トランスジェニック植物におけるオリゴ糖の産生
【課題】公知の製造経路が有する欠点を回避したオリゴ糖の別の製造経路を提供すること。
【解決手段】スクロースをオリゴ糖に変換する能力を有する酵素をコードする遺伝子を選抜し；適当な転写-開始および転写-終止シグナルに該遺伝子を連結して発現構築物を得；適当な植物細胞を該発現構築物で形質転換し；形質転換植物細胞からトランスジェニック植物を再生し；該酵素の発現および活性を許容する条件下で該トランスジェニック植物を培養し；ついで、該トランスジェニック植物からオリゴ糖を単離することよりなることを特徴とするオリゴ糖の製法、ならびに、オリゴ糖を産生し得るトランスジェニック植物およびその一部分に加えて、該方法によって得た産物およびその使用。
【解決手段】スクロースをオリゴ糖に変換する能力を有する酵素をコードする遺伝子を選抜し；適当な転写-開始および転写-終止シグナルに該遺伝子を連結して発現構築物を得；適当な植物細胞を該発現構築物で形質転換し；形質転換植物細胞からトランスジェニック植物を再生し；該酵素の発現および活性を許容する条件下で該トランスジェニック植物を培養し；ついで、該トランスジェニック植物からオリゴ糖を単離することよりなることを特徴とするオリゴ糖の製法、ならびに、オリゴ糖を産生し得るトランスジェニック植物およびその一部分に加えて、該方法によって得た産物およびその使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴ糖の製法、その方法で産生したオリゴ糖、オリゴ糖を産生し得るトランスジェニック植物および植物細胞、ならびにその方法で得たオリゴ糖の適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
食物産業においては、「ライト」および低カロリーに向けた大きくなりつつあるトレンドが認めることができる。製品中の多すぎる脂肪および/または砂糖の本明細書中における使用は避ける。それにもかかわらず、甘い味覚を有する食物製品を得るために、増加しつつある多種の砂糖代替物(substitute)が販売されてきている。アスパルタームは、その知られている例である。しかしながら、アスパルタームは、官能器刺激特性に乏しい。
【０００３】
もう１つの型の砂糖代替物は、オリゴ糖により形成される。オリゴ糖は、フルクトースおよび/またはグルコースのごとき、２個または３個以上の単糖よりなる分子である。該オリゴ糖中の単糖は、β-(２-１)-またはβ-(２-６)結合のいずれかによって互いに結合している。オリゴ糖中の単糖の数は、ＤＰ-値(「重合度」)によって示される。３のＤＰ-値とは、オリゴ糖が３個の単糖より構成されることを意味する。オリゴフルクトースとは、フルクトース単位より全体的になるオリゴ糖である。また、オリゴ糖が１または２以上のグルコース単位よりなる場合、これらは、フルクトース単位にα(１-２)結合によって結合するであろう。オリゴ糖の組成は、式ＧｍＦｎ,でも示され、ここに、Ｇはグルコース、Ｆはフルクトースを示し、ｍは０または１に等しく、ｎは０よりも大きいか、または０に等しい全体数である。特に適したオリゴ糖は、ｍが１に等しく、ｎが２〜８、好ましくは２または３であるものである。
【０００４】
オリゴ糖は加水分解され難く、例えば、ヒトの胃および小腸では全く加水分解されない。ヒトの消化酵素はオリゴフルクトース分子中のβ(２-１)およびβ(２-６)結合に何ら効果を有していないことが、オリゴフルクトースの知られている事実である。したがって、それは、分解され、体内に吸収されることなく胃および小腸を通過する。しかしながら、オリゴ糖は、大腸の微生物フローラによって代謝されるもの以外は身体に残らない。ここでガスに加えて放出されるのは、揮発性脂肪酸であり、ついで、これは再度、腸フローラのエネルギー源として供される。この現象は、なぜ、オリゴ糖が、身体に吸収されるグルコース、フルクトースおよびスクロースのごとき遊離糖よりもヒトに対して低エネルギー値を有するのかということを説明している。しかしながら、オリゴ糖は、砂糖代替物として供するに十分な甘味力を有しているのである。
【０００５】
さらに、オリゴ糖、特にオリゴフルクトースは、ビフィズス源効果(bifidogeniceffect)を有すること、すなわち、それが消化系のビフィズス菌の増殖を刺激することが知られている。ビフィズス菌は、病原性細菌の進展に対して保護し、それによって健康にプラスの影響を有する。加えて、オリゴ糖は栄養繊維である。
多様な方法で調製した種々のオリゴ糖がちょうど今、すでに販売されてきている。
【０００６】
オリゴ糖は、より長い植物イヌリン鎖の部分酵素的加水分解によって製造し得る。それに関する方法は、例えば、欧州特許出願440.074号に記載されている。
オリゴ糖は、同じく酵素的に合成し得る。この酵素的製造経路用途は、スクロースをオリゴ糖混合物に変換し、異なる微生物から単離された酵素、フルクトシルトランスフェラーゼ(ＪＰ-８０/４０１９３)よりなる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、公知の製造経路は多数の欠点を有している。第一に、双方の公知の製法は比較的高価である。製造混合物中には、２〜約７個の鎖長を有する所望のオリゴ糖に加えて、比較的に多数の遊離糖およびより長い鎖長を有するオリゴ糖も生じる。多くの遊離糖の欠点は、それが、混合物のエネルギー値の増加を生じることである。例えば、遊離糖が１７キロジュール/ｇのエネルギー定数を有するのに対し、純粋なＧＦ２およびＧＦ３は４〜６キロジュール/ｇのエネルギー定数を有する。加えて、遊離糖は歯科う触(虫歯)を引き起こす。
【０００８】
反対に、長過ぎる鎖長を有するオリゴ糖は、甘味能力が低く、このことは、混合物の平均甘味能力の低下を引き起こす。
たとえば、アスパルタームのごときある種の他の甘味料に対して、オリゴ糖は優れた官能器刺激特性を有する。
本発明の目的は、前記した欠点を回避したオリゴ糖の別の製造経路を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この最後に、本発明は、
ａ）スクロースをオリゴ糖に変換する能力を有する酵素をコードする遺伝子を選抜し；
ｂ）該遺伝子を適当な転写-開始シグナルおよび転写-終止シグナルに連結して発現構築物を得；
ｃ）適当な植物細胞を該発現構築物で形質転換し；
ｄ）該形質転換細胞からトランスジェニック細胞を再生し；
ｅ）酵素の発現および活性を許容する条件下にて該トランスジェニック植物を培養し；ついで、
ｆ）該トランスジェニック植物からオリゴ糖を単離する工程
よりなることを特徴とするオリゴ糖の製法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
したがって、本発明は、公知の産業的製法によって調製したオリゴ糖と比較して、より望ましい特性を有するオリゴ糖またはオリゴ糖の混合物をトランスジェニック植物または植物細胞によって製造する方法を提供する。
【００１１】
本発明による方法の特に有利な点は、鎖長分布が狭く、それによって最終産物中に遊離糖が全く、またはほとんど生じないことである。その結果は、低う触性および所望の低エネルギー値である。また、５より大きな鎖長を有するオリゴ糖もほとんど生じない。その利点は、本発明により製造されるオリゴ糖が、より高い特異的な甘味能力を有することである。甘味能力は「平均鎖長」に依存するのが事実である。混合物の平均鎖長が長くなる程、甘味能力は低下してゆく。高い特異的な甘味能力の利点は、余分の甘味料を製品の加工にほとんど添加する必要がないことである。
【００１２】
同様な考察は、溶解性に関してもあてはまる。平均鎖長が増加すると溶解性が低下することも事実である。したがって、本発明による混合物は、酵素的合成または酵素的加水分解によって得た混合物よりもより高い溶解性を有する。加えて、生産コストがかなり低下する。
【００１３】
ビフィズス菌体内では、短鎖が長鎖よりも吸収され得るということが示唆されている。したがって、本発明による方法により製造したオリゴ糖混合物は、より高いビフィズス源効果を有するであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
スクロースをオリゴ糖に変換する能力を有する酵素をコードする遺伝子を選抜するためには、例えば、細菌のような微生物、または植物のような、フルクトシルトランスフェラーゼ活性を含むいずれの可能な生物においても探索することが可能である。スクロースからフルクタンを生成し得るフルクトシルトランスフェラーゼを含む多種の微生物が知られている。これらの酵素は、フルクトース単位を、スクロースからフルクタン受容体分子に移動させる。微生物フルクトシルトランスフェラーゼは、通常、高ＤＰのフルクタンを生成する。かかる多糖類産生用のトランスジェニック植物を製造するための、種々のフルクトシルトランスフェラーゼの用途は、すでに文献に記載されている。かくして、バシラス・サチリス(Ｂacillus subtilis)のＳacＢ-遺伝子を植物に導入することによって、この植物のフルクタンのパターンを改変し得ることは知られている(ＷＯ８９/１２３８６号)。しかしながら、このことは、高分子量多糖類の生成にも関係している。
【００１５】
スクロースを高分子量フルクタンに変換し得るフルクトシルトランスフェラーゼをコードすることが知られているもう１つの遺伝子は、ストレプトコッカス・ミュータンス(Ｓtreptococcus mutans)のｆｔｆ遺伝子である。本発明によれば、驚くべきことには、高分子フルクタンに加えて、このフルクトシルトランスフェラーゼが、三糖類クラス(１-ケストース)の、かなりの量のオリゴ糖を生成することがここに判明した。また、突然変異体は、三糖類のみを蓄積し、多糖類は蓄積しないことも判明している。
【００１６】
さらに知られているのは、同様に、主として三糖類を産生するバシラス・サチリス(Ｂacillus subtilis)のＳac Ｂ遺伝子の突然変異体である。
【００１７】
膨大な種類の他の微生物も、同様にフルクトシルトランスフェラーゼを産生し得る。これらには、限定するものではないが、内生胞子を形成する、桿菌および球菌(例えば、バシラス(Ｂacillus))、グラム-陽性球菌(例えば、ストレプトコッカス(Ｓtreptococcus))、グラム-陰性好気性桿菌および球菌(例えば、シュードモナス(Ｐseudomonas)、ザントモナス(Ｘanthomonas)、アゾトバクター(Ａzotobacter))、グラム-陰性任意嫌気性桿菌(例えば、エルウィニア(Ｅrwinia)、ザイモモナス(Ｚymomonas))、放線菌類(例えば、アクチノマイセス類、ロシア類)ならびに藍細菌(例えば、トリポスリクス・テニス(Ｔolypothrix tenuis))が含まれる。
【００１８】
これらのフルクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、所望により、標的またはランダム突然変異導入技術によって改変して、望ましいオリゴ糖-合成酵素特性を有する酵素を提供することができる。
【００１９】
細菌フルクトシルトランスフェラーゼは、スクロースについては約２０ｍＭの比較的低いＫＭを有する。大部分の植物におけるスクロース濃度はかなり高く、したがって、これらの酵素は植物中でも活性であろう。細菌フルクトシルトランスフェラーゼの重要な特性は、０℃までの低温でのその活性である。植物は、しばしばこれらの温度に接するが、細菌酵素はこれらの条件下でさえもまだ活性であろう。
【００２０】
また、フルクトシルトランスフェラーゼは、植物起源とすることもできる。植物においては、フルクタンの生合成および分解は、限定された数の種でのみ起こる。例は、キク科(Ａsteraceae)、ユリ科(Ｌiliaceae)およびイネ科(Ｐoaceae)ファミリーである。既知の植物フルクトシルトランスフェラーゼから出発して、標的もしくはランダム突然変異導入法によってか、または、すでに天然に発生した突然変異体の選抜によって、本発明に適した遺伝子を単離し、または作製することができる。
【００２１】
非常に適当な植物フルクトシルトランスフェラーゼの例は、種々の植物種に生じ、特に三糖類の合成を触媒するスクロース-スクロース-フルクトシルトランスフェラーゼ(ＳＳＴ)である。
【００２２】
もう１つの例は、オオムギ(Ｈordeum vulgare Ｌ.)からのスクロース-フルクタン-６-フルクトシルトランスフェラーゼ(６-ＳＦＴ)である。本発明の１つの具体例によれば、オリゴ糖産生用の６-ＳＦＴを発現するトランスジェニック植物を提供する。
【００２３】
本発明のもう１つの具体例によれば、キクイモ(Ｈelianthus tuberosus Ｌ.)のフルクタン-フルクタン-フルクトシルトランスフェラーゼ(ＦＦＴ)を含むトランスジェニック植物を提供する。
【００２４】
選抜したフルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を植物内で発現させるためには、プロモーター、エンハンサーなどのごとき転写-開始シグナルを遺伝子付加して、所望の発現構築物を得ることができる。かかる発現プロモーターは、特定の細胞型に特異的とし得、または多様な細胞型で活性とし得る。加えて、発現の時期および部位は、例えば、分化-特異的プロモーターの使用によって決定し得る。植物における遺伝子発現用に一般的に用いられているプロモーターは、３５Ｓ カリフラワー・モザイクウイルス・プロモーター(ＣaＭＶプロモーター)であり、これは、植物の分化ステージに依存して、多種の細胞型で活性である。フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が植物起源である場合、それ自体の調節配列を使用することもできる。
【００２５】
好ましいプロモーターは、標的植物および目的に応じて、強力または弱い、組織-特異的または構成プロモーターとし得る。適当なプロモーターの例は、「シンク(sink)」-特異的パタチン・プロモーターおよびジャガイモの顆粒-結合デンプン・シンターゼ・プロモーター、またはサツマイモのスポラミン プロモーターである。
【００２６】
さらに転写レベルを上昇するために、プロモーターを改変し、またはエンハンサーを重複して含ませることができる。
【００２７】
ｍＲＮＡの転写は、アルファルファ・モザイクウイルス ＲＮＡ４翻訳エンハンサーシグナルのごとき転写エンハンサーを付加することによって改変し得、それは翻訳される５'非-翻訳領域に存在しなければならない。
【００２８】
転写を正確に終止させるために、構築物にターミネーター配列を付加し得る。かかる配列の例は、ノパリン・シンターゼ遺伝子終止配列である。
【００２９】
特別の状況に適した発現シグナルの選択は、もちろん、この目的のために行わなければならないさらなる進歩的な研究を行わなくとも、当業者が到達する範囲内である。
【００３０】
フルクトシルトランスフェラーゼの基質であるスクロースは、多くの異なる部位に存在する炭水化物である。それは細胞質で合成され、また、サイトゾル、液胞および細胞外間隙(アポプラスト)または他の可能な部位でかなりな量発見されている。
【００３１】
植物細胞における生化学プロセスは、同様にして、単一または多数の細胞区画にしばしば限定されるため、新たに導入した遺伝子の産物の蓄積は特異的な区画で起こることが望ましい。この目的のためには、細胞区画に特異的である標的配列は、トランスジェニック植物で発現するフルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のコード部分に近接して発現構築物中に存在させ得る。異なる細胞位置を標的化するための特異的アミノ酸領域は、すでに同定され解析されている。これらのＤＮＡ-配列は、フルクトシルトランスフェラーゼ活性が細胞または植物の所望の区画に指向されるよう、該酵素の遺伝子にリンクさせ得る。
【００３２】
したがって、本発明の好ましい具体例において、発現構築物は、また、フルクトシルトランスフェラーゼ活性を１または２以上の特異的な植物細胞区画に指向させる標的配列よりなる。標的配列の例は、ジャガイモからのパタチンのものか、またはサツマイモからのスポラミンのものの、カルボキシペプチダーゼＹ(ｃｐｙ)遺伝子のシグナル配列および液胞標的配列、あるいは、ＰＲ蛋白質Ｓ-遺伝子(ｐｒ-ｓ)のシグナル配列およびアポプラスト標的配列である。しかしながら、これらのものは例であって、当業者であれば、自身で他の標的配列を選択し得るであろう。
【００３３】
原則として、発現構築物は、液胞、色素体、細胞壁、細胞質ほかのごとき、いずれのランダムな細胞区画においても標的化が起こるように改変し得る。
【００３４】
導入遺伝子発現の位置のみならず時期までも、制御することがしばしば植物に有利となる。例えば、新たに導入した酵素の活性の発現は、通常、植物の特異的な部分、例えば、塊茎、果実または種子のごとき収穫し得る器官に限定することが通常望ましい。さらには、しばしば、特定の分化ステージにおいてこれらの器官で発現を開始させることが望ましい。このことは、たしかに、導入遺伝子の発現が、かかる器官の正常な分化を妨害する場合である。
【００３５】
本発明によるオリゴ糖は、「ライト」バージョンの種々の食物製品中の砂糖、グルコース・シロップおよびイソグルコースの代替物として用いることができる。食物製品の例は、糖菓、ビスケット、ケーキ、デイリー製品、ベビーフーズ、アイスクリームおよび他のデザート、チョコレートほかである。また、ビフィズス菌の刺激も、動物の健康に重要である。したがって、本発明によるオリゴ糖は、例えば、動物飼料としても適用し得る。
【００３６】
さらに、本発明は、以下の例を基礎としてさらに明瞭になるであろう。これは、本発明の説明目的のものであって、いかなる場合においても限定することを意図するものではない。以下に示す添付図面に関する説明は、実施例で行う。
【実施例】
【００３７】
実施例１
遺伝子の選抜
１．天然発生遺伝子
スクロースからのオリゴ糖のその産生能につき、多数の微生物をスクリーニングした。この目的のため、微生物培養は、液体栄養中で一晩増殖させた。オリゴ糖-産生活性は、培養試料を、０.１％Ｔriton Ｘ-１００存在下、２００ｍＭスクロースと共にインキュベートすることによって測定した。反応産物は、ＴＬＣによって分離し、フルクトース特異的試薬を用いて視覚化した(Ｃairns，Ａ.Ｊ.およびＰollock，Ｃ.Ｋ.,Ｎew Ｐhytol.109，399-405(1988))。ストレプトコッカス・ミュータンス(Ｓtreptococcus mutans)がオリゴ糖の有効な産生菌であることがこのスクリーニングの結果として判明した(図１参照)。オリゴ糖-産生酵素活性は、ＤＥＡＥ-イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーによってストレプトコッカス・ミュータンス(Ｓtreptococcus mutans)培養物から精製した。それから、ＳhirozaおよびＫuramitsu(Ｊ.Ｂacteriol.170，810-816(1988))によって記載されているｆｔｆ遺伝子の産物によって酵素活性が誘導されることが判明した。
【００３８】
つづいて、プラスミドｐＴＳ１０２(ＳhirozaおよびＫuramitsu，前掲)からのフルクトシルトランスフェラーゼ(ｆｔｆ)遺伝子を、ｐＥＭＢＬ９(Ｄenteら，Ｎucl.Ａcids Ｒes.11,1645-1655(1983))のマルチクローニングサイトにＥcoRV-ＢglＩＩフラグメントとしてクローン化し、このプラスミド中に存在するｌａｃＺプロモーターから発現させた。ついで、イー・コリ(Ｅ.coli)をそれで形質転換した。それによって細菌は、オリゴ糖を産生し得るようになった。
【００３９】
オリゴ糖の産生は、前記したスクリーニング法によって証明した。非-形質転換イー・コリ(Ｅ.coli)は、スクロースからオリゴ糖を何ら産生しない。
【００４０】
２．突然変異導入遺伝子
突然変異導入によって、必要により、それを酵素のオリゴ糖-産生活性に適用することが可能である。遺伝子中の突然変異は、例えば、以下の方法でなし得る。
【００４１】
ストレプトコッカス・ミュータンス(Ｓtreptococcus mutans)のｆｔｆ遺伝子の突然変異導入には、ゲノム組込み系(Ｖan Ｄer Ｐlasら，Ｇene 95，39-48(1990))によって、プラスミドｐＴＳ１０２をシネココッカス種(Ｓynechococcussp.)PCC 7942(R2-PIM9)のゲノムに組込み、株Ｒ２-ＰＴＳを得た。この藍細菌Ｒ２-ＰＴＳ株はフルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を発現する。Ｒ２-ＰＴＳ株は、ペリプラズム中のポリマー蓄積に起因するスクロース-感受性である。Ｒ２-ＰＴＳ培養物を、点突然変異(Ｔ→ＣおよびＧ→Ａ突然変異)を誘導するＮ-メチル-Ｎ'-ニトロ-Ｎ-ニトロソグアニジン(ＭＮＮＧ)で突然変異誘導した。変化したフルクトシルトランスフェラーゼ活性を有する突然変異体を選抜した。ＭＮＮＧによって突然変異導入した培養物を、スクロース含有培地上に平板し、合計４００個のスクロース-抵抗性のコロニーを、変化したフルクトシルトランスフェラーゼ活性について試験した。
【００４２】
これらのコロニーに由来したのはＲ２-ＰＴＳ培養物で、これを遠心によって濃縮した。かくして、得られたペレットを、１％Ｔriton X-100、２００ｍＭスクロースを入れた５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中に再懸濁し、３７℃にて一晩インキュベートした。その反応産物は、ＴＬＣ-分析によって分析した(ＣairnsおよびＰollock、前掲)。ＴＬＣは、８５：１５ アセトン：水で３回展開し、つづいてＷiseら，Ａnalytical Ｃhemistry 27,33-36(1955)によって記載されているのと同様に噴霧尿素で処理した。この方法は、フルクトースおよびフルクトース-含有ポリマーを優先的に染色する。
【００４３】
実質的に三糖類を産生する突然変異株の内から、前記方法で突然変異ｆｔｆ遺伝子の酵素的オリゴ糖-形成活性のイン・ビトロ(in vitro)証明用に１つを選択した。
【００４４】
本発明によれば、他の突然変異導入法(部位-特異的またはランダム)、および他の生物からのフルクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を同様に用いて、突然変異オリゴ糖-産生蛋白質の遺伝子を選抜することができる。
【００４５】
実施例２
植物におけるｆｔｆ遺伝子の発現
Ａ．植物形質転換ベクターにおける３５Ｓ-ｆｔｆ-ＮＯＳの構築
ｍＲＮＡの翻訳を刺激する二重エンハンサーおよび配列を有する植物-特異的３５Ｓプロモーターを含むプラスミドｐＭＯＧ１８は、Ｓymonsら(Ｂio/Ｔechnology 8，217-221(1990))によって記載されている。それは、３５Ｓ-プロモーター-ｕｉｄＡ-遺伝子-ＮＯＳ-ターミネーター構築物を含む。ＢamＨＩでの消化によって内部ＢamＨＩ-サイトを除去し、クレノー酵素で粘着末端を埋め、再度連結した、Ｓtratagene社(Ｓan Ｄiego,ＣＡ,Ｕ.Ｓ.Ａ.)からのｐＢluescriptＩＩＳＫ-プラスミドをさらなるクローニングに用いた。３５Ｓ-ｕｉｄＡ-ＮＯＳ-フラグメントをｐＭＯＧ１８のＥcoＲＩおよびＨindＩＩＩでの消化によって得、このＢamＨＩ-ｐＢluescriptを対応するＥcoＲＩ/ＨindＩＩＩサイトにクローン化し、プラスミドｐＰＡ２を得た。プラスミドｐＰＡ２をＮcoＩおよびＢamＨＩで消化し、ベクター含有フラグメントを単離した。
【００４６】
フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子ｆｔｆは、pＥＭＢＬ９のマルチクローニングサイト中のＥcoＲＶ/ＢglＩＩフラグメントとして、プラスミドｐＴＳ１０２からクローン化した(前記参照)。和合性ＳmaＩおよびＢamＨＩ部位をこの目的に用いた。これにより、プラスミドｐＴＡ１２を得た。
【００４７】
ｆｔｆ遺伝子の成熟プロセシングサイト(ヌクレオチド位置７８３)(Ｊ.Ｂacteriol.170，810-816(1988))に近接したＮcoＩ部位を得るために、以下のオリゴヌクレオチド：5'-GGCTCTCTTCTGTTCCATGGCAGATGAAGC-3'
で部位特異的-突然変異をＫramerら(Ｎucl.Ａcids Ｒes.12，9441-9456(1984))により記載されているごとく行った。これから、プラスミドｐＴＤ２を得た。成熟プロセシングサイトに対してアミノ酸位置＋１(ヌクレオチド位置７８３)のグルタミンが、これによってメチオニンに変化した。成熟フルクトシルトランスフェラーゼをコードする配列がその中に存在するＮcoＩ/ＰstＩフラグメントをさらなるクローニングに用いた。このプラスミドから、ＮcoＩ/ＰstＩフラグメントとしてｆｔｆ遺伝子を単離し、このフラグメントを前記のｐＰＡ２ベクター-含有フラグメントに連結した。これによりプラスミドｐＴＸを得た。ｐＴＸは、その中でｆｔｆがシグナル配列領域を有さない成熟フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子をその中に示す３５Ｓ-ｆｔｆ-ＮＯＳ-フラグメントを含む。ｐＴＸをＸbaＩおよびＨindＩＩＩで消化し、完全構築物(３５Ｓ-ｆｔｆ-ＮＯＳ)を含有するフラグメントを、バイナリ植物ベクターｐＢＩＮ１９(Ｂevan，Ｎucl.Ａcids Ｒes.,12，8711-8721)の誘導体であるｐＭＯＧ２３(Ｓymonsら，前掲)のＸbaＩ/ＨindＩＩＩ制限サイトにクローン化した。これからプラスミドｐＴＺを得た。
【００４８】
Ｂ．成熟ｆｔｆ遺伝子を発現するトランスジェニック植物の作成および解析
ｐＴＺ-プラスミドは、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３(Ｌam，Ｐlasmid 13，200-204(1985))の使用する３点交雑育種で、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Ａgrobacterium tumefaciens)LB4404(Ｈoekemaら，Ｎature 303，179-180(1983))にコンジュゲートした。リーフディスク形質転換法(Ｈorschら，Ｓcience 227，1229-1232(1985))を用いて、その構築物をニコチアナ・タバカム(Ｎicotiana tabacum) var.Ｐetit Ｈavanna(ＳＲ１)に導入した。再生植物はＫＰ-植物と呼称し、カナマイシン抵抗性につき選抜し、ＭＳ培地(ＭurashigeおよびＳkoog，Ｐhysiol.Ｐlant.15，473-497(1962))で培養した。その後に、植物を温室中の土壌で生育させ分析した。
【００４９】
葉材料を切除し、エッペンドルフチューブ中で摩砕した。遠心(１６,０００ｒｐｍにて２分間)後に、上清１μｌを、実施例１記載と同様にＴＬＣ上で分析した。オリゴ糖は、野生型植物または無-関係構築物で形質転換した植物では全く認められなかった。形質転換体のスクリーニングにより、この方法を用いてオリゴ糖-蓄積植物が実証された(図２参照)。発現レベルは、同構築物で形質転換した個々の植物間で変動した。このことは、植物における形質転換実験では通常の現象である。発現レベルの変動は、ゲノム中の組込み位置に実質的に依存する(位置効果)。
【００５０】
実施例３
タマネギからのオリゴ糖-産生酵素(ＳＳＴ)
微生物由来の前記で用いたフルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子に加えて、かかる酵素を植物によっても産生する。この例においては、タマネギ種子由来のＳＳＴ遺伝子を用いる。
【００５１】
タマネギ種子からのＳＳＴ蛋白質は、以下のプロトコールを用いたクロマトグラフィー法によって精製した。種子を湿布間にて、２２℃にて２〜３日間インキュベートし、ｐＨ５.７の５０ｍＭリン酸-クエン酸緩衝液中でホモジナイズした。デンプンおよび残渣は、約１０,０００ｇにて１０分間遠心することによって除去した。硫酸アンモニウムを２０％まで上清に添加し、沈殿を遠心によって採取した。上清中の硫酸アンモニウムの濃度を８０％まで上昇させ、沈殿を採取し、２０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４.６中に溶解した。その溶液を、３回緩衝液(２０ｍＭＮａＡｃ)を交換しつつ一晩透析し、その溶液を遠心によって清澄化した。上清をＦＰＬＣ monoＳ-カラム上に置き、０-０.５Ｍ ＮａＣlグラジエントを有する２０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４.６で溶出した。１０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５.６に対して一晩透析した後に、該溶液を、１０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５.６で平衡化したラフィノース-エポキシ・セファロースカラム(Ｐharmacia社)上に置いた。溶出は、１０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５.６(緩衝液Ａ)および１０ｍＭリン酸-クエン酸緩衝液、ｐＨ７.０＋０.５Ｍ ＮａＣl-緩衝液(緩衝液Ｂ)よりなる線形グラジエントで行った。活性フラクションは、２０ｍＭリン酸-クエン酸緩衝液、ｐＨ７.０に対して一晩透析し、２０ｍＭリン酸-クエン酸緩衝液、ｐＨ７.０中のmonoＱ ＦＰＬＣ-カラム上に置いた。そのカラムを０-０.５Ｍ ＮａＣｌのグラジエントで溶出した。最終精製のために、該蛋白質をＳepharose ６-カラム上に置き、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６.５、１％Ｔriton Ｘ-100で溶出した。タマネギ種子からの精製ＳＳＴのＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルの銀染色により、約６８,０００ｄの分子量を有する１のみのバンドが現れた(図３参照)。
【００５２】
この精製ＳＳＴをスクロースとインキュベートした場合、１-ケストースのみが産生された。顕著なインベルターゼ活性は何ら認められなかった(図４参照)。
精製蛋白質のアミノ酸配列は、徐々に消化することによって得たペプチドに基づいて決定した。６-ＳＦＴ遺伝子(実施例４参照)を用いて、２種のｃＤＮＡクローン、ｐＡＣ２２およびｐＡＣ９２を種子-産生タマネギ花からのｍＲＮＡのｃＤＮＡ-バンクから単離した。ｐＡＣ２２およびｐＡＣ９２のインサート配列はＡpplied Ｂiosystems Ｉnc.社からの自動シークエンサーで決定し、そのヌクレオチドおよび由来するアミノ酸配列を図１６および１７に示す。
【００５３】
ｐＡＣ２２およびｐＡＣ９２によりコードされる蛋白質の活性を決定するために、該インサートをその全体で、ＮcoＩおよびＢamＨＩでベクターを消化することによってエシェリキア・コリ(Ｅscherichia coli)uidＡコード配列を除去したｐＭＯＧ１８(Ｓijmonsら，Ｂio/Ｔechnology 8，217-221，1990)にクローン化した。ｐＡＣ２２およびｐＡＣ９２のＳmaＩ-ＸhoＩインサートをｐＭＯＧ１８中にクローン化し得る前に、ＮcoＩ５'粘着末端をＥxonucleaseＩＩＩで除去し、かくして平滑-末端を作製し、両方のＢamＨＩおよびＮcoＩ制限サイトを部分的にＫlenowポリメラーゼで埋め、それによって和合性連結サイトを作製した。かく得られた３５Ｓ-ＡＣ２２および３５Ｓ-ＡＣ９２プラスミドで、タバコプロトプラストを形質転換した(Ｇoodallら，Ｍeth.of Ｅnzymology 181，148-151，1990)。２５℃にてインキュベート２０時間後に、該プロトプラストをペレット化し、５０ｍＭ ＮａＰＯ４クエン酸緩衝液、ｐＨ５.７中に再懸濁した。液体窒素中で凍結することによって該プロトプラストを溶解した。激しく撹拌し、遠心した後に上清を１０ｍＭスクロースおよび１μｌ １４Ｃ-スクロース(Ａmersham社)と２５℃にて２０時間インキュベートした。試料を９５℃にて３分間加熱することによって反応を停止させた。試料当たり２μｌをＴＬＣプレート(Ｓchleider and Ｓchull社)上に負荷し、該ＴＬＣプレートを９０：１０アセトン：水中で３回展開し(ＣairnsおよびＰollock，Ｎew Ｐhytol．109，399-405，1988)、尿素噴霧で染色した(Ｗiseら，Ａnal.Ｂiochem.27，33-36，1955)。このようにして、オートラジオグラフィー(ハイパーフィルム-ＭＰ,Ａmersham社)後に、構築物３５Ｓ-ＡＣ２２および３５Ｓ-ＡＣ９２についてフルクトシルトランスフェラーゼ活性を証明し得た。
【００５４】
実施例４
オオムギからのスクロース-フルクタン ６-フルクトシルトランスフェラーゼ(６-ＳＦＴ)
１．導入部
スクロース-フルクタン ６-フルクトシルトランスフェラーゼ(６-ＳＦＴ)は、グラス(grass)に典型的な分岐フルクタン(グラミナンとも呼称される)生合成の鍵酵素である。該酵素は、スクロースからケストースを形成し、スクロースおよびイソケストースからビフルコースを形成する。この例においては、オオムギ(Ｈordeum vulgare Ｌ.)からの６-ＳＦＴの精製を記載する。加えて、完全ｃＤＮＡのクローニングおよび機能の立体配置についても記載する。
【００５５】
２．スクロース-フルクタン ６-フルクトシルトランスフェラーゼの精製
８〜１０日齢のオオムギ(Ｈordeum vulgare Ｌ.cv Ｅxpress)植物の第一葉を切除し、Ｓimmenら，Ｐlant Ｐhysiol.101，459-468(1993)によって記載されているのと同様にして、連続して４８時間光に暴露してフルクタンおよび該フルクタン生合成の酵素の蓄積を誘導した。つづいて、該葉を液体窒素中で凍結し、それを用いるまで-７０℃にて保存した。
【００５６】
酵素調製物は、誘導第一葉(７００ｇ新鮮重)を液体窒素中で微粉末に摩砕し、つづいてそれを抽出緩衝液(ＨＣlでｐＨ５.７５に調整した、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ベンズアミジン、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１ｍＭＰＭＳＦおよび０.５％ＰＶＰを含有する２５ｍＭ メチルピペラジン)中に懸濁することによって調製した。そのｇ新鮮重当たり２ｍlを用いた。除霜後に、該抽出物を４℃にて維持し、撹拌しつつ０.１Ｍ ＨＣlを滴下することによってｐＨ４.７５に調整した。３時間後に、その抽出物を１７,０００×ｇにて３０分間遠心した。得られた上清を、透析緩衝液(１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ベンズアミジン、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１ｍＭ ＰＭＳＦを含有する１０ｍＭ メチルピペラジン(ＨＣl)緩衝液(ｐＨ５.７５))に対して４℃にて一晩透析した。
【００５７】
その酵素溶液をＢlue Ｓepharose上のアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。この目的に、酵素溶液を０.４５μｍ Ｍilliporeフィルターを通して濾過し、前記透析緩衝液で予め平衡化したＢlue Ｓepharose-6-fast flow(Ｐharmacia社，Ｕppsala，Ｓweden)のカラム(26×120mm)上で流速２ｍl/分で負荷した。色素にアフィニティーを有さない蛋白質を除去するために、該カラムを３ベッド容積の透析緩衝液で洗浄した。結合蛋白質は、最初は１０ｍＭメチルピペラジン(ＨＣl)緩衝液(ｐＨ５.７５)中の０.２Ｍ ＮａＣｌで３０分間、つづいて同緩衝液中の０.２Ｍ−０.５Ｍ ＮａＣlの線形グラジエントで９０分以内、３ｍl/分の流速にて溶出した(５ｍlフラクション)。
【００５８】
６-ＳＦＴ活性を含有するすべてのフラクションを保存し、透析緩衝液に対して４℃にて一晩透析し、ついで透析バッグをポリエチレングリコール４０,０００でカバーし、４℃にて４時間インキュベートすることによって出発容積の１／３まで濃縮した。
【００５９】
第一アニオン交換クロマトグラフィー工程では、６-ＳＦＴフラクションを濾過し、透析緩衝液で予め平衡化した６ｍl resource Ｑカラム(Ｐharmacia社)上で、３ｍl/分の流速にて負荷した。該カラムを１０ｍＭ メチルピペラジン(ＨＣｌ)緩衝液(ｐＨ５.７５)で洗浄した後に、同緩衝液中の０−０.１５Ｍ ＮａＣｌの線形グラジエントで、１５ｍl／分の流速にて８分間以内、結合蛋白質を溶出した。１ｍlフラクションを採取した。６-ＳＦＴを含有するフラクションを保存し、硫酸アンモニウムを補充して最終濃度を２Ｍとした。
【００６０】
つづいて、６-ＳＦＴ保存液を疎水性相互作用クロマトグラフィーに付した。この目的には、２Ｍ硫酸アンモニウムを入れた５０ｍＭクエン酸-Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液(ｐＨ５.０)で予め平衡化したアルカリ-スパーロース-カラムＨＲ５/５(Ｐharmacia社)上で０.５ｍl/分の流速で、該保存液を負荷した。結合蛋白質は、５０ｍＭクエン酸-Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液(ｐＨ５.０)中の２−０Ｍ硫酸アンモニウムの線形グラジエントで０.５ｍl/分の流速にて６０分以内溶出した。０.５ｍlのフラクションを採取し、６-ＳＦＴ活性を含むフラクションを保存した。
【００６１】
保存フラクションをゲル濾過クロマトグラフィーに付し、その前に、微量濃縮遠心管(Ｃentricon-30，Ａmicon-Ｇrace社，Ｂeverly，ＣＴ)中にて１９０μｌの総容積までまず濃縮した。その濃縮物は、０.２Ｍ ＮａＣlを含有する１００ｍＭクエン酸-Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液で平衡化したＳuperdex 75ＨＲ 10/30ゲル濾過カラム(Ｐharmacia社)上に置き、流速０.４ｍl/分で同緩衝液で溶出した。０.２ｍlフラクションを採取し、６-ＳＦＴ活性を含むフラクションを保存し、１０ｍＭ メチルピペラジン(ＨＣｌ)緩衝液(ｐＨ５.７５)でのＣentricon-30微量遠心管中の５回連続濃縮および希釈工程によって脱塩した。
【００６２】
第二アニオン交換クロマトグラフィー工程には、脱塩試料を６ｍl Ｒesource Ｑカラム(Ｐharmacia社)上に負荷した。条件および緩衝液は、フラクションの大きさを０.５ｍlに減少する以外は、第一アニオン交換クロマトグラフィー工程と同一であった。６-ＳＦＴ活性を含有するフラクションを保存液Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩで合わせた(図５Ａ)。
【００６３】
精製の間で、種々の精製工程の後に、フラクションの酵素活性を測定した。この目的のために、３５０ｇにて５分間遠心することによってＢiogel Ｐ-１０カラム(８×３００ｍｍ)上で５０-１００μｌ部の酵素調製物を案内することによってそれを脱塩した(Ｓimmensら，前掲)。脱塩した酵素調製物は、５０ｍＭクエン酸-Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液(ｐＨ５.７５)中の０.２Ｍスクロースとインキュベートして、精製の間に６-ＳＦＴ活性を含むフラクションを同定した。最終酵素調製物(保存液ＩおよびＩＩＩ)を２５ｍＭメチルピペラジン(ＨＣｌ)緩衝液(ｐＨ５.７５)中の０.１Ｍスクロース単独、または０.１Ｍイソケストースと組み合わせてインキュベートした。特に断らない限り、酵素活性アッセイは、２７℃にて３時間行った。反応は、試料を９５℃にて３分間加熱することによって終止させた。試料を１３,０００×ｇにて５分間遠心し、トレハロース(内部標準)を補充して最終濃度０.１μｇ/μｌとし、分析まで-２０℃にて保存した。
【００６４】
中性炭水化物は、パルス電流滴定検出器に結合したＤionex ＤＸ-３００グラジエントクロマトグラフィー系に付けたＣarboＰac ＰＡ-100カラム(Ｄionex社，Ｓunnyvale，ＵＳＡ)上のアニオン交換クロマトグラフィーによって分析した(Ｓimmenら，前掲)。アニオン交換クロマトグラフィーにより分析する前に、スクロースからグルコースを遊離させる酵素活性を、酵素精製の間に採取したフラクション中で検出した。これには、製造業者の指示書に従って、グルコース試験キット(ＧＯＤ-Ｐerid法、Ｂoehringer ＧmbＨ社，Ｍannheim，Ｇermany)を用いた。
【００６５】
識別できない触媒特性を有する２種の６-ＳＦＴイソ型を精製によって単離した(表Ｉ)。ＨighＴrap blue column上のアフィニティークロマトグラフィー、およびアルカリスーパーロースカラム上の疎水性相互作用クロマトグラフィーによって、インベルターゼ(β-フルクトシダーゼ)活性を６-ＳＦＴからほぼ完全に分離した。このことは、６-ＳＦＴが全くインベルターゼ活性を有しないことを意味する。β-フルクトシダーゼおよびフルクトシルトランスフェラーゼ活性の間のモル比はアフィニティークロマトグラフィー後には係数６付近に低下し、ついで、疎水性相互作用クロマトグラフィーの後には約３の最終比までさらに低下した(表Ｉ)。残っているβ-フルクトシダーゼ活性は、６-ＳＦＴから分離できず、それゆえ、その触媒特性のうちの１つのようである。
【００６６】
Ｓimmenら(前掲)によってすでに示されているごとく、フルクトースをスクロースまたはイソケストースのいずれかに転移する能力は、６-ＳＦＴの特徴付け特性である。第二アニオン交換カラムの後に得た両方の６-ＳＦＴイソ型は、スクロース単独またはスクロースおよびイソケストースとインキュベートした後に形成した産物のＨＰＬＣ-分析によって示されるごとく、同一の触媒特性を有する(図５Ｂ)。基質のみとしてのスクロースの存在下では、主としてケストースが形成されるが、スクロースはグルコースおよびフルクトースに同様にして加水分解される。スクロースおよびイソケストースとインキュベートした後には、主としてビフルクトースが形成され、遥かに少ないスクロースが加水分解される。このことは、イソケストースがスクロースと比較して優先的な受容体であること、およびβ-フルクトシダーゼ活性は６-ＳＦＴの一要素であることを示している。
【００６７】
３．ゲル電気泳動
２種の６-ＳＦＴイソ型の純度を明らかにするために、２つの６-ＳＦＴピークの間にあるＲesource Ｑクロマトグラフィーのフラクション(従って、両方のフラクションを含有する)を保存(図５中の保存液ＩＩ)し、酵素活性アッセイ(図６Ａ)またはＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析(図６Ｂ)のいずれかと合わせた非-変性ＩＥＦゲル-分析によって分析した。
【００６８】
６-ＳＦＴ保存液ＩＩの２次元電気泳動には、製造業者のプロトコールに従って、ＭiniＰroteanＩＩ 2D-cell(Ｂiorad社)を使用する非変性条件下のｐＨ４-８の範囲内の等電点電気泳動に付した。
【００６９】
つづいて、１ｍｍ管状ゲルを５×試料緩衝液中で３０分間培養し、２次元で分離するために７.５-１２％SDS-ポリアクリルアミドゲル上に負荷する(Ｌaemmli，Ｎature 227，680-685，(1970))か、あるいは、０.５Ｍクエン酸-Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液(ｐＨ５.７５)中で１０分間、３回洗浄し、酵素活性アッセイ用に２.５ｍｍ片に切断するかした。その２.５ｍｍゲル片は、０.２Ｍスクロースおよび０.０２％ＮａＮ３を入れた０.４Ｍクエン酸-Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液(ｐＨ５.７５)中、２７℃にて１２時間インキュベートした。１３,０００ｇにて５分間遠心した後、その上清を採取し、９５℃にて３分間加熱し、トレハロース(内部標準、最終濃度０.１μｇ/μｌ)を補充し、さらなる分析用に-２０℃にて保存した。
【００７０】
ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル上で分離した蛋白質は、銀染色によって視覚化した(Ｂlum，1987)。
【００７１】
２種のイソ型は明らかに分離し、その両方は、フルクトシルトランスフェラーゼおよび同様にβ-フルクトシダーゼ活性を有していた。それらのｐＩはわずかしか異ならなく、ｐＨ５.０に近かった。両方の６-ＳＦＴイソ型を変性した後に、各々４９および２３ｋＤａの２種のサブユニットがＳＤＳ-ＰＡＧＥ上に供された。このデータおよびトリプシン消化によって得たパターンのほぼ完全な同一性(データは示さず)は、２種のイソ型が、構造および配列に関して非常に大きな同一性を示すことを示している。ネガティブに負荷した６-ＳＦＴ(両方のイソ型を含有する)は、分子量排除クロマトグラフィーによって測定して約６７ｋＤａの分子量を有していた(データは示さず)。
【００７２】
４．Ｎ-末端アミノ酸配列の決定
Ｎ-末端アミノ酸配列を決定するために、６-ＳＦＴ保存液Ｉおよび保存液ＩＩＩの１００μｇ蛋白質を、グラジエントゲル(７.５-１２％)上に負荷し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分離した(Ｌaemmli，前掲)。該蛋白質は、ＣＡＰＳ緩衝液系(Ｍatsudeira，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.，262，10035-10038(1987))を用いて、ポリビニリデンジフルオリド膜(Ｉmmobilon ＰＶＤＦ transfer membrane，Ｍillipore Ｃorp.社，Ｂedford，ＭＡ)に移した。蛋白質バンドを、１％酢酸中の０.２％Ｐonceau Ｓで膜上に視覚化し、切り出し、トリプシンで消化した。
【００７３】
トリプシン処理ペプチドは、逆相ＨＰＬＣによって分離し、トリプシン処理ペプチドのＮ-末端配列決定は自動エドマン分解によって行った。
【００７４】
４９ｋＤａサブユニットのＮ-末端のペプチド配列を決定し、その大きいおよび小さい、両方のサブユニットをトリプシンで消化して内部ペプチド配列を得た。両方のサブユニットについて、トリプシン処理したペプチドの２種のアミノ酸配列を決定し、ＤＮＡプライマーの設計に用いた(図７)。
【００７５】
５．プローブの設計
３９７ｂｐフラグメントは、ＲＴ-ＰＣＲによって作成した。この目的のため、合成オリゴ-ｄ(Ｔ)プライマー(２３-ｍｅｒ)およびＭ-ＭｕＬ Ｖ逆転写酵素を用いたポリ(Ａ＋)-ＲＮＡの逆転写によって一本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲは、２種の合成、変性プライマー：
(i) CGCCTGCAGGTACCACATGTT(C/T)TA(C/T)CA(A/G)TA(C/T)AA(C/T)CC
(ii) CCACGTCTAGAGCTCTC(A/G)TC(A/G)TACCA(A/C/G)GC(C/G)GTCAT
の間のＰerkin-Ｅlmer社プロトコールに従って行った。
【００７６】
これらのプライマーは、６-ＳＦＴのトリプシン処理後に得た２部のペプチド配列により設計した。得られたＰＣＲ産物は、ｐＣＲ-ＩＩＴＭベクター(ＴＡ-cloning kit，Ｉnvitrogen社)中にクローン化した。該フラグメントのα-３２Ｐ-ｄＡＴＰでの標識は、製造業者の指示書に従って、ランダムプライムド・ラベリングキット(Ｂoehringer ＧmbＨ社，Ｍannheim，Ｇermany)で行った。
【００７７】
６．ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
５の方法に従って作製した３９７ｂｐのフラグメントを第一葉のＲＮＡゲルブロット分析におけるプローブとして用いた。その第一葉では、フルクタンの蓄積が、種々の時間連続して光に連続曝露することによって誘導される。非処理葉の場合にはまったくハイブリダイゼーションシグナルが認められなかったのに対して、葉における６-ＳＦＴ活性が上昇するに対応する様式で、約１８００ｂｐのハイブリダイズバンドが急速に蓄積した(データは示さず)。この結果は、約１８００ｂｐ長のメッセンジャーＲＮＡの存在を指している。
【００７８】
また、ＰＣＲ産物を用いて第一葉のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングした。ここでは、完全長のｃＤＮＡの探索を行った。
【００７９】
ここでは終わりまで、８日-齢の切除第一葉から全ＲＮＡを抽出することによってｃＤＮＡ発現ライブラリーを最初に作製した。この第一葉では、光に４８時間連続して暴露することによってフルクタンの合成を誘導した。該葉を液体窒素で摩砕して微粉末とし、ＲＮＡ抽出緩衝液(１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１Ｍ ＮａＣｌおよび２５ｍＭ ＤＴＴを入れた０.１Ｍ Ｔris(ＨＣｌ)、ｐＨ９)中に懸濁した。まだ凍結した試料は、一様にクリーム様に達するまでさらに摩砕し、ついでその試料をフェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール(２５：２４：１；ｖ：ｖ：ｖ)(ＢrandtおよびＩngversen，Ｃarlsberg Ｒes. Ｃommun.43，451-469，1978)で抽出した。第二ホモゲナイズ工程を削除し、最後のクロロホルム抽出後にＲＮＡを２Ｍ ＬiＣｌで４℃にて一晩沈殿することによって該方法を幾分修飾した。最後のエタノール沈殿後に、ポリ(Ｕ)-Ｓepharoseクロマトグラフィー(ＢrandtおよびＩngversen，前掲)によってポリ(Ａ)＋-ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡ合成に用いた(ＺＡＰ-ｃＤＮＡ合成キット，Ｓtratagene社，ＬaＪolla，ＣＡ，ＵＳＡ)。
【００８０】
そのｃＤＮＡをユニ-ＺＡＰ-ＸＲベクターに連結し、ＥcoＲＩおよびＸhoＩで消化し、ファージ粒子(ＧigapackＩＩＩ Ｐackaging Ｋit,Ｓtratagene社，ＬaＪolla，ＣＡ，ＵＳＡ)中にパッケージングした(７.５×１０７プラーク形成単位／５μｇポリ(Ａ)＋-ＲＮＡ)。
【００８１】
第一ライブラリーは、Ｓtratagene社プロトコールに従って、６０℃にて、α-３２Ｐ-標識した６-ＳＦＴの３９７ｂｐ長のフラグメントでスクリーニングした(前記参照)。もう１回陽性クローンをスクーニングし、Ｅxassist/SOLR-system(Ｓtratagene社，Ｌa Ｊolla，ＣＡ，ＵＳＡ)を用いて、Ｂluescript phagemide陽性クローンから最終的に切断した。両方の鎖のＤＮＡ配列決定は、シークエンシング・プロキット(東洋紡績（株），大阪，日本)を用いた、ジデオキシヌクレオチド鎖停止法によって行った。特に断らない限り、標準的なプロトコールを用いた(Ｓambrookら，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress社，Ｃold Ｓpring Ｈarbor(1989))。配列データ-分析は、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージ,Ｖer.7.2(1992)を用いて行った。
【００８２】
第一スクリーニングの後に、９個の陽性クローンを単離した。さらなるスクリーニングの後でも、７個のクローンが陽性のままであった。これらの配列は、５'末端から、およびＰＣＲ産物に基づいて設計した内部プライマーから部分的に決定した。７個すべてのクローンが同一蛋白質をコードし、そのうちの４個が完全コード配列を含んでいるようであった。完全長の配列の可能性のあるクローンの内の１個の配列は両方の鎖で全体的に決定し、それが４９ｋＤａサブユニットならびに２３ｋＤａサブユニットを含むポリペプチドをコードすることが判明した(図７)。
【００８３】
完全に配列決定したｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列の概略図を図８および９に示す。それは、ヌクレオチド４６で始まり、２個の終始コドンによってヌクレオチド１９２３で終止する１個のオープンリーディングフレームを含む。該オープンリーディングフレームは、６７残基長のリーダー配列を含む６２６アミノ酸のポリペプチド鎖をコードする。
【００８４】
成熟６-ＳＦＴはヌクレオチド２４６で出発し、したがって、６１.３ｋＤａの計算分子量および５.３７の計算ｐＩを有する少なくとも５５９アミノ酸残基を有する。精製蛋白質から得たすべての５個の部分アミノ酸配列が、ｃＤＮＡ由来のアミノ酸配列中に存在する(図８および９)。ｃＤＮＡは、同様に、４５ｂｐの５'-非翻訳配列およびポリ(Ａ)テイルを有する１７１ｂｐの３'非-翻訳配列を含む。６-ＳＦＴ ｃＤＮＡの可能な翻訳開始シグナル(ＡＴＧ)は、ヌクレオチド位置４６ないし４８に位置し、可能なポリアデニル化配列は、ヌクレオチド位置１９７３ないし１９７９に存在する。成熟６-ＳＦＴは、ＣonＡ-Ｓepharose上にアルファ-メチル-マンノシド-可逆性結合を示し、このことは、それが糖蛋白質(データは示さず)であることを示している。同様にして、由来するアミノ酸配列は、６個の可能なグリコシル化位置(Ａsn-Ｘ-Ｓer/Ｔhr)を含む。
【００８５】
精製蛋白質から得たすべてのペプチド配列は、由来するアミノ酸配列となんら誤対合なしであった。精製ＳＦＴの２３ｋＤａサブユニットから得た２種のペプチド配列がｃＤＮＡの３'-末端付近に位置する一方、４９ｋＤａサブユニットから得た配列は５'-末端付近に位置する。
【００８６】
ｃＤＮＡの既知のβ-フルクトシダーゼおよびフルクトシルトランスフェラーゼに対する可能な関連をさらに研究するために、由来するアミノ酸配列を種々の植物、糸状菌類および細菌インベルターゼ、ならびに細菌レバナーゼおよびレバンスクラーゼの配列と比較した(図１０および図１１)。ここに記載するｃＤＮＡは、緑豆(ヤエナリ)(Ａraiら，前掲)、ニンジン(Ｕngerら，前掲)、およびトマト(Ｅlliottら，前掲)の可溶性酸インベルターゼと最も高い相同性を有し、他の生物界からのインベルターゼ、レバナーゼおよびレバンスクラーゼ、すなわち、多種のβ-フルクトシダーゼとも等しく明らかな相同性を有する。アミノ酸配列の比較は、少なくとも５個のよく保存されたドメインを示している。ドメインＩおよびＩＶは、ドメインＩＩ、ＩＩＩおよびVよりもインベルターゼおよびレバンスクラーゼとの間で保存性が低い。これらの酵素では、ドメインＩＩＩは特に非常に保存されている。驚くべきことには、最も制限された相同性は、細菌のレバンスクラーゼとで、すなわち、６-ＳＦＴとして、同様な６-フルクトシル転移反応を触媒するクラスの酵素とである(図１１中の樹系図参照)。
【００８７】
７．ニコチアナ・プラムバギニフォリア(Ｎicotiana plumbaginifolia)プロトプラストにおける６-ＳＦＴの発現
６-ＳＦＴ ｃＤＮＡクローンは、カリフラワー・モザイクウイルス３５Ｓ転写の発現シグナル(Ｎeuhausら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ 88，10362-10366(1991)参照)の調節下のｐＵＣ１１９プラスミドベクター(Ｓambrookら，Ｍolecular Ｃloning,Ａ Ｌaboratory Ｍanual，Ｃold Ｓpring Ｈarbor ＬaboratoryＰress社，Ｃold Ｓpring Ｈarbor，1989)の誘導体にサブ-クローン化した。
【００８８】
ニコチアナ・プラムバギニフォリア(Ｎicotiana plumbaginifolia)のプロトプラストは、Ｇoodallら(Ｍeth.Ｅnzymol.181，148-161(1990))により記載されているごとく大量に単離し形質転換した。要約すると、６-ＳＦＴ ｃＤＮＡを含有するプラスミド１０μｇを１５ｍlの滅菌プラスチック管中の１０μｌ容積のＴＥ緩衝液中に分散した。対照形質転換は、インサートを含まない同プラスミド１０μｇで行った。１×１０６個のプロトプラストを添加して０.５ｍl容積とし、等容積の２０％(ｗ/ｖ)ポリエチレングリコール６０００と注意深く混合した。２-５分後に、Ｋ３培地６.５ｍlを添加し、該プロトプラストを２７℃にて２時間インキュベートした。その後に、それをＷ５オスモチカム(osmoticum)で１：１に希釈し、１０００ｇにて１０分間ペレット化した。全プロトプラスト(ｔ＝０時間の対照としたものを除いて)をＫ３培地２ｍlに再懸濁し、２７℃にてインキュベートした。３、６、９、１８および２７時間後に、試料を産物分析用に採取した。ここで、該プロトプラストを、Ｗ５オスモチカム(osmoticum)２ｍlを添加した後に、１０００ｇにて１０分間ペレット化した。プロトプラストのペレットを０.１Ｍクエン酸-Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液(ｐＨ５.７５)に再懸濁し、滅菌エッペンドルフチューブに移し、液体窒素中で凍結した。脱霜した後に、該試料を激しく撹拌し、細胞残渣を１３,０００ｇにて３分間ペレット化した。上清(５０〜１００μｌ)は、前記のごとく、それをＢiogel Ｐ-１０カラム上に案内することによって脱塩した。脱塩酵素試料は、０.０２％ＮａＮ３を入れた５０ｍＭクエン酸-Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液(ｐＨ５.７５)中の、０.１Ｍスクロース、または０.１Ｍイソケストースと組み合わせた０.１Ｍスクロースと、２７℃にて２０時間インキュベートした。産物分析は、該試料を９５℃にて３分間加熱することによって反応を終結させた後、図５の場合に記載したごとく行った。
【００８９】
約３時間の初期対数増加期の後、プロトプラストの抽出物がスクロースからケストースを形成し、スクロースおよびイソケストースからビフルクトースを形成した。このことにより、該ｃＤＮＡが機能性６-ＳＦＴをコードすることが確認された(図１１)。精製酵素のように、プロトプラスト中に存在する活性は、スクロースからイソケストースの産生よりもだいたい４倍速い速度で、スクロースおよびイソケストースからのビフルコースの生成を触媒した。これらの結果により、ｃＤＮＡが６-ＳＦＴをコードしていることが確認された。
【００９０】
８．植物における６-ＳＦＴ遺伝子の発現
６-ＳＦＴ ｃＤＮＡは、植物-特異的３５Ｓプロモーターとノパリンシンターゼ遺伝子由来の終止シグナルとの間にクローン化した。このキメラ遺伝子構築物(３５Ｓ-６ＳＦＴ-ＮＯＳ)をつづいてバイナリ植物ベクターpＢＩＮ１９(Ｂevan，Ｎucl.Ａcids Ｒes. 12，8711-8721)の誘導体にインサートした。これにより、プラスミドｐＶＤＨ２８０を得た。このプラスミドは、ヘルパープラスミドｐＲＫ-２０１３(Ｌam,Ｐlasmid 13，200-204(1985))を用いた三点交差育種でアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Ａgrobacterium tumefaciens)ＬＢＡ４４０４(Ｈoekemaら，Ｎature 303，179-180(1983))とコンジュゲートした。該構築物は、リーフディスク形質転換法(Ｈorshら，Ｓcience 227，1229-1232(1985))を用いて、ニコチニア・タバカム(Ｎicotinia tabacum) var.Ｓumsun NNに導入した。再生植物を、カナマイシン抵抗性について選抜し、ＭＳ培地(ＭurashigeおよびＳkoog，Ｐhysiol.Ｐlant. 15，473-497(1962))で培養し分析した。
【００９１】
イン・ビトロ(in vitro)非トランスジェニック対照植物ならびにイン・ビトロ(in vitro)トランスジェニック植物１、３、４、５、７、９、１０および１１の葉材料を切り出し、エッペンドルフチューブ中で摩砕した。遠心(１６,０００ｒｐｍにて２分間)後に、ＰＡ-１００カラムおよびパルス電流滴定検出器を付けたＤionex ＤＸ-３００系によって２００μｌを分析し、１００％ＮａＯＨへのＮａＯＨ/ＮａＡｃグラジエントで溶出した。得られたスペクトルを図１９〜２１に示す。
【００９２】
野生型植物(Ｃ１)または無関係構築物で形質転換した植物においては、オリゴ糖は全く認められなかった(図１８〜２０)。形質転換体のスクリーニングによって、これらの方法の使用によって、イヌリンシリーズに基づくＤＰを有するオリゴ糖-蓄積-植物は３〜５および８〜９にあると概算される。発現レベルは、同構築物で形質転換した個々の植物の間で変動した。このことは、植物における形質転換実験においては通常の現象である。発現レベルの変動は、ゲノム中の組込み位置に実質的に依存する(位置効果)。
【００９３】
形質転換体番号４の抽出物に６-ケストース１００ｎｇを添加した後、再度、スペクトルを記録した。図２１は、形質転換体番号４の場合においては、２-６型結合を有するオリゴ糖が形成されていることを示している。なぜならば、６-ケストースなしのスペクトルに比してより高いピークが認められるからである。したがって、恐らく、該ピークは６-ケストースに対応する。
【００９４】
実施例５
キクイモからのフルクタン-フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ
本発明に適用する他の植物フルクトシルトランスフェラーゼは、塩析、レクチン-アフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを用いるＬuescher法によって、キクイモ(Ｈelianthus tuberosus Ｌ.)から精製した(Ｌuescher，Ｍ.ら，Ｎew Ｐhytol.123，717-724(1993))。
【００９５】
精製酵素は、無処理ＩＥＦ-ゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜上にブロットした。該膜をクーマシー・ブルー染色によって染色し、２種の最も重要なＦＦＴイソ型(各々Ｔ１およびＴ２)を切り出した(図１３参照)。
【００９６】
蛋白質Ｔ１およびＴ２の両方をトリプシンで消化し、そのペプチドをＨＰＬＣによって分離した。消化ＦＦＴイソ型のＨＰＬＣ図は、同一パターンを示す(図１４および１５参照)。Ｔ２の４種の精製ペプチド(フラクション１８、２４、２０および２６)のアミノ酸配列を決定した。第一ペプチドの配列は：
ＮＨ２-Ｅ-Ｑ-Ｗ-Ｅ-Ｇ-Ｘ-Ｆ-Ｍ-Ｑ-Ｑ-Ｙ-Ｘ-Ｘ-
第二ペプチドは以下のアミノ酸配列を有していた：
ＮＨ２-Ａ-Ｖ-Ｐ-Ｖ-Ｘ-Ｌ-Ｘ-Ｘ-Ｐ-Ｌ-(Ｆ/Ｌ)-Ｉ-Ｘ-Ｗ-Ｖ-
第三および第四のペプチドは、各々、以下のアミノ酸配列を有していた：
ＮＨ２-Ｗ-Ｔ-Ｐ-Ｄ-Ｎ-Ｐ-Ｅ-Ｌ-Ｄ-Ｖ-Ｇ-Ｉ-Ｇ-Ｌ；
ＮＨ２-Ｖ-Ｄ-Ｈ-Ｖ-Ｉ-Ｖ-Ｙ-Ｇ-Ｆ-Ａ-Ｑ-Ｇ
【００９７】
実施例５と同様の方法でｃＤＮＡを単離し配列を決定した。形質転換した完全ｃＤＮＡ-クローン植物細胞を用いて、トランスジェニック植物を得た。
【００９８】
実施例６
他の植物種での適用性
該技術の一般的な適用性を実証するために、先の実施例に記載した種々の構築物を種々の穀物に導入した。かくして、ジャガイモを、Ｖisser，Ｐlant ＴissueＣulture Ｍanual Ｂ５, １-９, Ｋluwer Ａcademic Ｐublishers社，1991に記載の方法に従って形質転換した。得られたトランスジェニック植物は各々の試験した器官にオリゴ糖を蓄積した。また、同構築物を、Ｄ'Ｈalluinら，Ｂio/Ｔechnology 10，309-314(1994)によって記載されているごとく形質転換したビート(Ｂeta vulugaris Ｌ.)にも導入した。得られたトランスジェニック・ビート植物は、例えば、その葉および根に顕著な量のオリゴ糖を蓄積した。同構築物は、Ｂlockら，Ｐlant Ｐhysiol.91，694-701(1989)に従って形質転換したナタネ(Ｂrassica napus Ｌ.)に導入した。得られたトランスジェニック植物は、例えば、その葉および貯蔵器官に、顕著なレベルのオリゴ糖を蓄積した。もちろん、植物を示した方法で形質転換することは必須でない。当業者の及ぶ範囲の他の方法も用いることができる。
【００９９】
改変し得る他の植物種の例には、限定するものではないが、トウモロコシ(Ｚea mays Ｌ.)、コムギ(Ｔriticum aestivum Ｌ.)、オオムギ(Ｈordeum vulgareＬ.)、コメ(Ｏryza sativa Ｌ.)、ダイズ(Ｇlycin max Ｌ.)、エンドウマメ(Ｐisum sativum Ｌ.)、インゲンマメ(Ｐhaseolus vulgaris Ｌ.)、チコリー(Ｃichorium intybus Ｌ.)、サトウキビ(Ｓaccharum officinarum Ｌ.)、サツマイモ(Ｄioscorea esculenta Ｌ.)、キャッサバ(Ｍanihot esculenta Ｌ.)およびグラス(例えば、(Ｌolium spp.)、(Ｐoa spp.)および(Ｆestuca spp.))が含まれる。
【０１００】
天然または誘導改変炭水化物分離パターンを有する植物は、オリゴ糖-合成遺伝子の導入について好ましい標的植物とし得る。かかる植物には、限定するものではないが、デンプンおよびスクロース代謝における天然の突然変異体、ならびに、例えば、ＳonnewaldおよびＷillmitzer，Ｐlant Ｐhysiology 99，1267-1270(1992)に記載されているごとき、分子および遺伝子技術によってデンプンおよびスクロース代謝を改変した植物が含まれる。
【０１０１】
実施例７
本発明によるオリゴ糖の用途
本発明による方法を用いて産生したオリゴ糖は、種々の製品の砂糖代替物として使用し得る。そのうちの３例を以下に示す。
【０１０２】
１．アイスクリーム
アイスクリームを以下の成分から製造する：
６３５部 水
９０部 バター脂肪
１００部 低-脂肪粉乳
１７０部 本発明によるオリゴ糖
５部 クレモダン(Ｃremodan)ＳＥ３０ＴＭ(Ｇrindsted社)
０.３部 アスパルタームＴＭ
所望により香料
粉乳を水に溶解する。その全体を４０-４５℃に加熱する。残りの乾燥成分を混合し、温牛乳に溶解する。ついで、溶解したバターを添加する。ついで、その全体を７２℃にて１０分間低温殺菌する。その後、その混合物を、１５０/３５ barにて二工程ホモジナイザーでホモジナイズする。かく得た氷混合物を５℃に急速に冷却し、つづいてその全体を５℃にて最低４時間熟成させる。最後に、その氷混合物に空気を混入させ、１００％増量割合まで凍結する。
【０１０３】
-３５℃にて硬化させ、-２０℃にて保存した後に、天然の砂糖(サッカロース、グルコースシロップ)で製造したアイスクリームの有する味覚およびテキスチャーに相当するアイスクリームを得る。
【０１０４】
２．ムースリ・バー
ムースリ・バーは、以下の成分から製造した：
２８部 本発明によるオリゴ糖
６８部 ムースリ・ミックス
４部 カカオ
加熱することによってオリゴ糖からシロップを製造し、そのシロップを他の成分と混合した。バーは、かく得た混合物から、円筒圧縮で形成した。天然砂糖を省略していることに起因して、該バーは従来のバーよりも遥かに低-カロリーである。
【０１０５】
３．ソフトドリンク
ソフトドリンクは以下の成分から製造した：
９０部 水または果汁
８-１０部 本発明によるオリゴ糖
人工甘味料
香料および着色剤
栄養酸
炭酸ガス
すべての成分を水の一部に溶解した。ついで、残りの水を、炭酸ガス-含有水として添加した。ソフトドリンクのエネルギー値は非常に低い。なぜならば、付加天然砂糖を全く添加していないからである。
【０１０６】
【表１】
ａケストース-産生活性として測定
ｂmolフルクトース/mol産生フルクトース
ｃナノカタール＝nmol・s−１
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】図１は、野生型および改変形のストレプトコッカス・ミュータンス(Ｓtreptococcus mutans)のフルクトシルトランスフェラーゼ(ｆｔｆ)のオリゴ糖-産生活性を示し、これは、Ｃarins，Ａ.Ｊ.およびＰollock，Ｃ.Ｊ.，Ｎew Ｐhytol.109，399-405(1988)により記載されているのと同様にして、スクロースと共にインキュベートし、ＴＬＣ上で分析した。コロニーおよび精製蛋白質由来である培養試料は、１％Ｔriton Ｘ-100を入れた５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液中の２００ｍＭスクロースと一緒に３７℃にて一晩インキュベートした。レーン１は、エス・ミュータンス(Ｓ.mutans)培養の反応産物を示し；レーン２は、エス・ミュータンス(Ｓ.mutans)からの精製酵素の活性を示し；レーン３は、プラスミドｐＴＳ１０２を運搬するイー・コリ(Ｅ.coli)株の活性を示し；レーン４は、プラスミドｐＴＤ２を運搬するイー・コリ(Ｅ.coli)株の活性を示し；レーン５は、イー・コリ(Ｅ.coli)プロモーター調節下の成熟エス・ミュータンス(Ｓ.mutans)フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子で形質転換したイー・コリ(Ｅ.coli)細胞の活性を示す。レーンＡで用いたオリゴ糖標準は、アリウム・セパ(Ａllium cepa)球根の抽出物であり、レーンＨで用いたものはキクイモ(Ｈelianthus tuberosus)塊茎の抽出物である。図において、Ｆはフルクトース、Ｇはグルコース、Ｓはスクロース(二糖)、Ｎはネオケストース(Ｆ６-６Ｇ１-２Ｆ、三糖)、Ｉはｌ-ケストース(Ｇ１-２Ｆ１-２Ｆ、三糖)、Ｋはケストース(Ｇ１-２Ｆ６-２Ｆ、三糖)を示す。より長いオリゴ糖(ＤＰ＝４-９)についても同様に示す。
【図２】図２は、エス・ミュータンス(Ｓ.mutans)のフルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を発現するトランスジェニック・タバコ植物(ＫＺ)のＴＬＣ-分析を示す。オリゴ糖がこれらの植物において蓄積している。レーンＨは、対照としての、キクイモ(Ｈelianthus tuberosus)塊茎の抽出物を示す。
【図３】図３は、タマネギ種子からの精製ＳＳＴのＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルを示す。銀染色によって染色したこのゲル上の試料が、単一バンドとして認められる。Ｍは、分子量マーカーを示し、ここにそれらのサイズはキロダルトン(ｋＤ)で示す。
【図４】図４は、スクロースと共にインキュベートしたタマネギ種子からの精製ＳＳＴの反応産物を示す(レーン４および５：ｏ-イン・ビトロ(in vitro))。三糖のみが形成される。レーン１はチューリップ茎(Ｔ)の抽出物を示し、レーン２はキクイモ(Ｈelianthus tuberosus)塊茎(Ｈ)の抽出物を示し、レーン３はアリウム・セパ(Ａllium cepa)球根(白抜き円)の抽出物を示す。Ｍは単糖を、Ｓはスクロース(二糖)を、Ｎはネオケストース(Ｆ２-６Ｇ１-２Ｆ、三糖)を、Ｉはｌ-ケストース(Ｇ１-２Ｆ１-２Ｆ、三糖)を示す。より長いオリゴ糖(ＤＰ４-５)も同様に示す。生成物は、図１記載と同様にしてＴＬＣ上で分析した。
【図５】図５は、精製工程中、Ｒesource Ｑカラム上の第二アニオン交換クロマトグラフィー段階後の、オオムギからのスクロース-フラクタン ６-フルクトシルトランスフェラーゼ(６-ＳＦＴ)の２種のイソ型の分離を示す。図５Ａは、２５ｍＭ メチルピペラジン(ＨＣl)緩衝液(ｐＨ５.７５)中の０.２Ｍスクロースと共にインキュベート後にクロマトグラフィーに付した後に得たフラクションの、蛋白質溶出特性(Ａ２８０)およびフルクトシルトランスフェラーゼ活性を示す。Ｄe クロマトグラム(図５Ｂ)は、ＣarboＰack-PA100カラム上のアニオン交換ＨＰＬＣ分離後に、パルス電流滴定検出(pulsed amperometric detection)によって得た。反応生成物は、スクロース単独、またはスクロースおよびイソケトースと保存液Ｉおよび保存液ＩＩＩとをインキュベートした後に得た。炭水化物は、その保持時間によって同定し、トレハロースを内部標準として用いた。図５Ａ中の白抜き円は、形成されたケストース、ビフルコース、イソケスチンおよびケスチンの合計で指したフルクトシルトランスフェラーゼ活性を表す。図５Ｂにおいて、ｐはイソケストース夾雑物から生じた非-同定産物に相当し、ｃはイソケトース基質の夾雑物に相当する。
【図６】図６Ａは、非-変性条件下の等電点電気泳動後の６-ＳＦＴのフラクションの保存液(保存液ＩＩとして示す；図５参照)の酵素活性のグラフを示す。黒塗り三角は、遊離フルクトースとして測定したβ-フラクトシダーゼ活性を示し、一方、白抜き円は形成したケストースとして測定したフルクトシルトランスフェラーゼ活性を示す。図６Ｂは、第二アニオン交換クロマトグラフィー後の保存液ＩＩの二次元解析後のＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルである。２種の６-ＳＦＴイソ型がここに示されている。双方のイソ型は、各々２３ｋＤａおよび４９ｋＤａの２種のサブユニットよりなることが判明している。図６Ｃは、ＩＦＥ-マーカー フィコシアニン(ｐＩ４.６)、β-ラクトグロブリン(ｐＩ５.１)およびウシ・カルボニックアンヒドラーゼ(ｐＩ６.０)の二次元ゲル電気泳動である。
【図７】図７は、オオムギからの６-ＳＦＴをコードするｃＤＮＡクローンを得るために用いた戦略の模式図である。
【図８】図８は、オオムギからの、オオムギ由来の６-ＳＦＴのｃＤＮＡ-配列およびアミノ酸配列を示す。
【図９】図９は、オオムギからの、オオムギ由来の６-ＳＦＴのｃＤＮＡ-配列およびアミノ酸配列（図８の続き）を示す。
【図１０】図１０は、オオムギ由来の６-ＳＦＴ、インベルターゼ(β-フルクトシダーゼ)、レバナーゼおよびレバンスクラーゼののアミノ酸配列の全体図である。該全体図は、ＧＣＧ sequence analysis software packageのＰileup Ｐrogramで作成した。以下の略語を用いた：Ｈ．ｖ． ６-ＳＦＴ＝オオムギからのスクロース-フルクタン ６-フルクトシルトランスフェラーゼ；Ｖ．ｒ．Ｉｎｖ＝緑豆からの可溶性酸インベルターゼ(ヤエナリ；Ａraiら，Ｐlant Ｃell Ｐhysiol.33，245-252(1992))；Ｄ．ｃ．Ｉｎｖ＝ニンジンの可溶性酸インベルターゼ(Ｕngerら，Ｐlant Ｐhysiol.104，1351-1357(1994))；Ｌ．ｅ．Ｉｎｖ＝トマトの可溶性酸インベルターゼ(Ｅlliottら，Ｐlant Ｍol.Ｂiol.21，515-524(1993))；Ｄ．ｃ．ｃｗ Ｉｎｖ＝ニンジンの細胞壁インベルターゼ(ＳtrumおよびＣrispeels，Ｐlant Ｃell 2，1107-1119(1990))；Ａ．ｓ．Ｉｎｖ＝エンバクの部分インベルターゼ配列(Ｗuら，Ｊ．Ｐlant Ｐhysiol.142，179-183(1993))；Ｅ．ｃ．Ｉｎｖ＝エシェリキア・コリ(Ｅscherichia coli)のインベルターゼ(rafＤ)(Ａslandisら，Ｊ.Ｂacteriol.171，6753-6763(1989))；Ｓ．ｍ．Ｓｃｒｂ＝ストレプトコッカス・ミュータンス(Ｓtreptococcus mutans)(ＳatoおよびＫuramitsu，Ｉnfect.Ｉmmun.56，1956-1960(1989))；Ｂ.ｐ.ＬｅｌＡ＝バシラス・ポリミキサ(Ｂacillus polymyxa)からのレバナーゼ(Ｂezzateら，非公開参考ＥＭＢＯデータベース)；Ｂ．ｓ．ＳａｃＣ＝バシラス・サチリス(Ｂacillus subtilis)のレバナーゼ(Ｍartinら，Ｍol.Ｇen.Ｇenet.208,177-184(1987))；Ｋ．ｍ．Ｉｎｕ＝クルイベロマイセス・マルキシアヌス(Ｋluiveromyces marxianus)のイヌリナーゼ(Ｌalouxら，FELVＬett.289，64-68(1991))；Ｓ．ｃ．Ｉｎｖｌ＝パン酵母のインベルターゼ１(ＨohmannおよびＧozalbo，Ｍol.Ｇen.Ｇenet.211，446-454(1988))；Ｓ．ｏ．ｉｎｖ＝シュバンニオマイセス・オクシデンタリス(Ｓchwanniomycesoccidentalis)のインベルターゼ(Ｋleinら,Ｃurr.Ｇenet.16，145-152(1989))；Ａ．ｎ.Ｉｎｖ＝アスペルギルス・ニガー(Ａspergillus niger)のインベルターゼ(Ｂoddyら，Ｃurr.Ｇenet.24，60-66(1993))；Ｂ.a.ＳacＢ＝バシラス・アミログファシエンス(Ｂacillus amyloguefaciens)のレバンスクラーゼ(Ｔangら，Ｇene 96，89-93(1990))；Ｂ．ｓ．ＳａｃＢ＝バシラス・サチリス(Ｂacillus subtilis)のレバンスクラーゼ(Ｓteinmetzら，Ｍol.Ｇen.Ｇenet.200，220-228(1985))；Ｓ．ｍ．ＳａｃＢ＝ストレプトコッカス・ミュータンス(Ｓtreptococcus mutans)のレバンスクラーゼ(ＳhirozaおよびＫuramitsu，Ｊ.Ｂacteriol.170，810-816(1988))；Ｚ．ｍ．ＬｅｖＵ＝ザイモモナス・モビリス(Ｚymomonas mobilis)のレバンスクラーゼ(Ｓongら，ＥＭＢＯデータベースの非公開参照)
【図１１】図１１は、由来するアミノ酸配列に基づいた、種々のインベルターゼ(β-フラクトシダーゼ)、レバナーゼおよびレバンスクラーゼとオオムギからの６-ＳＦＴとの樹系図である。該樹系図は、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージのＰileupプログラムを用いて、図１０に記載した配列で作成した。
【図１２】図１２は、ニコチアナ・プラムバギニフォリア(Ｎicotiana plumbaginifolia)プロトプラストにおけるオオムギ6-SFTの機能的発現を示す。エラー・バーは平均±標準偏差を示す。６-ＳＦＴｃＤＮＡは、プロトプラスト中で２７時間発現した。試料を膨大な回数採取し、フルクトシルトランスフェラーゼ活性を、スクロース(図１２Ａ)またはスクロースおよびシオケトース(図１２Ｂ)とインキュベートすることによって、プロトプラスト抽出物中で測定した。白抜き円は、６ＳＦＴ遺伝子構築物で形質転換したプロトプラストの抽出物の酵素活性を示す。白抜き四角は、６-ＳＦＴ ｃＤＮＡなしのベクターで形質転換したプロトプラストの抽出物の活性を示す。
【図１３】図１３は、キクイモ(Ｈelianthus tuberosus Ｌ.)からのフラクタン-フラクタン フルクトシルトランスフェラーゼ(ＦＦＴ）の精製酵素抽出物の天然ＩＥＦ-ゲルである。クーマシー・ブルー染色した後に、ＦＦＴの２種の最も重要なイソ型(Ｔ１(ｐＩ４.４５)およびＴ２(ｐＩ４.７５))に加えて、約５.５のｐＩを有するバンドが認められ、これは恐らく、変性ＦＦＴに相当する。
【図１４】図１４は、ＦＦＴイソ型Ｔ１のトリプシン消化物のＨＰＬＣ図である。
【図１５】図１５は、ＦＦＴイソ型Ｔ２のトリプシン消化物のＨＰＬＣ図である。
【図１６】図１６は、その下に示すオープンリーディングフレーム１を有するクローンｐＡＣ２２のＤＮＡ-配列を示す。
【図１７】図１７は、オープンリーディングフレーム２を有するクローンｐＡＣ９２のＤＮＡ-配列を示す。
【図１８】図１８は、ＰＡ-１００カラムおよびパルス電流滴定検出を有するＤionex ＤＸ-３００システムで得、１００％までのＮａＯＨ/ＮａＡｃグラジエントで溶出したトランスジェニックタバコ植物から得た抽出物のスペクトルを示す。トランスジェニック系統の番号は、スペクトル当たりに示す、すなわち１、３、４として示す。Ｃ１は、対照系統である。(Ｇ＝グルコース、Ｓ-スクロース、ＤＰ＝重合度)
【図１９】図１９は、ＰＡ-１００カラムおよびパルス電流滴定検出を有するＤionex ＤＸ-３００システムで得、１００％までのＮａＯＨ/ＮａＡｃグラジエントで溶出したトランスジェニックタバコ植物から得た抽出物のスペクトルを示す。トランスジェニック系統の番号は、スペクトル当たりに示す、すなわち５、７、９、１０として示す。(Ｇ＝グルコース、Ｓ-スクロース、ＤＰ＝重合度)
【図２０】図２０は、ＰＡ-１００カラムおよびパルス電流滴定検出を有するＤionex ＤＸ-３００システムで得、１００％までのＮａＯＨ/ＮａＡｃグラジエントで溶出したトランスジェニックタバコ植物から得た抽出物のスペクトルを示す。トランスジェニック系統の番号は、スペクトル当たりに示す、すなわち１１として示す。系統９のスペクトル(ＮＲ９＋ＳＴ)のスペクトルも、イヌリンシリーズとの組合せで示す(Ｇ＝グルコース、Ｓ-スクロース、ＤＰ＝重合度)。
【図２１】図２１は、対照(Ｃ１)、形質転換体番号４(＃４)(４番形質)、および１００ｎｇの６-ケストースを抽出物に添加した形質転換体(＃４＋６Ｋ)のスペクトルを示す。スペクトル中の「６Ｋ」なる記号は、６-ケストースピークを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴ糖の製法、その方法で産生したオリゴ糖、オリゴ糖を産生し得るトランスジェニック植物および植物細胞、ならびにその方法で得たオリゴ糖の適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
食物産業においては、「ライト」および低カロリーに向けた大きくなりつつあるトレンドが認めることができる。製品中の多すぎる脂肪および/または砂糖の本明細書中における使用は避ける。それにもかかわらず、甘い味覚を有する食物製品を得るために、増加しつつある多種の砂糖代替物(substitute)が販売されてきている。アスパルタームは、その知られている例である。しかしながら、アスパルタームは、官能器刺激特性に乏しい。
【０００３】
もう１つの型の砂糖代替物は、オリゴ糖により形成される。オリゴ糖は、フルクトースおよび/またはグルコースのごとき、２個または３個以上の単糖よりなる分子である。該オリゴ糖中の単糖は、β-(２-１)-またはβ-(２-６)結合のいずれかによって互いに結合している。オリゴ糖中の単糖の数は、ＤＰ-値(「重合度」)によって示される。３のＤＰ-値とは、オリゴ糖が３個の単糖より構成されることを意味する。オリゴフルクトースとは、フルクトース単位より全体的になるオリゴ糖である。また、オリゴ糖が１または２以上のグルコース単位よりなる場合、これらは、フルクトース単位にα(１-２)結合によって結合するであろう。オリゴ糖の組成は、式ＧｍＦｎ,でも示され、ここに、Ｇはグルコース、Ｆはフルクトースを示し、ｍは０または１に等しく、ｎは０よりも大きいか、または０に等しい全体数である。特に適したオリゴ糖は、ｍが１に等しく、ｎが２〜８、好ましくは２または３であるものである。
【０００４】
オリゴ糖は加水分解され難く、例えば、ヒトの胃および小腸では全く加水分解されない。ヒトの消化酵素はオリゴフルクトース分子中のβ(２-１)およびβ(２-６)結合に何ら効果を有していないことが、オリゴフルクトースの知られている事実である。したがって、それは、分解され、体内に吸収されることなく胃および小腸を通過する。しかしながら、オリゴ糖は、大腸の微生物フローラによって代謝されるもの以外は身体に残らない。ここでガスに加えて放出されるのは、揮発性脂肪酸であり、ついで、これは再度、腸フローラのエネルギー源として供される。この現象は、なぜ、オリゴ糖が、身体に吸収されるグルコース、フルクトースおよびスクロースのごとき遊離糖よりもヒトに対して低エネルギー値を有するのかということを説明している。しかしながら、オリゴ糖は、砂糖代替物として供するに十分な甘味力を有しているのである。
【０００５】
さらに、オリゴ糖、特にオリゴフルクトースは、ビフィズス源効果(bifidogeniceffect)を有すること、すなわち、それが消化系のビフィズス菌の増殖を刺激することが知られている。ビフィズス菌は、病原性細菌の進展に対して保護し、それによって健康にプラスの影響を有する。加えて、オリゴ糖は栄養繊維である。
多様な方法で調製した種々のオリゴ糖がちょうど今、すでに販売されてきている。
【０００６】
オリゴ糖は、より長い植物イヌリン鎖の部分酵素的加水分解によって製造し得る。それに関する方法は、例えば、欧州特許出願440.074号に記載されている。
オリゴ糖は、同じく酵素的に合成し得る。この酵素的製造経路用途は、スクロースをオリゴ糖混合物に変換し、異なる微生物から単離された酵素、フルクトシルトランスフェラーゼ(ＪＰ-８０/４０１９３)よりなる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、公知の製造経路は多数の欠点を有している。第一に、双方の公知の製法は比較的高価である。製造混合物中には、２〜約７個の鎖長を有する所望のオリゴ糖に加えて、比較的に多数の遊離糖およびより長い鎖長を有するオリゴ糖も生じる。多くの遊離糖の欠点は、それが、混合物のエネルギー値の増加を生じることである。例えば、遊離糖が１７キロジュール/ｇのエネルギー定数を有するのに対し、純粋なＧＦ２およびＧＦ３は４〜６キロジュール/ｇのエネルギー定数を有する。加えて、遊離糖は歯科う触(虫歯)を引き起こす。
【０００８】
反対に、長過ぎる鎖長を有するオリゴ糖は、甘味能力が低く、このことは、混合物の平均甘味能力の低下を引き起こす。
たとえば、アスパルタームのごときある種の他の甘味料に対して、オリゴ糖は優れた官能器刺激特性を有する。
本発明の目的は、前記した欠点を回避したオリゴ糖の別の製造経路を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この最後に、本発明は、
ａ）スクロースをオリゴ糖に変換する能力を有する酵素をコードする遺伝子を選抜し；
ｂ）該遺伝子を適当な転写-開始シグナルおよび転写-終止シグナルに連結して発現構築物を得；
ｃ）適当な植物細胞を該発現構築物で形質転換し；
ｄ）該形質転換細胞からトランスジェニック細胞を再生し；
ｅ）酵素の発現および活性を許容する条件下にて該トランスジェニック植物を培養し；ついで、
ｆ）該トランスジェニック植物からオリゴ糖を単離する工程
よりなることを特徴とするオリゴ糖の製法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
したがって、本発明は、公知の産業的製法によって調製したオリゴ糖と比較して、より望ましい特性を有するオリゴ糖またはオリゴ糖の混合物をトランスジェニック植物または植物細胞によって製造する方法を提供する。
【００１１】
本発明による方法の特に有利な点は、鎖長分布が狭く、それによって最終産物中に遊離糖が全く、またはほとんど生じないことである。その結果は、低う触性および所望の低エネルギー値である。また、５より大きな鎖長を有するオリゴ糖もほとんど生じない。その利点は、本発明により製造されるオリゴ糖が、より高い特異的な甘味能力を有することである。甘味能力は「平均鎖長」に依存するのが事実である。混合物の平均鎖長が長くなる程、甘味能力は低下してゆく。高い特異的な甘味能力の利点は、余分の甘味料を製品の加工にほとんど添加する必要がないことである。
【００１２】
同様な考察は、溶解性に関してもあてはまる。平均鎖長が増加すると溶解性が低下することも事実である。したがって、本発明による混合物は、酵素的合成または酵素的加水分解によって得た混合物よりもより高い溶解性を有する。加えて、生産コストがかなり低下する。
【００１３】
ビフィズス菌体内では、短鎖が長鎖よりも吸収され得るということが示唆されている。したがって、本発明による方法により製造したオリゴ糖混合物は、より高いビフィズス源効果を有するであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
スクロースをオリゴ糖に変換する能力を有する酵素をコードする遺伝子を選抜するためには、例えば、細菌のような微生物、または植物のような、フルクトシルトランスフェラーゼ活性を含むいずれの可能な生物においても探索することが可能である。スクロースからフルクタンを生成し得るフルクトシルトランスフェラーゼを含む多種の微生物が知られている。これらの酵素は、フルクトース単位を、スクロースからフルクタン受容体分子に移動させる。微生物フルクトシルトランスフェラーゼは、通常、高ＤＰのフルクタンを生成する。かかる多糖類産生用のトランスジェニック植物を製造するための、種々のフルクトシルトランスフェラーゼの用途は、すでに文献に記載されている。かくして、バシラス・サチリス(Ｂacillus subtilis)のＳacＢ-遺伝子を植物に導入することによって、この植物のフルクタンのパターンを改変し得ることは知られている(ＷＯ８９/１２３８６号)。しかしながら、このことは、高分子量多糖類の生成にも関係している。
【００１５】
スクロースを高分子量フルクタンに変換し得るフルクトシルトランスフェラーゼをコードすることが知られているもう１つの遺伝子は、ストレプトコッカス・ミュータンス(Ｓtreptococcus mutans)のｆｔｆ遺伝子である。本発明によれば、驚くべきことには、高分子フルクタンに加えて、このフルクトシルトランスフェラーゼが、三糖類クラス(１-ケストース)の、かなりの量のオリゴ糖を生成することがここに判明した。また、突然変異体は、三糖類のみを蓄積し、多糖類は蓄積しないことも判明している。
【００１６】
さらに知られているのは、同様に、主として三糖類を産生するバシラス・サチリス(Ｂacillus subtilis)のＳac Ｂ遺伝子の突然変異体である。
【００１７】
膨大な種類の他の微生物も、同様にフルクトシルトランスフェラーゼを産生し得る。これらには、限定するものではないが、内生胞子を形成する、桿菌および球菌(例えば、バシラス(Ｂacillus))、グラム-陽性球菌(例えば、ストレプトコッカス(Ｓtreptococcus))、グラム-陰性好気性桿菌および球菌(例えば、シュードモナス(Ｐseudomonas)、ザントモナス(Ｘanthomonas)、アゾトバクター(Ａzotobacter))、グラム-陰性任意嫌気性桿菌(例えば、エルウィニア(Ｅrwinia)、ザイモモナス(Ｚymomonas))、放線菌類(例えば、アクチノマイセス類、ロシア類)ならびに藍細菌(例えば、トリポスリクス・テニス(Ｔolypothrix tenuis))が含まれる。
【００１８】
これらのフルクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、所望により、標的またはランダム突然変異導入技術によって改変して、望ましいオリゴ糖-合成酵素特性を有する酵素を提供することができる。
【００１９】
細菌フルクトシルトランスフェラーゼは、スクロースについては約２０ｍＭの比較的低いＫＭを有する。大部分の植物におけるスクロース濃度はかなり高く、したがって、これらの酵素は植物中でも活性であろう。細菌フルクトシルトランスフェラーゼの重要な特性は、０℃までの低温でのその活性である。植物は、しばしばこれらの温度に接するが、細菌酵素はこれらの条件下でさえもまだ活性であろう。
【００２０】
また、フルクトシルトランスフェラーゼは、植物起源とすることもできる。植物においては、フルクタンの生合成および分解は、限定された数の種でのみ起こる。例は、キク科(Ａsteraceae)、ユリ科(Ｌiliaceae)およびイネ科(Ｐoaceae)ファミリーである。既知の植物フルクトシルトランスフェラーゼから出発して、標的もしくはランダム突然変異導入法によってか、または、すでに天然に発生した突然変異体の選抜によって、本発明に適した遺伝子を単離し、または作製することができる。
【００２１】
非常に適当な植物フルクトシルトランスフェラーゼの例は、種々の植物種に生じ、特に三糖類の合成を触媒するスクロース-スクロース-フルクトシルトランスフェラーゼ(ＳＳＴ)である。
【００２２】
もう１つの例は、オオムギ(Ｈordeum vulgare Ｌ.)からのスクロース-フルクタン-６-フルクトシルトランスフェラーゼ(６-ＳＦＴ)である。本発明の１つの具体例によれば、オリゴ糖産生用の６-ＳＦＴを発現するトランスジェニック植物を提供する。
【００２３】
本発明のもう１つの具体例によれば、キクイモ(Ｈelianthus tuberosus Ｌ.)のフルクタン-フルクタン-フルクトシルトランスフェラーゼ(ＦＦＴ)を含むトランスジェニック植物を提供する。
【００２４】
選抜したフルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を植物内で発現させるためには、プロモーター、エンハンサーなどのごとき転写-開始シグナルを遺伝子付加して、所望の発現構築物を得ることができる。かかる発現プロモーターは、特定の細胞型に特異的とし得、または多様な細胞型で活性とし得る。加えて、発現の時期および部位は、例えば、分化-特異的プロモーターの使用によって決定し得る。植物における遺伝子発現用に一般的に用いられているプロモーターは、３５Ｓ カリフラワー・モザイクウイルス・プロモーター(ＣaＭＶプロモーター)であり、これは、植物の分化ステージに依存して、多種の細胞型で活性である。フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が植物起源である場合、それ自体の調節配列を使用することもできる。
【００２５】
好ましいプロモーターは、標的植物および目的に応じて、強力または弱い、組織-特異的または構成プロモーターとし得る。適当なプロモーターの例は、「シンク(sink)」-特異的パタチン・プロモーターおよびジャガイモの顆粒-結合デンプン・シンターゼ・プロモーター、またはサツマイモのスポラミン プロモーターである。
【００２６】
さらに転写レベルを上昇するために、プロモーターを改変し、またはエンハンサーを重複して含ませることができる。
【００２７】
ｍＲＮＡの転写は、アルファルファ・モザイクウイルス ＲＮＡ４翻訳エンハンサーシグナルのごとき転写エンハンサーを付加することによって改変し得、それは翻訳される５'非-翻訳領域に存在しなければならない。
【００２８】
転写を正確に終止させるために、構築物にターミネーター配列を付加し得る。かかる配列の例は、ノパリン・シンターゼ遺伝子終止配列である。
【００２９】
特別の状況に適した発現シグナルの選択は、もちろん、この目的のために行わなければならないさらなる進歩的な研究を行わなくとも、当業者が到達する範囲内である。
【００３０】
フルクトシルトランスフェラーゼの基質であるスクロースは、多くの異なる部位に存在する炭水化物である。それは細胞質で合成され、また、サイトゾル、液胞および細胞外間隙(アポプラスト)または他の可能な部位でかなりな量発見されている。
【００３１】
植物細胞における生化学プロセスは、同様にして、単一または多数の細胞区画にしばしば限定されるため、新たに導入した遺伝子の産物の蓄積は特異的な区画で起こることが望ましい。この目的のためには、細胞区画に特異的である標的配列は、トランスジェニック植物で発現するフルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のコード部分に近接して発現構築物中に存在させ得る。異なる細胞位置を標的化するための特異的アミノ酸領域は、すでに同定され解析されている。これらのＤＮＡ-配列は、フルクトシルトランスフェラーゼ活性が細胞または植物の所望の区画に指向されるよう、該酵素の遺伝子にリンクさせ得る。
【００３２】
したがって、本発明の好ましい具体例において、発現構築物は、また、フルクトシルトランスフェラーゼ活性を１または２以上の特異的な植物細胞区画に指向させる標的配列よりなる。標的配列の例は、ジャガイモからのパタチンのものか、またはサツマイモからのスポラミンのものの、カルボキシペプチダーゼＹ(ｃｐｙ)遺伝子のシグナル配列および液胞標的配列、あるいは、ＰＲ蛋白質Ｓ-遺伝子(ｐｒ-ｓ)のシグナル配列およびアポプラスト標的配列である。しかしながら、これらのものは例であって、当業者であれば、自身で他の標的配列を選択し得るであろう。
【００３３】
原則として、発現構築物は、液胞、色素体、細胞壁、細胞質ほかのごとき、いずれのランダムな細胞区画においても標的化が起こるように改変し得る。
【００３４】
導入遺伝子発現の位置のみならず時期までも、制御することがしばしば植物に有利となる。例えば、新たに導入した酵素の活性の発現は、通常、植物の特異的な部分、例えば、塊茎、果実または種子のごとき収穫し得る器官に限定することが通常望ましい。さらには、しばしば、特定の分化ステージにおいてこれらの器官で発現を開始させることが望ましい。このことは、たしかに、導入遺伝子の発現が、かかる器官の正常な分化を妨害する場合である。
【００３５】
本発明によるオリゴ糖は、「ライト」バージョンの種々の食物製品中の砂糖、グルコース・シロップおよびイソグルコースの代替物として用いることができる。食物製品の例は、糖菓、ビスケット、ケーキ、デイリー製品、ベビーフーズ、アイスクリームおよび他のデザート、チョコレートほかである。また、ビフィズス菌の刺激も、動物の健康に重要である。したがって、本発明によるオリゴ糖は、例えば、動物飼料としても適用し得る。
【００３６】
さらに、本発明は、以下の例を基礎としてさらに明瞭になるであろう。これは、本発明の説明目的のものであって、いかなる場合においても限定することを意図するものではない。以下に示す添付図面に関する説明は、実施例で行う。
【実施例】
【００３７】
実施例１
遺伝子の選抜
１．天然発生遺伝子
スクロースからのオリゴ糖のその産生能につき、多数の微生物をスクリーニングした。この目的のため、微生物培養は、液体栄養中で一晩増殖させた。オリゴ糖-産生活性は、培養試料を、０.１％Ｔriton Ｘ-１００存在下、２００ｍＭスクロースと共にインキュベートすることによって測定した。反応産物は、ＴＬＣによって分離し、フルクトース特異的試薬を用いて視覚化した(Ｃairns，Ａ.Ｊ.およびＰollock，Ｃ.Ｋ.,Ｎew Ｐhytol.109，399-405(1988))。ストレプトコッカス・ミュータンス(Ｓtreptococcus mutans)がオリゴ糖の有効な産生菌であることがこのスクリーニングの結果として判明した(図１参照)。オリゴ糖-産生酵素活性は、ＤＥＡＥ-イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーによってストレプトコッカス・ミュータンス(Ｓtreptococcus mutans)培養物から精製した。それから、ＳhirozaおよびＫuramitsu(Ｊ.Ｂacteriol.170，810-816(1988))によって記載されているｆｔｆ遺伝子の産物によって酵素活性が誘導されることが判明した。
【００３８】
つづいて、プラスミドｐＴＳ１０２(ＳhirozaおよびＫuramitsu，前掲)からのフルクトシルトランスフェラーゼ(ｆｔｆ)遺伝子を、ｐＥＭＢＬ９(Ｄenteら，Ｎucl.Ａcids Ｒes.11,1645-1655(1983))のマルチクローニングサイトにＥcoRV-ＢglＩＩフラグメントとしてクローン化し、このプラスミド中に存在するｌａｃＺプロモーターから発現させた。ついで、イー・コリ(Ｅ.coli)をそれで形質転換した。それによって細菌は、オリゴ糖を産生し得るようになった。
【００３９】
オリゴ糖の産生は、前記したスクリーニング法によって証明した。非-形質転換イー・コリ(Ｅ.coli)は、スクロースからオリゴ糖を何ら産生しない。
【００４０】
２．突然変異導入遺伝子
突然変異導入によって、必要により、それを酵素のオリゴ糖-産生活性に適用することが可能である。遺伝子中の突然変異は、例えば、以下の方法でなし得る。
【００４１】
ストレプトコッカス・ミュータンス(Ｓtreptococcus mutans)のｆｔｆ遺伝子の突然変異導入には、ゲノム組込み系(Ｖan Ｄer Ｐlasら，Ｇene 95，39-48(1990))によって、プラスミドｐＴＳ１０２をシネココッカス種(Ｓynechococcussp.)PCC 7942(R2-PIM9)のゲノムに組込み、株Ｒ２-ＰＴＳを得た。この藍細菌Ｒ２-ＰＴＳ株はフルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を発現する。Ｒ２-ＰＴＳ株は、ペリプラズム中のポリマー蓄積に起因するスクロース-感受性である。Ｒ２-ＰＴＳ培養物を、点突然変異(Ｔ→ＣおよびＧ→Ａ突然変異)を誘導するＮ-メチル-Ｎ'-ニトロ-Ｎ-ニトロソグアニジン(ＭＮＮＧ)で突然変異誘導した。変化したフルクトシルトランスフェラーゼ活性を有する突然変異体を選抜した。ＭＮＮＧによって突然変異導入した培養物を、スクロース含有培地上に平板し、合計４００個のスクロース-抵抗性のコロニーを、変化したフルクトシルトランスフェラーゼ活性について試験した。
【００４２】
これらのコロニーに由来したのはＲ２-ＰＴＳ培養物で、これを遠心によって濃縮した。かくして、得られたペレットを、１％Ｔriton X-100、２００ｍＭスクロースを入れた５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中に再懸濁し、３７℃にて一晩インキュベートした。その反応産物は、ＴＬＣ-分析によって分析した(ＣairnsおよびＰollock、前掲)。ＴＬＣは、８５：１５ アセトン：水で３回展開し、つづいてＷiseら，Ａnalytical Ｃhemistry 27,33-36(1955)によって記載されているのと同様に噴霧尿素で処理した。この方法は、フルクトースおよびフルクトース-含有ポリマーを優先的に染色する。
【００４３】
実質的に三糖類を産生する突然変異株の内から、前記方法で突然変異ｆｔｆ遺伝子の酵素的オリゴ糖-形成活性のイン・ビトロ(in vitro)証明用に１つを選択した。
【００４４】
本発明によれば、他の突然変異導入法(部位-特異的またはランダム)、および他の生物からのフルクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を同様に用いて、突然変異オリゴ糖-産生蛋白質の遺伝子を選抜することができる。
【００４５】
実施例２
植物におけるｆｔｆ遺伝子の発現
Ａ．植物形質転換ベクターにおける３５Ｓ-ｆｔｆ-ＮＯＳの構築
ｍＲＮＡの翻訳を刺激する二重エンハンサーおよび配列を有する植物-特異的３５Ｓプロモーターを含むプラスミドｐＭＯＧ１８は、Ｓymonsら(Ｂio/Ｔechnology 8，217-221(1990))によって記載されている。それは、３５Ｓ-プロモーター-ｕｉｄＡ-遺伝子-ＮＯＳ-ターミネーター構築物を含む。ＢamＨＩでの消化によって内部ＢamＨＩ-サイトを除去し、クレノー酵素で粘着末端を埋め、再度連結した、Ｓtratagene社(Ｓan Ｄiego,ＣＡ,Ｕ.Ｓ.Ａ.)からのｐＢluescriptＩＩＳＫ-プラスミドをさらなるクローニングに用いた。３５Ｓ-ｕｉｄＡ-ＮＯＳ-フラグメントをｐＭＯＧ１８のＥcoＲＩおよびＨindＩＩＩでの消化によって得、このＢamＨＩ-ｐＢluescriptを対応するＥcoＲＩ/ＨindＩＩＩサイトにクローン化し、プラスミドｐＰＡ２を得た。プラスミドｐＰＡ２をＮcoＩおよびＢamＨＩで消化し、ベクター含有フラグメントを単離した。
【００４６】
フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子ｆｔｆは、pＥＭＢＬ９のマルチクローニングサイト中のＥcoＲＶ/ＢglＩＩフラグメントとして、プラスミドｐＴＳ１０２からクローン化した(前記参照)。和合性ＳmaＩおよびＢamＨＩ部位をこの目的に用いた。これにより、プラスミドｐＴＡ１２を得た。
【００４７】
ｆｔｆ遺伝子の成熟プロセシングサイト(ヌクレオチド位置７８３)(Ｊ.Ｂacteriol.170，810-816(1988))に近接したＮcoＩ部位を得るために、以下のオリゴヌクレオチド：5'-GGCTCTCTTCTGTTCCATGGCAGATGAAGC-3'
で部位特異的-突然変異をＫramerら(Ｎucl.Ａcids Ｒes.12，9441-9456(1984))により記載されているごとく行った。これから、プラスミドｐＴＤ２を得た。成熟プロセシングサイトに対してアミノ酸位置＋１(ヌクレオチド位置７８３)のグルタミンが、これによってメチオニンに変化した。成熟フルクトシルトランスフェラーゼをコードする配列がその中に存在するＮcoＩ/ＰstＩフラグメントをさらなるクローニングに用いた。このプラスミドから、ＮcoＩ/ＰstＩフラグメントとしてｆｔｆ遺伝子を単離し、このフラグメントを前記のｐＰＡ２ベクター-含有フラグメントに連結した。これによりプラスミドｐＴＸを得た。ｐＴＸは、その中でｆｔｆがシグナル配列領域を有さない成熟フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子をその中に示す３５Ｓ-ｆｔｆ-ＮＯＳ-フラグメントを含む。ｐＴＸをＸbaＩおよびＨindＩＩＩで消化し、完全構築物(３５Ｓ-ｆｔｆ-ＮＯＳ)を含有するフラグメントを、バイナリ植物ベクターｐＢＩＮ１９(Ｂevan，Ｎucl.Ａcids Ｒes.,12，8711-8721)の誘導体であるｐＭＯＧ２３(Ｓymonsら，前掲)のＸbaＩ/ＨindＩＩＩ制限サイトにクローン化した。これからプラスミドｐＴＺを得た。
【００４８】
Ｂ．成熟ｆｔｆ遺伝子を発現するトランスジェニック植物の作成および解析
ｐＴＺ-プラスミドは、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３(Ｌam，Ｐlasmid 13，200-204(1985))の使用する３点交雑育種で、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Ａgrobacterium tumefaciens)LB4404(Ｈoekemaら，Ｎature 303，179-180(1983))にコンジュゲートした。リーフディスク形質転換法(Ｈorschら，Ｓcience 227，1229-1232(1985))を用いて、その構築物をニコチアナ・タバカム(Ｎicotiana tabacum) var.Ｐetit Ｈavanna(ＳＲ１)に導入した。再生植物はＫＰ-植物と呼称し、カナマイシン抵抗性につき選抜し、ＭＳ培地(ＭurashigeおよびＳkoog，Ｐhysiol.Ｐlant.15，473-497(1962))で培養した。その後に、植物を温室中の土壌で生育させ分析した。
【００４９】
葉材料を切除し、エッペンドルフチューブ中で摩砕した。遠心(１６,０００ｒｐｍにて２分間)後に、上清１μｌを、実施例１記載と同様にＴＬＣ上で分析した。オリゴ糖は、野生型植物または無-関係構築物で形質転換した植物では全く認められなかった。形質転換体のスクリーニングにより、この方法を用いてオリゴ糖-蓄積植物が実証された(図２参照)。発現レベルは、同構築物で形質転換した個々の植物間で変動した。このことは、植物における形質転換実験では通常の現象である。発現レベルの変動は、ゲノム中の組込み位置に実質的に依存する(位置効果)。
【００５０】
実施例３
タマネギからのオリゴ糖-産生酵素(ＳＳＴ)
微生物由来の前記で用いたフルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子に加えて、かかる酵素を植物によっても産生する。この例においては、タマネギ種子由来のＳＳＴ遺伝子を用いる。
【００５１】
タマネギ種子からのＳＳＴ蛋白質は、以下のプロトコールを用いたクロマトグラフィー法によって精製した。種子を湿布間にて、２２℃にて２〜３日間インキュベートし、ｐＨ５.７の５０ｍＭリン酸-クエン酸緩衝液中でホモジナイズした。デンプンおよび残渣は、約１０,０００ｇにて１０分間遠心することによって除去した。硫酸アンモニウムを２０％まで上清に添加し、沈殿を遠心によって採取した。上清中の硫酸アンモニウムの濃度を８０％まで上昇させ、沈殿を採取し、２０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４.６中に溶解した。その溶液を、３回緩衝液(２０ｍＭＮａＡｃ)を交換しつつ一晩透析し、その溶液を遠心によって清澄化した。上清をＦＰＬＣ monoＳ-カラム上に置き、０-０.５Ｍ ＮａＣlグラジエントを有する２０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４.６で溶出した。１０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５.６に対して一晩透析した後に、該溶液を、１０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５.６で平衡化したラフィノース-エポキシ・セファロースカラム(Ｐharmacia社)上に置いた。溶出は、１０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５.６(緩衝液Ａ)および１０ｍＭリン酸-クエン酸緩衝液、ｐＨ７.０＋０.５Ｍ ＮａＣl-緩衝液(緩衝液Ｂ)よりなる線形グラジエントで行った。活性フラクションは、２０ｍＭリン酸-クエン酸緩衝液、ｐＨ７.０に対して一晩透析し、２０ｍＭリン酸-クエン酸緩衝液、ｐＨ７.０中のmonoＱ ＦＰＬＣ-カラム上に置いた。そのカラムを０-０.５Ｍ ＮａＣｌのグラジエントで溶出した。最終精製のために、該蛋白質をＳepharose ６-カラム上に置き、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６.５、１％Ｔriton Ｘ-100で溶出した。タマネギ種子からの精製ＳＳＴのＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルの銀染色により、約６８,０００ｄの分子量を有する１のみのバンドが現れた(図３参照)。
【００５２】
この精製ＳＳＴをスクロースとインキュベートした場合、１-ケストースのみが産生された。顕著なインベルターゼ活性は何ら認められなかった(図４参照)。
精製蛋白質のアミノ酸配列は、徐々に消化することによって得たペプチドに基づいて決定した。６-ＳＦＴ遺伝子(実施例４参照)を用いて、２種のｃＤＮＡクローン、ｐＡＣ２２およびｐＡＣ９２を種子-産生タマネギ花からのｍＲＮＡのｃＤＮＡ-バンクから単離した。ｐＡＣ２２およびｐＡＣ９２のインサート配列はＡpplied Ｂiosystems Ｉnc.社からの自動シークエンサーで決定し、そのヌクレオチドおよび由来するアミノ酸配列を図１６および１７に示す。
【００５３】
ｐＡＣ２２およびｐＡＣ９２によりコードされる蛋白質の活性を決定するために、該インサートをその全体で、ＮcoＩおよびＢamＨＩでベクターを消化することによってエシェリキア・コリ(Ｅscherichia coli)uidＡコード配列を除去したｐＭＯＧ１８(Ｓijmonsら，Ｂio/Ｔechnology 8，217-221，1990)にクローン化した。ｐＡＣ２２およびｐＡＣ９２のＳmaＩ-ＸhoＩインサートをｐＭＯＧ１８中にクローン化し得る前に、ＮcoＩ５'粘着末端をＥxonucleaseＩＩＩで除去し、かくして平滑-末端を作製し、両方のＢamＨＩおよびＮcoＩ制限サイトを部分的にＫlenowポリメラーゼで埋め、それによって和合性連結サイトを作製した。かく得られた３５Ｓ-ＡＣ２２および３５Ｓ-ＡＣ９２プラスミドで、タバコプロトプラストを形質転換した(Ｇoodallら，Ｍeth.of Ｅnzymology 181，148-151，1990)。２５℃にてインキュベート２０時間後に、該プロトプラストをペレット化し、５０ｍＭ ＮａＰＯ４クエン酸緩衝液、ｐＨ５.７中に再懸濁した。液体窒素中で凍結することによって該プロトプラストを溶解した。激しく撹拌し、遠心した後に上清を１０ｍＭスクロースおよび１μｌ １４Ｃ-スクロース(Ａmersham社)と２５℃にて２０時間インキュベートした。試料を９５℃にて３分間加熱することによって反応を停止させた。試料当たり２μｌをＴＬＣプレート(Ｓchleider and Ｓchull社)上に負荷し、該ＴＬＣプレートを９０：１０アセトン：水中で３回展開し(ＣairnsおよびＰollock，Ｎew Ｐhytol．109，399-405，1988)、尿素噴霧で染色した(Ｗiseら，Ａnal.Ｂiochem.27，33-36，1955)。このようにして、オートラジオグラフィー(ハイパーフィルム-ＭＰ,Ａmersham社)後に、構築物３５Ｓ-ＡＣ２２および３５Ｓ-ＡＣ９２についてフルクトシルトランスフェラーゼ活性を証明し得た。
【００５４】
実施例４
オオムギからのスクロース-フルクタン ６-フルクトシルトランスフェラーゼ(６-ＳＦＴ)
１．導入部
スクロース-フルクタン ６-フルクトシルトランスフェラーゼ(６-ＳＦＴ)は、グラス(grass)に典型的な分岐フルクタン(グラミナンとも呼称される)生合成の鍵酵素である。該酵素は、スクロースからケストースを形成し、スクロースおよびイソケストースからビフルコースを形成する。この例においては、オオムギ(Ｈordeum vulgare Ｌ.)からの６-ＳＦＴの精製を記載する。加えて、完全ｃＤＮＡのクローニングおよび機能の立体配置についても記載する。
【００５５】
２．スクロース-フルクタン ６-フルクトシルトランスフェラーゼの精製
８〜１０日齢のオオムギ(Ｈordeum vulgare Ｌ.cv Ｅxpress)植物の第一葉を切除し、Ｓimmenら，Ｐlant Ｐhysiol.101，459-468(1993)によって記載されているのと同様にして、連続して４８時間光に暴露してフルクタンおよび該フルクタン生合成の酵素の蓄積を誘導した。つづいて、該葉を液体窒素中で凍結し、それを用いるまで-７０℃にて保存した。
【００５６】
酵素調製物は、誘導第一葉(７００ｇ新鮮重)を液体窒素中で微粉末に摩砕し、つづいてそれを抽出緩衝液(ＨＣlでｐＨ５.７５に調整した、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ベンズアミジン、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１ｍＭＰＭＳＦおよび０.５％ＰＶＰを含有する２５ｍＭ メチルピペラジン)中に懸濁することによって調製した。そのｇ新鮮重当たり２ｍlを用いた。除霜後に、該抽出物を４℃にて維持し、撹拌しつつ０.１Ｍ ＨＣlを滴下することによってｐＨ４.７５に調整した。３時間後に、その抽出物を１７,０００×ｇにて３０分間遠心した。得られた上清を、透析緩衝液(１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ベンズアミジン、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１ｍＭ ＰＭＳＦを含有する１０ｍＭ メチルピペラジン(ＨＣl)緩衝液(ｐＨ５.７５))に対して４℃にて一晩透析した。
【００５７】
その酵素溶液をＢlue Ｓepharose上のアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。この目的に、酵素溶液を０.４５μｍ Ｍilliporeフィルターを通して濾過し、前記透析緩衝液で予め平衡化したＢlue Ｓepharose-6-fast flow(Ｐharmacia社，Ｕppsala，Ｓweden)のカラム(26×120mm)上で流速２ｍl/分で負荷した。色素にアフィニティーを有さない蛋白質を除去するために、該カラムを３ベッド容積の透析緩衝液で洗浄した。結合蛋白質は、最初は１０ｍＭメチルピペラジン(ＨＣl)緩衝液(ｐＨ５.７５)中の０.２Ｍ ＮａＣｌで３０分間、つづいて同緩衝液中の０.２Ｍ−０.５Ｍ ＮａＣlの線形グラジエントで９０分以内、３ｍl/分の流速にて溶出した(５ｍlフラクション)。
【００５８】
６-ＳＦＴ活性を含有するすべてのフラクションを保存し、透析緩衝液に対して４℃にて一晩透析し、ついで透析バッグをポリエチレングリコール４０,０００でカバーし、４℃にて４時間インキュベートすることによって出発容積の１／３まで濃縮した。
【００５９】
第一アニオン交換クロマトグラフィー工程では、６-ＳＦＴフラクションを濾過し、透析緩衝液で予め平衡化した６ｍl resource Ｑカラム(Ｐharmacia社)上で、３ｍl/分の流速にて負荷した。該カラムを１０ｍＭ メチルピペラジン(ＨＣｌ)緩衝液(ｐＨ５.７５)で洗浄した後に、同緩衝液中の０−０.１５Ｍ ＮａＣｌの線形グラジエントで、１５ｍl／分の流速にて８分間以内、結合蛋白質を溶出した。１ｍlフラクションを採取した。６-ＳＦＴを含有するフラクションを保存し、硫酸アンモニウムを補充して最終濃度を２Ｍとした。
【００６０】
つづいて、６-ＳＦＴ保存液を疎水性相互作用クロマトグラフィーに付した。この目的には、２Ｍ硫酸アンモニウムを入れた５０ｍＭクエン酸-Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液(ｐＨ５.０)で予め平衡化したアルカリ-スパーロース-カラムＨＲ５/５(Ｐharmacia社)上で０.５ｍl/分の流速で、該保存液を負荷した。結合蛋白質は、５０ｍＭクエン酸-Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液(ｐＨ５.０)中の２−０Ｍ硫酸アンモニウムの線形グラジエントで０.５ｍl/分の流速にて６０分以内溶出した。０.５ｍlのフラクションを採取し、６-ＳＦＴ活性を含むフラクションを保存した。
【００６１】
保存フラクションをゲル濾過クロマトグラフィーに付し、その前に、微量濃縮遠心管(Ｃentricon-30，Ａmicon-Ｇrace社，Ｂeverly，ＣＴ)中にて１９０μｌの総容積までまず濃縮した。その濃縮物は、０.２Ｍ ＮａＣlを含有する１００ｍＭクエン酸-Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液で平衡化したＳuperdex 75ＨＲ 10/30ゲル濾過カラム(Ｐharmacia社)上に置き、流速０.４ｍl/分で同緩衝液で溶出した。０.２ｍlフラクションを採取し、６-ＳＦＴ活性を含むフラクションを保存し、１０ｍＭ メチルピペラジン(ＨＣｌ)緩衝液(ｐＨ５.７５)でのＣentricon-30微量遠心管中の５回連続濃縮および希釈工程によって脱塩した。
【００６２】
第二アニオン交換クロマトグラフィー工程には、脱塩試料を６ｍl Ｒesource Ｑカラム(Ｐharmacia社)上に負荷した。条件および緩衝液は、フラクションの大きさを０.５ｍlに減少する以外は、第一アニオン交換クロマトグラフィー工程と同一であった。６-ＳＦＴ活性を含有するフラクションを保存液Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩで合わせた(図５Ａ)。
【００６３】
精製の間で、種々の精製工程の後に、フラクションの酵素活性を測定した。この目的のために、３５０ｇにて５分間遠心することによってＢiogel Ｐ-１０カラム(８×３００ｍｍ)上で５０-１００μｌ部の酵素調製物を案内することによってそれを脱塩した(Ｓimmensら，前掲)。脱塩した酵素調製物は、５０ｍＭクエン酸-Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液(ｐＨ５.７５)中の０.２Ｍスクロースとインキュベートして、精製の間に６-ＳＦＴ活性を含むフラクションを同定した。最終酵素調製物(保存液ＩおよびＩＩＩ)を２５ｍＭメチルピペラジン(ＨＣｌ)緩衝液(ｐＨ５.７５)中の０.１Ｍスクロース単独、または０.１Ｍイソケストースと組み合わせてインキュベートした。特に断らない限り、酵素活性アッセイは、２７℃にて３時間行った。反応は、試料を９５℃にて３分間加熱することによって終止させた。試料を１３,０００×ｇにて５分間遠心し、トレハロース(内部標準)を補充して最終濃度０.１μｇ/μｌとし、分析まで-２０℃にて保存した。
【００６４】
中性炭水化物は、パルス電流滴定検出器に結合したＤionex ＤＸ-３００グラジエントクロマトグラフィー系に付けたＣarboＰac ＰＡ-100カラム(Ｄionex社，Ｓunnyvale，ＵＳＡ)上のアニオン交換クロマトグラフィーによって分析した(Ｓimmenら，前掲)。アニオン交換クロマトグラフィーにより分析する前に、スクロースからグルコースを遊離させる酵素活性を、酵素精製の間に採取したフラクション中で検出した。これには、製造業者の指示書に従って、グルコース試験キット(ＧＯＤ-Ｐerid法、Ｂoehringer ＧmbＨ社，Ｍannheim，Ｇermany)を用いた。
【００６５】
識別できない触媒特性を有する２種の６-ＳＦＴイソ型を精製によって単離した(表Ｉ)。ＨighＴrap blue column上のアフィニティークロマトグラフィー、およびアルカリスーパーロースカラム上の疎水性相互作用クロマトグラフィーによって、インベルターゼ(β-フルクトシダーゼ)活性を６-ＳＦＴからほぼ完全に分離した。このことは、６-ＳＦＴが全くインベルターゼ活性を有しないことを意味する。β-フルクトシダーゼおよびフルクトシルトランスフェラーゼ活性の間のモル比はアフィニティークロマトグラフィー後には係数６付近に低下し、ついで、疎水性相互作用クロマトグラフィーの後には約３の最終比までさらに低下した(表Ｉ)。残っているβ-フルクトシダーゼ活性は、６-ＳＦＴから分離できず、それゆえ、その触媒特性のうちの１つのようである。
【００６６】
Ｓimmenら(前掲)によってすでに示されているごとく、フルクトースをスクロースまたはイソケストースのいずれかに転移する能力は、６-ＳＦＴの特徴付け特性である。第二アニオン交換カラムの後に得た両方の６-ＳＦＴイソ型は、スクロース単独またはスクロースおよびイソケストースとインキュベートした後に形成した産物のＨＰＬＣ-分析によって示されるごとく、同一の触媒特性を有する(図５Ｂ)。基質のみとしてのスクロースの存在下では、主としてケストースが形成されるが、スクロースはグルコースおよびフルクトースに同様にして加水分解される。スクロースおよびイソケストースとインキュベートした後には、主としてビフルクトースが形成され、遥かに少ないスクロースが加水分解される。このことは、イソケストースがスクロースと比較して優先的な受容体であること、およびβ-フルクトシダーゼ活性は６-ＳＦＴの一要素であることを示している。
【００６７】
３．ゲル電気泳動
２種の６-ＳＦＴイソ型の純度を明らかにするために、２つの６-ＳＦＴピークの間にあるＲesource Ｑクロマトグラフィーのフラクション(従って、両方のフラクションを含有する)を保存(図５中の保存液ＩＩ)し、酵素活性アッセイ(図６Ａ)またはＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析(図６Ｂ)のいずれかと合わせた非-変性ＩＥＦゲル-分析によって分析した。
【００６８】
６-ＳＦＴ保存液ＩＩの２次元電気泳動には、製造業者のプロトコールに従って、ＭiniＰroteanＩＩ 2D-cell(Ｂiorad社)を使用する非変性条件下のｐＨ４-８の範囲内の等電点電気泳動に付した。
【００６９】
つづいて、１ｍｍ管状ゲルを５×試料緩衝液中で３０分間培養し、２次元で分離するために７.５-１２％SDS-ポリアクリルアミドゲル上に負荷する(Ｌaemmli，Ｎature 227，680-685，(1970))か、あるいは、０.５Ｍクエン酸-Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液(ｐＨ５.７５)中で１０分間、３回洗浄し、酵素活性アッセイ用に２.５ｍｍ片に切断するかした。その２.５ｍｍゲル片は、０.２Ｍスクロースおよび０.０２％ＮａＮ３を入れた０.４Ｍクエン酸-Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液(ｐＨ５.７５)中、２７℃にて１２時間インキュベートした。１３,０００ｇにて５分間遠心した後、その上清を採取し、９５℃にて３分間加熱し、トレハロース(内部標準、最終濃度０.１μｇ/μｌ)を補充し、さらなる分析用に-２０℃にて保存した。
【００７０】
ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル上で分離した蛋白質は、銀染色によって視覚化した(Ｂlum，1987)。
【００７１】
２種のイソ型は明らかに分離し、その両方は、フルクトシルトランスフェラーゼおよび同様にβ-フルクトシダーゼ活性を有していた。それらのｐＩはわずかしか異ならなく、ｐＨ５.０に近かった。両方の６-ＳＦＴイソ型を変性した後に、各々４９および２３ｋＤａの２種のサブユニットがＳＤＳ-ＰＡＧＥ上に供された。このデータおよびトリプシン消化によって得たパターンのほぼ完全な同一性(データは示さず)は、２種のイソ型が、構造および配列に関して非常に大きな同一性を示すことを示している。ネガティブに負荷した６-ＳＦＴ(両方のイソ型を含有する)は、分子量排除クロマトグラフィーによって測定して約６７ｋＤａの分子量を有していた(データは示さず)。
【００７２】
４．Ｎ-末端アミノ酸配列の決定
Ｎ-末端アミノ酸配列を決定するために、６-ＳＦＴ保存液Ｉおよび保存液ＩＩＩの１００μｇ蛋白質を、グラジエントゲル(７.５-１２％)上に負荷し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分離した(Ｌaemmli，前掲)。該蛋白質は、ＣＡＰＳ緩衝液系(Ｍatsudeira，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.，262，10035-10038(1987))を用いて、ポリビニリデンジフルオリド膜(Ｉmmobilon ＰＶＤＦ transfer membrane，Ｍillipore Ｃorp.社，Ｂedford，ＭＡ)に移した。蛋白質バンドを、１％酢酸中の０.２％Ｐonceau Ｓで膜上に視覚化し、切り出し、トリプシンで消化した。
【００７３】
トリプシン処理ペプチドは、逆相ＨＰＬＣによって分離し、トリプシン処理ペプチドのＮ-末端配列決定は自動エドマン分解によって行った。
【００７４】
４９ｋＤａサブユニットのＮ-末端のペプチド配列を決定し、その大きいおよび小さい、両方のサブユニットをトリプシンで消化して内部ペプチド配列を得た。両方のサブユニットについて、トリプシン処理したペプチドの２種のアミノ酸配列を決定し、ＤＮＡプライマーの設計に用いた(図７)。
【００７５】
５．プローブの設計
３９７ｂｐフラグメントは、ＲＴ-ＰＣＲによって作成した。この目的のため、合成オリゴ-ｄ(Ｔ)プライマー(２３-ｍｅｒ)およびＭ-ＭｕＬ Ｖ逆転写酵素を用いたポリ(Ａ＋)-ＲＮＡの逆転写によって一本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲは、２種の合成、変性プライマー：
(i) CGCCTGCAGGTACCACATGTT(C/T)TA(C/T)CA(A/G)TA(C/T)AA(C/T)CC
(ii) CCACGTCTAGAGCTCTC(A/G)TC(A/G)TACCA(A/C/G)GC(C/G)GTCAT
の間のＰerkin-Ｅlmer社プロトコールに従って行った。
【００７６】
これらのプライマーは、６-ＳＦＴのトリプシン処理後に得た２部のペプチド配列により設計した。得られたＰＣＲ産物は、ｐＣＲ-ＩＩＴＭベクター(ＴＡ-cloning kit，Ｉnvitrogen社)中にクローン化した。該フラグメントのα-３２Ｐ-ｄＡＴＰでの標識は、製造業者の指示書に従って、ランダムプライムド・ラベリングキット(Ｂoehringer ＧmbＨ社，Ｍannheim，Ｇermany)で行った。
【００７７】
６．ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
５の方法に従って作製した３９７ｂｐのフラグメントを第一葉のＲＮＡゲルブロット分析におけるプローブとして用いた。その第一葉では、フルクタンの蓄積が、種々の時間連続して光に連続曝露することによって誘導される。非処理葉の場合にはまったくハイブリダイゼーションシグナルが認められなかったのに対して、葉における６-ＳＦＴ活性が上昇するに対応する様式で、約１８００ｂｐのハイブリダイズバンドが急速に蓄積した(データは示さず)。この結果は、約１８００ｂｐ長のメッセンジャーＲＮＡの存在を指している。
【００７８】
また、ＰＣＲ産物を用いて第一葉のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングした。ここでは、完全長のｃＤＮＡの探索を行った。
【００７９】
ここでは終わりまで、８日-齢の切除第一葉から全ＲＮＡを抽出することによってｃＤＮＡ発現ライブラリーを最初に作製した。この第一葉では、光に４８時間連続して暴露することによってフルクタンの合成を誘導した。該葉を液体窒素で摩砕して微粉末とし、ＲＮＡ抽出緩衝液(１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１Ｍ ＮａＣｌおよび２５ｍＭ ＤＴＴを入れた０.１Ｍ Ｔris(ＨＣｌ)、ｐＨ９)中に懸濁した。まだ凍結した試料は、一様にクリーム様に達するまでさらに摩砕し、ついでその試料をフェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール(２５：２４：１；ｖ：ｖ：ｖ)(ＢrandtおよびＩngversen，Ｃarlsberg Ｒes. Ｃommun.43，451-469，1978)で抽出した。第二ホモゲナイズ工程を削除し、最後のクロロホルム抽出後にＲＮＡを２Ｍ ＬiＣｌで４℃にて一晩沈殿することによって該方法を幾分修飾した。最後のエタノール沈殿後に、ポリ(Ｕ)-Ｓepharoseクロマトグラフィー(ＢrandtおよびＩngversen，前掲)によってポリ(Ａ)＋-ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡ合成に用いた(ＺＡＰ-ｃＤＮＡ合成キット，Ｓtratagene社，ＬaＪolla，ＣＡ，ＵＳＡ)。
【００８０】
そのｃＤＮＡをユニ-ＺＡＰ-ＸＲベクターに連結し、ＥcoＲＩおよびＸhoＩで消化し、ファージ粒子(ＧigapackＩＩＩ Ｐackaging Ｋit,Ｓtratagene社，ＬaＪolla，ＣＡ，ＵＳＡ)中にパッケージングした(７.５×１０７プラーク形成単位／５μｇポリ(Ａ)＋-ＲＮＡ)。
【００８１】
第一ライブラリーは、Ｓtratagene社プロトコールに従って、６０℃にて、α-３２Ｐ-標識した６-ＳＦＴの３９７ｂｐ長のフラグメントでスクリーニングした(前記参照)。もう１回陽性クローンをスクーニングし、Ｅxassist/SOLR-system(Ｓtratagene社，Ｌa Ｊolla，ＣＡ，ＵＳＡ)を用いて、Ｂluescript phagemide陽性クローンから最終的に切断した。両方の鎖のＤＮＡ配列決定は、シークエンシング・プロキット(東洋紡績（株），大阪，日本)を用いた、ジデオキシヌクレオチド鎖停止法によって行った。特に断らない限り、標準的なプロトコールを用いた(Ｓambrookら，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress社，Ｃold Ｓpring Ｈarbor(1989))。配列データ-分析は、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージ,Ｖer.7.2(1992)を用いて行った。
【００８２】
第一スクリーニングの後に、９個の陽性クローンを単離した。さらなるスクリーニングの後でも、７個のクローンが陽性のままであった。これらの配列は、５'末端から、およびＰＣＲ産物に基づいて設計した内部プライマーから部分的に決定した。７個すべてのクローンが同一蛋白質をコードし、そのうちの４個が完全コード配列を含んでいるようであった。完全長の配列の可能性のあるクローンの内の１個の配列は両方の鎖で全体的に決定し、それが４９ｋＤａサブユニットならびに２３ｋＤａサブユニットを含むポリペプチドをコードすることが判明した(図７)。
【００８３】
完全に配列決定したｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列の概略図を図８および９に示す。それは、ヌクレオチド４６で始まり、２個の終始コドンによってヌクレオチド１９２３で終止する１個のオープンリーディングフレームを含む。該オープンリーディングフレームは、６７残基長のリーダー配列を含む６２６アミノ酸のポリペプチド鎖をコードする。
【００８４】
成熟６-ＳＦＴはヌクレオチド２４６で出発し、したがって、６１.３ｋＤａの計算分子量および５.３７の計算ｐＩを有する少なくとも５５９アミノ酸残基を有する。精製蛋白質から得たすべての５個の部分アミノ酸配列が、ｃＤＮＡ由来のアミノ酸配列中に存在する(図８および９)。ｃＤＮＡは、同様に、４５ｂｐの５'-非翻訳配列およびポリ(Ａ)テイルを有する１７１ｂｐの３'非-翻訳配列を含む。６-ＳＦＴ ｃＤＮＡの可能な翻訳開始シグナル(ＡＴＧ)は、ヌクレオチド位置４６ないし４８に位置し、可能なポリアデニル化配列は、ヌクレオチド位置１９７３ないし１９７９に存在する。成熟６-ＳＦＴは、ＣonＡ-Ｓepharose上にアルファ-メチル-マンノシド-可逆性結合を示し、このことは、それが糖蛋白質(データは示さず)であることを示している。同様にして、由来するアミノ酸配列は、６個の可能なグリコシル化位置(Ａsn-Ｘ-Ｓer/Ｔhr)を含む。
【００８５】
精製蛋白質から得たすべてのペプチド配列は、由来するアミノ酸配列となんら誤対合なしであった。精製ＳＦＴの２３ｋＤａサブユニットから得た２種のペプチド配列がｃＤＮＡの３'-末端付近に位置する一方、４９ｋＤａサブユニットから得た配列は５'-末端付近に位置する。
【００８６】
ｃＤＮＡの既知のβ-フルクトシダーゼおよびフルクトシルトランスフェラーゼに対する可能な関連をさらに研究するために、由来するアミノ酸配列を種々の植物、糸状菌類および細菌インベルターゼ、ならびに細菌レバナーゼおよびレバンスクラーゼの配列と比較した(図１０および図１１)。ここに記載するｃＤＮＡは、緑豆(ヤエナリ)(Ａraiら，前掲)、ニンジン(Ｕngerら，前掲)、およびトマト(Ｅlliottら，前掲)の可溶性酸インベルターゼと最も高い相同性を有し、他の生物界からのインベルターゼ、レバナーゼおよびレバンスクラーゼ、すなわち、多種のβ-フルクトシダーゼとも等しく明らかな相同性を有する。アミノ酸配列の比較は、少なくとも５個のよく保存されたドメインを示している。ドメインＩおよびＩＶは、ドメインＩＩ、ＩＩＩおよびVよりもインベルターゼおよびレバンスクラーゼとの間で保存性が低い。これらの酵素では、ドメインＩＩＩは特に非常に保存されている。驚くべきことには、最も制限された相同性は、細菌のレバンスクラーゼとで、すなわち、６-ＳＦＴとして、同様な６-フルクトシル転移反応を触媒するクラスの酵素とである(図１１中の樹系図参照)。
【００８７】
７．ニコチアナ・プラムバギニフォリア(Ｎicotiana plumbaginifolia)プロトプラストにおける６-ＳＦＴの発現
６-ＳＦＴ ｃＤＮＡクローンは、カリフラワー・モザイクウイルス３５Ｓ転写の発現シグナル(Ｎeuhausら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ 88，10362-10366(1991)参照)の調節下のｐＵＣ１１９プラスミドベクター(Ｓambrookら，Ｍolecular Ｃloning,Ａ Ｌaboratory Ｍanual，Ｃold Ｓpring Ｈarbor ＬaboratoryＰress社，Ｃold Ｓpring Ｈarbor，1989)の誘導体にサブ-クローン化した。
【００８８】
ニコチアナ・プラムバギニフォリア(Ｎicotiana plumbaginifolia)のプロトプラストは、Ｇoodallら(Ｍeth.Ｅnzymol.181，148-161(1990))により記載されているごとく大量に単離し形質転換した。要約すると、６-ＳＦＴ ｃＤＮＡを含有するプラスミド１０μｇを１５ｍlの滅菌プラスチック管中の１０μｌ容積のＴＥ緩衝液中に分散した。対照形質転換は、インサートを含まない同プラスミド１０μｇで行った。１×１０６個のプロトプラストを添加して０.５ｍl容積とし、等容積の２０％(ｗ/ｖ)ポリエチレングリコール６０００と注意深く混合した。２-５分後に、Ｋ３培地６.５ｍlを添加し、該プロトプラストを２７℃にて２時間インキュベートした。その後に、それをＷ５オスモチカム(osmoticum)で１：１に希釈し、１０００ｇにて１０分間ペレット化した。全プロトプラスト(ｔ＝０時間の対照としたものを除いて)をＫ３培地２ｍlに再懸濁し、２７℃にてインキュベートした。３、６、９、１８および２７時間後に、試料を産物分析用に採取した。ここで、該プロトプラストを、Ｗ５オスモチカム(osmoticum)２ｍlを添加した後に、１０００ｇにて１０分間ペレット化した。プロトプラストのペレットを０.１Ｍクエン酸-Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液(ｐＨ５.７５)に再懸濁し、滅菌エッペンドルフチューブに移し、液体窒素中で凍結した。脱霜した後に、該試料を激しく撹拌し、細胞残渣を１３,０００ｇにて３分間ペレット化した。上清(５０〜１００μｌ)は、前記のごとく、それをＢiogel Ｐ-１０カラム上に案内することによって脱塩した。脱塩酵素試料は、０.０２％ＮａＮ３を入れた５０ｍＭクエン酸-Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液(ｐＨ５.７５)中の、０.１Ｍスクロース、または０.１Ｍイソケストースと組み合わせた０.１Ｍスクロースと、２７℃にて２０時間インキュベートした。産物分析は、該試料を９５℃にて３分間加熱することによって反応を終結させた後、図５の場合に記載したごとく行った。
【００８９】
約３時間の初期対数増加期の後、プロトプラストの抽出物がスクロースからケストースを形成し、スクロースおよびイソケストースからビフルクトースを形成した。このことにより、該ｃＤＮＡが機能性６-ＳＦＴをコードすることが確認された(図１１)。精製酵素のように、プロトプラスト中に存在する活性は、スクロースからイソケストースの産生よりもだいたい４倍速い速度で、スクロースおよびイソケストースからのビフルコースの生成を触媒した。これらの結果により、ｃＤＮＡが６-ＳＦＴをコードしていることが確認された。
【００９０】
８．植物における６-ＳＦＴ遺伝子の発現
６-ＳＦＴ ｃＤＮＡは、植物-特異的３５Ｓプロモーターとノパリンシンターゼ遺伝子由来の終止シグナルとの間にクローン化した。このキメラ遺伝子構築物(３５Ｓ-６ＳＦＴ-ＮＯＳ)をつづいてバイナリ植物ベクターpＢＩＮ１９(Ｂevan，Ｎucl.Ａcids Ｒes. 12，8711-8721)の誘導体にインサートした。これにより、プラスミドｐＶＤＨ２８０を得た。このプラスミドは、ヘルパープラスミドｐＲＫ-２０１３(Ｌam,Ｐlasmid 13，200-204(1985))を用いた三点交差育種でアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Ａgrobacterium tumefaciens)ＬＢＡ４４０４(Ｈoekemaら，Ｎature 303，179-180(1983))とコンジュゲートした。該構築物は、リーフディスク形質転換法(Ｈorshら，Ｓcience 227，1229-1232(1985))を用いて、ニコチニア・タバカム(Ｎicotinia tabacum) var.Ｓumsun NNに導入した。再生植物を、カナマイシン抵抗性について選抜し、ＭＳ培地(ＭurashigeおよびＳkoog，Ｐhysiol.Ｐlant. 15，473-497(1962))で培養し分析した。
【００９１】
イン・ビトロ(in vitro)非トランスジェニック対照植物ならびにイン・ビトロ(in vitro)トランスジェニック植物１、３、４、５、７、９、１０および１１の葉材料を切り出し、エッペンドルフチューブ中で摩砕した。遠心(１６,０００ｒｐｍにて２分間)後に、ＰＡ-１００カラムおよびパルス電流滴定検出器を付けたＤionex ＤＸ-３００系によって２００μｌを分析し、１００％ＮａＯＨへのＮａＯＨ/ＮａＡｃグラジエントで溶出した。得られたスペクトルを図１９〜２１に示す。
【００９２】
野生型植物(Ｃ１)または無関係構築物で形質転換した植物においては、オリゴ糖は全く認められなかった(図１８〜２０)。形質転換体のスクリーニングによって、これらの方法の使用によって、イヌリンシリーズに基づくＤＰを有するオリゴ糖-蓄積-植物は３〜５および８〜９にあると概算される。発現レベルは、同構築物で形質転換した個々の植物の間で変動した。このことは、植物における形質転換実験においては通常の現象である。発現レベルの変動は、ゲノム中の組込み位置に実質的に依存する(位置効果)。
【００９３】
形質転換体番号４の抽出物に６-ケストース１００ｎｇを添加した後、再度、スペクトルを記録した。図２１は、形質転換体番号４の場合においては、２-６型結合を有するオリゴ糖が形成されていることを示している。なぜならば、６-ケストースなしのスペクトルに比してより高いピークが認められるからである。したがって、恐らく、該ピークは６-ケストースに対応する。
【００９４】
実施例５
キクイモからのフルクタン-フルクタン フルクトシルトランスフェラーゼ
本発明に適用する他の植物フルクトシルトランスフェラーゼは、塩析、レクチン-アフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを用いるＬuescher法によって、キクイモ(Ｈelianthus tuberosus Ｌ.)から精製した(Ｌuescher，Ｍ.ら，Ｎew Ｐhytol.123，717-724(1993))。
【００９５】
精製酵素は、無処理ＩＥＦ-ゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜上にブロットした。該膜をクーマシー・ブルー染色によって染色し、２種の最も重要なＦＦＴイソ型(各々Ｔ１およびＴ２)を切り出した(図１３参照)。
【００９６】
蛋白質Ｔ１およびＴ２の両方をトリプシンで消化し、そのペプチドをＨＰＬＣによって分離した。消化ＦＦＴイソ型のＨＰＬＣ図は、同一パターンを示す(図１４および１５参照)。Ｔ２の４種の精製ペプチド(フラクション１８、２４、２０および２６)のアミノ酸配列を決定した。第一ペプチドの配列は：
ＮＨ２-Ｅ-Ｑ-Ｗ-Ｅ-Ｇ-Ｘ-Ｆ-Ｍ-Ｑ-Ｑ-Ｙ-Ｘ-Ｘ-
第二ペプチドは以下のアミノ酸配列を有していた：
ＮＨ２-Ａ-Ｖ-Ｐ-Ｖ-Ｘ-Ｌ-Ｘ-Ｘ-Ｐ-Ｌ-(Ｆ/Ｌ)-Ｉ-Ｘ-Ｗ-Ｖ-
第三および第四のペプチドは、各々、以下のアミノ酸配列を有していた：
ＮＨ２-Ｗ-Ｔ-Ｐ-Ｄ-Ｎ-Ｐ-Ｅ-Ｌ-Ｄ-Ｖ-Ｇ-Ｉ-Ｇ-Ｌ；
ＮＨ２-Ｖ-Ｄ-Ｈ-Ｖ-Ｉ-Ｖ-Ｙ-Ｇ-Ｆ-Ａ-Ｑ-Ｇ
【００９７】
実施例５と同様の方法でｃＤＮＡを単離し配列を決定した。形質転換した完全ｃＤＮＡ-クローン植物細胞を用いて、トランスジェニック植物を得た。
【００９８】
実施例６
他の植物種での適用性
該技術の一般的な適用性を実証するために、先の実施例に記載した種々の構築物を種々の穀物に導入した。かくして、ジャガイモを、Ｖisser，Ｐlant ＴissueＣulture Ｍanual Ｂ５, １-９, Ｋluwer Ａcademic Ｐublishers社，1991に記載の方法に従って形質転換した。得られたトランスジェニック植物は各々の試験した器官にオリゴ糖を蓄積した。また、同構築物を、Ｄ'Ｈalluinら，Ｂio/Ｔechnology 10，309-314(1994)によって記載されているごとく形質転換したビート(Ｂeta vulugaris Ｌ.)にも導入した。得られたトランスジェニック・ビート植物は、例えば、その葉および根に顕著な量のオリゴ糖を蓄積した。同構築物は、Ｂlockら，Ｐlant Ｐhysiol.91，694-701(1989)に従って形質転換したナタネ(Ｂrassica napus Ｌ.)に導入した。得られたトランスジェニック植物は、例えば、その葉および貯蔵器官に、顕著なレベルのオリゴ糖を蓄積した。もちろん、植物を示した方法で形質転換することは必須でない。当業者の及ぶ範囲の他の方法も用いることができる。
【００９９】
改変し得る他の植物種の例には、限定するものではないが、トウモロコシ(Ｚea mays Ｌ.)、コムギ(Ｔriticum aestivum Ｌ.)、オオムギ(Ｈordeum vulgareＬ.)、コメ(Ｏryza sativa Ｌ.)、ダイズ(Ｇlycin max Ｌ.)、エンドウマメ(Ｐisum sativum Ｌ.)、インゲンマメ(Ｐhaseolus vulgaris Ｌ.)、チコリー(Ｃichorium intybus Ｌ.)、サトウキビ(Ｓaccharum officinarum Ｌ.)、サツマイモ(Ｄioscorea esculenta Ｌ.)、キャッサバ(Ｍanihot esculenta Ｌ.)およびグラス(例えば、(Ｌolium spp.)、(Ｐoa spp.)および(Ｆestuca spp.))が含まれる。
【０１００】
天然または誘導改変炭水化物分離パターンを有する植物は、オリゴ糖-合成遺伝子の導入について好ましい標的植物とし得る。かかる植物には、限定するものではないが、デンプンおよびスクロース代謝における天然の突然変異体、ならびに、例えば、ＳonnewaldおよびＷillmitzer，Ｐlant Ｐhysiology 99，1267-1270(1992)に記載されているごとき、分子および遺伝子技術によってデンプンおよびスクロース代謝を改変した植物が含まれる。
【０１０１】
実施例７
本発明によるオリゴ糖の用途
本発明による方法を用いて産生したオリゴ糖は、種々の製品の砂糖代替物として使用し得る。そのうちの３例を以下に示す。
【０１０２】
１．アイスクリーム
アイスクリームを以下の成分から製造する：
６３５部 水
９０部 バター脂肪
１００部 低-脂肪粉乳
１７０部 本発明によるオリゴ糖
５部 クレモダン(Ｃremodan)ＳＥ３０ＴＭ(Ｇrindsted社)
０.３部 アスパルタームＴＭ
所望により香料
粉乳を水に溶解する。その全体を４０-４５℃に加熱する。残りの乾燥成分を混合し、温牛乳に溶解する。ついで、溶解したバターを添加する。ついで、その全体を７２℃にて１０分間低温殺菌する。その後、その混合物を、１５０/３５ barにて二工程ホモジナイザーでホモジナイズする。かく得た氷混合物を５℃に急速に冷却し、つづいてその全体を５℃にて最低４時間熟成させる。最後に、その氷混合物に空気を混入させ、１００％増量割合まで凍結する。
【０１０３】
-３５℃にて硬化させ、-２０℃にて保存した後に、天然の砂糖(サッカロース、グルコースシロップ)で製造したアイスクリームの有する味覚およびテキスチャーに相当するアイスクリームを得る。
【０１０４】
２．ムースリ・バー
ムースリ・バーは、以下の成分から製造した：
２８部 本発明によるオリゴ糖
６８部 ムースリ・ミックス
４部 カカオ
加熱することによってオリゴ糖からシロップを製造し、そのシロップを他の成分と混合した。バーは、かく得た混合物から、円筒圧縮で形成した。天然砂糖を省略していることに起因して、該バーは従来のバーよりも遥かに低-カロリーである。
【０１０５】
３．ソフトドリンク
ソフトドリンクは以下の成分から製造した：
９０部 水または果汁
８-１０部 本発明によるオリゴ糖
人工甘味料
香料および着色剤
栄養酸
炭酸ガス
すべての成分を水の一部に溶解した。ついで、残りの水を、炭酸ガス-含有水として添加した。ソフトドリンクのエネルギー値は非常に低い。なぜならば、付加天然砂糖を全く添加していないからである。
【０１０６】
【表１】
ａケストース-産生活性として測定
ｂmolフルクトース/mol産生フルクトース
ｃナノカタール＝nmol・s−１
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】図１は、野生型および改変形のストレプトコッカス・ミュータンス(Ｓtreptococcus mutans)のフルクトシルトランスフェラーゼ(ｆｔｆ)のオリゴ糖-産生活性を示し、これは、Ｃarins，Ａ.Ｊ.およびＰollock，Ｃ.Ｊ.，Ｎew Ｐhytol.109，399-405(1988)により記載されているのと同様にして、スクロースと共にインキュベートし、ＴＬＣ上で分析した。コロニーおよび精製蛋白質由来である培養試料は、１％Ｔriton Ｘ-100を入れた５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液中の２００ｍＭスクロースと一緒に３７℃にて一晩インキュベートした。レーン１は、エス・ミュータンス(Ｓ.mutans)培養の反応産物を示し；レーン２は、エス・ミュータンス(Ｓ.mutans)からの精製酵素の活性を示し；レーン３は、プラスミドｐＴＳ１０２を運搬するイー・コリ(Ｅ.coli)株の活性を示し；レーン４は、プラスミドｐＴＤ２を運搬するイー・コリ(Ｅ.coli)株の活性を示し；レーン５は、イー・コリ(Ｅ.coli)プロモーター調節下の成熟エス・ミュータンス(Ｓ.mutans)フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子で形質転換したイー・コリ(Ｅ.coli)細胞の活性を示す。レーンＡで用いたオリゴ糖標準は、アリウム・セパ(Ａllium cepa)球根の抽出物であり、レーンＨで用いたものはキクイモ(Ｈelianthus tuberosus)塊茎の抽出物である。図において、Ｆはフルクトース、Ｇはグルコース、Ｓはスクロース(二糖)、Ｎはネオケストース(Ｆ６-６Ｇ１-２Ｆ、三糖)、Ｉはｌ-ケストース(Ｇ１-２Ｆ１-２Ｆ、三糖)、Ｋはケストース(Ｇ１-２Ｆ６-２Ｆ、三糖)を示す。より長いオリゴ糖(ＤＰ＝４-９)についても同様に示す。
【図２】図２は、エス・ミュータンス(Ｓ.mutans)のフルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を発現するトランスジェニック・タバコ植物(ＫＺ)のＴＬＣ-分析を示す。オリゴ糖がこれらの植物において蓄積している。レーンＨは、対照としての、キクイモ(Ｈelianthus tuberosus)塊茎の抽出物を示す。
【図３】図３は、タマネギ種子からの精製ＳＳＴのＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルを示す。銀染色によって染色したこのゲル上の試料が、単一バンドとして認められる。Ｍは、分子量マーカーを示し、ここにそれらのサイズはキロダルトン(ｋＤ)で示す。
【図４】図４は、スクロースと共にインキュベートしたタマネギ種子からの精製ＳＳＴの反応産物を示す(レーン４および５：ｏ-イン・ビトロ(in vitro))。三糖のみが形成される。レーン１はチューリップ茎(Ｔ)の抽出物を示し、レーン２はキクイモ(Ｈelianthus tuberosus)塊茎(Ｈ)の抽出物を示し、レーン３はアリウム・セパ(Ａllium cepa)球根(白抜き円)の抽出物を示す。Ｍは単糖を、Ｓはスクロース(二糖)を、Ｎはネオケストース(Ｆ２-６Ｇ１-２Ｆ、三糖)を、Ｉはｌ-ケストース(Ｇ１-２Ｆ１-２Ｆ、三糖)を示す。より長いオリゴ糖(ＤＰ４-５)も同様に示す。生成物は、図１記載と同様にしてＴＬＣ上で分析した。
【図５】図５は、精製工程中、Ｒesource Ｑカラム上の第二アニオン交換クロマトグラフィー段階後の、オオムギからのスクロース-フラクタン ６-フルクトシルトランスフェラーゼ(６-ＳＦＴ)の２種のイソ型の分離を示す。図５Ａは、２５ｍＭ メチルピペラジン(ＨＣl)緩衝液(ｐＨ５.７５)中の０.２Ｍスクロースと共にインキュベート後にクロマトグラフィーに付した後に得たフラクションの、蛋白質溶出特性(Ａ２８０)およびフルクトシルトランスフェラーゼ活性を示す。Ｄe クロマトグラム(図５Ｂ)は、ＣarboＰack-PA100カラム上のアニオン交換ＨＰＬＣ分離後に、パルス電流滴定検出(pulsed amperometric detection)によって得た。反応生成物は、スクロース単独、またはスクロースおよびイソケトースと保存液Ｉおよび保存液ＩＩＩとをインキュベートした後に得た。炭水化物は、その保持時間によって同定し、トレハロースを内部標準として用いた。図５Ａ中の白抜き円は、形成されたケストース、ビフルコース、イソケスチンおよびケスチンの合計で指したフルクトシルトランスフェラーゼ活性を表す。図５Ｂにおいて、ｐはイソケストース夾雑物から生じた非-同定産物に相当し、ｃはイソケトース基質の夾雑物に相当する。
【図６】図６Ａは、非-変性条件下の等電点電気泳動後の６-ＳＦＴのフラクションの保存液(保存液ＩＩとして示す；図５参照)の酵素活性のグラフを示す。黒塗り三角は、遊離フルクトースとして測定したβ-フラクトシダーゼ活性を示し、一方、白抜き円は形成したケストースとして測定したフルクトシルトランスフェラーゼ活性を示す。図６Ｂは、第二アニオン交換クロマトグラフィー後の保存液ＩＩの二次元解析後のＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルである。２種の６-ＳＦＴイソ型がここに示されている。双方のイソ型は、各々２３ｋＤａおよび４９ｋＤａの２種のサブユニットよりなることが判明している。図６Ｃは、ＩＦＥ-マーカー フィコシアニン(ｐＩ４.６)、β-ラクトグロブリン(ｐＩ５.１)およびウシ・カルボニックアンヒドラーゼ(ｐＩ６.０)の二次元ゲル電気泳動である。
【図７】図７は、オオムギからの６-ＳＦＴをコードするｃＤＮＡクローンを得るために用いた戦略の模式図である。
【図８】図８は、オオムギからの、オオムギ由来の６-ＳＦＴのｃＤＮＡ-配列およびアミノ酸配列を示す。
【図９】図９は、オオムギからの、オオムギ由来の６-ＳＦＴのｃＤＮＡ-配列およびアミノ酸配列（図８の続き）を示す。
【図１０】図１０は、オオムギ由来の６-ＳＦＴ、インベルターゼ(β-フルクトシダーゼ)、レバナーゼおよびレバンスクラーゼののアミノ酸配列の全体図である。該全体図は、ＧＣＧ sequence analysis software packageのＰileup Ｐrogramで作成した。以下の略語を用いた：Ｈ．ｖ． ６-ＳＦＴ＝オオムギからのスクロース-フルクタン ６-フルクトシルトランスフェラーゼ；Ｖ．ｒ．Ｉｎｖ＝緑豆からの可溶性酸インベルターゼ(ヤエナリ；Ａraiら，Ｐlant Ｃell Ｐhysiol.33，245-252(1992))；Ｄ．ｃ．Ｉｎｖ＝ニンジンの可溶性酸インベルターゼ(Ｕngerら，Ｐlant Ｐhysiol.104，1351-1357(1994))；Ｌ．ｅ．Ｉｎｖ＝トマトの可溶性酸インベルターゼ(Ｅlliottら，Ｐlant Ｍol.Ｂiol.21，515-524(1993))；Ｄ．ｃ．ｃｗ Ｉｎｖ＝ニンジンの細胞壁インベルターゼ(ＳtrumおよびＣrispeels，Ｐlant Ｃell 2，1107-1119(1990))；Ａ．ｓ．Ｉｎｖ＝エンバクの部分インベルターゼ配列(Ｗuら，Ｊ．Ｐlant Ｐhysiol.142，179-183(1993))；Ｅ．ｃ．Ｉｎｖ＝エシェリキア・コリ(Ｅscherichia coli)のインベルターゼ(rafＤ)(Ａslandisら，Ｊ.Ｂacteriol.171，6753-6763(1989))；Ｓ．ｍ．Ｓｃｒｂ＝ストレプトコッカス・ミュータンス(Ｓtreptococcus mutans)(ＳatoおよびＫuramitsu，Ｉnfect.Ｉmmun.56，1956-1960(1989))；Ｂ.ｐ.ＬｅｌＡ＝バシラス・ポリミキサ(Ｂacillus polymyxa)からのレバナーゼ(Ｂezzateら，非公開参考ＥＭＢＯデータベース)；Ｂ．ｓ．ＳａｃＣ＝バシラス・サチリス(Ｂacillus subtilis)のレバナーゼ(Ｍartinら，Ｍol.Ｇen.Ｇenet.208,177-184(1987))；Ｋ．ｍ．Ｉｎｕ＝クルイベロマイセス・マルキシアヌス(Ｋluiveromyces marxianus)のイヌリナーゼ(Ｌalouxら，FELVＬett.289，64-68(1991))；Ｓ．ｃ．Ｉｎｖｌ＝パン酵母のインベルターゼ１(ＨohmannおよびＧozalbo，Ｍol.Ｇen.Ｇenet.211，446-454(1988))；Ｓ．ｏ．ｉｎｖ＝シュバンニオマイセス・オクシデンタリス(Ｓchwanniomycesoccidentalis)のインベルターゼ(Ｋleinら,Ｃurr.Ｇenet.16，145-152(1989))；Ａ．ｎ.Ｉｎｖ＝アスペルギルス・ニガー(Ａspergillus niger)のインベルターゼ(Ｂoddyら，Ｃurr.Ｇenet.24，60-66(1993))；Ｂ.a.ＳacＢ＝バシラス・アミログファシエンス(Ｂacillus amyloguefaciens)のレバンスクラーゼ(Ｔangら，Ｇene 96，89-93(1990))；Ｂ．ｓ．ＳａｃＢ＝バシラス・サチリス(Ｂacillus subtilis)のレバンスクラーゼ(Ｓteinmetzら，Ｍol.Ｇen.Ｇenet.200，220-228(1985))；Ｓ．ｍ．ＳａｃＢ＝ストレプトコッカス・ミュータンス(Ｓtreptococcus mutans)のレバンスクラーゼ(ＳhirozaおよびＫuramitsu，Ｊ.Ｂacteriol.170，810-816(1988))；Ｚ．ｍ．ＬｅｖＵ＝ザイモモナス・モビリス(Ｚymomonas mobilis)のレバンスクラーゼ(Ｓongら，ＥＭＢＯデータベースの非公開参照)
【図１１】図１１は、由来するアミノ酸配列に基づいた、種々のインベルターゼ(β-フラクトシダーゼ)、レバナーゼおよびレバンスクラーゼとオオムギからの６-ＳＦＴとの樹系図である。該樹系図は、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージのＰileupプログラムを用いて、図１０に記載した配列で作成した。
【図１２】図１２は、ニコチアナ・プラムバギニフォリア(Ｎicotiana plumbaginifolia)プロトプラストにおけるオオムギ6-SFTの機能的発現を示す。エラー・バーは平均±標準偏差を示す。６-ＳＦＴｃＤＮＡは、プロトプラスト中で２７時間発現した。試料を膨大な回数採取し、フルクトシルトランスフェラーゼ活性を、スクロース(図１２Ａ)またはスクロースおよびシオケトース(図１２Ｂ)とインキュベートすることによって、プロトプラスト抽出物中で測定した。白抜き円は、６ＳＦＴ遺伝子構築物で形質転換したプロトプラストの抽出物の酵素活性を示す。白抜き四角は、６-ＳＦＴ ｃＤＮＡなしのベクターで形質転換したプロトプラストの抽出物の活性を示す。
【図１３】図１３は、キクイモ(Ｈelianthus tuberosus Ｌ.)からのフラクタン-フラクタン フルクトシルトランスフェラーゼ(ＦＦＴ）の精製酵素抽出物の天然ＩＥＦ-ゲルである。クーマシー・ブルー染色した後に、ＦＦＴの２種の最も重要なイソ型(Ｔ１(ｐＩ４.４５)およびＴ２(ｐＩ４.７５))に加えて、約５.５のｐＩを有するバンドが認められ、これは恐らく、変性ＦＦＴに相当する。
【図１４】図１４は、ＦＦＴイソ型Ｔ１のトリプシン消化物のＨＰＬＣ図である。
【図１５】図１５は、ＦＦＴイソ型Ｔ２のトリプシン消化物のＨＰＬＣ図である。
【図１６】図１６は、その下に示すオープンリーディングフレーム１を有するクローンｐＡＣ２２のＤＮＡ-配列を示す。
【図１７】図１７は、オープンリーディングフレーム２を有するクローンｐＡＣ９２のＤＮＡ-配列を示す。
【図１８】図１８は、ＰＡ-１００カラムおよびパルス電流滴定検出を有するＤionex ＤＸ-３００システムで得、１００％までのＮａＯＨ/ＮａＡｃグラジエントで溶出したトランスジェニックタバコ植物から得た抽出物のスペクトルを示す。トランスジェニック系統の番号は、スペクトル当たりに示す、すなわち１、３、４として示す。Ｃ１は、対照系統である。(Ｇ＝グルコース、Ｓ-スクロース、ＤＰ＝重合度)
【図１９】図１９は、ＰＡ-１００カラムおよびパルス電流滴定検出を有するＤionex ＤＸ-３００システムで得、１００％までのＮａＯＨ/ＮａＡｃグラジエントで溶出したトランスジェニックタバコ植物から得た抽出物のスペクトルを示す。トランスジェニック系統の番号は、スペクトル当たりに示す、すなわち５、７、９、１０として示す。(Ｇ＝グルコース、Ｓ-スクロース、ＤＰ＝重合度)
【図２０】図２０は、ＰＡ-１００カラムおよびパルス電流滴定検出を有するＤionex ＤＸ-３００システムで得、１００％までのＮａＯＨ/ＮａＡｃグラジエントで溶出したトランスジェニックタバコ植物から得た抽出物のスペクトルを示す。トランスジェニック系統の番号は、スペクトル当たりに示す、すなわち１１として示す。系統９のスペクトル(ＮＲ９＋ＳＴ)のスペクトルも、イヌリンシリーズとの組合せで示す(Ｇ＝グルコース、Ｓ-スクロース、ＤＰ＝重合度)。
【図２１】図２１は、対照(Ｃ１)、形質転換体番号４(＃４)(４番形質)、および１００ｎｇの６-ケストースを抽出物に添加した形質転換体(＃４＋６Ｋ)のスペクトルを示す。スペクトル中の「６Ｋ」なる記号は、６-ケストースピークを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物-特異的転写-開始および終止シグナルに読み枠で結合した、植物または植物細胞中でスクロースをオリゴ糖に変換する能力を有する酵素をコードする遺伝子を含む、該酵素を発現するためのＤＮＡ構築物。
【請求項２】
スクロースをオリゴ糖に変換する能力を有する酵素をコードする遺伝子が、微生物起源のものであることを特徴とする、請求項１記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３】
スクロースをオリゴ糖に変換する能力を有する酵素をコードする遺伝子が、ストレプトコッカス・ミュータンス(Ｓtreptococcus mutans)のｆｔｆ遺伝子、バシラス・サチリス(Ｂacillus subtilis)のＳａｃＢ遺伝子およびそれらの突然変異形よりなる群から選択されることを特徴とする請求項２記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４】
スクロースをオリゴ糖に変換する能力を有する酵素をコードする遺伝子が、植物起源のものであることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ構築物。
【請求項５】
遺伝子が、タマネギのスクロース-スクロース-フルクトシルトランスフェラーゼ(ＳＳＴ)遺伝子、オオムギ(Ｈordeum vulgare Ｌ.)由来のスクロース-フルクタン ６-フルクトシルトランスフェラーゼ(６-ＳＦＴ)遺伝子、キクイモ(Ｈelianthus tuberosus)由来のフルクタン-フルクタン-フルクトシルトランスフェラーゼ(ＦＦＴ)遺伝子またはそれらの突然変異形から選択される請求項４記載のＤＮＡ構築物。
【請求項６】
さらに、発現構築物が、少なくとも１つの標的シグナル配列を含むことを特徴とする請求項１−５のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項７】
さらに、発現構築物が、少なくとも１つのエンハンサーを含むことを特徴とする請求項１−６のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項８】
請求項１−７のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物を含むトランスジェニック植物細胞。
【請求項９】
請求項８記載のトランスジェニック植物細胞から再生させることによって得ることができるトランスジェニック植物。
【請求項１０】
請求項９記載の植物由来の、または、請求項８記載のトランスジェニック植物細胞からの再生によって得ることができるトランスジェニック植物組織。
【請求項１１】
ａ）適当な植物細胞をＤＮＡ構築物で形質転換し；
ｂ）形質転換植物細胞からトランスジェニック植物を再生させ；
ｃ）酵素の発現および活性を許容する条件下にてトランスジェニック植物を培養し；ついで
ｄ）トランスジェニック植物からオリゴ糖を単離する
工程を含む方法において、オリゴ糖を製造するための請求項１−７のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物の使用。
【請求項１２】
請求項１−７のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物で植物細胞を形質転換し；形質転換植物細胞からトランスジェニック植物を再生させ；酵素の発現および活性を許容する条件下にてトランスジェニック植物を培養し；ついで、トランスジェニック植物からオリゴ糖を単離する、ことによって得ることができるオリゴ糖。
【請求項１３】
一般式ＧｍＦｎ(式中、Ｇはグルコース、Ｆはフルクトースを表し、ｍ＝０または１、ｎ≧０、好ましくはｍ＝１、ｎは２〜８で変動し、好ましくはｎ＝２または３)によって特徴付けられる請求項１２記載のオリゴ糖。
【請求項１４】
個々の分子の鎖長が実質的に２ないし８にある請求項１２および１３記載のオリゴ糖の混合物。
【請求項１５】
請求項１２または１３記載のオリゴ糖、および／または請求項１４記載のオリゴ糖の混合物の、食物製品における砂糖代替物としての使用。
【請求項１６】
請求項１２または１３記載のオリゴ糖、および／または請求項１４記載のオリゴ糖の混合物の、食物製品における栄養繊維としての使用。
【請求項１７】
請求項１２または１３記載のオリゴ糖、および／または請求項１４記載のオリゴ糖の混合物の、食物製品におけるビフィズス源剤(bifidogenic agent)としての使用。
【請求項１８】
請求項１２または１３記載のオリゴ糖、および／または請求項１４記載のオリゴ糖の混合物の、動物飼料におけるビフィズス源剤としての使用。
【請求項１】
植物-特異的転写-開始および終止シグナルに読み枠で結合した、植物または植物細胞中でスクロースをオリゴ糖に変換する能力を有する酵素をコードする遺伝子を含む、該酵素を発現するためのＤＮＡ構築物。
【請求項２】
スクロースをオリゴ糖に変換する能力を有する酵素をコードする遺伝子が、微生物起源のものであることを特徴とする、請求項１記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３】
スクロースをオリゴ糖に変換する能力を有する酵素をコードする遺伝子が、ストレプトコッカス・ミュータンス(Ｓtreptococcus mutans)のｆｔｆ遺伝子、バシラス・サチリス(Ｂacillus subtilis)のＳａｃＢ遺伝子およびそれらの突然変異形よりなる群から選択されることを特徴とする請求項２記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４】
スクロースをオリゴ糖に変換する能力を有する酵素をコードする遺伝子が、植物起源のものであることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ構築物。
【請求項５】
遺伝子が、タマネギのスクロース-スクロース-フルクトシルトランスフェラーゼ(ＳＳＴ)遺伝子、オオムギ(Ｈordeum vulgare Ｌ.)由来のスクロース-フルクタン ６-フルクトシルトランスフェラーゼ(６-ＳＦＴ)遺伝子、キクイモ(Ｈelianthus tuberosus)由来のフルクタン-フルクタン-フルクトシルトランスフェラーゼ(ＦＦＴ)遺伝子またはそれらの突然変異形から選択される請求項４記載のＤＮＡ構築物。
【請求項６】
さらに、発現構築物が、少なくとも１つの標的シグナル配列を含むことを特徴とする請求項１−５のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項７】
さらに、発現構築物が、少なくとも１つのエンハンサーを含むことを特徴とする請求項１−６のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項８】
請求項１−７のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物を含むトランスジェニック植物細胞。
【請求項９】
請求項８記載のトランスジェニック植物細胞から再生させることによって得ることができるトランスジェニック植物。
【請求項１０】
請求項９記載の植物由来の、または、請求項８記載のトランスジェニック植物細胞からの再生によって得ることができるトランスジェニック植物組織。
【請求項１１】
ａ）適当な植物細胞をＤＮＡ構築物で形質転換し；
ｂ）形質転換植物細胞からトランスジェニック植物を再生させ；
ｃ）酵素の発現および活性を許容する条件下にてトランスジェニック植物を培養し；ついで
ｄ）トランスジェニック植物からオリゴ糖を単離する
工程を含む方法において、オリゴ糖を製造するための請求項１−７のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物の使用。
【請求項１２】
請求項１−７のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物で植物細胞を形質転換し；形質転換植物細胞からトランスジェニック植物を再生させ；酵素の発現および活性を許容する条件下にてトランスジェニック植物を培養し；ついで、トランスジェニック植物からオリゴ糖を単離する、ことによって得ることができるオリゴ糖。
【請求項１３】
一般式ＧｍＦｎ(式中、Ｇはグルコース、Ｆはフルクトースを表し、ｍ＝０または１、ｎ≧０、好ましくはｍ＝１、ｎは２〜８で変動し、好ましくはｎ＝２または３)によって特徴付けられる請求項１２記載のオリゴ糖。
【請求項１４】
個々の分子の鎖長が実質的に２ないし８にある請求項１２および１３記載のオリゴ糖の混合物。
【請求項１５】
請求項１２または１３記載のオリゴ糖、および／または請求項１４記載のオリゴ糖の混合物の、食物製品における砂糖代替物としての使用。
【請求項１６】
請求項１２または１３記載のオリゴ糖、および／または請求項１４記載のオリゴ糖の混合物の、食物製品における栄養繊維としての使用。
【請求項１７】
請求項１２または１３記載のオリゴ糖、および／または請求項１４記載のオリゴ糖の混合物の、食物製品におけるビフィズス源剤(bifidogenic agent)としての使用。
【請求項１８】
請求項１２または１３記載のオリゴ糖、および／または請求項１４記載のオリゴ糖の混合物の、動物飼料におけるビフィズス源剤としての使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２】
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【図９】
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【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【公開番号】特開２００７−６８９８（Ｐ２００７−６８９８Ａ）
【公開日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２５４５１７（Ｐ２００６−２５４５１７）
【出願日】平成１８年９月２０日（２００６．９．２０）
【分割の表示】特願平８−５０４２３４の分割
【原出願日】平成７年７月７日（１９９５．７．７）
【出願人】（５０４１８９５４２）スティヒティング・スヘイクンディヒ・オンデルズーク・イン・ネーデルラント (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２０日（２００６．９．２０）
【分割の表示】特願平８−５０４２３４の分割
【原出願日】平成７年７月７日（１９９５．７．７）
【出願人】（５０４１８９５４２）スティヒティング・スヘイクンディヒ・オンデルズーク・イン・ネーデルラント (1)
【Ｆターム（参考）】
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