タンパク質を蛍光標識する方法
【課題】生体内分子を標識できる、タンパク質の蛍光標識方法の提供。
【解決手段】標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質を得ること、および該融合タンパク質と下記式（Ｉ）で表わされる化合物とを接触させることにより、対象タンパク質を蛍光標識することを含む、タンパク質の蛍光標識方法。
前記式（Ｉ）中、Ｘは、蛍光性基であり、Ｙは、消光性基であり、Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、Ｌ2は、Ｙのためのリンカーであり、Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基である。
【解決手段】標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質を得ること、および該融合タンパク質と下記式（Ｉ）で表わされる化合物とを接触させることにより、対象タンパク質を蛍光標識することを含む、タンパク質の蛍光標識方法。
前記式（Ｉ）中、Ｘは、蛍光性基であり、Ｙは、消光性基であり、Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、Ｌ2は、Ｙのためのリンカーであり、Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を蛍光標識する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生物が生きた状態において、生物内のタンパク質などの生体分子の機能を観察するバイオイメージングが注目されている。この生体分子機能の観察は、生体分子を蛍光で標識し、生物内におけるその生体分子の局在や動きを可視化することにより汎用的に行われている。生体分子を蛍光で標識する方法としては、遺伝子工学的手法を用いて、蛍光タンパク質を目的とする生体分子（タンパク質）の末端に共発現させる方法が一般的である。この蛍光タンパク質は、分子サイズが大きく、また、組織透過性の高い近赤外光蛍光の観測が困難であるなどの不都合がある。そのため、蛍光タンパク質より分子サイズが小さく、かつ、蛍光特性に優れた有機小分子に注目が集まっている。有機小分子を目的タンパク質にラベルする技術として、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）（プロメガ株式会社）（例えば非特許文献１参照）およびＳＮＡＰ−ｔａｇ（登録商標）（例えば非特許文献２参照）を用いたラベル化キットが商品化されている。これらのラベル化法は、酵素反応を利用して目的とする生体分子を蛍光で標識する。そのため、有機小分子を目的とする生体分子にラベル化する際の特異性は非常に高いが、生体分子に結合していない有機小分子由来の蛍光が、バックグラウンドシグナルとして観測されてしまう。このバックグラウンドシグナルを小さくするため、目的とする生体分子を有機小分子で蛍光標識した後、洗浄して、未反応の有機小分子を除去する必要がある。しかしながら、細胞内や生体内に存在する生体分子を洗浄するのは、一般的に困難であり、洗浄できない場合も多い。従って、細胞内や生体内での生体分子の機能を観察するには、上述のラベル化法は汎用的とはいえない。また、有機小分子と目的とする生体分子とを結びつける特定配列のペプチドを用いて、生体分子を蛍光で標識する方法も開発されているが、この方法は、ペプチドと有機小分子との特異性が低いという問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Qureshi,M.H., ら、J. Biol. Chem., 2001, 276, p.46422-8
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, p.9955-9959
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、細胞内や生体内における生体分子（タンパク質）を蛍光で標識するために使用できる、タンパク質を蛍光標識する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、タンパク質を蛍光標識する方法であって、標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質を得ること、および前記融合タンパク質と下記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含み、前記変異型βラクタマーゼは、前記式（Ｉ）で表わされる化合物のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記式（Ｉ）で表わされる化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なタンパク質である（以下、「第１の蛍光標識する方法」と呼ぶことがある)。
【０００６】
【化１】
【０００７】
前記式（Ｉ）中、Ｘは、蛍光性基であり、
Ｙは、消光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｌ2は、Ｙのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のタンパク質を蛍光標識する方法は、目的とするタンパク質を標識した場合にのみ、強い蛍光を示す。そのため、タンパク質を標識していない有機小分子を除去しなくとも、蛍光のバックグラウンドを最小限に抑えることができる。従って、精度の高い蛍光観察を行うことが可能である。また、未反応の有機小分子を除去する必要がないので、生体内での生体分子を観察する際に適する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１（ａ）は、Ｅ１６６ＮＴＥＭ−１をＣＡでラベル化した場合の蛍光画像（ｉ）とゲル染色画像（ｉｉ）と、ＣＡのみの場合の蛍光画像（ｉｉｉ）を、図１（ｂ）は、Ｅ１６６ＮＴＥＭ−１をＣＣＤでラベル化した場合の蛍光画像（ｉ）とゲル染色画像（ｉｉ）と、ＣＣＤのみの場合の蛍光画像（ｉｉｉ）を示す。
【図２】図２（ａ）は、図２（ａ）は、ＷＴＴＥＭ−１にＣＡを加えた場合の蛍光画像（左）とゲル染色画像（右）を、図２（ｂ）は、ＷＴＴＥＭ−１にＣＣＤを加えた場合の蛍光画像（左）とゲル染色画像（右）を示す。
【図３】図３（ａ）は、ＷＴ（野生株）について得られた蛍光波長４５０ｎｍにおける励起スペクトルを、図３（ｂ）は励起波長４１０ｎｍにおける蛍光スペクトルを示す。
【図４】図４（ａ）は、Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１について得られた蛍光波長４５０ｎｍにおける励起スペクトルを、図４（ｂ）は励起波長４１０ｎｍにおける蛍光スペクトルを示す。
【図５】図５はＭＢＰ−Ｅ１６６ＮＴＥＭ−１を哺乳類細胞破砕液中ＣＣＤでラベル化した場合の蛍光画像（左）とゲル染色画像（右）を示す。
【図６】図６は、ＭＢＰ-Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１を化合物ＣＡでラベル化した場合の蛍光画像（左）、ゲル染色画像（右）を示す。
【図７】図７（ａ）は、Ｔｂ3+が配位した化合物ｃｓＤＡｍの吸収スペクトル、図７（ｂ）はＥｕ3+が配位した化合物ｃｓＤＡｍの吸収スペクトルを示す。図７（ｃ）は図７（ａ）の拡大図、図７（ｄ）は図７（ｂ）の拡大図である。
【図８】図８（ａ）は、Ｔｂ3+が配位した化合物ｃｓＤＡｍの励起スペクトル、図ｓ（ｂ）はＥｕ3+が配位した化合物ｃｓＤＡｍの励起スペクトルを示す。
【図９】図９（ａ）は、Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１をＴｂ3+が配位した化合物ｃｓＤＡｍでラベル化した場合の定常状態蛍光測定による蛍光スペクトル、図９（ｂ）は時間分解蛍光測定による蛍光スペクトルを示す。
【図１０】図１０（ａ）は、Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１をＥｕ3+が配位した化合物ｃｓＤＡｍでラベル化した場合の定常状態蛍光測定による蛍光スペクトル、図１０（ｂ）は時間分解蛍光測定による蛍光スペクトルを示す。
【図１１】図１１（ａ）は、Ｔｂ3+が配位した化合物ｃｓＤＡｍの蛍光寿命を示すスペクトル、図１１（ｂ）はＥｕ3+が配位した化合物ｃｓＤＡｍの蛍光寿命を示すスペクトルである。
【図１２】図１２は、Ｅ１６６ＮＴＥＭ−１をＬｎが配位した化合物ｃｓＤＡｍでラベル化した場合の蛍光画像とゲル染色画像を示す。
【図１３】図１３は、ＷＴＴＥＭ−にＬｎが配位した化合物ｃｓＤＡｍを加えた場合の蛍光画像とゲル染色画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
βラクタマーゼのひとつ、ＴＥＭ−１は、下記スキーム１に示すような反応を経て、ペニシリンなどのβラクタム系抗生物質を加水分解することが知られている。
【００１１】
【化２】
【００１２】
前記スキーム１に示すように、ＴＥＭ−１は、その７０位Ｓｅｒがラクタム環へ求核攻撃してアシル−酵素複合体を形成する。次いで、その複合体が加水分解され、βラクタム環の加水分解が生じる。加水分解においては、ＴＥＭ−１の１６６位Ｇｌｕにより促進されることが知られている。そして、この１６６位Ｇｌｕを他のアミノ酸に変更した変異型βラクタマーゼは、アシル−酵素複合体の加水分解速度が大きく低下することが知られていた。例えば、１６６位ＧｌｕをＡｓｎに変更した変異型βラクタマーゼの場合、下記スキーム２に示すように、アシル−酵素中間体の加水分解が起こらない。そのため、このような変異型βラクタマーゼは、基質であるβラクタム環に不可逆的に結合する。
【００１３】
【化３】
【００１４】
本発明は、変異型βラクタマーゼとして例えば、この１６６位Ｇｌｕを他のアミノ酸に変更した変異型βラクタマーゼと、式（Ｉ）で表わされる化合物（以下、「式（Ｉ）の化合物」と呼ぶ）またはその塩を用いることを特徴の一つとする。変異型βラクタマーゼとしては、天然型βラクタマーゼのアミノ酸の変異部位は限定されず、前記式（Ｉ）で表わされる化合物のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記式（Ｉ）で表わされる化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なタンパク質であればよい。なお、式（Ｉ）の化合物は、蛍光性基であるＸと、消光性基であるＹを、分子内構造に有する。そのため、式（Ｉ）の化合物は、蛍光性基を有するにもかかわらず、蛍光強度が極めて低い。
【００１５】
本発明の第１の蛍光標識する方法においては、例えばこの変異型βラクタマーゼと標識対象タンパク質とを融合させた融合タンパク質を、式（Ｉ）の化合物と反応させる。そうすると、融合タンパク質の変異型βラクタマーゼは式（Ｉ）の化合物のβラクタム環を求核攻撃し、βラクタム環を開環させる（例えば、スキーム３参照）。生じたアシル−酵素中間体におけるビニル基を通じて電子移動が生じ、その結果、式（Ｉ）の化合物からＹを遊離させる。なお、生じたアシル−酵素中間体は加水分解を受けることができず、すなわち、変異型βラクタマーゼと式（Ｉ）の化合物の開環した部分は共有結合したままである。この変異型βラクタマーゼと式（Ｉ）の化合物の複合体は、消光剤であるＹを含まないため、式（Ｉ）の化合物に含まれている蛍光性Ｘが蛍光を発する。そうすると、変異型βラクタマーゼを介して標識対象タンパク質と結合した式（Ｉ）の化合物は、強い蛍光を発し、変異型βラクタマーゼを介して標識対象タンパク質と結合していない式（Ｉ）の化合物は蛍光強度が極めて低い。すなわち、式（Ｉ）の化合物は標識対象タンパク質と結合していないときには蛍光を発しないので、バックグラウンドシグナルが低い。その結果、式（Ｉ）の化合物で標識対象タンパク質（生体分子）を標識した後、洗浄しなくとも、バックグラウンドシグナルに邪魔されることなく、正確に標識対象タンパク質を検出することが可能なのである。
【００１６】
【化４】
【００１７】
変異型βラクタマーゼをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列、配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列の１〜数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記融合タンパク質において前記式（Ｉ）の化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び、配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、前記融合タンパク質において前記式（Ｉ）の化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、からなる群から選択される塩基配列が挙げられる。例えば、配列番号５の塩基配列は、１６６位グルタミン酸をアスパラギンに変更した変異型ＴＥＭ−１の塩基配列である（Adachiら、The Journal of Biochemistry, 1991, 266, 3186-3191参照）。
【００１８】
融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得るには、標識対象タンパク質をコードするポリヌクレオチド、変異型βラクタマーゼをコードするポリヌクレオチド等を用い、通常の方法に従い、そのようなプラスミド若しくはベクターを調製することができる。本発明において、ベクターは、ポリヌクレオチド、好ましくは、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入するためのポリヌクレオチドをいい、プラスミドを含むものをいう。なお、ベクターは、プラスミドベクターであってもよく、ウイルスベクターであってもよい。融合タンパク質を発現可能とする配列は、当業者であれば、導入する細胞の種類に応じて適宜選択しうる。プラスミド及びベクターは、融合タンパク質の発現を調節する配列（例えば、発現誘導プロモーターや制御配列）を含んでもよい。
【００１９】
細胞内で融合タンパク質を発現させるには、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを用いて、通常の方法に従って行うことができる。
【００２０】
発現した融合タンパク質を単離するには、通常の方法に従って行うことができる。
【００２１】
標識対象タンパク質および変異型βラクタマーゼの融合タンパク質は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で融合タンパク質を発現させること、又は、発現した融合タンパク質を単離することの１以上の工程を含む方法、または全ての工程を含む方法により得ることができる。すなわち、融合タンパク質を得ることは、該タンパク質を単離することのみならず、細胞内や生体内で発現させることを含む。
【００２２】
本発明の第１の蛍光標識する方法において用いられる式（Ｉ）の化合物は、前記のように、Ｘが、蛍光性基であり、Ｙが、消光性基であり、Ｌ1が、Ｘのためのリンカーであり、Ｌ2が、Ｙのためのリンカーであり、Ｒ1が、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基である。
【００２３】
【化５】
【００２４】
本発明の化合物において、蛍光性基とは、可視光線、紫外線、Ｘ線等が照射され、そのエネルギーを吸収することにより電子が励起し、それが基底状態に戻る際に余分なエネルギーを電磁波として放出する性質を有する基を意味する。具体的には、蛍光性基とは、クマリン色素、キサンテン色素、シアニン色素、アクリジン、イソインドール、ダンシル色素、アミノフタル酸ヒドラジド、アミノフタルイミド、アミノナフタルイミド、アミノベンゾフラン、アミノキノリン、ジシアノヒドロキノン等から誘導される基あるいは発光性希土類錯体が挙げられ、クマリン色素、キサンテン色素から誘導される基および発光性希土類錯体が好ましい。
【００２５】
前記発光性希土類錯体としては、例えば、以下の式（ｉｉ）および（ｘｉ）〜式（ｘｘｖｉｉｉ）で表わされる基と、希土類イオンとの錯体が挙げられる。前記希土類イオンとしては、Ｔｂ3+、Ｅｕ3+、Ｄｙ3+、Ｓｍ3+などが挙げられる。
【００２６】
【化６】
【００２７】
【化７】
【００２８】
【化８】
【００２９】
【化９】
【００３０】
式（Ｉ）の化合物において、蛍光性を低下させる消光性基とは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、光誘起電子移動、常磁性の項間交差の増強、デクスター交換カップリングおよび暗色複合体の形成などの励起子カップリングを含むメカニズムにより、蛍光性基の蛍光を消す基である。具体的には、消光性基とは、
【００３１】
【化１０】
【００３２】
ジメチルアミノアゾベンゼン、テトラメチルローダミン、QSYクエンチャー色素(Invitrogen社製)等が挙げられ、ジメチルアミノアゾベンゼンが好ましい。
【００３３】
本発明の化合物において、ＸのためのリンカーＬ1とは、式（Ｉ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物のセファロスポリン骨格とＸとを結びつけるための基または式（ＩＩ）の化合物のペニシリン骨格とＸとを結び付けるための基である。具体的には、Ｌ1は、−（ＣＨ2）n1ＣＯＮＲ2（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1ＮＲ2ＣＯ（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1ＮＲ3ＣＯＮＲ2（ＣＨ2）n2−、−(ＣＨ2)n1ＮＲ3ＣＳＮＲ2（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1ＣＯＮＲ3（ＣＨ2）n3ＣＯＮＲ2（ＣＨ2）n2−，−（ＣＨ2）n1ＣＯＮＲ3（ＣＨ2）n3（ＣＨＲ4）n4ＣＯＮＲ2（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1Ｓ（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1Ｏ（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1ＮＲ2（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1ＣＯ2（ＣＨ2）n2−等が挙げられ、−（ＣＨ2）n1ＣＯＮＲ3（ＣＨ2）n3ＣＯＮＲ2（ＣＨ2）n2−が好ましい。前記式中、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４はそれぞれ、０または１〜５の整数であり、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ、水素原子、低級アルキル基またはフェニル基である。このＸのためのリンカーとは、本発明のタンパク質を蛍光標識する方法における条件下で、切断されないリンカーであれば、その構造は限定されない。
【００３４】
式（Ｉ）の化合物において、ＹのためのリンカーＬ2とは、式（Ｉ）の化合物のセファロスポリン骨格とＹとを結びつけるための基である。さらに、Ｙのためのリンカーとは、式（Ｉ）の化合物のβラクタム環が、変異型βラクタマーゼにより開環され、生じたアシル−酵素中間体におけるビニル基を通じて電子移動が生じ、その結果、Ｙを遊離させるようなリンカーが好ましい。具体的には、Ｌ2は、−ＣＨ2Ｏ（ＣＨ2）n1−、−ＣＨ2Ｓ（ＣＨ2）n1−、−ＣＨ2ＮＲ2（ＣＨ2）n1−、−ＣＨ2Ｎ+Ｒ22（ＣＨ2）n1−、−ＣＨ2ＯＣＯＮＲ2（ＣＨ2）n1−、−ＣＨ2ＯＣＯ（ＣＨ2）n1−、−ＣＨ2ＣＳＮＲ2（ＣＨ2）n1−、−ＣＨ2ＳＣＳＯ（ＣＨ2）n1−、−ＣＨ＝ＣＨ−、
【００３５】
【化１１】
【００３６】
等が挙げられ、
【００３７】
【化１２】
【００３８】
が好ましい。前記式中、ｎ１、ｎ２はそれぞれ、０または１〜５の整数であり、Ｒ2は、水素原子または低級アルキル基である。
【００３９】
本発明の化合物において、セファロスポリン骨格、ペニシリン骨格、Ｘ、Ｙ、Ｌ1およびＬ2は、１か所以上の不斉中心を有することもあり、それゆえ、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物はラセミ体または純粋な立体異性体として存在してもよい。さらに、Ｘ、Ｙ、Ｌ1および／またはＬ2にアルケニル基を含有する場合、シス又はトランス異性体として存在しうる。いずれの場合にも、本発明はそれらの混合物及び各異性体を共に包含するものである。
【００４０】
ただし、式（Ｉ）の化合物において、セファロスポリン骨格は、変異型βラクタマーゼに対して特異性が高まるため、下式に示す立体を有するのが好ましい。
【００４１】
【化１３】
【００４２】
前記式中、Ｌ1、Ｌ2およびＲ1は、式（Ｉ）の化合物において定義したとおりである。
【００４３】
本発明の化合物において、低級アルキル基とは、炭素数１〜６のものが挙げられる。具体的には、低級アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｉ−ペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ｔ−ペンチル基、２−メチルブチル基、ｎ−ヘキシル基、１−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、４−メチルペンチル基、１−エチルブチル基、２−エチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、３，３−ジメチルブチル基、および１−エチル−１−メチルプロピル基などの直鎖状または分岐状のアルキル基を挙げることができ、好適には炭素数１〜３のものが挙げられる。
【００４４】
本発明の化合物において、低級アルキレン基とは、炭素数１〜６のものが挙げられる。具体的には、低級アルキル基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基などの直鎖状または分岐状のアルキル基を挙げることができ、好適には炭素数１〜３のものが挙げられる。
【００４５】
本発明の化合物において、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基とは、例えば、ｔ−ブトキシメチル、アセトキシメチル等が挙げられ、中でもアセトキシメチルが好ましい。
【００４６】
本発明において、式（Ｉ）の化合物の塩、式（ＩＩ）の化合物の塩および式（ＩＩＩ）の化合物の塩は、酸または塩基との塩であってもよい。そのような塩としては、例えばナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などの無機塩基との塩、及びトリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンアミンなどの有機アミン塩、及び塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸塩、及びギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸、酒石酸などの有機カルボン酸塩、及びメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などのスルホン酸付加塩、及びアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの塩基性又は酸性アミノ酸といった塩基との塩又は酸付加塩が挙げられる。
【００４７】
本発明において、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物は、溶媒和物の形をとることもありうるが、これも本発明の範囲に含まれる。溶媒和物としては、好ましくは、水和物及びエタノール和物が挙げられる。
【００４８】
本発明の蛍光標識する方法において用いられる式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物は、従来技術における公知文献を参考に自家製造してもよいし、市販で入手してもよい。
【００４９】
本発明の蛍光標識する方法において用いられる、標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質を得ることは、例えば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で融合タンパク質を発現させること、又は、発現した融合タンパク質を単離することを含んでもよい。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、標識対象タンパク質をコードするポリヌクレオチド、変異型βラクタマーゼをコードするポリヌクレオチド等を用い、通常の方法に従い、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを調製することができる。
【００５０】
本発明の第１の蛍光標識する方法において、前記融合タンパク質と、式（Ｉ）の化合物とを反応させる工程は、融合タンパク質を発現する細胞内や生体内で行ってもよく、単離した融合タンパク質を用いてin vitroで行ってもよい。標識をin vitroで行う場合、例えば、緩衝液中（ｐＨ６．８〜７．４）で２０〜３７℃の温度で行ってもよい。
【００５１】
本発明のタンパク質を蛍光標識する方法（第１の蛍光標識する方法）において、融合タンパク質における変異型βラクタマーゼのアミノ酸配列は、
（ｉ）配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質において上記式（Ｉ）で表わされる記化合物のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列、及び、
（ｉｉｉ）配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質において上記式（Ｉ）で表わされる化合物のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列であるのが好ましい。
【００５２】
本発明は、また、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩を含む本発明の第１の蛍光標識する方法に用いるための組成物である。
【００５３】
【化１４】
【００５４】
前記式（Ｉ）中、Ｘは、蛍光性基であり、
Ｙは、消光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｌ2は、Ｙのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基である。
【００５５】
本発明は、また、本発明の第１の蛍光標識する方法に用いるためのプラスミドまたはベクターであって、
前記プラスミドまたはベクターは、標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングするため又は前記融合タンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターであり、
前記プラスミド又はベクターは、
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列の１〜数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記融合タンパク質において前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び、
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、前記融合タンパク質において前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、からなる群から選択される塩基配列を含む。
【００５６】
また、本発明は、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩を含む本発明の方法に用いるための組成物と、本発明の方法に用いるためのプラスミドまたはベクターとを含むタンパク質の蛍光標識方法用キットである。
【００５７】
本発明のタンパク質の蛍光標識方法用キットは、さらに、前記プラスミド又はベクターを導入するための宿主細胞、キットの取り扱い説明書を含むのが好ましい。
【００５８】
本発明の第１の蛍光標識する方法において、前記式（Ｉ）中、Ｘが発光性希土類錯体である場合、蛍光標識された対象タンパク質を時間分解蛍光測定方法により検出するのが好ましい。このような式（Ｉ）の化合物は、Ｘが発光性希土類錯体であるため、発光する蛍光が長寿命である。そうすると、生体内で自家蛍光として観測される寿命が短い蛍光（リボフラビンやＮＡＤＨなど内在性蛍光物質に由来する蛍光）を排除し、対象タンパク質を高いＳ／Ｎ比で高感度に検出することができる。
【００５９】
本発明の第１の蛍光標識する方法、組成物、およびキットにおいて、Ｘがクマリンから誘導される下記式（ｉ）に示す基：
【００６０】
【化１５】
【００６１】
であり、Ｙが
【００６２】
【化１６】
【００６３】
であり、Ｌ1が−（ＣＨ2）n1ＣＯＮＲ3（ＣＨ2）n3ＣＯＮＲ2（ＣＨ2）n2−であり、Ｌ2が、
【００６４】
【化１７】
【００６５】
または−ＣＨ＝ＣＨ−である式（Ｉ）の化合物が好ましく、
以下の式で表わされる化合物ＣＣＤがさらに好ましい。
【００６６】
【化１８】
【００６７】
また、本発明は、一般式（Ｉ’）で表わされる化合物（以下、「式（Ｉ’）の化合物」と呼ぶ）またはその塩である。
【００６８】
【化１９】
【００６９】
前記式（Ｉ）中、Ｘは、蛍光性基、好ましくはクマリン色素、キサンテン色素から誘導される基であり、
Ｙは、消光性基、好ましくはジメチルアミノアゾベンゼンであり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカー、好ましくは−（ＣＨ2）n1ＣＯＮＲ3（ＣＨ2）n3ＣＯＮＲ2（ＣＨ2）n2−であり、
Ｌ2’は、
【００７０】
【化２０】
【００７１】
（前記式中、ｎ１、ｎ２はそれぞれ、０または１〜５の整数であり、
Ｒ2は、水素原子または低級アルキル基である）
または−ＣＨ＝ＣＨ−
で表わされる、Ｙのためのリンカー、好ましくは
【００７２】
【化２１】
【００７３】
であり、
Ｒ1は、Ｈまたは低級アルキル基である。
【００７４】
式（Ｉ’）の化合物は、下記式で表わされる保護基で保護されたセファロスポリン誘導体を出発原料とし、従来技術における公知文献および化合物ＣＣＤの製造方法を参考にすることにより、製造することができる。
【００７５】
【化２２】
【００７６】
前記式中、ＰｒｏおよびＰｒｏ’は、それぞれ、保護基を意味し、Ｈａｌは、ハロゲン原子を意味する。
【００７７】
また、本発明は、タンパク質を蛍光標識する方法であって、
標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質を得ること、および前記融合タンパク質と下記式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは下記式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含み、前記変異型βラクタマーゼは、前記式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは下記式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なタンパク質である、タンパク質の蛍光標識方法である（以下、「第２の蛍光標識する方法」と呼ぶことがある)。
【００７８】
【化２３】
【００７９】
前記式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）中、
Ｘは、蛍光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基であり、
Ｒ4は、Ｈまたは低級アルキルである。
【００８０】
前記のように、前記融合タンパク質と下記式（ＩＩ）の化合物もしくは下記式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩とを反応させると、融合タンパク質の変異型β−ラクタマーゼは、式（ＩＩ）の化合物または式（ＩＩＩ）の化合物のβラクタム環を求核攻撃し、βラクタム環を開環させる。開環後、βラクタム間と式（ＩＩ）の化合物または式（ＩＩＩ）の化合物との付加体は加水分解されないため、変異型β−ラクタマーゼは式（ＩＩ）の化合物または式（ＩＩＩ）の化合物で蛍光標識されることになる。この方法によれば、変異型β−ラクタマーゼを選択的に蛍光標識できるという利点がある。β−ラクタマーゼは細菌酵素であり、哺乳類動物細胞中には存在しない。そのため、この方法によれば、哺乳類動物細胞中の内在性タンパク質をラベル化する恐れは無いという利点がある。
【００８１】
前記第２の蛍光標識する方法において用いられる式（ＩＩ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物は、前記のようにＸが、蛍光性基であり、Ｌ1が、Ｘのためのリンカーであり、Ｒ1が、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基であり、Ｒ4が、Ｈまたは低級アルキルである。前記蛍光性基、Ｘのためのリンカー、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基および低級アルキル基については、式（Ｉ）の化合物について前記したとおりである。
【００８２】
本発明の第２の蛍光標識する方法において用いられる、標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質を得ることは、例えば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で融合タンパク質を発現させること、又は、発現した融合タンパク質を単離することを含んでもよい。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、標識対象タンパク質をコードするポリヌクレオチド、変異型βラクタマーゼをコードするポリヌクレオチド等を用い、通常の方法に従い、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを調製することができる。
【００８３】
本発明の第２の蛍光標識する方法において、前記融合タンパク質と、式（ＩＩ）の化合物または式（ＩＩＩ）の化合物とを反応させる工程は、融合タンパク質を発現する細胞内や生体内で行ってもよく、単離した融合タンパク質を用いてin vitroで行ってもよい。標識をin vitroで行う場合、例えば、緩衝液中（ｐＨ６．８〜７．４）で２０〜３７℃の温度で行ってもよい。
【００８４】
本発明の第２の蛍光標識する方法において、前記融合タンパク質における前記変異型βラクタマーゼのアミノ酸配列は、
（ｉ）配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質において上記式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列、及び、
（ｉｉｉ）配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質において上記式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列であるのが好ましい。
【００８５】
本発明の第２の蛍光標識する方法は、変異型β−ラクタマーゼを利用する。β−ラクタマーゼは細菌酵素であり、哺乳類細胞中には存在しないため、内在性タンパク質をラベル化することは無い。従って、本発明のタンパク質を蛍光標識する方法は、内在性タンパク質ではなく対象タンパク質を選択的にラベル化することができる。
【００８６】
本発明の第２の蛍光標識する方法において、前記式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）中、Ｘが発光性希土類錯体である場合、蛍光標識された対象タンパク質を時間分解蛍光測定方法により検出することが可能である。このような式（ＩＩ）の化合物または式（ＩＩＩ）の化合物は、Ｘが発光性希土類錯体であるため、発光する蛍光が長寿命である。そうすると、生体内で自家蛍光として観測される寿命が短い蛍光（リボフラビンやＮＡＤＨなど内在性蛍光物質に由来する蛍光）を排除し、対象タンパク質を高いＳ／Ｎ比で高感度に検出することができる。
【００８７】
本発明は、また、前記式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは下記式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩を含む本発明の方法に用いるための組成物である。
【００８８】
【化２４】
【００８９】
前記式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）中、
Ｘは、蛍光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基であり、
Ｒ4は、Ｈまたは低級アルキルである。
【００９０】
本発明は、または、本発明の第２の蛍光標識する方法に用いるためのプラスミドまたはベクターであって、
前記プラスミドまたはベクターは、標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングするため又は前記融合タンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターであり、
前記プラスミド又はベクターは、
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列の１〜数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記融合タンパク質において式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び、
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、前記融合タンパク質において式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、からなる群から選択される塩基配列を含む。
【００９１】
また、本発明は、前記式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは下記式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩を含む本発明の方法に用いるための組成物と、本発明の方法に用いるためのプラスミドまたはベクターとを含むタンパク質の蛍光標識方法用キットである。
【００９２】
本発明のタンパク質の蛍光標識方法用キットは、さらに、前記プラスミド又はベクターを導入するための宿主細胞、キットの取り扱い説明書を含むのが好ましい。
【００９３】
本発明の第２の蛍光標識する方法、組成物、およびキットにおいて、一般式（ＩＩ）で表わされる化合物としては、Ｘが下記式（ｉ）に示す基または式（ｉｉ）に示す基と希土類イオンとの錯体：
【００９４】
【化２５】
【００９５】
であり、Ｌ1が−（ＣＨ2）n1ＣＯＮＲ3（ＣＨ2）n3ＣＯＮＲ2（ＣＨ2）n2−または−（ＣＨ2）n1ＣＯＮＲ3（ＣＨ2）n3（ＣＨＲ4）n4ＣＯＮＲ2（ＣＨ2）n2−（前記式中、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４はそれぞれ、０または１〜５の整数であり、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ、水素原子、低級アルキル基またはフェニル基である。）
であり、Ｒ1はＨである化合物が好ましく、下記化合物ＣＡおよび下記化合物ｃｓＤＡｍに希土類イオンが錯体を形成した化合物がより好ましい。
【００９６】
【化２６】
【００９７】
また、本発明は、一般式（ＩＩ’）で表わされる化合物またはその塩である。
【００９８】
【化２７】
【００９９】
前記式（ＩＩ’）中、
Ｘ’は、発光性希土類錯体であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基である。
【０１００】
一般式（ＩＩ’）で表わされる化合物としては、Ｘが下記式（ｉｉ）に示す基と希土類イオンとの錯体：
【０１０１】
【化２８】
【０１０２】
であり、Ｌ1が−（ＣＨ2）n1ＣＯＮＲ3（ＣＨ2）n3ＣＯＮＲ2（ＣＨ2）n2−または−（ＣＨ2）n1ＣＯＮＲ3（ＣＨ2）n3（ＣＨＲ4）n4ＣＯＮＲ2（ＣＨ2）n2−（前記式中、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４はそれぞれ、０または１〜５の整数であり、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ、水素原子、低級アルキル基またはフェニル基である。）
であり、Ｒ1はＨである化合物が好ましく、下記化合物ｃｓＤＡｍに希土類イオンが錯体を形成した化合物がより好ましい。
【０１０３】
【化２９】
【０１０４】
式（ＩＩ）および式（ＩＩ’）の化合物は、下記式で表わされる保護基で保護されたペニシリン誘導体を出発原料とし、従来技術における公知文献および化合物ＣＡの製造方法を参考にすることにより、製造することができる。
【０１０５】
【化３０】
【０１０６】
前記式中、Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基である。
【０１０７】
［実施例］
本明細書の記載において、以下の略語を使用する。
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＷＳＣＤ：水溶性カルボジイミド：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
Ａｒ：アルゴン
ＴＥＡ：トリエチルアミン
ＢＯＣ：ｔ−ブトキシオキシカルボニル
［化合物および機器］
化合物は、入手できる最も高いグレードのものであり、東京化成工業株式会社、和光純薬工業株式会社、およびシグマ−アルドリッチジャパン株式会社から購入して、さらなる精製を行わずに用いた。７−アミノ−３−クロロメチル−３−セフェム−４−カルボン酸 ｐ−メトキシベンジル エステル 塩酸塩（ＡＣＬＥ・ＨＣｌ）は、大塚化学株式会社から購入した。制限エンドヌクレアーゼおよびPrimeSTAR（登録商標）ＨＳ ＤＮＡ ポリメラーゼは、タカラバイオ株式会社から購入した。カナマイシンおよび無機塩は、和光純薬工業株式会社またはナカライテスク株式会社から購入した。プラスミドDNAは、QIAprep Spin Miniprep kit（商品名）(株式会社キアゲン)を用いて単離した。
【０１０８】
XL10-Gold(ストラタジーン社)を特定部位の突然変異誘発実験の中間ホストとして用いた。E. coli BL21(DE3)(ノバジェン社)を標的遺伝子発現のホストとして用いた。ルリア−ベルターニ（Luria-Bertani）(LB)培地またはTerrific Broth (TB)を全ての菌株用成長培地として用いた。Bacto Agar (和光純薬工業株式会社)を固体培地の調製用に１．５％までの濃度で用いた。
【０１０９】
ＮＭＲスペクトルは、1Ｈ用には４００ＭＨｚで、13ＮＭＲ用には１００．４ＭＨｚで、テトラメチルシランを内部標準として用い、ＪＥＯＬ ＪＮＭ−ＡＬ４００装置で測定した。質量スペクトル（ＦＡＢ）は、ＪＥＯＬ ＪＭＳ−７００で測定した。ＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳは、Waters LCT-Premier XE（日本ウォーターズ株式会社）で測定した。MALDI-TOF MSは、Applied Biosystems Voyager RP（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）で測定した。ＵＶ−可視吸収スペクトルは、紫外可視分光光度計ＵＶ１６５０ＰＣスペクトロメーター（株式会社島津製作所）を用いて測定した。蛍光スペクトルは、日立分光蛍光光度計Ｆ−４５００を用いて測定した。スリット幅は励起および放射の両方について２．５ｎｍであった。光電子増倍管電圧は７００Ｖであった。全てのプローブは蛍光測定前に（生化学用グレード、和光純薬工業株式会社）に溶解させた。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、ＢＷ−３００（富士シリシア化学株式会社）を用いて行った。
【０１１０】
［参考例：化合物ＣＡの合成］
（１）化合物（１１）の合成
【０１１１】
【化３１】
【０１１２】
２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド（３．０ｇ，２２ｍｍｏｌ）およびジエチルマロネート（４．２ｇ，２６ｍｍｏｌ）を無水ＥｔＯＨ（３０ｍＬ）に溶解させ、ついでピペリジン（３７０ｍｇ，４．３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１２時間還流加熱し、ついで氷浴中で冷却した。析出物を集め、冷ＥｔＯＨで洗浄して化合物（１１）を得た（２．５ｇ，収率４９％）。
【０１１３】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.29 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 4.28 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 6.69 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.85 (dd, J = 1.8, 8.7 Hz), 7.74 (d, J = 8.7 Hz. 1H), 8.67 (s, 1H), 11.1 (brs, 1H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 15.2, 61.9, 102.9, 111.5, 113.1, 115.1, 133.1, 150.4, 157.5, 158.1, 164.0, 165.2;
HRMS (ESI+) m/z: 257.0406 (計算値[M+H]+: 257.0426)。
【０１１４】
（２）化合物（１２）の合成
【０１１５】
【化３２】
【０１１６】
化合物（１１）（０．３９ｇ，１．６ｍｍｏｌ）を２Ｎ ＮａＯＨ水溶液（５ｍＬ）に溶解させ、室温で１２時間攪拌した。その混合物を２Ｎ ＨＣｌ水溶液で酸性にした。ついで析出物を集め、水で洗浄して化合物（１２）を得た（０．２９ｇ，収率８７％）。
【０１１７】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 6.74 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.84 (dd, J = 2.1, 8.7 Hz, 1H), 7.74 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.68 (s, 1H), 11.1 (brs, 1H), 12.8 (brs, 1H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 102.4, 111.7, 113.6, 115.1, 133.1, 150.5, 158.1, 158.6, 165.0, 165.3;
HRMS (ESI+) m/z: 206.0215 (計算値[M+H]+: 206.0220)。
【０１１８】
（３）化合物（１３）の合成
【０１１９】
【化３３】
【０１２０】
化合物（１２）（０．２５ｇ，１．２ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．２１ｇ，１．８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させ、ついでＷＳＣＤ・ＨＣｌ（０．３５ｇ，１．８ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。その混合物を０℃で３時間Ａｒ雰囲気下で攪拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、１０％クエン酸水溶液、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。蒸発させて化合物（１３）を得た（０．２４ｇ，収率６６％）。
【０１２１】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.91 (s, 4H), 6.77 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.89 (dd, J = 1.8, 8.7 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 9.00 (s, 1H), 11.4 (brs, 1H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 102.4, 111.7, 113.6, 115.1, 133.1, 150.5, 158.1, 158.6, 165.0, 165.3;
HRMS (ESI+) m/z: 326.0263 (計算値[M+H]+: 326.0277)。
【０１２２】
（４）化合物ＣＡの合成
【０１２３】
【化３４】
【０１２４】
アンピシリン（０．３５ｇ，０．９９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解させ、ついでジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（１滴）および化合物（１３）（０．２０ｇ，０．６６ｍｍｏｌ）をそこへ０℃で添加した。その混合物を１０時間攪拌した。ついで１０％クエン酸水溶液を添加し、その混合物を酢酸エチルで抽出した。有機相を１０％クエン酸水溶液および水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。蒸発させて、化合物ＣＡ（クマリニルアンピシリン）を得た（０．３１ｇ，収率８８％）。
【０１２５】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ1.41 (s, 3H), 1.55 (s, 3H), 4.21 (s, 1H), 5.40 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.56 (dd, J = 3.0 Hz, 7.7 Hz, 1H), 5.92 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.83 (s, 1H), 6.88 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.35 (m, 7H), 7.83 (d, J = 8.43 Hz, 2H), 9.38 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 9.62 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 11.1 (s, 1H), 13.4 (brs, 1H).
【実施例１】
【０１２６】
化合物ＣＣＤの合成
（１）化合物（1）の合成
【０１２７】
【化３５】
【０１２８】
７−アミノ−３−クロロメチル−３−セフェム−４−カルボン酸ｐ−メトキシベンジルエステル塩酸塩（ＡＣＬＥ・ＨＣｌ）（１．０ｇ，２．５ｍｍｏｌ）、ＢＯＣ−グリシン（４８０ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ一水和物（７６０ｍｇ，４．９ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させ、その後トリエチルアミン（２５０ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）およびＷＳＣＤ・ＨＣｌ（５７０ｍｇ，３．０ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。その混合物を０℃で６時間Ａｒ雰囲気下で攪拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液、１０％クエン酸水溶液および水で洗浄し、その後、硫酸ナトリウムで乾燥した。蒸発させた後、残渣をヘキサン／酢酸エチル（１：１）で溶出してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物（１）を得た（１．２５ｇ，収率９６％）。
【０１２９】
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.46 (s, 9H), 3.48 (d, J = 18.4 Hz, 1H), 3.65 (d, J = 18.4 Hz, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.83 (m, 2H), 4.43 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.54 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.97 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 5.23 (s, 2H), 5.84 (dd, J = 5.2 Hz, 8.8 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8.8 Hz, 2H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 27.1, 28.2, 43.2, 44.1, 55.2, 57.5, 58.9, 68.2, 80.5, 113.9, 125.5, 126.2, 126.6, 130.6, 156.0, 159.9, 161.1, 164.6, 170.2, 171.2;
HRMS (FAB+) m/z: 526.1426 (計算値[M+H]+: 526.1415)。
【０１３０】
（２）化合物（２）の合成
【０１３１】
【化３６】
【０１３２】
化合物（１）（５６０ｍｇ，１．１ｍｍｏｌ）およびヨウ化ナトリウム（１．６ｇ，１１ｍｍｏｌ）のアセトン中混合物を、室温で１時間攪拌した。反応混合物を減圧下に濃縮し、酢酸エチルで希釈した。有機相を水で洗浄し、その後硫酸ナトリウムで乾燥した。得られたヨウ素誘導体（淡オレンジ色の非晶質）を精製なしに次の反応に用いた。ヨウ素誘導体（４００ｍｇ，０．６５ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶解させ、次いでＮａＨＣＯ3（８０ｍｇ，０．９５ｍｍｏｌ）を添加した。そこへ、ｐ−アミノチオフェノール（１２０ｍｇ，０．９５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液を滴下して加えた。得られた混合物を室温でＡｒ雰囲気下、５時間攪拌した。その混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液、１０％クエン酸水溶液および水で洗浄し、その後硫酸ナトリウムで乾燥した。蒸発させた後、残渣をヘキサン／酢酸エチル（１：１）で溶出してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物（２）を得た（２６０ｍｇ，収率５４％（２工程））。
【０１３３】
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ1.46 (s, 9H), 3.33 (d, J = 18.0 Hz, 1H), 3.59 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 3.67 (d, J = 18.0 Hz, 1H), 3.75 (brs, 2H), 3.81 (s, 3H), 3.84 (m, 2H), 4.17 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 4.87 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 4.98 (d, J = 11.7 Hz, 1H),5.07 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 5.17 (brs, 1H), 5.84 (dd, J = 4.9 Hz, 8.8 Hz, 1H), 6.53 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.89 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.04 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.15 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.30 (d, J = 8.8 Hz, 2H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 28.3, 28.6, 39.2, 44.3, 55.3, 57.5, 58.7, 67.6, 80.6, 113.9, 115.5, 120.6, 124.0, 127.0, 130.6, 130.7, 136.0, 147.1, 156.0, 159.8, 161.4, 164.4, 170.0;
HRMS (FAB+) m/z: 615.1940 (計算値[M+H]+: 615.1947)。
【０１３４】
（３）化合物（３）の合成
【０１３５】
【化３７】
【０１３６】
化合物（２）（２７０ｍｇ，０．４４ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノアゾベンゼン−４’−カルボン酸（１３０ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ）を、ピリジン（５ｍＬ）に溶解させ、ついでＰＯＣｌ3（７４ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ）を−２０℃で５分間にわたって滴下して加えた。その混合物を−２０℃で２０分間、Ａｒ雰囲気下で攪拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液、１０％クエン酸水溶液および水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。蒸発させた後、残渣をＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2（０％→１％）で溶出してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物（３）を得た（７６ｍｇ，収率２０％）。
【０１３７】
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.45 (s, 9H), 3.11 (s, 6H), 3.40 (d, J = 18.0 Hz, 1H ), 3.63 (d, J = 18.0 Hz, 1H), 3.80 (m, 3H), 4.15 (d, J = 13.3 Hz, 1H), 4.86 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 5.04 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 5.08 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 5.24 (brs, 1H), 5.71 (dd, J = 4.8 Hz, 9.0 Hz, 1H), 6.76 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.82 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.09 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.92 (m, 6H), 8.03 (brs, 1H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 28.3, 28.3, 38.0, 40.3, 44.3, 55.2, 57.5, 58.8, 67.7, 80.6, 111.5, 113.9, 120.6, 122.4, 124.4, 125.5, 126.9, 128.1, 128.4, 129.4, 130.6, 134.3, 134.4, 138.1, 143.6, 152.9, 155.4, 156.0, 159.8, 161.4, 164.3, 165.2, 170.0;
HRMS (FAB+) m/z: 866.3000 (計算値[M+H]+: 866.3006)。
【０１３８】
（４）化合物（４）の合成
【０１３９】
【化３８】
【０１４０】
化合物（３）（４０ｍｇ，46μmol)を無水ＣＨ2Ｃｌ2（４ｍＬ）に溶解させ、チオアニソール（８００μＬ）とトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（２．４ｍＬ）を０℃で添加した。その混合物を０℃で４時間攪拌し、ついで、冷ジエチルエーテル（１５ｍＬ）へ加えた。析出物を集め、ジエチルエーテルで洗浄して化合物（４）（トリフルオロ酢酸塩）を得た（３６ｍｇ，定量的）。
【０１４１】
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ3.12 (s, 6H), 3.55 (d, J = 17.6 Hz, 1H), 3.76 (m, 3H), 3.93 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 4.33 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 5.06 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 5.72 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 9.3 Hz, 2H), 7.45 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.70 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.88 (t, J = 9.3 Hz, 4H), 8.04 (d, J = 9.3 Hz, 2H);
13C NMR (100 MHz, DMF-d7) δ 28.4, 35.8, 40.2, 41.6, 58.4, 59.9, 112.3, 121.3, 121.4, 122.4, 125.9, 126.0, 129.5, 129.7, 132.2, 133.1, 135.9, 140.0, 143.9, 154.0, 155.5, 162.9, 163.8, 165.0, 165.8, 167.9;
HRMS (FAB+) m/z: 646.1915 (計算値[M+H]+: 646.1906)。
【０１４２】
（５）化合物CCDの合成
【０１４３】
【化３９】
【０１４４】
化合物（４）（１０ｍｇ，１３μｍｏｌ）をＤＭＦ（５００μＬ）に溶解させ、その後、トリエチルアミン（ＴＥＡ）（１滴）および化合物（１３）（４．４ｍｇ，１５μｍｏｌ）を室温で添加した。その混合物を１時間攪拌し、ついで溶媒を蒸発させ、１００ｍＭのギ酸アンモニウム水溶液（１５ｍＬ）を添加した。析出物を集め、１００ｍＭギ酸アンモニウム水溶液と水で洗浄して、化合物ＣＣＤを得た（１０ｍｇ，収率９１％）。
【０１４５】
1H NMR (400 MHz, DMF-d7) δ 3.13 (s, 6H), 3.61 (d, J = 18.1 Hz, 1H), 3.83 (d, J = 18.1 Hz, 1H), 4.02 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 4.27 (d, J = 3.9 Hz, 2H), 4.34 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 5.20 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 5.83 (dd, J = 4.9 Hz, 8.8 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 9.3 Hz, 2H), 6.97 (dd, J = 2.4 Hz, 8.8 Hz, 1H), 7.47 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.90 (m, 7H), 8.20 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 8.84 (s, 1H), 9.01 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 9.18 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 10.5 (s, 1H), 11.5 (brs, 1H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 27.3, 36.9, 39.8, 42.3, 57.7, 58.8, 101.8, 111.0, 111.6, 113.1, 114.4, 120.8, 121.6, 125.2, 128.9, 129.0 (two carbons), 129.6, 131.6, 132.1, 134.9, 138.4, 142.7, 148.3, 152.9, 154.3, 156.4, 160.9, 161.6, 163.0, 163.9, 164.2, 164.9, 169.2;
HRMS (FAB+) m/z: 834.2010 (計算値[M+H]+: 834.2016).
［プラスミドと点変異］
Omp-A WT（野生株）TEM-1ベクターS1（Thomas, V. L.; Golemi-Kotra, D.; Kim, C.; Vakulenko, S. B.; Mobashery, S.; Shoichet, B. K. Biochemistry. 2005, 44, 9330−9338参照）は、S. Mobashery 教授(Georgia Institute of Technology)から提供を受けた。Omp-A WT TEM-1における点変異は、QuikChange（登録商標） Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用い、製造者のプロコールに従い、配列番号９および１０の変異原性プライマーを用いることで目的プラスミドｐＥＴ−２４ａ（＋）−Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１を得た。得られたｐＥＴ−２４ａ（＋）−Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１（ＴＥＭ−１の１６６位のＧｌｕをＡｓｎに置き換えた）を含む点変異二本鎖プラスミドDNAの配列決定は、Sequenase DNA sequencing kit (BigDye Terminator version 3.1; Applied Biosystems)と、製造者のプロトコールによるオーダーメードの内部プライマーを用いて行った。
【０１４６】
［変異型ＴＥＭ−１ βラクタマーゼの精製］
２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを追加したＬＢ培地中の大腸菌Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）において、Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１を含む点変異二本鎖プラスミドを一晩、培養した。酵素精製のため、その培養物を、２０μｇ／ｍＬのカナマイシン、５００ｍＭのソルビトールおよび２．５ｍＭのベタインを追加したTerrific Broth で１００倍に希釈した。６００ｎｍで培養物の光学濃度が０．６に達するまで、３７℃で振とう（２６０〜２８０ｒｐｍ）して４〜５時間インキュベーションした後、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．４ｍＭまで添加し、その培養物を２５℃で一晩攪拌した。細胞を遠心分離によりペレット化し、酵素を含む上澄み液をVivaspin(膜分子量カットオフ, 10,000; Vivascience)により濃縮して、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．０）に置き換えた。濃縮したタンパク質を同じ緩衝液で平衡にしたＤＥＡＥセファデックスカラムにロードした。酵素をグラジェント溶出液（１０〜１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ 緩衝液）を用いて変異型ＴＥＭ−１ βラクタマーゼを溶出させた。
【０１４７】
［タンパク質ラベルのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる検出］
ＷＴ（野生株）ＴＥＭ−１ βラクタマーゼまたはＥ１６６Ｎ ＴＥＭ−１ βラクタマーゼ（２０μＭ）を２５℃で、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中の化合物ＣＡ（３０μＭ）溶液または化合物ＣＣＤ（３０μＭ）溶液に添加した。３０分後、蛍光ラベル化されたタンパク質と蛍光ラベル化されていないタンパク質を、SDS gel loading buffer （１％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％メルカプトエタノール、ｐＨ６．８）中に溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。電気泳動の後、ゲルの蛍光画像を、ＵＶランプにより３６５ｎｍの蛍光下、デジタルカメラで撮影した。蛍光画像を撮影した後、ゲルをCoomassie Brilliant Blueで染色し、その後、染色したゲル画像を撮影した。得られた結果を、図１および図２に示す。図１（a）は、Ｅ１６６ＮＴＥＭ−１をＣＡでラベル化した場合の蛍光画像（ｉ）とゲル染色画像（ｉｉ）を、図１（ｂ）はＥ１６６ＮＴＥＭ−１をＣＣＤでラベル化した場合の蛍光画像（ｉ）とゲル染色画像（ｉｉ）を示す。また、化合物ＣＡ（３０μＭ）または化合物ＣＣＤ（３０μＭ）のみを、SDS gel loading buffer （１％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％メルカプトエタノール、ｐＨ６．８）中に溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。電気泳動の後、ゲルの蛍光画像を、ＵＶランプにより３６５ｎｍの蛍光下、デジタルカメラで撮影した。得られた蛍光画像は、化合物ＣＡについては図１（ａ）（ｉｉｉ）に、化合物ＣＣＤについては図１（ｂ）（ｉｉｉ）に示す。
【０１４８】
また、図２（ａ）は、ＷＴＴＥＭ−１にＣＡを加えた場合の蛍光画像（左）とゲル染色画像（右）を、図２（ｂ）は、ＷＴＴＥＭ−１にＣＣＤを加えた場合の蛍光画像（左）とゲル染色画像（右）を示す。
【０１４９】
図１に示すように、化合物ＣＣＤが存在する場合または化合物ＣＡが存在する場合、Ｅ１６６ＮＴＥＭ−１がラベル化されていることが確認できた。また、Ｅ１６６ＮＴＥＭ−１を化合物ＣＡでラベル化した場合、ラベル化タンパク質由来のバンド以外に、未反応プローブと緩衝液中で自動的に加水分解を受けたプローブ由来のバンドが確認できた。一方、Ｅ１６６ＮＴＥＭ−１を化合物ＣＣＤでラベル化した場合、ラベル化タンパク質以外の蛍光は殆ど確認できなかった。従って、ＣＣＤによるＥ１６６ＮＴＥＭ−１のラベル化はＣＡと比較して、未反応プローブなどのバックグラウンドが非常に小さいことが確認できた
図２に示すように、ＷＴＴＥＭ−１に化合物ＣＡとＣＣＤを反応させた場合、両化合物ともＷＴＴＥＭ−１によって加水分解を受けることが確認できた。
【０１５０】
［蛍光分光］
蛍光プローブを全てジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解させて１０ｍＭストック溶液を調製した。プローブの相対的蛍光量子収率は、１００ ｍＭ ＨＥＰＥＳ 緩衝液（ｐＨ７．４）中のサンプルの修正蛍光スペクトル下面積と、100 ｍＭのＨ2ＳＯ4水溶液中キニン２硫酸塩の修正蛍光スペクトル下面積（文献Dawson, R. W.; Windsor, W. M. J. Phys. Chem. 1968, 72, 3251−3260によれば、量子収率は０．５５である。）とから、推定した。得られた結果を表１に示す。
【０１５１】
【表１】
【０１５２】
［酵素アッセイ］
ＷＴ（野生株）およびＥ１６６Ｎ ＴＥＭ−１の酵素アッセイを１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で室温で行った。精製酵素の溶液（１５μＭ、５μＬ）をＨＥＰＥＳ緩衝液中のプローブ（１μＭ、５００μＬ）に添加した。サンプルを４１０ｎｍで励起させ、４５０ｎｍでの蛍光強度を測定した。ＷＴ（野生株）について得られた４５０ｎｍでの発光スペクトルを図３（ａ）に、４１０ｎｍでの励起スペクトルを図３（ｂ）に示す。Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１について得られた４５０ｎｍでの発光スペクトルを図４（ａ）に、４１０ｎｍでの励起スペクトルを図４（ｂ）に示す。
【０１５３】
図３に示すように、ＷＴ（野生株）βラクタマーゼと化合物ＣＣＤを反応させると、蛍光強度が時間と共に増強していた。一方、図４に示すように、Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１βラクタマーゼと化合物ＣＣＤを反応させると、蛍光強度が時間と共に増強するが、ＷＴ（野生株）βラクタマーゼとの場合と比較して、増強の程度はかなり緩やかであった。従って、Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１βラクタマーゼが、化合物ＣＣＤにより共有結合的に標識されているのに対し、ＷＴ（野生株）βラクタマーゼは、触媒的に加水分解反応が進行しているために、大きく蛍光が増強していることが確認できた。
【０１５４】
［ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析］
ＣＣＤストック溶液（１０ｍＭ、０．２μＬ）を、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中のＥ１６６Ｎ ＴＥＭ−１溶液（１５μＭ、１９．８μＬ）に２５℃で添加した。１６時間後、未反応の化合物ＣＣＤをセファデックスG-50 quick spin column (DNA-グレード; GE Healthcare)を用いて除去した。その後、ＭＳ用サンプルを、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸をマトリックスとして調製した。得られた結果を表２に示す。
【０１５５】
【表２】
【０１５６】
表２に示すように、Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１βラクタマーゼ自体の分子量および化合物ＣＣＤにより蛍光標識されたＥ１６６Ｎ ＴＥＭ−１の分子量が確認できた。従って、これらの物質の構造が確認できた。
【０１５７】
［融合タンパク質ＭＢＰ−Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１の発現および精製］
ＭＢＰのＤＮＡ断片はｐＭＡＬ−ｃ2（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）からＰＣＲにより増幅した後、ＮｄｅＩとＮｈｅＩによって制限酵素処理した。ＭＢＰＤＮＡ断片を同様の制限処理を施したｐＥＴ−２１ｂ（＋）とライゲーションさせることでプラスミドｐＥＴ−２１ｂ（＋）−ＭＢＰを得た。次にｐＥＴ−２４a（＋）−Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１からＥ１６６Ｎ ＴＥＭ−１塩基配列をＰＣＲによって増幅し、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩによって制限酵素処理した。そして同様にＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩによって制限酵素処理を施したｐＥＴ−２１ｂ（＋）−ＭＢＰとライゲーションさせることで、目的プラスミドｐＥＴ−２１ｂ（＋）−ＭＢＰ−Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１を得た。ｐＥＴ−２１ｂ（＋）−ＭＢＰ−Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１は、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを追加したＬＢ培地中のＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）中で、成長細胞培地（ＯＤ600＝０．６〜１．０）へＩＰＴＧ（１００μＭ）添加した後、２５℃で２０時間発現させた。細胞を遠心分離により収穫し、カラム緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中で再懸濁させ、超音波で溶解させた。溶解液をアミロース樹脂カラム(New England Biolabs)に載せ、融合タンパク質を溶出緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのマルトース、ｐＨ７．４）を用いて溶出させた。得られたＭＢＰ−Ｅ１６６ＮＴＥＭ−１（１０μＭ）に哺乳類細胞破砕液とＣＣＤ（３０μＭ）を加え２５℃で、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中で反応させた。４５分後、蛍光ラベル化されたタンパク質と蛍光ラベル化されていないタンパク質を、SDS gel loading buffer （１％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％メルカプトエタノール、ｐＨ６．８）中に溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。電気泳動の後、ゲルの蛍光画像を、ＵＶランプにより３６５ｎｍの蛍光下、デジタルカメラで撮影した。蛍光画像を撮影した後、ゲルをCoomassie Brilliant Blueで染色し、その後、染色したゲル画像を撮影した。得られた結果を、図５に示す。図５は、ＭＢＰ−Ｅ１６６ＮＴＥＭ−１を哺乳類細胞破砕液中ＣＣＤでラベル化した場合の蛍光画像（左）とゲル染色画像（右）を示す。
【０１５８】
図５に示すように、融合タンパク質ＭＢＰ−Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１に哺乳類細胞破砕液を加え、ＣＣＤでラベル化を行ったところ、ＣＣＤは融合タンパク質のみを選択的にラベル化した。この結果からＥ１６６ＮＴＥＭ−１は他のタンパク質と融合しても、その機能を保っていること、また夾雑タンパク質と非特異的に反応しないことが確認できた。
【０１５９】
［化合物ＣＡによる融合タンパク質ＭＢＰ−Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１のラベル化］
前記のようにして得られたＭＢＰ−Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１（１０μＭ）に化合物ＣＡ（３０μＭ）を加え２５℃で、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中で反応させた。４５分後、蛍光ラベル化されたタンパク質と蛍光ラベル化されていないタンパク質を、SDS gel loading buffer （１％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％メルカプトエタノール、ｐＨ６．８）中に溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。電気泳動の後、ＵＶランプにより３６５ｎｍの励起光照射下、ゲルの蛍光画像をデジタルカメラで撮影した。蛍光画像撮影後、ゲルをCoomassie Brilliant Blueで染色し、染色したゲル画像をデジタルカメラで撮影した。得られた結果を、図６に示す。図６は、ＭＢＰ-Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１を化合物ＣＡでラベル化した場合の蛍光画像（左）、ゲル染色画像（右）を示す。
【０１６０】
図６に示すように、化合物ＣＡは変異型βラクタマーゼを選択的に蛍光標識できることが確認できた。
【実施例２】
【０１６１】
［化合物ｃｓＤＡｍの合成］
（１）７−アミノ−４−メチルキノリン−２（１Ｈ）−オン（化合物ｃｓ１２４）の合成
【０１６２】
【化４０】
【０１６３】
１，３−フェニレンジアミン（３．２２ｇ、２９．８ｍｍｏｌ）およびエチルアセトアセテート（３．８ｍＬ，３０．１ｍｍｏｌ）を４８時間１３０℃で還流加熱した。その混合物は徐々に固化した。エタノール（５ｍＬ）をその混合物に添加して粉砕し、ろ過して粗生成物を得た。メタノールを用いてその粗生成物を結晶化し、標題化合物を得た（２．５２ｇ、１４．５ｍｍｏｌ、収率４８．５％、黄色針状結晶。
【０１６４】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ11.1 (s, 1H, 1), 7.33 (d, J = 8.3 Hz, 1H, 4), 6.44 (dd, J = 8.3 Hz, 2.0 Hz, 1H, 5), 6.36 (d, J = 2.0 Hz, 1H, 7), 5.93 (s, 1H, 2), 5.71 (s, 2H, 6, 2.27 (s, 3H, 3);
MS (ESI+) 計算値 C10H11N2O 175.08, 測定値175.08。
【０１６５】
（２）化合物（csDAm）の合成
【０１６６】
【化４１】
【０１６７】
ＤＴＰＡ二無水物（１．０４ｇ、２．９１ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（ＴＥＡ、２７５ｍＬ）をＤＭＦ（２７５ｍＬ）中に溶解させ、そこへ、ＴＥＡ（２ｍＬ）、化合物ｃｓ１２４（０．５７２ｇ、３．２９ｍｍｏｌ）およびアンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ、１．０９ｇ、３．１３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５０ｍｌ）溶液を滴下して加えた。その混合物から減圧下に溶媒を除去した。得られた生成物を逆相ＨＰＬＣにより以下のようにして精製した：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ−３カラム（１０×２５０ｍｍ）に溶液を載せ、３３０ｎｍの波長で検出して、０．１％ ギ酸を含有する１５〜３０％アセトニトリル／Ｈ2Ｏ勾配溶液を４．７２６ｍＬ／分の流速で３０分で溶出した。生成物は、２９．５分に溶出した。
【０１６８】
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.79 (s, 1H, 5), 7.66 (d, J = 8.8 Hz, 1H, 3), 7.50 (d, J = 8.8 Hz, 1H, 4), 7.24~7.34 (m, 6H, 1,16,1718,19,20), 5.48 (s, 1H, 15), 5.46 (d, J = 3.6 Hz, 1H, 22) 5.36 (dd, J = 1.2 Hz, 3.8 Hz, 1H, 21), 4.28 (s, 1H, 25), 3.06~3.73 (m, 28H, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14), 2.42 (s, 3H, 2), 1.47 (s, 3H, 23), 1.39 (s, 3H, 24 );
MS (ESI+) 計算値C40H49N8O13S 881.31, 測定値 881.32,
計算値 C40H50N8O13S 441.16, 測定値 441.16。
【０１６９】
［化合物ｃｓＤＡｍへ希土類イオンを配位させた化合物の製造と蛍光測定］
希土類イオンの配位は０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で化合物ｃｓＤＡｍとＬｎ（ＮＯ3）3・６Ｈ2Ｏ（Ｌｎ＝Ｔｂ，Ｅｕ）がそれぞれ最終濃度が１０μＭになるよう調整し、２５℃で１時間ボルテックスした。測定にはボルテックス後、プローブの最終濃度が１μＭになるよう希釈したものを用いた。ＬｎがＴｂ3+の場合に得られた吸収スペクトルを図７（ａ）に、ＬｎがＥｕ3+の場合に得られた吸収スペクトルを図７（ｂ）に示す。図７（ａ）の拡大図を図７（ｃ）に、図７（ｂ）の拡大図を図７（ｄ）に示す。図７（ａ）〜図７（ｄ）に示すように、吸収スペクトルの３３０ｎｍ付近に化合物ｃｓ１２４の吸収が確認できる。従って、化合物ｃｓＤＡｍへ希土類イオンが配位した化合物の生成が確認できた。
【０１７０】
また、ＬｎがＴｂ3+の場合に得られた励起スペクトルを図８（ａ）に、ＬｎがＥｕ3+の場合に得られた励起スペクトルを図８（ｂ）に示す。図８（ａ）においてλEmは５４６ｎｍ、図８（ｂ）においてλEmは６１５ｎｍである。図８（ａ）に示すように、図７の吸収スペクトルと同様、３３０ｎｍ付近に極大値を有し、この吸収により化合物ｃｓ１２４により希土類イオンが励起されていることが確認できた。また、図８（ｂ）に示すように、図７の吸収スペクトルと同様、３２１ｎｍ付近に極大値を有し、この吸収により化合物ｃｓ１２４により希土類イオンが励起されていることが確認できた。
【０１７１】
［時間分解蛍光スペクトル］
０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で化合物ｃｓＤＡｍとＬｎ（ＮＯ3）3・６Ｈ2Ｏ（Ｌｎ＝Ｔｂ，Ｅｕ）がそれぞれ最終濃度が１０μＭになるよう調整し、２５℃で１時間ボルテックスした。測定にはボルテックス後、プローブの最終濃度が１μＭになるよう希釈したものを用いた。サンプルを３３０ｎｍで励起したときの、定常状態蛍光測定による蛍光スペクトルを図９（ａ）に、時間分解蛍光測定による蛍光スペクトルを図９（ｂ）に示す。その際、Delay timeは６０μｓ、Gate timeは２msで測定した。図９（ａ）に示すように、３４０〜４５０ｎｍ付近に化合物ｃｓ１２４由来のピークが、５００〜６２０ｎｍ付近にテルビウムイオン由来のシャープなピークが確認できた。また、図９（ｂ）に示すように、３５０〜４５０ｎｍ付近の化合物ｃｓ１２４由来のピークは消失し、希土類イオンであるテルビウムイオン由来のピークのみが観測されることが確認できた。なお、５００〜６２０ｎｍ付近にテルビウムイオン由来のシャープなピークは、３４０〜４５０ｎｍ付近に化合物ｃｓ１２４由来のピークと比較して強度が著しく強い。これは、化合物ｃｓ１２４からユーロピウムへのエネルギー移動および発光効率が高いことに由来すると考えられる。
【０１７２】
また、Ｔｂ（ＮＯ3）3・６Ｈ2Ｏの代わりにＥｕ（ＮＯ3）3・６Ｈ2Ｏを用いて、３２１ｎｍで励起させて同様に蛍光スペクトルを測定した。定常状態蛍光測定による蛍光スペクトルを図１０（ａ）に、時間分解蛍光測定による蛍光スペクトルを図１０（ｂ）に示す。その際、Delay timeは６０μｓ、Gate timeは２msで測定した。図１０（ａ）に示すように、３４０〜４５０ｎｍ付近に化合物ｃｓ１２４由来のピークが、５００〜６２０ｎｍ付近にユーロピウムイオン由来のシャープなピークが確認できた。また、図１０（ｂ）に示すように、３５０〜４５０ｎｍ付近の化合物ｃｓ１２４由来のピークは消失し、希土類イオンであるユーロピウムイオン由来のピークのみが観測されることが確認できた。
【０１７３】
［蛍光寿命］
化合物ｃｓＤＡｍ（１ｍＭ、２０μＬ）およびＴｂ（ＮＯ3）3・６Ｈ2Ｏ（１ｍＭ、２０μＬ）をそれぞれの最終濃度が０．５ｍＭになるよう調整し、２５℃で１時間ボルテックスした。測定にはボルテックス後、プローブの最終濃度が１μＭになるよう希釈したものを用いた。サンプルを３３０ｎｍで励起し、５４６ｎｍでの蛍光寿命を測定した。その結果を図１１（ａ）に示す。また、Ｔｂ（ＮＯ3）3・６Ｈ2Ｏの代わりにＥｕ（ＮＯ3）3・６Ｈ2Ｏを用いて、３２１ｎｍで励起し、６１５ｎｍでの蛍光寿命を測定した。その結果を図１１（ｂ）に示す。図１１（ａ）からＬｎがＴｂの場合の蛍光寿命が１．４６ｍｓ、図１１（ｂ）からＬｎがＥｕの場合の蛍光寿命が０．５８７ｍｓであることが確認できた。すなわち、ＬｎがＴｂまたはＥｕの場合、ｍｓオーダーの長い蛍光寿命を有することが確認できた。
【０１７４】
［タンパク質ラベルのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる検出］
ＷＴ（野生株）ＴＥＭ−１ βラクタマーゼまたはＥ１６６Ｎ ＴＥＭ−１ βラクタマーゼ、化合物ｃｓＤＡｍおよびＬｎ（ＮＯ3）3・６Ｈ2Ｏの最終濃度が、それぞれ２７．５μＭ、５５．０μＭおよび１８．３μＭとなるように、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中のＷＴ（野生株）ＴＥＭ−１ βラクタマーゼまたはＥ１６６Ｎ ＴＥＭ−１ βラクタマーゼを２５℃で、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中の化合物ｃｓＤＡｍ溶液および１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中のＬｎ（ＮＯ3）3・６Ｈ2Ｏ溶液に添加して反応溶液を作製した。反応溶液を２５℃で６０分間インキュベーションし、次いで、SDS gel loading buffer （１％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％メルカプトエタノール、ｐＨ６．８）中に溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。電気泳動の後、ゲルの蛍光画像を、ＵＶランプにより３６５ｎｍの蛍光下、デジタルカメラで撮影した。蛍光画像を撮影した後、ゲルをCoomassie Brilliant Blueで染色し、その後、染色したゲル画像を撮影した。得られた結果を、図１２および図１３に示す。図１２は、Ｅ１６６ＮＴＥＭ−１をＬｎで配位された化合物ｃｓＤＡｍでラベル化した場合の蛍光画像（左の４レーン）とゲル染色画像（右の４レーン）を、図１３はＷＴ（野生株）ＴＥＭ−１をＬｎで配位された化合物ｃｓＤＡｍでラベル化した場合の蛍光画像（左の２レーン）とゲル染色画像（右の２レーン）を示す。
【０１７５】
図１２における各レーン中のサンプルは以下の表３に示すように成分を混合して作製した。
【０１７６】
【表３】
【０１７７】
図１３における各レーン中のサンプルは以下の表４に示すように成分を混合して作製した。
【０１７８】
【表４】
【０１７９】
図１２に示すように、タグタンパク質となるβ−ラクタマーゼの分子量である２９ｋＤａ付近に、レーン１ではＴｂイオン由来の緑色、レーン２ではＥｕイオン由来の赤色の蛍光が確認できた。このことから、Ｌｎが配位した化合物ｃｓＤＡｍがβ−ラクタマーゼにラベル化していることが確認できた。また、レーン１および２においては、１５ｋＤａ付近にも緑色の蛍光が見られるが、これは遊離のＴｂが配位した化合物[ｃｓＤＡｍ−Ｔｂ]の蛍光であると考えられる。なお、Ｅｕが配位した化合物[ｃｓＤＡｍ−Ｅｕ］は蛍光強度がＴｂが配位した化合物[ｃｓＤＡｍ−Ｔｂ]に比べて弱いため、遊離のＥｕで配位した化合物[ｃｓＤＡｍ−Ｅｕ]由来の蛍光は見られない。
【０１８０】
図１３に示すように、ＷＴのβ-ラクタマーゼにはＴｂが配位した化合物[ｃｓＤＡｍ−Ｔｂ]およびＥｕが配位した化合物[ｃｓＤＡｍ−Ｅｕ］のいずれによってもラベル化されていないことが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１８１】
本発明のタンパク質を蛍光標識する方法は、細胞イメージング等に適用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１８２】
配列番号１ Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１のアミノ酸配列
配列番号２ Ｅ１６６Ａ ＴＥＭ−１のアミノ酸配列
配列番号３ Ｅ１６６Ｄ ＴＥＭ−１のアミノ酸配列
配列番号４ Ｅ１６６Ｑ ＴＥＭ−１のアミノ酸配列
配列番号５ Ｅ１６６Ｄ ＴＥＭ−１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号６ Ｅ１６６Ａ ＴＥＭ−１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号７ Ｅ１６６Ｄ ＴＥＭ−１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号８ Ｅ１６６Ｑ ＴＥＭ−１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号９ 変異原性プライマー
配列番号１０ 変異原性プライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を蛍光標識する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生物が生きた状態において、生物内のタンパク質などの生体分子の機能を観察するバイオイメージングが注目されている。この生体分子機能の観察は、生体分子を蛍光で標識し、生物内におけるその生体分子の局在や動きを可視化することにより汎用的に行われている。生体分子を蛍光で標識する方法としては、遺伝子工学的手法を用いて、蛍光タンパク質を目的とする生体分子（タンパク質）の末端に共発現させる方法が一般的である。この蛍光タンパク質は、分子サイズが大きく、また、組織透過性の高い近赤外光蛍光の観測が困難であるなどの不都合がある。そのため、蛍光タンパク質より分子サイズが小さく、かつ、蛍光特性に優れた有機小分子に注目が集まっている。有機小分子を目的タンパク質にラベルする技術として、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）（プロメガ株式会社）（例えば非特許文献１参照）およびＳＮＡＰ−ｔａｇ（登録商標）（例えば非特許文献２参照）を用いたラベル化キットが商品化されている。これらのラベル化法は、酵素反応を利用して目的とする生体分子を蛍光で標識する。そのため、有機小分子を目的とする生体分子にラベル化する際の特異性は非常に高いが、生体分子に結合していない有機小分子由来の蛍光が、バックグラウンドシグナルとして観測されてしまう。このバックグラウンドシグナルを小さくするため、目的とする生体分子を有機小分子で蛍光標識した後、洗浄して、未反応の有機小分子を除去する必要がある。しかしながら、細胞内や生体内に存在する生体分子を洗浄するのは、一般的に困難であり、洗浄できない場合も多い。従って、細胞内や生体内での生体分子の機能を観察するには、上述のラベル化法は汎用的とはいえない。また、有機小分子と目的とする生体分子とを結びつける特定配列のペプチドを用いて、生体分子を蛍光で標識する方法も開発されているが、この方法は、ペプチドと有機小分子との特異性が低いという問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Qureshi,M.H., ら、J. Biol. Chem., 2001, 276, p.46422-8
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, p.9955-9959
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、細胞内や生体内における生体分子（タンパク質）を蛍光で標識するために使用できる、タンパク質を蛍光標識する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、タンパク質を蛍光標識する方法であって、標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質を得ること、および前記融合タンパク質と下記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含み、前記変異型βラクタマーゼは、前記式（Ｉ）で表わされる化合物のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記式（Ｉ）で表わされる化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なタンパク質である（以下、「第１の蛍光標識する方法」と呼ぶことがある)。
【０００６】
【化１】
【０００７】
前記式（Ｉ）中、Ｘは、蛍光性基であり、
Ｙは、消光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｌ2は、Ｙのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のタンパク質を蛍光標識する方法は、目的とするタンパク質を標識した場合にのみ、強い蛍光を示す。そのため、タンパク質を標識していない有機小分子を除去しなくとも、蛍光のバックグラウンドを最小限に抑えることができる。従って、精度の高い蛍光観察を行うことが可能である。また、未反応の有機小分子を除去する必要がないので、生体内での生体分子を観察する際に適する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１（ａ）は、Ｅ１６６ＮＴＥＭ−１をＣＡでラベル化した場合の蛍光画像（ｉ）とゲル染色画像（ｉｉ）と、ＣＡのみの場合の蛍光画像（ｉｉｉ）を、図１（ｂ）は、Ｅ１６６ＮＴＥＭ−１をＣＣＤでラベル化した場合の蛍光画像（ｉ）とゲル染色画像（ｉｉ）と、ＣＣＤのみの場合の蛍光画像（ｉｉｉ）を示す。
【図２】図２（ａ）は、図２（ａ）は、ＷＴＴＥＭ−１にＣＡを加えた場合の蛍光画像（左）とゲル染色画像（右）を、図２（ｂ）は、ＷＴＴＥＭ−１にＣＣＤを加えた場合の蛍光画像（左）とゲル染色画像（右）を示す。
【図３】図３（ａ）は、ＷＴ（野生株）について得られた蛍光波長４５０ｎｍにおける励起スペクトルを、図３（ｂ）は励起波長４１０ｎｍにおける蛍光スペクトルを示す。
【図４】図４（ａ）は、Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１について得られた蛍光波長４５０ｎｍにおける励起スペクトルを、図４（ｂ）は励起波長４１０ｎｍにおける蛍光スペクトルを示す。
【図５】図５はＭＢＰ−Ｅ１６６ＮＴＥＭ−１を哺乳類細胞破砕液中ＣＣＤでラベル化した場合の蛍光画像（左）とゲル染色画像（右）を示す。
【図６】図６は、ＭＢＰ-Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１を化合物ＣＡでラベル化した場合の蛍光画像（左）、ゲル染色画像（右）を示す。
【図７】図７（ａ）は、Ｔｂ3+が配位した化合物ｃｓＤＡｍの吸収スペクトル、図７（ｂ）はＥｕ3+が配位した化合物ｃｓＤＡｍの吸収スペクトルを示す。図７（ｃ）は図７（ａ）の拡大図、図７（ｄ）は図７（ｂ）の拡大図である。
【図８】図８（ａ）は、Ｔｂ3+が配位した化合物ｃｓＤＡｍの励起スペクトル、図ｓ（ｂ）はＥｕ3+が配位した化合物ｃｓＤＡｍの励起スペクトルを示す。
【図９】図９（ａ）は、Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１をＴｂ3+が配位した化合物ｃｓＤＡｍでラベル化した場合の定常状態蛍光測定による蛍光スペクトル、図９（ｂ）は時間分解蛍光測定による蛍光スペクトルを示す。
【図１０】図１０（ａ）は、Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１をＥｕ3+が配位した化合物ｃｓＤＡｍでラベル化した場合の定常状態蛍光測定による蛍光スペクトル、図１０（ｂ）は時間分解蛍光測定による蛍光スペクトルを示す。
【図１１】図１１（ａ）は、Ｔｂ3+が配位した化合物ｃｓＤＡｍの蛍光寿命を示すスペクトル、図１１（ｂ）はＥｕ3+が配位した化合物ｃｓＤＡｍの蛍光寿命を示すスペクトルである。
【図１２】図１２は、Ｅ１６６ＮＴＥＭ−１をＬｎが配位した化合物ｃｓＤＡｍでラベル化した場合の蛍光画像とゲル染色画像を示す。
【図１３】図１３は、ＷＴＴＥＭ−にＬｎが配位した化合物ｃｓＤＡｍを加えた場合の蛍光画像とゲル染色画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
βラクタマーゼのひとつ、ＴＥＭ−１は、下記スキーム１に示すような反応を経て、ペニシリンなどのβラクタム系抗生物質を加水分解することが知られている。
【００１１】
【化２】
【００１２】
前記スキーム１に示すように、ＴＥＭ−１は、その７０位Ｓｅｒがラクタム環へ求核攻撃してアシル−酵素複合体を形成する。次いで、その複合体が加水分解され、βラクタム環の加水分解が生じる。加水分解においては、ＴＥＭ−１の１６６位Ｇｌｕにより促進されることが知られている。そして、この１６６位Ｇｌｕを他のアミノ酸に変更した変異型βラクタマーゼは、アシル−酵素複合体の加水分解速度が大きく低下することが知られていた。例えば、１６６位ＧｌｕをＡｓｎに変更した変異型βラクタマーゼの場合、下記スキーム２に示すように、アシル−酵素中間体の加水分解が起こらない。そのため、このような変異型βラクタマーゼは、基質であるβラクタム環に不可逆的に結合する。
【００１３】
【化３】
【００１４】
本発明は、変異型βラクタマーゼとして例えば、この１６６位Ｇｌｕを他のアミノ酸に変更した変異型βラクタマーゼと、式（Ｉ）で表わされる化合物（以下、「式（Ｉ）の化合物」と呼ぶ）またはその塩を用いることを特徴の一つとする。変異型βラクタマーゼとしては、天然型βラクタマーゼのアミノ酸の変異部位は限定されず、前記式（Ｉ）で表わされる化合物のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記式（Ｉ）で表わされる化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なタンパク質であればよい。なお、式（Ｉ）の化合物は、蛍光性基であるＸと、消光性基であるＹを、分子内構造に有する。そのため、式（Ｉ）の化合物は、蛍光性基を有するにもかかわらず、蛍光強度が極めて低い。
【００１５】
本発明の第１の蛍光標識する方法においては、例えばこの変異型βラクタマーゼと標識対象タンパク質とを融合させた融合タンパク質を、式（Ｉ）の化合物と反応させる。そうすると、融合タンパク質の変異型βラクタマーゼは式（Ｉ）の化合物のβラクタム環を求核攻撃し、βラクタム環を開環させる（例えば、スキーム３参照）。生じたアシル−酵素中間体におけるビニル基を通じて電子移動が生じ、その結果、式（Ｉ）の化合物からＹを遊離させる。なお、生じたアシル−酵素中間体は加水分解を受けることができず、すなわち、変異型βラクタマーゼと式（Ｉ）の化合物の開環した部分は共有結合したままである。この変異型βラクタマーゼと式（Ｉ）の化合物の複合体は、消光剤であるＹを含まないため、式（Ｉ）の化合物に含まれている蛍光性Ｘが蛍光を発する。そうすると、変異型βラクタマーゼを介して標識対象タンパク質と結合した式（Ｉ）の化合物は、強い蛍光を発し、変異型βラクタマーゼを介して標識対象タンパク質と結合していない式（Ｉ）の化合物は蛍光強度が極めて低い。すなわち、式（Ｉ）の化合物は標識対象タンパク質と結合していないときには蛍光を発しないので、バックグラウンドシグナルが低い。その結果、式（Ｉ）の化合物で標識対象タンパク質（生体分子）を標識した後、洗浄しなくとも、バックグラウンドシグナルに邪魔されることなく、正確に標識対象タンパク質を検出することが可能なのである。
【００１６】
【化４】
【００１７】
変異型βラクタマーゼをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列、配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列の１〜数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記融合タンパク質において前記式（Ｉ）の化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び、配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、前記融合タンパク質において前記式（Ｉ）の化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、からなる群から選択される塩基配列が挙げられる。例えば、配列番号５の塩基配列は、１６６位グルタミン酸をアスパラギンに変更した変異型ＴＥＭ−１の塩基配列である（Adachiら、The Journal of Biochemistry, 1991, 266, 3186-3191参照）。
【００１８】
融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得るには、標識対象タンパク質をコードするポリヌクレオチド、変異型βラクタマーゼをコードするポリヌクレオチド等を用い、通常の方法に従い、そのようなプラスミド若しくはベクターを調製することができる。本発明において、ベクターは、ポリヌクレオチド、好ましくは、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入するためのポリヌクレオチドをいい、プラスミドを含むものをいう。なお、ベクターは、プラスミドベクターであってもよく、ウイルスベクターであってもよい。融合タンパク質を発現可能とする配列は、当業者であれば、導入する細胞の種類に応じて適宜選択しうる。プラスミド及びベクターは、融合タンパク質の発現を調節する配列（例えば、発現誘導プロモーターや制御配列）を含んでもよい。
【００１９】
細胞内で融合タンパク質を発現させるには、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを用いて、通常の方法に従って行うことができる。
【００２０】
発現した融合タンパク質を単離するには、通常の方法に従って行うことができる。
【００２１】
標識対象タンパク質および変異型βラクタマーゼの融合タンパク質は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で融合タンパク質を発現させること、又は、発現した融合タンパク質を単離することの１以上の工程を含む方法、または全ての工程を含む方法により得ることができる。すなわち、融合タンパク質を得ることは、該タンパク質を単離することのみならず、細胞内や生体内で発現させることを含む。
【００２２】
本発明の第１の蛍光標識する方法において用いられる式（Ｉ）の化合物は、前記のように、Ｘが、蛍光性基であり、Ｙが、消光性基であり、Ｌ1が、Ｘのためのリンカーであり、Ｌ2が、Ｙのためのリンカーであり、Ｒ1が、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基である。
【００２３】
【化５】
【００２４】
本発明の化合物において、蛍光性基とは、可視光線、紫外線、Ｘ線等が照射され、そのエネルギーを吸収することにより電子が励起し、それが基底状態に戻る際に余分なエネルギーを電磁波として放出する性質を有する基を意味する。具体的には、蛍光性基とは、クマリン色素、キサンテン色素、シアニン色素、アクリジン、イソインドール、ダンシル色素、アミノフタル酸ヒドラジド、アミノフタルイミド、アミノナフタルイミド、アミノベンゾフラン、アミノキノリン、ジシアノヒドロキノン等から誘導される基あるいは発光性希土類錯体が挙げられ、クマリン色素、キサンテン色素から誘導される基および発光性希土類錯体が好ましい。
【００２５】
前記発光性希土類錯体としては、例えば、以下の式（ｉｉ）および（ｘｉ）〜式（ｘｘｖｉｉｉ）で表わされる基と、希土類イオンとの錯体が挙げられる。前記希土類イオンとしては、Ｔｂ3+、Ｅｕ3+、Ｄｙ3+、Ｓｍ3+などが挙げられる。
【００２６】
【化６】
【００２７】
【化７】
【００２８】
【化８】
【００２９】
【化９】
【００３０】
式（Ｉ）の化合物において、蛍光性を低下させる消光性基とは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、光誘起電子移動、常磁性の項間交差の増強、デクスター交換カップリングおよび暗色複合体の形成などの励起子カップリングを含むメカニズムにより、蛍光性基の蛍光を消す基である。具体的には、消光性基とは、
【００３１】
【化１０】
【００３２】
ジメチルアミノアゾベンゼン、テトラメチルローダミン、QSYクエンチャー色素(Invitrogen社製)等が挙げられ、ジメチルアミノアゾベンゼンが好ましい。
【００３３】
本発明の化合物において、ＸのためのリンカーＬ1とは、式（Ｉ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物のセファロスポリン骨格とＸとを結びつけるための基または式（ＩＩ）の化合物のペニシリン骨格とＸとを結び付けるための基である。具体的には、Ｌ1は、−（ＣＨ2）n1ＣＯＮＲ2（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1ＮＲ2ＣＯ（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1ＮＲ3ＣＯＮＲ2（ＣＨ2）n2−、−(ＣＨ2)n1ＮＲ3ＣＳＮＲ2（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1ＣＯＮＲ3（ＣＨ2）n3ＣＯＮＲ2（ＣＨ2）n2−，−（ＣＨ2）n1ＣＯＮＲ3（ＣＨ2）n3（ＣＨＲ4）n4ＣＯＮＲ2（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1Ｓ（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1Ｏ（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1ＮＲ2（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1ＣＯ2（ＣＨ2）n2−等が挙げられ、−（ＣＨ2）n1ＣＯＮＲ3（ＣＨ2）n3ＣＯＮＲ2（ＣＨ2）n2−が好ましい。前記式中、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４はそれぞれ、０または１〜５の整数であり、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ、水素原子、低級アルキル基またはフェニル基である。このＸのためのリンカーとは、本発明のタンパク質を蛍光標識する方法における条件下で、切断されないリンカーであれば、その構造は限定されない。
【００３４】
式（Ｉ）の化合物において、ＹのためのリンカーＬ2とは、式（Ｉ）の化合物のセファロスポリン骨格とＹとを結びつけるための基である。さらに、Ｙのためのリンカーとは、式（Ｉ）の化合物のβラクタム環が、変異型βラクタマーゼにより開環され、生じたアシル−酵素中間体におけるビニル基を通じて電子移動が生じ、その結果、Ｙを遊離させるようなリンカーが好ましい。具体的には、Ｌ2は、−ＣＨ2Ｏ（ＣＨ2）n1−、−ＣＨ2Ｓ（ＣＨ2）n1−、−ＣＨ2ＮＲ2（ＣＨ2）n1−、−ＣＨ2Ｎ+Ｒ22（ＣＨ2）n1−、−ＣＨ2ＯＣＯＮＲ2（ＣＨ2）n1−、−ＣＨ2ＯＣＯ（ＣＨ2）n1−、−ＣＨ2ＣＳＮＲ2（ＣＨ2）n1−、−ＣＨ2ＳＣＳＯ（ＣＨ2）n1−、−ＣＨ＝ＣＨ−、
【００３５】
【化１１】
【００３６】
等が挙げられ、
【００３７】
【化１２】
【００３８】
が好ましい。前記式中、ｎ１、ｎ２はそれぞれ、０または１〜５の整数であり、Ｒ2は、水素原子または低級アルキル基である。
【００３９】
本発明の化合物において、セファロスポリン骨格、ペニシリン骨格、Ｘ、Ｙ、Ｌ1およびＬ2は、１か所以上の不斉中心を有することもあり、それゆえ、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物はラセミ体または純粋な立体異性体として存在してもよい。さらに、Ｘ、Ｙ、Ｌ1および／またはＬ2にアルケニル基を含有する場合、シス又はトランス異性体として存在しうる。いずれの場合にも、本発明はそれらの混合物及び各異性体を共に包含するものである。
【００４０】
ただし、式（Ｉ）の化合物において、セファロスポリン骨格は、変異型βラクタマーゼに対して特異性が高まるため、下式に示す立体を有するのが好ましい。
【００４１】
【化１３】
【００４２】
前記式中、Ｌ1、Ｌ2およびＲ1は、式（Ｉ）の化合物において定義したとおりである。
【００４３】
本発明の化合物において、低級アルキル基とは、炭素数１〜６のものが挙げられる。具体的には、低級アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｉ−ペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ｔ−ペンチル基、２−メチルブチル基、ｎ−ヘキシル基、１−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、４−メチルペンチル基、１−エチルブチル基、２−エチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、３，３−ジメチルブチル基、および１−エチル−１−メチルプロピル基などの直鎖状または分岐状のアルキル基を挙げることができ、好適には炭素数１〜３のものが挙げられる。
【００４４】
本発明の化合物において、低級アルキレン基とは、炭素数１〜６のものが挙げられる。具体的には、低級アルキル基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基などの直鎖状または分岐状のアルキル基を挙げることができ、好適には炭素数１〜３のものが挙げられる。
【００４５】
本発明の化合物において、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基とは、例えば、ｔ−ブトキシメチル、アセトキシメチル等が挙げられ、中でもアセトキシメチルが好ましい。
【００４６】
本発明において、式（Ｉ）の化合物の塩、式（ＩＩ）の化合物の塩および式（ＩＩＩ）の化合物の塩は、酸または塩基との塩であってもよい。そのような塩としては、例えばナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などの無機塩基との塩、及びトリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンアミンなどの有機アミン塩、及び塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸塩、及びギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸、酒石酸などの有機カルボン酸塩、及びメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などのスルホン酸付加塩、及びアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの塩基性又は酸性アミノ酸といった塩基との塩又は酸付加塩が挙げられる。
【００４７】
本発明において、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物は、溶媒和物の形をとることもありうるが、これも本発明の範囲に含まれる。溶媒和物としては、好ましくは、水和物及びエタノール和物が挙げられる。
【００４８】
本発明の蛍光標識する方法において用いられる式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物は、従来技術における公知文献を参考に自家製造してもよいし、市販で入手してもよい。
【００４９】
本発明の蛍光標識する方法において用いられる、標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質を得ることは、例えば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で融合タンパク質を発現させること、又は、発現した融合タンパク質を単離することを含んでもよい。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、標識対象タンパク質をコードするポリヌクレオチド、変異型βラクタマーゼをコードするポリヌクレオチド等を用い、通常の方法に従い、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを調製することができる。
【００５０】
本発明の第１の蛍光標識する方法において、前記融合タンパク質と、式（Ｉ）の化合物とを反応させる工程は、融合タンパク質を発現する細胞内や生体内で行ってもよく、単離した融合タンパク質を用いてin vitroで行ってもよい。標識をin vitroで行う場合、例えば、緩衝液中（ｐＨ６．８〜７．４）で２０〜３７℃の温度で行ってもよい。
【００５１】
本発明のタンパク質を蛍光標識する方法（第１の蛍光標識する方法）において、融合タンパク質における変異型βラクタマーゼのアミノ酸配列は、
（ｉ）配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質において上記式（Ｉ）で表わされる記化合物のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列、及び、
（ｉｉｉ）配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質において上記式（Ｉ）で表わされる化合物のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列であるのが好ましい。
【００５２】
本発明は、また、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩を含む本発明の第１の蛍光標識する方法に用いるための組成物である。
【００５３】
【化１４】
【００５４】
前記式（Ｉ）中、Ｘは、蛍光性基であり、
Ｙは、消光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｌ2は、Ｙのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基である。
【００５５】
本発明は、また、本発明の第１の蛍光標識する方法に用いるためのプラスミドまたはベクターであって、
前記プラスミドまたはベクターは、標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングするため又は前記融合タンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターであり、
前記プラスミド又はベクターは、
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列の１〜数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記融合タンパク質において前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び、
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、前記融合タンパク質において前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、からなる群から選択される塩基配列を含む。
【００５６】
また、本発明は、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩を含む本発明の方法に用いるための組成物と、本発明の方法に用いるためのプラスミドまたはベクターとを含むタンパク質の蛍光標識方法用キットである。
【００５７】
本発明のタンパク質の蛍光標識方法用キットは、さらに、前記プラスミド又はベクターを導入するための宿主細胞、キットの取り扱い説明書を含むのが好ましい。
【００５８】
本発明の第１の蛍光標識する方法において、前記式（Ｉ）中、Ｘが発光性希土類錯体である場合、蛍光標識された対象タンパク質を時間分解蛍光測定方法により検出するのが好ましい。このような式（Ｉ）の化合物は、Ｘが発光性希土類錯体であるため、発光する蛍光が長寿命である。そうすると、生体内で自家蛍光として観測される寿命が短い蛍光（リボフラビンやＮＡＤＨなど内在性蛍光物質に由来する蛍光）を排除し、対象タンパク質を高いＳ／Ｎ比で高感度に検出することができる。
【００５９】
本発明の第１の蛍光標識する方法、組成物、およびキットにおいて、Ｘがクマリンから誘導される下記式（ｉ）に示す基：
【００６０】
【化１５】
【００６１】
であり、Ｙが
【００６２】
【化１６】
【００６３】
であり、Ｌ1が−（ＣＨ2）n1ＣＯＮＲ3（ＣＨ2）n3ＣＯＮＲ2（ＣＨ2）n2−であり、Ｌ2が、
【００６４】
【化１７】
【００６５】
または−ＣＨ＝ＣＨ−である式（Ｉ）の化合物が好ましく、
以下の式で表わされる化合物ＣＣＤがさらに好ましい。
【００６６】
【化１８】
【００６７】
また、本発明は、一般式（Ｉ’）で表わされる化合物（以下、「式（Ｉ’）の化合物」と呼ぶ）またはその塩である。
【００６８】
【化１９】
【００６９】
前記式（Ｉ）中、Ｘは、蛍光性基、好ましくはクマリン色素、キサンテン色素から誘導される基であり、
Ｙは、消光性基、好ましくはジメチルアミノアゾベンゼンであり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカー、好ましくは−（ＣＨ2）n1ＣＯＮＲ3（ＣＨ2）n3ＣＯＮＲ2（ＣＨ2）n2−であり、
Ｌ2’は、
【００７０】
【化２０】
【００７１】
（前記式中、ｎ１、ｎ２はそれぞれ、０または１〜５の整数であり、
Ｒ2は、水素原子または低級アルキル基である）
または−ＣＨ＝ＣＨ−
で表わされる、Ｙのためのリンカー、好ましくは
【００７２】
【化２１】
【００７３】
であり、
Ｒ1は、Ｈまたは低級アルキル基である。
【００７４】
式（Ｉ’）の化合物は、下記式で表わされる保護基で保護されたセファロスポリン誘導体を出発原料とし、従来技術における公知文献および化合物ＣＣＤの製造方法を参考にすることにより、製造することができる。
【００７５】
【化２２】
【００７６】
前記式中、ＰｒｏおよびＰｒｏ’は、それぞれ、保護基を意味し、Ｈａｌは、ハロゲン原子を意味する。
【００７７】
また、本発明は、タンパク質を蛍光標識する方法であって、
標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質を得ること、および前記融合タンパク質と下記式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは下記式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含み、前記変異型βラクタマーゼは、前記式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは下記式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なタンパク質である、タンパク質の蛍光標識方法である（以下、「第２の蛍光標識する方法」と呼ぶことがある)。
【００７８】
【化２３】
【００７９】
前記式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）中、
Ｘは、蛍光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基であり、
Ｒ4は、Ｈまたは低級アルキルである。
【００８０】
前記のように、前記融合タンパク質と下記式（ＩＩ）の化合物もしくは下記式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩とを反応させると、融合タンパク質の変異型β−ラクタマーゼは、式（ＩＩ）の化合物または式（ＩＩＩ）の化合物のβラクタム環を求核攻撃し、βラクタム環を開環させる。開環後、βラクタム間と式（ＩＩ）の化合物または式（ＩＩＩ）の化合物との付加体は加水分解されないため、変異型β−ラクタマーゼは式（ＩＩ）の化合物または式（ＩＩＩ）の化合物で蛍光標識されることになる。この方法によれば、変異型β−ラクタマーゼを選択的に蛍光標識できるという利点がある。β−ラクタマーゼは細菌酵素であり、哺乳類動物細胞中には存在しない。そのため、この方法によれば、哺乳類動物細胞中の内在性タンパク質をラベル化する恐れは無いという利点がある。
【００８１】
前記第２の蛍光標識する方法において用いられる式（ＩＩ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物は、前記のようにＸが、蛍光性基であり、Ｌ1が、Ｘのためのリンカーであり、Ｒ1が、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基であり、Ｒ4が、Ｈまたは低級アルキルである。前記蛍光性基、Ｘのためのリンカー、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基および低級アルキル基については、式（Ｉ）の化合物について前記したとおりである。
【００８２】
本発明の第２の蛍光標識する方法において用いられる、標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質を得ることは、例えば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で融合タンパク質を発現させること、又は、発現した融合タンパク質を単離することを含んでもよい。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、標識対象タンパク質をコードするポリヌクレオチド、変異型βラクタマーゼをコードするポリヌクレオチド等を用い、通常の方法に従い、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを調製することができる。
【００８３】
本発明の第２の蛍光標識する方法において、前記融合タンパク質と、式（ＩＩ）の化合物または式（ＩＩＩ）の化合物とを反応させる工程は、融合タンパク質を発現する細胞内や生体内で行ってもよく、単離した融合タンパク質を用いてin vitroで行ってもよい。標識をin vitroで行う場合、例えば、緩衝液中（ｐＨ６．８〜７．４）で２０〜３７℃の温度で行ってもよい。
【００８４】
本発明の第２の蛍光標識する方法において、前記融合タンパク質における前記変異型βラクタマーゼのアミノ酸配列は、
（ｉ）配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質において上記式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列、及び、
（ｉｉｉ）配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質において上記式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列であるのが好ましい。
【００８５】
本発明の第２の蛍光標識する方法は、変異型β−ラクタマーゼを利用する。β−ラクタマーゼは細菌酵素であり、哺乳類細胞中には存在しないため、内在性タンパク質をラベル化することは無い。従って、本発明のタンパク質を蛍光標識する方法は、内在性タンパク質ではなく対象タンパク質を選択的にラベル化することができる。
【００８６】
本発明の第２の蛍光標識する方法において、前記式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）中、Ｘが発光性希土類錯体である場合、蛍光標識された対象タンパク質を時間分解蛍光測定方法により検出することが可能である。このような式（ＩＩ）の化合物または式（ＩＩＩ）の化合物は、Ｘが発光性希土類錯体であるため、発光する蛍光が長寿命である。そうすると、生体内で自家蛍光として観測される寿命が短い蛍光（リボフラビンやＮＡＤＨなど内在性蛍光物質に由来する蛍光）を排除し、対象タンパク質を高いＳ／Ｎ比で高感度に検出することができる。
【００８７】
本発明は、また、前記式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは下記式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩を含む本発明の方法に用いるための組成物である。
【００８８】
【化２４】
【００８９】
前記式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）中、
Ｘは、蛍光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基であり、
Ｒ4は、Ｈまたは低級アルキルである。
【００９０】
本発明は、または、本発明の第２の蛍光標識する方法に用いるためのプラスミドまたはベクターであって、
前記プラスミドまたはベクターは、標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングするため又は前記融合タンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターであり、
前記プラスミド又はベクターは、
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列の１〜数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記融合タンパク質において式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び、
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、前記融合タンパク質において式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、からなる群から選択される塩基配列を含む。
【００９１】
また、本発明は、前記式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは下記式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩を含む本発明の方法に用いるための組成物と、本発明の方法に用いるためのプラスミドまたはベクターとを含むタンパク質の蛍光標識方法用キットである。
【００９２】
本発明のタンパク質の蛍光標識方法用キットは、さらに、前記プラスミド又はベクターを導入するための宿主細胞、キットの取り扱い説明書を含むのが好ましい。
【００９３】
本発明の第２の蛍光標識する方法、組成物、およびキットにおいて、一般式（ＩＩ）で表わされる化合物としては、Ｘが下記式（ｉ）に示す基または式（ｉｉ）に示す基と希土類イオンとの錯体：
【００９４】
【化２５】
【００９５】
であり、Ｌ1が−（ＣＨ2）n1ＣＯＮＲ3（ＣＨ2）n3ＣＯＮＲ2（ＣＨ2）n2−または−（ＣＨ2）n1ＣＯＮＲ3（ＣＨ2）n3（ＣＨＲ4）n4ＣＯＮＲ2（ＣＨ2）n2−（前記式中、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４はそれぞれ、０または１〜５の整数であり、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ、水素原子、低級アルキル基またはフェニル基である。）
であり、Ｒ1はＨである化合物が好ましく、下記化合物ＣＡおよび下記化合物ｃｓＤＡｍに希土類イオンが錯体を形成した化合物がより好ましい。
【００９６】
【化２６】
【００９７】
また、本発明は、一般式（ＩＩ’）で表わされる化合物またはその塩である。
【００９８】
【化２７】
【００９９】
前記式（ＩＩ’）中、
Ｘ’は、発光性希土類錯体であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基である。
【０１００】
一般式（ＩＩ’）で表わされる化合物としては、Ｘが下記式（ｉｉ）に示す基と希土類イオンとの錯体：
【０１０１】
【化２８】
【０１０２】
であり、Ｌ1が−（ＣＨ2）n1ＣＯＮＲ3（ＣＨ2）n3ＣＯＮＲ2（ＣＨ2）n2−または−（ＣＨ2）n1ＣＯＮＲ3（ＣＨ2）n3（ＣＨＲ4）n4ＣＯＮＲ2（ＣＨ2）n2−（前記式中、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４はそれぞれ、０または１〜５の整数であり、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ、水素原子、低級アルキル基またはフェニル基である。）
であり、Ｒ1はＨである化合物が好ましく、下記化合物ｃｓＤＡｍに希土類イオンが錯体を形成した化合物がより好ましい。
【０１０３】
【化２９】
【０１０４】
式（ＩＩ）および式（ＩＩ’）の化合物は、下記式で表わされる保護基で保護されたペニシリン誘導体を出発原料とし、従来技術における公知文献および化合物ＣＡの製造方法を参考にすることにより、製造することができる。
【０１０５】
【化３０】
【０１０６】
前記式中、Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基である。
【０１０７】
［実施例］
本明細書の記載において、以下の略語を使用する。
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＷＳＣＤ：水溶性カルボジイミド：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
Ａｒ：アルゴン
ＴＥＡ：トリエチルアミン
ＢＯＣ：ｔ−ブトキシオキシカルボニル
［化合物および機器］
化合物は、入手できる最も高いグレードのものであり、東京化成工業株式会社、和光純薬工業株式会社、およびシグマ−アルドリッチジャパン株式会社から購入して、さらなる精製を行わずに用いた。７−アミノ−３−クロロメチル−３−セフェム−４−カルボン酸 ｐ−メトキシベンジル エステル 塩酸塩（ＡＣＬＥ・ＨＣｌ）は、大塚化学株式会社から購入した。制限エンドヌクレアーゼおよびPrimeSTAR（登録商標）ＨＳ ＤＮＡ ポリメラーゼは、タカラバイオ株式会社から購入した。カナマイシンおよび無機塩は、和光純薬工業株式会社またはナカライテスク株式会社から購入した。プラスミドDNAは、QIAprep Spin Miniprep kit（商品名）(株式会社キアゲン)を用いて単離した。
【０１０８】
XL10-Gold(ストラタジーン社)を特定部位の突然変異誘発実験の中間ホストとして用いた。E. coli BL21(DE3)(ノバジェン社)を標的遺伝子発現のホストとして用いた。ルリア−ベルターニ（Luria-Bertani）(LB)培地またはTerrific Broth (TB)を全ての菌株用成長培地として用いた。Bacto Agar (和光純薬工業株式会社)を固体培地の調製用に１．５％までの濃度で用いた。
【０１０９】
ＮＭＲスペクトルは、1Ｈ用には４００ＭＨｚで、13ＮＭＲ用には１００．４ＭＨｚで、テトラメチルシランを内部標準として用い、ＪＥＯＬ ＪＮＭ−ＡＬ４００装置で測定した。質量スペクトル（ＦＡＢ）は、ＪＥＯＬ ＪＭＳ−７００で測定した。ＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳは、Waters LCT-Premier XE（日本ウォーターズ株式会社）で測定した。MALDI-TOF MSは、Applied Biosystems Voyager RP（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）で測定した。ＵＶ−可視吸収スペクトルは、紫外可視分光光度計ＵＶ１６５０ＰＣスペクトロメーター（株式会社島津製作所）を用いて測定した。蛍光スペクトルは、日立分光蛍光光度計Ｆ−４５００を用いて測定した。スリット幅は励起および放射の両方について２．５ｎｍであった。光電子増倍管電圧は７００Ｖであった。全てのプローブは蛍光測定前に（生化学用グレード、和光純薬工業株式会社）に溶解させた。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、ＢＷ−３００（富士シリシア化学株式会社）を用いて行った。
【０１１０】
［参考例：化合物ＣＡの合成］
（１）化合物（１１）の合成
【０１１１】
【化３１】
【０１１２】
２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド（３．０ｇ，２２ｍｍｏｌ）およびジエチルマロネート（４．２ｇ，２６ｍｍｏｌ）を無水ＥｔＯＨ（３０ｍＬ）に溶解させ、ついでピペリジン（３７０ｍｇ，４．３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１２時間還流加熱し、ついで氷浴中で冷却した。析出物を集め、冷ＥｔＯＨで洗浄して化合物（１１）を得た（２．５ｇ，収率４９％）。
【０１１３】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.29 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 4.28 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 6.69 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.85 (dd, J = 1.8, 8.7 Hz), 7.74 (d, J = 8.7 Hz. 1H), 8.67 (s, 1H), 11.1 (brs, 1H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 15.2, 61.9, 102.9, 111.5, 113.1, 115.1, 133.1, 150.4, 157.5, 158.1, 164.0, 165.2;
HRMS (ESI+) m/z: 257.0406 (計算値[M+H]+: 257.0426)。
【０１１４】
（２）化合物（１２）の合成
【０１１５】
【化３２】
【０１１６】
化合物（１１）（０．３９ｇ，１．６ｍｍｏｌ）を２Ｎ ＮａＯＨ水溶液（５ｍＬ）に溶解させ、室温で１２時間攪拌した。その混合物を２Ｎ ＨＣｌ水溶液で酸性にした。ついで析出物を集め、水で洗浄して化合物（１２）を得た（０．２９ｇ，収率８７％）。
【０１１７】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 6.74 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.84 (dd, J = 2.1, 8.7 Hz, 1H), 7.74 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.68 (s, 1H), 11.1 (brs, 1H), 12.8 (brs, 1H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 102.4, 111.7, 113.6, 115.1, 133.1, 150.5, 158.1, 158.6, 165.0, 165.3;
HRMS (ESI+) m/z: 206.0215 (計算値[M+H]+: 206.0220)。
【０１１８】
（３）化合物（１３）の合成
【０１１９】
【化３３】
【０１２０】
化合物（１２）（０．２５ｇ，１．２ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．２１ｇ，１．８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させ、ついでＷＳＣＤ・ＨＣｌ（０．３５ｇ，１．８ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。その混合物を０℃で３時間Ａｒ雰囲気下で攪拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、１０％クエン酸水溶液、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。蒸発させて化合物（１３）を得た（０．２４ｇ，収率６６％）。
【０１２１】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.91 (s, 4H), 6.77 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.89 (dd, J = 1.8, 8.7 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 9.00 (s, 1H), 11.4 (brs, 1H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 102.4, 111.7, 113.6, 115.1, 133.1, 150.5, 158.1, 158.6, 165.0, 165.3;
HRMS (ESI+) m/z: 326.0263 (計算値[M+H]+: 326.0277)。
【０１２２】
（４）化合物ＣＡの合成
【０１２３】
【化３４】
【０１２４】
アンピシリン（０．３５ｇ，０．９９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解させ、ついでジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（１滴）および化合物（１３）（０．２０ｇ，０．６６ｍｍｏｌ）をそこへ０℃で添加した。その混合物を１０時間攪拌した。ついで１０％クエン酸水溶液を添加し、その混合物を酢酸エチルで抽出した。有機相を１０％クエン酸水溶液および水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。蒸発させて、化合物ＣＡ（クマリニルアンピシリン）を得た（０．３１ｇ，収率８８％）。
【０１２５】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ1.41 (s, 3H), 1.55 (s, 3H), 4.21 (s, 1H), 5.40 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.56 (dd, J = 3.0 Hz, 7.7 Hz, 1H), 5.92 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.83 (s, 1H), 6.88 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.35 (m, 7H), 7.83 (d, J = 8.43 Hz, 2H), 9.38 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 9.62 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 11.1 (s, 1H), 13.4 (brs, 1H).
【実施例１】
【０１２６】
化合物ＣＣＤの合成
（１）化合物（1）の合成
【０１２７】
【化３５】
【０１２８】
７−アミノ−３−クロロメチル−３−セフェム−４−カルボン酸ｐ−メトキシベンジルエステル塩酸塩（ＡＣＬＥ・ＨＣｌ）（１．０ｇ，２．５ｍｍｏｌ）、ＢＯＣ−グリシン（４８０ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ一水和物（７６０ｍｇ，４．９ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させ、その後トリエチルアミン（２５０ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）およびＷＳＣＤ・ＨＣｌ（５７０ｍｇ，３．０ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。その混合物を０℃で６時間Ａｒ雰囲気下で攪拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液、１０％クエン酸水溶液および水で洗浄し、その後、硫酸ナトリウムで乾燥した。蒸発させた後、残渣をヘキサン／酢酸エチル（１：１）で溶出してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物（１）を得た（１．２５ｇ，収率９６％）。
【０１２９】
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.46 (s, 9H), 3.48 (d, J = 18.4 Hz, 1H), 3.65 (d, J = 18.4 Hz, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.83 (m, 2H), 4.43 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.54 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.97 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 5.23 (s, 2H), 5.84 (dd, J = 5.2 Hz, 8.8 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8.8 Hz, 2H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 27.1, 28.2, 43.2, 44.1, 55.2, 57.5, 58.9, 68.2, 80.5, 113.9, 125.5, 126.2, 126.6, 130.6, 156.0, 159.9, 161.1, 164.6, 170.2, 171.2;
HRMS (FAB+) m/z: 526.1426 (計算値[M+H]+: 526.1415)。
【０１３０】
（２）化合物（２）の合成
【０１３１】
【化３６】
【０１３２】
化合物（１）（５６０ｍｇ，１．１ｍｍｏｌ）およびヨウ化ナトリウム（１．６ｇ，１１ｍｍｏｌ）のアセトン中混合物を、室温で１時間攪拌した。反応混合物を減圧下に濃縮し、酢酸エチルで希釈した。有機相を水で洗浄し、その後硫酸ナトリウムで乾燥した。得られたヨウ素誘導体（淡オレンジ色の非晶質）を精製なしに次の反応に用いた。ヨウ素誘導体（４００ｍｇ，０．６５ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶解させ、次いでＮａＨＣＯ3（８０ｍｇ，０．９５ｍｍｏｌ）を添加した。そこへ、ｐ−アミノチオフェノール（１２０ｍｇ，０．９５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液を滴下して加えた。得られた混合物を室温でＡｒ雰囲気下、５時間攪拌した。その混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液、１０％クエン酸水溶液および水で洗浄し、その後硫酸ナトリウムで乾燥した。蒸発させた後、残渣をヘキサン／酢酸エチル（１：１）で溶出してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物（２）を得た（２６０ｍｇ，収率５４％（２工程））。
【０１３３】
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ1.46 (s, 9H), 3.33 (d, J = 18.0 Hz, 1H), 3.59 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 3.67 (d, J = 18.0 Hz, 1H), 3.75 (brs, 2H), 3.81 (s, 3H), 3.84 (m, 2H), 4.17 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 4.87 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 4.98 (d, J = 11.7 Hz, 1H),5.07 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 5.17 (brs, 1H), 5.84 (dd, J = 4.9 Hz, 8.8 Hz, 1H), 6.53 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.89 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.04 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.15 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.30 (d, J = 8.8 Hz, 2H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 28.3, 28.6, 39.2, 44.3, 55.3, 57.5, 58.7, 67.6, 80.6, 113.9, 115.5, 120.6, 124.0, 127.0, 130.6, 130.7, 136.0, 147.1, 156.0, 159.8, 161.4, 164.4, 170.0;
HRMS (FAB+) m/z: 615.1940 (計算値[M+H]+: 615.1947)。
【０１３４】
（３）化合物（３）の合成
【０１３５】
【化３７】
【０１３６】
化合物（２）（２７０ｍｇ，０．４４ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノアゾベンゼン−４’−カルボン酸（１３０ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ）を、ピリジン（５ｍＬ）に溶解させ、ついでＰＯＣｌ3（７４ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ）を−２０℃で５分間にわたって滴下して加えた。その混合物を−２０℃で２０分間、Ａｒ雰囲気下で攪拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液、１０％クエン酸水溶液および水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。蒸発させた後、残渣をＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2（０％→１％）で溶出してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物（３）を得た（７６ｍｇ，収率２０％）。
【０１３７】
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.45 (s, 9H), 3.11 (s, 6H), 3.40 (d, J = 18.0 Hz, 1H ), 3.63 (d, J = 18.0 Hz, 1H), 3.80 (m, 3H), 4.15 (d, J = 13.3 Hz, 1H), 4.86 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 5.04 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 5.08 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 5.24 (brs, 1H), 5.71 (dd, J = 4.8 Hz, 9.0 Hz, 1H), 6.76 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.82 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.09 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.92 (m, 6H), 8.03 (brs, 1H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 28.3, 28.3, 38.0, 40.3, 44.3, 55.2, 57.5, 58.8, 67.7, 80.6, 111.5, 113.9, 120.6, 122.4, 124.4, 125.5, 126.9, 128.1, 128.4, 129.4, 130.6, 134.3, 134.4, 138.1, 143.6, 152.9, 155.4, 156.0, 159.8, 161.4, 164.3, 165.2, 170.0;
HRMS (FAB+) m/z: 866.3000 (計算値[M+H]+: 866.3006)。
【０１３８】
（４）化合物（４）の合成
【０１３９】
【化３８】
【０１４０】
化合物（３）（４０ｍｇ，46μmol)を無水ＣＨ2Ｃｌ2（４ｍＬ）に溶解させ、チオアニソール（８００μＬ）とトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（２．４ｍＬ）を０℃で添加した。その混合物を０℃で４時間攪拌し、ついで、冷ジエチルエーテル（１５ｍＬ）へ加えた。析出物を集め、ジエチルエーテルで洗浄して化合物（４）（トリフルオロ酢酸塩）を得た（３６ｍｇ，定量的）。
【０１４１】
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ3.12 (s, 6H), 3.55 (d, J = 17.6 Hz, 1H), 3.76 (m, 3H), 3.93 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 4.33 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 5.06 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 5.72 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 9.3 Hz, 2H), 7.45 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.70 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.88 (t, J = 9.3 Hz, 4H), 8.04 (d, J = 9.3 Hz, 2H);
13C NMR (100 MHz, DMF-d7) δ 28.4, 35.8, 40.2, 41.6, 58.4, 59.9, 112.3, 121.3, 121.4, 122.4, 125.9, 126.0, 129.5, 129.7, 132.2, 133.1, 135.9, 140.0, 143.9, 154.0, 155.5, 162.9, 163.8, 165.0, 165.8, 167.9;
HRMS (FAB+) m/z: 646.1915 (計算値[M+H]+: 646.1906)。
【０１４２】
（５）化合物CCDの合成
【０１４３】
【化３９】
【０１４４】
化合物（４）（１０ｍｇ，１３μｍｏｌ）をＤＭＦ（５００μＬ）に溶解させ、その後、トリエチルアミン（ＴＥＡ）（１滴）および化合物（１３）（４．４ｍｇ，１５μｍｏｌ）を室温で添加した。その混合物を１時間攪拌し、ついで溶媒を蒸発させ、１００ｍＭのギ酸アンモニウム水溶液（１５ｍＬ）を添加した。析出物を集め、１００ｍＭギ酸アンモニウム水溶液と水で洗浄して、化合物ＣＣＤを得た（１０ｍｇ，収率９１％）。
【０１４５】
1H NMR (400 MHz, DMF-d7) δ 3.13 (s, 6H), 3.61 (d, J = 18.1 Hz, 1H), 3.83 (d, J = 18.1 Hz, 1H), 4.02 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 4.27 (d, J = 3.9 Hz, 2H), 4.34 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 5.20 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 5.83 (dd, J = 4.9 Hz, 8.8 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 9.3 Hz, 2H), 6.97 (dd, J = 2.4 Hz, 8.8 Hz, 1H), 7.47 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.90 (m, 7H), 8.20 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 8.84 (s, 1H), 9.01 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 9.18 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 10.5 (s, 1H), 11.5 (brs, 1H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 27.3, 36.9, 39.8, 42.3, 57.7, 58.8, 101.8, 111.0, 111.6, 113.1, 114.4, 120.8, 121.6, 125.2, 128.9, 129.0 (two carbons), 129.6, 131.6, 132.1, 134.9, 138.4, 142.7, 148.3, 152.9, 154.3, 156.4, 160.9, 161.6, 163.0, 163.9, 164.2, 164.9, 169.2;
HRMS (FAB+) m/z: 834.2010 (計算値[M+H]+: 834.2016).
［プラスミドと点変異］
Omp-A WT（野生株）TEM-1ベクターS1（Thomas, V. L.; Golemi-Kotra, D.; Kim, C.; Vakulenko, S. B.; Mobashery, S.; Shoichet, B. K. Biochemistry. 2005, 44, 9330−9338参照）は、S. Mobashery 教授(Georgia Institute of Technology)から提供を受けた。Omp-A WT TEM-1における点変異は、QuikChange（登録商標） Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用い、製造者のプロコールに従い、配列番号９および１０の変異原性プライマーを用いることで目的プラスミドｐＥＴ−２４ａ（＋）−Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１を得た。得られたｐＥＴ−２４ａ（＋）−Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１（ＴＥＭ−１の１６６位のＧｌｕをＡｓｎに置き換えた）を含む点変異二本鎖プラスミドDNAの配列決定は、Sequenase DNA sequencing kit (BigDye Terminator version 3.1; Applied Biosystems)と、製造者のプロトコールによるオーダーメードの内部プライマーを用いて行った。
【０１４６】
［変異型ＴＥＭ−１ βラクタマーゼの精製］
２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを追加したＬＢ培地中の大腸菌Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）において、Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１を含む点変異二本鎖プラスミドを一晩、培養した。酵素精製のため、その培養物を、２０μｇ／ｍＬのカナマイシン、５００ｍＭのソルビトールおよび２．５ｍＭのベタインを追加したTerrific Broth で１００倍に希釈した。６００ｎｍで培養物の光学濃度が０．６に達するまで、３７℃で振とう（２６０〜２８０ｒｐｍ）して４〜５時間インキュベーションした後、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．４ｍＭまで添加し、その培養物を２５℃で一晩攪拌した。細胞を遠心分離によりペレット化し、酵素を含む上澄み液をVivaspin(膜分子量カットオフ, 10,000; Vivascience)により濃縮して、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．０）に置き換えた。濃縮したタンパク質を同じ緩衝液で平衡にしたＤＥＡＥセファデックスカラムにロードした。酵素をグラジェント溶出液（１０〜１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ 緩衝液）を用いて変異型ＴＥＭ−１ βラクタマーゼを溶出させた。
【０１４７】
［タンパク質ラベルのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる検出］
ＷＴ（野生株）ＴＥＭ−１ βラクタマーゼまたはＥ１６６Ｎ ＴＥＭ−１ βラクタマーゼ（２０μＭ）を２５℃で、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中の化合物ＣＡ（３０μＭ）溶液または化合物ＣＣＤ（３０μＭ）溶液に添加した。３０分後、蛍光ラベル化されたタンパク質と蛍光ラベル化されていないタンパク質を、SDS gel loading buffer （１％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％メルカプトエタノール、ｐＨ６．８）中に溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。電気泳動の後、ゲルの蛍光画像を、ＵＶランプにより３６５ｎｍの蛍光下、デジタルカメラで撮影した。蛍光画像を撮影した後、ゲルをCoomassie Brilliant Blueで染色し、その後、染色したゲル画像を撮影した。得られた結果を、図１および図２に示す。図１（a）は、Ｅ１６６ＮＴＥＭ−１をＣＡでラベル化した場合の蛍光画像（ｉ）とゲル染色画像（ｉｉ）を、図１（ｂ）はＥ１６６ＮＴＥＭ−１をＣＣＤでラベル化した場合の蛍光画像（ｉ）とゲル染色画像（ｉｉ）を示す。また、化合物ＣＡ（３０μＭ）または化合物ＣＣＤ（３０μＭ）のみを、SDS gel loading buffer （１％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％メルカプトエタノール、ｐＨ６．８）中に溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。電気泳動の後、ゲルの蛍光画像を、ＵＶランプにより３６５ｎｍの蛍光下、デジタルカメラで撮影した。得られた蛍光画像は、化合物ＣＡについては図１（ａ）（ｉｉｉ）に、化合物ＣＣＤについては図１（ｂ）（ｉｉｉ）に示す。
【０１４８】
また、図２（ａ）は、ＷＴＴＥＭ−１にＣＡを加えた場合の蛍光画像（左）とゲル染色画像（右）を、図２（ｂ）は、ＷＴＴＥＭ−１にＣＣＤを加えた場合の蛍光画像（左）とゲル染色画像（右）を示す。
【０１４９】
図１に示すように、化合物ＣＣＤが存在する場合または化合物ＣＡが存在する場合、Ｅ１６６ＮＴＥＭ−１がラベル化されていることが確認できた。また、Ｅ１６６ＮＴＥＭ−１を化合物ＣＡでラベル化した場合、ラベル化タンパク質由来のバンド以外に、未反応プローブと緩衝液中で自動的に加水分解を受けたプローブ由来のバンドが確認できた。一方、Ｅ１６６ＮＴＥＭ−１を化合物ＣＣＤでラベル化した場合、ラベル化タンパク質以外の蛍光は殆ど確認できなかった。従って、ＣＣＤによるＥ１６６ＮＴＥＭ−１のラベル化はＣＡと比較して、未反応プローブなどのバックグラウンドが非常に小さいことが確認できた
図２に示すように、ＷＴＴＥＭ−１に化合物ＣＡとＣＣＤを反応させた場合、両化合物ともＷＴＴＥＭ−１によって加水分解を受けることが確認できた。
【０１５０】
［蛍光分光］
蛍光プローブを全てジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解させて１０ｍＭストック溶液を調製した。プローブの相対的蛍光量子収率は、１００ ｍＭ ＨＥＰＥＳ 緩衝液（ｐＨ７．４）中のサンプルの修正蛍光スペクトル下面積と、100 ｍＭのＨ2ＳＯ4水溶液中キニン２硫酸塩の修正蛍光スペクトル下面積（文献Dawson, R. W.; Windsor, W. M. J. Phys. Chem. 1968, 72, 3251−3260によれば、量子収率は０．５５である。）とから、推定した。得られた結果を表１に示す。
【０１５１】
【表１】
【０１５２】
［酵素アッセイ］
ＷＴ（野生株）およびＥ１６６Ｎ ＴＥＭ−１の酵素アッセイを１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で室温で行った。精製酵素の溶液（１５μＭ、５μＬ）をＨＥＰＥＳ緩衝液中のプローブ（１μＭ、５００μＬ）に添加した。サンプルを４１０ｎｍで励起させ、４５０ｎｍでの蛍光強度を測定した。ＷＴ（野生株）について得られた４５０ｎｍでの発光スペクトルを図３（ａ）に、４１０ｎｍでの励起スペクトルを図３（ｂ）に示す。Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１について得られた４５０ｎｍでの発光スペクトルを図４（ａ）に、４１０ｎｍでの励起スペクトルを図４（ｂ）に示す。
【０１５３】
図３に示すように、ＷＴ（野生株）βラクタマーゼと化合物ＣＣＤを反応させると、蛍光強度が時間と共に増強していた。一方、図４に示すように、Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１βラクタマーゼと化合物ＣＣＤを反応させると、蛍光強度が時間と共に増強するが、ＷＴ（野生株）βラクタマーゼとの場合と比較して、増強の程度はかなり緩やかであった。従って、Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１βラクタマーゼが、化合物ＣＣＤにより共有結合的に標識されているのに対し、ＷＴ（野生株）βラクタマーゼは、触媒的に加水分解反応が進行しているために、大きく蛍光が増強していることが確認できた。
【０１５４】
［ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析］
ＣＣＤストック溶液（１０ｍＭ、０．２μＬ）を、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中のＥ１６６Ｎ ＴＥＭ−１溶液（１５μＭ、１９．８μＬ）に２５℃で添加した。１６時間後、未反応の化合物ＣＣＤをセファデックスG-50 quick spin column (DNA-グレード; GE Healthcare)を用いて除去した。その後、ＭＳ用サンプルを、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸をマトリックスとして調製した。得られた結果を表２に示す。
【０１５５】
【表２】
【０１５６】
表２に示すように、Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１βラクタマーゼ自体の分子量および化合物ＣＣＤにより蛍光標識されたＥ１６６Ｎ ＴＥＭ−１の分子量が確認できた。従って、これらの物質の構造が確認できた。
【０１５７】
［融合タンパク質ＭＢＰ−Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１の発現および精製］
ＭＢＰのＤＮＡ断片はｐＭＡＬ−ｃ2（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）からＰＣＲにより増幅した後、ＮｄｅＩとＮｈｅＩによって制限酵素処理した。ＭＢＰＤＮＡ断片を同様の制限処理を施したｐＥＴ−２１ｂ（＋）とライゲーションさせることでプラスミドｐＥＴ−２１ｂ（＋）−ＭＢＰを得た。次にｐＥＴ−２４a（＋）−Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１からＥ１６６Ｎ ＴＥＭ−１塩基配列をＰＣＲによって増幅し、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩによって制限酵素処理した。そして同様にＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩによって制限酵素処理を施したｐＥＴ−２１ｂ（＋）−ＭＢＰとライゲーションさせることで、目的プラスミドｐＥＴ−２１ｂ（＋）−ＭＢＰ−Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１を得た。ｐＥＴ−２１ｂ（＋）−ＭＢＰ−Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１は、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを追加したＬＢ培地中のＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）中で、成長細胞培地（ＯＤ600＝０．６〜１．０）へＩＰＴＧ（１００μＭ）添加した後、２５℃で２０時間発現させた。細胞を遠心分離により収穫し、カラム緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中で再懸濁させ、超音波で溶解させた。溶解液をアミロース樹脂カラム(New England Biolabs)に載せ、融合タンパク質を溶出緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのマルトース、ｐＨ７．４）を用いて溶出させた。得られたＭＢＰ−Ｅ１６６ＮＴＥＭ−１（１０μＭ）に哺乳類細胞破砕液とＣＣＤ（３０μＭ）を加え２５℃で、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中で反応させた。４５分後、蛍光ラベル化されたタンパク質と蛍光ラベル化されていないタンパク質を、SDS gel loading buffer （１％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％メルカプトエタノール、ｐＨ６．８）中に溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。電気泳動の後、ゲルの蛍光画像を、ＵＶランプにより３６５ｎｍの蛍光下、デジタルカメラで撮影した。蛍光画像を撮影した後、ゲルをCoomassie Brilliant Blueで染色し、その後、染色したゲル画像を撮影した。得られた結果を、図５に示す。図５は、ＭＢＰ−Ｅ１６６ＮＴＥＭ−１を哺乳類細胞破砕液中ＣＣＤでラベル化した場合の蛍光画像（左）とゲル染色画像（右）を示す。
【０１５８】
図５に示すように、融合タンパク質ＭＢＰ−Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１に哺乳類細胞破砕液を加え、ＣＣＤでラベル化を行ったところ、ＣＣＤは融合タンパク質のみを選択的にラベル化した。この結果からＥ１６６ＮＴＥＭ−１は他のタンパク質と融合しても、その機能を保っていること、また夾雑タンパク質と非特異的に反応しないことが確認できた。
【０１５９】
［化合物ＣＡによる融合タンパク質ＭＢＰ−Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１のラベル化］
前記のようにして得られたＭＢＰ−Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１（１０μＭ）に化合物ＣＡ（３０μＭ）を加え２５℃で、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中で反応させた。４５分後、蛍光ラベル化されたタンパク質と蛍光ラベル化されていないタンパク質を、SDS gel loading buffer （１％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％メルカプトエタノール、ｐＨ６．８）中に溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。電気泳動の後、ＵＶランプにより３６５ｎｍの励起光照射下、ゲルの蛍光画像をデジタルカメラで撮影した。蛍光画像撮影後、ゲルをCoomassie Brilliant Blueで染色し、染色したゲル画像をデジタルカメラで撮影した。得られた結果を、図６に示す。図６は、ＭＢＰ-Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１を化合物ＣＡでラベル化した場合の蛍光画像（左）、ゲル染色画像（右）を示す。
【０１６０】
図６に示すように、化合物ＣＡは変異型βラクタマーゼを選択的に蛍光標識できることが確認できた。
【実施例２】
【０１６１】
［化合物ｃｓＤＡｍの合成］
（１）７−アミノ−４−メチルキノリン−２（１Ｈ）−オン（化合物ｃｓ１２４）の合成
【０１６２】
【化４０】
【０１６３】
１，３−フェニレンジアミン（３．２２ｇ、２９．８ｍｍｏｌ）およびエチルアセトアセテート（３．８ｍＬ，３０．１ｍｍｏｌ）を４８時間１３０℃で還流加熱した。その混合物は徐々に固化した。エタノール（５ｍＬ）をその混合物に添加して粉砕し、ろ過して粗生成物を得た。メタノールを用いてその粗生成物を結晶化し、標題化合物を得た（２．５２ｇ、１４．５ｍｍｏｌ、収率４８．５％、黄色針状結晶。
【０１６４】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ11.1 (s, 1H, 1), 7.33 (d, J = 8.3 Hz, 1H, 4), 6.44 (dd, J = 8.3 Hz, 2.0 Hz, 1H, 5), 6.36 (d, J = 2.0 Hz, 1H, 7), 5.93 (s, 1H, 2), 5.71 (s, 2H, 6, 2.27 (s, 3H, 3);
MS (ESI+) 計算値 C10H11N2O 175.08, 測定値175.08。
【０１６５】
（２）化合物（csDAm）の合成
【０１６６】
【化４１】
【０１６７】
ＤＴＰＡ二無水物（１．０４ｇ、２．９１ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（ＴＥＡ、２７５ｍＬ）をＤＭＦ（２７５ｍＬ）中に溶解させ、そこへ、ＴＥＡ（２ｍＬ）、化合物ｃｓ１２４（０．５７２ｇ、３．２９ｍｍｏｌ）およびアンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ、１．０９ｇ、３．１３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５０ｍｌ）溶液を滴下して加えた。その混合物から減圧下に溶媒を除去した。得られた生成物を逆相ＨＰＬＣにより以下のようにして精製した：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ−３カラム（１０×２５０ｍｍ）に溶液を載せ、３３０ｎｍの波長で検出して、０．１％ ギ酸を含有する１５〜３０％アセトニトリル／Ｈ2Ｏ勾配溶液を４．７２６ｍＬ／分の流速で３０分で溶出した。生成物は、２９．５分に溶出した。
【０１６８】
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.79 (s, 1H, 5), 7.66 (d, J = 8.8 Hz, 1H, 3), 7.50 (d, J = 8.8 Hz, 1H, 4), 7.24~7.34 (m, 6H, 1,16,1718,19,20), 5.48 (s, 1H, 15), 5.46 (d, J = 3.6 Hz, 1H, 22) 5.36 (dd, J = 1.2 Hz, 3.8 Hz, 1H, 21), 4.28 (s, 1H, 25), 3.06~3.73 (m, 28H, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14), 2.42 (s, 3H, 2), 1.47 (s, 3H, 23), 1.39 (s, 3H, 24 );
MS (ESI+) 計算値C40H49N8O13S 881.31, 測定値 881.32,
計算値 C40H50N8O13S 441.16, 測定値 441.16。
【０１６９】
［化合物ｃｓＤＡｍへ希土類イオンを配位させた化合物の製造と蛍光測定］
希土類イオンの配位は０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で化合物ｃｓＤＡｍとＬｎ（ＮＯ3）3・６Ｈ2Ｏ（Ｌｎ＝Ｔｂ，Ｅｕ）がそれぞれ最終濃度が１０μＭになるよう調整し、２５℃で１時間ボルテックスした。測定にはボルテックス後、プローブの最終濃度が１μＭになるよう希釈したものを用いた。ＬｎがＴｂ3+の場合に得られた吸収スペクトルを図７（ａ）に、ＬｎがＥｕ3+の場合に得られた吸収スペクトルを図７（ｂ）に示す。図７（ａ）の拡大図を図７（ｃ）に、図７（ｂ）の拡大図を図７（ｄ）に示す。図７（ａ）〜図７（ｄ）に示すように、吸収スペクトルの３３０ｎｍ付近に化合物ｃｓ１２４の吸収が確認できる。従って、化合物ｃｓＤＡｍへ希土類イオンが配位した化合物の生成が確認できた。
【０１７０】
また、ＬｎがＴｂ3+の場合に得られた励起スペクトルを図８（ａ）に、ＬｎがＥｕ3+の場合に得られた励起スペクトルを図８（ｂ）に示す。図８（ａ）においてλEmは５４６ｎｍ、図８（ｂ）においてλEmは６１５ｎｍである。図８（ａ）に示すように、図７の吸収スペクトルと同様、３３０ｎｍ付近に極大値を有し、この吸収により化合物ｃｓ１２４により希土類イオンが励起されていることが確認できた。また、図８（ｂ）に示すように、図７の吸収スペクトルと同様、３２１ｎｍ付近に極大値を有し、この吸収により化合物ｃｓ１２４により希土類イオンが励起されていることが確認できた。
【０１７１】
［時間分解蛍光スペクトル］
０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で化合物ｃｓＤＡｍとＬｎ（ＮＯ3）3・６Ｈ2Ｏ（Ｌｎ＝Ｔｂ，Ｅｕ）がそれぞれ最終濃度が１０μＭになるよう調整し、２５℃で１時間ボルテックスした。測定にはボルテックス後、プローブの最終濃度が１μＭになるよう希釈したものを用いた。サンプルを３３０ｎｍで励起したときの、定常状態蛍光測定による蛍光スペクトルを図９（ａ）に、時間分解蛍光測定による蛍光スペクトルを図９（ｂ）に示す。その際、Delay timeは６０μｓ、Gate timeは２msで測定した。図９（ａ）に示すように、３４０〜４５０ｎｍ付近に化合物ｃｓ１２４由来のピークが、５００〜６２０ｎｍ付近にテルビウムイオン由来のシャープなピークが確認できた。また、図９（ｂ）に示すように、３５０〜４５０ｎｍ付近の化合物ｃｓ１２４由来のピークは消失し、希土類イオンであるテルビウムイオン由来のピークのみが観測されることが確認できた。なお、５００〜６２０ｎｍ付近にテルビウムイオン由来のシャープなピークは、３４０〜４５０ｎｍ付近に化合物ｃｓ１２４由来のピークと比較して強度が著しく強い。これは、化合物ｃｓ１２４からユーロピウムへのエネルギー移動および発光効率が高いことに由来すると考えられる。
【０１７２】
また、Ｔｂ（ＮＯ3）3・６Ｈ2Ｏの代わりにＥｕ（ＮＯ3）3・６Ｈ2Ｏを用いて、３２１ｎｍで励起させて同様に蛍光スペクトルを測定した。定常状態蛍光測定による蛍光スペクトルを図１０（ａ）に、時間分解蛍光測定による蛍光スペクトルを図１０（ｂ）に示す。その際、Delay timeは６０μｓ、Gate timeは２msで測定した。図１０（ａ）に示すように、３４０〜４５０ｎｍ付近に化合物ｃｓ１２４由来のピークが、５００〜６２０ｎｍ付近にユーロピウムイオン由来のシャープなピークが確認できた。また、図１０（ｂ）に示すように、３５０〜４５０ｎｍ付近の化合物ｃｓ１２４由来のピークは消失し、希土類イオンであるユーロピウムイオン由来のピークのみが観測されることが確認できた。
【０１７３】
［蛍光寿命］
化合物ｃｓＤＡｍ（１ｍＭ、２０μＬ）およびＴｂ（ＮＯ3）3・６Ｈ2Ｏ（１ｍＭ、２０μＬ）をそれぞれの最終濃度が０．５ｍＭになるよう調整し、２５℃で１時間ボルテックスした。測定にはボルテックス後、プローブの最終濃度が１μＭになるよう希釈したものを用いた。サンプルを３３０ｎｍで励起し、５４６ｎｍでの蛍光寿命を測定した。その結果を図１１（ａ）に示す。また、Ｔｂ（ＮＯ3）3・６Ｈ2Ｏの代わりにＥｕ（ＮＯ3）3・６Ｈ2Ｏを用いて、３２１ｎｍで励起し、６１５ｎｍでの蛍光寿命を測定した。その結果を図１１（ｂ）に示す。図１１（ａ）からＬｎがＴｂの場合の蛍光寿命が１．４６ｍｓ、図１１（ｂ）からＬｎがＥｕの場合の蛍光寿命が０．５８７ｍｓであることが確認できた。すなわち、ＬｎがＴｂまたはＥｕの場合、ｍｓオーダーの長い蛍光寿命を有することが確認できた。
【０１７４】
［タンパク質ラベルのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる検出］
ＷＴ（野生株）ＴＥＭ−１ βラクタマーゼまたはＥ１６６Ｎ ＴＥＭ−１ βラクタマーゼ、化合物ｃｓＤＡｍおよびＬｎ（ＮＯ3）3・６Ｈ2Ｏの最終濃度が、それぞれ２７．５μＭ、５５．０μＭおよび１８．３μＭとなるように、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中のＷＴ（野生株）ＴＥＭ−１ βラクタマーゼまたはＥ１６６Ｎ ＴＥＭ−１ βラクタマーゼを２５℃で、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中の化合物ｃｓＤＡｍ溶液および１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中のＬｎ（ＮＯ3）3・６Ｈ2Ｏ溶液に添加して反応溶液を作製した。反応溶液を２５℃で６０分間インキュベーションし、次いで、SDS gel loading buffer （１％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％メルカプトエタノール、ｐＨ６．８）中に溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。電気泳動の後、ゲルの蛍光画像を、ＵＶランプにより３６５ｎｍの蛍光下、デジタルカメラで撮影した。蛍光画像を撮影した後、ゲルをCoomassie Brilliant Blueで染色し、その後、染色したゲル画像を撮影した。得られた結果を、図１２および図１３に示す。図１２は、Ｅ１６６ＮＴＥＭ−１をＬｎで配位された化合物ｃｓＤＡｍでラベル化した場合の蛍光画像（左の４レーン）とゲル染色画像（右の４レーン）を、図１３はＷＴ（野生株）ＴＥＭ−１をＬｎで配位された化合物ｃｓＤＡｍでラベル化した場合の蛍光画像（左の２レーン）とゲル染色画像（右の２レーン）を示す。
【０１７５】
図１２における各レーン中のサンプルは以下の表３に示すように成分を混合して作製した。
【０１７６】
【表３】
【０１７７】
図１３における各レーン中のサンプルは以下の表４に示すように成分を混合して作製した。
【０１７８】
【表４】
【０１７９】
図１２に示すように、タグタンパク質となるβ−ラクタマーゼの分子量である２９ｋＤａ付近に、レーン１ではＴｂイオン由来の緑色、レーン２ではＥｕイオン由来の赤色の蛍光が確認できた。このことから、Ｌｎが配位した化合物ｃｓＤＡｍがβ−ラクタマーゼにラベル化していることが確認できた。また、レーン１および２においては、１５ｋＤａ付近にも緑色の蛍光が見られるが、これは遊離のＴｂが配位した化合物[ｃｓＤＡｍ−Ｔｂ]の蛍光であると考えられる。なお、Ｅｕが配位した化合物[ｃｓＤＡｍ−Ｅｕ］は蛍光強度がＴｂが配位した化合物[ｃｓＤＡｍ−Ｔｂ]に比べて弱いため、遊離のＥｕで配位した化合物[ｃｓＤＡｍ−Ｅｕ]由来の蛍光は見られない。
【０１８０】
図１３に示すように、ＷＴのβ-ラクタマーゼにはＴｂが配位した化合物[ｃｓＤＡｍ−Ｔｂ]およびＥｕが配位した化合物[ｃｓＤＡｍ−Ｅｕ］のいずれによってもラベル化されていないことが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１８１】
本発明のタンパク質を蛍光標識する方法は、細胞イメージング等に適用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１８２】
配列番号１ Ｅ１６６Ｎ ＴＥＭ−１のアミノ酸配列
配列番号２ Ｅ１６６Ａ ＴＥＭ−１のアミノ酸配列
配列番号３ Ｅ１６６Ｄ ＴＥＭ−１のアミノ酸配列
配列番号４ Ｅ１６６Ｑ ＴＥＭ−１のアミノ酸配列
配列番号５ Ｅ１６６Ｄ ＴＥＭ−１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号６ Ｅ１６６Ａ ＴＥＭ−１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号７ Ｅ１６６Ｄ ＴＥＭ−１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号８ Ｅ１６６Ｑ ＴＥＭ−１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号９ 変異原性プライマー
配列番号１０ 変異原性プライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を蛍光標識する方法であって、
標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質を得ること、および前記融合タンパク質と下記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含み、
前記変異型βラクタマーゼは、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なタンパク質である、タンパク質の蛍光標識方法。
【化４２】
前記式（Ｉ）中、Ｘは、蛍光性基であり、
Ｙは、消光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｌ2は、Ｙのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基である。
【請求項２】
前記融合タンパク質における前記変異型βラクタマーゼのアミノ酸配列が、
配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列、
配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質において上記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列、及び、
配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質において上記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列である、請求項１記載のタンパク質の蛍光標識方法。
【請求項３】
前記融合タンパク質を得ることが、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、前記融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で前記融合タンパク質を発現させること、又は、発現した前記融合タンパク質を単離することを含む、請求項１又は２記載のタンパク質の蛍光標識方法。
【請求項４】
前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩を含む請求項１〜３のいずれかの方法に用いるための組成物。
【化４３】
前記式（Ｉ）中、Ｘは、蛍光性基であり、
Ｙは、消光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｌ2は、Ｙのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基である。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかの方法に用いるためのプラスミドまたはベクターであって、
前記プラスミドまたはベクターは、標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングするため又は前記融合タンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターであり、
前記プラスミド又はベクターは、
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列の１〜数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記融合タンパク質において式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び、
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、前記融合タンパク質において式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、からなる群から選択される塩基配列を含むプラスミドまたはベクター。
【化４４】
前記式（Ｉ）中、Ｘは、蛍光性基であり、
Ｙは、消光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｌ2は、Ｙのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基である。
【請求項６】
請求項４に記載の組成物と、請求項５に記載のプラスミドまたはベクターとを含むタンパク質の蛍光標識方法用キット。
【請求項７】
一般式（Ｉ’）で表わされる化合物またはその塩。
【化４５】
前記式（Ｉ）中、Ｘは、蛍光性基であり、
Ｙは、消光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｌ2’は、
【化４６】
または−ＣＨ＝ＣＨ−
で表わされる、Ｙのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基である。
【請求項８】
タンパク質を蛍光標識する方法であって、
標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質を得ること、および前記融合タンパク質と下記式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは下記式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含み、
前記変異型βラクタマーゼは、前記式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは下記式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なタンパク質である、タンパク質の蛍光標識方法。
【化４７】
前記式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）中、
Ｘは、蛍光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基であり、
Ｒ4は、Ｈまたは低級アルキルである。
【請求項９】
前記融合タンパク質における前記変異型βラクタマーゼのアミノ酸配列が、
配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列、
配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質において上記式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列、及び、
配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質において上記式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列である、請求項８記載のタンパク質の蛍光標識方法。
【請求項１０】
前記融合タンパク質を得ることが、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、前記融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で前記融合タンパク質を発現させること、又は、発現した前記融合タンパク質を単離することを含む、請求項８又は９に記載のタンパク質の蛍光標識方法。
【請求項１１】
前記式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは下記式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩を含む請求項８〜１０のいずれかの方法に用いるための組成物。
【化４８】
前記式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）中、
Ｘは、蛍光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基であり、
Ｒ4は、Ｈまたは低級アルキルである。
【請求項１２】
請求項８〜１０のいずれかの方法に用いるためのプラスミドまたはベクターであって、
前記プラスミドまたはベクターは、標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングするため又は前記融合タンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターであり、
前記プラスミド又はベクターは、
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列の１〜数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記融合タンパク質において式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び、
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、前記融合タンパク質において式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、からなる群から選択される塩基配列を含むプラスミドまたはベクター。
【化４９】
前記式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）中、
Ｘは、蛍光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基であり、
Ｒ4は、Ｈまたは低級アルキルである。
【請求項１３】
請求項１１に記載の組成物と、請求項１２に記載のプラスミドまたはベクターとを含むタンパク質の蛍光標識方法用キット。
【請求項１４】
一般式（ＩＩ’）で表わされる化合物またはその塩。
【化５０】
前記式（ＩＩ’）中、
Ｘ’は、発光性希土類錯体であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基である。
【請求項１】
タンパク質を蛍光標識する方法であって、
標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質を得ること、および前記融合タンパク質と下記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含み、
前記変異型βラクタマーゼは、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なタンパク質である、タンパク質の蛍光標識方法。
【化４２】
前記式（Ｉ）中、Ｘは、蛍光性基であり、
Ｙは、消光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｌ2は、Ｙのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基である。
【請求項２】
前記融合タンパク質における前記変異型βラクタマーゼのアミノ酸配列が、
配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列、
配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質において上記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列、及び、
配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質において上記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列である、請求項１記載のタンパク質の蛍光標識方法。
【請求項３】
前記融合タンパク質を得ることが、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、前記融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で前記融合タンパク質を発現させること、又は、発現した前記融合タンパク質を単離することを含む、請求項１又は２記載のタンパク質の蛍光標識方法。
【請求項４】
前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩を含む請求項１〜３のいずれかの方法に用いるための組成物。
【化４３】
前記式（Ｉ）中、Ｘは、蛍光性基であり、
Ｙは、消光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｌ2は、Ｙのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基である。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかの方法に用いるためのプラスミドまたはベクターであって、
前記プラスミドまたはベクターは、標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングするため又は前記融合タンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターであり、
前記プラスミド又はベクターは、
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列の１〜数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記融合タンパク質において式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び、
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、前記融合タンパク質において式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、からなる群から選択される塩基配列を含むプラスミドまたはベクター。
【化４４】
前記式（Ｉ）中、Ｘは、蛍光性基であり、
Ｙは、消光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｌ2は、Ｙのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基である。
【請求項６】
請求項４に記載の組成物と、請求項５に記載のプラスミドまたはベクターとを含むタンパク質の蛍光標識方法用キット。
【請求項７】
一般式（Ｉ’）で表わされる化合物またはその塩。
【化４５】
前記式（Ｉ）中、Ｘは、蛍光性基であり、
Ｙは、消光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｌ2’は、
【化４６】
または−ＣＨ＝ＣＨ−
で表わされる、Ｙのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基である。
【請求項８】
タンパク質を蛍光標識する方法であって、
標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質を得ること、および前記融合タンパク質と下記式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは下記式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含み、
前記変異型βラクタマーゼは、前記式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは下記式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なタンパク質である、タンパク質の蛍光標識方法。
【化４７】
前記式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）中、
Ｘは、蛍光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基であり、
Ｒ4は、Ｈまたは低級アルキルである。
【請求項９】
前記融合タンパク質における前記変異型βラクタマーゼのアミノ酸配列が、
配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列、
配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質において上記式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列、及び、
配列表の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質において上記式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列である、請求項８記載のタンパク質の蛍光標識方法。
【請求項１０】
前記融合タンパク質を得ることが、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、前記融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で前記融合タンパク質を発現させること、又は、発現した前記融合タンパク質を単離することを含む、請求項８又は９に記載のタンパク質の蛍光標識方法。
【請求項１１】
前記式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは下記式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩を含む請求項８〜１０のいずれかの方法に用いるための組成物。
【化４８】
前記式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）中、
Ｘは、蛍光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基であり、
Ｒ4は、Ｈまたは低級アルキルである。
【請求項１２】
請求項８〜１０のいずれかの方法に用いるためのプラスミドまたはベクターであって、
前記プラスミドまたはベクターは、標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングするため又は前記融合タンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターであり、
前記プラスミド又はベクターは、
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列の１〜数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記融合タンパク質において式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び、
配列表の配列番号５〜８のいずれかの塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、前記融合タンパク質において式（ＩＩ）で表わされる化合物もしくは式（ＩＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物のＹを遊離させ、かつ、前記化合物またはその塩のβラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、からなる群から選択される塩基配列を含むプラスミドまたはベクター。
【化４９】
前記式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）中、
Ｘは、蛍光性基であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基であり、
Ｒ4は、Ｈまたは低級アルキルである。
【請求項１３】
請求項１１に記載の組成物と、請求項１２に記載のプラスミドまたはベクターとを含むタンパク質の蛍光標識方法用キット。
【請求項１４】
一般式（ＩＩ’）で表わされる化合物またはその塩。
【化５０】
前記式（ＩＩ’）中、
Ｘ’は、発光性希土類錯体であり、
Ｌ1は、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ1は、Ｈ、低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキレン基または低級アルキル基である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１０−１１９３８２（Ｐ２０１０−１１９３８２Ａ）
【公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１９５５３５（Ｐ２００９−１９５５３５）
【出願日】平成２１年８月２６日（２００９．８．２６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度、文部科学省、平成２０年度科学技術総合研究委託事業による委託研究「科学技術連携施策群の効果的・効率的な推進 生体内分子を可視化するナノセンサ分子開発」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月２６日（２００９．８．２６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度、文部科学省、平成２０年度科学技術総合研究委託事業による委託研究「科学技術連携施策群の効果的・効率的な推進 生体内分子を可視化するナノセンサ分子開発」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
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