トランスグルタミナーゼを用いる新規なエリトロポエチン複合体の形成
本発明は生物学的に活性なエリトロポエチン（ＥＰＯ）複合体組成物を提供し、ここでＥＰＯ分子を非−抗原性親水性ポリマーに共有結合的且つ部位特異的に複合化させるためにトランスグルタミナーゼ反応が用いられ、親水性ポリマーは有機分子にも共有結合していることができ、それらの修飾のいずれかが組成物の循環血清半減期を延長させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、構造に基を結合させるか又は一次配列の突然変異を介して生物学的活性を変更する酵素的方法を用いて製造されるエリトロポエチンの新規な調製物に関する。特に、本発明は、変更された生理化学的及び薬物動態学的性質を有するエリトロポエチン複合体化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
エリトロポエチン（ＥＰＯ）は自然に生成する糖タンパク質であり、それはコロニー刺激因子として機能し、赤血球合成の調節に含まれる主要因子として働く。エリトロポエチンは、骨髄中の前駆体細胞を刺激してそれらを分裂させ、成熟赤血球に分化させることにより働く。このプロセスは、赤血球の破壊もしくは循環からの除去が新しい細胞形成の速度に調和するように、体内で厳密に制御される。天然に存在するＥＰＯは、腎臓で生産される糖タンパク質である（非特許文献１）。
【０００３】
エリトロポエチンは組換えＤＮＡ法を用い、ＥＰＯ遺伝子のクローニング及びチャイニーズハムスター卵巣細胞における発現を介して製造された（Ｌｉｎ，特許文献１）。組換え的に生産されるＥＰＯはしばらくの間、慢性腎不全、ジドビジン（ｚｉｄｏｖｉｄｉｎｅ）処置されたＨＩＶ感染患者及び骨髄抑制化学療法にあるガン患者と関連する貧血を含む種々の形態の貧血の処置において有効な治療薬として利用できた。糖タンパク質は非経口的に、担体としてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有する通常の緩衝された水溶液中の静脈内（ＩＶ）又は皮下（ＳＣ）注射として投与される。そのような調製物は合衆国内でＥＰＯＧＥＮＲ及びＰＲＯＣＲＩＴＲの商品名の下に販売されている。これらの製品は、防腐剤を含まない１ｍｌの単投薬量で、あるいは２ｍｌの複数投薬量の防腐されたバイアルにおいてエリトロポエチンを含有する。
【０００４】
これらの調製物は非常に成功に満ちたものであることが証明されたが、ある種の欠点が生成物に伴う。現在、エリトロポエチンのようなタンパク質治療薬の生物学的活性の期間は、短い血漿半減期及びプロテアーゼ分解を受け易いことにより限られている。ＥＰＯのような治療用タンパク質の４時間の短い半減期は、最大の臨床的有効性のために頻繁な投与を必要とする。これは慢性状態の処置のために不利であり、劣った患者のコンプライアンス、従って最適の結果より低い結果を生じ得る。従って、ＥＰＯの血漿半減期を延長させる試みが成されてきた。
【０００５】
近年、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非−抗原性水溶性ポリマーが治療的及び診断的に重要なポリペプチドの共有結合的修飾のために用いられてきた。例えば生体内におけるペプチドの半減期を延長するため、ならびに／又はそれらの免疫原性及び抗原性を減少させるために、インターロイキン（非特許文献２，非特許文献３）、インターフェロン（非特許文献４）、カタラーゼ（非特許文献５）、スーパーオキシドジスムターゼ（非特許文献６）及びアデノシンデアミナーゼ（非特許文献７）のような治療用ポリペプチドへのＰＥＧの共有結合が報告された。
【０００６】
誘導体化ＰＥＧ化合物は以前に報告されている（特許文献２，１９９５年８月１日，Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ−Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ｓａｍｅ，ａｎｄ Ｍｅｔｈ
ｏｄ ｏｆ Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｍｅ，Ｎ．Ｎ．Ｅｋｗｕｒｉｂｅ）。翻訳後誘導体化のためのこの方法はＥＰＯにも適用された。例えば特許文献３は、エリトロポエチン活性を有する炭水化物修飾ポリマー複合体を開示しており、この場合ＰＥＧは酸化された炭水化物を介して連結する。特許文献４は、ＥＰＯを含むリシン−枯渇（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）ポリペプチド変異体のポリアルキレンオキシド複合体を開示している。特許文献５は、ＥＰＯが遺伝子工学により導入されるシステイン残基を含有し、それに特殊なＰＥＧ試薬が共有結合するモノメトキシ−ＰＥＧ−ＥＰＯ（ｍＰＥＧ−ＥＰＯ）の製造を記載している。他のＰＥＧ−ＥＰＯ組成物は特許文献６、特許文献７、特許文献８及び特許文献９に開示されている。
【０００７】
純粋に化学的な方法を用いるＰＥＧへの複合化（「ＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）」）によりタンパク質を修飾する多くの方法のよくある制限的側面は、アミン基との無差別且つ多くの場合に不完全な反応であり、それはタンパク質の近づき得るリシン残基及び／又はＮ−末端アミンに起こり得る。他の化学的方法は、修飾戦略の一部として炭水化物基の酸化を必要とし、同様に不完全な又は一貫しない反応及び限定されない生成物組成物を生ずる。かくして利用可能な現在の選択肢を考えると、穏やかな部位−特異的やり方でＥＰＯを修飾するための方法が有利であろう。
【０００８】
トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅｓ）［ＥＣ２．３．２．１３；タンパク質−グルタミン：ガンマグルタミルトランスフェラーゼ］は、第１級アミンへのカルシウム−依存性アシル付加を触媒するタンパク質の群であり、付加においてはペプチド−結合グルタミン残基のガンマ−カルボキシアミド基がアシル供与体であり、第１級アミンがアシル受容体及びアミン供与体である。自然には、向き合ったタンパク質上のリシン及びグルタミン残基の間のアミド結合の形成を触媒することにより、ＴＧａｓｅｓがタンパク質を架橋する。周知の例はＴＧａｓｅ ＸＩＩＩａ因子によるフィブリン架橋である。この結合は安定であり、且つプロテアーゼに対して抵抗性であり、かくしてＴＧａｓｅｓは一般に細胞の構造成分を結合させるために用いられる。上記の血漿形態の他に、ＴＧａｓｅｓは肝臓、皮膚及び細胞外液のような組織中で見出される（非特許文献８）。ＴＧａｓｅの原核形態も既知である（非特許文献９，非特許文献１０）。ＴＧａｓｅｓの特異性は非常に顕著であり、通常タンパク質当たりに１個又はいくつかの場合に２個のみのグルタミン残基がアミン受容体として働く。種々の哺乳類組織及び種からのＴＧａｓｅｓが広範囲に研究された（非特許文献１１，非特許文献１２，非特許文献１３，非特許文献１４）。かくしてＴＧａｓｅｓをいくつかのタンパク質上のグルタミン残基を部位−特異的に修飾するために用いることができるはずであり、用いられてきた（特許文献１０，特許文献１１，特許文献１２）。
【０００９】
【化１】
【００１０】
多数の研究にかかわらず、ＴＧａｓｅ特異性の決定因子について少ない詳細しか明らかになっていない。ＴＧａｓｅｓは基質特異性において異なり、アシル供与体又は受容体として残基を選ぶ場合、基質残基を含有するかもしくはそれに隣接するとしての特定の配列モチーフの採択は、個々の酵素に関して一般的に同定されていない（非特許文献１５，非特許文献１６）。唯一の限定的な規則は、いずれのＴＧａｓｅに関する基質として働くた
めにも、グルタミン残基がＮ−末端から少なくとも３個の残基の位置になければならないことである。一般にグルタミン繰り返しは繰り返し中の各グルタミン残基の受容体性を強化することが示され、グルタミン残基の近づき易さもＴＧａｓｅ基質として機能するそれらの能力の決定において重要であることが示された（非特許文献１７）。
【００１１】
ＴＧａｓｅ修飾の部位−特異性が１９６０年代以来既知であり、且つ食品の安定化における工業的使用が実施されているが、治療用タンパク質の修飾における使用は最近探求され始めたのみである。脂肪族アミノ基を含有する５キロダルトンもしくはそれより大きいポリマーをタンパク質結合グルタミン残基に結合させるためのＴＧａｓｅｓの使用は最近、特許文献１２においてＳａｔｏ，ｅｔ ａｌにより開示された。この特許は、続いてＴＧａｓｅ触媒反応を用いて大ポリマーを結合させる目的のために、ＴＧａｓｅ基質であることが既知の付加されたＮ−末端もしくはＣ−末端ペプチドを含有するようにタンパク質を操作する方法も開示している。ＩＬ−２のＰＥＧ化がこれらの方法を用いて行なわれ（非特許文献１８）、バクテリアＴＧａｓｅを用いるＩＬ−２の種々の他のタンパク質への架橋（Ｔａｋａｈａｒａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．特許文献１０）ならびに組織操作のための修飾フィブリンマトリックスの形成におけるＸＩＩＩａ因子の使用（特許文献１１）も示された。
【００１２】
天然に存在する分子への修飾又はモチーフの付加は、治療用タンパク質のための製造方法を与える目的の遺伝子工学の分野に従事するものには周知の複数の危険を伴う。これらの影響の最も明白なものは、生物学的活性の喪失又は部分的喪失である。他の場合、哺乳類細胞系中に導入されると、構築される発現ベクターからの発現レベルが許容され得ないほど低い。天然に存在するタンパク質基質からの既知の基質配列のカップリング又は融合の別の方法は、抗原性エピトープを形成し、患者において望ましくない免疫反応を引き起こし得、それは結局治療用タンパク質の長期間有効性を制限する。さらに、最も反応性の官能基、リシンを攻撃する化学的方法を用いるタンパク質の修飾は、タンパク質の等電点及びｐＫａも変える。従って、目的が安全且つ経済的に製造される生成物を与えることである場合、これらの制限を理解することが重要である。グルタミンのアミド基のアルキル化アミンへの転換はそのグルタミンの等電点又は電荷を変化させない。かくして、安定な共有結合を形成するが、タンパク質の電荷を改変しない酵素的方法の使用が望ましいであろう。これまで、ＥＰＯは自然のＴＧａｓｅ基質と考えられてもこなかったし、ＥＰＯにおいてＴＧａｓｅ基質部位を形成するか、又は除去するための分子の再−操作も記載されていない。
【特許文献１】米国特許第５６１８６９８号明細書
【特許文献２】米国特許第５４３８０４０号明細書
【特許文献３】国際公開第９４／２８０２４号パンフレット
【特許文献４】米国特許第４９０４５８４号明細書
【特許文献５】国際公開第９０／１２８７４号パンフレット
【特許文献６】欧州特許第６０５６９３号明細書
【特許文献７】米国特許第６，０７７，９３９号明細書
【特許文献８】国際公開第０１／０２０１７号パンフレット
【特許文献９】欧州特許第５３９１６７号明細書
【特許文献１０】米国特許第６０１０８７１号明細書
【特許文献１１】米国特許第６３３１４２２号明細書
【特許文献１２】米国特許第６３２２９９６号明細書
【非特許文献１】Ｊａｃｏｂｓ，ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ ３１３（６００５），８０６−８１０（１９８５）
【非特許文献２】Ｋｎａｕｆ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８８，２６３，１５，０６４
【非特許文献３】Ｔｓｕｔｓｕｍｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １９９５，３３，４４７
【非特許文献４】Ｋｉｔａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．著，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ １９９０，６，１５７
【非特許文献５】Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９７７，２５２，３，５８２
【非特許文献６】Ｂｅａｕｃｈａｍｐ．Ｃ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．著，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８３，１３１，２５
【非特許文献７】Ｃｈｅｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．著，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １９８１，６６０，２９３
【非特許文献８】Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｃ．Ｓｅｔ ａｌ．著，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１９９１，５，３０７１−３０７７
【非特許文献９】Ａｎｄｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．著，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ５３（１０），２６１３−２６１７，１９８９
【非特許文献１０】Ｗａｓｈｉｚｕ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．著，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ５８（１），８２−８７，１９９４
【非特許文献１１】Ｆｏｌｋ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ Ｃｈｕｎｇ，Ｓ．Ｉ．著，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１９７３，３８，１０９−１９１
【非特許文献１２】Ｆｏｌｋ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ Ｆｉｎｌａｙｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．著，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．１９７７，３１，１−１３３
【非特許文献１３】Ｆｏｌｋ，Ｊ．Ｅ．＆ Ｃｏｌｅ，Ｐ．Ｗ．著，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １９６６，１２２，２４４−２６４
【非特許文献１４】Ｆｏｌｋ，Ｊ．Ｅ．；Ｃｈｕｎｇ，Ｓ．Ｉ．著，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９８５，１１３，３５８−３７５
【非特許文献１５】Ｇｏｒｍａｎ，Ｊ．Ｊ．；Ｆｏｌｋ，Ｊ．Ｅ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８１，２５６，２７１２−２７１５
【非特許文献１６】Ｇｏｒｍａｎ，Ｊ．Ｊ．；Ｆｏｌｋ，Ｊ．Ｅ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８０，２５５，４１９−４２７
【非特許文献１７】Ｋａｈｌｅｍ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９６，９３，１４５８０−１４５８５
【非特許文献１８】Ｓａｔｏ，Ｈ．；Ｉｋｅｄａ，Ｍ．；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．；Ｈｉｒａｙａｍａ．Ｋ．著，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６，３５，１３０７２−１３０８０
【発明の開示】
【００１３】
発明の概略
本発明は生物学的に活性なＥＰＯ複合体組成物を提供し、ここでＥＰＯはエリトロポエチン又は骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の生産の増加を生じさせる生物学的性質を有するその製薬学的に許容され得る誘導体であり、ここでＥＰＯ分子を非−抗原性親水性ポリマーに共有結合的且つ部位特異的に複合化させるためにトランスグルタミナーゼ反応が用いられ、非−抗原性親水性ポリマーは有機分子にも共有結合することができ、それらの修飾のいずれかが組成物の循環血清半減期を延長させる。
【００１４】
さらに特定的に、本発明の１つの態様は、かくして、式
ＥＰＯ−［Ｇｌｎ−Ａ−Ｘ−（Ｍ）ｎ］ｙ （Ｉ）
［式中、ＥＰＯはエリトロポエチン又は骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の生産の増加を生じさせる生物学的性質を有するその製薬学的に許容され得る誘導体であり；ＧｌｎはＥＰＯの一次配列内の１個もしくはそれより多いグルタミン残基から選ばれるグルタミン残基であり；ｙは修飾されたグルタミン残基の数を示す１〜７の整数であり；Ａはアミン供与体部分又はヒドロキシル基であり、Ｘは場合による親水性ポリマー部分であり；Ｍは構築物の循環半減期を延長させる場合による有機分子（ペプチド及びタンパク質を含む）であり；そしてｎは０〜１５の整数である］
により記載されるＥＰＯ誘導体に関する。部分Ｘ及びＭを必要通りに修飾し、カップリング又は原子価のために適した官能価を与えるように設計される基を含むようにすることができる。
【００１５】
有機分子、Ｍ、は任意（ｏｐｔｉｏｎａｌ）であり、親水性ポリマーに共有結合する。Ｍは得られる構築物の生体内半減期を延長させることができる有機部分から選ばれ、脂肪酸、ジカルボン酸、ジカルボン酸のモノエステル又はモノアミド、飽和脂肪酸を含有する脂質、不飽和脂肪酸を含有する脂質、飽和及び不飽和脂肪酸の混合物を含有する脂質、単純な炭水化物、複雑な炭水化物、炭素環式化合物（ステロイドのような）、複素環式化合物（アルカロイドのような）、アミノ酸鎖、タンパク質、酵素、酵素補因子又はビタミンが含まれる。
【００１６】
親水性ポリマーは、好ましくはポリエチレングリコールのようなポリアルキレンオキシドである。
【００１７】
本発明の他の態様は、式
ＥＰＯ−［Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｚ−Ｘ−（Ｍ）ｎ］ｙ （ＩＩ）
［式中、ＥＰＯはエリトロポエチン又は骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の生産の増加を生じさせる生物学的性質を有するその製薬学的に許容され得る誘導体であり；ＬｙｓはＥＰＯの一次配列内の１個もしくはそれより多いリシン残基から選ばれるリシン残基であり
；ｙは修飾されたリシン残基の数を示す１〜８の整数であり；Ｇｌｎはグルタミン残基であり；Ｚはトランスグルタミナーゼアミン受容体として働くことができるＧｌｎ残基を含有するペプチド又はタンパク質であり、Ｘは場合による親水性ポリマーであり；Ｍは、構築物の循環半減期を延長させる場合による有機分子（ペプチド及びタンパク質を含む）であり；Ｎは０〜１５の整数である］
により記載されるＥＰＯ誘導体に関する。部分Ｘ及びＭを必要な通りに修飾し、カップリング又は原子価のために適した官能価を与えるように設計される基を含むようにすることができる。
【００１８】
本発明は複合体の製造方法も提供する。該方法は、アグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）もしくはグリコシル化ＥＰＯ又はグルタミン残基を有する赤血球形成活性を有する糖タンパク質中の１個もしくはそれより多い特定のグルタミン残基への、アミノ基供与体もしくはアルキルアミン−複合体のアシル転移を触媒するためにＴＧａｓｅを用いる段階を含む。該方法は、ペプチド、タンパク質又は他のポリマー中の１個もしくはそれより多いグルタミン残基へのＥＰＯ上のアミノ基供与体のアシル転移を触媒するためにＴＧａｓｅを用いる段階も含む。
【００１９】
本発明に含まれるのは、ＴＧａｓｅ基質としてのＥＰＯの開示である。従って、グルタミンもしくはリシン残基又は他のいずれかの残基を突然変異させるか、付加するか又は修飾するための組換え的もしくは化学的手段によりＥＰＯ分子を改変し、ＥＰＯ分子がＴＧａｓｅ基質性として働くことを可能にするか又はその能力を向上させ、それによりアミン供与体又はアミン受容体部分を含有する親水性ポリマー又は他の有機部分へのＥＰＯ分子の複合化を可能にする方法もまた本発明に含まれる。ＴＧａｓｅ基質性はタンパク質の生物学的活性に含まれ得るので、組換え的又は化学的手段を介してＥＰＯ分子のＴＧａｓｅ基質性を向上又は低下させることも本発明に含まれる。かくして、本発明に従えばＥＰＯ分子を修飾して循環半減期を延長させるか、あるいは他に、哺乳類エリトロポエチン又はいずれかの複合体もしくは突然変異赤血球形成性タンパク質の生物学的活性を向上させることができる。
【００２０】
本発明は、内在性エリトロポエチン又は赤血球形成の減少と関連する貧血又は他の状態あるいは赤血球の増加が望まれる状態の処置方法も提供する。本発明のこの側面において、処置は本明細書に記載される複合体の有効量を、そのような治療の必要な哺乳類に投与することを含む。本発明の結果として、生体内における（ｉｎ ｖｉｖｏ）実質的に長期化した赤血球形成活性を有する複合体が与えられる。
【００２１】
本明細書で開示される方法は、延長された循環半減期及び向上した赤血球形成力価を有するＥＰＯ分子を与える利点を有する。さらに本発明の修飾ＥＰＯ分子は、複合化及び／又は突然変異が十分に制御され、実質的に十分に定義され且つ特性化された最終的生成物を生ずる点で利点を有する。
【００２２】
図面の簡単な記述
図１は、ヒトエリトロポエチンの成熟鎖のアミノ酸配列を示し、グルタミン残基は四角内である。
【００２３】
図２は、蛍光標識されたＴＧａｓｅ基質、ダンシルカダベリン（ＤＣ）をＴＧａｓｅの存在下又は不在下でタンパク質と一緒にインキュベーションしたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像である。ＵＶ露出を用いて標識を視覚化する：列１＝分子量マーカー。列２＝ＥＰＯ＋ＤＣ＋ＴＧａｓｅ。列３及び４＝ＥＰＯ＋ＤＣ；列５＝ＥＰＯ標準；及び列６＝ｂ−カゼイン＋ＤＣ＋ＴＧａｓｅ。ｂ−カゼインはＴＧａｓｅに関する既知の基質であり、正の標準として用いられた。列２における蛍光３５Ｋバンドは１個もしくはそれより多いＤＣ
分子が結合したＥＰＯに対応する。列２中のより高分子量のバンドはＥＰＯ二量体及び三量体に対応すると思われる。同ゲルを銀染色し、分子量マーカー及び他の非−蛍光バンドを同定した。
【００２４】
図３．（ａ）脱グリコシル化ＥＰＯ、（ｂ）脱グリコシル化ＥＰＯ−カダベリン−Ｘ−ビオチン（＋４２４の付加が見られるべきである）、（ｃ）脱グリコシル化ＥＰＯ−ＤＣ（＋３１８の付加が見られるべきである）及び（ｄ）脱グリコシル化ＥＰＯ−ｃｂｚ（＋３１９の付加が見られるべきである）のＭＡＬＤＩ ＭＳ分析。
【００２５】
図４．（ａ）ＥＰＯのＬｙｓ−Ｃ消化物（標準）；（ｂ）ＥＰＯ−Ｘ−ビオチンのＬｙｓ−Ｃ消化物；（ｃ）脱グリコシル化ＥＰＯのＬｙｓ−Ｃ消化物（標準）；（ｄ）脱グリコシル化ＥＰＯ−ＤＣのＬｙｓ−Ｃ消化物に関するＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量スペクトル。
【００２６】
図５．（ａ）脱グリコシル化ＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）バッチ＃１；（ｂ）脱グリコシル化ＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）バッチ＃２；（ｃ）脱グリコシル化ＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）バッチ＃１のＬｙｓ−Ｃ消化物；（ｄ）脱グリコシル化ＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）バッチ＃１のＬｙｓ−Ｃ消化物に関するＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量スペクトル。
【００２７】
図６は、ＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）又は非修飾ＥＰＯ（ＥＰＯ標準）と一緒にインキュベーションされたＵＴ７細胞の造血に関する吸光度対付加されたＥＰＯ種の濃度のグラフを示す。
【００２８】
図７は、ＴＧａｓｅ触媒反応を介するカダベリン−ＰＥＧ（２０Ｋ）のＥＰＯへの結合を示す、銀−染色ポリアクリルアミドゲルの画像である：列１＝分子量マーカー。列２＝ＥＰＯ＋ＴＧａｓｅ＋ＤＣ。列３＝ＥＰＯ標準。列４＝ＥＰＯ＋ＴＧａｓｅ（６時間）；列５＝ＥＰＯ＋ＴＧａｓｅ（２２時間）；列６及び７＝ＴＧａｓｅ（それぞれ６時間及び２２時間）；列８＝ＰＥＧ（２０Ｋ）−カダベリン；列９、１０及び１１＝ＥＰＯ＋ＰＥＧ２０Ｋ−カダベリン＋ＴＧａｓｅ（それぞれ６時間、２２時間及び２２時間（還元））。ＥＰＯ＋ＤＣ試料は、ＤＣの蛍光シグナルを最大にできるように、過剰負荷されたことに注意されたい。
【００２９】
図８は、ＥＰＯ＋ＰＥＧ２０Ｋ−カダベリン＋ＴＧａｓｅの反応混合物のＳＥＬＤＩ−ＭＳにおける質量対電荷比に対する強度の図形を示す。５１，０１０におけるピークはＰＥＧ化ＥＰＯ生成物に対応する。
【００３０】
図９は、ＥＰＯ（列１）及び精製されたＥＰＯ−ＰＥＧ５Ｋ−プトレッシン（列２）の銀−染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４−２０％）を示す。ＥＰＯ−プトレッシン−ＰＥＧ５Ｋ試料中に非常に少量の非修飾ＥＰＯが存在することに注意されたい。
【００３１】
図１０は、反応混合物（ＥＰＯ＋ＰＥＧ（５Ｋ）−プトレッシン＋ＴＧａｓｅ）のＳＥＬＤＩ−ＭＳにおける質量対電荷比に対する強度の図形を示す。
【００３２】
図１１は、精製されたＥＰＯ＋ＰＥＧ（５Ｋ）−プトレッシンに関するＳＥＬＤＩ−ＭＳにおける質量対電荷比に対する強度の図形を示す。（ＰＥＧ基はイオン化を抑制する傾向があり、かくしてピーク面積は存在する各種の相対的量の指標ではないことに注意されたい。）
図１２は、ＥＰＯ−プトレッシン−ＰＥＧ（５Ｋ）（ＥＰＯ−ＰＥＧ）又は非修飾ＥＰＯ（ＥＰＯ−標準）と一緒にインキュベーションされたＵＴ７細胞の造血に関する吸光度対付加されたＥＰＯ種の濃度のグラフを示す。
【００３３】
図１３は、ＥＰＯ＋プトレッシン−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ３．４Ｋ＋ＴＧａｓｅ（５５％エタノール及び４５％ＴＧａｓｅ反応緩衝液，ｐＨ７．５）の反応のＳＥＬＤＩ−ＭＳにおける質量対電荷比に対する強度の図形を示す。２８．８Ｋにおけるピークは非修飾ＥＰＯに対応し、３３．７Ｋ、３７．５Ｋ及び４１．６Ｋにおけるピークは、ＥＰＯ当たり１、２及び３個のプトレッシン−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ３．４Ｋ部分の付加に対応する。（脂質基はイオン化を抑制する傾向があり、かくしてピーク面積は存在する各種の相対的量の指標ではないことに注意されたい。）
詳細な記述
ＥＰＯは主に腎臓において生産され、前駆体細胞上の受容体二量体への結合を介して機能し、赤血球への分化及び続く増殖に導く（Ｌｉｖｎａｈ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．著，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９，２８３，９８７−９９０）。ＥＰＯの一次配列は７個のグルタミン残基を有する（配列番号：１）。集成されたＮＣＢＩファイル，Ｐ０１５８８はグルタミンを、成熟鎖の５８，５９，６５，７８，８６，９２及び１１５に対応する前駆体タンパク質の８５，８６，９２，１０５，１１３，１１９及び１４２の位置に記載している。これらを図１に示す。
【００３４】
ＥＰＯは２つの結合面を介して受容体に結合し、それらの一方は他方より受容体に関して高い親和性を有する。ＥＰＯの結晶構造は解明された（Ｓｙｅｄ，ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ ３９５（６７０１），５１１−５１６（１９９８）；Ｃｈｅｅｔｈａｍ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．著，Ｈｕｍａｎ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，ＮＭＲ ｍｉｎｉｍｉｚｅｄ ａｖｅｒａｇｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．８−Ｓｅｐ−１９９８．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａ ｂａｓｅ ＩＤ １ＢＵＹ）。その受容体に結合しているＥＰＯの結晶構造も記載されている（Ｓｔｒｏｕｄ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｒｅｉｄ，Ｓ．Ｗ．著，Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ
ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａ ｂａｓｅ ＩＤ １ＣＮ４）。複合体内で、ＥＰＯ上の８個のリシン残基の４個は受容体と直接接触するが、７個のグルタミン残基の１個を除くすべては溶媒が近づき得、Ｇｌｎ７８のみが受容体と何らかの可能な相互作用を示す。これらの観察から、ＥＰＯ上のグルタミン残基は受容体結合を妨げずにＰＥＧ又は他のポリマーの結合に関する有意な可能性を与えるが、リシン残基の無差別な修飾はある程度まで結合を妨げることがほとんど確実であることが明らかである。
【００３５】
ＥＰＯ上に存在するリシン残基のいくつかは受容体結合に含まれるが、他は、それらが特異的に修飾され得れば、ＰＥＧｓ又は他のポリマーの結合に関する有意な可能性を与えるであろう。ＴＧａｓｅｓは、アミン−供与体基質部位として働くことができるタンパク質上のリシンに関して非常に選択的なので、リシン残基がＴＧａｓｅｓにより選択的に標的とされれば、これらのリシン残基にポリマーを結合するためのＴＧａｓｅｓの使用に関する可能性が存在する。
【００３６】
ＴＧａｓｅｓは多くの哺乳類の体液及び組織中に存在するので、ＥＰＯがＴＧａｓｅ基質であるという発見は、従って、体内におけるトランスグルタミナーゼ−触媒反応がグルタミン及び／又はリシン残基を含む哺乳類エリトロポエチンからの配列を含有する治療用タンパク質の生物利用性及び分布に影響を与え得るはずであることを示す。かくしてこれらの残基の生来のＴＧａｓｅ基質性を低下させるかもしくは除去するためのそれらの除去、マスキング又は修飾は、そのような生物薬剤（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｇｅｎｔ）の生物学的性質を有意に変更し、そのような赤血球形成性タンパク質の有効性を強化し得ることになる。そのような修飾は該グルタミン及び／又はリシン残基を他の１９種の天然に存在するアミノ酸のいずれかに突然変異させることにより、該リシン及び／又はグルタミン残基を化学的に修飾することにより、あるいはＴＧａｓｅｓを用いて小さいアシル−供与体又はアミン−供与体基質をこれらの部位に結合させ、それによりＴＧ
ａｓｅ基質としてそれらを除去することにより成される。また、いくつかの残基はペプチド又はタンパク質中に含有されるリシンもしくはグルタミン残基の基質性を向上させるか又は低下させることが示唆されている。かくして、赤血球形成性タンパク質の配列内の他の残基の突然変異、付加又は化学的修飾は、タンパク質の一次アミノ酸配列内に含有されるリシン又はグルタミン残基の基質性を向上させるか又は低下させることができるはずである。最近の論文（Ｄａｌｅ，ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ ４１５（１０），１７５−１７９（２００２））において、著者はセロトニンがＴＧａｓｅ基質であり、表面タンパク質へのＴＧａｓｅ−触媒架橋を介して活性化血小板に結合することを示している。ＴＧａｓｅｓＸＩＩＩ因子及び組織トランスグルタミナーゼは活性化血小板の表面上で同定された。血小板表面へのセロトニンの架橋は、細胞表面上におけるプロコアグレーションタンパク質（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の保持を増大させる。この研究は、細胞外ＴＧａｓｅｓがＴＧａｓｅ基質部位を含有するタンパク質を細胞表面に架橋できること、ならびにこの活性がおそらくタンパク質のその受容体との結合を助長できることを示す。これは、ＴＧａｓｅｓが赤血球先祖細胞又は他の標的化された細胞系へのタンパク質の結合に含まれるなら、ＥＰＯが示すＴＧａｓｅ基質性がタンパク質の赤血球形成力価に直接含まれ得ることを示唆する。
ＥＰＯ
ＥＰＯの生物学的活性形態への修飾のための出発材料は、好ましくはエリトロポエチン又は骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の生産の増加を生じさせる生物学的性質を有するその誘導体である。ＥＰＯ糖タンパク質は天然源から得ることができるか、あるいは引用することによりその記載事項が本明細書の内容となる米国特許第４，７０３，００８；５，４４１，８６８；５，５４７，９３３；５，６１８，６９８及び５，６２１，０８０号明細書に開示されているような既知の方法を用いて組換え的に生産することができる。所望の生物学的活性を有するエリトロポエチンタンパク質の非グリコシル化形態又は高グルコシル化形態を用いることもできる。高グリコシル化ＥＰＯの製造法は、国際公開第０２４９６７３号パンフレット及び欧州特許第６４０６１９号明細書に記載されている。
トランスグルタミナーゼ
グルタミンから受容体へのアシル転移を触媒する酵素のいずれも本発明における使用に適している。モルモット肝臓由来のトランスグルタミナーゼは特に適しており、商業源、例えばＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ＩＣＮ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓなどを介して容易に入手可能である。微生物起源のＴＧａｓｅｓ、例えばストレプトベルチシリウム種（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）の、又はストレプトベルチシリウム・モバラエンセ（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ）からのカルシウム非依存性トランスグルタミナーゼを用いることもできる（Ａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．著，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３（１０），２６１３−１７，１９８９）。
アシル受容体／アミン供与体
ＴＧａｓｅｓは第１級アミン供与体に関して広い特異性を有し、それは第１級アミン含有化合物あるいはリシンのペプチド−もしくはタンパク質結合イプシロン−アミノ基であることができる。ＴＧａｓｅｓに関するアミン−供与体基質には：アンモニア、ヒドロキシルアミン、メチルアミン、エタノールアミン、フェニルエチルアミン、ヒスタミン、スペルミン、スペルミジン、カダベリン、プトレッシン、タンパク質−もしくはペプチド−結合リシン基、アミンアミド、例えばグリシンアミドが含まれるが、Ｌ−チロシンアミドは含まれない。Ｎ−（５−アミノペンタニル）−５−ジメチルアミノ−１−ナフタレン−スルホンアミド（ダンシルカダベリン）は、その蛍光性及び優れたアミン−供与体として働く能力の故に、タンパク質基質を調べるために有用な基質である（Ｆｏｌｋ ａｎｄ Ｃｈｕｎｇ，１９７３ 上記参照）。
【００３７】
この場合、水も求核試薬として働くことができ、グルタミンのグルタミン酸への転換を生じ、その場合には上記の式Ｉ中の部分Ａはヒドロキシル部分である。
【００３８】
アミノ糖類、例えば国際公開第０１７９４７４号パンフレットを参照されたい、及び日本特許第２０００３００２８７号明細書におけるアミノアルキル糖類も、タンパク質へのトランスグルタミナーゼ−触媒結合のための適したアミン供与体であることが示された。アミノ糖類は、第１級アミノ基を含有するいずれかの単糖類、オリゴ糖類又は多糖類ならびにアミノ基の導入のために単糖類、オリゴ糖類又は多糖類の還元的アミノ化により製造されたいずれかの単糖類、オリゴ糖類又は多糖類である。有利なアミノ糖の例はアミノソルビトールである。
【００３９】
かくして上記の化合物もしくは関連する化合物のいずれも、アミン供与体として働くことができ、さらにＴＧａｓｅが触媒するトランス−アシル化反応が該グルタミン残基においてＥＰＯ構造に付加することが望まれている基を有効に複合化させるように、それら自身を修飾することができる。式ＩのＡ部分に相当する特に好ましい分子は：カダベリン、プトレッシン、１，５−ジアミノペンタン、１，６−ジアミノヘキサン、１，７−ジアミノヘプタン又は類似のジアミノアルカンである。
アシル供与体／アミン受容体
ＴＧａｓｅｓは、リシン残基がＴＧａｓｅ基質部位として機能すれば、グルタミン−含有ペプチド及びタンパク質をタンパク質の構造内のリシンのε−アミノ基に結合させることができる。かくして上記の式ＩＩに従い、Ｚはトランスグルタミナーゼアミン受容体として働くことができるＧｌｎ残基を含有するペプチド又はタンパク質を示す。ＴＧａｓｅ触媒反応を介してタンパク質−結合リシン残基に架橋することが示されたペプチドには：ＴＶＱＱＥＬ、ＰＧＧＱＱＩＶ、ｐＥＡＱＱＩＶ、ＰＫＰＱＱＦＭ、ＥＡＱＱＩＶＭ及びベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）−ＱＧの複数の誘導体が含まれる（Ｇｒｏｏｔｊａｎｓ，ｅｔ ａｌ．著，ＪＢＣ ２７０（３９），２２８５５−２２８５８（１９９５）），（Ｇｒｏｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．著，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５，６７１−６７４（１９９２）），（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．著，ＪＢＣ ２５５（２），４１９−４２７（１９８０））。これらのようなペプチドはＰＥＧ又は上記のもののような他のポリマーに共有結合し、次いでＴＧａｓｅ触媒反応を介してＥＰＯ又はアミン−供与性リシン残基を含有する他のタンパク質に結合することができる。
水溶性ポリマー
特に好ましい水溶性ポリマーは、ＰＥＧのいくつかの種の１つである。ＰＥＧは基本的炭素単位、ＨＯ−（ＣＨ２）２−ＯＨから成り、種々の形態で：ポリエチレングリコール（種々の分子量）；ポリエチレンオキシド；Ｃａｒｂｏｗａｘ ＰＥＧ（種々の分子量）；アルファ−ヒドロ−オメガ−ヒドロキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）；エトキシル化１，２−エタンジオール；ポリオキシエチレンエーテル；ｅｍｋａｐｏｌ ２００；ｇａｆａｎｏｌ ｅ ２００；ｐｌｕｒｉｏｌ ｅ ２００；ポリジオール ２００；ポリエチレングリコール；ＰＥＧ；Ｐｏｌｙｏｘ ＷＳＲ−３０１；ＰＥＧ ２００；Ｍａｃｒｏｇｏｌ；及びｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｌｅｎｅｌｎの名前の下に販売されている。ＰＥＧに基づくポリマーが用いられる本発明の側面において、それらは約２００〜約１００，０００ダルトン、そして好ましくは約２，０００〜約４０，０００ダルトンの平均分子量を有するのが好ましい。
【００４０】
別の水溶性ポリマー物質にはデキストラン、ポリビニルピロリドン、多糖類、デンプン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド又は他の類似の非−免疫原性ポリマーのような材料が含まれる。当該技術分野における通常の熟練者は、前記が単に例であり、本明細書における使用に適した非−抗原性ポリマーの型を制限することが意図されていないことを認識するであろう。
生体内における薬物動態学的半減期の延長を与える有機分子
半減期を延長させるために親水性ポリマーに結合させることができる有機分子には脂肪酸、ジカルボン酸、ジカルボン酸のモノエステルもしくはモノアミド、飽和脂肪酸を含有
する脂質、不飽和脂肪酸を含有する脂質、飽和及び不飽和脂肪酸の混合物を含有する脂質、単純な炭水化物、複雑な炭水化物、炭素環式化合物（ステロイドのような）、複素環式化合物（アルカロイドのような）、アミノ酸鎖、タンパク質、酵素、酵素補因子又はビタミンが含まれる。
【００４１】
１つの態様において、親水性ポリマー基を１〜約６個のアルキル、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂質もしくはリン脂質基で置換する（本明細書に記載される通り、例えば式Ｉ及び式ＩＩ）。好ましくは、置換された親水性ポリマー基は直鎖状もしくは分枝鎖状ＰＥＧである。好ましくは、置換された親水性ポリマー基は、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂質もしくはリン脂質基又は炭化水素で末端が置換された直鎖状ＰＥＧ（例えばＰＥＧジアミン）である。アルキル、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂質又はリン脂質基で置換された親水性ポリマーは、適した方法を用いて製造することができる。例えばモノ保護ＰＥＧジアミンを活性化脂肪酸（例えばパルミトイルクロリド）と反応させることにより、修飾剤を製造することができる。得られる生成物を用い、脂肪酸基で置換されたＰＥＧを含む修飾されたＥＰＯを製造することができる。多様な他の適した合成案を用いることができる。例えば本明細書に記載されるようにアミン含有ポリマーを脂肪酸又は脂肪酸エステルにカップリングさせることができ、脂肪酸又は脂肪酸エステル上の活性化カルボキシレート（例えばＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールで活性化された）をポリマー上のヒドロキシル基にカップリングさせることができる。この方法で、所望の性質を有する複数の適した直鎖状及び分枝鎖状多量体構造を構築し、最終的にトランスグルタミナーゼアミン供与体として働くことができる第１級アミンあるいはトランスグルタミナーゼアミン受容体として働くことができるグルタミン−含有ペプチドもしくはポリマーを含有するように、結合させるかもしくは修飾することができる。
【００４２】
本発明における使用に適した脂肪酸及び脂肪酸エステルは飽和していることができるか、あるいは１個もしくはそれより多い不飽和単位を含有することができる。好ましい態様において、脂肪酸及び脂肪酸エステルは約６〜約４０個の炭素原子を含む。本発明の方法でＥＰＯを修飾するのに適した脂肪酸には、例えばｎ−ドデカノエート（Ｃ１２，ラウレート）、ｎ−テトラデカノエート（Ｃ１４，ミリステート）、ｎ−ヘキサデカノエート（Ｃ１６，パルミテート）、ｎ−オクタデカノエート（Ｃ１８，ステアレート）、ｎ−エイコサノエート（Ｃ２０，アラキデート）、ｎ−ドコサノエート（Ｃ２２，ベヘネート）、ｎ−トリアコンタノエート（Ｃ３０）、ｎ−テトラコンタノエート（Ｃ４０）、シス−Ｄ９−オクタデカノエート（Ｃ１８，オレエート）、全シスＤ５．８．１１．１４−エイコサテトラノエート（Ｃ２０，アラキドネート）、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などが含まれる。適した脂肪酸エステルには直鎖状もしくは分枝鎖状低級アルキル基を含むジカルボン酸のモノエステルが含まれる。低級アルキル基は１〜約１２個、好ましくは１〜約６個の炭素原子を含むことができる。本発明のタンパク質の修飾に適した脂肪酸エステルには、例えばオクタデカン酸メチル、オクタデカン酸エチル、オクタデカン酸プロピル、ドデカン酸ブチル、ドデカン酸ｓｅｃ−ブチル、ドデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル、テトラデカン酸ネオペンチル、テトラデカン酸ヘキシル、シス−Δ９−オクタデカン酸メチルなどが含まれる。
Ｅｐｏへの転移のためのＴＧａｓｅ基質の製造
かくして熟練者は、アミン供与体アミン部分又はアミン受容体部分に結合した２個もしくは３個又はそれより多い部分の複合体を製造することができ、得られる複合体はＴＧａｓｅ基質として機能するであろう。
【００４３】
他の基質の製造は、好ましくは段階的に行なわれ、最後の段階で１種の脱保護された、又は保護されていない第１級アミンを生ずるであろう。かくして水溶性ポリマー及び有機分子をカップリングさせるために、例えばトシレート、メシレート、ハロ（クロロ、ブロモ、ヨード）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）、置換フェニルエス
テル、アシルハライドなどのような求電子性基を含むアミン−反応性基が用いられるべき場合、第１級アミンはほとんどの場合に保護されねばならない。有機分子をポリマーに複合化させる他の方法は周知であり、チオールと反応できる薬剤、例えばマレイミド、ヨードアセチル、アクリロイル、ピリジルジスルフィド、５−チオール−２−ニトロ安息香酸チオール（ＴＮＢ−チオール）などの使用を含む。分子中へのそのようなチオール反応性基の導入に適した方法は当該技術分野において既知である（例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．著，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９６）を参照されたい）。アルデヒド又はケトン官能基をアミン−もしくはヒドラジド−含有分子にカップリングさせることができ、アジド基を３価のリン基と反応させてホスホルアミデート又はホスホルイミド結合を形成することができる。反応性基を親水性ポリマー、コンジュゲート複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）に直接結合させることができるか、又はリンカー部分、例えばＣ１〜Ｃ１２ヒドロカルビル基を介して結合させることができる。本明細書で用いられる場合、「ヒドロカルビル基」は、１個もしくはそれより多い炭素原子が場合により酸素、窒素又は硫黄のようなヘテロ原子で置き換えられていることができる炭化水素鎖を指す。適したリンカー部分には例えばテトラエチレングリコール、−（ＣＨ２）３−、−ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＮＨ−、−（ＣＨ２）２−ＮＨ−及び−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ−ＮＨ−が含まれる。
【００４４】
リンカー部分を含む修飾剤は、例えばモノ−Ｂｏｃ−アルキルジアミン（例えばモノ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン、モノ−Ｂｏｃ−ジアミノヘキサン）を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下で脂肪酸と反応させ、遊離のアミンと脂肪酸カルボキシレートの間にアミド結合を形成することにより製造することができる。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いる処理により生成物からＢｏｃ保護基を除去して第１級アミンを露出し、それを記載した通りに別のカルボキシレートにカップリングさせることができるか、あるいは無水マレイン酸と反応させ、得られる生成物を環化して脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を製造することができる。（例えば引用することによりその方法全体が本明細書の内容となるＴｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．著，国際公開第９２／１６２２１号パンフレットを参照されたい）。
【００４５】
誘導体化赤血球形成性化合物の例は以下である：
Ｍ−ＰＥＧ−Ａ−ＥＰＯ
ここでＭ−ＰＥＧはＴＧａｓｅを用いて特異的なグルタミン又はリシンに結合し、ここでＭは脂質、炭水化物、多糖類、脂肪酸、脂肪酸誘導体、脂肪アルコール又はタンパク質であり、Ａはアミン供与体、好ましくはカダベリン又はプトレッシンあるいはアミン受容体、好ましくは１〜３０アミノ酸の短いグルタミン−含有ペプチドである。
（Ｍ−ＰＥＧ）２−Ａ−ＥＰＯ
ここでＭ−ＰＥＧはＡ上の２個の異なるカルボキシル基にエステル化され、ここでＭは脂質、炭水化物、多糖類、脂肪酸、脂肪酸誘導体、脂肪アルコール又はタンパク質である。エステル化のための２個の異なるカルボキシル基を有する部分Ａの適した例にはジグリセリド又はトリグリセリド誘導体ならびにマレイン酸、シトラコン酸、グルタミン酸又は２個もしくはそれより多いカルボキシル炭素を含有する他のポリマーの誘導体が含まれる。より高い倍体（ｈｉｇｈｅｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅｓ）も同様に含まれる。
（Ｍ−ＰＥＧ）２−Ｒ−Ａ−ＥＰＯ
ここで（Ｍ−ＰＥＧ）２−ＲはＡ上の２個の異なるカルボキシル基であり、ここでＭは脂質、炭水化物、多糖類、脂肪酸、脂肪酸誘導体、脂肪アルコール又はタンパク質であり、Ｒは原子価強化構築物、例えばアミノ酸のデンドリマーなどであり、それは複数の（Ｍ−ＰＥＧ）２又は他の部分の結合のために複数の官能基を含有する。より高い倍体も同様に含まれる。
Ｍ−Ａ−ＥＰＯ
ここでＭはタンパク質又はペプチドであり、Ａは該タンパク質又はペプチド上のリシン側鎖である。
Ｍ−Ａ−ＥＰＯ
ここでＭはタンパク質又はペプチドであり、Ａは該タンパク質又はペプチド上のグルタミン側鎖である。
Ｍ−Ａ−ＥＰＯ
ここでＭは脂質であり、Ａはアミン受容体、好ましくは短いグルタミン−含有ペプチドである。
Ｍ−Ａ−ＥＰＯ
ここでＭは脂質であり、Ａはプトレッシン、カダベリン又は他のジアミノアルカンである。
Ｍ−Ａ−ＥＰＯ
ここでＭはビオチン、ダンシル又は研究、診断又は治療目的に有用な生物物理学的特性をＥＰＯに与える他の部分であり、Ａはプトレッシン、カダベリン又は他の適したＴＧａｓｅアミン供与体もしくはアミン受容体基質である。ビオチン又は既知の結合パートナーを有する別の部分が複合体に導入される場合、該複合体をビオチン−アビジン複合体におけるようにその既知の結合パートナーとの複合体において研究、診断もしくは治療に用いることができると思われる。
治療的使用
本発明のＥＰＯ調製物は、低いか又は欠陥のある赤血球生産を特徴とする血液障害、例えば慢性腎不全、ジドビジン処置されたＨＩＶ感染患者及び化学療法にあるガン患者と関連する貧血を含む種々の形態の貧血の処置において、非経口用調製物として有用である。それは多様な疾患状態、障害及び血液学的異常の状態、例えば鎌状赤血球症、ベータ−サラセミア、のう胞性線維症、妊娠及び月経障害、早熟の早期貧血（ｅａｒｌｙ ａｎｅｍｉａ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ）、脊髄損傷、宇宙飛行、急性失血、老化などの処置においても用途を有することができる。それは手術−前患者におけるように、赤血球の増加が望ましい状況においても用途を有することができる。好ましくは、本発明のＥＰＯ組成物は非経口的に（例えば静脈内、筋肉内、皮下又は腹膜内）投与される。有効な投薬量は、処置されている状態及び投与の経路に依存して有意に変わると思われるが、体重のｋｇ当たり０．１（〜７Ｕ）〜１００（〜７０００Ｕ）μｇの活性材料の範囲内であると思われる。貧血状態の処置のために好ましい投薬量は、週に３回の約５０〜約３００単位／ｋｇである。
製薬学的組成物
本発明に従って製造されるエリトロポエチン糖タンパク質生成物は、当該技術分野において既知の方法により、製薬学的に許容され得る担体又はビヒクルを用いる注入に適した製薬学的組成物において調製することができる。例えば適した組成物は国際公開第９７／０９９９６号パンフレット、国際公開第９７／４０８５０号パンフレット、国際公開第９８／５８６６０号パンフレット及び国際公開第９９／０７４０１号パンフレットに記載されている。本発明の生成物の調製のために好ましい製薬学的に許容され得る担体の中に、ヒト血清アルブミン、ヒト血漿タンパク質などがある。本発明の化合物は、等張剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ ａｇｅｎｔ）、例えば１３２ｍＭ塩化ナトリウムを含有するｐＨ７における１０ｍＭリン酸ナトリウム／カリウム緩衝液中で調製することができる。場合により製薬学的組成物は防腐剤を含有することができる。製薬学的組成物は種々の量のエリトロポエチン生成物、例えば１０〜２０００μｇ／ｍｌ、例えば５０μｇ又は４００μｇを含有することができる。
【００４６】
酸化防止剤、例えばトコフェロール、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、パルミチン酸アスコルビル又はエデト酸塩、例えばエデト酸二ナトリウムの添加により、組成物の安定性をさらに強化することができ、エデト酸塩はさらにおそらく存在する重金属を結合する。安息香酸及びパラベン類、例えばメチルパラベン及び／又
はプロピルパラベンのような防腐剤の添加により、安定性をさらに強化することができる。
低いか又は欠陥のある赤血球生産を特徴とする血液障害の処置
本発明のエリトロポエチン糖タンパク質生成物の投与は、ヒトにおいて赤血球形成を生ずる。従って、エリトロポエチン糖タンパク質生成物の投与は、赤血球の生産において重要なこのＥＰＯタンパク質を補充する。エリトロポエチン糖タンパク質生成物を含有する製薬学的組成物を、低いかもしくは欠陥のある赤血球生産を特徴とする血液障害を単独でもしくは状態もしくは疾患の一部として経験しているヒト患者への種々の手段による投与に有効な濃度で調製することができる。製薬学的組成物は、皮下、静脈内又は筋肉内注射のような注射により投与することができる。エリトロポエチン糖タンパク質生成物の平均量は変わることができ、特に資格を有する医師の勧告及び処方に基づくべきである。複合体の正確な量は、処置されている状態の正確な型、処置されている患者の状態ならびに組成物中の他の成分のような因子に依存して選ばれることである。例えば体重のｋｇ当たり０．０１〜１０μｇ、好ましくは体重のｋｇ当たり０．１〜１０μｇを、例えば毎週１回投与することができる。
【００４７】
本出願を通じて種々の公開文献を引用してきた。これらの公開文献中の開示は、当該技術分野の現状をより十分に記載するために、引用することによりその記載事項が本明細書の内容となる。
【００４８】
本発明をさらに以下の実施例により示し、実施例は例示の目的のために提示されるが、本発明の化合物及び組成物の調製を制限するものではない。最初の実験から、ＥＰＯ上の７個のグルタミンの少なくとも２個そしておそらく３個がＴＧａｓｅ基質として働くことができる。ペプチドマッピングは、Ｇｌｎ１１５がＴＧａｓｅのアシル供与体部位として働くことができること、ならびに他の６個のグルタミン残基の少なくとも１個が同様に働くことができることを示した。ＥＰＯへのＰＥＧ基及び脂肪族アミンを含有する脂質基の結合がモルモット肝臓ＴＧａｓｅを用いて行なわれ、５キロダルトンのＰＥＧ基の結合に続き、ＥＰＯはその活性の約４０％を保持していることが示された。ＴＧａｓｅに関する既知のアシル供与体基質であるＣｂｚ−ＱＧの結合及び続くペプチドマッピングは、ＥＰＯ上のＬｙｓ４５がＴＧａｓｅに関する非常に有効なアミン供与体基質部位として働くこと、ならびにＬｙｓ１５４もアミン供与体部位として働くことができることを示した。
実施例
［実施例１］
【００４９】
モルモット肝臓トランスグルタミナーゼを用いるヒトエリトロポエチンへのダンシル−カダベリン基質の複合化
組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）（１０μＭ）を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）及び１０ｍＭ ＣａＣｌ２中でダンシル−カダベリン（ＤＣ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（３ｍＭ）及びＴＧａｓｅ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（０．１５Ｕ／ｍｌ）と一緒に、３７℃で３時間インキュベーションした。ダンシル−カダベリンはＴＧａｓｅｓに関する周知の基質であり、反応の追跡を容易にするための蛍光マーカーを与える。反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、結果を図２に示す。ＥＰＯバンドの蛍光はＴＧａｓｅを介するＤＣの結合を確証し、ＥＰＯ上にアミン−受容体部位が存在することを示す。ＰＢＳを用いて平衡化されたＺｏｒｂａｘ ＧＦ−２５０ ＸＬ ＨＰＬＣカラム上で生成物を精製した。
【００５０】
ゲル中に蛍光性二量体及び三量体が存在することは、ＥＰＯ中のグルタミン残基の１個もしくはそれより多くとの架橋のためにリシン基質を備えていることにより、ＥＰＯ自身がＴＧａｓｅ基質として働くことができることを示す。これらのバンドが蛍光性であり、且つ架橋されているという事実は、ＥＰＯ上の少なくとも２個の異なるグルタミン残基が
ＴＧａｓｅアシル−供与体部位として働くことができる可能性を生ずる。
［実施例２］
【００５１】
モルモット肝臓トランスグルタミナーゼを用いるヒトエリトロポエチンへのカダベリン−Ｘ−ビオチン基質の複合化
組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）（５０〜１００μＭ）を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）及び１０ｍＭ ＣａＣｌ２中でカダベリン−Ｘ−ビオチン（Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）（３０ｍＭ）及びＴＧａｓｅ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（０．１５Ｕ／ｍｌ）と一緒に、３７℃で３時間インキュベーションした。ＰＢＳを用いて平衡化されたＺｏｒｂａｘ ＧＦ−２５０ ＸＬ ＨＰＬＣカラム上で生成物を精製した。
［実施例３］
【００５２】
モルモット肝臓トランスグルタミナーゼを用いるヒトエリトロポエチンへのＣｂｚ−ＱＧ基質の複合化
組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）（１．９６ｍｇ／ｍｌ）を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）及び１０ｍＭ ＣａＣｌ２中でＮ−α−ベンジルオキシカルボニルグルタミニルグリシン（Ｃｂｚ−ＱＧ）（１５ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及びＴＧａｓｅ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（０．１５Ｕ／ｍｌ）と一緒に、３７℃で３時間インキュベーションした。ＰＢＳを用いて平衡化されたＺｏｒｂａｘ ＧＦ−２５０ ＸＬ ＨＰＬＣカラム上で生成物を精製した。
［実施例４］
【００５３】
ＥＰＯ−ＤＣ、ＥＰＯ−カダベリン−Ｘ−ビオチン及びＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）の特性化及びペプチドマッピング
脱グリコシル化のために、５０μｌのｒｈＥＰＯ又は複合体（０．２〜２ｍｇ／ｍｌ）を５０μｌのＲａｐｉＧｅｓｔ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）（ＰＢＳ中の２ｍｇ／ｍｌ）中に希釈した。これに１０μｌのＮＰ−４０洗剤溶液（１５％）、それぞれ１０μｌのＰＮＧａｓｅ Ｆ、シアリダーゼ Ａ及びＯ−グリカナーゼ（Ｐｒｏｚｙｍｅ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）を加えた。溶液を３７度で合計９６時間インキュベーションした。試料を１：１の水／アセトニトリル（＋０．１％ トリフルオロ酢酸）中のシナピン酸と混合し、ＭＡＬＤＩ ＭＳプレート上にスポッティングすることにより無損傷の質量を得、続いてＡＢＩ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ−ＳＴＲ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ上で分析した。２５０００Ｖの集積電圧（ａｃｅｒｖａｔｉｎｇ ｖｏｌｔａｇｅ）を用い、直線様式で（ｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｍｏｄｅ）でタンパク質を分析した（図３及び５）。これに続き、それぞれ５０μＬを５μＬの４５ｍＭ ＤＴＴと混合し、溶液を６５℃で２０分間インキュベーションした。次いで５μＬの１００ｍＭヨードアセトアミドを加え、溶液を暗所で室温において２０分間インキュベーションした。次いで５μＬのＬｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（１．３μｇ／μｌ）を加え、溶液を３７℃で２０〜２４時間インキュベーションした。逆−相ＨＰＬＣ及びＷａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ３００ １ｘ５０ｍｍ Ｃ１８カラムを用いて各タンパク質消化物を分離した。それぞれの分離された消化物をＭＡＬＤＩプレート上に自動的にスポッティングし、分析した。イオン化のために、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸／ジヒドロキシ安息香酸（α−シアノ／ＤＨＢ）の飽和混合マトリックスを用いた（図４）。
【００５４】
図３は、ＥＰＯ及びそれぞれの複合体の脱グリコシル化された試料に関する無損傷の質量を示す。パネル（Ｂ）は１８７２５に小さいピークを示し、それは１個のカダベリン−Ｘ−ビオチン部分の付加に対応する（計算分子量シフト＝＋４２４）。パネル（Ｃ）は、１個のダンシル−カダベリン部分の付加に対応する１８６０３にピークを示し（計算分子
量シフト＝＋３１７）、パネル（Ｄ）は、１個のＣｂｚ−ＱＧペプチドの付加に対応する１８５９２にピークを示す（計算分子量シフト＝＋３１９）。このデータから、Ｃｂｚ−ＱＧの結合がダンシル−カダベリン又はカダベリン−Ｘ−ビオチンの結合より有効であると思われる。しかしながら、３つのすべての場合にＥＰＯはＴＧａｓｅ基質の結合を示す。
【００５５】
図４は、ＥＰＯ−カダベリン−Ｘ−ビオチン及びＥＰＯ−ＤＣのＬｙｓ−Ｃ消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）の質量スペクトルを示す。パネル（Ａ）及び（Ｂ）中の１９５８におけるピークは、ＥＰＯの残基９８−１１６を含有するものに対応する。矢印により示されるピークは、そのペプチドへのカダベリン−Ｘ−ビオチンの付加に対応する。これは、Ｇｌｎ１１５がＴＧａｓｅ基質部位として働くことを示し、それはそれがそのペプチド中の唯一のＧｌｎ残基であり、ＴＧａｓｅのみがカダベリンをＧｌｎ残基に結合させるからである。図４のパネル（Ｃ）及び（Ｄ）は、脱グリコシル化されたＥＰＯ及びＥＰＯ−ＤＣのＬｙｓ−Ｃ消化物のＭＡＬＤＩ ＭＳを示す。５０３８近辺のピークはＥＰＯの残基５３−９７（計算分子量＝５０２４．８）に対応する。パネル（Ｄ）において、５３５７におけるピークは３１９の分子量シフトに対応し、ダンシルカダベリン部分がタンパク質のこの領域内の残基において結合したことを示す。このペプチド中に６個のグルタミンが含有されるので、修飾された残基の正体は突き止められ得なかった。
【００５６】
図５のパネル（Ａ）及び（Ｂ）は、脱グリコシル化ｒｈＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）の２つの異なるバッチのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量スペクトルを示す。１８５８０近辺のピークはｒｈＥＰＯへの１個のＣｂｚ−ＱＧ（計算分子量シフト＝＋３１９）部分の結合に対応し、両スペクトルは、タンパク質の大部分が両バッチにおいて修飾されたこと、ならびにｒｈＥＰＯへのこのペプチドの結合が非常に再現性のあるものであることを示す。パネル（Ｃ）及び（Ｄ）は、脱グリコシル化ｒｈＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）のＬｙｓ−Ｃ消化物のＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量スペクトルを示す。パネル（Ｃ）は、Ｌｙｓ４５における追加の（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ）Ｃｂｚ−ＱＧ部分を有するＥＰＯの残基２１−５２に対応する４０４６にピークを示す（計算分子量＝４０３２．１）。Ｌｙｓ−Ｃは、修飾のためにＬｙｓ４５において切断しなかった。パネル（Ｄ）は、付加されたＣｂｚ−ＱＧ部分を有する残基１５３−１６５に対応する１８０７にピークを示す（計算分子量＝１８０２．６）。このペプチドにおいて、Ｌｙｓ１５４はＣｂｚ−ＱＧの結合のために切断されず、Ｌｙｓ１５４が修飾されていることを示す。
【００５７】
本明細書に記載されるＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量スペクトルを得るために、大きな質量ウインドウ（ｍａｓｓ ｗｉｎｄｏｗ）が必要であった。このために、スペクトルにおいて有意なドリフトが観察された。この理由で、複合体に関する分子量変化は、各個別の試料において修飾されないＥＰＯの場合に観察される分子量への比較により計算された。無損傷の脱グリコシル化試料に関する質量データ及びＬｙｓ−Ｃ消化データは一緒になって、ＴＧａｓｅの存在下でＧｌｎ１１５がカダベリン−Ｘ−ビオチン及びダンシル−カダベリンの両方で修飾されたこと、ならびにｒｈＥＰＯ中の少なくとも１個の他のＧｌｎ残基がダンシル−カダベリン修飾を受けたことを確証する。データは、ｒｈＥＰＯのＬｙｓ４５及びＬｙｓ１５４がＴＧａｓｅの存在下でＣｂｚ−ＱＧ修飾を受けたこと、ならびに分析された両バッチにおいて、最高でタンパク質の９０％が修飾されたことも示す。
［実施例５］
【００５８】
ｒｈＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）のＵＴ７アッセイ
ｒｈＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）につき、以下の通りにＵＴ７アッセイを行なった：アッセイの前に、Ｌ−ｇｌｕ及び５％ＦＢＳを含み、Ｅｐｏを含まないＩＭＤＭ中で、ＵＴ７細胞を２４時間飢えさせた。細胞を洗浄し、ウェル当たり３０，０００個の細胞においてプレート化した。ＥＰＯ（２０〜０．０１９５２ｎｇ／ｍＬ）及びｒｈＥＰＯ−（Ｃｂｚ
−ＱＧ）（２０〜０．０１９５２ｎｇ／ｍＬ）の希釈液を加え、二重に検定した。プレートを３７℃で４８時間インキュベーションし、Ｐｒｏｍｅｇａ’ｓ ＭＴＳ溶液を用い、１、２及び３時間間隔でとられるＯＤ読取りを用いて検定した。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏを用いて値をバックグラウンド修正した。平均バックグラウンドは０．２９２であった。アッセイは、複合体が非修飾ＥＰＯより約４倍活性が低い（４−ｆｏｌｄ ｌｅｓｓ ａｃｔｉｖｅ）ことを示し（図６を参照されたい）、受容体結合に有意に含まれる残基において修飾が起こらなかったことを示す。これは、Ｌｙｓ４５又はＬｙｓ１５４の修飾が活性における有意な損失に寄与しないことを意味し、ｒｈＥＰＯがその受容体に結合する能力に有意に影響することなく、これらの部位において他の修飾又は突然変異を行い得ることを示唆する。
［実施例６］
【００５９】
カダベリン−ＰＥＧ（２０Ｋ）の合成
商業的に入手可能な試薬を用いてカダベリン−ＰＥＧ（２０Ｋ）を合成した。２５ｍｇのカダベリンヒドロクロリド塩（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を５ｍｌのＰＢＳ中に溶解し、ｐＨを７に調整した。これに２５ｍｇのｍＰＥＧ（２０Ｋ）−スクシンイミジルプロピオネート（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａ）を加え、反応物を２２℃で２時間インキュベーションした。反応混合物を水中の０．１％酢酸に対して透析し、凍結乾燥した。
【００６０】
【化２】
［実施例７］
【００６１】
プトレッシン−ＰＥＧ（２０Ｋ）の合成
３００ｍｇのプトレッシンヒドロクロリド（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を１０ｍｌのＰＢＳ中に溶解し、ｐＨを７に調整することにより、プトレッシン−ＰＥＧ（５Ｋ）を合成した。１００ｍｇのｍＰＥＧ（５Ｋ）−スクシンイミジルプロピオネート（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａ）を加え、２２℃で２時間反応させた。反応混合物を水中の０．１％酢酸に対して透析し、凍結乾燥した。
【００６２】
【化３】
［実施例８］
【００６３】
プトレッシン−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（３．４Ｋ）の合成
１７６．５ｍｇのプトレッシンを１．７６５ｍｌのＰＢＳ（ｐｈ ７．４）中に溶解することにより、プトレッシン−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（３．４Ｋ）を合成した。１３．５ｍｇのＮＨＳ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（３．４Ｋ）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａ）を１ｍｌのエタノール／ＰＢＳ（１：１）中に溶解した。次いで１ｍｌのＮＨＳ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ溶液を１．７０４ｍｌのプトレッシン溶液
に滴下し、反応物を２２℃で４時間攪拌し、次いで０．１％酢酸（ｐＨ ４．５）で平衡化されたＺｏｒｂａｘ ＧＦ−２５０ ＸＬカラム上で精製した。
【００６４】
【化４】
［実施例７］
【００６５】
モルモット肝臓トランスグルタミナーゼを用いるヒトエリトロポエチンへのカダベリン−ＰＥＧ（２０Ｋ）基質の複合化
ＤＣの代わりに３．３ｍＭのカダベリン−ＰＥＧ（２０Ｋ）を用いる以外は実施例１に示した条件を用いて、カダベリン−ＰＥＧ（２０Ｋ）をＥＰＯと反応させた。図７は反応生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示し、図８は生成物のＳＥＬＤＩ質量スペクトルを示す。両方は、カダベリン−ＰＥＧ（２０Ｋ）がＥＰＯに結合したことを示す。ＳＥＬＤＩ−ＭＳのための試料は、標準的な案を用いてＣ−４ジップチップ（ｚｉｐ ｔｉｐ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから）を用いて脱塩し、金ＳＥＬＤＩチップ上にスポッティングすることにより調製された。
【００６６】
【化５】
［実施例８］
【００６７】
モルモット肝臓トランスグルタミナーゼを用いるヒトエリトロポエチンへのプトレッシン−ＰＥＧ（５Ｋ）基質の複合化
ＰＥＧ（２０Ｋ）−カダベリンの代わりに５ｍＭ ＰＥＧ（５Ｋ）−プトレッシンを用いる以外は実施例７に記載した条件を用い、プトレッシン−ＰＥＧ（５Ｋ）をＥＰＯと反応させた。プトレッシンはカダベリンより優れたＴＧａｓｅｓに関する基質であることが既知である（Ｆｏｌｋ ａｎｄ Ｃｈｕｎｇ，１９７３ 上記を参照されたい）。図９はＥＰＯ原液と比較された精製ＥＰＯ−プトレッシン−ＰＥＧ（５Ｋ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４−２０％）を示し、図１０はＥＰＯ＋ＴＧａｓｅ＋プトレッシン−ＰＥＧ（５Ｋ）から成る反応混合物のＳＥＬＤＩ−ＭＳを示し、図１１は精製されたＥＰＯ−プトレッシン−ＰＥＧ（５Ｋ）のＳＥＬＤＩ−ＭＳを示す。これらのデータは、プトレッシン−ＰＥＧ（５Ｋ）がＥＰＯへの複合化に成功したこと、ならびに精製されたＥＰＯ−プトレッシン−ＰＥＧ（５Ｋ）が少量の非修飾ＥＰＯしか含有しないことを示す。ＳＥＬＤＩ試料は、Ｈ−４ ＳＥＬＤＩチップ上にスポッティングし、３μｌの水で洗浄し、１μｌの飽和シナピン酸を加えることにより調製された。ＥＰＯ−プトレッシン−ＰＥＧ（５Ｋ）につき、以下の通りにＵＴ７アッセイを行なった：アッセイの前に、Ｌ−ｇｌｕ及び５％ＦＢＳを含み、Ｅｐｏを含まないＩＭＤＭ中で、ＵＴ７細胞を２４時間飢えさせた。細胞を洗浄し、ウェル当たり３０，０００個の細胞においてプレート化した。ＥＰＯ（２．５〜０．００２５ｎｇ／ｍＬ）及びＥＰＯ−ＰＥＧ（２０〜０．０１９５２ｎｇ／ｍＬ）の希釈液を加え、二重に検定した。プレートを３７℃で４８時間インキュベーションし、Ｐｒｏｍｅｇａ’ｓ ＭＴＳ溶液を用い、１、２及び３時間間隔でとられるＯＤ読取りを用い
て検定した。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏを用いて値をバックグラウンド修正した。平均バックグラウンドは０．２９３であった。アッセイは、複合体が非修飾ＥＰＯより約２．５倍活性が低い（２．５−ｆｏｌｄ ｌｅｓｓ ａｃｔｉｖｅ）ことを示し（図１２を参照されたい）、受容体結合に有意に含まれる残基において修飾が起こらなかったことを示す。活性における損失は、結合界面において立体的に妨害するＰＥＧの故であるのが最もあり得ることである。
［実施例９］
【００６８】
モルモット肝臓トランスグルタミナーゼを用いるヒトエリトロポエチンへのプトレッシン−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（３．４Ｋ）基質の複合化
プトレッシン−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（３．４Ｋ）（５．１ｍＭ）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）及び１０ｍＭ ＣａＣｌ２中の種々の濃度のエタノール（最高で５５％）及びＴＧａｓｅ（０．１５Ｕ／ｍｌ）中でＥＰＯ（４．８μＭ）と一緒にインキュベーションした。ＳＥＬＤＩ−ＭＳは、修飾されたＥＰＯのパーセントを定量するためには反応体積が十分でなかったが、５５％エタノールにおいてＥＰＯ当たりに最高で３個のプトレッシン−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（３．４Ｋ）部分が結合したことを示す（図１３を参照されたい）。これらのデータは、ＥＰＯ上の最高で３個のグルタミン残基がこれらの条件下でＴＧａｓｅ基質として働き得ることも確証する。ＳＥＬＤＩ試料は、Ｈ−４ ＳＥＬＤＩチップ上にスポッティングし、３μｌの水で洗浄し、１μｌの飽和シナピン酸を加えることにより調製された。
【００６９】
これらの実施例は、ＥＰＯ上の少なくとも３個のグルタミン残基がＴＧａｓｅ触媒反応を介する小分子、ＰＥＧ基（５Ｋ〜２０Ｋ）、ＰＥＧ化脂質及びタンパク質の結合のための部位として働き得ることを示す。１個のＰＥＧ化構築物の生物学的活性が確かめられ、わずかにしか低下しないことが示された。これらの修飾のいずれかの故に循環半減期が有意に延長されるなら、そのような活性の小さい損失は、修飾されたタンパク質のおそらく向上する薬物動態学と比較すると、有意でないはずである。
［実施例１０］
【００７０】
ＴＧａｓｅアミン受容体基質の合成及びｒｈＥＰＯへの結合
少なくとも１個のグルタミン残基を含有するペプチドを標準的な固相Ｆｍｏｃ化学により合成する。合成の完了に続き、ピペリジンを用いてペプチド樹脂を脱保護し、洗浄し、ＰＥＧ又は活性化エステルを含有する他のポリマーと反応させる。反応に続き、標準的なＴＦＡ条件を用いてペプチド−ＰＥＧ複合体を樹脂から切断し、エーテル中で沈殿させる。次いでペプチド−ＰＥＧ複合体を逆相ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥する。
【００７１】
組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）（１０μＭ）を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）及び１０ｍＭ ＣａＣｌ２中でペプチド−ＰＥＧ複合体（１５ｍＭ）及びＴＧａｓｅ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（０．１５Ｕ／ｍｌ）と一緒に３７℃で３時間インキュベーションする。反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＢＳで平衡化されたＺｏｒｂａｘ ＧＦ−２５０ ＸＬ ＨＰＬＣカラム上で生成物を精製する。
［実施例１１］
【００７２】
ＵＴ７細胞増殖アッセイ
ＵＴ７は、ＥＰＯ依存性となるように適応させられたヒト白血病細胞系である（Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．著，Ｂｌｏｏｄ ８２（２），４５６−４６４，１９９３）。ＵＴ７細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、アッセイの前に２４時間ＥＰＯを絶つ。Ｌ−グルタミン及び５％におけるＦＢＳが加えられたＩＭＤＭ培地中でＵＴ−７細胞を飢えさせる（１５Ｑ）。細胞を５０ｍＬのＤＰＢＳ中で１回洗浄し、ＤＰＢＳ中に懸濁されている間にカウントし、適した培地中にｍＬ当たり６ｘ１０５個の細胞の最終的濃度に懸濁させ
る（ウェル当たり３０，０００個の細胞の最終的濃度を与える）。ＥＰＯ原液（１．７ｍｇ／ｍＬ）を０．８５μｇ／ｍＬに希釈することにより、ＥＰＯ標準を調製する（４ｍＬの培地中に２μＬ）。１５Ｑ培地中で原液を２：３４０に希釈して５ｎｇ／ｍＬとし、続いて１：２系列希釈で０．００９８ｎｇ／ｍＬの濃度に下げる。得られる希釈液は２．５ｎｇ／ｍＬ〜０．００２４ｎｇ／ｍＬの濃度における標準を与える。試験試料を類似の方法で希釈する。ＵＴ−７細胞懸濁液の５０μＬのアリコートを対応するウェルに移し、プレートを３７℃で４８時間インキュベーションする。Ｐｒｏｍｅｇａ’ｓ ＭＴＳ溶液を用い、ウェル当たり２０μｌ加えて細胞増殖を評価する。ＭＴＳ添加から１時間後に読取りを開始する。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】ヒトエリトロポエチンの成熟鎖のアミノ酸配列。
【図２】蛍光標識されたＴＧａｓｅ基質、ダンシルカダベリン（ＤＣ）をＴＧａｓｅの存在下又は不在下でタンパク質と一緒にインキュベーションしたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像。
【図３】（ａ）脱グリコシル化ＥＰＯ、（ｂ）脱グリコシル化ＥＰＯ−カダベリン−Ｘ−ビオチン、（ｃ）脱グリコシル化ＥＰＯ−ＤＣ及び（ｄ）脱グリコシル化ＥＰＯ−ｃｂｚのＭＡＬＤＩ ＭＳ分析。
【図４】（ａ）ＥＰＯのＬｙｓ−Ｃ消化物（標準）；（ｂ）ＥＰＯ−Ｘ−ビオチンのＬｙｓ−Ｃ消化物；（ｃ）脱グリコシル化ＥＰＯのＬｙｓ−Ｃ消化物（標準）；（ｄ）脱グリコシル化ＥＰＯ−ＤＣのＬｙｓ−Ｃ消化物に関するＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量スペクトル。
【図５】（ａ）脱グリコシル化ＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）バッチ＃１；（ｂ）脱グリコシル化ＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）バッチ＃２；（ｃ）脱グリコシル化ＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）バッチ＃１のＬｙｓ−Ｃ消化物；（ｄ）脱グリコシル化ＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）バッチ＃１のＬｙｓ−Ｃ消化物に関するＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量スペクトル。
【図６】ＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）又は非修飾ＥＰＯ（ＥＰＯ標準）と一緒にインキュベーションされたＵＴ７細胞の造血に関する吸光度対付加されたＥＰＯ種の濃度のグラフ。
【図７】ＴＧａｓｅ触媒反応を介するカダベリン−ＰＥＧ（２０Ｋ）のＥＰＯへの結合を示す、銀−染色ポリアクリルアミドゲルの画像。
【図８】ＥＰＯ＋ＰＥＧ２０Ｋ−カダベリン＋ＴＧａｓｅの反応混合物のＳＥＬＤＩ−ＭＳにおける質量対電荷比に対する強度の図形。
【図９】ＥＰＯ（列１）及び精製されたＥＰＯ−ＰＥＧ５Ｋ−プトレッシン（列２）の銀−染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４−２０％）。
【図１０】反応混合物（ＥＰＯ＋ＰＥＧ（５Ｋ）−プトレッシン＋ＴＧａｓｅ）のＳＥＬＤＩ−ＭＳにおける質量対電荷比に対する強度の図形。
【図１１】精製されたＥＰＯ＋ＰＥＧ（５Ｋ）−プトレッシンに関するＳＥＬＤＩ−ＭＳにおける質量対電荷比に対する強度の図形。
【図１２】ＥＰＯ−プトレッシン−ＰＥＧ（５Ｋ）（ＥＰＯ−ＰＥＧ）又は非修飾ＥＰＯ（ＥＰＯ−標準）と一緒にインキュベーションされたＵＴ７細胞の造血に関する吸光度対付加されたＥＰＯ種の濃度のグラフ。
【図１３】ＥＰＯ＋プトレッシン−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ３．４Ｋ＋ＴＧａｓｅ（５５％エタノール及び４５％ＴＧａｓｅ反応緩衝液，ｐＨ７．５）の反応のＳＥＬＤＩ−ＭＳにおける質量対電荷比に対する強度の図形。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、構造に基を結合させるか又は一次配列の突然変異を介して生物学的活性を変更する酵素的方法を用いて製造されるエリトロポエチンの新規な調製物に関する。特に、本発明は、変更された生理化学的及び薬物動態学的性質を有するエリトロポエチン複合体化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
エリトロポエチン（ＥＰＯ）は自然に生成する糖タンパク質であり、それはコロニー刺激因子として機能し、赤血球合成の調節に含まれる主要因子として働く。エリトロポエチンは、骨髄中の前駆体細胞を刺激してそれらを分裂させ、成熟赤血球に分化させることにより働く。このプロセスは、赤血球の破壊もしくは循環からの除去が新しい細胞形成の速度に調和するように、体内で厳密に制御される。天然に存在するＥＰＯは、腎臓で生産される糖タンパク質である（非特許文献１）。
【０００３】
エリトロポエチンは組換えＤＮＡ法を用い、ＥＰＯ遺伝子のクローニング及びチャイニーズハムスター卵巣細胞における発現を介して製造された（Ｌｉｎ，特許文献１）。組換え的に生産されるＥＰＯはしばらくの間、慢性腎不全、ジドビジン（ｚｉｄｏｖｉｄｉｎｅ）処置されたＨＩＶ感染患者及び骨髄抑制化学療法にあるガン患者と関連する貧血を含む種々の形態の貧血の処置において有効な治療薬として利用できた。糖タンパク質は非経口的に、担体としてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有する通常の緩衝された水溶液中の静脈内（ＩＶ）又は皮下（ＳＣ）注射として投与される。そのような調製物は合衆国内でＥＰＯＧＥＮＲ及びＰＲＯＣＲＩＴＲの商品名の下に販売されている。これらの製品は、防腐剤を含まない１ｍｌの単投薬量で、あるいは２ｍｌの複数投薬量の防腐されたバイアルにおいてエリトロポエチンを含有する。
【０００４】
これらの調製物は非常に成功に満ちたものであることが証明されたが、ある種の欠点が生成物に伴う。現在、エリトロポエチンのようなタンパク質治療薬の生物学的活性の期間は、短い血漿半減期及びプロテアーゼ分解を受け易いことにより限られている。ＥＰＯのような治療用タンパク質の４時間の短い半減期は、最大の臨床的有効性のために頻繁な投与を必要とする。これは慢性状態の処置のために不利であり、劣った患者のコンプライアンス、従って最適の結果より低い結果を生じ得る。従って、ＥＰＯの血漿半減期を延長させる試みが成されてきた。
【０００５】
近年、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非−抗原性水溶性ポリマーが治療的及び診断的に重要なポリペプチドの共有結合的修飾のために用いられてきた。例えば生体内におけるペプチドの半減期を延長するため、ならびに／又はそれらの免疫原性及び抗原性を減少させるために、インターロイキン（非特許文献２，非特許文献３）、インターフェロン（非特許文献４）、カタラーゼ（非特許文献５）、スーパーオキシドジスムターゼ（非特許文献６）及びアデノシンデアミナーゼ（非特許文献７）のような治療用ポリペプチドへのＰＥＧの共有結合が報告された。
【０００６】
誘導体化ＰＥＧ化合物は以前に報告されている（特許文献２，１９９５年８月１日，Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ−Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ｓａｍｅ，ａｎｄ Ｍｅｔｈ
ｏｄ ｏｆ Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｍｅ，Ｎ．Ｎ．Ｅｋｗｕｒｉｂｅ）。翻訳後誘導体化のためのこの方法はＥＰＯにも適用された。例えば特許文献３は、エリトロポエチン活性を有する炭水化物修飾ポリマー複合体を開示しており、この場合ＰＥＧは酸化された炭水化物を介して連結する。特許文献４は、ＥＰＯを含むリシン−枯渇（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）ポリペプチド変異体のポリアルキレンオキシド複合体を開示している。特許文献５は、ＥＰＯが遺伝子工学により導入されるシステイン残基を含有し、それに特殊なＰＥＧ試薬が共有結合するモノメトキシ−ＰＥＧ−ＥＰＯ（ｍＰＥＧ−ＥＰＯ）の製造を記載している。他のＰＥＧ−ＥＰＯ組成物は特許文献６、特許文献７、特許文献８及び特許文献９に開示されている。
【０００７】
純粋に化学的な方法を用いるＰＥＧへの複合化（「ＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）」）によりタンパク質を修飾する多くの方法のよくある制限的側面は、アミン基との無差別且つ多くの場合に不完全な反応であり、それはタンパク質の近づき得るリシン残基及び／又はＮ−末端アミンに起こり得る。他の化学的方法は、修飾戦略の一部として炭水化物基の酸化を必要とし、同様に不完全な又は一貫しない反応及び限定されない生成物組成物を生ずる。かくして利用可能な現在の選択肢を考えると、穏やかな部位−特異的やり方でＥＰＯを修飾するための方法が有利であろう。
【０００８】
トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅｓ）［ＥＣ２．３．２．１３；タンパク質−グルタミン：ガンマグルタミルトランスフェラーゼ］は、第１級アミンへのカルシウム−依存性アシル付加を触媒するタンパク質の群であり、付加においてはペプチド−結合グルタミン残基のガンマ−カルボキシアミド基がアシル供与体であり、第１級アミンがアシル受容体及びアミン供与体である。自然には、向き合ったタンパク質上のリシン及びグルタミン残基の間のアミド結合の形成を触媒することにより、ＴＧａｓｅｓがタンパク質を架橋する。周知の例はＴＧａｓｅ ＸＩＩＩａ因子によるフィブリン架橋である。この結合は安定であり、且つプロテアーゼに対して抵抗性であり、かくしてＴＧａｓｅｓは一般に細胞の構造成分を結合させるために用いられる。上記の血漿形態の他に、ＴＧａｓｅｓは肝臓、皮膚及び細胞外液のような組織中で見出される（非特許文献８）。ＴＧａｓｅの原核形態も既知である（非特許文献９，非特許文献１０）。ＴＧａｓｅｓの特異性は非常に顕著であり、通常タンパク質当たりに１個又はいくつかの場合に２個のみのグルタミン残基がアミン受容体として働く。種々の哺乳類組織及び種からのＴＧａｓｅｓが広範囲に研究された（非特許文献１１，非特許文献１２，非特許文献１３，非特許文献１４）。かくしてＴＧａｓｅｓをいくつかのタンパク質上のグルタミン残基を部位−特異的に修飾するために用いることができるはずであり、用いられてきた（特許文献１０，特許文献１１，特許文献１２）。
【０００９】
【化１】
【００１０】
多数の研究にかかわらず、ＴＧａｓｅ特異性の決定因子について少ない詳細しか明らかになっていない。ＴＧａｓｅｓは基質特異性において異なり、アシル供与体又は受容体として残基を選ぶ場合、基質残基を含有するかもしくはそれに隣接するとしての特定の配列モチーフの採択は、個々の酵素に関して一般的に同定されていない（非特許文献１５，非特許文献１６）。唯一の限定的な規則は、いずれのＴＧａｓｅに関する基質として働くた
めにも、グルタミン残基がＮ−末端から少なくとも３個の残基の位置になければならないことである。一般にグルタミン繰り返しは繰り返し中の各グルタミン残基の受容体性を強化することが示され、グルタミン残基の近づき易さもＴＧａｓｅ基質として機能するそれらの能力の決定において重要であることが示された（非特許文献１７）。
【００１１】
ＴＧａｓｅ修飾の部位−特異性が１９６０年代以来既知であり、且つ食品の安定化における工業的使用が実施されているが、治療用タンパク質の修飾における使用は最近探求され始めたのみである。脂肪族アミノ基を含有する５キロダルトンもしくはそれより大きいポリマーをタンパク質結合グルタミン残基に結合させるためのＴＧａｓｅｓの使用は最近、特許文献１２においてＳａｔｏ，ｅｔ ａｌにより開示された。この特許は、続いてＴＧａｓｅ触媒反応を用いて大ポリマーを結合させる目的のために、ＴＧａｓｅ基質であることが既知の付加されたＮ−末端もしくはＣ−末端ペプチドを含有するようにタンパク質を操作する方法も開示している。ＩＬ−２のＰＥＧ化がこれらの方法を用いて行なわれ（非特許文献１８）、バクテリアＴＧａｓｅを用いるＩＬ−２の種々の他のタンパク質への架橋（Ｔａｋａｈａｒａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．特許文献１０）ならびに組織操作のための修飾フィブリンマトリックスの形成におけるＸＩＩＩａ因子の使用（特許文献１１）も示された。
【００１２】
天然に存在する分子への修飾又はモチーフの付加は、治療用タンパク質のための製造方法を与える目的の遺伝子工学の分野に従事するものには周知の複数の危険を伴う。これらの影響の最も明白なものは、生物学的活性の喪失又は部分的喪失である。他の場合、哺乳類細胞系中に導入されると、構築される発現ベクターからの発現レベルが許容され得ないほど低い。天然に存在するタンパク質基質からの既知の基質配列のカップリング又は融合の別の方法は、抗原性エピトープを形成し、患者において望ましくない免疫反応を引き起こし得、それは結局治療用タンパク質の長期間有効性を制限する。さらに、最も反応性の官能基、リシンを攻撃する化学的方法を用いるタンパク質の修飾は、タンパク質の等電点及びｐＫａも変える。従って、目的が安全且つ経済的に製造される生成物を与えることである場合、これらの制限を理解することが重要である。グルタミンのアミド基のアルキル化アミンへの転換はそのグルタミンの等電点又は電荷を変化させない。かくして、安定な共有結合を形成するが、タンパク質の電荷を改変しない酵素的方法の使用が望ましいであろう。これまで、ＥＰＯは自然のＴＧａｓｅ基質と考えられてもこなかったし、ＥＰＯにおいてＴＧａｓｅ基質部位を形成するか、又は除去するための分子の再−操作も記載されていない。
【特許文献１】米国特許第５６１８６９８号明細書
【特許文献２】米国特許第５４３８０４０号明細書
【特許文献３】国際公開第９４／２８０２４号パンフレット
【特許文献４】米国特許第４９０４５８４号明細書
【特許文献５】国際公開第９０／１２８７４号パンフレット
【特許文献６】欧州特許第６０５６９３号明細書
【特許文献７】米国特許第６，０７７，９３９号明細書
【特許文献８】国際公開第０１／０２０１７号パンフレット
【特許文献９】欧州特許第５３９１６７号明細書
【特許文献１０】米国特許第６０１０８７１号明細書
【特許文献１１】米国特許第６３３１４２２号明細書
【特許文献１２】米国特許第６３２２９９６号明細書
【非特許文献１】Ｊａｃｏｂｓ，ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ ３１３（６００５），８０６−８１０（１９８５）
【非特許文献２】Ｋｎａｕｆ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８８，２６３，１５，０６４
【非特許文献３】Ｔｓｕｔｓｕｍｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １９９５，３３，４４７
【非特許文献４】Ｋｉｔａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．著，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ １９９０，６，１５７
【非特許文献５】Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９７７，２５２，３，５８２
【非特許文献６】Ｂｅａｕｃｈａｍｐ．Ｃ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．著，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８３，１３１，２５
【非特許文献７】Ｃｈｅｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．著，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １９８１，６６０，２９３
【非特許文献８】Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｃ．Ｓｅｔ ａｌ．著，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１９９１，５，３０７１−３０７７
【非特許文献９】Ａｎｄｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．著，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ５３（１０），２６１３−２６１７，１９８９
【非特許文献１０】Ｗａｓｈｉｚｕ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．著，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ５８（１），８２−８７，１９９４
【非特許文献１１】Ｆｏｌｋ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ Ｃｈｕｎｇ，Ｓ．Ｉ．著，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１９７３，３８，１０９−１９１
【非特許文献１２】Ｆｏｌｋ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ Ｆｉｎｌａｙｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．著，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．１９７７，３１，１−１３３
【非特許文献１３】Ｆｏｌｋ，Ｊ．Ｅ．＆ Ｃｏｌｅ，Ｐ．Ｗ．著，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １９６６，１２２，２４４−２６４
【非特許文献１４】Ｆｏｌｋ，Ｊ．Ｅ．；Ｃｈｕｎｇ，Ｓ．Ｉ．著，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９８５，１１３，３５８−３７５
【非特許文献１５】Ｇｏｒｍａｎ，Ｊ．Ｊ．；Ｆｏｌｋ，Ｊ．Ｅ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８１，２５６，２７１２−２７１５
【非特許文献１６】Ｇｏｒｍａｎ，Ｊ．Ｊ．；Ｆｏｌｋ，Ｊ．Ｅ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８０，２５５，４１９−４２７
【非特許文献１７】Ｋａｈｌｅｍ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９６，９３，１４５８０−１４５８５
【非特許文献１８】Ｓａｔｏ，Ｈ．；Ｉｋｅｄａ，Ｍ．；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．；Ｈｉｒａｙａｍａ．Ｋ．著，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６，３５，１３０７２−１３０８０
【発明の開示】
【００１３】
発明の概略
本発明は生物学的に活性なＥＰＯ複合体組成物を提供し、ここでＥＰＯはエリトロポエチン又は骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の生産の増加を生じさせる生物学的性質を有するその製薬学的に許容され得る誘導体であり、ここでＥＰＯ分子を非−抗原性親水性ポリマーに共有結合的且つ部位特異的に複合化させるためにトランスグルタミナーゼ反応が用いられ、非−抗原性親水性ポリマーは有機分子にも共有結合することができ、それらの修飾のいずれかが組成物の循環血清半減期を延長させる。
【００１４】
さらに特定的に、本発明の１つの態様は、かくして、式
ＥＰＯ−［Ｇｌｎ−Ａ−Ｘ−（Ｍ）ｎ］ｙ （Ｉ）
［式中、ＥＰＯはエリトロポエチン又は骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の生産の増加を生じさせる生物学的性質を有するその製薬学的に許容され得る誘導体であり；ＧｌｎはＥＰＯの一次配列内の１個もしくはそれより多いグルタミン残基から選ばれるグルタミン残基であり；ｙは修飾されたグルタミン残基の数を示す１〜７の整数であり；Ａはアミン供与体部分又はヒドロキシル基であり、Ｘは場合による親水性ポリマー部分であり；Ｍは構築物の循環半減期を延長させる場合による有機分子（ペプチド及びタンパク質を含む）であり；そしてｎは０〜１５の整数である］
により記載されるＥＰＯ誘導体に関する。部分Ｘ及びＭを必要通りに修飾し、カップリング又は原子価のために適した官能価を与えるように設計される基を含むようにすることができる。
【００１５】
有機分子、Ｍ、は任意（ｏｐｔｉｏｎａｌ）であり、親水性ポリマーに共有結合する。Ｍは得られる構築物の生体内半減期を延長させることができる有機部分から選ばれ、脂肪酸、ジカルボン酸、ジカルボン酸のモノエステル又はモノアミド、飽和脂肪酸を含有する脂質、不飽和脂肪酸を含有する脂質、飽和及び不飽和脂肪酸の混合物を含有する脂質、単純な炭水化物、複雑な炭水化物、炭素環式化合物（ステロイドのような）、複素環式化合物（アルカロイドのような）、アミノ酸鎖、タンパク質、酵素、酵素補因子又はビタミンが含まれる。
【００１６】
親水性ポリマーは、好ましくはポリエチレングリコールのようなポリアルキレンオキシドである。
【００１７】
本発明の他の態様は、式
ＥＰＯ−［Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｚ−Ｘ−（Ｍ）ｎ］ｙ （ＩＩ）
［式中、ＥＰＯはエリトロポエチン又は骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の生産の増加を生じさせる生物学的性質を有するその製薬学的に許容され得る誘導体であり；ＬｙｓはＥＰＯの一次配列内の１個もしくはそれより多いリシン残基から選ばれるリシン残基であり
；ｙは修飾されたリシン残基の数を示す１〜８の整数であり；Ｇｌｎはグルタミン残基であり；Ｚはトランスグルタミナーゼアミン受容体として働くことができるＧｌｎ残基を含有するペプチド又はタンパク質であり、Ｘは場合による親水性ポリマーであり；Ｍは、構築物の循環半減期を延長させる場合による有機分子（ペプチド及びタンパク質を含む）であり；Ｎは０〜１５の整数である］
により記載されるＥＰＯ誘導体に関する。部分Ｘ及びＭを必要な通りに修飾し、カップリング又は原子価のために適した官能価を与えるように設計される基を含むようにすることができる。
【００１８】
本発明は複合体の製造方法も提供する。該方法は、アグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）もしくはグリコシル化ＥＰＯ又はグルタミン残基を有する赤血球形成活性を有する糖タンパク質中の１個もしくはそれより多い特定のグルタミン残基への、アミノ基供与体もしくはアルキルアミン−複合体のアシル転移を触媒するためにＴＧａｓｅを用いる段階を含む。該方法は、ペプチド、タンパク質又は他のポリマー中の１個もしくはそれより多いグルタミン残基へのＥＰＯ上のアミノ基供与体のアシル転移を触媒するためにＴＧａｓｅを用いる段階も含む。
【００１９】
本発明に含まれるのは、ＴＧａｓｅ基質としてのＥＰＯの開示である。従って、グルタミンもしくはリシン残基又は他のいずれかの残基を突然変異させるか、付加するか又は修飾するための組換え的もしくは化学的手段によりＥＰＯ分子を改変し、ＥＰＯ分子がＴＧａｓｅ基質性として働くことを可能にするか又はその能力を向上させ、それによりアミン供与体又はアミン受容体部分を含有する親水性ポリマー又は他の有機部分へのＥＰＯ分子の複合化を可能にする方法もまた本発明に含まれる。ＴＧａｓｅ基質性はタンパク質の生物学的活性に含まれ得るので、組換え的又は化学的手段を介してＥＰＯ分子のＴＧａｓｅ基質性を向上又は低下させることも本発明に含まれる。かくして、本発明に従えばＥＰＯ分子を修飾して循環半減期を延長させるか、あるいは他に、哺乳類エリトロポエチン又はいずれかの複合体もしくは突然変異赤血球形成性タンパク質の生物学的活性を向上させることができる。
【００２０】
本発明は、内在性エリトロポエチン又は赤血球形成の減少と関連する貧血又は他の状態あるいは赤血球の増加が望まれる状態の処置方法も提供する。本発明のこの側面において、処置は本明細書に記載される複合体の有効量を、そのような治療の必要な哺乳類に投与することを含む。本発明の結果として、生体内における（ｉｎ ｖｉｖｏ）実質的に長期化した赤血球形成活性を有する複合体が与えられる。
【００２１】
本明細書で開示される方法は、延長された循環半減期及び向上した赤血球形成力価を有するＥＰＯ分子を与える利点を有する。さらに本発明の修飾ＥＰＯ分子は、複合化及び／又は突然変異が十分に制御され、実質的に十分に定義され且つ特性化された最終的生成物を生ずる点で利点を有する。
【００２２】
図面の簡単な記述
図１は、ヒトエリトロポエチンの成熟鎖のアミノ酸配列を示し、グルタミン残基は四角内である。
【００２３】
図２は、蛍光標識されたＴＧａｓｅ基質、ダンシルカダベリン（ＤＣ）をＴＧａｓｅの存在下又は不在下でタンパク質と一緒にインキュベーションしたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像である。ＵＶ露出を用いて標識を視覚化する：列１＝分子量マーカー。列２＝ＥＰＯ＋ＤＣ＋ＴＧａｓｅ。列３及び４＝ＥＰＯ＋ＤＣ；列５＝ＥＰＯ標準；及び列６＝ｂ−カゼイン＋ＤＣ＋ＴＧａｓｅ。ｂ−カゼインはＴＧａｓｅに関する既知の基質であり、正の標準として用いられた。列２における蛍光３５Ｋバンドは１個もしくはそれより多いＤＣ
分子が結合したＥＰＯに対応する。列２中のより高分子量のバンドはＥＰＯ二量体及び三量体に対応すると思われる。同ゲルを銀染色し、分子量マーカー及び他の非−蛍光バンドを同定した。
【００２４】
図３．（ａ）脱グリコシル化ＥＰＯ、（ｂ）脱グリコシル化ＥＰＯ−カダベリン−Ｘ−ビオチン（＋４２４の付加が見られるべきである）、（ｃ）脱グリコシル化ＥＰＯ−ＤＣ（＋３１８の付加が見られるべきである）及び（ｄ）脱グリコシル化ＥＰＯ−ｃｂｚ（＋３１９の付加が見られるべきである）のＭＡＬＤＩ ＭＳ分析。
【００２５】
図４．（ａ）ＥＰＯのＬｙｓ−Ｃ消化物（標準）；（ｂ）ＥＰＯ−Ｘ−ビオチンのＬｙｓ−Ｃ消化物；（ｃ）脱グリコシル化ＥＰＯのＬｙｓ−Ｃ消化物（標準）；（ｄ）脱グリコシル化ＥＰＯ−ＤＣのＬｙｓ−Ｃ消化物に関するＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量スペクトル。
【００２６】
図５．（ａ）脱グリコシル化ＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）バッチ＃１；（ｂ）脱グリコシル化ＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）バッチ＃２；（ｃ）脱グリコシル化ＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）バッチ＃１のＬｙｓ−Ｃ消化物；（ｄ）脱グリコシル化ＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）バッチ＃１のＬｙｓ−Ｃ消化物に関するＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量スペクトル。
【００２７】
図６は、ＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）又は非修飾ＥＰＯ（ＥＰＯ標準）と一緒にインキュベーションされたＵＴ７細胞の造血に関する吸光度対付加されたＥＰＯ種の濃度のグラフを示す。
【００２８】
図７は、ＴＧａｓｅ触媒反応を介するカダベリン−ＰＥＧ（２０Ｋ）のＥＰＯへの結合を示す、銀−染色ポリアクリルアミドゲルの画像である：列１＝分子量マーカー。列２＝ＥＰＯ＋ＴＧａｓｅ＋ＤＣ。列３＝ＥＰＯ標準。列４＝ＥＰＯ＋ＴＧａｓｅ（６時間）；列５＝ＥＰＯ＋ＴＧａｓｅ（２２時間）；列６及び７＝ＴＧａｓｅ（それぞれ６時間及び２２時間）；列８＝ＰＥＧ（２０Ｋ）−カダベリン；列９、１０及び１１＝ＥＰＯ＋ＰＥＧ２０Ｋ−カダベリン＋ＴＧａｓｅ（それぞれ６時間、２２時間及び２２時間（還元））。ＥＰＯ＋ＤＣ試料は、ＤＣの蛍光シグナルを最大にできるように、過剰負荷されたことに注意されたい。
【００２９】
図８は、ＥＰＯ＋ＰＥＧ２０Ｋ−カダベリン＋ＴＧａｓｅの反応混合物のＳＥＬＤＩ−ＭＳにおける質量対電荷比に対する強度の図形を示す。５１，０１０におけるピークはＰＥＧ化ＥＰＯ生成物に対応する。
【００３０】
図９は、ＥＰＯ（列１）及び精製されたＥＰＯ−ＰＥＧ５Ｋ−プトレッシン（列２）の銀−染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４−２０％）を示す。ＥＰＯ−プトレッシン−ＰＥＧ５Ｋ試料中に非常に少量の非修飾ＥＰＯが存在することに注意されたい。
【００３１】
図１０は、反応混合物（ＥＰＯ＋ＰＥＧ（５Ｋ）−プトレッシン＋ＴＧａｓｅ）のＳＥＬＤＩ−ＭＳにおける質量対電荷比に対する強度の図形を示す。
【００３２】
図１１は、精製されたＥＰＯ＋ＰＥＧ（５Ｋ）−プトレッシンに関するＳＥＬＤＩ−ＭＳにおける質量対電荷比に対する強度の図形を示す。（ＰＥＧ基はイオン化を抑制する傾向があり、かくしてピーク面積は存在する各種の相対的量の指標ではないことに注意されたい。）
図１２は、ＥＰＯ−プトレッシン−ＰＥＧ（５Ｋ）（ＥＰＯ−ＰＥＧ）又は非修飾ＥＰＯ（ＥＰＯ−標準）と一緒にインキュベーションされたＵＴ７細胞の造血に関する吸光度対付加されたＥＰＯ種の濃度のグラフを示す。
【００３３】
図１３は、ＥＰＯ＋プトレッシン−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ３．４Ｋ＋ＴＧａｓｅ（５５％エタノール及び４５％ＴＧａｓｅ反応緩衝液，ｐＨ７．５）の反応のＳＥＬＤＩ−ＭＳにおける質量対電荷比に対する強度の図形を示す。２８．８Ｋにおけるピークは非修飾ＥＰＯに対応し、３３．７Ｋ、３７．５Ｋ及び４１．６Ｋにおけるピークは、ＥＰＯ当たり１、２及び３個のプトレッシン−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ３．４Ｋ部分の付加に対応する。（脂質基はイオン化を抑制する傾向があり、かくしてピーク面積は存在する各種の相対的量の指標ではないことに注意されたい。）
詳細な記述
ＥＰＯは主に腎臓において生産され、前駆体細胞上の受容体二量体への結合を介して機能し、赤血球への分化及び続く増殖に導く（Ｌｉｖｎａｈ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．著，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９，２８３，９８７−９９０）。ＥＰＯの一次配列は７個のグルタミン残基を有する（配列番号：１）。集成されたＮＣＢＩファイル，Ｐ０１５８８はグルタミンを、成熟鎖の５８，５９，６５，７８，８６，９２及び１１５に対応する前駆体タンパク質の８５，８６，９２，１０５，１１３，１１９及び１４２の位置に記載している。これらを図１に示す。
【００３４】
ＥＰＯは２つの結合面を介して受容体に結合し、それらの一方は他方より受容体に関して高い親和性を有する。ＥＰＯの結晶構造は解明された（Ｓｙｅｄ，ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ ３９５（６７０１），５１１−５１６（１９９８）；Ｃｈｅｅｔｈａｍ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．著，Ｈｕｍａｎ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，ＮＭＲ ｍｉｎｉｍｉｚｅｄ ａｖｅｒａｇｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．８−Ｓｅｐ−１９９８．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａ ｂａｓｅ ＩＤ １ＢＵＹ）。その受容体に結合しているＥＰＯの結晶構造も記載されている（Ｓｔｒｏｕｄ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｒｅｉｄ，Ｓ．Ｗ．著，Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ
ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａ ｂａｓｅ ＩＤ １ＣＮ４）。複合体内で、ＥＰＯ上の８個のリシン残基の４個は受容体と直接接触するが、７個のグルタミン残基の１個を除くすべては溶媒が近づき得、Ｇｌｎ７８のみが受容体と何らかの可能な相互作用を示す。これらの観察から、ＥＰＯ上のグルタミン残基は受容体結合を妨げずにＰＥＧ又は他のポリマーの結合に関する有意な可能性を与えるが、リシン残基の無差別な修飾はある程度まで結合を妨げることがほとんど確実であることが明らかである。
【００３５】
ＥＰＯ上に存在するリシン残基のいくつかは受容体結合に含まれるが、他は、それらが特異的に修飾され得れば、ＰＥＧｓ又は他のポリマーの結合に関する有意な可能性を与えるであろう。ＴＧａｓｅｓは、アミン−供与体基質部位として働くことができるタンパク質上のリシンに関して非常に選択的なので、リシン残基がＴＧａｓｅｓにより選択的に標的とされれば、これらのリシン残基にポリマーを結合するためのＴＧａｓｅｓの使用に関する可能性が存在する。
【００３６】
ＴＧａｓｅｓは多くの哺乳類の体液及び組織中に存在するので、ＥＰＯがＴＧａｓｅ基質であるという発見は、従って、体内におけるトランスグルタミナーゼ−触媒反応がグルタミン及び／又はリシン残基を含む哺乳類エリトロポエチンからの配列を含有する治療用タンパク質の生物利用性及び分布に影響を与え得るはずであることを示す。かくしてこれらの残基の生来のＴＧａｓｅ基質性を低下させるかもしくは除去するためのそれらの除去、マスキング又は修飾は、そのような生物薬剤（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｇｅｎｔ）の生物学的性質を有意に変更し、そのような赤血球形成性タンパク質の有効性を強化し得ることになる。そのような修飾は該グルタミン及び／又はリシン残基を他の１９種の天然に存在するアミノ酸のいずれかに突然変異させることにより、該リシン及び／又はグルタミン残基を化学的に修飾することにより、あるいはＴＧａｓｅｓを用いて小さいアシル−供与体又はアミン−供与体基質をこれらの部位に結合させ、それによりＴＧ
ａｓｅ基質としてそれらを除去することにより成される。また、いくつかの残基はペプチド又はタンパク質中に含有されるリシンもしくはグルタミン残基の基質性を向上させるか又は低下させることが示唆されている。かくして、赤血球形成性タンパク質の配列内の他の残基の突然変異、付加又は化学的修飾は、タンパク質の一次アミノ酸配列内に含有されるリシン又はグルタミン残基の基質性を向上させるか又は低下させることができるはずである。最近の論文（Ｄａｌｅ，ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ ４１５（１０），１７５−１７９（２００２））において、著者はセロトニンがＴＧａｓｅ基質であり、表面タンパク質へのＴＧａｓｅ−触媒架橋を介して活性化血小板に結合することを示している。ＴＧａｓｅｓＸＩＩＩ因子及び組織トランスグルタミナーゼは活性化血小板の表面上で同定された。血小板表面へのセロトニンの架橋は、細胞表面上におけるプロコアグレーションタンパク質（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の保持を増大させる。この研究は、細胞外ＴＧａｓｅｓがＴＧａｓｅ基質部位を含有するタンパク質を細胞表面に架橋できること、ならびにこの活性がおそらくタンパク質のその受容体との結合を助長できることを示す。これは、ＴＧａｓｅｓが赤血球先祖細胞又は他の標的化された細胞系へのタンパク質の結合に含まれるなら、ＥＰＯが示すＴＧａｓｅ基質性がタンパク質の赤血球形成力価に直接含まれ得ることを示唆する。
ＥＰＯ
ＥＰＯの生物学的活性形態への修飾のための出発材料は、好ましくはエリトロポエチン又は骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の生産の増加を生じさせる生物学的性質を有するその誘導体である。ＥＰＯ糖タンパク質は天然源から得ることができるか、あるいは引用することによりその記載事項が本明細書の内容となる米国特許第４，７０３，００８；５，４４１，８６８；５，５４７，９３３；５，６１８，６９８及び５，６２１，０８０号明細書に開示されているような既知の方法を用いて組換え的に生産することができる。所望の生物学的活性を有するエリトロポエチンタンパク質の非グリコシル化形態又は高グルコシル化形態を用いることもできる。高グリコシル化ＥＰＯの製造法は、国際公開第０２４９６７３号パンフレット及び欧州特許第６４０６１９号明細書に記載されている。
トランスグルタミナーゼ
グルタミンから受容体へのアシル転移を触媒する酵素のいずれも本発明における使用に適している。モルモット肝臓由来のトランスグルタミナーゼは特に適しており、商業源、例えばＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ＩＣＮ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓなどを介して容易に入手可能である。微生物起源のＴＧａｓｅｓ、例えばストレプトベルチシリウム種（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）の、又はストレプトベルチシリウム・モバラエンセ（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ）からのカルシウム非依存性トランスグルタミナーゼを用いることもできる（Ａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．著，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３（１０），２６１３−１７，１９８９）。
アシル受容体／アミン供与体
ＴＧａｓｅｓは第１級アミン供与体に関して広い特異性を有し、それは第１級アミン含有化合物あるいはリシンのペプチド−もしくはタンパク質結合イプシロン−アミノ基であることができる。ＴＧａｓｅｓに関するアミン−供与体基質には：アンモニア、ヒドロキシルアミン、メチルアミン、エタノールアミン、フェニルエチルアミン、ヒスタミン、スペルミン、スペルミジン、カダベリン、プトレッシン、タンパク質−もしくはペプチド−結合リシン基、アミンアミド、例えばグリシンアミドが含まれるが、Ｌ−チロシンアミドは含まれない。Ｎ−（５−アミノペンタニル）−５−ジメチルアミノ−１−ナフタレン−スルホンアミド（ダンシルカダベリン）は、その蛍光性及び優れたアミン−供与体として働く能力の故に、タンパク質基質を調べるために有用な基質である（Ｆｏｌｋ ａｎｄ Ｃｈｕｎｇ，１９７３ 上記参照）。
【００３７】
この場合、水も求核試薬として働くことができ、グルタミンのグルタミン酸への転換を生じ、その場合には上記の式Ｉ中の部分Ａはヒドロキシル部分である。
【００３８】
アミノ糖類、例えば国際公開第０１７９４７４号パンフレットを参照されたい、及び日本特許第２０００３００２８７号明細書におけるアミノアルキル糖類も、タンパク質へのトランスグルタミナーゼ−触媒結合のための適したアミン供与体であることが示された。アミノ糖類は、第１級アミノ基を含有するいずれかの単糖類、オリゴ糖類又は多糖類ならびにアミノ基の導入のために単糖類、オリゴ糖類又は多糖類の還元的アミノ化により製造されたいずれかの単糖類、オリゴ糖類又は多糖類である。有利なアミノ糖の例はアミノソルビトールである。
【００３９】
かくして上記の化合物もしくは関連する化合物のいずれも、アミン供与体として働くことができ、さらにＴＧａｓｅが触媒するトランス−アシル化反応が該グルタミン残基においてＥＰＯ構造に付加することが望まれている基を有効に複合化させるように、それら自身を修飾することができる。式ＩのＡ部分に相当する特に好ましい分子は：カダベリン、プトレッシン、１，５−ジアミノペンタン、１，６−ジアミノヘキサン、１，７−ジアミノヘプタン又は類似のジアミノアルカンである。
アシル供与体／アミン受容体
ＴＧａｓｅｓは、リシン残基がＴＧａｓｅ基質部位として機能すれば、グルタミン−含有ペプチド及びタンパク質をタンパク質の構造内のリシンのε−アミノ基に結合させることができる。かくして上記の式ＩＩに従い、Ｚはトランスグルタミナーゼアミン受容体として働くことができるＧｌｎ残基を含有するペプチド又はタンパク質を示す。ＴＧａｓｅ触媒反応を介してタンパク質−結合リシン残基に架橋することが示されたペプチドには：ＴＶＱＱＥＬ、ＰＧＧＱＱＩＶ、ｐＥＡＱＱＩＶ、ＰＫＰＱＱＦＭ、ＥＡＱＱＩＶＭ及びベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）−ＱＧの複数の誘導体が含まれる（Ｇｒｏｏｔｊａｎｓ，ｅｔ ａｌ．著，ＪＢＣ ２７０（３９），２２８５５−２２８５８（１９９５）），（Ｇｒｏｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．著，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５，６７１−６７４（１９９２）），（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．著，ＪＢＣ ２５５（２），４１９−４２７（１９８０））。これらのようなペプチドはＰＥＧ又は上記のもののような他のポリマーに共有結合し、次いでＴＧａｓｅ触媒反応を介してＥＰＯ又はアミン−供与性リシン残基を含有する他のタンパク質に結合することができる。
水溶性ポリマー
特に好ましい水溶性ポリマーは、ＰＥＧのいくつかの種の１つである。ＰＥＧは基本的炭素単位、ＨＯ−（ＣＨ２）２−ＯＨから成り、種々の形態で：ポリエチレングリコール（種々の分子量）；ポリエチレンオキシド；Ｃａｒｂｏｗａｘ ＰＥＧ（種々の分子量）；アルファ−ヒドロ−オメガ−ヒドロキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）；エトキシル化１，２−エタンジオール；ポリオキシエチレンエーテル；ｅｍｋａｐｏｌ ２００；ｇａｆａｎｏｌ ｅ ２００；ｐｌｕｒｉｏｌ ｅ ２００；ポリジオール ２００；ポリエチレングリコール；ＰＥＧ；Ｐｏｌｙｏｘ ＷＳＲ−３０１；ＰＥＧ ２００；Ｍａｃｒｏｇｏｌ；及びｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｌｅｎｅｌｎの名前の下に販売されている。ＰＥＧに基づくポリマーが用いられる本発明の側面において、それらは約２００〜約１００，０００ダルトン、そして好ましくは約２，０００〜約４０，０００ダルトンの平均分子量を有するのが好ましい。
【００４０】
別の水溶性ポリマー物質にはデキストラン、ポリビニルピロリドン、多糖類、デンプン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド又は他の類似の非−免疫原性ポリマーのような材料が含まれる。当該技術分野における通常の熟練者は、前記が単に例であり、本明細書における使用に適した非−抗原性ポリマーの型を制限することが意図されていないことを認識するであろう。
生体内における薬物動態学的半減期の延長を与える有機分子
半減期を延長させるために親水性ポリマーに結合させることができる有機分子には脂肪酸、ジカルボン酸、ジカルボン酸のモノエステルもしくはモノアミド、飽和脂肪酸を含有
する脂質、不飽和脂肪酸を含有する脂質、飽和及び不飽和脂肪酸の混合物を含有する脂質、単純な炭水化物、複雑な炭水化物、炭素環式化合物（ステロイドのような）、複素環式化合物（アルカロイドのような）、アミノ酸鎖、タンパク質、酵素、酵素補因子又はビタミンが含まれる。
【００４１】
１つの態様において、親水性ポリマー基を１〜約６個のアルキル、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂質もしくはリン脂質基で置換する（本明細書に記載される通り、例えば式Ｉ及び式ＩＩ）。好ましくは、置換された親水性ポリマー基は直鎖状もしくは分枝鎖状ＰＥＧである。好ましくは、置換された親水性ポリマー基は、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂質もしくはリン脂質基又は炭化水素で末端が置換された直鎖状ＰＥＧ（例えばＰＥＧジアミン）である。アルキル、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂質又はリン脂質基で置換された親水性ポリマーは、適した方法を用いて製造することができる。例えばモノ保護ＰＥＧジアミンを活性化脂肪酸（例えばパルミトイルクロリド）と反応させることにより、修飾剤を製造することができる。得られる生成物を用い、脂肪酸基で置換されたＰＥＧを含む修飾されたＥＰＯを製造することができる。多様な他の適した合成案を用いることができる。例えば本明細書に記載されるようにアミン含有ポリマーを脂肪酸又は脂肪酸エステルにカップリングさせることができ、脂肪酸又は脂肪酸エステル上の活性化カルボキシレート（例えばＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールで活性化された）をポリマー上のヒドロキシル基にカップリングさせることができる。この方法で、所望の性質を有する複数の適した直鎖状及び分枝鎖状多量体構造を構築し、最終的にトランスグルタミナーゼアミン供与体として働くことができる第１級アミンあるいはトランスグルタミナーゼアミン受容体として働くことができるグルタミン−含有ペプチドもしくはポリマーを含有するように、結合させるかもしくは修飾することができる。
【００４２】
本発明における使用に適した脂肪酸及び脂肪酸エステルは飽和していることができるか、あるいは１個もしくはそれより多い不飽和単位を含有することができる。好ましい態様において、脂肪酸及び脂肪酸エステルは約６〜約４０個の炭素原子を含む。本発明の方法でＥＰＯを修飾するのに適した脂肪酸には、例えばｎ−ドデカノエート（Ｃ１２，ラウレート）、ｎ−テトラデカノエート（Ｃ１４，ミリステート）、ｎ−ヘキサデカノエート（Ｃ１６，パルミテート）、ｎ−オクタデカノエート（Ｃ１８，ステアレート）、ｎ−エイコサノエート（Ｃ２０，アラキデート）、ｎ−ドコサノエート（Ｃ２２，ベヘネート）、ｎ−トリアコンタノエート（Ｃ３０）、ｎ−テトラコンタノエート（Ｃ４０）、シス−Ｄ９−オクタデカノエート（Ｃ１８，オレエート）、全シスＤ５．８．１１．１４−エイコサテトラノエート（Ｃ２０，アラキドネート）、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などが含まれる。適した脂肪酸エステルには直鎖状もしくは分枝鎖状低級アルキル基を含むジカルボン酸のモノエステルが含まれる。低級アルキル基は１〜約１２個、好ましくは１〜約６個の炭素原子を含むことができる。本発明のタンパク質の修飾に適した脂肪酸エステルには、例えばオクタデカン酸メチル、オクタデカン酸エチル、オクタデカン酸プロピル、ドデカン酸ブチル、ドデカン酸ｓｅｃ−ブチル、ドデカン酸ｔｅｒｔ−ブチル、テトラデカン酸ネオペンチル、テトラデカン酸ヘキシル、シス−Δ９−オクタデカン酸メチルなどが含まれる。
Ｅｐｏへの転移のためのＴＧａｓｅ基質の製造
かくして熟練者は、アミン供与体アミン部分又はアミン受容体部分に結合した２個もしくは３個又はそれより多い部分の複合体を製造することができ、得られる複合体はＴＧａｓｅ基質として機能するであろう。
【００４３】
他の基質の製造は、好ましくは段階的に行なわれ、最後の段階で１種の脱保護された、又は保護されていない第１級アミンを生ずるであろう。かくして水溶性ポリマー及び有機分子をカップリングさせるために、例えばトシレート、メシレート、ハロ（クロロ、ブロモ、ヨード）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）、置換フェニルエス
テル、アシルハライドなどのような求電子性基を含むアミン−反応性基が用いられるべき場合、第１級アミンはほとんどの場合に保護されねばならない。有機分子をポリマーに複合化させる他の方法は周知であり、チオールと反応できる薬剤、例えばマレイミド、ヨードアセチル、アクリロイル、ピリジルジスルフィド、５−チオール−２−ニトロ安息香酸チオール（ＴＮＢ−チオール）などの使用を含む。分子中へのそのようなチオール反応性基の導入に適した方法は当該技術分野において既知である（例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．著，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９６）を参照されたい）。アルデヒド又はケトン官能基をアミン−もしくはヒドラジド−含有分子にカップリングさせることができ、アジド基を３価のリン基と反応させてホスホルアミデート又はホスホルイミド結合を形成することができる。反応性基を親水性ポリマー、コンジュゲート複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）に直接結合させることができるか、又はリンカー部分、例えばＣ１〜Ｃ１２ヒドロカルビル基を介して結合させることができる。本明細書で用いられる場合、「ヒドロカルビル基」は、１個もしくはそれより多い炭素原子が場合により酸素、窒素又は硫黄のようなヘテロ原子で置き換えられていることができる炭化水素鎖を指す。適したリンカー部分には例えばテトラエチレングリコール、−（ＣＨ２）３−、−ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＮＨ−、−（ＣＨ２）２−ＮＨ−及び−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ−ＮＨ−が含まれる。
【００４４】
リンカー部分を含む修飾剤は、例えばモノ−Ｂｏｃ−アルキルジアミン（例えばモノ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン、モノ−Ｂｏｃ−ジアミノヘキサン）を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下で脂肪酸と反応させ、遊離のアミンと脂肪酸カルボキシレートの間にアミド結合を形成することにより製造することができる。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いる処理により生成物からＢｏｃ保護基を除去して第１級アミンを露出し、それを記載した通りに別のカルボキシレートにカップリングさせることができるか、あるいは無水マレイン酸と反応させ、得られる生成物を環化して脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を製造することができる。（例えば引用することによりその方法全体が本明細書の内容となるＴｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．著，国際公開第９２／１６２２１号パンフレットを参照されたい）。
【００４５】
誘導体化赤血球形成性化合物の例は以下である：
Ｍ−ＰＥＧ−Ａ−ＥＰＯ
ここでＭ−ＰＥＧはＴＧａｓｅを用いて特異的なグルタミン又はリシンに結合し、ここでＭは脂質、炭水化物、多糖類、脂肪酸、脂肪酸誘導体、脂肪アルコール又はタンパク質であり、Ａはアミン供与体、好ましくはカダベリン又はプトレッシンあるいはアミン受容体、好ましくは１〜３０アミノ酸の短いグルタミン−含有ペプチドである。
（Ｍ−ＰＥＧ）２−Ａ−ＥＰＯ
ここでＭ−ＰＥＧはＡ上の２個の異なるカルボキシル基にエステル化され、ここでＭは脂質、炭水化物、多糖類、脂肪酸、脂肪酸誘導体、脂肪アルコール又はタンパク質である。エステル化のための２個の異なるカルボキシル基を有する部分Ａの適した例にはジグリセリド又はトリグリセリド誘導体ならびにマレイン酸、シトラコン酸、グルタミン酸又は２個もしくはそれより多いカルボキシル炭素を含有する他のポリマーの誘導体が含まれる。より高い倍体（ｈｉｇｈｅｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅｓ）も同様に含まれる。
（Ｍ−ＰＥＧ）２−Ｒ−Ａ−ＥＰＯ
ここで（Ｍ−ＰＥＧ）２−ＲはＡ上の２個の異なるカルボキシル基であり、ここでＭは脂質、炭水化物、多糖類、脂肪酸、脂肪酸誘導体、脂肪アルコール又はタンパク質であり、Ｒは原子価強化構築物、例えばアミノ酸のデンドリマーなどであり、それは複数の（Ｍ−ＰＥＧ）２又は他の部分の結合のために複数の官能基を含有する。より高い倍体も同様に含まれる。
Ｍ−Ａ−ＥＰＯ
ここでＭはタンパク質又はペプチドであり、Ａは該タンパク質又はペプチド上のリシン側鎖である。
Ｍ−Ａ−ＥＰＯ
ここでＭはタンパク質又はペプチドであり、Ａは該タンパク質又はペプチド上のグルタミン側鎖である。
Ｍ−Ａ−ＥＰＯ
ここでＭは脂質であり、Ａはアミン受容体、好ましくは短いグルタミン−含有ペプチドである。
Ｍ−Ａ−ＥＰＯ
ここでＭは脂質であり、Ａはプトレッシン、カダベリン又は他のジアミノアルカンである。
Ｍ−Ａ−ＥＰＯ
ここでＭはビオチン、ダンシル又は研究、診断又は治療目的に有用な生物物理学的特性をＥＰＯに与える他の部分であり、Ａはプトレッシン、カダベリン又は他の適したＴＧａｓｅアミン供与体もしくはアミン受容体基質である。ビオチン又は既知の結合パートナーを有する別の部分が複合体に導入される場合、該複合体をビオチン−アビジン複合体におけるようにその既知の結合パートナーとの複合体において研究、診断もしくは治療に用いることができると思われる。
治療的使用
本発明のＥＰＯ調製物は、低いか又は欠陥のある赤血球生産を特徴とする血液障害、例えば慢性腎不全、ジドビジン処置されたＨＩＶ感染患者及び化学療法にあるガン患者と関連する貧血を含む種々の形態の貧血の処置において、非経口用調製物として有用である。それは多様な疾患状態、障害及び血液学的異常の状態、例えば鎌状赤血球症、ベータ−サラセミア、のう胞性線維症、妊娠及び月経障害、早熟の早期貧血（ｅａｒｌｙ ａｎｅｍｉａ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ）、脊髄損傷、宇宙飛行、急性失血、老化などの処置においても用途を有することができる。それは手術−前患者におけるように、赤血球の増加が望ましい状況においても用途を有することができる。好ましくは、本発明のＥＰＯ組成物は非経口的に（例えば静脈内、筋肉内、皮下又は腹膜内）投与される。有効な投薬量は、処置されている状態及び投与の経路に依存して有意に変わると思われるが、体重のｋｇ当たり０．１（〜７Ｕ）〜１００（〜７０００Ｕ）μｇの活性材料の範囲内であると思われる。貧血状態の処置のために好ましい投薬量は、週に３回の約５０〜約３００単位／ｋｇである。
製薬学的組成物
本発明に従って製造されるエリトロポエチン糖タンパク質生成物は、当該技術分野において既知の方法により、製薬学的に許容され得る担体又はビヒクルを用いる注入に適した製薬学的組成物において調製することができる。例えば適した組成物は国際公開第９７／０９９９６号パンフレット、国際公開第９７／４０８５０号パンフレット、国際公開第９８／５８６６０号パンフレット及び国際公開第９９／０７４０１号パンフレットに記載されている。本発明の生成物の調製のために好ましい製薬学的に許容され得る担体の中に、ヒト血清アルブミン、ヒト血漿タンパク質などがある。本発明の化合物は、等張剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ ａｇｅｎｔ）、例えば１３２ｍＭ塩化ナトリウムを含有するｐＨ７における１０ｍＭリン酸ナトリウム／カリウム緩衝液中で調製することができる。場合により製薬学的組成物は防腐剤を含有することができる。製薬学的組成物は種々の量のエリトロポエチン生成物、例えば１０〜２０００μｇ／ｍｌ、例えば５０μｇ又は４００μｇを含有することができる。
【００４６】
酸化防止剤、例えばトコフェロール、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、パルミチン酸アスコルビル又はエデト酸塩、例えばエデト酸二ナトリウムの添加により、組成物の安定性をさらに強化することができ、エデト酸塩はさらにおそらく存在する重金属を結合する。安息香酸及びパラベン類、例えばメチルパラベン及び／又
はプロピルパラベンのような防腐剤の添加により、安定性をさらに強化することができる。
低いか又は欠陥のある赤血球生産を特徴とする血液障害の処置
本発明のエリトロポエチン糖タンパク質生成物の投与は、ヒトにおいて赤血球形成を生ずる。従って、エリトロポエチン糖タンパク質生成物の投与は、赤血球の生産において重要なこのＥＰＯタンパク質を補充する。エリトロポエチン糖タンパク質生成物を含有する製薬学的組成物を、低いかもしくは欠陥のある赤血球生産を特徴とする血液障害を単独でもしくは状態もしくは疾患の一部として経験しているヒト患者への種々の手段による投与に有効な濃度で調製することができる。製薬学的組成物は、皮下、静脈内又は筋肉内注射のような注射により投与することができる。エリトロポエチン糖タンパク質生成物の平均量は変わることができ、特に資格を有する医師の勧告及び処方に基づくべきである。複合体の正確な量は、処置されている状態の正確な型、処置されている患者の状態ならびに組成物中の他の成分のような因子に依存して選ばれることである。例えば体重のｋｇ当たり０．０１〜１０μｇ、好ましくは体重のｋｇ当たり０．１〜１０μｇを、例えば毎週１回投与することができる。
【００４７】
本出願を通じて種々の公開文献を引用してきた。これらの公開文献中の開示は、当該技術分野の現状をより十分に記載するために、引用することによりその記載事項が本明細書の内容となる。
【００４８】
本発明をさらに以下の実施例により示し、実施例は例示の目的のために提示されるが、本発明の化合物及び組成物の調製を制限するものではない。最初の実験から、ＥＰＯ上の７個のグルタミンの少なくとも２個そしておそらく３個がＴＧａｓｅ基質として働くことができる。ペプチドマッピングは、Ｇｌｎ１１５がＴＧａｓｅのアシル供与体部位として働くことができること、ならびに他の６個のグルタミン残基の少なくとも１個が同様に働くことができることを示した。ＥＰＯへのＰＥＧ基及び脂肪族アミンを含有する脂質基の結合がモルモット肝臓ＴＧａｓｅを用いて行なわれ、５キロダルトンのＰＥＧ基の結合に続き、ＥＰＯはその活性の約４０％を保持していることが示された。ＴＧａｓｅに関する既知のアシル供与体基質であるＣｂｚ−ＱＧの結合及び続くペプチドマッピングは、ＥＰＯ上のＬｙｓ４５がＴＧａｓｅに関する非常に有効なアミン供与体基質部位として働くこと、ならびにＬｙｓ１５４もアミン供与体部位として働くことができることを示した。
実施例
［実施例１］
【００４９】
モルモット肝臓トランスグルタミナーゼを用いるヒトエリトロポエチンへのダンシル−カダベリン基質の複合化
組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）（１０μＭ）を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）及び１０ｍＭ ＣａＣｌ２中でダンシル−カダベリン（ＤＣ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（３ｍＭ）及びＴＧａｓｅ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（０．１５Ｕ／ｍｌ）と一緒に、３７℃で３時間インキュベーションした。ダンシル−カダベリンはＴＧａｓｅｓに関する周知の基質であり、反応の追跡を容易にするための蛍光マーカーを与える。反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、結果を図２に示す。ＥＰＯバンドの蛍光はＴＧａｓｅを介するＤＣの結合を確証し、ＥＰＯ上にアミン−受容体部位が存在することを示す。ＰＢＳを用いて平衡化されたＺｏｒｂａｘ ＧＦ−２５０ ＸＬ ＨＰＬＣカラム上で生成物を精製した。
【００５０】
ゲル中に蛍光性二量体及び三量体が存在することは、ＥＰＯ中のグルタミン残基の１個もしくはそれより多くとの架橋のためにリシン基質を備えていることにより、ＥＰＯ自身がＴＧａｓｅ基質として働くことができることを示す。これらのバンドが蛍光性であり、且つ架橋されているという事実は、ＥＰＯ上の少なくとも２個の異なるグルタミン残基が
ＴＧａｓｅアシル−供与体部位として働くことができる可能性を生ずる。
［実施例２］
【００５１】
モルモット肝臓トランスグルタミナーゼを用いるヒトエリトロポエチンへのカダベリン−Ｘ−ビオチン基質の複合化
組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）（５０〜１００μＭ）を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）及び１０ｍＭ ＣａＣｌ２中でカダベリン−Ｘ−ビオチン（Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）（３０ｍＭ）及びＴＧａｓｅ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（０．１５Ｕ／ｍｌ）と一緒に、３７℃で３時間インキュベーションした。ＰＢＳを用いて平衡化されたＺｏｒｂａｘ ＧＦ−２５０ ＸＬ ＨＰＬＣカラム上で生成物を精製した。
［実施例３］
【００５２】
モルモット肝臓トランスグルタミナーゼを用いるヒトエリトロポエチンへのＣｂｚ−ＱＧ基質の複合化
組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）（１．９６ｍｇ／ｍｌ）を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）及び１０ｍＭ ＣａＣｌ２中でＮ−α−ベンジルオキシカルボニルグルタミニルグリシン（Ｃｂｚ−ＱＧ）（１５ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及びＴＧａｓｅ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（０．１５Ｕ／ｍｌ）と一緒に、３７℃で３時間インキュベーションした。ＰＢＳを用いて平衡化されたＺｏｒｂａｘ ＧＦ−２５０ ＸＬ ＨＰＬＣカラム上で生成物を精製した。
［実施例４］
【００５３】
ＥＰＯ−ＤＣ、ＥＰＯ−カダベリン−Ｘ−ビオチン及びＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）の特性化及びペプチドマッピング
脱グリコシル化のために、５０μｌのｒｈＥＰＯ又は複合体（０．２〜２ｍｇ／ｍｌ）を５０μｌのＲａｐｉＧｅｓｔ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）（ＰＢＳ中の２ｍｇ／ｍｌ）中に希釈した。これに１０μｌのＮＰ−４０洗剤溶液（１５％）、それぞれ１０μｌのＰＮＧａｓｅ Ｆ、シアリダーゼ Ａ及びＯ−グリカナーゼ（Ｐｒｏｚｙｍｅ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）を加えた。溶液を３７度で合計９６時間インキュベーションした。試料を１：１の水／アセトニトリル（＋０．１％ トリフルオロ酢酸）中のシナピン酸と混合し、ＭＡＬＤＩ ＭＳプレート上にスポッティングすることにより無損傷の質量を得、続いてＡＢＩ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ−ＳＴＲ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ上で分析した。２５０００Ｖの集積電圧（ａｃｅｒｖａｔｉｎｇ ｖｏｌｔａｇｅ）を用い、直線様式で（ｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｍｏｄｅ）でタンパク質を分析した（図３及び５）。これに続き、それぞれ５０μＬを５μＬの４５ｍＭ ＤＴＴと混合し、溶液を６５℃で２０分間インキュベーションした。次いで５μＬの１００ｍＭヨードアセトアミドを加え、溶液を暗所で室温において２０分間インキュベーションした。次いで５μＬのＬｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（１．３μｇ／μｌ）を加え、溶液を３７℃で２０〜２４時間インキュベーションした。逆−相ＨＰＬＣ及びＷａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ３００ １ｘ５０ｍｍ Ｃ１８カラムを用いて各タンパク質消化物を分離した。それぞれの分離された消化物をＭＡＬＤＩプレート上に自動的にスポッティングし、分析した。イオン化のために、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸／ジヒドロキシ安息香酸（α−シアノ／ＤＨＢ）の飽和混合マトリックスを用いた（図４）。
【００５４】
図３は、ＥＰＯ及びそれぞれの複合体の脱グリコシル化された試料に関する無損傷の質量を示す。パネル（Ｂ）は１８７２５に小さいピークを示し、それは１個のカダベリン−Ｘ−ビオチン部分の付加に対応する（計算分子量シフト＝＋４２４）。パネル（Ｃ）は、１個のダンシル−カダベリン部分の付加に対応する１８６０３にピークを示し（計算分子
量シフト＝＋３１７）、パネル（Ｄ）は、１個のＣｂｚ−ＱＧペプチドの付加に対応する１８５９２にピークを示す（計算分子量シフト＝＋３１９）。このデータから、Ｃｂｚ−ＱＧの結合がダンシル−カダベリン又はカダベリン−Ｘ−ビオチンの結合より有効であると思われる。しかしながら、３つのすべての場合にＥＰＯはＴＧａｓｅ基質の結合を示す。
【００５５】
図４は、ＥＰＯ−カダベリン−Ｘ−ビオチン及びＥＰＯ−ＤＣのＬｙｓ−Ｃ消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）の質量スペクトルを示す。パネル（Ａ）及び（Ｂ）中の１９５８におけるピークは、ＥＰＯの残基９８−１１６を含有するものに対応する。矢印により示されるピークは、そのペプチドへのカダベリン−Ｘ−ビオチンの付加に対応する。これは、Ｇｌｎ１１５がＴＧａｓｅ基質部位として働くことを示し、それはそれがそのペプチド中の唯一のＧｌｎ残基であり、ＴＧａｓｅのみがカダベリンをＧｌｎ残基に結合させるからである。図４のパネル（Ｃ）及び（Ｄ）は、脱グリコシル化されたＥＰＯ及びＥＰＯ−ＤＣのＬｙｓ−Ｃ消化物のＭＡＬＤＩ ＭＳを示す。５０３８近辺のピークはＥＰＯの残基５３−９７（計算分子量＝５０２４．８）に対応する。パネル（Ｄ）において、５３５７におけるピークは３１９の分子量シフトに対応し、ダンシルカダベリン部分がタンパク質のこの領域内の残基において結合したことを示す。このペプチド中に６個のグルタミンが含有されるので、修飾された残基の正体は突き止められ得なかった。
【００５６】
図５のパネル（Ａ）及び（Ｂ）は、脱グリコシル化ｒｈＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）の２つの異なるバッチのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量スペクトルを示す。１８５８０近辺のピークはｒｈＥＰＯへの１個のＣｂｚ−ＱＧ（計算分子量シフト＝＋３１９）部分の結合に対応し、両スペクトルは、タンパク質の大部分が両バッチにおいて修飾されたこと、ならびにｒｈＥＰＯへのこのペプチドの結合が非常に再現性のあるものであることを示す。パネル（Ｃ）及び（Ｄ）は、脱グリコシル化ｒｈＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）のＬｙｓ−Ｃ消化物のＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量スペクトルを示す。パネル（Ｃ）は、Ｌｙｓ４５における追加の（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ）Ｃｂｚ−ＱＧ部分を有するＥＰＯの残基２１−５２に対応する４０４６にピークを示す（計算分子量＝４０３２．１）。Ｌｙｓ−Ｃは、修飾のためにＬｙｓ４５において切断しなかった。パネル（Ｄ）は、付加されたＣｂｚ−ＱＧ部分を有する残基１５３−１６５に対応する１８０７にピークを示す（計算分子量＝１８０２．６）。このペプチドにおいて、Ｌｙｓ１５４はＣｂｚ−ＱＧの結合のために切断されず、Ｌｙｓ１５４が修飾されていることを示す。
【００５７】
本明細書に記載されるＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量スペクトルを得るために、大きな質量ウインドウ（ｍａｓｓ ｗｉｎｄｏｗ）が必要であった。このために、スペクトルにおいて有意なドリフトが観察された。この理由で、複合体に関する分子量変化は、各個別の試料において修飾されないＥＰＯの場合に観察される分子量への比較により計算された。無損傷の脱グリコシル化試料に関する質量データ及びＬｙｓ−Ｃ消化データは一緒になって、ＴＧａｓｅの存在下でＧｌｎ１１５がカダベリン−Ｘ−ビオチン及びダンシル−カダベリンの両方で修飾されたこと、ならびにｒｈＥＰＯ中の少なくとも１個の他のＧｌｎ残基がダンシル−カダベリン修飾を受けたことを確証する。データは、ｒｈＥＰＯのＬｙｓ４５及びＬｙｓ１５４がＴＧａｓｅの存在下でＣｂｚ−ＱＧ修飾を受けたこと、ならびに分析された両バッチにおいて、最高でタンパク質の９０％が修飾されたことも示す。
［実施例５］
【００５８】
ｒｈＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）のＵＴ７アッセイ
ｒｈＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）につき、以下の通りにＵＴ７アッセイを行なった：アッセイの前に、Ｌ−ｇｌｕ及び５％ＦＢＳを含み、Ｅｐｏを含まないＩＭＤＭ中で、ＵＴ７細胞を２４時間飢えさせた。細胞を洗浄し、ウェル当たり３０，０００個の細胞においてプレート化した。ＥＰＯ（２０〜０．０１９５２ｎｇ／ｍＬ）及びｒｈＥＰＯ−（Ｃｂｚ
−ＱＧ）（２０〜０．０１９５２ｎｇ／ｍＬ）の希釈液を加え、二重に検定した。プレートを３７℃で４８時間インキュベーションし、Ｐｒｏｍｅｇａ’ｓ ＭＴＳ溶液を用い、１、２及び３時間間隔でとられるＯＤ読取りを用いて検定した。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏを用いて値をバックグラウンド修正した。平均バックグラウンドは０．２９２であった。アッセイは、複合体が非修飾ＥＰＯより約４倍活性が低い（４−ｆｏｌｄ ｌｅｓｓ ａｃｔｉｖｅ）ことを示し（図６を参照されたい）、受容体結合に有意に含まれる残基において修飾が起こらなかったことを示す。これは、Ｌｙｓ４５又はＬｙｓ１５４の修飾が活性における有意な損失に寄与しないことを意味し、ｒｈＥＰＯがその受容体に結合する能力に有意に影響することなく、これらの部位において他の修飾又は突然変異を行い得ることを示唆する。
［実施例６］
【００５９】
カダベリン−ＰＥＧ（２０Ｋ）の合成
商業的に入手可能な試薬を用いてカダベリン−ＰＥＧ（２０Ｋ）を合成した。２５ｍｇのカダベリンヒドロクロリド塩（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を５ｍｌのＰＢＳ中に溶解し、ｐＨを７に調整した。これに２５ｍｇのｍＰＥＧ（２０Ｋ）−スクシンイミジルプロピオネート（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａ）を加え、反応物を２２℃で２時間インキュベーションした。反応混合物を水中の０．１％酢酸に対して透析し、凍結乾燥した。
【００６０】
【化２】
［実施例７］
【００６１】
プトレッシン−ＰＥＧ（２０Ｋ）の合成
３００ｍｇのプトレッシンヒドロクロリド（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を１０ｍｌのＰＢＳ中に溶解し、ｐＨを７に調整することにより、プトレッシン−ＰＥＧ（５Ｋ）を合成した。１００ｍｇのｍＰＥＧ（５Ｋ）−スクシンイミジルプロピオネート（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａ）を加え、２２℃で２時間反応させた。反応混合物を水中の０．１％酢酸に対して透析し、凍結乾燥した。
【００６２】
【化３】
［実施例８］
【００６３】
プトレッシン−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（３．４Ｋ）の合成
１７６．５ｍｇのプトレッシンを１．７６５ｍｌのＰＢＳ（ｐｈ ７．４）中に溶解することにより、プトレッシン−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（３．４Ｋ）を合成した。１３．５ｍｇのＮＨＳ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（３．４Ｋ）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａ）を１ｍｌのエタノール／ＰＢＳ（１：１）中に溶解した。次いで１ｍｌのＮＨＳ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ溶液を１．７０４ｍｌのプトレッシン溶液
に滴下し、反応物を２２℃で４時間攪拌し、次いで０．１％酢酸（ｐＨ ４．５）で平衡化されたＺｏｒｂａｘ ＧＦ−２５０ ＸＬカラム上で精製した。
【００６４】
【化４】
［実施例７］
【００６５】
モルモット肝臓トランスグルタミナーゼを用いるヒトエリトロポエチンへのカダベリン−ＰＥＧ（２０Ｋ）基質の複合化
ＤＣの代わりに３．３ｍＭのカダベリン−ＰＥＧ（２０Ｋ）を用いる以外は実施例１に示した条件を用いて、カダベリン−ＰＥＧ（２０Ｋ）をＥＰＯと反応させた。図７は反応生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示し、図８は生成物のＳＥＬＤＩ質量スペクトルを示す。両方は、カダベリン−ＰＥＧ（２０Ｋ）がＥＰＯに結合したことを示す。ＳＥＬＤＩ−ＭＳのための試料は、標準的な案を用いてＣ−４ジップチップ（ｚｉｐ ｔｉｐ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから）を用いて脱塩し、金ＳＥＬＤＩチップ上にスポッティングすることにより調製された。
【００６６】
【化５】
［実施例８］
【００６７】
モルモット肝臓トランスグルタミナーゼを用いるヒトエリトロポエチンへのプトレッシン−ＰＥＧ（５Ｋ）基質の複合化
ＰＥＧ（２０Ｋ）−カダベリンの代わりに５ｍＭ ＰＥＧ（５Ｋ）−プトレッシンを用いる以外は実施例７に記載した条件を用い、プトレッシン−ＰＥＧ（５Ｋ）をＥＰＯと反応させた。プトレッシンはカダベリンより優れたＴＧａｓｅｓに関する基質であることが既知である（Ｆｏｌｋ ａｎｄ Ｃｈｕｎｇ，１９７３ 上記を参照されたい）。図９はＥＰＯ原液と比較された精製ＥＰＯ−プトレッシン−ＰＥＧ（５Ｋ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４−２０％）を示し、図１０はＥＰＯ＋ＴＧａｓｅ＋プトレッシン−ＰＥＧ（５Ｋ）から成る反応混合物のＳＥＬＤＩ−ＭＳを示し、図１１は精製されたＥＰＯ−プトレッシン−ＰＥＧ（５Ｋ）のＳＥＬＤＩ−ＭＳを示す。これらのデータは、プトレッシン−ＰＥＧ（５Ｋ）がＥＰＯへの複合化に成功したこと、ならびに精製されたＥＰＯ−プトレッシン−ＰＥＧ（５Ｋ）が少量の非修飾ＥＰＯしか含有しないことを示す。ＳＥＬＤＩ試料は、Ｈ−４ ＳＥＬＤＩチップ上にスポッティングし、３μｌの水で洗浄し、１μｌの飽和シナピン酸を加えることにより調製された。ＥＰＯ−プトレッシン−ＰＥＧ（５Ｋ）につき、以下の通りにＵＴ７アッセイを行なった：アッセイの前に、Ｌ−ｇｌｕ及び５％ＦＢＳを含み、Ｅｐｏを含まないＩＭＤＭ中で、ＵＴ７細胞を２４時間飢えさせた。細胞を洗浄し、ウェル当たり３０，０００個の細胞においてプレート化した。ＥＰＯ（２．５〜０．００２５ｎｇ／ｍＬ）及びＥＰＯ−ＰＥＧ（２０〜０．０１９５２ｎｇ／ｍＬ）の希釈液を加え、二重に検定した。プレートを３７℃で４８時間インキュベーションし、Ｐｒｏｍｅｇａ’ｓ ＭＴＳ溶液を用い、１、２及び３時間間隔でとられるＯＤ読取りを用い
て検定した。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏを用いて値をバックグラウンド修正した。平均バックグラウンドは０．２９３であった。アッセイは、複合体が非修飾ＥＰＯより約２．５倍活性が低い（２．５−ｆｏｌｄ ｌｅｓｓ ａｃｔｉｖｅ）ことを示し（図１２を参照されたい）、受容体結合に有意に含まれる残基において修飾が起こらなかったことを示す。活性における損失は、結合界面において立体的に妨害するＰＥＧの故であるのが最もあり得ることである。
［実施例９］
【００６８】
モルモット肝臓トランスグルタミナーゼを用いるヒトエリトロポエチンへのプトレッシン−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（３．４Ｋ）基質の複合化
プトレッシン−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（３．４Ｋ）（５．１ｍＭ）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）及び１０ｍＭ ＣａＣｌ２中の種々の濃度のエタノール（最高で５５％）及びＴＧａｓｅ（０．１５Ｕ／ｍｌ）中でＥＰＯ（４．８μＭ）と一緒にインキュベーションした。ＳＥＬＤＩ−ＭＳは、修飾されたＥＰＯのパーセントを定量するためには反応体積が十分でなかったが、５５％エタノールにおいてＥＰＯ当たりに最高で３個のプトレッシン−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（３．４Ｋ）部分が結合したことを示す（図１３を参照されたい）。これらのデータは、ＥＰＯ上の最高で３個のグルタミン残基がこれらの条件下でＴＧａｓｅ基質として働き得ることも確証する。ＳＥＬＤＩ試料は、Ｈ−４ ＳＥＬＤＩチップ上にスポッティングし、３μｌの水で洗浄し、１μｌの飽和シナピン酸を加えることにより調製された。
【００６９】
これらの実施例は、ＥＰＯ上の少なくとも３個のグルタミン残基がＴＧａｓｅ触媒反応を介する小分子、ＰＥＧ基（５Ｋ〜２０Ｋ）、ＰＥＧ化脂質及びタンパク質の結合のための部位として働き得ることを示す。１個のＰＥＧ化構築物の生物学的活性が確かめられ、わずかにしか低下しないことが示された。これらの修飾のいずれかの故に循環半減期が有意に延長されるなら、そのような活性の小さい損失は、修飾されたタンパク質のおそらく向上する薬物動態学と比較すると、有意でないはずである。
［実施例１０］
【００７０】
ＴＧａｓｅアミン受容体基質の合成及びｒｈＥＰＯへの結合
少なくとも１個のグルタミン残基を含有するペプチドを標準的な固相Ｆｍｏｃ化学により合成する。合成の完了に続き、ピペリジンを用いてペプチド樹脂を脱保護し、洗浄し、ＰＥＧ又は活性化エステルを含有する他のポリマーと反応させる。反応に続き、標準的なＴＦＡ条件を用いてペプチド−ＰＥＧ複合体を樹脂から切断し、エーテル中で沈殿させる。次いでペプチド−ＰＥＧ複合体を逆相ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥する。
【００７１】
組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）（１０μＭ）を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）及び１０ｍＭ ＣａＣｌ２中でペプチド−ＰＥＧ複合体（１５ｍＭ）及びＴＧａｓｅ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（０．１５Ｕ／ｍｌ）と一緒に３７℃で３時間インキュベーションする。反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＢＳで平衡化されたＺｏｒｂａｘ ＧＦ−２５０ ＸＬ ＨＰＬＣカラム上で生成物を精製する。
［実施例１１］
【００７２】
ＵＴ７細胞増殖アッセイ
ＵＴ７は、ＥＰＯ依存性となるように適応させられたヒト白血病細胞系である（Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．著，Ｂｌｏｏｄ ８２（２），４５６−４６４，１９９３）。ＵＴ７細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、アッセイの前に２４時間ＥＰＯを絶つ。Ｌ−グルタミン及び５％におけるＦＢＳが加えられたＩＭＤＭ培地中でＵＴ−７細胞を飢えさせる（１５Ｑ）。細胞を５０ｍＬのＤＰＢＳ中で１回洗浄し、ＤＰＢＳ中に懸濁されている間にカウントし、適した培地中にｍＬ当たり６ｘ１０５個の細胞の最終的濃度に懸濁させ
る（ウェル当たり３０，０００個の細胞の最終的濃度を与える）。ＥＰＯ原液（１．７ｍｇ／ｍＬ）を０．８５μｇ／ｍＬに希釈することにより、ＥＰＯ標準を調製する（４ｍＬの培地中に２μＬ）。１５Ｑ培地中で原液を２：３４０に希釈して５ｎｇ／ｍＬとし、続いて１：２系列希釈で０．００９８ｎｇ／ｍＬの濃度に下げる。得られる希釈液は２．５ｎｇ／ｍＬ〜０．００２４ｎｇ／ｍＬの濃度における標準を与える。試験試料を類似の方法で希釈する。ＵＴ−７細胞懸濁液の５０μＬのアリコートを対応するウェルに移し、プレートを３７℃で４８時間インキュベーションする。Ｐｒｏｍｅｇａ’ｓ ＭＴＳ溶液を用い、ウェル当たり２０μｌ加えて細胞増殖を評価する。ＭＴＳ添加から１時間後に読取りを開始する。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】ヒトエリトロポエチンの成熟鎖のアミノ酸配列。
【図２】蛍光標識されたＴＧａｓｅ基質、ダンシルカダベリン（ＤＣ）をＴＧａｓｅの存在下又は不在下でタンパク質と一緒にインキュベーションしたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像。
【図３】（ａ）脱グリコシル化ＥＰＯ、（ｂ）脱グリコシル化ＥＰＯ−カダベリン−Ｘ−ビオチン、（ｃ）脱グリコシル化ＥＰＯ−ＤＣ及び（ｄ）脱グリコシル化ＥＰＯ−ｃｂｚのＭＡＬＤＩ ＭＳ分析。
【図４】（ａ）ＥＰＯのＬｙｓ−Ｃ消化物（標準）；（ｂ）ＥＰＯ−Ｘ−ビオチンのＬｙｓ−Ｃ消化物；（ｃ）脱グリコシル化ＥＰＯのＬｙｓ−Ｃ消化物（標準）；（ｄ）脱グリコシル化ＥＰＯ−ＤＣのＬｙｓ−Ｃ消化物に関するＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量スペクトル。
【図５】（ａ）脱グリコシル化ＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）バッチ＃１；（ｂ）脱グリコシル化ＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）バッチ＃２；（ｃ）脱グリコシル化ＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）バッチ＃１のＬｙｓ−Ｃ消化物；（ｄ）脱グリコシル化ＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）バッチ＃１のＬｙｓ−Ｃ消化物に関するＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量スペクトル。
【図６】ＥＰＯ−（Ｃｂｚ−ＱＧ）又は非修飾ＥＰＯ（ＥＰＯ標準）と一緒にインキュベーションされたＵＴ７細胞の造血に関する吸光度対付加されたＥＰＯ種の濃度のグラフ。
【図７】ＴＧａｓｅ触媒反応を介するカダベリン−ＰＥＧ（２０Ｋ）のＥＰＯへの結合を示す、銀−染色ポリアクリルアミドゲルの画像。
【図８】ＥＰＯ＋ＰＥＧ２０Ｋ−カダベリン＋ＴＧａｓｅの反応混合物のＳＥＬＤＩ−ＭＳにおける質量対電荷比に対する強度の図形。
【図９】ＥＰＯ（列１）及び精製されたＥＰＯ−ＰＥＧ５Ｋ−プトレッシン（列２）の銀−染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４−２０％）。
【図１０】反応混合物（ＥＰＯ＋ＰＥＧ（５Ｋ）−プトレッシン＋ＴＧａｓｅ）のＳＥＬＤＩ−ＭＳにおける質量対電荷比に対する強度の図形。
【図１１】精製されたＥＰＯ＋ＰＥＧ（５Ｋ）−プトレッシンに関するＳＥＬＤＩ−ＭＳにおける質量対電荷比に対する強度の図形。
【図１２】ＥＰＯ−プトレッシン−ＰＥＧ（５Ｋ）（ＥＰＯ−ＰＥＧ）又は非修飾ＥＰＯ（ＥＰＯ−標準）と一緒にインキュベーションされたＵＴ７細胞の造血に関する吸光度対付加されたＥＰＯ種の濃度のグラフ。
【図１３】ＥＰＯ＋プトレッシン−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ３．４Ｋ＋ＴＧａｓｅ（５５％エタノール及び４５％ＴＧａｓｅ反応緩衝液，ｐＨ７．５）の反応のＳＥＬＤＩ−ＭＳにおける質量対電荷比に対する強度の図形。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
ＥＰＯ−［Ｇｌｎ−Ａ−Ｘ−（Ｍ）ｎ］ｙ
［式中、ＥＰＯはエリトロポエチン又は骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の生産の増加を生じさせ生物学的性質を有するその製薬学的に許容され得る誘導体であり；ＧｌｎはＥＰＯの一次配列内の１個もしくはそれより多いグルタミン残基から選ばれるグルタミン残基であり；ｙは修飾されたグルタミン残基の数を示す１〜７の整数であり；Ａはアミン供与体部分又はヒドロキシル基であり、Ｘは場合による親水性ポリマー部分であり；Ｍは場合による有機分子であり、それはＥＰＯ分子の循環半減期を延長させることができることを特徴とし；ｎは０〜１５の整数である］
の部分を含んでなる、骨髄細胞に赤血球の生産の増加を生じさせる生物学的性質を有する赤血球形成性複合体ならびにその製薬学的に許容され得る塩又はエステル。
【請求項２】
式：
ＥＰＯ−［Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｚ−Ｘ−（Ｍ）ｎ］ｙ （ＩＩ）
［式中、ＥＰＯはエリトロポエチン又は骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の生産の増加を生じさせる生物学的性質を有するその製薬学的に許容され得る誘導体であり；ＬｙｓはＥＰＯの一次配列内の１個もしくはそれより多いリシン残基から選ばれるリシン残基であり；ｙは修飾されたリシン残基の数を示す１〜８の整数であり；Ｇｌｎはグルタミン残基であり；Ｚはトランスグルタミナーゼアミン受容体として働くことができるＧｌｎ残基を含有するペプチド又はタンパク質であり、Ｘは場合による親水性ポリマーであり；Ｍは場合による有機分子であり、それはＥＰＯ分子の循環半減期を延長させることができることを特徴とし；Ｎは０〜１５の整数である］
の部分を含んでなる、骨髄細胞に赤血球の生産の増加を生じさせる生物学的性質を有する赤血球形成性複合体ならびにその製薬学的に許容され得る塩又はエステル。
【請求項３】
骨髄細胞に赤血球の生産の増加を生じさせ、該エリトロポエチン複合体の投与後、非複合化エリトロポエチンの投与後に見られる時間より長い時間、該増加が持続する請求項１又は２の赤血球形成性複合体。
【請求項４】
持続性効果が非修飾哺乳類エリトロポエチンより延長された血清半減期による請求項３の赤血球形成性複合体。
【請求項５】
Ｍが１〜約６個の有機部分であり、それらはそれぞれ独立して脂肪酸基、脂肪酸エステル基、脂質又はリン脂質から選ばれる請求項１又は２の赤血球形成性複合体。
【請求項６】
親水性ポリマーがポリアルキレンオキシドである請求項１又は２のエリトロポエチン複合体。
【請求項７】
該エリトロポエチン又は赤血球形成性部分が組換え及び非−組換え哺乳類エリトロポエチンから選ばれる請求項１又は２の赤血球形成性複合体。
【請求項８】
ポリアルキレンオキシドが置換されたポリエチレンオキシドである請求項６の赤血球形成性複合体。
【請求項９】
ポリアルキレンオキシドがポリエチレングリコールホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、アルキル−ポリエチレンオキシド、ビスポリエチレンオキシド及びポリアルキレンオキシドのコ−ポリマー又はブロックコ−ポリマーから選ばれる請求項６の赤血球形成性複合体。
【請求項１０】
該親水性ポリマーが成熟鎖ＥＰＯのＧＬＮ ５８、ＧＬＮ ５９、ＧＬＮ６５、ＧＬＮ７８、ＧＬＮ８６、ＧＬＮ９２、ＧＬＮ１１５の１〜７個に結合している請求項１の赤血球形成性複合体。
【請求項１１】
該親水性ポリマーが成熟鎖ＥＰＯのＬＹＳ ２０、ＬＹＳ ４５、ＬＹＳ ５２、ＬＹＳ ９７、ＬＹＳ １１６、ＬＹＳ １４０、ＬＹＳ １５２、ＬＹＳ １５４の１〜８個に結合している請求項２の赤血球形成性複合体。
【請求項１２】
該ポリアルキレンオキシドが約２００〜約１００，０００の分子量を有するポリエチレングリコールホモポリマーである請求項６の赤血球形成性複合体。
【請求項１３】
該親水性ポリマー基が直鎖状もしくは分枝鎖状ポリアルカングリコール鎖、炭水化物鎖、アミノ酸鎖又はポリビニルピロリドン鎖であり、且つ該親水性ポリマー基が約８００〜約１２０，０００ダルトンの分子量を有する請求項１及び２の赤血球形成性複合体。
【請求項１４】
該疎水性ポリマー基が２，０００ダルトンより大きい分子量を有する直鎖状もしくは分枝鎖状ポリアルカングリコール鎖である請求項１３の赤血球形成性複合体。
【請求項１５】
該親水性ポリマー基が直鎖状もしくは分枝鎖状ポリエチレングリコール鎖又は直鎖状もしくは分枝鎖状置換ポリエチレングリコール鎖であり、ｎが０以外の整数であり、有機部分がアルキル基、Ｃ６−Ｃ４０脂肪酸基、Ｃ６−Ｃ４０脂肪酸エステル基、脂質基及びリン脂質基から選ばれる請求項１３の赤血球形成性複合体。
【請求項１６】
該親水性ポリマー基が、アルキル基、Ｃ６−Ｃ４０脂肪酸基、Ｃ６−Ｃ４０脂肪酸エステル基、脂質基及びリン脂質基から選ばれる有機部分で末端が置換された直鎖状もしくは分枝鎖状ポリエチレングリコール鎖である請求項１３の赤血球形成性複合体。
【請求項１７】
該有機部分がパルミトイルである請求項１５の赤血球形成性複合体。
【請求項１８】
有機部分がジステロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である請求項１５の赤血球形成性複合体。
【請求項１９】
親水性ポリマー−有機部分が成熟鎖ＥＰＯのＧＬＮ ５８、ＧＬＮ ５９、ＧＬＮ６５、ＧＬＮ７８、ＧＬＮ８６、ＧＬＮ９２、ＧＬＮ１１５の１〜７個に共有結合している請求項１５の赤血球形成性複合体。
【請求項２０】
親水性ポリマー−有機部分が成熟鎖ＥＰＯのＬＹＳ ２０、ＬＹＳ ４５、ＬＹＳ ５２、ＬＹＳ ９７、ＬＹＳ １１６、ＬＹＳ １４０、ＬＹＳ １５２、ＬＹＳ １５４の１〜８個に共有結合している請求項１５の赤血球形成性複合体。
【請求項２１】
Ａがアミン供与体ＴＧａｓｅ基質であり、ＸがＰＥＧ又は他の水溶性ポリマーであり且つ任意であり、Ｍがビオチン、ダンシル又は研究、診断もしくは治療目的に有用な生物物理学的性質をＥＰＯに与える他の有機部分である請求項１の複合体。
【請求項２２】
Ａがグルタミン−含有ＴＧａｓｅ基質であり、ＸがＰＥＧ又は他の水溶性ポリマーであり且つ任意であり、Ｍがビオチン、ダンシル又は研究、診断もしくは治療目的に有用な生物物理学的性質をＥＰＯに与える他の有機部分である請求項２の複合体。
【請求項２３】
式：
ＥＰＯ−［Ｇｌｎ−Ａ−Ｘ−（Ｍ）ｎ］ｙ
［式中、ＥＰＯはエリトロポエチン又は骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の生産の増加を生じさせる生物学的性質を有するその製薬学的に許容され得る誘導体であり；ＧｌｎはＥＰＯの一次配列内の１個もしくはそれより多いグルタミン残基から選ばれるグルタミン残基であり；ｙは修飾されたグルタミン残基の数を示す１〜７の整数であり；Ａはアミン供与体部分又はヒドロキシル基であり、Ｘは場合による親水性ポリマー部分であり；Ｍは場合による有機分子であり、それはＥＰＯ分子の循環半減期を延長させることができることを特徴とし；ｎは０〜１５の整数である］
の赤血球形成活性を有するＥＰＯ複合体ならびにその製薬学的に許容され得る塩又はエステルの製造方法であって；
トランスグルタミナーゼの存在下に、ＥＰＯ−ポリマー−有機部分複合体が形成されるような条件下で、水が接近できるグルタミン残基を有するエリトロポエチン又は赤血球形成性タンパク質を、トランスグルタミナーゼ基質として働くことができるあらかじめ構築された式Ａ−Ｘ（Ｍ）ｎの親水性ポリマー−有機部分複合体と接触させることを含んでなる方法。
【請求項２４】
該ポリマーがポリアルキレンオキシドである請求項２３の方法。
【請求項２５】
該ポリアルキレンオキシドがアルファ−置換ポリアルキレンオキシドである請求項２４の方法。
【請求項２６】
該ポリアルキレンオキシドがポリエチレングリコールである請求項２５の方法。
【請求項２７】
トランスグルタミナーゼが哺乳類タンパク質である請求項２３の方法。
【請求項２８】
トランスグルタミナーゼがバクテリアタンパク質である請求項２３の方法。
【請求項２９】
トランスグルタミナーゼが原核生物タンパク質である請求項２３の方法。
【請求項３０】
Ａがアミン供与体ＴＧａｓｅ基質であり、ＸがＰＥＧ又は他の水溶性ポリマーであり且つ任意であり、Ｍがビオチン、ダンシル又は研究、診断もしくは治療目的に有用な生物物理学的性質をＥＰＯに与える他の部分である請求項２３の方法。
【請求項３１】
式：
ＥＰＯ−［Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｚ−Ｘ−（Ｍ）ｎ］ｙ （ＩＩ）
［式中、ＥＰＯはエリトロポエチン又は骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の生産の増加を生じさせる生物学的性質を有するその製薬学的に許容され得る誘導体であり；ＬｙｓはＥＰＯの一次配列内の１個もしくはそれより多いリシン残基から選ばれるリシン残基であり；ｙは修飾されたリシン残基の数を示す１〜８の整数であり；Ｇｌｎはグルタミン残基であり；Ｚはトランスグルタミナーゼアミン受容体として働くことができるＧｌｎ残基を含有するペプチド又はタンパク質であり、Ｘは場合による親水性ポリマーであり；Ｍは場合による有機分子であり、それはＥＰＯ分子の循環半減期を延長させることができることを特徴とし；Ｎは０〜１５の整数である］
の赤血球形成活性を有するＥＰＯ複合体ならびにその製薬学的に許容され得る塩又はエステルの製造方法であって；
トランスグルタミナーゼの存在下に、ＥＰＯ−ポリマー−有機部分複合体が形成されるような条件下で、水が接近できるリシン残基を有するエリトロポエチン又は赤血球形成性タンパク質を、トランスグルタミナーゼ基質として働くことができるあらかじめ構築された式Ｇｌｎ−Ｚ−Ｘ（Ｍ）ｎの親水性ポリマー−有機部分複合体と接触させることを含んでなる方法。
【請求項３２】
該ポリマーがポリアルキレンオキシドである請求項３１の方法。
【請求項３３】
該ポリアルキレンオキシドがアルファ−置換ポリアルキレンオキシドである請求項３２の方法。
【請求項３４】
該ポリアルキレンオキシドがポリエチレングリコールである請求項３３の方法。
【請求項３５】
トランスグルタミナーゼが哺乳類タンパク質である請求項３１の方法。
【請求項３６】
トランスグルタミナーゼがバクテリアタンパク質である請求項３１の方法。
【請求項３７】
トランスグルタミナーゼが原核生物タンパク質である請求項３１の方法。
【請求項３８】
Ａがアミン受容体ＴＧａｓｅ基質として働くことができるグルタミン残基を含有するペプチド、タンパク質又は他のポリマーであり、ＸがＰＥＧ又は他の水溶性ポリマーであり且つ任意であり、Ｍがビオチン、ダンシル又は研究、診断もしくは治療目的に有用な生物物理学的性質をＥＰＯに与える他の部分である請求項３１の方法。
【請求項３９】
請求項１又は２の複合体の治療的に有効な量を投与することを含んでなる貧血の処置方法。
【請求項４０】
該複合体が非複合化エリトロポエチンと比較して延長された血清半減期を特徴とする請求項３９の方法。
【請求項４１】
ＴＧａｓｅ基質性を改変し、それにより循環半減期を延長するか或いはまた赤血球形成性タンパク質の生物学的活性を変更するために、残基ＧＬＮ ５８、ＧＬＮ５９、ＧＬＮ６５、ＧＬＮ７８、ＧＬＮ８６、ＧＬＮ９２及びＧＬＮ１１５のいずれかもしくはすべてが組換え的、酵素的又は化学的手段により修飾された、組換え又は非−組換え哺乳類エリトロポエチンを含有する赤血球形成性タンパク質もしくはタンパク質複合体。
【請求項４２】
該グルタミン残基の１個もしくはそれより多くが化学的に修飾されるか、除去されるか又は他のアミノ酸に変更され、それによってグルタミン残基がＴＧａｓｅ基質として働く能力が増加するか、減少するか又は除去される請求項４１の赤血球形成性タンパク質又はタンパク質複合体。
【請求項４３】
ＴＧａｓｅ基質性を改変し、それにより循環半減期を延長するか或いはまた赤血球形成性タンパク質の生物学的活性を変更するために、残基ＬＹＳ ２０、ＬＹＳ ４５、ＬＹＳ ５２、ＬＹＳ ９７、ＬＹＳ １１６、ＬＹＳ １４０、ＬＹＳ １５２、ＬＹＳ
１５４のいずれかもしくはすべてが組換え的、酵素的又は化学的手段により修飾された、組換え又は非−組換え哺乳類エリトロポエチンを含有する赤血球形成性タンパク質もしくはタンパク質複合体。
【請求項４４】
ＴＧａｓｅ基質性に影響を与え、それにより循環半減期を延長するか或いはまた赤血球形成性タンパク質の生物学的活性を変更するために、いずれかの残基が組換え的、酵素的もしくは化学的手段により修飾された、組換え又は非−組換え哺乳類エリトロポエチンを含有する赤血球形成性タンパク質もしくはタンパク質複合体。
【請求項４５】
アミン供与体Ａが第２の官能基を含有し、それが該第２の官能基へのポリマーＸ及び／又は有機部分Ｍの化学的手段による複合化を可能にする請求項１のエリトロポエチン複合体
。
【請求項４６】
第２の官能基がチオール、アルデヒド、ヒドラジド、マレイミド又はシステイン基である請求項４５のエリトロポエチン複合体。
【請求項４７】
アミン供与体Ａが第２の官能基を含有し、それが該官能基へのポリマーＸ及び／又は有機部分Ｍの化学的手段による複合化を可能にする請求項２のエリトロポエチン複合体。
【請求項４８】
第２の官能基がチオール、アルデヒド、ヒドラジド、マレイミド又はシステイン基である請求項４７のエリトロポエチン複合体。
【請求項１】
式：
ＥＰＯ−［Ｇｌｎ−Ａ−Ｘ−（Ｍ）ｎ］ｙ
［式中、ＥＰＯはエリトロポエチン又は骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の生産の増加を生じさせ生物学的性質を有するその製薬学的に許容され得る誘導体であり；ＧｌｎはＥＰＯの一次配列内の１個もしくはそれより多いグルタミン残基から選ばれるグルタミン残基であり；ｙは修飾されたグルタミン残基の数を示す１〜７の整数であり；Ａはアミン供与体部分又はヒドロキシル基であり、Ｘは場合による親水性ポリマー部分であり；Ｍは場合による有機分子であり、それはＥＰＯ分子の循環半減期を延長させることができることを特徴とし；ｎは０〜１５の整数である］
の部分を含んでなる、骨髄細胞に赤血球の生産の増加を生じさせる生物学的性質を有する赤血球形成性複合体ならびにその製薬学的に許容され得る塩又はエステル。
【請求項２】
式：
ＥＰＯ−［Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｚ−Ｘ−（Ｍ）ｎ］ｙ （ＩＩ）
［式中、ＥＰＯはエリトロポエチン又は骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の生産の増加を生じさせる生物学的性質を有するその製薬学的に許容され得る誘導体であり；ＬｙｓはＥＰＯの一次配列内の１個もしくはそれより多いリシン残基から選ばれるリシン残基であり；ｙは修飾されたリシン残基の数を示す１〜８の整数であり；Ｇｌｎはグルタミン残基であり；Ｚはトランスグルタミナーゼアミン受容体として働くことができるＧｌｎ残基を含有するペプチド又はタンパク質であり、Ｘは場合による親水性ポリマーであり；Ｍは場合による有機分子であり、それはＥＰＯ分子の循環半減期を延長させることができることを特徴とし；Ｎは０〜１５の整数である］
の部分を含んでなる、骨髄細胞に赤血球の生産の増加を生じさせる生物学的性質を有する赤血球形成性複合体ならびにその製薬学的に許容され得る塩又はエステル。
【請求項３】
骨髄細胞に赤血球の生産の増加を生じさせ、該エリトロポエチン複合体の投与後、非複合化エリトロポエチンの投与後に見られる時間より長い時間、該増加が持続する請求項１又は２の赤血球形成性複合体。
【請求項４】
持続性効果が非修飾哺乳類エリトロポエチンより延長された血清半減期による請求項３の赤血球形成性複合体。
【請求項５】
Ｍが１〜約６個の有機部分であり、それらはそれぞれ独立して脂肪酸基、脂肪酸エステル基、脂質又はリン脂質から選ばれる請求項１又は２の赤血球形成性複合体。
【請求項６】
親水性ポリマーがポリアルキレンオキシドである請求項１又は２のエリトロポエチン複合体。
【請求項７】
該エリトロポエチン又は赤血球形成性部分が組換え及び非−組換え哺乳類エリトロポエチンから選ばれる請求項１又は２の赤血球形成性複合体。
【請求項８】
ポリアルキレンオキシドが置換されたポリエチレンオキシドである請求項６の赤血球形成性複合体。
【請求項９】
ポリアルキレンオキシドがポリエチレングリコールホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、アルキル−ポリエチレンオキシド、ビスポリエチレンオキシド及びポリアルキレンオキシドのコ−ポリマー又はブロックコ−ポリマーから選ばれる請求項６の赤血球形成性複合体。
【請求項１０】
該親水性ポリマーが成熟鎖ＥＰＯのＧＬＮ ５８、ＧＬＮ ５９、ＧＬＮ６５、ＧＬＮ７８、ＧＬＮ８６、ＧＬＮ９２、ＧＬＮ１１５の１〜７個に結合している請求項１の赤血球形成性複合体。
【請求項１１】
該親水性ポリマーが成熟鎖ＥＰＯのＬＹＳ ２０、ＬＹＳ ４５、ＬＹＳ ５２、ＬＹＳ ９７、ＬＹＳ １１６、ＬＹＳ １４０、ＬＹＳ １５２、ＬＹＳ １５４の１〜８個に結合している請求項２の赤血球形成性複合体。
【請求項１２】
該ポリアルキレンオキシドが約２００〜約１００，０００の分子量を有するポリエチレングリコールホモポリマーである請求項６の赤血球形成性複合体。
【請求項１３】
該親水性ポリマー基が直鎖状もしくは分枝鎖状ポリアルカングリコール鎖、炭水化物鎖、アミノ酸鎖又はポリビニルピロリドン鎖であり、且つ該親水性ポリマー基が約８００〜約１２０，０００ダルトンの分子量を有する請求項１及び２の赤血球形成性複合体。
【請求項１４】
該疎水性ポリマー基が２，０００ダルトンより大きい分子量を有する直鎖状もしくは分枝鎖状ポリアルカングリコール鎖である請求項１３の赤血球形成性複合体。
【請求項１５】
該親水性ポリマー基が直鎖状もしくは分枝鎖状ポリエチレングリコール鎖又は直鎖状もしくは分枝鎖状置換ポリエチレングリコール鎖であり、ｎが０以外の整数であり、有機部分がアルキル基、Ｃ６−Ｃ４０脂肪酸基、Ｃ６−Ｃ４０脂肪酸エステル基、脂質基及びリン脂質基から選ばれる請求項１３の赤血球形成性複合体。
【請求項１６】
該親水性ポリマー基が、アルキル基、Ｃ６−Ｃ４０脂肪酸基、Ｃ６−Ｃ４０脂肪酸エステル基、脂質基及びリン脂質基から選ばれる有機部分で末端が置換された直鎖状もしくは分枝鎖状ポリエチレングリコール鎖である請求項１３の赤血球形成性複合体。
【請求項１７】
該有機部分がパルミトイルである請求項１５の赤血球形成性複合体。
【請求項１８】
有機部分がジステロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である請求項１５の赤血球形成性複合体。
【請求項１９】
親水性ポリマー−有機部分が成熟鎖ＥＰＯのＧＬＮ ５８、ＧＬＮ ５９、ＧＬＮ６５、ＧＬＮ７８、ＧＬＮ８６、ＧＬＮ９２、ＧＬＮ１１５の１〜７個に共有結合している請求項１５の赤血球形成性複合体。
【請求項２０】
親水性ポリマー−有機部分が成熟鎖ＥＰＯのＬＹＳ ２０、ＬＹＳ ４５、ＬＹＳ ５２、ＬＹＳ ９７、ＬＹＳ １１６、ＬＹＳ １４０、ＬＹＳ １５２、ＬＹＳ １５４の１〜８個に共有結合している請求項１５の赤血球形成性複合体。
【請求項２１】
Ａがアミン供与体ＴＧａｓｅ基質であり、ＸがＰＥＧ又は他の水溶性ポリマーであり且つ任意であり、Ｍがビオチン、ダンシル又は研究、診断もしくは治療目的に有用な生物物理学的性質をＥＰＯに与える他の有機部分である請求項１の複合体。
【請求項２２】
Ａがグルタミン−含有ＴＧａｓｅ基質であり、ＸがＰＥＧ又は他の水溶性ポリマーであり且つ任意であり、Ｍがビオチン、ダンシル又は研究、診断もしくは治療目的に有用な生物物理学的性質をＥＰＯに与える他の有機部分である請求項２の複合体。
【請求項２３】
式：
ＥＰＯ−［Ｇｌｎ−Ａ−Ｘ−（Ｍ）ｎ］ｙ
［式中、ＥＰＯはエリトロポエチン又は骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の生産の増加を生じさせる生物学的性質を有するその製薬学的に許容され得る誘導体であり；ＧｌｎはＥＰＯの一次配列内の１個もしくはそれより多いグルタミン残基から選ばれるグルタミン残基であり；ｙは修飾されたグルタミン残基の数を示す１〜７の整数であり；Ａはアミン供与体部分又はヒドロキシル基であり、Ｘは場合による親水性ポリマー部分であり；Ｍは場合による有機分子であり、それはＥＰＯ分子の循環半減期を延長させることができることを特徴とし；ｎは０〜１５の整数である］
の赤血球形成活性を有するＥＰＯ複合体ならびにその製薬学的に許容され得る塩又はエステルの製造方法であって；
トランスグルタミナーゼの存在下に、ＥＰＯ−ポリマー−有機部分複合体が形成されるような条件下で、水が接近できるグルタミン残基を有するエリトロポエチン又は赤血球形成性タンパク質を、トランスグルタミナーゼ基質として働くことができるあらかじめ構築された式Ａ−Ｘ（Ｍ）ｎの親水性ポリマー−有機部分複合体と接触させることを含んでなる方法。
【請求項２４】
該ポリマーがポリアルキレンオキシドである請求項２３の方法。
【請求項２５】
該ポリアルキレンオキシドがアルファ−置換ポリアルキレンオキシドである請求項２４の方法。
【請求項２６】
該ポリアルキレンオキシドがポリエチレングリコールである請求項２５の方法。
【請求項２７】
トランスグルタミナーゼが哺乳類タンパク質である請求項２３の方法。
【請求項２８】
トランスグルタミナーゼがバクテリアタンパク質である請求項２３の方法。
【請求項２９】
トランスグルタミナーゼが原核生物タンパク質である請求項２３の方法。
【請求項３０】
Ａがアミン供与体ＴＧａｓｅ基質であり、ＸがＰＥＧ又は他の水溶性ポリマーであり且つ任意であり、Ｍがビオチン、ダンシル又は研究、診断もしくは治療目的に有用な生物物理学的性質をＥＰＯに与える他の部分である請求項２３の方法。
【請求項３１】
式：
ＥＰＯ−［Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｚ−Ｘ−（Ｍ）ｎ］ｙ （ＩＩ）
［式中、ＥＰＯはエリトロポエチン又は骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球の生産の増加を生じさせる生物学的性質を有するその製薬学的に許容され得る誘導体であり；ＬｙｓはＥＰＯの一次配列内の１個もしくはそれより多いリシン残基から選ばれるリシン残基であり；ｙは修飾されたリシン残基の数を示す１〜８の整数であり；Ｇｌｎはグルタミン残基であり；Ｚはトランスグルタミナーゼアミン受容体として働くことができるＧｌｎ残基を含有するペプチド又はタンパク質であり、Ｘは場合による親水性ポリマーであり；Ｍは場合による有機分子であり、それはＥＰＯ分子の循環半減期を延長させることができることを特徴とし；Ｎは０〜１５の整数である］
の赤血球形成活性を有するＥＰＯ複合体ならびにその製薬学的に許容され得る塩又はエステルの製造方法であって；
トランスグルタミナーゼの存在下に、ＥＰＯ−ポリマー−有機部分複合体が形成されるような条件下で、水が接近できるリシン残基を有するエリトロポエチン又は赤血球形成性タンパク質を、トランスグルタミナーゼ基質として働くことができるあらかじめ構築された式Ｇｌｎ−Ｚ−Ｘ（Ｍ）ｎの親水性ポリマー−有機部分複合体と接触させることを含んでなる方法。
【請求項３２】
該ポリマーがポリアルキレンオキシドである請求項３１の方法。
【請求項３３】
該ポリアルキレンオキシドがアルファ−置換ポリアルキレンオキシドである請求項３２の方法。
【請求項３４】
該ポリアルキレンオキシドがポリエチレングリコールである請求項３３の方法。
【請求項３５】
トランスグルタミナーゼが哺乳類タンパク質である請求項３１の方法。
【請求項３６】
トランスグルタミナーゼがバクテリアタンパク質である請求項３１の方法。
【請求項３７】
トランスグルタミナーゼが原核生物タンパク質である請求項３１の方法。
【請求項３８】
Ａがアミン受容体ＴＧａｓｅ基質として働くことができるグルタミン残基を含有するペプチド、タンパク質又は他のポリマーであり、ＸがＰＥＧ又は他の水溶性ポリマーであり且つ任意であり、Ｍがビオチン、ダンシル又は研究、診断もしくは治療目的に有用な生物物理学的性質をＥＰＯに与える他の部分である請求項３１の方法。
【請求項３９】
請求項１又は２の複合体の治療的に有効な量を投与することを含んでなる貧血の処置方法。
【請求項４０】
該複合体が非複合化エリトロポエチンと比較して延長された血清半減期を特徴とする請求項３９の方法。
【請求項４１】
ＴＧａｓｅ基質性を改変し、それにより循環半減期を延長するか或いはまた赤血球形成性タンパク質の生物学的活性を変更するために、残基ＧＬＮ ５８、ＧＬＮ５９、ＧＬＮ６５、ＧＬＮ７８、ＧＬＮ８６、ＧＬＮ９２及びＧＬＮ１１５のいずれかもしくはすべてが組換え的、酵素的又は化学的手段により修飾された、組換え又は非−組換え哺乳類エリトロポエチンを含有する赤血球形成性タンパク質もしくはタンパク質複合体。
【請求項４２】
該グルタミン残基の１個もしくはそれより多くが化学的に修飾されるか、除去されるか又は他のアミノ酸に変更され、それによってグルタミン残基がＴＧａｓｅ基質として働く能力が増加するか、減少するか又は除去される請求項４１の赤血球形成性タンパク質又はタンパク質複合体。
【請求項４３】
ＴＧａｓｅ基質性を改変し、それにより循環半減期を延長するか或いはまた赤血球形成性タンパク質の生物学的活性を変更するために、残基ＬＹＳ ２０、ＬＹＳ ４５、ＬＹＳ ５２、ＬＹＳ ９７、ＬＹＳ １１６、ＬＹＳ １４０、ＬＹＳ １５２、ＬＹＳ
１５４のいずれかもしくはすべてが組換え的、酵素的又は化学的手段により修飾された、組換え又は非−組換え哺乳類エリトロポエチンを含有する赤血球形成性タンパク質もしくはタンパク質複合体。
【請求項４４】
ＴＧａｓｅ基質性に影響を与え、それにより循環半減期を延長するか或いはまた赤血球形成性タンパク質の生物学的活性を変更するために、いずれかの残基が組換え的、酵素的もしくは化学的手段により修飾された、組換え又は非−組換え哺乳類エリトロポエチンを含有する赤血球形成性タンパク質もしくはタンパク質複合体。
【請求項４５】
アミン供与体Ａが第２の官能基を含有し、それが該第２の官能基へのポリマーＸ及び／又は有機部分Ｍの化学的手段による複合化を可能にする請求項１のエリトロポエチン複合体
。
【請求項４６】
第２の官能基がチオール、アルデヒド、ヒドラジド、マレイミド又はシステイン基である請求項４５のエリトロポエチン複合体。
【請求項４７】
アミン供与体Ａが第２の官能基を含有し、それが該官能基へのポリマーＸ及び／又は有機部分Ｍの化学的手段による複合化を可能にする請求項２のエリトロポエチン複合体。
【請求項４８】
第２の官能基がチオール、アルデヒド、ヒドラジド、マレイミド又はシステイン基である請求項４７のエリトロポエチン複合体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２００７−５３７９８６（Ｐ２００７−５３７９８６Ａ）
【公表日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３３４３７（Ｐ２００６−５３３４３７）
【出願日】平成１６年５月２７日（２００４．５．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１６６７０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０８６６７
【国際公開日】平成１６年１２月１６日（２００４．１２．１６）
【出願人】（５０３０５４１２２）セントカー・インコーポレーテツド (74)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年５月２７日（２００４．５．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１６６７０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０８６６７
【国際公開日】平成１６年１２月１６日（２００４．１２．１６）
【出願人】（５０３０５４１２２）セントカー・インコーポレーテツド (74)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]