】
本明細書において使用される用語「ＨＩＶに暴露された疑いのある人（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」は、ＨＩＶ陽性であると診断されなかったが、最近のハイリスクアクティビティー又は彼らをＨＩＶと接触した状態にした可能性があるアクティビティーのため、ＨＩＶに暴露し得た可能性がある人を意味する。例えば、ＨＩＶに暴露された疑いのある人は、ＨＩＶを含むサンプル又はＨＩＶに感染した人の何れかに接触した針に刺された人を意味する。サンプルの例は、限定ではないが、患者からの血液、血清、からだの分泌物等の実験室又は研究用の一つ又は複数のサンプルを含む。ＨＩＶに暴露された疑いのあるその他の人は、未知の質の血液により輸血を受けた人である。輸血された血液は試験されなかったかもしれないか、又は血液がＨＩＶを含まないことを示す結果が信用できないか又は疑わしい。幾つかの態様において、ＨＩＶに感染した疑いのある人は、性交、未防御の性交にてＨＩＶに感染した他人又は動物に噛まれた人、静脈内ドラッグの使用者等を含む。ＨＩＶに感染した疑いのある人の別の例は、限定ではないが、彼らが予防治療の必要があると信じる人である。幾つかの態様において、ＨＩＶに感染した疑いのある人は、臓器移植、組織移植、皮膚グラフト等を他人から受けた人である。臓器、組織、皮膚等が起源とする人はＨＩＶの存在及び／又は不在に関して試験されなかったかもしれず、あるいは、試験結果の信頼性が疑問かもしれない。
【００２３】
ｐ３８阻害剤の活性及びＨＩＶ感染による用途
ＨＩＶ Ｎｅｆは、アポトーシスを誘導することによる、感染したＴ細胞の長期間の生存に関して及び非感染Ｔ細胞の破壊を提供するために、宿主細胞のシグナルトランスダクション蛋白質に相互作用するウイルス蛋白質である。Ｎｅｆは、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）の発現をアップ制御する。ＦａｓＬを発現する感染Ｔ細胞が非感染Ｔ細胞に接触したとき、ＦａｓＬは非感染細胞上でＦａｓと相互作用して、それらがアポトーシスを受けるように誘導する。非感染Ｔ細胞内でのアポトーシスの誘導は、ＨＩＶ感染をクリアーするのに利用可能なＴ細胞の特異的減少並びにＨＩＶ感染患者におけるＴ細胞の一般的減少をもたらし、ＡＩＤＳを導き、ＡＩＤＳに特徴的である。
【００２４】
ｐ３８阻害剤はＦａｓＬ発現を阻害可能であること、特にＦａｓＬ発現がＮｅｆ−媒介性アップ制御によると信じられることが、発見された。従って、ｐ３８阻害剤は、ＨＩＶに感染した人を治療する方法並びにＨＩＶに暴露されたか又はＨＩＶに暴露された疑いのある人を治療する方法において使用することができる。
【００２５】
Ｔ細胞の活性化を阻害することなしにＨＩＶ感染細胞においてＨＩＶの複製をｐ３８阻害剤が阻害することも発見された。即ち、Ｔ細胞活性化を阻害しないｐ３８阻害剤は、ＨＩＶ複製を阻害するのに使用できる。従って、Ｔ細胞活性化を阻害しないｐ３８阻害剤は、ＨＩＶに感染した人を治療する方法並びにＨＩＶに暴露されたか又はＨＩＶに暴露された疑いのある人を治療する方法において使用することができる。
【００２６】
幾つかの態様において、ＨＩＶに感染した細胞においてＦａｓＬ発現を阻害するための方法が提供される。当該方法は、ＦａｓＬの発現を阻害するのに十分な量のｐ３８を感染細胞に送達する工程を含む。幾つかの態様において、ＨＩＶに感染した細胞においてＨＩＶの複製を阻害する方法が提供される。当該方法は、ＨＩＶの複製を阻害するのに十分な量のｐ３８を感染細胞に送達する工程を含む。
【００２７】
本発明は、さらに、抗−ＨＩＶ活性に関して化合物をスクリーニングする方法を提供する。当該方法は、ＦａｓＬ発現のＮｅｆ媒介性アップ制御を有する細胞内のＦａｓＬ発現に対するそれらの効果を決定するために化合物を試験することを提供する。
【００２８】
本発明は、さらに、ｐ３８経路の阻害活性に関して化合物をスクリーニングする方法を提供する。当該方法は、ＦａｓＬ発現のＮｅｆ媒介性アップ制御を有する細胞内のＦａｓＬ発現に対するそれらの効果を決定するために化合物を試験することを提供する。そのような化合物は、ｐ３８阻害活性に関してｐ３８に対して後に直接試験されるかもしれない、候補のｐ３８経路阻害剤である。
【００２９】
ＪＮＫ阻害剤活性及びＨＩＶ感染による用途
本発明は、さらに、ＪＮＫ経路阻害活性に関して化合物をスクリーニングする方法を提供する。当該方法は、ＦａｓＬ発現のＮｅｆ媒介性アップ制御を有する細胞内のＦａｓＬ発現に対するそれらの効果を決定するために化合物を試験することを提供する。そのような化合物は、ＪＮＫ阻害活性に関してｐ３８に対して後に直接試験されるかもしれない、候補のＪＮＫ経路阻害剤である。そのような化合物は、ＨＩＶに暴露されたか又はＨＩＶに暴露された疑いのある人を治療する方法において有用かもしれない。
【００３０】
ｐ３８阻害剤
当業界には多数のｐ３８阻害剤の例がある。米国特許番号５，９６５，５８３，６，０４０，３２０，６，１４７，０９６，６，２１４，８３０，６，４６９，１７４，６，５２１，６５５は、引用により本明細書に各々編入され、ｐ３８阻害剤である化合物を開示する。米国特許番号６，４１０，５４０，６，４７６，０３１，及び６，４４８，２５７も、引用により本明細書に各々編入され、ｐ３８阻害剤である化合物を開示する。同様に、米国特許番号６，４１０，５４０，６，４７９，５０７及び６，５０９，３６１は、引用により本明細書に各々編入され、ｐ３８阻害剤であると主張される化合物を開示する。米国公表出願番号２００２０１９８２１４及び２００２０１３２８４３は、引用により本明細書に各々編入され、ｐ３８阻害剤であると主張される化合物を開示する。
【００３１】
幾つかの態様において、ｐ３８阻害剤は、米国特許番号６，５２１，６５５の実施例４に開示された化合物：４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ヒドロキシブチン−１−イル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール、（４−［４−（４−フルオロ−フェニル）−１−（３−フェニル−プロピル）−５−ピリジン−４−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ブト−３−イン−１−オール及び４−［４−（４−フルオロフェニル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−３−ブチン−１−オールとも呼ばれる）であり、上記特許においてはＣｐｄ．４と命名され、本明細書においてはＣｐｄ４と呼ぶ。ｐ３８阻害剤の別の例はＳＢ２０３５８０であり、それは４−［５−（４−フルオロ−フェニル）−２−（４−メタンスルフィニル−フェニル）−３Ｈ−イミダゾール−４−イル］−ピリジンである。これらの化合物の構造を図８に示す。
【００３２】
ＨＩＶに感染した人のｐ３８阻害剤による治療
発明の幾つかの態様は、ＨＩＶに感染したと同定された人を治療するためのｐ３８阻害剤の使用を含む。
【００３３】
本発明の態様は、ＨＩＶに感染したと診断された人を治療するのに特に有用である。幾つかの態様において、ＨＩＶに感染した人を治療する方法は、ＨＩＶに感染したと同定された人に、ＨＩＶに感染したＴ細胞中でＦａｓＬの発現を阻害するのに有効な量のｐ３８阻害剤を投与する工程を含む。ＦａｓＬ発現のＮｅｆ媒介性アップ制御を阻害することにより、ｐ３８阻害剤は相するに違いない。ＦａｓＬ発現を阻害することにより、ＨＩＶ感染Ｔ細胞はＦａｓＬをほとんど有さなく、そしてそれにより、僅かな非感染Ｔ細胞においてしかアポトーシスを誘導しない。非感染Ｔ細胞におけるアポトーシスのこの誘導は、ＨＩＶ感染細胞の認識、攻撃及び排除に関与するＴ細胞を含むＴ細胞のより高い係数をもたらす。幾つかの態様において、ｐ３８阻害剤は、１ｍＭより低い濃度において、インビトロアッセイにて５０％より多い細胞においてＦａｓＬ発現レベルを５０％阻害するのに有効である。幾つかの態様において、ｐ３８阻害剤は、０．１ｍＭより低い濃度において、インビトロアッセイにて５０％より多い細胞においてＦａｓＬ発現レベルを５０％阻害するのに有効である。幾つかの態様において、ｐ３８阻害剤は、０．０５ｍＭより低い濃度において、インビトロアッセイにて５０％より多い細胞においてＦａｓＬ発現レベルを５０％阻害するのに有効である。幾つかの態様において、ｐ３８阻害剤は、０．０１ｍＭより低い濃度において、インビトロアッセイにて５０％より多い細胞においてＦａｓＬ発現レベルを５０％阻害するのに有効である。幾つかの態様において、ｐ３８阻害剤は、ＨＩＶ複製を阻害するのに有効な量にて送達される。幾つかの態様において、ｐ３８阻害剤は、１ｍＭより低い濃度において、インビトロアッセイにおいて計算されたところによればＨＩＶ複製を５０％阻害するのに有効である。幾つかの態様において、ｐ３８阻害剤は、０．１ｍＭより低い濃度において、インビトロアッセイにおいて計算されたところによればＨＩＶ複製を５０％阻害するのに有効である。幾つかの態様において、ｐ３８阻害剤は、０．０５ｍＭより低い濃度において、インビトロアッセイにおいて計算されたところによればＨＩＶ複製を５０％阻害するのに有効である。幾つかの態様において、ｐ３８阻害剤は、０．０１ｍＭより低い濃度において、インビトロアッセイにおいて計算されたところによればＨＩＶ複製を５０％阻害するのに有効である。幾つかの態様において、ｐ３８阻害剤は、Ｔ細胞の活性化を阻害しない量にて送達される。幾つかの態様において、ｐ３８阻害剤は、１ｍＭより低い濃度において、インビトロアッセイにおいて計算されたところによれば５０％のＴ細胞においてＴ細胞の活性化を１０％を超えて阻害しない。幾つかの態様において、ｐ３８阻害剤は、０．１ｍＭより低い濃度において、インビトロアッセイにおいて計算されたところによれば５０％のＴ細胞においてＴ細胞の活性化を１０％を超えて阻害しない。幾つかの態様において、ｐ３８阻害剤は、０．０５ｍＭより低い濃度において、インビトロアッセイにおいて計算されたところによれば５０％のＴ細胞においてＴ細胞の活性化を１０％を超えて阻害しない。幾つかの態様において、ｐ３８阻害剤は、０．０１ｍＭより低い濃度において、インビトロアッセイにおいて計算されたところによれば５０％のＴ細胞においてＴ細胞の活性化を１０％を超えて阻害しない。
【００３４】
いくつかの態様によれば、本発明は、ＨＩＶに感染した人を治療する方法を提供し、ＦａｓＬ発現を阻害するのに有効なｐ３８キナーゼ阻害剤を含む薬学組成物の量を投与する工程を含む。幾つかの態様において、投与されるｐ３８キナーゼ阻害剤の量は、Ｔ細胞の活性化を阻害することなくＨＩＶの複製を阻害するのに有効である。幾つかの態様において、本発明は、ＨＩＶに感染されたと同定された人を治療する方法を提供し、ＦａｓＬ発現及びＨＩＶ複製を阻害するのに有効な量にてｐ３８キナーゼ阻害剤を投与する工程を含む。幾つかの態様において、本発明は、ＨＩＶに感染されたと同定された人を治療する方法を提供し、Ｔ細胞活性化を阻害することなしに、ＦａｓＬ発現及びＨＩＶ複製を阻害するのに有効な量にてｐ３８キナーゼ阻害剤を投与する工程を含む。
【００３５】
ＨＩＶを有する患者の有効な治療は、感染の重度又はそこからの兆候における低下を導く。Ｔ細胞数の安定化又は増加は、数人の患者のための治療の有効性を測定するのに使用してよい一つの基準である。使用してよい別の基準は、ウイルス力価の安定化又は低下又は排除である。ＨＩＶに暴露されたか又は彼らがＨＩＶに暴露された疑いのある以前は未感染であった人の有効な治療は、感染のあらゆる指標の不在、例えば、ウイルス抗原の不在又は検出可能なウイルスの不在のはずである。
【００３６】
幾つかの態様において、ＨＩＶに感染した人を治療する方法は、ＨＩＶに感染していると同定された人に、ＨＩＶの治療に使用してよい一つ又はそれより多い追加の治療剤をｐ３８阻害剤と組み合わせて投与する工程を含む。ＨＩＶを治療するのに使用することができる「追加の治療剤」の例は、限定ではないが、融合阻害剤（即ち、エンフビルチド（ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ））、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩｓ，即ち、デラビルジン、エファビレンツ、ネビラピン）、ヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩｓ，即ち、アバカビル、アバカビル、ラミブジン、及びジドブジンの組み合わせ、ジダノシン、ラミブジン、ラミブジンとジドブジンの組み合わせ、スタブジン、テノフォビルＤＦ、ザルシタビン、ジドブジン）、プロテアーゼ阻害剤（即ち、アンプレナビル、インディナビル、ロピナビルとニトナビルの組み合わせ、ネルフィナビル、リトナビル、サクイナビル、インビラーゼ）、等々を含む。本明細書に記載されていない他の追加の治療剤も、ｐ３８キナーゼ阻害剤と同時投与することができる。治療剤の同時投与は、順々又は同時のいずれかにて、連続して起こり得る。或いは、ｐ３８阻害剤を含む一つ又はそれより多い治療剤を組み合わせてか又は共同して（ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ）投与する他のあらゆる養生法である。
【００３７】
ＨＩＶに感染した人の同定
本発明は、ＨＩＶに感染したと人を同定するための如何なる手段にも限定されない。ＨＩＶに感染した人を同定するための多数のよく知られた方法が存在する。ひとたび同定されたら、ｐ３８阻害剤は、ＨＩＶに完成したＴ細胞中のＦａｓＬの発現及び／又はＨＩＶ複製を阻害するのに有効な量にてＨＩＶに感染した人に投与される。幾つかの態様において、当該方法は、だが一方に（ｗｈｉｌｅ ｉｎ ｏｔｈｅｒ）、以前に診断されたかもしれず、且つＨＩＶ感染を有すると同定された人として知られる人を同定する工程を含む。
【００３８】
ＨＩＶに暴露された人のｐ３８阻害剤による治療
本発明は、ＨＩＶに暴露された疑いのある人を治療する方法も提供する。ＨＩＶ陽性であると診断されなかった多くの人は、ＨＩＶに暴露された可能性があり得たが、ＨＩＶに暴露されたか又はＨＩＶに感染したか否かが不明確である可能性がある状況に置かれた。ＨＩＶに暴露された疑いのある人を治療するためには、その人に上記のとおりにＨＩＶ感染者の治療においてｐ３８阻害剤を投与する。ＨＩＶに暴露された疑いのある人の治療は、上記のとおりに追加の治療剤の投与を含んでよい。予後治療のコースは、ＨＩＶ感染の指標のために定期的に監視することと共同して実施してよい。
【００３９】
薬学組成物及び投与の経路
薬学組成物は、当業者により、投与の選択された様式に依存して選択された組成物により製剤化してよい。適切な薬学上の担体は、この分野の標準の参照テキストであるレミントンのファマシューティカルサイエンセズ、Ａ．Ｏｓｏｌのもっとも最近の版に記載されている。
【００４０】
薬学組成物を投与することは、当業者に知られている様々な方法の何れかを用いて行うか又は実施することができる。全身性（ｓｙｓｔｅｍｉｃ）製剤は、注射による投与のためにデザインされたものを含み、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内（ｉｎｔｒａｓｔｈｅｃａｌ）又は腹腔内の注射、並びに、経皮、経粘、経口又は肺動脈投与のためにデザインされたものを含む。
【００４１】
注射のためには、発明の化合物を、水性溶液、好ましくは、生理学上適合可能なバッファー、例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、又は生理学上の塩溶液中で製剤化してよい。当該溶液は、製剤化剤、例えば、懸濁液、安定化剤及び／又は分散剤を含んでよい。注射可能物（ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅｓ）は、滅菌されており、発熱物質フリーである。当該化合物は、適切な媒質、例えば発熱物質フリーの滅菌水により使用前に戻す（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）ための粉末形態であってよい。経粘膜投与のためには、バリヤーに浸透するのに適した浸透剤（ｐｅｎｅｔｒａｎｔｓ）を製剤に用いる。そのような浸透剤は、一般に当業界において知られている。
【００４２】
非経口投与のためには、ｐ３８阻害剤を、例えば、溶液、懸濁液、エマルジョンとして製剤化するか、又は薬学上受容可能な経静脈媒質と共に凍結乾燥粉末にすることができる。そのような媒質の例は、水、栄養溶液、リンゲル溶液、デキストロース溶液、５％ヒト血清アルブミン、リンゲルデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸化されたリンゲルと固定されたオイル、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、レシチン、落花生油又はゴマ（ｓｅｓａｍｅ）油である。リポソーム非水性媒質、例えば、固定されたオイルを使用してもよい。媒質又は凍結乾燥された粉末は、等張性を維持する付加物（例えば、塩化ナトリウム、マニトール）及び化学安定性を維持する付加物（例えば、バッファー及び保存剤）を含んでよい。製剤は、普通に使用される技術により安定化される。非経口投薬量形態は、水又は別の滅菌担体を用いて調製してよい。例えば、注射による投与に適した非経口組成物は、１．５重量％の活性成分を０．９％の塩化ナトリウム溶液に溶解することにより調製する。或いは、溶液を凍結乾燥し、次に、投与直前に適切な溶剤により戻す（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ）ことができる。
【００４３】
薬学上受容可能な担体は、当業者に知られており、限定ではないが、０．０１−０．１Ｍ、そして好ましくは０．０５Ｍのリン酸バッファー又は０．８％の塩溶液を含む。静脈内担体は、流体及び栄養性補給物（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒｓ）、電解質補給物、例えば、リンゲルデキストロース等に基づくものを含む。さらに、そのような薬学上受容可能な担体は、水性又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルジョンであり得る。非水性溶剤の例は、プロピレングリコールポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油、及び注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルである。水性の担体は、水、エタノール、アルコール性／水性溶液、グリセロール、エマルジョン又は懸濁液を含み、塩溶液及び緩衝化された培地を含む。
【００４４】
薬学組成物は、慣用の薬学賦形剤及び化合物化（ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ）技術を用いて調製することができる。経口投薬形態は、治療される患者による経口摂取（ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ）のための、エリキシル、シロップ、タブレット、ピル、糖衣錠、カプセル、流体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等であってよい。典型的な固形担体は、不活性物質、例えば、ラクトース、スターチ、グルコース、セルロース調製物、例えば、トウモロコシスターチ、コムギスターチ、コメスターチ、ポテトスターチ、ゼラチン、トラガカンゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピレンメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）；顆粒化剤（ｇｒａｎｕｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）；結合剤、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、マニトール等であってよい。カプセルの形態の組成物は日常的な封入手法を用いて調製することができる。例えば、活性成分を含む沈殿物は、標準の担体を用いて調製して、次に、堅いゼラチンカプセルに満たすことができ；或いは、分散液又は懸濁液は、あらゆる適切な薬学上の担体、例えば、水性ゴム、セルロース、シリケート又はオイルを用いて調製することができ、そして次に分散液又は懸濁液を柔らかいゼラチンカプセルに満たす。典型的な流体経口賦形剤は、エタノール、グリセロールグリセリン、非水性溶剤、例えば、懸濁液、保存剤、芳香剤、発色剤等を伴うポリエチレングリコール、オイル、又は水を含む。全ての賦形剤は、必要により、崩壊剤、希釈剤、潤滑剤等と、投薬形態を調製する当業者に知られている慣用の技術を用いて、混合してよい。所望ならば、崩壊剤、例えば、架橋結合されたポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸又はその塩、例えば、アルギン酸ナトリウムを加えてよい。所望ならば、固形投薬形態は、標準の技術を用いて、糖コートされるか又は腸溶コートされてよい。経口流体調製物、例えば、懸濁、エリキシル及び溶液のためには、適切な担体、賦形剤又は希釈剤は、水、グリコール、オイル、アルコール等を含む。さらに、芳香剤、保存剤、発色剤等を加えてよい。
【００４５】
口内（ｂｕｃｃａｌ）投与のためには、上記化合物は、慣用の様式において製剤化された、タブレット、薬用ドロップ（ｌｏｚｅｎｇｅｓ）、等の形態であってよい。上記化合物は、直腸内又は膣内組成物、例えば、座薬又は浣腸剤にて製剤化してもよい。典型的な座薬製剤は、結合剤及び／又は潤滑剤、例えば、ポリマー性グリコール、グリセリド、ゼラチン又はココアバター又は他の低融点の植物性又は合成のワックス又は脂肪を含む。吸入（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）による投与のためには、発明による用途のための化合物は、加圧されたパック又は噴霧機からのエアロゾルスプレーの形態にて、適切な高圧ガス、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素又は他の適切なガスの使用と共に、便利に送達される。加圧されたエアロゾルの場合、測量された量を送達するためのバルブを用意することにより、投薬ユニットを決定してよい。吸入器（ｉｎｈａｌｅｒ）又は吸入器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）における使用のための例えばゼラチンのカプセル又はカートリッジを製剤化してよく、上記化合物と適切な粉末基剤、例えば、ラクトース又はスターチの粉末混合物を含む。
【００４６】
製剤は、移植（例えば、皮下又は筋肉内）によるか又は筋肉内注射により投与することができる貯蔵物（ｄｅｐｏｔ）調製物であってもよい。そのような態様においては、上記組成物を、適切なポリマー性又は疎水性材料（例えば、受容可能なオイル中のエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂によるか、又は節約性の（ｓｐａｒｉｎｇｌｙ）溶解性の誘導体、例えば、節約性の溶解性の塩として製剤化してよい。
【００４７】
或いは、他の薬剤送達系を用いてよい。リポソームとエマルジョンは、使用してよい送達媒質のよく知られた例である。特定の有機溶剤、例えば、ジメチルスルフォキシドも用いてよいが、通常は多大な毒性を犠牲にする。さらに、上記化合物は、徐放系、例えば、治療剤を含む固形ポリマーの半透性マトリックスを用いて送達してよい。様々な徐放性材料が確立されており、当業者にはよく知られている。それらの化学的性質に依存して、徐放カプセルは、数週から１００日にわたり上記化合物を放出する。治療剤の化学的性質と生物学上の安定性に依存して、蛋白質の安定化のための付加的な戦略を用いてよい。
【００４８】
発明において使用される化合物は、丸薬注射（ｂｏｌｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）又は連続注入による経静脈投与のために製剤化してもよく、ユニット投薬形態、例えば、アンプル、バイアル、少量注入又は予め充填されたシリンジにて、又は追加された保存剤を伴う複数投薬量コンテナ内に存在させてよい。
【００４９】
保存剤及び他の付加物も存在させることができ、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス等を含む。全ての担体は必要に応じて、分解剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｎｔ）、希釈剤、顆粒化剤、潤滑剤、結合剤等と共に、当業界で知られている慣用の技術を用いて混合することができる。
【００５０】
投薬及び治療養生法
本発明によれば、ＨＩＶに感染していると同定された人を治療する方法は、そのような人に、ＨＩＶに感染した細胞内でのＦａｓＬ発現を阻害するのに十分な量にｐ３８阻害剤を送達させることにより、実施される。そうすることにより、感染した細胞は、それらが接触するほとんどの未感染細胞においてアポトーシスを誘導せず、それによりＴ細胞の数が増加するか、又は遅い速度で低下する。即ち、ＦａｓＬ発現を阻害する投薬量にてのｐ３８阻害剤の投与を含まない治療に比較して、患者の生存が延長されるか、及び／又は生活の質が改善される。本発明は、ＨＩＶ感染細胞においてＦａｓＬ発現のＮｅｆ媒介性アップ制御を阻害する方法を提供し、ｐ３８阻害剤を、そのような細胞に、ＦａｓＬ発現のＮｅｆ媒介性アップ制御を阻害するのに有効な量にて送達する工程を含む。
【００５１】
ＨＩＶ複製
上に記載された薬学組成物は、人の体内の薬剤作用部位に活性薬剤を到達させることができるあらゆる手段により投与してよい。投与される投薬量は、薬力学特性；その投与の様式と経路；レシピエントの年齢、健康状態、及び体重；兆候の性質と程度；併用される治療の種類；及び治療の頻度のような因子に依存して変更される。
【００５２】
投与される化合物の量は、治療される被験者、被験者の体重、苦痛の重度、投与の様式及び処方する医師の判定に依存することになる。幾つかの態様において、投薬量の範囲は、平均的（７０ｋｇ）のヒトに関して、約１から３０００ｍｇ、特に約１０から１０００ｍｇ又は約２５から５００ｍｇの活性成分であり、幾つかの態様においては１日あたり１回から４回である。一般に、発明において使用される個々の化合物の活性は変更される。
【００５３】
投薬の量及び間隔は、治療効果を維持するのに十分な、化合物の血漿レベルを提供するように個別に調節してよい。通常、活性成分の投薬量は、体重のキログラムあたり約１マイクログラムから１００ミリグラムであり得る。幾つかの態様において、投薬量は、体重のキログラムあたり、０．０５ｍｇから約２００ｍｇである。別の態様において、有効な投薬量は、約０．５ｍｇから約５０ｍｇを送達するのに十分な投薬量である。通常、１日あたりキログラムあたり、１日に１から６回の分割された投薬にて又は徐放形態にて、０．０１から５０ミリグラム、幾つかの態様においては０．１から２０ミリグラムが、所望の結果を得るのに有効である。幾つかの態様において、注射による投与のための患者投薬量は、約０．１から５ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは、約０．５から１ｍｇ／ｋｇ／日である。治療上有効な血清レベルは、各日に副数投薬量を投与することにより達成される。延長された期間の治療が、有効な治療のために必要であると認識される。
【００５４】
幾つかの態様において、経路は経口投与によるか又は静脈内注入によってよい。経口投薬量は、通常、１日あたり約０．０５から１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。発明において使用される幾つかの化合物は、１日あたり、約０．０５から５０ｍｇ／ｋｇの範囲であるが、その他は１日あたり、約０．０５から約２０ｍｇ／ｋｇの範囲である。注入投薬量は、約１．０から１．０．ｔｉｍｅｓ．１０^４マイクログラム／ｋｇ／分の阻害剤の範囲であり得て、数分から数日の範囲の期間にわたり薬学上の担体と混合される。
【００５５】
ドラッグ送達方法
本発明は、さらに、抗−ＨＩＶ活性のための化合物をスクリーニングする方法を提供する。当該方法は、ＦａｓＬ発現をＮｅｆ媒介性アップ制御されて有する細胞内のＦａｓＬ発現に対するそれらの効果を決定するための試験化合物を提供する。ＦａｓＬ発現は、化合物を同定するためのマーカーとして使用することができる。幾つかの態様によれば、そのような化合物を同定する方法は、ＦａｓＬの発現をアップ制御するのに十分な量にてＮｅｆを発現する細胞を試験化合物に接触させ、そしてＦａｓＬ発現のレベルを測定する工程を含む試験アッセイを実施することを含む。試験アッセイにおけるＦａｓＬ発現のレベルを、試験化合物の不在下で起こるＦａｓＬ発現のレベルと比較する。幾つかの態様においては、上記方法は、さらに、ＦａｓＬの発現をアップ制御するのに十分な量にてＮｅｆを発現する細胞を、ＦａｓＬ発現を変調する物質を何ら含まないサンプルに接触させ、そしてＦａｓＬ発現のレベルを測定する工程を含む陰性対照アッセイを含む。陰性アッセイデータは、試験アッセイデータとの比較においての参照点として使用してよい。幾つかの態様において、上記方法は、さらに、ＦａｓＬの発現をアップ制御するのに十分な量にてＮｅｆを発現する細胞を、Ｎｅｆ媒介性ＦａｓＬ発現を阻害することが知られている化合物に接触させ、そしてＦａｓＬ発現のレベルを測定する工程を含む陽性対照アッセイを含む。陽性アッセイデータは、試験アッセイデータとの比較においての参照点として使用してよい。上記方法は、ＨＩＶに感染した細胞又はＮｅｆを発現するように操作された細胞を用いて実施することができる。そのようなアッセイにおいて有用な細胞は、ＦａｓＬ発現のＮｅｆ媒介性アップ制御を経る（ｕｎｄｅｒｇｏ）。ＦａｓＬ発現を測定するための方法のために使用され得るアッセイは、当業者によく知られており、日常的な実験しか必要としない。当業者によく知られているアッセイの例は、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチアッセイ、フローサイトメトリー、免疫沈殿、ＰＣＲ等を含む。
【００５６】
幾つかの態様において、そのようなアッセイを実施するためのキットを提供してよい。キットは、ａ）１）適切な細胞中でのトランスフェクションのためにＮｅｆをコードする発現ベクター及び任意に、使用することができる細胞を含むコンテナ又は２）Ｎｅｆを発現する形質転換された細胞又は３）１）及び２）の両方；及びｂ）アッセイを実施するための指示書を含む。当該キットは、さらに、ＦａｓＬ発現の検出において有用な試薬を含んでよい。当該キットは、さらに、陽性及び陰性データの写真、例及び／又は描写を含んでよい。
【００５７】
発明の特定の側面によれば、ｐ３８キナーゼ及び／又はＪＮＫシグナリング経路のＮｅｆ−媒介性活性化を阻害する化合物を同定する方法が提供される。ｐ３８経路の活性化のレベルを測定する方法は、限定ではないが、ｐ３８又はＪＮＫの下流の分子の、ｐ３８又はＪＮＫのリン酸化のレベルを測定することを含み、限定ではないが、ｐ３８又はＪＮＫの上流の分子の、有糸分裂促進物質（ｍｉｔｏｇｅｎ）活性化された蛋白質キナーゼ活性化蛋白質キナーゼ−２（ＭＡＰＫＡＰＫ−２，ＭＫ２）、熱ショック蛋白質７０（ＨＳＰ−７０）、ＡＴＦ−２，又はｃ−ｊｕｎ、例えばＭＫＫ３，ＭＫＫ４，ＭＫＫ６又はその他を含む。
【００５８】
本発明は、ｐ３８及びｐ３８経路の阻害に関する化合物をスクリーニングする方法をさらに提供する。当該方法は、ＦａｓＬ発現のＮｅｆ媒介性アップ制御を有する細胞内でのＦａｓＬに対するそれらの効果を測定するための試験化合物を提供する。ＦａｓＬ発現は、化合物を同定するためのマーカーとして使用することができる。幾つかの態様によれば、そのような化合物を同定する方法は、ＦａｓＬの発現をアップ制御するのに十分な量にて、Ｎｅｆを発現する細胞を、試験化合物と接触させ、そしてＦａｓＬ発現のレベルを測定する工程を含む試験アッセイを実施することを含む。試験アッセイにおけるＦａｓＬ発現のレベルを、試験化合物の不在下で起こるＦａｓＬ発現のレベルと比較する。幾つかの態様において、当該方法は、さらに、ＦａｓＬの発現をアップ制御するのに十分な量にて、Ｎｅｆを発現する細胞を、ＦａｓＬ発現を変調させる如何なる物質をも含まないサンプルと接触させ、そしてＦａｓＬ発現のレベルを測定する工程を含む陰性対照アッセイを含む。陰性対照データを、試験アッセイデータとの比較における参照点として使用してよい。幾つかの態様において、上記方法は、さらに、ＦａｓＬの発現をアップ制御するのに十分な量にて、Ｎｅｆを発現する細胞を、ｐ３８阻害剤と接触させ、そしてＦａｓＬ発現のレベルを測定する工程を含む陽性対照アッセイを含む。陽性対照データを、試験アッセイデータとの比較における参照点として使用してよい。当該方法は、ＨＩＶに感染した細胞又はＮｅｆを発現するように操作された細胞を用いて実施することができる。そのようなアッセイにおいて有用な細胞は、ＦａｓＬ発現のＮｅｆ媒介性アップ制御を経る。ＦａｓＬ発現を測定するための方法のために使用できるアッセイは、当業者によく知られており、そして日常的な実験しか必要としない。当業者によく知られているアッセイの例は、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチアッセイ、フローサイトメトリー、免疫沈殿、ＰＣＲ等を含む。方法は、さらに、ｐ３８上での化合物の活性をさらに試験する工程を含む。
【００５９】
幾つかの態様において、そのようなアッセイを実施するためのキットを提供してよい。キットは、ａ）１）適切な細胞中でのトランスフェクションのためにＮｅｆをコードする発現ベクター及び任意に、使用することができる細胞を含むコンテナ又は２）Ｎｅｆを発現する形質転換された細胞又は３）１）及び２）の両方；及びｂ）アッセイを実施するための指示書を含む。当該キットは、さらに、ＦａｓＬ発現の検出において有用な試薬を含んでよい。キットは、任意に、ｐ３８を含むコンテナを含んでよい。当該キットは、さらに、陽性及び陰性データの写真、例及び／又は描写を含んでよい。さらに、キットは、ｐ３８活性に対するそれらの効果に関して試験化合物をさらに試験するための成分を含んでよい。
【００６０】
本発明は、さらに、ＪＮＫ及びＪＮＫ経路の阻害に関して化合物をスクリーニングする方法を提供する。当該方法は、ＦａｓＬ発現のＮｅｆ媒介性アップ制御を有する細胞における、ＦａｓＬ発現に対するそれらの効果を測定するための試験化合物を提供する。ＦａｓＬ発現は、化合物を同定するためのマーカーとして使用することができる。幾つかの態様によれば、そのような化合物を同定する方法は、ＦａｓＬの発現をアップ制御するのに十分な量にて、Ｎｅｆを発現する細胞を、試験化合物と接触させ、そしてＦａｓＬ発現のレベルを測定する工程を含む試験アッセイを実施することを含む。試験アッセイにおけるＦａｓＬ発現のレベルを、試験化合物の不在下で起こるＦａｓＬ発現のレベルと比較する。幾つかの態様において、当該方法は、さらに、ＦａｓＬの発現をアップ制御するのに十分な量にて、Ｎｅｆを発現する細胞を、ＦａｓＬ発現を変調させる如何なる物質をも含まないサンプルと接触させ、そしてＦａｓＬ発現のレベルを測定する工程を含む陰性対照アッセイを含む。陰性対照データを、試験アッセイデータとの比較における参照点として使用してよい。幾つかの態様において、上記方法は、さらに、ＦａｓＬの発現をアップ制御するのに十分な量にて、Ｎｅｆを発現する細胞を、ＪＮＫ阻害剤と接触させ、そしてＦａｓＬ発現のレベルを測定する工程を含む陽性対照アッセイを含む。陽性対照データを、試験アッセイデータとの比較における参照点として使用してよい。当該方法は、ＨＩＶに感染した細胞又はＮｅｆを発現するように操作された細胞を用いて実施することができる。そのようなアッセイにおいて有用な細胞は、ＦａｓＬ発現のＮｅｆ媒介性アップ制御を経る。ＦａｓＬ発現を測定するための方法のために使用できるアッセイは、当業者によく知られており、そして日常的な実験しか必要としない。当業者によく知られているアッセイの例は、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチアッセイ、フローサイトメトリー、免疫沈殿、ＰＣＲ等を含む。方法は、さらに、ＪＮＫ上での化合物の活性をさらに試験する工程を含む。
【００６１】
幾つかの態様において、そのようなアッセイを実施するためのキットを提供してよい。キットは、ａ）１）適切な細胞中でのトランスフェクションのためにＮｅｆをコードする発現ベクター及び任意に、使用することができる細胞を含むコンテナ又は２）Ｎｅｆを発現する形質転換された細胞又は３）１）及び２）の両方；及びｂ）アッセイを実施するための指示書を含む。当該キットは、さらに、ＦａｓＬ発現の検出において有用な試薬を含んでよい。キットは、任意に、ＪＮＫを含むコンテナを含んでよい。当該キットは、さらに、陽性及び陰性データの写真、例及び／又は描写を含んでよい。さらに、キットは、ＪＮＫ活性に対するそれらの効果に関して試験化合物をさらに試験するための成分を含んでよい。
【００６２】
実施例
実施例１
新規なｐ３８阻害剤がインビトロにおいてＨＩＶ−１の複製を徐々に衰えさせる（ｕｎｄｅｒｍｉｎｅ）ことが観察された。複数の細胞表現型上での発散性（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）ウイルス単離物は、全て、ｐ３８封鎖（ｂｌｏｃｋａｄｅ）による阻害に対して感受性であった。発明は、ＨＩＶの病原性に対するｐ３８封鎖の防御効果に関する。当該ｐ３８封鎖は、標的の細胞のＨＩＶ媒介性アポトーシスを、大いに阻害することができる。このアポトーシスの事象は、ＨＩＶ感染によるＦａｓＬのアップ制御と調和した。分析が証明したことは、ｐ３８封鎖がＦａｓＬアップ制御を妨害できたことであった。ＨＩＶの個々の遺伝子産物の効果の分析は、Ｎｅｆがこのアップ制御に関して独特に必須であったこと、及びＣｐｄ４がｐ３８にリンクした転写因子活性化に依存していると観察されたＮｅｆ推進性ＦａｓＬ活性化を妨害できたことであった。さらに、Ｃｐｄ４は傍観者の細胞のＮｅｆ推進性アポトーシスを妨害できた。ＨＩＶ−１のＮｅｆ推進性病原性、ｐ３８ ＭＡＰＫ経路と、宿主細胞アポトーシスの間には、リンクがある。ＨＩＶ−１によるこの経路の利用（ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ）を妨害することは、ＨＩＶドラッグの開発に関して、有望な重要性の容易に接近可能な新規なエリアを代表する。
【００６３】
材料と方法
ＭＡＰＫ阻害剤（ｐ３８阻害剤）
ｐ３８阻害剤Ｃｐｄ４又はＳＢ２０３５８０は、以前に記載された。両化合物は、１μＭの濃度においてｐ３８ ＭＡＰキナーゼを阻害する。当該化合物をジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、そして希釈することにより、示されたとおりに、１００μＭ又は１μＭの最終濃度にした。対照として、等量のＤＭＳＯを実験対照細胞に加えた。
【００６４】
細胞
ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞系ジュルカット、又は単球系Ｕ９３７は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ロックビル、ＭＤ）から得た。細胞は１０％ ＦＢＳ，２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ，及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを追加したＲＰＭＩ１６４０中で継代し、３７℃及び５％ＣＯ_２にて維持し、そしてそれらがマイコプラズマ陰性であったことを証明すると日常的に立証された。ヒトＰＢＭＣｓは、健康なＨＩＶ血清陰性ドナーから、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ分離（ファルマシアバイオテックＡＢ、スエーデン）により単離した。健康な成人からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は、ヒト組換えインターロイキン−２（ｈｒＩＬ−２；Ｒ＆Ｄシステム、ＭＮ）５Ｕ／ｍｌの添加前に、２日間、５μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ，シグマ）と共に、インキュベートした。
【００６５】
単球由来のマクロファージ（ＭＤＭ）は、健康なドナーから得たＰＢＭＣｓから調製し、そして３７℃においてポリスチレンＴ−７５フラスコ中で４−１０日間、３７℃にてインキュベートした。インキュベーションの後に、細胞をＲＰＭＩ １６４０により３回洗浄することにより、非接着細胞を除去した。接着細胞をエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）により剥がし、そして相して単離された単球細胞集団の精製度が＞９８％であったことを、ＣＤ１４^＋に関するＦＡＣＳ染色により測定した。ＣＤ１４^＋陽性細胞を６ウエルプレート中で１ｘ１０^６細胞／ｍｌにて、１０％ヒト血清を付加したＰＲＭＩ培地中でインキュベートした。
【００６６】
ＮｅｆによりパッケージされたＨＩＶ−１ビリオンの構築と生成
Ｎｅｆを含む構築物を、示されたコドンにてオーバーラップ伸張ＰＣＲを用いて生成し、そしてｐＣＤＮＡ３．１ベクター（インビトロジェン、ＣＡ）中にクローン化した。ＨＩＶ−１プロウイルス感染性ベクターｐＮＬ４−３をＮＩＨ ＡＩＤＳリサーチ及びレファレンスリージェントプログラムを通して得た。このベクターは、Ｎｅｆ領域内で５’フレームシフト変異によるＮｅｆ欠損にした（Ｈｅ，Ｊ．，Ｃｈｏｅ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９，６７０５−６７１１（１９９５）、引用により本明細書に編入される）。
【００６７】
感染性ウイルスストックを調製するため、ＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡ（ｐＮＬ４−３ Ｗｔ及びｐＮＬ４−３及びＮｅｆデルタ）を、Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３７８２０−３７８３１（２００２）に記載されるとおりに生成させた。ウイルス力価を、連続希釈されたウイルス上清を用いて、ヒトＴ細胞系ジュルカットの感染により測定した。典型的には、ウイルス力価は５−１０ｘ１０^６感染ユニット（ｉｆｕ）／ｍｌの範囲を有した。ｐ２４^ｇａｇ抗原は捕捉ＥＬＩＳＡ（コウルター、ＦＬ）により測定した。ウイルスストックは、感染によるウイルス含有量に関して標準化し、そして力価及びストックをそれらの使用前まで−８０℃においてアリコートにて１０％ＦＢＳの存在下で保存した。
【００６８】
ＨＩＶ−１ウイルス及び感染
これらの研究においてアッセイされたウイルスは、ＣＣＲ５ ＆ ＣｘＣＲ４受容体の両方を用いるｐＮＬ４−３（二重トロピック）ウイルス及びＣＣＲ５ ＆ ＣｘＣＲ４受容体の両方を用いる８９．６（二重トロピック）ウイルスを含んだ。さらに、クレード特異的ウイルスを研究し、そしてこれらは、ＮＩＨ ＡＩＤＳリサーチ及びレファレンスリージェントプログラムを通して得た。感染研究に関しては、ヒトＰＢＭＣｓを正常の血清陰性ドナーから単離して、１００ＴＣＩＤ_５０／１０^６細胞／ｍｌの濃度にてＨＩＶ−１ウイルスと標的化細胞をインキュベートすることにより、感染を達成した。培養上清を、６，１２及び２４時間の間隔で回収し、そして培地に放出されたｐ２４抗原を、ＥＬＩＳＡ（コウルター、ＦＬ）により、製造者の指示書に従い測定することにより、ウイルスの生産をアッセイした。幾つかのデータは平均±ＳＥＭとして表す。パーセント変化として表されたデータに関して、基底ライン（培地のみ）値を、説明文に記載されたとおりに、各実験条件の値から差し引いた。
【００６９】
アポトーシス及びカスパーゼの研究
ＦＡＣＳ分析を実施することにより、アポトーシスを経た細胞を同定した。各試験群からの等しい数の細胞を分析のために回収した。実験細胞中のアポトーシスを、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（ＣＡ）からのアネキシン−Ｖアッセイキットを用いて分析した。データは、ＣＥＬＬ Ｑｕｅｓｔプログラム（ベクトンディッキンソン、ＣＡ）により分析した。カスパーゼ３活性は、カスパーゼ−３／ＣＰＰ３２発色プロテアーゼアッセイキットを用いて、製造者の指示書に従い（ＭＢＬ，ナゴヤ、日本）、測定した。
【００７０】
フローサイトメトリーによるＣＤ９５Ｌの分析
単細胞懸濁液を、０．２％ウシ血清アルブミン及び０．１％ ＮａＮ_３を含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）中で洗浄した。細胞をＰＥ標識された□−ＣＤ９５Ｌ抗体（ＮＯＫ−１，０．０５μｇ／ｍｌ，ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）抗体と共に６０分間４℃においてインキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、そして２％パラホルムアルデヒドにより固定して、２００μｌのＰＢＳに再度懸濁して、ＦＡＣＳ（ＦＬ２ヒストグラム）分析（ベクトンディッキンソン、ＣＡ）に供した。データは、ＣＥＬＬ Ｑｕｅｓｔプログラム（ベクトンディッキンソン、ＣＡ）により分析した。
【００７１】
イムノブロット分析
実験細胞を、氷冷ＰＢＳにより洗浄し、そして細胞を蛋白質溶解バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＥＧＴＡ，１％ ｔｒｉｔｏｎ，２．５ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ □−グリセロールホスフェート、１ｍM Ｎａ_３Ｖｐ_４、１μＭ／ｍｌ ロイペプチン及び１ｍＭ フェニルメチルスルフォニルフルオリド）中で溶解した。簡単な音波処理の後に、溶解物を１０，０００ｒｐｍにおける遠心分離により透明にし、そして蛋白質含有量をブラッドフォード法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＣＡ）により測定した。各抽出物を、ＮＥ−ＰＥＲ核及び細胞質抽出試薬（ピアス、ＵＳＡ）を用いて調製し、そして核抽出物の蛋白質濃度をＢＣＡ−２００蛋白質アッセイキット（ピアス、ＣＡ）により製造者の指示書に従い測定した。
【００７２】
ウエスタンブロット分析に関しては、レーンあたり５０μｇの蛋白質をアクリルアミドゲル上に負荷し、そして１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そしてＰＶＤＦ転写膜にブロットした。イムノブロットを一次抗体（ｃ−Ｊｕｎ，Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）；セルシグナリング、ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて実施し、そしてアマシャムＥＣＬシステムを用いて二次ＨＲＰ−コンジュゲートされた抗−ウサギＩｇＧにより検出した。さらに、１ｘウエスタン再プローブバッファーを用いて膜を徹底的に洗浄し、そして培養においてアクチン発現を認識して細胞を遺伝子発現のための陽性対照として及び内部標準として機能させる抗−アクチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）抗体を用いて再度免疫ブロットした。
【００７３】
ＨＩＶ−１特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞アポトーシス
ヒトＰＢＭＣ’ｓを上記のとおりに健康なＨＩＶ血清陰性ドナーから単離した。ＣＤ４^＋Ｔ細胞の枯渇に関して、磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ，ＣＡ）を用いた陰性免疫選択によりＰＢＭＣから精製されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を単離した。単離されたＣＤ８^＋Ｔ細胞の精製度はフローにより＞９９％の純度であると決定された。ＭＤＭを新たに単離されたＰＢＭＣから上記のとおりに精製した。ＭＤＭ細胞は、６ウエルプレート中で０．５ｘ１０^６細胞／ｍｌ／ウエルにて１０ｍｇ／ｍｌ Ｍ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ、ＭＮ）ＲＰＭＩ １６４０／１０％ヒト血清中で培養した。５日目に、ＭＤＭにＨＩＶ−１ウイルス８９．６を１００ＴＣＩＤ_５０／０．５ｘ１０^６細胞／ｍｌ／ウエルにて感染させた。別の実験群は、以下：偽を処理された群Ｉ（未処理）；ラテックスビーズのみを処理された群ＩＩ；２０μｇ／ｍｌの中和抗−ＦａｓＬモノクローナル抗体（ＺＢ４，ＭＢＬ，日本）を処理された群ＩＩＩ；ラテックスビーズと１μＭのｐ３８阻害剤を処理された群ＩＶであった。５日目に、０．５ｘ１０^６ポリスチレンラテックスビーズ（ＩＤＣ Ｓｐｈｅｒｅｓ，ＯＲ）を、群ＩＩ，ＩＩＩ及びＩＶに２時間３７℃において加え、そしてＣＯ_２インキュベーター中でインキュベートした。０．５ｘ１０^６自己精製されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を加える前に、抗−ＦａｓＬモノクローナル抗体を９０分間加えた。インキュベーションの１４時間後に、細胞を回収し、そして抗ＣＤ８（クローンＲＰＡ−Ｔ８；ＢＤファーミンゲン，ＣＡ）及び／又はＣＤ１４（クローンＭ５Ｅ２；ＢＤファーミンゲン，ＣＡ）を含むＭａｂ’ｓで染色し、そしてさらに、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（ＢＤファーミンゲン、ＣＡ）により対比染色した（ｃｏｕｎｔｅｒ ｓｔａｉｎｅｄ）。上記分析をゲート化されたＣＤ８^＋Ｔ−細胞（Ｒ１）に実施し、そして、アポトーシスをさらに分析するために、全ての実験サンプルにおいて、ＣＤ８^＋／アネキシンンＶ陽性細胞（Ｒ２集団）に関して、ＣＤ８^＋陽性細胞を分析した。
【００７４】
ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１リポーターアッセイ
ジュルカット細胞（１ｘ１０^６）を６０ｍｍの培養皿（Ｆａｌｃｏｎ）上に植えて、当該細胞を次の日に、ＮＦ−κＢ又はＡＰ−１依存性リポータープラスミド（１０μｇ）、ｐＮｅｆ（１０μｇ）により、Ｃｐｄ４（１Ｍ）と共に又は無しで、電気トランスフェクト（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）した。２４時間後に、トランスフェクトされた細胞を製造者の指示書に従い、リポーター溶解バッファーを用いて溶解した（Ｒｏｃｈｅ，ＵＳＡ）。ルシフェラーゼ活性をＬＵＭＡＴ ＬＢ９５０１（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，ＵＳＡ）により測定した。β−Ｇａｌレベルを用いて、化学発光β−Ｇａｌリポーター遺伝子アッセイキット（Ｒｏｃｈｅ，ＵＳＡ）によりトランスフェクション効率に関して標準化した。
【００７５】
統計分析
実験の全ては、少なくとも３回実施した。結果は平均±ＳＥとして表す。統計上の比較は、ＡＮＯＺＡ、次にアンペアドツーテイルドスチューデンツｔ試験により行った。Ｐｓ＜０．０５を有意と考える。
【００７６】
結果
ＨＩＶ−１誘導されたアポトーシスはｐ３８ ＭＡＰＫ／ＪＮＫ阻害剤によりブロックされる
ＨＩＶ−１誘導されたアポトーシスにおけるｐ３８ ＭＡＰＫ／ＪＮＫ阻害剤の役割を決定するために、等しい数のヒトＰＢＭＣｓに、偽（対照）、８９．６又はｐＮＬ４−３ウイルスを感染させた。さらに、感染させた細胞を、１μＭ ＳＢ２０３５８０又はＣｐｄ４又は対照とインキュベートした。各群に関して感染から４日後に細胞を回収し、そしてアネキシンＶ−ＦＩＴＣにより染色することにより分析した。図１Ａ及び図１Ｂに示すとおり、ＨＩＶ−１感染は、何れかのウイルス単離物による標的細胞のアポトーシスを促進させた。ＳＢ２０３５８０は、ウイルスにより推進されるアポトーシスをこの濃度において５０％を超えて阻害した。Ｃｐｄ４は、何れかのウイルス単離物により推進されるアポトーシスを阻害する点ではさらに有力であり、８０％を超える阻害レベルに達する（パネルｉｉｉ及びパネルｉｖ）。これらの結果は、ＨＩＶ−１により誘導されたアポトーシスが、一部には、ｐ３８カスケードをブロックすることにより阻害可能なｐ３８ ＭＡＰＫ活性化及びリン酸化を通して媒介されるのかもしれないことを示唆する。この活性が宿主シグナリング経路を標的化するウイルスにより媒介されることから、それは、保存されたウイルス機能であるかもしれない。従って、我々は、４つのサブタイプの発散性のウイルス単離物によるアポトーシスの誘導を分析した。４つの主要な（ｐｒｉｍａｒｙ）サブタイプ発散性ウイルス全てが、強くて明確に検出可能なレベルの標的細胞アポトーシスをこの感染系において誘導した。観察されたアポトーシスが少なくとも一部はｐ３８経路により媒介されることを確認するために、我々は、両阻害剤がこのウイルス誘導性事象をブロックする能力を試験した。結果は、図１Ａ及び図１Ｂにおいて観察されたのと類似であり、両化合物ＳＢ２０３５８０とＣｐｄ４はアポトーシスを阻害できた。再び、高い抗ｐ３８活性を有するＣｐｄ４は、再びこの阻害において最も有力であったことから、再び、アポトーシス誘導におけるｐ３８ ＭＡＰＫ経路のための直接の役割を支持する（図１Ｃ）。
【００７７】
これらの観察をさらに確認するために、アポトーシス誘導の後期下流活性化、カスパーゼ３活性を試験した。カスパーゼ３は、ＴＮＦ受容体推進性のカスパーゼ８アポトーシス経路並びにミトコンドリア推進性のカスパーゼ９媒介経路の両方の下流にあるから、死刑執行（ｅｘｅｃｕｔｉｏｎｅｒ）カスパーゼとも呼ばれる。カスパーゼ３は、アポトーシスの全ての最後のステージの作用を開始するのに必須である。カスパーゼ３は、８９．６又はｐＮＬ４−３ウイルスの何れかの感染により活性化された（図１Ｄ）。この活性は、ＡＢ２０３５８０によりほぼ５０％阻害され、Ｃｐｄ４による８０％に近い。これらのデータは、アネキシンＶ染色系を用いて得られたデータにきっちりと符合する。
【００７８】
ＦａｓＬ発現はＨＩＶ−１感染により増加される
Ｆａｓ（ＣＤ９５）は、一定の抗体によるか、又はエフェクターＴ細胞及びＮＫ及び樹状細胞上で発現され得るそのリガンドとの相互作用によるその架橋結合の後にアポトーシスを誘発することが示された細胞受容体である。以前の研究が示したことは、ＨＩＶ感染細胞がＦａｓＬ発現をアップ制御して、ＨＩＶ陽性の個体からのＦａｓＬ感受性Ｔ細胞のアポトーシスを選択的に誘導することである。ＨＩＶ感染細胞上でのＦａｓＬのアップ制御は複数の機構を通して生じると報告されたが、しかしながら、最近、この活性化はＮｅｆ抗原にリンクされた。しかしながら、この制御に関与する経路は未知である。観察されたアポトーシスの誘導に基づき（図１Ｃ）、ｐ３８経路のＦａｓＬ推進性アポトーシスへの関連を試験した。ＨＩＶ感染によるＦａｓＬの誘導の確認を最初に調べた。ＦａｓＬの強い誘導が、Ｔ細胞系並びにＰＢＭＣ’ｓの両方において、感染の４８時間後に観察された（図２Ａ）。データが示したことは、ｐ３８ ＭＡＰＫとＳＡＰ／ＪＮＫカスケードがＨＩＶ−１誘導性のアポトーシスに関与しているかもしれないということであった。よって、ｐ３８阻害剤がＦａｓＬのＨＩＶ推進性アップ制御を一部にブロックするように機能するかもしれないことが論証された（ｒｅａｓｏｎｅｄ）。偽又は８９．６又はｐＮＬ４−３−１を感染させたＰＢＭＣ’ｓ又はジュルカット細胞を１μｍのＣｐｄ４で処理して、ＦａｓＬ発現をフローサイトメトリー分析により測定した。ｐ３８封鎖によるＦａｓＬ誘導の強い阻害が観察された（図２Ｂ及び図２Ｃ）。この阻害は、何れの細胞表現型においても且つ研究された何れのウイルスによっても、生じた。これらデータが支持することは、観察されたアポトーシスがｐ３８経路のウイルス活性化により一部は推進されることである。この活性化は、ＨＩＶ感染された細胞上でＦａｓＬの発現を推進するのに、たぶん重要である。
【００７９】
ＨＩＶ−１ Ｎｅｆ及びＣＤ９５Ｌアポトーシス
ＨＩＶ−１は、７つの制御遺伝子をコードする。これらのうち、ｎｅｆ遺伝子産物は高度に保存されている。Ｎｅｆは、動物モデル系においてＡＩＤＳの発症に必須であったことが示されたとおり、実質上のウイルスの毒性因子（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒ）であるらしい。さらに、Ｎｅｆは、ヒト感染において重要であり、そのうえに病原性である。Ｎｅｆは、宿主細胞内に２つの直接の標的と１つの間接の標的を有することが確認された。特定すれば、プラズマ膜におけるＮｅｆのＣＤ４^＋との対合は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞上でのこの受容体の表面変調に一部必須である。さらに、そして同じ機構によりもしかしたら、Ｎｅｆは、そのうえ、ＭＨＣクラスＩ抗原の発現をダウン変調する。このダウン変調の効果は、ウイルス逃避免疫サーベイランスを助けると考えられる。この最近の研究に対して重要なことは、Ｎｅｆが感染細胞上でのＦａｓＬのアップ制御にも関与するという最近の報告である。このアップ制御は、エフェクターＴ細胞を誘発して、排除されるＦａｓＬ発現細胞に接触するようになり、さらに、ウイルスの免疫逃避を助長させる。しかしながら、ｐ３８経路はいくつかの免疫関連遺伝子の活性化に重要であるから、Ｎｅｆが直接ｐ３８経路を活性化することによりＦａｓＬ発現を推進するかもしれないという可能性を探索した。従って、全てが宿主細胞のアポトーシスの現象に関係している４つのＨＩＶ遺伝子産物、ｔａｔ，ｖｐｒ，ｅｎｖ及びｎｅｆを研究することにより、これらの個々の遺伝子の何れかがＦａｓＬ発現を推進できるかを測定した。４つの構築物を個別にジュルカット細胞にトランスフェクトさせ、そしてＦａｓＬ発現のレベルを対照プラスミドと比較した。
【００８０】
図３Ａに示されるとおり、Ｎｅｆは、研究された遺伝子のＦａｓＬ発現の最も有力な誘導因子であった。Ｔａｔ，Ｖｐｒ及びＥｎｖは全て低レベルのＦａｓＬ発現しか誘導しなかったが、Ｎｅｆによるトランスフェクションは、高いレベルのＦａｓＬ発現誘導を特異的に誘導した。これらの結果は、ＨＩＶ感染の間のＦａｓＬ発現を推進することにおけるＮｅｆの唯一の役割を支持する。
【００８１】
Ｎｅｆがｐ３８経路を通してＦａｓＬ発現を推進したか否かを次に直接試験した。ジュルカット細胞にｐＮｅｆ構築物をトランスフェクトし、そしてＣｐｄ４で処理するか又はせず（図３Ｂ）、そしてＦａｓＬ発現を測定した。化合物の不在下では、高いレベルのＦａｓＬ発現がＮｅｆトランスフェクションにより誘導された。この結果は、ＦａｓＬ誘導とＮｅｆ発現の間の関係性を示す最近の研究を確証させる。しかしながら、ＮｅｆとＣｐｄ４の存在下では、ＦａｓＬのＮｅｆ推進性誘導の強力な阻害が観察された。このデータは、Ｎｅｆがｐ３８経路を使用することによりＦａｓＬ発現を活性化することを強く示唆する。
【００８２】
ＨＩＶ−１のＮｅｆ蛋白質はＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌ経路の機能性アップ制御を通してアポトーシスを感作する
上記の研究は、Ｎｅｆの機能、及び単離された遺伝子産物としてのｐ３８経路とのその相互作用を確認した。ウイルス感染のコンテクストにおけるこの研究の確認を次に探索した。従って、Ｎｅｆ発現が欠損した一連のウイルスを構築した。そのようなベクターは、感染の間のＮｅｆ効果の試験を可能にさせる。ウイルスは、材料と方法のセクションに記載されるとおりに、フレームシフト変異をＮｅｆのＯＲＦに導入することにより構築した（図４Ａ）。Ｎｅｆ欠失を確認するため、プロウイルス構築物を一時的に２９３Ｔ細胞、ヒト腎臓推進性細胞系に感染させ、そしてトランスフェクトされた細胞からのＮｅｆ蛋白質の発現及び／又は欠失を、抗−ＨＩＶ−１ Ｎｅｆ抗体を用いた免疫ブロッティングにより分析した（図４Ｂ）。ウイルスを含む特定の欠失のみが、予測されたとおりに、Ｎｅｆの発現を失った。次に、ウイルス粒子を２９３Ｔ細胞への構築物のトランスフェクションにより生成させ、そしてｐ２４生産をＥＬＩＳＡにより決定した。濃縮と標準化に次いで、上清を用いて初期標的細胞に感染させ、そしてウイルスのｐ２４ｇａｇ発現を、抗ｐ２４ｇａｇ抗体により細胞を染色することによりＦＡＣＳ分析により検出し（データは示さず）、そしてｐＮＬ４−３Ｗｔ及びｐＮＬ４−３デルタＮｅｆビリオンによるｐ２４の生産もＥＬＩＳＡにより定量した（図４Ｃ）。全ての場合において、同じレベルのウイルス感染が観察された。
【００８３】
ＦａｓＬ発現はＨＩＶ−１ Ｎｅｆにより感染細胞中で増加される
ＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣ’ｓ培養液中でのＦａｓＬの観察されたアップ制御は、個々の細胞のＨＩＶ感染の直接の結果であり得たか、又はそれはＨＩＶ感染細胞似より生産されたサイトカイン及び／又は可溶性ウイルス蛋白質の間接の結果で有り得た。Ｚａｕｌｉらによる最近の結果（Ｂｌｏｏｄ ９３（３）：１０００−１０（１９９９），引用により本明細書に編入される）は、ＨＩＶ−１のＮｅｆ蛋白質がＴ細胞の分化とシグナリングを変え、そして最適なウイルス複製に必要であることを報告した。上で構築されたウイルスを用いたＮｅｆ陽性又は陰性の偽ウイルス感染アッセイを用いることにより、ＦａｓＬ発現に対する、ウイルスから生まれた（ｂｏｒｎｅ）Ｎｅｆの効果を分析した。ＰＢＭＣ’ｓのウイルス感染の後で、サイトプラズム内のｐ２４ｇａｇ及びＦａｓＬのフローサイトメトリーを、感染の４日後に測定した。図５に示すとおり、ＦａｓＬ発現をアップ制御したＨＩＶ−１のＮｅｆ陽性ウイルス感染細胞において、直接の相関が観察された。二重の（ｄｕａｌ）陽性細胞のパーセンテージを右上の四分円の各群に描写した。ｐ２４を呈した感染細胞の約１／２が４日目にＦａｓＬ陽性であった。ＦａｓＬ陽性細胞は、Ｎｅｆ含有ウイルス内においてのみ存在する細胞の唯一の分離集団を構成した。ｐ２４とＦａｓＬ発現の間の直接の関係は、統計上高度に有意であった（ｐ＜０．０１）。おもしろいことに、培養液の１μＭ濃度におけるＣｐｄ４の処理により、Ｎｅｆ媒介性ＦａｓＬ発現が完全に頓挫した。
【００８４】
ＨＩＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞はｐ３８阻害剤によりブロックされたアポトーシスを誘導した
Ｆａｓ／ＦａｓＬ相互作用により誘導されたアポトーシスは、末梢Ｔ−リンパ球止血及びリンパ球媒介性細胞障害性におけるその関与を通して免疫系において鍵となる役割を担う。生理学的Ｆａｓ／ＦａｓＬ相互作用の制御障害（ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）は、増強されたレベルのＦａｓ−媒介性アポトーシスにより特徴付けされる免疫疾患状態をもたらし得る。ＦａｓＬは、ＨＩＶ感染されたマクロファージ、おそらくはＴ細胞上でアップ制御されて、ＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞のＦａｓ媒介性アポトーシスを誘導することができると仮定された。感受性エフェクターＴリンパ球の、免疫細胞を発現するＦａｓＬとの遭遇は、アポトーシスによりその死を誘発できた。蓄積する証拠は、抗原提示細胞、例えば、マクロファージが、おそらくはこの機構により、活性化されたエフェクターＴ細胞の排除において鍵となる役割を担うかもしれないことを示す。従って、ＨＩＶ感染により誘導されたマクロファージ媒介性ＨＩＶ−特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の可能性及びそのｐ３８経路へのリンクを調査した。ＦａｓＬはマクロファージにより細胞内に保存されるし、感染したマクロファージが食作用によるか又は人工的にそれらの活性化により刺激されたときに表面上で発現されるか又は可溶性ＦａｓＬとして放出されるから、初期マクロファージをラテックスビーズにより刺激することにより、ＨＩＶウイルスによる感染後にそれらの活性化を誘導した。
【００８５】
図６Ａに示すとおり、１００ＴＣＩＤ_５０における８９．６の培養液への感染の４日後に、ＣＤ１４集団をＣＤ８^＋リンパ球集団から容易に識別することができる。さらに、アポトーシスのマーカーとしてアネキシンＶを用いたＣＤ８^＋Ｔ細胞集団上のさらなるゲート化は、高いレベルのアポトーシスがこのときに傍観者ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団内に起こることを明確に示す。ｐ３８経路に対する観察されたアポトーシスの間のリンクを調査した。再び、マクロファージを感染させ、そして再びＣＤ８^＋Ｔ細胞集団上でゲート化した。図６Ｂに示すとおり、たとえ活性化された場合でも、未感染のマクロファージは、試験された如何なる実験条件下でもＣＤ８^＋Ｔ細胞集団のアポトーシスほとんど誘導しない。対照的に、ラテックスビーズで刺激されたＨＩＶ感染マクロファージは、アポトーシスを有力に推進し、この培養液中でほぼ５０％のＣＤ８^＋Ｔ細胞を殺傷した。このアポトーシスがＦａｓ／ＦａｓＬ経路により媒介されるか否かを決定するために、我々は、中和性抗ＦａｓＬモノクローナル抗体を上記細胞培養液に加えることにより、アポトーシスをブロックすることを試みた。ＦａｓＬの添加は、観察されたアポトーシスのほとんどをブロックできた。観察された傍観者ＣＤ８^＋Ｔ細胞アポトーシスに対してｐ３８阻害剤が衝撃を与える能力を試験した。ｐ３８封鎖は、傍観者アポトーシスを阻害することにおいてＦａｓＬ抗体とほぼ同じく有効であったが、いくつかの違いが観察された。この違いは、他のアクセサリー遺伝子が非ｐ３８媒介性機構によるように、ＦａｓＬ発現により誘導される傍観者アポトーシスにおいて役割を担い得る事を示唆する以前の報告に一致する。一緒にすると、これらの発見は、ＨＩＶ感染マクロファージがＨＩＶ感染の間にＣＤ８^＋Ｔ細胞のＣＤ９５／Ｆａｓ媒介性アポトーシスを誘導できることを、明確に示す。これらの傍観者ＣＤ８^＋Ｔ細胞の殺傷は、ｐ３８封鎖によりほぼ完全に阻害され得ることから、傍観者殺傷プロセスにおけるＮｅｆの優占度（ｄｏｍｉｎａｎｃｅ）を示す。
【００８６】
Ｃｐｄ４はＡＰ−１のＨＩＶ−１ Ｎｅｆ媒介性転写を抑圧する
ＡＰ−１は免疫活性化における重要な転写因子である。それは、抗原提示細胞並びにＴ細胞においてサイトカイン生産において役割を担うことにより免疫拡大に中心的な役割を担う。その発見後、ＡＰ−１活性は多くの刺激により誘導されることがわかったが、成長因子、サイトカイン、Ｔ細胞活性化、神経伝達物質、及びＵＶ照射を含む。いくつかの機構が、ＡＰ−１活性の誘導に関与し、そしてＡＰ−１成分の豊富さを増加させるもの、及びそれらの活性を刺激するものに分類してよい。真核細胞は、有糸分裂活性化蛋白質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化により、外部ストレス及び炎症性の因子に応答することから、結局は転写の変化をもたらす。ほとんどの場合、ｐ３８は、それらのリン酸化を通してＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＫＫ）３及び６により活性化される。ＭＡＰＫにより活性化された転写は、ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１によるＦａｓＬの転写活性化を推進するのに必須である。よって、これらの経路を通してＦａｓＬ転写を誘導するためのＮｅｆの役割の調査を行った。最初に、ｐＮｅｆを、ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１活性化に特異的なリポーターベクターを含むジュルカット細胞にエレクトロフォレートした。図７Ａ及び７Ｂに示すとおり、Ｎｅｆは有効にこれらの転写因子の両方を活性化した。両群のｐ３８阻害剤Ｃｐｄ４による処理は、有効にこの作用をブロックした。しかしながら、前駆体キナーゼＭＥＫＫ１はｐ３８／ＪＮＫ及びＩＫＫ活性化の両方を有効に誘導することが示された。
【００８７】
ＨＩＶ−１ Ｎｅｆはｐ３８及びＪＮＫのリン酸化を誘導した
ＭＥＫＫ１を誘導することにおけるＮｅｆの役割は決定されないままであった。次に、Ｎｅｆをジュルカット細胞に送達し、そしてそれらをｐ３８ ＭＡＰＫ阻害剤Ｃｐｄ４により処理するか又はしなかった。ｐ３８ ＭＡＰＫとＪＮＫのＨＩＶ−１ Ｎｅｆ誘導性リン酸化状態を調査するため、二通りにリン酸化された状態のこれらの蛋白質を認識するリン酸特異的抗体を用いた。細胞のＮｅｆ処理は、ｐ３８の上記基底レベルのリン酸化において強い増加を誘導した（図７Ｃ）。対照的に、１μＭ投薬量において薬剤への１５分の暴露の後にＣｐｄ４の存在下で、Ｎｅｆ処理された細胞におけるｐ３８のリン酸化に、検出可能な増加はなかった。平行のブロットを走らせ、そして全レベルのｐ３８を検出した抗体により釣り上げた。Ｃｐｄ４への暴露はｐ３８の全レベルを変更せず、等しい蛋白質負荷も確認した。当該データは、Ｎｅｆがｐ３８ ＭＡＰのリン酸化を誘導できることを支持し、それがこの経路の直接の活性化因子であることを示唆する。
【００８８】
さらなる研究により、Ｎｅｆがそのうえｃ−Ｊｕｎのリン酸化を刺激できたか否かを調査した。内生ｃ−Ｊｕｎ蛋白質のリン酸化−状態非依存性レベルを特異的に認識する抗体を用いて、実験を実施した。Ｎｅｆへの１５分の暴露は、投薬量依存性様式にて細胞の核抽出物における強くリン酸化されたｃ−Ｊｕｎをもたらした。対照的に、ごく低いレベルの非リン酸化ｃ−Ｊｕｎしか非刺激対照には観察されなかった。２つのバックグラウンドバンドが、１μＭのＣｐｄ４による細胞の処理後にＮｅｆ処理された群において観察された。これらのバンドは、おそらく、リン酸ｃ−Ｊｕｎ（高いバンド）及び非リン酸化形態（低いバンド）に相当し、この抗体により検出されることが知られている。Ｃｐｄ４標的化細胞中のｃ−ＪｕｎのＮｅｆ媒介性リン酸化のブロッキングは、観察されたＪＮＫのレベルがｃ−Ｊｕｎへのシグナルのトランスダクションをもたらす（図７Ｄ）。Ｃｐｄ４処理には、ＡＰ−１エンハンサー結合転写活性化因子のメンバーであるｃ−Ｊｕｎのリン酸化された状態の減少が伴った。
【００８９】
考察
ＨＩＶ−１感染の特質は、典型的にＣＤ４^＋Ｔ細胞の破壊とインビボ細胞免疫応答の抑圧を含む。皮肉にも、最近の証拠は、ビレマ（ｖｉｒｅｍａ）の有効な免疫応答及び調節は、潜在的な細胞応答の生成に重く依存することを示唆する。事実、ウイルス特異的ＣＴＬｓは、重要なことに、急性なフェーズの感染の調節のせいであり、そしてウイルス負荷が制御され得る機構を象徴する。さらに、ＳＩＶ感染モデルに関する研究も、ウイルス血症（ｖｉｒｅｍｉａ）とウイルス負荷がＣＤ８^＋Ｔ細胞を通して有効に制御できたことを示した。これらの発見によると、ＨＩＶがＴ細胞の枯渇を誘導するように実行する実際の機構に関して幾つか矛盾する報告が存在した。例えば、２つの異なる機構が、ＨＩＶ感染の間のＴ細胞の排除に関して提案された。これら２つは、共に、免疫機能を破壊することにおいて、直接感染としての個々の何れかよりも顕著に有力であると予測され、殺傷はＣＤ４^＋Ｔ細胞に限定されるが、一方、傍観者の殺傷はＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞を含むと考えられ、当該集団細胞は免疫排除に直接的に必須である。間接の細胞殺傷は、ＦａｓＬのアップ制御を含むことにより、エフェクターＣＴＬｓがＣＤ４^＋Ｔ細胞及びマクロファージを運ぶウイルスにアプローチするため、それらのアポトーシスを誘導すると提案された。よって、この作用は、免疫認識を逃れることにおいてＨＩＶのための顕著な利点を表す。
【００９０】
最近、これらのＨＩＶ感染細胞がＣＴＬ誘導性殺傷に耐性であること、及びこの作用がＨＩＶ−１のアクセサリー遺伝子ｎｅｆの発現に依存性であったことが報告された。幾つかの機構がこれらのＮｅｆ媒介性作用に関して予備的に提案された。この作用は、ＡＳＫ−１媒介性ＪＮＫシグナリングの阻害を含むか又はＰＩ−３−キナーゼ及びＰＡＫによるＢａｄの間接リン酸化を通るかもしれない。例えば、Ｘｕら（Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１８９（９）：１４８９−９６（１９９９）引用により本明細書に編入される）による最近の報告は、ＮｅｆがＴＣＲのε鎖に結合し、そしてこの相互作用がＦａｓＬ発現の誘導に重要であったことを報告する。この研究においては、ＦａｓＬ発現の誘導がアミノ酸７３−８２内に位置するプロリンリッチドメイン（ＰｘｘＰ）ドメインに依存しており、プロテインチロシンキナーゼのＳＨ３ドメインに相互作用することが知られている。よって、ε鎖を通したＮｅｆによるＴ−細胞活性化誘導は、ＰｘｘＰドメインを必要とするらしい。さらに、このドメインは、ＮｅｆによるＦａｓＬ転写にも必須であったため、下流のシグナリングを、傍観者Ｔ−細胞アポトーシスの必須の制御因子としてＮｅｆを通してＰｘｘＰドメインにより誘導させる。従って、証拠は、Ｎｅｆも、ｐ２１関連キナーゼファミリー（ＰＡＫ）のメンバーであってＶａｖを通して小ＧＴＰａｓｅ ＣＤＣ４２及びＲａｃ１により活性化されるＮｅｆ−関連キナーゼ（ＮＡＫ）と共に沈殿することを示す。さらに、Ｐａｋ１と２はこの活性化に関係した。しかし、ＦａｓＬ転写の活性化はＣＤ３^＋ε鎖により媒介されるＴＣＲ−ＣＤ３^＋複合体を通して機能すると信じられる。これらの研究はどれも、ＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞の非Ｔ細胞誘導性アポトーシスにおけるＮｅｆの役割を明らかにしていない。ＡＰＣ誘導性傍観者アポトーシスにおいては、Ｎｅｆが関係したが、上記の何れかのどの役割がこれらの細胞中のシグナリングにおいて活動するかは、現在未知である。さらに、これらのアポトーシス作用を誘導するようにＮｅｆが表す本質的な転写シグナルは、未知のままである。そのような機構の解明は重要らしいということは明らかである。全体として、ＣＴＬ誘導性の死に対してそれ自身防御しながら、傍観者細胞のアポトーシスを誘導することによりＮｅｆを通してＨＩＶが一部には免疫からの逃避を伝えるという結論は、ＨＩＶの病原性を理解する上できわめて重要であるらしい。
【００９１】
本明細書に示した結果は、ＨＩＶ媒介性Ｔ細胞活性化とＦａｓＬ転写の必須の下流における連鎖が、有糸分裂因子活性化プロテインキナーゼｐ３８／ＪＮＫ経路を通ることを示す。従って、ＨＩＶに感染したＰＢＭＣｓの、ｐ３８ ＭＡＰＫの選択的阻害剤による処理は、ウイルス誘導性アポトーシスを厳格に停止させるか又は排除した（図１Ａ及び図１Ｂ）。この作用はクレード特異的ではなく、ｐ３８封鎖は、複数のウイルスサブタイプにより誘導される細胞死を有効に減じた（図１Ｃ）。一致して、ジュルカットｔ細胞とＰＢＭＣｓの両者に対する有力なｐ３８阻害剤（Ｃｐｄ４）による処理は、ＦａｓＬの表面発現を厳格に抑圧したことから、ＨＩＶはｐ３８ ＭＡＰＫ経路を通してＦａｓＬ媒介性傍観者アポトーシスを指揮することを示す。
【００９２】
Ｘｕらによる以前の研究は、ＨＩＶ媒介性ＦａｓＬ誘導がＮｅｆ誘導性機能の直接の結果であることを示唆する。我々の結果がこの以前の研究を補強するのは、ｐＶｐｒ，ｐＴａｔ及びｐＥｎｖに比較して、有意なＦａｓＬ発現がｐＮｅｆをトランスフェクトされたジュルカット細胞の間においてのみ観察されたからである（図３Ａ）。より重要なことは、これらの細胞内でのｐ３８ ＭＡＰＫのＣｐｄ４による阻害がＮｅｆ誘導性ＦａｓＬ発現を徹底的に抑圧したことである。さらに、ウイルス感染されたＰＢＭＣｓのｐ３８ ＭＡＰＫがＦａｓＬを発現し続けなかったため、この作用はウイルス感染環境（ｓｅｔｔｉｎｇ）に拡大された。よって、ｐ３８ ＭＡＰＫは、ウイルス感染環境においてＦａｓＬ媒介性の傍観者アポトーシスを誘導するようにＮｅｆが標的とする、必須のシグナルを表す。
【００９３】
ＦａｓＬのＮｅｆ誘導は、傍観者細胞アポトーシスにおいて役割を担うことが示唆された。ｐ３８ ＭＡＰＫ阻害が傍観者殺傷を阻害する能力を分析した。以前の研究は、マクロファージのＨＩＶ感染がＦａｓＬ発現を誘導して、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の有意な傍観者殺傷を推進することを示す。さらに、マクロファージも、ＨＩＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の傍観者殺傷を誘導するようにＦａｓＬアップ制御を推進する。ＦａｓＬ経路によるＣＤ８^＋Ｔ細胞の破壊は、細胞媒介性応答に対する重要なダンパーであるらしく、最終的に免疫排除を制限し得た。よって、ｐ３８阻害がＦａｓＬ発現を変調し、よってマクロファージとＣＤ８^＋Ｔ細胞の間の傍観者殺傷を変調させる能力も調査した。ＨＩＶ感染したマクロファージと自己ＣＤ８^＋Ｔ細胞とのＣｐｄ４の存在及び不在における同時培養は、ｐ３８ ＭＡＰＫの阻害がＣＤ８^＋Ｔ細胞の傍観者アポトーシスを有効にブロックしたことを明らかにした。さらに、この作用は、未感染細胞と混合したときに、ＨＩＶ−１感染患者からのＰＢＭＣｓの間でも観察された。よって、ＨＩＶ−１のＦａｓＬ媒介性傍観者アポトーシスは、複数の環境においてｐ３８／ＪＮＫ阻害により有効にブロックされる。
【００９４】
以前の仕事は、複数の因子がＮＦＡＴ，ｃ−Ｍｙｃ，ＮＦ−κＢ、及びＡＰ−１を含むＦａｓＬ発現を制御するかもしれないことを示唆する。従って、Ｎｅｆ誘導性ＦａｓＬ発現のコンテクストにおけるこれらの因子の必須依存性は、はっきりしない。この作用の生化学機構を詳細に研究するため、我々は、ルシフェラーゼ転写を推進するためにＡＰ−１又はＮＦ−κＢ結合部位を有するリポーターベクターで細胞を感染させた。これらの研究において、Ｎｅｆは、ＡＰ−１とＮＦ−κＢの両方の転写活性化を誘導することにおいて有効であった。より重要なことに、ｐ３８ ＭＡＰＫ阻害剤は、両転写因子の転写を有効に停止させた。さらに、当該阻害剤は、ｐ３８のリン酸化媒介性活性化を低下させることにおいて等しく有効であったため、ｃ−Ｊｕｎのリン酸化の有意な減少をもたらす。よって、当該阻害剤によるｐ３８の妨害は、一部には低下したリン酸化により、両シグナルを減少させる。より注目すべきことは、ＦａｓＬ誘導を媒介するためのＮＦ−κＢ及びＡＰ−１の依存性に関する以前の発見に基づくと、ｐ３８の妨害は、その下流の転写蛋白質を抑圧し、そしてＦａｓＬ発現の抑圧を導くらしい。
【００９５】
ＦａｓＬ誘導された傍観者アポトーシスは、ＣＴＬｓによる宿主枯渇を回避するための、ＨＩＶにより用いられる必須の免疫回避性の機動作戦である。今まで、このプロセスを媒介するシグナリング機構は明らかにされないままである。本明細書の結果は、ｐ３８ ＭＡＰＫシグナリングがＡＰ−１の転写活性化に必須であり、ウイルス環境内でＮｅｆによるＦａｓＬ誘導を推進することを示す。ｐ３８ ＭＡＰＫのＮｅｆ活性化を媒介するキナーゼ類は発見されていないが、にもかかわらず、この経路はＨＩＶ媒介性Ｔ細胞枯渇に対する治療上の開発のためのウイルス標的物を表す。これらの治療剤がウイルス依存性の宿主細胞経路を見かけ上は標的とするため、ＨＩＶはこの中心的な宿主経路を回避する試みにおいて顕著な制限を呈する見込みが無くもない。この経路のさらなる研究は、ＨＩＶ病原性に衝撃を与え得る新規な治療剤又は抗ウイルス併用療法剤の開発のための重要性を有する。
文献（引用により各々編入される）
【００９６】
【表１】

【００９７】
【表２】

【００９８】
【表３】

【００９９】
【表４】

【０１００】
【表５】

【０１０１】
【表６】

【０１０２】
【表７】

【０１０３】
実施例２
幾つかの態様において、上記化合物は、米国特許第５，９６５，５８３号に記載された構造（式１）：
【０１０４】
【化１】

【０１０５】
を有するか又はその薬学上受容可能な塩であり、
式中、
Ｒ_１は、フェニル、置換されたフェニル（置換基はＣ_１−５アルキル、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル、及びニトリルからなる群から選択される）、又はヘテロアリールが５又は６の環状原子を含むヘテロアリールであり；
Ｒ_２は、フェニル、置換されたフェニル（置換基はＣ_１−５アルキル、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル、及びニトリルからなる群から選択される）、ヘテロアリールが５又は６の環状原子を含むヘテロアリールであり、そして任意にＣ_１−４アルキル置換されており；
Ｒ_３は、水素、ＳＥＭ，Ｃ_１−５アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アリールＣ_１−５アルキルオキシカルボニル、アリールＣ_１−５アルキル、置換されたアリールＣ_１−５アルキル（アリール置換基は、Ｃ_１−５アルキル、Ｃ_１−５アルコキシ、ハロゲン、アミノ、Ｃ_１−５アルキルアミノ、及びジＣ_１−５アルキルアミノからなる群の一つ又はそれより多いメンバーから別個に選択される）、フタルイミドＣ_１−５アルキル、アミノＣ_１−５アルキル、ジアミノＣ_１−５アルキル、サクシニミドＣ_１−５アルキル、Ｃ_１−５アルキルカルボニル、アリールカルボニル、Ｃ_１−５アルキルカルボニルＣ_１−５アルキル、アリールオキシカルボニルＣ_１−５アルキル、ヘテロアリールＣ_１−５アルキルであって、ヘテロアリールは５又は６の環状原子を含み；
Ｒ_４は、−−（Ａ）−−（ＣＨ_２）_ｑ−Ｘであり、式中、Ａはビニレン、エチニレン又は
【０１０６】
【化２】

【０１０７】
であり、式中、Ｒ_５は、水素、Ｃ_１−５アルキル、フェニル及びフェニルＣ_１−５アルキルからなる群から選択され；
ｑは、０−９であり；
Ｘは、水素、ヒドロキシ、ビニル、置換されたビニル（一つ又はそれより多い置換基は、フッ素、臭素、塩素及びヨウ素からなる群から選択される）、エチニル、置換されたエチニル（置換基は、フッ素、臭素、塩素及びヨウ素からなる群の一つ又はそれより多くから選択される）、Ｃ_１−５−アルキル、置換されたＣ_１−５アルキル（アルキル置換基は、一つ又はそれより多いＣ_１−５アルコキシトリハロアルキル、フタルイミド及びアミノからなる群から選択される）、Ｃ_３−７シクロアルキル、Ｃ_１−５アルコキシ、置換されたＣ_１−５アルコキシ（アルキル置換基は、フタルイミド及びアミノからなる群から選択される）、フタルイミドオキシ、フェノキシ、置換されたフェノキシ（フェニル置換基は、Ｃ_１−５アルキル、ハロゲン及びＣ_１−５アルコキシからなる群から選択される）、フェニル、置換されたフェニル（フェニル置換基は、Ｃ_１−５アルキル、ハロゲン及びＣ_１−５アルコキシからなる群から選択される）、アリールＣ_１−５アルキル、置換されたアリールＣ_１−５アルキル（アリール置換基は、Ｃ_１−５アルキル、ハロゲン及びＣ_１−５アルコキシからなる群から選択される）、アリールオキシＣ_１−５アルキルアミノ、Ｃ_１−５アルキルアミノ、ジＣ_１−５アルキルアミノ、ニトリル、オキシム、ベンキシルオキシイミノ、Ｃ_１−５アルコキシイミノ、フタルイミド、サクシニミド、Ｃ_１−５アルキルカルボニルオキシ、フェニルカルボニルオキシ、置換されたフェニルカルボニオキシ（フェニル置換基は、Ｃ_１−５アルキル、ハロゲン及びＣ_１−５アルコキシからなる群から選択される）、フェニルＣ_１−５アルキルカルボニルオキシ、（フェニル置換基は、Ｃ_１−５アルキル、ハロゲン及びＣ_１−５アルコキシからなる群から選択される）、アミノカルボニルオキシ、Ｃ_１−５アルキルアミノカルボニルオキシ、ジＣ_１−５アルキルアミノカルボニルオキシ、Ｃ_１−５アルコキシカルボニルオキシ、置換されたＣ_１−５アルコキシカルボニルオキシ（アルキル置換基は、メチル、エチル、イソプロピル及びヘキシルからなる群から選択される）、フェノキシカルボニルオキシ、置換されたフェノキシカルボニルオキシ（フェニル置換基は、Ｃ_１−５アルキル、Ｃ_１−５アルコキシ、及びハロゲンからなる群から選択される）、Ｃ_１−５アルキルチオ、置換されたＣ_１−５アルキルチオ（アルキル置換基は、ヒドロキシ及びフタルイミドからなる群から選択される）、Ｃ_１−５アルキルスルフォニル、フェニルスルフォニル、置換されたフェニルスルフォニル（フェニル置換基は、臭素、フッ素、塩素、Ｃ_１−５アルコキシ及びトリフルオロメチルからなる群から選択される）からなる群から選択され；但し、
もし、Ａが
【０１０８】
【化３】

【０１０９】
ならば、
ｑは０であり、そしてＸはＨであり、そしてＲ_３はＳＥＭでなくてよい；
及びその薬学上受容可能な塩である。
【０１１０】
特定の化合物は、
４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ヒドロキシブチン−１−イル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジニル）イミダゾール、４−（４−フルオロフェニル）−２−（３−ヒドロキシプロピン−１−イル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジニル）イミダゾール、４−（４−フルオロフェニル）−２−（５−ヒドロキシペンチン−１−イル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジニル）イミダゾール、及び４−（４−フルオロフェニル）−２−（６−ヒドロキシヘキシン−１−イル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジニル）イミダゾール、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ヒドロキシブチン−１−イル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジニル）イミダゾール、４−（４−フルオロフェニル）−２−（５−シアノペンチン−１−イル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジニル）イミダゾール、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ジメチルアミノブチン−１−イル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジニル）イミダゾール、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−（フェニルカルボニルオキシ）ブチン−１−イル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジニル）イミダゾール、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルカルボニルオキシ）ブチン−１−イル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジニル）イミダゾール、４−（４−フルオロフェニル）−２−（３−シクロペンチルプロピン−１−イル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジニル）イミダゾール、及び４−（４−フルオロフェニル）−２−（５−（ブチルスルフォニル）ペンチン−１−イル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジニル）イミダゾール、４−（４−フルオロフェニル）−２−（オクチン−１−イル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジニル）イミダゾール、４−（４−フルオロフェニル）−２−（５−ブチルチオペンチン−１−イル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジニル）イミダゾール、４−（４−フルオロフェニル）−２−（５−フェニルペンチン−１−イル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジニル）イミダゾール、４−（４−フルオロフェニル）−２−（５−クロロペンチン−１−イル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジニル）イミダゾール、４−（４−フルオロフェニル）−２−（５−ヒドロキシペンチン−１−イル）−１−（３−フタルイミドールプロピル）−５−（４−ピリジニル）イミダゾール、４−（４−フルオロフェニル）−２−（ペンチン−１−イル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジニル）イミダゾール、及び４−（４−フルオロフェニル）−２−（５−Ｎ−サクシニミドペンチン−１−イル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジニル）イミダゾール、及びそれらの薬学上受容可能な塩を含む。
【０１１１】
実施例３
いくつかの態様において、上記化合物は、米国特許第６，０４０，３２０号に記載された構造（構造２）：
【０１１２】
【化４】

【０１１３】
を有するか、
又はその薬学上受容可能な塩であり、
式中、
Ｒ_１は、フェニル、ヘテロアリールであって、但し、ヘテロアリールは５又は６の環状原子を含むか、又は置換されたフェニルであり、
但し、置換基は、Ｃ_１−５アルキル、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル及びニトリルからなる群の一つ又はメンバーから別個に選択され；
Ｒ_２は、フェニル、ヘテロアリールであってヘテロアリールは５又は６の環状原子を含むヘテロアリール、置換されたヘテロアリールであって置換基は別個にＣ_１−５アルキル及びハロゲンからなる群の一つ又はそれより多いメンバーから選択される置換されたヘテロアリール、又は置換されたフェニルであって、置換基はＣ_１−５アルキル、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル、及びニトリルからなる群の一つ又はメンバーから別個に選択される置換されたフェニルであり；
Ｒ_３は、水素、ＳＥＭ，Ｃ_１−５アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アリールＣ_１−５アルキルオキシカルボニル、アリールＣ_１−５アルキル、フタルイミド_１−５アルキル、アミノＣ_１−５アルキル、ジアミノＣ_１−５アルキル、サクシニミドＣ_１−５アルキル、Ｃ_１−５アルキルカルボニル、アリールカルボニル、Ｃ_１−５アルキルカルボニルＣ_１−５アルキル、アリールオキシカルボニルＣ_１−５アルキル、ヘテロアリールＣ_１−５アルキルであって、ヘテロアリールは５又は６の環状原子を含むか、又は置換されたアリールＣ_１−５アルキルであって、アリール置換基は、Ｃ_１−５アルキル、Ｃ_１−５アルコキシ、ハロゲン、アミノ、Ｃ_１−５アルキルアミノ、及びジＣ_１−５アルキルアミノからなる群の一つ又はそれより多いメンバーから別個に選択される；
Ｒ_４は、−−（Ａ）_ｎ−−（ＣＨ_２）_ｑ−Ｘであり、式中、
Ａは硫黄又はカルボニルであり；
ｎは０又は１であり；
ｑは０−９であり；
Ｘは、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、ビニル、エチニル、Ｃ_１−５アルキル、Ｃ_３−７シクロアルキル、Ｃ_１−５アルコキシ、フェノキシ、フェニル、アリールＣ_１−５アルキル、アミノ、Ｃ_１−５アルキルアミノ、ニトリル、フタルイミド、アミド、フェニルカルボニル、Ｃ_１−５アルキルカルボニル、フェニルアミノカルボニル、アリールＣ_１−５アルキルカルボニル、Ｃ_１−５アルキルチオ、Ｃ_１−５アルキルスルフォニル、フェニルスルフォニル、置換されたスルフォナミドであってスルフォニル置換基はＣ_１−５アルキル、フェニル、アラＣ_１−５アルキル、チエニル、フラニル、及びナフチルからなる群から選択され；置換されたビニルであって置換基はフッ素、臭素、塩素及びヨウ素からなる群の一つ又はメンバーから別個に選択され、置換されたエチニルであって置換基はフッ素、臭素、塩素及びヨウ素からなる群の一つ又はメンバーから別個に選択され、置換されたＣ_１−５アルキルであって置換基は一つ又はそれより多いＣ_１−５アルコキシ、トリハロアルキル、フタルイミド及びアミノからなる群から選択され、置換されたフェニルであってフェニル置換基はＣ_１−５アルキル、ハロゲン及びＣ_１−５アルコキシからなる群の一つ又はそれより多いメンバーから別個に選択され、置換されたフェノキシであってフェニル置換基はＣ_１−５アルキル、ハロゲン及びＣ_１−５アルコキシからなる群の一つ又はそれより多いメンバーから別個に選択され、置換されたＣ_１−５アルコキシであってアルキル置換基はフタルイミド及びアミノからなる群から選択され、置換されたアリールＣ_１−５アルキルであってアルキル置換基はヒドロキシルであり、置換されたアリールＣ_１−５アルキルであってフェニル置換基はＣ_１−５アルキル、ハロゲン及びＣ_１−５アルコキシからなる群の一つ又はそれより多いメンバーから別個に選択され、置換されたアミドであってカルボニル置換基はＣ_１−５アルキル、フェニル、アラＣ_１−５アルキル、チエニル、フラニル、及びナフチルからなる群から選択され、置換されたフェニルカルボニルあってフェニル置換基はＣ_１−５アルキル、ハロゲン及びＣ_１−５アルコキシからなる群の一つ又はメンバーから別個に選択され、置換されたＣ_１−５アルキルチオであってアルキル置換基はヒドロキシ及びフタルイミドからなる群から選択され、置換されたＣ_１−５アルキルスルフォニルであってアルキル置換基はヒドロキシ及びフタルイミドからなる群から選択され、置換されたフェニルスルフォニルであってフェニル置換基は、臭素、フッ素、塩素、Ｃ_１−５アルコキシ及びトリフルオロメチルからなる群から別個に選択され、但し：
もし、Ａが硫黄であり、そしてＸが水素、Ｃ_１−５アルキルアミノカルボニル、フェニルアミノカルボニル、アリールＣ_１−５アルキルアミノカルボニル、Ｃ_１−５アルキルスルフォニル又はフェニルスルフォニル以外ならば、ｑは１に等しいか又は１より大きくなくてはならず；
もし、Ａが硫黄であり、そしてｑが１ならば、ＸはＣ_１−２アルキルであり得ず；
もし、Ａがカルボニルであり、そしてｑが０ならば、Ｘはビニル、エチニル、Ｃ_１−５アルキルアミノカルボニル、フェニルアミノカルボニル、アリールＣ_１−５アルキルアミノカルボニル、Ｃ_１−５アルキルスルフォニル又はフェニルスルフォニルではあり得ず；
もし、Ａがカルボニルで、ｑが０で、そしてＸがＨならば、Ｒ_３はＳＥＭではなく；
もし、ｎが０であり、そしてｑが０ならば、Ｘは水素ではあり得ない；
及びその薬学上受容可能な塩である。
【０１１４】
化合物は、５（４）−（４−フルオロフェニル）−２−（３−（ナフス−１−イルアミド）プロプ−１−イル）チオ−４（５）−（４−ピリジル）−イミダゾール；及び５（４）−（４−フルオロフェニル）−２−（３−（フェニルスルフォナミド）プロプ−１−イル）チオ−４（５）−（４−ピリジル）−イミダゾールである。
【０１１５】
実施例４
いくつかの態様において、上記化合物は、米国特許第６，１４７，０９６号に記載された構造（構造３）：
【０１１６】
【化５】

【０１１７】
を有するか、
又はその薬学上受容可能な塩であり、
式中、
（ａ）Ｒ_１，Ｒ_２及びＲ_３は、（ｉ）水素、（ｉｉ）Ｃ_１−５アルキル、（ｉｉｉ）Ｃ_１−５アルキルアミノ、（ｉｖ）ジＣ_１−５アルキルアミノ、（ｖ）一つ又はそれより多い水素、ハロゲン、Ｃ_１−５アルキル、及びトリハロＣ_１−５アルキルにより置換されたフェニル、及び（ｖｉ）一つ又はそれより多い水素、ハロゲン、Ｃ_１−５アルキル、及びトリハロＣ_１−５アルキルにより置換されたフェニルＣ１−５アルキルからなる群から別個に選択され；
（ｂ）環１及び２は、各々別個に、水素、ハロゲン、Ｃ_１−５アルキル、及びトリハロＣ_１−５アルキルからなる群から選択される一つ又はそれより多い置換基により置換されており；
（ｃ）Ａ及びＢは、別個に窒素又は炭素であって、Ａ及びＢの少なくとも一方は窒素であり；
（ｄ）Ｄ及びＥは窒素であり、但し、（ｉ）非アリール炭素とＤ又はＥの何れかの間には二重結合が存在し、（ｉｉ）非アリール炭素とＤの間に二重結合が存在するなら、Ｒ_２は不在であり、そして（ｉｉｉ）非アリール炭素とＥの間に二重結合が存在するなら、Ｒ_３は不在であり；そして
（ｅ）上記化合物は、１，６−ジヒドロ−７−（４−ピリジル）−８−（４−フルオロフェニル）−２−フェニルメチル−ピロロ［３，２−ｅ］ベンズイミダゾールでも、３，６−ジヒドロ−８−（４−フルオロフェニル）−３−（３−フェニルプロピル）−７−（４−ピリジル）−ピロロ［３，２−ｅ］ベンズイミダゾールでもない。
【０１１８】
いくつかの態様において、上記化合物は、（ｉ）１，６−ジヒドロ−７−（４−フルオロフェニル）−８−（４−ピリジル）−２−フェニル−ピロロ［３，２−ｅ］ベンズイミダゾール；（ｉｉ）１，６−ジヒドロ−７−（４−フルオロフェニル）−８−（４−ピリジル）−２−ブチル−ピロロ［３，２−ｅ］ベンズイミダゾール；（ｉｉｉ）１，６−ジヒドロ−７−（４−フルオロフェニル）−８−（４−ピリジル）−２−（２−フェニルエチル）−ピロロ［３，２−ｅ］ベンズイミダゾール；（ｉｖ）１，６−ジヒドロ−７−（４−ピリジル）−８−（４−フルオロフェニル）−ピロロ［３，２−ｅ］ベンズイミダゾール；及び（ｖ）１，６−ジヒドロ−７−（４−フルオロフェニル）−８−（４−ピリジル）−２−フェニルメチル−ピロロ［３，２−ｅ］ベンズイミダゾールからなる群から選択される。
【０１１９】
実施例５
いくつかの態様において、上記化合物は、米国特許第６，２１４，８３０号に記載された構造（構造４）：
【０１２０】
【化６】

【０１２１】
を有するか、
又はそのステレオアイソマー、溶媒和物、又は薬学上受容可能な塩であり、及び薬学上受容可能な担体、希釈剤又は賦形剤であり、
式中、
Ｒ_１は、フェニル、置換されたフェニル（置換基は、Ｃ１−５アルキル、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル、及びニトリルからなる群から選択され）、又はヘテロアリールであってヘテロアリールは５又は６の環状原子を含み；
Ｒ_２は、フェニル、置換されたフェニル（置換基は、Ｃ_１−５アルキル、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル、及びニトリルからなる群から選択され）、ヘテロアリールであってヘテロアリールは５又は６の環状原子を含み、そして任意にＣ_１−４アルキル置換されており；
Ｒ_３は、水素、ＳＥＭ，Ｃ_１−５アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アリールＣ_１−５アルキルオキシカルボニル、アリールＣ_１−５アルキル、置換されたアリールＣ_１−５アルキル（アリール置換基は、Ｃ_１−５アルキル、Ｃ_１−５アルコキシ、ハロゲン、アミノ、Ｃ_１−５アルキルアミノ、及びジＣ_１−５アルキルアミノからなる群の一つ又はそれより多いメンバーから別個に選択される）、フタルイミドＣ_１−５アルキル、アミノＣ_１−５アルキル、ジアミノＣ_１−５アルキル、サクシニミドＣ_１−５アルキル、Ｃ_１−５アルキルカルボニル、アリールカルボニル、Ｃ_１−５アルキルカルボニルＣ_１−５アルキル、アリールカルボニルＣ_１−５アルキル、ヘテロアリールＣ_１−５アルキルであって、但し、ヘテロアリールは５又は６の環状原子を含み；
Ｒ_４は、−−（Ａ）−−（ＣＨ_２）_ｑ−Ｘであり、式中、
Ａはビニレン、エチニレン又は
【０１２２】
【化７】

【０１２３】
であり、式中、
Ｒ_５は、水素、Ｃ_１−５アルキル、フェニル及びフェニルＣ_１−５アルキルからなる群から選択され；
ｑは、０−９であり；
Ｘは、水素、ヒドロキシ、ビニル、置換されたビニル（一つ又はそれより多い置換基は、フッ素、臭素、塩素及びヨウ素からなる群から選択される）、エチニル、置換されたエチニル（置換基は、フッ素、臭素、塩素及びヨウ素からなる群の一つ又はそれより多くから選択される）、Ｃ_１−５アルキル、置換されたＣ_１−５アルキル（アルキル置換基は、一つ又はそれより多いＣ_１−５アルコキシトリハロアルキル、フタルイミド及びアミノからなる群から選択される）、Ｃ_３−７シクロアルキル、Ｃ_１−５アルコキシ、置換されたＣ_１−５アルコキシ（アルキル置換基は、フタルイミド及びアミノからなる群から選択される）、フタルイミドオキシ、フェノキシ、置換されたフェノキシ（フェニル置換基は、Ｃ_１−５アルキル、ハロゲン及びＣ_１−５アルコキシからなる群から選択される）、フェニル、置換されたフェニル（フェニル置換基は、Ｃ_１−５アルキル、ハロゲン及びＣ_１−５アルコキシからなる群から選択される）、アリールＣ_１−５アルキル、置換されたアリールＣ_１−５アルキル（アリール置換基は、Ｃ_１−５アルキル、ハロゲン及びＣ_１−５アルコキシからなる群から選択される）、アリールオキシＣ_１−５アルキルアミノ、Ｃ_１−５アルキルアミノ、ジＣ_１−５アルキルアミノ、ニトリル、オキシム、ベンキシルオキシイミノ、Ｃ_１−５アルキルオキシ、フタルイミド、サクシニミド、Ｃ_１−５アルキルカルボニルオキシ、フェニルカルボニルオキシ、置換されたフェニルカルボニオキシ（フェニル置換基は、Ｃ_１−５アルキル、ハロゲン及びＣ_１−５アルコキシからなる群から選択される）、フェニルＣ_１−５アルキルカルボニルオキシ、（フェニル置換基は、Ｃ_１−５アルキル、ハロゲン及びＣ_１−５アルコキシからなる群から選択される）、アミノカルボニルオキシ、Ｃ_１−５アルキルアミノカルボニルオキシ、ジＣ_１−５アルキルアミノカルボニルオキシ、Ｃ_１−５アルコキシカルボニルオキシ、置換されたＣ_１−５アルコキシカルボニルオキシ（アルキル置換基は、メチル、エチル、イソプロピル及びヘキシルからなる群から選択される）、フェノキシカルボニルオキシ、置換されたフェノキシカルボニルオキシ（フェニル置換基は、Ｃ_１−５アルキル、Ｃ_１−５アルコキシ、及びハロゲンからなる群から選択される）、Ｃ_１−５アルキルチオ、置換されたＣ_１−５アルキルチオ（アルキル置換基は、ヒドロキシ及びフタルイミドからなる群から選択される）、Ｃ_１−５アルキルスルフォニル、フェニルスルフォニル、置換されたフェニルスルフォニル（フェニル置換基は、臭素、フッ素、塩素、Ｃ_１−５アルコキシ及びトリフルオロメチルからなる群から選択される）からなる群から選択され；但し、
もし、Ａが
【０１２４】
【化８】

【０１２５】
ならば、
ｑは０であり、そしてＸはＨであり、そしてＲ３はＳＥＭでなくてよく；
及びその薬学上受容可能な塩である。
【０１２６】
実施例６
いくつかの態様において、上記化合物は、米国特許第６，４６９，１７４号に記載された構造（構造５）：
【０１２７】
【化９】

【０１２８】
を有するか、
又はその薬学上受容可能な塩であり、
式中、
（ａ）Ｒ_１，Ｒ_２及びＲ_３は、（ｉ）水素、（ｉｉ）Ｃ_１−５アルキル、（ｉｉｉ）Ｃ_１−５アルキルアミノ、（ｉｖ）ジＣ_１−５アルキルアミノ、（ｖ）水素、ハロゲン、Ｃ_１−５アルキル、及びトリハロＣ_１−５アルキルの一つ又はそれより多くにより置換されたフェニル、及び（ｖｉ）水素、ハロゲン、Ｃ_１−５アルキル、及びトリハロＣ_１−５アルキルの一つ又はそれより多くにより置換されたフェニルＣ_１−５アルキルからなる群から別個に選択され；
（ｂ）環１及び２は、各々別個に、水素、ハロゲン、Ｃ_１−５アルキル、及びトリハロＣ_１−５アルキルからなる群から選択される一つ又はそれより多い置換基により置換されており；
（ｃ）Ａ及びＢは、別個に窒素又は炭素であって、Ａ及びＢの少なくとも一方は窒素であり；
（ｄ）Ｄ及びＥは窒素であり、但し、（ｉ）非アリール炭素とＤ又はＥの何れかの間には二重結合が存在し、（ｉｉ）非アリール炭素とＤの間に二重結合が存在するなら、Ｒ_２は不在であり、そして（ｉｉｉ）非アリール炭素とＥの間に二重結合が存在するなら、Ｒ_３は不在であり；そして
（ｅ）上記化合物は、１，６−ジヒドロ−７−（４−ピリジル）−８−（４−フルオロフェニル）−２−フェニルメチル−ピロロ［３，２−ｅ］ベンズイミダゾールでも、３，６−ジヒドロ−８−（４−フルオロフェニル）−３−（３−フェニルプロピル）−７−（４−ピリジル）−ピロロ［３，２−ｅ］ベンズイミダゾールでもない。
【０１２９】
いくつかの態様において、上記化合物は、（ｉ）１，６−ジヒドロ−７−（４−フルオロフェニル）−８−（４−ピリジル）−２−フェニル−ピロロ［３，２−ｅ］ベンズイミダゾール；（ｉｉ）１，６−ジヒドロ−７−（４−フルオロフェニル）−８−（４−ピリジル）−２−ブチル−ピロロ［３，２−ｅ］ベンズイミダゾール；（ｉｉｉ）１，６−ジヒドロ−７−（４−フルオロフェニル）−８−（４−ピリジル）−２−（２−フェニルエチル）−ピロロ［３，２−ｅ］ベンズイミダゾール；（ｉｖ）１，６−ジヒドロ−７−（４−ピリジル）−８−（４−フルオロフェニル）−ピロロ［３，２−ｅ］ベンズイミダゾール；及び（ｖ）１，６−ジヒドロ−７−（４−フルオロフェニル）−８−（４−ピリジル）−２−フェニルメチル−ピロロ［３，２−ｅ］ベンズイミダゾールからなる群から選択される。
【０１３０】
実施例７
いくつかの態様において、上記化合物は、米国特許第６，４１０，５４０号に記載された構造（構造６）：
【０１３１】
【化１０】

【０１３２】
を有するか、
及びその薬学上受容可能な塩であるか、又はその薬学上受容可能な組成物であり、
式中、
Ｚは、Ｎであるか又はＣＲ^１であり、Ｒ^１は非干渉置換基であり、
Ｘ^１とＸ^２の各々は、リンカーであり、
Ａｒ^１とＡｒ^２は、同一か又は異なり、そして任意に置換されたＣ_１−Ｃ_２０ヒドロカルビル残基を表し、但し、Ａｒ^１及びＡｒ^２の少なくとも一つは、任意に置換されたアリール基であって、但し、Ｘ^２がＣＨ_２又はその等量式（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）であり、Ｘ^１がＣＯ又はその等量式であり、そしてＡｒ^２が任意に置換されたフェニルであるとき、Ａｒ^１は任意に置換されたインドリル、ベンジルイミダゾリル又はベンゾトリアゾリル置換基以外であり、そして任意に置換されたフェニルは任意に置換されたインドリル、ベンジルイミダゾリル又はベンゾトリアゾリルではなく、
Ｙは非干渉置換基であるが、式中、ｎは０−４の整数であり、そして
式中、ｍは０−４の整数であり、そしてｌは０−３の整数である。
【０１３３】
いくつかの化合物は、１−（２−メトキシ−４−ヒドロキシベンゾイル）−４−ベンジルピペリジン；１−（２−メトキシ−４−メトキシベンゾイル）−４−ベンジルピペリジン；１−（２−メトキシ−４−ベンジルオキシベンゾイル）−４−ベンジルピペリジン；及び１−（２−メトキシ−４−メトキシベンゾイル）−４−（４−フルオロベンジル）ピペリジンを含む。
【０１３４】
実施例８
いくつかの態様において、上記化合物は、米国特許第６，４７６，０３１号に記載された構造（構造７）：
【０１３５】
【化１１】

【０１３６】
を有するか、
及びその薬学上受容可能な塩であるか、又はその薬学上受容可能な組成物であり、
式中、
Ｒ^３は、非干渉置換基であり；
各Ｚは、ＣＲ^２又はＮであるが、式中、環Ａ中の２つを超えないＺ位がＮであり、そして環Ａ中の２つの隣接したＺ位がＮではあり得ず；
各Ｒ^２は、別個に非干渉置換基であり；
Ｌはリンカーであり；
ｎは０又は１であり；そして
Ａｒ^１は、１−３の非干渉置換基により任意に置換された、環状脂肪族、環状ヘテロ脂肪族、芳香族又はヘテロ芳香族モイエティの残基である。
【０１３７】
いくつかの化合物は、２−フェニル−４−（４−ピリジルアミノ）−キナゾリン；２−（２−ブロモフェニル）−４−（４−ピリジルアミノ）−キナゾリン；２−（２−クロロフェニル）−４−（４−ピリジルアミノ）−キナゾリン；２−（２−フルオロフェニル）−４−（４−ピリジルアミノ）−キナゾリン；２−（２−メチルフェニル）−４−（４−ピリジルアミノ）−キナゾリン；２−（４−フルオロフェニル）−４−（４−ピリジルアミノ）−キナゾリン；２−（３−メトキシアニール（ｍｅｔｈｏｘｙａｎｉｙｌ））−４−（４−ピリジルアミノ）−キナゾリン；２−（２，６−ジクロロフェニル）−４−（４−ピリジルアミノ）−キナゾリン；２−（２，６−ジブロフォニル）−４−（４−ピリジルアミノ）−キナゾリン；２−（２，６−ジフルオムロフェニル）−４−（４−ピリジルアミノ）−キナゾリン；２−（２−フルオロフェニル）−４−（４−ピリジルアミノ）−６，７−ジメトキシキナゾリン；２−（４−フルオロフェニル）−４−（４−ピリジルアミノ）−６，７−ジメトキシキナゾリン；２−（２−フルオロフェニル）−４−（４−ピリジルアミノ）−６−ニトロキナゾリン；２−（２−フルオロフェニル）−４−（４−ピリジルアミノ）−６−アミノキナゾリン；２−（２−フルオロフェニル）−４−（４−ピクスジルアミノ）−７−アミノキナゾリン；２−（２−フルオロフェニル）−４−（４−ピリジルアミノ）−６−（３−メトキシベンジルアミノ）−キナゾリン；２−（２−フルオロフェニル）−４−（４−ピリジルアミノ）−６−（４メトキシベンジルアミノ）−キナゾリン；２−（２−フルオロフェニル）−４−（４−ピリジルアミノ）−６（２−イソブチルアミノ）−キナゾリン；及び２−（２−フルオロフェニル）−４−（４−ピリジルアミノ）−６（４メトキシメルカプトベンジルアミノ）−キナゾリンからなる群から選択される。
【０１３８】
実施例９
いくつかの態様において、上記化合物は、米国特許第６，４４８，２５７号に記載された構造（構造８）：
【０１３９】
【化１２】

【０１４０】
（式中、破線は任意の結合を表す）、好ましくは式：
【０１４１】
【化１３】

【０１４２】
を有するか、
及びその薬学上受容可能な塩であり、式中、
Ｘ^１は、融合した脂肪族５−７員環を形成するＯ，Ｓ，又はＮヘテロ原子を任意に含むアルキルブリッジであり、そしてハロ、ＯＲ，ＳＲ，ＮＲ_２，ＲＣＯ，ＣＯＯＲ，ＣＯＮＲ２，ＯＯＣＲ，又はＮＲＯＣＲの一つ又はそれより多くにより任意に置換されている（式中、ＲはＨ又はアルキル（１−６Ｃ）である）か、又は一つ又はそれより多いＣＮ又は＝Ｏにより任意に置換されているか、又は一つ又はそれより多い、任意に１−２ヘテロ原子を含む脂肪族又は芳香族５−又は６−員環により任意に置換されており；
Ｒ^１は、
【０１４３】
【化１４】

【０１４４】
であり、
式中、
Ｘ^２は、ＣＯ又はその等量式であり；
ｍは、０又は１であり；
Ｙは、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、又は任意に置換されたアリールアルキルであるか又は２つのＹが一緒になってアルキレン（２−３Ｃ）ブリッジを形成してよく；
ｎは、０−４であり；
Ｚ^１は、ＣＨ又はＮであり；
Ｘ^３は、ＣＨ又はＣＨＲであり、式中、ＲはＨ又はアルキル（１−６Ｃ）又はその等量式であり；そして
Ａｒはハロ、ニトロ、アルキル（１−６Ｃ）、アルケニル（１−６Ｃ）、アルキニル（１−６Ｃ）、ＣＮ又はＣＦ３により、又はＲＣＯ，ＣＯＯＲ，ＣＯＮＲ_２，ＮＲ_２，ＯＲ，ＳＲ，ＯＯＣＲ又はＮＲＯＣＲ（式中、ＲはＨ又はアルキル（１−６Ｃ）である）により、又はフェニルにより任意に置換されたＸ^３に直接カップリングした一つ又は二つのフェニルモイエティからなり、それ自身は前記の置換基により任意に置換されており；
Ｒ^２はＨであるか、又はアルキル（１−６Ｃ）又は当該アルキルの各アリール又はＯ，Ｓ又はＮであるヘテロ原子を一つ又はそれより多く任意に含むアリールであり、そしてハロ、ＯＲ，ＳＲ，ＮＲ_２，ＲＣＯ，ＣＯＯＲ，ＣＯＮＲ_２，ＯＯＣＲ，又はＮＲＯＣＲの一つ又はそれより多くにより任意に置換されている（式中、ＲはＨ又はアルキル（１−６Ｃ）である）か、又は一つ又はそれより多いＣＮ又は＝Ｏにより任意に置換されているか、又は一つ又はそれより多い、任意に１−２ヘテロ原子を含む脂肪族又は芳香族５−又は６−員環により任意に置換されており；
Ｒ^３は、Ｈ，ハロ、ＮＯ_２，アルキル（１−６Ｃ）、アルケニル（１−６Ｃ）、アルキニル（１−６Ｃ）、ＣＮ，ＯＲ，ＳＲ，ＮＲ_２，ＲＣＯ，ＣＯＯＲ，ＣＯＮＲ_２，ＯＯＣＲ，又はＮＲＯＣＲであり、式中、ＲはＨ又はアルキル（１−６Ｃ）である。
【０１４５】
実施例１０
いくつかの態様において、上記化合物は、米国特許第６，４７９，５０７号に記載された構造（構造９）：
【０１４６】
【化１５】

【０１４７】
を有し、
式中、
Ｒ^１は、ヘテロアリールであり；
−−−−−−は、ＢとＣＲ^１の間又はＱとＣＲ^１の間の何れかの結合を表すが、
（ｉ）−−−−−−がＱと−−ＣＲ^１−−の間であるとき：
Ｂは、窒素であり；
Ｒ^２は、アリールであり；そして
Ｑは、−−ＣＲ−−であり、式中：
Ｒは、水素、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、アシル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルカルボニル、ニトロ、シアノ、アミノ、モノ置換されたアミノ、ジ置換されたアミノ、アシルアミノ、スルフォニルアミノ、−−ＯＲ^５（式中、Ｒ^５は水素、アルキル、ヘテロアルキル又はヘテロシクリルアルキルである）−ＣＯＯＲ^７（式中、Ｒ^７は水素又はアルキルである）又は−−ＣＯＮＲ’Ｒ”（式中、Ｒ’及びＲ”は別個に水素、アルキル又はヘテロアルキルを表す）であり；そして
（ｉｉ）−−−−−−がＢと−−ＣＲ１−−の間であるとき：
Ｂは、炭素であり；
Ｒ^２は、アリール又はヘテロアリールであり；そして
Ｑは、−−ＮＲ４−−，−−Ｏ−−，又はＳ−−であり、式中：
Ｒ^４は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、アシル、アラルキル、ヘテロアラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルカルボニル、−−ＯＲ^５（式中、Ｒ^５は水素、アルキル、ヘテロアルキル又はヘテロシクリルアルキルである）、−ＳＯ_２Ｒ”（式中、Ｒ”は、アルキル、アミノ、モノ置換されたアミノ又はジ置換されたアミノである）、−−ＣＯＮＲ’Ｒ”（式中、Ｒ’及びＲ”は別個に水素、アルキル又はヘテロアルキルを表す），−（アルキレン）−Ｚ又は（アルキレン）−ＣＯ−（アルキレン）−Ｚであり、式中、
Ｚは、シアノ；−−ＣＯＯＲ^７（式中、Ｒ^７は水素又はアルキルである）；−−ＣＯＮＲ^８Ｒ^９（式中、Ｒ^８は水素又はアルキルであり、Ｒ^９はアルコキシ又は−（アルキレン）−ＣＯＯＲ^７であるか、又はＲ^８とＲ^９が一緒になってそれらが結合する窒素原子と共にヘテロ複素環を形成する）；
−−Ｃ（＝ＮＲ^１０）（ＮＲ^１１Ｒ^１２）であって、式中、Ｒ^１０，Ｒ^１１及びＲ^１２は、別個に水素又はアルキルを表すか、又はＲ^１０とＲ^１１が一緒になって−−（ＣＨ_２）_ｎ−−であるが、式中、ｎは２又は３であり、そしてＲ１２は水素又はアルキルであるか；又は
−−ＣＯＲ^１３であって、式中、Ｒ^１３はアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又はヘテロアラルキルであり；そして
【０１４８】
【化１６】

【０１４９】
が、式（Ｓ），（Ｔ），（Ｕ），（Ｖ）又は（Ｗ）により表される群であり、
【０１５０】
【化１７】

【０１５１】
式中、
Ｒ^６は、水素、アルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクリルアルキル、ハロ、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ置換されたアミノ、ジ置換されたアミノ、−−ＣＯＯＲ^１４，−（アルキレン）−ＣＯＯＲ^１４（式中、Ｒ^１４は、水素又はアルキルである），−−ＣＯＮＲ^１５Ｒ^１６（式中、Ｒ^１５とＲ^１６は、別個に水素又はアルキルを表すか、又はＲ^１５とＲ^１６が一緒になってそれらが結合する窒素原子と共にヘテロ複素環を形成する），−−Ｓ（Ｏ）ｎＲ^１７（式中、ｎは０から２の整数であり、そしてＲ^１７はアルキル、アミノ、モノ置換されたアミノ又はジ置換されたアミノである），−−Ｒ^１８（式中、Ｒ^１８は水素、アルキル、ヘテロアルキル又はヘテロシクリルアルキルである），−−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ”［式中、Ｒは、水素、アルキル又は：ヒドロキシルアルキルであり、そしてＲ”は水素、アルキル、シクロアルキル又は−（アルキレン）−Ｘであり、式中、Ｘはヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリルであるか又は
−−Ｓ（Ｏ）ｎＲ’であり（式中、ｎは０から２であり、そしてＲ’はアルキルである）］，−−ＮＲＳＯ_２Ｒ”であり［式中、Ｒは、水素又はアルキルであり、そしてＲ”はアルキル又は−（アルキレン）−Ｘであり、式中、Ｘはヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ又は −−Ｓ（Ｏ）ｎＲ’であり（式中、ｎは０から２であり、そしてＲ’はアルキルである）］；そして、Ｒ^３は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアルキルチオ、アラルキル、ヘテロアラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ハロ、シアノ、チオ、ニトロ、アミノ、モノ置換されたアミノ、ジ置換されたアミノ、アシルアミノ、スルフォニルアミノ、−−ＯＲ^１９（式中、Ｒ^１９は水素、アルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクリルアルキルである）、−−ＣＯＯＲ^２０（式中、Ｒ^２０は水素又はアルキルである），−−ＣＯＮＲ^２１Ｒ^２２（式中、Ｒ^２１とＲ^２２は別個に水素、アルキル又はヘテロアルキルであるか、又はＲ^２１とＲ^２２が一緒になってそれらが結合する窒素原子と共にヘテロ複素環を形成する）、
−−Ｓ（Ｏ）ｎＲ^２３（式中、ｎは０から２の整数であり、そしてＲ^２３はアルキル、ヘテロアルキル、アミノ、モノ置換されたアミノ、ジ置換されたアミノである），−（アルキレン）−Ｚ”又は−（アルキレン）−ＣＯ−（アルキレン）−Ｚ”であり、式中、
Ｚ”はシアノ；
−−ＣＯＯＲ^２４（式中、Ｒ^２４は、水素又はアルキルである）；
−−ＣＯＮＲ^２５Ｒ^２６（式中、Ｒ^２５及びＲ^２６は、別個に水素又はアルキルであるか、又はＲ^２５とＲ^２６が一緒になってそれらが結合する窒素原子と共にヘテロ複素環を形成する）；
−−Ｃ（＝ＮＲ^２７）（ＮＲ^２８Ｒ^２９）（式中、Ｒ^２７，Ｒ^２８及びＲ^２９は、別個に水素又はアルキルであるか、又はＲ^２７とＲ^２８が一緒になって−−（ＣＨ_２）ｎ−−（式中、ｎは２又は３であり、そして、Ｒ^２９は水素又はアルキルである））又は；
−−ＣＯＲ^３０（式中、Ｒ^３０は、アルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又はヘテロアラルキル）；及び、それらの薬学上受容可能な塩、プロドラッグ、個々のアイソマー、及びアイソマーの混合物であり、但し、Ｒ^３とＲ^６が共に、アミノ、モノ置換されたアミノ又はジ置換されたアミノの何れかではない。
【０１５２】
或いは、
【０１５３】
【化１８】

【０１５４】
式中、
Ｚ^１及びＺ^２の一方が窒素であり、他方は−−ＣＲ^６−−（式中、Ｒ^６は、水素、アルキル、又はアルコキシである）であるか；又は、Ｚ^１とＺ^２が共に窒素であるが、
（ａ）Ｚ^１又はＺ^２が水素であり、そして他方が−−ＣＲ^６−−であるとき：
（ｉ）Ｙがハロのとき、−−Ｑ−−Ｒは−−ＮＨ−−Ｃ（Ｒ^１）＝ＣＨ（Ｒ^２）又は−−Ｎ＝Ｃ（ＣＨ_３）（Ｒ^１）であり；
（ｉｉ）Ｙが−−Ｃ（Ｒ^２）＝Ｃ（Ｒ^１）ＯＸ（式中、Ｘはｐ−ＣＨ_３Ｃ_６Ｈ_４ＳＯ_２−−，ＣＨ_３ＳＯ_２−−，又はＣＦ_３ＳＯ_２である）のとき、−−Ｑ−−Ｒはニトロ又はアミノであり；そして
（ｉｉｉ）Ｙが−−Ｃ（Ｏ）Ｒ_２のとき、−−Ｑ−−Ｒは−−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ^１，−−ＯＣＨ_２ＣＯ_２Ｒ，又は−−ＳＣＨ_２Ｒ^１であり、
式中、
Ｒは、アルキルであり；
Ｒ^１は、ヘテロアリールであり；そして
Ｒ^２は、アリール又はヘテロアリールであり；そして
（ｂ）Ｚ^１とＺ^２が共に窒素であるとき：
Ｙはハロであり、そして−−Ｑ−−Ｒが−−ＮＨ−−Ｃ（Ｒ）＝ＣＨ（Ｒ^２）（式中、Ｒ^１及びＲ^２は上で定義されたとおりである）であり；そして
Ｒ^３は水素、アルキル、ハロ、又はアルコキシである。
【０１５５】
或いは、
【０１５６】
【化１９】

【０１５７】
式中、
Ｚ^３は、窒素であり、そしてＺ^４は−−ＣＲ^３−−（式中、Ｒ^３は水素、アルキル又はアルコキシである）であるか；又はＺ^４は窒素であり、そしてＺ^３は−−ＣＨ−−であり；
（ａ）Ｙが水素のとき、−−Ｑ−−Ｒは−−ＮＨ−−Ｈ＝Ｃ（Ｒ^１）ＣＨ_２（Ｒ^２）であり；そして
（ｂ）Ｙが−−Ｃ（Ｏ）Ｒ^２のとき、−−Ｑ−−Ｒは−−ＯＣＨ_２ＣＯ_２Ｒ又は−−ＳＣＨ_２Ｒ^１（式中、
Ｒはアルキルであり；
Ｒ^１はヘテロアリールであり；そして
Ｒ^２はアリール又はヘテロアリールであり；そして
Ｒ^６は水素、アルキル、ハロ又はアルコキシである）
である。
【０１５８】
治療上有効な量の化合物又は薬学上受容可能な塩及び薬学上受容可能な賦形剤を含む薬学組成物も含まれる。
【０１５９】
実施例１１
いくつかの態様において、上記化合物は、米国特許第６，５０９，３６１号に記載された構造（構造１０）：
【０１６０】
【化２０】

【０１６１】
を有し、
式中、
Ａは、＝Ｎ−−又は＝ＣＨ−−であり；
Ａｒ^１は、ハロゲン、ヒドロカルビル、ヒドロカルビルオキシ、ニトロ、シアノ、パーフルオロヒドロカルビル、トリフルオロメチルヒドロカルビル、パーフルオロヒドロカルビルオキシ、ヒドロキシ、メルカプト、ヒドロキシカルボニル、アリールオキシ、アリールチオ、スルフォニル又はスルフォキシドからなる群から選択される一つ又はそれより多い置換基により任意に置換されたアリール基であり、但し、硫黄上の置換基はヒドロカルビル、スルフォニルアミドであり、
但し、スルフォナミド窒素原子上の置換基は、ヒドリド又はヒドロカルビル、アリールアミノ、アリールヒドロカルビル、アリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、ヘテロアリールアミノ、ヘテロアリールヒドロカルビル、ヒドロカルビルオキシカルボニル−ヒドロカルビル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシカルボニル−ヒドロカルビル、ヘテロシクロチオ、ヘテロシクロアミノ、シクロヒドロカルビルオキシ、シクロヒドロカルビルチオ、ヘテロアリールヒドロカルビルキシ、ヘテロアリールヒドロカルビルチオ、ヘテロアリールヒドロカルビルアミノ、アリールヒドロカルビルオキシ、アリールヒドロカルビルチオ、アリールヒドロカルビルアミノ、複素環（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ）、ヘテロアリール、ヒドロキシカルボニルヒドロカルビルオキシ、ヒドロカルビルオキシカルボニルヒドロカルビルオキシ、ヒドロカルビロイル、アリールカルボニル、アリールヒドロカルビロイル、ヒドロカルボイルオキシ（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｙｌｏｘｙ）、アリールヒドロカルボイルオキシ、ヒドロキシヒドロカルビル、ヒドロキシヒドロカルビルオキシ、ヒドロカルビルチオ、ヒドロカルビルオキシヒドロカルビルチオ、ヒドロカルビルオキシカルボニル、ヒドロキシカルボニルヒドロカルビルオキシ、ヒドロカルビルオキシカルボニルヒドロカルビル、ヒドロカルビルヒドロキシカルボニルヒドロカルビルチオ、ヒドロカルビルオキシカルボニルヒドロカルビルオキシ、ヒドロカルビルオキシカルボニルヒドロカルビルチオ、ヒドロカルビルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、シクロヒドロカルビルカルボニルアミノ、ヘテロシクロヒドロカルビルカルボニルアミノ、アリールヒドロカルビルカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールヒドロカルビルカルボニルアミノ、ヘテロシクロヒドロカルビルオキシ、ヒドロカルビルスルフォニルアミノ、アリールスルフォニルアミノ、アリールヒドロカルビルスルフォニルアミノ、ヘテロアリールスルフォニルアミノ、ヘテロアリールヒドロカルビルスルフォニルアミノ、シクロヒドロカルビルスルフォニルアミノ、ヘテロシクロヒドロカルビルスルフォニルアミノ、Ｎ−モノ置換されたか又はＮ，Ｎ−ジ置換されたアミノヒドロカルビル基であり、
但し、アミノヒドロカルビル窒素原子上の置換基は、ヒドロカルビル、アリール、アリールヒドロカルビル、シクロヒドロカルビル、アリールヒドロカルビルオキシカルボニル、ヒドロカルビルオキシカルボニル、及びヒドロカルボイルからなる群から選択されるか、又は、アミノヒドロカルビル窒素及びそれらに結合した２つの置換基が５−又は８−員環複素環又はヘテロアリール環基、アミノ、及びＮ−モノ置換されたか又はＮ，Ｎ−ジ置換されたアミノ基を形成し、
但し、アミノ窒素上の置換基は、ヒドリド、ヒドロカルビル、アリール、アリールヒドロカルビル、シクロヒドロカルビル、アリールヒドロカルビルオキシカルボニル、ヒドロカルビルオキシカルボニル、ヒドロカルボイル、アリールスルフォニル、及びヒドロカルビルスルフォニルからなる群から選択されるか、又はアミノ窒素及びそれらに結合した２つの置換基が５−又は８−員環複素環又はヘテロアリール環基を形成し；
Ｚは、ヒドリド、ヒドロカルビル、ハロゲン、カルボキシ、シアノ、アジド、ヒドロカルビルスルフォニル、カルボニルオキシヒドロカルビル、カルボニルアミド、及び−−Ｘ−−Ｙ
（式中、
−−Ｘは、−−Ｏ，−−Ｓ又は−−ＮＯであり；
−−Ｙは、ヒドリド、ヒドロカルビル又はヒドロキシヒドロカルビルである）
からなる群から選択され；
Ｑは、ヒドリド、ヒドロカルビル、ヒドロキシルヒドロカルビルアリール，２−，３−，又は４−ピリジルヒドロカルビル、又はアリールヒドロカルビルであり；
Ｒ^１は、アジド、ヒドリド、ヒドロカルビル、アミド、ヒドロカルビルアミノ、ハロヒドロカルビル、パーハロヒドロカルビル、及びハロゲン、ヒドロカルビル、ヒドロカルビルオキシ、ニトロ、シアノ、パーフルオロヒドロカルビル、トリフルオロメチルヒドロカルビル、ヒドロキシ、メルカプト、ヒドロキシカルボニル、アリールオキシ、アリールチオ、アリールアミノ、アリールヒドロカルビル、アリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、ヘテロアリールアミノ、ヘテロアリールヒドロカルビル、ヒドロカルビルオキシカルボニルヒドロカルビル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシカルボニルヒドロカルビル、ヘテロシクロチオ、ヘテロシクロアミノ、シクロヒドロカルビルオキシ、シクロヒドロカルビルチオ、シクロヒドロカルビルアミノ、ヘテロアリールヒドロカルビルオキシ、ヘテロアリールヒドロカルビルチオ、ヘテロアリールヒドロカルビルアミノ、アリールヒドロカルビルオキシ、アリールヒドロカルビルチオ、アリールヒドロカルビルアミノ、複素環（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ）、ヘテロアリール、ヒドロキシカルボニルヒドロカルビルオキシ、アルコキシカルボニルアルコキシ、ヒドロカルビロイル、アリールカルボニル、アリールヒドロカルビロイル、ヒドロカルボイルオキシ（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｙｌｏｘｙ）、アリールヒドロカルボイルオキシ、ヒドロキシヒドロカルビル、ヒドロキシヒドロカルビルオキシ、ヒドロカルビルチオ、ヒドロカルビルオキシヒドロカルビルチオ、ヒドロカルビルオキシカルボニル、ヒドロキシカルボニルヒドロカルビルオキシ、ヒドロカルビルオキシ−カルボニルヒドロカルビル、ヒドロカルビルヒドロキシカルボニル−ヒドロカルビルチオ、ヒドロカルビルオキシカルボニルヒドロカルビルオキシ、ヒドロカルビルオキシカルボニルヒドロカルビルチオ、アミノ、ヒドロカルビルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、シクロヒドロカルビルカルボニルアミノ、ヘテロシクロヒドロカルビルカルボニルアミノ、アリールヒドロカルビルカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールヒドロカルビルカルボニルアミノ、ヘテロシクロヒドロカルビルオキシ、ヒドロカルビルスルフォニルアミノ、アリールスルフォニルアミノ、アリールヒドロカルビルスルフォニルアミノ、ヘテロアリールスルフォニルアミノ、ヘテロアリールヒドロカルビルスルフォニルアミノ、シクロヒドロカルビルスルフォニルアミノ、ヘテロシクロヒドロカルビルスルフォニルアミノ及びＮ−モノ置換されたか又はＮ，Ｎ−ジ置換されたアミノヒドロカルビル基からなる群から選択される一つ又はそれより多い置換基により任意に置換されたアリール置換基からなる群から選択され、
但し、アミノ−ヒドロカルビル窒素原子上の置換基は、ヒドロカルビル、アリール、アリールヒドロカルビル、シクロヒドロカルビル、アリールヒドロカルビルオキシカルボニル、ヒドロカルビルオキシカルボニル、及びヒドロカルボイルからなる群から選択されるか、又はアミノヒドロカルビル窒素及びそれらに結合した２つの置換基が５−又は８−員環複素環又はヘテロアリール環基を形成し；そして
Ｒ^２は、アジド、ヒドリド、ヒドロカルビル、アミド、ハロヒドロカルビル、パーハロヒドロカルビル、ヒドロカルビルオキシカルボニル、Ｎ−ピペラジニルカルボニル、アミノカルボニル、ピペラジニル、及びハロゲン、ヒドロカルビル、ヒドロカルビルオキシ、ニトロ、シアノ、パーフルオロヒドロカルビル、トリフルオロメチルヒドロカルビル、ヒドロキシ、メルカプト、ヒドロキシカルボニル、アリールオキシ、アリールチオ、アリールアミノ、アリールヒドロカルビル、アリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、ヘテロアリールアミノ、ヘテロアリールヒドロカルビル、ヒドロカルビルオキシカルボニルヒドロカルビル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシカルボニルヒドロカルビル、ヘテロシクロチオ、ヘテロシクロアミノ、シクロヒドロカルビルオキシ、シクロヒドロカルビルチオ、シクロヒドロカルビルアミノ、ヘテロアリールヒドロカルビルオキシ、ヘテロアリールヒドロカルビルチオ、ヘテロアリールヒドロカルビルアミノ、アリールヒドロカルビルオキシ、アリールヒドロカルビルチオ、アリールヒドロカルビルアミノ、複素環（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ）、ヘテロアリール、ヒドロキシカルボニル−ヒドロカルビルオキシ、アルコキシカルボニルアルコキシ、ヒドロカルビロイル、アリールカルボニル、アリールヒドロカルビロイル、ヒドロカルボイルオキシ（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｙｌｏｘｙ）、アリールヒドロカルボイルオキシ、ヒドロキシヒドロカルビル、ヒドロキシヒドロカルビルオキシ、ヒドロカルビルチオ、ヒドロカルビルオキシヒドロカルビルチオ、ヒドロカルビルオキシカルボニル、ヒドロキシカルボニル−ヒドロカルビルオキシ、ヒドロカルビルオキシカルボニルヒドロカルビル、ヒドロカルビルヒドロキシカルボニル−ヒドロカルビルチオ、ヒドロカルビルオキシカルボニルヒドロカルビルオキシ、ヒドロカルビルオキシカルボニルヒドロカルビルチオ、アミノ、ヒドロカルビルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、シクロヒドロカルビルカルボニルアミノ、ヘテロシクロヒドロカルビルカルボニルアミノ、アリールヒドロカルビルカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールヒドロカルビルカルボニルアミノ、ヘテロシクロヒドロカルビルオキシ、ヒドロカルビルスルフォニルアミノ、アリールスルフォニルアミノ、アリールヒドロカルビルスルフォニルアミノ、ヘテロアリールスルフォニルアミノ、ヘテロアリールヒドロカルビルスルフォニルアミノ、シクロヒドロカルビルスルフォニルアミノ、ヘテロシクロヒドロカルビルスルフォニルアミノ及びＮ−モノ置換されたか又はＮ，Ｎ−ジ置換されたアミノヒドロカルビル基からなる群から選択される一つ又はそれより多い置換基により任意に置換されたアリール基からなる群から選択され、
但し、アミノヒドロカルビル窒素原子上の置換基は、ヒドロカルビル、アリール、アリールヒドロカルビル、シクロヒドロカルビル、アリールヒドロカルビルオキシカルボニル、ヒドロカルビルオキシカルボニル、及びヒドロカルボイルからなる群から選択されるか、又はアミノヒドロカルビル窒素及びそれらに結合した２つの置換基が５−又は８−員環複素環又はヘテロアリール環基を形成し；そして
但し、Ａが、＝ＣＨ−−であり、そしてＺはヒドリド、ヒドロカルビル、ハロゲン、又はヒドロカルボイルであるとき；
１）Ａｒ^１は、ヒドリド、ハロゲン、ヒドロカルビル、パーフルオロヒドロカルビルオキシ、ニトロ、パーフルオロヒドロカルビル、アミノ、アミノスルフォニル、ハロヒドロカルビルオキシヒドロカルビル、ヒドロキシ、ヒドロカルビルスルフォニルアミノ、ヒドロカルビルスルフォニル、アセチルアミノ、カルボニルヒドロカルビルアミノ、パーフルオロヒドロカルビルスルフォニル、ヒドロカルビルアミノ、カルボニルモノ置換されたアミノ、カルボニル、ヒドロカルビルチオ、ヒドロキシヒドロカルビル、アリールヒドロカルビル、ヒドロカルビルオキシヒドロカルビル、ヒドロカルビルオキシカルボニル、ヒドロカルビルオキシアリールヒドロカルビル、ハロヒドロカルビルオキシ、ヒドロカルビルオキシヒドロカルビルからなる群から選択される一つ又はそれより多い置換基により置換されたアリール基であるか；又は
２）Ｒ^１は、ヒドリド、ヒドロカルビル、アリール、ハロアリール、シアノアリール、ヒドロキシアリール、ヒドロカルビルアリール、シアノ、パーフルオロヒドロカルビル、ヒドロキシヒドロカルビル、アリールヒドロカルビル、カルボキシ、ヒドロカルビルオキシカルボニル、ヒドロカルボイルヒドロカルビル、アミノカルボニル、アリールヒドロカルビル−ヒドロカルボイル−ヒドロカルビルモノ置換されたアミノカルボニル、ヒドロカルビル−ヒドロカルボイル−ヒドロカルビルモノ置換されたアミノカルボニル、ヒドロカルビル−ヒドロカルビルヒドロカルボイル−ヒドロカルビルモノ置換されたアミノカルボニル、ヒドロカルビル−ヒドロキシ−ジ置換されたアミノカルボニルヒドロカルビル、又は窒素原子で置換された６員環ヘテロアリール基以外であるか；又は
３）Ｒ^２は、ヒドリド、カルボキシ、ヒドロカルビルオキシカルボニル、ハロゲン又はアリール以外である。
【０１６２】
実施例１２
いくつかの態様において、上記化合物は、米国特許出願第２００２０１９８２１４号に記載された構造（構造１１）：
【０１６３】
【化２１】

【０１６４】
及びその薬学上受容可能な塩、又はその薬学組成物を有し、
式中、
Ａｒ^１は、０−５非干渉置換基により置換されたアリール基であり、但し、２つの隣接する非干渉置換基が融合された芳香族又は非芳香族環を形成することができ；
Ｌ^１及びＬ^２はリンカーであり；
各Ｒ^１は、別個に非干渉置換基であり；
Ｚ^１は、ＣＲ^２又はＮであり、式中、Ｒ^２は水素又は非干渉置換基であり；ｍは０−４であり；
ｎ及びｐの各々は、０−２の整数であり、但し、ｎとｐの合計は０−３であり；
Ａｒ^２は、実質上二次元であるか、単環式であるか、又は多環式芳香族モイエティであり、一つ又はそれより多い任意の環状ヘテロ原子を有し、上記モイエティは任意に一つ又はそれより多い非干渉置換基により置換されており、その２つ又はそれより多くが融合環を形成してよく；
Ｚは、−−Ｗ^１−−ＣＯＸ_ｊＹであり、式中、ＹはＣＯＲ^３又はその等量式であり；Ｒ^３は非干渉置換基であり、ＷとＸの各々は２−６オングストロームのスペーサーであり、そしてｉとｊの各々は別個に０又は１であり；
但し、Ｌ^２に結合したＡｒ^１の原子をＬ^１に結合したＡｒ^２の原子に対して分離する上記化合物中の共有結合の最小数が少なくとも６であり、但し、上記結合の各々は１．２から２．０オングストロームの結合長であり；及び／又は、Ｌ^２に結合したＡｒ^１の原子とＬ^１に結合したＡｒ^２の原子の間の空間の距離が４．５−２４オングストロームであり；
但し、Ａｒ^２−−Ｚにより表される化合物の一部はなく、
但し、一重又は二重結合を表し；ｎは０−３であり；一つのＺ^２はＣＡ又はＣＲＡであり、そして他方がＣＲ，ＣＲ^２，ＮＲ又はＮであり；Ａは−−Ｗ_ｉ−−ＣＯＸ_ｊＹであり、式中、ＹはＣＯＲ又はその等量式であり、ＷとＸの各々は２−６オングストロームのスペーサーであり、そしてｉとｊの各々は別個に０又は１であり；Ｚ^３はＮＲ又はＯであり；そして各Ｒは別個イン水素又は非干渉置換基である。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】図１Ａ−Ｄは、ＨＩＶ−１がヒトＰＢＭＣｓにおいてアポトーシスを誘導すること、及びそのようなアポトーシスがｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤により阻害されることを示すデータを示す。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ染色された細胞のＦＡＣＳ分析を、ＨＩＶ−１ ８９．６（図１Ａ）又は示されとおりに異なるクレード（ｃｌａｄｅ）特異的初期ウイルス単離物を有するｐＮＬ４−３（図１Ｂ又は１Ｃ）の何れかに感染した細胞上で行った。細胞を、未感染の偽（ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ ｍｏｃｋ）、ＨＩＶ−１ウイルスを感染、ウイルスを感染、そして１μＭのＳＢ２０３５８０で処理するか、又はウイルスを感染させ、そして１μＭのＣｐｄ４阻害剤で処理した。細胞を、材料と方法に記載されるとおりに、感染及び特異的阻害剤の処理の４日後に回収し、そして次にアネキシンＶ−ＦＩＴＣで染色した。パネルに示すナンバーはパーセントアネキシンＶ陽性を示す。ｐ３８阻害剤によるアポトーシスの顕著な阻害が現れる。図１Ｄは、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼブロックカスパーゼ３活性の選択的阻害剤を示すデータを示す。細胞溶解物を感染細胞から調製した。各細胞溶解物からの１００μｇの蛋白質を、材料と方法に記載されるとおりに、発色プロテアーゼアッセイに使用した。各カラムは、３つの個別の実験における３つのサンプルからの結果の平均標準偏差を表す。グループを、偽（未感染）、ウイルス感染、ウイルス感染＋Ｃｐｄ４及びウイルス感染＋ＳＢ２０３５８０で試験した。
【図２】図２Ａ−２Ｃは、ＨＩＶ感染がＦａｓＬ発現をアップ制御すること、及びＦａｓＬ発現がｐ３８阻害剤により阻害されることを示す。図２Ａは、偽又はＨＩＶ感染細胞（８９．６又はｐＮＬ４−３ウイルス）又はＰＢＭＣｓ及び又はジュルカットＴ細胞におけるＦａｓＬ発現のフローサイトメトリーからのデータを示す。図２Ｂは、１μＭのＣｐｄ４存在下での偽感染又はＨＩＶ感染ジュルカット細胞におけるＦａｓＬ発現のデータを示す。図２Ｃは、１μＭのＣｐｄ４存在下での偽感染又はＨＩＶ感染ＰＢＭＣｓにおけるＦａｓＬ発現のデータを示す。細胞を感染２日後に回収し、そして抗−ＦａｓＬ抗体（ＮＯＫ−１）ＰＥにより染色した。データは、研究された３人の異なるドナーによる３つの異なる実験の代表である。
【図３】図３Ａ及び３Ｂは、個々のＨＩＶ−１遺伝子によるＦａｓＬ発現の誘導の比較からのデータを示す。ジュルカットＴ細胞について、２０μｇのｐＣＤＮＡ ３．１（偽）、ｐＣＤＮＡ−Ｅｎｖ，ｐＣＤＮＡ−Ｔａｔ，ｐＣＤＮＡ−Ｖｐｒ又はｐＣＤＮＡ−Ｎｅｆプラスミドによりエレクトロポレーションを行った。トランスフェクションの４８時間後に、ＦａｓＬ発現の表面レベルを、ＦａｓＬ特異的抗体（ＮＯＫ−１）による染色の後に、フローサイトメトリーにより測定した。図３Ｂは、ＦａｓＬのＮｅｆ誘導がＣｐｄ４により高度に抑圧されることを示す。満たされたヒストグラムはＦａｓＬ発現レベルを表し、そして点線はＩｇＧアイソタイプ対照を表す。
【図４】図４Ａ−４Ｃは、Ｎｅｆ構築物、発現及び効果に関するデータを示す。図４Ａは、ＨＩＶ−１ ｐＮＬ４−３プロウイルスの発現構築物の模式的表示を示す。ｐＮＬ４−３ ｗｔ又はｐＮＬ４−３フレームシフト（５’Ｎｅｆ）。図４Ｂは、プロウイルス構築物のＮｅｆ発現分析からのデータを示す。ＨＩＶ−１プロウイルス構築物ｐＮＬ４−３ ｗｔ又はｐＮＬ４−３ Ｎｅｆ（−）をトランスフェクトされた細胞から、又はＮｅｆをコードするプラスミドｐＣＮｅｆをトランスフェクトされた細胞から又は野生型８９．６ウイルスを感染させた細胞からの細胞溶解物を、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そして次にニトロセルロースフィルター上に転写した。溶解物ＨＩＶ Ｎｅｆ特異的を抗結成により釣り上げた。図４Ｃは、ｐＮＬ４−３ Ｗｔ又はｐＮＬ４−３／デルタＮｅｆの培養上清中のｐ２４レベルを測定することにより感染後のウイルス生産を測定したデータを示す。示されたデータは、感染９６時間後の測定値を反映する。
【図５】図５は、ヒトＰＢＭＣｓ中のＮｅｆ陽性ウイルスによるＦａｓＬの誘導を研究する実験からのデータを示す。細胞（１ｘ１０^６細胞）にｐＮＬ４−３ Ｗｔ又はｐＮＬ４−３デルタＮｅｆビリオンを感染させ、そして次に感染細胞を示されたとおりに１μＭのＣｐｄ４化合物で処理した。感染及び処理の２日後に、等しい数の細胞（１ｘ１０^６）をｐ２４発現に関して研究し、そしてｐ２４ｇａｇ−ＦＩＴＣ又はＣＤ９５Ｌ−ＡＰＣのそれらの発現をプロットした。これらの実験は３回繰り返され、そして類似の結果が得られた。ＦａｓＬのＮｅｆ陽性ウイルス誘導は、Ｃｐｄ４により１μＭの濃度において完全に阻害される。
【図６】図６Ａ及び６Ｂは、本明細書中及び以下の様々な実験からのデータを示す。図６Ａは、ＣＤ１４^＋マクロファージがナイーブな患者から調製されて、刺激されて、そして次に８９．６ウイルス（１００ ＴＣＩＤ_５０／１ｘ１０^６細胞／ｍｌ）を感染させ、洗浄し、そして３日間インキュベートし、そして次に自己ＣＤ８^＋Ｔ細胞と混合された実験からのデータを示す。１２時間後に、細胞をアネキシンＶにより染色し、そしてＣＤ８^＋集団中のアポトーシス誘導を研究した（パネルｉｖ）。フローサイトメトリーにより検出されたとおり、ＣＤ８^＋Ｔ細胞のアポトーシスが誘導された。図６Ｂは、未感染（ｉ）及びＨＩＶ感染（ｉｉ）自己マクロファージを図６Ａにおけるように調製し、そしてポリスチレンラテックスビーズにより刺激し、そして中和性抗−ＦａｓＬ抗体の存在下で精製された未感染ＣＤ８^＋Ｔ細胞か又は１μＭのＣｐｄ４とインキュベートして一晩インキュベートされた実験からのデータを示す。材料と方法に記載されるとおりに、細胞を次に回収し、そしてアネキシンＶに関して染色した。各四角形の値はアネキシンＶ発現を％にて表す。実験を２回繰り返したところ、類似の結果を得た。
【図７】図７Ａ−７Ｄは、Ｎｅｆ及びＮｅｆ＋Ｃｐｄ４による効果を比較するデータを示す。ＨＩＶ Ｎｅｆは、Ｃｐｄ４により阻害され得る転写因子を活性化する。ジュルカットＴ細胞に、ＡＰ−１（図７Ａ）又はＮＦ−κＢ（図７Ｂ）依存性リポータープラスミド（１μｇ）及びＮｅｆプラスミド（１μｇ）をトランスフェクトし、そして示されるとおりに、Ｃｐｄ４（１μＭ）により処理したか又はしなかった。細胞を２４時間後に回収し、そしてルシフェラーゼ活性に関してアッセイした。結果を、対照のトランスフェクトされたβ−ｇａｌレベルに対して標準化した。実験を３回実施したが、類似の結果であった。Ｎｅｆ活性化の生化学を図７Ｃに示す。細胞を上記のとおりに処理し、そして次にｐ３８活性化に関して分析した。全蛋白質を材料と方法に記載されるとおりに抽出し、そして蛋白質定量のために上旬化された１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で解析した。ゲル調製の後に、ゲルをフィルターに移し、そして抗ｐ３８又はホスホｐ３８抗体を用いて免疫ブロットした。Ｎｅｆはｐ３８のリン酸化及び活性化を誘導し、そしてこの活性化はｐ３８阻害剤によりブロックされ得る。同様に処理された細胞の核抽出物をｃ−Ｊｕｎ活性化に関して分析した。ｐ３８経路によるように、Ｎｅｆはｃ−Ｊｕｎの強い活性化を誘導し、Ｃｐｄ４によりブロックされ得る（図７Ｄ）。
【図８】図８は、Ｃｐｄ４及びＳＢ２０３５８０の構造を示す。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶに感染したと同定された人を治療する方法であって、ＦａｓＬ発現を阻害するのに有効な量のｐ３８阻害剤をその人に投与する工程を含む方法。
【請求項２】
ｐ３８阻害剤がＨＩＶの複製を阻害するのに有効な量にて投与される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｔ細胞の活性化を阻害することなしにＨＩＶの複製を阻害するのに有効な量にてｐ３８阻害剤が投与される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ｐ３８阻害剤が、１ｍＭより低い濃度において、ＦａｓＬ発現を測定するためのインビトロアッセイにて５０％より多い細胞においてＦａｓＬ発現レベルを少なくとも５０％阻害するのに有効である、請求項１乃至３の何れか１項記載の方法。
【請求項５】
ｐ３８阻害剤が、０．１ｍＭより低い濃度において、ＦａｓＬ発現を測定するためのインビトロアッセイにて５０％より多い細胞においてＦａｓＬ発現レベルを少なくとも５０％阻害するのに有効である、請求項１乃至４の何れか１項記載の方法。
【請求項６】
ｐ３８阻害剤が、０．０５ｍＭより低い濃度において、ＦａｓＬ発現を測定するためのインビトロアッセイにて５０％より多い細胞においてＦａｓＬ発現レベルを少なくとも５０％阻害するのに有効である、請求項１乃至５の何れか１項記載の方法。
【請求項７】
ｐ３８阻害剤が、０．０１ｍＭより低い濃度において、ＦａｓＬ発現を測定するためのインビトロアッセイにて５０％より多い細胞においてＦａｓＬ発現レベルを少なくとも５０％阻害するのに有効である、請求項１乃至６の何れか１項記載の方法。
【請求項８】
ｐ３８阻害剤が、４−［５−（４−フルオロ−フェニル）−２−（４−メタンスルフィニル−フェニル）−３Ｈ−イミダゾール−４−イル］−ピリジンである、請求項１乃至７の何れか１項記載の方法。
【請求項９】
ｐ３８阻害剤と共に、一つ又はそれより多い他の抗−ＨＩＶ化合物を人に投与する工程をさらに含む、請求項１乃至８の何れか１項記載の方法。
【請求項１０】
ｐ３８阻害剤と共に、融合阻害剤（即ち、エンフビルチド（ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ））、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩｓ，即ち、デラビルジン、エファビレンツ、ネビラピン）、ヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩｓ，即ち、アバカビル、アバカビル、ラミブジン、及びジドブジンの組み合わせ、ジダノシン、ラミブジン、ラミブジンとジドブジンの組み合わせ、スタブジン、テノフォビルＤＦ、ザルシタビン、ジドブジン）、プロテアーゼ阻害剤（即ち、アンプレナビル、インディナビル、ロピナビルとニトナビルの組み合わせ、ネルフィナビル、リトナビル、サクイナビル、インビラーゼ）からなる群から選択される、一つ又はそれより多い他の抗−ＨＩＶ化合物を人に投与する工程をさらに含む、請求項１乃至９の何れか１項記載の方法。
【請求項１１】
ＨＩＶ感染細胞内のＦａｓＬ発現を阻害する方法であって、当該細胞においてＦａｓＬ発現を阻害するのに十分な量のｐ３８阻害剤をＨＩＶ感染細胞に送達する工程を含む、方法。
【請求項１２】
ｐ３８阻害剤がＨＩＶ複製を阻害するのに十分な量にて送達される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ｐ３８阻害剤がＴ細胞活性化を阻害しないｐ３８阻害剤である、請求項１１又は１２記載の方法。
【請求項１４】
ｐ３８阻害剤が、４−［５−（４−フルオロ−フェニル）−２−（４−メタンスルフィニル−フェニル）−３Ｈ−イミダゾール−４−イル］−ピリジンである、請求項１１乃至１３の何れか１項記載の方法。
【請求項１５】
ＨＩＶに暴露された疑いのある人を治療する方法であって、ＦａｓＬ発現を阻害するのに有効な量のｐ３８阻害剤をその人に投与する工程を含む方法。
【請求項１６】
ｐ３８阻害剤がＨＩＶの複製を阻害するのに有効な量にて投与される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
Ｔ細胞の活性化を阻害することなしにＨＩＶの複製を阻害するのに有効な量にてｐ３８阻害剤が投与される、請求項１５又は１６記載の方法。
【請求項１８】
ｐ３８阻害剤が、１ｍＭより低い濃度において、ＦａｓＬ発現を測定するためのインビトロアッセイにて５０％より多い細胞においてＦａｓＬ発現レベルを少なくとも５０％阻害するのに有効である、請求項１５乃至１７の何れか１項記載の方法。
【請求項１９】
ｐ３８阻害剤が、０．１ｍＭより低い濃度において、ＦａｓＬ発現を測定するためのインビトロアッセイにて５０％より多い細胞においてＦａｓＬ発現レベルを少なくとも５０％阻害するのに有効である、請求項１５乃至１８の何れか１項記載の方法。
【請求項２０】
ｐ３８阻害剤が、０．０５ｍＭより低い濃度において、ＦａｓＬ発現を測定するためのインビトロアッセイにて５０％より多い細胞においてＦａｓＬ発現レベルを少なくとも５０％阻害するのに有効である、請求項１５乃至１９の何れか１項記載の方法。
【請求項２１】
ｐ３８阻害剤が、０．０１ｍＭより低い濃度において、ＦａｓＬ発現を測定するためのインビトロアッセイにて５０％より多い細胞においてＦａｓＬ発現レベルを少なくとも５０％阻害するのに有効である、請求項１５乃至２０の何れか１項記載の方法。
【請求項２２】
ｐ３８阻害剤が、４−［５−（４−フルオロ−フェニル）−２−（４−メタンスルフィニル−フェニル）−３Ｈ−イミダゾール−４−イル］−ピリジンである、請求項１５乃至２１の何れか１項記載の方法。
【請求項２３】
ｐ３８阻害剤と共に、一つ又はそれより多い他の抗−ＨＩＶ化合物を人に投与する工程をさらに含む、請求項１５乃至２２の何れか１項記載の方法。
【請求項２４】
ｐ３８阻害剤と共に、融合阻害剤（即ち、エンフビルチド（ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ））、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩｓ，即ち、デラビルジン、エファビレンツ、ネビラピン）、ヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩｓ，即ち、アバカビル、アバカビル、ラミブジン、及びジドブジンの組み合わせ、ジダノシン、ラミブジン、ラミブジンとジドブジンの組み合わせ、スタブジン、テノフォビルＤＦ、ザルシタビン、ジドブジン）、プロテアーゼ阻害剤（即ち、アンプレナビル、インディナビル、ロピナビルとニトナビルの組み合わせ、ネルフィナビル、リトナビル、サクイナビル、インビラーゼ）からなる群から選択される、一つ又はそれより多い他の抗−ＨＩＶ化合物を人に投与する工程をさらに含む、請求項１５乃至２３の何れか１項記載の方法。
【請求項２５】
ＦａｓＬ発現のＮｅｆ媒介性アップ制御を阻害する化合物を同定する方法であて、
ａ）Ｎｅｆを発現する細胞を試験化合物に接触させるが、但し、Ｎｅｆが当該試験化合物の不在下で上記細胞内でＦａｓＬ発現をアップ制御し；
ｂ）ＦａｓＬ発現のレベルを測定し；そして
ｃ）当該レベルを、試験化合物不在下での上記細胞内でのＦａｓＬ発現のレベルと比較し、試験化合物存在下でのＦａｓＬ発現の減少がＦａｓＬ発現のＮｅｆ媒介性アップ制御を示唆する
工程を含む試験アッセイを実施することを含む方法。
【請求項２６】
陰性対照アッセイをさらに含む請求項２５記載の方法であって、当該陰性対照アッセイは、工程：
ａ）Ｎｅｆを発現する細胞を、ＦａｓＬ発現のＮｅｆアップ制御に作用する如何なる物質も含まない組成物に接触させるが、但し、Ｎｅｆを発現する上記細胞内でのＦａｓＬ発現は、Ｎｅｆの発現前の当該細胞内のＦａｓＬ発現よりも低く；
ｂ）ＦａｓＬ発現のレベルを測定し；そして
ｃ）上記陰性対照アッセイにおけるＦａｓＬ発現のレベルを、上記試験アッセイにおけるＦａｓＬ発現のレベルに対して比較するが、
但し、試験アッセイに対しての、陰性対照アッセイにおけるＦａｓＬ発現の高いレベルが、上記試験化合物がＦａｓＬ発現のＮｅｆ媒介性アップ制御を阻害することを示唆する、
請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
陽性対照アッセイをさらに含む請求項２５又は２６記載の方法であって、当該陽性対照アッセイは、工程：
ａ）Ｎｅｆを発現する細胞を、ＦａｓＬ発現のＮｅｆアップ制御を阻害することが知られている化合物に接触させるが、但し、Ｎｅｆを発現する上記細胞内でのＦａｓＬ発現は、Ｎｅｆの発現前の当該細胞内のＦａｓＬ発現よりも低く；
ｂ）ＦａｓＬ発現のレベルを測定し；そして
ｃ）上記陽性対照アッセイにおけるＦａｓＬ発現のレベルを、上記試験アッセイにおけるＦａｓＬ発現のレベルに対して比較するが、
但し、試験アッセイにおけるＦａｓＬ発現のレベルが陽性対照アッセイにおけるＦａｓＬ発現のレベルと同等であることが、上記試験化合物がＦａｓＬ発現のＮｅｆ媒介性アップ制御を阻害することを示唆する、
請求項２５又は２６記載の方法。
【請求項２８】
ＨＩＶに感染したと同定された人を治療する方法であって、Ｔ細胞活性化を阻害することなしに、ＨＩＶ複製を阻害するのに有効な量のｐ３８阻害剤をその人に投与する工程を含む方法。
【請求項２９】
ｐ３８阻害剤が、１ｍＭより低い濃度において、ＨＩＶ複製を測定するためのインビトロアッセイにて５０％より多い細胞においてＨＩＶ複製を少なくとも５０％阻害するのに有効である、請求項２８項記載の方法。
【請求項３０】
ｐ３８阻害剤が、０．１ｍＭより低い濃度において、ＨＩＶ複製を測定するためのインビトロアッセイにて５０％より多い細胞においてＨＩＶ複製を少なくとも５０％阻害するのに有効である、請求項２８又は２９項記載の方法。
【請求項３１】
ｐ３８阻害剤が、０．０５ｍＭより低い濃度において、ＨＩＶ複製を測定するためのインビトロアッセイにて５０％より多い細胞においてＨＩＶ複製を少なくとも５０％阻害するのに有効である、請求項２８乃至３０の何れか１項記載の方法。
【請求項３２】
ｐ３８阻害剤が、０．０ｍＭより低い濃度において、ＨＩＶ複製を測定するためのインビトロアッセイにて５０％より多い細胞においてＨＩＶ複製を少なくとも５０％阻害するのに有効である、請求項２８乃至３１の何れか１項記載の方法。
【請求項３３】
ｐ３８阻害剤が、４−［５−（４−フルオロ−フェニル）−２−（４−メタンスルフィニル−フェニル）−３Ｈ−イミダゾール−４−イル］−ピリジンである、請求項２８乃至３２の何れか１項記載の方法。
【請求項３４】
ｐ３８阻害剤と共に、一つ又はそれより多い他の抗−ＨＩＶ化合物を人に投与する工程をさらに含む、請求項２８乃至３３の何れか１項記載の方法。
【請求項３５】
ｐ３８阻害剤と共に、融合阻害剤（即ち、エンフビルチド（ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ））、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩｓ，即ち、デラビルジン、エファビレンツ、ネビラピン）、ヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩｓ，即ち、アバカビル、アバカビル、ラミブジン、及びジドブジンの組み合わせ、ジダノシン、ラミブジン、ラミブジンとジドブジンの組み合わせ、スタブジン、テノフォビルＤＦ、ザルシタビン、ジドブジン）、プロテアーゼ阻害剤（即ち、アンプレナビル、インディナビル、ロピナビルとニトナビルの組み合わせ、ネルフィナビル、リトナビル、サクイナビル、インビラーゼ）からなる群から選択される、一つ又はそれより多い他の抗−ＨＩＶ化合物を人に投与する工程をさらに含む、請求項２８乃至３４の何れか１項記載の方法。
【請求項３６】
ＨＩＶ感染細胞においてＨＩＶの複製を阻害する方法であって、ＨＩＶ複製を阻害するのに十分な量のｐ３８阻害剤を上記ＨＩＶ感染細胞に送達する工程を含み、但し、ｐ３８阻害剤はＴ細胞活性化を阻害しないｐ３８阻害剤である、方法。
【請求項３７】
ｐ３８阻害剤が、４−［５−（４−フルオロ−フェニル）−２−（４−メタンスルフィニル−フェニル）−３Ｈ−イミダゾール−４−イル］−ピリジンである、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
ＨＩＶに暴露された疑いのある人を治療する方法であって、Ｔ細胞の活性化を阻害することなしにＨＩＶの複製を阻害するのに有効な量にてｐ３８阻害剤を投与する工程を含む、方法。
【請求項３９】
ｐ３８阻害剤が、１ｍＭより低い濃度において、ＦａｓＬ発現を測定するためのインビトロアッセイにて５０％より多い細胞においてＦａｓＬ発現レベルを少なくとも５０％阻害するのに有効である、請求項３８項記載の方法。
【請求項４０】
ｐ３８阻害剤が、０．１ｍＭより低い濃度において、ＦａｓＬ発現を測定するためのインビトロアッセイにて５０％より多い細胞においてＦａｓＬ発現レベルを少なくとも５０％阻害するのに有効である、請求項３８又は３９記載の方法。
【請求項４１】
ｐ３８阻害剤が、０．０５ｍＭより低い濃度において、ＦａｓＬ発現を測定するためのインビトロアッセイにて５０％より多い細胞においてＦａｓＬ発現レベルを少なくとも５０％阻害するのに有効である、請求項３８乃至４０の何れか１項記載の方法。
【請求項４２】
ｐ３８阻害剤が、０．０１ｍＭより低い濃度において、ＦａｓＬ発現を測定するためのインビトロアッセイにて５０％より多い細胞においてＦａｓＬ発現レベルを少なくとも５０％阻害するのに有効である、請求項３８乃至４１の何れか１項記載の方法。
【請求項４３】
ｐ３８阻害剤が、４−［５−（４−フルオロ−フェニル）−２−（４−メタンスルフィニル−フェニル）−３Ｈ−イミダゾール−４−イル］−ピリジンである、請求項３８乃至４２の何れか１項記載の方法。
【請求項４４】
ｐ３８阻害剤と共に、一つ又はそれより多い他の抗−ＨＩＶ化合物を人に投与する工程をさらに含む、請求項３８乃至４３の何れか１項記載の方法。
【請求項４５】
ｐ３８阻害剤と共に、融合阻害剤（即ち、エンフビルチド（ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ））、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩｓ，即ち、デラビルジン、エファビレンツ、ネビラピン）、ヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩｓ，即ち、アバカビル、アバカビル、ラミブジン、及びジドブジンの組み合わせ、ジダノシン、ラミブジン、ラミブジンとジドブジンの組み合わせ、スタブジン、テノフォビルＤＦ、ザルシタビン、ジドブジン）、プロテアーゼ阻害剤（即ち、アンプレナビル、インディナビル、ロピナビルとニトナビルの組み合わせ、ネルフィナビル、リトナビル、サクイナビル、インビラーゼ）からなる群から選択される、一つ又はそれより多い他の抗−ＨＩＶ化合物を人に投与する工程をさらに含む、請求項３８乃至４４の何れか１項記載の方法。
【請求項４６】
ｐ３８経路を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）Ｎｅｆを発現する細胞を試験化合物に接触させるが、但し、Ｎｅｆが当該試験化合物の不在下で上記細胞内でＦａｓＬ発現をアップ制御し；
ｂ）ＦａｓＬ発現のレベルを測定し；そして
ｃ）当該レベルを、試験化合物不在下での上記細胞内でのＦａｓＬ発現のレベルと比較するが、
但し、試験化合物存在下でのＦａｓＬ発現の減少がｐ３８経路の阻害を示唆する
工程を含む試験アッセイを実施することを含む方法。
【請求項４７】
化合物がｐ３８活性を阻害するか否かを決定するために、ＦａｓＬ発現の阻害剤として同定された化合物をｐ３８阻害アッセイにおいてさらにスクリーニングする、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
陰性対照アッセイをさらに含む請求項４６又は４７記載の方法であって、当該陰性対照アッセイは、工程：
ａ）Ｎｅｆを発現する細胞を、ＦａｓＬ発現のＮｅｆアップ制御に作用する如何なる物質も含まない組成物に接触させるが、但し、Ｎｅｆを発現する上記細胞内でのＦａｓＬ発現は、Ｎｅｆの発現前の当該細胞内のＦａｓＬ発現よりも低く；
ｂ）ＦａｓＬ発現のレベルを測定し；そして
ｃ）上記陰性対照アッセイにおけるＦａｓＬ発現のレベルを、上記試験アッセイにおけるＦａｓＬ発現のレベルに対して比較するが、
但し、試験アッセイに対しての、陰性対照アッセイにおけるＦａｓＬ発現の高いレベルが、上記試験化合物がｐ３８経路を阻害することを示唆する、
請求項４６又は４７記載の方法。
【請求項４９】
陽性対照アッセイをさらに含む請求項４６乃至４８の何れか１項記載の方法であって、当該陽性対照アッセイは、工程：
ａ）Ｎｅｆを発現する細胞を、ＦａｓＬ発現のＮｅｆアップ制御を阻害することが知られている化合物に接触させるが、但し、Ｎｅｆを発現する上記細胞内でのＦａｓＬ発現は、Ｎｅｆの発現前の当該細胞内のＦａｓＬ発現よりも低く；
ｂ）ＦａｓＬ発現のレベルを測定し；そして
ｃ）上記陽性対照アッセイにおけるＦａｓＬ発現のレベルを、上記試験アッセイにおけるＦａｓＬ発現のレベルに対して比較するが、
但し、試験アッセイにおけるＦａｓＬ発現のレベルが陽性対照アッセイにおけるＦａｓＬ発現のレベルと同等であることが、上記試験化合物がｐ３８経路を阻害することを示唆する、
請求項４６乃至４８の何れか１項記載の方法。
【請求項５０】
異なる試験アッセイを上記化合物で実施することによりｐ３８阻害活性を決定する工程をさらに含む、請求項４６乃至４９の何れか１項記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【公表番号】特表２００６−５２７１９７（Ｐ２００６−５２７１９７Ａ）
【公表日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１５１８７（Ｐ２００６−５１５１８７）
【出願日】平成１６年６月４日（２００４．６．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１７６９６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０００４０５
【国際公開日】平成１７年１月６日（２００５．１．６）
【出願人】（５００４２９１０３）ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア (102)
【Ｆターム（参考）】