α−グルコシダーゼ阻害剤
【課題】ツルアラメの抽出物中のα−グルコシダーゼ阻害活性成分を突き止めること。
【解決手段】ダイエコールを有効成分とすることを特徴とするα−グルコシダーゼ阻害剤。
【解決手段】ダイエコールを有効成分とすることを特徴とするα−グルコシダーゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は褐藻類より抽出・精製された物質を有効成分とするα−グルコシダーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
二糖類分解酵素であるα−グルコシダーゼは、小腸に存在し、食物中の二糖類を単糖類へ分解し、小腸からの糖類の吸収を促進するため、体内において重要な役割をする酵素である。
【０００３】
このα−グルコシダーゼの活性を阻害する阻害剤は、二糖類から単糖類への分解を遅らせる作用を有するため、腸管での糖類の消化吸収が遅らすことができる。その結果、食後の血糖上昇が抑えられるので、糖尿病等の治療・予防に大変有用なものである。
【０００４】
これまでα−グルコシダーゼ阻害剤としては、種々の植物や、微生物の培養液等から得られたものが知られている。
【０００５】
本発明者らも、以前、褐藻類であるツルアラメの抽出物の乾燥パウダーに強力なα−グルコシダーゼ阻害活性があることを見出し、遺伝的糖尿病モデルマウスおよびショ糖負荷モデルラットに対してツルアラメ抽出物の経口投与が有意な血糖値上昇抑制効果を示すことを報告している（非特許文献１及び２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】岩井 邦久， 松江 一：褐藻ツルアラメの糖尿病モデルマウスにおける抗酸化および高血糖抑制効果. 第60 回日本栄養・食糧学会大会,2006年5月20日.
【非特許文献２】原高明, 八木勇三, 泉水直人：ショ糖負荷ラットの血糖値推移に対するSeametaherblineの効果, Food Function, 3, 85‐90, 2007.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、これらの報告では、α−グルコシダーゼを阻害する物質が何であるかについては全く検討していなかった。
【０００８】
従って、本発明は、上記ツルアラメの抽出物中のα−グルコシダーゼ阻害活性成分を突き止めることをその課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、上記阻害活性成分がダイエコールであることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、ダイエコールを有効成分とすることを特徴とするα−グルコシダーゼ阻害剤である。
【００１１】
また、本発明は、上記α−グルコシダーゼ阻害剤を含有することを特徴とする飲食品、特に糖尿病予防・治療用飲食品である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤は天然物由来のものであり、安全に摂取できるものである。
【００１３】
従って、本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤は、糖尿病の予防・治療薬等や、糖尿病予防・治療用飲食品に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤（以下、「本発明阻害剤」という）の有効成分であるダイエコール（Dieckol）は以下に示される公知の物質であり、例えば、文献（Hye Sook Kang, Hae Young Chung, Jee Hyung Jung, Byeng Wha Son, and Jae Sue Choi: A new phlorotannin from the brown alga Ecklonia stolonifera. Chem. Pharm. Bull. 51, 1012-1014, 2003. ）に記載の方法により得ることができる。このダイエコールは、ツルアラメ以外にもクロメやカジメ等の褐藻類に見出されており、抗菌活性等が報告されているが、α−グルコシダーゼ阻害活性があることについては報告されていないものである。
【００１５】
なお、本発明においてα−グルコシダーゼ阻害活性とは、マルトース等の二糖類分解酵素の阻害活性をいい、これは一般的な方法で測定できる。また、本発明阻害剤のα−グルコシダーゼ阻害活性は、下記参考例１と同様にして測定した場合に、０.４〜０.８ｍＭ程度である。
【００１６】
＜ダイエコールの性質＞
（分子式）Ｃ３６Ｈ２２Ｏ１８
（分子量）７４２.６
（構造式）
【化１】
（その他の性質）
水に難溶
アルコールに可溶
茶褐色
【００１７】
上記ダイエコールはコンブ目コンブ科の褐藻であるツルアラメ（Ecklonia stolonifera）を原料として次のようにしても得ることができる。
【００１８】
まず、ツルアラメの葉部１００〜５００ｇ程度を包丁等で細断し、これにメタノール、エタノール等の溶媒を０.３〜２Ｌ程度添加した後、ホモジナイザー等で攪拌する。その後、ホモジネートを４〜１０℃程度で遮光した状態で１日間程度放置し、抽出液を得る。次に、この抽出液を遠心し、上清を得る。更にその上清から溶媒を蒸発させた後、５０〜５００ｍＬ程度の水に溶解させて溶解液を得る。この溶解液をＳｅｐ−Ｐａｋ Ｖａｃ Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ製）に通液させ、その後、更に４０％（以下、単に「％」という）メタノール水溶液を通液させて得られる画分を採取する。
【００１９】
上記で採取された画分は、更に、１％ギ酸水溶液とメタノールを４０：６０の質量比で含有する溶液に溶解させる。その後、これについて以下の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行い、保持時間が９.５〜１１分の画分を採取する。この画分にはダイエコールおよびこれらの重合体のみが含まれる。
【００２０】
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ ｄＣ１８（４.６ｍｍＩＤ×１５０ｍｍＬ：Ｗａｔｅｒｓ社）
移動相：１％ギ酸（Ａ液）およびメタノール（Ｂ液）
グラジエント：スタート時のＡ：Ｂ＝４５：５５が１５分間でＡ：Ｂ＝３０：７０となるリニアグラジェント
流速：０.８ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出器：フォトダイオードアレイ検出器
検出波長：２８０ｎｍ
分取間隔：０.５分間
注入量：１０ｍｇ
【００２１】
本発明阻害剤は、上記ダイエコールを有効成分として含有していればよく、ダイエコールそのものあるいは従来の製剤担体と組み合わせて製剤化したものの何れであってもよい。また、製剤の剤形としては、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、タブレット剤、カプセル剤等が挙げられる。これら製剤におけるダイエコールの配合量は、特に制限されないが、例えば、それぞれが１日当たり４０ｍｇ以上、好ましくは２００〜５００ｍｇとなる量である。また、本発明阻害剤の摂取方法は、特に制限されないが、これを摂取することにより、食後の血糖上昇が抑えることができるため、上記配合量を１日１回または複数回、好ましくは３回に分けて食事後に摂取することが好ましい。更に、本発明阻害剤の効果を継続させるには、本発明阻害剤の摂取を２〜４週間程度連続で行うことが好ましい。
【００２２】
なお、本発明阻害剤は、従来のα−グルコシダーゼ阻害と同様に糖尿病の予防・治療薬等にも利用できる。この場合の製剤あたりの配合量や摂取方法は上記と同様である。
【００２３】
また、本発明阻害剤は、従来の飲食品にも添加することができる。この場合には、本発明阻害剤を一般的によく知られている他の食品原料に加えることにより、α−グルコシダーゼ阻害作用を有する飲食品、特に、糖尿病予防・治療用となる飲食品を得ることができる。この飲食品には、α−グルコシダーゼ阻害剤をダイエコールとして、０.１％以上、好ましくは０.５〜２％含有させればよい。
【００２４】
本発明阻害剤を含有させることが好ましい飲食品としては、例えば、パン類、麺類、菓子類、サプリメント等が挙げられる。なお、飲食品には動物の飼料も含まれる。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、この実施例により本発明は何ら制約されるものではない。
【００２６】
参 考 例 １
ツルアラメの各種溶媒抽出物のグルコシダーゼ阻害活性（ＩＣ５０）：
（１）ツルアラメ抽出物の調製
生のツルアラメ（Ecklonia stolonifera）葉部１００ｇを蒸留水で洗浄し、包丁で細かく切った後、蒸留水、エタノールおよびメタノールの３種類の溶媒４００ｍＬをそれぞれ加え、ミキサー（ＳＭ−ＫＭ３９：三洋電機株式会社）でホモジナイズした。３種類のホモジネートを遮光、４℃で一晩撹拌抽出し、それを遠心分離（４℃、１０，０００ｒｐｍ、３０分）によって上清と沈殿に分け、以下の処理により３種類の抽出物を調製した。
【００２７】
蒸留水で抽出した抽出物の上清はろ紙（Ｎｏ.２）でろ過後、ロータリーエバポレーターで濃縮したものを凍結乾燥した（ツルアラメ水抽出物）。また、エタノールで抽出した抽出物の上清をろ過後、濃縮したものを少量の蒸留水に再度溶解し、凍結乾燥した（ＥｔＯＨ抽出物）。更に、メタノールで抽出した抽出物の上清をろ過後に濃縮し、少量の蒸留水に再度溶解し、凍結乾燥した（ＭｅＯＨ抽出物）。これら３種の抽出物について以下の方法を用いてグルコシダーゼ阻害活性を測定した。
【００２８】
（２）グルコシダーゼ阻害活性の測定
ラット小腸粉末（ＳＩＧＭＡ社）０.５ｇに５６ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ６.０）５ｍＬを添加し、ポリトロンにてホモジナイズした。これを３,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清を粗酵素液とし、それを適宜希釈して使用した。各グルコシダーゼ活性測定の基質として、スクロースについてはスクラーゼ、マルトースについてはマルターゼ、デンプンについてはグルコアミラーゼ、パラチノースについてはイソマルターゼを使用した。各基質はいずれも５６ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ６.０）を用いて２０ｍｇ／ｍＬに調製した。
【００２９】
各抽出物は５６ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ６.０）に種々の濃度で溶解させ、その２０μＬを採取したチューブに２０ｍｇ／ｍＬの各基質溶液１００μＬを添加し、混合後３７℃で５分間ブレインキュベートした。この混合液に希釈した各酵素液を２０μＬ添加し、混合後３７℃でインキュベートした。インキュベートから０、１５、３０、６０、９０および１２０分後に反応液１５μＬを試験管に採取し、直ちに１０分間煮沸して酵素を失活させた。冷却後、反応液中のグルコース濃度をグルコースＣII−テストワコー（和光純薬工業社）を使用して測定した。
【００３０】
各反応液中グルコース生成量から各酵素の反応速度を算出した。酵素と基質のみの反応速度を１００％とし、各試料添加時の反応速度からその酵素阻害率を算出した。更に、各試料の濃度と阻害率をプロットし、その近似曲線から各酵素の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出した。その結果を表１に示した。
【００３１】
【表１】
【００３２】
何れの抽出物にもスクラーゼおよびイソマルターゼ阻害活性は認められなかったが、ＥｔＯＨ抽出物およびＭｅＯＨ抽出物には、マルターゼとグルコアミラーゼの強い阻害活性が認められた。一方、ツルアラメ水抽出物には期待できるマルターゼとグルコシダーゼの阻害活性は見られなかった。
【００３３】
以上の結果から、ツルアラメの阻害作用がフルクトースの結合分解には作用しないこと、あるいはツルアラメの阻害作用がα１→４結合の分解しかしないことが予想された。
【００３４】
実 施 例 １
ダイエコールの抽出：
（１）ＥｔＯＨ抽出物の分画
参考例１で調製したＥｔＯＨ抽出物２００ｍｇに蒸留水１０ｍＬを加え、超音波照射しながら溶解させて試料溶液を得た。一方、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｖａｃ Ｃ１８カラム（５ｇ／２０ｃｃ：Ｗａｔｅｒｓ社）にメタノール１２０ｍＬおよび蒸留水１２０ｍＬをこの順番で流し、コンディショニングしておいた。
【００３５】
続いて、２０ｍｇ／ｍＬの試料溶液１０ｍＬをＳｅｐ−Ｐａｋ Ｖａｃ Ｃ１８カラムに負荷し、負荷した液量分を溶出（素通り画分）させた後、蒸留水（０％メタノール）、２０％メタノール水溶液、４０％メタノール水溶液、６０％メタノール水溶液、８０％メタノール水溶液および１００％メタノールをそれぞれ７０ｍＬずつこの順番で通液した。各溶出液を収集し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、流した順に素通り画分、Ｅ０Ｍ（０％メタノール画分）、Ｅ２０Ｍ（２０％メタノール画分）、Ｅ４０Ｍ（４０％メタノール画分）、Ｅ６０Ｍ（６０％メタノール画分）、Ｅ８０Ｍ（８０％メタノール画分）およびＥ１００Ｍ（１００％メタノール画分）とした。素通り画分からＥ６０Ｍまではそれぞれ凍結乾燥させ、分画物を得た。Ｅ８０ＭおよびＥ１００Ｍは濃縮後に真空デシケーター中で乾固し、分画物を得た。各分画物のマルターゼおよびグルコアミラーゼの５０％阻害活性（ＩＣ５０）を参考例１と同様にして測定した。その結果を表２に示した。なお、Ｅ８０Ｍは殆ど回収されなかったため活性の測定などは行わなかった。
【００３６】
【表２】
【００３７】
ＥｔＯＨ抽出物からの収量はＥ４０Ｍが最も多かった。また、マルターゼ阻害活性はＥ４０ＭとＥ６０Ｍに強く認められ、グルコアミラーゼ阻害活性はＥ２０Ｍ、Ｅ４０Ｍ、Ｅ６０Ｍに認められた。なお、Ｅ４０Ｍは分画前に比べて酵素の阻害活性が１.５〜１.９倍上昇した。
【００３８】
以上の結果より、Ｅ４０Ｍにグルコシダーゼ阻害活性成分が含まれていることが示された。また、ＥｔＯＨ抽出物中のグルコシダーゼ阻害成分は４０％〜６０％メタノール水溶液で溶出できることが分かった。
【００３９】
（２）Ｅ４０ＭのＨＰＬＣ分析
（１）で調製した試料溶液は、１％ギ酸水溶液とメタノールを４０：６０の質量比で含有する溶液に溶解させ、１回分を約２ｍｇとして以下の条件でＨＰＬＣ分析を行った。収集した溶出液は、遠心エバポレーターにて減圧乾固し、分取物としてＨＰＬＣピークに合致させた。
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ ｄＣ１８（４.６ｍｍＩＤ×１５０ｍｍＬ：Ｗａｔｅｒｓ社）
移動相：１％ギ酸（Ａ液）およびメタノール（Ｂ液）
グラジエント：スタート時のＡ：Ｂ＝４５：５５が１５分間でＡ：Ｂ＝３０：７０となるリニアグラジェント
流速：０.８ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出器：２９９６フォトダイオードアレイ検出器（Ｗａｔｅｒｓ社）
検出波長：２８０ｎｍ
分取間隔：０.５分間
注入量：２ｍｇ
【００４０】
ＨＰＬＣ分析を行ったところ、クロマトグラムには主要なピークが４本検出され（図１のＦｒ.１〜Ｆｒ.４）、それらをフラクションコレクターで分取した。各フラクションについて酵素（マルターゼの）の５０％阻害活性を実施例１と同様にして測定した。その結果を表３に示した。
【００４１】
【表３】
【００４２】
上記より、Ｆｒ.４の阻害活性が０.５３２ｍｇ／ｍＬと最も強く、これはＥ４０Ｍの阻害活性の３.１倍に相当した。また、分取したＦｒ.４について、上記と同様の条件で再度ＨＰＬＣ分析を行ったところ、Ｆｒ.４には他のピークは混在しておらず、精製が確認された（図２）。このＦｒ.４を試料（Ｅ４０ＭＦｒ４）とし、これについて以下の構造解析を行った。
【００４３】
（３）構造解析
（ａ）Ｅ４０ＭＦｒ４のＮＭＲの測定
Ｅ４０ＭＦｒ４はアセトニトリル−ｄ３に溶解し、これの１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲおよびＤＥＰＴをＪＮＭ ＥＸ−２７０（２７０ＭＨｚ：ＪＥＯＬ社）を使用して測定した。
【００４４】
（ｂ）Ｅ４０ＭＦｒ４のＬＣ／ＭＳ／ＭＳの測定
ＡＰＩＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（アプライドバイオシステムズ社）を使用し、Ｅ４０ＭＦｒ４のＭＳおよびＭＳ／ＭＳを測定した。ＬＣのカラムにはＴＳＫｇｅｌＯＤＳ１００Ｖ（２ｍｍＩＤ×５０ｍｍＬ：東ソー社）、移動相には１％ギ酸（Ａ液）および１％ギ酸含有メタノール（Ｂ液）を使用し、Ａ：Ｂが０〜１８分間で９０：１０から１０：９０に変化するリニアグラジェントで、カラム温度４０℃、流速０.２ｍＬ／ｍｉｎで溶出させた。Ｅ４０ＭＦｒ４を１％ギ酸水溶液とメタノールを４０：６０の質量比で含有する溶液に溶解させ、１０ｍｇ／ｍＬとしたものを前記システムに５μＬ注入し、２８０ｎｍの吸光度検出とともに、ポジティブイオンモードでｍ／ｚ５０〜３０００の範囲でＭ＋Ｈを測定した。さらに、Ｍ＋Ｈの推定質量を親イオンとして解裂させたＭＳ／ＭＳ（娘イオンフラグメント）を測定した。
【００４５】
（ｃ）Ｅ４０ＭＦｒ４構造同定の結果
１３Ｃ−ＮＭＲの測定の結果（図３）からは、Ｅ４０ＭＦｒ４に含まれる物質の炭素数が３６個であることが示された。ＤＥＰＴの測定の結果（図４）からは３６個の炭素はＣＨとＣで構成されており、ＣＨ３およびＣＨ２は存在しないことが示された。１Ｈ−ＮＭＲの測定の結果（図５）からは、５.８〜６.３ｐｐｍにおけるケミカルシフト値が既知フロロタンニン化合物の文献値と一致することが示された。
【００４６】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの測定の結果（図６）からは、ＵＶ２８０ｎｍ検出ピークにおいてＥ４０ＭＦｒ４はほぼ単一のピークであることが分かった（図６（Ａ））。また、そのピークの分子量を測定したところＭ＋Ｈは最もシグナルの大きいｍ／ｚ７４３.０であることが分かった（図６（Ｃ））。さらに、Ｅ４０ＭＦｒ４の分子量を測定したデータからｍ／ｚ７４３.０を有するピークを探す（スキャンする）と、単一のピークがＵＶ２８０ｎｍの検出ピークで観察された位置と殆ど重なって得られた（図６（Ｂ））。これらのことから、Ｅ４０ＭＦｒ４の分子量は７４２.０であることが示された。また、ＭＳ／ＭＳスペクトルからは、ダイエコールの一部構造に一致するフラグメントがｍ／ｚ６１８、４９４、４１２、３８７、３７１、３０１、２８８に観察された（図６の（Ｄ））。
【００４７】
この分子量とＮＭＲの解析から、有力な候補化合物として既知フロロタンニン化合物であるダイエコール（Ｃ３６Ｈ２２Ｏ１８）が推定された。なお、分子量７４２.６のフロロタンニン化合物としては８,８'−バイエコールも存在するが、今回の構造解析結果からは８,８'−バイエコールに該当するデータは得られていない。
【００４８】
なお、ｍ／ｚ３０００までのＭＳスペクトルには、ｍ／ｚ１４８５および２２２７が観察され（図７（Ａ））、ｍ／ｚ１４８５を親イオンとした時のＭＳ／ＭＳスペクトル（図７（Ｂ））には、ダイエコールを示唆するｍ／ｚ７４３のフラグメントが観察され、ｍ／ｚ２２２７を親イオンとしたＭＳ／ＭＳスペクトルでは（図７（Ｃ））、ｍ／ｚ１４８５とｍ／ｚ７４３のフラグメントが観察された。これはダイエコールの二量体や三量体が存在する可能性を示している。
【００４９】
以上の結果より、Ｅ４０ＭＦｒ４に含まれる物質はダイエコールと同定された。
【００５０】
実 施 例 ２
Ｅ４０Ｍの単回投与によるマウス血糖上昇抑制効果：
（１）正常マウスにおけるＥ４０Ｍ投与時の経口糖負荷試験
正常マウスとして雄性Ｃ５７ＢＬマウス（日本クレア社）を購入し、１週間馴化飼育した後に、１８時間の絶食下で以下の試験に使用した。実験時のマウスは１２週齢で体重２０〜２２ｇであった。これらのマウスにヘパリン処理したプラスチック製キャピラリーチューブを用いて眼窩底採血した。引き続き、これらのマウスに実施例１の（１）で得られたＥ４０Ｍ（ダイエコールを１８％含有する）およびマルトースの混合溶液を単回経口投与した。Ｅ４０Ｍの投与量は０（Ｅ４０Ｍ−０）、５０（Ｅ４０Ｍ−５０）および３００（Ｅ４０Ｍ−３００）ｍｇ／ｋｇとし、マルトースの投与量は１.５ｇ／ｋｇとした。また、投与液量は１０ｍＬ／ｋｇとした。混合溶液投与後、０.５、１、２および４時間で、上記と同様に眼窩底採血した。採血後、直ちにキャピラリーチューブをヘマトクリット遠心機で遠心分離し（１２,０００ｒｐｍ×２分）、血漿を採取した。この血漿を適宜０.１５Ｍの塩化ナトリウム溶液で希釈し、血漿中グルコース濃度を富士ドライケム（ＦＤＣ３５００：ＧＬＵ−ＰＩＩＩ：冨士フィルム社）にて測定した。その結果を図８の（Ａ）に示した。
【００５１】
（２）糖尿病マウスにおけるＥ４０Ｍ投与時の経口糖負荷試験
２型糖尿病モデル動物として雄性ＫＫ−Ａｙマウス（日本クレア社）を購入し、１週間の馴化飼育後に１８時間の絶食下で以下の試験に使用した。実験時の週齢は１２週齢で、体重は３８〜４０ｇであった。Ｅ４０Ｍおよびマルトースの投与量ならびに実験手法は上記（１）と同様に行った。測定結果を図８のＢに示した。
【００５２】
（３）結果
Ｅ４０Ｍ−０はマルトース投与後０.５時間で４１０ｍｇ／ｄＬに血糖値が上昇し、その後減少した。Ｅ４０Ｍ−５０およびＥ４０Ｍ−３００も投与後０.５時間で血糖値が上昇しその後時間とともに減少したが、０.５時間での血糖値は約３００ｍｇ／ｄＬとＥ４０Ｍ−０より低く、Ｅ４０Ｍ−３００は０.５時間および１時間での血糖値がＥ４０Ｍ−０より有意に低値となった。
【００５３】
Ｃ５７ＢＬマウスと同様に、いずれの群もマルトース投与後０.５時間で血糖値が最大となり、その後時間とともに減少したが、血糖値の上昇はＣ５７ＢＬより高く、Ｅ４０Ｍ−０は５４０ｍｇ／ｄＬであった。また、Ｃ５７ＢＬマウスは投与後２時間で投与前の血糖値レベルに低下したが、ＫＫ−Ａｙマウスでは２時間後でも約１.５倍高いレベルであった。このような糖尿病マウスの血糖特性において、Ｅ４０Ｍを投与することにより血糖値上昇の抑制が見られた。Ｅ４０Ｍ−０と有意な低値を示したのはＥ４０Ｍ−３００の１時間だけであったが、０.５時間では７０〜１００ｍｇ／ｄＬ低く、また２時間後には投与前のレベルに近似した。
【００５４】
また、血糖値の変化を評価するために、濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）を測定した。その結果を表４に示した。
【００５５】
【表４】
【００５６】
濃度−時間曲線下面積は、Ｅ４０Ｍ−０と比べて、Ｅ４０Ｍ−５０が１２〜２０％、Ｅ４０Ｍ−３００が１７〜２４％減少した。この結果は、ある一時点だけではなく、実験時間を通じてグルコースの体内暴露量がＥ４０Ｍ投与によって減少したことを示している。また、Ｅ４０Ｍ−５０とＥ４０Ｍ−３００で容量依存性は顕著ではなかったが、単回同時投与で一部有意な抑制および抑制傾向が示されたことは、Ｅ４０Ｍの５０ｍｇ／ｋｇ投与あるいはそれ以下の投与量でも反復投与によって血糖上昇抑制効果が得られることが考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤は糖尿病の予防・治療薬等や、糖尿病予防・治療用飲食品に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】Ｅ４０ＭのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２】Ｅ４０ＭのＦｒ.４のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３】Ｅ４０ＭのＦｒ.４に含まれる物質の１３Ｃ−ＮＭＲ測定の結果である。
【図４】Ｅ４０ＭのＦｒ.４に含まれる物質のＤＥＰＴ測定の結果である。
【図５】Ｅ４０ＭのＦｒ.４に含まれる物質の１Ｈ−ＮＭＲ測定の結果である。
【図６】Ｅ４０ＭのＦｒ.４に含まれる物質のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定の結果である（図中、（Ａ）はＥ４０ＭＦｒ４のＵＶ２８０ｎｍ検出ピーク、（Ｂ）はＥ４０ＭＦｒ４をｍ／ｚ７４３でスキャンして得られたピーク、（Ｃ）はＥ４０ＭＦｒ４のＵＶ２８０ｎｍ検出で得られたピークの分子量を測定したスペクトル、（Ｄ）は（Ｃ）と同じピークを親イオンｍ／ｚ７４３で分解した時に得られる子イオンを測定したスペクトル、をそれぞれ示す）。
【図７】Ｅ４０ＭのＦｒ.４に含まれる物質のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定の結果である（図中、（Ａ）はｍ／ｚ３０００までのＭＳスペクトル、（Ｂ）はｍ／ｚ１４８５を親イオンとした時のＭＳ／ＭＳスペクトル、（Ｃ）はｍ／ｚ２２２７を親イオンとした時のＭＳ／ＭＳスペクトル、をそれぞれ示す）。
【図８】Ｅ４０Ｍを用いた経口糖負荷試験の結果を示す図面である（図中、（Ａ）は正常マウスの結果、（Ｂ）は糖尿病マウスの結果、をそれぞれ示す）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は褐藻類より抽出・精製された物質を有効成分とするα−グルコシダーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
二糖類分解酵素であるα−グルコシダーゼは、小腸に存在し、食物中の二糖類を単糖類へ分解し、小腸からの糖類の吸収を促進するため、体内において重要な役割をする酵素である。
【０００３】
このα−グルコシダーゼの活性を阻害する阻害剤は、二糖類から単糖類への分解を遅らせる作用を有するため、腸管での糖類の消化吸収が遅らすことができる。その結果、食後の血糖上昇が抑えられるので、糖尿病等の治療・予防に大変有用なものである。
【０００４】
これまでα−グルコシダーゼ阻害剤としては、種々の植物や、微生物の培養液等から得られたものが知られている。
【０００５】
本発明者らも、以前、褐藻類であるツルアラメの抽出物の乾燥パウダーに強力なα−グルコシダーゼ阻害活性があることを見出し、遺伝的糖尿病モデルマウスおよびショ糖負荷モデルラットに対してツルアラメ抽出物の経口投与が有意な血糖値上昇抑制効果を示すことを報告している（非特許文献１及び２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】岩井 邦久， 松江 一：褐藻ツルアラメの糖尿病モデルマウスにおける抗酸化および高血糖抑制効果. 第60 回日本栄養・食糧学会大会,2006年5月20日.
【非特許文献２】原高明, 八木勇三, 泉水直人：ショ糖負荷ラットの血糖値推移に対するSeametaherblineの効果, Food Function, 3, 85‐90, 2007.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、これらの報告では、α−グルコシダーゼを阻害する物質が何であるかについては全く検討していなかった。
【０００８】
従って、本発明は、上記ツルアラメの抽出物中のα−グルコシダーゼ阻害活性成分を突き止めることをその課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、上記阻害活性成分がダイエコールであることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、ダイエコールを有効成分とすることを特徴とするα−グルコシダーゼ阻害剤である。
【００１１】
また、本発明は、上記α−グルコシダーゼ阻害剤を含有することを特徴とする飲食品、特に糖尿病予防・治療用飲食品である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤は天然物由来のものであり、安全に摂取できるものである。
【００１３】
従って、本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤は、糖尿病の予防・治療薬等や、糖尿病予防・治療用飲食品に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤（以下、「本発明阻害剤」という）の有効成分であるダイエコール（Dieckol）は以下に示される公知の物質であり、例えば、文献（Hye Sook Kang, Hae Young Chung, Jee Hyung Jung, Byeng Wha Son, and Jae Sue Choi: A new phlorotannin from the brown alga Ecklonia stolonifera. Chem. Pharm. Bull. 51, 1012-1014, 2003. ）に記載の方法により得ることができる。このダイエコールは、ツルアラメ以外にもクロメやカジメ等の褐藻類に見出されており、抗菌活性等が報告されているが、α−グルコシダーゼ阻害活性があることについては報告されていないものである。
【００１５】
なお、本発明においてα−グルコシダーゼ阻害活性とは、マルトース等の二糖類分解酵素の阻害活性をいい、これは一般的な方法で測定できる。また、本発明阻害剤のα−グルコシダーゼ阻害活性は、下記参考例１と同様にして測定した場合に、０.４〜０.８ｍＭ程度である。
【００１６】
＜ダイエコールの性質＞
（分子式）Ｃ３６Ｈ２２Ｏ１８
（分子量）７４２.６
（構造式）
【化１】
（その他の性質）
水に難溶
アルコールに可溶
茶褐色
【００１７】
上記ダイエコールはコンブ目コンブ科の褐藻であるツルアラメ（Ecklonia stolonifera）を原料として次のようにしても得ることができる。
【００１８】
まず、ツルアラメの葉部１００〜５００ｇ程度を包丁等で細断し、これにメタノール、エタノール等の溶媒を０.３〜２Ｌ程度添加した後、ホモジナイザー等で攪拌する。その後、ホモジネートを４〜１０℃程度で遮光した状態で１日間程度放置し、抽出液を得る。次に、この抽出液を遠心し、上清を得る。更にその上清から溶媒を蒸発させた後、５０〜５００ｍＬ程度の水に溶解させて溶解液を得る。この溶解液をＳｅｐ−Ｐａｋ Ｖａｃ Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ製）に通液させ、その後、更に４０％（以下、単に「％」という）メタノール水溶液を通液させて得られる画分を採取する。
【００１９】
上記で採取された画分は、更に、１％ギ酸水溶液とメタノールを４０：６０の質量比で含有する溶液に溶解させる。その後、これについて以下の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行い、保持時間が９.５〜１１分の画分を採取する。この画分にはダイエコールおよびこれらの重合体のみが含まれる。
【００２０】
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ ｄＣ１８（４.６ｍｍＩＤ×１５０ｍｍＬ：Ｗａｔｅｒｓ社）
移動相：１％ギ酸（Ａ液）およびメタノール（Ｂ液）
グラジエント：スタート時のＡ：Ｂ＝４５：５５が１５分間でＡ：Ｂ＝３０：７０となるリニアグラジェント
流速：０.８ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出器：フォトダイオードアレイ検出器
検出波長：２８０ｎｍ
分取間隔：０.５分間
注入量：１０ｍｇ
【００２１】
本発明阻害剤は、上記ダイエコールを有効成分として含有していればよく、ダイエコールそのものあるいは従来の製剤担体と組み合わせて製剤化したものの何れであってもよい。また、製剤の剤形としては、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、タブレット剤、カプセル剤等が挙げられる。これら製剤におけるダイエコールの配合量は、特に制限されないが、例えば、それぞれが１日当たり４０ｍｇ以上、好ましくは２００〜５００ｍｇとなる量である。また、本発明阻害剤の摂取方法は、特に制限されないが、これを摂取することにより、食後の血糖上昇が抑えることができるため、上記配合量を１日１回または複数回、好ましくは３回に分けて食事後に摂取することが好ましい。更に、本発明阻害剤の効果を継続させるには、本発明阻害剤の摂取を２〜４週間程度連続で行うことが好ましい。
【００２２】
なお、本発明阻害剤は、従来のα−グルコシダーゼ阻害と同様に糖尿病の予防・治療薬等にも利用できる。この場合の製剤あたりの配合量や摂取方法は上記と同様である。
【００２３】
また、本発明阻害剤は、従来の飲食品にも添加することができる。この場合には、本発明阻害剤を一般的によく知られている他の食品原料に加えることにより、α−グルコシダーゼ阻害作用を有する飲食品、特に、糖尿病予防・治療用となる飲食品を得ることができる。この飲食品には、α−グルコシダーゼ阻害剤をダイエコールとして、０.１％以上、好ましくは０.５〜２％含有させればよい。
【００２４】
本発明阻害剤を含有させることが好ましい飲食品としては、例えば、パン類、麺類、菓子類、サプリメント等が挙げられる。なお、飲食品には動物の飼料も含まれる。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、この実施例により本発明は何ら制約されるものではない。
【００２６】
参 考 例 １
ツルアラメの各種溶媒抽出物のグルコシダーゼ阻害活性（ＩＣ５０）：
（１）ツルアラメ抽出物の調製
生のツルアラメ（Ecklonia stolonifera）葉部１００ｇを蒸留水で洗浄し、包丁で細かく切った後、蒸留水、エタノールおよびメタノールの３種類の溶媒４００ｍＬをそれぞれ加え、ミキサー（ＳＭ−ＫＭ３９：三洋電機株式会社）でホモジナイズした。３種類のホモジネートを遮光、４℃で一晩撹拌抽出し、それを遠心分離（４℃、１０，０００ｒｐｍ、３０分）によって上清と沈殿に分け、以下の処理により３種類の抽出物を調製した。
【００２７】
蒸留水で抽出した抽出物の上清はろ紙（Ｎｏ.２）でろ過後、ロータリーエバポレーターで濃縮したものを凍結乾燥した（ツルアラメ水抽出物）。また、エタノールで抽出した抽出物の上清をろ過後、濃縮したものを少量の蒸留水に再度溶解し、凍結乾燥した（ＥｔＯＨ抽出物）。更に、メタノールで抽出した抽出物の上清をろ過後に濃縮し、少量の蒸留水に再度溶解し、凍結乾燥した（ＭｅＯＨ抽出物）。これら３種の抽出物について以下の方法を用いてグルコシダーゼ阻害活性を測定した。
【００２８】
（２）グルコシダーゼ阻害活性の測定
ラット小腸粉末（ＳＩＧＭＡ社）０.５ｇに５６ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ６.０）５ｍＬを添加し、ポリトロンにてホモジナイズした。これを３,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清を粗酵素液とし、それを適宜希釈して使用した。各グルコシダーゼ活性測定の基質として、スクロースについてはスクラーゼ、マルトースについてはマルターゼ、デンプンについてはグルコアミラーゼ、パラチノースについてはイソマルターゼを使用した。各基質はいずれも５６ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ６.０）を用いて２０ｍｇ／ｍＬに調製した。
【００２９】
各抽出物は５６ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ６.０）に種々の濃度で溶解させ、その２０μＬを採取したチューブに２０ｍｇ／ｍＬの各基質溶液１００μＬを添加し、混合後３７℃で５分間ブレインキュベートした。この混合液に希釈した各酵素液を２０μＬ添加し、混合後３７℃でインキュベートした。インキュベートから０、１５、３０、６０、９０および１２０分後に反応液１５μＬを試験管に採取し、直ちに１０分間煮沸して酵素を失活させた。冷却後、反応液中のグルコース濃度をグルコースＣII−テストワコー（和光純薬工業社）を使用して測定した。
【００３０】
各反応液中グルコース生成量から各酵素の反応速度を算出した。酵素と基質のみの反応速度を１００％とし、各試料添加時の反応速度からその酵素阻害率を算出した。更に、各試料の濃度と阻害率をプロットし、その近似曲線から各酵素の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出した。その結果を表１に示した。
【００３１】
【表１】
【００３２】
何れの抽出物にもスクラーゼおよびイソマルターゼ阻害活性は認められなかったが、ＥｔＯＨ抽出物およびＭｅＯＨ抽出物には、マルターゼとグルコアミラーゼの強い阻害活性が認められた。一方、ツルアラメ水抽出物には期待できるマルターゼとグルコシダーゼの阻害活性は見られなかった。
【００３３】
以上の結果から、ツルアラメの阻害作用がフルクトースの結合分解には作用しないこと、あるいはツルアラメの阻害作用がα１→４結合の分解しかしないことが予想された。
【００３４】
実 施 例 １
ダイエコールの抽出：
（１）ＥｔＯＨ抽出物の分画
参考例１で調製したＥｔＯＨ抽出物２００ｍｇに蒸留水１０ｍＬを加え、超音波照射しながら溶解させて試料溶液を得た。一方、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｖａｃ Ｃ１８カラム（５ｇ／２０ｃｃ：Ｗａｔｅｒｓ社）にメタノール１２０ｍＬおよび蒸留水１２０ｍＬをこの順番で流し、コンディショニングしておいた。
【００３５】
続いて、２０ｍｇ／ｍＬの試料溶液１０ｍＬをＳｅｐ−Ｐａｋ Ｖａｃ Ｃ１８カラムに負荷し、負荷した液量分を溶出（素通り画分）させた後、蒸留水（０％メタノール）、２０％メタノール水溶液、４０％メタノール水溶液、６０％メタノール水溶液、８０％メタノール水溶液および１００％メタノールをそれぞれ７０ｍＬずつこの順番で通液した。各溶出液を収集し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、流した順に素通り画分、Ｅ０Ｍ（０％メタノール画分）、Ｅ２０Ｍ（２０％メタノール画分）、Ｅ４０Ｍ（４０％メタノール画分）、Ｅ６０Ｍ（６０％メタノール画分）、Ｅ８０Ｍ（８０％メタノール画分）およびＥ１００Ｍ（１００％メタノール画分）とした。素通り画分からＥ６０Ｍまではそれぞれ凍結乾燥させ、分画物を得た。Ｅ８０ＭおよびＥ１００Ｍは濃縮後に真空デシケーター中で乾固し、分画物を得た。各分画物のマルターゼおよびグルコアミラーゼの５０％阻害活性（ＩＣ５０）を参考例１と同様にして測定した。その結果を表２に示した。なお、Ｅ８０Ｍは殆ど回収されなかったため活性の測定などは行わなかった。
【００３６】
【表２】
【００３７】
ＥｔＯＨ抽出物からの収量はＥ４０Ｍが最も多かった。また、マルターゼ阻害活性はＥ４０ＭとＥ６０Ｍに強く認められ、グルコアミラーゼ阻害活性はＥ２０Ｍ、Ｅ４０Ｍ、Ｅ６０Ｍに認められた。なお、Ｅ４０Ｍは分画前に比べて酵素の阻害活性が１.５〜１.９倍上昇した。
【００３８】
以上の結果より、Ｅ４０Ｍにグルコシダーゼ阻害活性成分が含まれていることが示された。また、ＥｔＯＨ抽出物中のグルコシダーゼ阻害成分は４０％〜６０％メタノール水溶液で溶出できることが分かった。
【００３９】
（２）Ｅ４０ＭのＨＰＬＣ分析
（１）で調製した試料溶液は、１％ギ酸水溶液とメタノールを４０：６０の質量比で含有する溶液に溶解させ、１回分を約２ｍｇとして以下の条件でＨＰＬＣ分析を行った。収集した溶出液は、遠心エバポレーターにて減圧乾固し、分取物としてＨＰＬＣピークに合致させた。
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ ｄＣ１８（４.６ｍｍＩＤ×１５０ｍｍＬ：Ｗａｔｅｒｓ社）
移動相：１％ギ酸（Ａ液）およびメタノール（Ｂ液）
グラジエント：スタート時のＡ：Ｂ＝４５：５５が１５分間でＡ：Ｂ＝３０：７０となるリニアグラジェント
流速：０.８ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出器：２９９６フォトダイオードアレイ検出器（Ｗａｔｅｒｓ社）
検出波長：２８０ｎｍ
分取間隔：０.５分間
注入量：２ｍｇ
【００４０】
ＨＰＬＣ分析を行ったところ、クロマトグラムには主要なピークが４本検出され（図１のＦｒ.１〜Ｆｒ.４）、それらをフラクションコレクターで分取した。各フラクションについて酵素（マルターゼの）の５０％阻害活性を実施例１と同様にして測定した。その結果を表３に示した。
【００４１】
【表３】
【００４２】
上記より、Ｆｒ.４の阻害活性が０.５３２ｍｇ／ｍＬと最も強く、これはＥ４０Ｍの阻害活性の３.１倍に相当した。また、分取したＦｒ.４について、上記と同様の条件で再度ＨＰＬＣ分析を行ったところ、Ｆｒ.４には他のピークは混在しておらず、精製が確認された（図２）。このＦｒ.４を試料（Ｅ４０ＭＦｒ４）とし、これについて以下の構造解析を行った。
【００４３】
（３）構造解析
（ａ）Ｅ４０ＭＦｒ４のＮＭＲの測定
Ｅ４０ＭＦｒ４はアセトニトリル−ｄ３に溶解し、これの１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲおよびＤＥＰＴをＪＮＭ ＥＸ−２７０（２７０ＭＨｚ：ＪＥＯＬ社）を使用して測定した。
【００４４】
（ｂ）Ｅ４０ＭＦｒ４のＬＣ／ＭＳ／ＭＳの測定
ＡＰＩＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（アプライドバイオシステムズ社）を使用し、Ｅ４０ＭＦｒ４のＭＳおよびＭＳ／ＭＳを測定した。ＬＣのカラムにはＴＳＫｇｅｌＯＤＳ１００Ｖ（２ｍｍＩＤ×５０ｍｍＬ：東ソー社）、移動相には１％ギ酸（Ａ液）および１％ギ酸含有メタノール（Ｂ液）を使用し、Ａ：Ｂが０〜１８分間で９０：１０から１０：９０に変化するリニアグラジェントで、カラム温度４０℃、流速０.２ｍＬ／ｍｉｎで溶出させた。Ｅ４０ＭＦｒ４を１％ギ酸水溶液とメタノールを４０：６０の質量比で含有する溶液に溶解させ、１０ｍｇ／ｍＬとしたものを前記システムに５μＬ注入し、２８０ｎｍの吸光度検出とともに、ポジティブイオンモードでｍ／ｚ５０〜３０００の範囲でＭ＋Ｈを測定した。さらに、Ｍ＋Ｈの推定質量を親イオンとして解裂させたＭＳ／ＭＳ（娘イオンフラグメント）を測定した。
【００４５】
（ｃ）Ｅ４０ＭＦｒ４構造同定の結果
１３Ｃ−ＮＭＲの測定の結果（図３）からは、Ｅ４０ＭＦｒ４に含まれる物質の炭素数が３６個であることが示された。ＤＥＰＴの測定の結果（図４）からは３６個の炭素はＣＨとＣで構成されており、ＣＨ３およびＣＨ２は存在しないことが示された。１Ｈ−ＮＭＲの測定の結果（図５）からは、５.８〜６.３ｐｐｍにおけるケミカルシフト値が既知フロロタンニン化合物の文献値と一致することが示された。
【００４６】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの測定の結果（図６）からは、ＵＶ２８０ｎｍ検出ピークにおいてＥ４０ＭＦｒ４はほぼ単一のピークであることが分かった（図６（Ａ））。また、そのピークの分子量を測定したところＭ＋Ｈは最もシグナルの大きいｍ／ｚ７４３.０であることが分かった（図６（Ｃ））。さらに、Ｅ４０ＭＦｒ４の分子量を測定したデータからｍ／ｚ７４３.０を有するピークを探す（スキャンする）と、単一のピークがＵＶ２８０ｎｍの検出ピークで観察された位置と殆ど重なって得られた（図６（Ｂ））。これらのことから、Ｅ４０ＭＦｒ４の分子量は７４２.０であることが示された。また、ＭＳ／ＭＳスペクトルからは、ダイエコールの一部構造に一致するフラグメントがｍ／ｚ６１８、４９４、４１２、３８７、３７１、３０１、２８８に観察された（図６の（Ｄ））。
【００４７】
この分子量とＮＭＲの解析から、有力な候補化合物として既知フロロタンニン化合物であるダイエコール（Ｃ３６Ｈ２２Ｏ１８）が推定された。なお、分子量７４２.６のフロロタンニン化合物としては８,８'−バイエコールも存在するが、今回の構造解析結果からは８,８'−バイエコールに該当するデータは得られていない。
【００４８】
なお、ｍ／ｚ３０００までのＭＳスペクトルには、ｍ／ｚ１４８５および２２２７が観察され（図７（Ａ））、ｍ／ｚ１４８５を親イオンとした時のＭＳ／ＭＳスペクトル（図７（Ｂ））には、ダイエコールを示唆するｍ／ｚ７４３のフラグメントが観察され、ｍ／ｚ２２２７を親イオンとしたＭＳ／ＭＳスペクトルでは（図７（Ｃ））、ｍ／ｚ１４８５とｍ／ｚ７４３のフラグメントが観察された。これはダイエコールの二量体や三量体が存在する可能性を示している。
【００４９】
以上の結果より、Ｅ４０ＭＦｒ４に含まれる物質はダイエコールと同定された。
【００５０】
実 施 例 ２
Ｅ４０Ｍの単回投与によるマウス血糖上昇抑制効果：
（１）正常マウスにおけるＥ４０Ｍ投与時の経口糖負荷試験
正常マウスとして雄性Ｃ５７ＢＬマウス（日本クレア社）を購入し、１週間馴化飼育した後に、１８時間の絶食下で以下の試験に使用した。実験時のマウスは１２週齢で体重２０〜２２ｇであった。これらのマウスにヘパリン処理したプラスチック製キャピラリーチューブを用いて眼窩底採血した。引き続き、これらのマウスに実施例１の（１）で得られたＥ４０Ｍ（ダイエコールを１８％含有する）およびマルトースの混合溶液を単回経口投与した。Ｅ４０Ｍの投与量は０（Ｅ４０Ｍ−０）、５０（Ｅ４０Ｍ−５０）および３００（Ｅ４０Ｍ−３００）ｍｇ／ｋｇとし、マルトースの投与量は１.５ｇ／ｋｇとした。また、投与液量は１０ｍＬ／ｋｇとした。混合溶液投与後、０.５、１、２および４時間で、上記と同様に眼窩底採血した。採血後、直ちにキャピラリーチューブをヘマトクリット遠心機で遠心分離し（１２,０００ｒｐｍ×２分）、血漿を採取した。この血漿を適宜０.１５Ｍの塩化ナトリウム溶液で希釈し、血漿中グルコース濃度を富士ドライケム（ＦＤＣ３５００：ＧＬＵ−ＰＩＩＩ：冨士フィルム社）にて測定した。その結果を図８の（Ａ）に示した。
【００５１】
（２）糖尿病マウスにおけるＥ４０Ｍ投与時の経口糖負荷試験
２型糖尿病モデル動物として雄性ＫＫ−Ａｙマウス（日本クレア社）を購入し、１週間の馴化飼育後に１８時間の絶食下で以下の試験に使用した。実験時の週齢は１２週齢で、体重は３８〜４０ｇであった。Ｅ４０Ｍおよびマルトースの投与量ならびに実験手法は上記（１）と同様に行った。測定結果を図８のＢに示した。
【００５２】
（３）結果
Ｅ４０Ｍ−０はマルトース投与後０.５時間で４１０ｍｇ／ｄＬに血糖値が上昇し、その後減少した。Ｅ４０Ｍ−５０およびＥ４０Ｍ−３００も投与後０.５時間で血糖値が上昇しその後時間とともに減少したが、０.５時間での血糖値は約３００ｍｇ／ｄＬとＥ４０Ｍ−０より低く、Ｅ４０Ｍ−３００は０.５時間および１時間での血糖値がＥ４０Ｍ−０より有意に低値となった。
【００５３】
Ｃ５７ＢＬマウスと同様に、いずれの群もマルトース投与後０.５時間で血糖値が最大となり、その後時間とともに減少したが、血糖値の上昇はＣ５７ＢＬより高く、Ｅ４０Ｍ−０は５４０ｍｇ／ｄＬであった。また、Ｃ５７ＢＬマウスは投与後２時間で投与前の血糖値レベルに低下したが、ＫＫ−Ａｙマウスでは２時間後でも約１.５倍高いレベルであった。このような糖尿病マウスの血糖特性において、Ｅ４０Ｍを投与することにより血糖値上昇の抑制が見られた。Ｅ４０Ｍ−０と有意な低値を示したのはＥ４０Ｍ−３００の１時間だけであったが、０.５時間では７０〜１００ｍｇ／ｄＬ低く、また２時間後には投与前のレベルに近似した。
【００５４】
また、血糖値の変化を評価するために、濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）を測定した。その結果を表４に示した。
【００５５】
【表４】
【００５６】
濃度−時間曲線下面積は、Ｅ４０Ｍ−０と比べて、Ｅ４０Ｍ−５０が１２〜２０％、Ｅ４０Ｍ−３００が１７〜２４％減少した。この結果は、ある一時点だけではなく、実験時間を通じてグルコースの体内暴露量がＥ４０Ｍ投与によって減少したことを示している。また、Ｅ４０Ｍ−５０とＥ４０Ｍ−３００で容量依存性は顕著ではなかったが、単回同時投与で一部有意な抑制および抑制傾向が示されたことは、Ｅ４０Ｍの５０ｍｇ／ｋｇ投与あるいはそれ以下の投与量でも反復投与によって血糖上昇抑制効果が得られることが考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤は糖尿病の予防・治療薬等や、糖尿病予防・治療用飲食品に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】Ｅ４０ＭのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２】Ｅ４０ＭのＦｒ.４のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３】Ｅ４０ＭのＦｒ.４に含まれる物質の１３Ｃ−ＮＭＲ測定の結果である。
【図４】Ｅ４０ＭのＦｒ.４に含まれる物質のＤＥＰＴ測定の結果である。
【図５】Ｅ４０ＭのＦｒ.４に含まれる物質の１Ｈ−ＮＭＲ測定の結果である。
【図６】Ｅ４０ＭのＦｒ.４に含まれる物質のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定の結果である（図中、（Ａ）はＥ４０ＭＦｒ４のＵＶ２８０ｎｍ検出ピーク、（Ｂ）はＥ４０ＭＦｒ４をｍ／ｚ７４３でスキャンして得られたピーク、（Ｃ）はＥ４０ＭＦｒ４のＵＶ２８０ｎｍ検出で得られたピークの分子量を測定したスペクトル、（Ｄ）は（Ｃ）と同じピークを親イオンｍ／ｚ７４３で分解した時に得られる子イオンを測定したスペクトル、をそれぞれ示す）。
【図７】Ｅ４０ＭのＦｒ.４に含まれる物質のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定の結果である（図中、（Ａ）はｍ／ｚ３０００までのＭＳスペクトル、（Ｂ）はｍ／ｚ１４８５を親イオンとした時のＭＳ／ＭＳスペクトル、（Ｃ）はｍ／ｚ２２２７を親イオンとした時のＭＳ／ＭＳスペクトル、をそれぞれ示す）。
【図８】Ｅ４０Ｍを用いた経口糖負荷試験の結果を示す図面である（図中、（Ａ）は正常マウスの結果、（Ｂ）は糖尿病マウスの結果、をそれぞれ示す）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイエコールを有効成分とすることを特徴とするα−グルコシダーゼ阻害剤。
【請求項２】
請求項１記載のα−グルコシダーゼ阻害剤を含有することを特徴とする飲食品。
【請求項３】
請求項１記載のα−グルコシダーゼ阻害剤を含有することを特徴とする糖尿病予防・治療用飲食品。
【請求項１】
ダイエコールを有効成分とすることを特徴とするα−グルコシダーゼ阻害剤。
【請求項２】
請求項１記載のα−グルコシダーゼ阻害剤を含有することを特徴とする飲食品。
【請求項３】
請求項１記載のα−グルコシダーゼ阻害剤を含有することを特徴とする糖尿病予防・治療用飲食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１０−１８０１３３（Ｐ２０１０−１８０１３３Ａ）
【公開日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２２１９６（Ｐ２００９−２２１９６）
【出願日】平成２１年２月３日（２００９．２．３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年１１月１７日 第１３回日本フードファクター学会学術集会ＪＳＯＦＦ２００８講演事務局発行の「第１３回日本フードファクター学会学術集会 ＪＳＯＦＦ２００８ 講演要旨集」に発表
【出願人】（５０８１０５１８６）公立大学法人青森県立保健大学 (8)
【出願人】（５０６３４８３５２）株式会社ユニアル (2)
【出願人】（５０９０３４２０３）ＮＰＯ法人青森県新エネルギー創生研究会 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月３日（２００９．２．３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年１１月１７日 第１３回日本フードファクター学会学術集会ＪＳＯＦＦ２００８講演事務局発行の「第１３回日本フードファクター学会学術集会 ＪＳＯＦＦ２００８ 講演要旨集」に発表
【出願人】（５０８１０５１８６）公立大学法人青森県立保健大学 (8)
【出願人】（５０６３４８３５２）株式会社ユニアル (2)
【出願人】（５０９０３４２０３）ＮＰＯ法人青森県新エネルギー創生研究会 (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]