アミロイドベータタンパク質産生を阻害するための方法、組成物及び化合物アッセイ
細胞においてアミロイドベータ前駆体タンパク質プロセシングを阻害する化合物を同定する方法であって、テスト化合物をＧＰＣＲポリペプチド又はそれらのフラグメントに接触させること、及びアミロイドベータペプチドの産生に関連する化合物−ＧＰＣＲ特性を測定することを含む。本方法の細胞アッセイは、二次メッセンジャー及び／又はアミロイドベータペプチドレベルを含む指標を測定する。アミロイドベータ前駆体プロセシングを阻害するのに有効な量のＧＰＣＲ発現阻害剤を含む治療法及び医薬組成物は、アルツハイマー病などの認識機能障害を伴う病気の治療に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、哺乳動物の神経細胞疾患の分野、及び特に効果的な化合物を同定するための方法、及びヒトにおける知的能力の進行性喪失に関連する疾患の予防及び治療に有用な、そのような化合物を用いた治療並びに組成物に関連する。
知的能力の進行的喪失として最も広く知られている神経疾患はアルツハイマー病（ＡＤ）である。世界的に、約２０００万人の人々がアルツハイマー病で苦しんでいる。ＡＤは、記憶の初期喪失に続いて見当識障害、一般的に認識機能障害としてみなされる判断並びに論理的思考の障害、及び最終的には完全な認知症によって臨床的に特徴付けられる。ＡＤ患者は最終的に該疾患の発症後４〜１２年の間、ひどく衰弱して不動状態に陥る。
【背景技術】
【０００２】
ＡＤに対する重要な病理学的証拠は、神経変性に付随する細胞外アミロイド斑及び脳内の細胞内タウタングル（tau tangle）の存在である（Ritchie及びLovestone (2002)）。細胞外のアミロイド斑は、アミロイドベータ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の代謝によって産生された不溶性アミロイドベータペプチド１〜４２の増加の結果であると考えられている。分泌の後、これらのアミロイドベータ１〜４２ペプチドは、健康な人々で優勢に産生されるアミロイドベータ１〜４０ペプチドよりも、より容易にアミロイド線維を形成する。アミロイドベータペプチドは神経毒カスケードの頂点にあるようである：実験は、アミロイドベータ線維がＰ３０１Ｌタウトランスジェニックマウスの脳内に注入された場合に、神経原線維変化の形成を促進することを示す（Gotzらの文献 (2001)）。実際に、様々なアミロイドベータペプチドが、アミロイドベータペプチド１〜４２、１〜４０、１〜３９、１〜３８、１〜３７として同定されてきており、これらは斑内に存在することもあり、かつしばしば脳脊髄液中に見られる。
【０００３】
アミロイドベータペプチドは、１及び４０又は４２の位置で、それぞれベータセクレターゼ並びにガンマセクレターゼによって切断された後、膜アンカー型ＡＰＰから生じる（プロセシングされる）（図１Ａ）（Annaert及びDe Strooperの文献(2002)）。さらに、ベータセクレターゼの高い活性は、位置１から位置１１への切断の移動によって生じる。位置１７におけるアルファセクレターゼ活性、及び４０又は４２におけるガンマセクレターゼ活性によるアミロイドベータ前駆体タンパク質の切断は、非病理的なｐ３ペプチドを生じる。ベータセクレターゼは、膜アンカー型アスパルチルプロテアーゼＢＡＣＥとして同定され、一方ガンマセクレターゼは、プレセニリン１（ＰＳ１）又はプレセニリン２（ＰＳ２）、ニカストリン、前部咽頭欠損１（Anterior Pharynx Defective 1）（ＡＰＨ１）、及びプレセニリンエンハンサー２（ＰＥＮ２）を含むタンパク質複合体である。これらのタンパク質の中で、プレセニリンは、ガンマセクレターゼの触媒活性を構成すると広く考えられている一方で、他の構成要素はタンパク質複合体の成熟化及び局在に役割を担う。いくつかの結果は、プロテアーゼＡＤＡＭ１０及びＴＡＣＥが冗長的な機能を有し得ることを指摘しているが、アルファセクレターゼの独自性はそれでも傑出している。
【０００４】
ＡＤ病状（ほとんどは早発型ＡＤ）のごく少数は、プレセニリン１及び２（ＰＳ１；ＰＳ２）、並びにアミロイドベータ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をコードする遺伝子における常染色体の優性突然変異によって引き起こされ、かつＡＰＰ，ＰＳ１及びＰＳ２における変異は、脳において産生されるアミロイドベータ１〜４２のレベルの上昇をもたらすアミロイドベータ前駆体タンパク質の代謝を変化させることが見出されている。ＰＳ１、ＰＳ２及びアミロイドベータ前駆体タンパク質の変異は、遅発型のＡＤ患者においては同定されていないが、その病理学的特性は早発型のＡＤ患者によく似ている。これらのアミロイドベータペプチドの増加レベルは、乱れたアミロイドベータ前駆体タンパク質のプロセシング（例えば、高コレステロールレベルはアミロイドベータペプチド産生を高める）、又は減少したアミロイドベータペプチドの異化から加齢に伴って進行的に起こり得る。それゆえ、遅発型のＡＤ患者のＡＤはまた、脳において異常に上昇したアミロイドペプチドレベルによって引き起こされることが一般的に受け入れられている。これらのアミロイドベータペプチド、及びより具体的にはアミロイドベータペプチド１〜４２のレベルは、健常者におけるこれらのペプチドのレベルに比較して、アルツハイマー患者において上昇している。すなわち、これらのアミロイドベータペプチドのレベルを下げることが認識機能障害を有する患者に対して有益である可能性が高い。
【０００５】
（成果報告）
主要な現在のＡＤ治療は、コリン作動性ニューロンがＡＤの間に変性する最初の神経細胞であるために低下するアセチルコリン神経伝達物質レベルを上昇させるアセチルコリンエステラーゼ酵素を阻害することによって、進行的な記憶の喪失を遅延させることに限定される。この治療は該疾患の進行を止めはしない。
【０００６】
脳においてアミロイドベータペプチドのレベルを減少させることを目的とする治療はますます調査され、そしてベータ又はガンマセクレターゼ酵素が関与する異常なアミロイドベータ前駆体タンパク質プロセシングに焦点を当てている。
本発明は、特定の既知のポリペプチドが、神経細胞においてアミロイドベータ前駆体のプロセシングの上方調節及び／又は誘導における因子であり、かつそうしたポリペプチドの機能の阻害は、アミロイドベータペプチドのレベルを下げることに効果的であるという発見に基づいている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、アミロイドベータタンパク質産生を阻害するための方法、組成物及び化合物アッセイを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、哺乳動物細胞内において、Ｇタンパク質共役受容体（「ＧＰＣＲ」）の機能とアミロイドベータ前駆体タンパク質プロセシングとの関係に関連する。
本発明のある態様は、哺乳動物細胞内において、アミロイドベータ前駆体タンパク質のプロセシングを阻害する化合物を同定するための方法であって；
（ａ）化合物を、配列番号：４〜６、２８９〜３３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに接触させること；及び
（ｂ）アミロイドベータタンパク質の産生に関連する化合物−ポリペプチド特性を測定すること、を含む。
【０００９】
本方法の態様は、ＧＰＣＲのポリペプチドドメインを使用した化合物のインビトロアッセイを含み、及びＧＰＣＲ阻害の後で二次メッセンジャーレベル及び／又はアミロイドベータペプチドレベルを含む有効性の指標を観察する細胞アッセイを含む。
本発明の別の態様は、認識機能障害に苦しんでいる又は該病気に感受性の高い対象に対して、アミロイドベータ前駆体のプロセシングを阻害するのに効果的な量のＧＰＣＲ拮抗薬（antagonist）又は逆作動薬（inverse agonist）を含む医薬組成物を投与することによって、認識機能障害を伴う病気又は該病気に対する感受性を治療又は予防する方法である。
【００１０】
本発明のさらなる態様は、前記方法での使用用途の医薬組成物であり、ここで当該阻害剤はアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）からなる群から選択されるポリペプチドを含み、当該作用物質は、配列番号：４〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする天然のポリペプチド配列に相補的な、又は該配列から設計された核酸配列を含む。
【００１１】
本発明の別のさらなる態様は、医薬として許容し得るキャリアーとの混合物中で、アミロイドベータ前駆体のプロセシング阻害するのに治療的に有効な量のＧＰＣＲ拮抗薬又は逆作動薬、若しくは医薬として許容し得る塩、水和物、溶媒和物、又はそれらのプロドラッグを含む医薬組成物である。本ポリヌクレオチド、及びＧＰＣＲ拮抗薬並びに逆作動薬化合物はまた、アルツハイマー病の治療用薬物の製造において有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
下記の用語は、以下に示された意味を有することが意図され、また本発明の記述及び意図された範囲を理解することにおいて有用である。
（定義）
用語「作動薬（agonist）」は、作動薬が結合する受容体の細胞内反応を活性化させるリガンドをさす。
【００１３】
用語「アミロイドベータペプチド」は、アミロイドベータ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）からプロセシングされたアミロイドベータペプチドを意味する。最も一般的なペプチドは、アミロイドベータペプチド１〜４０、１〜４２、１１〜４０及び１１〜４２を含む。他の種の、より一般的でないアミロイドベータペプチドはｙ−４２として記述され、このときｙは２〜１７で変動し、かつ１−ｘにおいてｘは２４〜３９から４１の間で変動する。
用語「拮抗薬」は、作動薬と同じ部位で受容体に競合的に結合するが、該受容体の活性形態によって開始される細胞内反応を活性化させない部分を意味し、それによって作動薬による細胞内反応を阻害することができる。拮抗薬は、作動薬又は部分的作動薬の不在下で、細胞内反応のベースラインを減少させない。
【００１４】
用語「キャリアー」は、溶剤、容積及び／又は使用可能な形態の医薬組成物を提供するための医薬組成物の製剤において使用される非毒性物質を意味する。キャリアーは、賦形剤、安定剤又は水性のｐＨ緩衝液などの１以上のそのような物質を含んでもよい。生理的に許容可能なキャリアーの例は、リン酸、クエン酸及び他の有機酸を含む、水性又は固形緩衝成分；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む、単糖、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール、又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【００１５】
用語「化合物」は、本明細書において本発明のアッセイに関連して記述される「テスト化合物」又は「薬剤候補化合物」の文脈で用いられる。そのようなものとして、これらの化合物は合成的に得られたか又は天然資源に由来する、有機若しくは無機化合物を含む。該化合物は、比較的低分子量として特徴付けられたポリヌクレオチド、脂質又はホルモン類似物質などの、無機又は有機化合物を含む。他の生体高分子有機テスト化合物は、約２〜約４０アミノ酸からなるペプチド、及び抗体又は抗体複合体などの約４０〜約５００アミノ酸を含むより大きなペプチドを含む。
【００１６】
用語「構成的受容体活性」は、その内因性リガンド又はその化学的同等物を用いた受容体の結合以外の手段による、活性状態における受容体の安定化を意味する。
用語「接触（contact）」又は「接触すること（contacting）」は、インビトロ（in vitro）システム内又はインビボ（in vivo）システム内を問わず、少なくとも２つの部分を１つに合わせることを意味する。
用語「病気（condition）」又は「疾患（disease）」は、症状の明白な表出（すなわち、疾病（illness））若しくは異常な臨床指標の表出（例えば、生化学的指標）を意味し、あるアミロイドベータタンパク質前駆体プロセシングの欠陥に起因する。あるいは、用語「疾患」は、そのような症状又は異常な臨床指標を発現する遺伝的危険性又は環境的危険性若しくは傾向に関連する。
【００１７】
用語「内因性（endogenous）」は、哺乳動物が自然に産生する物質を意味するものとする。例えば、限定されないが、用語「受容体」に関する内因性は、哺乳動物（例えば、限定されないが、ヒト）又はウイルスによって自然に産生されるものを意味するものとする。対照的に、この文脈における用語「非内因性（non-endogenous）」は、哺乳動物（例えば、限定されないが、ヒト）、又はウイルスによって自然に産生されないものを意味するものとする。例えば、限定されないが、その内因性形態では構成的に活性ではないが、操作された場合に構成的に活性になる受容体は、本明細書で最も好ましくは「非内因性、構成的に活性化された受容体」と呼ばれる。両方の用語を使用して、「インビボ」及び「インビトロ」システムの両方を記載することができる。例えば、限定されないが、スクリーニングアプローチにおいて、内因性又は非内因性受容体は、インビトロスクリーニングシステムに関連するかもしれない。さらなる例としては、限定されないが、哺乳動物のゲノムが非内因性の構成的に活性化された受容体を含むように操作された場合、インビボシステムの手段による候補化合物のスクリーニングは実行可能である。
【００１８】
用語「発現」は、内因性発現及び形質導入による過剰発現の両方を含む。
用語「発現性核酸」は、タンパク質分子、ＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子をコードする核酸を意味する。
用語「ハイブリダイゼーション」は、それによって核酸の鎖が塩基対を介して相補鎖に結合する任意のプロセスを意味する。用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的塩基間での水素結合の形成の効力によって、２つの核酸配列間で形成される複合体をさす。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液中（例えば、C. sub. 0t又はR.sub.0t解析）で形成してもよく、又は溶液中に存在するある核酸配列と、固形支持体（例えば、紙、膜、フィルター、チップ、ピン、又はガラススライド、若しくは細胞又はそれらの核酸が固定される任意の他の適切な基質）上に固定された別の核酸配列との間で形成してもよい。用語「厳しい条件（stringent condition）」は、ポリヌクレオチドと本特許請求の範囲に記載されたポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションを可能にする条件をさす。厳しい条件は、塩濃度、有機溶媒、例えばホルムアミドの濃度、温度、及び当業者に周知の他の条件によって定義され得る。特に、塩濃度を減少させること、ホルムアミド濃度を増加させること又はハイブリダイゼーション温度を上げることは、厳しさを増加させ得る。
【００１９】
用語「反応」に関連して、用語「阻害（inhibit）」又は「阻害すること（inhibiting）」は、化合物の不在とは反対に、化合物の存在下で反応が減少させられる又は阻止させられることを意味する。
用語「逆作動薬」は、受容体の内因性形態に結合する部分を意味し、内因性リガンド又は作動薬、若しくは膜へのＧＴＰの結合の減少の不在下で観察される通常の基準レベルの活性以下で、受容体の活性型内因性形態によって開始される基準細胞内反応を阻害する。好ましくは、該基準細胞内反応は、逆作動薬の不在下における基準反応に比較して、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、及び最も好ましくは少なくとも７５％が逆作動薬の存在下で減少させられる。
【００２０】
用語「リガンド」は、内因性の、天然の受容体に特異的な、内因性の天然分子を意味する。
本明細書で用いられているように、用語「医薬として許容し得るプロドラッグ」は、本発明において有用な化合物のプロドラッグを意味し、これは健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、妥当な利益／危険性比率に相応なアレルギー反応を有する患者の組織と接触する使用に適しており、かつ本発明の化合物のそれらの使用目的に対して効果的である。用語「プロドラッグ」は、本発明、又はその医薬として許容し得る塩、水和物、又は溶媒和物において有用な、効果的な化合物を生じさせるために、インビボで形質転換された化合物を意味する。形質転換は、血中での加水分解を介するなどの、様々な機構によって発生することがある。代謝的に切断可能な基を有する化合物は、代謝的に切断可能な基の存在の特性によって、親化合物に与えられた促進された可溶性及び／又は吸収速度の結果として生体利用効率の向上が示されることがあり、それゆえそのような化合物はプロドラッグとして機能するので有利である。徹底した議論は、『プロドラッグのデザイン』、H. Bundgaard編, Elsevier (1985)；『酵素学の方法』、 K. Widderら編, Academic Press, 42, 309-396 (1985)；『ドラッグデザイン及び開発のテキストブック』、Krogsgaard-Larsen 及びH. Bandaged編、５章；『プロドラッグのデザイン及び応用』113-191 (1991)；『上級薬剤送達概説』, H. Bundgard, 8 , 1-38, (1992)；J. Pharm. Sci, 77,285 (1988) ；Chem. Pharm. Bull., N. Nakeyaらの論文, 32, 692 (1984)；『新規デリバリーシステムとしてのプロドラッグ』、T. Higuchi及びV. Stella, 14 A.C.S. Symposium Series；及び『ドラッグデザインにおける生体可逆性キャリアー』、E. B. Roche編, American Pharmaceutical Association 及びPergamon Press, 1987において提供され、これらは引用によって本明細書に組み込まれる。プロドラッグの例は、エステルプロドラッグである。「エステルプロドラッグ」は、本発明に従って、代謝的手段（例えば、加水分解によって）によって、インビボで阻害化合物に変換可能な化合物を意味する。例えば、カルボキシ基を含む化合物のエステルプロドラッグはインビボでの加水分解によって、対応するカルボキシ基へと変換されてもよい。
【００２１】
用語「医薬として許容し得る塩」は、本発明の化合物の非毒性、無機及び有機酸付加塩並びに塩基付加塩をさす。これらの塩は、本発明において有用な化合物の最終的な単離及び精製の間に、インサイチュウで調製され得る。
用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖又は二本鎖形態の、かつセンス又はアンチセンス方向のポリ核酸、厳しい条件下において特定のポリ核酸にハイブリダイズする相補的ポリ核酸、及びその塩基対の少なくとも約６０パーセント、及びより好ましくはその塩基対の７０％が共通であり、最も好ましくは９０パーセント、及び特別な実施態様ではその塩基対の１００パーセントで相同であるポリヌクレオチドを意味する。該ポリヌクレオチドは、ポリリボ核酸、ポリデオキシリボ核酸及びそれらの合成類似物を含む。該ポリヌクレオチドは、約１０〜約５０００塩基、好ましくは約１００〜約４０００塩基、より好ましくは約２５０〜約２５００塩基の範囲の長さで変化する配列によって記載される。好ましいポリヌクレオチドの実施態様は約１０〜約３０塩基の長さを含む。ポリヌクレオチドの特別な実施態様は、約１０〜約２２ヌクレオチドのポリリボ核酸であり、より一般的には低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として記載される。別の特別な実施態様は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ポリシロキサン、及び２´−Ｏ−（２−メトキシ）エチルフォスフォロチオエートなどの修飾された骨格を有する核酸であり、又は非天然の核酸残基、若しくはメチル、チオ、硫酸、ベンゾイル、フェニル、アミノ、プロピル、クロロ及びメタノカルバヌクレオシドなどの１以上の核酸置換基、又はその検出を促進するためのレポーター分子を含む。
【００２２】
用語「ポリペプチド」は、タンパク質、タンパク性分子、（キナーゼ、プロテアーゼ、ＧＰＣＲなどの）タンパク質の一部分、ペプチド及びオリゴペプチドに関連する。
用語「溶媒和物」は、１以上の溶媒分子を有する、本発明において有用な化合物の物理的結合を意味する。この物理的結合は水素結合を含む。特定の例において溶媒和物は、例えば、１以上の溶媒分子が結晶性固体の結晶格子に組み込まれた場合に単離可能であろう。「溶媒和物」は、液相、及び単離可能な溶媒和物の両方を含む。代表的な溶媒和物は、水和物、エタノレート及びメタノレートを含む。
【００２３】
用語「対象」は、ヒト及び他の哺乳動物を含む。
用語「有効量」又は「治療的に効果的な量」は、医師又は他の臨床医によって探求される対象の生物学的若しくは医学的反応を誘導するであろう化合物の量又は作用物質の量を意味する。特に、神経疾患の治療に関して、用語「有効量」は対象の脳組織中の、アミロイドベータペプチドのレベルの生物学的に有意な減少を引き起こすであろう化合物又は作用物質において、効果的にアミロイドベータ前駆体プロセシングを阻害する量を意味することを意図する。
【００２４】
用語「治療すること（treating）」は、その病状の進行を防ぐ又は病状を変化させる意図をもって実行される介入を意味し、それによってそうした障害又は病気の１以上の症状を含む障害、疾患又は病気を緩和させる。したがって、「治療すること」は、治療的処置、及び予防又は再発防止策の両方をさす。治療が必要な人々は、疾患が予防されている人々同様、その疾患にすでに罹っている人々も含む。本明細書で使用されているように、関連した用語「治療（treatment）」は、用語「治療すること」が先に定義したように、障害、症状、疾患又は病気を治療する行為をさす。
本発明の発見の背景は、以下において手短に記載される。
【００２５】
（Ｇタンパク質共役受容体の背景）
１９９４年にMarcheseとその同僚は、ＧＰＲ３遺伝子（Marcheseらの文献、1994）をクローニングし、１年後に、単一エキソンが３３０アミノ酸を有するこの受容体タンパク質をコードすることが見出され、アデニル酸シクラーゼ構成的活性化因子（ＡＣＣＡ）と呼ばれた。そのアミノ酸配列に基づいて、ＧＰＲ３を、ＧＰＲ６及びＧＰＲ１２と同じサブファミリーに分類することができた：ＧＰＲ３とＧＰＲ６は５８％の同一性、及びＧＰＲ３とＧＰＲ１２は５７％の同一性を示す（図５）。
【００２６】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は共通の構造モチーフを共有する。全てのこれらの受容体は、それぞれが７個の膜貫通ドメインを形成して膜を貫通する７個のアルファへリックスを形成する２２〜２４個の疎水性アミノ酸の７個の配列、細胞外Ｎ末端、及び細胞内Ｃ末端を有する。該膜貫通へリックスは、膜の細胞外側上の４番目から５番目の膜貫通ヘリックスの間のより大きなループを有するアミノ酸の鎖によって連結される。主に親水性アミノ酸で構成される別の大きなループは、膜の細胞内側上の膜貫通ヘリックス５及び６に連結する。図１Ｂを参照されたい。
【００２７】
生理的条件下において、ＧＰＣＲは２つの異なる状態又は立体構造：「不活性」状態及び「活性」状態の間で、平衡に細胞膜内に存在する。不活性状態の受容体は、細胞内変換経路に繋がり、生物学的反応を生じさせることはできない。活性化状態への受容体立体構造の変化は変換経路への繋がりを可能にし、生物学的反応を生じさせる。受容体は、内因性リガンド又は外因性作動薬リガンドによって、活性状態に安定化されることもある。最近の発見である該受容体のアミノ酸配列への修飾（それだけに限定されない）は、該活性状態立体構造を安定化させるためのリガンド以外の代替機構を提供している。これらのアプローチは、受容体に結合するリガンドの効果を刺激することによって、受容体を活性化状態に効率的に安定化させる。そのようなリガンド独立的アプローチによる安定化は「構成的受容体活性化」と称される。
【００２８】
ＧＰＣＲによって活性化される主要なシグナル変換カスケードは、３つの異なるタンパク質；Ｇα、Ｇβ及びＧγサブユニットから構成されるヘテロ三量体Ｇタンパク質の活性化によって開始される。カルボキシ末端同様、ヘリックス５及び６に連結しているループはＧタンパク質と相互作用していると考えられる。Uhlenbrockと同僚は（2002）、ＧＰＲ３、ＧＰＲ６及びＧＰＲ１２の全てが、Ｇ（ａ）（ｓ）及びＧ（ａ）（ｉ／ｏ）の構成的活性化を与えることを示し、かつ、最近、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）及びジヒドロスフィンゴシン−１−リン酸（ＤＨＳ１Ｐ）は、ＧＰＲ３、ＧＰＲ６及びＧＰＲ１２に対する生物活性の脂質リガンドとして同定された（Uhlenbrockらの論文、2002）。該ＧＰＲ３、ＧＰＲ６及びＧＰＲ１２の発現プロファイルもまた同様である：それらは全て脳組織において一次発現している。
【００２９】
シグナル変換カスケードは作動薬による受容体の活性化と共に開始する。該受容体における変形的変化はそれからＧタンパク質へと移行される。Ｇタンパク質は、Ｇα及びＧβγサブユニットへと解離する。両方のサブユニットは、該受容体から解離し、両方とも異なる細胞性反応を開始することができる。最もよく知られているのは、Ｇαサブユニットによって開始される細胞性効果である。Ｇタンパク質が、それらのＧαサブユニットによって分類されるのはこの理由による。Ｇタンパク質は、Ｇｓ、Ｇｉ／ｏ、Ｇｑ及びＧ１２／１３の４つのグループに分けられる。 これらのＧタンパク質のそれぞれは、エフェクタータンパク質を活性化させることができ、細胞内の二次メッセンジャーの変化をもたらす。二次メッセンジャーのレベル変化は、細胞を特定様式の細胞外シグナルに応答させる引き金である。ＧＰＣＲの活性は、二次メッセンジャーの活性レベルを測定することによって測定され得る。
【００３０】
細胞における２つの最も重要な二次メッセンジャーは、ｃＡＭＰ、及びＣａ２＋である。Ｇタンパク質のＧｓクラスのαサブユニットはアデニル酸シクラーゼを活性化することができ、ＡＴＰからｃＡＭＰへの代謝回転の増加をもたらす。Ｇｉ／ｏＧタンパク質のαサブユニットは正反対のことを行い、アデニル酸シクラーゼ活性を阻害し、細胞のｃＡＭＰレベルの減少をもたらす。これら２つのクラスのＧタンパク質は共に、二次メッセンジャーｃＡＭＰを制御する。Ｃａ２＋は、Ｇタンパク質のＧｑクラスのαサブユニットによって制御される。フォスフォリパーゼＣの活性化を介して、細胞膜からのフォスファチジルイノシトール４，５−ビスフォスフェート（ＰＩＰ２）は、イノシトール１，４，５−トリフォスフェート及び１，２−ジアシルグリセロールに加水分解され、これらの分子の両方は二次メッセンジャーとして作用する。イノシトール１，４，５−トリフォスフェートは、小胞体において特定の受容体と結合し、Ｃａ２＋チャネルの開口、そして細胞質内でのＣａ２＋の放出をもたらす。
【００３１】
ＧＰＣＲに与えられた機能は明らかではない。ＧＰＲ３及びＧＰＲ１２の発現レベルは、せん断応力後のヒト臍帯静脈内皮細胞において上昇する（Uhlenbrockらの文献、2003）。スフィンゴシン−１−リン酸は、ＧＰＲ３及びＧＰＲ１２に対するリガンドなので、上記データはヒト内皮細胞において、スフィンゴシン−１−リン酸介在性細胞内シグナリングにおける両方のＧＰＣＲの役割を示唆する。またＧＰＲ３及びＧＰＲ６の発現は、齧歯動物肥満モデルにおいて異なった制御をされることから、両方のＧＰＣＲ（＋ＧＰＲ２）は、食欲、空腹感、及び満腹感の制御における、潜在的薬剤標的として考えられる。一方、ＧＰＲ１２は、有糸分裂後ニューロンの分化及び成熟化に関与しているように見受けられる（Ignatovらの文献、2003）。
【００３２】
（参考文献）
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Wess, J. の論文(1998). 『受容体／Ｇタンパク質共役選択性の分子基盤』Pharmacol Ther 80(3): 231-64.
【００３３】
（ＧＰＣＲとアミロイドベータペプチドとの関連性に基づいた本出願人の発明）
先に記載されたように、本発明は、Ｇタンパク質共役受容体（「ＧＰＣＲ」）が、哺乳動物、及び基本的には神経細胞におけるアミロイドベータ前駆体プロセシングの上方調節及び／又は誘導における因子であること、並びにそのようなポリペプチドの機能の抑制はアミロイドベータタンパク質ペプチドのレベルを減少させることに効果的であるという、本発明者の発見に基づいている。
【００３４】
本発明者は、ＧＰＣＲ、及びより特異的にはＧＰＲ３、並びにアミロイドベータペプチド形成及び分泌を関連づける予備知識を何も持たない。以下の実験の項においてより詳細に議論されるように、本発明者は、ＧＰＲ３の過剰発現は形質導入細胞の馴化培地におけるアミロイドベータ１〜４２を増加させ、そしてＧＰＲ３のノックダウンは減少させることを示す。ＧＰＲ３、ＧＰＲ６及びＧＰＲ１２の優勢な発現は中枢神経系の組織内であるので、本発明はこれらの知見、及びＧＰＣＲがアルツハイマー病に対する推定上の薬剤標的であるという認識に基づいている。
【００３５】
本発明のある態様は、哺乳動物細胞におけるアミロイドベータ前駆体タンパク質のプロセシングを阻害する化合物を同定するための上記の発見に基づいた方法であり、それゆえ対象におけるアミロイドベータペプチドレベルを減少させることに有用であるかもしれない。本方法は、薬剤候補化合物をＧＰＣＲポリペプチド又は前記ポリペプチドのフラグメントに接触させること、及びアミロイドベータタンパク質の産生に関連する化合物−ポリペプチド特性を測定することを含む。「化合物−ポリペプチド特性」は、一般的な当業者によって選択される測定可能な現象であり、かつＧＰＣＲの活性化及び不活化は、アミロイドベータタンパク質前駆体プロセシングのそれぞれ活性化及び不活化、並びにアミロイドベータペプチドレベルのそれぞれ増加及び減少における原因因子であるという認識に基づいている。該測定可能な特性は、ＧＰＣＲポリペプチドのペプチドドメインに対する結合親和性から、ＧＰＣＲの活性化又は不活化から生じる多くの『二次メッセンジャー』の任意の１つのレベル、上記の二次メッセンジャーに直接結合したレポーター分子の特性、及び最終的には該化合物に接触した哺乳動物細胞によって分泌されたアミロイドベータペプチドのレベルにまで及ぶこともある。
【００３６】
当業者の選択によっては、本アッセイ方法を一連の測定として機能するためにデザインしてもよく、各測定を、薬物候補化合物がアミロイドベータペプチド経路に対するＧＰＣＲ上で実際に作用しているかどうかを決定するためにデザインした。例えば、ＧＰＣＲ又はそのフラグメントに対する化合物の結合親和性を測定するためにデザインされたアッセイは、テスト化合物が対象に投与された場合にアミロイドベータペプチドレベルを減少させるのに有用であるかどうかを確定させるために必要であるかもしれないが、十分ではない。それにもかかわらず、そのような結合の情報は、異なる特性、さらに下流の生化学的経路を測定する検査における使用のためのテスト化合物のセットを同定することに有用であるかもしれない。そのような二番目のアッセイをデザインして、ＧＰＣＲペプチドへの結合親和性を有するテスト化合物が、哺乳動物細胞において、作動薬又は逆作動薬としてＧＰＣＲ機能を実際に下方調節又は阻害することを確認してもよい。このさらなるアッセイで、ＧＰＣＲの活性化又は不活化の直接的な結果である二次メッセンジャー、若しくは二次メッセンジャーに応答する合成レポーターシステムを測定してもよい。異なる二次メッセンジャーを測定すること、及び／又はアッセイシステム自体が直接的に影響されずかつＧＰＣＲ経路ではないことを確認することは、おそらくさらに該アッセイの正当性を立証するであろう。後者の事項において、適切なコントロールを常に行い、擬陽性の解釈を防ぐ手段をとるべきである。
【００３７】
これらの測定を行う順番は本発明の実行に極めて重要であるとは考えられないので、これは任意の順番で実行されてよい。例えば、化合物のＧＰＣＲへの結合親和性についての情報が知られていない化合物セットのスクリーニングアッセイが最初に実行してもよい。あるいは、ＧＰＣＲペプチドドメインに対して結合親和性を有するものとして同定された化合物、又はＧＰＣＲの作動薬又は逆作動薬であるとして同定された化合物のクラスのセットをスクリーニングしてもよい。ＧＰＣＲポリペプチドの膜内ドメインでの可能な化合物相互作用のためにＧＰＣＲに対する結合親和性を知ることは必須ではなく、そのドメイン立体構造を親和性実験において再現することができなくてもよい。しかしながら、本アッセイが薬物候補化合物の最終的な使用に有意であるために、二次メッセンジャー又は最終的なアミロイドベータペプチドレベルの測定は必要である。コントロール及びＧＰＣＲへの結合親和性の測定を含む検証実験はそれでもなお、全ての治療的又は診断的用途において有用な化合物を同定することにおいて有用である。
【００３８】
本アッセイ方法は、１以上のＧＰＣＲタンパク質又はそれらのフラグメント若しくはＧＰＣＲポリペプチドを過剰発現するベクターを用いて形質導入された細胞から作られた膜画分を用いて、インビトロで実行してもよい。ＧＰＣＲのアミノ酸配列及びそれらの有用なフラグメントは、配列番号：４〜６、２８９〜３３３において見出される。ポリペプチドと化合物との結合親和性は、表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Biacore）、標識された化合物を用いた飽和結合解析（例えば、Scatchard及びLindmo解析）、微分紫外分光光度計、蛍光偏光アッセイ、蛍光分析イメージングプレートリーダー（FLIPR（登録商標））システム、蛍光共鳴エネルギー転移、及び生物発光共鳴エネルギー転移の使用などの当業者に既知の方法によって測定され得る。化合物の結合親和性はまた、解離定数（Ｋｄ）又はＩＣ５０若しくはＥＣ５０で表現され得る。ＩＣ５０は、別のリガンドのポリペプチドへの結合の５０％阻害に対して必要とされる化合物の濃度を表す。ＥＣ５０は、受容体機能を測定する任意のアッセイにおいて最大効果の５０％を獲得するために必要とされる濃度を表す。解離定数Ｋｄは、リガンドがポリペプチドにどのくらい結合しているかの測定であって、ポリペプチド上の結合部位のちょうど半分を飽和させるために必要とされるリガンド濃度に等しい。高親和性結合を有する化合物は、低いＫｄ、低いＩＣ５０値、及び低いＥＣ５０値、すなわち１００ｎＭから１ｐＭの範囲を有しており；中程度から低親和性結合は、高いＫｄ，高いＩＣ５０値、及び高いＥＣ５０値、すなわちマイクロモラーの範囲に関連する。
【００３９】
本アッセイ方法はまた細胞アッセイにおいて実施してもよく、ＧＰＣＲポリペプチドを発現している宿主細胞は、ポリペプチドの内因性発現を有する細胞又は例えば形質導入によってポリペプチドを過剰発現している細胞であり得る。ポリペプチドの内因性発現が容易に測定し得るベースラインを決定するのに十分でない場合、ＧＰＣＲを過剰発現する宿主細胞を使用してもよい。過剰発現は、二次メッセンジャーのレベルが内因性発現による活性レベルよりも高いという利点を有する。したがって、現在利用可能な技術を用いてそのようなレベルを測定することはより容易である。そのような細胞アッセイにおいて、サイクリックＡＭＰ、又はＣａ２＋、サイクリックＧＭＰ、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）及び／又はジアシルグリセロール（ＤＡＧ）などの二次メッセンジャーを使用してＧＰＣＲの生物学的活性を測定してもよい。サイクリックＡＭＰ、又はＣａ２＋は、測定するのに好ましい二次メッセンジャーである。二次メッセンジャーの活性化は以下に議論される、ＥＬＩＳＡ又は放射性テクノロジーによって直接的に、若しくはレポーター遺伝子解析によって間接的にのいずれかの、いくつかの異なる技術によって測定してもよい。好ましくは、該方法はさらに、ベースラインレベルを決定する前に該宿主細胞をＧＰＣＲに対する作動薬に接触させることを含む。作動薬の添加はさらにＧＰＣＲを刺激し、それによってさらに二次メッセンジャーの活性レベルが増加する。いくつかのそのような作動薬（リガンド）は当業者に既知であり；好ましくは、スフィンゴシン−１−リン酸又はジヒドロスフィンゴシン−１−リン酸である。ＧＰＣＲポリペプチド、過剰発現、又は活性化された場合、分泌されたアミロイドベータペプチドのレベル。
【００４０】
本発明はさらに、哺乳動物細胞におけるアミロイドベータ前駆体タンパク質のプロセシングを阻害する化合物を同定するための方法に関連し：
（ａ）化合物を配列番号：４〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに接触させること、
（ｂ）該化合物の該ポリペプチドに対する結合親和性を決定すること、
（ｃ）該化合物を発現している哺乳動物細胞の集団を、少なくとも１０マイクロモラーの結合親和性を示す化合物と接触させること、及び
（ｄ）哺乳動物細胞内で、アミロイドベータ前駆体タンパク質のプロセシングを阻害する化合物を同定することを含む。
【００４１】
本発明のさらなる実施態様は、細胞におけるアミロイドベータ前駆体タンパク質のプロセシングを阻害する化合物を同定するための方法に関連し、ここでＧＰＣＲポリペプチドの活性レベルは、１以上の二次メッセンジャーのレベルを決定するために測定され、このとき一次又は二次メッセンジャーは、該二次メッセンジャーに応答するプロモータによって制御されるレポーターを用いて決定される。該レポーターは、二次メッセンジャーの細胞レベルに応答するプロモータの制御下のレポーター遺伝子である。そのような好ましい二次メッセンジャーは、サイクリックＡＭＰ、又はＣａ２＋である。レポーター遺伝子は容易に検出される遺伝子産物を有するべきであり、当該宿主細胞内に安定的に感染されてもよい。そのような方法は任意の当業者に周知である。
【００４２】
レポーター遺伝子は、数あるなかでも、アルカリフォスファターゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、不安定化緑色蛍光タンパク質（ｄＧＦＰ）、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼから選択されてよい。レポーターはすぐに利用可能であり、かつ広い範囲にわたって測定することが容易なルシフェラーゼ又はベータガラクトシダーゼが好ましい。レポーター構築におけるプロモータは、サイクリックＡＭＰ応答性プロモータ、ＮＦ−ＫＢ応答性プロモータ又はＮＦ−ＡＴ応答性プロモータが好ましい。サイクリックＡＭＰ応答性プロモータは、当該細胞内において、サイクリックＡＭＰのレベルに応答する。ＮＦ−ＡＴ応答性プロモータは、当該細胞内の細胞質Ｃａ２＋レベルに感受性である。ＮＦ−ＫＢ応答性プロモータは、当該細胞内の活性化されたＮＦ−κＢレベルに対して感受性である。
【００４３】
本発明のさらなる実施態様は、細胞内でアミロイドベータ前駆体タンパク質のプロセシングを阻害する化合物を同定するための方法に関連し、このときＧＰＣＲポリペプチドの活性レベルはアミロイドベータペプチドのレベルを決定することによって測定される。これらのペプチドのレベルは、異なるアミロイドベータペプチド種を特異的に認識する抗体を用いた特異的ＥＬＩＳＡを用いて測定してもよい（例えば、実施例１を参照されたい）。様々なアミロイドベータペプチドの分泌はまた、全てのペプチドに結合する抗体を用いて測定してもよい。アミロイドベータペプチドのレベルはまた、質量分析解析によって測定され得る。
【００４４】
ハイスループットを目的とするために、化合物のライブラリーは抗体フラグメントライブラリー、ペプチドファージディスプレーライブラリー、ペプチドライブラリー（例えば、ＬＯＰＡＰ（商標）、Sigma Aldrich社）、脂質ライブラリー（BioMol社）、合成化合物ライブラリー（例えば、ＬＯＰＡＣ（商標）、Sigma Aldrich社）又は天然化合物ライブラリー（Specs, TimTec社）などを使用してもよい。
【００４５】
好ましい薬剤候補化合物は低分子量化合物である。低分子量化合物、すなわち５００ダルトン以下の分子量を有する化合物は、生物学的システムにおいて優れた吸収能及び浸透能を有する可能性が高く、結果として５００ダルトンより上の分子量を有する化合物よりも良好な薬剤候補である可能性がより高い（Lipinskiらの文献(1997)）。ペプチドは既知のＧＰＣＲ拮抗薬であるので、ペプチドは薬剤候補化合物の別の好ましいクラスを含む。おそらくペプチドはすばらしい薬剤候補であり、また稔性ホルモン及び血小板凝集阻害剤などの商業的に価値のあるペプチドの複数の例がある。天然の化合物は薬剤候補化合物の別の好ましいクラスである。そのような化合物は天然資源に見出され、天然資源から抽出され、その後合成されることもある。脂質は薬剤候補化合物の別の好ましいクラスである。脂質は表２にリスト化されているＧＰＣＲの拮抗薬でもよい（配列番号：１〜３、４〜６）。
【００４６】
薬剤候補化合物の別の好ましいクラスは抗体である。本発明はまた、ＧＰＣＲの細胞外ドメインに対して指示される抗体を提供する。これらの抗体は、ＧＰＣＲの１以上の細胞外ドメインに特異的に結合すべきであり、あるいは後に更に記載されるように内因性的に産生され、細胞内ＧＰＣＲドメインに結合するよう設計されるべきである。これらの抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってよい。本発明は、ＦＡｂフラグメント並びにＦＡｂ発現ライブラリーの産物、及びＦｖフラグメント並びにＦｖ発現ライブラリーの産物のみならず、キメラ抗体、一本鎖抗体及びヒト化抗体を含む。
【００４７】
特定の実施態様において、ポリクローナル抗体を本発明の実践において使用してもよい。当業者はポリクローナル抗体の調製方法を知っている。ポリクローナル抗体は、例えば、１以上の免疫剤及び所望ならばアジュバントの注射によって、哺乳動物内で抗体価を上げることができる。典型的には、免疫剤及び／又はアジュバントは、複数回の皮下又は腹腔内注射によって哺乳動物内へ注入される。抗体はまた、無傷のＧＰＣＲタンパク質又はポリペプチド若しくは細胞外ドメインペプチドなどのフラグメント、複合体を含む誘導体、又はＧＰＣＲタンパク質の他のエピトープ若しくは細胞膜に埋め込まれたＧＰＣＲなどのポリペプチド、又はファージディスプレーライブラリーなどの抗体可変領域のライブラリーに対して生成されることもある。
【００４８】
免疫された動物において免疫原性であることが知られているタンパク質に免疫剤を共役させることは有用である可能性がある。そのような免疫原性タンパク質の例は、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン及びダイズトリプシン阻害因子を含むがこれらに限定されない。使用されてもよいアジュバントの例は、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノフォスフォリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート）を含む。不適切な実験をしていない当業者は免疫プロトコールを選択することもある。
【００４９】
いくつかの実施態様において、抗体はモノクローナル抗体であってよい。モノクローナル抗体を当業者に周知の方法を使用して調製してもよい。本発明のモノクローナル抗体を「ヒト化」して、当該宿主を該抗体への免疫反応の高まりから保護してもよい。「ヒト化抗体」は、分子レベルで、相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び／又は軽鎖並びに／若しくは重鎖可変領域構造の他の部分がヒト以外の免疫グロブリンに由来するが、当該分子の残りの部分は１以上のヒト免疫グロブリンに由来する抗体である。またヒト化抗体は、ドナー又はアクセプターに関連するヒト化重鎖、修飾されていない軽鎖又はキメラ軽鎖によって特徴付けられる抗体を含み、或いはそれらの特徴を持つ抗体がヒト化抗体を含む。抗体のヒト化は当業者に周知の方法によって達成してもよい（例えば、Mark及びPadlanらの文献, (1994) 「４章．モノクローナル抗体のヒト化」『実験薬理学のハンドブック 第１１３巻』, Springer- Verlag, New Yorkを参照されたい）。トランスジェニック動物を使用してヒト化抗体を発現してもよい。
【００５０】
ヒト抗体はまた当業者に既知の様々な方法を用いて産生することができ、ファージディスプレーライブラリーを含む（Hoogenboom及びWinterの論文, (1991) J. MoI. Biol. 227:381- 8; Marksらの論文 (1991). J. MoI. Biol. 222:581-97）。Coleら、及びBoernerらの技術もまたヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である（Coleらの文献(1985) 『モノクローナル抗体及びガン治療』, Alan R. Liss, p. 77; Boernerらの論文 (1991). J. Immunol., 147(l):86-95）。
【００５１】
一本鎖抗体の産生用途の当業者に既知の技術は、ＧＰＣＲポリペプチド及び本発明のタンパク質に対する一本鎖抗体を産生するために適用され得る。一本鎖抗体は一価抗体であってよい。一価抗体の調製方法は当業者に既知である。例えばある方法は、免疫グロブリン軽鎖と修飾された重鎖の組換え発現を含む。該重鎖は、重鎖の交差結合を防ぐためにそのＦｃ領域内の任意の箇所で一般的に切り捨てられる。あるいは；関連するシステイン残基は、交差結合を防ぐために別のアミノ酸残基に置換されるか又は削除される。
【００５２】
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に、好ましくは細胞表面タンパク質又は受容体若しくは受容体サブユニットに特異的に結合するモノクローナル抗体、好ましくはヒトの又はヒト化モノクローナル抗体である。本事例において、結合特異性の１つはＧＰＣＲのある細胞外ドメインに対するものであり、他の１つは同じ又は異なるＧＰＣＲの別の細胞外ドメインに対するものである。
【００５３】
二重特異性抗体の作成方法は当業者に既知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え産生は２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現に基づいており、このとき当該２つの重鎖は異なる特異性を有する（Milstein及びCuelloの論文, (1983) Nature 305:537-9）。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の無作為の組み合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を産生し、そのうちの１種だけが正しい二重特異性構造を有する。親和性クロマトグラフィーの段階は通常、正しい分子の精製を達成する。同様な手順は、Trauneekerらの論文(199I) EMBO J. 10:3655-9に開示されている。
【００５４】
別の好ましい実施態様に従って、アッセイ法はＧＰＣＲへの結合親和性を有するものとして同定された薬剤候補化合物、及び／又は１以上のＧＰＣＲに対する拮抗薬又は逆作動薬活性などの下方制御活性を有するものとしてすでに同定されている薬物候補化合物を使用することを含む。そのような化合物の例は米国特許第6,420,563号（WO 01/62765）に開示されるアリールオキシジチオウレアであり、そこで開示される活性逆作動薬については引用によって本明細書に組み込まれる。
【００５５】
本発明の別の態様は哺乳動物細胞におけるアミロイドベータ前駆体タンパク質プロセシングを減少させるための方法に関連し、哺乳動物細胞を、ＧＰＣＲポリペプチドをコードするポリリボヌクレオチドの該細胞内における翻訳を阻害する発現阻害剤と接触させることによることを含む。特定の実施態様は、発現阻害剤と標的ＧＰＣＲｍＲＮＡを対を形成して機能する、少なくとも１つのアンチセンス鎖を含むポリヌクレオチドを含む組成物に関連し、それによってＧＰＣＲポリペプチドの発現を下方調節又は阻止する。該発現阻害剤は、好ましくはアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み、前記発現阻害剤は配列番号：４〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする天然のポリヌクレオチド配列に相補的な、又は該配列から設計された核酸配列を含む。
【００５６】
本発明の特別な実施態様は、発現阻害剤が、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、配列番号：４〜６をコードするポリリボヌクレオチドを切断するリボザイム、ｓｉＲＮＡがＧＰＣＲポリリボヌクレオチドからＧＰＣＲポリペプチドへの翻訳を妨げるような配列番号４〜６に一致するポリリボヌクレオチドの一部分に十分に相同的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）からなる群から選択される方法に関連する。
【００５７】
本発明の別の実施態様は、発現阻害剤がアンチセンスＲＮＡを発現する核酸、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、配列番号：４〜６をコードするポリリボヌクレオチドを切断するリボザイム、ｓｉＲＮＡがＧＰＣＲポリリボヌクレオチドのＧＰＣＲポリペプチドへの翻訳を妨げるような配列番号４〜６に対応するポリリボヌクレオチドの一部分に対して十分に相同的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である方法に関連する。好ましくは、本発現阻害剤は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、又は配列番号：７〜２８７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡである。
【００５８】
アンチセンス核酸を用いた遺伝子発現の下方調節は、翻訳又は転写レベルで達成され得る。本発明のアンチセンス核酸は、好ましくは、ＧＰＣＲポリペプチド又は対応するメッセンジャーＲＮＡをコードする核酸の全て若しくは一部を用いて特異的にハイブリダイズすることができる核酸フラグメントである。さらにアンチセンス核酸はその一次転写産物のスプライシングを阻害することによって、ＧＰＣＲポリペプチドをコードすることができる核酸配列の発現を減少させるようにデザインされてもよい。任意の長さのアンチセンス配列は、ＧＰＣＲをコードする核酸の発現を下方調節又は阻止することができる限り本発明の実行に適する。好ましくは、アンチセンス配列は少なくとも約１７ヌクレオチドの長さである。アンチセンス核酸、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡの調製及び使用、並びにオリゴ及び遺伝的アンチセンスの使用は当業者に既知である。
【００５９】
発現阻害剤のある実施態様は、配列番号：１〜３を含む核酸に対してアンチセンスである核酸である。例えばアンチセンス核酸（例えば、ＤＮＡ）は、配列番号：１〜３を含む核酸の細胞性発現を阻害するための遺伝子治療として、インビトロで細胞内へ導入、又はインビボで対象に投与してもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは約１７〜約１００ヌクレオチドを含む配列を含み、より好ましくは該アンチセンスオリゴヌクレオチドは約１８〜約３０ヌクレオチドを含む。アンチセンス核酸は反対方向に発現する、配列番号：１〜３の該配列から選択される約１０〜約３０の連続したヌクレオチドから調製されてよい。
【００６０】
アンチセンス核酸は好ましくはオリゴヌクレオチドであり、デオキシリボヌクレオチド、修飾されたデオキシリボヌクレオチド又は両方のいくつかの組み合わせだけでなることもある。アンチセンス核酸は合成オリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドを、所望ならば安定性及び／又は選択性を向上させるために化学的に修飾してもよい。オリゴヌクレオチドは細胞内ヌクレアーゼによる分解に感受性であるため、修飾は、例えばフォスフォジエステル結合の遊離酸素原子を置換するための硫黄基の使用を含み得る。この修飾はフォスフォロチオエート結合と呼ばれる。フォスフォロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは水溶性、ポリアニオン性であり、かつ内因性ヌクレアーゼに耐性である。さらにフォスフォロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドがその標的部位にハイブリダイズした場合、ＲＮＡ−ＤＮＡ二量体はハイブリッド分子のｍＲＮＡ成分を切断する内因性酵素リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｈを活性化させる。
【００６１】
さらに、フォスフォアミダイト及びポリアミド（ペプチド）結合を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは合成され得る。これらの分子はヌクレアーゼ分解に対してかなり抵抗性であるべきである。さらに、糖部分の２´炭素、及びピリミジンの５炭素（Ｃ−５）に化学基を付加して安定性を増大させ、かつその標的部位へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合を促進することができる。修飾は当業者に既知の他の修飾と同様、２´−デオキシ、Ｏ−ペントキシ、Ｏ−プロポキシ、Ｏ−メトキシ、フルオロ、メトキシエトキシフォスフォロチオエート、修飾された塩基を含んでよい。
【００６２】
ＧＰＣＲのレベルを減少させる発現阻害薬剤の別のタイプは、リボザイムである。リボザイムは、個々の触媒及び基質結合ドメインを有する触媒ＲＮＡ分子（ＲＮＡ酵素）である。基質結合配列は、ヌクレオチドの相補性、及び場合によってはその標的配列との非水素結合相互作用によって結合する。触媒部位は特定の部位で標的ＲＮＡを切断する。リボザイムの基質ドメインを設計して、それを特定のｍＲＮＡ配列に指示することができる。リボザイムは認識し、それから相補的塩基対を介して標的ｍＲＮＡに結合する。いったん正しい標的部位に結合すると、リボザイムは酵素的に対象のｍＲＮＡを切断するために作用する。リボザイムによるｍＲＮＡの切断は、対応するポリペプチドの合成を指示するためのその能力を破壊する。いったんリボザイムがその標的配列を切断するとリボザイムは放出され、繰り返し結合し、他のｍＲＮＡを切断することが可能である。
【００６３】
リボザイムの形態は、ハンマーヘッドモチーフ、ヘアピンモチーフ、デルタ肝炎ウイルス、グループＩイントロン、又はＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列に関連して）モチーフ、若しくはアカパンカビＶＳ ＲＮＡモチーフを含む。ハンマーヘッド又はヘアピン構造を有するリボザイムは、これらの触媒ＲＮＡ分子が細胞内の真核生物プロモータから発現され得るので、容易に調製される（Chenらの論文(1992) Nucleic Acids Res. 20:4581-9）。本発明のリボザイムは適切なＤＮＡベクターから真核生物細胞内で発現され得る。所望ならば、リボザイムの活性を、２番目のリボザイムによる一次転写産物からのその放出によって増加させてもよい（Venturaらの論文(1993) Nucleic Acids Res. 21 :3249-55）。
【００６４】
リボザイムは、オリゴデオキシリボヌクレオチドを、転写後に標的ｍＲＮＡにハイブリダイズする配列の側面に位置するリボザイム触媒ドメイン（２０ヌクレオチド）に組み合わせることによって化学的に合成してもよい。オリゴデオキシリボヌクレオチドは、基質結合配列をプライマーとして用いることによって増幅される。増幅産物は、真核生物発現ベクター内にクローニングされる。
【００６５】
リボザイムは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はウイルスベクター内に挿入された転写単位から発現される。リボザイム配列の転写は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌＩ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）、又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）に対するプロモータから駆動される。ｐｏｌＩＩ又はｐｏｌＩＩＩプロモータからの転写産物は、全ての細胞において高レベルで発現されるであろう；所与の細胞型における所与のｐｏｌＩＩプロモータのレベルは、近隣の遺伝子制御配列次第であろう。該原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適切な細胞において発現される限り、原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモータもまた使用される（Gao及びHuangの論文, (1993) Nucleic Acids Res. 21:2867-72）。これらのプロモータから発現されたリボザイムは、哺乳動物細胞内で機能できることが示されている（Kashani-Sabetらの論文(1992) Antisense Res. Dev. 2:3-15）。
【００６６】
特に好ましい阻害剤は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。ｓｉＲＮＡは、抑制されたＲＮＡに配列が相同である二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）による遺伝子抑制の転写後プロセスを仲介する。本発明に従ったｓｉＲＮＡは、配列番号：１〜３に記載される配列からなる群から選択される連続した１７〜２５ヌクレオチド配列に相補的又は相同的な１７〜２５ヌクレオチドのセンス鎖、及び該センス鎖に相補的な１７〜２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含む。最も好ましいｓｉＲＮＡは、互いに及び標的ポリヌクレオチド配列に対して１００パーセント相補的であるセンス及びアンチセンス鎖を含む。好ましくは、ｓｉＲＮＡはさらにセンス鎖とアンチセンス鎖とを連結するループ領域を含む。
【００６７】
本発明に従った自己相補的一本鎖ｓｉＲＮＡ分子ポリヌクレオチドは、ループ領域リンカーによって連結されたセンス部分及びアンチセンス部分を含む。好ましくは、ループ領域配列は、４〜３０ヌクレオチド長、より好ましくは５〜１５ヌクレオチド長、及び最も好ましくは８ヌクレオチド長である。最も好ましい実施態様において、リンカー配列はUUGCUAUA（配列番号：２８８）である。自己相補的一本鎖ｓｉＲＮＡはヘアピンループを形成し、通常のｄｓＲＮＡよりもより安定である。さらにそれらはベクターからより容易に産生される。
【００６８】
sｉＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡに類似であるため、ｓｉＲＮＡを修飾して、核酸分解に対する抵抗性を確認する、又は活性を強化させる、若しくは細胞内分布を広げる、又は細胞内取り込みを増加させることができ、そのような修飾は、修飾されたヌクレオシド内結合、修飾された核酸塩基、修飾された糖、及び／又は１以上の成分若しくは結合体へのｓｉＲＮＡの化学的結合から構成されてもよい。ヌクレオチド配列は、これらのｓｉＲＮＡのデザイン規則に適合しないヌクレオチド配列に比較して、標的配列の減少を強化させるｓｉＲＮＡのデザイン規則に従って選択される（ｓｉＲＮＡの調製のこれらの規則及び実施例の議論について、２００４年１１月４日に公開されたWO2004094636、及びUA20030198627は引用によって本明細書に組み込まれる）。
【００６９】
また本発明は組成物及び前記組成物を使用する方法に関連し、アミロイドベータタンパク質前駆体プロセシングを阻害することができ、かつ発現阻害剤として先に記載されたポリヌクレオチドを発現することができる、ＤＮＡ発現ベクターを含む。
これらの組成物及び方法の特別な態様は、ＧＰＣＲポリペプチドに選択的に相互作用することができる細胞内結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの誘導された発現による、ＧＰＣＲポリペプチドの発現の下方調節又は阻止に関連する。細胞内結合タンパク質は、それが発現している細胞内でポリペプチドに選択的に相互作用又は結合し、かつ該ポリペプチドの機能を中和することができる任意のタンパク質を含む。好ましくは、細胞内結合タンパク質は配列番号：４〜６の該ＧＰＣＲポリペプチドの細胞内ドメインに結合親和性を有する中和抗体又は中和抗体のフラグメントである。より好ましくは、細胞内結合タンパク質は一本鎖抗体である。
【００７０】
この組成物の特別な実施態様は、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、配列番号：４〜６をコードするポリリボヌクレオチドを切断するリボザイム、及び、ｓｉＲＮＡがＧＰＣＲポリリボヌクレオチドからＧＰＣＲポリペプチドへの翻訳に干渉するように配列番号４〜６に一致するポリリボヌクレオチドの一部分に十分に相同である低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）からなる群から選択される発現阻害剤を含む。
【００７１】
該発現阻害剤を発現しているポリヌクレオチド、又は細胞内結合タンパク質をコードするものは、ベクター内に好ましく含まれる。ポリ核酸は核酸配列の発現を可能にするシグナルに人為的に連結され、いったんベクターが細胞内に導入されるとアンチセンス核酸を発現する組換えベクターコンストラクトを好ましく利用して細胞内へと導入される。アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ヘルペス単純ウイルス、又はセンダイウイルスのベクターシステムを含む、ウイルスに基づいた様々なシステムが利用可能であり、かつそれらの全てを使用して、標的細胞内で発現阻害剤に対するポリヌクレオチド配列を導入かつ発現させてもよい。
【００７２】
好ましくは、本発明の諸方法において使用されたウイルスベクターは複製欠損型である。そのような複製欠損型ベクターは通常、感染細胞におけるウイルスの複製に必要な少なくとも１つの領域を欠いている。これらの領域は当業者に既知の任意の技術によって（全体、又は一部分）削除されるか、又は非機能的にされるかのどちらかであり得る。これらの技術は、全体の削除、置換、部分的削除、又は（複製のために）不可欠な領域への１以上の塩基の付加を含む。そのような技術は、遺伝子操作技術の使用又は突然変異誘発物質を用いた処理によって、（単離されたＤＮＡの）インビトロ、又はインサイチュウで実行されてよい。好ましくは、複製欠損型ウイルスはウイルス粒子をカプシドで包むために必要な、それ自身のゲノム配列を保持する。
【００７３】
好ましい実施態様において、ウイルス成分はアデノウイルスに由来する。好ましくは、媒体はアデノウイルスカプシド内に梱包されたアデノウイルスベクター、又はそれらの機能的部分、誘導体、及び／又は類似体を含む。アデノウイルスの生物学はまた、分子レベルで比較的よく知られている。アデノウイルスベクターのための多くのツールは発展し続けてきており、それゆえアデノウイルスカプシドを本発明のライブラリーに組み込むのに好ましい媒体にしている。アデノウイルスは様々な細胞に感染することができる。しかしながら、異なるアデノウイルス血清型は、細胞に対して異なる優先傾向を有する。本発明のアデノウイルスカプシドが、好ましい実施態様で入ることができる標的細胞集団を結集させ広げるために、媒体は少なくとも２種類のアデノウイルスからのアデノウイルス線維タンパク質を含む。
【００７４】
好ましい実施態様において、アデノウイルス由来の核酸は、アデノウイルス後期タンパク質、又はその機能的部分、誘導体、及び／又は類似体をコードする核酸を含む。アデノウイルス線維タンパク質を例とするアデノウイルス後期タンパク質は、これを都合に合わせて用いて特定の細胞に媒体を標的化させてもよく、又は該細胞に該媒体の強化された輸送を誘導してもよい。好ましくは、アデノウイルス由来の核酸は、実質的に全てのアデノウイルス後期タンパク質をコードし、アデノウイルスカプシド全体、又はその機能的部分、類似体、及び／又は誘導体の形成を可能にする。好ましくは、アデノウイルス由来の核酸はアデノウイルスＥ２Ａ、又はその機能的部分、誘導体、及び／又は類似体をコードする核酸を含む。好ましくは、アデノウイルス由来の核酸は、細胞内で核酸に由来するアデノウイルスの複製を少なくとも部分的には促進する、少なくとも１つのＥ４領域タンパク質、又はその機能的部分、誘導体、及び／又は類似体をコードする核酸を含む。本明細書の実施例で使用されるアデノウイルスベクターは、治療法発明に属する本方法において有用なベクターの典型である。
【００７５】
本発明の特定の実施態様はレトロウイルスベクターシステムを使用する。レトロウイルスは分裂細胞に感染する組込みウイルスであり、かつそれらの構成は当業者に周知である。レトロウイルスベクターは、ＭｏＭｕＬＶ（「マウスモロニー白血病ウイルス」）、ＭＳＶ（「マウスモロニー肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「ハーベイ肉腫ウイルス」）；ＳＮＶ（「脾臓壊死ウイルス」）；ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）及びフレンドウイルスなどの、異なるタイプのレトロウイルスから構築され得る。レンチウイルスベクターシステムもまた本発明の実践に使用されてよい。レトロウイルスシステム及びヘルペスウイルスシステムは、神経細胞のトランスフェクションに好ましい媒体であることがある。
【００７６】
本発明の他の好ましい実施態様は、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）が使用されることである。ＡＡＶウイルスは、感染細胞のゲノム中に安定的かつ部位特異的様式で組み込む、比較的小さなサイズのＤＮＡウイルスである。それらは、細胞の成長、形態、又は分化にどのような影響も誘発せずに、幅広い範囲の細胞に感染することができ、かつそれらはヒトの病理に関与していないようである。
【００７７】
ベクター構築において、本発明のポリヌクレオチド剤は、１以上の制御領域に連結されてよい。適切な制御領域の選択は当業者の技術レベル内で決まりきった事柄である。制御領域はプロモータを含み、かつエンハンサー、サプレッサーなどを含んでもよい。
本発明の発現ベクターに使用してもよいプロモータは、構成的プロモータ及び制御（誘導可能な）プロモータの両方を含む。プロモータは宿主次第で原核生物又は真核生物であってよい。原核生物（バクテリオファージを含む）プロモータの中で本発明の実践に有用なのは、ｌａｃプロモータ、ｌａｃＺプロモータ、Ｔ３プロモータ、ＴＩプロモータ、ラムダP.sub.rプロモータ、P.sub.lプロモータ、及びｔｒｐプロモータである。真核生物（ウイルスを含む）プロモータの中で本発明の実践に有用なのは、遍在性プロモータ（例えば、ＨＰＲＴ、ビメンチン、アクチン、チューブリン）、中間径フィラメントプロモータ（例えば、デスミン、神経フィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰ）、治療遺伝子プロモータ（例えば、ＭＤＲタイプ、ＣＦＴＲ、因子ＶＩＩＩ）、組織特異的プロモータ（例えば、平滑筋におけるアクチンプロモータ、又は内皮細胞において活性なＦｉｔプロモータ及びＦｌｋプロモータ）であり、組織特異性を示しかつトランスジェニック動物において用いられる以下の動物転写制御領域を含む：膵腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Swiftらの論文(1984) Cell 38:639-46; Ornitzらの論文(1986) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonaldの論文 (1987) Hepatology 7:425-515）；膵臓ベータ細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域（Hanahanの論文(1985) Nature 315:115-22）、リンパ球細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedlらの論文(1984) Cell 38:647-58; Adamesらの論文(1985) Nature 318:533-8; Alexanderらの論文(1987) MoI. Cell. Biol. 7:1436-44）、睾丸、乳腺、リンパ球及びマスト細胞において活性であるマウス乳ガンウイルス制御領域（Lederらの論文 (1986) Cell 45:485-95）、肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Pinkertらの論文(1987) Genes and Devel. 1 :268-76）、肝臓において活性であるアルファ−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlaufらの論文(1985) MoI. Cell. Biol., 5: 1639-48; Hammerらの論文(1987) Science 235:53-8）、肝臓において活性であるアルファ１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Kelseyらの論文(1987) Genes and Devel., 1: 161-71）、骨髄性細胞において活性であるベータグロビン遺伝子制御領域（Mogramらの論文 (1985) Nature 315:338-40; Kolliasらの論文 (1986) Cell 46:89- 94）、脳中のオリゴデンドロサイト細胞において活性であるミエリン塩基タンパク質遺伝子制御領域（Readheadらの論文 (1987) Cell 48:703-12）、骨格筋において活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Saniの論文(1985) Nature 314.283-6）、及び視床下部において活性である性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Masonらの論文(1986) Science 234:1372-8）。
【００７８】
本発明の実践において使用されてもよい他のプロモータは、分裂細胞で選択的に活性化されるプロモータ、刺激に応答するプロモータ（例えば、ステロイドホルモン受容体、レチノイン酸受容体）、テトラサイクリン制御性転写モジュレーター、サイトメガロウイルス前初期プロモータ、レトロウイルスＬＴＲプロモータ、メタロチオネインプロモータ、ＳＶ−４０プロモータ、Ｅ１ａプロモータ、及びＭＬＰプロモータを含む。
【００７９】
ベクターはまた、エンハンサー、リプレッサーシステム、及び局在化シグナルなどの他の要素を含む。膜局在化シグナルは、ＧＰＣＲの細胞内ドメインに接触することによって機能する細胞内結合タンパク質をコードし、かつベクター産物が、細胞内結合タンパク質の標的が存在する細胞膜の内側表面に指示される場合に最も効果的である配列を発現する場合に、好ましい要素である。膜局在化シグナルは当業者に周知である。例えば、原形質膜にポリペプチドを局在化させるための適切な膜局在化ドメインはファルネシル化のためのＣ末端配列ＣａａＸであり（ここで「ａ」は脂肪酸アミノ酸残基であり、かつ「Ｘ」は任意のアミノ酸残基、一般的にはロイシンである）、例えば、システイン−アラニン−アラニン−ロイシン、又はシステイン−イソロイシン−バリン−メチオニンである。他の膜局在化シグナルは、Ｂｃｌ−２のＣ末端又はＢｃｌ−２ファミリータンパク質の他のメンバーのＣ末端からの推定上の膜局在化配列を含む。
【００８０】
さらなるベクターシステムは、患者へのポリヌクレオチド剤の導入を促進する非ウイルスシステムを含む。例えば所望の配列をコードするＤＮＡベクターは、リポフェクションによってインビボで導入され得る。リポソーム介在性トランスフェクションで遭遇する困難を制限するためにデザインされた合成カチオン性脂質を使用して、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製することができる（Feignerらの論文(1987) Proc. Natl. Acad ScL USA 84:7413-7; Mackeyらの論文(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027-31; Ulmerらの論文(1993) Science 259:1745-8を参照されたい）。カチオン性脂質の使用は、負に荷電した核酸のカプシド包囲を促進することがあり、また負に荷電した細胞膜との融合を促進することもある（Feigner及びRingoldの論文, (1989) Nature 337:387-8）。核酸の導入用途の特に有用な脂質化合物及び組成物は、国際特許公報WO 95/18863並びにWO 96/17823、及び米国特許第5,459,127号に記載されている。インビボで特定の組織内に外来遺伝子を導入するためのリポフェクションの使用は特定の実用上の利点を有し、また特定の細胞型にトランスフェクションを指示することは、例えば、膵臓、肝臓、腎臓及び脳などの細胞の不均質性を有する組織において特に有利であるだろう。脂質は標的化の目的のために他の分子に化学的に連結されてよい。標的化ペプチド、例えば、ホルモン又は神経伝達物質及び、抗体を例とするタンパク質又は非ペプチド分子は、化学的にリポソームに連結され得る。他の分子もまたインビボにおける核酸のトランスフェクションを促進するために有用であり、例えばカチオン性オリゴペプチド（例えば、国際特許公報WO 95/21931）、ＤＮＡ結合タンパク質由来のペプチド（例えば、国際特許公報WO 96/25508）、又はカチオン性ポリマー（例えば、国際特許公報WO 95/21931）がある。
【００８１】
裸のＤＮＡプラスミドとしてインビボでＤＮＡベクターを導入することもまた可能である（米国特許第5,693,622号、第5,589,466号及び第5,580,859号を参照されたい）。治療目的のための裸のＤＮＡベクターは当業者に既知の方法、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、又はＤＮＡベクタートランスポーターの使用によって所望の宿主細胞内に導入され得る（例えば、Wilsonらの論文(1992) J. Biol. Chem. 267:963-7; Wu及びWuの論文 (1988) J. Biol. Chem. 263:14621-4; Hartmutらによって１９９０年３月１５日に出願されたカナダ特許出願第2,012,311号; Williamsらの論文(1991). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-30を参照されたい）。受容体介在性ＤＮＡ送達アプローチもまた使用され得る（Curielらの論文(1992) Hum. Gene Ther. 3:147- 54; Wu及びWuの論文, (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-32）。
【００８２】
本発明はまた、ＧＰＣＲの拮抗薬及び／又は逆作動薬として同定された化合物を含む生物学的適合性組成物、及び先に記載されたような発現阻害剤を提供する。
生物学的に適合性を有する組成物は、固体、液体、ゲル、又は他の形態であることもある組成物であり、組成物中に本発明の化合物、ポリヌクレオチド、ベクター及び抗体が、活性な形態、例えば、生物学的活性に影響を与え得る形態で維持される。例えば本発明の化合物は、ＧＰＣＲ上で逆作動薬活性又は拮抗薬活性を有し；核酸は複製、伝達内容の翻訳、又はＧＰＣＲの相補的ｍＲＮＡにハイブリダイズすることができ；ベクターは標的細胞にトランスフェクト、及び先に記載されたようなアンチセンス、抗体、リボザイム又はｓｉＲＮＡを発現することができ；抗体はＧＰＣＲポリペプチドドメインに結合するであろう。
【００８３】
好ましい生物学的適合性組成物は、例えば、トリス、リン酸、又は塩イオンを含むＨＥＰＥＳバッファーを用いて緩衝化された水溶液である。通常、塩イオン濃度は生理的レベルに近いであろう。生物学的適合性溶液は、安定剤及び保存料を含んでよい。さらに好ましい実施態様において、生体適合性組成物は、医薬として許容し得る組成物である。そのような組成物は、局所的経路、経口経路、非経口経路、鼻腔内経路、皮下経路、及び眼球内経路による投与のために製剤され得る。非経口投与は、静脈内注射、筋肉内注射、動脈内注射、又は融合技術を含んだものを意味する。組成物は、標準的で周知の非毒性の生理的に許容し得るキャリアー、所望のアジュバント、及び賦形剤を含む用量単位製剤で非経口的に投与されてよい。
【００８４】
本組成物発明の特に好ましい実施態様は、医薬として許容し得るキャリアーとの混合物中の、先に記載したような治療的有効量の発現阻害剤を含む認識強化医薬組成物である。別の好ましい実施態様は、認識機能障害を伴う病気又は該病気への感受性の治療又は予防のための医薬組成物であり、医薬として許容し得るキャリアーとの混合物中の、効果的にアミロイドベータペプチドを阻害する量のＧＰＣＲ拮抗薬又は逆作動薬、それらの医薬として許容し得る塩、水和物、溶媒和物、又はプロドラッグを含む。そのような組成物の特に好ましいクラスは、アリールオキシジチオウレア化合物を含む。
【００８５】
経口投与用の医薬組成物は経口投与に適切な容量で、当業者に周知の医薬として許容し得るキャリアーを用いて製剤され得る。そのようなキャリアーは、医薬組成物が患者による摂取のために、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方されることを可能にする。経口使用のための医薬組成物は活性化合物と固形賦形剤とを混合し、結果としてできた混合物を任意に粉砕すること、及び所望ならば錠剤又は糖衣錠核を得るための適切な助剤を加えた後に、顆粒混合物を加工することによって調製することができる。適切な賦形剤は炭水化物又はタンパク質充填剤であり、ラクトース、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖；トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ、又は他の植物からのデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；アラビア及びトラガカントを含むゴム；及びゼラチン及びコラーゲンなどのタンパク質などである。所望ならば、崩壊剤又は安定剤には、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はアルギン酸ナトリウムなどのその塩などが添加されてよい。糖衣錠核は濃縮糖溶液などの適切な被覆剤と合わせて使用されてよく、また被覆剤はアラビアゴム、滑石、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有機溶媒又は溶媒混合物を含んでよい。染料又は色素を、製品識別のために錠剤又は糖衣錠の被覆剤に添加、又は活性化合物の量、すなわち用量を特徴付けてもよい。
【００８６】
経口的に使用することができる医薬組成物は、ゼラチン及びグリセロール又はソルビトールなどの被覆剤から作られた軟らかい密封カプセルと同様に、ゼラチンから作られた押し込み型カプセルを含む。押し込み型カプセルは、ラクトース又はデンプンなどの充填剤又は結合剤、滑石又はステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、及び任意に安定剤と混合された活性成分を含み得る。軟らかいカプセルにおいて、活性化合物は、脂肪油、液体、又は安定剤を含む若しくは含まない液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解又は懸濁されてよい。
【００８７】
好ましい無菌の注射製剤は、非毒性の非経口的に許容可能な溶剤又は希釈剤中の溶液若しくは懸濁液であり得る。医薬として許容し得るキャリアーの例は、生理食塩水、緩衝食塩水、等張食塩水（例えば、リン酸一ナトリウム又はリン酸二ナトリウム、ナトリウム、カリウム；塩化カルシウム又は塩化マグネシウム、若しくはそれらのような塩の混合物）、リンガー溶液、デキストロース、水、滅菌水、グリセロール、エタノール及びそれらの組み合わせであり、また１，３−ブタンジオール及び滅菌された固定油は、溶剤又は懸濁化剤として都合に合わせて用いられる。任意の無味の固定油が使用されることができ、合成モノグリセリド又は合成ジグリセリドを含む。オレイン酸などの脂肪酸もまた注入可能な製剤での使用を見出す。
【００８８】
構成培地もまたヒドロゲルであることができ、ヒドロゲルは薬物吸収スポンジとして機能することができる親水性ポリアクリル酸ポリマーなどの任意の生体適合性又は非細胞毒性のホモポリマー若しくはヘテロポリマーから調製される。特にエチレン及び／又はプロピレン酸化物から得られたあるものは市販されている。ヒドロゲルは、例えば外科的介入の間、治療すべき組織の表面上に直接的に溶着され得る。
【００８９】
本発明の医薬組成物の実施態様は、本発明のポリヌクレオチド阻害剤、及びポロクサマーといったトランスフェクションエンハンサーをコードする複製欠損型組換えウイルスベクターを含む。ポロクサマーの例は、市販のポロクサマー４０７（BASF, Parsippany, N.J.）及び非毒性の生体適合性ポリオールである。組換えウイルスを浸透させたポロクサマーは、例えば外科的介入の間、治療すべき組織の表面上に直接的に溶着されてもよい。ポロクサマーは低目の粘度を有しているので、本質的にヒドロゲルと同じ利点を有する。
【００９０】
活性発現阻害剤はまた、コロイド薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）内又はマクロエマルジョン内で、例えば界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル、及びポリ−（メチルメタクリル樹脂）マイクロカプセル中にそれぞれ封入されてもよい。そのような技術は、レミングトンの薬学(1980)第１６版, Osol, A.編に開示されている。
【００９１】
徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の適切な例は抗体を含む固形の疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、マトリクスが、例えばフィルム又はマイクロカプセルなどの造形品の形態である。徐放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリル樹脂）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号）、Ｌ−グルタミン酸のコポリマー及びガンマ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン酢酸−ビニル、LUPRON DEPOT（商標）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（乳酸−グリコール酸コポリマー、及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフェア）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは１００日間を超えて分子の放出が可能であるが、特定のヒドロゲルはより短い期間でタンパク質を放出する。封入された抗体が体内で長期間保持された場合、それらは３７℃で水分にさらされた結果として分解又は凝集するかもしれず、生物学的活性の喪失及び免疫原性の変化の可能性をもたらす。合理的な方法は関与する機構次第で安定を図るために工夫され得る。例えば凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を介した分子内Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見されたならば、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、含水率の制御、適切な添加剤の使用及び特定のポリマーマトリクス組成物の開発によって安定化を達成してよい。
【００９２】
本発明はまた、アミロイドベータ前駆体タンパク質の異常なプロセシングに苦しむ又は感受性である対象における、前記タンパク質のプロセシングを阻害する方法を提供し、方法は前記対象への治療的有効量の本発明の発現阻害剤の投与を含む。本方法発明の別の態様は、認識機能障害を伴う病気又は該病気に対する感受性の治療若しくは予防である。本発明の特別な実施態様は病気がアルツハイマー病である場合の方法である。
【００９３】
先に定義されたように、治療的に有効な用量は、タンパク質、ポリヌクレオチド、ペプチド、又は症状若しくは病気を改善するその抗体、又は作動薬若しくは拮抗薬の量を意味する。そのような化合物の治療的有効性及び毒性は、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）及びＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）などの、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性効果対治療効果の用量比は治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０の割合として表され得る。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトでの使用のための用量の範囲を策定することに用いられる。そのような化合物の用量は、ほとんど、あるいは全く毒性のないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にあることが好ましい。用量は、使用される剤形、患者の感受性、及び投与経路によってこの範囲内で変化する。
【００９４】
任意の化合物について、治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイ、又は通常マウス、ウサギ、イヌ若しくはブタの動物モデルのどちらかで最初に概算され得る。動物モデルもまた、好ましい濃度範囲及び投与経路を得るために使用される。そのような情報がそれから使用され、ヒトでの有効用量及び投与経路を決定することができる。正確な用量は、治療される患者を考慮してそれぞれの医師によって選択される。用量及び投与は、十分なレベルの活性成分を提供、又は所望の効果を維持するために調節される。考慮されてよいさらなる因子は、病状の重篤度、年齢、体重、及び患者の性別；食事、望まれる治療期間、投与方法、投与時間及び頻度、薬剤の組み合わせ、反応感受性、及び治療に対する耐性／反応を含む。長時間作用型医薬組成物は、特定の製剤の半減期及び除去率次第で、３〜４日毎、１週毎又は２週毎に投与されてよい。
【００９５】
本発明に従った医薬組成物は様々な方法で対象に投与されてよい。それらは標的組織に直接的に加えられるか、カチオン性脂質と複合体を形成されるか、リポソーム内に包まれるか、又は当業者に既知の他の方法によって標的細胞へ輸送されてよい。所望の組織への局所的投与は、カテーテル、輸液ポンプ、又はステントでなされてよい。ＤＮＡ、ＤＮＡ／賦形剤複合体、又は組換えウイルス粒子は、治療部位に対する局所的に投与される。代替輸送経路は、これらに限定されないが、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、エアロゾル吸入、経口（錠剤、又は丸薬形態）、局所的輸送、全身的輸送、眼球輸送、腹腔内輸送、及び／又は髄腔内輸送を含む。リボザイム輸送及び投与の例は、Sullivanらの WO 94/02595において提供されている。
【００９６】
本発明に従った抗体は、ボーラスのみとして送達、経時的に注入、又はボーラスとしての投与及び経時的な注入の両方で送達されてよい。当業者は、タンパク質用とは異なる製剤を、ポリヌクレオチド用に用いてよい。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの輸送は、特定の細胞、状態、位置などに特異的であろう。
【００９７】
先に記載されたように、組換えウイルスを利用して、本発明で有用なポリヌクレオチド剤をコードするＤＮＡを導入してもよい。本発明に従った組換えウイルスは、通常約10. sup.4〜約10. sup.14 pfuの間の用量の剤形で処方及び投与される。ＡＡＶ及びアデノウイルスの場合、約10.sup.6〜約10. sup.11 pfuの用量が好ましく使用される。用語ｐｆｕ（「プラーク形成単位」）はビリオン懸濁液の感染力に対応し、適切な培養細胞に感染させ、形成されたプラークの数を測定することによって決定される。ウイルス溶液のｐｆｕ力価を決定するための技術は、先行技術において十分に立証されている。
【００９８】
本発明の別の態様は、対象において認識機能障害を伴う病態又は該病態への感受性を診断するための方法に関連し、生体サンプル中の配列番号：４〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの量を決定すること、及び該ポリペプチドの量を健康な対象のポリペプチド量と比較することを含み、このとき健康な対象と比較したポリペプチドの量の増加が病態の存在を示す。
【００９９】
（実験セクション）
（実施例１）：ＧＰＲ３はアミロイドベータ１〜４２のレベルを上昇させる
ＡＰＰプロセシングを変化させる新規薬剤標的を同定するために、ＡＰＰを過剰発現する安定細胞株を作成する。この安定細胞株は、ｐｃＤＮＡ３．１にクローン化されたＡＰＰ７７０ｗｔのｃＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、続いて３週間、Ｇ４１８を用いて選抜することによって作成する。この時点でコロニーを選別し、安定なクローンを増幅させ、かつ分泌されたアミロイドベータペプチドのレベルをテストする。高レベルでアミロイドベータを分泌するクローンであるＨＥＫ２９３ ＡＰＰｗｔを、薬剤標的を同定する実験のために選別する。これは、アデノウイルスｃＤＮＡライブラリーを用いてＨＥＫ２９３ ＡＰＰｗｔに形質導入すること、及び結果として生じたアミロイドベータ１〜４２のレベルの変化をＥＬＩＳＡを介して測定することによって達成される。
【０１００】
ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）中に、１５０００細胞／ウエル（３８４ウエルプレート）の細胞密度で、コラーゲン被覆されたプレートにまかれた細胞を、１μｌ又は０．２μｌのアデノウイルス（それぞれ、１２０及び２４の平均感染の多重度（ＭＯＩ）に一致する）を用いて、２４時間後に感染させる。その翌日、アデノウイルスを洗い流し、そしてＤＭＥＭ（２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ；１０％ＦＢＳ）を該細胞に添加する。アミロイドベータペプチドを２４時間蓄積させる。ＥＬＩＳＡプレートは、バッファー４２（表１）中において２．５μｇ／ｍｌの濃度の捕捉抗体（JRF/cAbeta42/26）（M Mercken, Johnson and Johnson Pharmaceutical Research and Development, B-2340 Beerse, Belgiumから入手）を用いて一晩被覆することによって調製する。その翌朝にＰＢＳを用いて余剰の捕捉抗体を洗い流し、それから該ＥＬＩＳＡプレートを４℃でカゼインバッファー（表１を参照されたい）を用いて一晩ブロッキングする。ブロッキングバッファーの除去後速やかに３０μｌのサンプルをＥＬＩＳＡプレートに移し、４℃で一晩インキュベートする。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０及びＰＢＳを用いた多量の洗浄の後、３０μｌのワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識された検出抗体（ペルオキシダーゼラベリングキット, Roche）、JRF/AbetaN/25-HRP（M Mercken, Johnson and Johnson Pharmaceutical Research and Development, B-2340 Beerse, Belgiumから入手）をバッファーＣ（表１を参照されたい）で１／５０００希釈し、そしてさらに２時間該ウエルに添加する。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０及びＰＢＳを用いた洗浄による余剰の検出抗体の除去の後、ＨＲＰ活性を、ＨＲＰ酵素によって化学発光へと変換されるルミノール基質（Roche）の添加を介して検出する。
【表１】
【０１０１】
該アッセイの正当性を立証するには、無作為な力価の２種の臨床的ＰＳ１変異体及びＢＡＣＥを伴うアデノウイルスの過剰発現が、アミロイドベータ１〜４２の産生に及ぼす効果を、ＨＥＫ２９３ ＡＰＰｗｔ細胞内で評価する。図２に示したように、全てのＰＳ１及びＢＡＣＥコンストラクトは、予測どおりアミロイドベータ１〜４２レベルを誘導する。
【０１０２】
アデノウイルスＧＰＣＲ ｃＤＮＡライブラリーを下記のように構築した。ＧＰＣＲの全長コード領域をカバーするＤＮＡフラグメントを、プールされた胎盤及び胎児肝臓のｃＤＮＡライブラリー（InvitroGen）からのＰＣＲによって増幅した。全てのフラグメントを、該内容が引用によって本明細書に組み込まれる米国特許第6,340,595号に記載されるようなアデノウイルスベクター内へクローン化し、次にアデノウイルスが作成され、アデノウイルスは対応するｃＤＮＡを保持する。ＨＥＫ２９３ ＡＰＰｗｔ細胞におけるアデノウイルスＧＰＣＲライブラリーのスクリーニングの間、ＧＰＲ３の過剰発現はＨＥＫ２９３ ＡＰＰｗｔ細胞の馴化培地中のアミロイドベータ１〜４２ペプチドのレベルの上昇をもたらす。これらの結果はＧＰＲ３がＡＰＰプロセシングのモジュレーターとして同定されたことを示す。
【０１０３】
ＧＰＲ３の刺激効果を、定量的リアルタイムＰＣＲで決定したとおりの既知の力価（ウイルス粒子／ｍｌ）を有するウイルスの再スクリーニング時に確認する。ＧＰＲ３ウイルスを２〜２５０の範囲のＭＯＩで感染させ、そして実験を先に記載されたように実行する。アミロイドベータ１〜４２のレベルは、Ａｄ５／ＧＰＲ３に対するネガティブコントロールに比較して２倍高い（図３Ａ）。さらに、アミロイドベータ１〜４０、１１〜４２、１−ｘ及びｙ−４２のレベルへのＧＰＲ３の効果を、上記と同様な条件下でチェックする（図３Ｂ〜３Ｅ）。それぞれのＥＬＩＳＡは、下記の抗体を使用したことを除いては先に記載されたように実行する：アミロイドベータ１〜４０ＥＬＩＳＡに対しては、捕捉及び検出抗体はそれぞれJRF/cAbeta40/10、及びJRF/AbetaN/25-HRP （M Mercken, Johnson and Johnson Pharmaceutical Research and Development, B-2340 Beerse, Belgiumから入手）、アミロイドベータ１１〜４２ＥＬＩＳＡに対しては、捕捉及び検出抗体はそれぞれJRF/cAbeta42/26及びJRF/hAb11/1（M Mercken, Johnson and Johnson Pharmaceutical Research and Development, B-2340 Beerse, Belgiumから入手）、アミロイドベータｙ−４２ＥＬＩＳＡに対しては（ｙは１〜１７の範囲）、捕捉及び検出抗体はそれぞれJRF/cAbeta42/26及び4G8-HRP（それぞれ、M Mercken, Johnson and Johnson Pharmaceutical Research and Development, B-2340 Beerse, Belgium、及びSignet, USAから得られる）、さらにアミロイドベータ１−ｘ ＥＬＩＳＡに対しては（ｘは２４〜４２の範囲）、捕捉及び検出抗体はそれぞれJRF/AbetaN/25及び4G8-HRP（それぞれM Mercken, Johnson and Johnson Pharmaceutical Research and Development, B-2340 Beerse, Belgium、及びSignet, USAから得られる）である。アミロイドベータ１−ｘ ＥＬＩＳＡは、可変Ｃ末端（アミロイドベータ１〜３７；１〜３８；１〜３９；１〜４０；１〜４２）を用いたアミロイドペプチドの検出のために使用する。これらの実験結果は、ＧＰＲ３の形質導入直後の、アミロイドベータ１〜４０、１１〜４２、ｙ−４２及び１−ｘ種の増加を明らかに示す（図３Ｂ〜３Ｅ）。同手順は、ＧＰＲ６及びＧＰＲ１２によるＡＰＰプロセシングの解析のために使用する。
【０１０４】
（実施例２）：ＧＰＲ３類似体の同定
ヒトＧＰＲ３受容体のアミノ酸配列は、ＧＰＲ３の最も近い類似体を見つけるために、全てのヒトＧＰＣＲに対して、ＢＬＡＳＴサーチにおける問い合わせ（ｑｕｅｒｙ）として使用した。表２（配列番号：５〜６）は、２つの最も近いＧＰＲ３受容体である。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いて配列比較を構築して、ＧＰＲ３とその最も近い類似体であるＧＰＲ６並びにＧＰＲ１２との間の相同性の度合いを示した（図５）。
【表２】
【０１０５】
（実施例３）：ＧＰＣＲ発現のノックダウンによるアミロイドベータペプチドの減少
拮抗薬の効果は、標的タンパク質の発現レベルの減少をもたらすｓｉＲＮＡに基づいた方法の使用を介して模倣し得る。例えば、ＧＰＲ３ ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションはアミロイドベータ１〜４２を減少させる。
オリゴフェクタミンと共に、ＧＰＲ３（Dharmacon, USA：表３）、ｅＧＦＰ、ルシフェラーゼ及びＢＡＣＥのｓｉＲＮＡのスマートプールを用いて、ＨＥＫ２９３ ＡＰＰｗｔ細胞をトランスフェクトさせる。トランスフェクション後２４時間で培地を新しくし、該細胞は先に記載したように、ＥＬＩＳＡ解析に先立つ２４時間の間、馴化培地中でアミロイドベータペプチドを蓄積することが可能になる。データは、ＧＰＲ３ ＲＮＡレベルに対して標的化されたｓｉＲＮＡは、コントロール条件に比較してアミロイドベータ１〜４２レベルを減少させることを明らかに示す（図４）。結論として、これらのデータは、ＧＰＲ３が分泌されるアミロイドベータのレベルを調節することを示す。同手順は、ＧＰＲ６及びＧＰＲ１２によるＡＰＰプロセシングの解析に対して用いる。
【表３】
【０１０６】
（実施例４）：ヒト脳におけるＧＰＲ３の発現
ＡＰＰプロセシングのモジュレーターの同定の際、モジュレーターが関心を引く組織及び細胞で発現しているかどうかを検討することは重要である。これは組織並びに細胞における、ＲＮＡ及び／又はタンパク質レベルを測定することによって達成され得る。近年、ＲＮＡレベルはリアルタイムＰＣＲ技術を使用して定量され、それによってＲＮＡは最初にｃＤＮＡへ転写され、続いて、関心を引くｃＤＮＡの増幅がＰＣＲ反応の間監視される。増幅プロット及び結果のＣｔ値は、サンプル中に存在するＲＮＡ量についての指標である。ハウスキーピング遺伝子のレベルの決定は、異なるＲＮＡサンプル間での標的遺伝子のＲＮＡレベルの標準化を可能にし、ΔＣｔ値として表される。
【０１０７】
本発明のＧＰＣＲがヒト脳で発現しているかどうかを調査するには、ＧＡＰＤＨ特異的プライマー及び本発明のそれぞれのＧＰＣＲのための特異的プライマーを用いたリアルタイムＰＣＲを、ヒト全体脳、ヒト大脳皮質、及びヒト海馬のトータルＲＮＡ（BD Biosciences）で実行する（表４を参照されたい）。
【表４】
【０１０８】
他のＧＰＣＲにはサイバーグリーン（SybrGreen）を用いたのに対し、ＧＡＰＤＨはタックマン（Taqman）プローブで検出する。手短に言うと、４０ｎｇのＲＮＡを、MultiScribe Reverse Transcriptase（５０Ｕ／μｌ）酵素（Applied BioSystems社）を用いてＤＮＡへと逆転写させる。結果として生じたｃＤＮＡを、ABI PRISM（登録商標）7000配列検出システムを使用し、４０サイクルの間に、AmpliTaq Gold ＤＮＡポリメラーゼ（Applied BioSystems社）を用いて増幅させる。
【０１０９】
全体脳、大脳皮質、及び海馬のトータルＲＮＡを、定量的リアルタイムＰＣＲを使用してＧＰＣＲ転写産物が存在するか解析する。ＧＰＲ３に関して、得られたＣｔ値は、全てのＲＮＡサンプルにおいてＧＰＲ３が検出されたことを示す（表５）。
特異的な細胞性発現へのさらなる洞察を得るために、免疫組織化学（タンパク質レベル）及び／又はインサイチュウハイブリダイゼーション（ＲＮＡレベル）を、ヒト正常並びにアルツハイマーの脳海馬、皮質及び皮質下構造からの切片で実行する。これらの結果は、発現が、神経細胞、マイクログリア細胞、又はアストロサイトで起こるかどうかを示す。疾患組織と健康組織との比較は、ＧＰＲ３が疾患組織で発現しているか、かつその発現レベルが、非病的状況に比較して変化しているかを示す。同手順は、ＧＰＲ６及びＧＰＲ１２の発現プロファイリングに対して使用する。
【表５】
【０１１０】
（実施例５）：ラット初代神経細胞におけるアミロイドベータ産生
実際のニューロンにおいて、ＧＰＲ３がアミロイドベータ産生に影響するかどうかを調べるために、ヒト又はラットの初代海馬若しくは皮質ニューロンに、ＧＰＲ３ ｃＤＮＡを含むアデノウイルスを用いて形質導入する。アミロイドベータのレベルをＥＬＩＳＡで決定する（実施例１を参照されたい）。齧歯類のＡＰＰ遺伝子は、該ヒト配列に比較してＡＰＰ中に多くの突然変異を有しているため、齧歯類のＡＰＰ遺伝子はより少ないアミロイドベータ１〜４０及び１〜４２を産生する。より高いアミロイドベータレベルを達成するために、ＧＰＲ３と、ヒト野生型ＡＰＰ又はヒトスウェーデン変異型ＡＰＰ（これはアミロイドベータ産生を増幅する）ｃＤＮＡとの共形質導入を実行する。
【０１１１】
ラット初代ニューロン培養は、Goslin及びBanker（神経細胞培養, 第２版, 1998 ISBN 0−262-02438-1）に従って、Ｅ１８〜Ｅ１９日齢の胎児スプラーグダウリー（Sprague Dawley）ラットの脳から調製する。手短に言うと、海馬又は皮質から得られた単個細胞浮遊液を調製する。生存細胞の数を決定し、１０％ウマ血清を添加した最小必須培地（ＭＥＭ）中で、ポリ−Ｌ−リジンで被覆されたプラスチック製９６ウエルプレート上にまく。該細胞は、ウエル当たり５０，０００細胞の密度（すなわち、約１６６，０００細胞／ｃｍ２）でまく。３〜４時間後、培地をＢ２７サプリメント（GIBCO BRL社）を含む１６０μｌの無血清神経基礎培地に交換する。シトシンアラビノシド（５μＭ）をまいた２４時間後に添加して、非神経性（グリア）細胞増殖を防ぐ。
【０１１２】
まいた５日後にニューロンを使用する。アデノウイルス形質導入前に、これらの培地の１５０μｌの馴化培地を空の９６ウエルプレートの対応するウエルに移し、そして５０μｌの該馴化培地を該細胞に戻す。残りの１００μｌ／ウエルは、３７℃かつ５％ＣＯ２で保存する。海馬初代神経培養細胞を、２５０〜２０００の範囲にわたるそれぞれ異なるＭＯＩで、ＧＰＲ３、ＬａｃＺ、ｅＧＦＰ、及びルシフェラーゼのｃＤＮＡを含む、Ad5C09Att00/A011200-GPR3_v3ウイルス、Ad5C09Att00/A010801-LacZ_v1ウイルス、Ad5C09Att00/A010800-eGFP_v1ウイルス並びにAd5C09Att00/A010800-luc_v17ウイルスの粗溶解物で感染させる。さらに該細胞はまた、２０００のＭＯＩでヒト野生型ＡＰＰ６９５を発現する精製アデノウイルスAd5C0lAtt01/A010800 APP_v6で感染させる。形質導入後１６〜２４時間でウイルスを取り除き、培養細胞を１００μｌの予め温めた未使用神経基礎培地で洗浄する。該洗浄溶液の除去後、５０μｌの保存されていた馴化培地及び５０μｌの未使用神経基礎培地を含む新しい培地を対応する細胞に移す。培地は４８〜７２時間後に回収した。該ウエル内の細胞数は、ＡＴＰレベルを調査することによって決定した。アミロイドベータ濃度は、アミロイドベータ１〜４２に特異的なＥＬＩＳＡ（実施例１を参照されたい）によって決定した。アミロイドベータ１〜４２のレベルを細胞数に対して標準化する。
データ（図６）は、初代ニューロンにおけるＧＰＲ３の過剰発現の増加レベルによって、ネガティブコントロールウイルスに比較して、アミロイドベータの１〜４２レベルが用量依存的に増加して対応したことをはっきりと示している。
【０１１３】
（実施例６）：ＧＰＣＲに対するリガンド選別
（レポーター遺伝子選別）
ＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ−Ｋ１細胞などの哺乳動物細胞は、ｃＡＭＰ依存性プロモータ（ＣＲＥエレメント）の制御下にルシフェラーゼ遺伝子を保持しているプラスミドを用いて安定的にトランスフェクトするか、又はｃＡＭＰ依存性プロモータの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を保持しているアデノウイルスを用いて形質転換するかのどちらかである。さらに、レポーターコンストラクトを、ルシフェラーゼ遺伝子と共に、Ｃａ２＋依存性プロモータ（ＮＦ−ＡＴエレメント）の制御下又はＮＦ−κＢによって制御されるプロモータの制御下で使用することができる。該レポーターコンストラクトを発現しているこれらの細胞をそれから、本発明のＧＰＣＲのｃＤＮＡを保持しているアデノウイルスを用いて形質導入する。形質導入４０時間後、該細胞を以下を用いて処理する：
ａ）受容体に対する作動薬（例えば、スフィンゴシン−１−リン酸）、及びペプチド（LOPAP, Sigma Aldrich社）、脂質（Biomol, TimTech社）、炭水化物（Specs）、天然化合物（Specs, TimTech社）、小さな化合物（Tocris）、市販のスクリーニングライブラリー、並びに配列番号：４〜６、２８９〜３３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合親和性を有することが実証された化合物を含む対照化合物の多数のコレクションに対して選別された作動薬であって、アリールオキシジチオウレア（米国特許第6,420,563号を参照されたい）、その塩、水和物、又は溶媒和物を含む化合物を含む作動薬、又は、
ｂ）ＧＰＲ３が構成的に活性なＧＰＣＲであると考えられる場合においてのみ、ペプチド（LOPAP, Sigma Aldrich社）、脂質（Biomol, TimTech社）、炭水化物（Specs）、天然化合物（Specs, TimTech社）、小さな化合物（Tocris）、市販のスクリーニングライブラリー、及び配列番号：４〜６、２８９〜３３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合親和性を有することが実証された化合物を含む対照化合物の多数のコレクションであって、アリールオキシジチオウレア（米国特許第6,420,563号を参照されたい）、その塩、水和物、又は溶媒和物を含む化合物を含む対照化合物の多数のコレクション。
【０１１４】
作動薬が誘導したルシフェラーゼ活性又は構成的活性の増加を減少させる化合物は、ＧＰＲ３への拮抗薬又は逆作動薬であると考えられる。これらの化合物を検証のために再び選別し、分泌されるアミロイドベータペプチドのレベルへのそれらの効果に対して選別する。該化合物をまた選別し、ＧＰＣＲに結合することを証明する。該結合、アミロイドベータペプチド及びレポーター活性アッセイを実質的に任意の順番で実行し、化合物を選別することができる。
【０１１５】
さらに、ＮＦ−ＡＴレポーター遺伝子を発現している細胞は、Ｇ１５のα−サブユニット、又はキメラのＧαサブユニットをコードするｃＤＮＡを保持しているアデノウイルスを用いて形質導入することができる。Ｇ１５は、多くの異なるＧＰＣＲに共役するＧｑクラスに属する、何にでも結合する（promiscuous) Ｇタンパク質であり、そのようなものとして、ＧＰＣＲのシグナル伝達を細胞内Ｃａ２＋貯蔵の放出に向け変更する。キメラのＧアルファサブユニットは、その最後の５個のＣ末端残基がＧαｑのＣ末端残基と置換されたＧｓ及びＧｉ／ｏファミリーのメンバーであり、これらのキメラのＧタンパク質もまたｃＡＭＰシグナル伝達をＣａ２＋シグナル伝達に変更する。
【０１１６】
（ＦＬＩＰＲ選別）
ＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ−Ｋ１細胞などの哺乳動物細胞に、本発明のＧＰＣＲのｃＤＮＡを保持する発現プラスミドコンストラクトを用いて安定的にトランスフェクトする。十分に安定な細胞を得ることができるまで、細胞をまき、成長させ、選別する。細胞はＦｕｒａ３又はＦｕｒａ４などのＣａ２＋依存性蛍光物質と共にロードする。余剰の蛍光物質を洗い流した後、該細胞へ同時に作動薬（あるいは、該受容体の構成的活性が使用されている場合には、作動薬を添加する必要はない）及び化合物を添加することによって、ペプチド（LOPAP, Sigma Aldrich社）、脂質（Biomol, TimTech社）、炭水化物（Specs）、天然化合物（Specs, TimTech社）、小さな化合物（Tocris）、市販のスクリーニングライブラリー、及び配列番号：４〜６、２８９〜３３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合親和性を有することが実証された化合物を含み、アリールオキシジチオウレア（米国特許第6,420,563号を参照されたい）、その塩、水和物、又は溶媒和物を含む化合物含む、対照化合物の多数のコレクションを対照に、該細胞を選別する。該受容体の活性化は、放出される蛍光物質とＣａ２＋との相互作用に起因するほとんど瞬間的な蛍光の増加として測定する。作動薬によって誘導される蛍光の増加（又は構成的な蛍光）を減少させる又は阻害する化合物は、それらを選別するのに対照する受容体に対する拮抗薬又は逆作動薬であると考えられる。これらの化合物を再び選別し、ＧＰＣＲへの結合と同様に、分泌されるアミロイドベータペプチドの量を測定する。
【０１１７】
（Ａｅｑｕｏ選別）
安定的にアポエクオリン（Apoaequorin）を発現しているＣＨＯ細胞に、ＧＰＣＲのｃＤＮＡを保持しているプラスミドコンストラクトを用いて安定的にトランスフェクトする。十分に安定な細胞が得られることができるまで、細胞をまき、成長させ、選別する。該細胞をアポエクオリンの補因子であるセレンテラジン（coelenterazine）とともにロードする。受容体活性化の直後に細胞内Ｃａ２＋貯蔵は枯渇し、そしてエクオリン（aequorin）は発光プロセスにおいてセレンテラジンと反応する。該細胞に同時に作動薬（あるいは、該受容体の構成的活性が使用されている場合には、作動薬は添加する必要はない）及び化合物を添加することによって、ペプチド（LOPAP, Sigma Aldrich）、脂質（Biomol, TimTech）、炭水化物（Specs）、天然化合物（Specs, TimTech）、小さな化合物（Tocris）、市販のスクリーニングライブラリー、及びアリールオキシジチオウレア（米国特許第6,420,563号を参照されたい）、その塩、水和物、又は溶媒和物を含む化合物を含む配列番号：４〜６、２８９〜３３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して結合親和性を有することが実証された化合物を含む、対照化合物の多数のコレクションを対照に、アポエクオリン及び該受容体の両方を安定的に発現しているＣＨＯを選別する。該受容体の活性化を、アポエクオリン、セレンテラジン、及び放出されるＣａ２＋の相互作用に起因する、ほとんど瞬間的な発光として測定する。作動薬が誘起する光、又は構成的活性の増大を低下若しくは阻害する化合物は、それらが選別された該受容体に対する拮抗薬又は逆作動薬であると考えられる。これらの化合物を再び選別し、該ＧＰＣＲへの結合に加えて、分泌されるアミロイドベータペプチドの量を測定する。
【０１１８】
さらに、安定的にアポエクオリン遺伝子を発現しているＣＨＯ細胞を、Ｇ１５のαサブユニット、又はキメラのＧαサブユニットをコードしているｃＤＮＡを保持するプラスミドコンストラクトを用いて、安定的にトランスフェクトさせる。Ｇ１５は、多くの異なるＧＰＣＲに共役するＧｑクラスに属する、何にでも結合する（promiscuous) Ｇタンパク質であり、そのようなものとして、ＧＰＣＲのシグナル伝達を細胞内Ｃａ２＋貯蔵の放出に向け変更する。キメラのＧアルファサブユニットは、その最後の５個のＣ末端残基がＧαｑのＣ末端残基と置換するＧｓ及びＧｉ／ｏファミリーのメンバーであり、これらのキメラのＧタンパク質もまたｃＡＭＰシグナル伝達をＣａ２＋シグナル伝達に変更する。
【０１１９】
（ＧＰＣＲポリペプチドに結合する化合物のスクリーニング（置換実験））
化合物はＧＰＣＲポリペプチドへの結合について選別する。ＧＰＣＲポリペプチドへの化合物の親和性は置換実験で決定する。手短に言うと、ＧＰＣＲポリペプチドは、ＧＰＣＲポリペプチドに結合することが既知である標識された（放射性同位体で標識された、蛍光標識された）リガンド（例えば、スフィンゴシン−１−リン酸、又はジヒドロスフィンゴシン−１−リン酸）、及びラベルされていない化合物と共にインキュベートする。ＧＰＣＲポリペプチドからの標識されたリガンドの置換は、現在ＧＰＣＲポリペプチドに結合している標識されたリガンドの量を測定することによって決定する。ＧＰＣＲポリペプチドに結合した量は化合物の濃度に対してプロットし、ＩＣ５０値を計算する。この値は、その標的、すなわち化合物のＧＰＣＲポリペプチドへの結合親和性を反映する。強力な結合剤は、ナノモラー及びピコモラーの範囲においてさえＩＣ５０を有する。少なくとも１０マイクロモル又はそれ以下の（ｎｍｏｌからｐｍｏｌ）のＩＣ５０を有する化合物をベータアミロイド分泌アッセイに適用し、ベータアミロイド分泌及びプロセシングにおけるそれらの効果をチェックする。ＧＰＣＲポリペプチドは、アッセイが細胞、細胞画分又は生化学的に精製されたタンパク質のどれで行われるかによって多くの方法で調製可能である。
【０１２０】
（ＧＰＣＲポリペプチドに結合する化合物のスクリーニング（一般的なＧＰＣＲスクリーニングアッセイ））
Ｇタンパク質受容体が構成的に活性になる場合、それはＧタンパク質（Ｇｑ、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｏ）に結合し、Ｇタンパク質へのＧＴＰの結合を促進する。Ｇタンパク質はそれからＧＴＰａｓｅとして機能し、ＧＴＰをＧＤＰへとゆっくりと加水分解し、それによって通常条件下の該受容体は不活化された状態になる。しかしながら、構成的に活性化された受容体はＧＤＰからＧＴＰへの交換を続ける。ＧＴＰの非加水分解性類似体である［３５Ｓ］ＧＴＰγＳを用いて、構成的に活性化された受容体を発現する膜への促進された結合をモニターすることができる。［３５Ｓ］ＧＴＰγＳを用いて、リガンド不在及び存在下で膜に共役するＧタンパク質をモニターすることができることが報告されている。さらに、好ましいアプローチは、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質融合タンパク質の使用である。ＧＰＲ３−Ｇタンパク質融合タンパク質を産生するための方法は当業者に周知である。ＧＰＲ３−Ｇタンパク質融合タンパク質を発現している膜を、逆作動薬などの候補化合物の直接的な同定における使用のために調製する。ホモジナイズされたＧＰＲ３−Ｇタンパク質融合タンパク質を有する膜を、９６ウエルプレート中に移す。ピンツール（pin-tool）を使用して候補化合物を［３５Ｓ］ＧＴＰγＳを加えたそれぞれのウエルに移し、続いて室温で６０分間、シェーカー上でインキュベーションする。該アッセイは、２２℃で１５分間、４０００ＲＰＭで該プレートを回転させることによって停止させる。該プレートをそれから吸引し、続いて放射活性を読み取る。同手順をＧＰＲ６及びＧＰＲ１２の解析に用いる。
【０１２１】
（細胞表面上での受容体リガンド結合調査）
受容体は、アデノウイルス形質導入細胞（米国特許第6,340,595号）によって、哺乳動物細胞（ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＣＯＳ７）で発現させる。該細胞を、１０ｐＭ〜１０μＭにわたる範囲の様々な濃度で、標識されたリガンド（ヨウ素化された、トリチウム化された、又は蛍光）、及びラベルされていない化合物の両方と共にインキュベートする（４℃で３時間：ｐＨ７．４に調整した、25 mM HEPES, 140 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 5 mM MgCl2 及び0.2% BSA）。反応混合物を、細胞収穫機（Packard）を用いてＰＥＩ処理したＧＦ／Ｂガラスフィルター上に吸引する。該フィルターを、氷冷洗浄バッファー（ｐＨ７．４に調整した、25 mM HEPES, 500 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 5 mM MgCl2）で２回洗浄する。シンチラント（Scintillant）（MicroScint−10; 35 μl）を乾いたフィルターに加え、そして該フィルターを（Packard Topcount）シンチレーションカウンターで計測する。データをプリズムソフトウエア（GraphPad Software, San Diego, Calif）を用いて解析し、プロットする。競合曲線を解析し、かつＩＣ５０値を計算する。１以上のデータ点が、競合曲線のシグモイド範囲内、又は該シグモイド範囲の近傍にこない場合、該アッセイを繰り返し、そして標識されたリガンド及びラベルされていない化合物の濃度を、該曲線のシグモイド範囲内又はその近傍により多くのデータ点を有するように適合化させた。
【０１２２】
（膜画分についての受容体リガンド結合調査）
膜分画は下記のように行い、受容体を過剰発現している哺乳動物細胞（ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＣＯＳ７）から単離する：培地を該形質導入細胞から吸引し、そして細胞を穏やかに剥離することによって１×ＰＢＳ中に収集する。細胞を沈殿させ（２５００ｒｐｍ、５分）、そして５０ｍＭトリスｐＨ７．４に再懸濁した（１０×１０６細胞／ｍｌ）。該細胞沈殿物は、５秒で３回超音波処理することによって（UP50H; sonotrode MSl; 最大振幅: 140 μm; 最大超音波密度: 125W/cm2）ホモジナイズする。膜画分を、最大速度（１３０００〜１５０００から２００００ｇ、又はｒｃｆ）で２０分遠心分離することによって調製する。結果として生じた沈殿物を５００μｌの５０ｍＭトリスｐＨ７．４に再懸濁し、そして再び５秒で３回超音波処理した。該膜画分を遠心分離によって単離し、そして最終的にＰＢＳ中に再懸濁した。結合競合及びＩＣ５０値の導出を、先に記載したように決定する。
【０１２３】
（内在化選別（１））
ＧＰＣＲ関連性シグナル転換経路の活性化は一般的に、細胞質から原形質膜、又は細胞質から核への特定のシグナル転換分子の転移を導く。Norak社は、細胞質から原形質膜への受容体−β−アレスチン−ＧＦＰ複合体の作動薬誘導性転移、及びそれに続く受容体脱感作の間に起こるこの複合体の内在化に基づいて、自社のトランスフロー（transfluor）アッセイを発展させてきた。同様なアッセイは、β−アレスチンの代わりにＧＦＰ標識された受容体を用いる。ＨＥＫ２９３細胞を、ＧＰＲ３−ｅＧＦＰ融合タンパク質を翻訳するＧＰＲ３−ｅＧＦＰベクターを用いて形質導入する。形質導入後４８時間で、該細胞を６０分間、未使用無血清培地に置き、３７℃かつ５％ＣＯ２で１５分間、３０分間、６０分間又は１２０分間リガンド（例えば、１００ｎＭスフィンゴシン−１−リン酸）で処理する。表示の曝露時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして室温で２０分間、５％パラホルムアルデヒドを用いて固定する。ＧＦＰ蛍光を、デジタルカメラがついたツァイス（Zeiss）顕微鏡で可視化する。この方法は、細胞内区画への該融合タンパク質のリガンド介在性（構成的活性仲介型）転移を阻害する化合物の同定を目的とする。同手順は、ＧＰＲ６及びＧＰＲ１２の解析に用いる。
【０１２４】
（内在化選別（２））
β−アレスチン及びβ−ガラクトシダーゼ酵素相補性、並びにエネルギードナーとしての受容体及びエネルギーアクセプターとしてのβ−アレスチンを有するＢＲＥＴに基づいたアッセイを使用することで、転移アッセイには様々なバリエーションが存在する。またｐＨ感受性色素を用いて標識された特異的受容体抗体の使用は、作動薬によって誘導された酸性リソソームへの受容体転移を検出するために使用する。それらの転移アッセイの全ては、作動薬性及び拮抗薬性作用リガンドの両方のスクリーニングのために使用する。
【０１２５】
（メラニン細胞アッセイ（Arena Pharmaceutical社））
メラニン細胞アッセイは、ゼノパスメラノフォアズ（Xenopus melanophores）におけるメラノソームを含むメラニンの分布を変化させるＧＰＣＲの能力に基づいている。メラノソームの分布は、Ｇｉ／ｏ又はＧｓ／ｑのどちらかに共役する外因性受容体に依存する。メラノソームの分布（分散した又は凝集した）は、吸光度を測定することによって容易に検出される。このタイプのアッセイを、拮抗薬化合物選別と作動薬化合物選別の両方に用いる。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１Ａ】ＡＰＰプロセシング：膜アンカー型アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）は、２つの経路：アミロイド生成型及び非アミロイド生成型経路によって処理される。後者の経路において、ＡＰＰは最初にアルファセクレターゼによって、次にガンマセクレターゼによって切断され、ｐ３ペプチド（１７〜４０、又は１７〜４２）を生じる。アミロイド生成型経路は、それぞれベータ及びガンマセクレターゼによって切断された後、病原性アミロイドベータペプチド（Ａベータ）を生じる。表示の数字はＡベータ配列を含む、アミノ酸の位置である。
【図１Ｂ】ＧＰＣＲタンパク質の膜貫通構造の絵描写。
【図２】ＡＰＰプロセシングアッセイの評価：ポジティブ（PS1G384L; PS1L392V 及びBACE１）及びネガティブ（eGFP, LacZ、及び空）コントロールウイルスを、スクリーニングを模倣する無作為のＭＯＩでＨｅｋ２９３ＡＰＰｗｔ中で感染させる。Ａ及びＢ：形質導入を、それぞれ１μｌ及び０．２μｌのウイルスを用いて実行し、そしてアミロイドベータ１〜４２レベルを測定する。データは相対的光単位として表現され、かつアミロイドベータ１〜４２のｐＭに相関がある。
【図３】ＡＰＰプロセシングにおけるＧＰＲ３の関与：ＨＥＫ２９３ ＡＰＰｗｔ細胞を、Ad5/GPR3、及び異なったＭＯＩ（２、１０、５０、２５０）でネガティブコントロールウイルス（Ad5/空, Ad5/LacZ, Ad5/eGFP、及びAd5/ルシフェラーゼ）を用いて形質導入する。結果として生じたアミロイドベータ１〜４２、１〜４０、１１〜４２、ｘ〜４２、及び１〜ｘペプチドを、適切なＥＬＩＳＡを用いて測定した。データはｐＭ、又はアミロイドベータのｐＭに相関する相対的光単位（ｒｌｕ）として表現される。
【図４】ＧＰＲ３ ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションは、アミロイドベータ１〜４２を減少させる：ＨＥＫ２９３ ＡＰＰｗｔ ｃｌ２９細胞は、ＧＰＲ３、ｅＧＦＰ、ルシフェラーゼ、及びＢＡＣＥのｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、そしてアミロイドベータ１〜４２レベルを測定した。細胞をトランスフェクトし、そしてトランスフェクションの２４時間後に培地を新しくし、そして細胞は２４時間（トランスフェクション後４８時間（ｐ．ｔ．））の間、アミロイドベータが蓄積することが可能である。アミロイドベータは、先に記載されたように、アミロイドベータ１〜４２ＥＬＩＳＡの方法によって測定する。データはアミロイドベータのｐＭで表現される。ＧＰＲ３のＲＮＡレベルはこれらのサンプルから決定される。
【図５】ＧＰＲ３、ＧＰＲ６、及びＧＰＲ１２のクラスタルＷタンパク質配列比較。
【図６】異なるＭＯＩで様々なタンパク質発現ウイルスを用いてトランスフェクトされたニューロンにおける、アミロイドベータペプチドレベルのグラフ。該グラフは、初代ニューロンにおけるＧＰＲ３過剰発現の増加したレベルが、ネガティブコントロールと比較したアミロイドベータ１〜４２レベルの用量依存的増加に対応することを示す。
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、哺乳動物の神経細胞疾患の分野、及び特に効果的な化合物を同定するための方法、及びヒトにおける知的能力の進行性喪失に関連する疾患の予防及び治療に有用な、そのような化合物を用いた治療並びに組成物に関連する。
知的能力の進行的喪失として最も広く知られている神経疾患はアルツハイマー病（ＡＤ）である。世界的に、約２０００万人の人々がアルツハイマー病で苦しんでいる。ＡＤは、記憶の初期喪失に続いて見当識障害、一般的に認識機能障害としてみなされる判断並びに論理的思考の障害、及び最終的には完全な認知症によって臨床的に特徴付けられる。ＡＤ患者は最終的に該疾患の発症後４〜１２年の間、ひどく衰弱して不動状態に陥る。
【背景技術】
【０００２】
ＡＤに対する重要な病理学的証拠は、神経変性に付随する細胞外アミロイド斑及び脳内の細胞内タウタングル（tau tangle）の存在である（Ritchie及びLovestone (2002)）。細胞外のアミロイド斑は、アミロイドベータ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の代謝によって産生された不溶性アミロイドベータペプチド１〜４２の増加の結果であると考えられている。分泌の後、これらのアミロイドベータ１〜４２ペプチドは、健康な人々で優勢に産生されるアミロイドベータ１〜４０ペプチドよりも、より容易にアミロイド線維を形成する。アミロイドベータペプチドは神経毒カスケードの頂点にあるようである：実験は、アミロイドベータ線維がＰ３０１Ｌタウトランスジェニックマウスの脳内に注入された場合に、神経原線維変化の形成を促進することを示す（Gotzらの文献 (2001)）。実際に、様々なアミロイドベータペプチドが、アミロイドベータペプチド１〜４２、１〜４０、１〜３９、１〜３８、１〜３７として同定されてきており、これらは斑内に存在することもあり、かつしばしば脳脊髄液中に見られる。
【０００３】
アミロイドベータペプチドは、１及び４０又は４２の位置で、それぞれベータセクレターゼ並びにガンマセクレターゼによって切断された後、膜アンカー型ＡＰＰから生じる（プロセシングされる）（図１Ａ）（Annaert及びDe Strooperの文献(2002)）。さらに、ベータセクレターゼの高い活性は、位置１から位置１１への切断の移動によって生じる。位置１７におけるアルファセクレターゼ活性、及び４０又は４２におけるガンマセクレターゼ活性によるアミロイドベータ前駆体タンパク質の切断は、非病理的なｐ３ペプチドを生じる。ベータセクレターゼは、膜アンカー型アスパルチルプロテアーゼＢＡＣＥとして同定され、一方ガンマセクレターゼは、プレセニリン１（ＰＳ１）又はプレセニリン２（ＰＳ２）、ニカストリン、前部咽頭欠損１（Anterior Pharynx Defective 1）（ＡＰＨ１）、及びプレセニリンエンハンサー２（ＰＥＮ２）を含むタンパク質複合体である。これらのタンパク質の中で、プレセニリンは、ガンマセクレターゼの触媒活性を構成すると広く考えられている一方で、他の構成要素はタンパク質複合体の成熟化及び局在に役割を担う。いくつかの結果は、プロテアーゼＡＤＡＭ１０及びＴＡＣＥが冗長的な機能を有し得ることを指摘しているが、アルファセクレターゼの独自性はそれでも傑出している。
【０００４】
ＡＤ病状（ほとんどは早発型ＡＤ）のごく少数は、プレセニリン１及び２（ＰＳ１；ＰＳ２）、並びにアミロイドベータ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をコードする遺伝子における常染色体の優性突然変異によって引き起こされ、かつＡＰＰ，ＰＳ１及びＰＳ２における変異は、脳において産生されるアミロイドベータ１〜４２のレベルの上昇をもたらすアミロイドベータ前駆体タンパク質の代謝を変化させることが見出されている。ＰＳ１、ＰＳ２及びアミロイドベータ前駆体タンパク質の変異は、遅発型のＡＤ患者においては同定されていないが、その病理学的特性は早発型のＡＤ患者によく似ている。これらのアミロイドベータペプチドの増加レベルは、乱れたアミロイドベータ前駆体タンパク質のプロセシング（例えば、高コレステロールレベルはアミロイドベータペプチド産生を高める）、又は減少したアミロイドベータペプチドの異化から加齢に伴って進行的に起こり得る。それゆえ、遅発型のＡＤ患者のＡＤはまた、脳において異常に上昇したアミロイドペプチドレベルによって引き起こされることが一般的に受け入れられている。これらのアミロイドベータペプチド、及びより具体的にはアミロイドベータペプチド１〜４２のレベルは、健常者におけるこれらのペプチドのレベルに比較して、アルツハイマー患者において上昇している。すなわち、これらのアミロイドベータペプチドのレベルを下げることが認識機能障害を有する患者に対して有益である可能性が高い。
【０００５】
（成果報告）
主要な現在のＡＤ治療は、コリン作動性ニューロンがＡＤの間に変性する最初の神経細胞であるために低下するアセチルコリン神経伝達物質レベルを上昇させるアセチルコリンエステラーゼ酵素を阻害することによって、進行的な記憶の喪失を遅延させることに限定される。この治療は該疾患の進行を止めはしない。
【０００６】
脳においてアミロイドベータペプチドのレベルを減少させることを目的とする治療はますます調査され、そしてベータ又はガンマセクレターゼ酵素が関与する異常なアミロイドベータ前駆体タンパク質プロセシングに焦点を当てている。
本発明は、特定の既知のポリペプチドが、神経細胞においてアミロイドベータ前駆体のプロセシングの上方調節及び／又は誘導における因子であり、かつそうしたポリペプチドの機能の阻害は、アミロイドベータペプチドのレベルを下げることに効果的であるという発見に基づいている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、アミロイドベータタンパク質産生を阻害するための方法、組成物及び化合物アッセイを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、哺乳動物細胞内において、Ｇタンパク質共役受容体（「ＧＰＣＲ」）の機能とアミロイドベータ前駆体タンパク質プロセシングとの関係に関連する。
本発明のある態様は、哺乳動物細胞内において、アミロイドベータ前駆体タンパク質のプロセシングを阻害する化合物を同定するための方法であって；
（ａ）化合物を、配列番号：４〜６、２８９〜３３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに接触させること；及び
（ｂ）アミロイドベータタンパク質の産生に関連する化合物−ポリペプチド特性を測定すること、を含む。
【０００９】
本方法の態様は、ＧＰＣＲのポリペプチドドメインを使用した化合物のインビトロアッセイを含み、及びＧＰＣＲ阻害の後で二次メッセンジャーレベル及び／又はアミロイドベータペプチドレベルを含む有効性の指標を観察する細胞アッセイを含む。
本発明の別の態様は、認識機能障害に苦しんでいる又は該病気に感受性の高い対象に対して、アミロイドベータ前駆体のプロセシングを阻害するのに効果的な量のＧＰＣＲ拮抗薬（antagonist）又は逆作動薬（inverse agonist）を含む医薬組成物を投与することによって、認識機能障害を伴う病気又は該病気に対する感受性を治療又は予防する方法である。
【００１０】
本発明のさらなる態様は、前記方法での使用用途の医薬組成物であり、ここで当該阻害剤はアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）からなる群から選択されるポリペプチドを含み、当該作用物質は、配列番号：４〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする天然のポリペプチド配列に相補的な、又は該配列から設計された核酸配列を含む。
【００１１】
本発明の別のさらなる態様は、医薬として許容し得るキャリアーとの混合物中で、アミロイドベータ前駆体のプロセシング阻害するのに治療的に有効な量のＧＰＣＲ拮抗薬又は逆作動薬、若しくは医薬として許容し得る塩、水和物、溶媒和物、又はそれらのプロドラッグを含む医薬組成物である。本ポリヌクレオチド、及びＧＰＣＲ拮抗薬並びに逆作動薬化合物はまた、アルツハイマー病の治療用薬物の製造において有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
下記の用語は、以下に示された意味を有することが意図され、また本発明の記述及び意図された範囲を理解することにおいて有用である。
（定義）
用語「作動薬（agonist）」は、作動薬が結合する受容体の細胞内反応を活性化させるリガンドをさす。
【００１３】
用語「アミロイドベータペプチド」は、アミロイドベータ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）からプロセシングされたアミロイドベータペプチドを意味する。最も一般的なペプチドは、アミロイドベータペプチド１〜４０、１〜４２、１１〜４０及び１１〜４２を含む。他の種の、より一般的でないアミロイドベータペプチドはｙ−４２として記述され、このときｙは２〜１７で変動し、かつ１−ｘにおいてｘは２４〜３９から４１の間で変動する。
用語「拮抗薬」は、作動薬と同じ部位で受容体に競合的に結合するが、該受容体の活性形態によって開始される細胞内反応を活性化させない部分を意味し、それによって作動薬による細胞内反応を阻害することができる。拮抗薬は、作動薬又は部分的作動薬の不在下で、細胞内反応のベースラインを減少させない。
【００１４】
用語「キャリアー」は、溶剤、容積及び／又は使用可能な形態の医薬組成物を提供するための医薬組成物の製剤において使用される非毒性物質を意味する。キャリアーは、賦形剤、安定剤又は水性のｐＨ緩衝液などの１以上のそのような物質を含んでもよい。生理的に許容可能なキャリアーの例は、リン酸、クエン酸及び他の有機酸を含む、水性又は固形緩衝成分；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む、単糖、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール、又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【００１５】
用語「化合物」は、本明細書において本発明のアッセイに関連して記述される「テスト化合物」又は「薬剤候補化合物」の文脈で用いられる。そのようなものとして、これらの化合物は合成的に得られたか又は天然資源に由来する、有機若しくは無機化合物を含む。該化合物は、比較的低分子量として特徴付けられたポリヌクレオチド、脂質又はホルモン類似物質などの、無機又は有機化合物を含む。他の生体高分子有機テスト化合物は、約２〜約４０アミノ酸からなるペプチド、及び抗体又は抗体複合体などの約４０〜約５００アミノ酸を含むより大きなペプチドを含む。
【００１６】
用語「構成的受容体活性」は、その内因性リガンド又はその化学的同等物を用いた受容体の結合以外の手段による、活性状態における受容体の安定化を意味する。
用語「接触（contact）」又は「接触すること（contacting）」は、インビトロ（in vitro）システム内又はインビボ（in vivo）システム内を問わず、少なくとも２つの部分を１つに合わせることを意味する。
用語「病気（condition）」又は「疾患（disease）」は、症状の明白な表出（すなわち、疾病（illness））若しくは異常な臨床指標の表出（例えば、生化学的指標）を意味し、あるアミロイドベータタンパク質前駆体プロセシングの欠陥に起因する。あるいは、用語「疾患」は、そのような症状又は異常な臨床指標を発現する遺伝的危険性又は環境的危険性若しくは傾向に関連する。
【００１７】
用語「内因性（endogenous）」は、哺乳動物が自然に産生する物質を意味するものとする。例えば、限定されないが、用語「受容体」に関する内因性は、哺乳動物（例えば、限定されないが、ヒト）又はウイルスによって自然に産生されるものを意味するものとする。対照的に、この文脈における用語「非内因性（non-endogenous）」は、哺乳動物（例えば、限定されないが、ヒト）、又はウイルスによって自然に産生されないものを意味するものとする。例えば、限定されないが、その内因性形態では構成的に活性ではないが、操作された場合に構成的に活性になる受容体は、本明細書で最も好ましくは「非内因性、構成的に活性化された受容体」と呼ばれる。両方の用語を使用して、「インビボ」及び「インビトロ」システムの両方を記載することができる。例えば、限定されないが、スクリーニングアプローチにおいて、内因性又は非内因性受容体は、インビトロスクリーニングシステムに関連するかもしれない。さらなる例としては、限定されないが、哺乳動物のゲノムが非内因性の構成的に活性化された受容体を含むように操作された場合、インビボシステムの手段による候補化合物のスクリーニングは実行可能である。
【００１８】
用語「発現」は、内因性発現及び形質導入による過剰発現の両方を含む。
用語「発現性核酸」は、タンパク質分子、ＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子をコードする核酸を意味する。
用語「ハイブリダイゼーション」は、それによって核酸の鎖が塩基対を介して相補鎖に結合する任意のプロセスを意味する。用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的塩基間での水素結合の形成の効力によって、２つの核酸配列間で形成される複合体をさす。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液中（例えば、C. sub. 0t又はR.sub.0t解析）で形成してもよく、又は溶液中に存在するある核酸配列と、固形支持体（例えば、紙、膜、フィルター、チップ、ピン、又はガラススライド、若しくは細胞又はそれらの核酸が固定される任意の他の適切な基質）上に固定された別の核酸配列との間で形成してもよい。用語「厳しい条件（stringent condition）」は、ポリヌクレオチドと本特許請求の範囲に記載されたポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションを可能にする条件をさす。厳しい条件は、塩濃度、有機溶媒、例えばホルムアミドの濃度、温度、及び当業者に周知の他の条件によって定義され得る。特に、塩濃度を減少させること、ホルムアミド濃度を増加させること又はハイブリダイゼーション温度を上げることは、厳しさを増加させ得る。
【００１９】
用語「反応」に関連して、用語「阻害（inhibit）」又は「阻害すること（inhibiting）」は、化合物の不在とは反対に、化合物の存在下で反応が減少させられる又は阻止させられることを意味する。
用語「逆作動薬」は、受容体の内因性形態に結合する部分を意味し、内因性リガンド又は作動薬、若しくは膜へのＧＴＰの結合の減少の不在下で観察される通常の基準レベルの活性以下で、受容体の活性型内因性形態によって開始される基準細胞内反応を阻害する。好ましくは、該基準細胞内反応は、逆作動薬の不在下における基準反応に比較して、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、及び最も好ましくは少なくとも７５％が逆作動薬の存在下で減少させられる。
【００２０】
用語「リガンド」は、内因性の、天然の受容体に特異的な、内因性の天然分子を意味する。
本明細書で用いられているように、用語「医薬として許容し得るプロドラッグ」は、本発明において有用な化合物のプロドラッグを意味し、これは健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、妥当な利益／危険性比率に相応なアレルギー反応を有する患者の組織と接触する使用に適しており、かつ本発明の化合物のそれらの使用目的に対して効果的である。用語「プロドラッグ」は、本発明、又はその医薬として許容し得る塩、水和物、又は溶媒和物において有用な、効果的な化合物を生じさせるために、インビボで形質転換された化合物を意味する。形質転換は、血中での加水分解を介するなどの、様々な機構によって発生することがある。代謝的に切断可能な基を有する化合物は、代謝的に切断可能な基の存在の特性によって、親化合物に与えられた促進された可溶性及び／又は吸収速度の結果として生体利用効率の向上が示されることがあり、それゆえそのような化合物はプロドラッグとして機能するので有利である。徹底した議論は、『プロドラッグのデザイン』、H. Bundgaard編, Elsevier (1985)；『酵素学の方法』、 K. Widderら編, Academic Press, 42, 309-396 (1985)；『ドラッグデザイン及び開発のテキストブック』、Krogsgaard-Larsen 及びH. Bandaged編、５章；『プロドラッグのデザイン及び応用』113-191 (1991)；『上級薬剤送達概説』, H. Bundgard, 8 , 1-38, (1992)；J. Pharm. Sci, 77,285 (1988) ；Chem. Pharm. Bull., N. Nakeyaらの論文, 32, 692 (1984)；『新規デリバリーシステムとしてのプロドラッグ』、T. Higuchi及びV. Stella, 14 A.C.S. Symposium Series；及び『ドラッグデザインにおける生体可逆性キャリアー』、E. B. Roche編, American Pharmaceutical Association 及びPergamon Press, 1987において提供され、これらは引用によって本明細書に組み込まれる。プロドラッグの例は、エステルプロドラッグである。「エステルプロドラッグ」は、本発明に従って、代謝的手段（例えば、加水分解によって）によって、インビボで阻害化合物に変換可能な化合物を意味する。例えば、カルボキシ基を含む化合物のエステルプロドラッグはインビボでの加水分解によって、対応するカルボキシ基へと変換されてもよい。
【００２１】
用語「医薬として許容し得る塩」は、本発明の化合物の非毒性、無機及び有機酸付加塩並びに塩基付加塩をさす。これらの塩は、本発明において有用な化合物の最終的な単離及び精製の間に、インサイチュウで調製され得る。
用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖又は二本鎖形態の、かつセンス又はアンチセンス方向のポリ核酸、厳しい条件下において特定のポリ核酸にハイブリダイズする相補的ポリ核酸、及びその塩基対の少なくとも約６０パーセント、及びより好ましくはその塩基対の７０％が共通であり、最も好ましくは９０パーセント、及び特別な実施態様ではその塩基対の１００パーセントで相同であるポリヌクレオチドを意味する。該ポリヌクレオチドは、ポリリボ核酸、ポリデオキシリボ核酸及びそれらの合成類似物を含む。該ポリヌクレオチドは、約１０〜約５０００塩基、好ましくは約１００〜約４０００塩基、より好ましくは約２５０〜約２５００塩基の範囲の長さで変化する配列によって記載される。好ましいポリヌクレオチドの実施態様は約１０〜約３０塩基の長さを含む。ポリヌクレオチドの特別な実施態様は、約１０〜約２２ヌクレオチドのポリリボ核酸であり、より一般的には低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として記載される。別の特別な実施態様は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ポリシロキサン、及び２´−Ｏ−（２−メトキシ）エチルフォスフォロチオエートなどの修飾された骨格を有する核酸であり、又は非天然の核酸残基、若しくはメチル、チオ、硫酸、ベンゾイル、フェニル、アミノ、プロピル、クロロ及びメタノカルバヌクレオシドなどの１以上の核酸置換基、又はその検出を促進するためのレポーター分子を含む。
【００２２】
用語「ポリペプチド」は、タンパク質、タンパク性分子、（キナーゼ、プロテアーゼ、ＧＰＣＲなどの）タンパク質の一部分、ペプチド及びオリゴペプチドに関連する。
用語「溶媒和物」は、１以上の溶媒分子を有する、本発明において有用な化合物の物理的結合を意味する。この物理的結合は水素結合を含む。特定の例において溶媒和物は、例えば、１以上の溶媒分子が結晶性固体の結晶格子に組み込まれた場合に単離可能であろう。「溶媒和物」は、液相、及び単離可能な溶媒和物の両方を含む。代表的な溶媒和物は、水和物、エタノレート及びメタノレートを含む。
【００２３】
用語「対象」は、ヒト及び他の哺乳動物を含む。
用語「有効量」又は「治療的に効果的な量」は、医師又は他の臨床医によって探求される対象の生物学的若しくは医学的反応を誘導するであろう化合物の量又は作用物質の量を意味する。特に、神経疾患の治療に関して、用語「有効量」は対象の脳組織中の、アミロイドベータペプチドのレベルの生物学的に有意な減少を引き起こすであろう化合物又は作用物質において、効果的にアミロイドベータ前駆体プロセシングを阻害する量を意味することを意図する。
【００２４】
用語「治療すること（treating）」は、その病状の進行を防ぐ又は病状を変化させる意図をもって実行される介入を意味し、それによってそうした障害又は病気の１以上の症状を含む障害、疾患又は病気を緩和させる。したがって、「治療すること」は、治療的処置、及び予防又は再発防止策の両方をさす。治療が必要な人々は、疾患が予防されている人々同様、その疾患にすでに罹っている人々も含む。本明細書で使用されているように、関連した用語「治療（treatment）」は、用語「治療すること」が先に定義したように、障害、症状、疾患又は病気を治療する行為をさす。
本発明の発見の背景は、以下において手短に記載される。
【００２５】
（Ｇタンパク質共役受容体の背景）
１９９４年にMarcheseとその同僚は、ＧＰＲ３遺伝子（Marcheseらの文献、1994）をクローニングし、１年後に、単一エキソンが３３０アミノ酸を有するこの受容体タンパク質をコードすることが見出され、アデニル酸シクラーゼ構成的活性化因子（ＡＣＣＡ）と呼ばれた。そのアミノ酸配列に基づいて、ＧＰＲ３を、ＧＰＲ６及びＧＰＲ１２と同じサブファミリーに分類することができた：ＧＰＲ３とＧＰＲ６は５８％の同一性、及びＧＰＲ３とＧＰＲ１２は５７％の同一性を示す（図５）。
【００２６】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は共通の構造モチーフを共有する。全てのこれらの受容体は、それぞれが７個の膜貫通ドメインを形成して膜を貫通する７個のアルファへリックスを形成する２２〜２４個の疎水性アミノ酸の７個の配列、細胞外Ｎ末端、及び細胞内Ｃ末端を有する。該膜貫通へリックスは、膜の細胞外側上の４番目から５番目の膜貫通ヘリックスの間のより大きなループを有するアミノ酸の鎖によって連結される。主に親水性アミノ酸で構成される別の大きなループは、膜の細胞内側上の膜貫通ヘリックス５及び６に連結する。図１Ｂを参照されたい。
【００２７】
生理的条件下において、ＧＰＣＲは２つの異なる状態又は立体構造：「不活性」状態及び「活性」状態の間で、平衡に細胞膜内に存在する。不活性状態の受容体は、細胞内変換経路に繋がり、生物学的反応を生じさせることはできない。活性化状態への受容体立体構造の変化は変換経路への繋がりを可能にし、生物学的反応を生じさせる。受容体は、内因性リガンド又は外因性作動薬リガンドによって、活性状態に安定化されることもある。最近の発見である該受容体のアミノ酸配列への修飾（それだけに限定されない）は、該活性状態立体構造を安定化させるためのリガンド以外の代替機構を提供している。これらのアプローチは、受容体に結合するリガンドの効果を刺激することによって、受容体を活性化状態に効率的に安定化させる。そのようなリガンド独立的アプローチによる安定化は「構成的受容体活性化」と称される。
【００２８】
ＧＰＣＲによって活性化される主要なシグナル変換カスケードは、３つの異なるタンパク質；Ｇα、Ｇβ及びＧγサブユニットから構成されるヘテロ三量体Ｇタンパク質の活性化によって開始される。カルボキシ末端同様、ヘリックス５及び６に連結しているループはＧタンパク質と相互作用していると考えられる。Uhlenbrockと同僚は（2002）、ＧＰＲ３、ＧＰＲ６及びＧＰＲ１２の全てが、Ｇ（ａ）（ｓ）及びＧ（ａ）（ｉ／ｏ）の構成的活性化を与えることを示し、かつ、最近、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）及びジヒドロスフィンゴシン−１−リン酸（ＤＨＳ１Ｐ）は、ＧＰＲ３、ＧＰＲ６及びＧＰＲ１２に対する生物活性の脂質リガンドとして同定された（Uhlenbrockらの論文、2002）。該ＧＰＲ３、ＧＰＲ６及びＧＰＲ１２の発現プロファイルもまた同様である：それらは全て脳組織において一次発現している。
【００２９】
シグナル変換カスケードは作動薬による受容体の活性化と共に開始する。該受容体における変形的変化はそれからＧタンパク質へと移行される。Ｇタンパク質は、Ｇα及びＧβγサブユニットへと解離する。両方のサブユニットは、該受容体から解離し、両方とも異なる細胞性反応を開始することができる。最もよく知られているのは、Ｇαサブユニットによって開始される細胞性効果である。Ｇタンパク質が、それらのＧαサブユニットによって分類されるのはこの理由による。Ｇタンパク質は、Ｇｓ、Ｇｉ／ｏ、Ｇｑ及びＧ１２／１３の４つのグループに分けられる。 これらのＧタンパク質のそれぞれは、エフェクタータンパク質を活性化させることができ、細胞内の二次メッセンジャーの変化をもたらす。二次メッセンジャーのレベル変化は、細胞を特定様式の細胞外シグナルに応答させる引き金である。ＧＰＣＲの活性は、二次メッセンジャーの活性レベルを測定することによって測定され得る。
【００３０】
細胞における２つの最も重要な二次メッセンジャーは、ｃＡＭＰ、及びＣａ２＋である。Ｇタンパク質のＧｓクラスのαサブユニットはアデニル酸シクラーゼを活性化することができ、ＡＴＰからｃＡＭＰへの代謝回転の増加をもたらす。Ｇｉ／ｏＧタンパク質のαサブユニットは正反対のことを行い、アデニル酸シクラーゼ活性を阻害し、細胞のｃＡＭＰレベルの減少をもたらす。これら２つのクラスのＧタンパク質は共に、二次メッセンジャーｃＡＭＰを制御する。Ｃａ２＋は、Ｇタンパク質のＧｑクラスのαサブユニットによって制御される。フォスフォリパーゼＣの活性化を介して、細胞膜からのフォスファチジルイノシトール４，５−ビスフォスフェート（ＰＩＰ２）は、イノシトール１，４，５−トリフォスフェート及び１，２−ジアシルグリセロールに加水分解され、これらの分子の両方は二次メッセンジャーとして作用する。イノシトール１，４，５−トリフォスフェートは、小胞体において特定の受容体と結合し、Ｃａ２＋チャネルの開口、そして細胞質内でのＣａ２＋の放出をもたらす。
【００３１】
ＧＰＣＲに与えられた機能は明らかではない。ＧＰＲ３及びＧＰＲ１２の発現レベルは、せん断応力後のヒト臍帯静脈内皮細胞において上昇する（Uhlenbrockらの文献、2003）。スフィンゴシン−１−リン酸は、ＧＰＲ３及びＧＰＲ１２に対するリガンドなので、上記データはヒト内皮細胞において、スフィンゴシン−１−リン酸介在性細胞内シグナリングにおける両方のＧＰＣＲの役割を示唆する。またＧＰＲ３及びＧＰＲ６の発現は、齧歯動物肥満モデルにおいて異なった制御をされることから、両方のＧＰＣＲ（＋ＧＰＲ２）は、食欲、空腹感、及び満腹感の制御における、潜在的薬剤標的として考えられる。一方、ＧＰＲ１２は、有糸分裂後ニューロンの分化及び成熟化に関与しているように見受けられる（Ignatovらの文献、2003）。
【００３２】
（参考文献）
Annaert, W.及びB. De Strooperの論文 (2002). 『アルツハイマー病についての細胞生物学的展望』Annu Rev Cell Dev Biol 18: 25-51.
Gotz, J., F. Chenらの論文(2001). 『Ａベータ４２原線維によって誘導されるＰ３０１１タウトランスジェニックマウスにおける神経原線維変化の形成』Science 293(5534): 1491-5.
Ignatov, A.; Lintzel, J.; Hermans-Borgmeyer, L; Kreienkamp, H-J., Joost, P.; Thomsen, S.; Methner, A.及びSchaller, H.C. の論文(2003). 『スフィンゴシルフォスフォリルコリンに対する高親和性受容体としてのＧタンパク質共役受容体ＧＰＲ１２の役割とその発現、及び脳の発達における機能』J. Neurosci. 23, 3: 907-914.
Lipinski, C. A., Lombardo, F., Dominy, B. W.,及びFeeneyの論文, P. J. Adv. Drag. Deliv. Rev., 23, 3-25, 1997
Marchese, A.; Docherty, JM.; Nguyen, T.; Heiber, M.; Cheng, R.; Heng, HH.; Tsui, LC; Shi, X.; George SR. 及びO'Dowd, BF.の論文 (1994). 『新規Ｇタンパク質共役受容体をコードするヒト遺伝子のクローニング』Genomics, 23, 3: 609-618.
Marinissen, M. J. 及びJ. S. Gutkind の論文(2001). 『Ｇタンパク質共役受容体及びシグナリングネットワーク：新たなパラダイム』Trends Pharmacol Sci 22(7): 368-76.
Ritchie, K. 及びS. Lovestoneの論文 (2002). 『認知症』 Lancet 360(9347): 1759-66.
Uhlenbrock, K.; Gassenhuber, H. 及びKostenis, E.の論文 (2002). 『スフィンゴシン−１−リン酸は構成的活性型Ｇタンパク質共役受容体の、ヒトＧＰＲ３ファミリー、ヒトＧＰＲ６ファミリー及びヒトＧＰＲ１２ファミリーのリガンドである』Cell Signal, 14, 11 : 941- 953.
Uhlenbrock, K.; Huber, J.; Ardati, A; Bush, AE. 及びKostenis, E. の論文(2003). 『流体せん断応力は、ヒト臍帯静脈内皮細胞におけるＧＰＲ３、ＧＰＲ６、及びＧＰＲ１２を別々に制御する』Cell Physiol. Biochem. 13, 2: 75- 84.
Wess, J. の論文(1998). 『受容体／Ｇタンパク質共役選択性の分子基盤』Pharmacol Ther 80(3): 231-64.
【００３３】
（ＧＰＣＲとアミロイドベータペプチドとの関連性に基づいた本出願人の発明）
先に記載されたように、本発明は、Ｇタンパク質共役受容体（「ＧＰＣＲ」）が、哺乳動物、及び基本的には神経細胞におけるアミロイドベータ前駆体プロセシングの上方調節及び／又は誘導における因子であること、並びにそのようなポリペプチドの機能の抑制はアミロイドベータタンパク質ペプチドのレベルを減少させることに効果的であるという、本発明者の発見に基づいている。
【００３４】
本発明者は、ＧＰＣＲ、及びより特異的にはＧＰＲ３、並びにアミロイドベータペプチド形成及び分泌を関連づける予備知識を何も持たない。以下の実験の項においてより詳細に議論されるように、本発明者は、ＧＰＲ３の過剰発現は形質導入細胞の馴化培地におけるアミロイドベータ１〜４２を増加させ、そしてＧＰＲ３のノックダウンは減少させることを示す。ＧＰＲ３、ＧＰＲ６及びＧＰＲ１２の優勢な発現は中枢神経系の組織内であるので、本発明はこれらの知見、及びＧＰＣＲがアルツハイマー病に対する推定上の薬剤標的であるという認識に基づいている。
【００３５】
本発明のある態様は、哺乳動物細胞におけるアミロイドベータ前駆体タンパク質のプロセシングを阻害する化合物を同定するための上記の発見に基づいた方法であり、それゆえ対象におけるアミロイドベータペプチドレベルを減少させることに有用であるかもしれない。本方法は、薬剤候補化合物をＧＰＣＲポリペプチド又は前記ポリペプチドのフラグメントに接触させること、及びアミロイドベータタンパク質の産生に関連する化合物−ポリペプチド特性を測定することを含む。「化合物−ポリペプチド特性」は、一般的な当業者によって選択される測定可能な現象であり、かつＧＰＣＲの活性化及び不活化は、アミロイドベータタンパク質前駆体プロセシングのそれぞれ活性化及び不活化、並びにアミロイドベータペプチドレベルのそれぞれ増加及び減少における原因因子であるという認識に基づいている。該測定可能な特性は、ＧＰＣＲポリペプチドのペプチドドメインに対する結合親和性から、ＧＰＣＲの活性化又は不活化から生じる多くの『二次メッセンジャー』の任意の１つのレベル、上記の二次メッセンジャーに直接結合したレポーター分子の特性、及び最終的には該化合物に接触した哺乳動物細胞によって分泌されたアミロイドベータペプチドのレベルにまで及ぶこともある。
【００３６】
当業者の選択によっては、本アッセイ方法を一連の測定として機能するためにデザインしてもよく、各測定を、薬物候補化合物がアミロイドベータペプチド経路に対するＧＰＣＲ上で実際に作用しているかどうかを決定するためにデザインした。例えば、ＧＰＣＲ又はそのフラグメントに対する化合物の結合親和性を測定するためにデザインされたアッセイは、テスト化合物が対象に投与された場合にアミロイドベータペプチドレベルを減少させるのに有用であるかどうかを確定させるために必要であるかもしれないが、十分ではない。それにもかかわらず、そのような結合の情報は、異なる特性、さらに下流の生化学的経路を測定する検査における使用のためのテスト化合物のセットを同定することに有用であるかもしれない。そのような二番目のアッセイをデザインして、ＧＰＣＲペプチドへの結合親和性を有するテスト化合物が、哺乳動物細胞において、作動薬又は逆作動薬としてＧＰＣＲ機能を実際に下方調節又は阻害することを確認してもよい。このさらなるアッセイで、ＧＰＣＲの活性化又は不活化の直接的な結果である二次メッセンジャー、若しくは二次メッセンジャーに応答する合成レポーターシステムを測定してもよい。異なる二次メッセンジャーを測定すること、及び／又はアッセイシステム自体が直接的に影響されずかつＧＰＣＲ経路ではないことを確認することは、おそらくさらに該アッセイの正当性を立証するであろう。後者の事項において、適切なコントロールを常に行い、擬陽性の解釈を防ぐ手段をとるべきである。
【００３７】
これらの測定を行う順番は本発明の実行に極めて重要であるとは考えられないので、これは任意の順番で実行されてよい。例えば、化合物のＧＰＣＲへの結合親和性についての情報が知られていない化合物セットのスクリーニングアッセイが最初に実行してもよい。あるいは、ＧＰＣＲペプチドドメインに対して結合親和性を有するものとして同定された化合物、又はＧＰＣＲの作動薬又は逆作動薬であるとして同定された化合物のクラスのセットをスクリーニングしてもよい。ＧＰＣＲポリペプチドの膜内ドメインでの可能な化合物相互作用のためにＧＰＣＲに対する結合親和性を知ることは必須ではなく、そのドメイン立体構造を親和性実験において再現することができなくてもよい。しかしながら、本アッセイが薬物候補化合物の最終的な使用に有意であるために、二次メッセンジャー又は最終的なアミロイドベータペプチドレベルの測定は必要である。コントロール及びＧＰＣＲへの結合親和性の測定を含む検証実験はそれでもなお、全ての治療的又は診断的用途において有用な化合物を同定することにおいて有用である。
【００３８】
本アッセイ方法は、１以上のＧＰＣＲタンパク質又はそれらのフラグメント若しくはＧＰＣＲポリペプチドを過剰発現するベクターを用いて形質導入された細胞から作られた膜画分を用いて、インビトロで実行してもよい。ＧＰＣＲのアミノ酸配列及びそれらの有用なフラグメントは、配列番号：４〜６、２８９〜３３３において見出される。ポリペプチドと化合物との結合親和性は、表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Biacore）、標識された化合物を用いた飽和結合解析（例えば、Scatchard及びLindmo解析）、微分紫外分光光度計、蛍光偏光アッセイ、蛍光分析イメージングプレートリーダー（FLIPR（登録商標））システム、蛍光共鳴エネルギー転移、及び生物発光共鳴エネルギー転移の使用などの当業者に既知の方法によって測定され得る。化合物の結合親和性はまた、解離定数（Ｋｄ）又はＩＣ５０若しくはＥＣ５０で表現され得る。ＩＣ５０は、別のリガンドのポリペプチドへの結合の５０％阻害に対して必要とされる化合物の濃度を表す。ＥＣ５０は、受容体機能を測定する任意のアッセイにおいて最大効果の５０％を獲得するために必要とされる濃度を表す。解離定数Ｋｄは、リガンドがポリペプチドにどのくらい結合しているかの測定であって、ポリペプチド上の結合部位のちょうど半分を飽和させるために必要とされるリガンド濃度に等しい。高親和性結合を有する化合物は、低いＫｄ、低いＩＣ５０値、及び低いＥＣ５０値、すなわち１００ｎＭから１ｐＭの範囲を有しており；中程度から低親和性結合は、高いＫｄ，高いＩＣ５０値、及び高いＥＣ５０値、すなわちマイクロモラーの範囲に関連する。
【００３９】
本アッセイ方法はまた細胞アッセイにおいて実施してもよく、ＧＰＣＲポリペプチドを発現している宿主細胞は、ポリペプチドの内因性発現を有する細胞又は例えば形質導入によってポリペプチドを過剰発現している細胞であり得る。ポリペプチドの内因性発現が容易に測定し得るベースラインを決定するのに十分でない場合、ＧＰＣＲを過剰発現する宿主細胞を使用してもよい。過剰発現は、二次メッセンジャーのレベルが内因性発現による活性レベルよりも高いという利点を有する。したがって、現在利用可能な技術を用いてそのようなレベルを測定することはより容易である。そのような細胞アッセイにおいて、サイクリックＡＭＰ、又はＣａ２＋、サイクリックＧＭＰ、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）及び／又はジアシルグリセロール（ＤＡＧ）などの二次メッセンジャーを使用してＧＰＣＲの生物学的活性を測定してもよい。サイクリックＡＭＰ、又はＣａ２＋は、測定するのに好ましい二次メッセンジャーである。二次メッセンジャーの活性化は以下に議論される、ＥＬＩＳＡ又は放射性テクノロジーによって直接的に、若しくはレポーター遺伝子解析によって間接的にのいずれかの、いくつかの異なる技術によって測定してもよい。好ましくは、該方法はさらに、ベースラインレベルを決定する前に該宿主細胞をＧＰＣＲに対する作動薬に接触させることを含む。作動薬の添加はさらにＧＰＣＲを刺激し、それによってさらに二次メッセンジャーの活性レベルが増加する。いくつかのそのような作動薬（リガンド）は当業者に既知であり；好ましくは、スフィンゴシン−１−リン酸又はジヒドロスフィンゴシン−１−リン酸である。ＧＰＣＲポリペプチド、過剰発現、又は活性化された場合、分泌されたアミロイドベータペプチドのレベル。
【００４０】
本発明はさらに、哺乳動物細胞におけるアミロイドベータ前駆体タンパク質のプロセシングを阻害する化合物を同定するための方法に関連し：
（ａ）化合物を配列番号：４〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに接触させること、
（ｂ）該化合物の該ポリペプチドに対する結合親和性を決定すること、
（ｃ）該化合物を発現している哺乳動物細胞の集団を、少なくとも１０マイクロモラーの結合親和性を示す化合物と接触させること、及び
（ｄ）哺乳動物細胞内で、アミロイドベータ前駆体タンパク質のプロセシングを阻害する化合物を同定することを含む。
【００４１】
本発明のさらなる実施態様は、細胞におけるアミロイドベータ前駆体タンパク質のプロセシングを阻害する化合物を同定するための方法に関連し、ここでＧＰＣＲポリペプチドの活性レベルは、１以上の二次メッセンジャーのレベルを決定するために測定され、このとき一次又は二次メッセンジャーは、該二次メッセンジャーに応答するプロモータによって制御されるレポーターを用いて決定される。該レポーターは、二次メッセンジャーの細胞レベルに応答するプロモータの制御下のレポーター遺伝子である。そのような好ましい二次メッセンジャーは、サイクリックＡＭＰ、又はＣａ２＋である。レポーター遺伝子は容易に検出される遺伝子産物を有するべきであり、当該宿主細胞内に安定的に感染されてもよい。そのような方法は任意の当業者に周知である。
【００４２】
レポーター遺伝子は、数あるなかでも、アルカリフォスファターゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、不安定化緑色蛍光タンパク質（ｄＧＦＰ）、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼから選択されてよい。レポーターはすぐに利用可能であり、かつ広い範囲にわたって測定することが容易なルシフェラーゼ又はベータガラクトシダーゼが好ましい。レポーター構築におけるプロモータは、サイクリックＡＭＰ応答性プロモータ、ＮＦ−ＫＢ応答性プロモータ又はＮＦ−ＡＴ応答性プロモータが好ましい。サイクリックＡＭＰ応答性プロモータは、当該細胞内において、サイクリックＡＭＰのレベルに応答する。ＮＦ−ＡＴ応答性プロモータは、当該細胞内の細胞質Ｃａ２＋レベルに感受性である。ＮＦ−ＫＢ応答性プロモータは、当該細胞内の活性化されたＮＦ−κＢレベルに対して感受性である。
【００４３】
本発明のさらなる実施態様は、細胞内でアミロイドベータ前駆体タンパク質のプロセシングを阻害する化合物を同定するための方法に関連し、このときＧＰＣＲポリペプチドの活性レベルはアミロイドベータペプチドのレベルを決定することによって測定される。これらのペプチドのレベルは、異なるアミロイドベータペプチド種を特異的に認識する抗体を用いた特異的ＥＬＩＳＡを用いて測定してもよい（例えば、実施例１を参照されたい）。様々なアミロイドベータペプチドの分泌はまた、全てのペプチドに結合する抗体を用いて測定してもよい。アミロイドベータペプチドのレベルはまた、質量分析解析によって測定され得る。
【００４４】
ハイスループットを目的とするために、化合物のライブラリーは抗体フラグメントライブラリー、ペプチドファージディスプレーライブラリー、ペプチドライブラリー（例えば、ＬＯＰＡＰ（商標）、Sigma Aldrich社）、脂質ライブラリー（BioMol社）、合成化合物ライブラリー（例えば、ＬＯＰＡＣ（商標）、Sigma Aldrich社）又は天然化合物ライブラリー（Specs, TimTec社）などを使用してもよい。
【００４５】
好ましい薬剤候補化合物は低分子量化合物である。低分子量化合物、すなわち５００ダルトン以下の分子量を有する化合物は、生物学的システムにおいて優れた吸収能及び浸透能を有する可能性が高く、結果として５００ダルトンより上の分子量を有する化合物よりも良好な薬剤候補である可能性がより高い（Lipinskiらの文献(1997)）。ペプチドは既知のＧＰＣＲ拮抗薬であるので、ペプチドは薬剤候補化合物の別の好ましいクラスを含む。おそらくペプチドはすばらしい薬剤候補であり、また稔性ホルモン及び血小板凝集阻害剤などの商業的に価値のあるペプチドの複数の例がある。天然の化合物は薬剤候補化合物の別の好ましいクラスである。そのような化合物は天然資源に見出され、天然資源から抽出され、その後合成されることもある。脂質は薬剤候補化合物の別の好ましいクラスである。脂質は表２にリスト化されているＧＰＣＲの拮抗薬でもよい（配列番号：１〜３、４〜６）。
【００４６】
薬剤候補化合物の別の好ましいクラスは抗体である。本発明はまた、ＧＰＣＲの細胞外ドメインに対して指示される抗体を提供する。これらの抗体は、ＧＰＣＲの１以上の細胞外ドメインに特異的に結合すべきであり、あるいは後に更に記載されるように内因性的に産生され、細胞内ＧＰＣＲドメインに結合するよう設計されるべきである。これらの抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってよい。本発明は、ＦＡｂフラグメント並びにＦＡｂ発現ライブラリーの産物、及びＦｖフラグメント並びにＦｖ発現ライブラリーの産物のみならず、キメラ抗体、一本鎖抗体及びヒト化抗体を含む。
【００４７】
特定の実施態様において、ポリクローナル抗体を本発明の実践において使用してもよい。当業者はポリクローナル抗体の調製方法を知っている。ポリクローナル抗体は、例えば、１以上の免疫剤及び所望ならばアジュバントの注射によって、哺乳動物内で抗体価を上げることができる。典型的には、免疫剤及び／又はアジュバントは、複数回の皮下又は腹腔内注射によって哺乳動物内へ注入される。抗体はまた、無傷のＧＰＣＲタンパク質又はポリペプチド若しくは細胞外ドメインペプチドなどのフラグメント、複合体を含む誘導体、又はＧＰＣＲタンパク質の他のエピトープ若しくは細胞膜に埋め込まれたＧＰＣＲなどのポリペプチド、又はファージディスプレーライブラリーなどの抗体可変領域のライブラリーに対して生成されることもある。
【００４８】
免疫された動物において免疫原性であることが知られているタンパク質に免疫剤を共役させることは有用である可能性がある。そのような免疫原性タンパク質の例は、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン及びダイズトリプシン阻害因子を含むがこれらに限定されない。使用されてもよいアジュバントの例は、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノフォスフォリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート）を含む。不適切な実験をしていない当業者は免疫プロトコールを選択することもある。
【００４９】
いくつかの実施態様において、抗体はモノクローナル抗体であってよい。モノクローナル抗体を当業者に周知の方法を使用して調製してもよい。本発明のモノクローナル抗体を「ヒト化」して、当該宿主を該抗体への免疫反応の高まりから保護してもよい。「ヒト化抗体」は、分子レベルで、相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び／又は軽鎖並びに／若しくは重鎖可変領域構造の他の部分がヒト以外の免疫グロブリンに由来するが、当該分子の残りの部分は１以上のヒト免疫グロブリンに由来する抗体である。またヒト化抗体は、ドナー又はアクセプターに関連するヒト化重鎖、修飾されていない軽鎖又はキメラ軽鎖によって特徴付けられる抗体を含み、或いはそれらの特徴を持つ抗体がヒト化抗体を含む。抗体のヒト化は当業者に周知の方法によって達成してもよい（例えば、Mark及びPadlanらの文献, (1994) 「４章．モノクローナル抗体のヒト化」『実験薬理学のハンドブック 第１１３巻』, Springer- Verlag, New Yorkを参照されたい）。トランスジェニック動物を使用してヒト化抗体を発現してもよい。
【００５０】
ヒト抗体はまた当業者に既知の様々な方法を用いて産生することができ、ファージディスプレーライブラリーを含む（Hoogenboom及びWinterの論文, (1991) J. MoI. Biol. 227:381- 8; Marksらの論文 (1991). J. MoI. Biol. 222:581-97）。Coleら、及びBoernerらの技術もまたヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である（Coleらの文献(1985) 『モノクローナル抗体及びガン治療』, Alan R. Liss, p. 77; Boernerらの論文 (1991). J. Immunol., 147(l):86-95）。
【００５１】
一本鎖抗体の産生用途の当業者に既知の技術は、ＧＰＣＲポリペプチド及び本発明のタンパク質に対する一本鎖抗体を産生するために適用され得る。一本鎖抗体は一価抗体であってよい。一価抗体の調製方法は当業者に既知である。例えばある方法は、免疫グロブリン軽鎖と修飾された重鎖の組換え発現を含む。該重鎖は、重鎖の交差結合を防ぐためにそのＦｃ領域内の任意の箇所で一般的に切り捨てられる。あるいは；関連するシステイン残基は、交差結合を防ぐために別のアミノ酸残基に置換されるか又は削除される。
【００５２】
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に、好ましくは細胞表面タンパク質又は受容体若しくは受容体サブユニットに特異的に結合するモノクローナル抗体、好ましくはヒトの又はヒト化モノクローナル抗体である。本事例において、結合特異性の１つはＧＰＣＲのある細胞外ドメインに対するものであり、他の１つは同じ又は異なるＧＰＣＲの別の細胞外ドメインに対するものである。
【００５３】
二重特異性抗体の作成方法は当業者に既知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え産生は２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現に基づいており、このとき当該２つの重鎖は異なる特異性を有する（Milstein及びCuelloの論文, (1983) Nature 305:537-9）。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の無作為の組み合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を産生し、そのうちの１種だけが正しい二重特異性構造を有する。親和性クロマトグラフィーの段階は通常、正しい分子の精製を達成する。同様な手順は、Trauneekerらの論文(199I) EMBO J. 10:3655-9に開示されている。
【００５４】
別の好ましい実施態様に従って、アッセイ法はＧＰＣＲへの結合親和性を有するものとして同定された薬剤候補化合物、及び／又は１以上のＧＰＣＲに対する拮抗薬又は逆作動薬活性などの下方制御活性を有するものとしてすでに同定されている薬物候補化合物を使用することを含む。そのような化合物の例は米国特許第6,420,563号（WO 01/62765）に開示されるアリールオキシジチオウレアであり、そこで開示される活性逆作動薬については引用によって本明細書に組み込まれる。
【００５５】
本発明の別の態様は哺乳動物細胞におけるアミロイドベータ前駆体タンパク質プロセシングを減少させるための方法に関連し、哺乳動物細胞を、ＧＰＣＲポリペプチドをコードするポリリボヌクレオチドの該細胞内における翻訳を阻害する発現阻害剤と接触させることによることを含む。特定の実施態様は、発現阻害剤と標的ＧＰＣＲｍＲＮＡを対を形成して機能する、少なくとも１つのアンチセンス鎖を含むポリヌクレオチドを含む組成物に関連し、それによってＧＰＣＲポリペプチドの発現を下方調節又は阻止する。該発現阻害剤は、好ましくはアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み、前記発現阻害剤は配列番号：４〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする天然のポリヌクレオチド配列に相補的な、又は該配列から設計された核酸配列を含む。
【００５６】
本発明の特別な実施態様は、発現阻害剤が、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、配列番号：４〜６をコードするポリリボヌクレオチドを切断するリボザイム、ｓｉＲＮＡがＧＰＣＲポリリボヌクレオチドからＧＰＣＲポリペプチドへの翻訳を妨げるような配列番号４〜６に一致するポリリボヌクレオチドの一部分に十分に相同的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）からなる群から選択される方法に関連する。
【００５７】
本発明の別の実施態様は、発現阻害剤がアンチセンスＲＮＡを発現する核酸、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、配列番号：４〜６をコードするポリリボヌクレオチドを切断するリボザイム、ｓｉＲＮＡがＧＰＣＲポリリボヌクレオチドのＧＰＣＲポリペプチドへの翻訳を妨げるような配列番号４〜６に対応するポリリボヌクレオチドの一部分に対して十分に相同的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である方法に関連する。好ましくは、本発現阻害剤は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、又は配列番号：７〜２８７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡである。
【００５８】
アンチセンス核酸を用いた遺伝子発現の下方調節は、翻訳又は転写レベルで達成され得る。本発明のアンチセンス核酸は、好ましくは、ＧＰＣＲポリペプチド又は対応するメッセンジャーＲＮＡをコードする核酸の全て若しくは一部を用いて特異的にハイブリダイズすることができる核酸フラグメントである。さらにアンチセンス核酸はその一次転写産物のスプライシングを阻害することによって、ＧＰＣＲポリペプチドをコードすることができる核酸配列の発現を減少させるようにデザインされてもよい。任意の長さのアンチセンス配列は、ＧＰＣＲをコードする核酸の発現を下方調節又は阻止することができる限り本発明の実行に適する。好ましくは、アンチセンス配列は少なくとも約１７ヌクレオチドの長さである。アンチセンス核酸、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡの調製及び使用、並びにオリゴ及び遺伝的アンチセンスの使用は当業者に既知である。
【００５９】
発現阻害剤のある実施態様は、配列番号：１〜３を含む核酸に対してアンチセンスである核酸である。例えばアンチセンス核酸（例えば、ＤＮＡ）は、配列番号：１〜３を含む核酸の細胞性発現を阻害するための遺伝子治療として、インビトロで細胞内へ導入、又はインビボで対象に投与してもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは約１７〜約１００ヌクレオチドを含む配列を含み、より好ましくは該アンチセンスオリゴヌクレオチドは約１８〜約３０ヌクレオチドを含む。アンチセンス核酸は反対方向に発現する、配列番号：１〜３の該配列から選択される約１０〜約３０の連続したヌクレオチドから調製されてよい。
【００６０】
アンチセンス核酸は好ましくはオリゴヌクレオチドであり、デオキシリボヌクレオチド、修飾されたデオキシリボヌクレオチド又は両方のいくつかの組み合わせだけでなることもある。アンチセンス核酸は合成オリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドを、所望ならば安定性及び／又は選択性を向上させるために化学的に修飾してもよい。オリゴヌクレオチドは細胞内ヌクレアーゼによる分解に感受性であるため、修飾は、例えばフォスフォジエステル結合の遊離酸素原子を置換するための硫黄基の使用を含み得る。この修飾はフォスフォロチオエート結合と呼ばれる。フォスフォロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは水溶性、ポリアニオン性であり、かつ内因性ヌクレアーゼに耐性である。さらにフォスフォロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドがその標的部位にハイブリダイズした場合、ＲＮＡ−ＤＮＡ二量体はハイブリッド分子のｍＲＮＡ成分を切断する内因性酵素リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｈを活性化させる。
【００６１】
さらに、フォスフォアミダイト及びポリアミド（ペプチド）結合を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは合成され得る。これらの分子はヌクレアーゼ分解に対してかなり抵抗性であるべきである。さらに、糖部分の２´炭素、及びピリミジンの５炭素（Ｃ−５）に化学基を付加して安定性を増大させ、かつその標的部位へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合を促進することができる。修飾は当業者に既知の他の修飾と同様、２´−デオキシ、Ｏ−ペントキシ、Ｏ−プロポキシ、Ｏ−メトキシ、フルオロ、メトキシエトキシフォスフォロチオエート、修飾された塩基を含んでよい。
【００６２】
ＧＰＣＲのレベルを減少させる発現阻害薬剤の別のタイプは、リボザイムである。リボザイムは、個々の触媒及び基質結合ドメインを有する触媒ＲＮＡ分子（ＲＮＡ酵素）である。基質結合配列は、ヌクレオチドの相補性、及び場合によってはその標的配列との非水素結合相互作用によって結合する。触媒部位は特定の部位で標的ＲＮＡを切断する。リボザイムの基質ドメインを設計して、それを特定のｍＲＮＡ配列に指示することができる。リボザイムは認識し、それから相補的塩基対を介して標的ｍＲＮＡに結合する。いったん正しい標的部位に結合すると、リボザイムは酵素的に対象のｍＲＮＡを切断するために作用する。リボザイムによるｍＲＮＡの切断は、対応するポリペプチドの合成を指示するためのその能力を破壊する。いったんリボザイムがその標的配列を切断するとリボザイムは放出され、繰り返し結合し、他のｍＲＮＡを切断することが可能である。
【００６３】
リボザイムの形態は、ハンマーヘッドモチーフ、ヘアピンモチーフ、デルタ肝炎ウイルス、グループＩイントロン、又はＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列に関連して）モチーフ、若しくはアカパンカビＶＳ ＲＮＡモチーフを含む。ハンマーヘッド又はヘアピン構造を有するリボザイムは、これらの触媒ＲＮＡ分子が細胞内の真核生物プロモータから発現され得るので、容易に調製される（Chenらの論文(1992) Nucleic Acids Res. 20:4581-9）。本発明のリボザイムは適切なＤＮＡベクターから真核生物細胞内で発現され得る。所望ならば、リボザイムの活性を、２番目のリボザイムによる一次転写産物からのその放出によって増加させてもよい（Venturaらの論文(1993) Nucleic Acids Res. 21 :3249-55）。
【００６４】
リボザイムは、オリゴデオキシリボヌクレオチドを、転写後に標的ｍＲＮＡにハイブリダイズする配列の側面に位置するリボザイム触媒ドメイン（２０ヌクレオチド）に組み合わせることによって化学的に合成してもよい。オリゴデオキシリボヌクレオチドは、基質結合配列をプライマーとして用いることによって増幅される。増幅産物は、真核生物発現ベクター内にクローニングされる。
【００６５】
リボザイムは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はウイルスベクター内に挿入された転写単位から発現される。リボザイム配列の転写は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌＩ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）、又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）に対するプロモータから駆動される。ｐｏｌＩＩ又はｐｏｌＩＩＩプロモータからの転写産物は、全ての細胞において高レベルで発現されるであろう；所与の細胞型における所与のｐｏｌＩＩプロモータのレベルは、近隣の遺伝子制御配列次第であろう。該原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適切な細胞において発現される限り、原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモータもまた使用される（Gao及びHuangの論文, (1993) Nucleic Acids Res. 21:2867-72）。これらのプロモータから発現されたリボザイムは、哺乳動物細胞内で機能できることが示されている（Kashani-Sabetらの論文(1992) Antisense Res. Dev. 2:3-15）。
【００６６】
特に好ましい阻害剤は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。ｓｉＲＮＡは、抑制されたＲＮＡに配列が相同である二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）による遺伝子抑制の転写後プロセスを仲介する。本発明に従ったｓｉＲＮＡは、配列番号：１〜３に記載される配列からなる群から選択される連続した１７〜２５ヌクレオチド配列に相補的又は相同的な１７〜２５ヌクレオチドのセンス鎖、及び該センス鎖に相補的な１７〜２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含む。最も好ましいｓｉＲＮＡは、互いに及び標的ポリヌクレオチド配列に対して１００パーセント相補的であるセンス及びアンチセンス鎖を含む。好ましくは、ｓｉＲＮＡはさらにセンス鎖とアンチセンス鎖とを連結するループ領域を含む。
【００６７】
本発明に従った自己相補的一本鎖ｓｉＲＮＡ分子ポリヌクレオチドは、ループ領域リンカーによって連結されたセンス部分及びアンチセンス部分を含む。好ましくは、ループ領域配列は、４〜３０ヌクレオチド長、より好ましくは５〜１５ヌクレオチド長、及び最も好ましくは８ヌクレオチド長である。最も好ましい実施態様において、リンカー配列はUUGCUAUA（配列番号：２８８）である。自己相補的一本鎖ｓｉＲＮＡはヘアピンループを形成し、通常のｄｓＲＮＡよりもより安定である。さらにそれらはベクターからより容易に産生される。
【００６８】
sｉＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡに類似であるため、ｓｉＲＮＡを修飾して、核酸分解に対する抵抗性を確認する、又は活性を強化させる、若しくは細胞内分布を広げる、又は細胞内取り込みを増加させることができ、そのような修飾は、修飾されたヌクレオシド内結合、修飾された核酸塩基、修飾された糖、及び／又は１以上の成分若しくは結合体へのｓｉＲＮＡの化学的結合から構成されてもよい。ヌクレオチド配列は、これらのｓｉＲＮＡのデザイン規則に適合しないヌクレオチド配列に比較して、標的配列の減少を強化させるｓｉＲＮＡのデザイン規則に従って選択される（ｓｉＲＮＡの調製のこれらの規則及び実施例の議論について、２００４年１１月４日に公開されたWO2004094636、及びUA20030198627は引用によって本明細書に組み込まれる）。
【００６９】
また本発明は組成物及び前記組成物を使用する方法に関連し、アミロイドベータタンパク質前駆体プロセシングを阻害することができ、かつ発現阻害剤として先に記載されたポリヌクレオチドを発現することができる、ＤＮＡ発現ベクターを含む。
これらの組成物及び方法の特別な態様は、ＧＰＣＲポリペプチドに選択的に相互作用することができる細胞内結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの誘導された発現による、ＧＰＣＲポリペプチドの発現の下方調節又は阻止に関連する。細胞内結合タンパク質は、それが発現している細胞内でポリペプチドに選択的に相互作用又は結合し、かつ該ポリペプチドの機能を中和することができる任意のタンパク質を含む。好ましくは、細胞内結合タンパク質は配列番号：４〜６の該ＧＰＣＲポリペプチドの細胞内ドメインに結合親和性を有する中和抗体又は中和抗体のフラグメントである。より好ましくは、細胞内結合タンパク質は一本鎖抗体である。
【００７０】
この組成物の特別な実施態様は、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、配列番号：４〜６をコードするポリリボヌクレオチドを切断するリボザイム、及び、ｓｉＲＮＡがＧＰＣＲポリリボヌクレオチドからＧＰＣＲポリペプチドへの翻訳に干渉するように配列番号４〜６に一致するポリリボヌクレオチドの一部分に十分に相同である低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）からなる群から選択される発現阻害剤を含む。
【００７１】
該発現阻害剤を発現しているポリヌクレオチド、又は細胞内結合タンパク質をコードするものは、ベクター内に好ましく含まれる。ポリ核酸は核酸配列の発現を可能にするシグナルに人為的に連結され、いったんベクターが細胞内に導入されるとアンチセンス核酸を発現する組換えベクターコンストラクトを好ましく利用して細胞内へと導入される。アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ヘルペス単純ウイルス、又はセンダイウイルスのベクターシステムを含む、ウイルスに基づいた様々なシステムが利用可能であり、かつそれらの全てを使用して、標的細胞内で発現阻害剤に対するポリヌクレオチド配列を導入かつ発現させてもよい。
【００７２】
好ましくは、本発明の諸方法において使用されたウイルスベクターは複製欠損型である。そのような複製欠損型ベクターは通常、感染細胞におけるウイルスの複製に必要な少なくとも１つの領域を欠いている。これらの領域は当業者に既知の任意の技術によって（全体、又は一部分）削除されるか、又は非機能的にされるかのどちらかであり得る。これらの技術は、全体の削除、置換、部分的削除、又は（複製のために）不可欠な領域への１以上の塩基の付加を含む。そのような技術は、遺伝子操作技術の使用又は突然変異誘発物質を用いた処理によって、（単離されたＤＮＡの）インビトロ、又はインサイチュウで実行されてよい。好ましくは、複製欠損型ウイルスはウイルス粒子をカプシドで包むために必要な、それ自身のゲノム配列を保持する。
【００７３】
好ましい実施態様において、ウイルス成分はアデノウイルスに由来する。好ましくは、媒体はアデノウイルスカプシド内に梱包されたアデノウイルスベクター、又はそれらの機能的部分、誘導体、及び／又は類似体を含む。アデノウイルスの生物学はまた、分子レベルで比較的よく知られている。アデノウイルスベクターのための多くのツールは発展し続けてきており、それゆえアデノウイルスカプシドを本発明のライブラリーに組み込むのに好ましい媒体にしている。アデノウイルスは様々な細胞に感染することができる。しかしながら、異なるアデノウイルス血清型は、細胞に対して異なる優先傾向を有する。本発明のアデノウイルスカプシドが、好ましい実施態様で入ることができる標的細胞集団を結集させ広げるために、媒体は少なくとも２種類のアデノウイルスからのアデノウイルス線維タンパク質を含む。
【００７４】
好ましい実施態様において、アデノウイルス由来の核酸は、アデノウイルス後期タンパク質、又はその機能的部分、誘導体、及び／又は類似体をコードする核酸を含む。アデノウイルス線維タンパク質を例とするアデノウイルス後期タンパク質は、これを都合に合わせて用いて特定の細胞に媒体を標的化させてもよく、又は該細胞に該媒体の強化された輸送を誘導してもよい。好ましくは、アデノウイルス由来の核酸は、実質的に全てのアデノウイルス後期タンパク質をコードし、アデノウイルスカプシド全体、又はその機能的部分、類似体、及び／又は誘導体の形成を可能にする。好ましくは、アデノウイルス由来の核酸はアデノウイルスＥ２Ａ、又はその機能的部分、誘導体、及び／又は類似体をコードする核酸を含む。好ましくは、アデノウイルス由来の核酸は、細胞内で核酸に由来するアデノウイルスの複製を少なくとも部分的には促進する、少なくとも１つのＥ４領域タンパク質、又はその機能的部分、誘導体、及び／又は類似体をコードする核酸を含む。本明細書の実施例で使用されるアデノウイルスベクターは、治療法発明に属する本方法において有用なベクターの典型である。
【００７５】
本発明の特定の実施態様はレトロウイルスベクターシステムを使用する。レトロウイルスは分裂細胞に感染する組込みウイルスであり、かつそれらの構成は当業者に周知である。レトロウイルスベクターは、ＭｏＭｕＬＶ（「マウスモロニー白血病ウイルス」）、ＭＳＶ（「マウスモロニー肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「ハーベイ肉腫ウイルス」）；ＳＮＶ（「脾臓壊死ウイルス」）；ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）及びフレンドウイルスなどの、異なるタイプのレトロウイルスから構築され得る。レンチウイルスベクターシステムもまた本発明の実践に使用されてよい。レトロウイルスシステム及びヘルペスウイルスシステムは、神経細胞のトランスフェクションに好ましい媒体であることがある。
【００７６】
本発明の他の好ましい実施態様は、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）が使用されることである。ＡＡＶウイルスは、感染細胞のゲノム中に安定的かつ部位特異的様式で組み込む、比較的小さなサイズのＤＮＡウイルスである。それらは、細胞の成長、形態、又は分化にどのような影響も誘発せずに、幅広い範囲の細胞に感染することができ、かつそれらはヒトの病理に関与していないようである。
【００７７】
ベクター構築において、本発明のポリヌクレオチド剤は、１以上の制御領域に連結されてよい。適切な制御領域の選択は当業者の技術レベル内で決まりきった事柄である。制御領域はプロモータを含み、かつエンハンサー、サプレッサーなどを含んでもよい。
本発明の発現ベクターに使用してもよいプロモータは、構成的プロモータ及び制御（誘導可能な）プロモータの両方を含む。プロモータは宿主次第で原核生物又は真核生物であってよい。原核生物（バクテリオファージを含む）プロモータの中で本発明の実践に有用なのは、ｌａｃプロモータ、ｌａｃＺプロモータ、Ｔ３プロモータ、ＴＩプロモータ、ラムダP.sub.rプロモータ、P.sub.lプロモータ、及びｔｒｐプロモータである。真核生物（ウイルスを含む）プロモータの中で本発明の実践に有用なのは、遍在性プロモータ（例えば、ＨＰＲＴ、ビメンチン、アクチン、チューブリン）、中間径フィラメントプロモータ（例えば、デスミン、神経フィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰ）、治療遺伝子プロモータ（例えば、ＭＤＲタイプ、ＣＦＴＲ、因子ＶＩＩＩ）、組織特異的プロモータ（例えば、平滑筋におけるアクチンプロモータ、又は内皮細胞において活性なＦｉｔプロモータ及びＦｌｋプロモータ）であり、組織特異性を示しかつトランスジェニック動物において用いられる以下の動物転写制御領域を含む：膵腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Swiftらの論文(1984) Cell 38:639-46; Ornitzらの論文(1986) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonaldの論文 (1987) Hepatology 7:425-515）；膵臓ベータ細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域（Hanahanの論文(1985) Nature 315:115-22）、リンパ球細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedlらの論文(1984) Cell 38:647-58; Adamesらの論文(1985) Nature 318:533-8; Alexanderらの論文(1987) MoI. Cell. Biol. 7:1436-44）、睾丸、乳腺、リンパ球及びマスト細胞において活性であるマウス乳ガンウイルス制御領域（Lederらの論文 (1986) Cell 45:485-95）、肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Pinkertらの論文(1987) Genes and Devel. 1 :268-76）、肝臓において活性であるアルファ−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlaufらの論文(1985) MoI. Cell. Biol., 5: 1639-48; Hammerらの論文(1987) Science 235:53-8）、肝臓において活性であるアルファ１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Kelseyらの論文(1987) Genes and Devel., 1: 161-71）、骨髄性細胞において活性であるベータグロビン遺伝子制御領域（Mogramらの論文 (1985) Nature 315:338-40; Kolliasらの論文 (1986) Cell 46:89- 94）、脳中のオリゴデンドロサイト細胞において活性であるミエリン塩基タンパク質遺伝子制御領域（Readheadらの論文 (1987) Cell 48:703-12）、骨格筋において活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Saniの論文(1985) Nature 314.283-6）、及び視床下部において活性である性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Masonらの論文(1986) Science 234:1372-8）。
【００７８】
本発明の実践において使用されてもよい他のプロモータは、分裂細胞で選択的に活性化されるプロモータ、刺激に応答するプロモータ（例えば、ステロイドホルモン受容体、レチノイン酸受容体）、テトラサイクリン制御性転写モジュレーター、サイトメガロウイルス前初期プロモータ、レトロウイルスＬＴＲプロモータ、メタロチオネインプロモータ、ＳＶ−４０プロモータ、Ｅ１ａプロモータ、及びＭＬＰプロモータを含む。
【００７９】
ベクターはまた、エンハンサー、リプレッサーシステム、及び局在化シグナルなどの他の要素を含む。膜局在化シグナルは、ＧＰＣＲの細胞内ドメインに接触することによって機能する細胞内結合タンパク質をコードし、かつベクター産物が、細胞内結合タンパク質の標的が存在する細胞膜の内側表面に指示される場合に最も効果的である配列を発現する場合に、好ましい要素である。膜局在化シグナルは当業者に周知である。例えば、原形質膜にポリペプチドを局在化させるための適切な膜局在化ドメインはファルネシル化のためのＣ末端配列ＣａａＸであり（ここで「ａ」は脂肪酸アミノ酸残基であり、かつ「Ｘ」は任意のアミノ酸残基、一般的にはロイシンである）、例えば、システイン−アラニン−アラニン−ロイシン、又はシステイン−イソロイシン−バリン−メチオニンである。他の膜局在化シグナルは、Ｂｃｌ−２のＣ末端又はＢｃｌ−２ファミリータンパク質の他のメンバーのＣ末端からの推定上の膜局在化配列を含む。
【００８０】
さらなるベクターシステムは、患者へのポリヌクレオチド剤の導入を促進する非ウイルスシステムを含む。例えば所望の配列をコードするＤＮＡベクターは、リポフェクションによってインビボで導入され得る。リポソーム介在性トランスフェクションで遭遇する困難を制限するためにデザインされた合成カチオン性脂質を使用して、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製することができる（Feignerらの論文(1987) Proc. Natl. Acad ScL USA 84:7413-7; Mackeyらの論文(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027-31; Ulmerらの論文(1993) Science 259:1745-8を参照されたい）。カチオン性脂質の使用は、負に荷電した核酸のカプシド包囲を促進することがあり、また負に荷電した細胞膜との融合を促進することもある（Feigner及びRingoldの論文, (1989) Nature 337:387-8）。核酸の導入用途の特に有用な脂質化合物及び組成物は、国際特許公報WO 95/18863並びにWO 96/17823、及び米国特許第5,459,127号に記載されている。インビボで特定の組織内に外来遺伝子を導入するためのリポフェクションの使用は特定の実用上の利点を有し、また特定の細胞型にトランスフェクションを指示することは、例えば、膵臓、肝臓、腎臓及び脳などの細胞の不均質性を有する組織において特に有利であるだろう。脂質は標的化の目的のために他の分子に化学的に連結されてよい。標的化ペプチド、例えば、ホルモン又は神経伝達物質及び、抗体を例とするタンパク質又は非ペプチド分子は、化学的にリポソームに連結され得る。他の分子もまたインビボにおける核酸のトランスフェクションを促進するために有用であり、例えばカチオン性オリゴペプチド（例えば、国際特許公報WO 95/21931）、ＤＮＡ結合タンパク質由来のペプチド（例えば、国際特許公報WO 96/25508）、又はカチオン性ポリマー（例えば、国際特許公報WO 95/21931）がある。
【００８１】
裸のＤＮＡプラスミドとしてインビボでＤＮＡベクターを導入することもまた可能である（米国特許第5,693,622号、第5,589,466号及び第5,580,859号を参照されたい）。治療目的のための裸のＤＮＡベクターは当業者に既知の方法、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、又はＤＮＡベクタートランスポーターの使用によって所望の宿主細胞内に導入され得る（例えば、Wilsonらの論文(1992) J. Biol. Chem. 267:963-7; Wu及びWuの論文 (1988) J. Biol. Chem. 263:14621-4; Hartmutらによって１９９０年３月１５日に出願されたカナダ特許出願第2,012,311号; Williamsらの論文(1991). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-30を参照されたい）。受容体介在性ＤＮＡ送達アプローチもまた使用され得る（Curielらの論文(1992) Hum. Gene Ther. 3:147- 54; Wu及びWuの論文, (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-32）。
【００８２】
本発明はまた、ＧＰＣＲの拮抗薬及び／又は逆作動薬として同定された化合物を含む生物学的適合性組成物、及び先に記載されたような発現阻害剤を提供する。
生物学的に適合性を有する組成物は、固体、液体、ゲル、又は他の形態であることもある組成物であり、組成物中に本発明の化合物、ポリヌクレオチド、ベクター及び抗体が、活性な形態、例えば、生物学的活性に影響を与え得る形態で維持される。例えば本発明の化合物は、ＧＰＣＲ上で逆作動薬活性又は拮抗薬活性を有し；核酸は複製、伝達内容の翻訳、又はＧＰＣＲの相補的ｍＲＮＡにハイブリダイズすることができ；ベクターは標的細胞にトランスフェクト、及び先に記載されたようなアンチセンス、抗体、リボザイム又はｓｉＲＮＡを発現することができ；抗体はＧＰＣＲポリペプチドドメインに結合するであろう。
【００８３】
好ましい生物学的適合性組成物は、例えば、トリス、リン酸、又は塩イオンを含むＨＥＰＥＳバッファーを用いて緩衝化された水溶液である。通常、塩イオン濃度は生理的レベルに近いであろう。生物学的適合性溶液は、安定剤及び保存料を含んでよい。さらに好ましい実施態様において、生体適合性組成物は、医薬として許容し得る組成物である。そのような組成物は、局所的経路、経口経路、非経口経路、鼻腔内経路、皮下経路、及び眼球内経路による投与のために製剤され得る。非経口投与は、静脈内注射、筋肉内注射、動脈内注射、又は融合技術を含んだものを意味する。組成物は、標準的で周知の非毒性の生理的に許容し得るキャリアー、所望のアジュバント、及び賦形剤を含む用量単位製剤で非経口的に投与されてよい。
【００８４】
本組成物発明の特に好ましい実施態様は、医薬として許容し得るキャリアーとの混合物中の、先に記載したような治療的有効量の発現阻害剤を含む認識強化医薬組成物である。別の好ましい実施態様は、認識機能障害を伴う病気又は該病気への感受性の治療又は予防のための医薬組成物であり、医薬として許容し得るキャリアーとの混合物中の、効果的にアミロイドベータペプチドを阻害する量のＧＰＣＲ拮抗薬又は逆作動薬、それらの医薬として許容し得る塩、水和物、溶媒和物、又はプロドラッグを含む。そのような組成物の特に好ましいクラスは、アリールオキシジチオウレア化合物を含む。
【００８５】
経口投与用の医薬組成物は経口投与に適切な容量で、当業者に周知の医薬として許容し得るキャリアーを用いて製剤され得る。そのようなキャリアーは、医薬組成物が患者による摂取のために、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方されることを可能にする。経口使用のための医薬組成物は活性化合物と固形賦形剤とを混合し、結果としてできた混合物を任意に粉砕すること、及び所望ならば錠剤又は糖衣錠核を得るための適切な助剤を加えた後に、顆粒混合物を加工することによって調製することができる。適切な賦形剤は炭水化物又はタンパク質充填剤であり、ラクトース、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖；トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ、又は他の植物からのデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；アラビア及びトラガカントを含むゴム；及びゼラチン及びコラーゲンなどのタンパク質などである。所望ならば、崩壊剤又は安定剤には、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はアルギン酸ナトリウムなどのその塩などが添加されてよい。糖衣錠核は濃縮糖溶液などの適切な被覆剤と合わせて使用されてよく、また被覆剤はアラビアゴム、滑石、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有機溶媒又は溶媒混合物を含んでよい。染料又は色素を、製品識別のために錠剤又は糖衣錠の被覆剤に添加、又は活性化合物の量、すなわち用量を特徴付けてもよい。
【００８６】
経口的に使用することができる医薬組成物は、ゼラチン及びグリセロール又はソルビトールなどの被覆剤から作られた軟らかい密封カプセルと同様に、ゼラチンから作られた押し込み型カプセルを含む。押し込み型カプセルは、ラクトース又はデンプンなどの充填剤又は結合剤、滑石又はステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、及び任意に安定剤と混合された活性成分を含み得る。軟らかいカプセルにおいて、活性化合物は、脂肪油、液体、又は安定剤を含む若しくは含まない液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解又は懸濁されてよい。
【００８７】
好ましい無菌の注射製剤は、非毒性の非経口的に許容可能な溶剤又は希釈剤中の溶液若しくは懸濁液であり得る。医薬として許容し得るキャリアーの例は、生理食塩水、緩衝食塩水、等張食塩水（例えば、リン酸一ナトリウム又はリン酸二ナトリウム、ナトリウム、カリウム；塩化カルシウム又は塩化マグネシウム、若しくはそれらのような塩の混合物）、リンガー溶液、デキストロース、水、滅菌水、グリセロール、エタノール及びそれらの組み合わせであり、また１，３−ブタンジオール及び滅菌された固定油は、溶剤又は懸濁化剤として都合に合わせて用いられる。任意の無味の固定油が使用されることができ、合成モノグリセリド又は合成ジグリセリドを含む。オレイン酸などの脂肪酸もまた注入可能な製剤での使用を見出す。
【００８８】
構成培地もまたヒドロゲルであることができ、ヒドロゲルは薬物吸収スポンジとして機能することができる親水性ポリアクリル酸ポリマーなどの任意の生体適合性又は非細胞毒性のホモポリマー若しくはヘテロポリマーから調製される。特にエチレン及び／又はプロピレン酸化物から得られたあるものは市販されている。ヒドロゲルは、例えば外科的介入の間、治療すべき組織の表面上に直接的に溶着され得る。
【００８９】
本発明の医薬組成物の実施態様は、本発明のポリヌクレオチド阻害剤、及びポロクサマーといったトランスフェクションエンハンサーをコードする複製欠損型組換えウイルスベクターを含む。ポロクサマーの例は、市販のポロクサマー４０７（BASF, Parsippany, N.J.）及び非毒性の生体適合性ポリオールである。組換えウイルスを浸透させたポロクサマーは、例えば外科的介入の間、治療すべき組織の表面上に直接的に溶着されてもよい。ポロクサマーは低目の粘度を有しているので、本質的にヒドロゲルと同じ利点を有する。
【００９０】
活性発現阻害剤はまた、コロイド薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）内又はマクロエマルジョン内で、例えば界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル、及びポリ−（メチルメタクリル樹脂）マイクロカプセル中にそれぞれ封入されてもよい。そのような技術は、レミングトンの薬学(1980)第１６版, Osol, A.編に開示されている。
【００９１】
徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の適切な例は抗体を含む固形の疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、マトリクスが、例えばフィルム又はマイクロカプセルなどの造形品の形態である。徐放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリル樹脂）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号）、Ｌ−グルタミン酸のコポリマー及びガンマ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン酢酸−ビニル、LUPRON DEPOT（商標）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（乳酸−グリコール酸コポリマー、及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフェア）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは１００日間を超えて分子の放出が可能であるが、特定のヒドロゲルはより短い期間でタンパク質を放出する。封入された抗体が体内で長期間保持された場合、それらは３７℃で水分にさらされた結果として分解又は凝集するかもしれず、生物学的活性の喪失及び免疫原性の変化の可能性をもたらす。合理的な方法は関与する機構次第で安定を図るために工夫され得る。例えば凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を介した分子内Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見されたならば、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、含水率の制御、適切な添加剤の使用及び特定のポリマーマトリクス組成物の開発によって安定化を達成してよい。
【００９２】
本発明はまた、アミロイドベータ前駆体タンパク質の異常なプロセシングに苦しむ又は感受性である対象における、前記タンパク質のプロセシングを阻害する方法を提供し、方法は前記対象への治療的有効量の本発明の発現阻害剤の投与を含む。本方法発明の別の態様は、認識機能障害を伴う病気又は該病気に対する感受性の治療若しくは予防である。本発明の特別な実施態様は病気がアルツハイマー病である場合の方法である。
【００９３】
先に定義されたように、治療的に有効な用量は、タンパク質、ポリヌクレオチド、ペプチド、又は症状若しくは病気を改善するその抗体、又は作動薬若しくは拮抗薬の量を意味する。そのような化合物の治療的有効性及び毒性は、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）及びＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）などの、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性効果対治療効果の用量比は治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０の割合として表され得る。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトでの使用のための用量の範囲を策定することに用いられる。そのような化合物の用量は、ほとんど、あるいは全く毒性のないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にあることが好ましい。用量は、使用される剤形、患者の感受性、及び投与経路によってこの範囲内で変化する。
【００９４】
任意の化合物について、治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイ、又は通常マウス、ウサギ、イヌ若しくはブタの動物モデルのどちらかで最初に概算され得る。動物モデルもまた、好ましい濃度範囲及び投与経路を得るために使用される。そのような情報がそれから使用され、ヒトでの有効用量及び投与経路を決定することができる。正確な用量は、治療される患者を考慮してそれぞれの医師によって選択される。用量及び投与は、十分なレベルの活性成分を提供、又は所望の効果を維持するために調節される。考慮されてよいさらなる因子は、病状の重篤度、年齢、体重、及び患者の性別；食事、望まれる治療期間、投与方法、投与時間及び頻度、薬剤の組み合わせ、反応感受性、及び治療に対する耐性／反応を含む。長時間作用型医薬組成物は、特定の製剤の半減期及び除去率次第で、３〜４日毎、１週毎又は２週毎に投与されてよい。
【００９５】
本発明に従った医薬組成物は様々な方法で対象に投与されてよい。それらは標的組織に直接的に加えられるか、カチオン性脂質と複合体を形成されるか、リポソーム内に包まれるか、又は当業者に既知の他の方法によって標的細胞へ輸送されてよい。所望の組織への局所的投与は、カテーテル、輸液ポンプ、又はステントでなされてよい。ＤＮＡ、ＤＮＡ／賦形剤複合体、又は組換えウイルス粒子は、治療部位に対する局所的に投与される。代替輸送経路は、これらに限定されないが、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、エアロゾル吸入、経口（錠剤、又は丸薬形態）、局所的輸送、全身的輸送、眼球輸送、腹腔内輸送、及び／又は髄腔内輸送を含む。リボザイム輸送及び投与の例は、Sullivanらの WO 94/02595において提供されている。
【００９６】
本発明に従った抗体は、ボーラスのみとして送達、経時的に注入、又はボーラスとしての投与及び経時的な注入の両方で送達されてよい。当業者は、タンパク質用とは異なる製剤を、ポリヌクレオチド用に用いてよい。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの輸送は、特定の細胞、状態、位置などに特異的であろう。
【００９７】
先に記載されたように、組換えウイルスを利用して、本発明で有用なポリヌクレオチド剤をコードするＤＮＡを導入してもよい。本発明に従った組換えウイルスは、通常約10. sup.4〜約10. sup.14 pfuの間の用量の剤形で処方及び投与される。ＡＡＶ及びアデノウイルスの場合、約10.sup.6〜約10. sup.11 pfuの用量が好ましく使用される。用語ｐｆｕ（「プラーク形成単位」）はビリオン懸濁液の感染力に対応し、適切な培養細胞に感染させ、形成されたプラークの数を測定することによって決定される。ウイルス溶液のｐｆｕ力価を決定するための技術は、先行技術において十分に立証されている。
【００９８】
本発明の別の態様は、対象において認識機能障害を伴う病態又は該病態への感受性を診断するための方法に関連し、生体サンプル中の配列番号：４〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの量を決定すること、及び該ポリペプチドの量を健康な対象のポリペプチド量と比較することを含み、このとき健康な対象と比較したポリペプチドの量の増加が病態の存在を示す。
【００９９】
（実験セクション）
（実施例１）：ＧＰＲ３はアミロイドベータ１〜４２のレベルを上昇させる
ＡＰＰプロセシングを変化させる新規薬剤標的を同定するために、ＡＰＰを過剰発現する安定細胞株を作成する。この安定細胞株は、ｐｃＤＮＡ３．１にクローン化されたＡＰＰ７７０ｗｔのｃＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、続いて３週間、Ｇ４１８を用いて選抜することによって作成する。この時点でコロニーを選別し、安定なクローンを増幅させ、かつ分泌されたアミロイドベータペプチドのレベルをテストする。高レベルでアミロイドベータを分泌するクローンであるＨＥＫ２９３ ＡＰＰｗｔを、薬剤標的を同定する実験のために選別する。これは、アデノウイルスｃＤＮＡライブラリーを用いてＨＥＫ２９３ ＡＰＰｗｔに形質導入すること、及び結果として生じたアミロイドベータ１〜４２のレベルの変化をＥＬＩＳＡを介して測定することによって達成される。
【０１００】
ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）中に、１５０００細胞／ウエル（３８４ウエルプレート）の細胞密度で、コラーゲン被覆されたプレートにまかれた細胞を、１μｌ又は０．２μｌのアデノウイルス（それぞれ、１２０及び２４の平均感染の多重度（ＭＯＩ）に一致する）を用いて、２４時間後に感染させる。その翌日、アデノウイルスを洗い流し、そしてＤＭＥＭ（２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ；１０％ＦＢＳ）を該細胞に添加する。アミロイドベータペプチドを２４時間蓄積させる。ＥＬＩＳＡプレートは、バッファー４２（表１）中において２．５μｇ／ｍｌの濃度の捕捉抗体（JRF/cAbeta42/26）（M Mercken, Johnson and Johnson Pharmaceutical Research and Development, B-2340 Beerse, Belgiumから入手）を用いて一晩被覆することによって調製する。その翌朝にＰＢＳを用いて余剰の捕捉抗体を洗い流し、それから該ＥＬＩＳＡプレートを４℃でカゼインバッファー（表１を参照されたい）を用いて一晩ブロッキングする。ブロッキングバッファーの除去後速やかに３０μｌのサンプルをＥＬＩＳＡプレートに移し、４℃で一晩インキュベートする。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０及びＰＢＳを用いた多量の洗浄の後、３０μｌのワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識された検出抗体（ペルオキシダーゼラベリングキット, Roche）、JRF/AbetaN/25-HRP（M Mercken, Johnson and Johnson Pharmaceutical Research and Development, B-2340 Beerse, Belgiumから入手）をバッファーＣ（表１を参照されたい）で１／５０００希釈し、そしてさらに２時間該ウエルに添加する。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０及びＰＢＳを用いた洗浄による余剰の検出抗体の除去の後、ＨＲＰ活性を、ＨＲＰ酵素によって化学発光へと変換されるルミノール基質（Roche）の添加を介して検出する。
【表１】
【０１０１】
該アッセイの正当性を立証するには、無作為な力価の２種の臨床的ＰＳ１変異体及びＢＡＣＥを伴うアデノウイルスの過剰発現が、アミロイドベータ１〜４２の産生に及ぼす効果を、ＨＥＫ２９３ ＡＰＰｗｔ細胞内で評価する。図２に示したように、全てのＰＳ１及びＢＡＣＥコンストラクトは、予測どおりアミロイドベータ１〜４２レベルを誘導する。
【０１０２】
アデノウイルスＧＰＣＲ ｃＤＮＡライブラリーを下記のように構築した。ＧＰＣＲの全長コード領域をカバーするＤＮＡフラグメントを、プールされた胎盤及び胎児肝臓のｃＤＮＡライブラリー（InvitroGen）からのＰＣＲによって増幅した。全てのフラグメントを、該内容が引用によって本明細書に組み込まれる米国特許第6,340,595号に記載されるようなアデノウイルスベクター内へクローン化し、次にアデノウイルスが作成され、アデノウイルスは対応するｃＤＮＡを保持する。ＨＥＫ２９３ ＡＰＰｗｔ細胞におけるアデノウイルスＧＰＣＲライブラリーのスクリーニングの間、ＧＰＲ３の過剰発現はＨＥＫ２９３ ＡＰＰｗｔ細胞の馴化培地中のアミロイドベータ１〜４２ペプチドのレベルの上昇をもたらす。これらの結果はＧＰＲ３がＡＰＰプロセシングのモジュレーターとして同定されたことを示す。
【０１０３】
ＧＰＲ３の刺激効果を、定量的リアルタイムＰＣＲで決定したとおりの既知の力価（ウイルス粒子／ｍｌ）を有するウイルスの再スクリーニング時に確認する。ＧＰＲ３ウイルスを２〜２５０の範囲のＭＯＩで感染させ、そして実験を先に記載されたように実行する。アミロイドベータ１〜４２のレベルは、Ａｄ５／ＧＰＲ３に対するネガティブコントロールに比較して２倍高い（図３Ａ）。さらに、アミロイドベータ１〜４０、１１〜４２、１−ｘ及びｙ−４２のレベルへのＧＰＲ３の効果を、上記と同様な条件下でチェックする（図３Ｂ〜３Ｅ）。それぞれのＥＬＩＳＡは、下記の抗体を使用したことを除いては先に記載されたように実行する：アミロイドベータ１〜４０ＥＬＩＳＡに対しては、捕捉及び検出抗体はそれぞれJRF/cAbeta40/10、及びJRF/AbetaN/25-HRP （M Mercken, Johnson and Johnson Pharmaceutical Research and Development, B-2340 Beerse, Belgiumから入手）、アミロイドベータ１１〜４２ＥＬＩＳＡに対しては、捕捉及び検出抗体はそれぞれJRF/cAbeta42/26及びJRF/hAb11/1（M Mercken, Johnson and Johnson Pharmaceutical Research and Development, B-2340 Beerse, Belgiumから入手）、アミロイドベータｙ−４２ＥＬＩＳＡに対しては（ｙは１〜１７の範囲）、捕捉及び検出抗体はそれぞれJRF/cAbeta42/26及び4G8-HRP（それぞれ、M Mercken, Johnson and Johnson Pharmaceutical Research and Development, B-2340 Beerse, Belgium、及びSignet, USAから得られる）、さらにアミロイドベータ１−ｘ ＥＬＩＳＡに対しては（ｘは２４〜４２の範囲）、捕捉及び検出抗体はそれぞれJRF/AbetaN/25及び4G8-HRP（それぞれM Mercken, Johnson and Johnson Pharmaceutical Research and Development, B-2340 Beerse, Belgium、及びSignet, USAから得られる）である。アミロイドベータ１−ｘ ＥＬＩＳＡは、可変Ｃ末端（アミロイドベータ１〜３７；１〜３８；１〜３９；１〜４０；１〜４２）を用いたアミロイドペプチドの検出のために使用する。これらの実験結果は、ＧＰＲ３の形質導入直後の、アミロイドベータ１〜４０、１１〜４２、ｙ−４２及び１−ｘ種の増加を明らかに示す（図３Ｂ〜３Ｅ）。同手順は、ＧＰＲ６及びＧＰＲ１２によるＡＰＰプロセシングの解析のために使用する。
【０１０４】
（実施例２）：ＧＰＲ３類似体の同定
ヒトＧＰＲ３受容体のアミノ酸配列は、ＧＰＲ３の最も近い類似体を見つけるために、全てのヒトＧＰＣＲに対して、ＢＬＡＳＴサーチにおける問い合わせ（ｑｕｅｒｙ）として使用した。表２（配列番号：５〜６）は、２つの最も近いＧＰＲ３受容体である。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いて配列比較を構築して、ＧＰＲ３とその最も近い類似体であるＧＰＲ６並びにＧＰＲ１２との間の相同性の度合いを示した（図５）。
【表２】
【０１０５】
（実施例３）：ＧＰＣＲ発現のノックダウンによるアミロイドベータペプチドの減少
拮抗薬の効果は、標的タンパク質の発現レベルの減少をもたらすｓｉＲＮＡに基づいた方法の使用を介して模倣し得る。例えば、ＧＰＲ３ ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションはアミロイドベータ１〜４２を減少させる。
オリゴフェクタミンと共に、ＧＰＲ３（Dharmacon, USA：表３）、ｅＧＦＰ、ルシフェラーゼ及びＢＡＣＥのｓｉＲＮＡのスマートプールを用いて、ＨＥＫ２９３ ＡＰＰｗｔ細胞をトランスフェクトさせる。トランスフェクション後２４時間で培地を新しくし、該細胞は先に記載したように、ＥＬＩＳＡ解析に先立つ２４時間の間、馴化培地中でアミロイドベータペプチドを蓄積することが可能になる。データは、ＧＰＲ３ ＲＮＡレベルに対して標的化されたｓｉＲＮＡは、コントロール条件に比較してアミロイドベータ１〜４２レベルを減少させることを明らかに示す（図４）。結論として、これらのデータは、ＧＰＲ３が分泌されるアミロイドベータのレベルを調節することを示す。同手順は、ＧＰＲ６及びＧＰＲ１２によるＡＰＰプロセシングの解析に対して用いる。
【表３】
【０１０６】
（実施例４）：ヒト脳におけるＧＰＲ３の発現
ＡＰＰプロセシングのモジュレーターの同定の際、モジュレーターが関心を引く組織及び細胞で発現しているかどうかを検討することは重要である。これは組織並びに細胞における、ＲＮＡ及び／又はタンパク質レベルを測定することによって達成され得る。近年、ＲＮＡレベルはリアルタイムＰＣＲ技術を使用して定量され、それによってＲＮＡは最初にｃＤＮＡへ転写され、続いて、関心を引くｃＤＮＡの増幅がＰＣＲ反応の間監視される。増幅プロット及び結果のＣｔ値は、サンプル中に存在するＲＮＡ量についての指標である。ハウスキーピング遺伝子のレベルの決定は、異なるＲＮＡサンプル間での標的遺伝子のＲＮＡレベルの標準化を可能にし、ΔＣｔ値として表される。
【０１０７】
本発明のＧＰＣＲがヒト脳で発現しているかどうかを調査するには、ＧＡＰＤＨ特異的プライマー及び本発明のそれぞれのＧＰＣＲのための特異的プライマーを用いたリアルタイムＰＣＲを、ヒト全体脳、ヒト大脳皮質、及びヒト海馬のトータルＲＮＡ（BD Biosciences）で実行する（表４を参照されたい）。
【表４】
【０１０８】
他のＧＰＣＲにはサイバーグリーン（SybrGreen）を用いたのに対し、ＧＡＰＤＨはタックマン（Taqman）プローブで検出する。手短に言うと、４０ｎｇのＲＮＡを、MultiScribe Reverse Transcriptase（５０Ｕ／μｌ）酵素（Applied BioSystems社）を用いてＤＮＡへと逆転写させる。結果として生じたｃＤＮＡを、ABI PRISM（登録商標）7000配列検出システムを使用し、４０サイクルの間に、AmpliTaq Gold ＤＮＡポリメラーゼ（Applied BioSystems社）を用いて増幅させる。
【０１０９】
全体脳、大脳皮質、及び海馬のトータルＲＮＡを、定量的リアルタイムＰＣＲを使用してＧＰＣＲ転写産物が存在するか解析する。ＧＰＲ３に関して、得られたＣｔ値は、全てのＲＮＡサンプルにおいてＧＰＲ３が検出されたことを示す（表５）。
特異的な細胞性発現へのさらなる洞察を得るために、免疫組織化学（タンパク質レベル）及び／又はインサイチュウハイブリダイゼーション（ＲＮＡレベル）を、ヒト正常並びにアルツハイマーの脳海馬、皮質及び皮質下構造からの切片で実行する。これらの結果は、発現が、神経細胞、マイクログリア細胞、又はアストロサイトで起こるかどうかを示す。疾患組織と健康組織との比較は、ＧＰＲ３が疾患組織で発現しているか、かつその発現レベルが、非病的状況に比較して変化しているかを示す。同手順は、ＧＰＲ６及びＧＰＲ１２の発現プロファイリングに対して使用する。
【表５】
【０１１０】
（実施例５）：ラット初代神経細胞におけるアミロイドベータ産生
実際のニューロンにおいて、ＧＰＲ３がアミロイドベータ産生に影響するかどうかを調べるために、ヒト又はラットの初代海馬若しくは皮質ニューロンに、ＧＰＲ３ ｃＤＮＡを含むアデノウイルスを用いて形質導入する。アミロイドベータのレベルをＥＬＩＳＡで決定する（実施例１を参照されたい）。齧歯類のＡＰＰ遺伝子は、該ヒト配列に比較してＡＰＰ中に多くの突然変異を有しているため、齧歯類のＡＰＰ遺伝子はより少ないアミロイドベータ１〜４０及び１〜４２を産生する。より高いアミロイドベータレベルを達成するために、ＧＰＲ３と、ヒト野生型ＡＰＰ又はヒトスウェーデン変異型ＡＰＰ（これはアミロイドベータ産生を増幅する）ｃＤＮＡとの共形質導入を実行する。
【０１１１】
ラット初代ニューロン培養は、Goslin及びBanker（神経細胞培養, 第２版, 1998 ISBN 0−262-02438-1）に従って、Ｅ１８〜Ｅ１９日齢の胎児スプラーグダウリー（Sprague Dawley）ラットの脳から調製する。手短に言うと、海馬又は皮質から得られた単個細胞浮遊液を調製する。生存細胞の数を決定し、１０％ウマ血清を添加した最小必須培地（ＭＥＭ）中で、ポリ−Ｌ−リジンで被覆されたプラスチック製９６ウエルプレート上にまく。該細胞は、ウエル当たり５０，０００細胞の密度（すなわち、約１６６，０００細胞／ｃｍ２）でまく。３〜４時間後、培地をＢ２７サプリメント（GIBCO BRL社）を含む１６０μｌの無血清神経基礎培地に交換する。シトシンアラビノシド（５μＭ）をまいた２４時間後に添加して、非神経性（グリア）細胞増殖を防ぐ。
【０１１２】
まいた５日後にニューロンを使用する。アデノウイルス形質導入前に、これらの培地の１５０μｌの馴化培地を空の９６ウエルプレートの対応するウエルに移し、そして５０μｌの該馴化培地を該細胞に戻す。残りの１００μｌ／ウエルは、３７℃かつ５％ＣＯ２で保存する。海馬初代神経培養細胞を、２５０〜２０００の範囲にわたるそれぞれ異なるＭＯＩで、ＧＰＲ３、ＬａｃＺ、ｅＧＦＰ、及びルシフェラーゼのｃＤＮＡを含む、Ad5C09Att00/A011200-GPR3_v3ウイルス、Ad5C09Att00/A010801-LacZ_v1ウイルス、Ad5C09Att00/A010800-eGFP_v1ウイルス並びにAd5C09Att00/A010800-luc_v17ウイルスの粗溶解物で感染させる。さらに該細胞はまた、２０００のＭＯＩでヒト野生型ＡＰＰ６９５を発現する精製アデノウイルスAd5C0lAtt01/A010800 APP_v6で感染させる。形質導入後１６〜２４時間でウイルスを取り除き、培養細胞を１００μｌの予め温めた未使用神経基礎培地で洗浄する。該洗浄溶液の除去後、５０μｌの保存されていた馴化培地及び５０μｌの未使用神経基礎培地を含む新しい培地を対応する細胞に移す。培地は４８〜７２時間後に回収した。該ウエル内の細胞数は、ＡＴＰレベルを調査することによって決定した。アミロイドベータ濃度は、アミロイドベータ１〜４２に特異的なＥＬＩＳＡ（実施例１を参照されたい）によって決定した。アミロイドベータ１〜４２のレベルを細胞数に対して標準化する。
データ（図６）は、初代ニューロンにおけるＧＰＲ３の過剰発現の増加レベルによって、ネガティブコントロールウイルスに比較して、アミロイドベータの１〜４２レベルが用量依存的に増加して対応したことをはっきりと示している。
【０１１３】
（実施例６）：ＧＰＣＲに対するリガンド選別
（レポーター遺伝子選別）
ＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ−Ｋ１細胞などの哺乳動物細胞は、ｃＡＭＰ依存性プロモータ（ＣＲＥエレメント）の制御下にルシフェラーゼ遺伝子を保持しているプラスミドを用いて安定的にトランスフェクトするか、又はｃＡＭＰ依存性プロモータの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を保持しているアデノウイルスを用いて形質転換するかのどちらかである。さらに、レポーターコンストラクトを、ルシフェラーゼ遺伝子と共に、Ｃａ２＋依存性プロモータ（ＮＦ−ＡＴエレメント）の制御下又はＮＦ−κＢによって制御されるプロモータの制御下で使用することができる。該レポーターコンストラクトを発現しているこれらの細胞をそれから、本発明のＧＰＣＲのｃＤＮＡを保持しているアデノウイルスを用いて形質導入する。形質導入４０時間後、該細胞を以下を用いて処理する：
ａ）受容体に対する作動薬（例えば、スフィンゴシン−１−リン酸）、及びペプチド（LOPAP, Sigma Aldrich社）、脂質（Biomol, TimTech社）、炭水化物（Specs）、天然化合物（Specs, TimTech社）、小さな化合物（Tocris）、市販のスクリーニングライブラリー、並びに配列番号：４〜６、２８９〜３３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合親和性を有することが実証された化合物を含む対照化合物の多数のコレクションに対して選別された作動薬であって、アリールオキシジチオウレア（米国特許第6,420,563号を参照されたい）、その塩、水和物、又は溶媒和物を含む化合物を含む作動薬、又は、
ｂ）ＧＰＲ３が構成的に活性なＧＰＣＲであると考えられる場合においてのみ、ペプチド（LOPAP, Sigma Aldrich社）、脂質（Biomol, TimTech社）、炭水化物（Specs）、天然化合物（Specs, TimTech社）、小さな化合物（Tocris）、市販のスクリーニングライブラリー、及び配列番号：４〜６、２８９〜３３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合親和性を有することが実証された化合物を含む対照化合物の多数のコレクションであって、アリールオキシジチオウレア（米国特許第6,420,563号を参照されたい）、その塩、水和物、又は溶媒和物を含む化合物を含む対照化合物の多数のコレクション。
【０１１４】
作動薬が誘導したルシフェラーゼ活性又は構成的活性の増加を減少させる化合物は、ＧＰＲ３への拮抗薬又は逆作動薬であると考えられる。これらの化合物を検証のために再び選別し、分泌されるアミロイドベータペプチドのレベルへのそれらの効果に対して選別する。該化合物をまた選別し、ＧＰＣＲに結合することを証明する。該結合、アミロイドベータペプチド及びレポーター活性アッセイを実質的に任意の順番で実行し、化合物を選別することができる。
【０１１５】
さらに、ＮＦ−ＡＴレポーター遺伝子を発現している細胞は、Ｇ１５のα−サブユニット、又はキメラのＧαサブユニットをコードするｃＤＮＡを保持しているアデノウイルスを用いて形質導入することができる。Ｇ１５は、多くの異なるＧＰＣＲに共役するＧｑクラスに属する、何にでも結合する（promiscuous) Ｇタンパク質であり、そのようなものとして、ＧＰＣＲのシグナル伝達を細胞内Ｃａ２＋貯蔵の放出に向け変更する。キメラのＧアルファサブユニットは、その最後の５個のＣ末端残基がＧαｑのＣ末端残基と置換されたＧｓ及びＧｉ／ｏファミリーのメンバーであり、これらのキメラのＧタンパク質もまたｃＡＭＰシグナル伝達をＣａ２＋シグナル伝達に変更する。
【０１１６】
（ＦＬＩＰＲ選別）
ＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ−Ｋ１細胞などの哺乳動物細胞に、本発明のＧＰＣＲのｃＤＮＡを保持する発現プラスミドコンストラクトを用いて安定的にトランスフェクトする。十分に安定な細胞を得ることができるまで、細胞をまき、成長させ、選別する。細胞はＦｕｒａ３又はＦｕｒａ４などのＣａ２＋依存性蛍光物質と共にロードする。余剰の蛍光物質を洗い流した後、該細胞へ同時に作動薬（あるいは、該受容体の構成的活性が使用されている場合には、作動薬を添加する必要はない）及び化合物を添加することによって、ペプチド（LOPAP, Sigma Aldrich社）、脂質（Biomol, TimTech社）、炭水化物（Specs）、天然化合物（Specs, TimTech社）、小さな化合物（Tocris）、市販のスクリーニングライブラリー、及び配列番号：４〜６、２８９〜３３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合親和性を有することが実証された化合物を含み、アリールオキシジチオウレア（米国特許第6,420,563号を参照されたい）、その塩、水和物、又は溶媒和物を含む化合物含む、対照化合物の多数のコレクションを対照に、該細胞を選別する。該受容体の活性化は、放出される蛍光物質とＣａ２＋との相互作用に起因するほとんど瞬間的な蛍光の増加として測定する。作動薬によって誘導される蛍光の増加（又は構成的な蛍光）を減少させる又は阻害する化合物は、それらを選別するのに対照する受容体に対する拮抗薬又は逆作動薬であると考えられる。これらの化合物を再び選別し、ＧＰＣＲへの結合と同様に、分泌されるアミロイドベータペプチドの量を測定する。
【０１１７】
（Ａｅｑｕｏ選別）
安定的にアポエクオリン（Apoaequorin）を発現しているＣＨＯ細胞に、ＧＰＣＲのｃＤＮＡを保持しているプラスミドコンストラクトを用いて安定的にトランスフェクトする。十分に安定な細胞が得られることができるまで、細胞をまき、成長させ、選別する。該細胞をアポエクオリンの補因子であるセレンテラジン（coelenterazine）とともにロードする。受容体活性化の直後に細胞内Ｃａ２＋貯蔵は枯渇し、そしてエクオリン（aequorin）は発光プロセスにおいてセレンテラジンと反応する。該細胞に同時に作動薬（あるいは、該受容体の構成的活性が使用されている場合には、作動薬は添加する必要はない）及び化合物を添加することによって、ペプチド（LOPAP, Sigma Aldrich）、脂質（Biomol, TimTech）、炭水化物（Specs）、天然化合物（Specs, TimTech）、小さな化合物（Tocris）、市販のスクリーニングライブラリー、及びアリールオキシジチオウレア（米国特許第6,420,563号を参照されたい）、その塩、水和物、又は溶媒和物を含む化合物を含む配列番号：４〜６、２８９〜３３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して結合親和性を有することが実証された化合物を含む、対照化合物の多数のコレクションを対照に、アポエクオリン及び該受容体の両方を安定的に発現しているＣＨＯを選別する。該受容体の活性化を、アポエクオリン、セレンテラジン、及び放出されるＣａ２＋の相互作用に起因する、ほとんど瞬間的な発光として測定する。作動薬が誘起する光、又は構成的活性の増大を低下若しくは阻害する化合物は、それらが選別された該受容体に対する拮抗薬又は逆作動薬であると考えられる。これらの化合物を再び選別し、該ＧＰＣＲへの結合に加えて、分泌されるアミロイドベータペプチドの量を測定する。
【０１１８】
さらに、安定的にアポエクオリン遺伝子を発現しているＣＨＯ細胞を、Ｇ１５のαサブユニット、又はキメラのＧαサブユニットをコードしているｃＤＮＡを保持するプラスミドコンストラクトを用いて、安定的にトランスフェクトさせる。Ｇ１５は、多くの異なるＧＰＣＲに共役するＧｑクラスに属する、何にでも結合する（promiscuous) Ｇタンパク質であり、そのようなものとして、ＧＰＣＲのシグナル伝達を細胞内Ｃａ２＋貯蔵の放出に向け変更する。キメラのＧアルファサブユニットは、その最後の５個のＣ末端残基がＧαｑのＣ末端残基と置換するＧｓ及びＧｉ／ｏファミリーのメンバーであり、これらのキメラのＧタンパク質もまたｃＡＭＰシグナル伝達をＣａ２＋シグナル伝達に変更する。
【０１１９】
（ＧＰＣＲポリペプチドに結合する化合物のスクリーニング（置換実験））
化合物はＧＰＣＲポリペプチドへの結合について選別する。ＧＰＣＲポリペプチドへの化合物の親和性は置換実験で決定する。手短に言うと、ＧＰＣＲポリペプチドは、ＧＰＣＲポリペプチドに結合することが既知である標識された（放射性同位体で標識された、蛍光標識された）リガンド（例えば、スフィンゴシン−１−リン酸、又はジヒドロスフィンゴシン−１−リン酸）、及びラベルされていない化合物と共にインキュベートする。ＧＰＣＲポリペプチドからの標識されたリガンドの置換は、現在ＧＰＣＲポリペプチドに結合している標識されたリガンドの量を測定することによって決定する。ＧＰＣＲポリペプチドに結合した量は化合物の濃度に対してプロットし、ＩＣ５０値を計算する。この値は、その標的、すなわち化合物のＧＰＣＲポリペプチドへの結合親和性を反映する。強力な結合剤は、ナノモラー及びピコモラーの範囲においてさえＩＣ５０を有する。少なくとも１０マイクロモル又はそれ以下の（ｎｍｏｌからｐｍｏｌ）のＩＣ５０を有する化合物をベータアミロイド分泌アッセイに適用し、ベータアミロイド分泌及びプロセシングにおけるそれらの効果をチェックする。ＧＰＣＲポリペプチドは、アッセイが細胞、細胞画分又は生化学的に精製されたタンパク質のどれで行われるかによって多くの方法で調製可能である。
【０１２０】
（ＧＰＣＲポリペプチドに結合する化合物のスクリーニング（一般的なＧＰＣＲスクリーニングアッセイ））
Ｇタンパク質受容体が構成的に活性になる場合、それはＧタンパク質（Ｇｑ、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｏ）に結合し、Ｇタンパク質へのＧＴＰの結合を促進する。Ｇタンパク質はそれからＧＴＰａｓｅとして機能し、ＧＴＰをＧＤＰへとゆっくりと加水分解し、それによって通常条件下の該受容体は不活化された状態になる。しかしながら、構成的に活性化された受容体はＧＤＰからＧＴＰへの交換を続ける。ＧＴＰの非加水分解性類似体である［３５Ｓ］ＧＴＰγＳを用いて、構成的に活性化された受容体を発現する膜への促進された結合をモニターすることができる。［３５Ｓ］ＧＴＰγＳを用いて、リガンド不在及び存在下で膜に共役するＧタンパク質をモニターすることができることが報告されている。さらに、好ましいアプローチは、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質融合タンパク質の使用である。ＧＰＲ３−Ｇタンパク質融合タンパク質を産生するための方法は当業者に周知である。ＧＰＲ３−Ｇタンパク質融合タンパク質を発現している膜を、逆作動薬などの候補化合物の直接的な同定における使用のために調製する。ホモジナイズされたＧＰＲ３−Ｇタンパク質融合タンパク質を有する膜を、９６ウエルプレート中に移す。ピンツール（pin-tool）を使用して候補化合物を［３５Ｓ］ＧＴＰγＳを加えたそれぞれのウエルに移し、続いて室温で６０分間、シェーカー上でインキュベーションする。該アッセイは、２２℃で１５分間、４０００ＲＰＭで該プレートを回転させることによって停止させる。該プレートをそれから吸引し、続いて放射活性を読み取る。同手順をＧＰＲ６及びＧＰＲ１２の解析に用いる。
【０１２１】
（細胞表面上での受容体リガンド結合調査）
受容体は、アデノウイルス形質導入細胞（米国特許第6,340,595号）によって、哺乳動物細胞（ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＣＯＳ７）で発現させる。該細胞を、１０ｐＭ〜１０μＭにわたる範囲の様々な濃度で、標識されたリガンド（ヨウ素化された、トリチウム化された、又は蛍光）、及びラベルされていない化合物の両方と共にインキュベートする（４℃で３時間：ｐＨ７．４に調整した、25 mM HEPES, 140 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 5 mM MgCl2 及び0.2% BSA）。反応混合物を、細胞収穫機（Packard）を用いてＰＥＩ処理したＧＦ／Ｂガラスフィルター上に吸引する。該フィルターを、氷冷洗浄バッファー（ｐＨ７．４に調整した、25 mM HEPES, 500 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 5 mM MgCl2）で２回洗浄する。シンチラント（Scintillant）（MicroScint−10; 35 μl）を乾いたフィルターに加え、そして該フィルターを（Packard Topcount）シンチレーションカウンターで計測する。データをプリズムソフトウエア（GraphPad Software, San Diego, Calif）を用いて解析し、プロットする。競合曲線を解析し、かつＩＣ５０値を計算する。１以上のデータ点が、競合曲線のシグモイド範囲内、又は該シグモイド範囲の近傍にこない場合、該アッセイを繰り返し、そして標識されたリガンド及びラベルされていない化合物の濃度を、該曲線のシグモイド範囲内又はその近傍により多くのデータ点を有するように適合化させた。
【０１２２】
（膜画分についての受容体リガンド結合調査）
膜分画は下記のように行い、受容体を過剰発現している哺乳動物細胞（ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＣＯＳ７）から単離する：培地を該形質導入細胞から吸引し、そして細胞を穏やかに剥離することによって１×ＰＢＳ中に収集する。細胞を沈殿させ（２５００ｒｐｍ、５分）、そして５０ｍＭトリスｐＨ７．４に再懸濁した（１０×１０６細胞／ｍｌ）。該細胞沈殿物は、５秒で３回超音波処理することによって（UP50H; sonotrode MSl; 最大振幅: 140 μm; 最大超音波密度: 125W/cm2）ホモジナイズする。膜画分を、最大速度（１３０００〜１５０００から２００００ｇ、又はｒｃｆ）で２０分遠心分離することによって調製する。結果として生じた沈殿物を５００μｌの５０ｍＭトリスｐＨ７．４に再懸濁し、そして再び５秒で３回超音波処理した。該膜画分を遠心分離によって単離し、そして最終的にＰＢＳ中に再懸濁した。結合競合及びＩＣ５０値の導出を、先に記載したように決定する。
【０１２３】
（内在化選別（１））
ＧＰＣＲ関連性シグナル転換経路の活性化は一般的に、細胞質から原形質膜、又は細胞質から核への特定のシグナル転換分子の転移を導く。Norak社は、細胞質から原形質膜への受容体−β−アレスチン−ＧＦＰ複合体の作動薬誘導性転移、及びそれに続く受容体脱感作の間に起こるこの複合体の内在化に基づいて、自社のトランスフロー（transfluor）アッセイを発展させてきた。同様なアッセイは、β−アレスチンの代わりにＧＦＰ標識された受容体を用いる。ＨＥＫ２９３細胞を、ＧＰＲ３−ｅＧＦＰ融合タンパク質を翻訳するＧＰＲ３−ｅＧＦＰベクターを用いて形質導入する。形質導入後４８時間で、該細胞を６０分間、未使用無血清培地に置き、３７℃かつ５％ＣＯ２で１５分間、３０分間、６０分間又は１２０分間リガンド（例えば、１００ｎＭスフィンゴシン−１−リン酸）で処理する。表示の曝露時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして室温で２０分間、５％パラホルムアルデヒドを用いて固定する。ＧＦＰ蛍光を、デジタルカメラがついたツァイス（Zeiss）顕微鏡で可視化する。この方法は、細胞内区画への該融合タンパク質のリガンド介在性（構成的活性仲介型）転移を阻害する化合物の同定を目的とする。同手順は、ＧＰＲ６及びＧＰＲ１２の解析に用いる。
【０１２４】
（内在化選別（２））
β−アレスチン及びβ−ガラクトシダーゼ酵素相補性、並びにエネルギードナーとしての受容体及びエネルギーアクセプターとしてのβ−アレスチンを有するＢＲＥＴに基づいたアッセイを使用することで、転移アッセイには様々なバリエーションが存在する。またｐＨ感受性色素を用いて標識された特異的受容体抗体の使用は、作動薬によって誘導された酸性リソソームへの受容体転移を検出するために使用する。それらの転移アッセイの全ては、作動薬性及び拮抗薬性作用リガンドの両方のスクリーニングのために使用する。
【０１２５】
（メラニン細胞アッセイ（Arena Pharmaceutical社））
メラニン細胞アッセイは、ゼノパスメラノフォアズ（Xenopus melanophores）におけるメラノソームを含むメラニンの分布を変化させるＧＰＣＲの能力に基づいている。メラノソームの分布は、Ｇｉ／ｏ又はＧｓ／ｑのどちらかに共役する外因性受容体に依存する。メラノソームの分布（分散した又は凝集した）は、吸光度を測定することによって容易に検出される。このタイプのアッセイを、拮抗薬化合物選別と作動薬化合物選別の両方に用いる。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１Ａ】ＡＰＰプロセシング：膜アンカー型アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）は、２つの経路：アミロイド生成型及び非アミロイド生成型経路によって処理される。後者の経路において、ＡＰＰは最初にアルファセクレターゼによって、次にガンマセクレターゼによって切断され、ｐ３ペプチド（１７〜４０、又は１７〜４２）を生じる。アミロイド生成型経路は、それぞれベータ及びガンマセクレターゼによって切断された後、病原性アミロイドベータペプチド（Ａベータ）を生じる。表示の数字はＡベータ配列を含む、アミノ酸の位置である。
【図１Ｂ】ＧＰＣＲタンパク質の膜貫通構造の絵描写。
【図２】ＡＰＰプロセシングアッセイの評価：ポジティブ（PS1G384L; PS1L392V 及びBACE１）及びネガティブ（eGFP, LacZ、及び空）コントロールウイルスを、スクリーニングを模倣する無作為のＭＯＩでＨｅｋ２９３ＡＰＰｗｔ中で感染させる。Ａ及びＢ：形質導入を、それぞれ１μｌ及び０．２μｌのウイルスを用いて実行し、そしてアミロイドベータ１〜４２レベルを測定する。データは相対的光単位として表現され、かつアミロイドベータ１〜４２のｐＭに相関がある。
【図３】ＡＰＰプロセシングにおけるＧＰＲ３の関与：ＨＥＫ２９３ ＡＰＰｗｔ細胞を、Ad5/GPR3、及び異なったＭＯＩ（２、１０、５０、２５０）でネガティブコントロールウイルス（Ad5/空, Ad5/LacZ, Ad5/eGFP、及びAd5/ルシフェラーゼ）を用いて形質導入する。結果として生じたアミロイドベータ１〜４２、１〜４０、１１〜４２、ｘ〜４２、及び１〜ｘペプチドを、適切なＥＬＩＳＡを用いて測定した。データはｐＭ、又はアミロイドベータのｐＭに相関する相対的光単位（ｒｌｕ）として表現される。
【図４】ＧＰＲ３ ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションは、アミロイドベータ１〜４２を減少させる：ＨＥＫ２９３ ＡＰＰｗｔ ｃｌ２９細胞は、ＧＰＲ３、ｅＧＦＰ、ルシフェラーゼ、及びＢＡＣＥのｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、そしてアミロイドベータ１〜４２レベルを測定した。細胞をトランスフェクトし、そしてトランスフェクションの２４時間後に培地を新しくし、そして細胞は２４時間（トランスフェクション後４８時間（ｐ．ｔ．））の間、アミロイドベータが蓄積することが可能である。アミロイドベータは、先に記載されたように、アミロイドベータ１〜４２ＥＬＩＳＡの方法によって測定する。データはアミロイドベータのｐＭで表現される。ＧＰＲ３のＲＮＡレベルはこれらのサンプルから決定される。
【図５】ＧＰＲ３、ＧＰＲ６、及びＧＰＲ１２のクラスタルＷタンパク質配列比較。
【図６】異なるＭＯＩで様々なタンパク質発現ウイルスを用いてトランスフェクトされたニューロンにおける、アミロイドベータペプチドレベルのグラフ。該グラフは、初代ニューロンにおけるＧＰＲ３過剰発現の増加したレベルが、ネガティブコントロールと比較したアミロイドベータ１〜４２レベルの用量依存的増加に対応することを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞内で、アミロイドベータ前駆体タンパク質のプロセシングを阻害する化合物を同定するための方法であって、
（ａ）化合物を配列番号：４〜６、２８９〜３３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに接触させること；及び
（ｂ）アミロイドベータタンパク質の産生に関連する化合物−ポリペプチド特性を測定することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、インビトロ無細胞調製において配列番号：２８９〜３３３を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが膜結合型である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、哺乳動物細胞内で膜貫通型細胞レセプターとして存在する、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記特性が、前記化合物の前記ポリペプチドへの結合親和性である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記特性が、アミロイドベータ前駆体タンパク質のプロセシングの指標を産生する生物学的経路の活性化である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記指標が二次メッセンジャーである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記二次メッセンジャーが、サイクリックＡＭＰ、又はＣａ２＋である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記指標がアミロイドベータペプチドである、請求項６の方法。
【請求項１０】
前記アミロイドベータタンパク質が、１以上のアミロイドベータペプチド１〜４２、１〜４０、１１〜４２、及び１１〜４０からなる群から選択される、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記アミロイドベータタンパク質がアミロイドベータペプチド１〜４２である、請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記指標が、前記哺乳動物細胞内でレポーターの発現を誘導する、請求項６記載の方法。
【請求項１３】
前記レポーターが、アルカリフォスファターゼ、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ｄＧＦＰ、ルシフェラーゼ、及びβ−ガラクトシダーゼからなる群から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物が、市販のスクリーニングライブラリーの化合物からなる群、及び配列番号：４〜６、２８９〜３３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドへの結合親和性を有することが示されている化合物から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物が、ファージディスプレーライブラリー、又は抗体フラグメントライブラリー中のペプチドである、請求項２記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物が、アリールオキシジチオウレア、その塩、水和物、又は溶媒和物である、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）からなる群から選択される、アミロイドベータ前駆体プロセシングを阻害するための作用物質であって、配列番号：４〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする天然のポリヌクレオチド配列に相補的な、又は該配列から設計された核酸配列を含む、前記作用物質。
【請求項１８】
哺乳動物細胞内のベクターが前記作用物質を発現する、請求項１７記載の作用物質。
【請求項１９】
前記ベクターが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペス単純ウイルスベクター、又はセンダイウイルスベクターである、請求項１８記載の作用物質。
【請求項２０】
前記アンチセンスポリヌクレオチド、及び前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に対して相補的な１７〜２５ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、このとき前記センス鎖が配列番号：４〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする天然の核酸の１７〜２５の連続したヌクレオチドから選択される、請求項１７、１８、又は１９記載の作用物質。
【請求項２１】
前記ｓｉＲＮＡがさらに前記センス鎖を含む、請求項１７〜２０のいずれか１項記載の作用物質。
【請求項２２】
前記センス鎖が、配列番号：１〜３からなる群から選択される核酸配列の１７〜２５の連続したヌクレオチドから選択される、請求項２０記載の作用物質。
【請求項２３】
前記ｓｉＲＮＡがさらに、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖とを連結するループ領域を含む、請求項１７〜２２いずれか１項記載の作用物質。
【請求項２４】
前記ループ領域が、配列番号：２８８で定義される核酸配列を含む、請求項２３記載の作用物質。
【請求項２５】
前記作用物質が、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、又は配列番号：７〜２８７からなる群から選択される核酸配列を含むｓｉＲＮＡである、請求項１７〜２４のいずれか１項記載の作用物質。
【請求項２６】
医薬として許容し得るキャリアーとの混合物中に、治療的有効量の請求項１７〜２５のいずれか１項記載の作用物質を含む、認識促進医薬組成物。
【請求項２７】
前記作用物質が、配列番号：７〜２８７からなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチド、前記核酸配列に相補的なポリヌクレオチド、及びそれらの組み合わせを含む、請求項２６記載の認識促進医薬組成物。
【請求項２８】
前記タンパク質の異常なプロセシングに苦しんでいる又は感受性である対象におけるアミロイドベータ前駆体タンパク質のプロセシングの阻害方法であって、前記対象に請求項２６又は２７記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項２９】
認識機能障害を伴う病気、又は前記病気に対する感受性の治療又は予防のための、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記病気がアルツハイマー病である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
認識機能障害を伴う病気、又は該病気に対する感受性の治療又は予防のための医薬組成物であって、アミロイドベータ前駆体プロセシングを阻害するのに効果的な量のＧＰＣＲ拮抗薬又は逆作動薬を含む、前記医薬組成物。
【請求項３２】
前記ＧＰＣＲ逆作動薬が、医薬として許容し得るキャリアーとの混合物中において、アリールオキシジチオウレア、その医薬として許容し得る塩、水和物、溶媒和物、又はそれらのプロドラッグである、請求項３１記載の組成物。
【請求項３３】
アミロイドベータ前駆体プロセシングの阻害用途の薬剤の調製のための、請求項１７〜２５のいずれか１項記載の作用物質の使用。
【請求項３４】
認識機能障害を伴う病気、又は前記病気への感受性の治療又は予防用途の薬剤の調製のための、請求項１７〜２５のいずれか１項記載の作用物質の使用。
【請求項３５】
認識機能障害を伴う病気、又は前記病気への感受性の治療又は予防のための、ＧＰＣＲ拮抗薬又は逆作動薬の使用。
【請求項３６】
前記病気がアルツハイマー病である、請求項３４又は３５記載の使用。
【請求項３７】
前記ＧＰＣＲ逆作動薬が、医薬として許容し得るキャリアーとの混合物中で、アリールオキシジチオウレア、その医薬として許容し得る塩、水和物、溶媒和物、又はそれらのプロドラッグである、請求項３５又は３６記載の使用。
【請求項１】
哺乳動物細胞内で、アミロイドベータ前駆体タンパク質のプロセシングを阻害する化合物を同定するための方法であって、
（ａ）化合物を配列番号：４〜６、２８９〜３３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに接触させること；及び
（ｂ）アミロイドベータタンパク質の産生に関連する化合物−ポリペプチド特性を測定することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、インビトロ無細胞調製において配列番号：２８９〜３３３を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが膜結合型である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、哺乳動物細胞内で膜貫通型細胞レセプターとして存在する、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記特性が、前記化合物の前記ポリペプチドへの結合親和性である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記特性が、アミロイドベータ前駆体タンパク質のプロセシングの指標を産生する生物学的経路の活性化である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記指標が二次メッセンジャーである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記二次メッセンジャーが、サイクリックＡＭＰ、又はＣａ２＋である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記指標がアミロイドベータペプチドである、請求項６の方法。
【請求項１０】
前記アミロイドベータタンパク質が、１以上のアミロイドベータペプチド１〜４２、１〜４０、１１〜４２、及び１１〜４０からなる群から選択される、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記アミロイドベータタンパク質がアミロイドベータペプチド１〜４２である、請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記指標が、前記哺乳動物細胞内でレポーターの発現を誘導する、請求項６記載の方法。
【請求項１３】
前記レポーターが、アルカリフォスファターゼ、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ｄＧＦＰ、ルシフェラーゼ、及びβ−ガラクトシダーゼからなる群から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物が、市販のスクリーニングライブラリーの化合物からなる群、及び配列番号：４〜６、２８９〜３３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドへの結合親和性を有することが示されている化合物から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物が、ファージディスプレーライブラリー、又は抗体フラグメントライブラリー中のペプチドである、請求項２記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物が、アリールオキシジチオウレア、その塩、水和物、又は溶媒和物である、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）からなる群から選択される、アミロイドベータ前駆体プロセシングを阻害するための作用物質であって、配列番号：４〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする天然のポリヌクレオチド配列に相補的な、又は該配列から設計された核酸配列を含む、前記作用物質。
【請求項１８】
哺乳動物細胞内のベクターが前記作用物質を発現する、請求項１７記載の作用物質。
【請求項１９】
前記ベクターが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペス単純ウイルスベクター、又はセンダイウイルスベクターである、請求項１８記載の作用物質。
【請求項２０】
前記アンチセンスポリヌクレオチド、及び前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に対して相補的な１７〜２５ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、このとき前記センス鎖が配列番号：４〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする天然の核酸の１７〜２５の連続したヌクレオチドから選択される、請求項１７、１８、又は１９記載の作用物質。
【請求項２１】
前記ｓｉＲＮＡがさらに前記センス鎖を含む、請求項１７〜２０のいずれか１項記載の作用物質。
【請求項２２】
前記センス鎖が、配列番号：１〜３からなる群から選択される核酸配列の１７〜２５の連続したヌクレオチドから選択される、請求項２０記載の作用物質。
【請求項２３】
前記ｓｉＲＮＡがさらに、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖とを連結するループ領域を含む、請求項１７〜２２いずれか１項記載の作用物質。
【請求項２４】
前記ループ領域が、配列番号：２８８で定義される核酸配列を含む、請求項２３記載の作用物質。
【請求項２５】
前記作用物質が、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、又は配列番号：７〜２８７からなる群から選択される核酸配列を含むｓｉＲＮＡである、請求項１７〜２４のいずれか１項記載の作用物質。
【請求項２６】
医薬として許容し得るキャリアーとの混合物中に、治療的有効量の請求項１７〜２５のいずれか１項記載の作用物質を含む、認識促進医薬組成物。
【請求項２７】
前記作用物質が、配列番号：７〜２８７からなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチド、前記核酸配列に相補的なポリヌクレオチド、及びそれらの組み合わせを含む、請求項２６記載の認識促進医薬組成物。
【請求項２８】
前記タンパク質の異常なプロセシングに苦しんでいる又は感受性である対象におけるアミロイドベータ前駆体タンパク質のプロセシングの阻害方法であって、前記対象に請求項２６又は２７記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項２９】
認識機能障害を伴う病気、又は前記病気に対する感受性の治療又は予防のための、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記病気がアルツハイマー病である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
認識機能障害を伴う病気、又は該病気に対する感受性の治療又は予防のための医薬組成物であって、アミロイドベータ前駆体プロセシングを阻害するのに効果的な量のＧＰＣＲ拮抗薬又は逆作動薬を含む、前記医薬組成物。
【請求項３２】
前記ＧＰＣＲ逆作動薬が、医薬として許容し得るキャリアーとの混合物中において、アリールオキシジチオウレア、その医薬として許容し得る塩、水和物、溶媒和物、又はそれらのプロドラッグである、請求項３１記載の組成物。
【請求項３３】
アミロイドベータ前駆体プロセシングの阻害用途の薬剤の調製のための、請求項１７〜２５のいずれか１項記載の作用物質の使用。
【請求項３４】
認識機能障害を伴う病気、又は前記病気への感受性の治療又は予防用途の薬剤の調製のための、請求項１７〜２５のいずれか１項記載の作用物質の使用。
【請求項３５】
認識機能障害を伴う病気、又は前記病気への感受性の治療又は予防のための、ＧＰＣＲ拮抗薬又は逆作動薬の使用。
【請求項３６】
前記病気がアルツハイマー病である、請求項３４又は３５記載の使用。
【請求項３７】
前記ＧＰＣＲ逆作動薬が、医薬として許容し得るキャリアーとの混合物中で、アリールオキシジチオウレア、その医薬として許容し得る塩、水和物、溶媒和物、又はそれらのプロドラッグである、請求項３５又は３６記載の使用。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図３−２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図３−２】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００７−５３３９８９（Ｐ２００７−５３３９８９Ａ）
【公表日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０８８５５（Ｐ２００７−５０８８５５）
【出願日】平成１７年４月２０日（２００５．４．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００４３２５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０３７１３
【国際公開日】平成１７年１１月３日（２００５．１１．３）
【出願人】（５０４０６４３６４）ガラパゴス・ナムローゼ・フェンノートシャップ (27)
【氏名又は名称原語表記】Ｇａｌａｐａｇｏｓ Ｎ．Ｖ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月２０日（２００５．４．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００４３２５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０３７１３
【国際公開日】平成１７年１１月３日（２００５．１１．３）
【出願人】（５０４０６４３６４）ガラパゴス・ナムローゼ・フェンノートシャップ (27)
【氏名又は名称原語表記】Ｇａｌａｐａｇｏｓ Ｎ．Ｖ．
【Ｆターム（参考）】
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