セフェム化合物
本発明は、新規セフェム化合物、およびその化合物の製造方法に関するものであり、その方法は発酵段階、化学的段階、および／または生体内変換段階を含む可能性がある。式（Ｉ）で表される本発明のセフェム化合物またはその塩若しくはそのエステル（式中、Ｒは（カルボキシメチルチオ）プロピオニル、（カルボキシエチルチオ）プロピオニル、Ｙ−ＣＨ２−ＣＯ１５からなる群から選択され、式中、Ｙはフェニル、フェノキシまたはテトラゾリルＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯであり、式中、Ｘは（ＣＨ２）４と定義されるか、あるいは式中、Ｘは（ＣＨ２）Ｐ−Ａ−（ＣＨ２）ｑと定義され、式中、ｐおよびｑはそれぞれ個別に０、１、２、３または４であり、ＡはＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、ＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、Ｓ、ＮＨであり、窒素は置換されてもよく、または硫黄は酸化されてもよく、Ｂは水素、ハロゲン、Ｃ１−３アルコキシ、ヒドロキシル、または置換されてもよいメチルであり、但し、ＡがＣＨ＝ＣＨまたはＣ≡Ｃのとき、ｐ＋ｑは２または３であり、またはＡがＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、ＳまたはＮＨのとき、ｐ＋ｑは３または４であり、あるいは式中、Ｘは（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ＝Ａ−（ＣＨ２）ｎまたは（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎであり、式中、ｍおよびｎはそれぞれ個別に０、１、２または３であり、ｍ＋ｎ＝２または３であり、ＡはＣＨまたはＮであるか、あるいは式中、Ｘは（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ−（ＣＨ２）ｑであり、式中、ｐおよびｑはそれぞれ個別に０または１であり、ｐ＋ｑ＝０または１であり、かつ式中、Ｒ’は、ＯＨ、アルキルが直鎖または分枝鎖であり得るＯ−（アルキル１〜６Ｃ）およびアルキル基が直鎖または分枝鎖であり得るＯ−Ｃ（アルキル１〜６Ｃ）−Ｏ−（アルキル１〜６Ｃ）からなる群から選択される）を、とりわけ本発明による発酵技術により、特に適当なアシル−６−アミノペニシラン酸を所望の化合物に変換するのに必要な遺伝子を有するか、またはその遺伝子で形質転換された適切な微生物を用いて調製することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規セフ−３−エム化合物およびその化合物の製造のためのバイオプロセスに関する。
【発明の詳細な説明】
【０００２】
本発明のセフ−３−エム化合物は、式（Ｉ）で特徴付けられ、
【化１】
またはその塩もしくはそのエステルであり、
式中、Ｒは、
ａ）ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯ−
式中、Ｘは（ＣＨ２）４と定義されるか、
あるいは式中、Ｘは（ＣＨ２）ｐ−Ａ−（ＣＨ２）ｑと定義され、
式中、ｐおよびｑはそれぞれ個別に０、１、２、３または４であり、ＡはＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、ＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、Ｓ、ＮＨであり、窒素は置換されてもよく、または硫黄は酸化されてもよく、Ｂは水素、ハロゲン、Ｃ１−３アルコキシ、ヒドロキシル、または置換されてもよいメチルであり、但し、ＡがＣＨ＝ＣＨまたはＣ≡Ｃであるとき、ｐ＋ｑは２または３であり、あるいはＡがＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、ＳまたはＮＨであるとき、ｐ＋ｑは３または４であり、
あるいは式中、Ｘは（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ＝Ａ−（ＣＨ２）ｎまたは（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎであり、
式中、ｍおよびｎはそれぞれ個別に０、１、２または３であり、ｍ＋ｎ＝２または３であり、ＡはＣＨまたはＮであり、
あるいは式中、Ｘは（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ−（ＣＨ２）ｑであり、
式中、ｐおよびｑはそれぞれ個別に０または１であり、ｐ＋ｑ＝０またはであり、あるいは、
ｂ）（カルボキシメチルチオ）プロピオニル
ｃ）（カルボキシエチルチオ）プロピオニル
からなる群から選択され、かつ、
式中、Ｒ’は、
ｄ）ＯＨ、
ｅ）アルキルは直鎖または分枝鎖であり得るＯ−（アルキル１〜６Ｃ）および
ｆ）アルキル基は直鎖または分枝鎖であり得るＯ−Ｃ（アルキル１〜６Ｃ）−Ｏ−（アルキル１〜６Ｃ）
からなる群から選択される。
【０００３】
このセフ−３−エム化合物（Ｉ）を、市販のセフ−３−エム抗生物質の製造における中間体として使用することができる。あるいは、このセフ−３−エム化合物（Ｉ）を別の中間体、すなわち７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩もしくはそのエステルに変換することができる。
【０００４】
このセフ−３−エム化合物（Ｉ）における特に有利な点は、セファロスポリンＣに比べて、精製および／または商業上で興味が持たれているセフ−３−エム抗生物質のさらなる合成の条件下でより安定性を有している点である。このため、セファロスポリンＣよりもかなり容易に、好適な化合物を単離することができる。
【０００５】
市販のセフ−３−エム抗生物質の例は、セファセトリル、セファクロール、セファログリシン、セファロニウム、セファロリジン、セファロチン、セファマンドール、セファピリン（ｃｅｆａｐｉｒｉｎ）、セファピリン（ｃｅｆａｐｙｒｉｎ）、セファトリジン、セファゼドン（ｃｅｆａｚｅｄｏｎｅ）、セファゾリン、セフブペラゾン、セフカペンピボキシル、セフジニル、セフジトレンピボキシル、セフェピム、セフェキシム、セフメノキシム、セフメタゾール、セフミノクス、セフォジジム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォラニド、セフォタキシム、セフォチアム、セフォチアムヘキセチル、セフピラミド、セフピロム、セフポドキシムプロキセチル、セフプロジル、セフロキサジン、セフスロジン、セフタジジム、セフテラムピボキシル、セフテゾール、セフチブテン、セフチオフル、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフロキシム、セフロキシムアキセチル、セフゾナムである。
【０００６】
セフロキシム、セフォキシチンおよびセフカペンピボキシルは、セファロスポリン抗生物質の例であり、３−カルバモイルオキシメチル基を共有し、７−ＡＣＡなどの現在入手可能なセフ−３−エム中間体から容易に製造することができない。本発明のセフ−３−エム化合物は３−カルバモイルオキシメチル基を有し、既知の手法を用いて、これらのセファロスポリン抗生物質のみならず他のセフ−３−エム抗生物質にも容易に変換することができる。
【０００７】
セファゾリン、セフタジジン（ｃｅｆｔａｚｉｄｉｎｅ）およびセフトリアキソンは、既知の手法により式（Ｉ）の化合物から調製することができる最も好ましいセファロスポリン抗生物質である。
【０００８】
さらに、式（Ｉ）の化合物自体を抗生物質として使用することができる。
【０００９】
本発明の最も好ましい化合物は、式（ＩＩ）の化合物（アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸）である。
【化２】
【００１０】
本発明のセフ−３−エム化合物を、当技術分野で知られた方法で化学的に、あるいは発酵により、あるいは１つまたは複数の生体内変換段階および１つまたは複数の発酵段階および／または１つまたは複数の化学的変換段階の組み合わせにより製造することができる。
【００１１】
本発明は、遺伝子操作された適切な微生物由来の二次代謝産物として、セフ−３−エム化合物（Ｉ）を製造するための発酵方法をも含む。
【００１２】
本発明によるセフ−３−エム化合物の発酵製造のために、好ましくは、β−ラクタムを製造するための少なくとも一部の代謝経路を本質的に有する微生物を使用することができる。例えば、ペナム系またはセフ−３−エム系β−ラクタム化合物の製造に少なくとも一部の代謝経路を有する微生物を使用することができる。この目的に適切な生物は、例えば、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍなどのペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、またはＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍなどのアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、またはＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓなどのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の真菌、あるいはＳ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｉｓなどのストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、またはＮ．ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓなどのノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、またはＬ．ｌａｃｔａｍｇｅｎｕｓなどのＬｙｓｏｂａｃｔｅｒ属の細菌である。
【００１３】
微生物におけるＯ−カルバモイル化セフ−３−エム化合物セファマイシンＣの生合成は、図１に示すスキームに従って行われると考えられる。セファロスポリンＣの合成は、図２のスキームで示される。
【００１４】
好ましくは、このような遺伝子操作生物を、得られたセフ−３−エム化合物で天然セフ−３−エム化合物の７位に存在するα−アミノ−アジピル側鎖が本発明による所望の側鎖に置き換えられる条件下で、培養する。この目的を達するために、この側鎖をもたらし得る組成物をｉｎ ｖｉｖｏ酵素的変換に供する。
【００１５】
適切には、このｉｎ ｖｉｖｏ酵素的変換を、
ｉ）３’−カルボキシメチルチオプロピオン酸またはその塩もしくはそのエステル、
ｉｉ）３，３’−チオジプロピオン酸またはその塩もしくはそのエステル、
ｉｉｉ）化合物ｐＹ−ＣＨ２−ＣＯＯＨまたはその塩もしくはそのエステル
（式中、Ｙはフェニル、フェノキシまたはテトラゾリルである）、
ｉｖ）一般式ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯＯＨの化合物またはその塩もしくはそのエステル
（式中、Ｘは（ＣＨ２）４と定義されるか、
あるいは式中、Ｘは（ＣＨ２）ｐ−Ａ−（ＣＨ２）ｑと定義され、
式中、ｐおよびｑはそれぞれ個別に０、１、２、３または４であり、ＡはＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、ＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、Ｓ、ＮＨであり、窒素は置換されてもよく、または硫黄は酸化されてもよく、Ｂは水素、ハロゲン、Ｃ１−３アルコキシ、ヒドロキシル、または置換されてもよいメチルであり、但し、ＡがＣＨ＝ＣＨまたはＣ≡Ｃであるとき、ｐ＋ｑは２または３であり、あるいはＡがＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、ＳまたはＮＨであるとき、ｐ＋ｑは３または４であり、
あるいは式中、Ｘは（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ＝Ａ−（ＣＨ２）ｎまたは（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎであり、
式中、ｍおよびｎはそれぞれ個別に０、１、２または３であり、ｍ＋ｎ＝２または３であり、ＡはＣＨまたはＮであり、
あるいは式中、Ｘは（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ−（ＣＨ２）ｑであり、
式中、ｐおよびｑはそれぞれ個別に０または１であり、ｐ＋ｑ＝０または１である）、
からなる群から選択される側鎖前駆物質により提供することができる。
【００１６】
製造のための遺伝子操作生物として、Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍを使用する場合、イソペニシリンＮアシルトランスフェラーゼをコードするｐｅｎＤＥ（Ａｌｖａｒｅｚ，Ｅ．、Ｂ．Ｍｅｅｓｓｃｈａｅｒｔ、Ｅ．Ｍｏｎｔｅｎｅｇｒｏ、Ｓ．Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ、Ｂ．Ｄｉｅｚ、Ｊ．Ｌ．Ｂａｒｒｅｄｏ、およびＪ．Ｆ．Ｍａｒｔｉｎ、１９９３年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１５、３２３〜３３２頁）、およびカルバモイルトランスフェラーゼをコードするｃｍｃＨ（Ｃｏｑｕｅ，Ｊ．Ｊ．Ｒ．、Ｆ．Ｊ．Ｐｅｒｅｚ−Ｌｌａｒｅｎａ、Ｆ．Ｊ．Ｅｎｇｕｉｔａ、Ｊ．Ｌ．Ｆｕｅｎｔｅ、Ｊ．Ｆ．Ｍａｒｔｉｎ、およびＰ．Ｌｉｒａｓ、１９９５年、Ｇｅｎｅ １６２、２１〜２７頁）を導入するべきである。さらに、少なくともＤＡＣアセチルトランスフェラーゼをコードするｃｅｆＧ遺伝子（Ｆｅｌｉｘ，Ｈ．Ｒ．、Ｊ．Ｎｅｕｓｃｈ、およびＷ．Ｗｅｈｒｌｉ、１９８０年、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．８、５５〜５８頁；Ｆｕｊｉｓａｗａ，Ｙ．、およびＴ．Ｋａｎｚａｋｉ、１９７５年、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３９、２０４３〜２０４８頁）および好ましくはＩＰＮエピメラーゼを共にコードするｃｅｆＤ１およびｃｅｆＤ２遺伝子（Ｕｌｌａｎ ＲＶ、Ｃａｓｑｕｅｉｒｏ Ｊ、Ｂａｎｕｅｌｏｓ Ｏ、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ＦＪ、Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ Ｓ、Ｍａｒｔｉｎ ＪＦ、２００２年、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７（４８）、４６２１６〜４６２２５頁）も、好ましくない副産物を避けるために不活性化するべきである。
【００１７】
製造のための遺伝子操作生物として、Ｎ．ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓまたはＳ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓを選択する場合、ｐｅｎＤＥの導入および発現が必要であり、好ましくはｃｅｆＤ遺伝子（Ｊａｙａｔｉｌａｋｅ，Ｓ．、Ｊ．Ａ．Ｈｕｄｄｌｅｓｔｏｎ、およびＥ．Ｐ．Ａｂｒａｈａｍ、１９８１年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９５、６４５〜６４７頁；Ｋｏｎｏｍｉ，Ｔ．、Ｓ．Ｈｅｒｃｈｅｎ、Ｊ．Ｅ．Ｂａｌｄｗｉｎ、Ｍ．Ｙｏｓｈｉｄａ、Ｎ．Ａ．Ｈｕｎｔ、およびＡ．Ｌ．Ｄｅｍａｉｎ、１９７９年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１８４、４２７〜４３０頁）およびＯＣＤＡＣヒドロキシラーゼをコードするｃｍｃＩ遺伝子（Ｘｉａｏ，Ｘ．、Ｇ．Ｈｉｎｔｅｒｍａｎｎ、Ａ．Ｈａｕｓｌｅｒ、Ｐ．Ｊ．Ｂａｒｋｅｒ、Ｆ．Ｆｏｏｒ、Ａ．Ｌ．Ｄｅｍａｉｎ、およびＪ．Ｐｉｒｅｔ、１９９３年、Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３７、８４〜８８頁）および場合によってメチルトランスフェラーゼまたはセファマイシンＣ合成酵素をコードするｃｍｃＪ遺伝子（Ｃｏｑｕｅ，Ｊ．Ｊ．Ｒ．、Ｆ．Ｊ．Ｐｅｒｅｚ−Ｌｉａｒｅｎａ、Ｆ．Ｊ．Ｅｎｇｕｉｔａ、Ｊ．Ｌ．Ｆｕｅｎｔｅ、Ｊ．Ｆ．Ｍａｒｔｉｎ、およびＰ．Ｌｉｒａｓ、１９９５年、Ｇｅｎｅ １６２、２１〜２７頁）をも、（後者の２つは、国際公開第ＷＯ９５／２９２５３号パンフレットに記載されるように、セファマイシン生合成を遅らせる酵素）、好ましくない副産物を避けるために、不活性化してもよい。
【００１８】
宿主としてＬ．ｌａｃｔａｍｇｅｎｕｓを選択する場合、少なくともｐｅｎＤＥおよびｃｍｃＨを導入するべきであり、好ましくはｃｅｆＤを不活性化するべきである。
【００１９】
本発明の化合物の製造のための遺伝子改変を備えるために、当技術分野で知られる方法で、生物に遺伝子の挿入および不活性化を行うことができる。挿入のためにゲノムＤＮＡ配列または所望に応じてｃＤＮＡを使用することができる。
【００２０】
本発明の化合物の発酵製造に好ましい微生物は、遺伝子操作により本発明の化合物製造に適する酵素をコードするＤＮＡ断片を備えており、また、Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの場合に適当な遺伝子が不活性化されている、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍおよびＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍである。
【００２１】
さらに好ましくは、本発明による化合物の発酵製造を、適切な方法で遺伝子操作を受けたＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍで行う。
【００２２】
このために、イソペニシリンＮを生成する能力のあるＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株は、以下のＤＮＡ断片セットを備えている：
１）エクスパンダーゼ（ｅｘｐａｎｄａｓｅ）酵素をコードするＤＮＡ
２）ヒドロキシラーゼ（ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）酵素をコードするＤＮＡ
３）Ｏ−カルバモイルトランスフェラーゼ（Ｏ−ｃａｒｂａｍｏｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）酵素をコードするＤＮＡ。
【００２３】
あるいは、二元機能のエクスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ酵素をコードするＤＮＡを、エクスパンダーゼ酵素およびヒドロキシラーゼ酵素を別々にコードするＤＮＡの代わりに導入してもよい。
【００２４】
好ましい実施形態では、本発明は式（Ｉ）の化合物
【化３】
またはその塩もしくはそのエステルの発酵製造方法に関し、
（式中、Ｒは、
ａ）ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯ−
（式中、Ｘは（ＣＨ２）４と定義されるか、
あるいは式中、Ｘは（ＣＨ２）ｐ−Ａ−（ＣＨ２）ｑと定義され、
式中、ｐおよびｑはそれぞれ個別に０、１、２、３または４であり、ＡはＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、ＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、Ｓ、ＮＨであり、窒素は置換されてもよく、または硫黄は酸化されてもよく、Ｂは水素、ハロゲン、Ｃ１−３アルコキシ、ヒドロキシル、または置換されてもよいメチルであり、但し、ＡがＣＨ＝ＣＨまたはＣ≡Ｃのとき、ｐ＋ｑは２または３であり、またはＡがＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、ＳまたはＮＨのとき、ｐ＋ｑは３または４であり、
あるいは式中、Ｘは（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ＝Ａ−（ＣＨ２）ｎまたは（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎであり、
式中、ｍおよびｎはそれぞれ個別に０、１、２または３であり、ｍ＋ｎ＝２または３であり、ＡはＣＨまたはＮであり、
あるいは式中、Ｘは（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ−（ＣＨ２）ｑであり、
式中、ｐおよびｑはそれぞれ個別に０または１であり、ｐ＋ｑ＝０またはである）、あるいは、
ｂ）（カルボキシメチルチオ）プロピオニル、
ｃ）（カルボキシエチルチオ）プロピオニル
ｄ）Ｙ−ＣＨ２−ＣＯ−
（式中、Ｙはフェニル、フェノキシまたはテトラゾリルである。）
からなる群から選択され、かつ、
式中、Ｒ’は、
ｅ）ＯＨ
ｆ）アルキルが直鎖または分枝鎖であり得るＯ−（アルキル１〜６Ｃ）および
ｇ）アルキル基が直鎖または分枝鎖であり得るＯ−Ｃ（アルキル１〜６Ｃ）−Ｏ−（アルキル１〜６Ｃ）
からなる群から選択される）
Ａ）イソペニシリンＮを産生するＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株を、その生育を維持することが可能な培地で維持し、
ｉ）３’−カルボキシメチルチオプロピオン酸またはその塩もしくはそのエステル、
ｉｉ）３，３’−チオジプロピオン酸またはその塩もしくはそのエステル、
ｉｉｉ）化合物ｐＹ−ＣＨ２−ＣＯＯＨまたはその塩もしくはそのエステル
（式中、Ｙはフェニル、フェノキシまたはテトラゾリルである）、
ｉｖ）一般式ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯＯＨの化合物またはその塩もしくはそのエステル
（式中、Ｘは（ＣＨ２）４と定義されるか、
あるいは式中、Ｘは（ＣＨ２）ｐ−Ａ−（ＣＨ２）ｑと定義され、
式中、ｐおよびｑはそれぞれ個別に０、１、２、３または４であり、ＡはＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、ＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、Ｓ、ＮＨであり、窒素は置換されてもよく、または硫黄は酸化されてもよく、Ｂは水素、ハロゲン、Ｃ１−３アルコキシ、ヒドロキシル、または置換されてもよいメチルであり、但し、ＡがＣＨ＝ＣＨまたはＣ≡Ｃのとき、ｐ＋ｑは２または３であり、またはＡがＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、ＳまたはＮＨのとき、ｐ＋ｑは３または４であり、
あるいは式中、Ｘは（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ＝Ａ−（ＣＨ２）ｎまたは（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎであり、
式中、ｍおよびｎはそれぞれ個別に０、１、２または３であり、ｍ＋ｎ＝２または３であり、ＡはＣＨまたはＮであり、
あるいは式中、Ｘは（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ−（ＣＨ２）ｑであり、
式中、ｐおよびｑはそれぞれ個別に０または１であり、ｐ＋ｑ＝０または１である）
からなる群から選択される、前記Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株により同化および利用されて適切なアシル−６−アミノペニシラン酸（アシル−６−ＡＰＡ）を生成し、それによりアシル−６−ＡＰＡを生成することが可能である任意の１つまたは複数の側鎖前駆物質を含むフィードストック（ｆｅｅｄｓｔｏｃｋ）を前記培地に添加するステップと、
Ｂ）対応する遺伝子のｉｎ ｓｉｔｕ発現により以下の酵素的変換を行うステップであって、
ｉ）アシル−６−ＡＰＡを、エクスパンダーゼ酵素によりｉｎ ｓｉｔｕで環拡大して、対応するアシル−７−アミノ−デスアセトキシセファロスポラン酸（アシル−７−ＡＤＣＡ）を生成し、ここで、アシル−６−ＡＰＡを基質として受容することができるエクパンダーゼ酵素をコードするＤＮＡにより、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株を形質転換し、その発現の結果、菌株で産生した前記アシル−６−ＡＰＡもその後ｉｎ ｓｉｔｕで環拡大して、対応するアシル−７−ＡＤＣＡを生成する、
ｉｉ）アシル−７−ＡＤＣＡの３−メチル側鎖を、ヒドロキシラーゼ酵素によりｉｎ ｓｉｔｕで水酸化して、対応するアシル−７−ＡＤＡＣを生成し、ここで、アシル−７−ＡＤＣＡを基質として受容することができるヒドロキシラーゼ酵素をコードするＤＮＡにより、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株を形質転換し、その発現の結果、菌株で産生したアシル−７−ＡＤＣＡもｉｎ ｓｉｔｕで水酸化されて、対応するアシル−７−ＡＤＡＣを生成し、
ｉｉｉ）アシル−７−ＡＤＡＣの３−ヒドロキシメチル側鎖を、Ｏ−カルバモイルトランスフェラーゼ酵素によりｉｎ ｓｉｔｕでＯ−カルバモイル化し、式（Ｉ）の化合物を生成し、ここで、アシル−７−ＡＤＡＣを基質として受容することができるＯ−カルバモイルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡにより、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株を形質転換し、その発現の結果、菌株で産生したアシル−７−ＡＤＡＣもｉｎ ｓｉｔｕでカルバモイル化されて、本発明の化合物を生成するステップとを含む。
【００２５】
本発明による使用のために、エクスパンダーゼ酵素、ヒドロキシラーゼ酵素またはＯ−カルバモイルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを、このＤＮＡを含むと報告され、かつ菌株保存機関から入手することができる微生物から得ることができ、または適当な自然源から単離された微生物から得る可能性がある。
【００２６】
エクスパンダーゼ酵素を含むと報告される微生物の例は、Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ（ｃｅｆＥＦ）、Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ（ｃｅｆＥ）、Ｎ．ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ（ｃｅｆＥ）、Ｌ．ｌａｃｔａｍｇｅｎｕｓ（ｃｅｆＥ）である。
【００２７】
ヒドロキシラーゼ酵素を含むと報告される微生物の例は、Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ（ｃｅｆＥＦ）、Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ（ｃｅｆＥ）、Ｎ．ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ（ｃｅｆＥ）、Ｌ．ｌａｃｔａｍｇｅｎｕｓ（ｃｅｆＥ）である。
【００２８】
Ｏ−カルバモイルトランスフェラーゼ酵素を含むと報告される微生物の例は、放線菌目由来の種であり、とりわけストレプトマイセス属由来の種である。米国特許第４０７５０６１号明細書（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４０７５０６１）の開示に基づき、所望のＯ−トランスカルバモイラーゼ活性をコードするＤＮＡを与えるために使用する可能性のある、特に適切な種には、英国特許第１３１５１７７号明細書（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．１３１５１７７）に記載されるＮＲＲＬ３５８５株などのＳ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ、オランダ特許出願第７３０８９４８号明細書（Ｄｕｔｃｈ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．７３０９４８）に記載されるＡＴＣＣ２１９４８株などのＳ．ｗａｄａｙａｍｅｎｓｉｓ、米国特許第３９１４１５８号明細書（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．３９１４１５８）に記載されるＮＲＲＬ５７３５などのＳ．ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ、英国特許第１３２１４１２号明細書（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．１３２１４１２）に記載されるＮＲＲＬ３８０２株などのＳ．ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ、および英国特許第１３８７９６５号明細書（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．１３８７９６５）に記載されるＮＲＲＬ５７４１株などのＳ．ｊｕｍｏｎｊｉｎｅｎｓｉｓなどがある。
【００２９】
特許公報国際公開第９５／２９２５３号パンフレットの開示によれば、ＤＮＡをコードする所望のＯ−カルバモイルトランスフェラーゼのさらなる適切な生物源は、Ｎ．ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ、Ｓ．ｌｉｐｍａｎｉｌ、Ｓ．ｐａｎａｙｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｃａｔｔｌｅｙａ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓ．ｔｏｄｏｒｏｍｉｎｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｆｉｌｉｐｉｎｅｎｓｉｓ ｃｅｐｈａｍｉｃｉｎｉおよびＳ．ｈｅｔｅｒｏｍｏｒｐｈｕｓである可能性がある。
【００３０】
一般に、宿主細胞、例えばＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍまたは他の真菌の形質転換は、ＰＥＧ／Ｃａ媒介のプロトプラスト法、エレクトロポレーション法またはパーティクルガン（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｇｕｎ）法のような様々な手段のＤＮＡの導入、および形質転換細胞の選択により行うことができる。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｆｕｎｇｉ（Ｐｅｂｅｒｄｙ、Ｌａｔｅｎ、Ｏｇｄｅｎ、Ｂｅｎｎｅｔｔ編）、ケンブリッジ大学出版局（１９９１年）のＶａｎ ｄｅｎ ＨｏｎｄｅｌとＰｕｎｔの「Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ｆｕｎｇｉ」を参照されたい。優性および非優性の選択マーカーのアプリケーションについて記載されている（上記のＶａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌら）。同種生物源（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来）および異種生物源（非Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来）の両方の選択マーカーについて記載されている（Ｇｏｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０（１９９１年）、１８９〜２００頁）。
【００３１】
形質転換細胞の選択において、ベクター配列の存在下または非存在下で、選択不能のＤＮＡに物理的に連結しているかまたは連結していない、様々な同種または異種形質転換細胞選択マーカーのアプリケーションがよく知られている。
【００３２】
例えばＷｉｓｃｏｎｓｉｎ５４−１２５５株（ＡＴＣＣにおいて登録番号２８０８９で寄託されている）のＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍにおいて、エクスパンダーゼ活性、ヒドロキシラーゼ活性およびＯ−カルバモイルトランスフェラーゼ活性をコードするＤＮＡ配列をこのような方法で導入し、発現させる。β―ラクタム産生を改良させた、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ５４−１２５５株の変異体を含む他のＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株も適する。このような高産生菌株の例は、ＣＢＳ４５５．９５株、ＰａｎｌａｂｓＰ２およびＡＳＰ−７８（Ｂａｒｒｅｄｏ ＪＬ、Ａｌｖａｒｅｚ Ｅ、Ｃａｎｔｏｒａｌ ＪＭ、Ｄｉｅｚ Ｂ、Ｍａｒｔｉｎ ＪＦ、１９８８年、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ３２（７）、１０６１〜１０６７頁）である。
【００３３】
さらに、ｃｅｆＥおよびｃｅｆＦまたはｃｅｆＥＦと共にｃｍｃＨ遺伝子を、異種または同種制御エレメントの転写制御下および翻訳制御下、好ましくは真菌遺伝子制御エレメントの制御下に置く。これらのエレメントを、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのＩＰＮＳまたはｐｃｂＣ遺伝子、β−チューブリン遺伝子、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓのｇｐｄＡ遺伝子、またはＡ．ｎｉｇｅｒのｇｌａＡ遺伝子などのクローン化真菌遺伝子から得ることができる。
【００３４】
完全な発酵製造の代替法として、１つまたは複数の発酵段階および１つまたは複数の生体内変換段階および／または１つまたは複数の化学的変換段階の組み合わせにより、本発明の化合物を調製することができる。
【００３５】
例えば、第１の段階で、ペニシリンＧまたはペニシリンＶなどの適切なペニシリン誘導体、またはアジポイル−７−ＡＤＣＡまたはアジポイル−７−ＡＤＡＣなどのセファロスポリン誘導体を発酵製造することができる。
【００３６】
適切なペニシリン誘導体について、対応する７−アシル−３−メチル−セフ−３−エム化合物に変換する前に、場合によって６−アシル基を交換させてもよい。順々に後者の化合物を、対応する７−アシル−３−ヒドロキシメチル−セフ−３−エムに変換し、最後に式（Ｉ）の化合物に変換することができる。
【００３７】
この変換のために、必要な酵素（ｐｅｎＤＥ、ｃｅｆＥ、ｃｅｆＦおよびｃｍｃＨ遺伝子あるいはｐｅｎＤＥ、ｃｅｆＥＦおよびｃｍｃＨ遺伝子がそれぞれコードする、アシルトランスフェラーゼ、エクスパンダーゼ、ヒドロキシラーゼおよびカルバモイルトランスフェラーゼ、あるいは代わりにアシルトランスフェラーゼ、エクスパンダーゼ・ヒドロキシラーゼおよびカルバモイルトランスフェラーゼ）を任意の適切な宿主で別々に製造することができる。好ましくは、当技術分野で知られる方法に従って、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）でこれを行う。酵素を精製し、必要であれば固定化し、あるいは全細胞の生体内変換または粗製の無細胞抽出液において、単回および連続反応容器、またはワンポット反応で利用し、式（Ｉ）の化合物を製造することができる。
【００３８】
この複数段階経路（例えば、ペニシリンＧ→アシル−６−ＡＰＡ→アシル−７−ＡＤＣＡ→アシル−７−ＡＤＡＣ→化合物（Ｉ））の１段階を、発酵的変換または化学的変換段階に変えることができる。例えば、ｃｅｆＥで形質転換したＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍで生成したアジポイル−７−ＡＤＣＡを（例えば、ＥＰ０５２３３４１で記載される方法により）使用する場合、第１の段階を省くことができ、あるいは、代わりに（例えば、ＥＰ０５４０２１０で記載される方法により）ｃｅｆＥおよびｃｅｆＦで形質転換したＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍで生成したアシル−７−ＡＤＡＣから開始することにより最初の２段階を省くことができる。代替方法として、当技術分野で知られる各段階の化学的変換を応用することができる。
【実施例】
【００３９】
（実施例１ エクスパンダーゼ、ヒドロキシラーゼおよび３’−ヒドロキメチルセフェムＯ−カルバモイルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子を用いたＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの形質転換）
本願では、遺伝子クローニング法に使用される一般的な手法を用いる。これらの手法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、合成オリゴヌクレオチドの合成、ＤＮＡのヌクレオチド配列分析、ＤＮＡの酵素的ライゲーションおよび制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベクターのサブクローニング、形質転換および形質転換細胞の選択、ＤＮＡの単離および精製、サザンブロット分析によるＤＮＡの特徴付けなどがある。これらの手法は全て、当技術分野で非常によく知られており、多くの参考文献に適切に記載されている。
【００４０】
Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ５４−１２５５（ＡＴＴＣ２８０８９）を用いて形質転換を行った。Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍに導入された全てのコンストラクトは、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのＩＰＮＳプロモーターおよびＡＴターミネーターの制御下にある。β−ラクタムの産生が改良されたＷｉｓｃｏｎｓｉｎ５４−１２５５株の変異体を含む、他のＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株も適する。このような菌株の例は、ＣＢＳ４５５．９５である。
【００４１】
形質転換に使用するプロトプラストの生成のために、ＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース）でＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの培養を行う。プロトプラスト処理および再生手順は、使用されるＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの個々の菌株および実施される形質転換細胞選択法次第で若干異なる可能性がある。
【００４２】
Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ ＡＴＣＣ２７０６４を、ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔh（Ｄｉｆｃｏ）で培養する。この菌株の染色体ＤＮＡをＰＣＲによるｃｅｆＥ遺伝子の単離に使用する。公表されているＳ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓのＣｅｆＥ配列（Ｋｏｖａｃｅｖｉｃ Ｓ、Ｗｅｉｇｅｌ ＢＪ、Ｔｏｂｉｎ ＭＢ、Ｉｎｇｏｌｉａ ＴＤ、Ｍｉｌｌｅｒ ＪＲ、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ（１９８９）１７１（２）、７５４〜７６０頁；Ｉｎｇｏｌｉａら、米国特許第５０７００２０号明細書）を用いて、５’正方向プライマー４３６３：５’−ＧＡＴ ＣＡＧ ＴＧＡ ＣＡＧ ＴＴＧ ＣＡＴ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＣＧ ＡＣＧ ＧＴＧ ＣＣＣ ＡＣＣ ＴＴＣ ＡＧＣ ＣＴＧ−３’（配列番号１）および３’逆方向プライマー４３６４：５’−ＣＣＣ ＧＧＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＴＡ ＴＧＣ ＣＴＴ ＧＧＡ ＴＧＴ ＧＣＧ ＧＣＧ ＧＡＴ ＧＴＴ−３’（配列番号２）を設計した。
【００４３】
得られたＰＣＲ産物をＮｄｅＩおよびＸｂａＩで切断し、この０．９ｋｂ断片を同様にＮｄｅＩおよびＸｂａＩで切断したｐＭｃＴＮｄｅＩ（断片：３．９ｋｂ）と連結しｐＭｃＴＳＥを得た。ｐＭＣＴＮｄｅＩはｐＭＣ−５の誘導体であり（Ｓｔａｎｓｓｅｎｓら、ＮＡＲ（１９８９）１７、４４４１頁）、リボソーム結合配列（ＲＢＳ）部位およびＮｄｅＩクローニング部位の前に、ｔａｃプロモーターをコードする断片を挿入することにより作成する（Ｅ．Ｐ．Ｐａｔ．Ｎｏ．０３５１０２９も参照されたい）。
【００４４】
最初に、エクスパンダーゼ遺伝子の前でＡＴプロモーターをクローニングした。Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの染色体ＤＮＡにおいて、プライマー４４８８：５’−ＡＧＡ ＡＣＧ ＧＡＴ ＴＡＧ ＴＴＡ ＧＴＣ ＴＧＡ ＡＴＴ ＣＡＡ ＣＡＡ ＧＡＡ ＣＧＧ ＣＣＡ ＧＡＣ−３’（配列番号３）および４４８９：５’−ＧＡＣ ＡＧＡ ＧＧＡ ＴＧＴ ＧＡＡ ＧＣＡ ＴＡＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＧＧ ＧＴＣ ＧＧＡ ＡＧＡ ＴＧＧ−３’（配列番号４）を用いて、ＰＣＲによりＡＴプロモーターを得た。これらのオリゴは、Ｂａｒｒｅｄｏら（１９８９年）のＧｅｎｅ ８３、５７２〜５７６頁、およびＤｉｅｚらのＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９年）２１８、５７２〜５７６頁で公表されている、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのｐｅｎＤＥ遺伝子配列に基づく。この産物をＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩで消化し、１．５ｋｂ断片を得た。この断片を、３．０ｋｂのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片およびＳ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓのエクスパンダーゼ遺伝子を含む０．９ｋｂのｐＭｃＴＳＥ ＮｄｅＩ−ＸｂａＩ断片と連結した。これにより、ＡＴプロモーターの後ろにエクスパンダーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＡＳＥが生じる。
【００４５】
ｐＡＳＥプラスミドにおいて、エクスパンダーゼ遺伝子の後ろで（ＡＴをコードする）ｐｅｎＤＥターミネーターをクローニングした。従って、５’正方向プライマー４５７９：５’−ＴＴＣ ＧＡＴ ＧＴＣ ＡＧＣ ＣＴＧ ＧＡＣ ＧＧＣ ＧＡＧ ＡＣＣ ＧＣＣ ＡＣＧ ＴＴＣ ＣＡＧ ＧＡＴ ＴＧＧ ＡＴＣ ＧＧＧ ＧＧＣ ＡＡＣ ＴＡＣ ＧＴＧ ＡＡＣ ＡＴＣ ＣＧＣ ＣＧＣ ＡＣＡ ＴＣＣ ＡＡＧ ＧＣＡ ＴＧＡ ＡＧＧ ＣＴＣ ＴＴＣ ＡＴＧ ＡＣＧ−３’（配列番号６）および３’逆方向プライマー４５０７：５’−ＧＧＡ ＣＴＡ ＧＴＧ ＴＣＧ ＡＣＣ ＣＴＧ ＴＣＣ ＡＴＣ ＣＴＧ ＡＡＡ ＧＡＧ ＴＴＧ（配列番号５）を用いて、ＡＴターミネーターのＰＣＲに、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの染色体ＤＮＡを鋳型として使用した。この断片を、ＢｇｌＩ−ＳｐｅＩで消化し、この０．６ｋｂ産物を、ＳｐｅＩおよびＢｇｌＩで消化したプラスミドｐＡＳＥと連結し、ｐＡＳＥＷＡを生成した。
【００４６】
最後に、エクスパンダーゼ遺伝子を、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのＩＰＮＳプロモーターの後ろに入れた（ＩＰＮＳプロモーターがＡＴプロモーターに取って代わる）。Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの染色体ＤＮＡを鋳型として用いて、５’オリゴ４９２３：５’−ＣＧＡ ＧＧＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＴＴ ＡＴＡ ＣＴＧ ＧＧＣ ＴＧ ＣＴＧ ＣＡＴ ＴＧＧ ＴＣＴ Ｇ（配列番号７）（Ｄｉｅｚ，Ｂ．、Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ，Ｓ．、Ｂａｒｒｅｄｏ，Ｊ．Ｌ．、ｖａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎ，Ｐ．、ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｏｏｒｔ，Ｌ．Ｈ．とＭａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｆ．（１９９０年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（２７）、１６３５８〜１６３６５頁で公表される配列を使用）および３’オリゴ４９２４：５’−ＣＣＣ ＧＧＧ ＣＡＴ ＡＴＧ ＣＡＴ ＡＴＧ ＧＧＴ ＧＴＣ ＴＡＧ ＡＡＡ ＡＡＴ ＡＡＴ ＧＧＴ ＧＡＡ ＡＡＣ（配列番号８）（Ｃａｒｒ ＬＧ、Ｓｋａｔｒｕｄ ＰＬ、Ｓｃｈｅｅｔｚ ＭＥ ２ｎｄ、Ｑｕｅｅｎｅｒ ＳＷ、Ｉｎｇｏｌｉａ ＴＤ．（１９８６年）、Ｇｅｎｅ ４８（２−３）、２５７〜２６６頁で公表される配列を使用）で、ＩＰＮＳプロモーターを増幅した。ｐＡＳＥＷＡをＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩで消化し、エクスパンダーゼ遺伝子を有する４．６ｋｂ断片を生成し、ＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩで消化した０．９ｋｂのＩＰＮＳプロモーターＰＣＲ産物とＡＴターミネーターを連結した。これによりｐＩＳＥＷＡが生じる。ＩＰＮＳプロモーターおよびＡＴターミネーターを有するｃｅｆＥ遺伝子を、ＮｏｔＩ消化によりｐＩＳＥＷＡｎから得た（図３）。
【００４７】
ヒドロキシラーゼ遺伝子（ｃｅｆＦ）をＳ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ（ＡＴＣＣ２７０６４）から単離した。この菌株の染色体ＤＮＡを、ＰＣＲによるｃｅｆＦ遺伝子の単離に用い、その遺伝子の上流にＮｄｅＩ部位、下流にＮｓｉＩ部位を導入した。このコンストラクトをＩＰＮＳプロモーターの後とＡＴターミネーターの前に連結し、ｐＩＳＦＷＡを生成した。Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの形質転換のために、ＮｏｔＩによる切断後に、ｃｅｆＦ遺伝子とＩＰＮＳプロモーターおよびＡＴターミネーターを含むコンストラクトをｐＩＳＦＷＡから単離した（図４）。
【００４８】
ＰＣＲにより、Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ（＝Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）のエクスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ遺伝子（ｃｅｆＥＦ）を染色体ＤＮＡから得た。設計された正方向オリゴはＮｄｅＩ部位を導入し、逆方向オリゴはＮｓｉＩ部位を導入した。ＮｄｅＩおよびＮｓｉＩによる消化後に、この遺伝子をペニシリウム発現ベクターに入れることができ、ｐＩＣＥＦＷＡを生成した（図５）。ペニシリウムの形質転換のために、ＩＰＮＳプロモーターおよびＡＴターミネーターを用いて、ＮｏｔＩ消化により、Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来ｃｅｆＥＦをｐＩＣＥＦＷＡから単離した。
【００４９】
正方向プライマー：ＡＢ１２５８６（５’−ＡＣＡ ＧＡＣ ＣＡＴ ＡＴＧ ＣＴＣ ＧＴＣ ＧＴＴ ＧＣＡ ＴＴＣ ＡＡＧ−３’（配列番号９））および逆方向プライマー：５’−ＡＢ１２５８７（ＧＡＣ ＧＧＣ ＡＴＧ ＣＡＴ ＴＣＡ ＧＧＡ ＡＣＣ ＧＧＣ ＴＡＴ ＴＣＧ Ｃ−３’（配列番号１０））を用いて、染色体ＤＮＡのＰＣＲにより、ｃｍｃＨ遺伝子をＳ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓから得て、ＮｄｅＩ、ＮｓｉＩで切断し、ｐＩＳＥＷＡＮのＮｄｅＩ、ＮｓｉＩ断片に連結する（エクスパンダーゼ遺伝子をｃｍｃＨ遺伝子に置換する）ことにより、ｐＩＳｃＣＴＷＡが生じた（図６）。ＮｏｔＩ消化により、ＩＰＮＳプロモーターおよびＡＴターミネーターを含むｃｍｃＨ遺伝子をｐＩＳｃＣＴＷＡから単離した。
【００５０】
ＨｉｎｄＩＩＩによる消化により、ＨｅｌＹに隣接するＡｍｄＳ断片をｐＨＥＬＹ−Ａ１から単離した（図７）。
【００５１】
ａｍｄＳ選択マーカーを用いた同時形質転換により、ｃｅｆＥＦコンストラクトまたはｃｅｆＥおよびｃｅｆＦコンストラクトを有するｃｍｃＨを、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＡＴＣＣ２８０８９に導入した。ａｍｄＳマーカーの組込みにより、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ形質転換体は、唯一の窒素源としてアセトアミドを含む選択培地で生育することが可能となる。
【００５２】
Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのプロトプラストへのＤＮＡの移入に関する手法は、当技術分野でよく知られており、ＦｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎとＢａｌｌ（編）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ，ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ（１９９２年）；ＢｅｎｎｅｔｔとＬａｓｕｒｅ（編）、Ｍｏｒｅ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｆｕｎｇｉ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９１年）；Ｔｕｒｎｅｒ（Ｐｕｈｌｅｒ）（編）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｅｃｏｎｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｒｅｖｉｓｅｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、ＶＨＣ（１９９２年）などの多くの参考文献に記載されている。Ｃａ−ＰＥＧ媒介プロトプラスト形質転換は、ＥＰ６３５５７４に記載される通りに使用する。
【００５３】
（実施例２ アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸の発酵製造）
実施例１で得られたＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ形質転換体を、米国特許第２００２００３９７５８号明細書のペニシリンＶ産生試験で記載される通り、培地上に２×１０６分生子／ｍｌで接種したが、フェノキシ酢酸カリウムの代わりに、側鎖前駆物質としてアジピン酸ナトリウム０．５〜１０ｍｇ／ｍｌを補った（滅菌前のｐＨは５．５〜６．０）。２５℃、毎分２８０回転で１４４〜１６９時間培養した。
【００５４】
十分に培養した培養液のろ液を、アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸の生成についてＨＰＬＣおよびＮＭＲで分析した。ＮＭＲスペクトルは、所望の化合物に特徴的なピークを示す（図９参照）。
【００５５】
（実施例３ アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸の化学合成）
（フェニルアセチル−７−アミノ−３−ヒドロキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸−ベンズヒドリルエステル（式（ＩＶ））の調製）
【化４】
【００５６】
撹拌した７−アミノ−セファロスポラン酸（５ｇ、１８．３ｍｍｏｌ）水溶液（２０ｍｌ）に、０℃で２０％ＮａＯＨ溶液８．５ｍｌを滴下した。５分間撹拌した後、酢酸でｐＨを８．５に調整し、その溶液をアセトン（２０ｍｌ）で希釈した。その後、ＮａＯＨ水溶液の添加によりｐＨを７．５と８．５の間に保持しながら、塩化フェニルアセチル（２．９ｍｌ、２２ｍｍｏｌ）アセトン溶液（３ｍｌ）を滴下し、この溶液を０℃で１時間撹拌した。その後、アセトンを減圧除去し、酢酸エチル（７０ｍｌ）を添加して、水相を希塩酸でｐＨ３まで酸化した。有機相を分離し、さらなる酢酸エチルで水相を再抽出した。有機相を合わせてブライン（ＭｇＳＯ４）で洗浄し、ろ過した。その後、この溶液に、撹拌しながらジフェニルジアゾメタン（５ｇ、２５．８ｍｍｏｌ）酢酸エチル溶液（５ｍｌ）を添加した。この溶液を約４０ｍｌまで減圧濃縮し、４℃で一晩静置した。その結果生じた沈殿物をろ過により集め、酢酸エチルで洗浄し、白色粉末の生成物（３．８３ｇ、４０％）を得た。δＨ（（ＣＤ３）２ＳＯ、３００ＭＨｚ）３．５４ ＆ ３．６３（２Ｈ、ＡＢｑ、Ｊ １３．９、ＰｈＣＨ２）、３．６５（２Ｈ、ｓ、ＳＣＨ２）、４．２５（２Ｈ、ｓ、ＣＨ２ＯＨ）、５．１５（１Ｈ、ｄ、Ｊ ４．７、ＣＨＣＨＳ）、５．７６（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ ４．７、８．２、ＮＨＣＨ）、６．９４（１Ｈ、ｓ、ＣＨＰｈ２）７．２〜７．６（１５Ｈ、ｍ、Ｐｈ２ＣＨ、ＰｈＣＨ２）、９．１７（１Ｈ、ｄ、Ｊ ８．２、ＮＨＣＨ）。Ｍ／ｚ（ＥＳ＋）５３７（Ｍ＋Ｎａ、１００％）。
【００５７】
（トリクロロアセチル−フェニルアセチル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸−ベンズヒドリルエステル（式（Ｖ））の調製）
【化５】
【００５８】
イソシアン酸トリクロロアセチル（０．２３ｍｌ、１．９ｍｍｏｌ）を撹拌した式（ＩＶ）（６００ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）のアセトン溶液（２０ｍｌ）に添加した。２時間の撹拌後に白色の沈殿物をろ過により集め、アセトンで洗浄し、乾燥した（８１１ｍｇ、９９％）。δＨ（（ＣＤ３）２ＳＯ、３００ＭＨｚ）３．５４ ＆ ３．６２（２Ｈ、ＡＢｑ、Ｊ １３．９、ＰｈＣＨ２）、３．６６ ＆ ３．７６（２Ｈ、ＡＢｑ、Ｊ １８．５、ＳＣＨ２）、４．９０ ＆ ５．０２（２Ｈ、ＡＢｑ、Ｊ １２．８、ＣＨ２Ｏ）、５．２０（１Ｈ、ｄ、Ｊ ４．８、ＣＨＣＨＳ）、５．８２（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ ４．８、８．１、ＮＨＣＨＣＨ）、６．９６（１Ｈ、ｓ、ＣＨＰｈ２）、７．２〜７．６（１５Ｈ、ｍ、ＣＨＰｈ２、ＰｈＣＨ２）、９．１７（１Ｈ、ｄ、Ｊ ８．１、ＮＨＣＨ）、１２．０（１Ｈ、ｓ、ＣＯＮＨＣＯ）。Ｍ／ｚ（ＥＳ−）７０２（Ｍ−１、１００％）。
【００５９】
（トリクロロアセチル−ＧＯフェニルアセチル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸ＲＣＯ（式（ＶＩ））の調製）
【化６】
【００６０】
式（Ｖ）（５．１５ｇ、７．３３ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（３５ｍｌ）とアニソール（４ｍｌ）の冷却（０℃）混合液に溶解させた。２時間の撹拌後、この溶液を減圧濃縮し、オイルを得て石油エーテル（４０〜６０℃画分）を用いて粉砕し、酢酸エチル（３０ｍｌ）に溶解させ、炭で脱色化した。ろ過後、この溶液を減圧濃縮し、さらに精製することなく次の段階で使用する黄色のオイルを得た。δＨ（（ＣＤ３）２ＳＯ、３００ＭＨｚ）３．５０〜３．７５（４Ｈ、ｍ、ＰｈＣＨ２、ＳＣＨ２）、４．９４（１Ｈ、一部ＡＢｑ、Ｊ １２．５、ＣＨ２Ｏ）、５．１４（２Ｈ、ｍ、一部ＡＢｑ ＣＨ２Ｏ、ＣＨＣＨＳ）、５．７２（１Ｈ、ｍ、ＮＨＣＨＣＨ）、７．０〜７．４（５Ｈ、ｍ、ＰｈＣＨ２）、９．１２（１Ｈ、ｄ、Ｊ ８．２、ＮＨＣＨ）、１１．９５（１Ｈ、ｓ、ＣＯＮＨＣＯ）。Ｍ／ｚ（ＥＳ−）５３６（Ｍ−１、６７％）。
【００６１】
（フェニルアセチル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸（式（ＶＩＩ））の調製）
【化７】
【００６２】
１０％ＮａＨＣＯ３溶液を添加して、ｐＨが約９に達するまで、前段階で得た黄色のオイルを注意深く溶解させた後、この溶液を一晩撹拌した。その後、希塩酸を用いて、沈殿が発生する２までｐＨを下げた。沈殿をろ過により取り除き、エーテルで洗浄し、淡黄色の固体（２段階越しで１．８１ｇ、６３．３％）を得た。δＨ（（ＣＤ３）２ＳＯ、３００ＭＨｚ）３．４〜３．６５（ピークがＨ２Ｏのピークでマスク）、４．６３ ＆ ４．９１（２Ｈ、ＡＢｑ、Ｊ １２．８、ＣＨ２Ｏ）、５．１０（１Ｈ、ｄ、Ｊ ４．５、ＣＨＣＨＳ）、５．６８（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ ４．５、８．２、ＮＨＣＨＣＨ）、７．２８（５Ｈ、ｍ、ＰｈＣＨ２）、９．１１（１Ｈ、ｄ、Ｊ ８．２、ＮＨＣＨ）。δＨ（（ＣＤ３）２ＳＯ＋Ｄ２Ｏ、３００ＭＨｚ）３．５２（４Ｈ、ｍ、ＰｈＣＨ２、ＳＣＨ２）、４．６３ ＆ ４．８８（２Ｈ、ＡＢｑ、Ｊ １２．９、ＣＨ２Ｏ）、５．０５（１Ｈ、ｄ、Ｊ ４．８、ＣＨＣＨＳ）、５．６５（１Ｈ、ｄ、Ｊ ４．７、ＮＨＣＨＣＨ）、７．２８（５Ｈ、ｍ、ＰｈＣＨ２）。Ｍ／ｚ（ＥＳ−）３９０（Ｍ−１、２０％）。
【００６３】
（７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸（式（ＶＩＩＩ））の調製）
【化８】
【００６４】
式（ＶＩＩ）（７６０ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）をリン酸カリウムバッファー（２０ｍｌ、０．５Ｍ、ｐＨ７）中で撹拌し、ＮａＯＨ水溶液の添加によりｐＨをｐＨ７．８まで上昇させた。ペニシリンアミダーゼ・アクリルビーズ（グルコース安定化剤を取り除くための洗浄後の約３７５ｍｇ）を添加し、その結果生じた懸濁液を２．５時間撹拌した。その後、このビーズをろ過により取り除き、希塩酸の添加により溶液のｐＨを３まで下げた。この溶液を４℃で一晩冷却後、ろ過して淡黄色の粉末の生成物を得た（３３４ｍｇ、６３％）δＨ（（ＣＤ３）２ＳＯ＋Ｄ２Ｏ、３００ＭＨｚ）３．３６ ＆ ３．５３（２Ｈ、ＡＢｑ、Ｊ １８．１、ＳＣＨ２）、４．６０ ＆ ４．８２（２Ｈ、ＡＢｑ、Ｊ １２．８、ＣＨ２Ｏ）、４．７４（１Ｈ、ｄ、Ｊ ４．９、ＣＨＣＨＳ）、４．９４（１Ｈ、ｄ、Ｊ ４．９、Ｈ２ＮＣＨＣＨ）。
【００６５】
（環状無水アジピン酸（式（ＩＸ））の調製）
【化９】
【００６６】
アジピン酸（５ｇ、３４ｍｍｏｌ）および無水酢酸の混合物（１５ｍｌ）を４時間加熱還流した。その後、この溶液を減圧濃縮し、その残渣を減圧蒸留し、無色のオイル（湿気に暴露されると重合化を起こす）を得た。δＨ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）２．０（４Ｈ、ｍ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）、２．７６（４Ｈ、ｔ、Ｊ ６．６、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）。
【００６７】
（アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸（式（Ｘ））の調製）
【化１０】
【００６８】
ＮａＯＨ水溶液を注意深く添加して、式（ＶＩＩＩ）（１００ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）のアセトン水溶液（１０ｍｌ、１：１ｖ／ｖ）をｐＨ８．５に調整した。０℃で、ＮａＯＨ水溶液の添加によりｐＨを７．５と８．５の間に保持しながら、この溶液に式（ＩＸ）（８０ｍｇ、０．６２５ｍｍｏｌ）のアセトン溶液（２ｍｌ）を滴下した。その結果生じた溶液を、０℃で２時間撹拌した後、アセトンを減圧除去し、ＨＣｌ水溶液の添加によりｐＨを２に調整した。この溶液をシクロヘキサノン（２×２０ｍｌ）で抽出し、集めた有機相を数ｍｌにまで濃縮した。濃縮したシクロヘキサノン溶液をシクロヘキサン（２００ｍｌ）に注ぎ、ろ過により集めた沈殿物を得た（６１ｍｇ、４１％）。δＨ（（ＣＤ３）２ＳＯ、３００ＭＨｚ）１．５０（４Ｈ、ｍ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）、２．２２（４Ｈ、ｍ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、３．４５ ＆ ３．５９（２Ｈ、ＡＢｑ、Ｊ １８．１、ＳＣＨ２）、４．６２ ＆ ４．９０（２Ｈ、ＡＢｑ、Ｊ １２．９、ＣＨ２Ｏ）、５．１０（１Ｈ、ｄ、Ｊ ４．８、ＣＨＣＨＳ）、５．６７（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ ４．８、８．２、ＮＨＣＨＣＨ）、８．８２（１Ｈ、ｄ、Ｊ ８．２、ＮＨＣＨ）。Ｍ／ｚ（ＥＳ−）８０１（２Ｍ−１、１７％）、４００（Ｍ−１、３５％）（図１０）。
【００６９】
実施例４ 生物変換を用いたアジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸のｉｎ ｖｉｔｒｏ製造
（無細胞抽出液の調製）
プラスミドｐＧＫ１０５（図１１）を用いて、ｌａｃプロモーターの制御下でＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓのｃｍｃＨ遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅで発現させた。ｃｍｃＨ遺伝子の発現のために、クロラムフェニコール含有ＬＢ培養培地５ｍｌにＸＬ１−Ｂｌｕｅ：ｐＧＫ１０５の単一コロニーを接種し、３７℃で１６時間、２５０ｒｐｍで振とう培養した。この培養液を用いて、クロラムフェニコールを補足した滅菌ＬＢ培地１００ｍｌを含むフラスコに１％接種した後、２７℃、２５０ｒｐｍで振とう培養し、ＯＤ６００が０．４〜０．６に達するまでよく通気させた。その後、ＩＰＴＧを、最終濃度の０．３ｍＭまで培養液に添加し、さらに１６時間培養を続けた。遠心分離（４０００ｇ、２０分、４℃）により細胞を集め、細胞ペレットを５ｍｌのバッファー（２０ｍＭ トリスＨＣｌ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７）に再懸濁し、−８０℃で１時間または−２０℃で一晩冷凍した。氷水浴で解凍した後、細胞懸濁液をソニケート（ＭＳＥ Ｓｏｎｉｐｒｅｐ１５０）した。１０秒の超音波処理と１０秒の冷却時間を１５〜２０サイクル行えば、完全に溶菌し、ブラッドフォード法で可溶性タンパク質の放出を測定するのに十分であった。細胞デブリ、つまり不溶性タンパク質および溶菌されない細胞を遠心分離（４０００ｇ、６０分、４℃）により沈殿化した。上清をクラブラン酸カリウム（５ｍｇｍｌ−１）で２７℃で１時間処理し、染色体にコードされるβ−ラクタマーゼを全て不活性化した。ＰＤ−１０脱塩カラムを用いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（登録商標）によるゲルろ過により過剰量のクラブラン酸塩を除去し、生じた酵素溶液を直ちに使用するか、または必要時まで−２０℃で貯蔵した。
【００７０】
（カルバモイルトランスフェラーゼアッセイ）
２８℃で４時間アッセイ（１００μｌ）を行い、ｐＨ６．７５〜７でアジポイル−デアセチルセファロスポラン酸（１〜５ｍＭ）、ＭｇＳＯ４（０．８ｍＭ）、ＭｎＣｌ２（１ｍＭ）、イミダゾール（１００ｍＭ）、ＡＴＰ（５．４ｍＭ）、リン酸カルバモイル（９．８ｍＭ）を含んだ。使用されたタンパク質量は１０μｇから２５０μｇの範囲であった。この酵素溶液を氷上で解凍し、加熱ブロックで２８℃にさせた反応混合液に添加した。氷冷メタノール（１００μｌ）を添加することにより、この反応を終了させ、混合した後、沈殿したタンパク質をペレット化した。１００℃で５分間の加熱処理により変性させた可溶性タンパク質をコントロール反応に使用し、常に通常のアッセイと一緒に試験した。
【００７１】
（ＨＰＬＣ／ＭＳ分析）
バッファーＡとして０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム、およびバッファーＢとして０．０５Ｍリン酸二水素ナトリウム／５０％アセトニトリルからなる移動相、１ｍｌ／ｍｉｎ−１の流速のＧｉｌｓｏｎＨＰＬＣシステムを用い、２５４ｎｍでモニターして、室温でＳｐｈｅｒｉｓｏｒｂ分析Ｃ１８カラム（２５０×４．６ｍｍ）上で反応成分を分離した。この条件を用いて、セファロスポリウムの出発物質および生成物の信頼のおける標準品におけるリテンションタイムは、それぞれ１９分および２２．５分であった。いくつかの分析ランの生成物ピークをためておき、ｐＨ１．８にまで酸性化し、シクロヘキサノンで抽出した。その後、二相抽出混合物のｐＨを７に調整し、途中で断続的に振とうしながら、有機相を水で逆抽出した。水相を凍結乾燥し、再び水に溶かし、エレクトロスプレー（陰イオンモード）イオン化ＭＳで分析し、カルバモイル化セファロスポリン生成物を特徴的な（Ｍ−Ｈ）−により特定した（図１２）。
【００７２】
（結論）
本実験により、生物変換を用いて、アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸の製造が可能であると結論することができる。
【００７３】
実施例５ アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸の細胞外搬出
実施例２に従って調製した試料を、ろ液のバイオマス分離によりさらに詳細に分析した。２５℃、毎分２８０回転で１６８時間培養後、この十分に培養した培養液のろ液を、ろ過によりバイオマスから分離し、ＮＭＲで分析した。このバイオマスを、氷冷生理食塩水（０．９ｍＭ ＮａＣｌ）で２度洗浄し、液体窒素中で冷凍し、凍結乾燥し、再び水に溶かしてＮＭＲで分析した。
【００７４】
アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸の他に、この菌株は、中間体、それぞれＩＰＮ、６ＡＰＡ、ａｄ６ＡＰＡ、ａｄ７ＡＤＣＡおよびａｄＡＨＣＡ（＝ａｄＡＤＡＣ）も生成する。しかし、アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸がもっぱら分泌される唯一のβ−ラクタムである。
【００７５】
これらの実験の結果を図１３（ＡおよびＢ）にまとめる。
【００７６】
実施例６ フェノキシアセトイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸の発酵製造
実施例１で得られたＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ形質転換体を、実施例２で記載した産生試験培地に接種したが、酢酸ナトリウムの代わりに、産生試験のための側鎖前駆物質としてフェノキシ酢酸５ｍｇ／ｍｌを補った（ろ過前のｐＨが６．０）。培養時間は、２５℃、毎分２８０回転で１６８時間であった。
【００７７】
十分に培養した培養液のろ液をバイオマスから分離し、ＮＭＲで分析した。このバイオマスを、氷冷生理食塩水（０．９ｍＭ ＮａＣｌ）で２度洗浄し、液体窒素中で冷凍し、凍結乾燥し、再び水に溶かしてＮＭＲで分析した。菌糸体画分でフェノキシアセトイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸を得た。
【００７８】
実施例７ トランスヒドロムコノイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸の発酵製造
実施例１で得られたＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ形質転換体を、実施例２で記載した産生試験培地に接種したが、酢酸ナトリウムの代わりに、産生試験のための側鎖前駆物質としてトランスヒドロムコン酸４ｍｇ／ｍｌを補った（ろ過前のｐＨが６．０）。培養時間は、２５℃、毎分２８０回転で１６８時間であった。
【００７９】
十分に培養した培養液のろ液をバイオマスから分離し、ＮＭＲで分析した。このバイオマスを、氷冷生理食塩水（０．９ｍＭ ＮａＣｌ）で２度洗浄し、液体窒素中で冷凍し、凍結乾燥し、再び水に溶かしてＮＭＲで分析した。菌糸体画分でトランスヒドロムコノイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸を得た。
【００８０】
実施例８ アミノアジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸の発酵製造
実施例１で得られたＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ形質転換体を、実施例２で記載した産生試験培地に接種したが、何も側鎖前駆物質を添加しなかった。培養時間は、２５℃、毎分２８０回転で１６８時間であった。
【００８１】
十分に培養した培養液のろ液をバイオマスから分離し、ＮＭＲで分析した。このバイオマスを、氷冷生理食塩水（０．９ｍＭ ＮａＣｌ）で２度洗浄し、液体窒素中で冷凍し、凍結乾燥し、再び水に溶かしてＮＭＲで分析した。両画分でアミノアジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸を得た。
【００８２】
実施例９ アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸の生物活性
実施例３に従って調製したアジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸を用いて、様々な細菌に対するその活性を評価した。使用した細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＥＳＳ（ｘｘｘｒｅｆ ｋｏｍｔ ｎｏｇｘｘ）、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ ＤＳＭ３４８（Ａｎｄｒａｔｅ，Ａ．Ｃ．、Ｖａｎ Ｎｉｓｔｅｉｒｏｏｙ，Ｊ．Ｇ．Ｍ．、Ｐｅｅｒｙ，Ｒ．Ｂ．、Ｓｋａｔｒｕｄ，Ｐ．Ｌ．、Ｄｅ Ｗａａｒｄ，Ｍ．Ａ．、２０００年、Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＡＢＣ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｉｎ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ６６３３（ｘｘｘｒｅｆ ｋｏｍｔ ｎｏｇｘｘ）であった。２×ＴＹ液体培地（ｘｘｘｒｅｆ ｋｏｍｔ ｎｏｇｘｘ）中で、細菌を３７℃、毎分２８０回転で一晩培養し、その後、新鮮培地で１０００倍に希釈した。この希釈細菌培養液１ｍｌを、２ｍｌ深底ウェルｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒプレートに接種し、様々な濃度のアジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸（アジポイル−ＡＣＣＡまたはＡｄ−ＡＣＣＡ）を個々のウェルに添加した。コントロールとして、数種の他の活性β−ラクタムおよび活性の低いβ−ラクタム、つまり６−ＡＰＡ、アジポイル−６−ＡＰＡ、７−ＡＤＣＡ、アジポイル−７−ＡＤＣＡ、７−ＡＣＡ、セファロスポリンＣおよびセフロキシムを用いた。このｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒプレートを、２５℃、毎分５５０回転で２日間培養した。
【００８３】
アジポイル−７−ＡＤＣＡ、アジポイル−ＡＣＣＡおよびセフロキシムによる増殖阻害結果を図１４（枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、図１５（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））および図１６（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）にまとめる。
【００８４】
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ６６３３、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＳＳおよびＭ．ｌｕｔｅｕｓ ＤＳＭ３４８に対するアジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸の最小阻害濃度は、それぞれ４μＭ、７μＭおよび７μＭであった。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓにおけるセファマイシンＣの発酵製造の略図である。
【図２】Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍにおけるセファロスポリンＣの発酵製造の略図である。
【図３】ｃｅｆＥ遺伝子のクローニングおよびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ５４−１２２５の形質転換に使用するプラスミドを示す図である。
【図４】ｃｅｆＦ遺伝子のクローニングおよびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ５４−１２２５の形質転換に使用するプラスミドを示す図である。
【図５】ｃｅｆＥＦ遺伝子のクローニングおよびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ５４−１２２５の形質転換に使用するプラスミドを示す図である。
【図６】ｃｍｃＨ遺伝子のクローニングおよびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ５４−１２２５の形質転換に使用するプラスミドを示す図である。
【図７】ａｍｄＳ遺伝子のクローニングおよびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ５４−１２２５の形質転換に使用するプラスミドを示す図である。
【図８】本発明の発酵方法の略図である。
【図９】アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸のＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１０】実施例３に従って調製された、アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸のＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１１】プラスミドｐＧＫ１０５を示す図である。
【図１２】アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸を生じる、カルバモイルトランスフェラーゼによる生物変換産物のＨＰＬＣ／ＭＳ分析を示す図である。
【図１３】実施例２に従って形質転換したＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍにおけるアジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸および他のβ−ラクタムの細胞内（Ａ）および細胞外（Ｂ）分布を示す図である（ｍｍｏｌ）。
【図１４】アジポイル−７−ＡＤＣＡ、アジポイル−ＡＣＣＡおよびセフロキシムによる枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の増殖阻害を示す図である。
【図１５】アジポイル−７−ＡＤＣＡ、アジポイル−ＡＣＣＡおよびセフロキシムによる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の増殖阻害を示す図である。
【図１６】アジポイル−７−ＡＤＣＡ、アジポイル−ＡＣＣＡおよびセフロキシムによるＭ．ｌｕｔｅｕｓの増殖阻害を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規セフ−３−エム化合物およびその化合物の製造のためのバイオプロセスに関する。
【発明の詳細な説明】
【０００２】
本発明のセフ−３−エム化合物は、式（Ｉ）で特徴付けられ、
【化１】
またはその塩もしくはそのエステルであり、
式中、Ｒは、
ａ）ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯ−
式中、Ｘは（ＣＨ２）４と定義されるか、
あるいは式中、Ｘは（ＣＨ２）ｐ−Ａ−（ＣＨ２）ｑと定義され、
式中、ｐおよびｑはそれぞれ個別に０、１、２、３または４であり、ＡはＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、ＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、Ｓ、ＮＨであり、窒素は置換されてもよく、または硫黄は酸化されてもよく、Ｂは水素、ハロゲン、Ｃ１−３アルコキシ、ヒドロキシル、または置換されてもよいメチルであり、但し、ＡがＣＨ＝ＣＨまたはＣ≡Ｃであるとき、ｐ＋ｑは２または３であり、あるいはＡがＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、ＳまたはＮＨであるとき、ｐ＋ｑは３または４であり、
あるいは式中、Ｘは（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ＝Ａ−（ＣＨ２）ｎまたは（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎであり、
式中、ｍおよびｎはそれぞれ個別に０、１、２または３であり、ｍ＋ｎ＝２または３であり、ＡはＣＨまたはＮであり、
あるいは式中、Ｘは（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ−（ＣＨ２）ｑであり、
式中、ｐおよびｑはそれぞれ個別に０または１であり、ｐ＋ｑ＝０またはであり、あるいは、
ｂ）（カルボキシメチルチオ）プロピオニル
ｃ）（カルボキシエチルチオ）プロピオニル
からなる群から選択され、かつ、
式中、Ｒ’は、
ｄ）ＯＨ、
ｅ）アルキルは直鎖または分枝鎖であり得るＯ−（アルキル１〜６Ｃ）および
ｆ）アルキル基は直鎖または分枝鎖であり得るＯ−Ｃ（アルキル１〜６Ｃ）−Ｏ−（アルキル１〜６Ｃ）
からなる群から選択される。
【０００３】
このセフ−３−エム化合物（Ｉ）を、市販のセフ−３−エム抗生物質の製造における中間体として使用することができる。あるいは、このセフ−３−エム化合物（Ｉ）を別の中間体、すなわち７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩もしくはそのエステルに変換することができる。
【０００４】
このセフ−３−エム化合物（Ｉ）における特に有利な点は、セファロスポリンＣに比べて、精製および／または商業上で興味が持たれているセフ−３−エム抗生物質のさらなる合成の条件下でより安定性を有している点である。このため、セファロスポリンＣよりもかなり容易に、好適な化合物を単離することができる。
【０００５】
市販のセフ−３−エム抗生物質の例は、セファセトリル、セファクロール、セファログリシン、セファロニウム、セファロリジン、セファロチン、セファマンドール、セファピリン（ｃｅｆａｐｉｒｉｎ）、セファピリン（ｃｅｆａｐｙｒｉｎ）、セファトリジン、セファゼドン（ｃｅｆａｚｅｄｏｎｅ）、セファゾリン、セフブペラゾン、セフカペンピボキシル、セフジニル、セフジトレンピボキシル、セフェピム、セフェキシム、セフメノキシム、セフメタゾール、セフミノクス、セフォジジム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォラニド、セフォタキシム、セフォチアム、セフォチアムヘキセチル、セフピラミド、セフピロム、セフポドキシムプロキセチル、セフプロジル、セフロキサジン、セフスロジン、セフタジジム、セフテラムピボキシル、セフテゾール、セフチブテン、セフチオフル、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフロキシム、セフロキシムアキセチル、セフゾナムである。
【０００６】
セフロキシム、セフォキシチンおよびセフカペンピボキシルは、セファロスポリン抗生物質の例であり、３−カルバモイルオキシメチル基を共有し、７−ＡＣＡなどの現在入手可能なセフ−３−エム中間体から容易に製造することができない。本発明のセフ−３−エム化合物は３−カルバモイルオキシメチル基を有し、既知の手法を用いて、これらのセファロスポリン抗生物質のみならず他のセフ−３−エム抗生物質にも容易に変換することができる。
【０００７】
セファゾリン、セフタジジン（ｃｅｆｔａｚｉｄｉｎｅ）およびセフトリアキソンは、既知の手法により式（Ｉ）の化合物から調製することができる最も好ましいセファロスポリン抗生物質である。
【０００８】
さらに、式（Ｉ）の化合物自体を抗生物質として使用することができる。
【０００９】
本発明の最も好ましい化合物は、式（ＩＩ）の化合物（アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸）である。
【化２】
【００１０】
本発明のセフ−３−エム化合物を、当技術分野で知られた方法で化学的に、あるいは発酵により、あるいは１つまたは複数の生体内変換段階および１つまたは複数の発酵段階および／または１つまたは複数の化学的変換段階の組み合わせにより製造することができる。
【００１１】
本発明は、遺伝子操作された適切な微生物由来の二次代謝産物として、セフ−３−エム化合物（Ｉ）を製造するための発酵方法をも含む。
【００１２】
本発明によるセフ−３−エム化合物の発酵製造のために、好ましくは、β−ラクタムを製造するための少なくとも一部の代謝経路を本質的に有する微生物を使用することができる。例えば、ペナム系またはセフ−３−エム系β−ラクタム化合物の製造に少なくとも一部の代謝経路を有する微生物を使用することができる。この目的に適切な生物は、例えば、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍなどのペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、またはＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍなどのアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、またはＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓなどのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の真菌、あるいはＳ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｉｓなどのストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、またはＮ．ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓなどのノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、またはＬ．ｌａｃｔａｍｇｅｎｕｓなどのＬｙｓｏｂａｃｔｅｒ属の細菌である。
【００１３】
微生物におけるＯ−カルバモイル化セフ−３−エム化合物セファマイシンＣの生合成は、図１に示すスキームに従って行われると考えられる。セファロスポリンＣの合成は、図２のスキームで示される。
【００１４】
好ましくは、このような遺伝子操作生物を、得られたセフ−３−エム化合物で天然セフ−３−エム化合物の７位に存在するα−アミノ−アジピル側鎖が本発明による所望の側鎖に置き換えられる条件下で、培養する。この目的を達するために、この側鎖をもたらし得る組成物をｉｎ ｖｉｖｏ酵素的変換に供する。
【００１５】
適切には、このｉｎ ｖｉｖｏ酵素的変換を、
ｉ）３’−カルボキシメチルチオプロピオン酸またはその塩もしくはそのエステル、
ｉｉ）３，３’−チオジプロピオン酸またはその塩もしくはそのエステル、
ｉｉｉ）化合物ｐＹ−ＣＨ２−ＣＯＯＨまたはその塩もしくはそのエステル
（式中、Ｙはフェニル、フェノキシまたはテトラゾリルである）、
ｉｖ）一般式ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯＯＨの化合物またはその塩もしくはそのエステル
（式中、Ｘは（ＣＨ２）４と定義されるか、
あるいは式中、Ｘは（ＣＨ２）ｐ−Ａ−（ＣＨ２）ｑと定義され、
式中、ｐおよびｑはそれぞれ個別に０、１、２、３または４であり、ＡはＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、ＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、Ｓ、ＮＨであり、窒素は置換されてもよく、または硫黄は酸化されてもよく、Ｂは水素、ハロゲン、Ｃ１−３アルコキシ、ヒドロキシル、または置換されてもよいメチルであり、但し、ＡがＣＨ＝ＣＨまたはＣ≡Ｃであるとき、ｐ＋ｑは２または３であり、あるいはＡがＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、ＳまたはＮＨであるとき、ｐ＋ｑは３または４であり、
あるいは式中、Ｘは（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ＝Ａ−（ＣＨ２）ｎまたは（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎであり、
式中、ｍおよびｎはそれぞれ個別に０、１、２または３であり、ｍ＋ｎ＝２または３であり、ＡはＣＨまたはＮであり、
あるいは式中、Ｘは（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ−（ＣＨ２）ｑであり、
式中、ｐおよびｑはそれぞれ個別に０または１であり、ｐ＋ｑ＝０または１である）、
からなる群から選択される側鎖前駆物質により提供することができる。
【００１６】
製造のための遺伝子操作生物として、Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍを使用する場合、イソペニシリンＮアシルトランスフェラーゼをコードするｐｅｎＤＥ（Ａｌｖａｒｅｚ，Ｅ．、Ｂ．Ｍｅｅｓｓｃｈａｅｒｔ、Ｅ．Ｍｏｎｔｅｎｅｇｒｏ、Ｓ．Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ、Ｂ．Ｄｉｅｚ、Ｊ．Ｌ．Ｂａｒｒｅｄｏ、およびＪ．Ｆ．Ｍａｒｔｉｎ、１９９３年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１５、３２３〜３３２頁）、およびカルバモイルトランスフェラーゼをコードするｃｍｃＨ（Ｃｏｑｕｅ，Ｊ．Ｊ．Ｒ．、Ｆ．Ｊ．Ｐｅｒｅｚ−Ｌｌａｒｅｎａ、Ｆ．Ｊ．Ｅｎｇｕｉｔａ、Ｊ．Ｌ．Ｆｕｅｎｔｅ、Ｊ．Ｆ．Ｍａｒｔｉｎ、およびＰ．Ｌｉｒａｓ、１９９５年、Ｇｅｎｅ １６２、２１〜２７頁）を導入するべきである。さらに、少なくともＤＡＣアセチルトランスフェラーゼをコードするｃｅｆＧ遺伝子（Ｆｅｌｉｘ，Ｈ．Ｒ．、Ｊ．Ｎｅｕｓｃｈ、およびＷ．Ｗｅｈｒｌｉ、１９８０年、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．８、５５〜５８頁；Ｆｕｊｉｓａｗａ，Ｙ．、およびＴ．Ｋａｎｚａｋｉ、１９７５年、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３９、２０４３〜２０４８頁）および好ましくはＩＰＮエピメラーゼを共にコードするｃｅｆＤ１およびｃｅｆＤ２遺伝子（Ｕｌｌａｎ ＲＶ、Ｃａｓｑｕｅｉｒｏ Ｊ、Ｂａｎｕｅｌｏｓ Ｏ、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ＦＪ、Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ Ｓ、Ｍａｒｔｉｎ ＪＦ、２００２年、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７（４８）、４６２１６〜４６２２５頁）も、好ましくない副産物を避けるために不活性化するべきである。
【００１７】
製造のための遺伝子操作生物として、Ｎ．ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓまたはＳ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓを選択する場合、ｐｅｎＤＥの導入および発現が必要であり、好ましくはｃｅｆＤ遺伝子（Ｊａｙａｔｉｌａｋｅ，Ｓ．、Ｊ．Ａ．Ｈｕｄｄｌｅｓｔｏｎ、およびＥ．Ｐ．Ａｂｒａｈａｍ、１９８１年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９５、６４５〜６４７頁；Ｋｏｎｏｍｉ，Ｔ．、Ｓ．Ｈｅｒｃｈｅｎ、Ｊ．Ｅ．Ｂａｌｄｗｉｎ、Ｍ．Ｙｏｓｈｉｄａ、Ｎ．Ａ．Ｈｕｎｔ、およびＡ．Ｌ．Ｄｅｍａｉｎ、１９７９年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１８４、４２７〜４３０頁）およびＯＣＤＡＣヒドロキシラーゼをコードするｃｍｃＩ遺伝子（Ｘｉａｏ，Ｘ．、Ｇ．Ｈｉｎｔｅｒｍａｎｎ、Ａ．Ｈａｕｓｌｅｒ、Ｐ．Ｊ．Ｂａｒｋｅｒ、Ｆ．Ｆｏｏｒ、Ａ．Ｌ．Ｄｅｍａｉｎ、およびＪ．Ｐｉｒｅｔ、１９９３年、Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３７、８４〜８８頁）および場合によってメチルトランスフェラーゼまたはセファマイシンＣ合成酵素をコードするｃｍｃＪ遺伝子（Ｃｏｑｕｅ，Ｊ．Ｊ．Ｒ．、Ｆ．Ｊ．Ｐｅｒｅｚ−Ｌｉａｒｅｎａ、Ｆ．Ｊ．Ｅｎｇｕｉｔａ、Ｊ．Ｌ．Ｆｕｅｎｔｅ、Ｊ．Ｆ．Ｍａｒｔｉｎ、およびＰ．Ｌｉｒａｓ、１９９５年、Ｇｅｎｅ １６２、２１〜２７頁）をも、（後者の２つは、国際公開第ＷＯ９５／２９２５３号パンフレットに記載されるように、セファマイシン生合成を遅らせる酵素）、好ましくない副産物を避けるために、不活性化してもよい。
【００１８】
宿主としてＬ．ｌａｃｔａｍｇｅｎｕｓを選択する場合、少なくともｐｅｎＤＥおよびｃｍｃＨを導入するべきであり、好ましくはｃｅｆＤを不活性化するべきである。
【００１９】
本発明の化合物の製造のための遺伝子改変を備えるために、当技術分野で知られる方法で、生物に遺伝子の挿入および不活性化を行うことができる。挿入のためにゲノムＤＮＡ配列または所望に応じてｃＤＮＡを使用することができる。
【００２０】
本発明の化合物の発酵製造に好ましい微生物は、遺伝子操作により本発明の化合物製造に適する酵素をコードするＤＮＡ断片を備えており、また、Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの場合に適当な遺伝子が不活性化されている、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍおよびＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍである。
【００２１】
さらに好ましくは、本発明による化合物の発酵製造を、適切な方法で遺伝子操作を受けたＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍで行う。
【００２２】
このために、イソペニシリンＮを生成する能力のあるＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株は、以下のＤＮＡ断片セットを備えている：
１）エクスパンダーゼ（ｅｘｐａｎｄａｓｅ）酵素をコードするＤＮＡ
２）ヒドロキシラーゼ（ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）酵素をコードするＤＮＡ
３）Ｏ−カルバモイルトランスフェラーゼ（Ｏ−ｃａｒｂａｍｏｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）酵素をコードするＤＮＡ。
【００２３】
あるいは、二元機能のエクスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ酵素をコードするＤＮＡを、エクスパンダーゼ酵素およびヒドロキシラーゼ酵素を別々にコードするＤＮＡの代わりに導入してもよい。
【００２４】
好ましい実施形態では、本発明は式（Ｉ）の化合物
【化３】
またはその塩もしくはそのエステルの発酵製造方法に関し、
（式中、Ｒは、
ａ）ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯ−
（式中、Ｘは（ＣＨ２）４と定義されるか、
あるいは式中、Ｘは（ＣＨ２）ｐ−Ａ−（ＣＨ２）ｑと定義され、
式中、ｐおよびｑはそれぞれ個別に０、１、２、３または４であり、ＡはＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、ＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、Ｓ、ＮＨであり、窒素は置換されてもよく、または硫黄は酸化されてもよく、Ｂは水素、ハロゲン、Ｃ１−３アルコキシ、ヒドロキシル、または置換されてもよいメチルであり、但し、ＡがＣＨ＝ＣＨまたはＣ≡Ｃのとき、ｐ＋ｑは２または３であり、またはＡがＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、ＳまたはＮＨのとき、ｐ＋ｑは３または４であり、
あるいは式中、Ｘは（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ＝Ａ−（ＣＨ２）ｎまたは（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎであり、
式中、ｍおよびｎはそれぞれ個別に０、１、２または３であり、ｍ＋ｎ＝２または３であり、ＡはＣＨまたはＮであり、
あるいは式中、Ｘは（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ−（ＣＨ２）ｑであり、
式中、ｐおよびｑはそれぞれ個別に０または１であり、ｐ＋ｑ＝０またはである）、あるいは、
ｂ）（カルボキシメチルチオ）プロピオニル、
ｃ）（カルボキシエチルチオ）プロピオニル
ｄ）Ｙ−ＣＨ２−ＣＯ−
（式中、Ｙはフェニル、フェノキシまたはテトラゾリルである。）
からなる群から選択され、かつ、
式中、Ｒ’は、
ｅ）ＯＨ
ｆ）アルキルが直鎖または分枝鎖であり得るＯ−（アルキル１〜６Ｃ）および
ｇ）アルキル基が直鎖または分枝鎖であり得るＯ−Ｃ（アルキル１〜６Ｃ）−Ｏ−（アルキル１〜６Ｃ）
からなる群から選択される）
Ａ）イソペニシリンＮを産生するＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株を、その生育を維持することが可能な培地で維持し、
ｉ）３’−カルボキシメチルチオプロピオン酸またはその塩もしくはそのエステル、
ｉｉ）３，３’−チオジプロピオン酸またはその塩もしくはそのエステル、
ｉｉｉ）化合物ｐＹ−ＣＨ２−ＣＯＯＨまたはその塩もしくはそのエステル
（式中、Ｙはフェニル、フェノキシまたはテトラゾリルである）、
ｉｖ）一般式ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯＯＨの化合物またはその塩もしくはそのエステル
（式中、Ｘは（ＣＨ２）４と定義されるか、
あるいは式中、Ｘは（ＣＨ２）ｐ−Ａ−（ＣＨ２）ｑと定義され、
式中、ｐおよびｑはそれぞれ個別に０、１、２、３または４であり、ＡはＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、ＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、Ｓ、ＮＨであり、窒素は置換されてもよく、または硫黄は酸化されてもよく、Ｂは水素、ハロゲン、Ｃ１−３アルコキシ、ヒドロキシル、または置換されてもよいメチルであり、但し、ＡがＣＨ＝ＣＨまたはＣ≡Ｃのとき、ｐ＋ｑは２または３であり、またはＡがＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、ＳまたはＮＨのとき、ｐ＋ｑは３または４であり、
あるいは式中、Ｘは（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ＝Ａ−（ＣＨ２）ｎまたは（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎであり、
式中、ｍおよびｎはそれぞれ個別に０、１、２または３であり、ｍ＋ｎ＝２または３であり、ＡはＣＨまたはＮであり、
あるいは式中、Ｘは（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ−（ＣＨ２）ｑであり、
式中、ｐおよびｑはそれぞれ個別に０または１であり、ｐ＋ｑ＝０または１である）
からなる群から選択される、前記Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株により同化および利用されて適切なアシル−６−アミノペニシラン酸（アシル−６−ＡＰＡ）を生成し、それによりアシル−６−ＡＰＡを生成することが可能である任意の１つまたは複数の側鎖前駆物質を含むフィードストック（ｆｅｅｄｓｔｏｃｋ）を前記培地に添加するステップと、
Ｂ）対応する遺伝子のｉｎ ｓｉｔｕ発現により以下の酵素的変換を行うステップであって、
ｉ）アシル−６−ＡＰＡを、エクスパンダーゼ酵素によりｉｎ ｓｉｔｕで環拡大して、対応するアシル−７−アミノ−デスアセトキシセファロスポラン酸（アシル−７−ＡＤＣＡ）を生成し、ここで、アシル−６−ＡＰＡを基質として受容することができるエクパンダーゼ酵素をコードするＤＮＡにより、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株を形質転換し、その発現の結果、菌株で産生した前記アシル−６−ＡＰＡもその後ｉｎ ｓｉｔｕで環拡大して、対応するアシル−７−ＡＤＣＡを生成する、
ｉｉ）アシル−７−ＡＤＣＡの３−メチル側鎖を、ヒドロキシラーゼ酵素によりｉｎ ｓｉｔｕで水酸化して、対応するアシル−７−ＡＤＡＣを生成し、ここで、アシル−７−ＡＤＣＡを基質として受容することができるヒドロキシラーゼ酵素をコードするＤＮＡにより、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株を形質転換し、その発現の結果、菌株で産生したアシル−７−ＡＤＣＡもｉｎ ｓｉｔｕで水酸化されて、対応するアシル−７−ＡＤＡＣを生成し、
ｉｉｉ）アシル−７−ＡＤＡＣの３−ヒドロキシメチル側鎖を、Ｏ−カルバモイルトランスフェラーゼ酵素によりｉｎ ｓｉｔｕでＯ−カルバモイル化し、式（Ｉ）の化合物を生成し、ここで、アシル−７−ＡＤＡＣを基質として受容することができるＯ−カルバモイルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡにより、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株を形質転換し、その発現の結果、菌株で産生したアシル−７−ＡＤＡＣもｉｎ ｓｉｔｕでカルバモイル化されて、本発明の化合物を生成するステップとを含む。
【００２５】
本発明による使用のために、エクスパンダーゼ酵素、ヒドロキシラーゼ酵素またはＯ−カルバモイルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを、このＤＮＡを含むと報告され、かつ菌株保存機関から入手することができる微生物から得ることができ、または適当な自然源から単離された微生物から得る可能性がある。
【００２６】
エクスパンダーゼ酵素を含むと報告される微生物の例は、Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ（ｃｅｆＥＦ）、Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ（ｃｅｆＥ）、Ｎ．ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ（ｃｅｆＥ）、Ｌ．ｌａｃｔａｍｇｅｎｕｓ（ｃｅｆＥ）である。
【００２７】
ヒドロキシラーゼ酵素を含むと報告される微生物の例は、Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ（ｃｅｆＥＦ）、Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ（ｃｅｆＥ）、Ｎ．ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ（ｃｅｆＥ）、Ｌ．ｌａｃｔａｍｇｅｎｕｓ（ｃｅｆＥ）である。
【００２８】
Ｏ−カルバモイルトランスフェラーゼ酵素を含むと報告される微生物の例は、放線菌目由来の種であり、とりわけストレプトマイセス属由来の種である。米国特許第４０７５０６１号明細書（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４０７５０６１）の開示に基づき、所望のＯ−トランスカルバモイラーゼ活性をコードするＤＮＡを与えるために使用する可能性のある、特に適切な種には、英国特許第１３１５１７７号明細書（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．１３１５１７７）に記載されるＮＲＲＬ３５８５株などのＳ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ、オランダ特許出願第７３０８９４８号明細書（Ｄｕｔｃｈ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．７３０９４８）に記載されるＡＴＣＣ２１９４８株などのＳ．ｗａｄａｙａｍｅｎｓｉｓ、米国特許第３９１４１５８号明細書（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．３９１４１５８）に記載されるＮＲＲＬ５７３５などのＳ．ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ、英国特許第１３２１４１２号明細書（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．１３２１４１２）に記載されるＮＲＲＬ３８０２株などのＳ．ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ、および英国特許第１３８７９６５号明細書（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．１３８７９６５）に記載されるＮＲＲＬ５７４１株などのＳ．ｊｕｍｏｎｊｉｎｅｎｓｉｓなどがある。
【００２９】
特許公報国際公開第９５／２９２５３号パンフレットの開示によれば、ＤＮＡをコードする所望のＯ−カルバモイルトランスフェラーゼのさらなる適切な生物源は、Ｎ．ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ、Ｓ．ｌｉｐｍａｎｉｌ、Ｓ．ｐａｎａｙｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｃａｔｔｌｅｙａ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓ．ｔｏｄｏｒｏｍｉｎｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｆｉｌｉｐｉｎｅｎｓｉｓ ｃｅｐｈａｍｉｃｉｎｉおよびＳ．ｈｅｔｅｒｏｍｏｒｐｈｕｓである可能性がある。
【００３０】
一般に、宿主細胞、例えばＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍまたは他の真菌の形質転換は、ＰＥＧ／Ｃａ媒介のプロトプラスト法、エレクトロポレーション法またはパーティクルガン（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｇｕｎ）法のような様々な手段のＤＮＡの導入、および形質転換細胞の選択により行うことができる。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｆｕｎｇｉ（Ｐｅｂｅｒｄｙ、Ｌａｔｅｎ、Ｏｇｄｅｎ、Ｂｅｎｎｅｔｔ編）、ケンブリッジ大学出版局（１９９１年）のＶａｎ ｄｅｎ ＨｏｎｄｅｌとＰｕｎｔの「Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ｆｕｎｇｉ」を参照されたい。優性および非優性の選択マーカーのアプリケーションについて記載されている（上記のＶａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌら）。同種生物源（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来）および異種生物源（非Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来）の両方の選択マーカーについて記載されている（Ｇｏｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０（１９９１年）、１８９〜２００頁）。
【００３１】
形質転換細胞の選択において、ベクター配列の存在下または非存在下で、選択不能のＤＮＡに物理的に連結しているかまたは連結していない、様々な同種または異種形質転換細胞選択マーカーのアプリケーションがよく知られている。
【００３２】
例えばＷｉｓｃｏｎｓｉｎ５４−１２５５株（ＡＴＣＣにおいて登録番号２８０８９で寄託されている）のＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍにおいて、エクスパンダーゼ活性、ヒドロキシラーゼ活性およびＯ−カルバモイルトランスフェラーゼ活性をコードするＤＮＡ配列をこのような方法で導入し、発現させる。β―ラクタム産生を改良させた、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ５４−１２５５株の変異体を含む他のＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株も適する。このような高産生菌株の例は、ＣＢＳ４５５．９５株、ＰａｎｌａｂｓＰ２およびＡＳＰ−７８（Ｂａｒｒｅｄｏ ＪＬ、Ａｌｖａｒｅｚ Ｅ、Ｃａｎｔｏｒａｌ ＪＭ、Ｄｉｅｚ Ｂ、Ｍａｒｔｉｎ ＪＦ、１９８８年、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ３２（７）、１０６１〜１０６７頁）である。
【００３３】
さらに、ｃｅｆＥおよびｃｅｆＦまたはｃｅｆＥＦと共にｃｍｃＨ遺伝子を、異種または同種制御エレメントの転写制御下および翻訳制御下、好ましくは真菌遺伝子制御エレメントの制御下に置く。これらのエレメントを、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのＩＰＮＳまたはｐｃｂＣ遺伝子、β−チューブリン遺伝子、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓのｇｐｄＡ遺伝子、またはＡ．ｎｉｇｅｒのｇｌａＡ遺伝子などのクローン化真菌遺伝子から得ることができる。
【００３４】
完全な発酵製造の代替法として、１つまたは複数の発酵段階および１つまたは複数の生体内変換段階および／または１つまたは複数の化学的変換段階の組み合わせにより、本発明の化合物を調製することができる。
【００３５】
例えば、第１の段階で、ペニシリンＧまたはペニシリンＶなどの適切なペニシリン誘導体、またはアジポイル−７−ＡＤＣＡまたはアジポイル−７−ＡＤＡＣなどのセファロスポリン誘導体を発酵製造することができる。
【００３６】
適切なペニシリン誘導体について、対応する７−アシル−３−メチル−セフ−３−エム化合物に変換する前に、場合によって６−アシル基を交換させてもよい。順々に後者の化合物を、対応する７−アシル−３−ヒドロキシメチル−セフ−３−エムに変換し、最後に式（Ｉ）の化合物に変換することができる。
【００３７】
この変換のために、必要な酵素（ｐｅｎＤＥ、ｃｅｆＥ、ｃｅｆＦおよびｃｍｃＨ遺伝子あるいはｐｅｎＤＥ、ｃｅｆＥＦおよびｃｍｃＨ遺伝子がそれぞれコードする、アシルトランスフェラーゼ、エクスパンダーゼ、ヒドロキシラーゼおよびカルバモイルトランスフェラーゼ、あるいは代わりにアシルトランスフェラーゼ、エクスパンダーゼ・ヒドロキシラーゼおよびカルバモイルトランスフェラーゼ）を任意の適切な宿主で別々に製造することができる。好ましくは、当技術分野で知られる方法に従って、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）でこれを行う。酵素を精製し、必要であれば固定化し、あるいは全細胞の生体内変換または粗製の無細胞抽出液において、単回および連続反応容器、またはワンポット反応で利用し、式（Ｉ）の化合物を製造することができる。
【００３８】
この複数段階経路（例えば、ペニシリンＧ→アシル−６−ＡＰＡ→アシル−７−ＡＤＣＡ→アシル−７−ＡＤＡＣ→化合物（Ｉ））の１段階を、発酵的変換または化学的変換段階に変えることができる。例えば、ｃｅｆＥで形質転換したＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍで生成したアジポイル−７−ＡＤＣＡを（例えば、ＥＰ０５２３３４１で記載される方法により）使用する場合、第１の段階を省くことができ、あるいは、代わりに（例えば、ＥＰ０５４０２１０で記載される方法により）ｃｅｆＥおよびｃｅｆＦで形質転換したＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍで生成したアシル−７−ＡＤＡＣから開始することにより最初の２段階を省くことができる。代替方法として、当技術分野で知られる各段階の化学的変換を応用することができる。
【実施例】
【００３９】
（実施例１ エクスパンダーゼ、ヒドロキシラーゼおよび３’−ヒドロキメチルセフェムＯ−カルバモイルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子を用いたＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの形質転換）
本願では、遺伝子クローニング法に使用される一般的な手法を用いる。これらの手法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、合成オリゴヌクレオチドの合成、ＤＮＡのヌクレオチド配列分析、ＤＮＡの酵素的ライゲーションおよび制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベクターのサブクローニング、形質転換および形質転換細胞の選択、ＤＮＡの単離および精製、サザンブロット分析によるＤＮＡの特徴付けなどがある。これらの手法は全て、当技術分野で非常によく知られており、多くの参考文献に適切に記載されている。
【００４０】
Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ５４−１２５５（ＡＴＴＣ２８０８９）を用いて形質転換を行った。Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍに導入された全てのコンストラクトは、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのＩＰＮＳプロモーターおよびＡＴターミネーターの制御下にある。β−ラクタムの産生が改良されたＷｉｓｃｏｎｓｉｎ５４−１２５５株の変異体を含む、他のＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株も適する。このような菌株の例は、ＣＢＳ４５５．９５である。
【００４１】
形質転換に使用するプロトプラストの生成のために、ＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース）でＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの培養を行う。プロトプラスト処理および再生手順は、使用されるＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの個々の菌株および実施される形質転換細胞選択法次第で若干異なる可能性がある。
【００４２】
Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ ＡＴＣＣ２７０６４を、ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔh（Ｄｉｆｃｏ）で培養する。この菌株の染色体ＤＮＡをＰＣＲによるｃｅｆＥ遺伝子の単離に使用する。公表されているＳ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓのＣｅｆＥ配列（Ｋｏｖａｃｅｖｉｃ Ｓ、Ｗｅｉｇｅｌ ＢＪ、Ｔｏｂｉｎ ＭＢ、Ｉｎｇｏｌｉａ ＴＤ、Ｍｉｌｌｅｒ ＪＲ、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ（１９８９）１７１（２）、７５４〜７６０頁；Ｉｎｇｏｌｉａら、米国特許第５０７００２０号明細書）を用いて、５’正方向プライマー４３６３：５’−ＧＡＴ ＣＡＧ ＴＧＡ ＣＡＧ ＴＴＧ ＣＡＴ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＣＧ ＡＣＧ ＧＴＧ ＣＣＣ ＡＣＣ ＴＴＣ ＡＧＣ ＣＴＧ−３’（配列番号１）および３’逆方向プライマー４３６４：５’−ＣＣＣ ＧＧＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＴＡ ＴＧＣ ＣＴＴ ＧＧＡ ＴＧＴ ＧＣＧ ＧＣＧ ＧＡＴ ＧＴＴ−３’（配列番号２）を設計した。
【００４３】
得られたＰＣＲ産物をＮｄｅＩおよびＸｂａＩで切断し、この０．９ｋｂ断片を同様にＮｄｅＩおよびＸｂａＩで切断したｐＭｃＴＮｄｅＩ（断片：３．９ｋｂ）と連結しｐＭｃＴＳＥを得た。ｐＭＣＴＮｄｅＩはｐＭＣ−５の誘導体であり（Ｓｔａｎｓｓｅｎｓら、ＮＡＲ（１９８９）１７、４４４１頁）、リボソーム結合配列（ＲＢＳ）部位およびＮｄｅＩクローニング部位の前に、ｔａｃプロモーターをコードする断片を挿入することにより作成する（Ｅ．Ｐ．Ｐａｔ．Ｎｏ．０３５１０２９も参照されたい）。
【００４４】
最初に、エクスパンダーゼ遺伝子の前でＡＴプロモーターをクローニングした。Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの染色体ＤＮＡにおいて、プライマー４４８８：５’−ＡＧＡ ＡＣＧ ＧＡＴ ＴＡＧ ＴＴＡ ＧＴＣ ＴＧＡ ＡＴＴ ＣＡＡ ＣＡＡ ＧＡＡ ＣＧＧ ＣＣＡ ＧＡＣ−３’（配列番号３）および４４８９：５’−ＧＡＣ ＡＧＡ ＧＧＡ ＴＧＴ ＧＡＡ ＧＣＡ ＴＡＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＧＧ ＧＴＣ ＧＧＡ ＡＧＡ ＴＧＧ−３’（配列番号４）を用いて、ＰＣＲによりＡＴプロモーターを得た。これらのオリゴは、Ｂａｒｒｅｄｏら（１９８９年）のＧｅｎｅ ８３、５７２〜５７６頁、およびＤｉｅｚらのＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９年）２１８、５７２〜５７６頁で公表されている、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのｐｅｎＤＥ遺伝子配列に基づく。この産物をＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩで消化し、１．５ｋｂ断片を得た。この断片を、３．０ｋｂのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片およびＳ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓのエクスパンダーゼ遺伝子を含む０．９ｋｂのｐＭｃＴＳＥ ＮｄｅＩ−ＸｂａＩ断片と連結した。これにより、ＡＴプロモーターの後ろにエクスパンダーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＡＳＥが生じる。
【００４５】
ｐＡＳＥプラスミドにおいて、エクスパンダーゼ遺伝子の後ろで（ＡＴをコードする）ｐｅｎＤＥターミネーターをクローニングした。従って、５’正方向プライマー４５７９：５’−ＴＴＣ ＧＡＴ ＧＴＣ ＡＧＣ ＣＴＧ ＧＡＣ ＧＧＣ ＧＡＧ ＡＣＣ ＧＣＣ ＡＣＧ ＴＴＣ ＣＡＧ ＧＡＴ ＴＧＧ ＡＴＣ ＧＧＧ ＧＧＣ ＡＡＣ ＴＡＣ ＧＴＧ ＡＡＣ ＡＴＣ ＣＧＣ ＣＧＣ ＡＣＡ ＴＣＣ ＡＡＧ ＧＣＡ ＴＧＡ ＡＧＧ ＣＴＣ ＴＴＣ ＡＴＧ ＡＣＧ−３’（配列番号６）および３’逆方向プライマー４５０７：５’−ＧＧＡ ＣＴＡ ＧＴＧ ＴＣＧ ＡＣＣ ＣＴＧ ＴＣＣ ＡＴＣ ＣＴＧ ＡＡＡ ＧＡＧ ＴＴＧ（配列番号５）を用いて、ＡＴターミネーターのＰＣＲに、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの染色体ＤＮＡを鋳型として使用した。この断片を、ＢｇｌＩ−ＳｐｅＩで消化し、この０．６ｋｂ産物を、ＳｐｅＩおよびＢｇｌＩで消化したプラスミドｐＡＳＥと連結し、ｐＡＳＥＷＡを生成した。
【００４６】
最後に、エクスパンダーゼ遺伝子を、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのＩＰＮＳプロモーターの後ろに入れた（ＩＰＮＳプロモーターがＡＴプロモーターに取って代わる）。Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの染色体ＤＮＡを鋳型として用いて、５’オリゴ４９２３：５’−ＣＧＡ ＧＧＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＴＴ ＡＴＡ ＣＴＧ ＧＧＣ ＴＧ ＣＴＧ ＣＡＴ ＴＧＧ ＴＣＴ Ｇ（配列番号７）（Ｄｉｅｚ，Ｂ．、Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ，Ｓ．、Ｂａｒｒｅｄｏ，Ｊ．Ｌ．、ｖａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎ，Ｐ．、ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｏｏｒｔ，Ｌ．Ｈ．とＭａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｆ．（１９９０年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（２７）、１６３５８〜１６３６５頁で公表される配列を使用）および３’オリゴ４９２４：５’−ＣＣＣ ＧＧＧ ＣＡＴ ＡＴＧ ＣＡＴ ＡＴＧ ＧＧＴ ＧＴＣ ＴＡＧ ＡＡＡ ＡＡＴ ＡＡＴ ＧＧＴ ＧＡＡ ＡＡＣ（配列番号８）（Ｃａｒｒ ＬＧ、Ｓｋａｔｒｕｄ ＰＬ、Ｓｃｈｅｅｔｚ ＭＥ ２ｎｄ、Ｑｕｅｅｎｅｒ ＳＷ、Ｉｎｇｏｌｉａ ＴＤ．（１９８６年）、Ｇｅｎｅ ４８（２−３）、２５７〜２６６頁で公表される配列を使用）で、ＩＰＮＳプロモーターを増幅した。ｐＡＳＥＷＡをＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩで消化し、エクスパンダーゼ遺伝子を有する４．６ｋｂ断片を生成し、ＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩで消化した０．９ｋｂのＩＰＮＳプロモーターＰＣＲ産物とＡＴターミネーターを連結した。これによりｐＩＳＥＷＡが生じる。ＩＰＮＳプロモーターおよびＡＴターミネーターを有するｃｅｆＥ遺伝子を、ＮｏｔＩ消化によりｐＩＳＥＷＡｎから得た（図３）。
【００４７】
ヒドロキシラーゼ遺伝子（ｃｅｆＦ）をＳ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ（ＡＴＣＣ２７０６４）から単離した。この菌株の染色体ＤＮＡを、ＰＣＲによるｃｅｆＦ遺伝子の単離に用い、その遺伝子の上流にＮｄｅＩ部位、下流にＮｓｉＩ部位を導入した。このコンストラクトをＩＰＮＳプロモーターの後とＡＴターミネーターの前に連結し、ｐＩＳＦＷＡを生成した。Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの形質転換のために、ＮｏｔＩによる切断後に、ｃｅｆＦ遺伝子とＩＰＮＳプロモーターおよびＡＴターミネーターを含むコンストラクトをｐＩＳＦＷＡから単離した（図４）。
【００４８】
ＰＣＲにより、Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ（＝Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）のエクスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ遺伝子（ｃｅｆＥＦ）を染色体ＤＮＡから得た。設計された正方向オリゴはＮｄｅＩ部位を導入し、逆方向オリゴはＮｓｉＩ部位を導入した。ＮｄｅＩおよびＮｓｉＩによる消化後に、この遺伝子をペニシリウム発現ベクターに入れることができ、ｐＩＣＥＦＷＡを生成した（図５）。ペニシリウムの形質転換のために、ＩＰＮＳプロモーターおよびＡＴターミネーターを用いて、ＮｏｔＩ消化により、Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来ｃｅｆＥＦをｐＩＣＥＦＷＡから単離した。
【００４９】
正方向プライマー：ＡＢ１２５８６（５’−ＡＣＡ ＧＡＣ ＣＡＴ ＡＴＧ ＣＴＣ ＧＴＣ ＧＴＴ ＧＣＡ ＴＴＣ ＡＡＧ−３’（配列番号９））および逆方向プライマー：５’−ＡＢ１２５８７（ＧＡＣ ＧＧＣ ＡＴＧ ＣＡＴ ＴＣＡ ＧＧＡ ＡＣＣ ＧＧＣ ＴＡＴ ＴＣＧ Ｃ−３’（配列番号１０））を用いて、染色体ＤＮＡのＰＣＲにより、ｃｍｃＨ遺伝子をＳ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓから得て、ＮｄｅＩ、ＮｓｉＩで切断し、ｐＩＳＥＷＡＮのＮｄｅＩ、ＮｓｉＩ断片に連結する（エクスパンダーゼ遺伝子をｃｍｃＨ遺伝子に置換する）ことにより、ｐＩＳｃＣＴＷＡが生じた（図６）。ＮｏｔＩ消化により、ＩＰＮＳプロモーターおよびＡＴターミネーターを含むｃｍｃＨ遺伝子をｐＩＳｃＣＴＷＡから単離した。
【００５０】
ＨｉｎｄＩＩＩによる消化により、ＨｅｌＹに隣接するＡｍｄＳ断片をｐＨＥＬＹ−Ａ１から単離した（図７）。
【００５１】
ａｍｄＳ選択マーカーを用いた同時形質転換により、ｃｅｆＥＦコンストラクトまたはｃｅｆＥおよびｃｅｆＦコンストラクトを有するｃｍｃＨを、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＡＴＣＣ２８０８９に導入した。ａｍｄＳマーカーの組込みにより、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ形質転換体は、唯一の窒素源としてアセトアミドを含む選択培地で生育することが可能となる。
【００５２】
Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのプロトプラストへのＤＮＡの移入に関する手法は、当技術分野でよく知られており、ＦｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎとＢａｌｌ（編）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ，ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ（１９９２年）；ＢｅｎｎｅｔｔとＬａｓｕｒｅ（編）、Ｍｏｒｅ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｆｕｎｇｉ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９１年）；Ｔｕｒｎｅｒ（Ｐｕｈｌｅｒ）（編）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｅｃｏｎｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｒｅｖｉｓｅｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、ＶＨＣ（１９９２年）などの多くの参考文献に記載されている。Ｃａ−ＰＥＧ媒介プロトプラスト形質転換は、ＥＰ６３５５７４に記載される通りに使用する。
【００５３】
（実施例２ アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸の発酵製造）
実施例１で得られたＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ形質転換体を、米国特許第２００２００３９７５８号明細書のペニシリンＶ産生試験で記載される通り、培地上に２×１０６分生子／ｍｌで接種したが、フェノキシ酢酸カリウムの代わりに、側鎖前駆物質としてアジピン酸ナトリウム０．５〜１０ｍｇ／ｍｌを補った（滅菌前のｐＨは５．５〜６．０）。２５℃、毎分２８０回転で１４４〜１６９時間培養した。
【００５４】
十分に培養した培養液のろ液を、アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸の生成についてＨＰＬＣおよびＮＭＲで分析した。ＮＭＲスペクトルは、所望の化合物に特徴的なピークを示す（図９参照）。
【００５５】
（実施例３ アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸の化学合成）
（フェニルアセチル−７−アミノ−３−ヒドロキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸−ベンズヒドリルエステル（式（ＩＶ））の調製）
【化４】
【００５６】
撹拌した７−アミノ−セファロスポラン酸（５ｇ、１８．３ｍｍｏｌ）水溶液（２０ｍｌ）に、０℃で２０％ＮａＯＨ溶液８．５ｍｌを滴下した。５分間撹拌した後、酢酸でｐＨを８．５に調整し、その溶液をアセトン（２０ｍｌ）で希釈した。その後、ＮａＯＨ水溶液の添加によりｐＨを７．５と８．５の間に保持しながら、塩化フェニルアセチル（２．９ｍｌ、２２ｍｍｏｌ）アセトン溶液（３ｍｌ）を滴下し、この溶液を０℃で１時間撹拌した。その後、アセトンを減圧除去し、酢酸エチル（７０ｍｌ）を添加して、水相を希塩酸でｐＨ３まで酸化した。有機相を分離し、さらなる酢酸エチルで水相を再抽出した。有機相を合わせてブライン（ＭｇＳＯ４）で洗浄し、ろ過した。その後、この溶液に、撹拌しながらジフェニルジアゾメタン（５ｇ、２５．８ｍｍｏｌ）酢酸エチル溶液（５ｍｌ）を添加した。この溶液を約４０ｍｌまで減圧濃縮し、４℃で一晩静置した。その結果生じた沈殿物をろ過により集め、酢酸エチルで洗浄し、白色粉末の生成物（３．８３ｇ、４０％）を得た。δＨ（（ＣＤ３）２ＳＯ、３００ＭＨｚ）３．５４ ＆ ３．６３（２Ｈ、ＡＢｑ、Ｊ １３．９、ＰｈＣＨ２）、３．６５（２Ｈ、ｓ、ＳＣＨ２）、４．２５（２Ｈ、ｓ、ＣＨ２ＯＨ）、５．１５（１Ｈ、ｄ、Ｊ ４．７、ＣＨＣＨＳ）、５．７６（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ ４．７、８．２、ＮＨＣＨ）、６．９４（１Ｈ、ｓ、ＣＨＰｈ２）７．２〜７．６（１５Ｈ、ｍ、Ｐｈ２ＣＨ、ＰｈＣＨ２）、９．１７（１Ｈ、ｄ、Ｊ ８．２、ＮＨＣＨ）。Ｍ／ｚ（ＥＳ＋）５３７（Ｍ＋Ｎａ、１００％）。
【００５７】
（トリクロロアセチル−フェニルアセチル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸−ベンズヒドリルエステル（式（Ｖ））の調製）
【化５】
【００５８】
イソシアン酸トリクロロアセチル（０．２３ｍｌ、１．９ｍｍｏｌ）を撹拌した式（ＩＶ）（６００ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）のアセトン溶液（２０ｍｌ）に添加した。２時間の撹拌後に白色の沈殿物をろ過により集め、アセトンで洗浄し、乾燥した（８１１ｍｇ、９９％）。δＨ（（ＣＤ３）２ＳＯ、３００ＭＨｚ）３．５４ ＆ ３．６２（２Ｈ、ＡＢｑ、Ｊ １３．９、ＰｈＣＨ２）、３．６６ ＆ ３．７６（２Ｈ、ＡＢｑ、Ｊ １８．５、ＳＣＨ２）、４．９０ ＆ ５．０２（２Ｈ、ＡＢｑ、Ｊ １２．８、ＣＨ２Ｏ）、５．２０（１Ｈ、ｄ、Ｊ ４．８、ＣＨＣＨＳ）、５．８２（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ ４．８、８．１、ＮＨＣＨＣＨ）、６．９６（１Ｈ、ｓ、ＣＨＰｈ２）、７．２〜７．６（１５Ｈ、ｍ、ＣＨＰｈ２、ＰｈＣＨ２）、９．１７（１Ｈ、ｄ、Ｊ ８．１、ＮＨＣＨ）、１２．０（１Ｈ、ｓ、ＣＯＮＨＣＯ）。Ｍ／ｚ（ＥＳ−）７０２（Ｍ−１、１００％）。
【００５９】
（トリクロロアセチル−ＧＯフェニルアセチル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸ＲＣＯ（式（ＶＩ））の調製）
【化６】
【００６０】
式（Ｖ）（５．１５ｇ、７．３３ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（３５ｍｌ）とアニソール（４ｍｌ）の冷却（０℃）混合液に溶解させた。２時間の撹拌後、この溶液を減圧濃縮し、オイルを得て石油エーテル（４０〜６０℃画分）を用いて粉砕し、酢酸エチル（３０ｍｌ）に溶解させ、炭で脱色化した。ろ過後、この溶液を減圧濃縮し、さらに精製することなく次の段階で使用する黄色のオイルを得た。δＨ（（ＣＤ３）２ＳＯ、３００ＭＨｚ）３．５０〜３．７５（４Ｈ、ｍ、ＰｈＣＨ２、ＳＣＨ２）、４．９４（１Ｈ、一部ＡＢｑ、Ｊ １２．５、ＣＨ２Ｏ）、５．１４（２Ｈ、ｍ、一部ＡＢｑ ＣＨ２Ｏ、ＣＨＣＨＳ）、５．７２（１Ｈ、ｍ、ＮＨＣＨＣＨ）、７．０〜７．４（５Ｈ、ｍ、ＰｈＣＨ２）、９．１２（１Ｈ、ｄ、Ｊ ８．２、ＮＨＣＨ）、１１．９５（１Ｈ、ｓ、ＣＯＮＨＣＯ）。Ｍ／ｚ（ＥＳ−）５３６（Ｍ−１、６７％）。
【００６１】
（フェニルアセチル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸（式（ＶＩＩ））の調製）
【化７】
【００６２】
１０％ＮａＨＣＯ３溶液を添加して、ｐＨが約９に達するまで、前段階で得た黄色のオイルを注意深く溶解させた後、この溶液を一晩撹拌した。その後、希塩酸を用いて、沈殿が発生する２までｐＨを下げた。沈殿をろ過により取り除き、エーテルで洗浄し、淡黄色の固体（２段階越しで１．８１ｇ、６３．３％）を得た。δＨ（（ＣＤ３）２ＳＯ、３００ＭＨｚ）３．４〜３．６５（ピークがＨ２Ｏのピークでマスク）、４．６３ ＆ ４．９１（２Ｈ、ＡＢｑ、Ｊ １２．８、ＣＨ２Ｏ）、５．１０（１Ｈ、ｄ、Ｊ ４．５、ＣＨＣＨＳ）、５．６８（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ ４．５、８．２、ＮＨＣＨＣＨ）、７．２８（５Ｈ、ｍ、ＰｈＣＨ２）、９．１１（１Ｈ、ｄ、Ｊ ８．２、ＮＨＣＨ）。δＨ（（ＣＤ３）２ＳＯ＋Ｄ２Ｏ、３００ＭＨｚ）３．５２（４Ｈ、ｍ、ＰｈＣＨ２、ＳＣＨ２）、４．６３ ＆ ４．８８（２Ｈ、ＡＢｑ、Ｊ １２．９、ＣＨ２Ｏ）、５．０５（１Ｈ、ｄ、Ｊ ４．８、ＣＨＣＨＳ）、５．６５（１Ｈ、ｄ、Ｊ ４．７、ＮＨＣＨＣＨ）、７．２８（５Ｈ、ｍ、ＰｈＣＨ２）。Ｍ／ｚ（ＥＳ−）３９０（Ｍ−１、２０％）。
【００６３】
（７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸（式（ＶＩＩＩ））の調製）
【化８】
【００６４】
式（ＶＩＩ）（７６０ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）をリン酸カリウムバッファー（２０ｍｌ、０．５Ｍ、ｐＨ７）中で撹拌し、ＮａＯＨ水溶液の添加によりｐＨをｐＨ７．８まで上昇させた。ペニシリンアミダーゼ・アクリルビーズ（グルコース安定化剤を取り除くための洗浄後の約３７５ｍｇ）を添加し、その結果生じた懸濁液を２．５時間撹拌した。その後、このビーズをろ過により取り除き、希塩酸の添加により溶液のｐＨを３まで下げた。この溶液を４℃で一晩冷却後、ろ過して淡黄色の粉末の生成物を得た（３３４ｍｇ、６３％）δＨ（（ＣＤ３）２ＳＯ＋Ｄ２Ｏ、３００ＭＨｚ）３．３６ ＆ ３．５３（２Ｈ、ＡＢｑ、Ｊ １８．１、ＳＣＨ２）、４．６０ ＆ ４．８２（２Ｈ、ＡＢｑ、Ｊ １２．８、ＣＨ２Ｏ）、４．７４（１Ｈ、ｄ、Ｊ ４．９、ＣＨＣＨＳ）、４．９４（１Ｈ、ｄ、Ｊ ４．９、Ｈ２ＮＣＨＣＨ）。
【００６５】
（環状無水アジピン酸（式（ＩＸ））の調製）
【化９】
【００６６】
アジピン酸（５ｇ、３４ｍｍｏｌ）および無水酢酸の混合物（１５ｍｌ）を４時間加熱還流した。その後、この溶液を減圧濃縮し、その残渣を減圧蒸留し、無色のオイル（湿気に暴露されると重合化を起こす）を得た。δＨ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）２．０（４Ｈ、ｍ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）、２．７６（４Ｈ、ｔ、Ｊ ６．６、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）。
【００６７】
（アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸（式（Ｘ））の調製）
【化１０】
【００６８】
ＮａＯＨ水溶液を注意深く添加して、式（ＶＩＩＩ）（１００ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）のアセトン水溶液（１０ｍｌ、１：１ｖ／ｖ）をｐＨ８．５に調整した。０℃で、ＮａＯＨ水溶液の添加によりｐＨを７．５と８．５の間に保持しながら、この溶液に式（ＩＸ）（８０ｍｇ、０．６２５ｍｍｏｌ）のアセトン溶液（２ｍｌ）を滴下した。その結果生じた溶液を、０℃で２時間撹拌した後、アセトンを減圧除去し、ＨＣｌ水溶液の添加によりｐＨを２に調整した。この溶液をシクロヘキサノン（２×２０ｍｌ）で抽出し、集めた有機相を数ｍｌにまで濃縮した。濃縮したシクロヘキサノン溶液をシクロヘキサン（２００ｍｌ）に注ぎ、ろ過により集めた沈殿物を得た（６１ｍｇ、４１％）。δＨ（（ＣＤ３）２ＳＯ、３００ＭＨｚ）１．５０（４Ｈ、ｍ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）、２．２２（４Ｈ、ｍ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、３．４５ ＆ ３．５９（２Ｈ、ＡＢｑ、Ｊ １８．１、ＳＣＨ２）、４．６２ ＆ ４．９０（２Ｈ、ＡＢｑ、Ｊ １２．９、ＣＨ２Ｏ）、５．１０（１Ｈ、ｄ、Ｊ ４．８、ＣＨＣＨＳ）、５．６７（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ ４．８、８．２、ＮＨＣＨＣＨ）、８．８２（１Ｈ、ｄ、Ｊ ８．２、ＮＨＣＨ）。Ｍ／ｚ（ＥＳ−）８０１（２Ｍ−１、１７％）、４００（Ｍ−１、３５％）（図１０）。
【００６９】
実施例４ 生物変換を用いたアジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸のｉｎ ｖｉｔｒｏ製造
（無細胞抽出液の調製）
プラスミドｐＧＫ１０５（図１１）を用いて、ｌａｃプロモーターの制御下でＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓのｃｍｃＨ遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅで発現させた。ｃｍｃＨ遺伝子の発現のために、クロラムフェニコール含有ＬＢ培養培地５ｍｌにＸＬ１−Ｂｌｕｅ：ｐＧＫ１０５の単一コロニーを接種し、３７℃で１６時間、２５０ｒｐｍで振とう培養した。この培養液を用いて、クロラムフェニコールを補足した滅菌ＬＢ培地１００ｍｌを含むフラスコに１％接種した後、２７℃、２５０ｒｐｍで振とう培養し、ＯＤ６００が０．４〜０．６に達するまでよく通気させた。その後、ＩＰＴＧを、最終濃度の０．３ｍＭまで培養液に添加し、さらに１６時間培養を続けた。遠心分離（４０００ｇ、２０分、４℃）により細胞を集め、細胞ペレットを５ｍｌのバッファー（２０ｍＭ トリスＨＣｌ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７）に再懸濁し、−８０℃で１時間または−２０℃で一晩冷凍した。氷水浴で解凍した後、細胞懸濁液をソニケート（ＭＳＥ Ｓｏｎｉｐｒｅｐ１５０）した。１０秒の超音波処理と１０秒の冷却時間を１５〜２０サイクル行えば、完全に溶菌し、ブラッドフォード法で可溶性タンパク質の放出を測定するのに十分であった。細胞デブリ、つまり不溶性タンパク質および溶菌されない細胞を遠心分離（４０００ｇ、６０分、４℃）により沈殿化した。上清をクラブラン酸カリウム（５ｍｇｍｌ−１）で２７℃で１時間処理し、染色体にコードされるβ−ラクタマーゼを全て不活性化した。ＰＤ−１０脱塩カラムを用いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（登録商標）によるゲルろ過により過剰量のクラブラン酸塩を除去し、生じた酵素溶液を直ちに使用するか、または必要時まで−２０℃で貯蔵した。
【００７０】
（カルバモイルトランスフェラーゼアッセイ）
２８℃で４時間アッセイ（１００μｌ）を行い、ｐＨ６．７５〜７でアジポイル−デアセチルセファロスポラン酸（１〜５ｍＭ）、ＭｇＳＯ４（０．８ｍＭ）、ＭｎＣｌ２（１ｍＭ）、イミダゾール（１００ｍＭ）、ＡＴＰ（５．４ｍＭ）、リン酸カルバモイル（９．８ｍＭ）を含んだ。使用されたタンパク質量は１０μｇから２５０μｇの範囲であった。この酵素溶液を氷上で解凍し、加熱ブロックで２８℃にさせた反応混合液に添加した。氷冷メタノール（１００μｌ）を添加することにより、この反応を終了させ、混合した後、沈殿したタンパク質をペレット化した。１００℃で５分間の加熱処理により変性させた可溶性タンパク質をコントロール反応に使用し、常に通常のアッセイと一緒に試験した。
【００７１】
（ＨＰＬＣ／ＭＳ分析）
バッファーＡとして０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム、およびバッファーＢとして０．０５Ｍリン酸二水素ナトリウム／５０％アセトニトリルからなる移動相、１ｍｌ／ｍｉｎ−１の流速のＧｉｌｓｏｎＨＰＬＣシステムを用い、２５４ｎｍでモニターして、室温でＳｐｈｅｒｉｓｏｒｂ分析Ｃ１８カラム（２５０×４．６ｍｍ）上で反応成分を分離した。この条件を用いて、セファロスポリウムの出発物質および生成物の信頼のおける標準品におけるリテンションタイムは、それぞれ１９分および２２．５分であった。いくつかの分析ランの生成物ピークをためておき、ｐＨ１．８にまで酸性化し、シクロヘキサノンで抽出した。その後、二相抽出混合物のｐＨを７に調整し、途中で断続的に振とうしながら、有機相を水で逆抽出した。水相を凍結乾燥し、再び水に溶かし、エレクトロスプレー（陰イオンモード）イオン化ＭＳで分析し、カルバモイル化セファロスポリン生成物を特徴的な（Ｍ−Ｈ）−により特定した（図１２）。
【００７２】
（結論）
本実験により、生物変換を用いて、アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸の製造が可能であると結論することができる。
【００７３】
実施例５ アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸の細胞外搬出
実施例２に従って調製した試料を、ろ液のバイオマス分離によりさらに詳細に分析した。２５℃、毎分２８０回転で１６８時間培養後、この十分に培養した培養液のろ液を、ろ過によりバイオマスから分離し、ＮＭＲで分析した。このバイオマスを、氷冷生理食塩水（０．９ｍＭ ＮａＣｌ）で２度洗浄し、液体窒素中で冷凍し、凍結乾燥し、再び水に溶かしてＮＭＲで分析した。
【００７４】
アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸の他に、この菌株は、中間体、それぞれＩＰＮ、６ＡＰＡ、ａｄ６ＡＰＡ、ａｄ７ＡＤＣＡおよびａｄＡＨＣＡ（＝ａｄＡＤＡＣ）も生成する。しかし、アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸がもっぱら分泌される唯一のβ−ラクタムである。
【００７５】
これらの実験の結果を図１３（ＡおよびＢ）にまとめる。
【００７６】
実施例６ フェノキシアセトイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸の発酵製造
実施例１で得られたＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ形質転換体を、実施例２で記載した産生試験培地に接種したが、酢酸ナトリウムの代わりに、産生試験のための側鎖前駆物質としてフェノキシ酢酸５ｍｇ／ｍｌを補った（ろ過前のｐＨが６．０）。培養時間は、２５℃、毎分２８０回転で１６８時間であった。
【００７７】
十分に培養した培養液のろ液をバイオマスから分離し、ＮＭＲで分析した。このバイオマスを、氷冷生理食塩水（０．９ｍＭ ＮａＣｌ）で２度洗浄し、液体窒素中で冷凍し、凍結乾燥し、再び水に溶かしてＮＭＲで分析した。菌糸体画分でフェノキシアセトイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸を得た。
【００７８】
実施例７ トランスヒドロムコノイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸の発酵製造
実施例１で得られたＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ形質転換体を、実施例２で記載した産生試験培地に接種したが、酢酸ナトリウムの代わりに、産生試験のための側鎖前駆物質としてトランスヒドロムコン酸４ｍｇ／ｍｌを補った（ろ過前のｐＨが６．０）。培養時間は、２５℃、毎分２８０回転で１６８時間であった。
【００７９】
十分に培養した培養液のろ液をバイオマスから分離し、ＮＭＲで分析した。このバイオマスを、氷冷生理食塩水（０．９ｍＭ ＮａＣｌ）で２度洗浄し、液体窒素中で冷凍し、凍結乾燥し、再び水に溶かしてＮＭＲで分析した。菌糸体画分でトランスヒドロムコノイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸を得た。
【００８０】
実施例８ アミノアジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸の発酵製造
実施例１で得られたＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ形質転換体を、実施例２で記載した産生試験培地に接種したが、何も側鎖前駆物質を添加しなかった。培養時間は、２５℃、毎分２８０回転で１６８時間であった。
【００８１】
十分に培養した培養液のろ液をバイオマスから分離し、ＮＭＲで分析した。このバイオマスを、氷冷生理食塩水（０．９ｍＭ ＮａＣｌ）で２度洗浄し、液体窒素中で冷凍し、凍結乾燥し、再び水に溶かしてＮＭＲで分析した。両画分でアミノアジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸を得た。
【００８２】
実施例９ アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸の生物活性
実施例３に従って調製したアジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸を用いて、様々な細菌に対するその活性を評価した。使用した細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＥＳＳ（ｘｘｘｒｅｆ ｋｏｍｔ ｎｏｇｘｘ）、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ ＤＳＭ３４８（Ａｎｄｒａｔｅ，Ａ．Ｃ．、Ｖａｎ Ｎｉｓｔｅｉｒｏｏｙ，Ｊ．Ｇ．Ｍ．、Ｐｅｅｒｙ，Ｒ．Ｂ．、Ｓｋａｔｒｕｄ，Ｐ．Ｌ．、Ｄｅ Ｗａａｒｄ，Ｍ．Ａ．、２０００年、Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＡＢＣ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｉｎ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ６６３３（ｘｘｘｒｅｆ ｋｏｍｔ ｎｏｇｘｘ）であった。２×ＴＹ液体培地（ｘｘｘｒｅｆ ｋｏｍｔ ｎｏｇｘｘ）中で、細菌を３７℃、毎分２８０回転で一晩培養し、その後、新鮮培地で１０００倍に希釈した。この希釈細菌培養液１ｍｌを、２ｍｌ深底ウェルｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒプレートに接種し、様々な濃度のアジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸（アジポイル−ＡＣＣＡまたはＡｄ−ＡＣＣＡ）を個々のウェルに添加した。コントロールとして、数種の他の活性β−ラクタムおよび活性の低いβ−ラクタム、つまり６−ＡＰＡ、アジポイル−６−ＡＰＡ、７−ＡＤＣＡ、アジポイル−７−ＡＤＣＡ、７−ＡＣＡ、セファロスポリンＣおよびセフロキシムを用いた。このｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒプレートを、２５℃、毎分５５０回転で２日間培養した。
【００８３】
アジポイル−７−ＡＤＣＡ、アジポイル−ＡＣＣＡおよびセフロキシムによる増殖阻害結果を図１４（枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、図１５（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））および図１６（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）にまとめる。
【００８４】
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ６６３３、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＳＳおよびＭ．ｌｕｔｅｕｓ ＤＳＭ３４８に対するアジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸の最小阻害濃度は、それぞれ４μＭ、７μＭおよび７μＭであった。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓにおけるセファマイシンＣの発酵製造の略図である。
【図２】Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍにおけるセファロスポリンＣの発酵製造の略図である。
【図３】ｃｅｆＥ遺伝子のクローニングおよびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ５４−１２２５の形質転換に使用するプラスミドを示す図である。
【図４】ｃｅｆＦ遺伝子のクローニングおよびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ５４−１２２５の形質転換に使用するプラスミドを示す図である。
【図５】ｃｅｆＥＦ遺伝子のクローニングおよびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ５４−１２２５の形質転換に使用するプラスミドを示す図である。
【図６】ｃｍｃＨ遺伝子のクローニングおよびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ５４−１２２５の形質転換に使用するプラスミドを示す図である。
【図７】ａｍｄＳ遺伝子のクローニングおよびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ５４−１２２５の形質転換に使用するプラスミドを示す図である。
【図８】本発明の発酵方法の略図である。
【図９】アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸のＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１０】実施例３に従って調製された、アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸のＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１１】プラスミドｐＧＫ１０５を示す図である。
【図１２】アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸を生じる、カルバモイルトランスフェラーゼによる生物変換産物のＨＰＬＣ／ＭＳ分析を示す図である。
【図１３】実施例２に従って形質転換したＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍにおけるアジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸および他のβ−ラクタムの細胞内（Ａ）および細胞外（Ｂ）分布を示す図である（ｍｍｏｌ）。
【図１４】アジポイル−７−ＡＤＣＡ、アジポイル−ＡＣＣＡおよびセフロキシムによる枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の増殖阻害を示す図である。
【図１５】アジポイル−７−ＡＤＣＡ、アジポイル−ＡＣＣＡおよびセフロキシムによる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の増殖阻害を示す図である。
【図１６】アジポイル−７−ＡＤＣＡ、アジポイル−ＡＣＣＡおよびセフロキシムによるＭ．ｌｕｔｅｕｓの増殖阻害を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）で特徴付けられるセフ−３−エム化合物、またはその塩若しくはそのエステル。
【化１】
〔式中、Ｒは、
ａ）ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯ−
ここで、
Ｘは（ＣＨ２）４と定義されるか、
あるいは
Ｘは（ＣＨ２）ｐ−Ａ−（ＣＨ２）ｑと定義され、
ｐおよびｑはそれぞれ個別に０、１、２、３または４であり、ＡはＣＨ＝ＣＨ、
Ｃ≡Ｃ、ＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、Ｓ、ＮＨであり、窒素は置換されてもよく、または
硫黄は酸化されてもよく、Ｂは水素、ハロゲン、Ｃ１−３アルコキシ、ヒドロキシ
ル、または置換されてもよいメチルであり、但し、
ＡがＣＨ＝ＣＨまたはＣ≡Ｃであるとき、ｐ＋ｑは２または３であり、あるいは
ＡがＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、ＳまたはＮＨであるとき、ｐ＋ｑは３または４であり、
あるいは
Ｘは（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ＝Ａ−（ＣＨ２）ｎまたは（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎ
であり、
ｍおよびｎはそれぞれ個別に０、１、２または３であり、ｍ＋ｎ＝２または３であ
り、ＡはＣＨまたはＮであり、
あるいは
Ｘは（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ−（ＣＨ２）ｑであり、
ｐおよびｑはそれぞれ個別に０または１であり、ｐ＋ｑ＝０またはである、
あるいは、
ｂ）（カルボキシメチルチオ）プロピオニル
ｃ）（カルボキシエチルチオ）プロピオニル
からなる群から選択され、かつ、
式中、Ｒ’は、
ｄ）ＯＨ、
ｅ）Ｏ−（アルキル１〜６Ｃ）（前記アルキルは直鎖または分枝鎖であり得る）および
ｆ）Ｏ−Ｃ（アルキル１〜６Ｃ）−Ｏ−（アルキル１〜６Ｃ）（前記アルキル基は直鎖または分枝鎖であり得る）
からなる群から選択される〕
【請求項２】
前記Ｒ’基はＯＨであり、前記Ｒ基はアジポイル、フェノキシアセチルおよびテトラゾールアセチルから選択される、請求項１に記載の化合物またはその塩もしくはそのエステル。
【請求項３】
アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩もしくはそのエステル。
【請求項４】
式（Ｉ）で特徴付けられるセフ−３−エム化合物またはその塩もしくはそのエステルの発酵製造のためのバイオプロセスであり、
【化２】
〔式中、Ｒは、
ａ．ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯ−
ここで、
Ｘは（ＣＨ２）４と定義されるか、
あるいは
Ｘは（ＣＨ２）ｐ−Ａ−（ＣＨ２）ｑと定義され、
ｐおよびｑはそれぞれ個別に０、１、２、３または４であり、ＡはＣＨ＝ＣＨ、
Ｃ≡Ｃ、ＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、Ｓ、ＮＨであり、窒素は置換されてもよく、または
硫黄は酸化されてもよく、Ｂは水素、ハロゲン、Ｃ１−３アルコキシ、ヒドロキシ
ル、または置換されてもよいメチルであり、但し、
ＡがＣＨ＝ＣＨまたはＣ≡Ｃであるとき、ｐ＋ｑは２または３であり、あるいは
ＡがＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、ＳまたはＮＨであるとき、ｐ＋ｑは３または４であり、
あるいは、
Ｘは（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ＝Ａ−（ＣＨ２）ｎまたは（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎ
であり、
ｍおよびｎはそれぞれ個別に０、１、２または３であり、ｍ＋ｎ＝２または３であ
り、ＡはＣＨまたはＮであり、
あるいは、
Ｘは（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ−（ＣＨ２）ｑであり、
ｐおよびｑはそれぞれ個別に０または１であり、ｐ＋ｑ＝０またはである、
あるいは、
ｂ．（カルボキシメチルチオ）プロピオニル
ｃ．（カルボキシエチルチオ）プロピオニル
ｄ．Ｙ−ＣＨ２−ＣＯ−（式中、Ｙはフェニル、フェノキシまたはテトラゾリルである）
からなる群から選択され、かつ、
式中、Ｒ’は、
ｅ．ＯＨ
ｆ．Ｏ−（アルキル１〜６Ｃ）（前記アルキルが直鎖または分枝鎖であり得る）および
ｇ．Ｏ−Ｃ（アルキル１〜６Ｃ）−Ｏ−（アルキル１〜６Ｃ）（前記アルキル基が直鎖または分枝鎖であり得る）からなる群から選択される〕
Ａ）イソペニシリンＮを産生するＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株を、その生育を維持することが可能な培地で維持し、
・３’−カルボキシメチルチオプロピオン酸またはその塩もしくはそのエステル、
・３，３’−チオジプロピオン酸またはその塩もしくはそのエステル、
・Ｙ−ＣＨ２−ＣＯＯＨまたはその塩もしくはそのエステル
（式中、Ｙはフェニル、フェノキシまたはテトラゾリルである）、
・一般式ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯＯＨの化合物またはその塩もしくはそのエステル
（式中、Ｘは（ＣＨ２）４と定義されるか、
あるいは
Ｘは（ＣＨ２）ｐ−Ａ−（ＣＨ２）ｑと定義され、
ｐおよびｑはそれぞれ個別に０、１、２、３または４であり、Ａは
ＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、ＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、Ｓ、ＮＨであり、窒素は置換
されてもよく、または硫黄は酸化されてもよく、Ｂは水素、ハロゲン、
Ｃ１−３アルコキシ、ヒドロキシル、または置換されてもよいメチルであ
り、但し、
ＡがＣＨ＝ＣＨまたはＣ≡Ｃであるとき、ｐ＋ｑは２または３であり、ある
いは、ＡがＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、ＳまたはＮＨであるとき、ｐ＋ｑは３また
は４であり、
あるいは
Ｘは（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ＝Ａ−（ＣＨ２）ｎまたは
（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎであり、
ｍおよびｎはそれぞれ個別に０、１、２または３であり、ｍ＋ｎ＝２または
３であり、ＡはＣＨまたはＮであり、
あるいは
Ｘは（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ−（ＣＨ２）ｑであり、
ｐおよびｑはそれぞれ個別に０または１であり、ｐ＋ｑ＝０または１であ
る）
からなる群から選択される、
前記Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株により同化および利用されて、対応するアシル−６−アミノペニシラン酸（アシル−６−ＡＰＡ）を生成し、それにより前記アシル−６−ＡＰＡを生成することが可能である、
任意の１つまたは複数の側鎖前駆物質を含むフィードストック（ｆｅｅｄｓｔｏｃｋ）を前記培地に添加するステップと、
Ｂ）対応する遺伝子のｉｎ ｓｉｔｕ発現により酵素的変換を行うステップであって、
ｉ）前記アシル−６−ＡＰＡを、エクスパンダーゼ（ｅｘｐａｎｄａｓｅ）酵素により
ｉｎ ｓｉｔｕで環拡大して、対応するアシル−７−アミノ−デスアセトキシ
セファロスポラン酸（アジポイル−７−ＡＤＣＡ）を生成し、ここで、前記アシル
−６−ＡＰＡを基質として受容することができるエクパンダーゼ酵素をコードする
ＤＮＡにより、前記Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株を形質転換し、その発現の結
果、前記菌株で産生された前記アシル−６−ＡＰＡもその後ｉｎ ｓｉｔｕで環拡
大して、対応するアシル−７−ＡＤＣＡを生成し、
ｉｉ）前記アシル−７−ＡＤＣＡの３−メチル側鎖を、ヒドロキシラーゼ（ｈｙｄｒｏ
ｘｙｌａｓｅ）酵素によりｉｎ ｓｉｔｕで水酸化して、対応するアシル−７−ア
ミノ−デスアルキルセファロスポラン酸（アシル−７−ＡＤＡＣ）を生成し、ここ
で、前記アシル−７−ＡＤＣＡを基質として受容することができるヒドロキシラー
ゼ酵素をコードするＤＮＡにより、前記Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株を形質転換
し、その発現の結果、前記菌株で産生した前記アシル−７−ＡＤＣＡもｉｎ ｓｉ
ｔｕで水酸化されて、対応するアシル−７−ＡＤＡＣを生成し、
ｉｉｉ）前記アシル−７−ＡＤＡＣの３−ヒドロキシメチル側鎖を、Ｏ−カルバモイル
トランスフェラーゼ（Ｏ−ｃａｒｂａｍｏｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）酵素に
よりｉｎ ｓｉｔｕでＯ−カルバモイル化して、式（Ｉ）の化合物を生成し、ここ
で、前記アシル−７−ＡＤＡＣを基質として受容することができるＯ−カルバモイ
ルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡにより、前記Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅ
ｎｕｍ株を形質転換し、その発現の結果、前記菌株で産生した前記アシル−７−Ａ
ＤＡＣもｉｎ ｓｉｔｕでカルバモイル化されて、本発明の化合物を製造する
ステップとを
含むバイオプロセス。
【請求項５】
セフ−３−エム抗生物質の製造における、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項６】
３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム抗生物質の製造における、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項７】
前記３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム抗生物質は
ａ．セフロキシム
ｂ．セフォキシチン
ｃ．セフカペンピボキシル
からなる群から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩もしくはそのエステルの製造における、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項９】
イソペニシリンＮを産生する能力のあるＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株の微生物であり、
ａ．エクスパンダーゼ酵素
ｂ．ヒドロキシラーゼ酵素
ｃ．Ｏ−カルバモイルトランスフェラーゼ酵素
をコードするＤＮＡ断片を備えている微生物。
【請求項１０】
イソペニシリンＮを産生する能力のあるＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株の微生物であり、
ａ．結合したエクスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ酵素
ｂ．Ｏ−カルバモイルトランスフェラーゼ酵素
をコードするＤＮＡ断片を備えている微生物。
【請求項１１】
請求項１から３のいずれか１項に記載の化合物を含む医薬品。
【請求項１】
式（I）で特徴付けられるセフ−３−エム化合物、またはその塩若しくはそのエステル。
【化１】
〔式中、Ｒは、
ａ）ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯ−
ここで、
Ｘは（ＣＨ２）４と定義されるか、
あるいは
Ｘは（ＣＨ２）ｐ−Ａ−（ＣＨ２）ｑと定義され、
ｐおよびｑはそれぞれ個別に０、１、２、３または４であり、ＡはＣＨ＝ＣＨ、
Ｃ≡Ｃ、ＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、Ｓ、ＮＨであり、窒素は置換されてもよく、または
硫黄は酸化されてもよく、Ｂは水素、ハロゲン、Ｃ１−３アルコキシ、ヒドロキシ
ル、または置換されてもよいメチルであり、但し、
ＡがＣＨ＝ＣＨまたはＣ≡Ｃであるとき、ｐ＋ｑは２または３であり、あるいは
ＡがＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、ＳまたはＮＨであるとき、ｐ＋ｑは３または４であり、
あるいは
Ｘは（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ＝Ａ−（ＣＨ２）ｎまたは（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎ
であり、
ｍおよびｎはそれぞれ個別に０、１、２または３であり、ｍ＋ｎ＝２または３であ
り、ＡはＣＨまたはＮであり、
あるいは
Ｘは（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ−（ＣＨ２）ｑであり、
ｐおよびｑはそれぞれ個別に０または１であり、ｐ＋ｑ＝０またはである、
あるいは、
ｂ）（カルボキシメチルチオ）プロピオニル
ｃ）（カルボキシエチルチオ）プロピオニル
からなる群から選択され、かつ、
式中、Ｒ’は、
ｄ）ＯＨ、
ｅ）Ｏ−（アルキル１〜６Ｃ）（前記アルキルは直鎖または分枝鎖であり得る）および
ｆ）Ｏ−Ｃ（アルキル１〜６Ｃ）−Ｏ−（アルキル１〜６Ｃ）（前記アルキル基は直鎖または分枝鎖であり得る）
からなる群から選択される〕
【請求項２】
前記Ｒ’基はＯＨであり、前記Ｒ基はアジポイル、フェノキシアセチルおよびテトラゾールアセチルから選択される、請求項１に記載の化合物またはその塩もしくはそのエステル。
【請求項３】
アジポイル−７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩もしくはそのエステル。
【請求項４】
式（Ｉ）で特徴付けられるセフ−３−エム化合物またはその塩もしくはそのエステルの発酵製造のためのバイオプロセスであり、
【化２】
〔式中、Ｒは、
ａ．ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯ−
ここで、
Ｘは（ＣＨ２）４と定義されるか、
あるいは
Ｘは（ＣＨ２）ｐ−Ａ−（ＣＨ２）ｑと定義され、
ｐおよびｑはそれぞれ個別に０、１、２、３または４であり、ＡはＣＨ＝ＣＨ、
Ｃ≡Ｃ、ＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、Ｓ、ＮＨであり、窒素は置換されてもよく、または
硫黄は酸化されてもよく、Ｂは水素、ハロゲン、Ｃ１−３アルコキシ、ヒドロキシ
ル、または置換されてもよいメチルであり、但し、
ＡがＣＨ＝ＣＨまたはＣ≡Ｃであるとき、ｐ＋ｑは２または３であり、あるいは
ＡがＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、ＳまたはＮＨであるとき、ｐ＋ｑは３または４であり、
あるいは、
Ｘは（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ＝Ａ−（ＣＨ２）ｎまたは（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎ
であり、
ｍおよびｎはそれぞれ個別に０、１、２または３であり、ｍ＋ｎ＝２または３であ
り、ＡはＣＨまたはＮであり、
あるいは、
Ｘは（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ−（ＣＨ２）ｑであり、
ｐおよびｑはそれぞれ個別に０または１であり、ｐ＋ｑ＝０またはである、
あるいは、
ｂ．（カルボキシメチルチオ）プロピオニル
ｃ．（カルボキシエチルチオ）プロピオニル
ｄ．Ｙ−ＣＨ２−ＣＯ−（式中、Ｙはフェニル、フェノキシまたはテトラゾリルである）
からなる群から選択され、かつ、
式中、Ｒ’は、
ｅ．ＯＨ
ｆ．Ｏ−（アルキル１〜６Ｃ）（前記アルキルが直鎖または分枝鎖であり得る）および
ｇ．Ｏ−Ｃ（アルキル１〜６Ｃ）−Ｏ−（アルキル１〜６Ｃ）（前記アルキル基が直鎖または分枝鎖であり得る）からなる群から選択される〕
Ａ）イソペニシリンＮを産生するＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株を、その生育を維持することが可能な培地で維持し、
・３’−カルボキシメチルチオプロピオン酸またはその塩もしくはそのエステル、
・３，３’−チオジプロピオン酸またはその塩もしくはそのエステル、
・Ｙ−ＣＨ２−ＣＯＯＨまたはその塩もしくはそのエステル
（式中、Ｙはフェニル、フェノキシまたはテトラゾリルである）、
・一般式ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯＯＨの化合物またはその塩もしくはそのエステル
（式中、Ｘは（ＣＨ２）４と定義されるか、
あるいは
Ｘは（ＣＨ２）ｐ−Ａ−（ＣＨ２）ｑと定義され、
ｐおよびｑはそれぞれ個別に０、１、２、３または４であり、Ａは
ＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、ＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、Ｓ、ＮＨであり、窒素は置換
されてもよく、または硫黄は酸化されてもよく、Ｂは水素、ハロゲン、
Ｃ１−３アルコキシ、ヒドロキシル、または置換されてもよいメチルであ
り、但し、
ＡがＣＨ＝ＣＨまたはＣ≡Ｃであるとき、ｐ＋ｑは２または３であり、ある
いは、ＡがＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、ＳまたはＮＨであるとき、ｐ＋ｑは３また
は４であり、
あるいは
Ｘは（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ＝Ａ−（ＣＨ２）ｎまたは
（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎであり、
ｍおよびｎはそれぞれ個別に０、１、２または３であり、ｍ＋ｎ＝２または
３であり、ＡはＣＨまたはＮであり、
あるいは
Ｘは（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ−（ＣＨ２）ｑであり、
ｐおよびｑはそれぞれ個別に０または１であり、ｐ＋ｑ＝０または１であ
る）
からなる群から選択される、
前記Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株により同化および利用されて、対応するアシル−６−アミノペニシラン酸（アシル−６−ＡＰＡ）を生成し、それにより前記アシル−６−ＡＰＡを生成することが可能である、
任意の１つまたは複数の側鎖前駆物質を含むフィードストック（ｆｅｅｄｓｔｏｃｋ）を前記培地に添加するステップと、
Ｂ）対応する遺伝子のｉｎ ｓｉｔｕ発現により酵素的変換を行うステップであって、
ｉ）前記アシル−６−ＡＰＡを、エクスパンダーゼ（ｅｘｐａｎｄａｓｅ）酵素により
ｉｎ ｓｉｔｕで環拡大して、対応するアシル−７−アミノ−デスアセトキシ
セファロスポラン酸（アジポイル−７−ＡＤＣＡ）を生成し、ここで、前記アシル
−６−ＡＰＡを基質として受容することができるエクパンダーゼ酵素をコードする
ＤＮＡにより、前記Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株を形質転換し、その発現の結
果、前記菌株で産生された前記アシル−６−ＡＰＡもその後ｉｎ ｓｉｔｕで環拡
大して、対応するアシル−７−ＡＤＣＡを生成し、
ｉｉ）前記アシル−７−ＡＤＣＡの３−メチル側鎖を、ヒドロキシラーゼ（ｈｙｄｒｏ
ｘｙｌａｓｅ）酵素によりｉｎ ｓｉｔｕで水酸化して、対応するアシル−７−ア
ミノ−デスアルキルセファロスポラン酸（アシル−７−ＡＤＡＣ）を生成し、ここ
で、前記アシル−７−ＡＤＣＡを基質として受容することができるヒドロキシラー
ゼ酵素をコードするＤＮＡにより、前記Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株を形質転換
し、その発現の結果、前記菌株で産生した前記アシル−７−ＡＤＣＡもｉｎ ｓｉ
ｔｕで水酸化されて、対応するアシル−７−ＡＤＡＣを生成し、
ｉｉｉ）前記アシル−７−ＡＤＡＣの３−ヒドロキシメチル側鎖を、Ｏ−カルバモイル
トランスフェラーゼ（Ｏ−ｃａｒｂａｍｏｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）酵素に
よりｉｎ ｓｉｔｕでＯ−カルバモイル化して、式（Ｉ）の化合物を生成し、ここ
で、前記アシル−７−ＡＤＡＣを基質として受容することができるＯ−カルバモイ
ルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡにより、前記Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅ
ｎｕｍ株を形質転換し、その発現の結果、前記菌株で産生した前記アシル−７−Ａ
ＤＡＣもｉｎ ｓｉｔｕでカルバモイル化されて、本発明の化合物を製造する
ステップとを
含むバイオプロセス。
【請求項５】
セフ−３−エム抗生物質の製造における、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項６】
３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム抗生物質の製造における、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項７】
前記３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム抗生物質は
ａ．セフロキシム
ｂ．セフォキシチン
ｃ．セフカペンピボキシル
からなる群から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
７−アミノ−３−カルバモイルオキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩もしくはそのエステルの製造における、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項９】
イソペニシリンＮを産生する能力のあるＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株の微生物であり、
ａ．エクスパンダーゼ酵素
ｂ．ヒドロキシラーゼ酵素
ｃ．Ｏ−カルバモイルトランスフェラーゼ酵素
をコードするＤＮＡ断片を備えている微生物。
【請求項１０】
イソペニシリンＮを産生する能力のあるＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株の微生物であり、
ａ．結合したエクスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ酵素
ｂ．Ｏ−カルバモイルトランスフェラーゼ酵素
をコードするＤＮＡ断片を備えている微生物。
【請求項１１】
請求項１から３のいずれか１項に記載の化合物を含む医薬品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２００６−５２８９７０（Ｐ２００６−５２８９７０Ａ）
【公表日】平成１８年１２月２８日（２００６．１２．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３２１３１（Ｐ２００６−５３２１３１）
【出願日】平成１６年５月２４日（２００４．５．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００４／０００３６７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０６３４７
【国際公開日】平成１６年１２月９日（２００４．１２．９）
【出願人】（５０５０７４３１１）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１２月２８日（２００６．１２．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年５月２４日（２００４．５．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００４／０００３６７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０６３４７
【国際公開日】平成１６年１２月９日（２００４．１２．９）
【出願人】（５０５０７４３１１）
【Ｆターム（参考）】
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