エクソ特異的アミラーゼポリペプチド、これらのポリペプチドをコードする核酸、及びその使用方法
【課題】改変されたエクソ特異性を持つポリペプチドを提供する。
【解決手段】アミラーゼポリペプチド、ポリペプチドをコードする核酸、及びその使用方法。前記アミラーゼの特定の群からなる配列のうちの一つと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ、シュードモナス・サッカロフィリア由来のアミラーゼポリペプチド配列の位置番号に関して、307位における置換を含む、従来に比して、より有用な品質を備えるように改良され、改変された外特異性（exospecificity)を示す非マルトース生成・エクソアミラーゼ。
【解決手段】アミラーゼポリペプチド、ポリペプチドをコードする核酸、及びその使用方法。前記アミラーゼの特定の群からなる配列のうちの一つと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ、シュードモナス・サッカロフィリア由来のアミラーゼポリペプチド配列の位置番号に関して、307位における置換を含む、従来に比して、より有用な品質を備えるように改良され、改変された外特異性（exospecificity)を示す非マルトース生成・エクソアミラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への言及）
本願は、「エクソ特異的 アミラーゼ ポリペプチド、これらのポリペプチドをコードする核酸、及びその使用方法」(管理番号 NO.GC807P) のタイトルでベルグ他により、２００３年７月７日に出願された、USSN60/485,616 及び「これらポリペプチド及びその使用方法をコードする、熱安定性のある アミラーゼ ポリペプチド、これらのポリペプチドをコードする核酸、及びその使用方法」(管理番号 NO.GC806P) のタイトルで２００３年７月7日に出願されたUSSN60/485,413に基づく優先権の利益を主張するものである。これらの出願は２００３年７月7日に出願された「ポリペプチド」(管理番号 NO.P.016939USO)のタイトルの出願USSN60/485,539に関連するものである。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、アミラーゼ ポリペプチド、ポリペプチドをコードする核酸、及びその使用方法に関する。本発明のアミラーゼは、従来に比して、より有用な品質を備えるように改良されている。特に本発明のアミラーゼは改変されたエクソ特異性（exospecificity)を示す。
【背景技術】
【０００３】
改良されたアミラーゼは、ベーキングなどの工程における固有の問題を改善することができる。ベーキングの数日後にアミロペクチンの結晶化がでんぷん粒に起こり、そのためパンが堅くなって、パンの老化の原因となる。パンが老化するとパンの身は柔らかさ及び湿り気を失う。その結果、パンの身は弾力性を失い、パンは外皮が堅くなる。
【０００４】
アミロペクチンの側鎖の酵素による加水分解（例えば、アミラーゼによる）は結晶化の度合いを減らし、パンの対老化抵抗性を増す。結晶化の程度はアミロペクチンの側鎖の長さにより、側鎖が長いほど、結晶化の度合いは大きくなる。でんぷん粒の大半は、アミロペクチンとアミロースの二つの重合体の混合したものからなり、その約７５％はアミロペクチンである。アミロぺクチンは非常に大きな、枝分かれした分子であり、（１−４）結合で連結したα−Ｄ−（１−６）グルコピラノース単位の鎖状構造よりなる。その鎖はα−Ｄ−（１−６）連結によって枝分かれしている。アミロースは、（１−４）で連結するα−Ｄ−グルコピラノス単位の直鎖状の構造であり、α−Ｄ−（１−６）の枝分かれは殆どもたない。
【０００５】
精製したライ麦、小麦粉及びロールから作ったパンである白パンのような、でんぷん粒のパン製品、は、パン生地をオーブンの温度１８０−２５０℃の範囲で、１５−６０分かけて焼き上げる。ベーキング工程では、パンの皮となるパン生地の外側の層では、急角度の温度勾配（２００→１２０℃）が生じる。しかしながら、蒸気のため、パンの身の部分の温度はベーキング工程の終了時には約１００℃にしかならない。約８５℃以上の温度では、酵素が不活性となり、酵素はパンの老化に対する抵抗特性を失ってしまう。熱安定性のあるアミラーゼのみが、ベーキング工程においてでんぷんを効率的に改質することができる。
【０００６】
エンドアミラーゼの活性は、最終的にパン製品の品質に好ましくない影響を与える。枝分かれしたデキストリンの蓄積により、パンの身が、べとついた、または粘つく身のパンを生み出すからである。ここでエクソアミラーゼの活性が望まれる。エクソアミラーゼは、エンドアミラーゼの活性に伴う好ましくない影響が現れることを抑制し、パンの老化を遅らせるように、でんぷんに望ましい改変をもたらせるからである。エンドアミラーゼの活性を抑えることにより、エクソ特異性を増大させる結果、枝分かれデキストリンを減少させ、より品質の良いパンを生み出すことができるからである。
本願発明は、改変されたエクソ特異性を持つポリペプチドに係る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
配列番号１，５，７,または11と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を有し、かつ,4,33,34,70,71,87,99,108,113,121,134,141,157,158,171,178,179, 188, 198,199,223,290,307,315,334,343,399, および405からなる群から選択される少なくともひとつの置換を有するエクソ特異的・マルトース非生成性エクソアミラーゼ（exo-specific non-maltogenic exoamylase）。
（項目２）
前記アミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも７５％同一である項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目３）
前記アミノ酸配列が、配列番号５と少なくとも７５％同一である項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目４）
前記アミノ酸配列が、配列番号７と少なくとも７５％同一である項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目５）
前記アミノ酸配列が、配列番号１１と少なくとも７５％同一である項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目６）
前記アミノ酸配列が、配列番号2-4b、または8-10と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を有する項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目７）
少なくとも一つの置換がG4D, N33Y, D34N, G70D, K71R, G87S, A99V,K108R,V113I,G121D,G134R,A141P,I157L,G158D,Y171S,L178F,A179T,G188A,Y198F,Y198L,A199V,G223A,V290I,H307L,I315V,S334P,D343E,S399P,A405FおよびA405Eから選択される項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目８）
少なくとも一つの位置が33,34,71,87,121,134,141,157,178,179, 223,207,334 および343から選択される項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目９）
少なくとも一つの置換がN33Y, D34N, K71R, G87S, G121D G134R, A141P, I157L, L178F, A179T,G223A,H307L, S334P,および D343Eから選択される項目８に記載のエクソアミラーゼ。
（項目１０）
前記108、158、171、および188から選択される位置において、さらに少なくとも一つの置換を有する項目８に記載のエクソアミラーゼ。
（項目１１）
さらに少なくとも一つの置換がＫ108Ｒ、Ｇ158Ｄ、Ｙ171Ｓ、およびＧ188Ａから選択される項目１０に記載のエクソアミラーゼ。
（項目１２）
少なくとも一つの置換が、次の組み合わせ、
【化１】
の中から選択される一の組み合せを有する項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目１３）
少なくとも一つの置換が、次の組み合わせ、
【化２】
の中から選択される一の組み合わせを含む項目３に記載のエクソアミラーゼ。
（項目１４）
少なくとも一つの置換が、次の組み合わせ、
N33Y, D34N, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A, H307L および S334P;
N33Y, D34N, G87S, G121D, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A, H307L および、S334P;
および
N33Y, D34N, G87S, G121D, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A, H307L および S334P
の中から選択される一の組み合わせを有する項目３に記載のエクソアミラーゼ。
（項目１５）
アミラーゼが、配列番号2,3,4,４a,4b,8,9, および10から選択される一つのアミノ酸配列を含む、項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目１６）
エクソアミラーゼが、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）に由来する項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目１７）
シュードモナス属が、シュードモナス・サッカロフィリア（Pseudomonas saccharophilia）、およびシュードモナス・ストツェリ（Pseudomonas stutzeri）から選択される項目１６に記載のエクソアミラーゼ。
（項目１８）
項目1に記載のエクソアミラーゼをコードする核酸配列と少なくとも75％同一である核酸配列。
（項目１９）
項目18に記載の核酸配列を有するベクター。
（項目２０）
項目19に記載の核酸配列を有する宿主細胞。
（発明の要旨）
まず、第一の特徴として、本発明は、親ポリペプチドに由来するPS4変異体（PS4 variant）を有するポリペプチドを提供する。親酵素は、配列番号1または、配列番号５に記載のアミノ酸配列を持つエクソアミラーゼのような、シュードモナス サッカロフィリア （Pseudomonas saccharophilia）マルトース非生成性エクソアミラーゼ（non-maltogenic exoamylase）である。親酵素は、好ましくは、配列番号７,または１１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドのようなシュードモナス ストチェリ（Pseudomonas stutzeri）マルトース非生成性エクソアミラーゼである。PS4ファミリーの他のメンバーも親酵素として用いることができる。
【０００８】
好ましい実施の態様として、親ポリペプチドは配列番号１、または配列番号５に記載のアミノ酸配列を持つシュードモナス サッカロフィリアに由来するマルトース非生成性エクソアミラーゼである。
【０００９】
他の好ましい実施の態様としては、親ポリペプチドは配列番号７、または配列番号11に記載のアミノ酸配列を有するシュードモナス ストチェリに由来するマルトース非生成性エクソアミラーゼである。好ましい実施の態様においては、PS4変異体は、アミノ酸置換を含むことにより親ポリペプチドと異なっている。その置換は4,9,13,33,34,42,70,71,87,99,100,108,113,121,131, 134,135,141,153,157,158,160,161,166,170,171,178,179,184,188,198,199,221,223,238,270,277,290,307,315,334,335,342,343,372,392,398,399,405,415,425から成る群から選択される少なくとも一つの位置を含む位置にあり、上記の番号は配列番号1として示すシュードモナス サッカロフィリア配列に基づいて示す位置番号をいうものである。好ましい実施の形態においては、PS4変異体はアミノ酸置換を含むことにより親ポリペプチドから異なっている。その置換は4,33,34,70,71,87,99,108,113,121,131,134,141,157,158,171,178,179,188,198,199,223, 290,307,315,334,343, 399,および405から成る群から選択される少なくとも一つの位置を含む位置に位置し、上記の番号は、配列番号1に記載のシュードモナス サッカロフィリア 配列に関して付した位置番号である。好ましくは、その位置は33,34,71,87,121,134,141,157,178,179, 223,307,334, 及び343 より成る群から選択される少なくとも一つの位置に関しての番号である。好ましくは、PS４変異体はN33Y,D34N,K71R,G87S,G121D,G134R, A141P,L178F,A179T,G223A,H307L,S334P及びD343Eから成る群から選択される少なくとも一つの置換を含む。
【００１０】
他の実施の態様においては、エクソアミラーゼはさらに108,158,171 および188から選択される位置において、さらに、少なくとも一つの置換を含む。
【００１１】
好ましくは、PS4変異体は、K108R,G158D,Y171S およびG188Aから選択される少なくとも一つの置換を含む。
【００１２】
好ましくは、PS4変異体はG4D,N33Y,D34N,G70D,K71R,G87S,A99V,K108R, V113I,G121D,G134R,A141P,I157L,G158D,Y171S,L178F,A179T,G188A,Y198F,Y198L,A199V,G223A,V290I,H307L,I315V,S334P,D343E,S399P,A405F,及びA405Eから成る群から選択される少なくとも一つの置換を含む。好ましくは、PS4変異体はN33Y,D34N,G134R,A141P,I157L, G223A,H307L,およびS334Pのうちの少なくともひとつの置換を有し、さらに、L178F, またはA179Tのうち少なくとも一つを追加的に持つ。好ましくは、PS4変異体はN33Y,D34N,I157L, L178F,A179T,G223A,またはH307Lの少なくとも一つの置換を含む。好ましくは、PS4変異体は、G87S,G134R,A141P,またはS334Pのうちの少なくとも一つの置換を有する。
【００１３】
他の好ましい実施の態様にいては、PS4変異ポリペプチドは以下の（数１）から選択される一つの組合せを有する；
【数１】
【００１４】
他の好ましい実施の態様においては、PS4変異ポリペプチドは以下の（数２）から選択される一つの組合せを有する；
【数２】
【００１５】
他の好ましい実施の態様においては、PS4変異ポリペプチドは以下の（数３）から選択される一つの組合せを有する；
【数３】
【００１６】
好ましい実施の態様においては、PS4変異体は配列番号2, 配列番号3, 配列番号4, 配列番号4a, 配列番号4b, 配列番号4c, 配列番号8, 配列番号9,または配列番号10のいずれかの配列を含むアミノ酸である。
【００１７】
PS4変異体は、シュードモナス種（Pseudomonas sp.）に由来する場合がある。一つの実施の態様においては、シュードモナス種はシュードモナス サッカロフィリアおよびシュードモナス ストチェリ から選択される。
【００１８】
PS4変異ポリペプチドは、上記に記載したもの以外に１又は２以上の突然変異（mutation）を含む。他の変異は、１又は２以上の位置における、例えば、欠失、挿入、置換、転換、転移および逆位も含む。同様に、ポリペプチドは少なくとも一つの上記の置換において欠けていることもある。
【００１９】
好ましい実施の態様においては、ポリペプチドは先端を切断した形を持っている。切断はN-先端、またはC-先端に起きる。親酵素、またはPS4変異体は、活性であるか否かを問わず、サブ配列、シグナル配列、ドメイン，部分、のような一部またはそれ以上の部分を欠くこともある。例えば、親酵素、またはPS4変異ポリペプチドは、本明細書に記載のとおり、シグナル配列を欠いていることもある。選択的に、または追加的に、親酵素は、またはPS4変異体は１又は２以上の触媒もしくは結合ドメインを欠いていることもある。好ましい実施の態様においては、親酵素、またはPS4変異体は、でんぷん結合ドメインのようにマルトース非生成性エクソアミラーゼに存在するドメインの１又は２以上のドメインを欠いていてもよいかも知れない。例えば、PS4ポリペプチドは配列番号1に示すシュードモナス サッカロフィリアのマルトース非生成性エクソアミラーゼの番号の429の位置までの配列しか持っていないこともある。好ましい実施の態様においては、図面に記載のアミノ酸配列を持っている変異体、PS4変異体、pSac-d34(配列番号4c,FIG.8c)、pSac-D20(配列番号4a, FIG.8a), およびpSac-D14(配列番号4b, FIG.8b)が提供される。
【００２０】
PS4変異体はまた、相同配列を持っている。相同配列は、PS4変異ポリペプチド酵素をコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも75,80,85,または90%同一のヌクレオチド配列を含み、好ましくは、少なくとも95,96,97,98,または99％同一配列を有する。
【００２１】
好ましい実施の態様においては、機能同等物（functional equivalent）を含む。この明細書に記載のPS4変異ポリペプチドは、好ましくはマルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を示すポリペプチドに由来する、またはその変種（variant）である。好ましくは、親酵素はマルトース非生成性エクソアミラーゼ自体である。好ましい実施の態様においては、PS4変異ポリペプチドは、またマルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を示す。
【００２２】
ここに記載のPS4変異体は、好ましくはエクソ特異性、例えば、ここに規定されるエクソ特異性指数（exospecificity index）により測定されるエクソ特異性をもち、エクソアミラーゼの特性と矛盾しないものである。さらに、その変異体は、好ましくはそれが生成した親酵素、またはポリペプチドと比較し、より高い、または大きいエクソ特異性を有している。このばあい、例えば、PS４変異ポリペプチドは、エクソ特異性指数が２０以上、すなわちその全アミラーゼ活性（エクソアミラーゼ活性を含む）がそのエンドアミラーゼ活性の２０倍、またはそれ以上あることがある。好ましい実施の態様においては、エクソアミラーゼのエクソ特異性指数が３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、または１００以上ある。好ましい実施の態様においては、エクソ特異性指数は１５０以上、２００以上、３００以上、または４００以上である。
【００２３】
好ましい状態では、PS４変異体はその親よりも熱安定性がある。好ましくは、PS４変異ペプチドは約５５℃から約８０℃、またはそれ以上の温度ででんぷんを分解することができる。好ましくは、PS４変異体は約９５℃までの温度にさらされた後でも活性を保持している。ここに記載されたPS4変異ポリペプチドは親酵素と比べ、半減期が10%,20%,30%, 40%,50%,60%,70%,80%,90%, 100%,200%,またはそれ以上長い。好ましくはより高温の５５℃から約９５℃またはそれ以上の温度で、好ましくは約８０℃において、半減期が同様なる効果を与える。好ましくはサンプルは、約８０℃、もしくはそれ以上の温度で1−１０分間加熱されるのが望ましい。
【００２４】
好ましくは、PS4変異ポリペプチドは、pHに対してより安定的である。好ましくは、その同属である親ペプチドよりpH安定性が高い。PS4変異ポリペプチドは約pH5から約pH10.5において、でんぷんを分解することができる。PS4変異ポリペプチドは、同じpH条件下において、親ポリペプチドに比べその半減期が10%,20%,30%, 40%,50%,60%,70%, 80%,90%,100%,200%,またはそれ以上長い半減期を持っていると思われる。他の実施の態様においては、pHに対する安定度は、特定のpH条件においての、酵素の活性または比活性を測定することによりアッセイされる。特定のpH状態とは、pH5からpH10.5の間のどのpH数値でも良い。
【００２５】
好ましい実施の態様においては、機能等価物は、PS4ファミリーメンバーの少なくとも一つと配列相同性を持っている。機能等価物は、上で述べたシュードモナス サッカロフィリアおよびシュードモナス ストチェリのマルトース非生成性エクソアミラーゼのいずれかと、または、好ましくは、その両方と配列相同である。機能等価物はまた配列番号1-12,好ましくは、配列番号1,または 配列番号7、またはその両方に規定する配列のいずれかと配列相同性である。配列相同性は、好ましくは少なくとも60%以上、好ましくは65%以上、好ましくは75%以上、好ましくは80%以上、好ましくは85%以上、好ましくは90%以上、好ましくは95%以上、である。配列相同は、ここに記載されたプログラムのいずれか、またはそのすべてにより生成される。他の実施の態様においては機能等価物は、上に規定する配列のいずれかと特異的にハイブリッド形成することができる。
【００２６】
第2の特徴としては、本発明は、上記に述べるように親ポリペプチドに由来するPS4変異体を含むポリペプチドをコードする核酸を提供する。親酵素は、好ましくは、配列番号1、または配列番号５に示すシュードモナスサッカロフィリアのマルトース非生成性エクソアミラーゼである。親酵素は好ましくは、配列番号７、または配列番号11に示すシュードモナスストチェリのマルトース非生成性エクソアミラーゼである。PS４ファミリーの他のメンバーも親酵素として用いることができる。
【００２７】
好ましい実施の形態においては、親ポリペプチドは配列番号1 、または配列番号５に記載された配列を持つシュードモナス サッカロフィリアのマルトース非生成性エクソアミラーゼに由来するマルトース非生成性エクソアミラーゼである。他の好ましい実施の態様においては、親ポリペプチドは、配列番号7または、配列番号11に示された配列を持つシュードモナス ストチェリに由来するマルトース非生成性エクソアミラーゼを含む。好ましい実施の態様においては、PS4変異体をコードする核酸は、4,9,13,33,34,42,70,71,87,99, 100,108,113, 121, 131,134,135,141,153,157,158,160,161,166,170,171,178,179,184,188,198,199, 221,223,238,270,277,290,307,315,334,335,342,343,372,392,398,399,405,415, 425から成る群から選択される、少なくとも一つの位置を含む位置にあるアミノ酸置換をコードすることにより親核酸と異なっている。これらの位置番号は、配列番号1に示すシュードモナス サッカロフィリア 配列についてのものである。好ましくは、これら位置は、33,34, 87, 121, 134, 141,157,178, 179,223,307, および334から成る群から選択される少なくとも一つの位置である。
【００２８】
好ましくは、PS4変異体をコードする核酸は、ポリペプチドにおけるN33Y, D34N, G87S, G121D, G134R, A141P, I157L,L178F, A179T, G223A, H307L,およびS334Pより成る群から選択される少なくとも一つの置換をコードする核酸を含む。好ましくは、PS4変異体をコードする核酸は、N33Y,D34N, G134R, A141P, I157L, G223A, H307L,およびS334Pより成る置換、そして、L178FまたはA179Tの少なくとも一つの置換を追加的に含む。好ましくは、PS4変異体をコードする核酸は、N33Y,D34N, I157L, L178F, A179T, G223A, またはH307L,の置換の一つを含む。好ましくは、PS4変異体をコードする核酸は、G87S,G134R, A141P またはS334Pの置換の一つを含む。他の実施の態様においては、PS4変異をコードする核酸は、K71R,K108R,G158D,Y171S,G188AおよびD343Eの置換の少なくともコードする核酸を含む。
【００２９】
他の実施の態様においては、PS4変異をコードする核酸は、以下の（数４）の組合せの少なくとも一つをコードする核酸を含む；
G134R, A141P I157L
【数４】
【００３０】
好ましい実施の態様においては、PS4変異体をコードする核酸は、配列配列番号2, 配列番号3, 配列番号4, 配列番号4a, 配列番号4b, 配列番号4c, 配列番号8,配列番号9, または 配列番号10のいずれか一つを含むアミノ酸をコードする。
【００３１】
好ましい実施の態様においては、核酸は端を切断したポリペプチドをコードする。切断箇所はN末端、またはC末端である。親酵素、またはPS4変異体はそれが活性か、否かを問わず、サブ配列、シグナル配列、ドメインまたはその部分のような、その一部、または複数の部分を欠いていることもある。例えば、親酵素、またはPS4変異ポリペプチドは、シグナル配列を欠いていることもある。選択的に、または、追加的に、親酵素、またはPS4変異体は、一又はそれ以上の触媒または結合ドメインを欠いていてもよい。好ましい実施の態様においては、親酵素、またはPS4変異体は、でんぷん結合ドメインのようなマルトース非生成性エクソアミラーゼにある一、またはそれ以上のドメインを欠いている。例えば、PS4ポリペプチドは、配列番号1に示すシュードモナス サッカロフィリア マルトース非生成性エクソアミラーゼの番号において429までの位置しか持たないこともある。好ましい実施の態様においては、核酸は、図面に示すPS4変異体 pSac-d34,pSac-D20およびｐSac-D14をコードする。
【００３２】
PS4変異ポリペプチドをコードする核酸は、上に示す変異に加え、１又は２以上の変異を含んでいてもよい。１又は２以上の他の位置における欠失、挿入、置換、転換、転位および逆位などのような、その他の変異も含まれる。同様に、核酸にコードされるポリペプチドは、上に示す置換の少なくとも一つを欠いていてもよい。
【００３３】
PS4変異体をコードする核酸は、また、相同配列を含んでいてもよい。相同配列は、PS4変異ポリペプチド酵素をコードするヌクレオチド配列と少なくとも75,80,85,または90%同一の、好ましくは、少なくとも95,96,97,98,または99%同一のヌクレオチド配列を含む。
【００３４】
好ましい実施の態様においては、PS4変異体の機能等価物であるポリペプチドをコードする核酸を含んでいることもある。この明細書に記載されているPS4変異ポリペプチドをコードする核酸は、好ましくはマルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を持っている酵素をコードする核酸に由来し、またはその変異体である。好ましくは、核酸にコードされる親酵素はマルトース非生成性エクソアミラーゼ自体である。核酸にコードされるPS4変異ポリペプチドはその好ましい実施の態様においては、またマルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を示す。
【００３５】
核酸にコードされるPS4変異体は、ここの記載のように、エクソ特異性指数で測ったエクソ特異性を持っている。さらにそれは、好ましくは同一条件で、由来する親酵素、または、ポリペプチドと比較した場合、より高い、またはより大きいエクソ特異性を持っている。その場合、例えば、PS4変異ポリペプチドは10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,100%,200%,またはそれ以上のエクソ特異性指数を持つ。これらPS4変異ポリペプチドは、好ましくは同一条件下で比較した場合、親ポリペプチドより1.5倍以上、2倍以上、5倍以上、10倍以上、50倍以上、100倍以上のエクソ特異性持つと思われる。
【００３６】
好ましくは、核酸にコードされたPS4変異体はその親よりも熱安定性がある。好ましくはPS4変異ポリペプチドは約55℃から約80℃の温度においてでんぷんを分解することができる。好ましくは、PS4変異体は約95℃までの温度に曝された後でも、活性を維持することができる。ここに記載されたPS4変異ポリペプチドは、約55℃から約95℃の高めの温度、またはそれ以上の温度で、好ましくは約80℃の温度で、親酵素と比べ、半減期が10%,20%,30%,40%, 50%,60%,70%, 80%,90%,100%,200%,またはそれ以上に長い。好ましくは、サンプルは約80℃、もしくはそれ以上の温度で1−10分間加熱される。
【００３７】
好ましくは、核酸にコードされるPS4変異ポリペプチドは、対pH安定である。好ましくは、PS4変異ポリペプチドは親ポリペプチドよりもより高いpH安定度を持っている。好ましくは、PS4変異ポリペプチドは、約pH5から約10.5においてでんぷんを分解することができる。特定のpH条件は、pH5から10.5の範囲であればどのpHでもよい。核酸にコードされるPS4変異ポリペプチドは同一条件下において親ポリペプチドと比較した場合、半減期が長い、またはより高い活性を示す（アッセイによる）。PS4変異ポリペプチドは、同一のpH条件で比較した場合、親ポリペプチドより半減期が10%,20%,30%,40%, 50%,60%,70%,80%,90%,100%,200%,またはそれ以上に長い場合がある。選択的に、または追加的に、PS4変異ポリペプチドは同一のpH条件で比較した場合、親ポリペプチドより高い活性を示す。
【００３８】
好ましい実施の態様においては、核酸にコードされる機能等価物は、PS4ファミリーメンバーの少なくとも一つと相同配列である。好ましい実施の態様において、機能等価物は、上述したシュードモナス サッカロフィリア、およびシュードモナス ストチェリのマルトース非生成性エクソアミラーゼ のいずれか、または、好ましくは、その双方と配列相同である。機能等価物は、また配列番号1〜配列番号12、好ましくは配列番号１、または配列番号７、またはその双方と配列相同である。配列相同は、好ましくは少なくとも60％、好ましくは少なくとも65％以上、好ましくは少なくとも75％以上、好ましくは少なくとも80％以上、好ましくは少なくとも85％以上、好ましくは少なくとも90％以上、好ましくは少なくとも95％以上ある。
【００３９】
他の実施の態様においては、ここに記載するいずれかのPS4変異体をコードする核酸と相補的な関係にある核酸が提供される。さらに，相補物とハイブリッド形成することのできる核酸を提供する。好ましい実施の態様においては、その相補物のみならず、上記の配列のいずれとも、特にハイブリッド形成することができる機能等価物をコードする核酸が提供される。
【００４０】
好ましい実施の態様においては、ここに記載の方法および組成において使用する配列は、合成配列である。その配列は、それに限定されるものではないが、例えば、メチロトローフ酵母（methylotrophic yeasts）のピキア（Pichia）、およびハンセヌラ（Hansenula）のような宿主生物にとり最適なコドン使用に基づき作された配列をふくむ。
【００４１】
発明の第3の特徴は、少なくとも一つのPS4変異ポリペプチド、および他の成分を含む組成を提供していることである。他の成分はオキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、グリコシダーゼ、アミラーゼ、プルラナーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、へミセルラーゼ、でんぷん分解酵素、プロテアーゼ、リポキシゲナーゼ、の群から選択される一つの酵素をいう。好ましい実施の態様においては、WO91/04669に開示されているように、組成はバシラス種から得られる、少なくとも一つのPS4変異体、およびマルトースアミラーゼを含む。好ましい実施の態様においては、PS4変異体および小麦粉を含む。
【００４２】
さらに追加酵素を、小麦粉、水または必要に応じて他の成分、添加物、あるいは、パン生地の改良組成を含むパン生地成分にとともに加えることができる。追加酵素は、小麦粉、水、任意追加成分、および添加物、もしくは、パン生地改良組成物を加える前後を問わず添加することができる。さらに、追加酵素は液状または乾燥した組成物の形態であってもよい。
【００４３】
第4の特徴は、PS4変異ポリペプチドを含むベクター、PS4変異ポリペプチドを含む細胞、PS4変異ポリペプチドの発現方法を提供することである。好ましい実施の態様においては、本発明は、PS4変異ポリペプチドをコードする核酸を持つ組み替え可能な、複製可能な、ベクターを対象としていることである。ベクターは、追加的に、ここに規定する要素のいずれをも含むことができる。他の好ましい実施の態様では、PS4変異体をコードする核酸を含む宿主細胞を提供している。宿主細胞はここに記載された細菌、真菌、イースト菌細胞のいずれかである。好ましい実施の態様においては、ここに記載するように、本発明はPS4変異ポリペプチドの発現方法について考察している。
発明の更なる特徴は、管理番号674510-2007およびGC806Pの関連出願に記載されており、その全ての図面、参考例、図表を含み、引例により本願に組み入れられている。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図面1（図１、以下同様）は、PS4変異体の熱安定性の改良を示すグラフである。PS4cclはシュードモナス サッカロフィリアに由来する、シグナル配列、およびでんぷん結合ドメインを持たない発現比較例酵素である。PS4cc1,pSac-D3, pSac-D20, および pSac-D14についての分単位表示の半減期を，摂氏温度に対しプロットしてある。
【図２】図2はモデルパン生地システム試験における、pSac-D34の投与効果を示すグラフである。パンの身の固くなった分量はNMRにより測定した。固くなった部分の分量で測定した堅さを、コントロール、D34の0.5, 1, 2ppmの各ケースについて、焼いた後の経過日に対してプロットしたものである。
【図３】図3 は小麦粉1kg当たり1mgのPSac-D3, およびPsac-D14, を投与した場合の堅さの減少、および堅くなる度合を示すパン焼き試験の結果を示すグラフである。hPaで測定した堅さの数値をコントロールについてプロットしたものである。
【図４】図4は、半減期が、75℃で、９．３分であるPSac-D3 （G134R, A141P, I157L, G223A, A307L, S334P,K71R, D343E, N33Y, D34N, L178F, A179T）に対し、75℃で３．６分のPsac-D3 (N33Y, D34N,K71R,L178F,A179Tを持たない)と比較した、PSac-D3のソフト化効果の増加を示すベーキング試験の結果を表したものである。
【図５】図5は、シュードモナス サッカロフィリア マルトテトラヒドロラーゼ アミノ酸配列に由来するPS4（配列番号1）参照配列を示す。
【図６】図６は、PS4変異体の配列（配列番号２）；G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P,N33Y,D34N,L178F,及びA179T置換を持つシュードモナス サッカロフィリア マルトテトラヒドロラーゼ アミノ酸配列を示す。
【図７】図７は、PS4変異体の配列（配列番号３）；G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P, N33Y,D34N, L178F, 179T, 及びG121D置換を持つシュードモナス サッカロフィリア マルトテトラヒドロラーゼ アミノ酸配列を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、PS4変異体配列（配列番号４）；G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P, N33Y,D34N, L178F, A179T, G121D及びP87S置換を持つシュードモナス サッカロフィリア マルトテトラヒドロラーゼ アミノ酸配列を示す。
【図８Ｂ】図8Ｂは、PSac-D20の配列（配列番号４a）； 13置換及びでんぷん結合ドメインの欠失を持つシュードモナス サッカロフィリア マルトテトラヒドロラーゼ アミノ酸配列を示す。
【図８Ｃ】図8Ｃは、Psac-D14の配列（配列番号４b）の配列； 1４置換及びでんぷん結合ドメインの欠失を持つシュードモナス サッカロフィリア マルトテトラヒドロラーゼ アミノ酸配列を示す。
【図８Ｄ】図8Ｄは、Psac-D34の配列（配列番号４b）の配列； 11置換及びでんぷん結合ドメインの欠失を持つシュードモナス サッカロフィリア マルトテトラヒドロラーゼ アミノ酸配列を示す。
【図９】図９は、シュードモナス サッカロフィリア マルトテロラヒドロラーゼ（配列番号5）のアミノ酸配列を示す。シュードモナス サッカロフィリア グルカン 1,4-α−マルトテトラヒドロラーゼ 前駆体(E.C.3.2.1.60)(G4-アミラーゼ)（マルトテトラオース形成アミラーゼ）（エクソマルトテトラオヒドロラーゼ ）（マルトテトラオース形成エクソアミラーゼ）SWISS-PROTアクセッション番号P22963。
【図１０Ａ】図10Aはシュードモナス サッカロフィリア マルトテトラヒドロラーゼ の核酸配列（配列番号６）を示す。マルトテトラヒドロラーゼ をコードするシュードモナス サッカロフィリア mta 遺伝子(E.C.番号3.2.1.60）。ジーンバンク（GenBank）アクセッション番号X16732。
【図１０Ｂ】図10Ｂはシュードモナス サッカロフィリア マルトテトラヒドロラーゼ の核酸配列（配列番号６）を示す。マルトテトラヒドロラーゼ をコードするシュードモナス サッカロフィリア mta 遺伝子(E.C.番号3.2.1.60）。ジーンバンク（GenBank）アクセッション番号X16732。
【図１１】図11はシュードモナス ストチェリ マルトテトラヒドロラーゼ （配列番号７）のアミノ酸配列を示す。
【図１２】図12は、PStu-D34の配列(配列番号８)を示す。 G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P,N33Y, D34N置換を持つ、シュードモナス ストチェリ マルトテトラヒドロラーゼ アミノ酸。
【図１３】図13は、PStu-D20の配列 (配列番号9)を示す。置換G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P,N33Y, D34N, 及びG121Dを持つ、シュードモナス ストチェリ マルトテトラヒドロラーゼ アミノ酸配列。
【図１４】図14は、PStu-D14の配列(配列番号10)を示す。 G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P,N33Y, D34N,G121D,及びG87S置換を持つ、シュードモナス ストチェリ マルトテトラヒドロラーゼ アミノ酸配列。
【図１５】図15は、シュードモナス ストチェリ（シュードモナス ペルフェクトマリナ）の配列（配列番号11）を示す。グルカン1，4−α−マルトテトラヒドロラーゼ 先駆体(E.C.3.2.1.60)(G４-アミラーゼ)（マルトテトラオース形成アミラーゼ）（エクソマルトテロラオヒドロラーゼ ）（マルトテトラオース形成アミラーゼ）SWISS-PROTアクセッション番号P13507。
【図１６】図.16は、シュードモナス ストチェリ マルトテトラヒドロラーゼ 核酸配列を示す。シュードモナス ストチェリ マルトテトラオース形成アミラーゼ（amyP）遺伝子、完全cds. ジーンバンク（GeneBank）アクセッション番号M24516(配列番号12)。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明においては、特に示さない限り、当業者の通常の能力の範囲にある、化学、分子生物学、微生物学、DNA組み換え、及び免疫学における通常の技法を用いる。そのような技法は、例えば、次のような文献に記載されている。J,Sambrook,E.F.Fritsch,and T..Maniatis, 1989, Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition、Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Ausubel, F.M etal.,（1995 and periodic supplement; Current Protocols in Molecular Biology, ch.9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.）; B. Roe, J. Crabtree, and A.Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing. Essential Techniques, John Wiley & Sons;J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization. Principles and Practice;Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis.A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992,Methods of Enzymology. DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology,Academic Press; Using Antibodies A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. I by Edward Harlow,David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7);Antibodies : A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor)(1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855,Lars-Inge Larsson "Immunocytochemisity: Theory and Practice", CRC Press inc.,Baca Raton, Florida, 1988, ISBN 0-8493-6078-1, John D. Pound (ed);"Immunochemical Protocols, vol 80", in the series: "Methods in Molecular Biology",Humana Press, Totowa, New Jersey, 1998, ISBN 0-89603-493-3, Handbook of Drug Screening,edited by Ramakrishna Seethala, Prabbavathi B. Femandes (2001, New York, NY,Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); and Lab Ref: A Handbook of Recipes,Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers,2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3. 上記の全ての一般的文章は、引用により本明細書に組み入れられる。
【００４６】
ここに記載のように、「PS４」は配列番号1または配列番号5に示すアミノ酸配列を持つエクソアミラーゼのようなシュードモナス サッカロフィリア マルトース非生成性エクソアミラーゼ、または、配列番号7及び配列番号11に示すアミノ酸配列を持つポリペプチドのようなシュードモナス ストチェリ マルトース非生成性エクソアミラーゼに関係する、もしくは、配列を持つ、または、機能的相同性を持つ、ファミリーメンバーをいう。他のファミリーメンバーは、（表1）に記載されている。
【００４７】
以下の、シュードモナス サッカロフィリア エクソアミラーゼに由来するPS4変異体の位置番号（数５）は配列番号1に関するものである。
【数５】
【００４８】
参照配列は、SWISS-PROTアクセッション番号P22963を持つが、シグナル配列MSHILRAAVLAAVLLPFPALA を持たないシュードモナス サッカロフィリアに由来する。
【００４９】
ナンバーリング付与システムは、特定配列を塩基参照ポイントとして用いることができるが、すべての関連する相同配列にも適用される。例えば、位置番号は、他のシュードモナス種または、他のバクテリアの相同配列に適用される。好ましくは相同体は、参照配列番号1と、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上相同である。タンパク質の間の配列相同性は、ここに記載されている周知のアラインメントプログラム、及びハイブリッド技術を用いて確かめることができる。
【００５０】
以下の、シュードモナス ストチェリに由来するPS4変異体についての、位置番号（数６）は、配列番号7に関するものである。
【数６】
【００５１】
ここで用いる「PS4変異核酸」は、PS4ファミリーメンバーの変異体である、PS4ポリペプチドをコードする核酸をいう。
【００５２】
ここで用いる、「PS4変異ポリペプチド」または、「PS4変異体」はPS4ファミリーメンバーの変異体である、ポリペプチドをいう。
【００５３】
ここで用いる、「親酵素」「親配列」および「親ポリペプチド」はPS4変異ポリペプチドが基本とする酵素、及びポリペプチドを意味する。親酵素は、前駆体酵素（すなわち、実際に変異される酵素）であるか、または、新たに用意されるものである。親酵素は野生型酵素であることもある。
【００５４】
ここで用いる「変異体」は、親分子に由来する分子をいう。変異体は、核酸のみならずポリペプチドも含む。変異体は、特に、１又は２以上の位置における置換、挿入、転換（transversion）、及び逆位（inversion）を含む。変異体は、切断を含む。変異体は、親分子と相同、及び機能等価性を持つ誘導体（derivative）を含む。変異体は、ここに示すヌクレオチド配列とハイブリッド形成することのできる配列と相補の関係の配列を含む。例えば、変異体配列は、ここに示すヌクレオチド配列と、厳しい条件下で（例えば、50℃、及び0.2xSSC(1xSSC=0.15M NaCl,0.015 M Na3クエン酸 pH7.0))でハイブリッド形成することのできる配列と相補の関係にある。より好ましくは、変異体の用語は、ここに示すヌクレオチド配列と、極めて厳しい条件（例えば、65℃、及び0.1xSSC(1xSSC=0.15M NaCl,0.015 M Na3クエン酸 pH7.0))でハイブリッド形成することのできる配列を相補する関係にあるものを含む。
【００５５】
ここで用いる「前躯体」は、改質酵素を生み出すために用いる酵素をいう。前躯体は、変異誘発により修飾された酵素でもよい。同様に、前躯体は野生型酵素、変異野生型酵素、あるいは既に変異した酵素でもよい。
【００５６】
ここで用いる「機能等価物」は、親酵素との関係を言うものであり、親分子と類似または、同一機能を持つ分子をいう。親分子は、シュードモナス サッカロフィリア マルトース非生成性エクソアミラーゼ、またはシュードモナ ストチェリ マルトース非生成性エクソアミラーゼ、あるいは他のソースから得られるポリペプチドの場合がある。機能等価物である酵素は、異なるアミノ酸配列を持つがマルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を有する。機能を決めるアッセイ（assay）の例は、ここに記載されており、当業者によく知られている。
【００５７】
ここで用いる「分離された」とは、その配列が、自然に関連付けられ、そして自然界に存在する、少なくとも一つの他の構成要素から、少なくとも本質的に自由である配列をいう。
【００５８】
ここで用いる「精製された」（purified）とは、その配列が比較的純化された状態にあることをいう、例えば、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98%純粋であることをいう。
【００５９】
ここで用いる「アミラーゼ」は、酵素を意味し、なかでも、でんぷんの加水分解を触媒することができるものをいう。アミラーゼはでんぷんのα−D(１→4)O−グリコシド結合を開裂するヒドロラーゼ（加水分解酵素）である。一般的に、α−アミラーゼ(E.C.3.2.1.1,α−D(１→4)グルカン グルカノヒドロラーゼ)は、でんぷん分子の中のα−D(１→4)O-グリコシド結合を無作為に開裂するエンド型の（endo-acting）酵素と定義される。これと対照的に,β−アミラーゼ(E.C.3.2.1.2 α−D(１→4)グルカンマルトヒドロラーゼ )のような、エクソ型（exo-acting）でんぷん分解酵素、及び、マルトース生成性（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ）α−アミラーゼ(E.C.3.2.1.133)のような、いくつかの生成物特異的に作用するアミラーゼは基質の非還元末端からでんぷん分子を開裂する。β−アミラーゼ、α-グルコシダーゼ(E.C.3.2.1.20 α−D−グルコシド グルコヒドロラーゼ )、グルコアミラーゼ（(E.C.3.2.1.3 α−D((１→4)−グルカン グルコヒドロラーゼ )、及び生成物特異的アミラーゼは、でんぷんから特定長のマルトオリゴ糖を作り出すことができる。
【００６０】
ここで用いる「マルトース非生成性エクソアミラーゼ酵素」(non-maltogenic exoamylase enzyme)は、最初にでんぷんを大量のマルトースに分解することのない酵素をいう。これを確認するアッセイ方法はここに記載されている。
【００６１】
ここで用いる「直線状のマルトオリゴ糖」は、α−(１→4)結合により結合された２から２０単位のα−Dグルコピラノースをいう。
【００６２】
ここで用いる「熱安定」は、酵素が高めの温度にさらされた後に、活性を維持する能力に関していう。マルトース非生成性エクソアミラーゼのような酵素の熱安定性は、その半減期により測定される。半減期（t1/2）は、規定される条件で、酵素の半分が活性を失う分単位の時間数値をいう。半減期数値は、残留アミラーゼの活性を測定することにより算出される。半減期アッセイは、実施例において、さらに詳細に記載される方法でおこなわれる。
【００６３】
ここで用いる「pH安定」は、広範囲のpHにわたり、活性を維持する酵素の能力についていう。対pHアッセイは、実施例に記載の方法により行う。
【００６４】
ここで用いる「エクソ特異性」（exo-specificity）は、改善された、例えば、非置換エクソアミラーゼのエクソ特異性比率と比べ、増加したエクソ特異性指数についていう。
【００６５】
ここで用いる「エクソ特異性指数」（exo-spificity index）は、全エンドアミラーゼ活性に対する全アミラーゼの活性比率を言う。アミラーゼ、及びエンドアミラーゼ活性の測定のためのアッセイは、本明細書中に述べられている。
【００６６】
ここで用いる「食物」は、小麦粉のような食物の成分のみならず、調理済み食物をもふくむ。
【００６７】
ここで用いる「食品成分」は、機能性食品（functional foods）または、食料品（食品材料）である、あるいは、これらに加えることのできる調理品（formulation）を含み、さらに、例えば、酸化、または乳状化を必要とする広範囲の種類の製品にいて、少量用いられる調理品をふくむ。食品の成分は、使用、応用、そして、または管理の仕方により液状または固形状で用いられる。
【００６８】
ここで用いる「機能食品」は栄養的に効果、そして、または、味覚上の満足を提供できる食品のみならず、消費者に対してさらに有益な効果をもたらすことのできるものをいう。
【００６９】
ここで用いる「アミノ酸配列」は、「ポリペプチド」そして、または「タンパク質」という用語と同義である。ある場合には、「アミノ酸配列」は、「ペプチド」という用語と同義である。ある場合には、「アミノ酸配列」は、「酵素」という用語と同義である。
【００７０】
ここで用いる「ペプトイド形」(peptoid form)はα−炭素置換群が、α−炭素原子よりも、残留基の窒素原子に位置するる、変異体アミノ酸残基をいう。「ペプトイド形」においてペプチドを準備するプロセスは、例えば、Simon RJ他、PNAS(1992)89(20),9367-9371 and Howell DC,Trends Biotechnol, (1995) 13(4),132-134にあるように業界で知られている。
【００７１】
ここで用いる「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」はオリゴヌクレオチド配列、または、ポリヌクレオチド配列、及び変異体，相同体、断片、及びそれらの由来物（その部分であるような）を指す。ヌクレオチド配列は、センス鎖、またはアンチセンス鎖の何れをあらわすものであろうとも、二本鎖、または一本鎖である、ゲノム、または合成、あるいは遺伝子組み換えを源とする。ここで用いる、ヌクレオチド配列の用語は、ゲノム、DNA, cDNA,合成DNA及びRNAを含む。好ましくは、それは、cDNA を、より好ましくは、PS4変異ポリペプチドをコードするDNAを意味する。
【００７２】
ここで用いる「でんぷん」は、でんぷんそれ自体、または、その一構成物、特にアミロペクチンをいう。「でんぷん培地」（starch medium）はでんぷんを含む、あらゆる適切な培地をいう。「でんぷん製品」とは、でんぷんを含む、でんぷんをベースとする、またはでんぷんに由来するあらゆる製品を含む。好ましくは、でんぷん製品は、白小麦粉から得られるでんぷんを含む、または、でんぷんをベースとする、または、それに由来するものである。
【００７３】
ここで用いる「小麦粉」は、小麦または他の穀物を細かく粉砕した粉をいう。例えば、小麦粉は、小麦自体から得たものであり、他の穀物からのものは含まない。白小麦粉は、パン生地のような中間体の形での小麦粉を指すとともに、白小麦粉自体をもいう。
【００７４】
ここで用いる「焼いたでんぷん粉のパン製品」は、パン生地を作る条件で、小麦粉、水及び酵母を混ぜて得られるパン生地をベースとする、焼いたあらゆる製品をいう。
【００７５】
ここで用いる「相同物」「相同」は、主アミノ酸配列、及び主ヌクレオチド配列と一定程度の同一性を持つものをいう。相同配列は、主配列と少なくとも75％、80％、85％、または90％、好ましくは、少なくとも95％、96％、97％、98％、または9９％の同一のアミノ酸配列を持つ。典型的には、相同物は、主アミノ酸と同じ活性部位を持っている。
【００７６】
ここで用いる「ハイブリッド形成」（hybridisation）とは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術により行われる、増幅プロセスのみならず、塩基の対合を通じて、核酸鎖が相補鎖と結合するプロセスを含む。PS4核酸は一本鎖、二本鎖DNA,RNA, RNA/DNA ヘテロ二本鎖、または共重合RNA/DNAとして存在する。
【００７７】
ここで用いる「共重合体」は、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドをともに含む一本鎖核酸をいう。PS4核酸は、さらに発現を増加させるように適正化されたコドンである場合もある。
【００７８】
ここで用いる「合成物質」は試験管の中で、化学的に、または酵素合成により作りだされるものをいう。メチロトーフ酵母であるピチア及びハンセヌラ（Pichia and Hansenula）のような宿主生物のためのコドンとしてのて適正な用途をもつPS4核酸を含むが、それに限定されるものではない。
【００７９】
ここで用いる「形質転換細胞」は、DNA遺伝子組み換え技術を用いて変換される細胞を含む。特徴的な転換は、１又は２以上のヌクレオチド配列を細胞に挿入することにより起こる。このように挿入されたヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列（すなわち、変換される細胞にとり自然でない配列）、および/または代替的に、挿入されるヌクレオチド配列は相同ヌクレオチド配列、（すなわち変換される細胞にとり自然な配列である配列）であることもある。そして、細胞は既にそこにあるヌクレオチド配列の一つ、またはそれ以上のコピーをさらに受け取る。
【００８０】
ここで用いる「操作可能にリンクされた」とは、記載された構成部分が意図された態様で機能することを可能とする関係をいう。コードする配列に操作可能にリンクされたアラインメント塩基配列は、制御配列と適合可能な条件下でコード配列の発現を達成するような方法でコード配列に連結される。
【００８１】
ここで用いる「生物学的に活性」とは、自然的に発生する配列と同じような構造的機能（必ずしも同じ程度である必要はない）、同じ様なアラインメント機能（必ずしも同じ程度である必要はない）、そして、または、同じ様な生化学的機能（必ずしも同じ程度である必要はない）をもつ配列を指す。
【００８２】
Ｉ． 本発明のポリペプチドの詳細な説明
最初の特徴として、本発明は、親ポリペプチドに由来するPS4変異体を含むポリペプチドを提供する。親酵素は、好ましくは、マルトース非生成性エクソアミラーゼ、好ましくは、細菌マルトース非生成性エクソアミラーゼ酵素である。親酵素は、好ましくはマルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を示すポリペプチドである。
【００８３】
親酵素は、配列番号1、または配列番号5に示すエクソアミラーゼのようなシュードモナス サッカロフィリア マルトース非生成性エクソアミラーゼである場合もある。親酵素は、配列番号7、または配列番号11に示すポリペプチドのようなシュードモナス ストチェリ マルトース非生成性エクソアミラーゼであることもある。PS4ファミリーの他のメンバーは、下記（表1）に示す親酵素として用いることができる。好ましくは、PS4ファミリーのメンバーは、通常、配列番号1、配列番号5、配列番号7、または 配列番号11に示す、エクソアミラーゼと類似し、相同であり、または機能等価物である。プローブ（probe）を用いて、適当なライブラリーをハイブリッド形成スクリーニングすることにより、または、ゲノム配列分析のような標準的方法によって、識別することができる。識別方法を以下に記す。
【表１】
【００８４】
表１： 親配列（PS4ファミリーメンバー）。記載の配列は、規定のアミノ酸残基からなる置換を含む点で、表の最上行に示す位置においてシュードモナス サッカロフィリア配列と異なる。例えば、pS4ccl-S161Aは野生型シュードモナス マルトース非生成性エクソアミラーゼの変異種であり、したがって親酵素として用いることができる。さらに、ATCC17686のようなシュードモナス属の他の種に由来するマルトース非生成性エクソアミラーゼは、また親ポリペプチドとして用いることができる。PS4変異ポリペプチド残基は、変異PS4 ポリペプチド配列を生み出すために、これらの何れの親配列にも挿入することができる。
【００８５】
PS4変異ポリペプチドは、アミノ酸置換を含む多くの変異を含む点により親配列と異なっている。好ましい実施の態様においては、親ポリペプチドは、配列番号1, または配列番号5に示す配列をもつシュードモナス サッカロフィリア マルトース非生成性エクソアミラーゼに由来するマルトース非生成性エクソアミラーゼである。好ましい実施の態様においては、親ポリペプチドは、配列番号７、または配列番号11に示す配列をもつシュードモナスストチェリに由来するマルトース非生成性エクソアミラーゼを含んでいる。好ましい実施の態様においては、PS4変異体は-、アミノ酸置換を含むことにより、親ポリペプチドと異なっている。置換位置は以下に示す群から選択ばれる少なくとも一つ位置を含む。すなわち、4,9,13,33,34,42,70,71, 87,99,100,108,113,121,131, 134, 135, 141,153, 157,158, 160, 161, 166, 170,171, 178, 179, 184, 188, 198,199, 221,223,238, 270,277, 290, 307,315,334,335,342,343, 372,392,398,399, 405, 415,及び425である。ここで、位置番号は配列番号1に示すシュードモナス サッカロフィリアエクソアミラーゼに関するものである。好ましくは、当該位置は以下に示す群から選択される少なくとも一つの位置である。すなわち、33,34,87,121,134,141, 157,178,179,223,307及び334である。他の実施の態様においては、変異体はさらに、71,108,158,171,188,及び343に示す群から選択される一の置換を含む。他の実施の態様においては、変異体はさらに、113,198及び290の群から選択される一の置換を含む。
【００８６】
好ましくは、PS4変異体はN33Y, D34N,G87S,G121D,G134R, A141P, I157L, L178F,A179T,G223A,H307L及びS334Pよりなる群から選択される少なくとも一つの置換を持つ。好ましくは、PS4変異体は以下の置換をもつ。すなわち、N33Y,D34N, G134R, A141P, I157L, G223A,H307L及びS334Pよりなる群から選択される少なくとも一つの置換、及びさらにL178FまたはA179Tのいずれか一つを、追加的に持つものである。好ましくは、PS4変異体はN33Y,D34N,I157L,L178F, A179T, G223A,または,H307Lの一つの置換を持つ。好ましくは、PS4変異体はG87S,G134R,A141P またはS334Pの一つの置換を持つ。他の実施の態様においては、PS4変異体はK71R,K108R, G158D,Y171S,G188A, 及びD343Eの一つの置換を持っている。他の実施の態様においては、PS4変異体はV113I,Y198F,Y198W, 及びV290Iの内の一つの置換を持っている。
【００８７】
理論に拘泥することは望ましくないが、発明者は以下のように考える、すなわち、シュードモナス アミラーゼの3次元結晶構造は提案されている基質結合部位モデル（Molecular Operating Environment(MOE)ソフトプログラム、Chemical Computing Group, Inc., Montreal Canadaより入手可能）と併せて考察すると、残基位置121,157,223,及び307は、基質結合部位に近接していることを示している。実施例に示すデータは、G121Dは、酵素の安定性及びエクソ特異性を共に改善し、G223Aは、酵素の熱安定性を改善することを示している。既に、観察したような改善がなされ、その予想される位置が基質結合部位に近接していると予想されることを考慮すると、その各位置において、全ての可能なアミノ酸を代替することにより、さらに改善をすることができる。一の実施の態様においては、近接度は、基質結合部位から、特定の位置まで10.0オングストローム以内である。また、一つの実施の態様においては、近接度は、基質結合部位から、特定の位置まで7.5オングストローム以内である。一つの実施の態様においては、近接度は、基質結合部位から、特定の位置まで6.0オングストローム以内である。例えば、G121 C-αから基質まで約5.9オングストローム;G223 C-αから基質まで約5.82オングストロームである。
【００８８】
ある実施の態様においては、PS4変異体は、以下の（数７）から選択される一つの組合せを含む；
【数７】
【００８９】
他の実施の態様においては、少なくとも一つの置換は、以下の（数８）から選択される一つの組合せを含む；
【数８】
【００９０】
他の実施の態様においては、少なくとも一つの置換を含むエクソアミラーゼは、以下の（数９）から選択される一つの組合せを含む；
【数９】
【００９１】
他の実施の態様においては、少なくとも一つの置換を含むエクソアミラーゼは、以下の（数１０）から選択される一つの組合せを含む；
【数１０】
【００９２】
好ましい実施の態様においては、PS4変異体は、配列番号2, 配列番号 3, 配列番号4, 配列番号4a, 配列番号4b, 配列番号4c, 配列番号8 配列番号9または配列番号10のいずれかを含むアミノ酸配列である。
【００９３】
PS4変異ポリペプチドは、上に述べものに加え、１又は２以上の変異を含んでもよい。一またはそれ以上の位置における、欠失、挿入、置換、転換、転位、及び逆位のような他の変異も含まんでもよい。同様にポリペプチドは、上に規定する置換の少なくとも一つを欠いていてもよい。
【００９４】
PS4変異体は、対応する置換（塩基対塩基、酸性対酸性、極対極等）として発生する同類置換を含んでもよい。非同類置換も起き得る、すなわち、ある種類の残留基から他の種類の残留基への置換、または、代替的にオルニチン（以下 Zという）ジアミノブチル酸オルニチン（以下 B という）、ノルロイシン、オルニチン（以下Oという）、ピリララニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシンのような自然界にないアミノ酸を含む形でも起こり得る。
【００９５】
配列は、また目立たない変化を生み出し、結果的に機能等価物な基質を生み出すアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を持つこともある。意図的なアミノ酸置換は、アミノ酸の固有の特質（例えば、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および/または両親媒性など）における類似をベースに行われる。したがって、アミノ酸を官能基別にグループ化することは有益である。アミノ酸は、その側鎖の持つ特性のみにより、グループ化することができる。しかし、さらに、変異データを含むことにより一層有益なものとなる。このようにして得られるアミノ酸の組は、その構造の違いとして分類されると思われる。これらの組は、Vennダイアグラム（Livingstone C.D. and Barton G.J.(1993) 「タンパク質配列のアラインメント、同類残基の系統的分析のための戦略」(Protein sequence alignments:a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation”) Comput Appl Biosci,9:745-756(Taylor W.R.(1986)「同類アミノ酸の分類」(The classification of amino acid conservation”J.Theor, Biol. 119:205-218). 同類置換は、例えば、Vennダイアグラムのによるアミノ酸のグループ化を表すものとして一般に受け入れられている下記（数１１）に従い作成することができる。
【数１１】
【００９６】
変異アミノ酸配列は、またグリシン、またはβアラニン残基のようなアミノ酸スペーサに加え、メチル、エチル、プロピル基のようなアルキル基を含む配列の、何れかの二つのアミノ酸残基の間に挿入される適当なスペーサをも含む。更なる分化の形態としては、ぺプトイドの形をとる一又は二以上のアミノ酸残基がある。
【００９７】
PS4変異体は、また相同配列を持っている場合がある。相同配列は、PS4変異体をコードするヌクレオチド配列と少なくとも、75%,80%,85%,または90%、好ましくは少なくとも95%,96%,97%,98%,または99％同一配列をもつ。典型的な場合は、相同体は、活性サイトをコードする配列が、主配列と同じ配列である配列を持つことがある。
【００９８】
相同性の比較は、肉眼により実行でき、より一般的には、簡易に入手可能な配列比較プログラムを用いて行う。これらの、商業的に入手可能なコンピュータプログラムは、2またはそれ以上の配列間の相同性％を計算をすることができる。相同性％は連続した配列にわたって計算することができる、すなわち、一の配列を他の配列と互いにアラインさせ、一の配列中の各アミノ酸を他の配列中の対応するアミノ酸と、一度に残基一つについて直接対比して行う。これは「隙間のないアラインメント」（ungapped alignment）と呼ばれている。典型的には、このような「隙間のないアラインメント」は比較的少数の残基についてのみ行う。
【００９９】
非常に簡便で、理屈に合った方法であるが、しかしこの方法は以下の点の考慮が欠けている。たとえば、それらの、挿入、欠失がなければ同一である一組の配列において、一つの挿入または欠失があることにより、続くアミノ酸残基が「アラインメント」から外れてしまい、全体としてのアラインメントを取った場合、相同性％が大きく減少するおそれがある。そのため、殆どの配列比較法は全体としての相同性の数値を不当に損なうことのない様、予想される挿入、および欠失を考慮した最適アラインメントを生み出すようにデザインされている。これは、局所での相同性を極力最大化するように、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することにより達成される。
【０１００】
しかしながら、これらの内のより複雑な方法は、アラインメントで生ずる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り振り、そのため、同一のアミノ酸が同数である場合に、配列アラインメントにおいてギャップを極力少なくすればする程−これは、対比される2つの配列間により高い関連性があることを示すーギャップが多い配列よりも高い数値が得られるようになっている。「擬似変換ギャップコスト」は、典型的には、一のギャップのある場合は比較的高いコストを課し、そのギャプに生ずる各従属残基にはより小さいペナルティを課す形で用いられる。この方法が最も多く用いられているギャップ得点システムである。高いギャップペナルティは、勿論一層ギャップの少ない最適なアラインメントを生み出す。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティの改変を認めている。しかしながら、配列比較にそのようなソフトを使用する場合には、初期設定によることがのぞましい。例えば、GCG Wisconsin Bestfitセットを使用する場合、アミノ酸配列のギャップペナルティの初期設定は、1ギャップに対して-12, そして、それぞれの延長（extension）に対して-4となっている。
【０１０１】
したがって、相同性％の最大値を計算する場合には、まず、ギャップペナルティを考慮して、最適アラインメントを生み出すことが必要となる。そのようなアラインメント生み出すのにふさわしいコンピュータプログラムは、GCG Wisconsin Bestfitセット(Devereux et. al 1984 Nuc. Acids Reseach 12 p387)である。他のソフトで配列比較が可能なものとして、これらに限定されるものではないが、BLASTセット（Ausubel et. al 1999, Short Protocols in Molecular Biology, 4thEd.-Chapter 18）, FASTA (Altshul et. al , 1990 J. Mol. Biol. 403-410)およびGENEWORKS 比較ツールセットがある。BLAST、およびFASTAはともにオフラインおよびオンラインの両方で利用可能である（Ausubel et. al 1999,Short Protocols in Molecular Biology,、７-５８頁、７-６０頁参照）。しかしながら、アプリケイションによっては、GCG Bestfitプログラムを用いるのが好ましい。BLAST２Sequenceはタンパク質およびヌクレオチド配列の比較に利用できる（FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1):187-8;およびtatiana@ncbi.nlm.nih.gov）。
【０１０２】
最終的な相同性％は、同一であるか否かにより測られるが、アラインメントプロセス自体は、特徴的には、ゼロか全てかの二者択一による対比によるものではない。それ代わり一般的には、段階的な類似スコアマトリックスが用いられており、化学的な類似、または進化の距離に基づきそれぞれの組について点数を割り当てる。そのようなマトリックスで、通常用いられる例として、BLOSUM62マトリックス−BLASTプログラムセットの初期設定マトリックスーがある。GCG Wisconsinプログラムは一般に公表されている初期設定値、またはもし入手できればオーダーメイドのシンボル比較表を用いる（詳細はユザーマニュアル参照のこと）。いくつかの適用例においては、GCGセットの場合、公表初期設定値を用いるか、または他のソフトの場合はBLOSUM62のように、初期設定マトリックスを用いる。
【０１０３】
また、選択的に、相同性％はCLUSRAL(Higgins DG & Sharp PM (1977), Gene 73(1), 237-244)に類似した、アルゴリズムに基づくDNASISTM（日立 ソフト）の複数アラインメント特性を用いて計算することもできる。
【０１０４】
ソフトが最適なアラインメント組合せを生み出したなら、相同性％、好ましくは、同一配列の％を計算することが可能となる。ソフトは、典型的には、配列比較の一部として、これを実行し、数値結果をだす。
【０１０５】
好ましい実施の態様においては、また、機能等価物を含んでいる。ここに記載されたPS4変異ポリペプチドは、好ましくはマルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を示すポリペプチドに由来し、またはその変異体である。好ましくは、これらの親酵素は、マルトース非生成性エクソアミラーゼ自体である。PS4変異ポリペプチド自体、好ましい実施の態様においては、またマルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を示す。
【０１０６】
ここに記載のPS4変異体は、好ましくは、例えば、それがエクソアミラーゼであることと矛盾せず、上記のようなエクソ特異性指標により測定した、エクソ特異性を持つ。さらにPS4変異体は、それが由来した親酵素またはポリペプチドと比較した場合に、より高い、または増大したエクソ特異性（exospecificity）をもつ。したがって、例えば、PS4変異ポリペプチドは、親ポリペプチドと、好ましくは同一の条件下で比較した場合、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、またはそれより高いエクソ特異性を持つと思われる。これらは、好ましくは同一条件下で親ポリペプチドと比較した場合、1.5倍以上、２倍以上、5倍以上、10倍以上、50倍以上、100倍以上、持つと思われる。
【０１０７】
好ましい実施の態様においては、機能等価物はPS4ファミリーメンバーの少なくとも一つと相同の配列を持つ。機能等価物は、上に述べたシュードモナス サッカロフィリア、およびシュードモナス ストチェリ マルトース非生成性エクソアミラーゼのいずれかと、好ましくは両方と配列相同性をもつ。機能等価物は、配列番号1から１２、好ましくは、配列番号1、または配列番号7、またはその両方に示された配列とも配列相同性をもつ。そのような配列間の配列相同性は、好ましくは、少なくとも、60％以上、好ましくは65％以上、好ましくは75％以上、好ましくは80％以上、好ましくは85％以上、好ましくは90％以上、または好ましくは95％以上、ある。
【０１０８】
他の実施の態様においては、機能等価物は上記の配列の何れとも、特にハイブリッド形成をすることができる。一の配列が他の配列とハイブリッド形成することができるかを決定する方法は、業界で知られており、例えば、Sambrook et.al (上記)、Ausubel,F.M. et. al(上記)に記載されている。極めて好ましい実施の態様においては、機能等価物は65℃、および0.1xSSC(1xSSC=0.15M NaCl, 0.015M Na3 クエン酸 pH7.0)のような厳しい条件の下においてハイブリッド形成をする。
【０１０９】
アミノ酸配列は、適切なソースから準備・分離することができ、または合成し、またはDNA遺伝子組み換え技術を用いて作ることができる。いくつかの方法を下記する。
【０１１０】
２．本願発明の核酸の詳細な説明
第二の特徴は、本発明は核酸を提供する。核酸は、上で述べたように、親ポリペプチドに由来するPS4変異体を含むポリペプチドをコードする。
【０１１１】
当業者であれば、核酸の配列とポリペプチド配列間の関係、特に、遺伝子コードおよびこのコードの縮重を知っており、困難なく、そのようなPS4核酸を構築することができるだろう。例えば、当業者はPS4変異ポリペプチド配列中の各々のアミノ酸置換について、置換アミノ酸をコードする一またはそれ以上以上のコドンがあることを知っているであろう。したがって、ある特定のアミノ酸残基に関する遺伝子コードの縮重に基づき、一又はそれ以上のPS4核酸配列がそのPS4変異ポリペプチド配列に対応して生成されることは明白であろう。したがって、例えば、PS４核酸配列は、ポリペプチドをコードする親配列に由来するかも知れない。そこでは、PS4変異体核酸は、以下の位置のアミノ酸置換をコードしている。すなわち、G134,A141,I157,G223,H307, S334,N33およびD34,に加えL178およびA179のいずれか一つ、またはその両方である。
【０１１２】
アミノ酸配列、および核酸配列における変異は、業界で公知のように、多くの技法により作られている。特に好ましい実施の態様においては、変異は、実施例に描かれているように、適用なプライマーを用いてPCR（polymerase chain reaction）により親配列に導入される。
【０１１３】
親酵素は、ここに記載されたPS4変異体配列を生み出すためアミノ酸レベル、または核酸レベルで修飾を受ける。したがって、本発明のこの特徴について、好ましい実施の態様として、マルトース非生成性エクソアミラーゼ ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の１又は２以上の対応するコドン変化を導入することによりPS4変異ポリペプチドを生み出すことを提供している。
【０１１４】
上記のコドン変化は、何れのPS4ファミリー核酸配列においてもなしうることに注目すべきである。例えば、配列変化は、シュードモナス サッカロフィリアまたはシュードモナス ストチェリ マルトース非生成性エクソアミラーゼ核酸配列にも起こすことができる（例えば、X16732, 配列番号6、または、M24516,配列番号12）。
【０１１５】
親酵素は「完全な」酵素、すなわち、自然に発生したままの長さ（または、変異したまま）、または、その切断した形のものを含む。そのような酵素に由来するPS4変異体は、したがって、そのように切断された形、または「全長」を持っている。切断は、N-末端、またはC-末端で起きる。親酵素、またはPS4変異体は、活性であるか否かを問わず、サブ配列、シグナル配列、ドメインまたはその部分のような１又は２以上の部分を欠くこともある。例えば、親酵素、またはPS4変異ポリペプチドは、上に述べたようにシグナル配列を欠いていることもある。代替的に、または、追加的に、親酵素、またはPS4変異体は、１又は２以上の触媒、または結合ドメインを欠いていることもある。
【０１１６】
極めて好ましい実施の態様においては、親酵素、またはPS4変異体は、でんぷん結合ドメインのようなマルトース非生成性エクソアミラーゼにある、１又は２以上のドメインを欠いていることもある。例えば、PS4ポリペプチドは配列番号:1に示す、シュードモナス サッカロフィリア マルトース非生成性エクソアミラーゼの番号429までの配列しか持っていないこともある。例えば、このケースは実施例に記載されたPS4変異体pSac-d34,pSac-D20, pSac-D14,または、他の変異体である。
【０１１７】
典型的には、PS4変異体ヌクレオチド配列は、DNA組み換え技法を用いて準備されたものである。しかしながら、他の代替的実施の態様においては、ヌクレオチド配列は、業界で公知の化学的技法を用いて、全体もしくは、その一部を合成することが可能であると思われる（Caruthers MHat al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 and Horn T el al, (1980), Nuc Acids Res Symp Ser 225-232）。
【０１１８】
ここに規定した特性を持つ酵素、または親酵素のように、修飾に適している酵素をコードするヌクレオチド配列は、その酵素を生みだす細胞、または生物から同定、分離、および/または精製される。ヌクレオチド配列の同定、分離、および/または、精製のための種々の方法は業界でよく知られている。その例としては、ある適切な配列が、同定、分離、および/または精製されたならば、その配列の、更に多くの配列を準備するPCR増幅技術をが用いることができる。
【０１１９】
さらに例を挙げると、ゲノムDNA、および/またはｃDNAライブラリーは、酵素を生み出す生物の染色体DNA、またはメッセンジャーRNAを用いて構築される。酵素のアミノ酸配列、または、酵素のアミノ酸配列の一部が知られていれば、標識のついたオリゴヌクレオチドプローブが合成され、その生物から準備されたゲノムライブラリーの酵素をコードするクローンを同定するために用いられる。代替的に、他の知られた酵素ゲノムと相同配列をもつ標識のついたオリゴヌクレオチドプローブが、酵素をコードするクローンを同定するために用いられる。後のケースにおいては、ハイブリッド形成および洗浄は厳格度の緩い条件が適用される。
【０１２０】
代替的に、酵素をコードするクローンは、プラスミドのような発現ベクターにゲノムDNAの断片を挿入することにより同定することが出来る。そして生じたゲノムDNAライブラリーによって酵素否定的バクテリアを変換し、そして酵素の基質（例えば、マルトース）を含むかんてん培地に、変換されたバクテリアを植えつけることにより酵素を発現させることによりクローンが同定される。
【０１２１】
更なる代替的方法としては、酵素をコードするヌクレオチド配列は、例えば、Beucage S.L. et al., (1981)、Tetrahedron Letters 22,p1859-1869,に記載されたフォスフォロアミダイト法（phosphoroamidite）、またはMatthes et al.,(1984), EMBO J.3,p801-805に記載された方法などのような確立された標準的方法により合成することができる。フォスフォロアミダイト法は、例えば、オリゴヌクレオチドが、例えば、DNAの自動合成により、精製、アニール、連結、および、適当なベクターを用いてクローン合成される。
【０１２２】
ヌクレオチド配列は、標準の技法により、合成された、ゲノムの、またはｃDNAオリジンの各断片を連結することにより準備された、ゲノムと合成物の混合、合成物とｃDNAオリジンの混合、またはゲノムとcDNAオリジンの混合からなる。連結された、各断片は、全ヌクレオチド配列の各部分に対応する。DNA配列は、また、例えば、US4,683,202,または、Saiki R.K et al,(Science （1988） p239, pp487-491)に記載されている様な特定のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により作ることもある。
【０１２３】
ここに記載のヌクレオチド配列で、ここに記載の方法、および構成に使用するのに適しているものは、その中に、合成、または修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドの修飾は、多くの異なるタイプの方法が業界において知られている。これら、メチルフォスフォネートおよびフォスフォロチオエート骨格、および/または分子の３’および/または５’の位置で，アクリジン（acridine）または、ポリリシン（polylysine）が付加されたものを含む。本明細書においては、ここに記載のヌクレオチド配列は、当業者に利用可能の方法により修飾してもよいと解される。そのような修飾はヌクレオチド配列の生体内活性を高め、または寿命を長引かせるために認められる。
【０１２４】
好ましい実施の態様においては、本発明は、核酸及びここに提示されている核酸配列に相補的な核酸配列の使用、それらに由来する配列、断片、またはその断片の由来物に相補的であるヌクレオチド配列、およびその使用法について提示している。もし、配列がその断片にとり相補的であるとすれば、その配列は、他の生物などにおいて同様のコード配列を同定するプローブとして用いることができる。
【０１２５】
PS4変異体配列と100％相同ではないポリヌクレオチドは、多くの方法で入手することができる。ここに記載する配列の他の変異体は、例えば、個人の範囲、すなわち、例えば、異種人口のその構成する個人に由来するDNAライブラリーをプローブすることで得ることができる。さらに、他の相同種が得られることもあり、その相同種、およびその断片は、通常ここに記載の配列リストに示す配列と、選択的にハイブリッド形成をすることができる。そのような配列は、他の種に由来するｃDNAライブラリー、または、他の種に由来するゲノムDNAライブラリーのプローブにより、および、添付した配列表にある全て、またはそのいずれかの配列の一部を含むプローグを有するそのようなライブラリーを、中程度から高度に厳しい条件の下で、プローブすることにより得ることができる。本発明に記載した相同種、およびポリぺプチド、またはヌクレオチド配列の対立遺伝子変異体を得る場合にも同様の考えが適用される。
【０１２６】
変異体、相同菌株/種は、また保存アミノ酸配列をコードする変異体および相同種中の、配列をターゲットしてデザインされたプライマーを用いる縮重PCRを用いることにより得られる。縮重PCRで用いられるプライマーは一または二以上の縮重位置を持ち、既知の配列に対してシングル配列プライマーによって配列をクローンするのに用いられた条件より緩い条件で用いられる。保存配列は、例えば、いくつかの変異体/相同体からアミノ酸配列をアラインすることにより予測されうる。配列のアラインメントは、ここに記載されたように、業界で知られたコンピュータソフトを使って実施することができる。
【０１２７】
代替的に、そのようなポリヌクレオチドは、特徴配列の部位特異的突然変異誘発法により得ることができる。これは、例えば、ポリヌクレオチド配列が発現している特定の宿主細胞にコドンを選択的に備えるために、サイレントコドン配列の変更が必要となる場合に有用である。他の配列の変更は、制限酵素認識部位を導入する、またはポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの特性または機能を変えるために望まれることがある。
【０１２８】
ポリヌクレオチドは、プライマーを作りだすために用いられる。例えば、PCRプライマー、代替的増幅反応のためのプライマー、プローブ、例えば、放射性または、非放射性ラベルを用いる従来方法による標識のついたプローブ、またはポリヌクレオチドがベクターに複製される。このプライマー、プローブ、および他の断片は、その長さにおいて、少なくとも15、好ましくは少なくとも20、たとえば、少なくとも25,30または、40ヌクレオチドを持ち、これらもまた、ポリヌクレオチドの用語に含まれる。
【０１２９】
DNAポリヌクレオチドのようなポリヌクレオチド、およびプローブは、遺伝子組み換えにより合成、または当業者に取り利用可能などのような方法によっても作り出すことができる。また、これらは標準技法によりクローン複製することもできる。一般的にプライマーは、所望する核酸配列を、一つのヌクレオチドを一度に一つ作る段階的製作する合成法により作り出される。自動化された技法を使いこれを作り出す手法は、当業者に利用可能である。
【０１３０】
より長いポリヌクレオチドは、一般に、例えばPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)のクローン技術を用いる組換え方法により作りだされる。増幅DNAが、適当なクローンベクターに複製されるように、プライマーは適当な制限酵素認識部位を含むようにデザインされている。好ましくは、変異体配列は、少なくともここに記載されている配列と同程度に生物学活性がある。
【０１３１】
発明の好ましい実施の態様においては、PS4変異体のヌクレオチド配列（ここに記載されているヌクレオチドの相補配列を含む）とハイブリッド形成することのできる配列と相補的であるヌクレオチド配列のみならず、PS4変異体の核酸配列と相補的な配列や、またはPS4変異体のヌクレオチド配列（ここに記載されているヌクレオチドの相補配列を含む）とハイブリッド形成することのできる配列を含む。好ましい実施の態様においては、中程度から厳しい条件でここに記載の核酸配列とハイブリッド形成することができるポリヌクレオチド配列を提供する。
【０１３２】
好ましい実施の態様においては、厳しい条件（例えば、50℃および0.2ｘSSC）下で、PS4変異体核酸または、その補体とハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列を含む。より好ましくは、ヌクレオチド配列はPS4変異体のヌクレオチド配列、またはその補体と高度に厳格な条件（例えば、65℃および0.1ｘSSC）下で、PS4変異体の核酸配列とハイブリッド形成することができる。
【０１３３】
一旦、酵素をコードするヌクレオチド配列が分離され、または酵素をコードする推定ヌクレオチド配列が確認されたならば、酵素を作るために、配列を変異させることが望ましい。したがって、PS4変異体配列は親配列から作ることができる。変異は、合成オリゴヌクレオチドを用いて導入することができる。このオリゴヌクレオチドは、所望する変異部位の側面に位置するヌクレオチド配列を含む。一つの適切な方法は、Morinaga,et al..(Biotechnology (1984)2, p646-649)に記載されている。酵素をコードするヌクレオチド配列に変異を導入する他の方法はNelson and Long(Analytical Biochmistry (1989).180, p147-151)に記載されている。さらに、別の方法がSakar and Sommer(Biotechniques (1990), 8,p404-407,（The megaprimer method of site directted mutagenesis）に記載されている。
【０１３４】
好ましい実施の態様においては、ここに記載された方法および構成で用いれられる配列は、遺伝子組み換え配列、すなわち遺伝子組み換えDNA技術を用いて準備された配列である。かかる技術、例えば、J.Sambrook,E.F.Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Habour Laboratory Press.の文献に説明されている。
【０１３５】
３、発明の構成の詳細な説明
発明の第3の特徴は、変異ポリポリペプチドおよびこれらの組成物についての使用についてのみならず、マルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を持つポリペプチドの変異体であるポリペプチドを含む組成物を提供する。ここで組成物とは、他の組成物を含有するポリペプチド変異体を含む。
【０１３６】
発明の好ましい実施の態様においては、PS4変異ポリペプチド、および任意選択的に，更なる成分、または追加酵素、またはその両者を含む。PS4ポリペプチドに加え、例えば、食品、パン生地、食品材料、または、でんぷん成分に、一又は二以上の酵素が追加される。さらにパン生地に加えられる追加酵素は、α-アミラーゼ、プルラナーゼ、およびキシラナーゼ、のようなグリコシダーゼに加え、オキシドレダクターゼ、カルボン酸エステル結合を加水分解し、カルボン酸を放出するリパーゼ（例えば、リパーゼ(E.C.３.1.1．)）のような、また、トリアシルグリセロールリパーゼ(E.C.3.1.1.3),ガラクトリパーゼ(E.C.3.1.1.26)、フォスフォリパーゼA1(E.C.3.1.1.32),フォスフォリパーゼA2(E.C.3.1.1.4)),リポタンパク質リパーゼA2(E.C.3.1.1.34)のような、ヒドロラーゼ、およびエステラーゼ、を含む。マルトース酸化酵素、グルコース酸化酵素(E.C.1.1.3.4)、炭水化物酸化酵素、グリセロール酸化酵素、ピラノース酸化酵素、ガサクトース酸化酵素(E.C.1.1.3.10)、ヘキソース酸化酵素(E.C.1.1.3.5)、のようなオキシドレダクターゼ（酸化還元酵素）は、パン生地を強くし、焼いたパン製品の容量をコントロールするために用いられる。また、キシラナーゼおよび他のヘミセルラーゼはパン生地の取り扱いをより容易に改善し、パンの身を軟らかくし、その容量を増す。リパーゼは、パン生地を強力にし、またパン生地の身を軟らかくする。αアミラーゼおよび他のでんぷん分解酵素はパンの容量をコントロールし、さらにパンの身が堅くなるのを抑えるために、パン生地に加えられる。さらに加える追加酵素は、セルラーゼ、へミセルラーゼ、でんぷん分解酵素、プロテアーゼ、リポキシゲナーゼ、よりなる群から選択することができる。好ましい実施の態様においては、PS4変異ポリペプチドは，アミラーゼ、特にマルトース生成性アミラーゼ（maltogenic amylases）と組合せるのが望ましい。マルトース生成性α−アミラーゼ（グルカン １，４−αマルトヒドロラーゼ(E.C.3.2.1.133)）は、アミロースおよびアミロペクチンをα−配置のマルトースに加水分解することができる。
【０１３７】
Bacillus (EP120 693)に由来するマルトース生成性α−アミラーゼは、市場で調達が可能であり（Novo Nordisk A/S,Denmark）でんぷんの後退を抑える働きをするため、製パン業界において、広く老化抑制剤として用いられている（例えば、WO 91/04669 参照）。マルトース生成性α−アミラーゼはシクロデクストリングルカノ転移酵素（GCTases）と配列相同（Henrissat B,Bairoch A; Biochem J., 316, 695-696(1996)）および、トランスグリコシル化 製品（Christophersen C.,et al., 1997, Starch, vol.50, No.1, 39-45）の構成を含み、いくつかの点で共通の特徴を持っている。好ましい実施の態様においては、α−アミラーゼ、またはそのいずれの変異体とPS4変異ポリペプチドを含む組合せがある。
【０１３８】
そのような組合せは、ベーキングのような食品生産には有用である。米国特許US6,162,628に開示された、変異体、相同物、および変異体の変異種は −同特許に開示されている内容は全ては本願に引用として組み入れられる− ここに記載のPS4変異ポリペプチドと組み合わせて用いることができる。US6,162,128に記載されているどのポリペプチドも、特に配列番号１の変異体は、以下の（数１２）の一または二以上の対応する位置におけるものは、組み合わせて用いることができる。
【数１２】
【０１３９】
さらに、小麦粉、水、他の任意に選択した成分、添加物または、パン生地を改良する構成物を含むどのようなパン生地原料と共に追加することができる。追加酵素は、小麦粉、水、他の任意に選択した成分、添加物または、パン生地を改良する組成物を入れる前、または後に追加することができる。さらに、その酵素は、必要に応じて、液体で準備しても良くまた乾燥した形のものでも良い。
【０１４０】
パン生地を改良する組成分を含む酵素のいくつかは、小麦粉のパン生地の変形、流動、および/または、その機械加工性の改良への影響、および/または酵素を加えたパン生地から作られる製品の品質に対する影響が、追加的効果であるのみでなく、相乗的であるという範囲において、互いに相互作用を及ぼしあうことができる。パン生地から作られる製品（最終製品）の改良に関していえば、組み合わせの結果によりパンの身の構成に関して、本質的な相乗効果が見出せるといえる。また、焼いた製品の容量についても、相乗効果が見られるであろう。
【０１４１】
４．ベクター、細胞 及びPS4ポリペプチドの発現方法
第４の特徴として、本発明はPS4変異ポリペプチドを含むベクター、PS4変異ポリペプチドを含む細胞、及びPS4変異ポリペプチドを発現する方法を提供する。
【０１４２】
ここに記載されている方法及び構成物による使用されるヌクレオチド配列は、遺伝子組み換えによる複写可能なベクターに組み入れられる。ベクターは酵素の形で、互換性のある宿主細胞において、および/または宿主細胞から得るヌクレオチド配列を複製して、そして発現するために用いられる。その発現は、例えば、調整配列などの制御配列を用いて制御される。遺伝子組み換え宿主細胞から、ヌクレオチド配列発現により生み出された酵素は、配列及び、もしくは用いられるベクターに応じて、分秘されるか、細胞に内包される。コード配列は、特定の原核細胞、または、真核細胞膜を通じ、配列をコードする物質を分秘することを指示するシグナル配列を有するようにデザインされる。
【０１４３】
ポリヌクレオチドは遺伝子組み換え複製ベクターに組み入れることができる。ベクターは適合性のある宿主細胞において核酸を複製するのに用いられる。ポリペプチド配列を含むベクターは、適当な宿主細胞に変換される。適当な宿生は、バクテリア、イースト、昆虫、及び菌類細胞を含む。
【０１４４】
PS4変異ポリペプチド及びポリヌクレオチドは、ポリペプチドを複製ベクターに、ベクターを適合性のある宿主細胞に導入し、そしてベクターの複製を作ることのできる条件のもとで宿主細胞を成長させることにより発現することができる。ベクターは宿主細胞から回収される。
【０１４５】
PS4核酸は、対象となっている宿主細胞において活性のある、転写、翻訳、調整要素とその活性がリンクされている。PS4核酸はまた、たとえばシュワソニノシーセス オキシデンタリス（Shwanniomyces occidentalis）に由来する、グルコアミラーゼ遺伝子、また、サッカロミーセス セレビシア（Saccharomyces cerevisiae）に由来するα因子接合タイプ遺伝子、及びアスペルシラス オリジー（Aspergillus oryzae）由来のTAKA アミラーゼのようなシグナル配列を含む融合たんぱく質をコードすることもある。代替的に、PS4核酸は細胞膜を結合するドメインを含む融合たんぱく質をコードすることもある。
【０１４６】
PS4変異体は、発現ベクターを用いることにより、宿生生物において望ましいレベルにおいて発現することができる。PS4核酸を含む発現ベクターは選択された宿生生物における、PS4核酸をコードする遺伝子を発現させるどのようなベクターであってもよく、そしてベクターの選択は、それが導入される宿生細胞によって異なる。したがって、ベクターは自動的に複製するベクター、すなわち、エピソーム体として存在するべクターであり、その複製物は、たとえば、プラスミド、バクテリオファージ、または、エピソマル要素、小染色体、または人工的染色体のような、染色体による複製とはまったく独立したものである。代替的に、ベクターは、宿主細胞に導入された場合に宿主細胞ゲノムと一体となり、染色体と共に複製されるものでもよい。
【０１４７】
発現ベクターは、典型的には、例えば、選択された宿生生物において、ベクターの自動複製を許す要素であるクーロンべクターの構成部分、及び、選択のために発現型の検知可能な、１又は２以上のマーカーを持っている。発現ベクターは、通常、プロモータ、オペレータ、リボソーム結合サイト、翻訳開始シグナル、及び任意選択的に抑制遺伝子、または,１又は２以上の活性遺伝子をコードする制御ヌクレオチド配列を含む。さらに、発現ベクターは、ぺロオキシソームのように宿主細胞小器官に、または、特定の宿主細胞区画を標的として、PS4変異体を向けることのできるアミノ酸配列をコードする配列を含む。そのような標的配列は、これに限定されるものではないが、SKL配列を含む。制御配列の指示下での発現では、核酸配列PS4変異体は、発現との関係において、作業可能なように適当な方法により制御配列と連結されている。
【０１４８】
好ましくは、ベクターのポリヌクレオチドは、宿主細胞によりコード配列の発現を提供することのできる制御配列に作業可能なようにリンクされている。すなわち、ベクターは発現ベクターである。制御配列は、たとえば、更なる転写調整要素を追加することにより、転写活性調節因子により反応する制御配列によって転写レベルを指示できるように、制御配列を修飾することができる。制御配列は特にプロモータを含む場合がある。
【０１４９】
ベクターにおいては、PS4変異ポリペプチドをコードする核酸配列はひとつの、適当なプロモータ配列と、作動可能になるように組合されている。プロモータは、選択された宿生生物における転写活動をする何れのDNA配列でもよく、宿生生物と相同または非相同である遺伝子に由来することができる。PS4核酸ような、宿生バクテリアにおいて修飾されたヌクレオチド配列の転写を指令するプロモータの適当な例として、例えば、以下のものがある。E.coliのＬａｃオペロン（lac operon）のプロモータ、ストレプトマイセス コリコロー アガラーゼ（Sytreptomyces coelicolor agarase）遺伝子dagA プロモータ、バシラス リケニフォルムス（Bacillus licheniformis） α-アミラーゼ遺伝子（amyL）プロモータ、バシラスサブティリス（Bacillus subtilis）のaprEプロモータ、バシラス ステアロテモフィラス マルトース生成性アミラーゼ、(Bacillus stearothemophilus maltogenic amylase 遺伝子 (amyM))のプロモータ, バシラス アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens） α-アミラーゼ遺伝子（amyQ）プロモータ、バシラス サブティリス（Bacillus subtilis）xylA and xylB 遺伝子プロモータ、及び、P170を含むラクトコッカス種由来（Lactococcus sp-derived ）プロモータから得られるプロモータ。PS4変異ポリペプチドをコードする遺伝子が、E.coli.のようなバクテリア種において発現される場合、たとえばＴ７プロモータ、およびラムダファージ(Phage lambda) プロモータを含むバクテリオファージプロモータから適当なプロモータを選択することができる。菌種の転写における有用なプロモータの例としては、以下をコードする遺伝子に由来するものがある、すなわち
アスペルギラス オリジー（Aspergillus oryzae） TAKA アミラーゼ、リゾムコールミーヘイ アスパラギン酸プロティナーゼ、（Rhizomucor miehei aspartic proteinase）、アスペルギラス ニジェール（Aspergillus niger）中性α-アミラーゼ、アスペルギラス ニジェール（Aspergillus niger） 酸安定性α-アミラーゼ、アスペルギラス ニジェール グルコアミラーゼ（Aspergillus niger glucoamylase,）、リゾムコールミーヘイリパーゼ（Rhizomucor miehei lipase） リパーゼ、アスペルギラス オリジーアルカリプロテアーゼ（Aspergullus oryzae alkaline protease）、アスペルギラス オリジートリオース フォスフェートイソメラーゼ（Aspergilus oryzae triose phosphate isomerase）,または アスペルギラス ニドランアセトアミラーゼ（Aspergillus nidulans acetamidase）。イースト種に置ける発現の適当なプロモータの例としては、これに限定するものではないが、サッカロミーセス セレヴィジー（Saccharomyces cerevisiae）のGal 1, Gal 2のプロモータ、及びピキア パストリス（Pichia pastoris） AOX1 またはAOX2 プロモータがある。
【０１５０】
適当なバクテリア宿生生物の例として、グラム陽性のバクテリア種、たとえば、バシラス サブトリス（Bacillus subtilis）, バシラス リチェニフォルミス（Bacillus lichniformis）, バシラス レントス （Bacillus lentus）, バシラス ブレビス（Bacillus brevis）,バシラス ステアロテルモフィラス（Bacillus stearothermophilus）, バシラス アルカロフィラス （Bacillus alkalophilus）,バシラス アミリリクファシーン（Bacillus amylilique- faciens）バシラス コアグルン（Bacillus coagulans）,バシラス ランツス（Bacillus lautus）,バシラス メガテリウム（Bacillus megaterium） 及バシラス トルギエンシ（Bacillus thurungiensis）, のようなバシラセ種（Bacillaceae）、ストレプトミーセス ムリナス（Streptomyces murinus）,のようなStreptomyces種、ラクトコカス ラクチス（Lactococcus lactis） のようなラクトコカス種（Lactococcus spp）.を含む乳酸菌種、ラクトバシラスロイテリ（Lactobacillus reuteri）を含むLactobacillus spp.,ロイコノストク（Leuconostoc spp）,ペディオコッカス（Pediococcus spp）.及びStreptococcus spp.がある。代替的に、E.coli を含むエントロバクテリアシー（Enterobacteriaceae） または、シュードモナダシー（Pseudomonadaceae）に属するグラム陰性バクテリア種は宿生生物として選択することができる。適切なイースト宿生生物は、以下のイースト種に限定されることなく、生物工学的に関連する以下のイースト種、例えば、Pichia sp.Hansenula sp., または、クリベロマイセス（Kluyveromyces）,ヤロウイーナ（Yarrowinia種）、または Sacchromyces cerevisiaeを含むSaccharomyces、または、たとえば、エスポンベ（S.Pombe 種）のようなスキゾサッカロミーセース（Schizpsaccharomyce） に属する種 から選択することができる。好ましくは、メチロトロフィックイースト種ピキアパストリス（Pichia pastoris種）は宿生生物として用いられるのが望ましい。好ましくは宿生生物はハンセヌーラ（Hansenula 種）であることが望ましい。繊維状細胞の中の適切な宿生生物はアスペルギラス（Aspergillus種）、例えば、アスペルギラス ニジェール（Aspergillus niger）, アスペルギラス オリギー（Aspergillus oryzae）, アスペルギラス ツビンゲンシス（Aspergillus tubigensis）,アスペルギラス アワモリ（Asperguillus awamori）,またはアスペルギラス ニドラン（Aspergillus nidulans）,であることが望ましい。代替的に、例えば、フサリウム オキシポール（Fusarium oxysporum）のようなフサリウム（Fusarium種）または、リゾムコール、ミーヘイ（Rhizomucor miehei） のようなリゾムコール（Rhizomucor 種）の菌は宿生生物として使うことができる。他の適当な菌株としてはテモミーセス（Themomyces）、及びムコール（Mucor種）を含む。
【０１５１】
ポリペプチドを発現させるために、-変異PS4ポリペプチド、その断片、その相同物、その変異体、またはそれの誘導物のような、ポリヌクレオチドを含む宿主細胞が使われる。宿主細胞は、たんぱく質の発現を起こすのにふさわしい条件下で培養される、ポリペプチドの発現は、恒常的なものであり、ポリペプチドは継続的に生産され、発現開始のため誘導され、その刺激を必要とする。誘導発現の場合には、たんぱく質の生産は、例えば、デキサメタゾン、または、IPTGのような培養培地へ、例えば必要な場合に誘導物質を加えることにより開始される。ポリペプチドは、酵素、化学品および/または浸透圧溶解及び物理的破断を含む公知の様々の技法により、宿主細胞から抽出することができる。ポリペプチドは、また、TnTTM（Promega）ウサギの網状赤血球システムのような、生物外で、細胞を使わないシステムにより遺伝子組み換えによって作り出すこともできる。
【０１５２】
５．使用
以下の記載、及び例示において、文意より他の意に解されない限り、PS4変異ポリペプチドの投与量は、小麦粉の百万分の一(１グラム当たり百万分の一グラム)とする。例えば、表２中の「１Ｄ３４」はsSac-D34の百万分の一の部分をいう。
【０１５３】
ここに記載のPS4置換変異体は、親酵素が適しているあらゆる使用の目的に用いられる。特に、エクソマルトテトラヒドロラーゼのどのような応用例にも使用できる。極めて好ましい実施の態様においては、それらは、より高い熱安定性、より高いエクソアミラーゼ活性、より高い対pH安定性、またはこれらの何れかも組み合わせ対して、更なる有利な効果を持っている。PS4変異ポリペプチド及び核酸に適した使用例には、食品材料の製造のみならず、特にパンを焼くことを含み、食品の製造を含んでいる。具体例は、以下に詳細に記載する。
【０１５４】
以下のシステムは、ここに記載した方法、及び構成に対応した方法の使用に適したマルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を持つポリペプチドの特徴を示すために用いる。このシステムは、例えば、ここに記載したPS4親、または変異ポリペプチドの特徴を示すために用いる。
【０１５５】
導入のための背景情報として、ろう様（waxy）メイズアミロぺククチン（WAXILYS 200の商品名でRoquette, Franceから入手可能）は非常に高いアミロペクチン含有量（９０％以上）を持つでんぷんである。20mg/mlのろう様メイズでんぷんを50mM MES、2-(N-モルフォリノエタンサルフォニック酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid),2mM塩化カルシウム、pH6.0の緩衝液中で３分煮て、そしてその後50℃の温度で培養して30分以内に使用した。
【０１５６】
一単位のマルトース非生成性エクソアミラーゼとは、上記で述べたように、10mg/mlろう様メイズでんぷんを50mM MES,2mM塩化カルシウム、pH6.0で準備したもの4mlを５０℃で試験管で培養したばあい、1分間に１μモルの砂糖を還元するのに等しい加水分解製品を生み出す酵素の量として定義される。砂糖の還元はマルトースを標準にとり、Bermfeld,Methods Enzymol(1954), l, 149-158のジニトロサリチル酸を使うか、または、砂糖の還元を定量化する他の公知の方法も用いることができる。
【０１５７】
マルトース非生成性エクソアミラーゼの製品の加水分解パターンは、上述のように、緩衝液で準備した10mg/mlろう様メイズでんぷんを、４mlを試験管中で、マルトース非生成性エクソアミラーゼ0.7単位により、15−300分、50℃で培養することにより定める。反応は、試験管を沸騰槽に3分間沈めて停止させる。
【０１５８】
加水分解製品は、酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、及び水を溶離液として、Dionex PA 100カラム を用いるHPLC陰イオン交換により、パルスアンペアメータ探知により、グルコースからマルトヘプタオースの、公知の直線状マルトオリゴ糖を標準として解析及び定量化する。マルトオクタオースからマルトデカオースに用いられるレスポンスファクターはマルトヘプタオースのものと同じである。
【０１５９】
好ましくは、PS4親ポリペプチド（及びPS4変異ポリペプチド）はマルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を持っている。そのため、もしマルトース非生成性エクソアミラーゼ0.7単位量で50mM 2-(N-モルフォリノエタンスルホン酸(2-(N-morpholino)ethane sulfonic acid)、及び2mM塩化カルシウムを含む緩衝液mlあたり,予めボイルした10mgのろう様メイズでんぷんの水溶液4ml中で、50℃、pH6.0で15分間培養をしたとき、酵素は、2から10 D-グルコピラノシル単位、及び任意的にグルコースをもつ、一もしくは、それ以上の直線状マルトオリゴ糖よりなる加水分解製品を作り出すと思われる。そして、2から10 D-グルコピラノシル単位、及び任意的にグルコースからなる加水分解製品は、その少なくとも60重量％、少なくとも70重量%, 少なくとも80重量%,少なくとも85重量%は、3から10 D-グルコピラノシル単位の直線状マルトオリゴ糖からなり、好ましくは、4から8 D-グルコピラノシル単位からなる直線状マルトオリゴ糖からなる。
【０１６０】
説明を容易にするため、及び、本発明の目的を明らかにするために、50mM 2-(N-モルフォリノエタンスルホン酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)、及び２mM 塩化カルシウムを含む緩衝液mlあたり、予めボイルした10mgのろう様メイズでんぷんを含む水溶液の4ml中で、50℃、pH6.0条件下で15分間、0.7単位量のマルトース非生成性エクソアミラーゼで培養をすることを、「ろう様メイズでんぷん培養試験」という。
【０１６１】
したがって、別の発現をすると、好ましい、マルトース非生成性エクソアミラーゼは以下のような特徴を持っている。すなわち、ろう様メイズでんぷん培養試験において、2から１０ D-グルコピラノシル単位、及び任意的にグルコースからなる１又は２以上の直線状マルトオリゴ糖からなる加水分解製品を生みだす能力を持ち、その加水分解製品は重量で少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、最も好ましくは少なくとも85％は、3から10 D-グルコピラノシル単位、好ましくは、4から８ D-グルコピラノシル単位、からなる直線状の、マルトオリゴ糖からなるのが望ましい。
【０１６２】
ろう様メイズでんぷん培養試験における加水分解製品は、１又は２以上の2から10 D-グルコピラノシル単位、及び任意的にグルコースからなる直線状マルトオリゴ糖を含む。ろう様メイズでんぷん培養試験は、また他の加水分解製品も含む。しかし、3から10 D-グルコピラノシル単位からなる直線状マルトオリゴ糖の重量％は2から10 D-グルコピラノシル単位及び任意的にグルコースからなる１又は２以上のマルトオリゴ糖、からなる加水分解製品の量をベースとするものである。換言すると、3から１０ D-グルコピラノシル単位からなる直線状マルトオリゴ糖の重量％は2から10 D-グルコピラノシル単位、及びグルコースからなる １又は２以上の直線状マルトオリゴ糖以外の加水分解製品をベースとするものではないということである。加水分解製品は、どのような適切な方法によっても分析してもよい。例えば加水分解製品は、パルスアンメーター探知方式のDionex PA100コラムを用いる陰イオン交換HPLCを用いて、また、例えば、グルコースからマルトへプタオースの場合の公知の直線状マルトオリゴ糖を標準として分析することができる。
【０１６３】
好ましくは、ここに記載されたPS4変異体は、パンを焼いている間、そして約55℃で開始するでんぷん粒のゼラチン化の間、及びその後においてでんぷんを加水分解する。より熱安定性があればある程マルトース非生成性エクソアミラーゼは活性が長く、より高い老化抑制効果を示す。しかしながら、約85度以上で焼くと酵素は不活性となる。この状態が発生するとマルトース非生成性エクソアミラーゼは次第に活性を失い、焼く工程終了後にパン製品となったときには実質的に活性は見られなくなる。したがって、好ましくは、ここに記載した、マルトース非生成性エクソアミラーゼの適切な使用方法としては、50℃以上98℃以下の最適な温度で使用するのが望ましい。
【０１６４】
エクソ特異性は、全エンドアミラーゼの活性に対する全アミラーゼの活性を決めることにより有用に測定される。この書類においては、この比率は、エクソ特異性指数（exo-specificity index）として表されている。好ましい実施の態様においては、酵素は、そのエクソ特異性指数が2０以上,すなわち、全アミラーゼ活性（エクソアミラーゼ活性を含む）が、そのエンドアミラーゼ活性より２０倍以上ある場合、エクソアミラーゼと考えられる。極めて好ましい実施の態様においては、エクソアミラーゼのエクソ特異性指数は30以上、40以上、50以上、60以上、70以上、80以上、90以上、100以上ある。極めて好ましい実施の態様においては、エクソアミラーゼのエクソ特異性指数は150以上、200以上、300以上、400以上である。
【０１６５】
全アミラーゼの活性及びエンドアミラーゼ活性は、どのような公知の方法でも測定することができる。例えば全アミラーゼ活性はでんぷん基質から開放された還元末端の全数をアッセイして、測定する。代替的にBetamyl評価の使用が実施例において、さらに詳細に記載されている。便宜のために、実施例でアッセイされたアミラーゼの活性が（表）及び（図）にBetamyl単位で記載されている。
【０１６６】
エンドアミラーゼ活性は、Phadebas キット（Phaemacia and Upjohn）を用いてアッセイすることができる。これは、青標識の架橋（crosslinked）でんぷん（アゾ染料の標識表示）を利用する；でんぷん分子中の内部での切断が標識を開放し、外部の切断はその様に作用しない。染色の開放はスペクトロフォトメトリーにより測定する。したがってPhadebasキットは、エンドアミラーゼ活性を測定する。便宜のため、そのようなアッセイ（実施例に記載されている）の結果はこの書類中では、「Phadebas 単位」と呼ぶ。
【０１６７】
したがって、好ましい実施の態様においては、エクソ特異性指数はBetamyl単位/Phadebas単位で表されている。
【０１６８】
エクソ特異性はまた、先行技術、例えば、公表番号 WO99/50399に記載された方法によりアッセイすることもできる。この方法は、エクソ特異性をエクソアミラーゼ活性とエンドアミラーゼ活性の比率を対比することにより測定する。したがって、好ましい特徴的な場合として、ここに記載されたPS4変異体は、単位あたりのエクソアミラーゼ活性に対し、エンドアミラーゼ活性が０．５単位（EAU）以下である。好ましくは、本発明における使用法として適しているマルトース非生成性エクソアミラーゼ活性単位当り0.05EAU以下であり、より好ましくは、単位当たりエクソアミラーゼの活性に対して、0.01EAU以下である。
【０１６９】
PS4変異ポリペプチド、核酸、宿主細胞、発現ベクターなどはアミラーゼが用いられるどのような用途にも用いることができる。特に、どのマルトース非生成性エクソアミラーゼの代替として用いることができる。それらは単独で、または、公知のアミラーゼ、またはマルトース非生成性エクソアミラーゼと組み合わされて、アミラーゼ、またはマルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を補うものとして使用されうる。
【０１７０】
ここの記載したPS4変異体配列は、例えば、パン製品、飲料製品等、食品産業で様々に応用することとができる。また、薬品の組成物として、さらには化学工業のような分野においても応用できる。特にPS4変異ポリペプチド及び核酸は、ベーキング（WO99/50399で開示されているように）及び、小麦粉の標準化（増量または改良）を含む様々な産業において有用に使用される。でんぷんおよび他の基質からマルトテトラオースを作るのに用いられる。
【０１７１】
PS4変異ポリペプチドは、パンのような製パン製品の容積を増すために用いられる。したがって、PS4変異ポリペプチドを含む、またはそれにより処理された食品製品は、PS4変異ポリペプチドで処理されていない、または、親ポリペプチドで処理された製品と比べ、容積が膨らんでいる。換言すると、そのような食品製品は、製品単位容積当り、より多くの空気を含むのである。代替的に、または追加的にPS4変異ポリペプチドにより処理された食品製品は、容積あたりに対する密度または重量（質量）が小さい。特に好ましい実施の態様においては、PS4変異ポリペプチドは、パンの容積を増やすために用いられる。容積を増やす、または膨張させることにより食品の粘り感や、糊状の感じを減少させるからである。軽い食品が消費者に好まれ、消費者の嗜好の幅は拡大する。好ましい実施の態様においては、PS4変異ポリペプチドは、容積を10％、20％、30％、40％、50％、またはそれ以上増加させる。
【０１７２】
ここに記載したPS4変異ポリペプチド及び核酸は食品として、またはその準備工程に用いられる。特に食品に添加、すなわち、食品添加物として用いられる。好ましいケースとしては、人の消費用の食品として用いられる場合である。食品は、その使用、応用、または管理の形態により、液状または固体の形をとる。
【０１７３】
PS4変異ポリペプチド及び核酸は、食品成分としてもちいられる。ここに記載された、PS4変異ポリペプチド及び核酸は補助食品として、または補助食品に添加されるものである。ここに記載されたPS4変異ポリペプチド及び核酸は、機能食品として、または機能食品に添加することができる。
【０１７４】
PS4変異ポリペプチドはまた、食品、または食料品の製造にも用いられる。典型的な食料品としては、酪農製品、肉製品、家禽製品、魚加工品、及びパン生地製品を含む。パン生地製品は、油で焼いた、油で揚げた、ローストした、焼いた（baked）、蒸気蒸しパン及びライスケーキのような蒸気で蒸した、及び茹でた生地を含むあらゆる製品を含む。極めて好ましい実施の態様においては、食料品は、パン製品である。
【０１７５】
好ましくは、食料品はパン製品である。典型的なパン（焼いたーbaked）製品には、食パン、ロール（roll）,ロールパン（bun）、ピザの生地など、ペーストリー、プレッゼル、トルティーヤ、ケーキ、クッキー、ビスケット，クラッカー等がある。
【０１７６】
PS4変異体タンパク質は、でんぷんゲルのような、でんぷん培地の老化を遅らせることができる。PS4変異ポリペプチドは、特にでんぷんの欠点である老化を遅らせることができる。
【０１７７】
したがって、食品製造のどのプロセスにおいても、例えば、パンを焼く最中、または焼いた後に、ここに記載のPS4変異ポリペプチドをでんぷんに添加した場合、でんぷんの老化を遅らせ、またはその老化速度を遅らせることができる。以下、さらにこの使用について詳細に記載する。
【０１７８】
ここに記載したマルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を持つPS4変異ポリペプチドの老化抑制効果の評価のために、パンの身の硬さを、焼き上げ後、１、3，および７日後にInstron 4301 Universal Food Texture分析器、または公知の同様の機器により測定することができる。
【０１７９】
マルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を持つPS4変異ポリペプチドのでんぷん老化を遅らせる効果を評価する、従来から用いられている他の公知の方法は、DSC(示差操作熱量測定法)に基づくものがある。この場合、パンの身、または、酵素を用いた、または、酵素（コントロール）なしで焼いたモデルシステム生地のパンの身のアミロペクチン退化の融解エントロピーを測定する。実施例で用いた、DSC機器は、Mettler-Toledo DSC820で、20−90℃の間で、温度勾配を10℃/分に設定した。サンプル準備として、パンの身10−20mgが計量され、Mettler-Toledoアルミパンに移され、そしてシールで密封される。
【０１８０】
ここに記載の実施例で使用されるモデルシステムパン生地は、標準小麦粉と適量の水、または、マルトース非生成性PS4変異体エクソアミラーゼを含む、または含まない緩衝液を含む。これらは10g、または50g Brabender Farinographで6、または7分間、それぞれ混合される。パン生地のサンプルを蓋のあるガラス試験管（15x0.8cm）にとり、試験管は水槽に入れて、ベーキング工程に付される。まず33℃で30分培養され、続いて分あたり1.1℃の温度勾配条件で、33℃から95℃に加熱される。そして、最終的に95℃で5分間培養する。次に、DSC分析の前に、試験管はサーモスタットに20℃で保管される。
【０１８１】
好ましい実施の態様においては、ここに記載したPS4変異体は「コントロール」に比べて、融解エントルピーが減少している。極めて好ましい実施の態様においては、PS4変異体は10％以上に融解エンタルピーが減少している。好ましくは、それは、コントロールに比べ、20％以上、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、またはそれ以上に融解エンタルピーが減少している。
【表２】
【０１８２】
上記の表2は、７日間保管した後、小麦粉に対して、PSac-D34を各百万分（グラム当たり百万分の一グラム）の0.5、１及び２を投与したパン生地モデルシステムのDSC値を示している。
【０１８３】
PS4変異ポリペプチドは、食品、特にでんぷん製品の製造のために用いることができる。その方法は、PS4変異ポリペプチドのようなマルトース非生成性エクソアミラーゼ酵素をでんぷん培地に加えることによりでんぷん製品を作り出すことを含む。でんぷん培地が、パン生地の場合、パン生地は、小麦粉、水、PS4変異ポリペプチドであるマルトース非生成性エクソアミラーゼ，及び任意的に選択される他の成分、及び添加物を混合して作る。
【０１８４】
好ましくは、粉は、小麦粉、ライ麦粉、またはそれらの混合物である。しかし、他の種類の穀物、例えば、米、メイズ、大麦、及びアズキモロコシから得られる粉を含むパン生地も考えられる。好ましくは、でんぷん製品は、焼いた（baked）製品である。好ましくは、でんぷん製品は、パン生地製品である。さらに好ましくは、でんぷん製品は、焼いたでんぷん質のパン製品である。
【０１８５】
したがって、もし、でんぷん製品が焼いたでんぷん質のでんぷん製品であれば、その工程は、−適切であれば、その順序は問わないー小麦粉、水、及び発酵物資をパン生地を形成する条件で混合し、さらにPS4変異ポリペプチドを加えるが、任意選択的に、混合済みの混合物の形で追加することを含む。発酵物質は、重曹のような化学物質，または、サッカロミーセス・セレヴィシエ（出芽酵母）（Baker’s Yeast）種であればいずれでも良い。
【０１８６】
PS4変異体マルトース非生成性エクソアミラーゼは、水を含むどのようなパン生地成分、パン生地成分の混合、またはどのような添加物、または、添加物の混合物とともに加えることができる。パン生地は、製パン業で、または、小麦粉のパン生地をベースとする製品を作るどのような他産業で、通常用いられている、従来のパン生地製造法によりつくることができる。
【０１８７】
好ましい実施の態様においては、パン製品を作る工程は以下をふくむ；（a）でんぷん培地を準備する、（b）でんぷん培地にこの書類に記載したPS4変異ポリペプチドを加える、(c)パン製品を製造するために（ｂ）プロセスの間、またはその後にでんぷん培地を加熱する。パン製品を作るプロセスの他の好ましい実施の態様としては、でんぷん培地にここに記載のようなPS4変異ポリペプチドを加えることを含む。
【０１８８】
マルトース非生成性エクソアミラーゼPS4変異ポリペプチドは液体状、または、唯一の活性を持つ構成物としての酵素を含むか、または、１又は２以上のパン生地成分、またはパン生地添加物との混合物を含む乾燥粉末状の組成物の形で加えることができる。
【０１８９】
他の好ましい実施の態様においては、焼いている間に、パン及びパン生地を改良させるような組成物を用いる方法である。更なる実施の形態においては、パン、またはパン生地を改良する組成物から得られる、焼いた製品、またはパン生地を提供することである。他の実施の態様においては、パン、またはパン生地を改良する組成物を使用することにより得られる、焼いた製品、またはパン生地を提供することである。
【０１９０】
パン生地は、小麦粉、水、PS4変異ポリペプチド（上に記載）を含むパン生地改良組成物及び任意選択的な他の成分、及び添加物を混合して作る。
【０１９１】
パン生地改良組成物には、小麦粉、水または他の任意選択的成分、あるいは添加物を含むどのようなパン生地成分とともに加えることができる。パン生地改良組成物は、小麦粉、水または他の任意選択的成分あるいは添加物の前に加えることができる。パン生地改良組成物は、小麦粉、水または他の任意選択的成分あるいは添加物の後に加えることができる。パン生地は、製パン業、または小麦粉パン生地をベースとする製品製造業で、従来普通に用いられるパン生地の製法より作ることができる。
【０１９２】
パン生地改良組成物は、液状、または唯一の活性構成物として、または一又は二以上のパン生地成分あるいは、添加物と混合したものを含んだ乾燥粉末状の形で加えることができる。
【０１９３】
添加されるPS4変異ポリペプチドマルトース非生成性エクソアミラーゼの量は、最終パン生地製品において、通常、小麦粉１kg当たり50から100,000単位、好ましくは、100−50,000単位存在する量である。好ましくは、小麦粉１kg当たり200−20,000の範囲である。
【０１９４】
本稿の説明においては、マルトース非生成性エクソアミラーゼ１単位は、以下に記すように、ボイルした10mg/mlのろう様メイズでんぷんを、50ｍM MES,２mM 塩化カルシウム,pH6.0の溶液4mlを入れた試験管中で、50℃で、培養したときに、分当たり１μモルの砂糖を還元するに相当する加水分解製品を放出する酵素の量として定義される。
【０１９５】
ここに記載した、パン生地は、通常，小麦全粒粉、または小麦粉、および/またはコーン粉末、コーンでんぷん、メイズ粉、米粉、ライ麦全粒分、ライ粉、オート分、オート全粒粉、大豆粉、モロコシ全粒粉、モロコシ粉、ポテト全粒粉、ポテト粉または、ポテトでんぷんのような、他の種類の全粒分、粉末、またはでんぷん、を含む。パン生地は生、冷凍、または半焼き状態を含む。
【０１９６】
パン生地は、膨張したパン生地であっても、その後に膨張するパン生地であってもよい。パン生地は、種々の方法で膨張することができる（例えば、重曹のような化学的膨張剤の添加によるか、または、イースト（膨張しているパン生地）の添加による）。しかし、好ましくは、例えば、商業的に入手可能なサッカロマイセス・セレヴィシエ（出芽酵母）（パン製造イースト）種のようなサッカロマイセス・セレヴィシエを培養した適当なイースト菌を加えることにより発酵させるのが望ましい。
【０１９７】
パン生地は、粒状の脂肪またはショートニングを含むこともある。パン生地は、さらにモノ-またはジ-グリセリド、脂肪酸の糖エステル、脂肪酸のポリグリセロールエステル、モノグリセリドの乳酸エステル、モノグリセリドの酢酸エステル、ステアリン酸ポリオキシエチレン、またはリソレシチンのような乳化剤を含むこともある。
【０１９８】
他の実施の態様においては、ここに記載されたような組合せと、小麦粉を含む事前に混合されたものがある。事前混合材料は、例えば、ここに記載した酵素を含む、いずれかの添加物のような他のパン生地、および/またはパン製品の改良のための添加物を含む。
【０１９９】
焼いた製品の特性をさらに向上させ、製品に他と異なる品質を付与するために、パン生地に、さらにパン生地成分、および/または添加物を含ませることできる。典型的な例として、そのような追加構成物には、塩、穀物、脂肪および油，砂糖、およびスイートナー、ダイエット繊維、粉ミルク、大豆グルテン、あるいは卵のようなタンパク質源、乳化剤、他の酵素、浸水コロイド、調味料、酸化剤、ミネラルおよびビタミンのようなパン生地添加物を含む。
【０２００】
乳化剤は、パン生地強化剤、およびパン生地の身を軟らかくする軟化材として有用である。乳化剤は、パン生地強化剤として、寝かせる間の緩衝材として、またふんわりとさせる間のショックを和らげる材料として使うことができる。さらに、パン生地強化剤は、発酵の間に、パン生地に様々なバリエイションを与えるという幅を持たせる。パン生地強化剤のほとんどは、またオーブンで弾力を増す、すなわちこれは、発酵した状態から焼いた商品になる間に容量が増すことを意味する。最後に、パン生地強化剤は、混合レシピ中のあらゆる脂肪を乳化する。
【０２０１】
乳化剤としてふさわしいものとして、以下のものが含まれる。すなわち、レシチン、スレアリン酸ポリオキシエチレン、食用脂肪酸のモノ、およびジグリセリドの酢酸エステル、食用脂肪酸のモノ、およびジグリセリドの乳酸エステル、食用脂肪酸のモノ、およびジグリセリドのクエン酸エステル、食用脂肪酸のモノ、およびジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、食用脂肪酸のモノ、およびジグリセリドのショ糖エステル、ナトリウム ステアロイル２−ラクチレート（sodium stearoyl-2-lactylate）及びカルシウムステアロイル２−ラクチレート（calcium stearoyl-2-lactylate）である。
【０２０２】
さらに、パン生地添加物、または成分として、どのようなパン生地成分であっても共に加えることができるものとして、小麦粉、水、他の任意の選択成分、または添加物、あるいはパン生地、改良組成物を含む。さらに、パン生地添加物または成分を小麦、水、他の任意の選択成分、または添加物、あるいはパン生地改良組成物を加える前に、これらを添加することができる。さらに、これらのパン生地添加物または成分は小麦、水、他の任意の選択成分、または添加物、あるいはパン生地改良組成物を加えた後に、添加することができる。
【０２０３】
この様に追加するパン生地の添加物、または成分は、液状のものが使用に便利である。しかし、これらは乾燥した形で使用することが便利なこともある。
【０２０４】
このようなパン生地の追加添加物、または、成分は、好ましくはパン生地内の小麦粉の構成重量の少なくとも１％である。さらに好ましくは、その量は少なくとも２％、好ましくは少なくとも３％、好ましくは少なくとも４％、好ましくは少なくとも５％、好ましくは少なくとも６％である。もし添加物が脂肪酸の場合は、特徴的な場合、脂肪酸は、１％から５％、典型的には、１〜３％、さらに典型的には約２％存在する。
【０２０５】
他の使用方法については、また整理番号674510-2007,およびGC806Pに記載されている。これらは全て、図面、図表を含み引用として、本明細書に含まれる。
【実施例】
【０２０６】
実施例 １ PS4のクローニング
シュードモナス サッカロフィリアはLB培地上で一夜生成され、染色体DNAは標準的方法（Sambrook J, 1989）により分離される。PS4オープンリーディングフレーム（読み取り枠）（Zhou etal., 1989）を含む2190 bp断片は、プライマーP1およびP2（表3参照）を用いるPCRにより、シュードモナス サッカロフィリア染色体DNAから増幅される。得られる断片は、プライマーP3およびP4と共に、入れ子PCRにおいて鋳型（template）としてもちいられ、そのシグナル配列なしでPS4オープンリーディングフレームを増幅し、遺伝子の５’末端にNcoIサイト、および３’末端のBamHIサイトに導入する。NcoIサイトとともに、N末端メチオニンにコドンが導入され、PS4の細胞内発現を可能にする。1605bp断片はｐCRBLUNT TOPO（インビトロゲン社）に複製され、構成物の完全性が、配列分析により確かめられる。大腸菌（E.coli Bacillus）シャトルベクターｐDP66K（Penninga et al.,1996）は、P32プロモータおよびctgaseシグナル配列のコントロール下で、PS4が発現するように修飾される。結果として得られるプラスミドｐＣＳｍｔａを、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに形質転換する。
【０２０７】
第二の発現の構成は、PS4のでんぷん結合ドメインが除かれている場合である。pCSmtaのプライマP3およびP6によるPCRでは、他mtaの切断遺伝子型が生み出される。pCSmtaの完全長を持つmta遺伝子は、pCSmta-SBDプラスミドとなる切断型に取って代わられる。
【０２０８】
実施例2 PS4の部位特異的突然変異誘発法
突然変異は、2つの方法によりmta遺伝子に導入される。2段階のPCRをベースとする方式、またはQuick Exchange 法(QE)である。便宜のために、mta遺伝子は３つの部分に分割される。すなわち、PvuI-FspI, FspI-PstI, PstI-AspI断片であり、以下、それぞれ断片1，2および3という。
【０２０９】
２段階のPCRに基づく方法においては、変異はPfu DNAポリメラーゼ（ストラテジーン社）を用い導入される。最初のPCRは、コードする鎖についての変異プライマ（表４）、および、下位鎖の下流プライマ（表３の２Rまたは３R）で実行される。反応生成物は、第2のPCRステップでコード鎖における上流プライマとともにプライマとして使用される。最終反応の生成物は、pCRBLUNT topo（インビトロゲン社）にクローンされ、シークエンシングの後に、断片はpCSmtaの対応する断片と交換される。
【０２１０】
Quick Exchange法（ストラテジーン社）においては、変異はmta遺伝子、またはmta遺伝子の部分を含むプラスミドに、PCRにおける2つの相補的プライマを用い導入される。
【０２１１】
この目的のために、３SDMプラスミドおよび ３pCSΔプラスミドを含むプラスミドの便宜なセットが生成される。SDMプラスミドは、各上記のmtaの遺伝子の断片1を各々持ち、所望する変異がQEにより導入される。配列により確認後、この断片は、対応する受容pCSΔプラスミドに複製される。pCSΔプラスミドは、pCSmtaの不活性派性物である。活性はSDMプラスミドから対応断片をクローニングすることにより復活され、スクリーニングが容易となる。
【表３】
【表４】
【表５】
【０２１２】
実施例３、マルチSDM
PS4変異体は、Quick Chang（登録商標）マルチ部位特異的突然変異誘発セット（ストラテジーン社）の製作者のプロトコールに、述べたような幾つかの改変を加えたものを用い生成した。
【０２１３】
ステップ１ 突然変異鎖合成反応（PCR）
− 3ml. LB(22g/l Lennox L Broth Base, Sigma) + 抗生物質0.05μg/ml,カナマイシン、Sigma）を10ml Falcon管に入れる
− 37℃、約200rpmで培養する
− 遠心力（5000rpm/5分）で細胞を沈降させる
− 培地を排出する
− QIAGEN Plasmid Mini Purification Protocol を用いてds-DNA鋳型を準備する
【０２１４】
１．突然変異鎖合成反応のための熱サイクルの準備を以下のように行った：
PCRミックス
2.5μl 10XQuick Change（登録商標）マルチ反応緩衝液
0. 75μl QuickSolution
X μl プライマ（プライマ長さ 28-35bp→10pmol）
（プライマ長さ 24-27bp→7pmol）
（プライマ長さ 20-23bp→5pmol）
1μl ｄNTP ミックス
X μl ds-DNA鋳型（200ng）
1μl Quick Change（登録商標） Multi酵素ブレンド(2.5U/μl)（PfuTurbo DNAポリメラーゼ）
Xμl dH2O (最終容量25μl)
全ての組成物をピペットで混合し、反応物をすばやく沈降させる
【０２１５】
２．以下の条件で反応を繰り返す
変性35サイクル（96℃/分）
プライマアニーリング（62.8℃/分）
エロンゲーション（65℃/15分）
その後4℃で保持
PCR管を装置に入れる前に、PCR装置の覆いを105℃に、板を95℃に余熱する（eppendorf 熱サイクル）
【０２１６】
ステップ２ Dpn I 分解
１． 各増幅反応に対し2μlのDpn I制限酵素（10U/μl）を加え、ピペットで混合し、混合物を沈降させる
２． 37℃で最長3時間培養する
【０２１７】
ステップ３．XL10-Gold（登録商標）Ultracompetent Cellの形質転換
１． XL10-Gold 細胞を氷上で溶かす。突然変異反応当り各45μl細胞を予冷したFalcon試験管に分ける
２． 水浴槽の栓（42℃）を開栓し、試験管を予熱するために槽にNZY＋培養液とともに浸す
３． ２μlのβ-メルカプトエタノール混合液を各試験管に加える。掻き混ぜて、静かに栓を抜き、氷上で10分培養する、2分ごとに掻き混ぜる。
【０２１８】
４． Dpn I 処理したDNA 1.5μlをそれぞれに分けた細胞に加え、掻き混ぜて混合し、そして氷上で30分培養する。
【０２１９】
５． 42℃の温浴槽で30秒熱パルス加熱し、その後氷上で２分保持する。
【０２２０】
６． 0.5mlの予熱したNZY＋培養液を各試験管に加え、225−250rpmで回転振動させながら、37℃で1時間培養する。
【０２２１】
７． 1％のでんぷんおよび0.05μlのカナマイシンを含むLB板（33.6g/l Lennox L Agar , Sigma）上に各転換反応の200μlを板に塗る（plate）。
【０２２２】
８． 形質転換のプレートを37℃で一夜培養する。
【表６】
【表７】
【表８】
【０２２３】
ｐPD77に基づくベクターシステム
ｐPD77に用いるベクターシステムはpCRbluntTOPOLII (インビトロゲン社) に基づくものである。ゼオシン レジスタンス カセット(zeocin resistance cassette)はpmlIにより除去されており、393bp断片は除かれている。次にpCCベクター（P32−ssCGTase-PS4-tt）の発現カセットはベクターに挿入されている。
【０２２４】
PS4変異体のpCCMiniへの連結
関係する突然変異（MSDMにより作られる）を含むプラスミドは制限酵素NcoIおよびHind III(Biolabs)により切断される：
3μgプラスミドDNA、Xμl 10ｘ緩衝剤２、NcoI 10単位、HindIII 20単位、37℃で2時間培養する
1％のアガロースゲルで分解を進める。1293bp（PS4 遺伝子）サイズの断片をゲルから切断し、Qiagen ゲル精製キットを用いて精製する。
【０２２５】
その後PCCMini ベクターは、制限酵素NcoIおよび Hind IIIにより切断され、そして分解が1％アガロースゲル上で行われる。3569bpサイズの断片をゲルから切断し、Qiagenゲル精製キットを用いて精製する。
【０２２６】
連結：Rapid DNA連結キット（Roche）を用いる
ベクターの数の2倍の挿入量を用いる
例．２μl 挿入（PS4遺伝子）
１μl ベクター
５μl T4 DNA連結緩衝液 ２ｘ濃度
１μl ｄH2O
１μl T4 DNA リガーゼ
５分/RTで連結する
製造者のプロトコール（インビトロゲン社）に従い、連結物を用いてOne Shot TOPOコンピテント細胞を形質転換する。形質転換において、5μl連結物を用いる。
【０２２７】
50μl変換ミックスを、1％のでんぷん、および0.05μl/mlのカナマイシンを含むLB板（33.6g/l Lennox L Agar Sigma）上で板に塗る（plate）。挿入体(PS4変異体)を含むベクターはでんぷん板上のハロ形成により認識される。
【０２２８】
実施例４ 枯草菌（Bacillus subtilis）への形質転換（プロトプラスト形質転換）
枯草菌（系統 DB104A；Smith et al., 1988; Gene 70, 351-361）は次の手順により変異pCSプラスミドにより形質転換される。
【０２２９】
A. プロトプラスト および形質転換の培地
２ｘSMM リッター当たり：342ｇショ糖（１M）;4.72ｇ マレアート
ナトリウム（Sodium Maleate）(0.04M), 8:12g MgCl2, 6H2O(0.04M);濃縮NaOH でpH6.5、50mlに分配し、10分間加圧滅菌する
４ｘYT(1/2 NaCl) 2g イースト菌エキス+3.2g Tryptone+0.5g NaCl(100ml当り)
SMMP ２ｘSMPP、および等容量の４ｘYTを混合
PEG 10gポリエチレングリコール6000（BDH）、または8000（Sigma）を SMM 25ml中にとり（10分間加圧滅菌する）
【０２３０】
B. 平板培養/再生のための培地
寒天 4％Difco 最小培地寒天、15分間加圧滅菌する。
【０２３１】
コハク酸ナトリウム 270g/l(1M), pH7.3の塩酸、15分間加圧滅菌する。
【０２３２】
リン酸緩衝液 3.5gK2HPO4＋1.5gKH2 PO4/100ml、15分間加圧滅菌する。
【０２３３】
MgCl２ 20.3g MgCl２、6H2O/100ml(1M);
カザミノ酸 5％（w/v）液、15分間加圧滅菌する。
【０２３４】
イーストエキス 10g/100ml, 15分間加圧滅菌する。
【０２３５】
グルコース 20％（w/v）液、10分間加圧滅菌する。
【０２３６】
DM3再生培地： ：60℃で混合（浴槽；500mlビン）
250ml コハク酸ナトリウム
50ml カザミノ酸
25ml イーストエキス
50ml リン酸緩衝液
15ml グルコース
10ml MgCl２
100ml 溶融寒天
適量の抗生物質を加える：クロラムフェニコール、およびテトラサイクリン、5ug/ml; エリトロマイシン, 1ug/ml. DM3培地にカナマイシンを使うことは問題がある：250ug/mlの濃度が必要となる。
【０２３７】
C. プロトプラストの準備
１． 全工程を通じて、界面活性剤を含まないプラスチック、またはガラス機器を使用する。
【０２３８】
２． 同一コロニーから得られる10mlの２ｘYT培地を100-mlフラスコで培養する。25-30℃で、シェイカー中で一夜培養する（200回転/分）。
【０２３９】
３． 一夜培養20倍に薄め、新鮮な２ｘＹＴ100ml（250-mlフラスコ）にいれ、シェイカー（200-250回転/分）中で、37℃において、OD600＝0.4-0.5（約2時間）成長させる。
【０２４０】
４． 遠心分離で細胞をとる（9000g、20分、4℃）
５． ピペットで浮遊物を除き、細胞を5mlのSMMP＋５ｍｇリソザイム中で、再懸濁する
、消毒済みフィルターを使用する。
【０２４１】
６． 温浴シェイカー（100回転/分）中、温度37℃で培養する。
【０２４２】
30分後、その後15分の間隔で、25ulサンプルを顕微鏡検査する。99％の細胞がプロトプラスト化（球状）するまで培養を続ける。プロトプラストを遠心分離（4000g、20分、RT）に掛けて回収し、浮遊物をピペットで除く。ペレットを静かに1-2mlのSMMP中で再懸濁する
プロトプラストは、用いられる状態になっている。（一部は（例えば、0.15ml）は後の使用のために−80℃で冷凍保存することができる（グリセロール添加は不要）。形質転換効率は減少することとなるが、冷凍プロトプラストから、ug当りDNAから106の形質転換細胞が得られる。
【０２４３】
D. 形質転換
１． 450ulのPEGを小試験管にとる。
【０２４４】
２． 1-10ulの DNA（0.2ug）を150ulのプロトプラストと混合し、混合したものにPEGの入った試験管に加える。直ちに、ただし、静かに混合する。
【０２４５】
３． RTに2分置き、その後1.5モルのSMMPを加え、混合する。
【０２４６】
４． プロトプラストを小遠心分離（10分、13.000回転/分（10-12.000ｇ））により回収し、浮遊物を排出する。残りの小滴をガーゼなどで除く。
【０２４７】
SMMP 300ulを加え（かき回さない）、抗生物質耐性マーカーを発現をさせるため水浴槽シェイカー（100回転/分）中で、37℃で60-90分培養する。（プロトプラストは水浴槽の振動により十分に再懸濁される。１ｘSSM中で、適当に希薄させ、ＤＭ3板に0.1mlを平板培養する。
【０２４８】
実施例５ シェイクフラスコでのPS4変異体の発酵
シェイクフラスコの基質は以下の通りに準備する：
成分 ％（w/v）
水 −
イーストエキス ２
大豆粉 ２
NaCl 0.5
リン酸２カリウム 0.5
消泡剤 0.05
基質は、加圧減菌される前に、４Ｎの硫酸、または水酸化ナトリウムによりpH6.8になるよう調整される。100mlの基質が、整流装置を一つ持つ500mlフラスコに入れられ、30分間加圧減菌される。その後、6mlの殺菌済みデキストロースシロップが加えられる。デキストロースシロップは、50％w/vデキストロース１容量に対し、水１容量をミックスして作り、それを20分間加圧減菌したものを用いる。
【０２４９】
シェイクフラスコに変異体を植え付け、培養基で35℃/180rpmで24時間培養する。培養後、細胞は遠心分離により（１０分間で10.000ｘｇ）培養液から分離され、最終的に、浮遊物は0.2μlの極細ろ過により細胞を含まないものとなる。細胞を含まない浮遊物は、アッセイおよび応用試験に用いられる。
【０２５０】
実施例６ アミラーゼアッセイ（assay）
Betamyl 分析(assay)
Betamyl 一単位は、1分当たり、PNP結合した、マルトペンタオース0.0351ｍモルを分解する活性と定義される。したがって、1分当たり0.0351ｍモルPNPは過剰のαグルコシダーゼにより、アッセイミックスに放出される。アッセイミックスは50ul 50mlクエン酸ナトリウム、５ｍMの２塩化カルシウム（CaCl2）,pH6.5、25ul酵素サンプルおよび25ul Betamyl 基質（Glc5-PNP およびαグルコシダーゼ）アイルランドのMegazyme製（10mlの水に1瓶を溶解）を含む。ミックスは、４０℃で30分培養し、150ul,4%Tris. を加えた後停止する。420nmでELISA-readerを用い吸収度を測定し、Betamyl活性を、アッセイした酵素サンプルのBetamyl 単位/mlで活性＝420ｘｄに基づき計算する。
【０２５１】
エンドアミラーゼアッセイ
エンドアミラーゼ分析は、製造者（Pharmacia & Upjohn Diagnostics AB）によるPhadebas アッセイと同一である。
【０２５２】
エクソ特異性
エクソ特異性を評価するためにPhadebas活性に対するエクソアミラーゼ活性の比率を用いた。
【０２５３】
比活性度
PSac-D14, PSac-D20,および PSac-D34変異体について精製したタンパク質のマイクログラム当たり10Betamyl単位の平均比活性度を、Bradford(1976,Anal. Biochem. 72, 248)に従い測定した。この比活性度は、応用試験例において用いた投与量を算出するために用いられる。
【０２５４】
実施例７ 半減期の決定
t1/2は酵素の半分の活性が、規定する熱条件の下で、不活性となる時間(分)と定義される。酵素の半減期を決定するために、サンプルを60℃から90℃の間の一定の温度で1−10分間の間加熱する。半減期は、Betamylアッセイの残留に基づき計算する。
【０２５５】
手順：Eppendorfチューブで、緩衝液1,000μlが60℃以上で、少なくとも10間余熱する。サンプルの熱処理は余熱された緩衝液に、100μlサンプルを加え、Eppendorfチューブを熱培養器中（Eppemdorf製Termomixer comfort）で連続攪拌（800rpm）する条件下で開始される。0, 2,4,6,8および9分の培養の後熱処理を中止し、サンプル45μlを20℃に保った1,000μl緩衝液に移し、1500rpm、20℃で1分間培養する。残留活性をBetamylアッセイにより測定する。
【０２５６】
計算方法：ｔ1/2の計算は、培養時間に対する残留Betamyl活性の対数（底10のlog）の傾きに基づき算出する。t1/2は、傾き/0.301=t1/2として算出する。
【０２５７】
実施例８ 結果
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【０２５８】
実施例９ モデルシステムベーキング試験
パン生地は、30.0℃でFarinographで作られる。10.00gの改良小麦粉が計量され、Farinographに加えられる。1分間攪拌した後、参照/サンプル（参照＝緩衝液、または水、サンプル＝酵素＋緩衝液、または水）が消毒したピペットにより練り桶の孔を通して添加される。30秒後、小麦粉は、同様にまた、練り桶の孔を通して、淵から擦り落とされる。サンプルは7分間練られる。
【０２５９】
最終参照試験に先立ち、緩衝液、または水によるテストがFarinographで行われる。FUは参照で400なければならない。もし，そうでなければ、例えば、液の量により調整する必要がある。参照/サンプルは、ヘラにより取り出され、手（使い捨て手袋を使用）に収め、そして、小さなガラス管（約4.5cm長さ）に満たし、NMR管に挿入され、コルク栓をする。一つのパン生地当たり7本の管を用意する。
【０２６０】
サンプルが全て準備されたら、管は33℃の水槽（プログラム可能）（コルク栓なし）に25分浸ける。その後、水槽は33℃で5分保ち、そして、56分かけて98℃まで加熱し(1.1℃/分)、最終的に96℃で5分間置く。
【０２６１】
管は、保熱棚に20.0℃で保存する。パンの身の固くなった容量は、図表２（Fig.2）に示す0.05，１および２ppmのPSacD34を使用したパンの身のサンプルのようにBruker NMS120 Minispec NMR分析器を使い、NMRプロトンにより1，3、および７日目に測定する。時間の経過とともに、固い部分の増加度合いが低下していることは、アミロペクチンの後退が減少していることを示す。20.0℃で７日間保熱棚に保存した後、パンの身のサンプル10-20mgを計量し、40μlのアルミ標準DSCカプセルに取り、20℃に保つ。
【０２６２】
カプセルは、Mettler Toledo DSC820機器による示差走査熱量測定にかけられる。パラメータとして、10℃/分の20−95℃加熱サイクル、ガス流量毎分80mlのN2を使用する。結果を分析し、後退アミロペクチン溶解エンタルピーをJ/gにより算出する。
【０２６３】
実施例 10 アンチステイル(対老化)効果
モデルとなるパンの身を、実施例８に従い、準備し計量する。表2に示すように、PS4変異体は、コントロールに比べ、示差走査熱量測定法で測定したパンを焼いた後のアミロペクチンの後退抑制効果が強いことが分る。PS4変異体は明白な投与効果を示している。
【０２６４】
実施例11．パン焼きテストの対硬化度効果
パン焼きテストを標準白パンのスポンジおよび米国トーストのパン生地調理法に従い行った。生パンスポンジは、Sisco Mills USAの「All Purpose Classic」小麦粉1600g、水950g、大豆あぶら40g、および乾燥イースト32gを用いた。スポンジはHobart スパイラルミキサーにより、低速で1分間、続いて、速度2で3分間混合した。スポンジはその後、まず３５℃、85％RHで2.5時間で、続いて5℃で0.5時間発酵させた。
【０２６５】
その後、小麦粉400g、乾燥イースト4g、塩40g、プロピオン酸カルシウム2.4g、高果糖コーンシロップ（Isosweet）240g, 乳化剤PANODAN 205 5g、酵素活性大豆粉5g、非活性大豆30ｇ、水220gおよびアスコルビン酸30g（溶液4gを水500gに溶解したもの）をスポンジに加えた。できたパン生地をDiosnaミキサーで、まず、低速で1分間、続いて速度2で6分間混合する。その後、パン生地は大気温度で5分間置き、そして、一個が550gのパン生地が計量され5分間寝かせた後、Glimekシーターにおいて両側を設定1:4, 2:4. 3:15,4:12および10の設定でシートされ（sheeted）、パン焼き台に移される。43℃、90％RHで60分間ふんわりとさせた後、パン生地は218℃で29分間焼かれる。
【０２６６】
硬さ、および弾力性はTA-XT2質感（texture）分析器により測定した。軟らかさ、もちもち感（cohesiveness）,および弾力性は、Stable Micro System,UKの質感分析器（Texture Analyser）を使い、質感断面分析（Texture Profile Analysis）により、薄切りパンを対象に分析し、測定値を出した。測定の設定条件は以下の通り：
予備試験スピード 2mm/s
本試験スピード 2mm/s
後試験スピード 10mm/s
破断試験距離 １％
距離 40％
負荷 0.098N
時間 ５秒
カウント 5
荷重計 5kg
引金タイプ（trigger type） 自動−0.01N
結果は、図表3 および４に示す。
【０２６７】
実施例12 デニッシュロールの容量コントロール
デニッシュロールは、デニッシュ改良小麦粉（Cerealia製）2000ｇを圧搾酵母120g、塩32g、ショ糖32gを用いたパン生地をベースにする。水は事前に適量用意して、パン生地に加える。
【０２６８】
パン生地は、Diosnaミキサーで混合する（低速で2分間、高速で5分間）。混合後のパン生地の温度は、26℃に保った。1350gのパン生地が計量され、保熱棚に３０℃で10分間寝かせる。ロールはFortunaモールド装置で型に作られ、34℃および85％相対湿度で、45分間ふっくらと膨らまされる。次に、ロールはBago2オーブンで、最初13秒間蒸気にさらされ、そして250度で18分間焼かれる。焼いた後、25分の間冷まし、その後重量および容積が測られる。
【０２６９】
ロールは、外皮の形態、身の均一さ、外皮の表面覆いの様子（capping）、見かけ（ausbund）、および容積比（ブドウ種変異法による容量測定）により評価される。
【０２７０】
これらの基準に基づいた場合、PS4変異体は容積比を増大させ、デニッシュロールの品質数値を改善することがわかる。このように、PS4変異体により、焼いたパン製品の容積をコントロールすることができる。
【０２７１】
その以下の各応用および特許の実施（「応用に引用された書類」）を含み、この明細書に記載の各応用例および特許、その各応用および特許に引用され、または参考として上げられた各書類、およびその各応用および特許におよび応用に引用された書類中に引用され、または参考として上げられた製品についての製造者への取扱い指示、またはカタログ、は引用により本願に含まれる。
【０２７２】
さらに、この文書中で引用した全ての書類、および、この明細書中で引用した書類中で引用した、または参考にした全ての書類、および、この明細書中で引用した、または触れたあらゆる製品についての製造者への取扱い指示、あるいはカタログ、は引用により本願に含まれる。
【０２７３】
ここに記載された方法、およびシステムの種々の改変、および変形は本発明の範囲および趣旨から外れることなく、当業者にとって明白なものである。本発明は、特定の好ましい実施の態様について記述されているが、請求の範囲に記載された発明は、かかる実施の態様に限定されるものではない。事実、分子生物学、または関係する分野の当業者にとり明らかにである本発明の態様の種々の改変を実施することは、請求の範囲に属する発明を実施することを意味する。
【表１６】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への言及）
本願は、「エクソ特異的 アミラーゼ ポリペプチド、これらのポリペプチドをコードする核酸、及びその使用方法」(管理番号 NO.GC807P) のタイトルでベルグ他により、２００３年７月７日に出願された、USSN60/485,616 及び「これらポリペプチド及びその使用方法をコードする、熱安定性のある アミラーゼ ポリペプチド、これらのポリペプチドをコードする核酸、及びその使用方法」(管理番号 NO.GC806P) のタイトルで２００３年７月7日に出願されたUSSN60/485,413に基づく優先権の利益を主張するものである。これらの出願は２００３年７月7日に出願された「ポリペプチド」(管理番号 NO.P.016939USO)のタイトルの出願USSN60/485,539に関連するものである。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、アミラーゼ ポリペプチド、ポリペプチドをコードする核酸、及びその使用方法に関する。本発明のアミラーゼは、従来に比して、より有用な品質を備えるように改良されている。特に本発明のアミラーゼは改変されたエクソ特異性（exospecificity)を示す。
【背景技術】
【０００３】
改良されたアミラーゼは、ベーキングなどの工程における固有の問題を改善することができる。ベーキングの数日後にアミロペクチンの結晶化がでんぷん粒に起こり、そのためパンが堅くなって、パンの老化の原因となる。パンが老化するとパンの身は柔らかさ及び湿り気を失う。その結果、パンの身は弾力性を失い、パンは外皮が堅くなる。
【０００４】
アミロペクチンの側鎖の酵素による加水分解（例えば、アミラーゼによる）は結晶化の度合いを減らし、パンの対老化抵抗性を増す。結晶化の程度はアミロペクチンの側鎖の長さにより、側鎖が長いほど、結晶化の度合いは大きくなる。でんぷん粒の大半は、アミロペクチンとアミロースの二つの重合体の混合したものからなり、その約７５％はアミロペクチンである。アミロぺクチンは非常に大きな、枝分かれした分子であり、（１−４）結合で連結したα−Ｄ−（１−６）グルコピラノース単位の鎖状構造よりなる。その鎖はα−Ｄ−（１−６）連結によって枝分かれしている。アミロースは、（１−４）で連結するα−Ｄ−グルコピラノス単位の直鎖状の構造であり、α−Ｄ−（１−６）の枝分かれは殆どもたない。
【０００５】
精製したライ麦、小麦粉及びロールから作ったパンである白パンのような、でんぷん粒のパン製品、は、パン生地をオーブンの温度１８０−２５０℃の範囲で、１５−６０分かけて焼き上げる。ベーキング工程では、パンの皮となるパン生地の外側の層では、急角度の温度勾配（２００→１２０℃）が生じる。しかしながら、蒸気のため、パンの身の部分の温度はベーキング工程の終了時には約１００℃にしかならない。約８５℃以上の温度では、酵素が不活性となり、酵素はパンの老化に対する抵抗特性を失ってしまう。熱安定性のあるアミラーゼのみが、ベーキング工程においてでんぷんを効率的に改質することができる。
【０００６】
エンドアミラーゼの活性は、最終的にパン製品の品質に好ましくない影響を与える。枝分かれしたデキストリンの蓄積により、パンの身が、べとついた、または粘つく身のパンを生み出すからである。ここでエクソアミラーゼの活性が望まれる。エクソアミラーゼは、エンドアミラーゼの活性に伴う好ましくない影響が現れることを抑制し、パンの老化を遅らせるように、でんぷんに望ましい改変をもたらせるからである。エンドアミラーゼの活性を抑えることにより、エクソ特異性を増大させる結果、枝分かれデキストリンを減少させ、より品質の良いパンを生み出すことができるからである。
本願発明は、改変されたエクソ特異性を持つポリペプチドに係る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
配列番号１，５，７,または11と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を有し、かつ,4,33,34,70,71,87,99,108,113,121,134,141,157,158,171,178,179, 188, 198,199,223,290,307,315,334,343,399, および405からなる群から選択される少なくともひとつの置換を有するエクソ特異的・マルトース非生成性エクソアミラーゼ（exo-specific non-maltogenic exoamylase）。
（項目２）
前記アミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも７５％同一である項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目３）
前記アミノ酸配列が、配列番号５と少なくとも７５％同一である項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目４）
前記アミノ酸配列が、配列番号７と少なくとも７５％同一である項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目５）
前記アミノ酸配列が、配列番号１１と少なくとも７５％同一である項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目６）
前記アミノ酸配列が、配列番号2-4b、または8-10と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を有する項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目７）
少なくとも一つの置換がG4D, N33Y, D34N, G70D, K71R, G87S, A99V,K108R,V113I,G121D,G134R,A141P,I157L,G158D,Y171S,L178F,A179T,G188A,Y198F,Y198L,A199V,G223A,V290I,H307L,I315V,S334P,D343E,S399P,A405FおよびA405Eから選択される項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目８）
少なくとも一つの位置が33,34,71,87,121,134,141,157,178,179, 223,207,334 および343から選択される項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目９）
少なくとも一つの置換がN33Y, D34N, K71R, G87S, G121D G134R, A141P, I157L, L178F, A179T,G223A,H307L, S334P,および D343Eから選択される項目８に記載のエクソアミラーゼ。
（項目１０）
前記108、158、171、および188から選択される位置において、さらに少なくとも一つの置換を有する項目８に記載のエクソアミラーゼ。
（項目１１）
さらに少なくとも一つの置換がＫ108Ｒ、Ｇ158Ｄ、Ｙ171Ｓ、およびＧ188Ａから選択される項目１０に記載のエクソアミラーゼ。
（項目１２）
少なくとも一つの置換が、次の組み合わせ、
【化１】
の中から選択される一の組み合せを有する項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目１３）
少なくとも一つの置換が、次の組み合わせ、
【化２】
の中から選択される一の組み合わせを含む項目３に記載のエクソアミラーゼ。
（項目１４）
少なくとも一つの置換が、次の組み合わせ、
N33Y, D34N, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A, H307L および S334P;
N33Y, D34N, G87S, G121D, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A, H307L および、S334P;
および
N33Y, D34N, G87S, G121D, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A, H307L および S334P
の中から選択される一の組み合わせを有する項目３に記載のエクソアミラーゼ。
（項目１５）
アミラーゼが、配列番号2,3,4,４a,4b,8,9, および10から選択される一つのアミノ酸配列を含む、項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目１６）
エクソアミラーゼが、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）に由来する項目1に記載のエクソアミラーゼ。
（項目１７）
シュードモナス属が、シュードモナス・サッカロフィリア（Pseudomonas saccharophilia）、およびシュードモナス・ストツェリ（Pseudomonas stutzeri）から選択される項目１６に記載のエクソアミラーゼ。
（項目１８）
項目1に記載のエクソアミラーゼをコードする核酸配列と少なくとも75％同一である核酸配列。
（項目１９）
項目18に記載の核酸配列を有するベクター。
（項目２０）
項目19に記載の核酸配列を有する宿主細胞。
（発明の要旨）
まず、第一の特徴として、本発明は、親ポリペプチドに由来するPS4変異体（PS4 variant）を有するポリペプチドを提供する。親酵素は、配列番号1または、配列番号５に記載のアミノ酸配列を持つエクソアミラーゼのような、シュードモナス サッカロフィリア （Pseudomonas saccharophilia）マルトース非生成性エクソアミラーゼ（non-maltogenic exoamylase）である。親酵素は、好ましくは、配列番号７,または１１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドのようなシュードモナス ストチェリ（Pseudomonas stutzeri）マルトース非生成性エクソアミラーゼである。PS4ファミリーの他のメンバーも親酵素として用いることができる。
【０００８】
好ましい実施の態様として、親ポリペプチドは配列番号１、または配列番号５に記載のアミノ酸配列を持つシュードモナス サッカロフィリアに由来するマルトース非生成性エクソアミラーゼである。
【０００９】
他の好ましい実施の態様としては、親ポリペプチドは配列番号７、または配列番号11に記載のアミノ酸配列を有するシュードモナス ストチェリに由来するマルトース非生成性エクソアミラーゼである。好ましい実施の態様においては、PS4変異体は、アミノ酸置換を含むことにより親ポリペプチドと異なっている。その置換は4,9,13,33,34,42,70,71,87,99,100,108,113,121,131, 134,135,141,153,157,158,160,161,166,170,171,178,179,184,188,198,199,221,223,238,270,277,290,307,315,334,335,342,343,372,392,398,399,405,415,425から成る群から選択される少なくとも一つの位置を含む位置にあり、上記の番号は配列番号1として示すシュードモナス サッカロフィリア配列に基づいて示す位置番号をいうものである。好ましい実施の形態においては、PS4変異体はアミノ酸置換を含むことにより親ポリペプチドから異なっている。その置換は4,33,34,70,71,87,99,108,113,121,131,134,141,157,158,171,178,179,188,198,199,223, 290,307,315,334,343, 399,および405から成る群から選択される少なくとも一つの位置を含む位置に位置し、上記の番号は、配列番号1に記載のシュードモナス サッカロフィリア 配列に関して付した位置番号である。好ましくは、その位置は33,34,71,87,121,134,141,157,178,179, 223,307,334, 及び343 より成る群から選択される少なくとも一つの位置に関しての番号である。好ましくは、PS４変異体はN33Y,D34N,K71R,G87S,G121D,G134R, A141P,L178F,A179T,G223A,H307L,S334P及びD343Eから成る群から選択される少なくとも一つの置換を含む。
【００１０】
他の実施の態様においては、エクソアミラーゼはさらに108,158,171 および188から選択される位置において、さらに、少なくとも一つの置換を含む。
【００１１】
好ましくは、PS4変異体は、K108R,G158D,Y171S およびG188Aから選択される少なくとも一つの置換を含む。
【００１２】
好ましくは、PS4変異体はG4D,N33Y,D34N,G70D,K71R,G87S,A99V,K108R, V113I,G121D,G134R,A141P,I157L,G158D,Y171S,L178F,A179T,G188A,Y198F,Y198L,A199V,G223A,V290I,H307L,I315V,S334P,D343E,S399P,A405F,及びA405Eから成る群から選択される少なくとも一つの置換を含む。好ましくは、PS4変異体はN33Y,D34N,G134R,A141P,I157L, G223A,H307L,およびS334Pのうちの少なくともひとつの置換を有し、さらに、L178F, またはA179Tのうち少なくとも一つを追加的に持つ。好ましくは、PS4変異体はN33Y,D34N,I157L, L178F,A179T,G223A,またはH307Lの少なくとも一つの置換を含む。好ましくは、PS4変異体は、G87S,G134R,A141P,またはS334Pのうちの少なくとも一つの置換を有する。
【００１３】
他の好ましい実施の態様にいては、PS4変異ポリペプチドは以下の（数１）から選択される一つの組合せを有する；
【数１】
【００１４】
他の好ましい実施の態様においては、PS4変異ポリペプチドは以下の（数２）から選択される一つの組合せを有する；
【数２】
【００１５】
他の好ましい実施の態様においては、PS4変異ポリペプチドは以下の（数３）から選択される一つの組合せを有する；
【数３】
【００１６】
好ましい実施の態様においては、PS4変異体は配列番号2, 配列番号3, 配列番号4, 配列番号4a, 配列番号4b, 配列番号4c, 配列番号8, 配列番号9,または配列番号10のいずれかの配列を含むアミノ酸である。
【００１７】
PS4変異体は、シュードモナス種（Pseudomonas sp.）に由来する場合がある。一つの実施の態様においては、シュードモナス種はシュードモナス サッカロフィリアおよびシュードモナス ストチェリ から選択される。
【００１８】
PS4変異ポリペプチドは、上記に記載したもの以外に１又は２以上の突然変異（mutation）を含む。他の変異は、１又は２以上の位置における、例えば、欠失、挿入、置換、転換、転移および逆位も含む。同様に、ポリペプチドは少なくとも一つの上記の置換において欠けていることもある。
【００１９】
好ましい実施の態様においては、ポリペプチドは先端を切断した形を持っている。切断はN-先端、またはC-先端に起きる。親酵素、またはPS4変異体は、活性であるか否かを問わず、サブ配列、シグナル配列、ドメイン，部分、のような一部またはそれ以上の部分を欠くこともある。例えば、親酵素、またはPS4変異ポリペプチドは、本明細書に記載のとおり、シグナル配列を欠いていることもある。選択的に、または追加的に、親酵素は、またはPS4変異体は１又は２以上の触媒もしくは結合ドメインを欠いていることもある。好ましい実施の態様においては、親酵素、またはPS4変異体は、でんぷん結合ドメインのようにマルトース非生成性エクソアミラーゼに存在するドメインの１又は２以上のドメインを欠いていてもよいかも知れない。例えば、PS4ポリペプチドは配列番号1に示すシュードモナス サッカロフィリアのマルトース非生成性エクソアミラーゼの番号の429の位置までの配列しか持っていないこともある。好ましい実施の態様においては、図面に記載のアミノ酸配列を持っている変異体、PS4変異体、pSac-d34(配列番号4c,FIG.8c)、pSac-D20(配列番号4a, FIG.8a), およびpSac-D14(配列番号4b, FIG.8b)が提供される。
【００２０】
PS4変異体はまた、相同配列を持っている。相同配列は、PS4変異ポリペプチド酵素をコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも75,80,85,または90%同一のヌクレオチド配列を含み、好ましくは、少なくとも95,96,97,98,または99％同一配列を有する。
【００２１】
好ましい実施の態様においては、機能同等物（functional equivalent）を含む。この明細書に記載のPS4変異ポリペプチドは、好ましくはマルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を示すポリペプチドに由来する、またはその変種（variant）である。好ましくは、親酵素はマルトース非生成性エクソアミラーゼ自体である。好ましい実施の態様においては、PS4変異ポリペプチドは、またマルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を示す。
【００２２】
ここに記載のPS4変異体は、好ましくはエクソ特異性、例えば、ここに規定されるエクソ特異性指数（exospecificity index）により測定されるエクソ特異性をもち、エクソアミラーゼの特性と矛盾しないものである。さらに、その変異体は、好ましくはそれが生成した親酵素、またはポリペプチドと比較し、より高い、または大きいエクソ特異性を有している。このばあい、例えば、PS４変異ポリペプチドは、エクソ特異性指数が２０以上、すなわちその全アミラーゼ活性（エクソアミラーゼ活性を含む）がそのエンドアミラーゼ活性の２０倍、またはそれ以上あることがある。好ましい実施の態様においては、エクソアミラーゼのエクソ特異性指数が３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、または１００以上ある。好ましい実施の態様においては、エクソ特異性指数は１５０以上、２００以上、３００以上、または４００以上である。
【００２３】
好ましい状態では、PS４変異体はその親よりも熱安定性がある。好ましくは、PS４変異ペプチドは約５５℃から約８０℃、またはそれ以上の温度ででんぷんを分解することができる。好ましくは、PS４変異体は約９５℃までの温度にさらされた後でも活性を保持している。ここに記載されたPS4変異ポリペプチドは親酵素と比べ、半減期が10%,20%,30%, 40%,50%,60%,70%,80%,90%, 100%,200%,またはそれ以上長い。好ましくはより高温の５５℃から約９５℃またはそれ以上の温度で、好ましくは約８０℃において、半減期が同様なる効果を与える。好ましくはサンプルは、約８０℃、もしくはそれ以上の温度で1−１０分間加熱されるのが望ましい。
【００２４】
好ましくは、PS4変異ポリペプチドは、pHに対してより安定的である。好ましくは、その同属である親ペプチドよりpH安定性が高い。PS4変異ポリペプチドは約pH5から約pH10.5において、でんぷんを分解することができる。PS4変異ポリペプチドは、同じpH条件下において、親ポリペプチドに比べその半減期が10%,20%,30%, 40%,50%,60%,70%, 80%,90%,100%,200%,またはそれ以上長い半減期を持っていると思われる。他の実施の態様においては、pHに対する安定度は、特定のpH条件においての、酵素の活性または比活性を測定することによりアッセイされる。特定のpH状態とは、pH5からpH10.5の間のどのpH数値でも良い。
【００２５】
好ましい実施の態様においては、機能等価物は、PS4ファミリーメンバーの少なくとも一つと配列相同性を持っている。機能等価物は、上で述べたシュードモナス サッカロフィリアおよびシュードモナス ストチェリのマルトース非生成性エクソアミラーゼのいずれかと、または、好ましくは、その両方と配列相同である。機能等価物はまた配列番号1-12,好ましくは、配列番号1,または 配列番号7、またはその両方に規定する配列のいずれかと配列相同性である。配列相同性は、好ましくは少なくとも60%以上、好ましくは65%以上、好ましくは75%以上、好ましくは80%以上、好ましくは85%以上、好ましくは90%以上、好ましくは95%以上、である。配列相同は、ここに記載されたプログラムのいずれか、またはそのすべてにより生成される。他の実施の態様においては機能等価物は、上に規定する配列のいずれかと特異的にハイブリッド形成することができる。
【００２６】
第2の特徴としては、本発明は、上記に述べるように親ポリペプチドに由来するPS4変異体を含むポリペプチドをコードする核酸を提供する。親酵素は、好ましくは、配列番号1、または配列番号５に示すシュードモナスサッカロフィリアのマルトース非生成性エクソアミラーゼである。親酵素は好ましくは、配列番号７、または配列番号11に示すシュードモナスストチェリのマルトース非生成性エクソアミラーゼである。PS４ファミリーの他のメンバーも親酵素として用いることができる。
【００２７】
好ましい実施の形態においては、親ポリペプチドは配列番号1 、または配列番号５に記載された配列を持つシュードモナス サッカロフィリアのマルトース非生成性エクソアミラーゼに由来するマルトース非生成性エクソアミラーゼである。他の好ましい実施の態様においては、親ポリペプチドは、配列番号7または、配列番号11に示された配列を持つシュードモナス ストチェリに由来するマルトース非生成性エクソアミラーゼを含む。好ましい実施の態様においては、PS4変異体をコードする核酸は、4,9,13,33,34,42,70,71,87,99, 100,108,113, 121, 131,134,135,141,153,157,158,160,161,166,170,171,178,179,184,188,198,199, 221,223,238,270,277,290,307,315,334,335,342,343,372,392,398,399,405,415, 425から成る群から選択される、少なくとも一つの位置を含む位置にあるアミノ酸置換をコードすることにより親核酸と異なっている。これらの位置番号は、配列番号1に示すシュードモナス サッカロフィリア 配列についてのものである。好ましくは、これら位置は、33,34, 87, 121, 134, 141,157,178, 179,223,307, および334から成る群から選択される少なくとも一つの位置である。
【００２８】
好ましくは、PS4変異体をコードする核酸は、ポリペプチドにおけるN33Y, D34N, G87S, G121D, G134R, A141P, I157L,L178F, A179T, G223A, H307L,およびS334Pより成る群から選択される少なくとも一つの置換をコードする核酸を含む。好ましくは、PS4変異体をコードする核酸は、N33Y,D34N, G134R, A141P, I157L, G223A, H307L,およびS334Pより成る置換、そして、L178FまたはA179Tの少なくとも一つの置換を追加的に含む。好ましくは、PS4変異体をコードする核酸は、N33Y,D34N, I157L, L178F, A179T, G223A, またはH307L,の置換の一つを含む。好ましくは、PS4変異体をコードする核酸は、G87S,G134R, A141P またはS334Pの置換の一つを含む。他の実施の態様においては、PS4変異をコードする核酸は、K71R,K108R,G158D,Y171S,G188AおよびD343Eの置換の少なくともコードする核酸を含む。
【００２９】
他の実施の態様においては、PS4変異をコードする核酸は、以下の（数４）の組合せの少なくとも一つをコードする核酸を含む；
G134R, A141P I157L
【数４】
【００３０】
好ましい実施の態様においては、PS4変異体をコードする核酸は、配列配列番号2, 配列番号3, 配列番号4, 配列番号4a, 配列番号4b, 配列番号4c, 配列番号8,配列番号9, または 配列番号10のいずれか一つを含むアミノ酸をコードする。
【００３１】
好ましい実施の態様においては、核酸は端を切断したポリペプチドをコードする。切断箇所はN末端、またはC末端である。親酵素、またはPS4変異体はそれが活性か、否かを問わず、サブ配列、シグナル配列、ドメインまたはその部分のような、その一部、または複数の部分を欠いていることもある。例えば、親酵素、またはPS4変異ポリペプチドは、シグナル配列を欠いていることもある。選択的に、または、追加的に、親酵素、またはPS4変異体は、一又はそれ以上の触媒または結合ドメインを欠いていてもよい。好ましい実施の態様においては、親酵素、またはPS4変異体は、でんぷん結合ドメインのようなマルトース非生成性エクソアミラーゼにある一、またはそれ以上のドメインを欠いている。例えば、PS4ポリペプチドは、配列番号1に示すシュードモナス サッカロフィリア マルトース非生成性エクソアミラーゼの番号において429までの位置しか持たないこともある。好ましい実施の態様においては、核酸は、図面に示すPS4変異体 pSac-d34,pSac-D20およびｐSac-D14をコードする。
【００３２】
PS4変異ポリペプチドをコードする核酸は、上に示す変異に加え、１又は２以上の変異を含んでいてもよい。１又は２以上の他の位置における欠失、挿入、置換、転換、転位および逆位などのような、その他の変異も含まれる。同様に、核酸にコードされるポリペプチドは、上に示す置換の少なくとも一つを欠いていてもよい。
【００３３】
PS4変異体をコードする核酸は、また、相同配列を含んでいてもよい。相同配列は、PS4変異ポリペプチド酵素をコードするヌクレオチド配列と少なくとも75,80,85,または90%同一の、好ましくは、少なくとも95,96,97,98,または99%同一のヌクレオチド配列を含む。
【００３４】
好ましい実施の態様においては、PS4変異体の機能等価物であるポリペプチドをコードする核酸を含んでいることもある。この明細書に記載されているPS4変異ポリペプチドをコードする核酸は、好ましくはマルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を持っている酵素をコードする核酸に由来し、またはその変異体である。好ましくは、核酸にコードされる親酵素はマルトース非生成性エクソアミラーゼ自体である。核酸にコードされるPS4変異ポリペプチドはその好ましい実施の態様においては、またマルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を示す。
【００３５】
核酸にコードされるPS4変異体は、ここの記載のように、エクソ特異性指数で測ったエクソ特異性を持っている。さらにそれは、好ましくは同一条件で、由来する親酵素、または、ポリペプチドと比較した場合、より高い、またはより大きいエクソ特異性を持っている。その場合、例えば、PS4変異ポリペプチドは10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,100%,200%,またはそれ以上のエクソ特異性指数を持つ。これらPS4変異ポリペプチドは、好ましくは同一条件下で比較した場合、親ポリペプチドより1.5倍以上、2倍以上、5倍以上、10倍以上、50倍以上、100倍以上のエクソ特異性持つと思われる。
【００３６】
好ましくは、核酸にコードされたPS4変異体はその親よりも熱安定性がある。好ましくはPS4変異ポリペプチドは約55℃から約80℃の温度においてでんぷんを分解することができる。好ましくは、PS4変異体は約95℃までの温度に曝された後でも、活性を維持することができる。ここに記載されたPS4変異ポリペプチドは、約55℃から約95℃の高めの温度、またはそれ以上の温度で、好ましくは約80℃の温度で、親酵素と比べ、半減期が10%,20%,30%,40%, 50%,60%,70%, 80%,90%,100%,200%,またはそれ以上に長い。好ましくは、サンプルは約80℃、もしくはそれ以上の温度で1−10分間加熱される。
【００３７】
好ましくは、核酸にコードされるPS4変異ポリペプチドは、対pH安定である。好ましくは、PS4変異ポリペプチドは親ポリペプチドよりもより高いpH安定度を持っている。好ましくは、PS4変異ポリペプチドは、約pH5から約10.5においてでんぷんを分解することができる。特定のpH条件は、pH5から10.5の範囲であればどのpHでもよい。核酸にコードされるPS4変異ポリペプチドは同一条件下において親ポリペプチドと比較した場合、半減期が長い、またはより高い活性を示す（アッセイによる）。PS4変異ポリペプチドは、同一のpH条件で比較した場合、親ポリペプチドより半減期が10%,20%,30%,40%, 50%,60%,70%,80%,90%,100%,200%,またはそれ以上に長い場合がある。選択的に、または追加的に、PS4変異ポリペプチドは同一のpH条件で比較した場合、親ポリペプチドより高い活性を示す。
【００３８】
好ましい実施の態様においては、核酸にコードされる機能等価物は、PS4ファミリーメンバーの少なくとも一つと相同配列である。好ましい実施の態様において、機能等価物は、上述したシュードモナス サッカロフィリア、およびシュードモナス ストチェリのマルトース非生成性エクソアミラーゼ のいずれか、または、好ましくは、その双方と配列相同である。機能等価物は、また配列番号1〜配列番号12、好ましくは配列番号１、または配列番号７、またはその双方と配列相同である。配列相同は、好ましくは少なくとも60％、好ましくは少なくとも65％以上、好ましくは少なくとも75％以上、好ましくは少なくとも80％以上、好ましくは少なくとも85％以上、好ましくは少なくとも90％以上、好ましくは少なくとも95％以上ある。
【００３９】
他の実施の態様においては、ここに記載するいずれかのPS4変異体をコードする核酸と相補的な関係にある核酸が提供される。さらに，相補物とハイブリッド形成することのできる核酸を提供する。好ましい実施の態様においては、その相補物のみならず、上記の配列のいずれとも、特にハイブリッド形成することができる機能等価物をコードする核酸が提供される。
【００４０】
好ましい実施の態様においては、ここに記載の方法および組成において使用する配列は、合成配列である。その配列は、それに限定されるものではないが、例えば、メチロトローフ酵母（methylotrophic yeasts）のピキア（Pichia）、およびハンセヌラ（Hansenula）のような宿主生物にとり最適なコドン使用に基づき作された配列をふくむ。
【００４１】
発明の第3の特徴は、少なくとも一つのPS4変異ポリペプチド、および他の成分を含む組成を提供していることである。他の成分はオキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、グリコシダーゼ、アミラーゼ、プルラナーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、へミセルラーゼ、でんぷん分解酵素、プロテアーゼ、リポキシゲナーゼ、の群から選択される一つの酵素をいう。好ましい実施の態様においては、WO91/04669に開示されているように、組成はバシラス種から得られる、少なくとも一つのPS4変異体、およびマルトースアミラーゼを含む。好ましい実施の態様においては、PS4変異体および小麦粉を含む。
【００４２】
さらに追加酵素を、小麦粉、水または必要に応じて他の成分、添加物、あるいは、パン生地の改良組成を含むパン生地成分にとともに加えることができる。追加酵素は、小麦粉、水、任意追加成分、および添加物、もしくは、パン生地改良組成物を加える前後を問わず添加することができる。さらに、追加酵素は液状または乾燥した組成物の形態であってもよい。
【００４３】
第4の特徴は、PS4変異ポリペプチドを含むベクター、PS4変異ポリペプチドを含む細胞、PS4変異ポリペプチドの発現方法を提供することである。好ましい実施の態様においては、本発明は、PS4変異ポリペプチドをコードする核酸を持つ組み替え可能な、複製可能な、ベクターを対象としていることである。ベクターは、追加的に、ここに規定する要素のいずれをも含むことができる。他の好ましい実施の態様では、PS4変異体をコードする核酸を含む宿主細胞を提供している。宿主細胞はここに記載された細菌、真菌、イースト菌細胞のいずれかである。好ましい実施の態様においては、ここに記載するように、本発明はPS4変異ポリペプチドの発現方法について考察している。
発明の更なる特徴は、管理番号674510-2007およびGC806Pの関連出願に記載されており、その全ての図面、参考例、図表を含み、引例により本願に組み入れられている。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図面1（図１、以下同様）は、PS4変異体の熱安定性の改良を示すグラフである。PS4cclはシュードモナス サッカロフィリアに由来する、シグナル配列、およびでんぷん結合ドメインを持たない発現比較例酵素である。PS4cc1,pSac-D3, pSac-D20, および pSac-D14についての分単位表示の半減期を，摂氏温度に対しプロットしてある。
【図２】図2はモデルパン生地システム試験における、pSac-D34の投与効果を示すグラフである。パンの身の固くなった分量はNMRにより測定した。固くなった部分の分量で測定した堅さを、コントロール、D34の0.5, 1, 2ppmの各ケースについて、焼いた後の経過日に対してプロットしたものである。
【図３】図3 は小麦粉1kg当たり1mgのPSac-D3, およびPsac-D14, を投与した場合の堅さの減少、および堅くなる度合を示すパン焼き試験の結果を示すグラフである。hPaで測定した堅さの数値をコントロールについてプロットしたものである。
【図４】図4は、半減期が、75℃で、９．３分であるPSac-D3 （G134R, A141P, I157L, G223A, A307L, S334P,K71R, D343E, N33Y, D34N, L178F, A179T）に対し、75℃で３．６分のPsac-D3 (N33Y, D34N,K71R,L178F,A179Tを持たない)と比較した、PSac-D3のソフト化効果の増加を示すベーキング試験の結果を表したものである。
【図５】図5は、シュードモナス サッカロフィリア マルトテトラヒドロラーゼ アミノ酸配列に由来するPS4（配列番号1）参照配列を示す。
【図６】図６は、PS4変異体の配列（配列番号２）；G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P,N33Y,D34N,L178F,及びA179T置換を持つシュードモナス サッカロフィリア マルトテトラヒドロラーゼ アミノ酸配列を示す。
【図７】図７は、PS4変異体の配列（配列番号３）；G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P, N33Y,D34N, L178F, 179T, 及びG121D置換を持つシュードモナス サッカロフィリア マルトテトラヒドロラーゼ アミノ酸配列を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、PS4変異体配列（配列番号４）；G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P, N33Y,D34N, L178F, A179T, G121D及びP87S置換を持つシュードモナス サッカロフィリア マルトテトラヒドロラーゼ アミノ酸配列を示す。
【図８Ｂ】図8Ｂは、PSac-D20の配列（配列番号４a）； 13置換及びでんぷん結合ドメインの欠失を持つシュードモナス サッカロフィリア マルトテトラヒドロラーゼ アミノ酸配列を示す。
【図８Ｃ】図8Ｃは、Psac-D14の配列（配列番号４b）の配列； 1４置換及びでんぷん結合ドメインの欠失を持つシュードモナス サッカロフィリア マルトテトラヒドロラーゼ アミノ酸配列を示す。
【図８Ｄ】図8Ｄは、Psac-D34の配列（配列番号４b）の配列； 11置換及びでんぷん結合ドメインの欠失を持つシュードモナス サッカロフィリア マルトテトラヒドロラーゼ アミノ酸配列を示す。
【図９】図９は、シュードモナス サッカロフィリア マルトテロラヒドロラーゼ（配列番号5）のアミノ酸配列を示す。シュードモナス サッカロフィリア グルカン 1,4-α−マルトテトラヒドロラーゼ 前駆体(E.C.3.2.1.60)(G4-アミラーゼ)（マルトテトラオース形成アミラーゼ）（エクソマルトテトラオヒドロラーゼ ）（マルトテトラオース形成エクソアミラーゼ）SWISS-PROTアクセッション番号P22963。
【図１０Ａ】図10Aはシュードモナス サッカロフィリア マルトテトラヒドロラーゼ の核酸配列（配列番号６）を示す。マルトテトラヒドロラーゼ をコードするシュードモナス サッカロフィリア mta 遺伝子(E.C.番号3.2.1.60）。ジーンバンク（GenBank）アクセッション番号X16732。
【図１０Ｂ】図10Ｂはシュードモナス サッカロフィリア マルトテトラヒドロラーゼ の核酸配列（配列番号６）を示す。マルトテトラヒドロラーゼ をコードするシュードモナス サッカロフィリア mta 遺伝子(E.C.番号3.2.1.60）。ジーンバンク（GenBank）アクセッション番号X16732。
【図１１】図11はシュードモナス ストチェリ マルトテトラヒドロラーゼ （配列番号７）のアミノ酸配列を示す。
【図１２】図12は、PStu-D34の配列(配列番号８)を示す。 G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P,N33Y, D34N置換を持つ、シュードモナス ストチェリ マルトテトラヒドロラーゼ アミノ酸。
【図１３】図13は、PStu-D20の配列 (配列番号9)を示す。置換G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P,N33Y, D34N, 及びG121Dを持つ、シュードモナス ストチェリ マルトテトラヒドロラーゼ アミノ酸配列。
【図１４】図14は、PStu-D14の配列(配列番号10)を示す。 G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P,N33Y, D34N,G121D,及びG87S置換を持つ、シュードモナス ストチェリ マルトテトラヒドロラーゼ アミノ酸配列。
【図１５】図15は、シュードモナス ストチェリ（シュードモナス ペルフェクトマリナ）の配列（配列番号11）を示す。グルカン1，4−α−マルトテトラヒドロラーゼ 先駆体(E.C.3.2.1.60)(G４-アミラーゼ)（マルトテトラオース形成アミラーゼ）（エクソマルトテロラオヒドロラーゼ ）（マルトテトラオース形成アミラーゼ）SWISS-PROTアクセッション番号P13507。
【図１６】図.16は、シュードモナス ストチェリ マルトテトラヒドロラーゼ 核酸配列を示す。シュードモナス ストチェリ マルトテトラオース形成アミラーゼ（amyP）遺伝子、完全cds. ジーンバンク（GeneBank）アクセッション番号M24516(配列番号12)。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明においては、特に示さない限り、当業者の通常の能力の範囲にある、化学、分子生物学、微生物学、DNA組み換え、及び免疫学における通常の技法を用いる。そのような技法は、例えば、次のような文献に記載されている。J,Sambrook,E.F.Fritsch,and T..Maniatis, 1989, Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition、Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Ausubel, F.M etal.,（1995 and periodic supplement; Current Protocols in Molecular Biology, ch.9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.）; B. Roe, J. Crabtree, and A.Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing. Essential Techniques, John Wiley & Sons;J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization. Principles and Practice;Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis.A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992,Methods of Enzymology. DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology,Academic Press; Using Antibodies A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. I by Edward Harlow,David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7);Antibodies : A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor)(1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855,Lars-Inge Larsson "Immunocytochemisity: Theory and Practice", CRC Press inc.,Baca Raton, Florida, 1988, ISBN 0-8493-6078-1, John D. Pound (ed);"Immunochemical Protocols, vol 80", in the series: "Methods in Molecular Biology",Humana Press, Totowa, New Jersey, 1998, ISBN 0-89603-493-3, Handbook of Drug Screening,edited by Ramakrishna Seethala, Prabbavathi B. Femandes (2001, New York, NY,Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); and Lab Ref: A Handbook of Recipes,Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers,2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3. 上記の全ての一般的文章は、引用により本明細書に組み入れられる。
【００４６】
ここに記載のように、「PS４」は配列番号1または配列番号5に示すアミノ酸配列を持つエクソアミラーゼのようなシュードモナス サッカロフィリア マルトース非生成性エクソアミラーゼ、または、配列番号7及び配列番号11に示すアミノ酸配列を持つポリペプチドのようなシュードモナス ストチェリ マルトース非生成性エクソアミラーゼに関係する、もしくは、配列を持つ、または、機能的相同性を持つ、ファミリーメンバーをいう。他のファミリーメンバーは、（表1）に記載されている。
【００４７】
以下の、シュードモナス サッカロフィリア エクソアミラーゼに由来するPS4変異体の位置番号（数５）は配列番号1に関するものである。
【数５】
【００４８】
参照配列は、SWISS-PROTアクセッション番号P22963を持つが、シグナル配列MSHILRAAVLAAVLLPFPALA を持たないシュードモナス サッカロフィリアに由来する。
【００４９】
ナンバーリング付与システムは、特定配列を塩基参照ポイントとして用いることができるが、すべての関連する相同配列にも適用される。例えば、位置番号は、他のシュードモナス種または、他のバクテリアの相同配列に適用される。好ましくは相同体は、参照配列番号1と、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上相同である。タンパク質の間の配列相同性は、ここに記載されている周知のアラインメントプログラム、及びハイブリッド技術を用いて確かめることができる。
【００５０】
以下の、シュードモナス ストチェリに由来するPS4変異体についての、位置番号（数６）は、配列番号7に関するものである。
【数６】
【００５１】
ここで用いる「PS4変異核酸」は、PS4ファミリーメンバーの変異体である、PS4ポリペプチドをコードする核酸をいう。
【００５２】
ここで用いる、「PS4変異ポリペプチド」または、「PS4変異体」はPS4ファミリーメンバーの変異体である、ポリペプチドをいう。
【００５３】
ここで用いる、「親酵素」「親配列」および「親ポリペプチド」はPS4変異ポリペプチドが基本とする酵素、及びポリペプチドを意味する。親酵素は、前駆体酵素（すなわち、実際に変異される酵素）であるか、または、新たに用意されるものである。親酵素は野生型酵素であることもある。
【００５４】
ここで用いる「変異体」は、親分子に由来する分子をいう。変異体は、核酸のみならずポリペプチドも含む。変異体は、特に、１又は２以上の位置における置換、挿入、転換（transversion）、及び逆位（inversion）を含む。変異体は、切断を含む。変異体は、親分子と相同、及び機能等価性を持つ誘導体（derivative）を含む。変異体は、ここに示すヌクレオチド配列とハイブリッド形成することのできる配列と相補の関係の配列を含む。例えば、変異体配列は、ここに示すヌクレオチド配列と、厳しい条件下で（例えば、50℃、及び0.2xSSC(1xSSC=0.15M NaCl,0.015 M Na3クエン酸 pH7.0))でハイブリッド形成することのできる配列と相補の関係にある。より好ましくは、変異体の用語は、ここに示すヌクレオチド配列と、極めて厳しい条件（例えば、65℃、及び0.1xSSC(1xSSC=0.15M NaCl,0.015 M Na3クエン酸 pH7.0))でハイブリッド形成することのできる配列を相補する関係にあるものを含む。
【００５５】
ここで用いる「前躯体」は、改質酵素を生み出すために用いる酵素をいう。前躯体は、変異誘発により修飾された酵素でもよい。同様に、前躯体は野生型酵素、変異野生型酵素、あるいは既に変異した酵素でもよい。
【００５６】
ここで用いる「機能等価物」は、親酵素との関係を言うものであり、親分子と類似または、同一機能を持つ分子をいう。親分子は、シュードモナス サッカロフィリア マルトース非生成性エクソアミラーゼ、またはシュードモナ ストチェリ マルトース非生成性エクソアミラーゼ、あるいは他のソースから得られるポリペプチドの場合がある。機能等価物である酵素は、異なるアミノ酸配列を持つがマルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を有する。機能を決めるアッセイ（assay）の例は、ここに記載されており、当業者によく知られている。
【００５７】
ここで用いる「分離された」とは、その配列が、自然に関連付けられ、そして自然界に存在する、少なくとも一つの他の構成要素から、少なくとも本質的に自由である配列をいう。
【００５８】
ここで用いる「精製された」（purified）とは、その配列が比較的純化された状態にあることをいう、例えば、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98%純粋であることをいう。
【００５９】
ここで用いる「アミラーゼ」は、酵素を意味し、なかでも、でんぷんの加水分解を触媒することができるものをいう。アミラーゼはでんぷんのα−D(１→4)O−グリコシド結合を開裂するヒドロラーゼ（加水分解酵素）である。一般的に、α−アミラーゼ(E.C.3.2.1.1,α−D(１→4)グルカン グルカノヒドロラーゼ)は、でんぷん分子の中のα−D(１→4)O-グリコシド結合を無作為に開裂するエンド型の（endo-acting）酵素と定義される。これと対照的に,β−アミラーゼ(E.C.3.2.1.2 α−D(１→4)グルカンマルトヒドロラーゼ )のような、エクソ型（exo-acting）でんぷん分解酵素、及び、マルトース生成性（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ）α−アミラーゼ(E.C.3.2.1.133)のような、いくつかの生成物特異的に作用するアミラーゼは基質の非還元末端からでんぷん分子を開裂する。β−アミラーゼ、α-グルコシダーゼ(E.C.3.2.1.20 α−D−グルコシド グルコヒドロラーゼ )、グルコアミラーゼ（(E.C.3.2.1.3 α−D((１→4)−グルカン グルコヒドロラーゼ )、及び生成物特異的アミラーゼは、でんぷんから特定長のマルトオリゴ糖を作り出すことができる。
【００６０】
ここで用いる「マルトース非生成性エクソアミラーゼ酵素」(non-maltogenic exoamylase enzyme)は、最初にでんぷんを大量のマルトースに分解することのない酵素をいう。これを確認するアッセイ方法はここに記載されている。
【００６１】
ここで用いる「直線状のマルトオリゴ糖」は、α−(１→4)結合により結合された２から２０単位のα−Dグルコピラノースをいう。
【００６２】
ここで用いる「熱安定」は、酵素が高めの温度にさらされた後に、活性を維持する能力に関していう。マルトース非生成性エクソアミラーゼのような酵素の熱安定性は、その半減期により測定される。半減期（t1/2）は、規定される条件で、酵素の半分が活性を失う分単位の時間数値をいう。半減期数値は、残留アミラーゼの活性を測定することにより算出される。半減期アッセイは、実施例において、さらに詳細に記載される方法でおこなわれる。
【００６３】
ここで用いる「pH安定」は、広範囲のpHにわたり、活性を維持する酵素の能力についていう。対pHアッセイは、実施例に記載の方法により行う。
【００６４】
ここで用いる「エクソ特異性」（exo-specificity）は、改善された、例えば、非置換エクソアミラーゼのエクソ特異性比率と比べ、増加したエクソ特異性指数についていう。
【００６５】
ここで用いる「エクソ特異性指数」（exo-spificity index）は、全エンドアミラーゼ活性に対する全アミラーゼの活性比率を言う。アミラーゼ、及びエンドアミラーゼ活性の測定のためのアッセイは、本明細書中に述べられている。
【００６６】
ここで用いる「食物」は、小麦粉のような食物の成分のみならず、調理済み食物をもふくむ。
【００６７】
ここで用いる「食品成分」は、機能性食品（functional foods）または、食料品（食品材料）である、あるいは、これらに加えることのできる調理品（formulation）を含み、さらに、例えば、酸化、または乳状化を必要とする広範囲の種類の製品にいて、少量用いられる調理品をふくむ。食品の成分は、使用、応用、そして、または管理の仕方により液状または固形状で用いられる。
【００６８】
ここで用いる「機能食品」は栄養的に効果、そして、または、味覚上の満足を提供できる食品のみならず、消費者に対してさらに有益な効果をもたらすことのできるものをいう。
【００６９】
ここで用いる「アミノ酸配列」は、「ポリペプチド」そして、または「タンパク質」という用語と同義である。ある場合には、「アミノ酸配列」は、「ペプチド」という用語と同義である。ある場合には、「アミノ酸配列」は、「酵素」という用語と同義である。
【００７０】
ここで用いる「ペプトイド形」(peptoid form)はα−炭素置換群が、α−炭素原子よりも、残留基の窒素原子に位置するる、変異体アミノ酸残基をいう。「ペプトイド形」においてペプチドを準備するプロセスは、例えば、Simon RJ他、PNAS(1992)89(20),9367-9371 and Howell DC,Trends Biotechnol, (1995) 13(4),132-134にあるように業界で知られている。
【００７１】
ここで用いる「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」はオリゴヌクレオチド配列、または、ポリヌクレオチド配列、及び変異体，相同体、断片、及びそれらの由来物（その部分であるような）を指す。ヌクレオチド配列は、センス鎖、またはアンチセンス鎖の何れをあらわすものであろうとも、二本鎖、または一本鎖である、ゲノム、または合成、あるいは遺伝子組み換えを源とする。ここで用いる、ヌクレオチド配列の用語は、ゲノム、DNA, cDNA,合成DNA及びRNAを含む。好ましくは、それは、cDNA を、より好ましくは、PS4変異ポリペプチドをコードするDNAを意味する。
【００７２】
ここで用いる「でんぷん」は、でんぷんそれ自体、または、その一構成物、特にアミロペクチンをいう。「でんぷん培地」（starch medium）はでんぷんを含む、あらゆる適切な培地をいう。「でんぷん製品」とは、でんぷんを含む、でんぷんをベースとする、またはでんぷんに由来するあらゆる製品を含む。好ましくは、でんぷん製品は、白小麦粉から得られるでんぷんを含む、または、でんぷんをベースとする、または、それに由来するものである。
【００７３】
ここで用いる「小麦粉」は、小麦または他の穀物を細かく粉砕した粉をいう。例えば、小麦粉は、小麦自体から得たものであり、他の穀物からのものは含まない。白小麦粉は、パン生地のような中間体の形での小麦粉を指すとともに、白小麦粉自体をもいう。
【００７４】
ここで用いる「焼いたでんぷん粉のパン製品」は、パン生地を作る条件で、小麦粉、水及び酵母を混ぜて得られるパン生地をベースとする、焼いたあらゆる製品をいう。
【００７５】
ここで用いる「相同物」「相同」は、主アミノ酸配列、及び主ヌクレオチド配列と一定程度の同一性を持つものをいう。相同配列は、主配列と少なくとも75％、80％、85％、または90％、好ましくは、少なくとも95％、96％、97％、98％、または9９％の同一のアミノ酸配列を持つ。典型的には、相同物は、主アミノ酸と同じ活性部位を持っている。
【００７６】
ここで用いる「ハイブリッド形成」（hybridisation）とは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術により行われる、増幅プロセスのみならず、塩基の対合を通じて、核酸鎖が相補鎖と結合するプロセスを含む。PS4核酸は一本鎖、二本鎖DNA,RNA, RNA/DNA ヘテロ二本鎖、または共重合RNA/DNAとして存在する。
【００７７】
ここで用いる「共重合体」は、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドをともに含む一本鎖核酸をいう。PS4核酸は、さらに発現を増加させるように適正化されたコドンである場合もある。
【００７８】
ここで用いる「合成物質」は試験管の中で、化学的に、または酵素合成により作りだされるものをいう。メチロトーフ酵母であるピチア及びハンセヌラ（Pichia and Hansenula）のような宿主生物のためのコドンとしてのて適正な用途をもつPS4核酸を含むが、それに限定されるものではない。
【００７９】
ここで用いる「形質転換細胞」は、DNA遺伝子組み換え技術を用いて変換される細胞を含む。特徴的な転換は、１又は２以上のヌクレオチド配列を細胞に挿入することにより起こる。このように挿入されたヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列（すなわち、変換される細胞にとり自然でない配列）、および/または代替的に、挿入されるヌクレオチド配列は相同ヌクレオチド配列、（すなわち変換される細胞にとり自然な配列である配列）であることもある。そして、細胞は既にそこにあるヌクレオチド配列の一つ、またはそれ以上のコピーをさらに受け取る。
【００８０】
ここで用いる「操作可能にリンクされた」とは、記載された構成部分が意図された態様で機能することを可能とする関係をいう。コードする配列に操作可能にリンクされたアラインメント塩基配列は、制御配列と適合可能な条件下でコード配列の発現を達成するような方法でコード配列に連結される。
【００８１】
ここで用いる「生物学的に活性」とは、自然的に発生する配列と同じような構造的機能（必ずしも同じ程度である必要はない）、同じ様なアラインメント機能（必ずしも同じ程度である必要はない）、そして、または、同じ様な生化学的機能（必ずしも同じ程度である必要はない）をもつ配列を指す。
【００８２】
Ｉ． 本発明のポリペプチドの詳細な説明
最初の特徴として、本発明は、親ポリペプチドに由来するPS4変異体を含むポリペプチドを提供する。親酵素は、好ましくは、マルトース非生成性エクソアミラーゼ、好ましくは、細菌マルトース非生成性エクソアミラーゼ酵素である。親酵素は、好ましくはマルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を示すポリペプチドである。
【００８３】
親酵素は、配列番号1、または配列番号5に示すエクソアミラーゼのようなシュードモナス サッカロフィリア マルトース非生成性エクソアミラーゼである場合もある。親酵素は、配列番号7、または配列番号11に示すポリペプチドのようなシュードモナス ストチェリ マルトース非生成性エクソアミラーゼであることもある。PS4ファミリーの他のメンバーは、下記（表1）に示す親酵素として用いることができる。好ましくは、PS4ファミリーのメンバーは、通常、配列番号1、配列番号5、配列番号7、または 配列番号11に示す、エクソアミラーゼと類似し、相同であり、または機能等価物である。プローブ（probe）を用いて、適当なライブラリーをハイブリッド形成スクリーニングすることにより、または、ゲノム配列分析のような標準的方法によって、識別することができる。識別方法を以下に記す。
【表１】
【００８４】
表１： 親配列（PS4ファミリーメンバー）。記載の配列は、規定のアミノ酸残基からなる置換を含む点で、表の最上行に示す位置においてシュードモナス サッカロフィリア配列と異なる。例えば、pS4ccl-S161Aは野生型シュードモナス マルトース非生成性エクソアミラーゼの変異種であり、したがって親酵素として用いることができる。さらに、ATCC17686のようなシュードモナス属の他の種に由来するマルトース非生成性エクソアミラーゼは、また親ポリペプチドとして用いることができる。PS4変異ポリペプチド残基は、変異PS4 ポリペプチド配列を生み出すために、これらの何れの親配列にも挿入することができる。
【００８５】
PS4変異ポリペプチドは、アミノ酸置換を含む多くの変異を含む点により親配列と異なっている。好ましい実施の態様においては、親ポリペプチドは、配列番号1, または配列番号5に示す配列をもつシュードモナス サッカロフィリア マルトース非生成性エクソアミラーゼに由来するマルトース非生成性エクソアミラーゼである。好ましい実施の態様においては、親ポリペプチドは、配列番号７、または配列番号11に示す配列をもつシュードモナスストチェリに由来するマルトース非生成性エクソアミラーゼを含んでいる。好ましい実施の態様においては、PS4変異体は-、アミノ酸置換を含むことにより、親ポリペプチドと異なっている。置換位置は以下に示す群から選択ばれる少なくとも一つ位置を含む。すなわち、4,9,13,33,34,42,70,71, 87,99,100,108,113,121,131, 134, 135, 141,153, 157,158, 160, 161, 166, 170,171, 178, 179, 184, 188, 198,199, 221,223,238, 270,277, 290, 307,315,334,335,342,343, 372,392,398,399, 405, 415,及び425である。ここで、位置番号は配列番号1に示すシュードモナス サッカロフィリアエクソアミラーゼに関するものである。好ましくは、当該位置は以下に示す群から選択される少なくとも一つの位置である。すなわち、33,34,87,121,134,141, 157,178,179,223,307及び334である。他の実施の態様においては、変異体はさらに、71,108,158,171,188,及び343に示す群から選択される一の置換を含む。他の実施の態様においては、変異体はさらに、113,198及び290の群から選択される一の置換を含む。
【００８６】
好ましくは、PS4変異体はN33Y, D34N,G87S,G121D,G134R, A141P, I157L, L178F,A179T,G223A,H307L及びS334Pよりなる群から選択される少なくとも一つの置換を持つ。好ましくは、PS4変異体は以下の置換をもつ。すなわち、N33Y,D34N, G134R, A141P, I157L, G223A,H307L及びS334Pよりなる群から選択される少なくとも一つの置換、及びさらにL178FまたはA179Tのいずれか一つを、追加的に持つものである。好ましくは、PS4変異体はN33Y,D34N,I157L,L178F, A179T, G223A,または,H307Lの一つの置換を持つ。好ましくは、PS4変異体はG87S,G134R,A141P またはS334Pの一つの置換を持つ。他の実施の態様においては、PS4変異体はK71R,K108R, G158D,Y171S,G188A, 及びD343Eの一つの置換を持っている。他の実施の態様においては、PS4変異体はV113I,Y198F,Y198W, 及びV290Iの内の一つの置換を持っている。
【００８７】
理論に拘泥することは望ましくないが、発明者は以下のように考える、すなわち、シュードモナス アミラーゼの3次元結晶構造は提案されている基質結合部位モデル（Molecular Operating Environment(MOE)ソフトプログラム、Chemical Computing Group, Inc., Montreal Canadaより入手可能）と併せて考察すると、残基位置121,157,223,及び307は、基質結合部位に近接していることを示している。実施例に示すデータは、G121Dは、酵素の安定性及びエクソ特異性を共に改善し、G223Aは、酵素の熱安定性を改善することを示している。既に、観察したような改善がなされ、その予想される位置が基質結合部位に近接していると予想されることを考慮すると、その各位置において、全ての可能なアミノ酸を代替することにより、さらに改善をすることができる。一の実施の態様においては、近接度は、基質結合部位から、特定の位置まで10.0オングストローム以内である。また、一つの実施の態様においては、近接度は、基質結合部位から、特定の位置まで7.5オングストローム以内である。一つの実施の態様においては、近接度は、基質結合部位から、特定の位置まで6.0オングストローム以内である。例えば、G121 C-αから基質まで約5.9オングストローム;G223 C-αから基質まで約5.82オングストロームである。
【００８８】
ある実施の態様においては、PS4変異体は、以下の（数７）から選択される一つの組合せを含む；
【数７】
【００８９】
他の実施の態様においては、少なくとも一つの置換は、以下の（数８）から選択される一つの組合せを含む；
【数８】
【００９０】
他の実施の態様においては、少なくとも一つの置換を含むエクソアミラーゼは、以下の（数９）から選択される一つの組合せを含む；
【数９】
【００９１】
他の実施の態様においては、少なくとも一つの置換を含むエクソアミラーゼは、以下の（数１０）から選択される一つの組合せを含む；
【数１０】
【００９２】
好ましい実施の態様においては、PS4変異体は、配列番号2, 配列番号 3, 配列番号4, 配列番号4a, 配列番号4b, 配列番号4c, 配列番号8 配列番号9または配列番号10のいずれかを含むアミノ酸配列である。
【００９３】
PS4変異ポリペプチドは、上に述べものに加え、１又は２以上の変異を含んでもよい。一またはそれ以上の位置における、欠失、挿入、置換、転換、転位、及び逆位のような他の変異も含まんでもよい。同様にポリペプチドは、上に規定する置換の少なくとも一つを欠いていてもよい。
【００９４】
PS4変異体は、対応する置換（塩基対塩基、酸性対酸性、極対極等）として発生する同類置換を含んでもよい。非同類置換も起き得る、すなわち、ある種類の残留基から他の種類の残留基への置換、または、代替的にオルニチン（以下 Zという）ジアミノブチル酸オルニチン（以下 B という）、ノルロイシン、オルニチン（以下Oという）、ピリララニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシンのような自然界にないアミノ酸を含む形でも起こり得る。
【００９５】
配列は、また目立たない変化を生み出し、結果的に機能等価物な基質を生み出すアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を持つこともある。意図的なアミノ酸置換は、アミノ酸の固有の特質（例えば、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および/または両親媒性など）における類似をベースに行われる。したがって、アミノ酸を官能基別にグループ化することは有益である。アミノ酸は、その側鎖の持つ特性のみにより、グループ化することができる。しかし、さらに、変異データを含むことにより一層有益なものとなる。このようにして得られるアミノ酸の組は、その構造の違いとして分類されると思われる。これらの組は、Vennダイアグラム（Livingstone C.D. and Barton G.J.(1993) 「タンパク質配列のアラインメント、同類残基の系統的分析のための戦略」(Protein sequence alignments:a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation”) Comput Appl Biosci,9:745-756(Taylor W.R.(1986)「同類アミノ酸の分類」(The classification of amino acid conservation”J.Theor, Biol. 119:205-218). 同類置換は、例えば、Vennダイアグラムのによるアミノ酸のグループ化を表すものとして一般に受け入れられている下記（数１１）に従い作成することができる。
【数１１】
【００９６】
変異アミノ酸配列は、またグリシン、またはβアラニン残基のようなアミノ酸スペーサに加え、メチル、エチル、プロピル基のようなアルキル基を含む配列の、何れかの二つのアミノ酸残基の間に挿入される適当なスペーサをも含む。更なる分化の形態としては、ぺプトイドの形をとる一又は二以上のアミノ酸残基がある。
【００９７】
PS4変異体は、また相同配列を持っている場合がある。相同配列は、PS4変異体をコードするヌクレオチド配列と少なくとも、75%,80%,85%,または90%、好ましくは少なくとも95%,96%,97%,98%,または99％同一配列をもつ。典型的な場合は、相同体は、活性サイトをコードする配列が、主配列と同じ配列である配列を持つことがある。
【００９８】
相同性の比較は、肉眼により実行でき、より一般的には、簡易に入手可能な配列比較プログラムを用いて行う。これらの、商業的に入手可能なコンピュータプログラムは、2またはそれ以上の配列間の相同性％を計算をすることができる。相同性％は連続した配列にわたって計算することができる、すなわち、一の配列を他の配列と互いにアラインさせ、一の配列中の各アミノ酸を他の配列中の対応するアミノ酸と、一度に残基一つについて直接対比して行う。これは「隙間のないアラインメント」（ungapped alignment）と呼ばれている。典型的には、このような「隙間のないアラインメント」は比較的少数の残基についてのみ行う。
【００９９】
非常に簡便で、理屈に合った方法であるが、しかしこの方法は以下の点の考慮が欠けている。たとえば、それらの、挿入、欠失がなければ同一である一組の配列において、一つの挿入または欠失があることにより、続くアミノ酸残基が「アラインメント」から外れてしまい、全体としてのアラインメントを取った場合、相同性％が大きく減少するおそれがある。そのため、殆どの配列比較法は全体としての相同性の数値を不当に損なうことのない様、予想される挿入、および欠失を考慮した最適アラインメントを生み出すようにデザインされている。これは、局所での相同性を極力最大化するように、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することにより達成される。
【０１００】
しかしながら、これらの内のより複雑な方法は、アラインメントで生ずる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り振り、そのため、同一のアミノ酸が同数である場合に、配列アラインメントにおいてギャップを極力少なくすればする程−これは、対比される2つの配列間により高い関連性があることを示すーギャップが多い配列よりも高い数値が得られるようになっている。「擬似変換ギャップコスト」は、典型的には、一のギャップのある場合は比較的高いコストを課し、そのギャプに生ずる各従属残基にはより小さいペナルティを課す形で用いられる。この方法が最も多く用いられているギャップ得点システムである。高いギャップペナルティは、勿論一層ギャップの少ない最適なアラインメントを生み出す。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティの改変を認めている。しかしながら、配列比較にそのようなソフトを使用する場合には、初期設定によることがのぞましい。例えば、GCG Wisconsin Bestfitセットを使用する場合、アミノ酸配列のギャップペナルティの初期設定は、1ギャップに対して-12, そして、それぞれの延長（extension）に対して-4となっている。
【０１０１】
したがって、相同性％の最大値を計算する場合には、まず、ギャップペナルティを考慮して、最適アラインメントを生み出すことが必要となる。そのようなアラインメント生み出すのにふさわしいコンピュータプログラムは、GCG Wisconsin Bestfitセット(Devereux et. al 1984 Nuc. Acids Reseach 12 p387)である。他のソフトで配列比較が可能なものとして、これらに限定されるものではないが、BLASTセット（Ausubel et. al 1999, Short Protocols in Molecular Biology, 4thEd.-Chapter 18）, FASTA (Altshul et. al , 1990 J. Mol. Biol. 403-410)およびGENEWORKS 比較ツールセットがある。BLAST、およびFASTAはともにオフラインおよびオンラインの両方で利用可能である（Ausubel et. al 1999,Short Protocols in Molecular Biology,、７-５８頁、７-６０頁参照）。しかしながら、アプリケイションによっては、GCG Bestfitプログラムを用いるのが好ましい。BLAST２Sequenceはタンパク質およびヌクレオチド配列の比較に利用できる（FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1):187-8;およびtatiana@ncbi.nlm.nih.gov）。
【０１０２】
最終的な相同性％は、同一であるか否かにより測られるが、アラインメントプロセス自体は、特徴的には、ゼロか全てかの二者択一による対比によるものではない。それ代わり一般的には、段階的な類似スコアマトリックスが用いられており、化学的な類似、または進化の距離に基づきそれぞれの組について点数を割り当てる。そのようなマトリックスで、通常用いられる例として、BLOSUM62マトリックス−BLASTプログラムセットの初期設定マトリックスーがある。GCG Wisconsinプログラムは一般に公表されている初期設定値、またはもし入手できればオーダーメイドのシンボル比較表を用いる（詳細はユザーマニュアル参照のこと）。いくつかの適用例においては、GCGセットの場合、公表初期設定値を用いるか、または他のソフトの場合はBLOSUM62のように、初期設定マトリックスを用いる。
【０１０３】
また、選択的に、相同性％はCLUSRAL(Higgins DG & Sharp PM (1977), Gene 73(1), 237-244)に類似した、アルゴリズムに基づくDNASISTM（日立 ソフト）の複数アラインメント特性を用いて計算することもできる。
【０１０４】
ソフトが最適なアラインメント組合せを生み出したなら、相同性％、好ましくは、同一配列の％を計算することが可能となる。ソフトは、典型的には、配列比較の一部として、これを実行し、数値結果をだす。
【０１０５】
好ましい実施の態様においては、また、機能等価物を含んでいる。ここに記載されたPS4変異ポリペプチドは、好ましくはマルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を示すポリペプチドに由来し、またはその変異体である。好ましくは、これらの親酵素は、マルトース非生成性エクソアミラーゼ自体である。PS4変異ポリペプチド自体、好ましい実施の態様においては、またマルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を示す。
【０１０６】
ここに記載のPS4変異体は、好ましくは、例えば、それがエクソアミラーゼであることと矛盾せず、上記のようなエクソ特異性指標により測定した、エクソ特異性を持つ。さらにPS4変異体は、それが由来した親酵素またはポリペプチドと比較した場合に、より高い、または増大したエクソ特異性（exospecificity）をもつ。したがって、例えば、PS4変異ポリペプチドは、親ポリペプチドと、好ましくは同一の条件下で比較した場合、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、またはそれより高いエクソ特異性を持つと思われる。これらは、好ましくは同一条件下で親ポリペプチドと比較した場合、1.5倍以上、２倍以上、5倍以上、10倍以上、50倍以上、100倍以上、持つと思われる。
【０１０７】
好ましい実施の態様においては、機能等価物はPS4ファミリーメンバーの少なくとも一つと相同の配列を持つ。機能等価物は、上に述べたシュードモナス サッカロフィリア、およびシュードモナス ストチェリ マルトース非生成性エクソアミラーゼのいずれかと、好ましくは両方と配列相同性をもつ。機能等価物は、配列番号1から１２、好ましくは、配列番号1、または配列番号7、またはその両方に示された配列とも配列相同性をもつ。そのような配列間の配列相同性は、好ましくは、少なくとも、60％以上、好ましくは65％以上、好ましくは75％以上、好ましくは80％以上、好ましくは85％以上、好ましくは90％以上、または好ましくは95％以上、ある。
【０１０８】
他の実施の態様においては、機能等価物は上記の配列の何れとも、特にハイブリッド形成をすることができる。一の配列が他の配列とハイブリッド形成することができるかを決定する方法は、業界で知られており、例えば、Sambrook et.al (上記)、Ausubel,F.M. et. al(上記)に記載されている。極めて好ましい実施の態様においては、機能等価物は65℃、および0.1xSSC(1xSSC=0.15M NaCl, 0.015M Na3 クエン酸 pH7.0)のような厳しい条件の下においてハイブリッド形成をする。
【０１０９】
アミノ酸配列は、適切なソースから準備・分離することができ、または合成し、またはDNA遺伝子組み換え技術を用いて作ることができる。いくつかの方法を下記する。
【０１１０】
２．本願発明の核酸の詳細な説明
第二の特徴は、本発明は核酸を提供する。核酸は、上で述べたように、親ポリペプチドに由来するPS4変異体を含むポリペプチドをコードする。
【０１１１】
当業者であれば、核酸の配列とポリペプチド配列間の関係、特に、遺伝子コードおよびこのコードの縮重を知っており、困難なく、そのようなPS4核酸を構築することができるだろう。例えば、当業者はPS4変異ポリペプチド配列中の各々のアミノ酸置換について、置換アミノ酸をコードする一またはそれ以上以上のコドンがあることを知っているであろう。したがって、ある特定のアミノ酸残基に関する遺伝子コードの縮重に基づき、一又はそれ以上のPS4核酸配列がそのPS4変異ポリペプチド配列に対応して生成されることは明白であろう。したがって、例えば、PS４核酸配列は、ポリペプチドをコードする親配列に由来するかも知れない。そこでは、PS4変異体核酸は、以下の位置のアミノ酸置換をコードしている。すなわち、G134,A141,I157,G223,H307, S334,N33およびD34,に加えL178およびA179のいずれか一つ、またはその両方である。
【０１１２】
アミノ酸配列、および核酸配列における変異は、業界で公知のように、多くの技法により作られている。特に好ましい実施の態様においては、変異は、実施例に描かれているように、適用なプライマーを用いてPCR（polymerase chain reaction）により親配列に導入される。
【０１１３】
親酵素は、ここに記載されたPS4変異体配列を生み出すためアミノ酸レベル、または核酸レベルで修飾を受ける。したがって、本発明のこの特徴について、好ましい実施の態様として、マルトース非生成性エクソアミラーゼ ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の１又は２以上の対応するコドン変化を導入することによりPS4変異ポリペプチドを生み出すことを提供している。
【０１１４】
上記のコドン変化は、何れのPS4ファミリー核酸配列においてもなしうることに注目すべきである。例えば、配列変化は、シュードモナス サッカロフィリアまたはシュードモナス ストチェリ マルトース非生成性エクソアミラーゼ核酸配列にも起こすことができる（例えば、X16732, 配列番号6、または、M24516,配列番号12）。
【０１１５】
親酵素は「完全な」酵素、すなわち、自然に発生したままの長さ（または、変異したまま）、または、その切断した形のものを含む。そのような酵素に由来するPS4変異体は、したがって、そのように切断された形、または「全長」を持っている。切断は、N-末端、またはC-末端で起きる。親酵素、またはPS4変異体は、活性であるか否かを問わず、サブ配列、シグナル配列、ドメインまたはその部分のような１又は２以上の部分を欠くこともある。例えば、親酵素、またはPS4変異ポリペプチドは、上に述べたようにシグナル配列を欠いていることもある。代替的に、または、追加的に、親酵素、またはPS4変異体は、１又は２以上の触媒、または結合ドメインを欠いていることもある。
【０１１６】
極めて好ましい実施の態様においては、親酵素、またはPS4変異体は、でんぷん結合ドメインのようなマルトース非生成性エクソアミラーゼにある、１又は２以上のドメインを欠いていることもある。例えば、PS4ポリペプチドは配列番号:1に示す、シュードモナス サッカロフィリア マルトース非生成性エクソアミラーゼの番号429までの配列しか持っていないこともある。例えば、このケースは実施例に記載されたPS4変異体pSac-d34,pSac-D20, pSac-D14,または、他の変異体である。
【０１１７】
典型的には、PS4変異体ヌクレオチド配列は、DNA組み換え技法を用いて準備されたものである。しかしながら、他の代替的実施の態様においては、ヌクレオチド配列は、業界で公知の化学的技法を用いて、全体もしくは、その一部を合成することが可能であると思われる（Caruthers MHat al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 and Horn T el al, (1980), Nuc Acids Res Symp Ser 225-232）。
【０１１８】
ここに規定した特性を持つ酵素、または親酵素のように、修飾に適している酵素をコードするヌクレオチド配列は、その酵素を生みだす細胞、または生物から同定、分離、および/または精製される。ヌクレオチド配列の同定、分離、および/または、精製のための種々の方法は業界でよく知られている。その例としては、ある適切な配列が、同定、分離、および/または精製されたならば、その配列の、更に多くの配列を準備するPCR増幅技術をが用いることができる。
【０１１９】
さらに例を挙げると、ゲノムDNA、および/またはｃDNAライブラリーは、酵素を生み出す生物の染色体DNA、またはメッセンジャーRNAを用いて構築される。酵素のアミノ酸配列、または、酵素のアミノ酸配列の一部が知られていれば、標識のついたオリゴヌクレオチドプローブが合成され、その生物から準備されたゲノムライブラリーの酵素をコードするクローンを同定するために用いられる。代替的に、他の知られた酵素ゲノムと相同配列をもつ標識のついたオリゴヌクレオチドプローブが、酵素をコードするクローンを同定するために用いられる。後のケースにおいては、ハイブリッド形成および洗浄は厳格度の緩い条件が適用される。
【０１２０】
代替的に、酵素をコードするクローンは、プラスミドのような発現ベクターにゲノムDNAの断片を挿入することにより同定することが出来る。そして生じたゲノムDNAライブラリーによって酵素否定的バクテリアを変換し、そして酵素の基質（例えば、マルトース）を含むかんてん培地に、変換されたバクテリアを植えつけることにより酵素を発現させることによりクローンが同定される。
【０１２１】
更なる代替的方法としては、酵素をコードするヌクレオチド配列は、例えば、Beucage S.L. et al., (1981)、Tetrahedron Letters 22,p1859-1869,に記載されたフォスフォロアミダイト法（phosphoroamidite）、またはMatthes et al.,(1984), EMBO J.3,p801-805に記載された方法などのような確立された標準的方法により合成することができる。フォスフォロアミダイト法は、例えば、オリゴヌクレオチドが、例えば、DNAの自動合成により、精製、アニール、連結、および、適当なベクターを用いてクローン合成される。
【０１２２】
ヌクレオチド配列は、標準の技法により、合成された、ゲノムの、またはｃDNAオリジンの各断片を連結することにより準備された、ゲノムと合成物の混合、合成物とｃDNAオリジンの混合、またはゲノムとcDNAオリジンの混合からなる。連結された、各断片は、全ヌクレオチド配列の各部分に対応する。DNA配列は、また、例えば、US4,683,202,または、Saiki R.K et al,(Science （1988） p239, pp487-491)に記載されている様な特定のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により作ることもある。
【０１２３】
ここに記載のヌクレオチド配列で、ここに記載の方法、および構成に使用するのに適しているものは、その中に、合成、または修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドの修飾は、多くの異なるタイプの方法が業界において知られている。これら、メチルフォスフォネートおよびフォスフォロチオエート骨格、および/または分子の３’および/または５’の位置で，アクリジン（acridine）または、ポリリシン（polylysine）が付加されたものを含む。本明細書においては、ここに記載のヌクレオチド配列は、当業者に利用可能の方法により修飾してもよいと解される。そのような修飾はヌクレオチド配列の生体内活性を高め、または寿命を長引かせるために認められる。
【０１２４】
好ましい実施の態様においては、本発明は、核酸及びここに提示されている核酸配列に相補的な核酸配列の使用、それらに由来する配列、断片、またはその断片の由来物に相補的であるヌクレオチド配列、およびその使用法について提示している。もし、配列がその断片にとり相補的であるとすれば、その配列は、他の生物などにおいて同様のコード配列を同定するプローブとして用いることができる。
【０１２５】
PS4変異体配列と100％相同ではないポリヌクレオチドは、多くの方法で入手することができる。ここに記載する配列の他の変異体は、例えば、個人の範囲、すなわち、例えば、異種人口のその構成する個人に由来するDNAライブラリーをプローブすることで得ることができる。さらに、他の相同種が得られることもあり、その相同種、およびその断片は、通常ここに記載の配列リストに示す配列と、選択的にハイブリッド形成をすることができる。そのような配列は、他の種に由来するｃDNAライブラリー、または、他の種に由来するゲノムDNAライブラリーのプローブにより、および、添付した配列表にある全て、またはそのいずれかの配列の一部を含むプローグを有するそのようなライブラリーを、中程度から高度に厳しい条件の下で、プローブすることにより得ることができる。本発明に記載した相同種、およびポリぺプチド、またはヌクレオチド配列の対立遺伝子変異体を得る場合にも同様の考えが適用される。
【０１２６】
変異体、相同菌株/種は、また保存アミノ酸配列をコードする変異体および相同種中の、配列をターゲットしてデザインされたプライマーを用いる縮重PCRを用いることにより得られる。縮重PCRで用いられるプライマーは一または二以上の縮重位置を持ち、既知の配列に対してシングル配列プライマーによって配列をクローンするのに用いられた条件より緩い条件で用いられる。保存配列は、例えば、いくつかの変異体/相同体からアミノ酸配列をアラインすることにより予測されうる。配列のアラインメントは、ここに記載されたように、業界で知られたコンピュータソフトを使って実施することができる。
【０１２７】
代替的に、そのようなポリヌクレオチドは、特徴配列の部位特異的突然変異誘発法により得ることができる。これは、例えば、ポリヌクレオチド配列が発現している特定の宿主細胞にコドンを選択的に備えるために、サイレントコドン配列の変更が必要となる場合に有用である。他の配列の変更は、制限酵素認識部位を導入する、またはポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの特性または機能を変えるために望まれることがある。
【０１２８】
ポリヌクレオチドは、プライマーを作りだすために用いられる。例えば、PCRプライマー、代替的増幅反応のためのプライマー、プローブ、例えば、放射性または、非放射性ラベルを用いる従来方法による標識のついたプローブ、またはポリヌクレオチドがベクターに複製される。このプライマー、プローブ、および他の断片は、その長さにおいて、少なくとも15、好ましくは少なくとも20、たとえば、少なくとも25,30または、40ヌクレオチドを持ち、これらもまた、ポリヌクレオチドの用語に含まれる。
【０１２９】
DNAポリヌクレオチドのようなポリヌクレオチド、およびプローブは、遺伝子組み換えにより合成、または当業者に取り利用可能などのような方法によっても作り出すことができる。また、これらは標準技法によりクローン複製することもできる。一般的にプライマーは、所望する核酸配列を、一つのヌクレオチドを一度に一つ作る段階的製作する合成法により作り出される。自動化された技法を使いこれを作り出す手法は、当業者に利用可能である。
【０１３０】
より長いポリヌクレオチドは、一般に、例えばPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)のクローン技術を用いる組換え方法により作りだされる。増幅DNAが、適当なクローンベクターに複製されるように、プライマーは適当な制限酵素認識部位を含むようにデザインされている。好ましくは、変異体配列は、少なくともここに記載されている配列と同程度に生物学活性がある。
【０１３１】
発明の好ましい実施の態様においては、PS4変異体のヌクレオチド配列（ここに記載されているヌクレオチドの相補配列を含む）とハイブリッド形成することのできる配列と相補的であるヌクレオチド配列のみならず、PS4変異体の核酸配列と相補的な配列や、またはPS4変異体のヌクレオチド配列（ここに記載されているヌクレオチドの相補配列を含む）とハイブリッド形成することのできる配列を含む。好ましい実施の態様においては、中程度から厳しい条件でここに記載の核酸配列とハイブリッド形成することができるポリヌクレオチド配列を提供する。
【０１３２】
好ましい実施の態様においては、厳しい条件（例えば、50℃および0.2ｘSSC）下で、PS4変異体核酸または、その補体とハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列を含む。より好ましくは、ヌクレオチド配列はPS4変異体のヌクレオチド配列、またはその補体と高度に厳格な条件（例えば、65℃および0.1ｘSSC）下で、PS4変異体の核酸配列とハイブリッド形成することができる。
【０１３３】
一旦、酵素をコードするヌクレオチド配列が分離され、または酵素をコードする推定ヌクレオチド配列が確認されたならば、酵素を作るために、配列を変異させることが望ましい。したがって、PS4変異体配列は親配列から作ることができる。変異は、合成オリゴヌクレオチドを用いて導入することができる。このオリゴヌクレオチドは、所望する変異部位の側面に位置するヌクレオチド配列を含む。一つの適切な方法は、Morinaga,et al..(Biotechnology (1984)2, p646-649)に記載されている。酵素をコードするヌクレオチド配列に変異を導入する他の方法はNelson and Long(Analytical Biochmistry (1989).180, p147-151)に記載されている。さらに、別の方法がSakar and Sommer(Biotechniques (1990), 8,p404-407,（The megaprimer method of site directted mutagenesis）に記載されている。
【０１３４】
好ましい実施の態様においては、ここに記載された方法および構成で用いれられる配列は、遺伝子組み換え配列、すなわち遺伝子組み換えDNA技術を用いて準備された配列である。かかる技術、例えば、J.Sambrook,E.F.Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Habour Laboratory Press.の文献に説明されている。
【０１３５】
３、発明の構成の詳細な説明
発明の第3の特徴は、変異ポリポリペプチドおよびこれらの組成物についての使用についてのみならず、マルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を持つポリペプチドの変異体であるポリペプチドを含む組成物を提供する。ここで組成物とは、他の組成物を含有するポリペプチド変異体を含む。
【０１３６】
発明の好ましい実施の態様においては、PS4変異ポリペプチド、および任意選択的に，更なる成分、または追加酵素、またはその両者を含む。PS4ポリペプチドに加え、例えば、食品、パン生地、食品材料、または、でんぷん成分に、一又は二以上の酵素が追加される。さらにパン生地に加えられる追加酵素は、α-アミラーゼ、プルラナーゼ、およびキシラナーゼ、のようなグリコシダーゼに加え、オキシドレダクターゼ、カルボン酸エステル結合を加水分解し、カルボン酸を放出するリパーゼ（例えば、リパーゼ(E.C.３.1.1．)）のような、また、トリアシルグリセロールリパーゼ(E.C.3.1.1.3),ガラクトリパーゼ(E.C.3.1.1.26)、フォスフォリパーゼA1(E.C.3.1.1.32),フォスフォリパーゼA2(E.C.3.1.1.4)),リポタンパク質リパーゼA2(E.C.3.1.1.34)のような、ヒドロラーゼ、およびエステラーゼ、を含む。マルトース酸化酵素、グルコース酸化酵素(E.C.1.1.3.4)、炭水化物酸化酵素、グリセロール酸化酵素、ピラノース酸化酵素、ガサクトース酸化酵素(E.C.1.1.3.10)、ヘキソース酸化酵素(E.C.1.1.3.5)、のようなオキシドレダクターゼ（酸化還元酵素）は、パン生地を強くし、焼いたパン製品の容量をコントロールするために用いられる。また、キシラナーゼおよび他のヘミセルラーゼはパン生地の取り扱いをより容易に改善し、パンの身を軟らかくし、その容量を増す。リパーゼは、パン生地を強力にし、またパン生地の身を軟らかくする。αアミラーゼおよび他のでんぷん分解酵素はパンの容量をコントロールし、さらにパンの身が堅くなるのを抑えるために、パン生地に加えられる。さらに加える追加酵素は、セルラーゼ、へミセルラーゼ、でんぷん分解酵素、プロテアーゼ、リポキシゲナーゼ、よりなる群から選択することができる。好ましい実施の態様においては、PS4変異ポリペプチドは，アミラーゼ、特にマルトース生成性アミラーゼ（maltogenic amylases）と組合せるのが望ましい。マルトース生成性α−アミラーゼ（グルカン １，４−αマルトヒドロラーゼ(E.C.3.2.1.133)）は、アミロースおよびアミロペクチンをα−配置のマルトースに加水分解することができる。
【０１３７】
Bacillus (EP120 693)に由来するマルトース生成性α−アミラーゼは、市場で調達が可能であり（Novo Nordisk A/S,Denmark）でんぷんの後退を抑える働きをするため、製パン業界において、広く老化抑制剤として用いられている（例えば、WO 91/04669 参照）。マルトース生成性α−アミラーゼはシクロデクストリングルカノ転移酵素（GCTases）と配列相同（Henrissat B,Bairoch A; Biochem J., 316, 695-696(1996)）および、トランスグリコシル化 製品（Christophersen C.,et al., 1997, Starch, vol.50, No.1, 39-45）の構成を含み、いくつかの点で共通の特徴を持っている。好ましい実施の態様においては、α−アミラーゼ、またはそのいずれの変異体とPS4変異ポリペプチドを含む組合せがある。
【０１３８】
そのような組合せは、ベーキングのような食品生産には有用である。米国特許US6,162,628に開示された、変異体、相同物、および変異体の変異種は −同特許に開示されている内容は全ては本願に引用として組み入れられる− ここに記載のPS4変異ポリペプチドと組み合わせて用いることができる。US6,162,128に記載されているどのポリペプチドも、特に配列番号１の変異体は、以下の（数１２）の一または二以上の対応する位置におけるものは、組み合わせて用いることができる。
【数１２】
【０１３９】
さらに、小麦粉、水、他の任意に選択した成分、添加物または、パン生地を改良する構成物を含むどのようなパン生地原料と共に追加することができる。追加酵素は、小麦粉、水、他の任意に選択した成分、添加物または、パン生地を改良する組成物を入れる前、または後に追加することができる。さらに、その酵素は、必要に応じて、液体で準備しても良くまた乾燥した形のものでも良い。
【０１４０】
パン生地を改良する組成分を含む酵素のいくつかは、小麦粉のパン生地の変形、流動、および/または、その機械加工性の改良への影響、および/または酵素を加えたパン生地から作られる製品の品質に対する影響が、追加的効果であるのみでなく、相乗的であるという範囲において、互いに相互作用を及ぼしあうことができる。パン生地から作られる製品（最終製品）の改良に関していえば、組み合わせの結果によりパンの身の構成に関して、本質的な相乗効果が見出せるといえる。また、焼いた製品の容量についても、相乗効果が見られるであろう。
【０１４１】
４．ベクター、細胞 及びPS4ポリペプチドの発現方法
第４の特徴として、本発明はPS4変異ポリペプチドを含むベクター、PS4変異ポリペプチドを含む細胞、及びPS4変異ポリペプチドを発現する方法を提供する。
【０１４２】
ここに記載されている方法及び構成物による使用されるヌクレオチド配列は、遺伝子組み換えによる複写可能なベクターに組み入れられる。ベクターは酵素の形で、互換性のある宿主細胞において、および/または宿主細胞から得るヌクレオチド配列を複製して、そして発現するために用いられる。その発現は、例えば、調整配列などの制御配列を用いて制御される。遺伝子組み換え宿主細胞から、ヌクレオチド配列発現により生み出された酵素は、配列及び、もしくは用いられるベクターに応じて、分秘されるか、細胞に内包される。コード配列は、特定の原核細胞、または、真核細胞膜を通じ、配列をコードする物質を分秘することを指示するシグナル配列を有するようにデザインされる。
【０１４３】
ポリヌクレオチドは遺伝子組み換え複製ベクターに組み入れることができる。ベクターは適合性のある宿主細胞において核酸を複製するのに用いられる。ポリペプチド配列を含むベクターは、適当な宿主細胞に変換される。適当な宿生は、バクテリア、イースト、昆虫、及び菌類細胞を含む。
【０１４４】
PS4変異ポリペプチド及びポリヌクレオチドは、ポリペプチドを複製ベクターに、ベクターを適合性のある宿主細胞に導入し、そしてベクターの複製を作ることのできる条件のもとで宿主細胞を成長させることにより発現することができる。ベクターは宿主細胞から回収される。
【０１４５】
PS4核酸は、対象となっている宿主細胞において活性のある、転写、翻訳、調整要素とその活性がリンクされている。PS4核酸はまた、たとえばシュワソニノシーセス オキシデンタリス（Shwanniomyces occidentalis）に由来する、グルコアミラーゼ遺伝子、また、サッカロミーセス セレビシア（Saccharomyces cerevisiae）に由来するα因子接合タイプ遺伝子、及びアスペルシラス オリジー（Aspergillus oryzae）由来のTAKA アミラーゼのようなシグナル配列を含む融合たんぱく質をコードすることもある。代替的に、PS4核酸は細胞膜を結合するドメインを含む融合たんぱく質をコードすることもある。
【０１４６】
PS4変異体は、発現ベクターを用いることにより、宿生生物において望ましいレベルにおいて発現することができる。PS4核酸を含む発現ベクターは選択された宿生生物における、PS4核酸をコードする遺伝子を発現させるどのようなベクターであってもよく、そしてベクターの選択は、それが導入される宿生細胞によって異なる。したがって、ベクターは自動的に複製するベクター、すなわち、エピソーム体として存在するべクターであり、その複製物は、たとえば、プラスミド、バクテリオファージ、または、エピソマル要素、小染色体、または人工的染色体のような、染色体による複製とはまったく独立したものである。代替的に、ベクターは、宿主細胞に導入された場合に宿主細胞ゲノムと一体となり、染色体と共に複製されるものでもよい。
【０１４７】
発現ベクターは、典型的には、例えば、選択された宿生生物において、ベクターの自動複製を許す要素であるクーロンべクターの構成部分、及び、選択のために発現型の検知可能な、１又は２以上のマーカーを持っている。発現ベクターは、通常、プロモータ、オペレータ、リボソーム結合サイト、翻訳開始シグナル、及び任意選択的に抑制遺伝子、または,１又は２以上の活性遺伝子をコードする制御ヌクレオチド配列を含む。さらに、発現ベクターは、ぺロオキシソームのように宿主細胞小器官に、または、特定の宿主細胞区画を標的として、PS4変異体を向けることのできるアミノ酸配列をコードする配列を含む。そのような標的配列は、これに限定されるものではないが、SKL配列を含む。制御配列の指示下での発現では、核酸配列PS4変異体は、発現との関係において、作業可能なように適当な方法により制御配列と連結されている。
【０１４８】
好ましくは、ベクターのポリヌクレオチドは、宿主細胞によりコード配列の発現を提供することのできる制御配列に作業可能なようにリンクされている。すなわち、ベクターは発現ベクターである。制御配列は、たとえば、更なる転写調整要素を追加することにより、転写活性調節因子により反応する制御配列によって転写レベルを指示できるように、制御配列を修飾することができる。制御配列は特にプロモータを含む場合がある。
【０１４９】
ベクターにおいては、PS4変異ポリペプチドをコードする核酸配列はひとつの、適当なプロモータ配列と、作動可能になるように組合されている。プロモータは、選択された宿生生物における転写活動をする何れのDNA配列でもよく、宿生生物と相同または非相同である遺伝子に由来することができる。PS4核酸ような、宿生バクテリアにおいて修飾されたヌクレオチド配列の転写を指令するプロモータの適当な例として、例えば、以下のものがある。E.coliのＬａｃオペロン（lac operon）のプロモータ、ストレプトマイセス コリコロー アガラーゼ（Sytreptomyces coelicolor agarase）遺伝子dagA プロモータ、バシラス リケニフォルムス（Bacillus licheniformis） α-アミラーゼ遺伝子（amyL）プロモータ、バシラスサブティリス（Bacillus subtilis）のaprEプロモータ、バシラス ステアロテモフィラス マルトース生成性アミラーゼ、(Bacillus stearothemophilus maltogenic amylase 遺伝子 (amyM))のプロモータ, バシラス アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens） α-アミラーゼ遺伝子（amyQ）プロモータ、バシラス サブティリス（Bacillus subtilis）xylA and xylB 遺伝子プロモータ、及び、P170を含むラクトコッカス種由来（Lactococcus sp-derived ）プロモータから得られるプロモータ。PS4変異ポリペプチドをコードする遺伝子が、E.coli.のようなバクテリア種において発現される場合、たとえばＴ７プロモータ、およびラムダファージ(Phage lambda) プロモータを含むバクテリオファージプロモータから適当なプロモータを選択することができる。菌種の転写における有用なプロモータの例としては、以下をコードする遺伝子に由来するものがある、すなわち
アスペルギラス オリジー（Aspergillus oryzae） TAKA アミラーゼ、リゾムコールミーヘイ アスパラギン酸プロティナーゼ、（Rhizomucor miehei aspartic proteinase）、アスペルギラス ニジェール（Aspergillus niger）中性α-アミラーゼ、アスペルギラス ニジェール（Aspergillus niger） 酸安定性α-アミラーゼ、アスペルギラス ニジェール グルコアミラーゼ（Aspergillus niger glucoamylase,）、リゾムコールミーヘイリパーゼ（Rhizomucor miehei lipase） リパーゼ、アスペルギラス オリジーアルカリプロテアーゼ（Aspergullus oryzae alkaline protease）、アスペルギラス オリジートリオース フォスフェートイソメラーゼ（Aspergilus oryzae triose phosphate isomerase）,または アスペルギラス ニドランアセトアミラーゼ（Aspergillus nidulans acetamidase）。イースト種に置ける発現の適当なプロモータの例としては、これに限定するものではないが、サッカロミーセス セレヴィジー（Saccharomyces cerevisiae）のGal 1, Gal 2のプロモータ、及びピキア パストリス（Pichia pastoris） AOX1 またはAOX2 プロモータがある。
【０１５０】
適当なバクテリア宿生生物の例として、グラム陽性のバクテリア種、たとえば、バシラス サブトリス（Bacillus subtilis）, バシラス リチェニフォルミス（Bacillus lichniformis）, バシラス レントス （Bacillus lentus）, バシラス ブレビス（Bacillus brevis）,バシラス ステアロテルモフィラス（Bacillus stearothermophilus）, バシラス アルカロフィラス （Bacillus alkalophilus）,バシラス アミリリクファシーン（Bacillus amylilique- faciens）バシラス コアグルン（Bacillus coagulans）,バシラス ランツス（Bacillus lautus）,バシラス メガテリウム（Bacillus megaterium） 及バシラス トルギエンシ（Bacillus thurungiensis）, のようなバシラセ種（Bacillaceae）、ストレプトミーセス ムリナス（Streptomyces murinus）,のようなStreptomyces種、ラクトコカス ラクチス（Lactococcus lactis） のようなラクトコカス種（Lactococcus spp）.を含む乳酸菌種、ラクトバシラスロイテリ（Lactobacillus reuteri）を含むLactobacillus spp.,ロイコノストク（Leuconostoc spp）,ペディオコッカス（Pediococcus spp）.及びStreptococcus spp.がある。代替的に、E.coli を含むエントロバクテリアシー（Enterobacteriaceae） または、シュードモナダシー（Pseudomonadaceae）に属するグラム陰性バクテリア種は宿生生物として選択することができる。適切なイースト宿生生物は、以下のイースト種に限定されることなく、生物工学的に関連する以下のイースト種、例えば、Pichia sp.Hansenula sp., または、クリベロマイセス（Kluyveromyces）,ヤロウイーナ（Yarrowinia種）、または Sacchromyces cerevisiaeを含むSaccharomyces、または、たとえば、エスポンベ（S.Pombe 種）のようなスキゾサッカロミーセース（Schizpsaccharomyce） に属する種 から選択することができる。好ましくは、メチロトロフィックイースト種ピキアパストリス（Pichia pastoris種）は宿生生物として用いられるのが望ましい。好ましくは宿生生物はハンセヌーラ（Hansenula 種）であることが望ましい。繊維状細胞の中の適切な宿生生物はアスペルギラス（Aspergillus種）、例えば、アスペルギラス ニジェール（Aspergillus niger）, アスペルギラス オリギー（Aspergillus oryzae）, アスペルギラス ツビンゲンシス（Aspergillus tubigensis）,アスペルギラス アワモリ（Asperguillus awamori）,またはアスペルギラス ニドラン（Aspergillus nidulans）,であることが望ましい。代替的に、例えば、フサリウム オキシポール（Fusarium oxysporum）のようなフサリウム（Fusarium種）または、リゾムコール、ミーヘイ（Rhizomucor miehei） のようなリゾムコール（Rhizomucor 種）の菌は宿生生物として使うことができる。他の適当な菌株としてはテモミーセス（Themomyces）、及びムコール（Mucor種）を含む。
【０１５１】
ポリペプチドを発現させるために、-変異PS4ポリペプチド、その断片、その相同物、その変異体、またはそれの誘導物のような、ポリヌクレオチドを含む宿主細胞が使われる。宿主細胞は、たんぱく質の発現を起こすのにふさわしい条件下で培養される、ポリペプチドの発現は、恒常的なものであり、ポリペプチドは継続的に生産され、発現開始のため誘導され、その刺激を必要とする。誘導発現の場合には、たんぱく質の生産は、例えば、デキサメタゾン、または、IPTGのような培養培地へ、例えば必要な場合に誘導物質を加えることにより開始される。ポリペプチドは、酵素、化学品および/または浸透圧溶解及び物理的破断を含む公知の様々の技法により、宿主細胞から抽出することができる。ポリペプチドは、また、TnTTM（Promega）ウサギの網状赤血球システムのような、生物外で、細胞を使わないシステムにより遺伝子組み換えによって作り出すこともできる。
【０１５２】
５．使用
以下の記載、及び例示において、文意より他の意に解されない限り、PS4変異ポリペプチドの投与量は、小麦粉の百万分の一(１グラム当たり百万分の一グラム)とする。例えば、表２中の「１Ｄ３４」はsSac-D34の百万分の一の部分をいう。
【０１５３】
ここに記載のPS4置換変異体は、親酵素が適しているあらゆる使用の目的に用いられる。特に、エクソマルトテトラヒドロラーゼのどのような応用例にも使用できる。極めて好ましい実施の態様においては、それらは、より高い熱安定性、より高いエクソアミラーゼ活性、より高い対pH安定性、またはこれらの何れかも組み合わせ対して、更なる有利な効果を持っている。PS4変異ポリペプチド及び核酸に適した使用例には、食品材料の製造のみならず、特にパンを焼くことを含み、食品の製造を含んでいる。具体例は、以下に詳細に記載する。
【０１５４】
以下のシステムは、ここに記載した方法、及び構成に対応した方法の使用に適したマルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を持つポリペプチドの特徴を示すために用いる。このシステムは、例えば、ここに記載したPS4親、または変異ポリペプチドの特徴を示すために用いる。
【０１５５】
導入のための背景情報として、ろう様（waxy）メイズアミロぺククチン（WAXILYS 200の商品名でRoquette, Franceから入手可能）は非常に高いアミロペクチン含有量（９０％以上）を持つでんぷんである。20mg/mlのろう様メイズでんぷんを50mM MES、2-(N-モルフォリノエタンサルフォニック酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid),2mM塩化カルシウム、pH6.0の緩衝液中で３分煮て、そしてその後50℃の温度で培養して30分以内に使用した。
【０１５６】
一単位のマルトース非生成性エクソアミラーゼとは、上記で述べたように、10mg/mlろう様メイズでんぷんを50mM MES,2mM塩化カルシウム、pH6.0で準備したもの4mlを５０℃で試験管で培養したばあい、1分間に１μモルの砂糖を還元するのに等しい加水分解製品を生み出す酵素の量として定義される。砂糖の還元はマルトースを標準にとり、Bermfeld,Methods Enzymol(1954), l, 149-158のジニトロサリチル酸を使うか、または、砂糖の還元を定量化する他の公知の方法も用いることができる。
【０１５７】
マルトース非生成性エクソアミラーゼの製品の加水分解パターンは、上述のように、緩衝液で準備した10mg/mlろう様メイズでんぷんを、４mlを試験管中で、マルトース非生成性エクソアミラーゼ0.7単位により、15−300分、50℃で培養することにより定める。反応は、試験管を沸騰槽に3分間沈めて停止させる。
【０１５８】
加水分解製品は、酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、及び水を溶離液として、Dionex PA 100カラム を用いるHPLC陰イオン交換により、パルスアンペアメータ探知により、グルコースからマルトヘプタオースの、公知の直線状マルトオリゴ糖を標準として解析及び定量化する。マルトオクタオースからマルトデカオースに用いられるレスポンスファクターはマルトヘプタオースのものと同じである。
【０１５９】
好ましくは、PS4親ポリペプチド（及びPS4変異ポリペプチド）はマルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を持っている。そのため、もしマルトース非生成性エクソアミラーゼ0.7単位量で50mM 2-(N-モルフォリノエタンスルホン酸(2-(N-morpholino)ethane sulfonic acid)、及び2mM塩化カルシウムを含む緩衝液mlあたり,予めボイルした10mgのろう様メイズでんぷんの水溶液4ml中で、50℃、pH6.0で15分間培養をしたとき、酵素は、2から10 D-グルコピラノシル単位、及び任意的にグルコースをもつ、一もしくは、それ以上の直線状マルトオリゴ糖よりなる加水分解製品を作り出すと思われる。そして、2から10 D-グルコピラノシル単位、及び任意的にグルコースからなる加水分解製品は、その少なくとも60重量％、少なくとも70重量%, 少なくとも80重量%,少なくとも85重量%は、3から10 D-グルコピラノシル単位の直線状マルトオリゴ糖からなり、好ましくは、4から8 D-グルコピラノシル単位からなる直線状マルトオリゴ糖からなる。
【０１６０】
説明を容易にするため、及び、本発明の目的を明らかにするために、50mM 2-(N-モルフォリノエタンスルホン酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)、及び２mM 塩化カルシウムを含む緩衝液mlあたり、予めボイルした10mgのろう様メイズでんぷんを含む水溶液の4ml中で、50℃、pH6.0条件下で15分間、0.7単位量のマルトース非生成性エクソアミラーゼで培養をすることを、「ろう様メイズでんぷん培養試験」という。
【０１６１】
したがって、別の発現をすると、好ましい、マルトース非生成性エクソアミラーゼは以下のような特徴を持っている。すなわち、ろう様メイズでんぷん培養試験において、2から１０ D-グルコピラノシル単位、及び任意的にグルコースからなる１又は２以上の直線状マルトオリゴ糖からなる加水分解製品を生みだす能力を持ち、その加水分解製品は重量で少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、最も好ましくは少なくとも85％は、3から10 D-グルコピラノシル単位、好ましくは、4から８ D-グルコピラノシル単位、からなる直線状の、マルトオリゴ糖からなるのが望ましい。
【０１６２】
ろう様メイズでんぷん培養試験における加水分解製品は、１又は２以上の2から10 D-グルコピラノシル単位、及び任意的にグルコースからなる直線状マルトオリゴ糖を含む。ろう様メイズでんぷん培養試験は、また他の加水分解製品も含む。しかし、3から10 D-グルコピラノシル単位からなる直線状マルトオリゴ糖の重量％は2から10 D-グルコピラノシル単位及び任意的にグルコースからなる１又は２以上のマルトオリゴ糖、からなる加水分解製品の量をベースとするものである。換言すると、3から１０ D-グルコピラノシル単位からなる直線状マルトオリゴ糖の重量％は2から10 D-グルコピラノシル単位、及びグルコースからなる １又は２以上の直線状マルトオリゴ糖以外の加水分解製品をベースとするものではないということである。加水分解製品は、どのような適切な方法によっても分析してもよい。例えば加水分解製品は、パルスアンメーター探知方式のDionex PA100コラムを用いる陰イオン交換HPLCを用いて、また、例えば、グルコースからマルトへプタオースの場合の公知の直線状マルトオリゴ糖を標準として分析することができる。
【０１６３】
好ましくは、ここに記載されたPS4変異体は、パンを焼いている間、そして約55℃で開始するでんぷん粒のゼラチン化の間、及びその後においてでんぷんを加水分解する。より熱安定性があればある程マルトース非生成性エクソアミラーゼは活性が長く、より高い老化抑制効果を示す。しかしながら、約85度以上で焼くと酵素は不活性となる。この状態が発生するとマルトース非生成性エクソアミラーゼは次第に活性を失い、焼く工程終了後にパン製品となったときには実質的に活性は見られなくなる。したがって、好ましくは、ここに記載した、マルトース非生成性エクソアミラーゼの適切な使用方法としては、50℃以上98℃以下の最適な温度で使用するのが望ましい。
【０１６４】
エクソ特異性は、全エンドアミラーゼの活性に対する全アミラーゼの活性を決めることにより有用に測定される。この書類においては、この比率は、エクソ特異性指数（exo-specificity index）として表されている。好ましい実施の態様においては、酵素は、そのエクソ特異性指数が2０以上,すなわち、全アミラーゼ活性（エクソアミラーゼ活性を含む）が、そのエンドアミラーゼ活性より２０倍以上ある場合、エクソアミラーゼと考えられる。極めて好ましい実施の態様においては、エクソアミラーゼのエクソ特異性指数は30以上、40以上、50以上、60以上、70以上、80以上、90以上、100以上ある。極めて好ましい実施の態様においては、エクソアミラーゼのエクソ特異性指数は150以上、200以上、300以上、400以上である。
【０１６５】
全アミラーゼの活性及びエンドアミラーゼ活性は、どのような公知の方法でも測定することができる。例えば全アミラーゼ活性はでんぷん基質から開放された還元末端の全数をアッセイして、測定する。代替的にBetamyl評価の使用が実施例において、さらに詳細に記載されている。便宜のために、実施例でアッセイされたアミラーゼの活性が（表）及び（図）にBetamyl単位で記載されている。
【０１６６】
エンドアミラーゼ活性は、Phadebas キット（Phaemacia and Upjohn）を用いてアッセイすることができる。これは、青標識の架橋（crosslinked）でんぷん（アゾ染料の標識表示）を利用する；でんぷん分子中の内部での切断が標識を開放し、外部の切断はその様に作用しない。染色の開放はスペクトロフォトメトリーにより測定する。したがってPhadebasキットは、エンドアミラーゼ活性を測定する。便宜のため、そのようなアッセイ（実施例に記載されている）の結果はこの書類中では、「Phadebas 単位」と呼ぶ。
【０１６７】
したがって、好ましい実施の態様においては、エクソ特異性指数はBetamyl単位/Phadebas単位で表されている。
【０１６８】
エクソ特異性はまた、先行技術、例えば、公表番号 WO99/50399に記載された方法によりアッセイすることもできる。この方法は、エクソ特異性をエクソアミラーゼ活性とエンドアミラーゼ活性の比率を対比することにより測定する。したがって、好ましい特徴的な場合として、ここに記載されたPS4変異体は、単位あたりのエクソアミラーゼ活性に対し、エンドアミラーゼ活性が０．５単位（EAU）以下である。好ましくは、本発明における使用法として適しているマルトース非生成性エクソアミラーゼ活性単位当り0.05EAU以下であり、より好ましくは、単位当たりエクソアミラーゼの活性に対して、0.01EAU以下である。
【０１６９】
PS4変異ポリペプチド、核酸、宿主細胞、発現ベクターなどはアミラーゼが用いられるどのような用途にも用いることができる。特に、どのマルトース非生成性エクソアミラーゼの代替として用いることができる。それらは単独で、または、公知のアミラーゼ、またはマルトース非生成性エクソアミラーゼと組み合わされて、アミラーゼ、またはマルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を補うものとして使用されうる。
【０１７０】
ここの記載したPS4変異体配列は、例えば、パン製品、飲料製品等、食品産業で様々に応用することとができる。また、薬品の組成物として、さらには化学工業のような分野においても応用できる。特にPS4変異ポリペプチド及び核酸は、ベーキング（WO99/50399で開示されているように）及び、小麦粉の標準化（増量または改良）を含む様々な産業において有用に使用される。でんぷんおよび他の基質からマルトテトラオースを作るのに用いられる。
【０１７１】
PS4変異ポリペプチドは、パンのような製パン製品の容積を増すために用いられる。したがって、PS4変異ポリペプチドを含む、またはそれにより処理された食品製品は、PS4変異ポリペプチドで処理されていない、または、親ポリペプチドで処理された製品と比べ、容積が膨らんでいる。換言すると、そのような食品製品は、製品単位容積当り、より多くの空気を含むのである。代替的に、または追加的にPS4変異ポリペプチドにより処理された食品製品は、容積あたりに対する密度または重量（質量）が小さい。特に好ましい実施の態様においては、PS4変異ポリペプチドは、パンの容積を増やすために用いられる。容積を増やす、または膨張させることにより食品の粘り感や、糊状の感じを減少させるからである。軽い食品が消費者に好まれ、消費者の嗜好の幅は拡大する。好ましい実施の態様においては、PS4変異ポリペプチドは、容積を10％、20％、30％、40％、50％、またはそれ以上増加させる。
【０１７２】
ここに記載したPS4変異ポリペプチド及び核酸は食品として、またはその準備工程に用いられる。特に食品に添加、すなわち、食品添加物として用いられる。好ましいケースとしては、人の消費用の食品として用いられる場合である。食品は、その使用、応用、または管理の形態により、液状または固体の形をとる。
【０１７３】
PS4変異ポリペプチド及び核酸は、食品成分としてもちいられる。ここに記載された、PS4変異ポリペプチド及び核酸は補助食品として、または補助食品に添加されるものである。ここに記載されたPS4変異ポリペプチド及び核酸は、機能食品として、または機能食品に添加することができる。
【０１７４】
PS4変異ポリペプチドはまた、食品、または食料品の製造にも用いられる。典型的な食料品としては、酪農製品、肉製品、家禽製品、魚加工品、及びパン生地製品を含む。パン生地製品は、油で焼いた、油で揚げた、ローストした、焼いた（baked）、蒸気蒸しパン及びライスケーキのような蒸気で蒸した、及び茹でた生地を含むあらゆる製品を含む。極めて好ましい実施の態様においては、食料品は、パン製品である。
【０１７５】
好ましくは、食料品はパン製品である。典型的なパン（焼いたーbaked）製品には、食パン、ロール（roll）,ロールパン（bun）、ピザの生地など、ペーストリー、プレッゼル、トルティーヤ、ケーキ、クッキー、ビスケット，クラッカー等がある。
【０１７６】
PS4変異体タンパク質は、でんぷんゲルのような、でんぷん培地の老化を遅らせることができる。PS4変異ポリペプチドは、特にでんぷんの欠点である老化を遅らせることができる。
【０１７７】
したがって、食品製造のどのプロセスにおいても、例えば、パンを焼く最中、または焼いた後に、ここに記載のPS4変異ポリペプチドをでんぷんに添加した場合、でんぷんの老化を遅らせ、またはその老化速度を遅らせることができる。以下、さらにこの使用について詳細に記載する。
【０１７８】
ここに記載したマルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を持つPS4変異ポリペプチドの老化抑制効果の評価のために、パンの身の硬さを、焼き上げ後、１、3，および７日後にInstron 4301 Universal Food Texture分析器、または公知の同様の機器により測定することができる。
【０１７９】
マルトース非生成性エクソアミラーゼ活性を持つPS4変異ポリペプチドのでんぷん老化を遅らせる効果を評価する、従来から用いられている他の公知の方法は、DSC(示差操作熱量測定法)に基づくものがある。この場合、パンの身、または、酵素を用いた、または、酵素（コントロール）なしで焼いたモデルシステム生地のパンの身のアミロペクチン退化の融解エントロピーを測定する。実施例で用いた、DSC機器は、Mettler-Toledo DSC820で、20−90℃の間で、温度勾配を10℃/分に設定した。サンプル準備として、パンの身10−20mgが計量され、Mettler-Toledoアルミパンに移され、そしてシールで密封される。
【０１８０】
ここに記載の実施例で使用されるモデルシステムパン生地は、標準小麦粉と適量の水、または、マルトース非生成性PS4変異体エクソアミラーゼを含む、または含まない緩衝液を含む。これらは10g、または50g Brabender Farinographで6、または7分間、それぞれ混合される。パン生地のサンプルを蓋のあるガラス試験管（15x0.8cm）にとり、試験管は水槽に入れて、ベーキング工程に付される。まず33℃で30分培養され、続いて分あたり1.1℃の温度勾配条件で、33℃から95℃に加熱される。そして、最終的に95℃で5分間培養する。次に、DSC分析の前に、試験管はサーモスタットに20℃で保管される。
【０１８１】
好ましい実施の態様においては、ここに記載したPS4変異体は「コントロール」に比べて、融解エントルピーが減少している。極めて好ましい実施の態様においては、PS4変異体は10％以上に融解エンタルピーが減少している。好ましくは、それは、コントロールに比べ、20％以上、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、またはそれ以上に融解エンタルピーが減少している。
【表２】
【０１８２】
上記の表2は、７日間保管した後、小麦粉に対して、PSac-D34を各百万分（グラム当たり百万分の一グラム）の0.5、１及び２を投与したパン生地モデルシステムのDSC値を示している。
【０１８３】
PS4変異ポリペプチドは、食品、特にでんぷん製品の製造のために用いることができる。その方法は、PS4変異ポリペプチドのようなマルトース非生成性エクソアミラーゼ酵素をでんぷん培地に加えることによりでんぷん製品を作り出すことを含む。でんぷん培地が、パン生地の場合、パン生地は、小麦粉、水、PS4変異ポリペプチドであるマルトース非生成性エクソアミラーゼ，及び任意的に選択される他の成分、及び添加物を混合して作る。
【０１８４】
好ましくは、粉は、小麦粉、ライ麦粉、またはそれらの混合物である。しかし、他の種類の穀物、例えば、米、メイズ、大麦、及びアズキモロコシから得られる粉を含むパン生地も考えられる。好ましくは、でんぷん製品は、焼いた（baked）製品である。好ましくは、でんぷん製品は、パン生地製品である。さらに好ましくは、でんぷん製品は、焼いたでんぷん質のパン製品である。
【０１８５】
したがって、もし、でんぷん製品が焼いたでんぷん質のでんぷん製品であれば、その工程は、−適切であれば、その順序は問わないー小麦粉、水、及び発酵物資をパン生地を形成する条件で混合し、さらにPS4変異ポリペプチドを加えるが、任意選択的に、混合済みの混合物の形で追加することを含む。発酵物質は、重曹のような化学物質，または、サッカロミーセス・セレヴィシエ（出芽酵母）（Baker’s Yeast）種であればいずれでも良い。
【０１８６】
PS4変異体マルトース非生成性エクソアミラーゼは、水を含むどのようなパン生地成分、パン生地成分の混合、またはどのような添加物、または、添加物の混合物とともに加えることができる。パン生地は、製パン業で、または、小麦粉のパン生地をベースとする製品を作るどのような他産業で、通常用いられている、従来のパン生地製造法によりつくることができる。
【０１８７】
好ましい実施の態様においては、パン製品を作る工程は以下をふくむ；（a）でんぷん培地を準備する、（b）でんぷん培地にこの書類に記載したPS4変異ポリペプチドを加える、(c)パン製品を製造するために（ｂ）プロセスの間、またはその後にでんぷん培地を加熱する。パン製品を作るプロセスの他の好ましい実施の態様としては、でんぷん培地にここに記載のようなPS4変異ポリペプチドを加えることを含む。
【０１８８】
マルトース非生成性エクソアミラーゼPS4変異ポリペプチドは液体状、または、唯一の活性を持つ構成物としての酵素を含むか、または、１又は２以上のパン生地成分、またはパン生地添加物との混合物を含む乾燥粉末状の組成物の形で加えることができる。
【０１８９】
他の好ましい実施の態様においては、焼いている間に、パン及びパン生地を改良させるような組成物を用いる方法である。更なる実施の形態においては、パン、またはパン生地を改良する組成物から得られる、焼いた製品、またはパン生地を提供することである。他の実施の態様においては、パン、またはパン生地を改良する組成物を使用することにより得られる、焼いた製品、またはパン生地を提供することである。
【０１９０】
パン生地は、小麦粉、水、PS4変異ポリペプチド（上に記載）を含むパン生地改良組成物及び任意選択的な他の成分、及び添加物を混合して作る。
【０１９１】
パン生地改良組成物には、小麦粉、水または他の任意選択的成分、あるいは添加物を含むどのようなパン生地成分とともに加えることができる。パン生地改良組成物は、小麦粉、水または他の任意選択的成分あるいは添加物の前に加えることができる。パン生地改良組成物は、小麦粉、水または他の任意選択的成分あるいは添加物の後に加えることができる。パン生地は、製パン業、または小麦粉パン生地をベースとする製品製造業で、従来普通に用いられるパン生地の製法より作ることができる。
【０１９２】
パン生地改良組成物は、液状、または唯一の活性構成物として、または一又は二以上のパン生地成分あるいは、添加物と混合したものを含んだ乾燥粉末状の形で加えることができる。
【０１９３】
添加されるPS4変異ポリペプチドマルトース非生成性エクソアミラーゼの量は、最終パン生地製品において、通常、小麦粉１kg当たり50から100,000単位、好ましくは、100−50,000単位存在する量である。好ましくは、小麦粉１kg当たり200−20,000の範囲である。
【０１９４】
本稿の説明においては、マルトース非生成性エクソアミラーゼ１単位は、以下に記すように、ボイルした10mg/mlのろう様メイズでんぷんを、50ｍM MES,２mM 塩化カルシウム,pH6.0の溶液4mlを入れた試験管中で、50℃で、培養したときに、分当たり１μモルの砂糖を還元するに相当する加水分解製品を放出する酵素の量として定義される。
【０１９５】
ここに記載した、パン生地は、通常，小麦全粒粉、または小麦粉、および/またはコーン粉末、コーンでんぷん、メイズ粉、米粉、ライ麦全粒分、ライ粉、オート分、オート全粒粉、大豆粉、モロコシ全粒粉、モロコシ粉、ポテト全粒粉、ポテト粉または、ポテトでんぷんのような、他の種類の全粒分、粉末、またはでんぷん、を含む。パン生地は生、冷凍、または半焼き状態を含む。
【０１９６】
パン生地は、膨張したパン生地であっても、その後に膨張するパン生地であってもよい。パン生地は、種々の方法で膨張することができる（例えば、重曹のような化学的膨張剤の添加によるか、または、イースト（膨張しているパン生地）の添加による）。しかし、好ましくは、例えば、商業的に入手可能なサッカロマイセス・セレヴィシエ（出芽酵母）（パン製造イースト）種のようなサッカロマイセス・セレヴィシエを培養した適当なイースト菌を加えることにより発酵させるのが望ましい。
【０１９７】
パン生地は、粒状の脂肪またはショートニングを含むこともある。パン生地は、さらにモノ-またはジ-グリセリド、脂肪酸の糖エステル、脂肪酸のポリグリセロールエステル、モノグリセリドの乳酸エステル、モノグリセリドの酢酸エステル、ステアリン酸ポリオキシエチレン、またはリソレシチンのような乳化剤を含むこともある。
【０１９８】
他の実施の態様においては、ここに記載されたような組合せと、小麦粉を含む事前に混合されたものがある。事前混合材料は、例えば、ここに記載した酵素を含む、いずれかの添加物のような他のパン生地、および/またはパン製品の改良のための添加物を含む。
【０１９９】
焼いた製品の特性をさらに向上させ、製品に他と異なる品質を付与するために、パン生地に、さらにパン生地成分、および/または添加物を含ませることできる。典型的な例として、そのような追加構成物には、塩、穀物、脂肪および油，砂糖、およびスイートナー、ダイエット繊維、粉ミルク、大豆グルテン、あるいは卵のようなタンパク質源、乳化剤、他の酵素、浸水コロイド、調味料、酸化剤、ミネラルおよびビタミンのようなパン生地添加物を含む。
【０２００】
乳化剤は、パン生地強化剤、およびパン生地の身を軟らかくする軟化材として有用である。乳化剤は、パン生地強化剤として、寝かせる間の緩衝材として、またふんわりとさせる間のショックを和らげる材料として使うことができる。さらに、パン生地強化剤は、発酵の間に、パン生地に様々なバリエイションを与えるという幅を持たせる。パン生地強化剤のほとんどは、またオーブンで弾力を増す、すなわちこれは、発酵した状態から焼いた商品になる間に容量が増すことを意味する。最後に、パン生地強化剤は、混合レシピ中のあらゆる脂肪を乳化する。
【０２０１】
乳化剤としてふさわしいものとして、以下のものが含まれる。すなわち、レシチン、スレアリン酸ポリオキシエチレン、食用脂肪酸のモノ、およびジグリセリドの酢酸エステル、食用脂肪酸のモノ、およびジグリセリドの乳酸エステル、食用脂肪酸のモノ、およびジグリセリドのクエン酸エステル、食用脂肪酸のモノ、およびジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、食用脂肪酸のモノ、およびジグリセリドのショ糖エステル、ナトリウム ステアロイル２−ラクチレート（sodium stearoyl-2-lactylate）及びカルシウムステアロイル２−ラクチレート（calcium stearoyl-2-lactylate）である。
【０２０２】
さらに、パン生地添加物、または成分として、どのようなパン生地成分であっても共に加えることができるものとして、小麦粉、水、他の任意の選択成分、または添加物、あるいはパン生地、改良組成物を含む。さらに、パン生地添加物または成分を小麦、水、他の任意の選択成分、または添加物、あるいはパン生地改良組成物を加える前に、これらを添加することができる。さらに、これらのパン生地添加物または成分は小麦、水、他の任意の選択成分、または添加物、あるいはパン生地改良組成物を加えた後に、添加することができる。
【０２０３】
この様に追加するパン生地の添加物、または成分は、液状のものが使用に便利である。しかし、これらは乾燥した形で使用することが便利なこともある。
【０２０４】
このようなパン生地の追加添加物、または、成分は、好ましくはパン生地内の小麦粉の構成重量の少なくとも１％である。さらに好ましくは、その量は少なくとも２％、好ましくは少なくとも３％、好ましくは少なくとも４％、好ましくは少なくとも５％、好ましくは少なくとも６％である。もし添加物が脂肪酸の場合は、特徴的な場合、脂肪酸は、１％から５％、典型的には、１〜３％、さらに典型的には約２％存在する。
【０２０５】
他の使用方法については、また整理番号674510-2007,およびGC806Pに記載されている。これらは全て、図面、図表を含み引用として、本明細書に含まれる。
【実施例】
【０２０６】
実施例 １ PS4のクローニング
シュードモナス サッカロフィリアはLB培地上で一夜生成され、染色体DNAは標準的方法（Sambrook J, 1989）により分離される。PS4オープンリーディングフレーム（読み取り枠）（Zhou etal., 1989）を含む2190 bp断片は、プライマーP1およびP2（表3参照）を用いるPCRにより、シュードモナス サッカロフィリア染色体DNAから増幅される。得られる断片は、プライマーP3およびP4と共に、入れ子PCRにおいて鋳型（template）としてもちいられ、そのシグナル配列なしでPS4オープンリーディングフレームを増幅し、遺伝子の５’末端にNcoIサイト、および３’末端のBamHIサイトに導入する。NcoIサイトとともに、N末端メチオニンにコドンが導入され、PS4の細胞内発現を可能にする。1605bp断片はｐCRBLUNT TOPO（インビトロゲン社）に複製され、構成物の完全性が、配列分析により確かめられる。大腸菌（E.coli Bacillus）シャトルベクターｐDP66K（Penninga et al.,1996）は、P32プロモータおよびctgaseシグナル配列のコントロール下で、PS4が発現するように修飾される。結果として得られるプラスミドｐＣＳｍｔａを、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに形質転換する。
【０２０７】
第二の発現の構成は、PS4のでんぷん結合ドメインが除かれている場合である。pCSmtaのプライマP3およびP6によるPCRでは、他mtaの切断遺伝子型が生み出される。pCSmtaの完全長を持つmta遺伝子は、pCSmta-SBDプラスミドとなる切断型に取って代わられる。
【０２０８】
実施例2 PS4の部位特異的突然変異誘発法
突然変異は、2つの方法によりmta遺伝子に導入される。2段階のPCRをベースとする方式、またはQuick Exchange 法(QE)である。便宜のために、mta遺伝子は３つの部分に分割される。すなわち、PvuI-FspI, FspI-PstI, PstI-AspI断片であり、以下、それぞれ断片1，2および3という。
【０２０９】
２段階のPCRに基づく方法においては、変異はPfu DNAポリメラーゼ（ストラテジーン社）を用い導入される。最初のPCRは、コードする鎖についての変異プライマ（表４）、および、下位鎖の下流プライマ（表３の２Rまたは３R）で実行される。反応生成物は、第2のPCRステップでコード鎖における上流プライマとともにプライマとして使用される。最終反応の生成物は、pCRBLUNT topo（インビトロゲン社）にクローンされ、シークエンシングの後に、断片はpCSmtaの対応する断片と交換される。
【０２１０】
Quick Exchange法（ストラテジーン社）においては、変異はmta遺伝子、またはmta遺伝子の部分を含むプラスミドに、PCRにおける2つの相補的プライマを用い導入される。
【０２１１】
この目的のために、３SDMプラスミドおよび ３pCSΔプラスミドを含むプラスミドの便宜なセットが生成される。SDMプラスミドは、各上記のmtaの遺伝子の断片1を各々持ち、所望する変異がQEにより導入される。配列により確認後、この断片は、対応する受容pCSΔプラスミドに複製される。pCSΔプラスミドは、pCSmtaの不活性派性物である。活性はSDMプラスミドから対応断片をクローニングすることにより復活され、スクリーニングが容易となる。
【表３】
【表４】
【表５】
【０２１２】
実施例３、マルチSDM
PS4変異体は、Quick Chang（登録商標）マルチ部位特異的突然変異誘発セット（ストラテジーン社）の製作者のプロトコールに、述べたような幾つかの改変を加えたものを用い生成した。
【０２１３】
ステップ１ 突然変異鎖合成反応（PCR）
− 3ml. LB(22g/l Lennox L Broth Base, Sigma) + 抗生物質0.05μg/ml,カナマイシン、Sigma）を10ml Falcon管に入れる
− 37℃、約200rpmで培養する
− 遠心力（5000rpm/5分）で細胞を沈降させる
− 培地を排出する
− QIAGEN Plasmid Mini Purification Protocol を用いてds-DNA鋳型を準備する
【０２１４】
１．突然変異鎖合成反応のための熱サイクルの準備を以下のように行った：
PCRミックス
2.5μl 10XQuick Change（登録商標）マルチ反応緩衝液
0. 75μl QuickSolution
X μl プライマ（プライマ長さ 28-35bp→10pmol）
（プライマ長さ 24-27bp→7pmol）
（プライマ長さ 20-23bp→5pmol）
1μl ｄNTP ミックス
X μl ds-DNA鋳型（200ng）
1μl Quick Change（登録商標） Multi酵素ブレンド(2.5U/μl)（PfuTurbo DNAポリメラーゼ）
Xμl dH2O (最終容量25μl)
全ての組成物をピペットで混合し、反応物をすばやく沈降させる
【０２１５】
２．以下の条件で反応を繰り返す
変性35サイクル（96℃/分）
プライマアニーリング（62.8℃/分）
エロンゲーション（65℃/15分）
その後4℃で保持
PCR管を装置に入れる前に、PCR装置の覆いを105℃に、板を95℃に余熱する（eppendorf 熱サイクル）
【０２１６】
ステップ２ Dpn I 分解
１． 各増幅反応に対し2μlのDpn I制限酵素（10U/μl）を加え、ピペットで混合し、混合物を沈降させる
２． 37℃で最長3時間培養する
【０２１７】
ステップ３．XL10-Gold（登録商標）Ultracompetent Cellの形質転換
１． XL10-Gold 細胞を氷上で溶かす。突然変異反応当り各45μl細胞を予冷したFalcon試験管に分ける
２． 水浴槽の栓（42℃）を開栓し、試験管を予熱するために槽にNZY＋培養液とともに浸す
３． ２μlのβ-メルカプトエタノール混合液を各試験管に加える。掻き混ぜて、静かに栓を抜き、氷上で10分培養する、2分ごとに掻き混ぜる。
【０２１８】
４． Dpn I 処理したDNA 1.5μlをそれぞれに分けた細胞に加え、掻き混ぜて混合し、そして氷上で30分培養する。
【０２１９】
５． 42℃の温浴槽で30秒熱パルス加熱し、その後氷上で２分保持する。
【０２２０】
６． 0.5mlの予熱したNZY＋培養液を各試験管に加え、225−250rpmで回転振動させながら、37℃で1時間培養する。
【０２２１】
７． 1％のでんぷんおよび0.05μlのカナマイシンを含むLB板（33.6g/l Lennox L Agar , Sigma）上に各転換反応の200μlを板に塗る（plate）。
【０２２２】
８． 形質転換のプレートを37℃で一夜培養する。
【表６】
【表７】
【表８】
【０２２３】
ｐPD77に基づくベクターシステム
ｐPD77に用いるベクターシステムはpCRbluntTOPOLII (インビトロゲン社) に基づくものである。ゼオシン レジスタンス カセット(zeocin resistance cassette)はpmlIにより除去されており、393bp断片は除かれている。次にpCCベクター（P32−ssCGTase-PS4-tt）の発現カセットはベクターに挿入されている。
【０２２４】
PS4変異体のpCCMiniへの連結
関係する突然変異（MSDMにより作られる）を含むプラスミドは制限酵素NcoIおよびHind III(Biolabs)により切断される：
3μgプラスミドDNA、Xμl 10ｘ緩衝剤２、NcoI 10単位、HindIII 20単位、37℃で2時間培養する
1％のアガロースゲルで分解を進める。1293bp（PS4 遺伝子）サイズの断片をゲルから切断し、Qiagen ゲル精製キットを用いて精製する。
【０２２５】
その後PCCMini ベクターは、制限酵素NcoIおよび Hind IIIにより切断され、そして分解が1％アガロースゲル上で行われる。3569bpサイズの断片をゲルから切断し、Qiagenゲル精製キットを用いて精製する。
【０２２６】
連結：Rapid DNA連結キット（Roche）を用いる
ベクターの数の2倍の挿入量を用いる
例．２μl 挿入（PS4遺伝子）
１μl ベクター
５μl T4 DNA連結緩衝液 ２ｘ濃度
１μl ｄH2O
１μl T4 DNA リガーゼ
５分/RTで連結する
製造者のプロトコール（インビトロゲン社）に従い、連結物を用いてOne Shot TOPOコンピテント細胞を形質転換する。形質転換において、5μl連結物を用いる。
【０２２７】
50μl変換ミックスを、1％のでんぷん、および0.05μl/mlのカナマイシンを含むLB板（33.6g/l Lennox L Agar Sigma）上で板に塗る（plate）。挿入体(PS4変異体)を含むベクターはでんぷん板上のハロ形成により認識される。
【０２２８】
実施例４ 枯草菌（Bacillus subtilis）への形質転換（プロトプラスト形質転換）
枯草菌（系統 DB104A；Smith et al., 1988; Gene 70, 351-361）は次の手順により変異pCSプラスミドにより形質転換される。
【０２２９】
A. プロトプラスト および形質転換の培地
２ｘSMM リッター当たり：342ｇショ糖（１M）;4.72ｇ マレアート
ナトリウム（Sodium Maleate）(0.04M), 8:12g MgCl2, 6H2O(0.04M);濃縮NaOH でpH6.5、50mlに分配し、10分間加圧滅菌する
４ｘYT(1/2 NaCl) 2g イースト菌エキス+3.2g Tryptone+0.5g NaCl(100ml当り)
SMMP ２ｘSMPP、および等容量の４ｘYTを混合
PEG 10gポリエチレングリコール6000（BDH）、または8000（Sigma）を SMM 25ml中にとり（10分間加圧滅菌する）
【０２３０】
B. 平板培養/再生のための培地
寒天 4％Difco 最小培地寒天、15分間加圧滅菌する。
【０２３１】
コハク酸ナトリウム 270g/l(1M), pH7.3の塩酸、15分間加圧滅菌する。
【０２３２】
リン酸緩衝液 3.5gK2HPO4＋1.5gKH2 PO4/100ml、15分間加圧滅菌する。
【０２３３】
MgCl２ 20.3g MgCl２、6H2O/100ml(1M);
カザミノ酸 5％（w/v）液、15分間加圧滅菌する。
【０２３４】
イーストエキス 10g/100ml, 15分間加圧滅菌する。
【０２３５】
グルコース 20％（w/v）液、10分間加圧滅菌する。
【０２３６】
DM3再生培地： ：60℃で混合（浴槽；500mlビン）
250ml コハク酸ナトリウム
50ml カザミノ酸
25ml イーストエキス
50ml リン酸緩衝液
15ml グルコース
10ml MgCl２
100ml 溶融寒天
適量の抗生物質を加える：クロラムフェニコール、およびテトラサイクリン、5ug/ml; エリトロマイシン, 1ug/ml. DM3培地にカナマイシンを使うことは問題がある：250ug/mlの濃度が必要となる。
【０２３７】
C. プロトプラストの準備
１． 全工程を通じて、界面活性剤を含まないプラスチック、またはガラス機器を使用する。
【０２３８】
２． 同一コロニーから得られる10mlの２ｘYT培地を100-mlフラスコで培養する。25-30℃で、シェイカー中で一夜培養する（200回転/分）。
【０２３９】
３． 一夜培養20倍に薄め、新鮮な２ｘＹＴ100ml（250-mlフラスコ）にいれ、シェイカー（200-250回転/分）中で、37℃において、OD600＝0.4-0.5（約2時間）成長させる。
【０２４０】
４． 遠心分離で細胞をとる（9000g、20分、4℃）
５． ピペットで浮遊物を除き、細胞を5mlのSMMP＋５ｍｇリソザイム中で、再懸濁する
、消毒済みフィルターを使用する。
【０２４１】
６． 温浴シェイカー（100回転/分）中、温度37℃で培養する。
【０２４２】
30分後、その後15分の間隔で、25ulサンプルを顕微鏡検査する。99％の細胞がプロトプラスト化（球状）するまで培養を続ける。プロトプラストを遠心分離（4000g、20分、RT）に掛けて回収し、浮遊物をピペットで除く。ペレットを静かに1-2mlのSMMP中で再懸濁する
プロトプラストは、用いられる状態になっている。（一部は（例えば、0.15ml）は後の使用のために−80℃で冷凍保存することができる（グリセロール添加は不要）。形質転換効率は減少することとなるが、冷凍プロトプラストから、ug当りDNAから106の形質転換細胞が得られる。
【０２４３】
D. 形質転換
１． 450ulのPEGを小試験管にとる。
【０２４４】
２． 1-10ulの DNA（0.2ug）を150ulのプロトプラストと混合し、混合したものにPEGの入った試験管に加える。直ちに、ただし、静かに混合する。
【０２４５】
３． RTに2分置き、その後1.5モルのSMMPを加え、混合する。
【０２４６】
４． プロトプラストを小遠心分離（10分、13.000回転/分（10-12.000ｇ））により回収し、浮遊物を排出する。残りの小滴をガーゼなどで除く。
【０２４７】
SMMP 300ulを加え（かき回さない）、抗生物質耐性マーカーを発現をさせるため水浴槽シェイカー（100回転/分）中で、37℃で60-90分培養する。（プロトプラストは水浴槽の振動により十分に再懸濁される。１ｘSSM中で、適当に希薄させ、ＤＭ3板に0.1mlを平板培養する。
【０２４８】
実施例５ シェイクフラスコでのPS4変異体の発酵
シェイクフラスコの基質は以下の通りに準備する：
成分 ％（w/v）
水 −
イーストエキス ２
大豆粉 ２
NaCl 0.5
リン酸２カリウム 0.5
消泡剤 0.05
基質は、加圧減菌される前に、４Ｎの硫酸、または水酸化ナトリウムによりpH6.8になるよう調整される。100mlの基質が、整流装置を一つ持つ500mlフラスコに入れられ、30分間加圧減菌される。その後、6mlの殺菌済みデキストロースシロップが加えられる。デキストロースシロップは、50％w/vデキストロース１容量に対し、水１容量をミックスして作り、それを20分間加圧減菌したものを用いる。
【０２４９】
シェイクフラスコに変異体を植え付け、培養基で35℃/180rpmで24時間培養する。培養後、細胞は遠心分離により（１０分間で10.000ｘｇ）培養液から分離され、最終的に、浮遊物は0.2μlの極細ろ過により細胞を含まないものとなる。細胞を含まない浮遊物は、アッセイおよび応用試験に用いられる。
【０２５０】
実施例６ アミラーゼアッセイ（assay）
Betamyl 分析(assay)
Betamyl 一単位は、1分当たり、PNP結合した、マルトペンタオース0.0351ｍモルを分解する活性と定義される。したがって、1分当たり0.0351ｍモルPNPは過剰のαグルコシダーゼにより、アッセイミックスに放出される。アッセイミックスは50ul 50mlクエン酸ナトリウム、５ｍMの２塩化カルシウム（CaCl2）,pH6.5、25ul酵素サンプルおよび25ul Betamyl 基質（Glc5-PNP およびαグルコシダーゼ）アイルランドのMegazyme製（10mlの水に1瓶を溶解）を含む。ミックスは、４０℃で30分培養し、150ul,4%Tris. を加えた後停止する。420nmでELISA-readerを用い吸収度を測定し、Betamyl活性を、アッセイした酵素サンプルのBetamyl 単位/mlで活性＝420ｘｄに基づき計算する。
【０２５１】
エンドアミラーゼアッセイ
エンドアミラーゼ分析は、製造者（Pharmacia & Upjohn Diagnostics AB）によるPhadebas アッセイと同一である。
【０２５２】
エクソ特異性
エクソ特異性を評価するためにPhadebas活性に対するエクソアミラーゼ活性の比率を用いた。
【０２５３】
比活性度
PSac-D14, PSac-D20,および PSac-D34変異体について精製したタンパク質のマイクログラム当たり10Betamyl単位の平均比活性度を、Bradford(1976,Anal. Biochem. 72, 248)に従い測定した。この比活性度は、応用試験例において用いた投与量を算出するために用いられる。
【０２５４】
実施例７ 半減期の決定
t1/2は酵素の半分の活性が、規定する熱条件の下で、不活性となる時間(分)と定義される。酵素の半減期を決定するために、サンプルを60℃から90℃の間の一定の温度で1−10分間の間加熱する。半減期は、Betamylアッセイの残留に基づき計算する。
【０２５５】
手順：Eppendorfチューブで、緩衝液1,000μlが60℃以上で、少なくとも10間余熱する。サンプルの熱処理は余熱された緩衝液に、100μlサンプルを加え、Eppendorfチューブを熱培養器中（Eppemdorf製Termomixer comfort）で連続攪拌（800rpm）する条件下で開始される。0, 2,4,6,8および9分の培養の後熱処理を中止し、サンプル45μlを20℃に保った1,000μl緩衝液に移し、1500rpm、20℃で1分間培養する。残留活性をBetamylアッセイにより測定する。
【０２５６】
計算方法：ｔ1/2の計算は、培養時間に対する残留Betamyl活性の対数（底10のlog）の傾きに基づき算出する。t1/2は、傾き/0.301=t1/2として算出する。
【０２５７】
実施例８ 結果
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【０２５８】
実施例９ モデルシステムベーキング試験
パン生地は、30.0℃でFarinographで作られる。10.00gの改良小麦粉が計量され、Farinographに加えられる。1分間攪拌した後、参照/サンプル（参照＝緩衝液、または水、サンプル＝酵素＋緩衝液、または水）が消毒したピペットにより練り桶の孔を通して添加される。30秒後、小麦粉は、同様にまた、練り桶の孔を通して、淵から擦り落とされる。サンプルは7分間練られる。
【０２５９】
最終参照試験に先立ち、緩衝液、または水によるテストがFarinographで行われる。FUは参照で400なければならない。もし，そうでなければ、例えば、液の量により調整する必要がある。参照/サンプルは、ヘラにより取り出され、手（使い捨て手袋を使用）に収め、そして、小さなガラス管（約4.5cm長さ）に満たし、NMR管に挿入され、コルク栓をする。一つのパン生地当たり7本の管を用意する。
【０２６０】
サンプルが全て準備されたら、管は33℃の水槽（プログラム可能）（コルク栓なし）に25分浸ける。その後、水槽は33℃で5分保ち、そして、56分かけて98℃まで加熱し(1.1℃/分)、最終的に96℃で5分間置く。
【０２６１】
管は、保熱棚に20.0℃で保存する。パンの身の固くなった容量は、図表２（Fig.2）に示す0.05，１および２ppmのPSacD34を使用したパンの身のサンプルのようにBruker NMS120 Minispec NMR分析器を使い、NMRプロトンにより1，3、および７日目に測定する。時間の経過とともに、固い部分の増加度合いが低下していることは、アミロペクチンの後退が減少していることを示す。20.0℃で７日間保熱棚に保存した後、パンの身のサンプル10-20mgを計量し、40μlのアルミ標準DSCカプセルに取り、20℃に保つ。
【０２６２】
カプセルは、Mettler Toledo DSC820機器による示差走査熱量測定にかけられる。パラメータとして、10℃/分の20−95℃加熱サイクル、ガス流量毎分80mlのN2を使用する。結果を分析し、後退アミロペクチン溶解エンタルピーをJ/gにより算出する。
【０２６３】
実施例 10 アンチステイル(対老化)効果
モデルとなるパンの身を、実施例８に従い、準備し計量する。表2に示すように、PS4変異体は、コントロールに比べ、示差走査熱量測定法で測定したパンを焼いた後のアミロペクチンの後退抑制効果が強いことが分る。PS4変異体は明白な投与効果を示している。
【０２６４】
実施例11．パン焼きテストの対硬化度効果
パン焼きテストを標準白パンのスポンジおよび米国トーストのパン生地調理法に従い行った。生パンスポンジは、Sisco Mills USAの「All Purpose Classic」小麦粉1600g、水950g、大豆あぶら40g、および乾燥イースト32gを用いた。スポンジはHobart スパイラルミキサーにより、低速で1分間、続いて、速度2で3分間混合した。スポンジはその後、まず３５℃、85％RHで2.5時間で、続いて5℃で0.5時間発酵させた。
【０２６５】
その後、小麦粉400g、乾燥イースト4g、塩40g、プロピオン酸カルシウム2.4g、高果糖コーンシロップ（Isosweet）240g, 乳化剤PANODAN 205 5g、酵素活性大豆粉5g、非活性大豆30ｇ、水220gおよびアスコルビン酸30g（溶液4gを水500gに溶解したもの）をスポンジに加えた。できたパン生地をDiosnaミキサーで、まず、低速で1分間、続いて速度2で6分間混合する。その後、パン生地は大気温度で5分間置き、そして、一個が550gのパン生地が計量され5分間寝かせた後、Glimekシーターにおいて両側を設定1:4, 2:4. 3:15,4:12および10の設定でシートされ（sheeted）、パン焼き台に移される。43℃、90％RHで60分間ふんわりとさせた後、パン生地は218℃で29分間焼かれる。
【０２６６】
硬さ、および弾力性はTA-XT2質感（texture）分析器により測定した。軟らかさ、もちもち感（cohesiveness）,および弾力性は、Stable Micro System,UKの質感分析器（Texture Analyser）を使い、質感断面分析（Texture Profile Analysis）により、薄切りパンを対象に分析し、測定値を出した。測定の設定条件は以下の通り：
予備試験スピード 2mm/s
本試験スピード 2mm/s
後試験スピード 10mm/s
破断試験距離 １％
距離 40％
負荷 0.098N
時間 ５秒
カウント 5
荷重計 5kg
引金タイプ（trigger type） 自動−0.01N
結果は、図表3 および４に示す。
【０２６７】
実施例12 デニッシュロールの容量コントロール
デニッシュロールは、デニッシュ改良小麦粉（Cerealia製）2000ｇを圧搾酵母120g、塩32g、ショ糖32gを用いたパン生地をベースにする。水は事前に適量用意して、パン生地に加える。
【０２６８】
パン生地は、Diosnaミキサーで混合する（低速で2分間、高速で5分間）。混合後のパン生地の温度は、26℃に保った。1350gのパン生地が計量され、保熱棚に３０℃で10分間寝かせる。ロールはFortunaモールド装置で型に作られ、34℃および85％相対湿度で、45分間ふっくらと膨らまされる。次に、ロールはBago2オーブンで、最初13秒間蒸気にさらされ、そして250度で18分間焼かれる。焼いた後、25分の間冷まし、その後重量および容積が測られる。
【０２６９】
ロールは、外皮の形態、身の均一さ、外皮の表面覆いの様子（capping）、見かけ（ausbund）、および容積比（ブドウ種変異法による容量測定）により評価される。
【０２７０】
これらの基準に基づいた場合、PS4変異体は容積比を増大させ、デニッシュロールの品質数値を改善することがわかる。このように、PS4変異体により、焼いたパン製品の容積をコントロールすることができる。
【０２７１】
その以下の各応用および特許の実施（「応用に引用された書類」）を含み、この明細書に記載の各応用例および特許、その各応用および特許に引用され、または参考として上げられた各書類、およびその各応用および特許におよび応用に引用された書類中に引用され、または参考として上げられた製品についての製造者への取扱い指示、またはカタログ、は引用により本願に含まれる。
【０２７２】
さらに、この文書中で引用した全ての書類、および、この明細書中で引用した書類中で引用した、または参考にした全ての書類、および、この明細書中で引用した、または触れたあらゆる製品についての製造者への取扱い指示、あるいはカタログ、は引用により本願に含まれる。
【０２７３】
ここに記載された方法、およびシステムの種々の改変、および変形は本発明の範囲および趣旨から外れることなく、当業者にとって明白なものである。本発明は、特定の好ましい実施の態様について記述されているが、請求の範囲に記載された発明は、かかる実施の態様に限定されるものではない。事実、分子生物学、または関係する分野の当業者にとり明らかにである本発明の態様の種々の改変を実施することは、請求の範囲に属する発明を実施することを意味する。
【表１６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、５、７、または11のうちの一つと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号１として示されるシュードモナス・サッカロフィリア（Pseudomonas saccharophilia）の配列の位置番号付けに関して、307位における置換を含む、マルトース非生成性エクソアミラーゼ（non-maltogenic exoamylase）。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも９５％同一である請求項1に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項３】
前記アミノ酸配列が、配列番号５と少なくとも９５％同一である請求項1に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項４】
前記アミノ酸配列が、配列番号７と少なくとも９５％同一である請求項1に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項５】
前記アミノ酸配列が、配列番号１１と少なくとも９５％同一である請求項1に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項６】
配列番号2-4b、または8-10または4cのうちの少なくとも一つと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号１として示されるシュードモナス・サッカロフィリア（Pseudomonas saccharophilia）の配列の位置番号付けに関して、３０７位における置換を含む、マルトース非生成性エクソアミラーゼ。
【請求項７】
G4D, N33Y, D34N, G70D, K71R, G87S, A99V,K108R,V113I,G121D,G134R,A141P,I157L,G158D,Y171S,L178F,A179T,G188A,Y198F,A199V,G223A,V290I,I315V,S334P,D343E,S399P,A405FおよびA405Eから選択される少なくとも一つの置換をさらに含む、請求項1または６に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項８】
33,34,71,87,121,134,141,157,178,179, 223,334 および343から選択される少なくとも一つのさらなる位置をさらに含む、請求項1または６に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項９】
少なくとも一つのさらなる置換がN33Y, D34N, K71R, G87S, G121D, G134R, A141P, I157L, L178F,A179T, G223A,S334P,および D343Eから選択される請求項８に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項１０】
前記108、158、171、および188から選択される位置において、さらに少なくとも一つのさらなる置換を含む請求項８に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項１１】
少なくとも一つのさらなる置換がＫ108Ｒ、Ｇ158Ｄ、Ｙ171Ｓ、およびＧ188Ａから選択される請求項１０に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項１２】
以下：
【化１−１】
【化１−２】
【化１−３】
の中から選択される置換の組み合せを含む、請求項1または６に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項１３】
以下：
【化２】
の中から選択される置換の組み合わせを含む、請求項３に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項１４】
以下：
【化３】
の中から選択される置換の組み合わせを含む、請求項３に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項１５】
アミラーゼが、配列番号2,3,4,４a,4b,4c,8,9, および10から選択される一つのアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項１６】
エクソアミラーゼが、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）に由来する請求項1または６に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項１７】
シュードモナス属が、シュードモナス・サッカロフィリア（Pseudomonas saccharophilia）、およびシュードモナス・ストツェリ（Pseudomonas stutzeri）から選択される請求項１６に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項１８】
配列番号1,5,7,11,2-4b,8-10または4cのいずれかと９０％の同一性を有し、かつ、配列番号１として示されるシュードモナス・サッカロフィリア（Pseudomonas saccharophilia）の配列の位置番号付けに関して、３０７位における少なくとも一つの置換を含むアミノ酸配列を含むエクソ特異的・マルトース非生成性エクソアミラーゼ（exo-specific non-maltogenic exoamylase）をコードする核酸と少なくとも９０％同一である核酸。
【請求項１９】
請求項18に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２０】
請求項19に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のエクソアミラーゼを含む組成物。
【請求項２２】
さらなる成分、または、さらなる酵素、あるいはその両方を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記さらなる酵素が、オキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、グリコシダーゼ、アミラーゼ、プルラナーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、でんぷん分解酵素、プロテアーゼおよびリポキシゲナーゼからなる群より選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記酵素がバシラス種に由来するマルトース生成性アミラーゼである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記酵素が、ＥＰ １２０ ６９３に開示されるバシラス由来のマルトース生成性α−アミラーゼ、または、α−アミラーゼ活性を有するその変異体、相同物もしくは変異種、あるいは、これらを含む組成物である、請求項２２〜２４に記載の組成物。
【請求項２６】
小麦粉、水を含む任意のパン生地成分、または、他の成分、もしくは添加物、もしくはパン生地を改良する組成物が追加される、請求項２１〜２５に記載の組成物。
【請求項２７】
食品製品の製造における、または、食品成分としての、請求項１〜１７に記載のエクソアミラーゼの使用。
【請求項２８】
前記食品製品がパン生地製品を含む、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記食品製品が油で焼いた、油で揚げた（deep fried）、ローストした、焼いた、蒸気で蒸した、または茹でたパン生地製品を含む、請求項２７または２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記食品製品がパン製品を含む、請求項２７に記載の使用。
【請求項３１】
食品製品を製造するための方法であって、以下：
（ａ）でんぷん媒体を準備する工程；
（ｂ）該でんぷん媒体に、請求項１〜１７のいずれかに記載のエクソアミラーゼを加える工程
を包含する、方法。
【請求項３２】
パン製品を作るためのプロセスであって、以下：
（ａ）でんぷん媒体を準備する工程；
（ｂ）該でんぷん媒体に、請求項１〜１７に記載のＰＳ４変異エクソアミラーゼを加える工程；および
（ｃ）工程（ｂ）の間または後に、該でんぷん媒体に熱を適用して、パン製品を製造する工程
を包含する、プロセス。
【請求項３３】
請求項１〜１７のいずれかに記載のＰＳ４変異エクソアミラーゼと、少なくとも一つのさらなるパン生地成分またはパン生地添加物とを含む、パン生地改良組成物。
【請求項３４】
パン製品の容積を増すための、請求項１〜１７に記載のエクソアミラーゼの使用。
【請求項３５】
でんぷんの有害な老化を遅らせまたは速度を遅らせるための、食品製品における請求項１〜１７に記載のエクソアミラーゼの使用。
【請求項３６】
適合性のある宿主細胞に請求項１９に記載のベクターを導入し、そして、該ベクターの複製を引き起こす条件下で該宿主細胞を増殖させる工程を包含する、請求項１〜１７に記載のエクソアミラーゼを発現させる方法。
【請求項３７】
ＰＣＲを用いて親ポリペプチドにアミノ酸置換を導入することによる、請求項１〜１７に記載のエクソアミラーゼを作る方法。
【請求項３８】
マルトース非生成性エクソアミラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列における、一つ以上の対応するコドンの変化を誘導することによる、請求項１〜１７に記載のエクソアミラーゼを作る方法。
【請求項３９】
マルトース非生成性エクソアミラーゼ中に存在する一つ以上のドメインを欠く、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項４０】
前記でんぷん結合ドメインを欠く請求項１〜１７のいずれか１項に記載のエクソアミラーゼであって、ここで、該でんぷん結合ドメインは、配列番号１として示されるシュードモナス・サッカロフィリア（Pseudomonas saccharophilia）の配列の位置番号付けに関して、４２９位の後のアミノ酸に対応する、エクソアミラーゼ。
【請求項４１】
前記親ポリペプチドと比較してより高い熱安定性を有する、請求項１〜１７、３９または４０のいずれかに記載のエクソアミラーゼ。
【請求項４２】
請求項１〜１７または３９〜４１のいずれかに記載のエクソアミラーゼであって、ここで、５５℃〜９５℃またはそれ以上、好ましくは約８０℃の高温にて、半減期が前記親酵素と比較して、好ましくは１０％またはそれ以上、好ましくは５０％またはそれ以上、好ましくは１００％またはそれ以上延長される、エクソアミラーゼ。
【請求項４３】
前記半減期が８０℃において前記親酵素と比較して延長される、請求項４２に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項４４】
前記親ポリペプチドと比較してより高いｐＨ安定性を有する、請求項１〜１７または３９〜４３のいずれかに記載のエクソアミラーゼ。
【請求項４５】
同一のｐＨ条件下で前記親ポリペプチドと比較した場合に、１０％またはそれ以上、好ましくは５０％またはそれ以上、好ましくは１００％またはそれよりも長い半減期を有する、請求項１〜１７または３９〜４４のいずれかに記載のエクソアミラーゼ。
【請求項４６】
前記親酵素と比較して増加したエクソ特異性を有する、請求項１〜１７または３９〜４５のいずれかに記載のエクソアミラーゼ。
【請求項４７】
同一の条件下で前記親ポリペプチドと比較した場合に、１０％またはそれ以上、好ましくは５０％またはそれ以上、好ましくは１００％またはそれよりも高いエクソ特異性を有する、請求項１〜１７または３９〜４６のいずれかに記載のエクソアミラーゼ。
【請求項４８】
配列番号1,5,7または11と９５％の同一性を有し、かつ、配列番号１として示されるシュードモナス・サッカロフィリア（Pseudomonas saccharophilia）の配列の位置番号付けに関して、３０７位における少なくとも一つの置換を含むアミノ酸配列を含むエクソ特異的・マルトース非生成性エクソアミラーゼ（exo-specific non-maltogenic exoamylase）をコードする核酸と少なくとも９５％同一である核酸。
【請求項４９】
でんぷん結合ドメインのようなドメインを欠く、請求項３９または４０に記載のエクソアミラーゼをコードする核酸に対して少なくとも９０％同一な核酸。
【請求項５０】
明細書中に記載の発明。
【請求項１】
配列番号１、５、７、または11のうちの一つと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号１として示されるシュードモナス・サッカロフィリア（Pseudomonas saccharophilia）の配列の位置番号付けに関して、307位における置換を含む、マルトース非生成性エクソアミラーゼ（non-maltogenic exoamylase）。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも９５％同一である請求項1に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項３】
前記アミノ酸配列が、配列番号５と少なくとも９５％同一である請求項1に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項４】
前記アミノ酸配列が、配列番号７と少なくとも９５％同一である請求項1に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項５】
前記アミノ酸配列が、配列番号１１と少なくとも９５％同一である請求項1に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項６】
配列番号2-4b、または8-10または4cのうちの少なくとも一つと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号１として示されるシュードモナス・サッカロフィリア（Pseudomonas saccharophilia）の配列の位置番号付けに関して、３０７位における置換を含む、マルトース非生成性エクソアミラーゼ。
【請求項７】
G4D, N33Y, D34N, G70D, K71R, G87S, A99V,K108R,V113I,G121D,G134R,A141P,I157L,G158D,Y171S,L178F,A179T,G188A,Y198F,A199V,G223A,V290I,I315V,S334P,D343E,S399P,A405FおよびA405Eから選択される少なくとも一つの置換をさらに含む、請求項1または６に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項８】
33,34,71,87,121,134,141,157,178,179, 223,334 および343から選択される少なくとも一つのさらなる位置をさらに含む、請求項1または６に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項９】
少なくとも一つのさらなる置換がN33Y, D34N, K71R, G87S, G121D, G134R, A141P, I157L, L178F,A179T, G223A,S334P,および D343Eから選択される請求項８に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項１０】
前記108、158、171、および188から選択される位置において、さらに少なくとも一つのさらなる置換を含む請求項８に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項１１】
少なくとも一つのさらなる置換がＫ108Ｒ、Ｇ158Ｄ、Ｙ171Ｓ、およびＧ188Ａから選択される請求項１０に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項１２】
以下：
【化１−１】
【化１−２】
【化１−３】
の中から選択される置換の組み合せを含む、請求項1または６に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項１３】
以下：
【化２】
の中から選択される置換の組み合わせを含む、請求項３に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項１４】
以下：
【化３】
の中から選択される置換の組み合わせを含む、請求項３に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項１５】
アミラーゼが、配列番号2,3,4,４a,4b,4c,8,9, および10から選択される一つのアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項１６】
エクソアミラーゼが、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）に由来する請求項1または６に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項１７】
シュードモナス属が、シュードモナス・サッカロフィリア（Pseudomonas saccharophilia）、およびシュードモナス・ストツェリ（Pseudomonas stutzeri）から選択される請求項１６に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項１８】
配列番号1,5,7,11,2-4b,8-10または4cのいずれかと９０％の同一性を有し、かつ、配列番号１として示されるシュードモナス・サッカロフィリア（Pseudomonas saccharophilia）の配列の位置番号付けに関して、３０７位における少なくとも一つの置換を含むアミノ酸配列を含むエクソ特異的・マルトース非生成性エクソアミラーゼ（exo-specific non-maltogenic exoamylase）をコードする核酸と少なくとも９０％同一である核酸。
【請求項１９】
請求項18に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２０】
請求項19に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のエクソアミラーゼを含む組成物。
【請求項２２】
さらなる成分、または、さらなる酵素、あるいはその両方を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記さらなる酵素が、オキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、グリコシダーゼ、アミラーゼ、プルラナーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、でんぷん分解酵素、プロテアーゼおよびリポキシゲナーゼからなる群より選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記酵素がバシラス種に由来するマルトース生成性アミラーゼである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記酵素が、ＥＰ １２０ ６９３に開示されるバシラス由来のマルトース生成性α−アミラーゼ、または、α−アミラーゼ活性を有するその変異体、相同物もしくは変異種、あるいは、これらを含む組成物である、請求項２２〜２４に記載の組成物。
【請求項２６】
小麦粉、水を含む任意のパン生地成分、または、他の成分、もしくは添加物、もしくはパン生地を改良する組成物が追加される、請求項２１〜２５に記載の組成物。
【請求項２７】
食品製品の製造における、または、食品成分としての、請求項１〜１７に記載のエクソアミラーゼの使用。
【請求項２８】
前記食品製品がパン生地製品を含む、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記食品製品が油で焼いた、油で揚げた（deep fried）、ローストした、焼いた、蒸気で蒸した、または茹でたパン生地製品を含む、請求項２７または２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記食品製品がパン製品を含む、請求項２７に記載の使用。
【請求項３１】
食品製品を製造するための方法であって、以下：
（ａ）でんぷん媒体を準備する工程；
（ｂ）該でんぷん媒体に、請求項１〜１７のいずれかに記載のエクソアミラーゼを加える工程
を包含する、方法。
【請求項３２】
パン製品を作るためのプロセスであって、以下：
（ａ）でんぷん媒体を準備する工程；
（ｂ）該でんぷん媒体に、請求項１〜１７に記載のＰＳ４変異エクソアミラーゼを加える工程；および
（ｃ）工程（ｂ）の間または後に、該でんぷん媒体に熱を適用して、パン製品を製造する工程
を包含する、プロセス。
【請求項３３】
請求項１〜１７のいずれかに記載のＰＳ４変異エクソアミラーゼと、少なくとも一つのさらなるパン生地成分またはパン生地添加物とを含む、パン生地改良組成物。
【請求項３４】
パン製品の容積を増すための、請求項１〜１７に記載のエクソアミラーゼの使用。
【請求項３５】
でんぷんの有害な老化を遅らせまたは速度を遅らせるための、食品製品における請求項１〜１７に記載のエクソアミラーゼの使用。
【請求項３６】
適合性のある宿主細胞に請求項１９に記載のベクターを導入し、そして、該ベクターの複製を引き起こす条件下で該宿主細胞を増殖させる工程を包含する、請求項１〜１７に記載のエクソアミラーゼを発現させる方法。
【請求項３７】
ＰＣＲを用いて親ポリペプチドにアミノ酸置換を導入することによる、請求項１〜１７に記載のエクソアミラーゼを作る方法。
【請求項３８】
マルトース非生成性エクソアミラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列における、一つ以上の対応するコドンの変化を誘導することによる、請求項１〜１７に記載のエクソアミラーゼを作る方法。
【請求項３９】
マルトース非生成性エクソアミラーゼ中に存在する一つ以上のドメインを欠く、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項４０】
前記でんぷん結合ドメインを欠く請求項１〜１７のいずれか１項に記載のエクソアミラーゼであって、ここで、該でんぷん結合ドメインは、配列番号１として示されるシュードモナス・サッカロフィリア（Pseudomonas saccharophilia）の配列の位置番号付けに関して、４２９位の後のアミノ酸に対応する、エクソアミラーゼ。
【請求項４１】
前記親ポリペプチドと比較してより高い熱安定性を有する、請求項１〜１７、３９または４０のいずれかに記載のエクソアミラーゼ。
【請求項４２】
請求項１〜１７または３９〜４１のいずれかに記載のエクソアミラーゼであって、ここで、５５℃〜９５℃またはそれ以上、好ましくは約８０℃の高温にて、半減期が前記親酵素と比較して、好ましくは１０％またはそれ以上、好ましくは５０％またはそれ以上、好ましくは１００％またはそれ以上延長される、エクソアミラーゼ。
【請求項４３】
前記半減期が８０℃において前記親酵素と比較して延長される、請求項４２に記載のエクソアミラーゼ。
【請求項４４】
前記親ポリペプチドと比較してより高いｐＨ安定性を有する、請求項１〜１７または３９〜４３のいずれかに記載のエクソアミラーゼ。
【請求項４５】
同一のｐＨ条件下で前記親ポリペプチドと比較した場合に、１０％またはそれ以上、好ましくは５０％またはそれ以上、好ましくは１００％またはそれよりも長い半減期を有する、請求項１〜１７または３９〜４４のいずれかに記載のエクソアミラーゼ。
【請求項４６】
前記親酵素と比較して増加したエクソ特異性を有する、請求項１〜１７または３９〜４５のいずれかに記載のエクソアミラーゼ。
【請求項４７】
同一の条件下で前記親ポリペプチドと比較した場合に、１０％またはそれ以上、好ましくは５０％またはそれ以上、好ましくは１００％またはそれよりも高いエクソ特異性を有する、請求項１〜１７または３９〜４６のいずれかに記載のエクソアミラーゼ。
【請求項４８】
配列番号1,5,7または11と９５％の同一性を有し、かつ、配列番号１として示されるシュードモナス・サッカロフィリア（Pseudomonas saccharophilia）の配列の位置番号付けに関して、３０７位における少なくとも一つの置換を含むアミノ酸配列を含むエクソ特異的・マルトース非生成性エクソアミラーゼ（exo-specific non-maltogenic exoamylase）をコードする核酸と少なくとも９５％同一である核酸。
【請求項４９】
でんぷん結合ドメインのようなドメインを欠く、請求項３９または４０に記載のエクソアミラーゼをコードする核酸に対して少なくとも９０％同一な核酸。
【請求項５０】
明細書中に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２０１１−４１５７５（Ｐ２０１１−４１５７５Ａ）
【公開日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２４１５６４（Ｐ２０１０−２４１５６４）
【出願日】平成２２年１０月２７日（２０１０．１０．２７）
【分割の表示】特願２００６−５１８８６９（Ｐ２００６−５１８８６９）の分割
【原出願日】平成１６年７月７日（２００４．７．７）
【出願人】（５００２８４５８０）ジェネンコー・インターナショナル・インク (67)
【出願人】（３９７０６０５８８）ダニスコ エイ／エス (67)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月２７日（２０１０．１０．２７）
【分割の表示】特願２００６−５１８８６９（Ｐ２００６−５１８８６９）の分割
【原出願日】平成１６年７月７日（２００４．７．７）
【出願人】（５００２８４５８０）ジェネンコー・インターナショナル・インク (67)
【出願人】（３９７０６０５８８）ダニスコ エイ／エス (67)
【Ｆターム（参考）】
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