がんの診断および治療のためのＶＨＺ
がんの診断および治療のためのＶＨＺ
個体において、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんを治療、予防または軽減する方法で用いるためのＶＨＺを本発明者らは提供する。そのようながんの治療、予防または軽減のための抗ＶＨＺ剤を本発明者らは提供する。抗ＶＨＺ剤は、配列番号４または配列番号５、あるいはその両方を含んでもよい。
個体において、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんを治療、予防または軽減する方法で用いるためのＶＨＺを本発明者らは提供する。そのようながんの治療、予防または軽減のための抗ＶＨＺ剤を本発明者らは提供する。抗ＶＨＺ剤は、配列番号４または配列番号５、あるいはその両方を含んでもよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、細胞生物学、分子生物学および遺伝学の分野に関する。本発明は、医学の分野に関する。
【０００２】
特に、本発明は、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんなどの疾患の治療および診断、ならびにこのような使用のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＶＨＺは、ヒトＰＲＬ−ＰＴＰと約２８％のアミノ酸配列同一性を共有するホスファターゼである。ＶＨＺは、多くの組織で発現し、サイトゾルおよび核小体に局在することがこれまでに報告されている（Ａｌｏｎｓｏ ｅｔ ａｌ．，２００４ａ）。
【０００４】
しかし、ＶＨＺは進化を通じてカエル、魚類、ハエ、および古細菌のオルソログとともに保存されているにもかかわらず、ＶＨＺの役割は大部分が不明であった。ＶＨＺは、ＶＨＲと同様に、ＶＨ１様のＰＴＰの別個のサブグループに属する（Ａｌｏｎｓｏ ｅｔ ａｌ，２００４ｂ）。ＶＨＲは、細胞周期の進行の制御に役割を有することが報告されている（Ｒａｈｍｏｕｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００６）。
【０００５】
がんは、世界中で重大な健康問題である。２００７年には世界で７６０万人ががんで死亡したと推定される。例えば英国では、がんは年に１２６，０００人が死亡する原因である。４人のうち１人ががんで死亡する。がんに対する公知の治療としては、外科手術、化学療法および放射線療法が挙げられる。多くのがんは十分早期に発見されれば治癒することができる。
【０００６】
改良されたがんの検出および療法に対する必要性がある。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の第１の態様に従って、本発明者らは、個体において、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんを治療、予防または軽減する方法で用いるためのＶＨＺを提供する。
【０００８】
本発明の第２の態様によれば、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんの治療、予防または軽減のための抗ＶＨＺ剤が提供され、好ましくは、抗ＶＨＺ剤は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７８２３またはＮＰ＿０６０２９３として示されるＶＨＺ配列、またはその配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列の発現、量または活性の任意の組合せをダウンレギュレーションすることができ、抗ＶＨＺ剤は、好ましくは、ヒトＶＨＺのアミノ酸残基（１２６〜１４０）に相当するＲＲＬＲＰＧＳＩＥＴＹＥＱＥＫに対して産生された抗ペプチド抗体などの抗ＶＨＺ抗体、例えば、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＬＳ−Ｃ３２２８１、アミノ酸３５〜９０、ＬＳ−Ｃ４２４５８、ＬＳ−Ａ６８０６およびＬＳ−Ａ６８０３、ＬＳ−Ｃ３２２８１、ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｉｎｃ、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＤＳ−ＰＢ−００６７６、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、Ｇｅｏｒｇｉａ、ＵＳＡ）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＸＷ−７８５７、ＰｒｏＳｃｉ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｐｏｗａｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号Ｆ４５６０およびＤ９８４０−６６Ａ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号Ｄ９８４０−６６、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＡＨＰ１１４２、ＡｄＢ Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１１０−４０４５２、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡ）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１００−７５３２８、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡ）などを含むか、または、ＲＮＡ干渉、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、若しくは、ＤＵＳＰ２３プレデザインキメラＲＮＡｉ（カタログ番号Ｈ０００５４９３５−Ｒ０１、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡ）などのキメラＲＮＡｉを含むものなどによりＶＨＺをダウンレギュレーションすることができる。
【０００９】
本発明の第３の態様によれば、本発明者らは、個体において、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんまたはそのようながんに対する個体の感受性を検出するためのキットであって、個体または個体から採取した試料においてＶＨＺ発現を検出するための手段と、任意選択により使用説明書とを含み、好ましくはがんの治療、予防または軽減のための治療薬をさらに含むキットであって、好ましくは、前記検出するための手段は、ＶＨＺポリヌクレオチドまたはそのフラグメント；ＶＨＺ核酸に対して相補的なヌクレオチド配列またはそのフラグメント；ＶＨＺポリペプチドまたはそのフラグメント、あるいは請求項２に記載される抗ＶＨＺ抗体または抗ＶＨＺ剤からなる群から選択される、キットを提供する。
【００１０】
本発明の第４の態様として、（ａ）結腸がん細胞、肺がん細胞、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌細胞、膵臓がん細胞、脳がん細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、膀胱がん細胞、腎がん細胞、皮膚がん細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞および精巣がん細胞からなる群から選択されるがん細胞を検出する方法であって、該細胞においてＶＨＺの発現、量または活性の変化（好ましくはアップレギュレーション）を検出することを含み、好ましくはＶＨＺの発現を、非がん性であることがわかっている対照細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性と比較する、方法、（ｂ）上記（ａ）による方法であって、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７８２３またはＮＰ＿０６０２９３として示される配列またはそのような配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有する核酸の少なくとも一部を含むプローブなどの手段によりＶＨＺ核酸を検出することを含むか、または、例えば、請求項２に示される抗ＶＨＺ抗体などの手段によりＶＨＺポリペプチドを検出することを含み、好ましくは例えばＥｌｓｔｏｎ−Ｅｌｌｉｓ修正Ｓｃａｒｆｆ、Ｂｌｏｏｍ、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎの類別方式（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ Ｇｒａｄｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＮＧＳ））を使用することなどによる組織学的類別を含む、方法、（ｃ）結腸がん細胞、肺がん細胞、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌細胞、膵臓がん細胞、脳がん細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、膀胱がん細胞、腎がん細胞、皮膚がん細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞および精巣がん細胞からなる群から選択されるがん細胞の増殖状態を決定するか、または該がん細胞が浸潤性または侵襲性となることになる可能性を決定する方法であって、該細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性の変化を検出することを含む、方法、（ｄ）結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんを有する個体の生存率を推定する方法であって、個体の細胞においてＶＨＺの発現の変化を検出することを含む、方法、（ｅ）結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんを有する個体のための療法を選択する方法であって、個体の細胞においてＶＨＺの発現の変化を検出することと、該がんの侵襲性に基づいて、適切な療法、例えば抗ＶＨＺ剤などを選択することを含む、方法、（ｆ）結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんを有する個体において特定の療法の成功の可能性を決定する方法であって、該療法と上記の（ｅ）による方法により決定される療法を比較することを含む、方法、並びに、（ｇ）本発明の第１、第２または第３の態様のいずれか一つに示される特徴をさらに含む、上記（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載の方法、からなる群から選択される方法が提供される。
【００１１】
本発明の第５の態様によれば、本発明者らは、結腸がん細胞、肺がん細胞、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌細胞、膵臓がん細胞、脳がん細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、膀胱がん細胞、腎がん細胞、皮膚がん細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞および精巣がん細胞を操作する方法であって、（ａ）好ましくは、操作の結果としてがん細胞が非がん性となるか、あるいは浸潤性または転移性がん細胞が非浸潤性または非転移性となるように、例えば、ＶＨＺに特異的に結合することができるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはキメラＲＮＡｉに細胞を曝露することによるか、または細胞を請求項２に示される抗ＶＨＺ抗体に曝露することにより、細胞においてＶＨＺの発現、量または活性を調節する（好ましくはダウンレギュレーションする）ことを含むか、または（ｂ）（ａ）細胞において増加したＶＨＺ発現、量または活性を検出するステップと、（ｂ）細胞中のＶＨＺのレベルを低下させるステップとを含む、方法を提供する。
【００１２】
本発明は、第６の態様によれば、（ａ）ＶＨＺポリペプチドに結合することができる分子を同定する方法であって、ＶＨＺポリペプチドまたはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を候補分子と接触させること、および該候補分子が該ＶＨＺポリペプチドまたはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に結合するかどうかを決定することを含む、方法、（ｂ）ＶＨＺのモジュレーターを同定する方法であって、細胞を候補分子と接触させること、および該細胞中のＶＨＺまたは該細胞のＶＨＺの発現、量または活性の増加または低下を検出することを含む、方法、（ｃ）結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんの治療、予防または軽減に適した分子を同定する方法であって、候補分子が、ＶＨＺまたはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを、好ましくは、候補分子がそのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定するために、候補分子をＶＨＺポリペプチドまたはＶＨＺポリペプチドを発現する細胞に曝露して決定することを含む、方法、並びに（ｄ）ＶＨＺまたはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法であって、候補分子を動物に投与することおよび該動物がＶＨＺの発現、量または活性の増加または低下を提示するかどうかを決定することを含む、方法からなる群から選択される方法を提供する。
【００１３】
本発明の第７の態様では、上記に示される方法または使用により同定されるＶＨＺポリペプチドの分子、アゴニストまたはアンタゴニストが提供される。
【００１４】
本発明の第８の態様によれば、本発明者らは、がんの治療、予防または軽減に用いるためのＶＨＺの発現を調節する（例えばダウンレギュレーションする）ことのできる分子、例えば、ヒトＶＨＺのアミノ酸残基（１２６〜１４０）に相当するＲＲＬＲＰＧＳＩＥＴＹＥＱＥＫに対して産生された抗ペプチド抗体などを提供する。
【００１５】
本発明者らは、本発明の第９の態様によれば、ＶＨＺポリペプチドに結合することのできる抗体を提供し、該抗体は、抗体２０９、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントにより結合されるエピトープに結合することができ、好ましくは、（ａ）抗体２０９により結合されるＶＨＺポリペプチド上のエピトープに結合することができる、（ｂ）ＶＨＺの残基Ｃ９５を含む配列、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントであるエピトープに結合することができる抗ＶＨＺ抗体を含む、（ｃ）ＶＨＺに結合することができるモノクローナル抗体２０９、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントの可変領域を含む、（ｄ）細胞内ＶＨＺポリペプチドに結合することができる、（ｅ）細胞の形質膜を通過することができる、（ｆ）ＶＨＺに結合し、かつＶＨＺの生物活性を阻害することができ、（ｇ）がん、例えば、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんなどの転移を防ぐことができる、あるいは（ｈ）モノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体を含む。
【００１６】
本発明の第１０の態様によれば、ＶＨＺに結合することができる、配列番号４および配列番号５からなる群から選択される配列、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントを含むポリペプチドが提供される。
【００１７】
本発明の第１１の態様として、本発明者らは、ＶＨＺ結合活性を有するポリペプチドをコードすることができる、上記に示される分子をコードすることができる配列またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントを含む核酸を提供する。
【００１８】
本発明者らは、本発明の第１２の態様によれば、上記に示される核酸配列を含むか、またはその核酸配列で形質転換された細胞、あるいはそのような細胞の子孫を提供する。
【００１９】
本発明の第１３の態様によれば、本発明者らは、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんの腫瘍が、個体において、浸潤性もしくは転移性腫瘍であるか、またはその可能性が高いかどうかを決定する方法を提供し、該方法は、個体の腫瘍細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性の変化を検出することを含む。
【００２０】
本発明の第１４の態様によれば、（ａ）個体において、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんの治療、予防または軽減の方法であって、個体の細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性を調節することを含み、好ましくは個体のがん細胞においてＶＨＺの発現、量または活性が低下している、方法、及び（ｂ）結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんまたは個体におけるそのようながんに対する感受性またはそのようながんを有する個体の予後の診断方法であって、個体の細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性の変化を検出することを含む、方法、からなる群から選択されるがんの治療、予防または軽減あるいは診断の方法が提供される。
【００２１】
本発明者らは、本発明の第１５の態様によれば、個体において、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんの治療、予防または軽減の方法を提供し、該方法は、個体の細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性の変化を検出すること、および腫瘍の侵襲性に基づいて適切な療法、例えば抗ＶＨＺ剤などを個体に投与することを含む。
【００２２】
診断、予後または療法の選択は、腫瘍のサイズ、またはリンパ節ステージ、あるいはその両方を、所望によりその他の危険因子とともにまたは組み合わせて評価することによりさらに決定されてもよく、好ましくは診断、予後または療法の選択は、腫瘍のエストロゲン受容体（ＥＲ）の状態を評価することによりさらに決定される。
【００２３】
本発明の実行は、特に断りのない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来技法を用いることになり、それらは当業者の能力の範囲内である。このような技法は文献で説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ １−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９５および定期的な補遺；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｃｈ．９，１３，ａｎｄ １６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ，ａｎｄ Ａ．Ｋａｈｎ，１９９６，ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ，１９９０，Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（Ｅｄｉｔｏｒ），１９８４，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉｒｌ Ｐｒｅｓｓ；Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ ａｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ＮＯ．Ｉ ｂｙ Ｅｄｗａｒｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ（１９９９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ ０−８７９６９−５４４−７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｂｙ Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（Ｅｄｉｔｏｒ）（１９８８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３１４−２），１８５５．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ Ｓｅｅｔｈａｌａ，Ｐｒａｂｈａｖａｔｈｉ Ｂ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ（２００１，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＩＳＢＮ ０−８２４７−０５６２−９）；およびＬａｂ Ｒｅｆ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｒｅｃｉｐｅｓ，Ｒｅａｇｅｎｔｓ，ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ａｔ ｔｈｅ Ｂｅｎｃｈ，Ｅｄｉｔｅｄ Ｊａｎｅ Ｒｏｓｋａｍｓ ａｎｄ Ｌｉｎｄａ Ｒｏｄｇｅｒｓ，２００２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＩＳＢＮ ０−８７９６９−６３０−３を参照されたい。これらの一般的な原文は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】外因性ＶＨＺが、中心体および細胞質全体に局在することを示す図である。間接免疫蛍光により中心体の外因性ＶＨＺが示された。
【図１Ａ】ＶＨＺ−ＥＧＦＰ（緑色）は、ＮＲＫ細胞にトランスフェクトされ、細胞内の位置の範囲を示す（ａ）。ＶＨＺの優勢な局在は中心体であり、中心体でＶＨＺは赤色で示される中心体マーカー−ペリセントリンと同時に局在する（ｂ）。Ｔｏ−ｐｒｏ−３ヨージドを用いて核を青色に可視化する（ｂ）。合成した画像は、ペリセントリンと同時に局在するＶＨＺ−ＥＧＦＰ（緑色）を示した（ｃ）。バーは２０μｍ。
【図１Ｂ】ＶＨＺ−ＥＧＦＰはＮＲＫ細胞にトランスフェクトされ、様々な細胞周期ステージ、すなわち、間期（ａ）、前期（ｂ）、中期（ｃ）、および終期の細胞で可視化される（ｄ）。ペリセントリンは赤色で示され（ａ’−ｄ’）、核は青色のＴｏ−ｐｒｏ−３ヨージドで示される（ａ’−ｄ’）。示されるように画像は合成されている（ａ”−ｄ”）。バーは１０μｍ。
【図２】内因性ＶＨＺが中心体および細胞質に局在することを示す図である。
【図２Ａ】内因性ＶＨＺを、ＮＲＫ（ａ〜ｃ、バーは１０μｍ）細胞およびＭＣＦ−１０Ａ（ｄ〜ｆ、バーは２０μｍ）細胞において、アフィニティー精製したウサギ抗ＶＨＺおよびマウス抗γチューブリン抗体、それに続いて抗ウサギ−ＦＩＴＣ（緑色）を結合させた抗ウサギＩｇＧおよび抗マウス−テキサスレッドを結合させた抗マウスＩｇＧを用いる二重染色により可視化する。内因性ＶＨＺは、Ａ４３１細胞（ｇ〜ｉ、バーは２０μｍ）においても、マウスモノクローナル抗体抗ＶＨＺ（クローン＃２５）およびウサギ抗ペリセントリン抗体、それに続いて抗マウス−ＦＩＴＣ（緑色）を結合させた抗マウスＩｇＧおよび抗ウサギ−テキサスレッドを結合させた抗ウサギＩｇＧを用いる二重染色により検出される。
【図２Ｂ】内因性ＶＨＺを、血清飢餓ＮＲＫ（ａ〜ｃ、バーは２０μｍ）において、ウサギ抗ＶＨＺおよびマウス抗γチューブリン抗体、それに続いて抗ウサギ−ＦＩＴＣ（緑色）を結合させた抗ウサギＩｇＧおよび抗マウス−テキサスレッドを結合させた抗マウスＩｇＧを用いる二重染色により可視化する。
【図３】ＶＨＺがタンパク質チロシンホスファターゼ活性を有し、細胞周期制御に関与していることを示す図である。
【図３Ａ】本発明者らは、それぞれのタンパク質（０．６７５ピコモル）をそのＰＴＰアーゼ活性について試験する。ＶＨＺのＰＴＰアーゼ活性は、１０μＭオルトバナジン酸ナトリウムを反応に添加することによるか（ＶＨＺ−ＧＳＴ＋バナジン酸塩）、またはＣｙｓ９５のＳｅｒへの点突然変異により［ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＧＳＴ］］完全に消失する。
【図３Ｂ】ａ．３種類の全細胞可溶化液は、ＶＨＺ−ＥＧＦＰ、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰ、またはＥＧＦＰベクターを発現するＭＣＦ−７細胞から得たものである。タンパク質発現レベルは抗ＥＧＦＰ抗体を用いるウエスタンブロットにより分析する。ＧＡＰＤＨをタンパク質負荷対照として使用する。ｂ．ＤＮＡ含量は、ＢｒｄＵ取り込みおよびＦＡＣＳ分析により測定する。新たに合成されたＤＮＡへのＡＰＣ−ＢｒｄＵ取り込み（Ｒ１は赤色の蛍光の量に相当する）。
【図３Ｃ】同じ３種類の発現構築物を安定して発現したＮＲＫ細胞は、ＶＨＺがＧ１を減少させるがＳ集団を増加させることができたことを示した。得られるヒストグラムは、３つの集団（％表示）：Ｍ１：Ｇ１期、Ｍ２：Ｓ期およびＭ３：Ｇ２／Ｍ期からなる。このグラフは、その個別の細胞のＤＮＡ含量をＦＡＣＳ分析により決定する場合に、増殖する細胞集団について得られる典型的な結果を示した。
【図４】ＭＣＦ−７細胞においてＶＨＺがＧ１／Ｓ移行を増強することを示す図である。
【図４Ａ】ＥＧＦＰベクター、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰまたはＶＨＺ−ＥＧＦＰを発現しているＭＣＦ−７細胞を、Ｇ１／Ｓ細胞周期制御に関与するいくつかの分子について分析する。それらは、ｐ２１ Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１、Ｃｄｋ４、ならびに、Ｓｅｒ７８０、Ｓｅｒ７９５およびＳｅｒ８０７／８１１でリン酸化されたＲｂである。
【図４Ｂ】ＶＨＺがＧ１／Ｓ期移行においてこれらの分子とどのように連係するかを説明するための提案モデルを示す。
【図５】いくつかの乳がん試料において過剰発現したＶＨＺタンパク質が上皮腫瘍細胞の中心体または細胞質に分布していることを示す図である。ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した乳がん試料を、ＶＨＺタンパク質発現について評価する。
【図５Ａ】同じ組織切片への間接的な二重免疫蛍光標識により、ＶＨＺは乳がんの細胞の中心体に局在するように見える。白色の矢印で示されるように、ＶＨＺ（ａ）とγ−チューブリン（ｂ）は、中心体（ｃ）に同時局在する。画像ｃは、ａとｂの合成画像を示す。バー：１００μｍ。
【図５Ｂ】乳がん試料の２つの連続した切片を、それぞれＶＨＺおよびγチューブリンを検出するための免疫組織化学標識用に処理する。陽性シグナルは、３，３’−ジアミノベンジジン色素原（茶色）で染色することにより検出される。ＶＨＺ（ａ）およびγチューブリン局在（ｂ）の類似する中心体標識パターンを黒色の矢印で示す。全体像（ａ’、ｂ’）は、２つの隣接する切片から得たものである。パネルａ’〜ｃ’中の枠で囲まれた３つの長方形の領域（拡大率６３０倍）をさらに拡大し（５倍）およびそれぞれパネルａ〜ｃに示し、中心体を黒色の矢印で示す。パネルｃ’およびｃは、ＶＨＺ陰性試料を対照として示す。元の全体像は（図８Ａ）に示される。
【図５Ｃ】いくつかの乳がん試料において、ＶＨＺタンパク質は、分散した上皮の細胞質全体に過剰発現する。元の全体像は（図８Ｂ）に示される。異なる乳房試料から選択した切片を全体像に示す（ａ’およびｂ’）。全体像中の枠で囲まれた３つの長方形の領域（ａ’、ｂ’およびｃ’、拡大率４００倍）をさらに拡大し（５倍）、それぞれパネルａ、ｂおよびｃに示す。パネルｃおよびｃ’は、ＶＨＺ陰性試料を対照として示す。
【図６】Ｅ−カドヘリン陰性細胞中のＶＨＺ発現およびＶＨＺの過剰発現が、ＭＣＦ−７細胞の運動性を増強することを示す図である。
【図６Ａ】ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した２つの隣接する乳がん試料組織切片は、ＶＨＺ陽性細胞がＥ−カドヘリン陰性であり（ａ、拡大率４００倍）、ＶＨＺ陰性上皮がＥ−カドヘリン陽性である（ｂ、拡大率４００倍）ことを示した。
【図６Ｂ】ＭＣＦ−７−ＶＨＺ−ＥＧＦＰとＭＣＦ−７−ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰ細胞運動を評価するため、細胞を、カバーガラス上のコンフルエント単層に蒔く。次に、細胞で覆ったカバーガラスを、新鮮な培養皿の上に細胞側を下にして反転させる。ＭＣＦ−７−ＶＨＺ−ＥＧＦＰ細胞（ａ、ａ’）およびＭＣＦ−７−ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰ（ｂ、ｂ’）の画像を０時および４８時に撮影する。パネルａ’は、ＭＣＦ−７−ＶＨＺ−ＥＧＦＰ細胞が表面を覆うカバーガラスの下から出て行く（矢印で示す）ことを示した。免疫蛍光画像（ａ、ｂ）。位相差画像（ａ’、ｂ’、拡大率２００倍）。
【図７】ＶＨＺ ｍＲＮＡが組織および細胞で広範に発現していることを示す図である。 ヒトマルチプル組織アレイ（カタログ番号７７７６−１）は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）より入手する。アレイには、６５種類の異なるヒト組織および８種類のヒト細胞株に由来する７３のｍＲＮＡが収容されている。
【図７Ａ】ドットブロットを、製造業者の取扱説明書（カタログ番号１５８５５８４、Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って３２Ｐ−ｄＣＴＰで放射標識されたヒトＶＨＺ ｃＤＮＡを用いてプローブする。ＶＨＺ ｍＲＮＡ発現パターンが示される。ＶＨＺは主に心臓（スポット：４Ａ、４Ｃ−４Ｈ）および多くのその他の組織、ならびに肺癌細胞株−Ａ５４９（スポット−１０Ｈ）で発現する。
【図７Ｂ】ヒトマルチプル組織アレイの完全なマップである。
【図８】免疫組織化学によりＶＨＺタンパク質が乳がんの中心体および細胞質において過剰発現することを示す図である。
【図８Ａ】ＶＨＺタンパク質の過剰発現は、乳がんの中心体で明らかである。中心体は黒色矢印で示される（拡大率４００倍）。
【図８Ｂ】ＶＨＺタンパク質の過剰発現は、乳がん細胞の細胞質で見出される（拡大率２００倍）。
【図９】ウサギおよびマウス抗ＶＨＺ抗体の特徴づけを示す図である。
【図９Ａ】ウサギおよびマウス抗ＶＨＺ抗体を用いるウエスタンブロット分析。全細胞可溶化液は、Ａ４３１、ＨａＬａ、ＮＲＫ、およびＭＣＦ−７細胞から得たものである。ＭＣＦ−７全細胞可溶化液を、２μｇのＶＨＺ−ＧＳＴ（レーン１）とともにプレインキュベートする。ＶＨＺバンドの検出は、ＶＨＺ−ＧＳＴにより特異的に阻止される（矢印で示す）。
【図９Ｂ】ＶＨＺ ｍＡｂは、ＥＣＬ（Ａ）、ＩＦ（Ｂ）およびＩＨＣ（図５）に使用することができる。
【図１０】創傷治癒アッセイにより、ＶＨＺを発現するＭＣＦ１０Ａ細胞が、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）を発現するＭＣＦ１０Ａ細胞よりも強化された遊走特性を示したことを示す図である。本発明者らは、ｐＢＡＢＥｐｕｒｏベクターを用いるレトロウイルス媒介性の形質導入によりＶＨＺおよびＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）をＭＣＦ１０Ａ細胞（５×１０５）に発現させた。創傷治癒アッセイにより、ＶＨＺを発現するＭＣＦ１０Ａ細胞は、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）を発現するＭＣＦ１０Ａ細胞よりも強化された遊走特性を示した。細胞遊走の開始時（０時間、上のパネル）と終了時（８時間、下のパネル）の明白な違いを観察することができる。
【図１１】創傷治癒アッセイにより、ＶＨＺを発現するＭＣＦ１０Ａ細胞が、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）を発現するＭＣＦ１０Ａ細胞と比較して強化された遊走特性を示すことが見られる。本発明者らは、ｐＢＡＢＥｐｕｒｏベクターを用いるレトロウイルス媒介性の形質導入によりＶＨＺおよびＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）をＭＣＦ１０Ａ細胞（５×１０５）に発現させた。創傷治癒アッセイにより、ＶＨＺを発現するＭＣＦ１０Ａ細胞は、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）を発現するＭＣＦ１０Ａ細胞と比較して強化された遊走特性を示した。細胞遊走の開始時（０時間、上のパネル）と終了時（８時間、下のパネル）の明白な違いを観察することができる。
【図１２】ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した複数のヒトがん試料におけるＶＨＺタンパク質発現の評価を示す図である。ＤＡＢ色素原（褐色）を用いるＤａｋｏ ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）Ｓｙｓｔｅｍを用いてＶＨＺ特異的マウスモノクローナル抗体で染色することにより、ＶＨＺタンパク質を明らかにする。
【図１３Ａ】ＶＨＺ＃２０９キメラ抗体の構築ステップを概説する図である。
【図１３Ｂ】ＶＨＺ＃２０９キメラ抗体の可変重鎖の配列を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、細胞生物学、分子生物学および遺伝学の分野に関する。本発明は、医学の分野に関する。
【０００２】
特に、本発明は、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんなどの疾患の治療および診断、ならびにこのような使用のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＶＨＺは、ヒトＰＲＬ−ＰＴＰと約２８％のアミノ酸配列同一性を共有するホスファターゼである。ＶＨＺは、多くの組織で発現し、サイトゾルおよび核小体に局在することがこれまでに報告されている（Ａｌｏｎｓｏ ｅｔ ａｌ．，２００４ａ）。
【０００４】
しかし、ＶＨＺは進化を通じてカエル、魚類、ハエ、および古細菌のオルソログとともに保存されているにもかかわらず、ＶＨＺの役割は大部分が不明であった。ＶＨＺは、ＶＨＲと同様に、ＶＨ１様のＰＴＰの別個のサブグループに属する（Ａｌｏｎｓｏ ｅｔ ａｌ，２００４ｂ）。ＶＨＲは、細胞周期の進行の制御に役割を有することが報告されている（Ｒａｈｍｏｕｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００６）。
【０００５】
がんは、世界中で重大な健康問題である。２００７年には世界で７６０万人ががんで死亡したと推定される。例えば英国では、がんは年に１２６，０００人が死亡する原因である。４人のうち１人ががんで死亡する。がんに対する公知の治療としては、外科手術、化学療法および放射線療法が挙げられる。多くのがんは十分早期に発見されれば治癒することができる。
【０００６】
改良されたがんの検出および療法に対する必要性がある。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の第１の態様に従って、本発明者らは、個体において、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんを治療、予防または軽減する方法で用いるためのＶＨＺを提供する。
【０００８】
本発明の第２の態様によれば、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんの治療、予防または軽減のための抗ＶＨＺ剤が提供され、好ましくは、抗ＶＨＺ剤は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７８２３またはＮＰ＿０６０２９３として示されるＶＨＺ配列、またはその配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列の発現、量または活性の任意の組合せをダウンレギュレーションすることができ、抗ＶＨＺ剤は、好ましくは、ヒトＶＨＺのアミノ酸残基（１２６〜１４０）に相当するＲＲＬＲＰＧＳＩＥＴＹＥＱＥＫに対して産生された抗ペプチド抗体などの抗ＶＨＺ抗体、例えば、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＬＳ−Ｃ３２２８１、アミノ酸３５〜９０、ＬＳ−Ｃ４２４５８、ＬＳ−Ａ６８０６およびＬＳ−Ａ６８０３、ＬＳ−Ｃ３２２８１、ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｉｎｃ、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＤＳ−ＰＢ−００６７６、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、Ｇｅｏｒｇｉａ、ＵＳＡ）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＸＷ−７８５７、ＰｒｏＳｃｉ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｐｏｗａｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号Ｆ４５６０およびＤ９８４０−６６Ａ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号Ｄ９８４０−６６、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＡＨＰ１１４２、ＡｄＢ Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１１０−４０４５２、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡ）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１００−７５３２８、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡ）などを含むか、または、ＲＮＡ干渉、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、若しくは、ＤＵＳＰ２３プレデザインキメラＲＮＡｉ（カタログ番号Ｈ０００５４９３５−Ｒ０１、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡ）などのキメラＲＮＡｉを含むものなどによりＶＨＺをダウンレギュレーションすることができる。
【０００９】
本発明の第３の態様によれば、本発明者らは、個体において、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんまたはそのようながんに対する個体の感受性を検出するためのキットであって、個体または個体から採取した試料においてＶＨＺ発現を検出するための手段と、任意選択により使用説明書とを含み、好ましくはがんの治療、予防または軽減のための治療薬をさらに含むキットであって、好ましくは、前記検出するための手段は、ＶＨＺポリヌクレオチドまたはそのフラグメント；ＶＨＺ核酸に対して相補的なヌクレオチド配列またはそのフラグメント；ＶＨＺポリペプチドまたはそのフラグメント、あるいは請求項２に記載される抗ＶＨＺ抗体または抗ＶＨＺ剤からなる群から選択される、キットを提供する。
【００１０】
本発明の第４の態様として、（ａ）結腸がん細胞、肺がん細胞、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌細胞、膵臓がん細胞、脳がん細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、膀胱がん細胞、腎がん細胞、皮膚がん細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞および精巣がん細胞からなる群から選択されるがん細胞を検出する方法であって、該細胞においてＶＨＺの発現、量または活性の変化（好ましくはアップレギュレーション）を検出することを含み、好ましくはＶＨＺの発現を、非がん性であることがわかっている対照細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性と比較する、方法、（ｂ）上記（ａ）による方法であって、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７８２３またはＮＰ＿０６０２９３として示される配列またはそのような配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有する核酸の少なくとも一部を含むプローブなどの手段によりＶＨＺ核酸を検出することを含むか、または、例えば、請求項２に示される抗ＶＨＺ抗体などの手段によりＶＨＺポリペプチドを検出することを含み、好ましくは例えばＥｌｓｔｏｎ−Ｅｌｌｉｓ修正Ｓｃａｒｆｆ、Ｂｌｏｏｍ、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎの類別方式（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ Ｇｒａｄｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＮＧＳ））を使用することなどによる組織学的類別を含む、方法、（ｃ）結腸がん細胞、肺がん細胞、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌細胞、膵臓がん細胞、脳がん細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、膀胱がん細胞、腎がん細胞、皮膚がん細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞および精巣がん細胞からなる群から選択されるがん細胞の増殖状態を決定するか、または該がん細胞が浸潤性または侵襲性となることになる可能性を決定する方法であって、該細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性の変化を検出することを含む、方法、（ｄ）結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんを有する個体の生存率を推定する方法であって、個体の細胞においてＶＨＺの発現の変化を検出することを含む、方法、（ｅ）結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんを有する個体のための療法を選択する方法であって、個体の細胞においてＶＨＺの発現の変化を検出することと、該がんの侵襲性に基づいて、適切な療法、例えば抗ＶＨＺ剤などを選択することを含む、方法、（ｆ）結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんを有する個体において特定の療法の成功の可能性を決定する方法であって、該療法と上記の（ｅ）による方法により決定される療法を比較することを含む、方法、並びに、（ｇ）本発明の第１、第２または第３の態様のいずれか一つに示される特徴をさらに含む、上記（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載の方法、からなる群から選択される方法が提供される。
【００１１】
本発明の第５の態様によれば、本発明者らは、結腸がん細胞、肺がん細胞、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌細胞、膵臓がん細胞、脳がん細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、膀胱がん細胞、腎がん細胞、皮膚がん細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞および精巣がん細胞を操作する方法であって、（ａ）好ましくは、操作の結果としてがん細胞が非がん性となるか、あるいは浸潤性または転移性がん細胞が非浸潤性または非転移性となるように、例えば、ＶＨＺに特異的に結合することができるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはキメラＲＮＡｉに細胞を曝露することによるか、または細胞を請求項２に示される抗ＶＨＺ抗体に曝露することにより、細胞においてＶＨＺの発現、量または活性を調節する（好ましくはダウンレギュレーションする）ことを含むか、または（ｂ）（ａ）細胞において増加したＶＨＺ発現、量または活性を検出するステップと、（ｂ）細胞中のＶＨＺのレベルを低下させるステップとを含む、方法を提供する。
【００１２】
本発明は、第６の態様によれば、（ａ）ＶＨＺポリペプチドに結合することができる分子を同定する方法であって、ＶＨＺポリペプチドまたはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を候補分子と接触させること、および該候補分子が該ＶＨＺポリペプチドまたはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に結合するかどうかを決定することを含む、方法、（ｂ）ＶＨＺのモジュレーターを同定する方法であって、細胞を候補分子と接触させること、および該細胞中のＶＨＺまたは該細胞のＶＨＺの発現、量または活性の増加または低下を検出することを含む、方法、（ｃ）結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんの治療、予防または軽減に適した分子を同定する方法であって、候補分子が、ＶＨＺまたはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを、好ましくは、候補分子がそのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定するために、候補分子をＶＨＺポリペプチドまたはＶＨＺポリペプチドを発現する細胞に曝露して決定することを含む、方法、並びに（ｄ）ＶＨＺまたはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法であって、候補分子を動物に投与することおよび該動物がＶＨＺの発現、量または活性の増加または低下を提示するかどうかを決定することを含む、方法からなる群から選択される方法を提供する。
【００１３】
本発明の第７の態様では、上記に示される方法または使用により同定されるＶＨＺポリペプチドの分子、アゴニストまたはアンタゴニストが提供される。
【００１４】
本発明の第８の態様によれば、本発明者らは、がんの治療、予防または軽減に用いるためのＶＨＺの発現を調節する（例えばダウンレギュレーションする）ことのできる分子、例えば、ヒトＶＨＺのアミノ酸残基（１２６〜１４０）に相当するＲＲＬＲＰＧＳＩＥＴＹＥＱＥＫに対して産生された抗ペプチド抗体などを提供する。
【００１５】
本発明者らは、本発明の第９の態様によれば、ＶＨＺポリペプチドに結合することのできる抗体を提供し、該抗体は、抗体２０９、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントにより結合されるエピトープに結合することができ、好ましくは、（ａ）抗体２０９により結合されるＶＨＺポリペプチド上のエピトープに結合することができる、（ｂ）ＶＨＺの残基Ｃ９５を含む配列、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントであるエピトープに結合することができる抗ＶＨＺ抗体を含む、（ｃ）ＶＨＺに結合することができるモノクローナル抗体２０９、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントの可変領域を含む、（ｄ）細胞内ＶＨＺポリペプチドに結合することができる、（ｅ）細胞の形質膜を通過することができる、（ｆ）ＶＨＺに結合し、かつＶＨＺの生物活性を阻害することができ、（ｇ）がん、例えば、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんなどの転移を防ぐことができる、あるいは（ｈ）モノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体を含む。
【００１６】
本発明の第１０の態様によれば、ＶＨＺに結合することができる、配列番号４および配列番号５からなる群から選択される配列、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントを含むポリペプチドが提供される。
【００１７】
本発明の第１１の態様として、本発明者らは、ＶＨＺ結合活性を有するポリペプチドをコードすることができる、上記に示される分子をコードすることができる配列またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントを含む核酸を提供する。
【００１８】
本発明者らは、本発明の第１２の態様によれば、上記に示される核酸配列を含むか、またはその核酸配列で形質転換された細胞、あるいはそのような細胞の子孫を提供する。
【００１９】
本発明の第１３の態様によれば、本発明者らは、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんの腫瘍が、個体において、浸潤性もしくは転移性腫瘍であるか、またはその可能性が高いかどうかを決定する方法を提供し、該方法は、個体の腫瘍細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性の変化を検出することを含む。
【００２０】
本発明の第１４の態様によれば、（ａ）個体において、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんの治療、予防または軽減の方法であって、個体の細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性を調節することを含み、好ましくは個体のがん細胞においてＶＨＺの発現、量または活性が低下している、方法、及び（ｂ）結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんまたは個体におけるそのようながんに対する感受性またはそのようながんを有する個体の予後の診断方法であって、個体の細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性の変化を検出することを含む、方法、からなる群から選択されるがんの治療、予防または軽減あるいは診断の方法が提供される。
【００２１】
本発明者らは、本発明の第１５の態様によれば、個体において、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんの治療、予防または軽減の方法を提供し、該方法は、個体の細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性の変化を検出すること、および腫瘍の侵襲性に基づいて適切な療法、例えば抗ＶＨＺ剤などを個体に投与することを含む。
【００２２】
診断、予後または療法の選択は、腫瘍のサイズ、またはリンパ節ステージ、あるいはその両方を、所望によりその他の危険因子とともにまたは組み合わせて評価することによりさらに決定されてもよく、好ましくは診断、予後または療法の選択は、腫瘍のエストロゲン受容体（ＥＲ）の状態を評価することによりさらに決定される。
【００２３】
本発明の実行は、特に断りのない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来技法を用いることになり、それらは当業者の能力の範囲内である。このような技法は文献で説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ １−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９５および定期的な補遺；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｃｈ．９，１３，ａｎｄ １６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ，ａｎｄ Ａ．Ｋａｈｎ，１９９６，ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ，１９９０，Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（Ｅｄｉｔｏｒ），１９８４，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉｒｌ Ｐｒｅｓｓ；Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ ａｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ＮＯ．Ｉ ｂｙ Ｅｄｗａｒｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ（１９９９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ ０−８７９６９−５４４−７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｂｙ Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（Ｅｄｉｔｏｒ）（１９８８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３１４−２），１８５５．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ Ｓｅｅｔｈａｌａ，Ｐｒａｂｈａｖａｔｈｉ Ｂ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ（２００１，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＩＳＢＮ ０−８２４７−０５６２−９）；およびＬａｂ Ｒｅｆ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｒｅｃｉｐｅｓ，Ｒｅａｇｅｎｔｓ，ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ａｔ ｔｈｅ Ｂｅｎｃｈ，Ｅｄｉｔｅｄ Ｊａｎｅ Ｒｏｓｋａｍｓ ａｎｄ Ｌｉｎｄａ Ｒｏｄｇｅｒｓ，２００２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＩＳＢＮ ０−８７９６９−６３０−３を参照されたい。これらの一般的な原文は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】外因性ＶＨＺが、中心体および細胞質全体に局在することを示す図である。間接免疫蛍光により中心体の外因性ＶＨＺが示された。
【図１Ａ】ＶＨＺ−ＥＧＦＰ（緑色）は、ＮＲＫ細胞にトランスフェクトされ、細胞内の位置の範囲を示す（ａ）。ＶＨＺの優勢な局在は中心体であり、中心体でＶＨＺは赤色で示される中心体マーカー−ペリセントリンと同時に局在する（ｂ）。Ｔｏ−ｐｒｏ−３ヨージドを用いて核を青色に可視化する（ｂ）。合成した画像は、ペリセントリンと同時に局在するＶＨＺ−ＥＧＦＰ（緑色）を示した（ｃ）。バーは２０μｍ。
【図１Ｂ】ＶＨＺ−ＥＧＦＰはＮＲＫ細胞にトランスフェクトされ、様々な細胞周期ステージ、すなわち、間期（ａ）、前期（ｂ）、中期（ｃ）、および終期の細胞で可視化される（ｄ）。ペリセントリンは赤色で示され（ａ’−ｄ’）、核は青色のＴｏ−ｐｒｏ−３ヨージドで示される（ａ’−ｄ’）。示されるように画像は合成されている（ａ”−ｄ”）。バーは１０μｍ。
【図２】内因性ＶＨＺが中心体および細胞質に局在することを示す図である。
【図２Ａ】内因性ＶＨＺを、ＮＲＫ（ａ〜ｃ、バーは１０μｍ）細胞およびＭＣＦ−１０Ａ（ｄ〜ｆ、バーは２０μｍ）細胞において、アフィニティー精製したウサギ抗ＶＨＺおよびマウス抗γチューブリン抗体、それに続いて抗ウサギ−ＦＩＴＣ（緑色）を結合させた抗ウサギＩｇＧおよび抗マウス−テキサスレッドを結合させた抗マウスＩｇＧを用いる二重染色により可視化する。内因性ＶＨＺは、Ａ４３１細胞（ｇ〜ｉ、バーは２０μｍ）においても、マウスモノクローナル抗体抗ＶＨＺ（クローン＃２５）およびウサギ抗ペリセントリン抗体、それに続いて抗マウス−ＦＩＴＣ（緑色）を結合させた抗マウスＩｇＧおよび抗ウサギ−テキサスレッドを結合させた抗ウサギＩｇＧを用いる二重染色により検出される。
【図２Ｂ】内因性ＶＨＺを、血清飢餓ＮＲＫ（ａ〜ｃ、バーは２０μｍ）において、ウサギ抗ＶＨＺおよびマウス抗γチューブリン抗体、それに続いて抗ウサギ−ＦＩＴＣ（緑色）を結合させた抗ウサギＩｇＧおよび抗マウス−テキサスレッドを結合させた抗マウスＩｇＧを用いる二重染色により可視化する。
【図３】ＶＨＺがタンパク質チロシンホスファターゼ活性を有し、細胞周期制御に関与していることを示す図である。
【図３Ａ】本発明者らは、それぞれのタンパク質（０．６７５ピコモル）をそのＰＴＰアーゼ活性について試験する。ＶＨＺのＰＴＰアーゼ活性は、１０μＭオルトバナジン酸ナトリウムを反応に添加することによるか（ＶＨＺ−ＧＳＴ＋バナジン酸塩）、またはＣｙｓ９５のＳｅｒへの点突然変異により［ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＧＳＴ］］完全に消失する。
【図３Ｂ】ａ．３種類の全細胞可溶化液は、ＶＨＺ−ＥＧＦＰ、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰ、またはＥＧＦＰベクターを発現するＭＣＦ−７細胞から得たものである。タンパク質発現レベルは抗ＥＧＦＰ抗体を用いるウエスタンブロットにより分析する。ＧＡＰＤＨをタンパク質負荷対照として使用する。ｂ．ＤＮＡ含量は、ＢｒｄＵ取り込みおよびＦＡＣＳ分析により測定する。新たに合成されたＤＮＡへのＡＰＣ−ＢｒｄＵ取り込み（Ｒ１は赤色の蛍光の量に相当する）。
【図３Ｃ】同じ３種類の発現構築物を安定して発現したＮＲＫ細胞は、ＶＨＺがＧ１を減少させるがＳ集団を増加させることができたことを示した。得られるヒストグラムは、３つの集団（％表示）：Ｍ１：Ｇ１期、Ｍ２：Ｓ期およびＭ３：Ｇ２／Ｍ期からなる。このグラフは、その個別の細胞のＤＮＡ含量をＦＡＣＳ分析により決定する場合に、増殖する細胞集団について得られる典型的な結果を示した。
【図４】ＭＣＦ−７細胞においてＶＨＺがＧ１／Ｓ移行を増強することを示す図である。
【図４Ａ】ＥＧＦＰベクター、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰまたはＶＨＺ−ＥＧＦＰを発現しているＭＣＦ−７細胞を、Ｇ１／Ｓ細胞周期制御に関与するいくつかの分子について分析する。それらは、ｐ２１ Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１、Ｃｄｋ４、ならびに、Ｓｅｒ７８０、Ｓｅｒ７９５およびＳｅｒ８０７／８１１でリン酸化されたＲｂである。
【図４Ｂ】ＶＨＺがＧ１／Ｓ期移行においてこれらの分子とどのように連係するかを説明するための提案モデルを示す。
【図５】いくつかの乳がん試料において過剰発現したＶＨＺタンパク質が上皮腫瘍細胞の中心体または細胞質に分布していることを示す図である。ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した乳がん試料を、ＶＨＺタンパク質発現について評価する。
【図５Ａ】同じ組織切片への間接的な二重免疫蛍光標識により、ＶＨＺは乳がんの細胞の中心体に局在するように見える。白色の矢印で示されるように、ＶＨＺ（ａ）とγ−チューブリン（ｂ）は、中心体（ｃ）に同時局在する。画像ｃは、ａとｂの合成画像を示す。バー：１００μｍ。
【図５Ｂ】乳がん試料の２つの連続した切片を、それぞれＶＨＺおよびγチューブリンを検出するための免疫組織化学標識用に処理する。陽性シグナルは、３，３’−ジアミノベンジジン色素原（茶色）で染色することにより検出される。ＶＨＺ（ａ）およびγチューブリン局在（ｂ）の類似する中心体標識パターンを黒色の矢印で示す。全体像（ａ’、ｂ’）は、２つの隣接する切片から得たものである。パネルａ’〜ｃ’中の枠で囲まれた３つの長方形の領域（拡大率６３０倍）をさらに拡大し（５倍）およびそれぞれパネルａ〜ｃに示し、中心体を黒色の矢印で示す。パネルｃ’およびｃは、ＶＨＺ陰性試料を対照として示す。元の全体像は（図８Ａ）に示される。
【図５Ｃ】いくつかの乳がん試料において、ＶＨＺタンパク質は、分散した上皮の細胞質全体に過剰発現する。元の全体像は（図８Ｂ）に示される。異なる乳房試料から選択した切片を全体像に示す（ａ’およびｂ’）。全体像中の枠で囲まれた３つの長方形の領域（ａ’、ｂ’およびｃ’、拡大率４００倍）をさらに拡大し（５倍）、それぞれパネルａ、ｂおよびｃに示す。パネルｃおよびｃ’は、ＶＨＺ陰性試料を対照として示す。
【図６】Ｅ−カドヘリン陰性細胞中のＶＨＺ発現およびＶＨＺの過剰発現が、ＭＣＦ−７細胞の運動性を増強することを示す図である。
【図６Ａ】ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した２つの隣接する乳がん試料組織切片は、ＶＨＺ陽性細胞がＥ−カドヘリン陰性であり（ａ、拡大率４００倍）、ＶＨＺ陰性上皮がＥ−カドヘリン陽性である（ｂ、拡大率４００倍）ことを示した。
【図６Ｂ】ＭＣＦ−７−ＶＨＺ−ＥＧＦＰとＭＣＦ−７−ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰ細胞運動を評価するため、細胞を、カバーガラス上のコンフルエント単層に蒔く。次に、細胞で覆ったカバーガラスを、新鮮な培養皿の上に細胞側を下にして反転させる。ＭＣＦ−７−ＶＨＺ−ＥＧＦＰ細胞（ａ、ａ’）およびＭＣＦ−７−ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰ（ｂ、ｂ’）の画像を０時および４８時に撮影する。パネルａ’は、ＭＣＦ−７−ＶＨＺ−ＥＧＦＰ細胞が表面を覆うカバーガラスの下から出て行く（矢印で示す）ことを示した。免疫蛍光画像（ａ、ｂ）。位相差画像（ａ’、ｂ’、拡大率２００倍）。
【図７】ＶＨＺ ｍＲＮＡが組織および細胞で広範に発現していることを示す図である。 ヒトマルチプル組織アレイ（カタログ番号７７７６−１）は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）より入手する。アレイには、６５種類の異なるヒト組織および８種類のヒト細胞株に由来する７３のｍＲＮＡが収容されている。
【図７Ａ】ドットブロットを、製造業者の取扱説明書（カタログ番号１５８５５８４、Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って３２Ｐ−ｄＣＴＰで放射標識されたヒトＶＨＺ ｃＤＮＡを用いてプローブする。ＶＨＺ ｍＲＮＡ発現パターンが示される。ＶＨＺは主に心臓（スポット：４Ａ、４Ｃ−４Ｈ）および多くのその他の組織、ならびに肺癌細胞株−Ａ５４９（スポット−１０Ｈ）で発現する。
【図７Ｂ】ヒトマルチプル組織アレイの完全なマップである。
【図８】免疫組織化学によりＶＨＺタンパク質が乳がんの中心体および細胞質において過剰発現することを示す図である。
【図８Ａ】ＶＨＺタンパク質の過剰発現は、乳がんの中心体で明らかである。中心体は黒色矢印で示される（拡大率４００倍）。
【図８Ｂ】ＶＨＺタンパク質の過剰発現は、乳がん細胞の細胞質で見出される（拡大率２００倍）。
【図９】ウサギおよびマウス抗ＶＨＺ抗体の特徴づけを示す図である。
【図９Ａ】ウサギおよびマウス抗ＶＨＺ抗体を用いるウエスタンブロット分析。全細胞可溶化液は、Ａ４３１、ＨａＬａ、ＮＲＫ、およびＭＣＦ−７細胞から得たものである。ＭＣＦ−７全細胞可溶化液を、２μｇのＶＨＺ−ＧＳＴ（レーン１）とともにプレインキュベートする。ＶＨＺバンドの検出は、ＶＨＺ−ＧＳＴにより特異的に阻止される（矢印で示す）。
【図９Ｂ】ＶＨＺ ｍＡｂは、ＥＣＬ（Ａ）、ＩＦ（Ｂ）およびＩＨＣ（図５）に使用することができる。
【図１０】創傷治癒アッセイにより、ＶＨＺを発現するＭＣＦ１０Ａ細胞が、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）を発現するＭＣＦ１０Ａ細胞よりも強化された遊走特性を示したことを示す図である。本発明者らは、ｐＢＡＢＥｐｕｒｏベクターを用いるレトロウイルス媒介性の形質導入によりＶＨＺおよびＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）をＭＣＦ１０Ａ細胞（５×１０５）に発現させた。創傷治癒アッセイにより、ＶＨＺを発現するＭＣＦ１０Ａ細胞は、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）を発現するＭＣＦ１０Ａ細胞よりも強化された遊走特性を示した。細胞遊走の開始時（０時間、上のパネル）と終了時（８時間、下のパネル）の明白な違いを観察することができる。
【図１１】創傷治癒アッセイにより、ＶＨＺを発現するＭＣＦ１０Ａ細胞が、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）を発現するＭＣＦ１０Ａ細胞と比較して強化された遊走特性を示すことが見られる。本発明者らは、ｐＢＡＢＥｐｕｒｏベクターを用いるレトロウイルス媒介性の形質導入によりＶＨＺおよびＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）をＭＣＦ１０Ａ細胞（５×１０５）に発現させた。創傷治癒アッセイにより、ＶＨＺを発現するＭＣＦ１０Ａ細胞は、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）を発現するＭＣＦ１０Ａ細胞と比較して強化された遊走特性を示した。細胞遊走の開始時（０時間、上のパネル）と終了時（８時間、下のパネル）の明白な違いを観察することができる。
【図１２】ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した複数のヒトがん試料におけるＶＨＺタンパク質発現の評価を示す図である。ＤＡＢ色素原（褐色）を用いるＤａｋｏ ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）Ｓｙｓｔｅｍを用いてＶＨＺ特異的マウスモノクローナル抗体で染色することにより、ＶＨＺタンパク質を明らかにする。
【図１３Ａ】ＶＨＺ＃２０９キメラ抗体の構築ステップを概説する図である。
【図１３Ｂ】ＶＨＺ＃２０９キメラ抗体の可変重鎖の配列を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体において、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんの治療、予防または軽減の方法で用いるためのＶＨＺ。
【請求項２】
結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択される、がんの治療、予防または軽減のための抗ＶＨＺ剤であって、
好ましくは、該抗ＶＨＺ剤が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７８２３またはＮＰ＿０６０２９３として示されるＶＨＺ配列、またはその配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列の発現、量または活性の任意の組合せをダウンレギュレーションすることができ、
該抗ＶＨＺ剤が、好ましくは、ヒトＶＨＺのアミノ酸残基（１２６〜１４０）に相当するＲＲＬＲＰＧＳＩＥＴＹＥＱＥＫに対して産生された抗ペプチド抗体のような抗ＶＨＺ抗体、例えば、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＬＳ−Ｃ３２２８１、アミノ酸３５〜９０、ＬＳ−Ｃ４２４５８、ＬＳ−Ａ６８０６およびＬＳ−Ａ６８０３、ＬＳ−Ｃ３２２８１、ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｉｎｃ、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＤＳ−ＰＢ−００６７６、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、Ｇｅｏｒｇｉａ、ＵＳＡ）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＸＷ−７８５７、ＰｒｏＳｃｉ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｐｏｗａｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号Ｆ４５６０およびＤ９８４０−６６Ａ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号Ｄ９８４０−６６、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＡＨＰ１１４２、ＡｄＢ Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１１０−４０４５２、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡ）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１００−７５３２８、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡ）などを含むか、あるいは、該抗ＶＨＺ剤が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、または、ＤＵＳＰ２３プレデザインキメラＲＮＡｉ（カタログ番号Ｈ０００５４９３５−Ｒ０１、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡ）などのキメラＲＮＡｉを含むものなどのようなＲＮＡ干渉によりＶＨＺをダウンレギュレーションすることができる、
抗ＶＨＺ剤。
【請求項３】
個体において、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがん、またはそのようながんに対する該個体の感受性を検出するためのキットであって、該個体または個体から採取した試料においてＶＨＺ発現を検出するための手段と、任意選択により使用説明書とを含み、好ましくは、該検出手段が、ＶＨＺポリヌクレオチド若しくはそのフラグメント；ＶＨＺ核酸に対して相補的なヌクレオチド配列若しくはそのフラグメント；ＶＨＺポリペプチド若しくはそのフラグメント、又は、請求項２に記載の抗ＶＨＺ抗体若しくは抗ＶＨＺ剤からなる群から選択され、好ましくは、該がんの治療、予防または軽減のための治療薬をさらに含む、キット。
【請求項４】
（ａ）結腸がん細胞、肺がん細胞、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌細胞、膵臓がん細胞、脳がん細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、膀胱がん細胞、腎がん細胞、皮膚がん細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞および精巣がん細胞からなる群から選択されるがん細胞を検出する方法であって、該細胞においてＶＨＺの発現、量または活性の変化（好ましくはアップレギュレーション）を検出することを含み、好ましくは、ＶＨＺの該発現が、非がん性であることがわかっている対照細胞中のＶＨＺの該発現、量または活性と比較される、方法、
（ｂ）上記（ａ）による方法であって、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７８２３またはＮＰ＿０６０２９３として示される配列またはそのような配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有する核酸の少なくとも一部を含むプローブなどの手段によりＶＨＺ核酸を検出することを含むか、あるいは、例えば、請求項２に示される抗ＶＨＺ抗体などの手段によりＶＨＺポリペプチドを検出することを含み、好ましくは組織学的類別、例えば、Ｅｌｓｔｏｎ−Ｅｌｌｉｓ修正Ｓｃａｒｆｆ、Ｂｌｏｏｍ、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎの類別方式（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ Ｇｒａｄｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＮＧＳ））を使用することによるなどを含む、方法、
（ｃ）結腸がん細胞、肺がん細胞、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌細胞、膵臓がん細胞、脳がん細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、膀胱がん細胞、腎がん細胞、皮膚がん細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞および精巣がん細胞からなる群から選択されるがん細胞の増殖状態を決定するか、または該がん細胞が浸潤性または侵襲性となることになる可能性を決定する方法であって、該細胞中のＶＨＺの発現、量または活性の変化を検出することを含む、方法、
（ｄ）結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんを有する個体の生存率を推定する方法であって、個体の細胞においてＶＨＺの発現の変化を検出することを含む、方法、
（ｅ）結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんを有する個体のための療法を選ぶ方法であって、該個体の細胞においてＶＨＺの発現の変化を検出することと、がんの侵襲性に基づいて、適切な療法、例えば抗ＶＨＺ剤などを選択することとを含む、方法、
（ｆ）結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんを有する個体において特定の療法の成功の可能性を決定する方法であって、該療法と上記の（ｅ）による方法により決定される療法を比較することを含む、方法、および
（ｇ）請求項１〜３のいずれか一項に示される特徴をさらに含む、上記（ａ）〜（ｆ）のいずれか一項に記載の方法、
からなる群から選択される方法。
【請求項５】
結腸がん細胞、肺がん細胞、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌細胞、膵臓がん細胞、脳がん細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、膀胱がん細胞、腎がん細胞、皮膚がん細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞および精巣がん細胞を操作する方法であって、
（ａ）好ましくは、操作の結果としてがん細胞が非がん性となるか、あるいは浸潤性または転移性がん細胞が非浸潤性または非転移性となるように、例えば、ＶＨＺに特異的に結合することができるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはキメラＲＮＡｉに細胞を曝露することによるか、または請求項２に示される抗ＶＨＺ抗体に細胞を曝露することにより、該細胞においてＶＨＺの発現、量または活性を変化させる（好ましくはダウンレギュレーションする）ことを含む方法、または
（ｂ）（ａ）細胞において増加したＶＨＺ発現、量または活性を検出するステップと、（ｂ）該細胞中のＶＨＺの該レベルを低下させるステップとを含む方法。
【請求項６】
（ａ）ＶＨＺポリペプチドに結合することができる分子を同定する方法であって、ＶＨＺポリペプチドまたはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を候補分子に接触させることと、該候補分子が該ＶＨＺポリペプチドまたはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に結合するかどうかを決定することとを含む、方法、
（ｂ）ＶＨＺのモジュレーターを同定する方法であって、細胞を候補分子と接触させることと、該細胞中のまたは該細胞のＶＨＺの発現、量または活性の増加または低下を検出することとを含む、方法、
（ｃ）結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんの治療、予防または軽減に適した分子を同定する方法であって、候補分子がＶＨＺのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定するために、好ましくは、候補分子をＶＨＺポリペプチドまたはＶＨＺポリペプチドを発現する細胞に曝露することによって、候補分子が、ＶＨＺまたはＶＨＺと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定することを含む、方法、および
（ｄ）ＶＨＺまたはＶＨＺと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法であって、候補分子を動物に投与することおよび該動物がＶＨＺの発現、量または活性の増加または低下を提示するかどうかを決定することを含む、方法
からなる群から選択される方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法または使用により同定される、ＶＨＺポリペプチドの分子、アゴニストまたはアンタゴニスト。
【請求項８】
ヒトＶＨＺのアミノ酸残基（１２６〜１４０）に相当するＲＲＬＲＰＧＳＩＥＴＹＥＱＥＫに対して産生された抗ペプチド抗体のような、がんの治療、予防または軽減における使用のためのＶＨＺの発現を変化させる（例えばダウンレギュレーションする）ことができる分子。
【請求項９】
ＶＨＺポリペプチドに結合することができる抗体であって、抗体２０９、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントにより結合されるエピトープに結合することができ、好ましくは、
（ａ）抗体２０９により結合されているＶＨＺポリペプチド上のエピトープに結合することができる、
（ｂ）ＶＨＺの残基Ｃ９５を含む配列、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントであるであるエピトープに結合することができる抗ＶＨＺ抗体を含む、
（ｃ）ＶＨＺに結合することができるモノクローナル抗体２０９、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントの可変領域を含む、
（ｄ）細胞内ＶＨＺポリペプチドに結合することができる、
（ｅ）細胞の形質膜を通過することができる、
（ｆ）ＶＨＺに結合し、かつＶＨＺの生物活性を抑制することができる、
（ｇ）がん、例えば、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんなどの転移を防ぐことができる、または、
（ｈ）モノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体を含む、
抗体。
【請求項１０】
ＶＨＺに結合することができる、配列番号４および配列番号５からなる群から選択される配列、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントを含む、ポリペプチド。
【請求項１１】
ＶＨＺ結合活性を有するポリペプチドをコードすることができる、請求項１０に記載の分子をコードすることができる配列、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントを含む、核酸。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸配列を含むか、または請求項１１に記載の核酸配列により形質転換された細胞、あるいはそのような細胞の子孫。
【請求項１３】
個体における、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんの腫瘍が、浸潤性もしくは転移性腫瘍であるか、またはその可能性が高いかどうかを決定する方法であって、該個体の腫瘍細胞でのＶＨＺの発現、量または活性の変化を検出することを含む、方法。
【請求項１４】
（ａ）個体における、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択される、がんの治療、予防または軽減の方法であって、個体の細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性を変化させることを含み、好ましくは個体のがん細胞においてＶＨＺの発現、量または活性が低下する、方法、および、
（ｂ）結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがん、または個体におけるそのようながんに対する感受性、またはそのようながんの個体の予後の診断の方法であって、個体の細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性の変化を検出することを含む、方法
からなる群から選択される、がんの治療、予防、軽減または診断の方法。
【請求項１５】
個体における、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんの治療、予防または軽減の方法であって、該個体の細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性の変化を検出すること、および該腫瘍の該侵襲性に基づいて適切な療法、例えば抗ＶＨＺ剤などを該個体に投与することを含む、方法。
【請求項１６】
診断、予後または療法の選択が、腫瘍のサイズ、またはリンパ節段階、あるいはその両方を、任意選択によりその他のリスク因子とともにまたは組み合わせて評価することによりさらに決定され、好ましくは、診断、予後または療法の選択が、腫瘍のエストロゲン受容体（ＥＲ）の状態を評価することによりさらに決定される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
添付の図面の図１〜１５を参照して、かつそれに示されるように、本明細書に記載される方法および物。
【請求項１】
個体において、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんの治療、予防または軽減の方法で用いるためのＶＨＺ。
【請求項２】
結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択される、がんの治療、予防または軽減のための抗ＶＨＺ剤であって、
好ましくは、該抗ＶＨＺ剤が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７８２３またはＮＰ＿０６０２９３として示されるＶＨＺ配列、またはその配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列の発現、量または活性の任意の組合せをダウンレギュレーションすることができ、
該抗ＶＨＺ剤が、好ましくは、ヒトＶＨＺのアミノ酸残基（１２６〜１４０）に相当するＲＲＬＲＰＧＳＩＥＴＹＥＱＥＫに対して産生された抗ペプチド抗体のような抗ＶＨＺ抗体、例えば、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＬＳ−Ｃ３２２８１、アミノ酸３５〜９０、ＬＳ−Ｃ４２４５８、ＬＳ−Ａ６８０６およびＬＳ−Ａ６８０３、ＬＳ−Ｃ３２２８１、ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｉｎｃ、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＤＳ−ＰＢ−００６７６、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、Ｇｅｏｒｇｉａ、ＵＳＡ）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＸＷ−７８５７、ＰｒｏＳｃｉ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｐｏｗａｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号Ｆ４５６０およびＤ９８４０−６６Ａ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号Ｄ９８４０−６６、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＡＨＰ１１４２、ＡｄＢ Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１１０−４０４５２、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡ）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１００−７５３２８、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡ）などを含むか、あるいは、該抗ＶＨＺ剤が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、または、ＤＵＳＰ２３プレデザインキメラＲＮＡｉ（カタログ番号Ｈ０００５４９３５−Ｒ０１、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡ）などのキメラＲＮＡｉを含むものなどのようなＲＮＡ干渉によりＶＨＺをダウンレギュレーションすることができる、
抗ＶＨＺ剤。
【請求項３】
個体において、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがん、またはそのようながんに対する該個体の感受性を検出するためのキットであって、該個体または個体から採取した試料においてＶＨＺ発現を検出するための手段と、任意選択により使用説明書とを含み、好ましくは、該検出手段が、ＶＨＺポリヌクレオチド若しくはそのフラグメント；ＶＨＺ核酸に対して相補的なヌクレオチド配列若しくはそのフラグメント；ＶＨＺポリペプチド若しくはそのフラグメント、又は、請求項２に記載の抗ＶＨＺ抗体若しくは抗ＶＨＺ剤からなる群から選択され、好ましくは、該がんの治療、予防または軽減のための治療薬をさらに含む、キット。
【請求項４】
（ａ）結腸がん細胞、肺がん細胞、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌細胞、膵臓がん細胞、脳がん細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、膀胱がん細胞、腎がん細胞、皮膚がん細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞および精巣がん細胞からなる群から選択されるがん細胞を検出する方法であって、該細胞においてＶＨＺの発現、量または活性の変化（好ましくはアップレギュレーション）を検出することを含み、好ましくは、ＶＨＺの該発現が、非がん性であることがわかっている対照細胞中のＶＨＺの該発現、量または活性と比較される、方法、
（ｂ）上記（ａ）による方法であって、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７８２３またはＮＰ＿０６０２９３として示される配列またはそのような配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有する核酸の少なくとも一部を含むプローブなどの手段によりＶＨＺ核酸を検出することを含むか、あるいは、例えば、請求項２に示される抗ＶＨＺ抗体などの手段によりＶＨＺポリペプチドを検出することを含み、好ましくは組織学的類別、例えば、Ｅｌｓｔｏｎ−Ｅｌｌｉｓ修正Ｓｃａｒｆｆ、Ｂｌｏｏｍ、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎの類別方式（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ Ｇｒａｄｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＮＧＳ））を使用することによるなどを含む、方法、
（ｃ）結腸がん細胞、肺がん細胞、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌細胞、膵臓がん細胞、脳がん細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、膀胱がん細胞、腎がん細胞、皮膚がん細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞および精巣がん細胞からなる群から選択されるがん細胞の増殖状態を決定するか、または該がん細胞が浸潤性または侵襲性となることになる可能性を決定する方法であって、該細胞中のＶＨＺの発現、量または活性の変化を検出することを含む、方法、
（ｄ）結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんを有する個体の生存率を推定する方法であって、個体の細胞においてＶＨＺの発現の変化を検出することを含む、方法、
（ｅ）結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんを有する個体のための療法を選ぶ方法であって、該個体の細胞においてＶＨＺの発現の変化を検出することと、がんの侵襲性に基づいて、適切な療法、例えば抗ＶＨＺ剤などを選択することとを含む、方法、
（ｆ）結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんを有する個体において特定の療法の成功の可能性を決定する方法であって、該療法と上記の（ｅ）による方法により決定される療法を比較することを含む、方法、および
（ｇ）請求項１〜３のいずれか一項に示される特徴をさらに含む、上記（ａ）〜（ｆ）のいずれか一項に記載の方法、
からなる群から選択される方法。
【請求項５】
結腸がん細胞、肺がん細胞、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌細胞、膵臓がん細胞、脳がん細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、膀胱がん細胞、腎がん細胞、皮膚がん細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞および精巣がん細胞を操作する方法であって、
（ａ）好ましくは、操作の結果としてがん細胞が非がん性となるか、あるいは浸潤性または転移性がん細胞が非浸潤性または非転移性となるように、例えば、ＶＨＺに特異的に結合することができるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはキメラＲＮＡｉに細胞を曝露することによるか、または請求項２に示される抗ＶＨＺ抗体に細胞を曝露することにより、該細胞においてＶＨＺの発現、量または活性を変化させる（好ましくはダウンレギュレーションする）ことを含む方法、または
（ｂ）（ａ）細胞において増加したＶＨＺ発現、量または活性を検出するステップと、（ｂ）該細胞中のＶＨＺの該レベルを低下させるステップとを含む方法。
【請求項６】
（ａ）ＶＨＺポリペプチドに結合することができる分子を同定する方法であって、ＶＨＺポリペプチドまたはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を候補分子に接触させることと、該候補分子が該ＶＨＺポリペプチドまたはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列に結合するかどうかを決定することとを含む、方法、
（ｂ）ＶＨＺのモジュレーターを同定する方法であって、細胞を候補分子と接触させることと、該細胞中のまたは該細胞のＶＨＺの発現、量または活性の増加または低下を検出することとを含む、方法、
（ｃ）結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんの治療、予防または軽減に適した分子を同定する方法であって、候補分子がＶＨＺのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定するために、好ましくは、候補分子をＶＨＺポリペプチドまたはＶＨＺポリペプチドを発現する細胞に曝露することによって、候補分子が、ＶＨＺまたはＶＨＺと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定することを含む、方法、および
（ｄ）ＶＨＺまたはＶＨＺと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法であって、候補分子を動物に投与することおよび該動物がＶＨＺの発現、量または活性の増加または低下を提示するかどうかを決定することを含む、方法
からなる群から選択される方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法または使用により同定される、ＶＨＺポリペプチドの分子、アゴニストまたはアンタゴニスト。
【請求項８】
ヒトＶＨＺのアミノ酸残基（１２６〜１４０）に相当するＲＲＬＲＰＧＳＩＥＴＹＥＱＥＫに対して産生された抗ペプチド抗体のような、がんの治療、予防または軽減における使用のためのＶＨＺの発現を変化させる（例えばダウンレギュレーションする）ことができる分子。
【請求項９】
ＶＨＺポリペプチドに結合することができる抗体であって、抗体２０９、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントにより結合されるエピトープに結合することができ、好ましくは、
（ａ）抗体２０９により結合されているＶＨＺポリペプチド上のエピトープに結合することができる、
（ｂ）ＶＨＺの残基Ｃ９５を含む配列、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントであるであるエピトープに結合することができる抗ＶＨＺ抗体を含む、
（ｃ）ＶＨＺに結合することができるモノクローナル抗体２０９、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントの可変領域を含む、
（ｄ）細胞内ＶＨＺポリペプチドに結合することができる、
（ｅ）細胞の形質膜を通過することができる、
（ｆ）ＶＨＺに結合し、かつＶＨＺの生物活性を抑制することができる、
（ｇ）がん、例えば、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんなどの転移を防ぐことができる、または、
（ｈ）モノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体を含む、
抗体。
【請求項１０】
ＶＨＺに結合することができる、配列番号４および配列番号５からなる群から選択される配列、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントを含む、ポリペプチド。
【請求項１１】
ＶＨＺ結合活性を有するポリペプチドをコードすることができる、請求項１０に記載の分子をコードすることができる配列、またはその変異体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントを含む、核酸。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸配列を含むか、または請求項１１に記載の核酸配列により形質転換された細胞、あるいはそのような細胞の子孫。
【請求項１３】
個体における、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんの腫瘍が、浸潤性もしくは転移性腫瘍であるか、またはその可能性が高いかどうかを決定する方法であって、該個体の腫瘍細胞でのＶＨＺの発現、量または活性の変化を検出することを含む、方法。
【請求項１４】
（ａ）個体における、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択される、がんの治療、予防または軽減の方法であって、個体の細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性を変化させることを含み、好ましくは個体のがん細胞においてＶＨＺの発現、量または活性が低下する、方法、および、
（ｂ）結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがん、または個体におけるそのようながんに対する感受性、またはそのようながんの個体の予後の診断の方法であって、個体の細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性の変化を検出することを含む、方法
からなる群から選択される、がんの治療、予防、軽減または診断の方法。
【請求項１５】
個体における、結腸がん、肺がん、口唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎がんを含む扁平上皮癌、膵臓がん、脳がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、皮膚がん、卵巣がん、前立腺がんおよび精巣がんからなる群から選択されるがんの治療、予防または軽減の方法であって、該個体の細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性の変化を検出すること、および該腫瘍の該侵襲性に基づいて適切な療法、例えば抗ＶＨＺ剤などを該個体に投与することを含む、方法。
【請求項１６】
診断、予後または療法の選択が、腫瘍のサイズ、またはリンパ節段階、あるいはその両方を、任意選択によりその他のリスク因子とともにまたは組み合わせて評価することによりさらに決定され、好ましくは、診断、予後または療法の選択が、腫瘍のエストロゲン受容体（ＥＲ）の状態を評価することによりさらに決定される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
添付の図面の図１〜１５を参照して、かつそれに示されるように、本明細書に記載される方法および物。
【公表番号】特表２０１１−５３０２８３（Ｐ２０１１−５３０２８３Ａ）
【公表日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２２０２９（Ｐ２０１１−５２２０２９）
【出願日】平成２１年８月７日（２００９．８．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００９／０００２７６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１６８０６
【国際公開日】平成２２年２月１１日（２０１０．２．１１）
【出願人】（５１００９５０２０）エイジェンシー・フォー・サイエンス，テクノロジー・アンド・リサーチ（エイ・スター） (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月７日（２００９．８．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００９／０００２７６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１６８０６
【国際公開日】平成２２年２月１１日（２０１０．２．１１）
【出願人】（５１００９５０２０）エイジェンシー・フォー・サイエンス，テクノロジー・アンド・リサーチ（エイ・スター） (4)
【Ｆターム（参考）】
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