グルタチオン産生促進剤、グルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤及び飲食品
【課題】安全性の高い天然物の中からグルタチオン産生促進作用を有するものを見出し、それを有効成分とするグルタチオン産生促進剤及びグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤を提供する。
【解決手段】グルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤に、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上を有効成分として含有せしめる。
【解決手段】グルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤に、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上を有効成分として含有せしめる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルタチオン産生促進剤、グルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤及び飲食品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
グルタチオンは、グルタミン酸、システイン、グリシンの３つのアミノ酸からなるトリペプチドであり、細胞内の主要なシステイン残基を有する化合物である。このグルタチオンは、細胞内においてラジカルの捕捉、酸化還元による細胞機能の調節、解毒機構への関与及び各種酵素のＳＨ供与体等としての役割を果たすことが知られている。
【０００３】
このような役割を果たすグルタチオンの細胞内濃度が低下すると、紫外線曝露による細胞傷害、炎症、黒色化、シミ又はソバカスの生成、急性又は慢性アルコール肝障害、肝臓病、慢性腎不全、喫煙等が要因の肺疾患、特発性肺線維症、白内障、虚血性心疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、胃潰瘍、成人呼吸器障害症候群、免疫不全、骨髄形成不全、後天性免疫不全症候群、潜伏性ウイルス感染症、生理学的な加齢に伴う老化現象、及び癌化等の病状が引き起こされることが知られている。このようなグルタチオンの細胞内濃度の低下によって引き起こされる病状の治療には、従来、細胞内グルタチオン濃度の低下した細胞にグルタチオンを取り込ませることを目的として、グルタチオンを含有するグルタチオン製剤が用いられていた（特許文献１参照）。しかしながら、グルタチオン製剤の経口摂取による治療は、治療対象部位によっては思うような効果が期待できず、また、グルタチオン製剤の静脈注射による治療は、経口摂取による治療より効果は期待できるものの、痛みを伴うこと、通院が必要なこと等の問題を抱えていた。
【０００４】
したがって、生体内細胞におけるグルタチオンの産生を促進することにより細胞内グルタチオン濃度を上昇させることができれば、加齢により衰える酸化ストレスに対する防御能を高めるとともに、紫外線の照射による酸化ストレスに対する傷害を抑制することにつながり、皮膚の老化、シミ等の色素沈着症の予防、治療又は改善が期待できるとともに、グルタチオンの欠乏によって起こる各種臓器の機能低下や種々の疾患の予防又は治療が期待できると考えられる。このような考えに基づき、グルタチオン産生促進作用を有するものとして、ビルベリー抽出物及びウォルナット抽出物（特許文献２参照）、クチナシ属植物の抽出物（特許文献３参照）等が知られている。
【０００５】
また、生体内において、グルタチオンは、活性酸素種を除去する作用を有する還元型グルタチオン、及び還元型グルタチオンと活性酸素種との反応により生産される酸化型グルタチオンとして存在する。近年、この酸化型グルタチオンが、神経細胞の興奮を抑制し、睡眠を促進する睡眠促進物質であることが確認されている。そのため、グルタチオンの産生を促進し、還元型グルタチオンのみならず、酸化型グルタチオンの細胞内濃度をも上昇させることができれば、不眠症等の睡眠障害の予防、治療又は改善に有効であると考えられている。このような考えに基づき、従来、酸化型グルタチオンを有効成分とする催眠剤が知られている（特許文献４参照）。
【０００６】
生体細胞においては、γ−グルタミルシステインシンテターゼの作用により、システインとグルタミン酸とが反応してγ−グルタミルシステインが生合成され、グルタチオンシンテターゼの作用により、γ−グルタミルシステインとグリシンとが反応してグルタチオンが生合成されることが知られている。そのため、グルタチオンの前駆体であるγ−グルタミルシステインを生合成するための触媒的役割を果たすγ−グルタミルシステインシンテターゼの発現を促進することで、生体細胞内グルタチオン濃度を上昇させることができると考えられる。
【特許文献１】国際公開２００３／０３２９６６号パンフレット
【特許文献２】特開２００６−２４１０６２号公報
【特許文献３】特開２００６−３４７９３４号公報
【特許文献４】特開平４−９３３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、安全性の高い天然物の中からグルタチオン産生促進作用及びγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を有するものを見出し、それを有効成分とするグルタチオン産生促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明のグルタチオン産生促進剤及びグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤は、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上を有効成分として含有することを特徴とする。
【０００９】
また、本発明の飲食品は、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上を配合したことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上を有効成分として含有し、安全性に優れたグルタチオン産生促進剤、グルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤及び飲食品を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明について説明する。
〔グルタチオン産生促進剤，グルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤〕
本発明のグルタチオン産生促進剤及びグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤は、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上を有効成分として含有する。
【００１２】
リクイリチン（liquiritin）、リクイリチゲニン（liquiritigenin）、イソリクイリチン（isoliquiritin）、イソリクイリチゲニン（isoliquiritigenin）及びリコカルコンＡ（licochalcone A）は、フラボノイド類の一種であり、これらの化合物を含有する植物抽出物から単離・精製することにより製造することができる。
【００１３】
リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン又はリコカルコンＡを含有する植物抽出物は、植物の抽出に一般に用いられている方法によって得ることができる。リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン又はリコカルコンＡを含有する植物としては、例えば、甘草等が挙げられる。
【００１４】
甘草には、Glychyrrhiza glabra、Glychyrrhiza inflata、Glychyrrhiza uralensis、Glychyrrhiza aspera、Glychyrrhiza eurycarpa、Glychyrrhiza pallidiflora、Glychyrrhiza yunnanensis、Glychyrrhiza lepidota、Glychyrrhiza echinata、Glychyrrhiza acanthocarpa等、様々な種類のものがあり、これらのうち、いずれの種類の甘草を抽出原料として使用してもよいが、特にGlychyrrhiza glabraを抽出原料として使用することが好ましい。
【００１５】
抽出原料として使用し得る甘草の構成部位としては、例えば、葉部、枝部、樹皮部、幹部、茎部、果実部、花部等の地上部、根部又はこれらの部位の混合物等が挙げられるが、好ましくは根部である。
【００１６】
リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン又はリコカルコンＡを含有する植物抽出物は、抽出原料を乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより得ることができる。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、植物の極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００１７】
抽出溶媒としては、極性溶媒を用いるのが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。
【００１８】
抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、酸性化、アルカリ化、緩衝化等が含まれる。したがって、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、有機酸酸性水、アンモニアアルカリ水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００１９】
抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。
【００２０】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族アルコール１〜９０容量部を混合するのが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族ケトン１〜４０容量部を混合するのが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して多価アルコール１０〜９０容量部を混合するのが好ましい。
【００２１】
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液から溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られ、この濃縮物をさらに乾燥すると乾燥物が得られる。
【００２２】
以上のようにして得られた抽出液、当該抽出液の濃縮物又は当該抽出液の乾燥物からリクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン又はリコカルコンＡを単離・精製する方法は、特に限定されるものではなく、常法により行うことができる。
【００２３】
例えば、植物抽出物を、シリカゲルやアルミナ等の多孔質物質、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体やポリメタクリレート等の多孔性樹脂等を用いたカラムクロマトグラフィーに付して、水、アルコールの順で溶出させ、アルコールで溶出される画分として得ることができる。
【００２４】
カラムクロマトグラフィーにて溶出液として用いられるアルコールは、特に限定されるものではなく、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール又はそれらの水溶液等が挙げられる。
【００２５】
さらに、カラムクロマトグラフィーにより得られたアルコール画分を、ＯＤＳを用いた逆相シリカゲルクロマトグラフィー、再結晶、液−液向流抽出、イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー等の任意の有機化合物精製手段を用いて精製してもよい。
【００２６】
以上のようにして得られるリクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン又はリコカルコンＡは、グルタチオン産生促進作用を有しているため、その作用を利用してグルタチオン産生促進剤の有効成分として使用することができる。なお、上記化合物は、γ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用も有しているため、その作用を利用してγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進剤の有効成分としても使用することができる。
【００２７】
また、上記化合物は、そのグルタチオン産生促進作用を通じて、グルタチオンの産生を促進することができるため、グルタチオンの欠乏に起因する疾患（例えば、活性酸素種等の酸化ストレスによって起こる疾患；肝炎、肝機能障害等の肝臓疾患；慢性腎不全；特発性肺線維症、成人呼吸器障害症候群等の呼吸器系疾患；白内障；虚血性心疾患；パーキンソン病；アルツハイマー病：胃潰瘍等の消化器系疾患；癌；骨髄形成不全；後天性免疫不全症候群；潜伏性ウイルス感染症等）の予防・治療剤の有効成分としても使用することができる。
【００２８】
さらに、上記化合物は、グルタチオン産生促進作用を有しており、その作用を利用して酸化型グルタチオンの細胞内濃度を上昇させることができるため、不眠症等の睡眠障害の予防、治療又は改善剤の有効成分としても使用することができる。
【００２９】
なお、本発明のグルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤においては、上記化合物のうちのいずれか１種を上記有効成分として使用してもよいし、上記化合物より選ばれる２種以上の化合物を混合して上記有効成分として使用してもよい。上記化合物より選ばれる２種以上の化合物を混合して上記有効成分として使用する場合、それらの配合比は、それらの作用の程度に応じて適宜決定すればよい。
【００３０】
本発明のグルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤は、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上のみからなるものであってもよいし、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上を製剤化したものであってもよい。
【００３１】
リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を使用して、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味・矯臭剤等を使用することができる。また、上記化合物は、他の組成物（例えば、飲食品等）に配合して使用することができるほか、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等として使用することができる。
【００３２】
なお、本発明のグルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤は、必要に応じて、グルタチオン産生促進作用を有する他の天然抽出物等を配合して有効成分として使用することができる。
【００３３】
本発明のグルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤の投与方法としては、一般に経皮投与、経口投与、静脈投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。
【００３４】
また、本発明のグルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。
【００３５】
本発明のグルタチオン産生促進剤は、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物が有するグルタチオン産生促進作用を通じて、加齢により衰える酸化ストレスに対する防御能を高めるとともに、紫外線の照射による酸化ストレスに対する傷害を抑制することができ、皮膚の老化、シミ等の色素沈着症や、グルタチオンの欠乏によって起こる各種臓器の機能低下等による種々の疾患を予防、治療又は改善することができる。ただし、本発明のグルタチオン産生促進剤は、これらの用途以外にもグルタチオン産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に使用することができる。
【００３６】
後述する実施例において示されるように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡは、皮膚線維芽細胞及び表皮角化細胞におけるグルタチオンの産生を効果的に促進することができるため、これらの化合物を含有するグルタチオン産生促進剤によれば、皮膚線維芽細胞及び表皮角化細胞内で活性酸素種を消去することができ、皮膚線維芽細胞及び表皮角化細胞を酸化的ストレスによる傷害等から保護することができ、結果として、皮膚の老化等を効果的に防止することができる。
【００３７】
また、グルタチオンがチロシナーゼの成熟化を抑制する作用を有していることから、グルタチオンの産生を促進することによってチロシナーゼの成熟化をより抑制することができ、メラノサイトにおけるメラニンの生成を抑制することができる。そのため、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上を含有するグルタチオン産生促進剤によれば、メラノサイトにおけるグルタチオンの産生を効果的に促進し、チロシナーゼの成熟化をより抑制することができるため、結果として、皮膚色素沈着症、皮膚の黒化、シミ、ソバカス等を予防することができる。
【００３８】
さらに、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡは、肝細胞におけるグルタチオンの産生を効果的に促進することができるため、これらの化合物を含有するグルタチオン産生促進剤は、グルタチオンの欠乏に起因する肝臓疾患を効果的に予防・治療することができる。
【００３９】
なお、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物をγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進剤に含有せしめることで、これらの化合物が有するγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、グルタチオンの前駆体であるγ−グルタミルシステインの生合成を促進することができる。
【００４０】
本発明のグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤は、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物が有するグルタチオン産生促進作用を通じて、グルタチオンの欠乏に起因する疾患（例えば、活性酸素種等の酸化ストレスによって起こる疾患；肝炎、肝機能障害等の肝臓疾患；慢性腎不全；特発性肺線維症、成人呼吸器障害症候群等の呼吸器系疾患；白内障；虚血性心疾患；パーキンソン病；アルツハイマー病：胃潰瘍等の消化器系疾患；癌；骨髄形成不全；後天性免疫不全症候群；潜伏性ウイルス感染症等）を予防・治療することができるとともに、酸化型グルタチオンの細胞内濃度を上昇させることができるため、不眠症等の睡眠障害を予防、治療又は改善することができる。
【００４１】
〔飲食品〕
本発明の飲食品は、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上を配合したものである。
【００４２】
リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡは、グルタチオン産生促進作用を有しており、消化管で消化されるようなものではないことが確認されており、また安全性に優れているため、一般食品、健康食品、保健機能食品又は栄養補助食品等、任意の飲食品に配合するのに好適である。この場合、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物をそのまま配合してもよいし、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物により製剤化したグルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤を配合してもよい。
【００４３】
上記リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物、グルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤を飲食品に配合する場合、それらにおける有効成分の配合量は、使用目的、性別、症状等を考慮して適宜調整することができるが、添加対象飲食品の一般的な摂取量を考慮して成人１日あたりの化合物摂取量が約０．１〜１０００ｍｇになるようにするのが好ましい。
【００４４】
上記リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物、グルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤を配合し得る飲食品は、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡの有するグルタチオン産生促進作用を妨げない限り、特に限定されるものではない。
【００４５】
具体例としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物；その他種々の形態の健康・栄養補助食品；錠剤、カプセル剤、ドリンク剤などに上記リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物、グルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤を配合することができ、このとき、通常用いられる補助的な原料や添加物を併用することができる。
【００４６】
なお、本発明のグルタチオン産生促進剤、グルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤又は飲食品は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【実施例】
【００４７】
以下、製造例、試験例及び配合例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。
【００４８】
〔製造例１〕リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡの製造
甘草（Glycyrrhiza inflata）の根部５００ｇに５０容量％エタノール（水とエタノールとの容量比＝１：１）５０００ｍＬを加え、穏やかに撹拌しながら８０℃にて２時間保ち、熱時濾過した。得られた抽出液を４０℃で減圧下にて濃縮し、減圧乾燥機で乾燥して甘草根部５０容量％エタノール抽出物（１２４ｇ）を得た。
【００４９】
このようにして得られた甘草根部５０容量％エタノール抽出物１００ｇに水１Ｌを加えて懸濁させ、多孔性樹脂（商品名：ＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０，和光純薬社製）１Ｌ上に付し、水２０００ｍＬ、３０容量％エタノール２０００ｍＬ、７０容量％エタノール２０００ｍＬ及び９９容量％エタノール２０００ｍＬの順で溶出させた。
【００５０】
このようにして得られた９９容量％エタノール画分（固形分：２．８ｇ）を６０容量％メタノール（水とメタノールの容量比＝４：６）に溶解し、ＯＤＳカラム（商品名：クロマトレックスＯＤＳ ＤＭ１０２０Ｔ，富士シリシア化学社製）に付し、移動相として６０容量％メタノール（水とメタノールとの容量比＝４：６）を用いて溶出させ分離し、画分１、画分２及び画分３を得た。得られた画分１、２及び３をそれぞれ減圧下で濃縮し、画分１の濃縮物（２００ｍｇ）、画分２の濃縮物（３００ｍｇ）及び画分３の濃縮物（１００ｍｇ）を得た。
【００５１】
得られた画分１の濃縮物、画分２の濃縮物及び画分３の濃縮物のそれぞれにメタノール１０ｍＬと水１０ｍＬとを加えて一晩放置し、再結晶させることで、それぞれの精製物（１２５ｍｇ（試料２），１８５ｍｇ（試料４），６７ｍｇ（試料５））を得た。
【００５２】
上記７０容量％エタノール画分（固形分：１０．０ｇ）を４０容量％メタノール（水とメタノールの容量比＝６：４）に溶解し、ＯＤＳカラム（商品名：クロマトレックスＯＤＳ ＤＭ１０２０Ｔ，富士シリシア化学社製）に付し、移動相として４０容量％メタノール（水とメタノールとの容量比＝６：４）を用いて溶出させ分離し、画分４及び画分５を得た。得られた画分４及び５をそれぞれ減圧下で濃縮し、画分４の濃縮物（６．７ｇ）及び画分５の濃縮物（３．２ｇ）を得た。得られた画分４の濃縮物及び画分５の濃縮物をそれぞれクロロホルム：メタノール＝５：１（容量比）の混合液に溶解し、ＳｉＯ２カラム（商品名：シリカゲル６０，富士シリシア化学社製）に付し、移動相としてクロロホルム：メタノール＝５：１（容量比）の混合液を用いて溶出させ分離した後、減圧下濃縮した。得られたそれぞれの濃縮物を下記の液体クロマトグラフィーを用いて分画した。
【００５３】
＜液体クロマトグラフィー条件＞
固定相：ＪＡＩＧＥＬ ＧＳ−３１０（日本分析工業社製）
カラム径：２０ｍｍ
カラム長：５００ｍｍ
移動相流量：５ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
【００５４】
上記液体クロマトグラフィーにて保持時間６０分〜７０分に流出する画分を、リサイクルＨＰＬＣにより精製することで、精製物（３５０ｍｇ，２７０ｍｇ，試料１，３）をそれぞれ得た。上述のようにして得られた各精製物（試料１〜５）を１３Ｃ−ＮＭＲにより分析した結果を下記に示す。
【００５５】
＜試料１の１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属炭素，ＤＭＳＯ−ｄ６）：＞
43.1(3-C)，60.7(6''-C)，69.7(4''-C)，73.1(2''-C)，76.5(3''-C)，76.9(5''-C)，78.5(2-C)，100.3(1''-C)，102.4(8-C)，110.4(6-C)，113.4(10-C)，116.1(3',5'-C)，127.7(2',6'-C)，128.1(5-C)，132.2(1'-C)，157.2(4'-C)，162.8(9-C)，164.4(7-C)，189.5(4-C)
【００５６】
＜試料２の１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属炭素，ＤＭＳＯ−ｄ６）：＞
43.1(3-C)，78.8(2-C)，102.4(8-C)，110.3(6-C)，113.4(10-C)，114.9(3',5'-C)，127.9(2',6'-C)，127.9(5-C)，129.1(1'-C)，157.3(4'-C)，162.9(9-C)，164.3(7-C)，189.7(4-C)
【００５７】
＜試料３の１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属炭素，ＤＭＳＯ−ｄ６）：＞
60.6(6''-C)，69.6(4''-C)，73.1(2''-C)，76.5(3''-C)，77.0(5''-C)，99.9(1''-C)，102.4(3'-C)，108.0(5'-C)，112.8(1'-C)，116.3(3',5'-C)，119.0(α-C)，128.2(1-C)，130.4(2',6'-C)，132.7(6'-C)，143.2(β-C)，159.2(4'-C)，164.9(2'-C)，165.5(4'-C)，191.2(C=O)
【００５８】
＜試料４の１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属炭素，ＤＭＳＯ−ｄ６）：＞
102.4(3'-C)，107.9(5'-C)，112.8(1'-C)，115.6(3',5'-C)，117.3(α-C)，125.6(1-C)，130.9(2',6'-C)，132.5(6'-C)，143.9(β-C)，156.0(4'-C)，164.6(2'-C)，165.4(4'-C)，191.2(C=O)
【００５９】
＜試料５の１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属炭素，ＣＤＣｌ３）：＞
27.1(4''',5'''-C)，39.8(1'''-C)，55.6(OMe)，101.1(3-C)，113.8(3'''-C)，115.6(3',5'-C)，116.3(1-C)，120.0(α-C)，124.6(5-C)，128.8(6-C)，130.8(1'-C)，131.2(2',6'-C)，141.4(β-C)，147.6(2'''-C)，158.3(2-C)，159.5(4-C)，160.9(4'-C)，190.8(C=O)
【００６０】
以上の結果から、得られた各精製物のそれぞれが、リクイリチン（試料１）、リクイリチゲニン（試料２）、イソリクイリチン（試料３）、イソリクイリチゲニン（試料４）及びリコカルコンＡ（試料５）であることが確認された。
【００６１】
〔試験例１〕表皮角化細胞におけるグルタチオン産生促進作用試験
上記のようにして得られたリクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡ（試料１〜５）について、以下のようにして表皮角化細胞におけるグルタチオン産生促進作用を試験した。
【００６２】
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（Normal Human Epidermal Keratinocyte：ＮＨＥＫ）を、正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（EpiLife-KG2）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにEpiLife-KG2で希釈した後、４８ウェルプレートに１ウェル当たり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。
【００６３】
培養後、EpiLife-KG2で溶解した試料溶液（試料１〜５，試料濃度は下記表１を参照）を各ウェルに２００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、各ウェルから培地を抜き、４００μＬのＰＢＳ(−)にて洗浄後、１５０μＬのＭ−ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用して細胞を溶解した。
【００６４】
このうちの１００μＬを使用して総グルタチオンの定量を行った。すなわち、９６ウェルプレートに溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１Ｍのリン酸緩衝液５０μＬ、２ｍＭのＮＡＤＰＨ２５μＬ及びグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度１７．５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を加え３７℃で１０分間加温した後、１０ｍＭの5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)２５μＬを加え、５分後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は、酸化型グルタチオン（和光純薬社製）を使用して作成した検量線をもとに算出した。得られた値を総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記式に基づいてグルタチオン産生促進率（％）を算出した。
【００６５】
グルタチオン産生促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
式中、Ａは「試料無添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量」を表す。
結果を表１に示す。
【００６６】
【表１】
【００６７】
表１に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡは、いずれも表皮角化細胞においてグルタチオンの産生を効果的に促進し得ることが確認された。
【００６８】
〔試験例２〕皮膚線維芽細胞におけるグルタチオン産生促進作用試験
上記のようにして得られたリクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡ（試料１〜５）について、以下のようにして皮膚線維芽細胞におけるグルタチオン産生促進作用を試験した。
【００６９】
ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を、１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭで希釈した後、４８ウェルプレートに１ウェルあたり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。
【００７０】
培養後、１％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭで溶解した試料溶液（試料１〜５，試料濃度は下記表２を参照）を各ウェルに２００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、各ウェルから培地を抜き、４００μＬのＰＢＳ(−)にて洗浄後、１５０μＬのＭ−ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて細胞を溶解した。
【００７１】
このうちの１００μＬを使用して総グルタチオンの定量を行った。すなわち、９６ウェルプレートに溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１Ｍのリン酸緩衝液５０μＬ、２ｍＭのＮＡＤＰＨ２５μＬ及びグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度１７．５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を加え３７℃で１０分間加温した後、１０ｍＭの5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)２５μＬを加え、５分後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は、酸化型グルタチオン（和光純薬社製）を使用して作成した検量線をもとに算出した。得られた値を総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記式に基づいてグルタチオン産生促進率（％）を算出した。
【００７２】
グルタチオン産生促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
式中、Ａは「試料無添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量」を表す。
結果を表２に示す。
【００７３】
【表２】
【００７４】
表２に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡは、いずれも皮膚線維芽細胞においてグルタチオンの産生を効果的に促進し得ることが確認された。
【００７５】
〔試験例３〕Ｂ１６メラノーマ細胞におけるグルタチオン産生促進作用試験
上記のようにして得られたリクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡ（試料１〜５）について、以下のようにしてＢ１６メラノーマ細胞におけるグルタチオン産生促進作用を試験した。
【００７６】
Ｂ１６メラノーマ細胞を、１０％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように１０％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地で希釈した後、４８ウェルプレートに１ウェル当たり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。
【００７７】
培養後、１％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地で溶解した試料溶液（試料１〜５，試料濃度は下記表３を参照）を各ウェルに２００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、各ウェルから培地を抜き、４００μＬのＰＢＳ(−)にて洗浄後、１５０μＬのＭ−ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用して細胞を溶解した。
【００７８】
このうちの１００μＬを使用して総グルタチオンの定量を行った。すなわち、９６ウェルプレートに溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１Ｍのリン酸緩衝液５０μＬ、２ｍＭのＮＡＤＰＨ２５μＬ及びグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度１７．５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を加え３７℃で１０分間加温した後、１０ｍＭの5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)２５μＬを加え、５分後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は、酸化型グルタチオン（和光純薬社製）を使用して作成した検量線をもとに算出した。得られた値を総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記式に基づいてグルタチオン産生促進率（％）を算出した。
【００７９】
グルタチオン産生促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
式中、Ａは「試料無添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量」を表す。
結果を表３に示す。
【００８０】
【表３】
【００８１】
表３に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡは、いずれもＢ１６メラノーマ細胞においてグルタチオンの産生を効果的に促進し得ることが確認された。
【００８２】
〔試験例４〕肝細胞におけるグルタチオン産生促進作用試験
上記のようにして得られたリクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡ（試料１〜５）について、以下のようにして肝細胞におけるグルタチオン産生促進作用を試験した。
【００８３】
正常ヒト肝細胞（Cell System-Hc Cells，セルシステムズ社）を、ＣＳ−Ｃ無血清培地（セルシステムズ社製）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにＣＳ−Ｃ無血清培地で希釈した後、２４ウェルプレートに１ウェルあたり４００μＬずつ播種し、一晩培養した。
【００８４】
培養後、ＣＳ−Ｃ無血清培地で溶解した試料溶液（試料１〜５，試料濃度は下記表４を参照）を各ウェルに４００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、各ウェルから培地を抜き、４００μＬのＰＢＳ(−)にて洗浄後、２５０μＬのＭ−ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて細胞を溶解した。
【００８５】
このうちの１００μＬを用いて総グルタチオンの定量を行った。すなわち、９６ウェルプレートに溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１Ｍのリン酸緩衝液５０μＬ、２ｍＭのＮＡＤＰＨ２５μＬ及びグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度１７．５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を加え３７℃で１０分間加温した後、１０ｍＭの5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)２５μＬを加え、５分後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は、酸化型グルタチオン（和光純薬社製）を使用して作成した検量線をもとに算出した。得られた値を総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記式に基づいてグルタチオン産生促進率（％）を算出した。
【００８６】
グルタチオン産生促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
式中、Ａは「試料無添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量」を表す。
結果を表４に示す。
【００８７】
【表４】
【００８８】
表４に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡは、いずれも肝細胞においてグルタチオンの産生を促進し得ることが確認された。
【００８９】
〔試験例５〕表皮角化細胞におけるγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用試験
上記のようにして得られたリクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡ（試料１〜５）について、以下のようにして表皮角化細胞におけるγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【００９０】
正常ヒト新生児表皮角化細胞（Normal Human Epidermal Keratinocyte：ＮＨＥＫ）を、正常ヒト表皮角化細胞長期培養増殖培地（EpiLife-KG2）を用いた培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにEpiLife-KG2で希釈した後、３５ｍｍシャーレに２．５ｍＬずつ播種し、一晩培養した。
【００９１】
培養後、EpiLife-KG2で溶解した試料溶液（試料１〜５，試料濃度は下記表５を参照）を２．５ｍＬ添加し、さらに１６時間培養した。培養終了後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製，Cat.No.311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００μｇ／ｍＬになるように総ＲＮＡを調整した。
【００９２】
この総ＲＮＡを鋳型とし、γ−グルタミルシステインシンテターゼ及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム２ＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。γ−グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現量は、同一サンプルにおけるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量の値で補正を行った後、さらに「試料無添加時」の補正値を１００としたときの「試料添加時」の補正値を算出した後に、下記式に基づいてγ−グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現促進率（％）を算出した。
【００９３】
ｍＲＮＡ発現促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
式中、Ａは「試料無添加時のｍＲＮＡ発現量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時のｍＲＮＡ発現量」を表す。
結果を表５に示す。
【００９４】
【表５】
【００９５】
表５に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡは、いずれも表皮角化細胞においてγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡの発現を効果的に促進し得ることが確認された。
【００９６】
〔試験例６〕皮膚線維芽細胞におけるγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用試験
上記のようにして得られたリクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡ（試料１〜５）について、以下のようにして皮膚線維芽細胞におけるγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【００９７】
ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を、１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭを用いた培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように１０％ＦＢＳ含有アルファ−ＭＥＭで希釈した後、３５ｍｍシャーレに２．５ｍＬずつ播種し、一晩培養した。
【００９８】
培養後、１％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭで溶解した試料溶液（試料１〜５，試料濃度は下記表６を参照）を２．５ｍＬ添加し、さらに１６時間培養した。培養終了後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製，Cat.No.311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００μｇ／ｍＬになるように総ＲＮＡを調整した。
【００９９】
この総ＲＮＡを鋳型とし、γ−グルタミルシステインシンテターゼ及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム２ＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。γ−グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現量は、同一サンプルにおけるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量の値で補正を行った後、さらに「試料無添加時」の補正値を１００としたときの「試料添加時」の補正値を算出した後に、下記式に基づいてγ−グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現促進率（％）を算出した。
【０１００】
ｍＲＮＡ発現促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
式中、Ａは「試料無添加時のｍＲＮＡ発現量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時のｍＲＮＡ発現量」を表す。
結果を表６に示す。
【０１０１】
【表６】
【０１０２】
表６に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡは、いずれも皮膚線維芽細胞においてγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡの発現を効果的に促進し得ることが確認された。
【０１０３】
〔試験例７〕肝細胞におけるγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用試験
上記のようにして得られたリクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡ（試料１〜５）について、以下のようにして肝細胞におけるγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【０１０４】
正常ヒト肝細胞（Cell System-Hc Cells，セルシステムズ社）を、ＣＳ−Ｃ無血清培地（セルシステムズ社製）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにＣＳ−Ｃ無血清培地で希釈した後、３５ｍｍシャーレに２．５ｍＬずつ播種し、一晩培養した。
【０１０５】
培養後、ＣＳ−Ｃ無血清培地で溶解した試料溶液（試料１〜５，試料濃度は下記表７を参照）を２．５ｍＬ添加し、さらに１６時間培養した。培養終了後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製，Cat.No.311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００μｇ／ｍＬになるように総ＲＮＡを調整した。
【０１０６】
この総ＲＮＡを鋳型とし、γ−グルタミルシステインシンテターゼ及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム２ＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。γ−グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現量は、同一サンプルにおけるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量の値で補正を行った後、さらに「試料無添加時」の補正値を１００としたときの「試料添加時」の補正値を算出した後に、下記式に基づいてγ−グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現促進率（％）を算出した。
【０１０７】
ｍＲＮＡ発現促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
式中、Ａは「試料無添加時のｍＲＮＡ発現量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時のｍＲＮＡ発現量」を表す。
結果を表７に示す。
【０１０８】
【表７】
【０１０９】
表７に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡは、いずれも肝細胞においてγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡの発現を効果的に促進し得ることが確認された。
【０１１０】
上述した試験例１〜４から明らかなように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡは、いずれも優れたグルタチオン産生促進作用を有している。また、試験例５〜７から明らかなように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡは、いずれも優れたγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を有している。このことから、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡは、γ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、グルタチオンの前駆体であるγ−グルタミルシステインの生合成を促進し、それにより生体内でのグルタチオンの産生を促進しているものと推察される。
【０１１１】
〔配合例１〕
常法により、以下の組成を有する錠剤を製造した。
リクイリチン（試料１） ７．５ｍｇ
イソリクイリチゲニン（試料４） ３．５ｍｇ
リコカルコンＡ（試料５） ４．０ｍｇ
乳精ミネラル（カルシウム２５〜３０％含有） １００．０ｍｇ
ビタミンＫ２（１％含有粉末） １．５ｍｇ
マルチトール １７１．０ｍｇ
グリセリン脂肪酸エステル １２．５ｍｇ
【０１１２】
〔配合例２〕
常法により、以下の組成を有する錠剤を製造した。
リクイリチゲニン（試料２） ３．０ｍｇ
イソリクイリチゲニン（試料４） ２．０ｍｇ
ドロマイト（カルシウム２０％、マグネシウム１０％含有） ８３．４ｍｇ
カゼインホスホペプチド １６．７ｍｇ
ビタミンＣ ３３．４ｍｇ
マルチトール １３６．８ｍｇ
コラーゲン １２．７ｍｇ
ショ糖脂肪酸エステル １２．０ｍｇ
【０１１３】
〔配合例３〕
常法により、以下の組成を有するカプセル剤を製造した。なお、カプセルとしては、１号ハードゼラチンカプセルを使用した。
＜１カプセル（１錠２００ｍｇ）中の組成＞
イソリクイリチン（試料３） ４．０ｍｇ
イソリクイリチゲニン（試料４） ４．０ｍｇ
リコカルコンＡ（試料５） ２．０ｍｇ
コーンスターチ ７０．０ｍｇ
乳糖 １００．０ｍｇ
乳酸カルシウム １０．０ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ−Ｌ） １０．０ｍｇ
【０１１４】
〔配合例４〕
常法により、以下の組成を有する経口液状製剤を製造した。
＜１アンプル（１本１００ｍＬ）中の組成＞
リクイリチン（試料１） ０．２質量％
イソリクイリチゲニン（試料４） ０．１質量％
ソルビット １２．０質量％
安息香酸ナトリウム ０．１質量％
香料 １．０質量％
硫酸カルシウム ０．５質量％
精製水 残部（１００質量％）
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明のグルタチオン産生促進剤は、皮膚の老化、シミ、紫外線の照射による酸化ストレスに対する傷害、グルタチオンの欠乏に起因する疾患（例えば、活性酸素種等の酸化ストレスによって起こる疾患；肝炎、肝機能障害等の肝臓疾患；慢性腎不全；特発性肺線維症、成人呼吸器障害症候群等の呼吸器系疾患；白内障；虚血性心疾患；パーキンソン病；アルツハイマー病：胃潰瘍等の消化器系疾患；癌；骨髄形成不全；後天性免疫不全症候群；潜伏性ウイルス感染症等）、酸化型グルタチオンの欠乏に起因する不眠症等の睡眠障害等の予防、治療又は改善に大きく貢献できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルタチオン産生促進剤、グルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤及び飲食品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
グルタチオンは、グルタミン酸、システイン、グリシンの３つのアミノ酸からなるトリペプチドであり、細胞内の主要なシステイン残基を有する化合物である。このグルタチオンは、細胞内においてラジカルの捕捉、酸化還元による細胞機能の調節、解毒機構への関与及び各種酵素のＳＨ供与体等としての役割を果たすことが知られている。
【０００３】
このような役割を果たすグルタチオンの細胞内濃度が低下すると、紫外線曝露による細胞傷害、炎症、黒色化、シミ又はソバカスの生成、急性又は慢性アルコール肝障害、肝臓病、慢性腎不全、喫煙等が要因の肺疾患、特発性肺線維症、白内障、虚血性心疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、胃潰瘍、成人呼吸器障害症候群、免疫不全、骨髄形成不全、後天性免疫不全症候群、潜伏性ウイルス感染症、生理学的な加齢に伴う老化現象、及び癌化等の病状が引き起こされることが知られている。このようなグルタチオンの細胞内濃度の低下によって引き起こされる病状の治療には、従来、細胞内グルタチオン濃度の低下した細胞にグルタチオンを取り込ませることを目的として、グルタチオンを含有するグルタチオン製剤が用いられていた（特許文献１参照）。しかしながら、グルタチオン製剤の経口摂取による治療は、治療対象部位によっては思うような効果が期待できず、また、グルタチオン製剤の静脈注射による治療は、経口摂取による治療より効果は期待できるものの、痛みを伴うこと、通院が必要なこと等の問題を抱えていた。
【０００４】
したがって、生体内細胞におけるグルタチオンの産生を促進することにより細胞内グルタチオン濃度を上昇させることができれば、加齢により衰える酸化ストレスに対する防御能を高めるとともに、紫外線の照射による酸化ストレスに対する傷害を抑制することにつながり、皮膚の老化、シミ等の色素沈着症の予防、治療又は改善が期待できるとともに、グルタチオンの欠乏によって起こる各種臓器の機能低下や種々の疾患の予防又は治療が期待できると考えられる。このような考えに基づき、グルタチオン産生促進作用を有するものとして、ビルベリー抽出物及びウォルナット抽出物（特許文献２参照）、クチナシ属植物の抽出物（特許文献３参照）等が知られている。
【０００５】
また、生体内において、グルタチオンは、活性酸素種を除去する作用を有する還元型グルタチオン、及び還元型グルタチオンと活性酸素種との反応により生産される酸化型グルタチオンとして存在する。近年、この酸化型グルタチオンが、神経細胞の興奮を抑制し、睡眠を促進する睡眠促進物質であることが確認されている。そのため、グルタチオンの産生を促進し、還元型グルタチオンのみならず、酸化型グルタチオンの細胞内濃度をも上昇させることができれば、不眠症等の睡眠障害の予防、治療又は改善に有効であると考えられている。このような考えに基づき、従来、酸化型グルタチオンを有効成分とする催眠剤が知られている（特許文献４参照）。
【０００６】
生体細胞においては、γ−グルタミルシステインシンテターゼの作用により、システインとグルタミン酸とが反応してγ−グルタミルシステインが生合成され、グルタチオンシンテターゼの作用により、γ−グルタミルシステインとグリシンとが反応してグルタチオンが生合成されることが知られている。そのため、グルタチオンの前駆体であるγ−グルタミルシステインを生合成するための触媒的役割を果たすγ−グルタミルシステインシンテターゼの発現を促進することで、生体細胞内グルタチオン濃度を上昇させることができると考えられる。
【特許文献１】国際公開２００３／０３２９６６号パンフレット
【特許文献２】特開２００６−２４１０６２号公報
【特許文献３】特開２００６−３４７９３４号公報
【特許文献４】特開平４−９３３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、安全性の高い天然物の中からグルタチオン産生促進作用及びγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を有するものを見出し、それを有効成分とするグルタチオン産生促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明のグルタチオン産生促進剤及びグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤は、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上を有効成分として含有することを特徴とする。
【０００９】
また、本発明の飲食品は、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上を配合したことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上を有効成分として含有し、安全性に優れたグルタチオン産生促進剤、グルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤及び飲食品を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明について説明する。
〔グルタチオン産生促進剤，グルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤〕
本発明のグルタチオン産生促進剤及びグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤は、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上を有効成分として含有する。
【００１２】
リクイリチン（liquiritin）、リクイリチゲニン（liquiritigenin）、イソリクイリチン（isoliquiritin）、イソリクイリチゲニン（isoliquiritigenin）及びリコカルコンＡ（licochalcone A）は、フラボノイド類の一種であり、これらの化合物を含有する植物抽出物から単離・精製することにより製造することができる。
【００１３】
リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン又はリコカルコンＡを含有する植物抽出物は、植物の抽出に一般に用いられている方法によって得ることができる。リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン又はリコカルコンＡを含有する植物としては、例えば、甘草等が挙げられる。
【００１４】
甘草には、Glychyrrhiza glabra、Glychyrrhiza inflata、Glychyrrhiza uralensis、Glychyrrhiza aspera、Glychyrrhiza eurycarpa、Glychyrrhiza pallidiflora、Glychyrrhiza yunnanensis、Glychyrrhiza lepidota、Glychyrrhiza echinata、Glychyrrhiza acanthocarpa等、様々な種類のものがあり、これらのうち、いずれの種類の甘草を抽出原料として使用してもよいが、特にGlychyrrhiza glabraを抽出原料として使用することが好ましい。
【００１５】
抽出原料として使用し得る甘草の構成部位としては、例えば、葉部、枝部、樹皮部、幹部、茎部、果実部、花部等の地上部、根部又はこれらの部位の混合物等が挙げられるが、好ましくは根部である。
【００１６】
リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン又はリコカルコンＡを含有する植物抽出物は、抽出原料を乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより得ることができる。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、植物の極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００１７】
抽出溶媒としては、極性溶媒を用いるのが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。
【００１８】
抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、酸性化、アルカリ化、緩衝化等が含まれる。したがって、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、有機酸酸性水、アンモニアアルカリ水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００１９】
抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。
【００２０】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族アルコール１〜９０容量部を混合するのが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族ケトン１〜４０容量部を混合するのが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して多価アルコール１０〜９０容量部を混合するのが好ましい。
【００２１】
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液から溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られ、この濃縮物をさらに乾燥すると乾燥物が得られる。
【００２２】
以上のようにして得られた抽出液、当該抽出液の濃縮物又は当該抽出液の乾燥物からリクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン又はリコカルコンＡを単離・精製する方法は、特に限定されるものではなく、常法により行うことができる。
【００２３】
例えば、植物抽出物を、シリカゲルやアルミナ等の多孔質物質、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体やポリメタクリレート等の多孔性樹脂等を用いたカラムクロマトグラフィーに付して、水、アルコールの順で溶出させ、アルコールで溶出される画分として得ることができる。
【００２４】
カラムクロマトグラフィーにて溶出液として用いられるアルコールは、特に限定されるものではなく、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール又はそれらの水溶液等が挙げられる。
【００２５】
さらに、カラムクロマトグラフィーにより得られたアルコール画分を、ＯＤＳを用いた逆相シリカゲルクロマトグラフィー、再結晶、液−液向流抽出、イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー等の任意の有機化合物精製手段を用いて精製してもよい。
【００２６】
以上のようにして得られるリクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン又はリコカルコンＡは、グルタチオン産生促進作用を有しているため、その作用を利用してグルタチオン産生促進剤の有効成分として使用することができる。なお、上記化合物は、γ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用も有しているため、その作用を利用してγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進剤の有効成分としても使用することができる。
【００２７】
また、上記化合物は、そのグルタチオン産生促進作用を通じて、グルタチオンの産生を促進することができるため、グルタチオンの欠乏に起因する疾患（例えば、活性酸素種等の酸化ストレスによって起こる疾患；肝炎、肝機能障害等の肝臓疾患；慢性腎不全；特発性肺線維症、成人呼吸器障害症候群等の呼吸器系疾患；白内障；虚血性心疾患；パーキンソン病；アルツハイマー病：胃潰瘍等の消化器系疾患；癌；骨髄形成不全；後天性免疫不全症候群；潜伏性ウイルス感染症等）の予防・治療剤の有効成分としても使用することができる。
【００２８】
さらに、上記化合物は、グルタチオン産生促進作用を有しており、その作用を利用して酸化型グルタチオンの細胞内濃度を上昇させることができるため、不眠症等の睡眠障害の予防、治療又は改善剤の有効成分としても使用することができる。
【００２９】
なお、本発明のグルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤においては、上記化合物のうちのいずれか１種を上記有効成分として使用してもよいし、上記化合物より選ばれる２種以上の化合物を混合して上記有効成分として使用してもよい。上記化合物より選ばれる２種以上の化合物を混合して上記有効成分として使用する場合、それらの配合比は、それらの作用の程度に応じて適宜決定すればよい。
【００３０】
本発明のグルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤は、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上のみからなるものであってもよいし、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上を製剤化したものであってもよい。
【００３１】
リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を使用して、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味・矯臭剤等を使用することができる。また、上記化合物は、他の組成物（例えば、飲食品等）に配合して使用することができるほか、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等として使用することができる。
【００３２】
なお、本発明のグルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤は、必要に応じて、グルタチオン産生促進作用を有する他の天然抽出物等を配合して有効成分として使用することができる。
【００３３】
本発明のグルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤の投与方法としては、一般に経皮投与、経口投与、静脈投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。
【００３４】
また、本発明のグルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。
【００３５】
本発明のグルタチオン産生促進剤は、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物が有するグルタチオン産生促進作用を通じて、加齢により衰える酸化ストレスに対する防御能を高めるとともに、紫外線の照射による酸化ストレスに対する傷害を抑制することができ、皮膚の老化、シミ等の色素沈着症や、グルタチオンの欠乏によって起こる各種臓器の機能低下等による種々の疾患を予防、治療又は改善することができる。ただし、本発明のグルタチオン産生促進剤は、これらの用途以外にもグルタチオン産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に使用することができる。
【００３６】
後述する実施例において示されるように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡは、皮膚線維芽細胞及び表皮角化細胞におけるグルタチオンの産生を効果的に促進することができるため、これらの化合物を含有するグルタチオン産生促進剤によれば、皮膚線維芽細胞及び表皮角化細胞内で活性酸素種を消去することができ、皮膚線維芽細胞及び表皮角化細胞を酸化的ストレスによる傷害等から保護することができ、結果として、皮膚の老化等を効果的に防止することができる。
【００３７】
また、グルタチオンがチロシナーゼの成熟化を抑制する作用を有していることから、グルタチオンの産生を促進することによってチロシナーゼの成熟化をより抑制することができ、メラノサイトにおけるメラニンの生成を抑制することができる。そのため、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上を含有するグルタチオン産生促進剤によれば、メラノサイトにおけるグルタチオンの産生を効果的に促進し、チロシナーゼの成熟化をより抑制することができるため、結果として、皮膚色素沈着症、皮膚の黒化、シミ、ソバカス等を予防することができる。
【００３８】
さらに、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡは、肝細胞におけるグルタチオンの産生を効果的に促進することができるため、これらの化合物を含有するグルタチオン産生促進剤は、グルタチオンの欠乏に起因する肝臓疾患を効果的に予防・治療することができる。
【００３９】
なお、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物をγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進剤に含有せしめることで、これらの化合物が有するγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、グルタチオンの前駆体であるγ−グルタミルシステインの生合成を促進することができる。
【００４０】
本発明のグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤は、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物が有するグルタチオン産生促進作用を通じて、グルタチオンの欠乏に起因する疾患（例えば、活性酸素種等の酸化ストレスによって起こる疾患；肝炎、肝機能障害等の肝臓疾患；慢性腎不全；特発性肺線維症、成人呼吸器障害症候群等の呼吸器系疾患；白内障；虚血性心疾患；パーキンソン病；アルツハイマー病：胃潰瘍等の消化器系疾患；癌；骨髄形成不全；後天性免疫不全症候群；潜伏性ウイルス感染症等）を予防・治療することができるとともに、酸化型グルタチオンの細胞内濃度を上昇させることができるため、不眠症等の睡眠障害を予防、治療又は改善することができる。
【００４１】
〔飲食品〕
本発明の飲食品は、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上を配合したものである。
【００４２】
リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡは、グルタチオン産生促進作用を有しており、消化管で消化されるようなものではないことが確認されており、また安全性に優れているため、一般食品、健康食品、保健機能食品又は栄養補助食品等、任意の飲食品に配合するのに好適である。この場合、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物をそのまま配合してもよいし、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物により製剤化したグルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤を配合してもよい。
【００４３】
上記リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物、グルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤を飲食品に配合する場合、それらにおける有効成分の配合量は、使用目的、性別、症状等を考慮して適宜調整することができるが、添加対象飲食品の一般的な摂取量を考慮して成人１日あたりの化合物摂取量が約０．１〜１０００ｍｇになるようにするのが好ましい。
【００４４】
上記リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物、グルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤を配合し得る飲食品は、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡの有するグルタチオン産生促進作用を妨げない限り、特に限定されるものではない。
【００４５】
具体例としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物；その他種々の形態の健康・栄養補助食品；錠剤、カプセル剤、ドリンク剤などに上記リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物、グルタチオン産生促進剤又はグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤を配合することができ、このとき、通常用いられる補助的な原料や添加物を併用することができる。
【００４６】
なお、本発明のグルタチオン産生促進剤、グルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤又は飲食品は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【実施例】
【００４７】
以下、製造例、試験例及び配合例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。
【００４８】
〔製造例１〕リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡの製造
甘草（Glycyrrhiza inflata）の根部５００ｇに５０容量％エタノール（水とエタノールとの容量比＝１：１）５０００ｍＬを加え、穏やかに撹拌しながら８０℃にて２時間保ち、熱時濾過した。得られた抽出液を４０℃で減圧下にて濃縮し、減圧乾燥機で乾燥して甘草根部５０容量％エタノール抽出物（１２４ｇ）を得た。
【００４９】
このようにして得られた甘草根部５０容量％エタノール抽出物１００ｇに水１Ｌを加えて懸濁させ、多孔性樹脂（商品名：ＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０，和光純薬社製）１Ｌ上に付し、水２０００ｍＬ、３０容量％エタノール２０００ｍＬ、７０容量％エタノール２０００ｍＬ及び９９容量％エタノール２０００ｍＬの順で溶出させた。
【００５０】
このようにして得られた９９容量％エタノール画分（固形分：２．８ｇ）を６０容量％メタノール（水とメタノールの容量比＝４：６）に溶解し、ＯＤＳカラム（商品名：クロマトレックスＯＤＳ ＤＭ１０２０Ｔ，富士シリシア化学社製）に付し、移動相として６０容量％メタノール（水とメタノールとの容量比＝４：６）を用いて溶出させ分離し、画分１、画分２及び画分３を得た。得られた画分１、２及び３をそれぞれ減圧下で濃縮し、画分１の濃縮物（２００ｍｇ）、画分２の濃縮物（３００ｍｇ）及び画分３の濃縮物（１００ｍｇ）を得た。
【００５１】
得られた画分１の濃縮物、画分２の濃縮物及び画分３の濃縮物のそれぞれにメタノール１０ｍＬと水１０ｍＬとを加えて一晩放置し、再結晶させることで、それぞれの精製物（１２５ｍｇ（試料２），１８５ｍｇ（試料４），６７ｍｇ（試料５））を得た。
【００５２】
上記７０容量％エタノール画分（固形分：１０．０ｇ）を４０容量％メタノール（水とメタノールの容量比＝６：４）に溶解し、ＯＤＳカラム（商品名：クロマトレックスＯＤＳ ＤＭ１０２０Ｔ，富士シリシア化学社製）に付し、移動相として４０容量％メタノール（水とメタノールとの容量比＝６：４）を用いて溶出させ分離し、画分４及び画分５を得た。得られた画分４及び５をそれぞれ減圧下で濃縮し、画分４の濃縮物（６．７ｇ）及び画分５の濃縮物（３．２ｇ）を得た。得られた画分４の濃縮物及び画分５の濃縮物をそれぞれクロロホルム：メタノール＝５：１（容量比）の混合液に溶解し、ＳｉＯ２カラム（商品名：シリカゲル６０，富士シリシア化学社製）に付し、移動相としてクロロホルム：メタノール＝５：１（容量比）の混合液を用いて溶出させ分離した後、減圧下濃縮した。得られたそれぞれの濃縮物を下記の液体クロマトグラフィーを用いて分画した。
【００５３】
＜液体クロマトグラフィー条件＞
固定相：ＪＡＩＧＥＬ ＧＳ−３１０（日本分析工業社製）
カラム径：２０ｍｍ
カラム長：５００ｍｍ
移動相流量：５ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
【００５４】
上記液体クロマトグラフィーにて保持時間６０分〜７０分に流出する画分を、リサイクルＨＰＬＣにより精製することで、精製物（３５０ｍｇ，２７０ｍｇ，試料１，３）をそれぞれ得た。上述のようにして得られた各精製物（試料１〜５）を１３Ｃ−ＮＭＲにより分析した結果を下記に示す。
【００５５】
＜試料１の１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属炭素，ＤＭＳＯ−ｄ６）：＞
43.1(3-C)，60.7(6''-C)，69.7(4''-C)，73.1(2''-C)，76.5(3''-C)，76.9(5''-C)，78.5(2-C)，100.3(1''-C)，102.4(8-C)，110.4(6-C)，113.4(10-C)，116.1(3',5'-C)，127.7(2',6'-C)，128.1(5-C)，132.2(1'-C)，157.2(4'-C)，162.8(9-C)，164.4(7-C)，189.5(4-C)
【００５６】
＜試料２の１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属炭素，ＤＭＳＯ−ｄ６）：＞
43.1(3-C)，78.8(2-C)，102.4(8-C)，110.3(6-C)，113.4(10-C)，114.9(3',5'-C)，127.9(2',6'-C)，127.9(5-C)，129.1(1'-C)，157.3(4'-C)，162.9(9-C)，164.3(7-C)，189.7(4-C)
【００５７】
＜試料３の１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属炭素，ＤＭＳＯ−ｄ６）：＞
60.6(6''-C)，69.6(4''-C)，73.1(2''-C)，76.5(3''-C)，77.0(5''-C)，99.9(1''-C)，102.4(3'-C)，108.0(5'-C)，112.8(1'-C)，116.3(3',5'-C)，119.0(α-C)，128.2(1-C)，130.4(2',6'-C)，132.7(6'-C)，143.2(β-C)，159.2(4'-C)，164.9(2'-C)，165.5(4'-C)，191.2(C=O)
【００５８】
＜試料４の１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属炭素，ＤＭＳＯ−ｄ６）：＞
102.4(3'-C)，107.9(5'-C)，112.8(1'-C)，115.6(3',5'-C)，117.3(α-C)，125.6(1-C)，130.9(2',6'-C)，132.5(6'-C)，143.9(β-C)，156.0(4'-C)，164.6(2'-C)，165.4(4'-C)，191.2(C=O)
【００５９】
＜試料５の１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属炭素，ＣＤＣｌ３）：＞
27.1(4''',5'''-C)，39.8(1'''-C)，55.6(OMe)，101.1(3-C)，113.8(3'''-C)，115.6(3',5'-C)，116.3(1-C)，120.0(α-C)，124.6(5-C)，128.8(6-C)，130.8(1'-C)，131.2(2',6'-C)，141.4(β-C)，147.6(2'''-C)，158.3(2-C)，159.5(4-C)，160.9(4'-C)，190.8(C=O)
【００６０】
以上の結果から、得られた各精製物のそれぞれが、リクイリチン（試料１）、リクイリチゲニン（試料２）、イソリクイリチン（試料３）、イソリクイリチゲニン（試料４）及びリコカルコンＡ（試料５）であることが確認された。
【００６１】
〔試験例１〕表皮角化細胞におけるグルタチオン産生促進作用試験
上記のようにして得られたリクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡ（試料１〜５）について、以下のようにして表皮角化細胞におけるグルタチオン産生促進作用を試験した。
【００６２】
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（Normal Human Epidermal Keratinocyte：ＮＨＥＫ）を、正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（EpiLife-KG2）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにEpiLife-KG2で希釈した後、４８ウェルプレートに１ウェル当たり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。
【００６３】
培養後、EpiLife-KG2で溶解した試料溶液（試料１〜５，試料濃度は下記表１を参照）を各ウェルに２００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、各ウェルから培地を抜き、４００μＬのＰＢＳ(−)にて洗浄後、１５０μＬのＭ−ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用して細胞を溶解した。
【００６４】
このうちの１００μＬを使用して総グルタチオンの定量を行った。すなわち、９６ウェルプレートに溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１Ｍのリン酸緩衝液５０μＬ、２ｍＭのＮＡＤＰＨ２５μＬ及びグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度１７．５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を加え３７℃で１０分間加温した後、１０ｍＭの5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)２５μＬを加え、５分後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は、酸化型グルタチオン（和光純薬社製）を使用して作成した検量線をもとに算出した。得られた値を総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記式に基づいてグルタチオン産生促進率（％）を算出した。
【００６５】
グルタチオン産生促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
式中、Ａは「試料無添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量」を表す。
結果を表１に示す。
【００６６】
【表１】
【００６７】
表１に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡは、いずれも表皮角化細胞においてグルタチオンの産生を効果的に促進し得ることが確認された。
【００６８】
〔試験例２〕皮膚線維芽細胞におけるグルタチオン産生促進作用試験
上記のようにして得られたリクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡ（試料１〜５）について、以下のようにして皮膚線維芽細胞におけるグルタチオン産生促進作用を試験した。
【００６９】
ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を、１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭで希釈した後、４８ウェルプレートに１ウェルあたり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。
【００７０】
培養後、１％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭで溶解した試料溶液（試料１〜５，試料濃度は下記表２を参照）を各ウェルに２００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、各ウェルから培地を抜き、４００μＬのＰＢＳ(−)にて洗浄後、１５０μＬのＭ−ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて細胞を溶解した。
【００７１】
このうちの１００μＬを使用して総グルタチオンの定量を行った。すなわち、９６ウェルプレートに溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１Ｍのリン酸緩衝液５０μＬ、２ｍＭのＮＡＤＰＨ２５μＬ及びグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度１７．５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を加え３７℃で１０分間加温した後、１０ｍＭの5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)２５μＬを加え、５分後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は、酸化型グルタチオン（和光純薬社製）を使用して作成した検量線をもとに算出した。得られた値を総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記式に基づいてグルタチオン産生促進率（％）を算出した。
【００７２】
グルタチオン産生促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
式中、Ａは「試料無添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量」を表す。
結果を表２に示す。
【００７３】
【表２】
【００７４】
表２に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡは、いずれも皮膚線維芽細胞においてグルタチオンの産生を効果的に促進し得ることが確認された。
【００７５】
〔試験例３〕Ｂ１６メラノーマ細胞におけるグルタチオン産生促進作用試験
上記のようにして得られたリクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡ（試料１〜５）について、以下のようにしてＢ１６メラノーマ細胞におけるグルタチオン産生促進作用を試験した。
【００７６】
Ｂ１６メラノーマ細胞を、１０％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように１０％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地で希釈した後、４８ウェルプレートに１ウェル当たり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。
【００７７】
培養後、１％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地で溶解した試料溶液（試料１〜５，試料濃度は下記表３を参照）を各ウェルに２００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、各ウェルから培地を抜き、４００μＬのＰＢＳ(−)にて洗浄後、１５０μＬのＭ−ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用して細胞を溶解した。
【００７８】
このうちの１００μＬを使用して総グルタチオンの定量を行った。すなわち、９６ウェルプレートに溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１Ｍのリン酸緩衝液５０μＬ、２ｍＭのＮＡＤＰＨ２５μＬ及びグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度１７．５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を加え３７℃で１０分間加温した後、１０ｍＭの5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)２５μＬを加え、５分後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は、酸化型グルタチオン（和光純薬社製）を使用して作成した検量線をもとに算出した。得られた値を総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記式に基づいてグルタチオン産生促進率（％）を算出した。
【００７９】
グルタチオン産生促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
式中、Ａは「試料無添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量」を表す。
結果を表３に示す。
【００８０】
【表３】
【００８１】
表３に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡは、いずれもＢ１６メラノーマ細胞においてグルタチオンの産生を効果的に促進し得ることが確認された。
【００８２】
〔試験例４〕肝細胞におけるグルタチオン産生促進作用試験
上記のようにして得られたリクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡ（試料１〜５）について、以下のようにして肝細胞におけるグルタチオン産生促進作用を試験した。
【００８３】
正常ヒト肝細胞（Cell System-Hc Cells，セルシステムズ社）を、ＣＳ−Ｃ無血清培地（セルシステムズ社製）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにＣＳ−Ｃ無血清培地で希釈した後、２４ウェルプレートに１ウェルあたり４００μＬずつ播種し、一晩培養した。
【００８４】
培養後、ＣＳ−Ｃ無血清培地で溶解した試料溶液（試料１〜５，試料濃度は下記表４を参照）を各ウェルに４００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、各ウェルから培地を抜き、４００μＬのＰＢＳ(−)にて洗浄後、２５０μＬのＭ−ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて細胞を溶解した。
【００８５】
このうちの１００μＬを用いて総グルタチオンの定量を行った。すなわち、９６ウェルプレートに溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１Ｍのリン酸緩衝液５０μＬ、２ｍＭのＮＡＤＰＨ２５μＬ及びグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度１７．５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を加え３７℃で１０分間加温した後、１０ｍＭの5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)２５μＬを加え、５分後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は、酸化型グルタチオン（和光純薬社製）を使用して作成した検量線をもとに算出した。得られた値を総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記式に基づいてグルタチオン産生促進率（％）を算出した。
【００８６】
グルタチオン産生促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
式中、Ａは「試料無添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量」を表す。
結果を表４に示す。
【００８７】
【表４】
【００８８】
表４に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡは、いずれも肝細胞においてグルタチオンの産生を促進し得ることが確認された。
【００８９】
〔試験例５〕表皮角化細胞におけるγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用試験
上記のようにして得られたリクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡ（試料１〜５）について、以下のようにして表皮角化細胞におけるγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【００９０】
正常ヒト新生児表皮角化細胞（Normal Human Epidermal Keratinocyte：ＮＨＥＫ）を、正常ヒト表皮角化細胞長期培養増殖培地（EpiLife-KG2）を用いた培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにEpiLife-KG2で希釈した後、３５ｍｍシャーレに２．５ｍＬずつ播種し、一晩培養した。
【００９１】
培養後、EpiLife-KG2で溶解した試料溶液（試料１〜５，試料濃度は下記表５を参照）を２．５ｍＬ添加し、さらに１６時間培養した。培養終了後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製，Cat.No.311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００μｇ／ｍＬになるように総ＲＮＡを調整した。
【００９２】
この総ＲＮＡを鋳型とし、γ−グルタミルシステインシンテターゼ及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム２ＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。γ−グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現量は、同一サンプルにおけるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量の値で補正を行った後、さらに「試料無添加時」の補正値を１００としたときの「試料添加時」の補正値を算出した後に、下記式に基づいてγ−グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現促進率（％）を算出した。
【００９３】
ｍＲＮＡ発現促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
式中、Ａは「試料無添加時のｍＲＮＡ発現量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時のｍＲＮＡ発現量」を表す。
結果を表５に示す。
【００９４】
【表５】
【００９５】
表５に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡは、いずれも表皮角化細胞においてγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡの発現を効果的に促進し得ることが確認された。
【００９６】
〔試験例６〕皮膚線維芽細胞におけるγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用試験
上記のようにして得られたリクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡ（試料１〜５）について、以下のようにして皮膚線維芽細胞におけるγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【００９７】
ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を、１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭを用いた培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように１０％ＦＢＳ含有アルファ−ＭＥＭで希釈した後、３５ｍｍシャーレに２．５ｍＬずつ播種し、一晩培養した。
【００９８】
培養後、１％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭで溶解した試料溶液（試料１〜５，試料濃度は下記表６を参照）を２．５ｍＬ添加し、さらに１６時間培養した。培養終了後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製，Cat.No.311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００μｇ／ｍＬになるように総ＲＮＡを調整した。
【００９９】
この総ＲＮＡを鋳型とし、γ−グルタミルシステインシンテターゼ及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム２ＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。γ−グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現量は、同一サンプルにおけるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量の値で補正を行った後、さらに「試料無添加時」の補正値を１００としたときの「試料添加時」の補正値を算出した後に、下記式に基づいてγ−グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現促進率（％）を算出した。
【０１００】
ｍＲＮＡ発現促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
式中、Ａは「試料無添加時のｍＲＮＡ発現量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時のｍＲＮＡ発現量」を表す。
結果を表６に示す。
【０１０１】
【表６】
【０１０２】
表６に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡは、いずれも皮膚線維芽細胞においてγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡの発現を効果的に促進し得ることが確認された。
【０１０３】
〔試験例７〕肝細胞におけるγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用試験
上記のようにして得られたリクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡ（試料１〜５）について、以下のようにして肝細胞におけるγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【０１０４】
正常ヒト肝細胞（Cell System-Hc Cells，セルシステムズ社）を、ＣＳ−Ｃ無血清培地（セルシステムズ社製）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにＣＳ−Ｃ無血清培地で希釈した後、３５ｍｍシャーレに２．５ｍＬずつ播種し、一晩培養した。
【０１０５】
培養後、ＣＳ−Ｃ無血清培地で溶解した試料溶液（試料１〜５，試料濃度は下記表７を参照）を２．５ｍＬ添加し、さらに１６時間培養した。培養終了後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製，Cat.No.311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００μｇ／ｍＬになるように総ＲＮＡを調整した。
【０１０６】
この総ＲＮＡを鋳型とし、γ−グルタミルシステインシンテターゼ及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム２ＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。γ−グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現量は、同一サンプルにおけるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量の値で補正を行った後、さらに「試料無添加時」の補正値を１００としたときの「試料添加時」の補正値を算出した後に、下記式に基づいてγ−グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡの発現促進率（％）を算出した。
【０１０７】
ｍＲＮＡ発現促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
式中、Ａは「試料無添加時のｍＲＮＡ発現量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時のｍＲＮＡ発現量」を表す。
結果を表７に示す。
【０１０８】
【表７】
【０１０９】
表７に示すように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡは、いずれも肝細胞においてγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡの発現を効果的に促進し得ることが確認された。
【０１１０】
上述した試験例１〜４から明らかなように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡは、いずれも優れたグルタチオン産生促進作用を有している。また、試験例５〜７から明らかなように、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡは、いずれも優れたγ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を有している。このことから、リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡは、γ−グルタミルシステインシンテターゼｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、グルタチオンの前駆体であるγ−グルタミルシステインの生合成を促進し、それにより生体内でのグルタチオンの産生を促進しているものと推察される。
【０１１１】
〔配合例１〕
常法により、以下の組成を有する錠剤を製造した。
リクイリチン（試料１） ７．５ｍｇ
イソリクイリチゲニン（試料４） ３．５ｍｇ
リコカルコンＡ（試料５） ４．０ｍｇ
乳精ミネラル（カルシウム２５〜３０％含有） １００．０ｍｇ
ビタミンＫ２（１％含有粉末） １．５ｍｇ
マルチトール １７１．０ｍｇ
グリセリン脂肪酸エステル １２．５ｍｇ
【０１１２】
〔配合例２〕
常法により、以下の組成を有する錠剤を製造した。
リクイリチゲニン（試料２） ３．０ｍｇ
イソリクイリチゲニン（試料４） ２．０ｍｇ
ドロマイト（カルシウム２０％、マグネシウム１０％含有） ８３．４ｍｇ
カゼインホスホペプチド １６．７ｍｇ
ビタミンＣ ３３．４ｍｇ
マルチトール １３６．８ｍｇ
コラーゲン １２．７ｍｇ
ショ糖脂肪酸エステル １２．０ｍｇ
【０１１３】
〔配合例３〕
常法により、以下の組成を有するカプセル剤を製造した。なお、カプセルとしては、１号ハードゼラチンカプセルを使用した。
＜１カプセル（１錠２００ｍｇ）中の組成＞
イソリクイリチン（試料３） ４．０ｍｇ
イソリクイリチゲニン（試料４） ４．０ｍｇ
リコカルコンＡ（試料５） ２．０ｍｇ
コーンスターチ ７０．０ｍｇ
乳糖 １００．０ｍｇ
乳酸カルシウム １０．０ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ−Ｌ） １０．０ｍｇ
【０１１４】
〔配合例４〕
常法により、以下の組成を有する経口液状製剤を製造した。
＜１アンプル（１本１００ｍＬ）中の組成＞
リクイリチン（試料１） ０．２質量％
イソリクイリチゲニン（試料４） ０．１質量％
ソルビット １２．０質量％
安息香酸ナトリウム ０．１質量％
香料 １．０質量％
硫酸カルシウム ０．５質量％
精製水 残部（１００質量％）
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明のグルタチオン産生促進剤は、皮膚の老化、シミ、紫外線の照射による酸化ストレスに対する傷害、グルタチオンの欠乏に起因する疾患（例えば、活性酸素種等の酸化ストレスによって起こる疾患；肝炎、肝機能障害等の肝臓疾患；慢性腎不全；特発性肺線維症、成人呼吸器障害症候群等の呼吸器系疾患；白内障；虚血性心疾患；パーキンソン病；アルツハイマー病：胃潰瘍等の消化器系疾患；癌；骨髄形成不全；後天性免疫不全症候群；潜伏性ウイルス感染症等）、酸化型グルタチオンの欠乏に起因する不眠症等の睡眠障害等の予防、治療又は改善に大きく貢献できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上を有効成分として含有することを特徴とするグルタチオン産生促進剤。
【請求項２】
リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上を有効成分として含有することを特徴とするグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤。
【請求項３】
リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上を配合したことを特徴とする飲食品。
【請求項１】
リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上を有効成分として含有することを特徴とするグルタチオン産生促進剤。
【請求項２】
リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上を有効成分として含有することを特徴とするグルタチオンの欠乏に起因する疾患の予防・治療剤。
【請求項３】
リクイリチン、リクイリチゲニン、イソリクイリチン、イソリクイリチゲニン及びリコカルコンＡからなる群より選ばれる１種又は２種以上を配合したことを特徴とする飲食品。
【公開番号】特開２００９−２６９８８９（Ｐ２００９−２６９８８９Ａ）
【公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１２３９４０（Ｐ２００８−１２３９４０）
【出願日】平成２０年５月９日（２００８．５．９）
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月９日（２００８．５．９）
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【Ｆターム（参考）】
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