シュクラーゼ阻害剤
【課題】シュクラーゼ阻害作用を有する新たな血糖値上昇抑制剤を提供すること。
【解決手段】本発明におけるシュクラーゼ阻害剤は、発酵茶に含まれているエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートを有効成分として含有することを特徴とした新しいシュクラーゼ阻害剤（但し、発酵茶抽出物を除く）であり、飲食品、医薬品、医薬部外品、健康食品、栄養補助食品などに幅広く応用できる汎用性の高いものである。また、食後の血糖値の上昇を抑制することにより糖尿病の予防および／または改善につながることが期待できる。
【解決手段】本発明におけるシュクラーゼ阻害剤は、発酵茶に含まれているエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートを有効成分として含有することを特徴とした新しいシュクラーゼ阻害剤（但し、発酵茶抽出物を除く）であり、飲食品、医薬品、医薬部外品、健康食品、栄養補助食品などに幅広く応用できる汎用性の高いものである。また、食後の血糖値の上昇を抑制することにより糖尿病の予防および／または改善につながることが期待できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵した茶葉に含まれているエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｔｈｅａｆｌａｖｉｃ ａｃｉｄ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）を有効成分として含有するシュクラーゼ阻害剤並びにそれを含有し、糖尿病の予防もしくは血糖値の改善のために用いられる口腔適用対象物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
食生活の変化による摂取カロリーの過多が、肥満、動脈硬化、糖尿病などの生活習慣病のリスクを高めているといわれて久しい。デンプンやシュクロースなどの糖質の消化を抑えることは、糖尿病をはじめ肥満などのリスクを下げると考えられ、デンプンの消化酵素であるα−アミラーゼやシュクロースの分解酵素であるシュクラーゼの作用を阻害する物質を食品素材から見出そうとする研究がなされてきた。
特に、茶の成分に関しては緑茶カテキン類であるエピカテキンガレート、エピガロカテキンガレートや紅茶のポリフェノール成分である遊離型テアフラビン、テアフラビンモノガレート、テアフラビンジガレートにα−アミラーゼ阻害作用（特許文献１）やシュクラーゼ阻害作用（特許文献２）があることが開示されている。また、特定の比率でテアフラビン、テアフラビン−３−ガレート、テアフラビン−３’−ガレート、テアフラビン−３，３’−ジガレートを含有する組成物にα−アミラーゼやα−グルコシダーゼに対する阻害作用があることが開示されている（特許文献３）。さらに、カメリアシネンシス由来のフラボノールアグリコン及びフラボノール配糖体を含有するポリフェノール組成物がα−アミラーゼの阻害活性を示すことも報告されている（特許文献４）。特許文献５では、ベンゾトロポロン環含有化合物についてα―グリコシダーゼ阻害活性があることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平３−１３３９２８
【特許文献２】特開平５−１７３６４
【特許文献３】特開２００９−２６８４２０
【特許文献４】特開２０１０−２２２２７７
【特許文献５】ＷＯ／２０１０／１３４５９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、発酵茶であるウーロン茶や紅茶の成分として知られているエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートがシュクラーゼの阻害作用を有するという報告はない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、発酵茶に含まれるエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートを合成することに成功し、これら成分の生理活性作用を検討したところ、シュクラーゼに対して阻害作用を示すことを見出した。
【０００６】
すなわち、本願請求項１記載の発明は、下記の式（Ｉ）で表されるエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートを有効成分として含有することを特徴とするシュクラーゼ阻害剤である(但し、発酵茶抽出物を除く)。
式(Ｉ)
【化１】
本願請求項２記載の発明は、請求項１記載のシュクラーゼ阻害剤を含有する口腔適用対象物である。
請求項３記載の本願発明は、飲食品である請求項２記載の口腔適用対象物である。
請求項４記載の本願発明は、医薬品又は医薬部外品である請求項２記載の口腔適用対象物である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明はエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートを有効成分としたシュクラーゼ阻害剤であり、飲食品、医薬品、医薬部外品などに幅広く応用出来る汎用性の高いものであり、食後の血糖値の上昇を抑制することにより糖尿病の予防及び／又は改善につなげることが期待できる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明におけるエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートは、公知のテアフラビンの酵素合成法（特許文献６）に基づいてチロシナーゼをカテキン類と没食子酸の混合溶液に作用させることにより簡単に合成できるほか、エピカテキンガレートと没食子酸との混合溶液にパーオキシダーゼを作用させることにより合成することも可能である。カテキン類と没食子酸の濃度及びその比率、反応温度、反応時間、ｐＨ、酵素量などは、収率が向上するよう適宜調整することができる。
【特許文献６】特開２０１０−３５５４８
【０００９】
また、シュクラーゼ阻害効果が期待できるテアシネンシン類は、公知の有機化学合成法（特許文献７）により得ることができる。また、ナシの果実ホモジネート中の酵素を用いて製造することも可能である（非特許文献１）。またテアシネンシン類は下記の式（ＩＩ）で表されるテアシネンシンＡ、テアシネンシンＢ、テアシネンシンＣが挙げられる。
式(ＩＩ)
【化２】
【特許文献７】特開２０１０−１３８１０３
【非特許文献１】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， ５９， ７９３９〜７９４７（２００３）
【００１０】
上記の有機化学合成法や酵素合成法により得られるエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートは、医薬上または食品上許容し得る規格に適合し，本発明の効果を発揮するものであれば，粗精製物であってもよく，さらに得られた合成物や抽出物を公知の分離精製方法を適宜組み合わせて純度を上げても良く、例えば水、熱水、アルコール等の極性溶媒、または非極性溶媒を用いて行う溶剤抽出方法や、遠心分離、高速液体クロマトグラフィーやカラムクロマトグラフィー等の精製手段が挙げられる。
【００１１】
本発明のシュクラーゼ阻害剤は利用の形態は限定されないが、たとえば液状、粉末状、顆粒状などが挙げられ、食品または栄養補助品として、通常用いられる形態、たとえば液剤、懸濁剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、エリキシル剤、酒精剤に利用することが出来る。
【００１２】
本発明のシュクラーゼ阻害剤は、更に他のシュクラーゼ阻害剤、例えば、カテキン類、テアフラビン類、グアバポリフェノール類、フラボノールアグリコンやフラボノール配糖体、柿ポリフェノール、１−デオキシノジリマイシン、桑由来のポリフェノールなどと併用して利用することもできる。
【００１３】
また、本発明のシュクラーゼ阻害剤を医薬品として用いる場合は、日本薬局方に収められている医薬品で口に含むことができれば特に限定されるものではなく、上記有効成分に薬学的に許容される担体を添加して、経口用の製剤とすることが出来る。製剤形態としては、錠剤、顆粒剤、細粒剤、丸剤、散剤、カプセル剤、トローチ剤、チュアブル剤、液剤（ドリンク剤）などが挙げられる。
【００１４】
医薬部外品としては厚生労働大臣が指定した医薬部外品で口に含むことができれば特に限定されるものではなく、例えば、内服液剤、健康飲料、ビタミン含有保健剤などが挙げられる。
【００１５】
本発明のシュクラーゼ阻害剤を必須成分として含有する食品はどのような形態であってもよく、例えば、水溶液や混濁物や乳化物などの液状形態であっても、ゲル状やペースト状の半固形状形態であっても、粉末や顆粒やカプセルやタブレットなどのサプリメント等の固形状形態であってもよい。
【００１６】
本発明のシュクラーゼ阻害剤を必須成分として含有する飲食品としては、例えば、即席食品類（即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席味噌汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズドライ食品など）、炭酸飲料、柑橘類（グレープフルーツ、オレンジ、レモンなど）の果汁や果汁飲料や果汁入り清涼飲料、柑橘類の果肉飲料や果粒入り果実飲料、トマト、ピーマン、セロリ、ウリ、ニンジン、ジャガイモ、アスパラガスなどの野菜を含む野菜系飲料、豆乳・豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料やタバコなどの嗜好飲料・嗜好品類、マカロニ・スパゲッティ、麺類、ケーキミックス、唐揚げ粉、パン粉、ギョーザの皮などの小麦粉製品、キャラメル・キャンディー、チューイングガム、チョコレート、クッキー・ビスケット、ケーキ・パイ、スナック・クラッカー、和菓子・米菓子・豆菓子、デザート菓子などの菓子類、しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類、甘味料などの基礎調味料、風味調味料、調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類などの複合調味料・食品類、バター、マーガリン類、マヨネーズ類、植物油などの油脂類、牛乳・加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリームなどの乳・乳製品、素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済み冷凍食品などの冷凍食品、水産缶詰め、果実缶詰め・ペースト類、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、水産乾物類、佃煮類などの水産加工品、畜産缶詰め・ペースト類、畜肉缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物・煮豆類、農産乾物類、シリアル（穀物加工品）などの農産加工品、ベビーフード、ふりかけ・お茶漬けのりなどの市販食品などが挙げられる。
【００１７】
飲食品に対する本発明のシュクラーゼ阻害剤の配合量は、特に制限されないが、対象となる飲食品により配合量を適宜設定する。最終製品中で０.００１〜２０重量％であることが好ましく、０．００５〜１０重量％であることがより好ましく、０．０１〜５重量％であることがさらに好ましく、０．１〜１重量％であることが最も好ましい。
【００１８】
以下に、製造例、試験例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
製造例１：エピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートの合成
エピカテキンガレート（ＥＣｇ；ＳＩＧＭＡ社製）４５１ｍｇ（１．０２ｍｍｏｌ）と没食子酸（ＳＩＧＭＡ社製）１．４２ｇ（８．３７ｍｍｏｌ）を５００ｍＬのＭａｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解した。この溶液を５本の１Ｌ三角フラスコに１００ｍＬずつ分注し、それぞれに水１００ｍＬを加えた。この溶液にＳＩＧＭＡ社製のチロシナーゼを１つの三角フラスコにつき２０００００Ｕ添加し、４０℃で１０分間、１００ｒｐｍでインキュベーションした。上記の酵素反応液に等量の酢酸エチルを加えて抽出した。さらに２回酢酸エチル抽出を繰り返した。集めた有機層を溶媒留去し、目的のエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートを２８０ｎｍの面積値純度で１５．３％含む画分を１．６４ｇ得た。得られた画分を９５％メタノール３０ｍＬに溶解後、トヨパールＨＷ−４０Ｓカラムクロマトグラフィー（東ソー（株）製；４０ｍｍＩ．Ｄ．×４５０ｍｍ、５６５ｍＬ、移動相；９５％メタノール、流速１０ｍＬ／ｍｉｎ）に全量供し、メタノールで溶出した。更に約５ｍＬまで濃縮後、全量を１２０％アセトニトリルに溶解した。そして、エムシーアイゲルＣＨＰ５５Ｙカラムクロマトグラフィー（三菱化学（株）製；２０ｍｍＩ．Ｄ．×２９０ｍｍ、９１ｍＬ、移動相；１２％→２２％アセトニトリルグラジエント、流速１０ｍＬ／ｍｉｎ）に全量供し、２８０ｎｍの面積値純度が９９％以上であるエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートを５２．５ｍｇ（９０．５μｍｏｌ）得た。使用したＥＣｇに対する収率は８．８６％であった。なお、エピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートの収率は次の式、収率（％）＝｛（得られたエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートのモル数）／（原料のＥＣｇのモル数）｝×１００により算出した。
【００２０】
製造例２：テアシネンシンＢの合成
エピガロカテキン（ＥＧＣ；ＳＩＧＭＡ社製）６１３ｍｇ（２．００ｍｍｏｌ）とエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ；ＳＩＧＭＡ社製）９１７ｍｇ（２．００ｍｍｏｌ）を水６０ｍＬとＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ５）６０ｍＬで溶解した。５０ｍＬコニカルビーカー４つそれぞれにこの溶液３０ｍＬと１０％パラジウム／炭素（約５０％水湿潤品，Ａｌｄｒｉｃｈ製）２５０ｍｇを加えて、空気雰囲気下室温で２１０分間撹拌した。触媒をろ別した後、ろ液にトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩８６０ｍｇ（３．００ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０分間撹拌した。反応液を直接ダイアイオンＨＰ−２０カラムクロマトグラフィー（三菱化学（株）製；３０ｍｍＩ．Ｄ．×１４０ｍｍ）に供し、水３５０ｍＬで洗浄後、４０％メタノール５００ｍＬで溶出した。濃縮乾固した４０％メタノール画分１１７２ｍｇをメタノール（５ｍＬ）で溶解し、トヨパールＨＷ−４０Ｓカラムクロマトグラフィー（東ソー（株）製；４０ｍｍＩ．Ｄ．×４５０ｍｍ，移動相；メタノール，流速１５ｍＬ／ｍｉｎ）に供し、粗テアシネンシンＢを２９４ｍｇ得た。得られた粗テアシネンシンＢを５％アセトニトリル７．５ｍＬに溶解後、エムシーアイゲルＣＨＰ５５Ｙカラムクロマトグラフィー（三菱化学（株）製；２０ｍｍＩ．Ｄ．×３００ｍｍ、移動相；水：アセトニトリル：ギ酸＝９００：１００：１、流速７．５ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製し、テアシネンシンＢ１８８ｍｇ（２４７μｍｏｌ、収率１２．３％）をオフホワイトの粉末として得た。なお、テアシネンシンＢの収率は次の式、収率（％）＝｛（得られたテアシネンシンＢのモル数）／（原料のカテキン類のモル数×０．５）｝×１００により算出した。
【実施例２】
【００２１】
試験例：シュクラーゼ阻害活性測定
シュクラーゼの調製：ラット腸管アセトン粉末（ＳＩＧＭＡ社製）を０．１ｍＭ マレイン酸緩衝溶液（ｐＨ６．０）に溶解し、２回の遠心分離（４℃、３０００ｒｐｍ、１０分）で得た遠心上清をシュクラーゼ酵素溶液（０．０１２ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）とした。
基質溶液の調製：シュクロース（和光純薬工業製）を１００ｍＭとなるように水に溶解し調製した。
シュクラーゼ酵素反応は、酵素液（０．０１２ ｕｎｉｔｓ／ｍＬ） ５０μＬに試料溶液５０μＬと基質溶液（基質：１００ｍＭシュクロース溶液）１００μＬを加え、３７℃で２０分間反応させた後、アセトニトリル２５０μＬを加えて反応を停止させた。さらに水３００μＬとアセトニトリル２５０μＬを加えて希釈し、遠心上清中のグルコース量をＨＰＬＣ−ＥＬＳＤにより測定した。ＨＰＬＣの分析条件は、ＵＫ−Ａｍｉｎｏカラム（２．０ Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ、インタクト（株）製）を用い、８３％アセトニトリルで溶出し、ＥＬＳＤ（ウォーターズ社製 蒸発光散乱検出器ＥＬＳＤ２４２０）で検出した。
シュクラーゼ阻害活性は下記式より求めた。なお、試料溶液は５％エタノール含むマレイン酸緩衝溶液で調製し、対照には５％エタノール含むマレイン酸緩衝溶液を用いた。また、それぞれのブランクとして、基質溶液の代わりに蒸留水を用いた。
阻害率（％）＝[（Ａ−Ｂ）−（Ｃ−Ｄ）]／ (Ａ−Ｂ）×１００
ただし、Ａ：対照溶液（シュクラーゼ酵素液＋５％エタノール含むマレイン酸緩衝溶液＋基質溶液）の面積値
Ｂ：対照溶液のブランク（Ａのシュクラーゼ酵素液に代わり蒸留水を使用）の面積値
Ｃ：試料溶液（シュクラーゼ酵素液＋発明品の阻害剤（５％エタノール含むマレイン酸緩衝溶液）＋基質）の面積値
Ｄ：試料溶液のブランク（Ｃのシュクラーゼ酵素液に代わり蒸留水を使用）の面積値
上記のシュクラーゼ阻害活性の結果から、各サンプルのシュクロースに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を求めた。
【００２２】
エピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートのシュクロースに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）は６６８μＭであり、シュクラーゼ阻害効果が確認された。また、テアシネンシンＢに関しても同様にシュクラーゼ阻害効果を調べたところ、エピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートと同様のシュクラーゼ阻害効果が確認された（ＩＣ５０値：８２６μＭ）。
【実施例３】
【００２３】
製造例：キャンディー
砂糖:３３重量％、水飴:６６重量％、クエン酸:０．６７重量％、香料:０．１６重量％、着色料:０．０７重量％及び製造例１で得られたエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレート:０．１０重量％をキャンディー処方により常法で調製し、エピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートを含有するキャンディーを得た。
【実施例４】
【００２４】
製造例：スポーツ飲料
製造例１で得られたエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレート:０．２重量部、ビタミンＢ１塩酸塩:０．０００２重量部、ビタミンＢ２:０．０００１重量部、ビタミンＣ:０．００５重量部、ナイアシン:０．０００４重量部、パントテン酸Ｃａ:０．０００１重量部、クエン酸鉄アンモニウム:０．００６重量部、クエン酸:０．０５重量部及び果糖:１．２５重量部の成分にイオン交換水を加え全量を２００重量部とし、エピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートを含有するスポーツ飲料を調製した。
【実施例５】
【００２５】
製造例：チュアブル錠剤
製造例１で得られたエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレート０．６重量部、キシリトール３３．７重量部、マンニトール３０．６重量部、微結晶性セルロース６．１重量部、着香料１４．１重量部、ステアリン酸４．３重量部、タルク０．６重量部、ソルビトール９．８重量部を混合した粉体を錠剤プレスによって圧縮し、エピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートを含有する錠剤を得た。
【実施例６】
【００２６】
製造例：清涼飲料水
果糖ブドウ糖液糖１３重量部、グレープフルーツストレート果汁２．０重量部、クエン酸０．３重量部、ビタミンＣ０．０１重量部、クエン酸ナトリウム０．０２重量部、香料（グレープフルーツ様香料）０．１重量部、製造例１で得られたエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレート０．１重量部に水を加えて溶解し、１００重量部の飲料を調製した。これをガラス瓶容器に分注して、常法により殺菌を行い、エピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートを含有する清涼飲料を得た。
【実施例７】
【００２７】
製造例：タブレット菓子
粉糖８７重量部、乳糖２重量部、ビタミンＣ３重量部、クエン酸粉末１．５重量部、ゼラチン１％水溶液４重量部、製造例１で得られたエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレート１重量部、ショ糖脂肪酸エステル１重量部、粉末レモン香料０．５重量部を均一混合し、常法により１５ｍｍφの径を有する２錠剤を打錠し、エピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートを含有する錠菓を得た。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明のシュクラーゼ阻害剤は、医薬品としての他、健康志向型食品として、健康食品、栄養補助食品、特定保健用食品、成分調製食品等の業界で有利に利用することが出来るものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵した茶葉に含まれているエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｔｈｅａｆｌａｖｉｃ ａｃｉｄ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）を有効成分として含有するシュクラーゼ阻害剤並びにそれを含有し、糖尿病の予防もしくは血糖値の改善のために用いられる口腔適用対象物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
食生活の変化による摂取カロリーの過多が、肥満、動脈硬化、糖尿病などの生活習慣病のリスクを高めているといわれて久しい。デンプンやシュクロースなどの糖質の消化を抑えることは、糖尿病をはじめ肥満などのリスクを下げると考えられ、デンプンの消化酵素であるα−アミラーゼやシュクロースの分解酵素であるシュクラーゼの作用を阻害する物質を食品素材から見出そうとする研究がなされてきた。
特に、茶の成分に関しては緑茶カテキン類であるエピカテキンガレート、エピガロカテキンガレートや紅茶のポリフェノール成分である遊離型テアフラビン、テアフラビンモノガレート、テアフラビンジガレートにα−アミラーゼ阻害作用（特許文献１）やシュクラーゼ阻害作用（特許文献２）があることが開示されている。また、特定の比率でテアフラビン、テアフラビン−３−ガレート、テアフラビン−３’−ガレート、テアフラビン−３，３’−ジガレートを含有する組成物にα−アミラーゼやα−グルコシダーゼに対する阻害作用があることが開示されている（特許文献３）。さらに、カメリアシネンシス由来のフラボノールアグリコン及びフラボノール配糖体を含有するポリフェノール組成物がα−アミラーゼの阻害活性を示すことも報告されている（特許文献４）。特許文献５では、ベンゾトロポロン環含有化合物についてα―グリコシダーゼ阻害活性があることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平３−１３３９２８
【特許文献２】特開平５−１７３６４
【特許文献３】特開２００９−２６８４２０
【特許文献４】特開２０１０−２２２２７７
【特許文献５】ＷＯ／２０１０／１３４５９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、発酵茶であるウーロン茶や紅茶の成分として知られているエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートがシュクラーゼの阻害作用を有するという報告はない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、発酵茶に含まれるエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートを合成することに成功し、これら成分の生理活性作用を検討したところ、シュクラーゼに対して阻害作用を示すことを見出した。
【０００６】
すなわち、本願請求項１記載の発明は、下記の式（Ｉ）で表されるエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートを有効成分として含有することを特徴とするシュクラーゼ阻害剤である(但し、発酵茶抽出物を除く)。
式(Ｉ)
【化１】
本願請求項２記載の発明は、請求項１記載のシュクラーゼ阻害剤を含有する口腔適用対象物である。
請求項３記載の本願発明は、飲食品である請求項２記載の口腔適用対象物である。
請求項４記載の本願発明は、医薬品又は医薬部外品である請求項２記載の口腔適用対象物である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明はエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートを有効成分としたシュクラーゼ阻害剤であり、飲食品、医薬品、医薬部外品などに幅広く応用出来る汎用性の高いものであり、食後の血糖値の上昇を抑制することにより糖尿病の予防及び／又は改善につなげることが期待できる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明におけるエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートは、公知のテアフラビンの酵素合成法（特許文献６）に基づいてチロシナーゼをカテキン類と没食子酸の混合溶液に作用させることにより簡単に合成できるほか、エピカテキンガレートと没食子酸との混合溶液にパーオキシダーゼを作用させることにより合成することも可能である。カテキン類と没食子酸の濃度及びその比率、反応温度、反応時間、ｐＨ、酵素量などは、収率が向上するよう適宜調整することができる。
【特許文献６】特開２０１０−３５５４８
【０００９】
また、シュクラーゼ阻害効果が期待できるテアシネンシン類は、公知の有機化学合成法（特許文献７）により得ることができる。また、ナシの果実ホモジネート中の酵素を用いて製造することも可能である（非特許文献１）。またテアシネンシン類は下記の式（ＩＩ）で表されるテアシネンシンＡ、テアシネンシンＢ、テアシネンシンＣが挙げられる。
式(ＩＩ)
【化２】
【特許文献７】特開２０１０−１３８１０３
【非特許文献１】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， ５９， ７９３９〜７９４７（２００３）
【００１０】
上記の有機化学合成法や酵素合成法により得られるエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートは、医薬上または食品上許容し得る規格に適合し，本発明の効果を発揮するものであれば，粗精製物であってもよく，さらに得られた合成物や抽出物を公知の分離精製方法を適宜組み合わせて純度を上げても良く、例えば水、熱水、アルコール等の極性溶媒、または非極性溶媒を用いて行う溶剤抽出方法や、遠心分離、高速液体クロマトグラフィーやカラムクロマトグラフィー等の精製手段が挙げられる。
【００１１】
本発明のシュクラーゼ阻害剤は利用の形態は限定されないが、たとえば液状、粉末状、顆粒状などが挙げられ、食品または栄養補助品として、通常用いられる形態、たとえば液剤、懸濁剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、エリキシル剤、酒精剤に利用することが出来る。
【００１２】
本発明のシュクラーゼ阻害剤は、更に他のシュクラーゼ阻害剤、例えば、カテキン類、テアフラビン類、グアバポリフェノール類、フラボノールアグリコンやフラボノール配糖体、柿ポリフェノール、１−デオキシノジリマイシン、桑由来のポリフェノールなどと併用して利用することもできる。
【００１３】
また、本発明のシュクラーゼ阻害剤を医薬品として用いる場合は、日本薬局方に収められている医薬品で口に含むことができれば特に限定されるものではなく、上記有効成分に薬学的に許容される担体を添加して、経口用の製剤とすることが出来る。製剤形態としては、錠剤、顆粒剤、細粒剤、丸剤、散剤、カプセル剤、トローチ剤、チュアブル剤、液剤（ドリンク剤）などが挙げられる。
【００１４】
医薬部外品としては厚生労働大臣が指定した医薬部外品で口に含むことができれば特に限定されるものではなく、例えば、内服液剤、健康飲料、ビタミン含有保健剤などが挙げられる。
【００１５】
本発明のシュクラーゼ阻害剤を必須成分として含有する食品はどのような形態であってもよく、例えば、水溶液や混濁物や乳化物などの液状形態であっても、ゲル状やペースト状の半固形状形態であっても、粉末や顆粒やカプセルやタブレットなどのサプリメント等の固形状形態であってもよい。
【００１６】
本発明のシュクラーゼ阻害剤を必須成分として含有する飲食品としては、例えば、即席食品類（即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席味噌汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズドライ食品など）、炭酸飲料、柑橘類（グレープフルーツ、オレンジ、レモンなど）の果汁や果汁飲料や果汁入り清涼飲料、柑橘類の果肉飲料や果粒入り果実飲料、トマト、ピーマン、セロリ、ウリ、ニンジン、ジャガイモ、アスパラガスなどの野菜を含む野菜系飲料、豆乳・豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料やタバコなどの嗜好飲料・嗜好品類、マカロニ・スパゲッティ、麺類、ケーキミックス、唐揚げ粉、パン粉、ギョーザの皮などの小麦粉製品、キャラメル・キャンディー、チューイングガム、チョコレート、クッキー・ビスケット、ケーキ・パイ、スナック・クラッカー、和菓子・米菓子・豆菓子、デザート菓子などの菓子類、しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類、甘味料などの基礎調味料、風味調味料、調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類などの複合調味料・食品類、バター、マーガリン類、マヨネーズ類、植物油などの油脂類、牛乳・加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリームなどの乳・乳製品、素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済み冷凍食品などの冷凍食品、水産缶詰め、果実缶詰め・ペースト類、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、水産乾物類、佃煮類などの水産加工品、畜産缶詰め・ペースト類、畜肉缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物・煮豆類、農産乾物類、シリアル（穀物加工品）などの農産加工品、ベビーフード、ふりかけ・お茶漬けのりなどの市販食品などが挙げられる。
【００１７】
飲食品に対する本発明のシュクラーゼ阻害剤の配合量は、特に制限されないが、対象となる飲食品により配合量を適宜設定する。最終製品中で０.００１〜２０重量％であることが好ましく、０．００５〜１０重量％であることがより好ましく、０．０１〜５重量％であることがさらに好ましく、０．１〜１重量％であることが最も好ましい。
【００１８】
以下に、製造例、試験例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
製造例１：エピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートの合成
エピカテキンガレート（ＥＣｇ；ＳＩＧＭＡ社製）４５１ｍｇ（１．０２ｍｍｏｌ）と没食子酸（ＳＩＧＭＡ社製）１．４２ｇ（８．３７ｍｍｏｌ）を５００ｍＬのＭａｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解した。この溶液を５本の１Ｌ三角フラスコに１００ｍＬずつ分注し、それぞれに水１００ｍＬを加えた。この溶液にＳＩＧＭＡ社製のチロシナーゼを１つの三角フラスコにつき２０００００Ｕ添加し、４０℃で１０分間、１００ｒｐｍでインキュベーションした。上記の酵素反応液に等量の酢酸エチルを加えて抽出した。さらに２回酢酸エチル抽出を繰り返した。集めた有機層を溶媒留去し、目的のエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートを２８０ｎｍの面積値純度で１５．３％含む画分を１．６４ｇ得た。得られた画分を９５％メタノール３０ｍＬに溶解後、トヨパールＨＷ−４０Ｓカラムクロマトグラフィー（東ソー（株）製；４０ｍｍＩ．Ｄ．×４５０ｍｍ、５６５ｍＬ、移動相；９５％メタノール、流速１０ｍＬ／ｍｉｎ）に全量供し、メタノールで溶出した。更に約５ｍＬまで濃縮後、全量を１２０％アセトニトリルに溶解した。そして、エムシーアイゲルＣＨＰ５５Ｙカラムクロマトグラフィー（三菱化学（株）製；２０ｍｍＩ．Ｄ．×２９０ｍｍ、９１ｍＬ、移動相；１２％→２２％アセトニトリルグラジエント、流速１０ｍＬ／ｍｉｎ）に全量供し、２８０ｎｍの面積値純度が９９％以上であるエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートを５２．５ｍｇ（９０．５μｍｏｌ）得た。使用したＥＣｇに対する収率は８．８６％であった。なお、エピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートの収率は次の式、収率（％）＝｛（得られたエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートのモル数）／（原料のＥＣｇのモル数）｝×１００により算出した。
【００２０】
製造例２：テアシネンシンＢの合成
エピガロカテキン（ＥＧＣ；ＳＩＧＭＡ社製）６１３ｍｇ（２．００ｍｍｏｌ）とエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ；ＳＩＧＭＡ社製）９１７ｍｇ（２．００ｍｍｏｌ）を水６０ｍＬとＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ５）６０ｍＬで溶解した。５０ｍＬコニカルビーカー４つそれぞれにこの溶液３０ｍＬと１０％パラジウム／炭素（約５０％水湿潤品，Ａｌｄｒｉｃｈ製）２５０ｍｇを加えて、空気雰囲気下室温で２１０分間撹拌した。触媒をろ別した後、ろ液にトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩８６０ｍｇ（３．００ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０分間撹拌した。反応液を直接ダイアイオンＨＰ−２０カラムクロマトグラフィー（三菱化学（株）製；３０ｍｍＩ．Ｄ．×１４０ｍｍ）に供し、水３５０ｍＬで洗浄後、４０％メタノール５００ｍＬで溶出した。濃縮乾固した４０％メタノール画分１１７２ｍｇをメタノール（５ｍＬ）で溶解し、トヨパールＨＷ−４０Ｓカラムクロマトグラフィー（東ソー（株）製；４０ｍｍＩ．Ｄ．×４５０ｍｍ，移動相；メタノール，流速１５ｍＬ／ｍｉｎ）に供し、粗テアシネンシンＢを２９４ｍｇ得た。得られた粗テアシネンシンＢを５％アセトニトリル７．５ｍＬに溶解後、エムシーアイゲルＣＨＰ５５Ｙカラムクロマトグラフィー（三菱化学（株）製；２０ｍｍＩ．Ｄ．×３００ｍｍ、移動相；水：アセトニトリル：ギ酸＝９００：１００：１、流速７．５ｍＬ／ｍｉｎ）にて精製し、テアシネンシンＢ１８８ｍｇ（２４７μｍｏｌ、収率１２．３％）をオフホワイトの粉末として得た。なお、テアシネンシンＢの収率は次の式、収率（％）＝｛（得られたテアシネンシンＢのモル数）／（原料のカテキン類のモル数×０．５）｝×１００により算出した。
【実施例２】
【００２１】
試験例：シュクラーゼ阻害活性測定
シュクラーゼの調製：ラット腸管アセトン粉末（ＳＩＧＭＡ社製）を０．１ｍＭ マレイン酸緩衝溶液（ｐＨ６．０）に溶解し、２回の遠心分離（４℃、３０００ｒｐｍ、１０分）で得た遠心上清をシュクラーゼ酵素溶液（０．０１２ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）とした。
基質溶液の調製：シュクロース（和光純薬工業製）を１００ｍＭとなるように水に溶解し調製した。
シュクラーゼ酵素反応は、酵素液（０．０１２ ｕｎｉｔｓ／ｍＬ） ５０μＬに試料溶液５０μＬと基質溶液（基質：１００ｍＭシュクロース溶液）１００μＬを加え、３７℃で２０分間反応させた後、アセトニトリル２５０μＬを加えて反応を停止させた。さらに水３００μＬとアセトニトリル２５０μＬを加えて希釈し、遠心上清中のグルコース量をＨＰＬＣ−ＥＬＳＤにより測定した。ＨＰＬＣの分析条件は、ＵＫ−Ａｍｉｎｏカラム（２．０ Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ、インタクト（株）製）を用い、８３％アセトニトリルで溶出し、ＥＬＳＤ（ウォーターズ社製 蒸発光散乱検出器ＥＬＳＤ２４２０）で検出した。
シュクラーゼ阻害活性は下記式より求めた。なお、試料溶液は５％エタノール含むマレイン酸緩衝溶液で調製し、対照には５％エタノール含むマレイン酸緩衝溶液を用いた。また、それぞれのブランクとして、基質溶液の代わりに蒸留水を用いた。
阻害率（％）＝[（Ａ−Ｂ）−（Ｃ−Ｄ）]／ (Ａ−Ｂ）×１００
ただし、Ａ：対照溶液（シュクラーゼ酵素液＋５％エタノール含むマレイン酸緩衝溶液＋基質溶液）の面積値
Ｂ：対照溶液のブランク（Ａのシュクラーゼ酵素液に代わり蒸留水を使用）の面積値
Ｃ：試料溶液（シュクラーゼ酵素液＋発明品の阻害剤（５％エタノール含むマレイン酸緩衝溶液）＋基質）の面積値
Ｄ：試料溶液のブランク（Ｃのシュクラーゼ酵素液に代わり蒸留水を使用）の面積値
上記のシュクラーゼ阻害活性の結果から、各サンプルのシュクロースに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を求めた。
【００２２】
エピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートのシュクロースに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）は６６８μＭであり、シュクラーゼ阻害効果が確認された。また、テアシネンシンＢに関しても同様にシュクラーゼ阻害効果を調べたところ、エピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートと同様のシュクラーゼ阻害効果が確認された（ＩＣ５０値：８２６μＭ）。
【実施例３】
【００２３】
製造例：キャンディー
砂糖:３３重量％、水飴:６６重量％、クエン酸:０．６７重量％、香料:０．１６重量％、着色料:０．０７重量％及び製造例１で得られたエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレート:０．１０重量％をキャンディー処方により常法で調製し、エピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートを含有するキャンディーを得た。
【実施例４】
【００２４】
製造例：スポーツ飲料
製造例１で得られたエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレート:０．２重量部、ビタミンＢ１塩酸塩:０．０００２重量部、ビタミンＢ２:０．０００１重量部、ビタミンＣ:０．００５重量部、ナイアシン:０．０００４重量部、パントテン酸Ｃａ:０．０００１重量部、クエン酸鉄アンモニウム:０．００６重量部、クエン酸:０．０５重量部及び果糖:１．２５重量部の成分にイオン交換水を加え全量を２００重量部とし、エピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートを含有するスポーツ飲料を調製した。
【実施例５】
【００２５】
製造例：チュアブル錠剤
製造例１で得られたエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレート０．６重量部、キシリトール３３．７重量部、マンニトール３０．６重量部、微結晶性セルロース６．１重量部、着香料１４．１重量部、ステアリン酸４．３重量部、タルク０．６重量部、ソルビトール９．８重量部を混合した粉体を錠剤プレスによって圧縮し、エピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートを含有する錠剤を得た。
【実施例６】
【００２６】
製造例：清涼飲料水
果糖ブドウ糖液糖１３重量部、グレープフルーツストレート果汁２．０重量部、クエン酸０．３重量部、ビタミンＣ０．０１重量部、クエン酸ナトリウム０．０２重量部、香料（グレープフルーツ様香料）０．１重量部、製造例１で得られたエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレート０．１重量部に水を加えて溶解し、１００重量部の飲料を調製した。これをガラス瓶容器に分注して、常法により殺菌を行い、エピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートを含有する清涼飲料を得た。
【実施例７】
【００２７】
製造例：タブレット菓子
粉糖８７重量部、乳糖２重量部、ビタミンＣ３重量部、クエン酸粉末１．５重量部、ゼラチン１％水溶液４重量部、製造例１で得られたエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレート１重量部、ショ糖脂肪酸エステル１重量部、粉末レモン香料０．５重量部を均一混合し、常法により１５ｍｍφの径を有する２錠剤を打錠し、エピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートを含有する錠菓を得た。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明のシュクラーゼ阻害剤は、医薬品としての他、健康志向型食品として、健康食品、栄養補助食品、特定保健用食品、成分調製食品等の業界で有利に利用することが出来るものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）で表されるエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートを有効成分として含有することを特徴とするシュクラーゼ阻害剤（但し、発酵茶抽出物を除く）。
式（Ｉ）
【化１】
【請求項２】
請求項１記載のシュクラーゼ阻害剤を含有する口腔適用対象物。
【請求項３】
飲食品である請求項２記載の口腔適用対象物。
【請求項４】
医薬品又は医薬部外品である請求項２記載の口腔適用対象物。
【請求項１】
式（Ｉ）で表されるエピテアフラビン酸−３−Ｏ−ガレートを有効成分として含有することを特徴とするシュクラーゼ阻害剤（但し、発酵茶抽出物を除く）。
式（Ｉ）
【化１】
【請求項２】
請求項１記載のシュクラーゼ阻害剤を含有する口腔適用対象物。
【請求項３】
飲食品である請求項２記載の口腔適用対象物。
【請求項４】
医薬品又は医薬部外品である請求項２記載の口腔適用対象物。
【公開番号】特開２０１２−１８４２０８（Ｐ２０１２−１８４２０８Ａ）
【公開日】平成２４年９月２７日（２０１２．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−４９８９２（Ｐ２０１１−４９８９２）
【出願日】平成２３年３月８日（２０１１．３．８）
【出願人】（３０３０４４７１２）三井農林株式会社 (72)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年９月２７日（２０１２．９．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月８日（２０１１．３．８）
【出願人】（３０３０４４７１２）三井農林株式会社 (72)
【Ｆターム（参考）】
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