プロリルエンドペクチダーゼ阻害剤
【課題】 プロリルエンドペプチダーゼに対して優れた阻害活性を有し、かつ生体に対する安全性が向上した、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤を提供すること。
【解決手段】 生体内でのプロリルエンドペプチダーゼ活性を阻害し得る、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤が開示されている。本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、褐藻類こんぶ目こんぶ科のマコンブ、褐藻類こんぶ目ちがいそ科のアラメ、サガラメ、ツルアラメ、クロメ、カジメ、ワカメ、アオワカメ、ヒロメ、アイヌワカメ、およびチガイソ；褐藻類ひばまた目ほんだわら科のホンダワラ、ヒジキ、およびアカモク；褐藻類まがまつも目もずく科のモズクおよびオキナワモズク；および、紅藻類スギノリ目すぎのり科に属する海藻；からなる群より選択される少なくとも１種の海藻由来の抽出物を有効成分として含有する。
【解決手段】 生体内でのプロリルエンドペプチダーゼ活性を阻害し得る、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤が開示されている。本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、褐藻類こんぶ目こんぶ科のマコンブ、褐藻類こんぶ目ちがいそ科のアラメ、サガラメ、ツルアラメ、クロメ、カジメ、ワカメ、アオワカメ、ヒロメ、アイヌワカメ、およびチガイソ；褐藻類ひばまた目ほんだわら科のホンダワラ、ヒジキ、およびアカモク；褐藻類まがまつも目もずく科のモズクおよびオキナワモズク；および、紅藻類スギノリ目すぎのり科に属する海藻；からなる群より選択される少なくとも１種の海藻由来の抽出物を有効成分として含有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に関し、より詳細には、生体に対する安全性が向上したプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロリルエンドペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２１．２６）はペプチド鎖中のプロリン残基におけるカルボキシル基側のペプチド結合を特異的に認識し、切断するペプチダーゼである。プロリルエンドペプチダーゼは、記憶の固定場所とされている脳の海馬部分にて高い酵素活性にて存在し、かつ動物臓器に広く分布することが知られている。また、同様の酵素は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌からも発見されている。
【０００３】
プロリルエンドペプチダーゼは、神経伝達物質であると言われるサブスタンスＰおよびニューロテンシン、記憶に関係していると考えられているＴＨＲ（甲状腺刺激ホルモン）、ならびにステップスルー型受動的回避学習法で記憶保持活性を有すると言われる脳内バソプレシンに作用し、これらを不活性化させることが知られている。バソプレシンは腎臓で水分再吸収に働くペプチドホルモンであるが、脳内においては学習および記憶の過程にも関与しており、このホルモンが分解され、不活性化されると記憶保持に障害が現れると言われている。また、痴呆患者のバソプレシン量は、正常人のものよりも少ないことが知られている。近年、このようなプロリルエンドペプチダーゼの活性を阻害することにより、痴呆症を予防または治療するための研究が行われている。
【０００４】
従来では、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＣＨ２Ｃｌ、Ｚ−Ｐｒｏ−ｐｒｏｌｉｎａｌ、Ｚ−Ｖａｌ−ｐｒｏｌｉｎａｌ、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ｐｒｏｌｉｎａｌなどの合成されたプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤が抗健忘作用を示すことが動物試験によって確認されている。また、通常の有機化学的な合成手法を利用してアミノ酸を段階的に導入する方法、天然タンパク質の酵素加水分解方法、加水分解酵素の逆反応を利用したペプチド合成法、遺伝子工学的方法等によって、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤が製造され得ることも開示されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
しかし、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に製造おいて、このような合成方法等を用いることは高度かつ複雑な技術または技能を要することが多く、必ずしも当該阻害剤の汎用性をさらに向上させ得るものということはできない。これに対し、近年では、食品または食品成分由来のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤が開示されている（例えば、特許文献２〜４参照）。
【０００６】
このような従来の食品または食品成分由来のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、汎用性を高めることができ、かつ生体に対する安全性をも向上させることができる。しかし、これらのプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、その阻害活性が未だ充分な状態にまで達しているとは言えず、かつ他の食品または食品成分由来のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤の開発が期待されている。
【０００７】
【特許文献１】特開平５−３３１０７２号公報
【特許文献２】特開平１０−７７３００号公報
【特許文献３】特開２００２−８０４９７号公報
【特許文献４】特開２０００−３２５０４２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記問題の解決を課題とするものであり、その目的とするところは、プロリルエンドペプチダーゼに対して優れた阻害活性を有し、かつ生体に対する安全性が向上した、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、褐藻類こんぶ目こんぶ科のマコンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、褐藻類こんぶ目ちがいそ科のアラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ ｂｉｃｙｃｌｉｓ）、サガラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ ａｒｂｏｒｅａ）、ツルアラメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｓｔｌｏｎｉｆｅｒａ）、クロメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｋｕｒｏｍｅ）、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｃａｖａ）、ワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ）、アオワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｅｔｅｒｓｅｎｉａｎａ）、ヒロメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｕｎｄａｒｉｏｉｄｅｓ）、アイヌワカメ（（Ａｌａｒｉａ ｐｒａｅｌｏｍｇａ）、およびチガイソ（Ａｌａｒｉａ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ）；褐藻類ひばまた目ほんだわら科のホンダワラ（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｆｕｌｕｖｅｌｌｕｍ）、ヒジキ（Ｈｉｚｉｋｉａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ）、およびアカモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｈｏｒｎｅｒｉ）；褐藻類まがまつも目もずく科のモズク（Ｎｅｍａｃｙｓｔｕｓ ｄｅｃｉｐｉｅｕｓ）およびオキナワモズク（Ｃｌａｄｏｓｉｐｈｏｎ ｏｋａｍｕｒａｎｕｓ）；および、紅藻類スギノリ目すぎのり科に属する海藻；からなる群より選択される少なくとも１種の海藻由来の抽出物を有効成分として含有する、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤である。
【００１０】
１つの実施形態では、上記抽出物は、溶媒として水を用いた上記海藻由来の粗抽出物を含有する５０（ｖ／ｖ）％以上のＣ１〜Ｃ３アルコール液の上清から得られた抽出物である。
【００１１】
さらなる実施形態では、上記抽出物は、上記上清の濃縮物を、４０（ｖ／ｖ）％から９０（ｖ／ｖ）％のＣ１〜Ｃ３アルコール水溶液を用いるカラムクロマトグラフィーにかけることにより得られた画分由来の抽出物である。
【００１２】
さらなる実施形態では、上記カラムクロマトグラフィーに用いる吸着剤はスチレン−ジビニルベンゼン系吸着剤である。
【００１３】
本発明はまた、海藻由来の抽出物を有効成分として含有するプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤であって、該抽出物が該抽出物に含まれる固形分の重量を基準としてフロロタンニンを１５重量％以上の割合で含有する、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤である。
【００１４】
本発明はまた、フロロタンニンを有効成分として含有する、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤である。
【００１５】
１つの実施形態では、上記フロロタンニンは海藻由来である。
【００１６】
本発明はまた、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤の製造方法であって、褐藻類こんぶ目こんぶ科のマコンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、褐藻類こんぶ目ちがいそ科のアラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ ｂｉｃｙｃｌｉｓ）、サガラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ ａｒｂｏｒｅａ）、ツルアラメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｓｔｌｏｎｉｆｅｒａ）、クロメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｋｕｒｏｍｅ）、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｃａｖａ）、ワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ）、アオワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｅｔｅｒｓｅｎｉａｎａ）、ヒロメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｕｎｄａｒｉｏｉｄｅｓ）、アイヌワカメ（（Ａｌａｒｉａ ｐｒａｅｌｏｍｇａ）、およびチガイソ（Ａｌａｒｉａ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ）；褐藻類ひばまた目ほんだわら科のホンダワラ（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｆｕｌｕｖｅｌｌｕｍ）、ヒジキ（Ｈｉｚｉｋｉａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ）、およびアカモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｈｏｒｎｅｒｉ）；褐藻類まがまつも目もずく科のモズク（Ｎｅｍａｃｙｓｔｕｓ ｄｅｃｉｐｉｅｕｓ）およびオキナワモズク（Ｃｌａｄｏｓｉｐｈｏｎ ｏｋａｍｕｒａｎｕｓ）；および、紅藻類スギノリ目すぎのり科に属する海藻；からなる群より選択される少なくとも１種の海藻を、６０℃から１００℃の水中で抽出して粗抽出物を得る工程；
該粗抽出物に、Ｃ１〜Ｃ３アルコールまたはＣ１〜Ｃ３アルコール水溶液と合わせて、５０（ｖ／ｖ）％以上の該アルコールを含有するアルコール液を得る工程；ならびに
該アルコール液の上清を分取する工程；
を包含する、方法である。
【００１７】
１つの実施形態では、さらに、上記上清を濃縮して、該上清の濃縮物を得る工程；および該上清の濃縮物を、４０（ｖ／ｖ）％から９０（ｖ／ｖ）％のＣ１〜Ｃ３アルコール水溶液を用いるカラムに通す工程；を包含する。
【００１８】
さらなる実施形態では、上記カラムはスチレン−ジビニルベンゼン系吸着剤を含有する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、プロリルエンドペプチダーゼ活性をより効果的に阻害し得るとともに、生体に対する安全性をも向上させることができる。このため、本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は日常的な使用がより可能となり、食品分野、医薬分野などの分野において汎用性を高めることができる。本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤はまた、アルツハイマー症のような神経細胞疾患性痴呆症、非神経細胞疾患性痴呆症などの脳機能障害に対する予防または治療の目的に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
まず、本発明の第一のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤について説明する。
【００２１】
本発明の第一のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、海藻由来の抽出物を有効成分として含有する。
【００２２】
本発明に用いられる海藻の例としては、褐藻類のこんぶ目こんぶ科、褐藻類こんぶ目ちがいそ科、褐藻類ひばまた目ほんだわら科、褐藻類ながまつも目もずく科、または紅藻類スギノリ目すぎのり科に属する海藻が挙げられる。
【００２３】
上記海藻に包含される、具体的な例としては、褐藻類こんぶ目こんぶ科のマコンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、褐藻類こんぶ目ちがいそ科のアラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ ｂｉｃｙｃｌｉｓ）、サガラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ ａｒｂｏｒｅａ）、ツルアラメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｓｔｌｏｎｉｆｅｒａ）、クロメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｋｕｒｏｍｅ）、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｃａｖａ）、ワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ）、アオワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｅｔｅｒｓｅｎｉａｎａ）、ヒロメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｕｎｄａｒｉｏｉｄｅｓ）、アイヌワカメ（Ａｌａｒｉａ ｐｒａｅｌｏｍｇａ）、およびチガイソ（Ａｌａｒｉａ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ）；褐藻類ひばまた目ほんだわら科のホンダワラ（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｆｕｌｕｖｅｌｌｕｍ）、ヒジキ（Ｈｉｚｉｋｉａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ）、およびアカモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｈｏｒｎｅｒｉ）；褐藻類まがまつも目もずく科のモズク（Ｎｅｍａｃｙｓｔｕｓ ｄｅｃｉｐｉｅｕｓ）およびオキナワモズク（Ｃｌａｄｏｓｉｐｈｏｎ ｏｋａｍｕｒａｎｕｓ）；ならびに紅藻類スギノリ目すぎのり科に属する海藻；が挙げられる。本発明に用いられる海藻としては、特に、海藻自体の生産量が比較的多く入手が容易であり、かつ後述するプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を有する抽出物の画分がより得られ易いという理由から、アラメ、クロメ、ワカメ、ヒジキが好ましい。
【００２４】
本明細書において、海藻とは、これらの海藻の全草自体、あるいは根、茎、および葉を包含する少なくとも一つの部位を包含していう。本発明に用いられる海藻の形態は、未加工のもの、断片、細片または粉末を包含する。さらに、本発明に用いられる海藻は、乾燥物または生の状態のもののいずれをも包含する。
【００２５】
また、本発明において、抽出物とは、上記のような海藻を、水、極性または非極性の溶媒、あるいはこれらの混合物を抽出溶媒として用い適切な条件で抽出された抽出物を意味する。抽出物の形態は特に限定されず、抽出液、あるいは当該抽出液を当業者が通常用いる手段により濃縮または乾燥して得られる粉末またはペースト状物も含まれる。
【００２６】
本発明に用いられる海藻由来の抽出物は、例えば、溶媒として水（好ましくは、熱水）を用い、上述したような種類の海藻由来の粗抽出物を含有するＣ１〜Ｃ３アルコール液の上清から得られたものである。より具体的には、後述するような操作を通じて、上記海藻から粗抽出物を得、次いで、これに、メタノール、エタノールまたはプロパノール、あるいはそれらの組合わせのような、１個〜３個の炭素原子数を有するアルコールまたは当該アルコール水溶液と合わせた、５０％（ｖ／ｖ）％以上、より好ましくは６０（ｖ／ｖ）％以上９８（ｖ／ｖ）％以下のＣ１〜Ｃ３アルコール液から、上清を分取して得ることができる。本発明において、上記上清を得るために調製されるＣ１〜Ｃ３アルコール液の濃度は、このような範囲において、当業者は任意に濃度を設定することができる。すなわち、使用する海藻の種類、使用部位、産地、採取時期、採取後の保存状態等によって、本発明において重要なプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を有する成分含量が変動することがある。また、後述する一連の抽出操作においても、得られる成分含量に誤差が生じることもある。よって、当業者は、このような条件に応じて、上記上清を得るために調製されるＣ１〜Ｃ３アルコール液の濃度をこのような範囲内で任意に設定することができる。このＣ１〜Ｃ３アルコール液を調製するために使用されるアルコールはエタノールであることが好ましい。
【００２７】
本発明の第一のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤において、上記上清は、当該上清に含まれる固形分の重量を基準として、フロロタンニンを好ましくは１５重量％以上、より好ましくは１８重量％〜１００重量％、さらにより好ましくは３０重量％〜９９重量％、さらにより好ましくは６０重量％〜９９重量％、さらにより好ましくは７０重量％〜９９重量％の割合で含有する。ここで、本明細書中に用いられる用語「上清に含まれる固形分の重量」とは、上記上清を構成する液体成分を取除く（例えば、蒸発させる）ことにより、固体成分として残存し得る物質の重量を指して言う。当該上清がこのような範囲内におけるフロロタンニン含量を満足することにより、プロリルエンドペプチダーゼに対する阻害剤としての作用が著しく向上する。なお、本明細書中に用いられる用語「フロロタンニン」とは、一般に海藻タンニンとも呼ばれるポリフェノールの一種であり、フロログルシノールを基本骨格単位とする、フロロタンニン類全体を包含する化合物を指して言う。本発明に用いられ得るフロロタンニンは、１種の当該フロロタンニン類または複数の当該フロロタンニン類でなる混合物のいずれをも包含する。
【００２８】
次に、本発明の第二のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤について説明する。
【００２９】
本発明の第二のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、海藻由来の抽出物を有効成分として含有し、該抽出物が該抽出物に含まれる固形分の重量を基準としてフロロタンニンを１５重量％以上、好ましくは１８重量％〜１００重量％、より好ましくは３０重量％〜９９重量％、さらにより好ましくは６０重量％〜９９重量％、さらにより好ましくは７０重量％〜９９重量％の割合で含有する。ここで、本明細書中に用いられる用語「抽出物に含まれる固形分の重量」とは、上記抽出物を構成する液体成分を取除く（例えば、蒸発させる）ことにより、固体成分として残存し得る物質の重量を指して言う。
【００３０】
本発明の第二のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、海藻中に含まれるフロロタンニンが上記範囲で含有されている。よって、この含有量の範囲を満足する限りにおいて、使用され得る海藻の種類は特に限定されない。本発明の第二のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に含まれる抽出物として使用可能な海藻の例としては、褐藻類または紅藻類に属する海藻が挙げられる。また、これら褐藻類または紅藻類のより具体的な例としては、褐藻類のこんぶ目こんぶ科、褐藻類こんぶ目ちがいそ科、褐藻類ひばまた目ほんだわら科、褐藻類ながまつも目もずく科、または紅藻類スギノリ目すぎのり科に属する海藻が挙げられるが、これらもまた特に限定されない。
【００３１】
本発明の第二のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に用いられ得る海藻のさらに具体的な例としては、上記本発明の第一のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に用いられる海藻と同様のものが包含される。
【００３２】
本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤において、当該阻害剤に用いられる海藻由来の抽出物は、例えば、以下のようにして製造される。
【００３３】
まず、上記海藻を水（好ましくは、熱水）中に所定時間浸漬することにより、粗抽出物が製造される。
【００３４】
この浸漬における当該海藻と水との量比は特に限定されないが、例えば、海藻１００ｇ（乾燥重量）に対して、好ましくは１リットル〜１０リットル、より好ましくは２リットル〜５リットルの水が使用される。
【００３５】
なお、この操作において熱水が使用される場合、当該熱水の温度（抽出温度）は、好ましくは６０℃〜１００℃、より好ましくは８０℃〜１００℃、さらにより好ましくは９０℃〜１００℃である。なお、上記海藻を浸漬している間は、本発明に用いられる有効成分がより抽出し易くする目的で、熱水の温度を低下させることのないよう、当業者に公知の手段を用いて加熱することにより温度を維持することが好ましい。
【００３６】
水中に浸漬する時間（抽出時間）は、使用する抽出温度によって変化するため、必ずしも限定されないが、例えば、溶媒として熱水を用い、その温度をほぼ１００℃に維持する場合、好ましくは１分〜１２０分、より好ましくは１０分〜６０分である。抽出時間をこのような範囲内で行うことにより、本発明に用いられる有効成分がより効率良く抽出され得るとともに、不要物の過度の抽出を防止することができる。
【００３７】
上記浸漬の後、例えば、室温まで放冷され、濾過または遠心分離により海藻が取り除かされる。こうして粗抽出物を得ることができる。なお、得られた粗抽出物は、その後、予め不純物を除去する目的で、ヘキサン、クロロホルムなどの有機溶媒と合わせ、有機層が取り除かれた水層由来のものであってもよい。さらに、得られた粗抽出物は、後述の工程に対し、そのまま用いられてもよく、あるいは必要に応じ、当業者に公知の手段を用いて水分を蒸発させた乾固物またはペースト状物の形態で用いられてもよい。
【００３８】
次いで、当該粗抽出物にＣ１〜Ｃ３アルコールまたはＣ１〜Ｃ３アルコール水溶液が合わされ、好ましくは５０（ｖ／ｖ）％以上、より好ましくは６０（ｖ／ｖ）％〜９８（ｖ／ｖ）％の当該アルコール濃度を有するＣ１〜Ｃ３アルコール液が調製される。なお、調製されるＣ１〜Ｃ３アルコール液の濃度は、このような範囲において、当業者によって任意に設定され得る。
【００３９】
より具体的には、当該粗抽出物を、１個〜３個の炭素原子を有するアルコールまたは所定濃度に調製された１個〜３個の炭素数を有するアルコール水溶液（含水アルコール）と合わすことにより、上記のようなアルコール濃度を有するＣ１〜Ｃ３アルコール液が調製される。このような操作において使用可能な１個〜３個の炭素原子を有するアルコールの例としては、メタノール、エタノールおよびプロパノール、ならびにそれらの組合わせが挙げられる。生体に対する安全性をさらに向上させることを考慮すれば、エタノールを用いることが好ましい。このようなアルコールまたは含水アルコールの使用量は、合わせる粗抽出物の量によって変化するため特に限定されない。
【００４０】
その後、このＣ１〜Ｃ３アルコール液の上清が分取される。
【００４１】
上記アルコール濃度に設定されたアルコール液を調製することにより、当該アルコール液に不溶な物質が沈殿する場合がある。上清の分取は主にこの沈殿物を除去する目的で行われ、上清は当業者に周知の方法（例えば、濾過または遠心分離）によって取り出すことができる。
【００４２】
このようにして本発明に用いられる海藻由来の抽出物を製造することができる。なお、得られた海藻由来の抽出物は、本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を高める目的で精製が行われてもよい。この精製は、例えば、上記で得られた上清を、当業者に周知の手段を用いて濃縮した後、好ましくは４０（ｖ／ｖ）％〜９０（ｖ／ｖ）％、より好ましくは５０（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％のＣ１〜Ｃ３アルコール（好ましくはエタノール）水溶液を用いるカラムに通すことによって行われる。このカラムクロマトグラフィーに有用な吸着剤は、好ましくは芳香族系吸着剤であり、より具体的な例としては、スチレン−ジビニルベンゼン系吸着剤が挙げられる。スチレン−ジビニルベンゼン系吸着剤は、例えば、ダイヤイオンＨＰ２０という商品名で三菱化学（株）より市販されている。なお、本発明においては、β−グルクロニダーゼ阻害活性をさらに高める目的で、上記Ｃ１〜Ｃ３アルコール水溶液を用いる精製を行う前に、上記カラムに対し、水（例えば、蒸留水）を用いて予備的な精製を行うことが好ましい。さらに、この水を用いる予備的な精製は複数回に分けて行うことが好ましい。
【００４３】
上記クロマトグラフィーを行うことにより、さらにプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性が高められた画分を抽出することができる。得られた画分は、本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤としてそのまま使用することができる。
【００４４】
本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、経口による投与または摂取を目的としたもの、あるいは静脈注射または経皮吸収のような非経口による投与を目的としたもののいずれの目的にも使用することができる。
【００４５】
本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤はまた、有効成分である上記海藻由来の抽出物以外に、目的に応じて他の成分を含有していてもよい。本発明に含有され得る他の成分の例としては、水；アルコール；食肉加工品；米、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、スイートポテト、大豆、コンブ、ワカメ、テングサなどの一般食品材料およびそれらの粉末；デンプン、水飴、乳糖、グルコース、果糖、スクロース、マンニトールなどの糖類；香辛料、甘味料、食用油、ビタミン類などの一般的な食品添加物；界面活性剤；賦形剤；着色料；保存料；コーティング助剤；ラクトース；デキストリン；コーンスターチ；ソルビトール；結晶性セルロース；ポリビニルピロリドン；油分；保湿剤；増粘剤；防腐剤；香料；ならびにこれらの組合わせが挙げられる。本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤はさらに、必要に応じて他の薬剤（例えば、漢方薬を包含する）を含有していてもよい。このような他の成分および／または他の薬剤の含有量は、特に限定されず、当業者によって適切な量が選択され得る。
【００４６】
さらに、本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、必ずしもインビボまたはインビトロのいずれに限定されることなく、プロリルエンドペプチダーゼ活性の阻害を必要とする任意の用途において広範に利用され得る。すなわち、本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、特に限定されないが、例えば、健康食品などの食品組成物に添加される添加物の一種として使用されてもよく、家畜または養殖魚などの生産分野に利用される飼料組成物として、そのままあるいは他の飼料用材料と組合わせて使用されてもよく、あるいは医薬品、医薬部外品などの医薬組成物として、そのままあるいは他の医薬組成物と組合わせて使用されてもよい。
【００４７】
本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤が食品組成物として使用される場合、その形態には固定食品に限定されず、飲料（例えば、液体飲料）のようなものを包含される。より具体的な例としては液状、ペースト状、固形状等の形態でなる、茶飲料、コーヒー飲料、清涼飲料、乳飲料、菓子類、シロップ類、果実加工品、野菜加工品、漬物類、畜肉製品、魚肉製品、珍味類、缶・ビン詰類、即席飲食物、内服液、肝油ドロップ、口中清涼剤、ゼリーなどが挙げられるが特にこれらに限定されない。本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤を含有するこのような食品組成物は、当業者に公知の手法を用いて製造され得る。
【００４８】
本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤が医薬組成物として使用される場合、その投与剤形は特に限定されず、日本薬局方に記載の方法にしたがって適切な剤形に加工される。投与剤形のより具体的な例としては、経口投与を目的とする医薬組成物の場合、カプセル剤、錠剤、粉剤、顆粒剤、細粒剤、徐放剤などの剤形が挙げられ、そして非経口投与を目的とする医薬組成物の場合、注射剤、輸液剤などの剤形が挙げられる。用量は、対象となる者の体重等の条件によって容易に変動し得るため、当業者によって適宜選択され得る。
【００４９】
本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、その使用形態に応じて当該分野で通常用いる方法によって製造され、その形態に応じた方法で適宜に適量摂取または適用することができる。
【００５０】
プロリルエンドペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２１．２６）はプロリンに特異性を有し、そのカルボキシル基側でペプチドを切断するセリンプロテアーゼである。上記のように、生体内のバソプレシン量は当該プロリルエンドペプチダーゼの分解によって低減し、痴呆症の発症または進行に関与することが知られている。本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、このようなプロリルエンドペプチダーゼ自体が有する活性を阻害することにより、例えば、バソプレシンの分解を防止することができる。このことにより、本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、痴呆症の予防または治療用途のために利用することができる。
【００５１】
さらに、プロリルエンドペプチダーゼは、例えば、リューマチ性変形関節炎（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００１年，第２巻，第２８３号，ｐｐ．３３４−３３９）および遅延型アレルギー性炎症病巣（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００４年，第１巻，第３１６号，ｐｐ．７８−８４）に罹患した人の細胞中で上昇することが報告されている。また、腸内細菌などの人の粘膜上に生息する微生物は、プロリルエンドペプチダーゼを多量に産生し、人粘膜抗体ＩｇＡを分解し、その免疫能力を無効にしていることが報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００２年，第１４巻，第２７７号，ｐｐ．１１９８７−１１９９４）。本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、プロリルエンドペプチダーゼ活性を阻害することにより、このような疾患の予防または治療、当該微生物の増殖抑制、または当該微生物のプロリルエンドペプチダーゼ活性の抑制に利用することもできる。
【実施例】
【００５２】
以下、本発明を実施例によって具体的に記述する。しかし、これらによって本発明は制限されるものではない。
【００５３】
＜実施例１：アラメを用いた海藻熱水抽出物および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物の製造＞
凍結乾燥した１０ｇのアラメをミキサーにかけ、乾燥粉末を調製した。この乾燥粉末４ｇに８０ｍｌの蒸留水を添加し、１００℃にて１０分間加熱して抽出を行った。次いで、抽出残渣を濾過にて取除いて得た、熱水抽出画分２０ｍｌを凍結乾燥して海藻熱水抽出物（Ａ１）を得た。他方、２０ｍｌの上記熱水抽出画分を別に取り、これに同量のエタノールを添加し、生じた沈殿を濾過により取除くことにより、５０％エタノール可溶化画分を得た。得られた５０％エタノール可溶化画分を減圧下にて濃縮し、残渣を２０ｍｌの蒸留水に溶解した後、凍結乾燥して海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物（Ｂ１）を得た。
【００５４】
＜実施例２：ワカメメカブを用いた海藻熱水抽出物および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物の製造＞
凍結乾燥したアラメの代わりに、凍結乾燥した１０ｇのワカメメカブを用いたこと以外は実施例１と同様にして熱水抽出画分を得、かつ当該熱水抽出画分から実施例１とそれぞれ同様にして、海藻熱水抽出物（Ａ２）および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物（Ｂ２）を得た。
【００５５】
＜実施例３：ヒジキを用いた海藻熱水抽出物および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物の製造＞
凍結乾燥したアラメの代わりに、凍結乾燥した１０ｇのヒジキを用いたこと以外は実施例１と同様にして熱水抽出画分を得、かつ当該熱水抽出画分から実施例１とそれぞれ同様にして、海藻熱水抽出物（Ａ３）および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物（Ｂ３）を得た。
【００５６】
＜実施例４：アカモクを用いた海藻熱水抽出物および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物の製造＞
凍結乾燥したアラメの代わりに、凍結乾燥した１０ｇのアカモクを用いたこと以外は実施例１と同様にして熱水抽出画分を得、かつ当該熱水抽出画分から実施例１とそれぞれ同様にして、海藻熱水抽出物（Ａ４）および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物（Ｂ４）を得た。
【００５７】
＜実施例５：オキナワモズクを用いた海藻熱水抽出物および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物の製造＞
凍結乾燥したアラメの代わりに、凍結乾燥した１０ｇのオキナワモズクを用いたこと以外は実施例１と同様にして熱水抽出画分を得、かつ当該熱水抽出画分から実施例１とそれぞれ同様にして、海藻熱水抽出物（Ａ５）および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物（Ｂ５）を得た。
【００５８】
＜実施例６：ホンダワラを用いた海藻熱水抽出物および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物の製造＞
凍結乾燥したアラメの代わりに、凍結乾燥した１０ｇのホンダワラを用いたこと以外は実施例１と同様にして熱水抽出画分を得、かつ当該熱水抽出画分から実施例１とそれぞれ同様にして、海藻熱水抽出物（Ａ６）および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物（Ｂ６）を得た。
【００５９】
＜実施例７：スギノリを用いた海藻熱水抽出物および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物の製造＞
凍結乾燥したアラメの代わりに、凍結乾燥した１０ｇのスギノリを用いたこと以外は実施例１と同様にして熱水抽出画分を得、かつ当該熱水抽出画分から実施例１とそれぞれ同様にして、海藻熱水抽出物（Ａ７）および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物（Ｂ７）を得た。
【００６０】
＜実施例８：プロリルエンドペプチダーゼ阻害活性の測定１＞
Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ（ＢＡＣＨＥＭ社製）を４０％のジオキサン／０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、２ｍＭのＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ溶液を調製した。他方、プロリルエンドペプチダーゼ（フラボバクテリウム由来／生化学工業（株）製）を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、０．２５ユニット／ｍｌのプロリルエンドペプチダーゼ溶液を調製した。さらに、実施例１〜７で得られた海藻熱水抽出物（Ａ１）〜（Ａ７）および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物（Ｂ１）〜（Ｂ７）を１０ｍｇづつ量りとり、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、１０ｍｇ／ｍｌのサンプル溶液をそれぞれ調製した。得られたサンプル溶液について、海藻熱水抽出物（Ａ１）〜（Ａ７）および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物（Ｂ１）〜（Ｂ７）の最終濃度が８００μｇ／ｍｌとなるように、それぞれ必要に応じて適量の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、評価サンプル溶液とした。
【００６１】
０．４５ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．０５ｍｌの評価サンプル溶液（ただし、コントロールの場合は０．０５ｍＬの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を代用した）、および０．５ｍｌのＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ溶液（２ｍＭ）を試験管に入れ、３７℃で予め加温した。これに、０．２５ｍｌの０．２５ユニット／ｍｌプロリルエンドペプチダーゼ溶液（ただし、ブランクの場合は０．２５ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を代用した）を添加した反応液をそれぞれ調製し、３７℃にて２０分間かけて酵素反応を行った。その後、０．５ｍｌの１Ｎ塩酸で反応を停止し、各反応液における波長４０５ｎｍの吸光度を分光光度計にて測定した。コントロールの吸光度Ａｃ、反応停止後の評価サンプル溶液の吸光度Ａｓとして、ならびに対応するそれぞれのブランクの吸光度をＡｃｂおよびＡｓｂとして、下記式にてプロリルエンドペプチダーゼ阻害率（％）を算出した：
【００６２】
【数１】
【００６３】
実施例１〜７で得られた海藻熱水抽出物（Ａ１）〜（Ａ７）および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物（Ｂ１）〜（Ｂ７）に対する上記プロリルエンドペプチダーゼ阻害率（％）を表１および表２に示す。
【００６４】
【表１】
【００６５】
【表２】
【００６６】
表１および表２に示されるように、 実施例１〜７で得られた海藻熱水抽出物（Ａ１）〜（Ａ７）および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物（Ｂ１）〜（Ｂ７）はいずれも、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤としての優れたプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を有していることがわかる。
【００６７】
＜実施例９：アラメ画分の製造＞
凍結乾燥した１００ｇのアラメをミキサーにかけ、乾燥粉末を調製した。これに、２Ｌの蒸留水を添加し、１００℃にて１０分間加熱して抽出を行い、抽出残渣を濾過にて取除いて、熱水粗抽出物（７００ｍｌ）を得、これにエタノールを添加して９０（ｖ／ｖ）％のエタノール液に調製した。
【００６８】
その後、得られたエタノール液を濾過して上清のみを取出した。次いで、この上清を減圧濃縮して、３５０ｍｌのエタノール可溶画分を得た。このエタノール可溶画分を３５０ｍｌのクロロホルムと合わせ分液抽出して得られた水層のうち、５０ｍｌをスチレン−ジビニルベンゼン吸着剤（三菱化学（株）製ダイヤイオンＨＰ２０）を含有するカラム（φ３．８ｃｍ×３０ｃｍ）に充填し、溶出液として、（Ｆ１）蒸留水（５００ｍｌ）、（Ｆ２）蒸留水（５００ｍＬ）、（Ｆ３）３０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液（５００ｍｌ）、（Ｆ４）６０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液（５００ｍｌ）、および（Ｆ５）１００（ｖ／ｖ）％エタノール（５００ｍｌ）を用いて順次溶出し、粗画分（Ｆ１）、（Ｆ２）、（Ｆ３）、（Ｆ４）および（Ｆ５）をそれぞれ５００ｍｌ分割収集した。次いで、粗画分（Ｆ１）、（Ｆ２）、（Ｆ３）、（Ｆ４）および（Ｆ５）の溶媒をそれぞれ減圧下にて留去した後、再度４０ｍｌの蒸留水に溶解または再懸濁して凍結乾燥し、アラメ画分（Ｆ１）、（Ｆ２）、（Ｆ３）、（Ｆ４）および（Ｆ５）をそれぞれ得た。
【００６９】
＜実施例１０：プロリルエンドペプチダーゼ阻害活性の測定２＞
Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ（ＢＡＣＨＥＭ社製）を４０％のジオキサン／０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、２ｍＭのＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ溶液を調製した。他方、プロリルエンドペプチダーゼ（フラボバクテリウム由来／生化学工業（株）製）を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、０．２５ユニット／ｍｌのプロリルエンドペプチダーゼ溶液を調製した。さらに、実施例９で得られたアラメ画分（Ｆ１）、（Ｆ２）、（Ｆ３）、（Ｆ４）および（Ｆ５）を１０ｍｇづつ量りとり、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、１０ｍｇ／ｍｌのサンプル溶液をそれぞれ調製した。得られたサンプル溶液について、アラメ画分（Ｆ１）、（Ｆ２）、（Ｆ３）、（Ｆ４）および（Ｆ５）の最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるように、それぞれ必要に応じて適量の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、評価サンプル溶液とした。
【００７０】
得られた各評価サンプル溶液について、実施例８と同様にして当該評価サンプル溶液の阻害率（％）を算出した。得られた阻害率の結果を表３に示す。
【００７１】
【表３】
【００７２】
表３に示されるように、実施例９で得られたアラメ画分（Ｆ１）、（Ｆ２）、（Ｆ３）、（Ｆ４）および（Ｆ５）はいずれも、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤として使用可能なプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を有していることがわかる。特に、エタノールまたはその水溶液で溶出して得たアラメ画分（Ｆ３）、（Ｆ４）および（Ｆ５）は優れたプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を有し、特に６０（ｖ／ｖ）％付近のエタノール水溶液においてその阻害率（％）が著しく向上することがわかる。
【００７３】
さらに、上記アラメ画分（Ｆ４）を用いて調製した評価サンプル液を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、１／２段階希釈を行って複数のサンプル液を調製し、これら複数のサンプル液のそれぞれについて、上記と同様にして阻害率（％）を算出した。その後、プロリルエンドペプチダーゼの５０％阻害率を達成する濃度（ＩＣ５０）を求めた。得られたＩＣ５０値は、２８０ｎｇ／ｍｌであった。
【００７４】
＜実施例１１：フロロタンニンの定量＞
実施例９で得られたアラメ画分（Ｆ４）１００ｍｇを正確に量りとり、当該画分の総フロロタンニン量を、フロログルシノールを標準物質として用いるＦｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ法（日本食品科学工学会誌，２００２年，第４９巻，ｐｐ．５０７−５１１）により測定した。得られたそれぞれの総フロロタンニン量は、８９．４％であった。このことから、実施例１０において最もプロリルエンドペプチダーゼ阻害率が高い値を示した当該アラメ画分（Ｆ４）には、高濃度のフロロタンニンが含有されていることが見出された。
【００７５】
＜実施例１２：アラメ抽出物の７日間反復投与による抗健忘作用＞
アラメ抽出物の７日間反復投与による抗健忘作用を確認するために、実施例１で得られた海藻（アラメ）熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物（Ｂ１）を使用した。
【００７６】
抗健忘作用の測定を、１試行ステップ−スルー（ｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ）受動的回避実験法にしたがって、以下のように実施した。
【００７７】
５週齢のマウスを検討開始日の体重を指標にして、層別無作為化法にて各群の平均体重が等しくなるよう１０匹を１群として、Ｇ１群およびＧ２群の合計２群に群分けした。群分け後、Ｇ１群のマウス（コントロール）には、被験物質として１％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）水溶液を体重１０ｇあたり０．３ｍｌの割合にて、１日あたり１回経口投与し、これを７日間継続した。他方、Ｇ２群のマウスには、被験物質として実施例１で得られた海藻（アラメ）熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物（本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤）を１０ｍｇ／ｍｌの割合で含有する１％ＣＭＣ水溶液を体重１０ｇあたり０．３ｍｌの割合にて、１日あたり１回経口投与し、これを７日間継続した。
【００７８】
その後、０．０５ｍｇ／ｍｌのスコポラミン（ＳＣＯＰ）水溶液を、体重１０ｇあたり０．１ｍｌの割合で、Ｇ１群およびＧ２群の各マウスに対し、被験物質の最終投与の６０分後にそれぞれ腹腔内投与した。
【００７９】
ＳＣＯＰを投与して３０分間が経過した後、Ｇ１群およびＧ２群の各マウスについて、まず、照度４８０ルクスの蛍光灯照明下にて、以下の獲得試行を行った：すなわち、暗室側の床グリッドにショックジェネレータスクランブラー（ＮＳ−ＳＧ０１、（株）ニューロサイエンス製）を用いて１ｍＡのスクランブル電撃を与え続けた状態にある、マウス用明暗分別測定装置（（株）ニューロサイエンス製）の明室側に、当該マウスを１匹ずつ収容した。収容後から各マウスが暗室に入るまでの時間（潜時）を、デジタルストップウォッチ（ＳＯ５１、セイコー（株）製）で測定した（なお、この獲得試行における潜時の測定は最大３００秒までとし、暗室の移動がそれ以上の時間となったものについては測定を行わなかった）。Ｇ１群のマウスおよびＧ２群のマウスについて、当該獲得試行において得られた潜時の平均値を比較したところ、両者に優位な差は見出されなかった。本能的に暗室に移動したマウスは、いずれも暗室の床グリッドに与えられたスクランブル電撃に応答し、明室に再び移動したことを確認した。
【００８０】
次いで、上記獲得試行を行ったＧ１群およびＧ２群の各マウスについて、照度４８０ルクスの蛍光灯照明下にて、以下の保持試行を行った：すなわち、上記獲得試行を行ったマウスを、当該獲得試行から２４時間経過後、上記マウス用明暗分別測定装置の明室側に１匹ずつ収容し、収容後から当該マウスが暗室に入るまでの時間（潜時：秒）を上記と同様にして測定した（なお、この保持試行における潜時の測定は最大３００秒までとし、暗室の移動がそれ以上の時間となったものについては測定を行わなかった）。Ｇ１群のマウスおよびＧ２群のマウスについて、当該保持試行において得られた潜時の平均値を算出した。得られた結果を図１に示す。
【００８１】
図１に示されるように、コントロールであるＧ１群のマウスと比較して、実施例１で得られた海藻（アラメ）熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物を投与したＧ２群のマウスは、保持試行における潜時が著しく上昇していたことがわかる。このことから、本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、生体内における抗健忘作用に有効であることがわかる。
【００８２】
＜実施例１３：食品組成物の調製＞
上記実施例９で得られたアラメ画分（Ｆ４）を用いて、以下の組成を有する食品組成物を調製した。
【００８３】
成分 重量（ｇ）
アラメ画分（Ｆ４） ０．６
大豆サポニン ２．０
黒酢エキス ２．０
リンゴファイバー ２．０
レシチン １．０
フラクトオリゴ糖 ２．０
果糖 １．０
粉末酢 ０．１
シクロデキストリン １．０
蜂蜜 １．０
骨粉 １．０
デキストリン ４．９。
【００８４】
各成分を流動造粒機中で混合した後、水を噴霧して造粒を行い、入風温度８０℃で乾燥して、顆粒状食品を得た。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、食品として用いられ得る海藻の抽出物を有効成分として使用するため、安全性が高く、日常的な使用が可能であり、食品、医薬品などに利用され得る。本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤はまた、プロリルエンドペプチダーゼ活性を阻害することにより、生体内のバソプレシンの分解を防止することができ、その結果、アルツハイマー型痴呆のような健忘症に対する予防または治療の目的に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】実施例１２の１試行ステップ−スルー受動的回避実験法で得られた、Ｇ１群のマウス（コントロール）とＧ２群のマウス（海藻（アラメ）熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物を投与）との保持試行における潜時の平均値を示す、グラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に関し、より詳細には、生体に対する安全性が向上したプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロリルエンドペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２１．２６）はペプチド鎖中のプロリン残基におけるカルボキシル基側のペプチド結合を特異的に認識し、切断するペプチダーゼである。プロリルエンドペプチダーゼは、記憶の固定場所とされている脳の海馬部分にて高い酵素活性にて存在し、かつ動物臓器に広く分布することが知られている。また、同様の酵素は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌からも発見されている。
【０００３】
プロリルエンドペプチダーゼは、神経伝達物質であると言われるサブスタンスＰおよびニューロテンシン、記憶に関係していると考えられているＴＨＲ（甲状腺刺激ホルモン）、ならびにステップスルー型受動的回避学習法で記憶保持活性を有すると言われる脳内バソプレシンに作用し、これらを不活性化させることが知られている。バソプレシンは腎臓で水分再吸収に働くペプチドホルモンであるが、脳内においては学習および記憶の過程にも関与しており、このホルモンが分解され、不活性化されると記憶保持に障害が現れると言われている。また、痴呆患者のバソプレシン量は、正常人のものよりも少ないことが知られている。近年、このようなプロリルエンドペプチダーゼの活性を阻害することにより、痴呆症を予防または治療するための研究が行われている。
【０００４】
従来では、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＣＨ２Ｃｌ、Ｚ−Ｐｒｏ−ｐｒｏｌｉｎａｌ、Ｚ−Ｖａｌ−ｐｒｏｌｉｎａｌ、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ｐｒｏｌｉｎａｌなどの合成されたプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤が抗健忘作用を示すことが動物試験によって確認されている。また、通常の有機化学的な合成手法を利用してアミノ酸を段階的に導入する方法、天然タンパク質の酵素加水分解方法、加水分解酵素の逆反応を利用したペプチド合成法、遺伝子工学的方法等によって、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤が製造され得ることも開示されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
しかし、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に製造おいて、このような合成方法等を用いることは高度かつ複雑な技術または技能を要することが多く、必ずしも当該阻害剤の汎用性をさらに向上させ得るものということはできない。これに対し、近年では、食品または食品成分由来のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤が開示されている（例えば、特許文献２〜４参照）。
【０００６】
このような従来の食品または食品成分由来のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、汎用性を高めることができ、かつ生体に対する安全性をも向上させることができる。しかし、これらのプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、その阻害活性が未だ充分な状態にまで達しているとは言えず、かつ他の食品または食品成分由来のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤の開発が期待されている。
【０００７】
【特許文献１】特開平５−３３１０７２号公報
【特許文献２】特開平１０−７７３００号公報
【特許文献３】特開２００２−８０４９７号公報
【特許文献４】特開２０００−３２５０４２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記問題の解決を課題とするものであり、その目的とするところは、プロリルエンドペプチダーゼに対して優れた阻害活性を有し、かつ生体に対する安全性が向上した、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、褐藻類こんぶ目こんぶ科のマコンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、褐藻類こんぶ目ちがいそ科のアラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ ｂｉｃｙｃｌｉｓ）、サガラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ ａｒｂｏｒｅａ）、ツルアラメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｓｔｌｏｎｉｆｅｒａ）、クロメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｋｕｒｏｍｅ）、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｃａｖａ）、ワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ）、アオワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｅｔｅｒｓｅｎｉａｎａ）、ヒロメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｕｎｄａｒｉｏｉｄｅｓ）、アイヌワカメ（（Ａｌａｒｉａ ｐｒａｅｌｏｍｇａ）、およびチガイソ（Ａｌａｒｉａ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ）；褐藻類ひばまた目ほんだわら科のホンダワラ（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｆｕｌｕｖｅｌｌｕｍ）、ヒジキ（Ｈｉｚｉｋｉａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ）、およびアカモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｈｏｒｎｅｒｉ）；褐藻類まがまつも目もずく科のモズク（Ｎｅｍａｃｙｓｔｕｓ ｄｅｃｉｐｉｅｕｓ）およびオキナワモズク（Ｃｌａｄｏｓｉｐｈｏｎ ｏｋａｍｕｒａｎｕｓ）；および、紅藻類スギノリ目すぎのり科に属する海藻；からなる群より選択される少なくとも１種の海藻由来の抽出物を有効成分として含有する、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤である。
【００１０】
１つの実施形態では、上記抽出物は、溶媒として水を用いた上記海藻由来の粗抽出物を含有する５０（ｖ／ｖ）％以上のＣ１〜Ｃ３アルコール液の上清から得られた抽出物である。
【００１１】
さらなる実施形態では、上記抽出物は、上記上清の濃縮物を、４０（ｖ／ｖ）％から９０（ｖ／ｖ）％のＣ１〜Ｃ３アルコール水溶液を用いるカラムクロマトグラフィーにかけることにより得られた画分由来の抽出物である。
【００１２】
さらなる実施形態では、上記カラムクロマトグラフィーに用いる吸着剤はスチレン−ジビニルベンゼン系吸着剤である。
【００１３】
本発明はまた、海藻由来の抽出物を有効成分として含有するプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤であって、該抽出物が該抽出物に含まれる固形分の重量を基準としてフロロタンニンを１５重量％以上の割合で含有する、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤である。
【００１４】
本発明はまた、フロロタンニンを有効成分として含有する、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤である。
【００１５】
１つの実施形態では、上記フロロタンニンは海藻由来である。
【００１６】
本発明はまた、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤の製造方法であって、褐藻類こんぶ目こんぶ科のマコンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、褐藻類こんぶ目ちがいそ科のアラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ ｂｉｃｙｃｌｉｓ）、サガラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ ａｒｂｏｒｅａ）、ツルアラメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｓｔｌｏｎｉｆｅｒａ）、クロメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｋｕｒｏｍｅ）、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｃａｖａ）、ワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ）、アオワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｅｔｅｒｓｅｎｉａｎａ）、ヒロメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｕｎｄａｒｉｏｉｄｅｓ）、アイヌワカメ（（Ａｌａｒｉａ ｐｒａｅｌｏｍｇａ）、およびチガイソ（Ａｌａｒｉａ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ）；褐藻類ひばまた目ほんだわら科のホンダワラ（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｆｕｌｕｖｅｌｌｕｍ）、ヒジキ（Ｈｉｚｉｋｉａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ）、およびアカモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｈｏｒｎｅｒｉ）；褐藻類まがまつも目もずく科のモズク（Ｎｅｍａｃｙｓｔｕｓ ｄｅｃｉｐｉｅｕｓ）およびオキナワモズク（Ｃｌａｄｏｓｉｐｈｏｎ ｏｋａｍｕｒａｎｕｓ）；および、紅藻類スギノリ目すぎのり科に属する海藻；からなる群より選択される少なくとも１種の海藻を、６０℃から１００℃の水中で抽出して粗抽出物を得る工程；
該粗抽出物に、Ｃ１〜Ｃ３アルコールまたはＣ１〜Ｃ３アルコール水溶液と合わせて、５０（ｖ／ｖ）％以上の該アルコールを含有するアルコール液を得る工程；ならびに
該アルコール液の上清を分取する工程；
を包含する、方法である。
【００１７】
１つの実施形態では、さらに、上記上清を濃縮して、該上清の濃縮物を得る工程；および該上清の濃縮物を、４０（ｖ／ｖ）％から９０（ｖ／ｖ）％のＣ１〜Ｃ３アルコール水溶液を用いるカラムに通す工程；を包含する。
【００１８】
さらなる実施形態では、上記カラムはスチレン−ジビニルベンゼン系吸着剤を含有する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、プロリルエンドペプチダーゼ活性をより効果的に阻害し得るとともに、生体に対する安全性をも向上させることができる。このため、本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は日常的な使用がより可能となり、食品分野、医薬分野などの分野において汎用性を高めることができる。本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤はまた、アルツハイマー症のような神経細胞疾患性痴呆症、非神経細胞疾患性痴呆症などの脳機能障害に対する予防または治療の目的に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
まず、本発明の第一のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤について説明する。
【００２１】
本発明の第一のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、海藻由来の抽出物を有効成分として含有する。
【００２２】
本発明に用いられる海藻の例としては、褐藻類のこんぶ目こんぶ科、褐藻類こんぶ目ちがいそ科、褐藻類ひばまた目ほんだわら科、褐藻類ながまつも目もずく科、または紅藻類スギノリ目すぎのり科に属する海藻が挙げられる。
【００２３】
上記海藻に包含される、具体的な例としては、褐藻類こんぶ目こんぶ科のマコンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、褐藻類こんぶ目ちがいそ科のアラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ ｂｉｃｙｃｌｉｓ）、サガラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ ａｒｂｏｒｅａ）、ツルアラメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｓｔｌｏｎｉｆｅｒａ）、クロメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｋｕｒｏｍｅ）、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｃａｖａ）、ワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ）、アオワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｅｔｅｒｓｅｎｉａｎａ）、ヒロメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｕｎｄａｒｉｏｉｄｅｓ）、アイヌワカメ（Ａｌａｒｉａ ｐｒａｅｌｏｍｇａ）、およびチガイソ（Ａｌａｒｉａ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ）；褐藻類ひばまた目ほんだわら科のホンダワラ（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｆｕｌｕｖｅｌｌｕｍ）、ヒジキ（Ｈｉｚｉｋｉａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ）、およびアカモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｈｏｒｎｅｒｉ）；褐藻類まがまつも目もずく科のモズク（Ｎｅｍａｃｙｓｔｕｓ ｄｅｃｉｐｉｅｕｓ）およびオキナワモズク（Ｃｌａｄｏｓｉｐｈｏｎ ｏｋａｍｕｒａｎｕｓ）；ならびに紅藻類スギノリ目すぎのり科に属する海藻；が挙げられる。本発明に用いられる海藻としては、特に、海藻自体の生産量が比較的多く入手が容易であり、かつ後述するプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を有する抽出物の画分がより得られ易いという理由から、アラメ、クロメ、ワカメ、ヒジキが好ましい。
【００２４】
本明細書において、海藻とは、これらの海藻の全草自体、あるいは根、茎、および葉を包含する少なくとも一つの部位を包含していう。本発明に用いられる海藻の形態は、未加工のもの、断片、細片または粉末を包含する。さらに、本発明に用いられる海藻は、乾燥物または生の状態のもののいずれをも包含する。
【００２５】
また、本発明において、抽出物とは、上記のような海藻を、水、極性または非極性の溶媒、あるいはこれらの混合物を抽出溶媒として用い適切な条件で抽出された抽出物を意味する。抽出物の形態は特に限定されず、抽出液、あるいは当該抽出液を当業者が通常用いる手段により濃縮または乾燥して得られる粉末またはペースト状物も含まれる。
【００２６】
本発明に用いられる海藻由来の抽出物は、例えば、溶媒として水（好ましくは、熱水）を用い、上述したような種類の海藻由来の粗抽出物を含有するＣ１〜Ｃ３アルコール液の上清から得られたものである。より具体的には、後述するような操作を通じて、上記海藻から粗抽出物を得、次いで、これに、メタノール、エタノールまたはプロパノール、あるいはそれらの組合わせのような、１個〜３個の炭素原子数を有するアルコールまたは当該アルコール水溶液と合わせた、５０％（ｖ／ｖ）％以上、より好ましくは６０（ｖ／ｖ）％以上９８（ｖ／ｖ）％以下のＣ１〜Ｃ３アルコール液から、上清を分取して得ることができる。本発明において、上記上清を得るために調製されるＣ１〜Ｃ３アルコール液の濃度は、このような範囲において、当業者は任意に濃度を設定することができる。すなわち、使用する海藻の種類、使用部位、産地、採取時期、採取後の保存状態等によって、本発明において重要なプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を有する成分含量が変動することがある。また、後述する一連の抽出操作においても、得られる成分含量に誤差が生じることもある。よって、当業者は、このような条件に応じて、上記上清を得るために調製されるＣ１〜Ｃ３アルコール液の濃度をこのような範囲内で任意に設定することができる。このＣ１〜Ｃ３アルコール液を調製するために使用されるアルコールはエタノールであることが好ましい。
【００２７】
本発明の第一のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤において、上記上清は、当該上清に含まれる固形分の重量を基準として、フロロタンニンを好ましくは１５重量％以上、より好ましくは１８重量％〜１００重量％、さらにより好ましくは３０重量％〜９９重量％、さらにより好ましくは６０重量％〜９９重量％、さらにより好ましくは７０重量％〜９９重量％の割合で含有する。ここで、本明細書中に用いられる用語「上清に含まれる固形分の重量」とは、上記上清を構成する液体成分を取除く（例えば、蒸発させる）ことにより、固体成分として残存し得る物質の重量を指して言う。当該上清がこのような範囲内におけるフロロタンニン含量を満足することにより、プロリルエンドペプチダーゼに対する阻害剤としての作用が著しく向上する。なお、本明細書中に用いられる用語「フロロタンニン」とは、一般に海藻タンニンとも呼ばれるポリフェノールの一種であり、フロログルシノールを基本骨格単位とする、フロロタンニン類全体を包含する化合物を指して言う。本発明に用いられ得るフロロタンニンは、１種の当該フロロタンニン類または複数の当該フロロタンニン類でなる混合物のいずれをも包含する。
【００２８】
次に、本発明の第二のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤について説明する。
【００２９】
本発明の第二のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、海藻由来の抽出物を有効成分として含有し、該抽出物が該抽出物に含まれる固形分の重量を基準としてフロロタンニンを１５重量％以上、好ましくは１８重量％〜１００重量％、より好ましくは３０重量％〜９９重量％、さらにより好ましくは６０重量％〜９９重量％、さらにより好ましくは７０重量％〜９９重量％の割合で含有する。ここで、本明細書中に用いられる用語「抽出物に含まれる固形分の重量」とは、上記抽出物を構成する液体成分を取除く（例えば、蒸発させる）ことにより、固体成分として残存し得る物質の重量を指して言う。
【００３０】
本発明の第二のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、海藻中に含まれるフロロタンニンが上記範囲で含有されている。よって、この含有量の範囲を満足する限りにおいて、使用され得る海藻の種類は特に限定されない。本発明の第二のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に含まれる抽出物として使用可能な海藻の例としては、褐藻類または紅藻類に属する海藻が挙げられる。また、これら褐藻類または紅藻類のより具体的な例としては、褐藻類のこんぶ目こんぶ科、褐藻類こんぶ目ちがいそ科、褐藻類ひばまた目ほんだわら科、褐藻類ながまつも目もずく科、または紅藻類スギノリ目すぎのり科に属する海藻が挙げられるが、これらもまた特に限定されない。
【００３１】
本発明の第二のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に用いられ得る海藻のさらに具体的な例としては、上記本発明の第一のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に用いられる海藻と同様のものが包含される。
【００３２】
本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤において、当該阻害剤に用いられる海藻由来の抽出物は、例えば、以下のようにして製造される。
【００３３】
まず、上記海藻を水（好ましくは、熱水）中に所定時間浸漬することにより、粗抽出物が製造される。
【００３４】
この浸漬における当該海藻と水との量比は特に限定されないが、例えば、海藻１００ｇ（乾燥重量）に対して、好ましくは１リットル〜１０リットル、より好ましくは２リットル〜５リットルの水が使用される。
【００３５】
なお、この操作において熱水が使用される場合、当該熱水の温度（抽出温度）は、好ましくは６０℃〜１００℃、より好ましくは８０℃〜１００℃、さらにより好ましくは９０℃〜１００℃である。なお、上記海藻を浸漬している間は、本発明に用いられる有効成分がより抽出し易くする目的で、熱水の温度を低下させることのないよう、当業者に公知の手段を用いて加熱することにより温度を維持することが好ましい。
【００３６】
水中に浸漬する時間（抽出時間）は、使用する抽出温度によって変化するため、必ずしも限定されないが、例えば、溶媒として熱水を用い、その温度をほぼ１００℃に維持する場合、好ましくは１分〜１２０分、より好ましくは１０分〜６０分である。抽出時間をこのような範囲内で行うことにより、本発明に用いられる有効成分がより効率良く抽出され得るとともに、不要物の過度の抽出を防止することができる。
【００３７】
上記浸漬の後、例えば、室温まで放冷され、濾過または遠心分離により海藻が取り除かされる。こうして粗抽出物を得ることができる。なお、得られた粗抽出物は、その後、予め不純物を除去する目的で、ヘキサン、クロロホルムなどの有機溶媒と合わせ、有機層が取り除かれた水層由来のものであってもよい。さらに、得られた粗抽出物は、後述の工程に対し、そのまま用いられてもよく、あるいは必要に応じ、当業者に公知の手段を用いて水分を蒸発させた乾固物またはペースト状物の形態で用いられてもよい。
【００３８】
次いで、当該粗抽出物にＣ１〜Ｃ３アルコールまたはＣ１〜Ｃ３アルコール水溶液が合わされ、好ましくは５０（ｖ／ｖ）％以上、より好ましくは６０（ｖ／ｖ）％〜９８（ｖ／ｖ）％の当該アルコール濃度を有するＣ１〜Ｃ３アルコール液が調製される。なお、調製されるＣ１〜Ｃ３アルコール液の濃度は、このような範囲において、当業者によって任意に設定され得る。
【００３９】
より具体的には、当該粗抽出物を、１個〜３個の炭素原子を有するアルコールまたは所定濃度に調製された１個〜３個の炭素数を有するアルコール水溶液（含水アルコール）と合わすことにより、上記のようなアルコール濃度を有するＣ１〜Ｃ３アルコール液が調製される。このような操作において使用可能な１個〜３個の炭素原子を有するアルコールの例としては、メタノール、エタノールおよびプロパノール、ならびにそれらの組合わせが挙げられる。生体に対する安全性をさらに向上させることを考慮すれば、エタノールを用いることが好ましい。このようなアルコールまたは含水アルコールの使用量は、合わせる粗抽出物の量によって変化するため特に限定されない。
【００４０】
その後、このＣ１〜Ｃ３アルコール液の上清が分取される。
【００４１】
上記アルコール濃度に設定されたアルコール液を調製することにより、当該アルコール液に不溶な物質が沈殿する場合がある。上清の分取は主にこの沈殿物を除去する目的で行われ、上清は当業者に周知の方法（例えば、濾過または遠心分離）によって取り出すことができる。
【００４２】
このようにして本発明に用いられる海藻由来の抽出物を製造することができる。なお、得られた海藻由来の抽出物は、本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を高める目的で精製が行われてもよい。この精製は、例えば、上記で得られた上清を、当業者に周知の手段を用いて濃縮した後、好ましくは４０（ｖ／ｖ）％〜９０（ｖ／ｖ）％、より好ましくは５０（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％のＣ１〜Ｃ３アルコール（好ましくはエタノール）水溶液を用いるカラムに通すことによって行われる。このカラムクロマトグラフィーに有用な吸着剤は、好ましくは芳香族系吸着剤であり、より具体的な例としては、スチレン−ジビニルベンゼン系吸着剤が挙げられる。スチレン−ジビニルベンゼン系吸着剤は、例えば、ダイヤイオンＨＰ２０という商品名で三菱化学（株）より市販されている。なお、本発明においては、β−グルクロニダーゼ阻害活性をさらに高める目的で、上記Ｃ１〜Ｃ３アルコール水溶液を用いる精製を行う前に、上記カラムに対し、水（例えば、蒸留水）を用いて予備的な精製を行うことが好ましい。さらに、この水を用いる予備的な精製は複数回に分けて行うことが好ましい。
【００４３】
上記クロマトグラフィーを行うことにより、さらにプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性が高められた画分を抽出することができる。得られた画分は、本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤としてそのまま使用することができる。
【００４４】
本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、経口による投与または摂取を目的としたもの、あるいは静脈注射または経皮吸収のような非経口による投与を目的としたもののいずれの目的にも使用することができる。
【００４５】
本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤はまた、有効成分である上記海藻由来の抽出物以外に、目的に応じて他の成分を含有していてもよい。本発明に含有され得る他の成分の例としては、水；アルコール；食肉加工品；米、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、スイートポテト、大豆、コンブ、ワカメ、テングサなどの一般食品材料およびそれらの粉末；デンプン、水飴、乳糖、グルコース、果糖、スクロース、マンニトールなどの糖類；香辛料、甘味料、食用油、ビタミン類などの一般的な食品添加物；界面活性剤；賦形剤；着色料；保存料；コーティング助剤；ラクトース；デキストリン；コーンスターチ；ソルビトール；結晶性セルロース；ポリビニルピロリドン；油分；保湿剤；増粘剤；防腐剤；香料；ならびにこれらの組合わせが挙げられる。本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤はさらに、必要に応じて他の薬剤（例えば、漢方薬を包含する）を含有していてもよい。このような他の成分および／または他の薬剤の含有量は、特に限定されず、当業者によって適切な量が選択され得る。
【００４６】
さらに、本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、必ずしもインビボまたはインビトロのいずれに限定されることなく、プロリルエンドペプチダーゼ活性の阻害を必要とする任意の用途において広範に利用され得る。すなわち、本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、特に限定されないが、例えば、健康食品などの食品組成物に添加される添加物の一種として使用されてもよく、家畜または養殖魚などの生産分野に利用される飼料組成物として、そのままあるいは他の飼料用材料と組合わせて使用されてもよく、あるいは医薬品、医薬部外品などの医薬組成物として、そのままあるいは他の医薬組成物と組合わせて使用されてもよい。
【００４７】
本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤が食品組成物として使用される場合、その形態には固定食品に限定されず、飲料（例えば、液体飲料）のようなものを包含される。より具体的な例としては液状、ペースト状、固形状等の形態でなる、茶飲料、コーヒー飲料、清涼飲料、乳飲料、菓子類、シロップ類、果実加工品、野菜加工品、漬物類、畜肉製品、魚肉製品、珍味類、缶・ビン詰類、即席飲食物、内服液、肝油ドロップ、口中清涼剤、ゼリーなどが挙げられるが特にこれらに限定されない。本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤を含有するこのような食品組成物は、当業者に公知の手法を用いて製造され得る。
【００４８】
本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤が医薬組成物として使用される場合、その投与剤形は特に限定されず、日本薬局方に記載の方法にしたがって適切な剤形に加工される。投与剤形のより具体的な例としては、経口投与を目的とする医薬組成物の場合、カプセル剤、錠剤、粉剤、顆粒剤、細粒剤、徐放剤などの剤形が挙げられ、そして非経口投与を目的とする医薬組成物の場合、注射剤、輸液剤などの剤形が挙げられる。用量は、対象となる者の体重等の条件によって容易に変動し得るため、当業者によって適宜選択され得る。
【００４９】
本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、その使用形態に応じて当該分野で通常用いる方法によって製造され、その形態に応じた方法で適宜に適量摂取または適用することができる。
【００５０】
プロリルエンドペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２１．２６）はプロリンに特異性を有し、そのカルボキシル基側でペプチドを切断するセリンプロテアーゼである。上記のように、生体内のバソプレシン量は当該プロリルエンドペプチダーゼの分解によって低減し、痴呆症の発症または進行に関与することが知られている。本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、このようなプロリルエンドペプチダーゼ自体が有する活性を阻害することにより、例えば、バソプレシンの分解を防止することができる。このことにより、本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、痴呆症の予防または治療用途のために利用することができる。
【００５１】
さらに、プロリルエンドペプチダーゼは、例えば、リューマチ性変形関節炎（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００１年，第２巻，第２８３号，ｐｐ．３３４−３３９）および遅延型アレルギー性炎症病巣（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００４年，第１巻，第３１６号，ｐｐ．７８−８４）に罹患した人の細胞中で上昇することが報告されている。また、腸内細菌などの人の粘膜上に生息する微生物は、プロリルエンドペプチダーゼを多量に産生し、人粘膜抗体ＩｇＡを分解し、その免疫能力を無効にしていることが報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００２年，第１４巻，第２７７号，ｐｐ．１１９８７−１１９９４）。本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、プロリルエンドペプチダーゼ活性を阻害することにより、このような疾患の予防または治療、当該微生物の増殖抑制、または当該微生物のプロリルエンドペプチダーゼ活性の抑制に利用することもできる。
【実施例】
【００５２】
以下、本発明を実施例によって具体的に記述する。しかし、これらによって本発明は制限されるものではない。
【００５３】
＜実施例１：アラメを用いた海藻熱水抽出物および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物の製造＞
凍結乾燥した１０ｇのアラメをミキサーにかけ、乾燥粉末を調製した。この乾燥粉末４ｇに８０ｍｌの蒸留水を添加し、１００℃にて１０分間加熱して抽出を行った。次いで、抽出残渣を濾過にて取除いて得た、熱水抽出画分２０ｍｌを凍結乾燥して海藻熱水抽出物（Ａ１）を得た。他方、２０ｍｌの上記熱水抽出画分を別に取り、これに同量のエタノールを添加し、生じた沈殿を濾過により取除くことにより、５０％エタノール可溶化画分を得た。得られた５０％エタノール可溶化画分を減圧下にて濃縮し、残渣を２０ｍｌの蒸留水に溶解した後、凍結乾燥して海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物（Ｂ１）を得た。
【００５４】
＜実施例２：ワカメメカブを用いた海藻熱水抽出物および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物の製造＞
凍結乾燥したアラメの代わりに、凍結乾燥した１０ｇのワカメメカブを用いたこと以外は実施例１と同様にして熱水抽出画分を得、かつ当該熱水抽出画分から実施例１とそれぞれ同様にして、海藻熱水抽出物（Ａ２）および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物（Ｂ２）を得た。
【００５５】
＜実施例３：ヒジキを用いた海藻熱水抽出物および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物の製造＞
凍結乾燥したアラメの代わりに、凍結乾燥した１０ｇのヒジキを用いたこと以外は実施例１と同様にして熱水抽出画分を得、かつ当該熱水抽出画分から実施例１とそれぞれ同様にして、海藻熱水抽出物（Ａ３）および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物（Ｂ３）を得た。
【００５６】
＜実施例４：アカモクを用いた海藻熱水抽出物および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物の製造＞
凍結乾燥したアラメの代わりに、凍結乾燥した１０ｇのアカモクを用いたこと以外は実施例１と同様にして熱水抽出画分を得、かつ当該熱水抽出画分から実施例１とそれぞれ同様にして、海藻熱水抽出物（Ａ４）および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物（Ｂ４）を得た。
【００５７】
＜実施例５：オキナワモズクを用いた海藻熱水抽出物および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物の製造＞
凍結乾燥したアラメの代わりに、凍結乾燥した１０ｇのオキナワモズクを用いたこと以外は実施例１と同様にして熱水抽出画分を得、かつ当該熱水抽出画分から実施例１とそれぞれ同様にして、海藻熱水抽出物（Ａ５）および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物（Ｂ５）を得た。
【００５８】
＜実施例６：ホンダワラを用いた海藻熱水抽出物および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物の製造＞
凍結乾燥したアラメの代わりに、凍結乾燥した１０ｇのホンダワラを用いたこと以外は実施例１と同様にして熱水抽出画分を得、かつ当該熱水抽出画分から実施例１とそれぞれ同様にして、海藻熱水抽出物（Ａ６）および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物（Ｂ６）を得た。
【００５９】
＜実施例７：スギノリを用いた海藻熱水抽出物および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物の製造＞
凍結乾燥したアラメの代わりに、凍結乾燥した１０ｇのスギノリを用いたこと以外は実施例１と同様にして熱水抽出画分を得、かつ当該熱水抽出画分から実施例１とそれぞれ同様にして、海藻熱水抽出物（Ａ７）および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物（Ｂ７）を得た。
【００６０】
＜実施例８：プロリルエンドペプチダーゼ阻害活性の測定１＞
Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ（ＢＡＣＨＥＭ社製）を４０％のジオキサン／０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、２ｍＭのＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ溶液を調製した。他方、プロリルエンドペプチダーゼ（フラボバクテリウム由来／生化学工業（株）製）を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、０．２５ユニット／ｍｌのプロリルエンドペプチダーゼ溶液を調製した。さらに、実施例１〜７で得られた海藻熱水抽出物（Ａ１）〜（Ａ７）および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物（Ｂ１）〜（Ｂ７）を１０ｍｇづつ量りとり、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、１０ｍｇ／ｍｌのサンプル溶液をそれぞれ調製した。得られたサンプル溶液について、海藻熱水抽出物（Ａ１）〜（Ａ７）および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物（Ｂ１）〜（Ｂ７）の最終濃度が８００μｇ／ｍｌとなるように、それぞれ必要に応じて適量の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、評価サンプル溶液とした。
【００６１】
０．４５ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．０５ｍｌの評価サンプル溶液（ただし、コントロールの場合は０．０５ｍＬの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を代用した）、および０．５ｍｌのＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ溶液（２ｍＭ）を試験管に入れ、３７℃で予め加温した。これに、０．２５ｍｌの０．２５ユニット／ｍｌプロリルエンドペプチダーゼ溶液（ただし、ブランクの場合は０．２５ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を代用した）を添加した反応液をそれぞれ調製し、３７℃にて２０分間かけて酵素反応を行った。その後、０．５ｍｌの１Ｎ塩酸で反応を停止し、各反応液における波長４０５ｎｍの吸光度を分光光度計にて測定した。コントロールの吸光度Ａｃ、反応停止後の評価サンプル溶液の吸光度Ａｓとして、ならびに対応するそれぞれのブランクの吸光度をＡｃｂおよびＡｓｂとして、下記式にてプロリルエンドペプチダーゼ阻害率（％）を算出した：
【００６２】
【数１】
【００６３】
実施例１〜７で得られた海藻熱水抽出物（Ａ１）〜（Ａ７）および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物（Ｂ１）〜（Ｂ７）に対する上記プロリルエンドペプチダーゼ阻害率（％）を表１および表２に示す。
【００６４】
【表１】
【００６５】
【表２】
【００６６】
表１および表２に示されるように、 実施例１〜７で得られた海藻熱水抽出物（Ａ１）〜（Ａ７）および海藻熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物（Ｂ１）〜（Ｂ７）はいずれも、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤としての優れたプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を有していることがわかる。
【００６７】
＜実施例９：アラメ画分の製造＞
凍結乾燥した１００ｇのアラメをミキサーにかけ、乾燥粉末を調製した。これに、２Ｌの蒸留水を添加し、１００℃にて１０分間加熱して抽出を行い、抽出残渣を濾過にて取除いて、熱水粗抽出物（７００ｍｌ）を得、これにエタノールを添加して９０（ｖ／ｖ）％のエタノール液に調製した。
【００６８】
その後、得られたエタノール液を濾過して上清のみを取出した。次いで、この上清を減圧濃縮して、３５０ｍｌのエタノール可溶画分を得た。このエタノール可溶画分を３５０ｍｌのクロロホルムと合わせ分液抽出して得られた水層のうち、５０ｍｌをスチレン−ジビニルベンゼン吸着剤（三菱化学（株）製ダイヤイオンＨＰ２０）を含有するカラム（φ３．８ｃｍ×３０ｃｍ）に充填し、溶出液として、（Ｆ１）蒸留水（５００ｍｌ）、（Ｆ２）蒸留水（５００ｍＬ）、（Ｆ３）３０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液（５００ｍｌ）、（Ｆ４）６０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液（５００ｍｌ）、および（Ｆ５）１００（ｖ／ｖ）％エタノール（５００ｍｌ）を用いて順次溶出し、粗画分（Ｆ１）、（Ｆ２）、（Ｆ３）、（Ｆ４）および（Ｆ５）をそれぞれ５００ｍｌ分割収集した。次いで、粗画分（Ｆ１）、（Ｆ２）、（Ｆ３）、（Ｆ４）および（Ｆ５）の溶媒をそれぞれ減圧下にて留去した後、再度４０ｍｌの蒸留水に溶解または再懸濁して凍結乾燥し、アラメ画分（Ｆ１）、（Ｆ２）、（Ｆ３）、（Ｆ４）および（Ｆ５）をそれぞれ得た。
【００６９】
＜実施例１０：プロリルエンドペプチダーゼ阻害活性の測定２＞
Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ（ＢＡＣＨＥＭ社製）を４０％のジオキサン／０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、２ｍＭのＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ溶液を調製した。他方、プロリルエンドペプチダーゼ（フラボバクテリウム由来／生化学工業（株）製）を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、０．２５ユニット／ｍｌのプロリルエンドペプチダーゼ溶液を調製した。さらに、実施例９で得られたアラメ画分（Ｆ１）、（Ｆ２）、（Ｆ３）、（Ｆ４）および（Ｆ５）を１０ｍｇづつ量りとり、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、１０ｍｇ／ｍｌのサンプル溶液をそれぞれ調製した。得られたサンプル溶液について、アラメ画分（Ｆ１）、（Ｆ２）、（Ｆ３）、（Ｆ４）および（Ｆ５）の最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるように、それぞれ必要に応じて適量の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、評価サンプル溶液とした。
【００７０】
得られた各評価サンプル溶液について、実施例８と同様にして当該評価サンプル溶液の阻害率（％）を算出した。得られた阻害率の結果を表３に示す。
【００７１】
【表３】
【００７２】
表３に示されるように、実施例９で得られたアラメ画分（Ｆ１）、（Ｆ２）、（Ｆ３）、（Ｆ４）および（Ｆ５）はいずれも、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤として使用可能なプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を有していることがわかる。特に、エタノールまたはその水溶液で溶出して得たアラメ画分（Ｆ３）、（Ｆ４）および（Ｆ５）は優れたプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を有し、特に６０（ｖ／ｖ）％付近のエタノール水溶液においてその阻害率（％）が著しく向上することがわかる。
【００７３】
さらに、上記アラメ画分（Ｆ４）を用いて調製した評価サンプル液を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、１／２段階希釈を行って複数のサンプル液を調製し、これら複数のサンプル液のそれぞれについて、上記と同様にして阻害率（％）を算出した。その後、プロリルエンドペプチダーゼの５０％阻害率を達成する濃度（ＩＣ５０）を求めた。得られたＩＣ５０値は、２８０ｎｇ／ｍｌであった。
【００７４】
＜実施例１１：フロロタンニンの定量＞
実施例９で得られたアラメ画分（Ｆ４）１００ｍｇを正確に量りとり、当該画分の総フロロタンニン量を、フロログルシノールを標準物質として用いるＦｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ法（日本食品科学工学会誌，２００２年，第４９巻，ｐｐ．５０７−５１１）により測定した。得られたそれぞれの総フロロタンニン量は、８９．４％であった。このことから、実施例１０において最もプロリルエンドペプチダーゼ阻害率が高い値を示した当該アラメ画分（Ｆ４）には、高濃度のフロロタンニンが含有されていることが見出された。
【００７５】
＜実施例１２：アラメ抽出物の７日間反復投与による抗健忘作用＞
アラメ抽出物の７日間反復投与による抗健忘作用を確認するために、実施例１で得られた海藻（アラメ）熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物（Ｂ１）を使用した。
【００７６】
抗健忘作用の測定を、１試行ステップ−スルー（ｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ）受動的回避実験法にしたがって、以下のように実施した。
【００７７】
５週齢のマウスを検討開始日の体重を指標にして、層別無作為化法にて各群の平均体重が等しくなるよう１０匹を１群として、Ｇ１群およびＧ２群の合計２群に群分けした。群分け後、Ｇ１群のマウス（コントロール）には、被験物質として１％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）水溶液を体重１０ｇあたり０．３ｍｌの割合にて、１日あたり１回経口投与し、これを７日間継続した。他方、Ｇ２群のマウスには、被験物質として実施例１で得られた海藻（アラメ）熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物（本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤）を１０ｍｇ／ｍｌの割合で含有する１％ＣＭＣ水溶液を体重１０ｇあたり０．３ｍｌの割合にて、１日あたり１回経口投与し、これを７日間継続した。
【００７８】
その後、０．０５ｍｇ／ｍｌのスコポラミン（ＳＣＯＰ）水溶液を、体重１０ｇあたり０．１ｍｌの割合で、Ｇ１群およびＧ２群の各マウスに対し、被験物質の最終投与の６０分後にそれぞれ腹腔内投与した。
【００７９】
ＳＣＯＰを投与して３０分間が経過した後、Ｇ１群およびＧ２群の各マウスについて、まず、照度４８０ルクスの蛍光灯照明下にて、以下の獲得試行を行った：すなわち、暗室側の床グリッドにショックジェネレータスクランブラー（ＮＳ−ＳＧ０１、（株）ニューロサイエンス製）を用いて１ｍＡのスクランブル電撃を与え続けた状態にある、マウス用明暗分別測定装置（（株）ニューロサイエンス製）の明室側に、当該マウスを１匹ずつ収容した。収容後から各マウスが暗室に入るまでの時間（潜時）を、デジタルストップウォッチ（ＳＯ５１、セイコー（株）製）で測定した（なお、この獲得試行における潜時の測定は最大３００秒までとし、暗室の移動がそれ以上の時間となったものについては測定を行わなかった）。Ｇ１群のマウスおよびＧ２群のマウスについて、当該獲得試行において得られた潜時の平均値を比較したところ、両者に優位な差は見出されなかった。本能的に暗室に移動したマウスは、いずれも暗室の床グリッドに与えられたスクランブル電撃に応答し、明室に再び移動したことを確認した。
【００８０】
次いで、上記獲得試行を行ったＧ１群およびＧ２群の各マウスについて、照度４８０ルクスの蛍光灯照明下にて、以下の保持試行を行った：すなわち、上記獲得試行を行ったマウスを、当該獲得試行から２４時間経過後、上記マウス用明暗分別測定装置の明室側に１匹ずつ収容し、収容後から当該マウスが暗室に入るまでの時間（潜時：秒）を上記と同様にして測定した（なお、この保持試行における潜時の測定は最大３００秒までとし、暗室の移動がそれ以上の時間となったものについては測定を行わなかった）。Ｇ１群のマウスおよびＧ２群のマウスについて、当該保持試行において得られた潜時の平均値を算出した。得られた結果を図１に示す。
【００８１】
図１に示されるように、コントロールであるＧ１群のマウスと比較して、実施例１で得られた海藻（アラメ）熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物を投与したＧ２群のマウスは、保持試行における潜時が著しく上昇していたことがわかる。このことから、本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、生体内における抗健忘作用に有効であることがわかる。
【００８２】
＜実施例１３：食品組成物の調製＞
上記実施例９で得られたアラメ画分（Ｆ４）を用いて、以下の組成を有する食品組成物を調製した。
【００８３】
成分 重量（ｇ）
アラメ画分（Ｆ４） ０．６
大豆サポニン ２．０
黒酢エキス ２．０
リンゴファイバー ２．０
レシチン １．０
フラクトオリゴ糖 ２．０
果糖 １．０
粉末酢 ０．１
シクロデキストリン １．０
蜂蜜 １．０
骨粉 １．０
デキストリン ４．９。
【００８４】
各成分を流動造粒機中で混合した後、水を噴霧して造粒を行い、入風温度８０℃で乾燥して、顆粒状食品を得た。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、食品として用いられ得る海藻の抽出物を有効成分として使用するため、安全性が高く、日常的な使用が可能であり、食品、医薬品などに利用され得る。本発明のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤はまた、プロリルエンドペプチダーゼ活性を阻害することにより、生体内のバソプレシンの分解を防止することができ、その結果、アルツハイマー型痴呆のような健忘症に対する予防または治療の目的に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】実施例１２の１試行ステップ−スルー受動的回避実験法で得られた、Ｇ１群のマウス（コントロール）とＧ２群のマウス（海藻（アラメ）熱水抽出５０％エタノール可溶抽出物を投与）との保持試行における潜時の平均値を示す、グラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
褐藻類こんぶ目こんぶ科のマコンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、褐藻類こんぶ目ちがいそ科のアラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ ｂｉｃｙｃｌｉｓ）、サガラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ ａｒｂｏｒｅａ）、ツルアラメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｓｔｌｏｎｉｆｅｒａ）、クロメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｋｕｒｏｍｅ）、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｃａｖａ）、ワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ）、アオワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｅｔｅｒｓｅｎｉａｎａ）、ヒロメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｕｎｄａｒｉｏｉｄｅｓ）、アイヌワカメ（（Ａｌａｒｉａ ｐｒａｅｌｏｍｇａ）、およびチガイソ（Ａｌａｒｉａ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ）；褐藻類ひばまた目ほんだわら科のホンダワラ（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｆｕｌｕｖｅｌｌｕｍ）、ヒジキ（Ｈｉｚｉｋｉａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ）、およびアカモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｈｏｒｎｅｒｉ）；褐藻類まがまつも目もずく科のモズク（Ｎｅｍａｃｙｓｔｕｓ ｄｅｃｉｐｉｅｕｓ）およびオキナワモズク（Ｃｌａｄｏｓｉｐｈｏｎ ｏｋａｍｕｒａｎｕｓ）；および、紅藻類スギノリ目すぎのり科に属する海藻；からなる群より選択される少なくとも１種の海藻由来の抽出物を有効成分として含有する、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤。
【請求項２】
前記抽出物が、溶媒として水を用いた前記海藻由来の粗抽出物を含有する５０（ｖ／ｖ）％以上のＣ１〜Ｃ３アルコール液の上清から得られた抽出物である、請求項１に記載のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤。
【請求項３】
前記抽出物が、前記上清の濃縮物を、４０（ｖ／ｖ）％から９０（ｖ／ｖ）％のＣ１〜Ｃ３アルコール水溶液を用いるカラムクロマトグラフィーにかけることにより得られた画分由来の抽出物である、請求項２に記載のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤。
【請求項４】
前記カラムクロマトグラフィーに用いる吸着剤がスチレン−ジビニルベンゼン系吸着剤である、請求項３に記載のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤。
【請求項５】
海藻由来の抽出物を有効成分として含有するプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤であって、該抽出物が該抽出物に含まれる固形分の重量を基準としてフロロタンニンを１５重量％以上の割合で含有する、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤。
【請求項６】
フロロタンニンを有効成分として含有する、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤。
【請求項７】
前記フロロタンニンが海藻由来である、請求項６に記載のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤。
【請求項８】
プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤の製造方法であって、
褐藻類こんぶ目こんぶ科のマコンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、褐藻類こんぶ目ちがいそ科のアラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ ｂｉｃｙｃｌｉｓ）、サガラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ ａｒｂｏｒｅａ）、ツルアラメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｓｔｌｏｎｉｆｅｒａ）、クロメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｋｕｒｏｍｅ）、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｃａｖａ）、ワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ）、アオワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｅｔｅｒｓｅｎｉａｎａ）、ヒロメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｕｎｄａｒｉｏｉｄｅｓ）、アイヌワカメ（（Ａｌａｒｉａ ｐｒａｅｌｏｍｇａ）、およびチガイソ（Ａｌａｒｉａ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ）；褐藻類ひばまた目ほんだわら科のホンダワラ（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｆｕｌｕｖｅｌｌｕｍ）、ヒジキ（Ｈｉｚｉｋｉａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ）、およびアカモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｈｏｒｎｅｒｉ）；褐藻類まがまつも目もずく科のモズク（Ｎｅｍａｃｙｓｔｕｓ ｄｅｃｉｐｉｅｕｓ）およびオキナワモズク（Ｃｌａｄｏｓｉｐｈｏｎ ｏｋａｍｕｒａｎｕｓ）；および、紅藻類スギノリ目すぎのり科に属する海藻；からなる群より選択される少なくとも１種の海藻を、６０℃から１００℃の水中で抽出して粗抽出物を得る工程；
該粗抽出物に、Ｃ１〜Ｃ３アルコールまたはＣ１〜Ｃ３アルコール水溶液と合わせて、５０（ｖ／ｖ）％以上の該アルコールを含有するアルコール液を得る工程；ならびに
該アルコール液の上清を分取する工程；
を包含する、方法。
【請求項９】
さらに、前記上清を濃縮して、該上清の濃縮物を得る工程；および該上清の濃縮物を、４０（ｖ／ｖ）％から９０（ｖ／ｖ）％のＣ１〜Ｃ３アルコール水溶液を用いるカラムに通す工程；を包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記カラムがスチレン−ジビニルベンゼン系吸着剤を含有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１】
褐藻類こんぶ目こんぶ科のマコンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、褐藻類こんぶ目ちがいそ科のアラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ ｂｉｃｙｃｌｉｓ）、サガラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ ａｒｂｏｒｅａ）、ツルアラメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｓｔｌｏｎｉｆｅｒａ）、クロメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｋｕｒｏｍｅ）、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｃａｖａ）、ワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ）、アオワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｅｔｅｒｓｅｎｉａｎａ）、ヒロメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｕｎｄａｒｉｏｉｄｅｓ）、アイヌワカメ（（Ａｌａｒｉａ ｐｒａｅｌｏｍｇａ）、およびチガイソ（Ａｌａｒｉａ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ）；褐藻類ひばまた目ほんだわら科のホンダワラ（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｆｕｌｕｖｅｌｌｕｍ）、ヒジキ（Ｈｉｚｉｋｉａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ）、およびアカモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｈｏｒｎｅｒｉ）；褐藻類まがまつも目もずく科のモズク（Ｎｅｍａｃｙｓｔｕｓ ｄｅｃｉｐｉｅｕｓ）およびオキナワモズク（Ｃｌａｄｏｓｉｐｈｏｎ ｏｋａｍｕｒａｎｕｓ）；および、紅藻類スギノリ目すぎのり科に属する海藻；からなる群より選択される少なくとも１種の海藻由来の抽出物を有効成分として含有する、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤。
【請求項２】
前記抽出物が、溶媒として水を用いた前記海藻由来の粗抽出物を含有する５０（ｖ／ｖ）％以上のＣ１〜Ｃ３アルコール液の上清から得られた抽出物である、請求項１に記載のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤。
【請求項３】
前記抽出物が、前記上清の濃縮物を、４０（ｖ／ｖ）％から９０（ｖ／ｖ）％のＣ１〜Ｃ３アルコール水溶液を用いるカラムクロマトグラフィーにかけることにより得られた画分由来の抽出物である、請求項２に記載のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤。
【請求項４】
前記カラムクロマトグラフィーに用いる吸着剤がスチレン−ジビニルベンゼン系吸着剤である、請求項３に記載のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤。
【請求項５】
海藻由来の抽出物を有効成分として含有するプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤であって、該抽出物が該抽出物に含まれる固形分の重量を基準としてフロロタンニンを１５重量％以上の割合で含有する、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤。
【請求項６】
フロロタンニンを有効成分として含有する、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤。
【請求項７】
前記フロロタンニンが海藻由来である、請求項６に記載のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤。
【請求項８】
プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤の製造方法であって、
褐藻類こんぶ目こんぶ科のマコンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、褐藻類こんぶ目ちがいそ科のアラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ ｂｉｃｙｃｌｉｓ）、サガラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ ａｒｂｏｒｅａ）、ツルアラメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｓｔｌｏｎｉｆｅｒａ）、クロメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｋｕｒｏｍｅ）、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｃａｖａ）、ワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ）、アオワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｅｔｅｒｓｅｎｉａｎａ）、ヒロメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｕｎｄａｒｉｏｉｄｅｓ）、アイヌワカメ（（Ａｌａｒｉａ ｐｒａｅｌｏｍｇａ）、およびチガイソ（Ａｌａｒｉａ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ）；褐藻類ひばまた目ほんだわら科のホンダワラ（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｆｕｌｕｖｅｌｌｕｍ）、ヒジキ（Ｈｉｚｉｋｉａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ）、およびアカモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｈｏｒｎｅｒｉ）；褐藻類まがまつも目もずく科のモズク（Ｎｅｍａｃｙｓｔｕｓ ｄｅｃｉｐｉｅｕｓ）およびオキナワモズク（Ｃｌａｄｏｓｉｐｈｏｎ ｏｋａｍｕｒａｎｕｓ）；および、紅藻類スギノリ目すぎのり科に属する海藻；からなる群より選択される少なくとも１種の海藻を、６０℃から１００℃の水中で抽出して粗抽出物を得る工程；
該粗抽出物に、Ｃ１〜Ｃ３アルコールまたはＣ１〜Ｃ３アルコール水溶液と合わせて、５０（ｖ／ｖ）％以上の該アルコールを含有するアルコール液を得る工程；ならびに
該アルコール液の上清を分取する工程；
を包含する、方法。
【請求項９】
さらに、前記上清を濃縮して、該上清の濃縮物を得る工程；および該上清の濃縮物を、４０（ｖ／ｖ）％から９０（ｖ／ｖ）％のＣ１〜Ｃ３アルコール水溶液を用いるカラムに通す工程；を包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記カラムがスチレン−ジビニルベンゼン系吸着剤を含有する、請求項９に記載の方法。
【図１】
【公開番号】特開２００６−９６７０９（Ｐ２００６−９６７０９Ａ）
【公開日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２８５６２８（Ｐ２００４−２８５６２８）
【出願日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（０００２１４２７２）長瀬産業株式会社 (137)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（０００２１４２７２）長瀬産業株式会社 (137)
【Ｆターム（参考）】
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