マダニのシスタチン
【課題】マダニ駆除又はマダニ媒介性感染症の治療若しくは予防に有用な新規ポリペプチド及びポリヌクレオチドを提供する。
【解決手段】前記ポリペプチドは、新規のシスタチンである。前記ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、又はそれを含むベクターは、マダニ駆除又はマダニ媒介性感染症の治療若しくは予防に有用である。また、前記ポリペプチドに対する阻害剤又は前記ポリペプチドに対する抗体も、マダニ駆除又はマダニ媒介性感染症の治療若しくは予防に有用である。
【解決手段】前記ポリペプチドは、新規のシスタチンである。前記ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、又はそれを含むベクターは、マダニ駆除又はマダニ媒介性感染症の治療若しくは予防に有用である。また、前記ポリペプチドに対する阻害剤又は前記ポリペプチドに対する抗体も、マダニ駆除又はマダニ媒介性感染症の治療若しくは予防に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マダニのシスタチン、それをコードする核酸分子及びそれらの利用に関する。
【０００２】
より詳細には、本発明は、マダニの生存に不可欠な吸血、及びこれによってマダニ体内に侵入する動物・ヒトの病原体に関わるタンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、及びそれらの使用に関する。ここで、動物・ヒトの病原体とは、世界的に甚大な被害をもたらすピロプラズマ症の病原体であるタイレリア又はバベシア原虫をはじめとする人獣共通細菌・ウイルスを意味する。具体的には、本発明は、宿主動物からの血液成分の摂取（すなわち吸血）と消化、ならびに吸血にともなってマダニ個体へ侵入した病原体に対して、中腸上皮や体内移行経路にあたる器官・組織で発現するシスタチンをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを保持する組換え体細胞、組換えペプチドタンパク質、及び合成ペプチドに関する。本発明により、マダニの吸血の予防と阻止、ピロプラズマ症をはじめとする人及び動物の感染症の予防及び治療を目的とした化合物の合成、あるいはそれら病原体による感染症の治療薬の開発に応用することができる。
【背景技術】
【０００３】
地球上に棲息する約５００属１５，０００種を越える吸血性節足動物の中で、マダニはわずか１９属約７５０種（５％）の弱小グループであるが、ヒト以外の動物では第１位、ヒトでは蚊に次いで第２位に重要な感染症媒介節足動物である。経済的被害からもマダニとマダニ媒介性疾病による世界の損害額は、畜産領域だけでも毎年１４０億米ドル以上（非特許文献１）にのぼり、その対策は世界各国で畜産振興上の最も重要な課題のひとつとなっている。マダニ防除の中心は化学療法剤などの薬剤利用に深く依存している。ＤＴＴが開発された１９５０年以降、シナプス後膜作用型のニコチン系、ネオニコチノイド系、神経伝達物質分解酵素型の有機燐系、カーバメート系、クロルジメフォルム、神経繊維膜作用型の塩素系、ピレスロイド系などの化合物が殺ダニ剤としてマダニ防除に使用されてきた。しかしながら、マダニは、薬剤の連続使用によるいわゆる薬剤耐性をいずれの薬剤に対しても獲得し、殺ダニ効果が減少あるいは消失したものも少なくない。さらに、薬剤の使用には常に人あるいは動物への副作用を考えなくてはならず、同時に、食と環境の安全性を脅かす薬物残留問題があり、消費者から敬遠される傾向にある。そのうえ、経済動物である家畜では、薬剤の使用には有効性や適用範囲に加えて、膨大な開発コストの面からも限界が生じつつある。
【０００４】
感染症媒介者（ベクター）としてのマダニは、マラリアベクターの蚊と比べて、ウイルス、リケッチア、細菌、原虫、寄生虫などほぼすべての種類の病原体の伝播に関与する他に比肩しうるもののない優れた疾病媒介能を有する。ヒトではマラリアが世界的に猛威を振るっていることはよく知られているが、動物（家畜・愛玩動物）ではマラリアに類似した感染症としてマダニが媒介するバベシアやタイレリアなどの原虫によるピロプラズマ症がある。本症は畜産・獣医学領域で最も被害の大きい寄生虫感染症であり、近年ではヒトでのバベシア症が世界各国で報告され、新興人獣共通感染症のひとつにあげられている。
【０００５】
感染症予防の最大の武器はワクチンであるが、寄生虫ワクチン（多大な資金と精力的なワクチン開発が行われているマラリアに対しても）の開発は困難を極めている。進化した生活環を有する寄生虫では、動物・ヒトの獲得防御免疫に関する主要な寄生虫由来の抗原や免疫誘導機構など、不明な点が多くあるためであるが、とりわけ重大なのは、寄生虫は高度に発達した免疫回避機構により宿主の免疫監視から逃れるシステムを発達させており、防御免疫の獲得が困難なことにある。このようなことからタイレリアやバベシアなどのピロプラズマ原虫についても例外ではなく、ピロプラズマ症の発症をもたらす宿主体内ステージに焦点をあてた研究開発からはワクチンを生まれていない。
【０００６】
一方、マダニの頻回寄生に対して宿主が抵抗性を獲得する現象を応用した獲得免疫によるマダニ防除法が以前から試みられている（非特許文献２）。また、宿主への接触が全くないマダニタンパク質がマダニ感染に対する防御抗原となることも明らかにされ、実際にワクチン抗原（Tick GARD）（非特許文献３）として一部のマダニとマダニ媒介性病原体［例えば１宿主性のマダニ（Boophilus microplus）とその媒介するウシバベシア原虫］に対して野外応用されているものの、これらの効果は限定的であり、他のワクチン抗原との併用による効果増大の必要性が指摘されるなど、多くのマダニとマダニ媒介性病原体に対するワクチンは依然として開発途上にあり、病原体側のマダニ媒介性病原体の防除対策もマダニと同様に薬剤に深く依存しているのが実情である。このように２１世紀におけるマダニとマダニ媒介性病原体による人及び家畜生産の被害を既存の薬剤使用によって防ぐことは、非常に難しい状況にある。
【０００７】
シスタチンは、パパイン・ファミリーのシステイン・プロテアーゼに対して阻害活性を有するインヒビター群である。１９６０年代に鶏の卵白から初めて報告された後、現在、分布は、原虫、線虫、昆虫、植物、ほ乳類まで様々な生物で広く存在が知られている。マダニシスタチンとしては、ヒメダニの１つであるオルニソドロス・モウバタ（Ornithodoros moubata）由来のシスタチン、あるいは、ヒトのライム病のベクターであるマダニ属のイクソデス・リシヌス（Ixodes ricinus）とイクソデス・スカピュラーリス（Ixodes scapularis）由来のシスタチン［NCBI (National Center for Biotechnology Information)、BLASTP (Protein-protein Basic Local Alignment Search Tool) サーチ, Accession No. AY521024、AJ547803、AF483724］の塩基配列及びアミノ酸配列がそれぞれ決定されている（非特許文献４）。また、米国のヒト、イヌ、ネコのエールリヒア症の病原体（Ehrlichia chaffeensisやEhrlichia ewingii）のベクターであるキララマダニ属の１種のアンブリオンマ アメリカナム（Amblyomma americanum）では、シスタチンのRNA干渉法による機能の解明が試みられている（非特許文献５）。しかしながら、マダニのシスタチンの全塩基配列の単離や特性解明に関しては、いずれのマダニにおいても実証されるに至っていない。
【０００８】
【非特許文献１】ベテリナリー・パラシトロジー(Veterinary Parasitology), （オランダ国）,1997年, 71巻, 77-97頁
【非特許文献２】「ナショナルインスティチュート・オブ・アニマルヘルス・クオータリー（トウキョウ）(National Institute of Animal Health Quarterly、Tokyo)，1978年，18巻，27-38頁
【非特許文献３】「プラシトロジー・トゥデー（Parasitology Today）」，（オランダ国），1999年，15巻，258-262頁
【非特許文献４】「ザ・ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・バイオロジー（The Journal of Experimental Biology）」，（英国），2002年，205巻，2843-2864頁
【非特許文献５】「バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ」（Biochemical Biophysical Research Communications），（オランダ国），2005年，334巻，1336-1342頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者及びその共同研究者は約２０年来にわたって継代してきた日本の最優占種であるフタトゲチマダニを用いて、その防除とこれが媒介するピロプラズマ原虫（Theileria orientalis、Babesia ovata、Babesia gibsoni）などの疾病媒介の予防・治療に関するプロジェクト研究を推進してきてきた。近年、本発明者らは、マダニ個体における様々な生物活性分子が、マダニの吸血・消化と病原体伝搬において果たす役割と機構の大きさに着目してきたが、今回、解析の結果から、吸血・消化ならびにマダニ体内に侵入する原虫などの病原体によって中腸上皮とヘモサイトにおける発現が上方調節され、マダニの吸血生理と自然免疫に関わる分子と想定されるシスタチンの単離に成功した。
【００１０】
シスタチンは、選択的にまた特異的にシステイン・プロテアーゼの活性を阻害する細胞内あるいは細胞外に局在するタンパク質であり、アミノ酸配列などの構造特性の相違によって、タイプ１〜３の３群に分類される。分布は、脊椎動物のほ乳類から線虫、昆虫などの無脊椎動物、原虫、植物にも広く存在が知られている。機能的には不明な点が残されているが、生物のタンパク質の代謝回転に代表される生命現象の基本部分を担うとともに、病原体の侵入、ガン、神経変性疾患やアポトーシスといった様々な病態において大きな動態を示し、重要な役割を有することが判明している［Dubin G. Cell Mol Life Sci. 62:653-669(2005)］。しかしながら、マダニに関しては、シスタチンが重要であるとの報告はこれまでなかった。
【００１１】
本発明は、マダニとマダニが媒介する感染症から、人及び動物を守るための化合物を提供し、ウイルス、細菌、原虫、寄生虫などの様々なマダニ媒介性病原体による感染症の防除法を提供するものである。具体的には、マダニのシスタチン、前記感染防御抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを保持する組換え体細胞、マダニのシスタチンに対する抗体などの阻害剤、並びにマダニ媒介性病原体の感染及び増殖を防ぐ化合物の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、偏性吸血動物としてのマダニでは、その生存に必須の宿主からの吸血にともなう中腸における血液タンパク質の消化に働くシステイン・プロテアーゼなどの消化酵素群の活性の高まりに対して、あるいはまた吸血にともなって侵入してきたピロプラズマ原虫などの各種病原体の侵入に対して、局所的に細胞上皮で産生される何らかの応答性の生物活性分子があることを想定した。本発明者は、マダニの吸血・消化機構と病原体媒介能は偶然に成立したものではなく、長い年月をかけて成立した分子間相互作用を基盤にしているものと想定しており、今回、フタトゲチマダニにおいて、吸血、細菌細胞外膜リポ多糖（LPS）の接種、ならびにバベシア原虫感染にともなって、中腸における発現が著しく上方調節され、しかもインビトロで媒介バベシア原虫の増殖を抑制するシスタチンを突き止めた。このようなことから、マダニのシスタチンは、マダニの吸血によって惹起される中腸における血液タンパク質の消化に関わる酵素の活性調節と、吸血にともなう病原体侵入と伝搬に関わる自然免疫において、重要な役割を果たしているものと考えられる。また、蛋白性レギュレーターあるいはプロテクタントを活用した創薬を目指す上で、マダニのシスタチンは大きな可能性を秘めていると推察することができる。今回単離したフタトゲチマダニ・シスタチンは、バベシアなどのピロプラズマ原虫に限らず、マダニが媒介する野兎病、Ｑ熱、ウイルス性脳炎などの伝搬防除にも応用することができる。これまで、マダニの吸血、ならびにマダニが媒介する病原体の発育・生存において、シスタチンが重要であるとの報告はなく、マダニのシスタチンをコードする遺伝子及びその組換えタンパク質は、マダニ媒介性感染症の予防・防除を目的とした化合物の作出に有効である。
【００１３】
すなわち、本発明は、
［１］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチド、
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、シスタチン活性を示すポリペプチド、又は
（４）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が５０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチド；
［２］［１］のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［３］［２］のポリヌクレオチドを含むベクター；
［４］［２］のポリヌクレオチドを含む形質転換体；
［５］［４］の形質転換体を培養する工程を含む、［１］のポリペプチドを製造する方法；
［６］［１］のポリペプチド若しくはその断片、［２］のポリヌクレオチド、又は［３］のベクターを有効成分として含む、医薬；
［７］マダニに対するワクチンである、［６］の医薬；
［８］抗原虫剤である、［６］の医薬；
［９］［１］のポリペプチド若しくはその断片、［２］のポリヌクレオチド、又は［３］のベクターと、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる担体又は希釈剤とを含む、医薬組成物；
［１０］［１］のポリペプチド若しくはその断片、［２］のポリヌクレオチド、又は［３］のベクターを、マダニ駆除の必要な対象に、有効量で投与することを含む、マダニ駆除方法；
［１１］［１］のポリペプチド若しくはその断片、［２］のポリヌクレオチド、又は［３］のベクターを、マダニ媒介性感染症の治療又は予防の必要な対象に、有効量で投与することを含む、マダニ媒介性感染症の治療又は予防方法；
［１２］［１］のポリペプチドに対する抗体又はその断片；
［１３］［１］のポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、及び前記ポリペプチドのシスタチン活性を分析する工程を含む、前記ポリペプチドのシスタチン活性を修飾する物質のスクリーニング方法；
［１４］シスタチン阻害剤、又は［１２］の抗体若しくはその断片を有効成分として含む、マダニ駆除剤；
［１５］シスタチン阻害剤、又は［１２］の抗体若しくはその断片を有効成分として含む、マダニ媒介性感染症の治療又は予防剤；並びに
［１６］シスタチンを有効成分として含む、抗原虫剤
に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、形質転換体、及び抗体によれば、本発明の医薬、特にはマダニワクチンを提供することができる。また、本発明の医薬、特にはマダニワクチンによれば、例えば、マダニ駆除、又はマダニ媒介性感染症（例えば、人獣のピロプラズマ症、Ｑ熱、又はウイルス性脳炎など）の治療若しくは予防が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
［１］本発明のポリペプチド
本発明のポリペプチドには、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチド；
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）；及び
（４）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が５０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）
が含まれる。
【００１６】
本明細書において「シスタチン活性」とは、フタトゲチマダニのシスタチンタンパク質の生物学的活性を意味し、具体的には、例えば、システイン・プロテアーゼ（例えば、例えば、パパイン、カテプシンＬ）に対する結合活性及び／又は活性阻害活性を挙げることができる。
【００１７】
或るポリペプチドがシスタチン活性を有するか否かは、公知の方法に従って、判定することができる。例えば、或るポリペプチドがシステイン・プロテアーゼ活性の阻止能を有するか否かは、例えば、実施例４に示すように、Roche et al., Eur. J. Biochem 245:373-380(1997)に従って判定することができる。より具体的には、実施例４に示すように、ペプチドによるシステイン・プロテアーゼの活性阻害は、市販のパパインやカテプシンなどのシステイン・プロテアーゼと混合後、混合後のプロテアーゼがベンジルオキシカルボニル・フェニルアラニン−アルギニン−７−アミド−４−メチルクマリン基質に対する活性を維持しているかを調べることによって、判定することができる。
【００１８】
また、或るポリペプチドがマダニ媒介性病原体に対する増殖阻止活性を有するか否かは、例えば、ウシバベシア原虫をペプチドを含む培養液でインビトロ培養し、経時的にギムザ染色塗抹標本を鏡検して原虫の増殖(パラシテミア)を確認することにより判定することができ、より具体的には、実施例１０に示す方法により判定することができる。
【００１９】
本発明のポリペプチドである「配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチド」としては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチド（好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はその１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列からなるポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なシグナル配列及び／又はマーカー配列等が付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、シスタチン活性を有する融合ポリペプチド；あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はその１９番〜１３１番のアミノ酸からなるポリペプチドと、融合用パートナーとの融合ポリペプチドであって、しかも、シスタチン活性を有する融合ポリペプチドを挙げることができる。
【００２０】
前記マーカー配列としては、例えば、ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧタグ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを用いることができる。
【００２１】
また、前記融合用パートナーとしては、例えば、精製用ポリペプチド［例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の全部又は一部］、検出用ポリペプチド［例えば、ヘムアグルチニン又はβ−ガラクトシダーゼαペプチド（ＬａｃＺ α）の全部又は一部］、又は発現用ポリペプチド（例えば、シグナル配列）などを用いることができる。
【００２２】
更に、前記融合ポリペプチドにおいては、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はその１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列からなるポリペプチドと前記マーカー配列又は融合用パートナーとの間に、限定分解するタンパク質分解酵素（例えば、トロンビン、血液凝固因子Ｘａ、エントロキナーゼ、ＴＥＶプロテアーゼなど）で切断することができるアミノ酸配列を適宜導入することもできる。
【００２３】
本発明の機能的等価改変体は、配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、全体として１又は数個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜７個、更に好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチドである限り、特に限定されるものではなく、その起源もフタトゲチマダニに限定されない。
【００２４】
例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はその１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列からなるポリペプチドのフタトゲチマダニにおける変異体が含まれるだけでなく、フタトゲチマダニ以外の生物（例えば、その他のマダニ類、又はヒメダニ類）由来の機能的等価改変体が含まれる。更には、それらの天然ポリペプチド（すなわち、フタトゲチマダニ由来の変異体、あるいは、フタトゲチマダニ以外の生物由来の機能的等価改変体）をコードするポリヌクレオチドを元にして、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はその１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列をコードするポリヌクレオチドを元にして、遺伝子工学的に、コードするアミノ酸配列を人為的に改変したポリヌクレオチドを用いて製造したポリペプチドなどが含まれる。なお、本明細書において「変異体」（variation）とは、同一種内の同一ポリペプチドにみられる個体差、あるいは、数種間の相同ポリペプチドにみられる差異を意味する。
【００２５】
配列番号２で表されるアミノ酸配列又はその１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列からなるポリペプチドのフタトゲチマダニにおける変異体、あるいは、フタトゲチマダニ以外の生物由来の機能的等価改変体は、当業者であれば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列（例えば、配列番号１で表される塩基配列における７２番〜４６７番の塩基からなる配列）、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列（例えば、配列番号１で表される塩基配列における１２６番〜４６７番の塩基からなる配列）の情報を基にして、取得することができる。なお、遺伝子組換え技術については、特に断りがない場合、公知の方法（例えば、Sambrookら,“Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harber Laboratory Press, 1989）に従って実施することが可能である。
【００２６】
例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はその１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列の情報を基にして適当なプライマー又はプローブを設計し、前記プライマー又はプローブと、目的とする生物（例えば、その他のマダニ類、又はヒメダニ類）由来の試料（例えば、全ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ画分、ｃＤＮＡライブラリー、又はファージライブラリー）とを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（Saiki, R. K. ら, Science, 239, 487-491, 1988）又はハイブリダイゼーション法を実施することにより、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させ、発現したポリペプチドが、シスタチン活性を有することを確認することにより、所望のポリペプチドを取得することができる。
【００２７】
また、前記の遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドは、常法、例えば、部位特異的突然変異誘発法（site-specific mutagenesis; Mark, D. F. ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666, 1984）により、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させ、発現したポリペプチドが、シスタチン活性を有することを確認することにより、所望のポリペプチドを取得することができる。
【００２８】
本発明の相同ポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はその１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列との相同性が５０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチドである限り、特に限定されるものではない。本発明の相同ポリペプチドとしては、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はその１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列に関して、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなることができる。なお、本明細書における前記「相同性」とは、Clustal program（Higgins及びSharp, Gene, 73, 237-244, 1988; 並びにThompsonら, Nucleic Acid Res., 22, 4673-4680, 1994）により、デフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値を意味する。
【００２９】
これらの本発明の新規ポリペプチドは、種々の公知の方法によって製造することができ、例えば、本発明の前記ポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドを用いて公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。より具体的には、後述する本発明の形質転換体（すなわち、本発明のポリヌクレオチドを含む形質転換体）を、本発明による新規ポリペプチドの発現が可能な条件下で培養し、ポリペプチドの分離及び精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から目的ポリペプチドを分離及び精製することにより調製することができる。前記の分離及び精製方法としては、例えば、硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、又は凍結乾燥等を挙げることができる。
【００３０】
また、本発明には、本発明によるポリペプチドの断片も含まれる。本発明による前記断片は、本発明による医薬の有効成分として、あるいは、本発明の抗体を調製するための抗原として有用である。
【００３１】
［２］本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではなく、例えば、配列番号１で表される塩基配列における１２６番〜４６７番の塩基からなる配列を含むポリヌクレオチド［例えば、配列番号１で表される塩基配列における７２番〜４６７番の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチド（すなわち、フタトゲチマダニのシスタチン前駆体をコードする遺伝子（Ｈｌｃｙｓｔ遺伝子））、配列番号１で表される塩基配列における１２６番〜４６７番の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチド（シグナルペプチドを含まない成熟体をコード）、あるいは、配列番号１で表される塩基配列（すなわち、全長）からなるポリヌクレオチド］、あるいは、配列番号１で表される塩基配列における７２番〜４６７番又は１２６番〜４６７番の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、ガレクチン活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
【００３２】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、フタトゲチマダニのシスタチンをコードするＤＮＡ配列とＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに９０％以上の相同性、好ましくは９５％以上の相同性、より好ましくは９７％以上の相同性が配列間に存在するときのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。通常、完全ハイブリッドの融解温度より約５℃〜約３０℃、好ましくは約１０℃〜約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、J.Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載されており、ここに記載の条件を使用することができる。例えば、ストリンジェントな条件としてハイブリダイゼーションを６５℃で一晩実施し、非特異反応を除去するための洗浄を２×ＳＳＣを用いて室温で５分間行った後、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣを用いて６５℃で３０分間の洗浄を２回繰り返すことなどが挙げられる。なお、２ＸＳＳＣの組成は、０．３ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ及び３０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）である。
【００３３】
［３］本発明のベクター及び形質転換体
本発明のベクターは、本発明による前記ポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明による前記ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるベクターを挙げることができる。
【００３４】
また、本発明の形質転換体も、本発明による前記ポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、本発明による前記ポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、本発明による前記ポリヌクレオチドを含むベクターの形で含有する形質転換体であることもできる。また、本発明によるポリペプチドを発現している形質転換体であることもできるし、あるいは、本発明によるポリペプチドを発現していない形質転換体であることもできる。本発明の形質転換体は、例えば、本発明による前記ベクターにより、あるいは、本発明による前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。
【００３５】
前記宿主細胞としては、例えば、通常使用される公知の微生物、例えば、大腸菌又は酵母（Saccharomyces cerevisiae）、あるいは、公知の培養細胞、例えば、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、又はＣＯＳ細胞）又は昆虫細胞（例えば、ＢｍＮ４細胞）を挙げることができる。
【００３６】
また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば、大腸菌に対しては、ｐＵＣ、ｐＴＶ、ｐＧＥＸ、ｐＫＫ、又はｐＴｒｃＨｉｓを；酵母に対しては、ｐＥＭＢＬＹ又はｐＹＥＳ２を；ＣＨＯ細胞に対してはｐｃＤＮＡ３又はｐＭＡＭｎｅｏを；ＨＥＫ−２９３細胞に対してはｐｃＤＮＡ３を；ＣＯＳ細胞に対してはｐｃＤＮＡ３を；ＢｍＮ４細胞に対しては、カイコ核多角体ウイルス（ＢｍＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（例えば、ｐＢＫ２８３）を挙げることができる。更に、公知の発現ベクターとしては、遺伝子治療用のベクターとして使用することのできるウイルスベクター、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、又はセンダイウイルス等を挙げることができる。
【００３７】
［４］本発明の医薬
本発明の医薬（好ましくはマダニに対するワクチン）は、有効成分として、本発明のポリペプチド若しくはその断片、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明のベクターを含む。すなわち、本発明においては、本発明のポリペプチド若しくはその断片、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明のベクターを、それ単独で、又は好ましくは薬剤学的若しくは獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、マダニ駆除の必要な動物、好ましくは哺乳動物（特には、ヒト）に経口的に又は非経口的に投与することができる。
【００３８】
本発明の医薬における前記有効成分である、本発明のポリペプチド若しくはその断片、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明のベクターをマダニワクチンとして投与すると、抗体産生を誘導することができ、宿主の再感染防御能を介してダニを駆除することができる。また、その結果として、マダニ媒介性感染症（例えば、人獣のピロプラズマ症、Ｑ熱、又はウイルス性脳炎など）の治療又は予防が可能である。
【００３９】
すなわち、本発明の医薬組成物（好ましくは、マダニ駆除用医薬組成物、あるいは、マダニ媒介性感染症の治療又は予防用医薬組成物）は、有効成分としての本発明のポリペプチドもしくはその断片、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明のベクターと、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる担体又は希釈剤とを含む。本発明における有効成分である、本発明のポリペプチド若しくはその断片、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明のベクターは、前記医薬（好ましくは、マダニ駆除用医薬、あるいは、マダニ媒介性感染症の治療又は予防用医薬）を製造するために使用することができる。
【００４０】
本発明の医薬をマダニワクチンとして使用する場合、本発明のポリペプチドの断片としては、投与対象に投与した場合に、前記断片に対して免疫を誘導するのに充分な断片である限り、特に限定されるものではなく、当業者であれば適宜選択することができる。
【００４１】
本発明の医薬（特にはマダニワクチン）では、例えば、本発明のポリペプチドをアジュバント等と混合して、マダニに対するワクチンとして、適当な間隔で動物（例えば、家畜等）に接種することができる。あるいは、本発明のポリペプチドを直接、適当な溶媒に溶解又は懸濁して使用することもできるし、リポソーム中に封入したり、適当なベクターに組み込んだ形にして使用することもできる。また、必要に応じて、本発明のポリペプチドに薬学的に許容し得る担体を添加し、例えば、注射剤、錠剤、カプセル剤、点眼剤、クリーム剤、坐剤、噴霧剤、又はパップ剤等の適当な剤型にして使用することができる。
【００４２】
薬学的に許容し得る担体には、当業者には周知の溶媒、基剤、安定化剤、防腐剤、溶解剤、賦形剤、及び緩衝剤等が含まれる。本発明の医薬に含有される本発明のポリペプチドは、このような剤型とした場合、例えば、投与対象の年齢、性別、疾患の種類、又は程度等に応じて、その投与方法及び投与量を適宜設定して使用することができる。
【００４３】
経口投与には舌下投与を含む。非経口投与としては、例えば、吸入、経皮投与、点眼、膣内投与、関節内投与、直腸投与、動脈内投与、静脈内投与、局所投与、筋肉内投与、皮下投与、及び腹腔内投与等から適当な方法を選んで投与することができる。
【００４４】
［５］本発明の抗体又はその断片
本発明のポリペプチドに反応する抗体（例えば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）は、各種動物に、本発明のポリペプチド、又はその断片を直接投与することで得ることができる。また、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入したプラスミドを用いて、ＤＮＡワクチン法[Raz, E.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9519-9523 (1994); 又はDonnelly, J.J.ら, J. Infect. Dis., 173, 314-320, (1996）]によっても得ることができる。
【００４５】
ポリクローナル抗体は、例えば、本発明のポリペプチド又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、腹腔、皮下、又は静脈等に免疫して感作した動物（例えば、ウサギ、ラット、ヤギ、又はニワトリ等）の血清又は卵から製造することができる。このように製造された血清又は卵から、常法のポリペプチド単離精製法によりポリクローナル抗体を分離精製することができる。そのような分離精製方法としては、例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、又はＤＥＡＥ−セルロース、ハイドロキシアパタイト、若しくはプロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法を挙げることができる。
【００４６】
モノクローナル抗体は、例えば、ケーラーとミルスタインの細胞融合法 [Kohler, G.及びMilstein, C., Nature, 256, 495-497(1975）]により、当業者が容易に製造することが可能である。すなわち、本発明のポリペプチド又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、数週間おきにマウスの腹腔、皮下、又は静脈に数回繰り返し接種することにより免疫する。最終免疫後、脾臓細胞を取り出し、ミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを作製する。
【００４７】
ハイブリドーマを得るためのミエローマ細胞としては、例えば、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損又はチミジンキナーゼ欠損のようなマーカーを有するミエローマ細胞（例えば、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．Ｕ１）を利用することができる。また、融合剤としては、例えば、ポリエチレングリコールを利用することができる。更には、ハイブリドーマ作製における培地として、例えば、イーグル氏最小必須培地、ダルベッコ氏変法最小必須培地、又はＲＰＭＩ−１６４０などの通常よく用いられている培地に、１０〜３０％のウシ胎仔血清を適宜加えて用いることができる。融合株は、ＨＡＴ選択法により選択することができる。ハイブリドーマのスクリーニングは培養上清を用い、ＥＬＩＳＡ法又は免疫組織染色法などの周知の方法により行ない、目的の抗体を分泌しているハイブリドーマのクローンを選択することができる。また、限界希釈法によってサブクローニングを繰り返すことにより、ハイブリドーマの単クローン性を保証することができる。このようにして得られるハイブリドーマは、培地中で２〜４日間、あるいは、プリスタンで前処理したＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔内で１０〜２０日間培養することで、精製可能な量の抗体を産生することができる。
【００４８】
このように製造されたモノクローナル抗体は、培養上清又は腹水から常法のポリペプチド単離精製法により分離精製することができる。そのような分離精製方法としては、例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、又はＤＥＡＥ−セルロース、ハイドロキシアパタイト、若しくはプロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法を挙げることができる。
【００４９】
また、モノクローナル抗体又はその一部分を含む抗体断片は、前記モノクローナル抗体をコードする遺伝子の全部又は一部を発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞（例えば、大腸菌、酵母、又は動物細胞）に導入して生産させることもできる。
【００５０】
以上のように分離精製された抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）について、常法により、ポリペプチド分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）によって消化を行ない、引き続き、常法のポリペプチド単離精製法により分離精製することで、活性のある抗体の一部分を含む抗体断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖを得ることができる。
【００５１】
更には、本発明のポリペプチドに反応する抗体を、クラクソンらの方法又はゼベデらの方法 [Clackson, T.ら, Nature, 352, 624-628 (1991); 又はZebedee, S. ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 3175-3179 (1992）] により、一本鎖（single chain）Ｆｖ又はＦａｂとして得ることも可能である。また、マウスの抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置き換えたトランスジェニックマウス [Lonberg, N. ら, Nature, 368, 856-859 (1994)] に免疫することで、ヒト抗体を得ることも可能である。
【００５２】
［６］本発明のスクリーニング方法並びにそのスクリーニング結果物又は本発明の抗体を含む医薬
本発明のポリペプチドを用いると、試験物質が、本発明のポリペプチドのシスタチン活性を修飾（例えば、抑制又は促進）するか否かをスクリーニングすることができる。本発明には、本発明のポリペプチドを含むスクリーニングキットが含まれる。
【００５３】
本発明のスクリーニング方法にかけることのできる試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術 [Terrett, N. K. ら, Tetrahedron, 51, 8135-8137 (1995)] 又は通常の合成技術によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法 [Felici, F. ら, J. Mol. Biol., 222, 301-310 (1991)] などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。更には、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物（ペプチドを含む）を、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることができる。
【００５４】
本発明のスクリーニング方法においては、本発明のポリペプチドと試験物質とを接触させ、前記試験物質の存在下における、本発明のポリペプチドのシスタチン活性を分析することにより、前記試験物質が、本発明のポリペプチドのシスタチン活性を修飾するか否かを判断することができる。試験物質の不在下における本発明のポリペプチドのシスタチン活性と比較して、試験物質の存在下における前記シスタチン活性が減少する場合には、前記試験物質が、本発明のポリペプチドのシスタチン活性を抑制又は阻害すると判断することができる。一方、シスタチン活性が上昇する場合には、前記試験物質が、本発明のポリペプチドのシスタチン活性を促進すると判断することができる。
【００５５】
シスタチン活性を抑制する物質（すなわち、シスタチン阻害剤）は、寄生虫駆除剤の有用な候補物質であり、例えば、マダニ駆除、又はマダニ媒介性感染症（例えば、人獣のピロプラズマ症、Ｑ熱、又はウイルス性脳炎など）の治療若しくは予防に用いることができる。シスタチン阻害剤としては、例えば、シスタチン中和抗体、構造活性相関に基づく親和物を公知のものとして挙げることができる。
【００５６】
本発明における有効成分、すなわち、シスタチン阻害剤は、所望により、種々の形態で投与することができる。このような投与形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、あるいは、注射剤、点滴剤、座薬などによる非経口投与を挙げることができる。本発明の医薬は、公知の方法によって製造することができ、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含むことができる。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射剤は、前記有効成分を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁又は乳化することによって調製することができる。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用可能であり、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用しても良い。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用しても良い。その投与量は、症状、年齢、体重、及び／又は投与経路に応じて適宜決定することができ、医師の判断及び各患者の状況に応じて決定することができる。有効用量は、例えば、インビトロにおける試験又はインビボの動物モデル試験系から導くことができる。
【００５７】
［７］本発明の抗原虫剤
本発明の抗原虫剤は、有効成分として、シスタチンを含む。
本発明においては、シスタチンを、それ単独で、又は好ましくは薬剤学的若しくは獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、原虫駆除の必要な動物、好ましくは哺乳動物（特には、ヒト）に経口的に又は非経口的に投与することができる。また、本発明における有効成分であるシスタチンは、抗原虫剤を製造するために使用することができる。
【００５８】
本発明の抗原虫剤の適当対象である原虫としては、特に限定されるものではないが、例えば、バベシア原虫（例えば、ウシバベシア原虫のバベシアボビス、バベシアビゲミナ、バベシアオバタ、イヌバベシア原虫のバベシアカニス、バベシアギブソニ、ウマバベシア原虫のバベシアカバリ、バベシアエクイ）、タイレリア原虫（例えば、ウシタイレリア原虫のタイレリアオリエンターリス、タイレリアブッフェリ、タイレリアパルバ、タイレリアアヌラータ）を挙げることができる。
【００５９】
本発明の抗原虫剤に用いることのできるシスタチンとしては、本発明の新規ポリペプチドを使用することができるだけでなく、公知の各種シスタチンを使用することができる。前記シスタチンとしては、脊椎動物（例えば、ほ乳類）、無脊椎動物（例えば、線虫、昆虫）、原虫、植物に由来する天然シスタチン、あるいは、シスタチン活性を有する改変タンパク質を用いることができ、タイプ２に属するシスタチンが好ましい。
【００６０】
後述の実施例１０に示すように、本発明の抗原虫剤の有効成分であるシスタチンは、インビトロで媒介バベシア原虫の増殖を抑制することができる。
本発明の抗原虫剤は、所望により、種々の形態で投与することができ、例えば、前記の［４］本発明の医薬、あるいは、［６］本発明のスクリーニング方法並びにそのスクリーニング結果物又は本発明の抗体を含む医薬において先述した形態で投与することができる。
【００６１】
また、本発明は、前記ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、動物の治療を目的とした治療的化合物、並びにその応用も含まれる。本発明のフタトゲチマダニのシスタチンタンパク質及び核酸は、マダニ媒介性病原体が属するウイルス、細菌、原虫、寄生虫を含むマダニ媒介性病原体による人又は動物の寄生虫病予防及び／又は治療を目的とした化合物の合成及び治療薬の開発に応用することができる。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、以下の実施例においては、各種分子生物学、ダニ学、節足動物学、免疫学、及び生化学的な技術を用いた。これらの技術は、Sambrook, Ｊ．ら, Molecular Cloning, a laboratory manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Harlow E. ら, Antibodies, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)やその関連書を参考にした。また、ＤＮＡ解析ソフトとしては、MacVectorTM（Oxford Molecular社）を使用した。
【００６３】
《実施例１：シスタチンをコードする遺伝子の単離及び塩基配列決定》
家兎を吸血４日目のフタトゲチマダニ（Haemaphysalis longicornis）の雌成ダニ５００匹から、中腸組織を実体顕微鏡下で摘出した。これらから直ちに、アシッドグアニジニウム（Acid Guanidinium）−フェノール−クロロホルム法［Chomczynski et al., Anal Biochem 162: 156-159 (1987)］（AGPC法）を用いて全ＲＮＡを調製し、この５μｇを使用し、Ｇ−キャッピング法（G-Capping法）による完全長ｃＤＮＡ合成を行った。pGCAPベクター［Kato et al., DNA Res. 12: 53-62(2005)］に２本鎖ｃＤＮＡがインサートされたプラスミドは、フェノール抽出後、エタノール沈殿により回収し、ＴＥ緩衝液に溶解した。得られたプラスミド溶液は、DH5αコンピテント細胞（Takara社）と混合し、エレクトロポレーション法により形質転換を行い、寒天培地に蒔いて培養した。
【００６４】
得られたｃＤＮＡライブラリーのサイズは約１ｘ１０５個の形質転換体を含むもので、直ちにライブラリーの予備的なインサート確認を実施した結果、ｃＤＮＡの完全長率は、９２％と極めて高率であった。作製したｃＤＮＡライブラリーに含まれる形質転換体から順次、プラスミドＤＮＡを単離・精製し、このプラスミドを鋳型にして５’端側よりサイクルシーケンス反応を行い、ＤＮＡシーケンサー（ABI社製3730型シーケンサー）でｃＤＮＡの５’端塩基配列を決定した。この中腸のｃＤＮＡライブラリーから10,000クローンずつ選択し、５’端塩基配列を決定し、全クローンをGenBank（http://www.Ncbi.nih.gov/BLAST/）データベースを用いてＢＬＡＳＴＸ検索を実施した。この結果を表計算ソフトウェア（マイクロソフトExcel）のワークシート上でアノテーションし、アセンブルを行った。その結果、中腸のｃＤＮＡライブラリーは、有効クローンを8,304（83%）含有し、さらに完全長ｃＤＮＡクローンを7,639（92%）含有していることが示された。さらに、得られた有効クローンについてクラスターリング解析を行ったところ、中腸のｃＤＮＡライブラリーに3,433種類の遺伝子（クラスター）が含有されることが示され、この遺伝子の中から、シスタチンを同定した。
【００６５】
得られたｃＤＮＡの全長（配列番号１）は５６９ｂｐであり、ＯＲＦ（Open Reading Frame）は７２位〜４６７位にあり、１３１残基のアミノ酸（配列番号２）をコードしていることが確認され、推定分子量は１２．９ｋＤａであった。また、配列番号２で表されるアミノ酸配列における１番〜１８番のアミノ酸からなる配列は、シグナルペプチドであり、１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列は、フタトゲチマダニ・シスタチン成熟体のアミノ酸配列であった。予想されるアミノ酸配列をＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のＢＬＡＳＴ法にて相同性検索を行ったところ、これまでに報告されている他の生物のシスタチンタンパク質に高い相同性を有することが確認された。例えば、同じマダニ類とは、オルニソドロス・モウバタ（Ornithodoros moubata）のシスタチンとの相同性は４８％、イクソデス・リシヌス（Ixodes ricinus）のシスタチンとは４０％、イクソデス・スカピュラーリス（Ixodes scapularis）のシスタチンとは３４％の相同性であった。
【００６６】
《実施例２：シスタチン融合タンパク質の発現用ベクターの構築》
シグナルペプチド（配列番号２で表されるアミノ酸配列における１番〜１８番のアミノ酸からなる配列）を含まない、フタトゲチマダニ・シスタチン成熟体（配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列）をコードする遺伝子断片をＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲ産物をフェノール／クロロホルム処理した後に、エタノール沈澱法にて回収し、蒸留水中に溶解した。得られたＤＮＡ液を制限酵素EcoRIで消化した後に、電気泳動にて分離し、ＤＮＡ精製キット（Biotechnologies社）にて精製し、蒸留水中に回収した。一方、大腸菌発現用ベクターpGEX-4T3（Pharmacia Biotech社）を制限酵素EcoRIで消化した後に、アルカリホスファターゼにて脱リン酸化処理し、その後、ＰＣＲ産物と同様な方法にて精製した。
【００６７】
精製したＰＣＲ産物とベクターとを、ＤＮＡライゲーションキット（Takara社）を用いて、キットに添付のプロトコールに従って反応させた。大腸菌DH5α株をライゲーション反応産物にて形質転換させ、フタトゲチマダニ・シスタチン遺伝子ＯＲＦ断片がベクターのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（GST）と同一方向に挿入された組換えクローンを選択した。プラスミド精製キット（Qiagen社）にて組換えプラスミドを精製した。
【００６８】
《実施例３：組換えフタトゲチマダニ・シスタチン融合タンパク質の大腸菌による発現》
実施例２で得られた組換えプラスミドにて、大腸菌DH5α株を形質転換させた後、３７℃でアンピシリン含有ＬＢ培地で培養した。培養液のＯＤ６００ｎｍが０．３〜０．５に達した時点で、イソプロピルチオガラクトシド（IPTG）を最終濃度が０．５ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加し、更に３７℃で４時間培養を続けた。組換えタンパク質の発現は、１０％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動［Laemmli ら, Nature, 227, 680-685 (1970)］を実施した後、クーマシー染色で確認した。
【００６９】
結果を図１に示す。図１において、レーン１は分子量マーカー、レーン２は大腸菌ライセート（ＩＰＴＧ無添加）、レーン３は大腸菌ライセート（ＩＰＴＧ添加）、レーン４は精製した組換え融合タンパク質（実施例６参照）の泳動結果である。
その結果、約３８ｋＤａの組換えタンパク質の発現が認められ、ＧＳＴリーダータンパク質（２６ｋＤａ）とフタトゲチマダニ・シスタチンタンパク質（１３ｋＤａ）の融合タンパク質（以下、組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質と称する）
【００７０】
《実施例４：組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質のシステイン・プロテアーゼ活性阻害の測定》
組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質によるシステイン・プロテアーゼの活性阻害を、市販のパパイン（SIGMA社）、ヒトカテプシンＬ（SIGMA社）、ヒトカテプシンＢ（SIGMA社）を用いて確認した。なお、パパイン及びカテプシンＬはシステイン・プロテアーゼであり、カテプシンＢはアスパラギン酸プロテアーゼである。酵素活性の阻害試験は、リン酸ナトリウム（100 mmol/L）、ジチオトレイトール（DTT; 1 mmol/L）、及びＥＤＴＡ（2 mmol/L）を含有する反応緩衝液を用いて、溶解後のｐＨが、パパインはｐＨ６．５、カテプシンＬとカテプシンＢはｐＨ６．０になるようにして、すべて０．２μｍｏｌ／Ｌ溶液とした。組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質は、０、０．１、０．２、０．４、０．８、又は１．６μｍｏｌ／Ｌの濃度になるように、市販システイン・プロテアーゼの０．２μｍｏｌ／Ｌ溶液と混合した後に、ベンジルオキシカルボニル・フェニルアラニン−アルギニン−７−アミド−４−メチルクマリン基質（ペプチド研究所）１０μｍｏｌ／Ｌを加え、３７℃で３０分間反応させた。その後、蛍光マイクロリーダ（Thermo Electron社）を用い、３５５ｎｍの励起光と４６０ｎｍの放射光にてプロテアーゼ活性を測定した。
【００７１】
結果を図２に示す。その結果、組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質は高いシステイン・プロテアーゼ阻止活性を有していることが示された。すなわち、パパイン及びカテプシンＬの酵素活性は０．４μｍｏｌ／Ｌ以上の濃度の組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質によって顕著に阻害されることが認められたが、カテプシンＢの活性は阻害されなかった。
【００７２】
《実施例５：組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質の熱安定性の測定》
２５℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃、又は１００℃に組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質（４μｍｏｌ／Ｌ）を５分間置いた後に、その０．８μｍｏｌ／Ｌ濃度液を用いて、実施例４の方法で、市販パパイン０．２μｍｏｌ／Ｌ溶液に対する活性阻害を検討した。
【００７３】
結果を図３に示す。その結果、組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質は５０℃でも活性を維持しており、７０℃以上の高温でシステイン・プロテアーゼに対する阻止活性を消失することが示された。
【００７４】
《実施例６：組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質の抗血清の調製、及びイムノブロット法によるネイティブ（天然型）シスタチンの同定》
実施例３で述べた方法により、大腸菌で発現させた組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質を、市販のキット（Pharmacia Biotech社）に添付のプロトコールに従って精製した。この１００μｇを含む溶液２００μＬと、フロイント完全アジュバント（Adjuvant Complete Freund; Difco社）２００μＬとを混合した後に、ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢，雌）に腹腔内接種した。腹腔内接種から２週間及び４週間経過後に、それぞれ、組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質１００μｇをフロイント不完全アジュバント（Difco社）と混合し、追加接種を行なった。最終接種後から２週目に採血し、得られた血清を−２０℃に保存した。得られた抗組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質マウス血清を用い、イムノブロット法［Towbin et al., Proc Natl Acad Sci USA 76: 4350-4354 (1979)］にて天然型シスタチンタンパク質の同定を行なった。なお、試料として、４日間家兎を吸血した雌成ダニの中腸と唾液腺ライセートを使用した。
【００７５】
結果を図４に示す。図４において、レーン１は、分子量マーカーの泳動結果であり、レーン２、３は、それぞれ中腸ライセート、唾液腺ライセートの泳動結果であり、レーン４は、組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質の泳動結果である。図４に示すように、中腸ライセートにおいて約１５ｋＤａの特異的バンドが検出された。天然型シスタチンタンパク質の分子量が推定理論値と一致すると考えられた。なお、免疫前の血清と組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質やダニのライセートとの反応は認められなかった。
【００７６】
《実施例７：天然型シスタチンのフタトゲチマダニの各発育期と主要内部器官における発現分布》
フタトゲチマダニの卵、幼ダニ、若ダニ、成ダニの全発育期と、家兎を４日間吸血して半飽血状態の雌ダニの主要内部器官における天然型シスタチンの発現分布について、常法に従って、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法によりｍＲＮＡ発現の分析を実施した。ＲＴ−ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ発現分析の発育期別の結果を図５に、臓器別の結果を図６に示す。
【００７７】
図５において、記号ＥＧ、ＬＡ、ＮＹ、ＡＤは、それぞれ、卵（egg）、未吸血幼ダニ（larvae）、未吸血若ダニ（nympha）、未吸血雌成ダニ（adult）のフタトゲチマダニの個体（whole tick）由来のＲＮＡの結果であることを意味する。また、図６において、記号ＳＧ、ＭＤ、ＯＶ、ＨＣ、ＦＢは、それぞれ、前記フタトゲチマダニの唾液腺（salivary glands）、中腸組織（midguts）、卵巣（ovaries）、ヘモサイト（hemocytes）、及び脂肪体（fat body）由来のＲＮＡの結果であることを意味する。図５及び図６の結果が示すとおり、天然型シスタチンは、全発育期において発現し、雌成ダニの体内臓器別では、主に中腸組織、微量がヘモサイトにおいて発現することが確認された。
【００７８】
《実施例７：天然型シスタチンのフタトゲチマダニの吸血にともなう発現の増加》
フタトゲチマダニの雌成ダニを家兎に吸血させ、吸血後１日目、４日目、７日目（飽血）の雌ダニ体内における天然型シスタチンの発現の推移について、常法に従って、ＲＴ−ＰＣＲ法によりｍＲＮＡ発現の分析を実施した。ＲＴ−ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ発現分析の結果を図７に示す。
【００７９】
図７において、天然型シスタチンは、マダニの吸血にともなって発現が増大し、飽血時（４〜７日目）において発現は最大になることが確認された。
【００８０】
《実施例８：天然型シスタチンの細菌リポタンパク質（ＬＰＳ）の接種にともなうフタトゲチマダニ体内における発現動態》
１０μＬのガラス毛細管（Microcap；Drummond Scientific社）の一端を加熱によって注射針状にしたものを用いて、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に０．１μｇ/ｍＬに溶解したＬＰＳ（Sigma社）を、１個体当たり１μＬ、フタトゲチマダニの未吸血雌成ダニ３０個体の第４基節付近から血体腔内に接種した。マダニは接種後６時間、２５℃に静置し、体内における天然型シスタチンの発現の推移を、常法に従ってＲＴ−ＰＣＲ法によりｍＲＮＡ発現の分析を実施した。ＬＰＳ接種の対照としては、ＰＢＳを１個体当たり１μＬ、合計３０個体に接種した。
【００８１】
結果を図８に示す。図８において、天然型シスタチンは、ＬＰＳの血体腔接種によって発現が対照の１．６倍に増大することが確認された。
【００８２】
《実施例９：天然型シスタチンのフタトゲチマダニのイヌバベシア感染にともなう発現動態》
１歳の摘脾ビーグル犬にイヌバベシア（Babesia gibsoni）のNRCPD株を実験感染させた [Fukumoto S.ら, J. Vet. Med. Sci., 63, 977-981 (2001)]。原虫寄生率（パラシテミア）が５％以上になったときに、雌成ダニを耳袋法で寄生させ、飽血個体を回収し、２５℃及び９０％相対湿度で産卵させた。１匹の雌ダニの産卵塊からふ化し２ヶ月後の幼ダニにおける天然型シスタチンの発現の推移を、常法に従ってＲＴ−ＰＣＲ法によりｍＲＮＡ発現の分析を実施した。あわせて、ＰＣＲ法によりダニ体内のイヌバベシアのｍＲＮＡの発現を調べ、幼ダニにおけるバベシア感染を確認した。
【００８３】
天然型シスタチンの発現に関する結果を、図９に示す。図９において、天然型シスタチンは、イヌバベシア感染幼ダニにおいて、発現が非感染幼ダニの１．８倍に増大することが確認された。
【００８４】
《実施例１０：組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質のインビトロ培養バベシア原虫に対する増殖抑制効果》
ウシバベシア原虫（Babesia bovis）のインビトロ培養方法［Bork S.ら, Am. J. Trop. Med. Hyg., 68, 334-340 (2003)］に従って、ウシバベシア原虫感染血液１００μＬを非感染ウシ赤血球で希釈してパラシテミアを１％に調整後、この０．１μＬに、１、２、又は３μｍｏｌ／Ｌの濃度で組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質を加えた０．９μＬの培養液（Growth medium）を加え、２４穴の培養プレートにて、３７℃で４日間培養した。組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質を加えた培養液は、０．９μＬを毎日更新し、更新直前に培養液のギムザ染色塗抹を作製して、原虫寄生赤血球数を鏡検し、寄生原虫の形態とパラシテミアの推移を検討することによって、ウシバベシア原虫の増殖に対する組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質の影響を確認した。なお対照として、組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質の代わりにＧＳＴ３μＬを加えた培養液で培養した系を用意した。
【００８５】
結果を図１０及び図１１に示す。図１０において、組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質は、インビトロで培養したウシバベシア原虫の発育を、用量依存的に阻止することが確認された。また、図１１において、組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質暴露下でインビトロ培養されたウシバベシア原虫は、寄生赤血球内において細胞変性と核濃縮などの形態変化を示し、発育と増殖に異常のあることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、又はベクターは、例えば、マダニ（特にはフタトゲチマダニ）媒介性感染症の治療又は予防、特にマダニワクチンの用途に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】組換えフタトゲチマダニ（Ｈｌ）シスタチン（ｃｙｓｔ）融合タンパク質の電気泳動の結果を示す、図面に代わる写真である。
【図２】組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質のシステイン・プロテアーゼ活性阻害の測定の結果を示すグラフである。
【図３】組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質の活性の熱安定性測定の結果を示すグラフである。
【図４】組換えフタトゲチマダニ（Ｈｌ）シスタチン（ｃｙｓｔ）融合タンパク質の電気泳動（イムノブロット）の結果を示す、図面に代わる写真である。
【図５】天然型シスタチンタンパク質のマダニの各発育期における発現を示すグラフである。
【図６】天然型シスタチンタンパク質のマダニの主要臓器における発現を示すグラフである。
【図７】天然型シスタチンタンパク質のマダニの吸血にともなう発現の変化を示すグラフである。
【図８】天然型シスタチンタンパク質の、ＬＰＳのマダニ血体腔への接種にともなう発現の増大を示すグラフである。
【図９】天然型シスタチンタンパク質の、マダニのバベシア感染にともなう発現の増大を示すグラフである。
【図１０】組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質のインビトロ培養ウシバベシア原虫（Babesia bovis）に対する増殖抑制効果を示すグラフである。
【図１１】組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質が、インビトロ培養されたウシバベシア原虫の発育と増殖に異常をもたらす結果を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マダニのシスタチン、それをコードする核酸分子及びそれらの利用に関する。
【０００２】
より詳細には、本発明は、マダニの生存に不可欠な吸血、及びこれによってマダニ体内に侵入する動物・ヒトの病原体に関わるタンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、及びそれらの使用に関する。ここで、動物・ヒトの病原体とは、世界的に甚大な被害をもたらすピロプラズマ症の病原体であるタイレリア又はバベシア原虫をはじめとする人獣共通細菌・ウイルスを意味する。具体的には、本発明は、宿主動物からの血液成分の摂取（すなわち吸血）と消化、ならびに吸血にともなってマダニ個体へ侵入した病原体に対して、中腸上皮や体内移行経路にあたる器官・組織で発現するシスタチンをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを保持する組換え体細胞、組換えペプチドタンパク質、及び合成ペプチドに関する。本発明により、マダニの吸血の予防と阻止、ピロプラズマ症をはじめとする人及び動物の感染症の予防及び治療を目的とした化合物の合成、あるいはそれら病原体による感染症の治療薬の開発に応用することができる。
【背景技術】
【０００３】
地球上に棲息する約５００属１５，０００種を越える吸血性節足動物の中で、マダニはわずか１９属約７５０種（５％）の弱小グループであるが、ヒト以外の動物では第１位、ヒトでは蚊に次いで第２位に重要な感染症媒介節足動物である。経済的被害からもマダニとマダニ媒介性疾病による世界の損害額は、畜産領域だけでも毎年１４０億米ドル以上（非特許文献１）にのぼり、その対策は世界各国で畜産振興上の最も重要な課題のひとつとなっている。マダニ防除の中心は化学療法剤などの薬剤利用に深く依存している。ＤＴＴが開発された１９５０年以降、シナプス後膜作用型のニコチン系、ネオニコチノイド系、神経伝達物質分解酵素型の有機燐系、カーバメート系、クロルジメフォルム、神経繊維膜作用型の塩素系、ピレスロイド系などの化合物が殺ダニ剤としてマダニ防除に使用されてきた。しかしながら、マダニは、薬剤の連続使用によるいわゆる薬剤耐性をいずれの薬剤に対しても獲得し、殺ダニ効果が減少あるいは消失したものも少なくない。さらに、薬剤の使用には常に人あるいは動物への副作用を考えなくてはならず、同時に、食と環境の安全性を脅かす薬物残留問題があり、消費者から敬遠される傾向にある。そのうえ、経済動物である家畜では、薬剤の使用には有効性や適用範囲に加えて、膨大な開発コストの面からも限界が生じつつある。
【０００４】
感染症媒介者（ベクター）としてのマダニは、マラリアベクターの蚊と比べて、ウイルス、リケッチア、細菌、原虫、寄生虫などほぼすべての種類の病原体の伝播に関与する他に比肩しうるもののない優れた疾病媒介能を有する。ヒトではマラリアが世界的に猛威を振るっていることはよく知られているが、動物（家畜・愛玩動物）ではマラリアに類似した感染症としてマダニが媒介するバベシアやタイレリアなどの原虫によるピロプラズマ症がある。本症は畜産・獣医学領域で最も被害の大きい寄生虫感染症であり、近年ではヒトでのバベシア症が世界各国で報告され、新興人獣共通感染症のひとつにあげられている。
【０００５】
感染症予防の最大の武器はワクチンであるが、寄生虫ワクチン（多大な資金と精力的なワクチン開発が行われているマラリアに対しても）の開発は困難を極めている。進化した生活環を有する寄生虫では、動物・ヒトの獲得防御免疫に関する主要な寄生虫由来の抗原や免疫誘導機構など、不明な点が多くあるためであるが、とりわけ重大なのは、寄生虫は高度に発達した免疫回避機構により宿主の免疫監視から逃れるシステムを発達させており、防御免疫の獲得が困難なことにある。このようなことからタイレリアやバベシアなどのピロプラズマ原虫についても例外ではなく、ピロプラズマ症の発症をもたらす宿主体内ステージに焦点をあてた研究開発からはワクチンを生まれていない。
【０００６】
一方、マダニの頻回寄生に対して宿主が抵抗性を獲得する現象を応用した獲得免疫によるマダニ防除法が以前から試みられている（非特許文献２）。また、宿主への接触が全くないマダニタンパク質がマダニ感染に対する防御抗原となることも明らかにされ、実際にワクチン抗原（Tick GARD）（非特許文献３）として一部のマダニとマダニ媒介性病原体［例えば１宿主性のマダニ（Boophilus microplus）とその媒介するウシバベシア原虫］に対して野外応用されているものの、これらの効果は限定的であり、他のワクチン抗原との併用による効果増大の必要性が指摘されるなど、多くのマダニとマダニ媒介性病原体に対するワクチンは依然として開発途上にあり、病原体側のマダニ媒介性病原体の防除対策もマダニと同様に薬剤に深く依存しているのが実情である。このように２１世紀におけるマダニとマダニ媒介性病原体による人及び家畜生産の被害を既存の薬剤使用によって防ぐことは、非常に難しい状況にある。
【０００７】
シスタチンは、パパイン・ファミリーのシステイン・プロテアーゼに対して阻害活性を有するインヒビター群である。１９６０年代に鶏の卵白から初めて報告された後、現在、分布は、原虫、線虫、昆虫、植物、ほ乳類まで様々な生物で広く存在が知られている。マダニシスタチンとしては、ヒメダニの１つであるオルニソドロス・モウバタ（Ornithodoros moubata）由来のシスタチン、あるいは、ヒトのライム病のベクターであるマダニ属のイクソデス・リシヌス（Ixodes ricinus）とイクソデス・スカピュラーリス（Ixodes scapularis）由来のシスタチン［NCBI (National Center for Biotechnology Information)、BLASTP (Protein-protein Basic Local Alignment Search Tool) サーチ, Accession No. AY521024、AJ547803、AF483724］の塩基配列及びアミノ酸配列がそれぞれ決定されている（非特許文献４）。また、米国のヒト、イヌ、ネコのエールリヒア症の病原体（Ehrlichia chaffeensisやEhrlichia ewingii）のベクターであるキララマダニ属の１種のアンブリオンマ アメリカナム（Amblyomma americanum）では、シスタチンのRNA干渉法による機能の解明が試みられている（非特許文献５）。しかしながら、マダニのシスタチンの全塩基配列の単離や特性解明に関しては、いずれのマダニにおいても実証されるに至っていない。
【０００８】
【非特許文献１】ベテリナリー・パラシトロジー(Veterinary Parasitology), （オランダ国）,1997年, 71巻, 77-97頁
【非特許文献２】「ナショナルインスティチュート・オブ・アニマルヘルス・クオータリー（トウキョウ）(National Institute of Animal Health Quarterly、Tokyo)，1978年，18巻，27-38頁
【非特許文献３】「プラシトロジー・トゥデー（Parasitology Today）」，（オランダ国），1999年，15巻，258-262頁
【非特許文献４】「ザ・ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・バイオロジー（The Journal of Experimental Biology）」，（英国），2002年，205巻，2843-2864頁
【非特許文献５】「バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ」（Biochemical Biophysical Research Communications），（オランダ国），2005年，334巻，1336-1342頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者及びその共同研究者は約２０年来にわたって継代してきた日本の最優占種であるフタトゲチマダニを用いて、その防除とこれが媒介するピロプラズマ原虫（Theileria orientalis、Babesia ovata、Babesia gibsoni）などの疾病媒介の予防・治療に関するプロジェクト研究を推進してきてきた。近年、本発明者らは、マダニ個体における様々な生物活性分子が、マダニの吸血・消化と病原体伝搬において果たす役割と機構の大きさに着目してきたが、今回、解析の結果から、吸血・消化ならびにマダニ体内に侵入する原虫などの病原体によって中腸上皮とヘモサイトにおける発現が上方調節され、マダニの吸血生理と自然免疫に関わる分子と想定されるシスタチンの単離に成功した。
【００１０】
シスタチンは、選択的にまた特異的にシステイン・プロテアーゼの活性を阻害する細胞内あるいは細胞外に局在するタンパク質であり、アミノ酸配列などの構造特性の相違によって、タイプ１〜３の３群に分類される。分布は、脊椎動物のほ乳類から線虫、昆虫などの無脊椎動物、原虫、植物にも広く存在が知られている。機能的には不明な点が残されているが、生物のタンパク質の代謝回転に代表される生命現象の基本部分を担うとともに、病原体の侵入、ガン、神経変性疾患やアポトーシスといった様々な病態において大きな動態を示し、重要な役割を有することが判明している［Dubin G. Cell Mol Life Sci. 62:653-669(2005)］。しかしながら、マダニに関しては、シスタチンが重要であるとの報告はこれまでなかった。
【００１１】
本発明は、マダニとマダニが媒介する感染症から、人及び動物を守るための化合物を提供し、ウイルス、細菌、原虫、寄生虫などの様々なマダニ媒介性病原体による感染症の防除法を提供するものである。具体的には、マダニのシスタチン、前記感染防御抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを保持する組換え体細胞、マダニのシスタチンに対する抗体などの阻害剤、並びにマダニ媒介性病原体の感染及び増殖を防ぐ化合物の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、偏性吸血動物としてのマダニでは、その生存に必須の宿主からの吸血にともなう中腸における血液タンパク質の消化に働くシステイン・プロテアーゼなどの消化酵素群の活性の高まりに対して、あるいはまた吸血にともなって侵入してきたピロプラズマ原虫などの各種病原体の侵入に対して、局所的に細胞上皮で産生される何らかの応答性の生物活性分子があることを想定した。本発明者は、マダニの吸血・消化機構と病原体媒介能は偶然に成立したものではなく、長い年月をかけて成立した分子間相互作用を基盤にしているものと想定しており、今回、フタトゲチマダニにおいて、吸血、細菌細胞外膜リポ多糖（LPS）の接種、ならびにバベシア原虫感染にともなって、中腸における発現が著しく上方調節され、しかもインビトロで媒介バベシア原虫の増殖を抑制するシスタチンを突き止めた。このようなことから、マダニのシスタチンは、マダニの吸血によって惹起される中腸における血液タンパク質の消化に関わる酵素の活性調節と、吸血にともなう病原体侵入と伝搬に関わる自然免疫において、重要な役割を果たしているものと考えられる。また、蛋白性レギュレーターあるいはプロテクタントを活用した創薬を目指す上で、マダニのシスタチンは大きな可能性を秘めていると推察することができる。今回単離したフタトゲチマダニ・シスタチンは、バベシアなどのピロプラズマ原虫に限らず、マダニが媒介する野兎病、Ｑ熱、ウイルス性脳炎などの伝搬防除にも応用することができる。これまで、マダニの吸血、ならびにマダニが媒介する病原体の発育・生存において、シスタチンが重要であるとの報告はなく、マダニのシスタチンをコードする遺伝子及びその組換えタンパク質は、マダニ媒介性感染症の予防・防除を目的とした化合物の作出に有効である。
【００１３】
すなわち、本発明は、
［１］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチド、
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、シスタチン活性を示すポリペプチド、又は
（４）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が５０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチド；
［２］［１］のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［３］［２］のポリヌクレオチドを含むベクター；
［４］［２］のポリヌクレオチドを含む形質転換体；
［５］［４］の形質転換体を培養する工程を含む、［１］のポリペプチドを製造する方法；
［６］［１］のポリペプチド若しくはその断片、［２］のポリヌクレオチド、又は［３］のベクターを有効成分として含む、医薬；
［７］マダニに対するワクチンである、［６］の医薬；
［８］抗原虫剤である、［６］の医薬；
［９］［１］のポリペプチド若しくはその断片、［２］のポリヌクレオチド、又は［３］のベクターと、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる担体又は希釈剤とを含む、医薬組成物；
［１０］［１］のポリペプチド若しくはその断片、［２］のポリヌクレオチド、又は［３］のベクターを、マダニ駆除の必要な対象に、有効量で投与することを含む、マダニ駆除方法；
［１１］［１］のポリペプチド若しくはその断片、［２］のポリヌクレオチド、又は［３］のベクターを、マダニ媒介性感染症の治療又は予防の必要な対象に、有効量で投与することを含む、マダニ媒介性感染症の治療又は予防方法；
［１２］［１］のポリペプチドに対する抗体又はその断片；
［１３］［１］のポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、及び前記ポリペプチドのシスタチン活性を分析する工程を含む、前記ポリペプチドのシスタチン活性を修飾する物質のスクリーニング方法；
［１４］シスタチン阻害剤、又は［１２］の抗体若しくはその断片を有効成分として含む、マダニ駆除剤；
［１５］シスタチン阻害剤、又は［１２］の抗体若しくはその断片を有効成分として含む、マダニ媒介性感染症の治療又は予防剤；並びに
［１６］シスタチンを有効成分として含む、抗原虫剤
に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、形質転換体、及び抗体によれば、本発明の医薬、特にはマダニワクチンを提供することができる。また、本発明の医薬、特にはマダニワクチンによれば、例えば、マダニ駆除、又はマダニ媒介性感染症（例えば、人獣のピロプラズマ症、Ｑ熱、又はウイルス性脳炎など）の治療若しくは予防が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
［１］本発明のポリペプチド
本発明のポリペプチドには、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチド；
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）；及び
（４）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が５０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）
が含まれる。
【００１６】
本明細書において「シスタチン活性」とは、フタトゲチマダニのシスタチンタンパク質の生物学的活性を意味し、具体的には、例えば、システイン・プロテアーゼ（例えば、例えば、パパイン、カテプシンＬ）に対する結合活性及び／又は活性阻害活性を挙げることができる。
【００１７】
或るポリペプチドがシスタチン活性を有するか否かは、公知の方法に従って、判定することができる。例えば、或るポリペプチドがシステイン・プロテアーゼ活性の阻止能を有するか否かは、例えば、実施例４に示すように、Roche et al., Eur. J. Biochem 245:373-380(1997)に従って判定することができる。より具体的には、実施例４に示すように、ペプチドによるシステイン・プロテアーゼの活性阻害は、市販のパパインやカテプシンなどのシステイン・プロテアーゼと混合後、混合後のプロテアーゼがベンジルオキシカルボニル・フェニルアラニン−アルギニン−７−アミド−４−メチルクマリン基質に対する活性を維持しているかを調べることによって、判定することができる。
【００１８】
また、或るポリペプチドがマダニ媒介性病原体に対する増殖阻止活性を有するか否かは、例えば、ウシバベシア原虫をペプチドを含む培養液でインビトロ培養し、経時的にギムザ染色塗抹標本を鏡検して原虫の増殖(パラシテミア)を確認することにより判定することができ、より具体的には、実施例１０に示す方法により判定することができる。
【００１９】
本発明のポリペプチドである「配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチド」としては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチド（好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はその１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列からなるポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なシグナル配列及び／又はマーカー配列等が付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、シスタチン活性を有する融合ポリペプチド；あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はその１９番〜１３１番のアミノ酸からなるポリペプチドと、融合用パートナーとの融合ポリペプチドであって、しかも、シスタチン活性を有する融合ポリペプチドを挙げることができる。
【００２０】
前記マーカー配列としては、例えば、ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧタグ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを用いることができる。
【００２１】
また、前記融合用パートナーとしては、例えば、精製用ポリペプチド［例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の全部又は一部］、検出用ポリペプチド［例えば、ヘムアグルチニン又はβ−ガラクトシダーゼαペプチド（ＬａｃＺ α）の全部又は一部］、又は発現用ポリペプチド（例えば、シグナル配列）などを用いることができる。
【００２２】
更に、前記融合ポリペプチドにおいては、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はその１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列からなるポリペプチドと前記マーカー配列又は融合用パートナーとの間に、限定分解するタンパク質分解酵素（例えば、トロンビン、血液凝固因子Ｘａ、エントロキナーゼ、ＴＥＶプロテアーゼなど）で切断することができるアミノ酸配列を適宜導入することもできる。
【００２３】
本発明の機能的等価改変体は、配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、全体として１又は数個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜７個、更に好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチドである限り、特に限定されるものではなく、その起源もフタトゲチマダニに限定されない。
【００２４】
例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はその１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列からなるポリペプチドのフタトゲチマダニにおける変異体が含まれるだけでなく、フタトゲチマダニ以外の生物（例えば、その他のマダニ類、又はヒメダニ類）由来の機能的等価改変体が含まれる。更には、それらの天然ポリペプチド（すなわち、フタトゲチマダニ由来の変異体、あるいは、フタトゲチマダニ以外の生物由来の機能的等価改変体）をコードするポリヌクレオチドを元にして、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はその１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列をコードするポリヌクレオチドを元にして、遺伝子工学的に、コードするアミノ酸配列を人為的に改変したポリヌクレオチドを用いて製造したポリペプチドなどが含まれる。なお、本明細書において「変異体」（variation）とは、同一種内の同一ポリペプチドにみられる個体差、あるいは、数種間の相同ポリペプチドにみられる差異を意味する。
【００２５】
配列番号２で表されるアミノ酸配列又はその１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列からなるポリペプチドのフタトゲチマダニにおける変異体、あるいは、フタトゲチマダニ以外の生物由来の機能的等価改変体は、当業者であれば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列（例えば、配列番号１で表される塩基配列における７２番〜４６７番の塩基からなる配列）、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列（例えば、配列番号１で表される塩基配列における１２６番〜４６７番の塩基からなる配列）の情報を基にして、取得することができる。なお、遺伝子組換え技術については、特に断りがない場合、公知の方法（例えば、Sambrookら,“Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harber Laboratory Press, 1989）に従って実施することが可能である。
【００２６】
例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はその１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列の情報を基にして適当なプライマー又はプローブを設計し、前記プライマー又はプローブと、目的とする生物（例えば、その他のマダニ類、又はヒメダニ類）由来の試料（例えば、全ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ画分、ｃＤＮＡライブラリー、又はファージライブラリー）とを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（Saiki, R. K. ら, Science, 239, 487-491, 1988）又はハイブリダイゼーション法を実施することにより、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させ、発現したポリペプチドが、シスタチン活性を有することを確認することにより、所望のポリペプチドを取得することができる。
【００２７】
また、前記の遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドは、常法、例えば、部位特異的突然変異誘発法（site-specific mutagenesis; Mark, D. F. ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666, 1984）により、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させ、発現したポリペプチドが、シスタチン活性を有することを確認することにより、所望のポリペプチドを取得することができる。
【００２８】
本発明の相同ポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はその１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列との相同性が５０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチドである限り、特に限定されるものではない。本発明の相同ポリペプチドとしては、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はその１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列に関して、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなることができる。なお、本明細書における前記「相同性」とは、Clustal program（Higgins及びSharp, Gene, 73, 237-244, 1988; 並びにThompsonら, Nucleic Acid Res., 22, 4673-4680, 1994）により、デフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値を意味する。
【００２９】
これらの本発明の新規ポリペプチドは、種々の公知の方法によって製造することができ、例えば、本発明の前記ポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドを用いて公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。より具体的には、後述する本発明の形質転換体（すなわち、本発明のポリヌクレオチドを含む形質転換体）を、本発明による新規ポリペプチドの発現が可能な条件下で培養し、ポリペプチドの分離及び精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から目的ポリペプチドを分離及び精製することにより調製することができる。前記の分離及び精製方法としては、例えば、硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、又は凍結乾燥等を挙げることができる。
【００３０】
また、本発明には、本発明によるポリペプチドの断片も含まれる。本発明による前記断片は、本発明による医薬の有効成分として、あるいは、本発明の抗体を調製するための抗原として有用である。
【００３１】
［２］本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではなく、例えば、配列番号１で表される塩基配列における１２６番〜４６７番の塩基からなる配列を含むポリヌクレオチド［例えば、配列番号１で表される塩基配列における７２番〜４６７番の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチド（すなわち、フタトゲチマダニのシスタチン前駆体をコードする遺伝子（Ｈｌｃｙｓｔ遺伝子））、配列番号１で表される塩基配列における１２６番〜４６７番の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチド（シグナルペプチドを含まない成熟体をコード）、あるいは、配列番号１で表される塩基配列（すなわち、全長）からなるポリヌクレオチド］、あるいは、配列番号１で表される塩基配列における７２番〜４６７番又は１２６番〜４６７番の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、ガレクチン活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
【００３２】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、フタトゲチマダニのシスタチンをコードするＤＮＡ配列とＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに９０％以上の相同性、好ましくは９５％以上の相同性、より好ましくは９７％以上の相同性が配列間に存在するときのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。通常、完全ハイブリッドの融解温度より約５℃〜約３０℃、好ましくは約１０℃〜約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、J.Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載されており、ここに記載の条件を使用することができる。例えば、ストリンジェントな条件としてハイブリダイゼーションを６５℃で一晩実施し、非特異反応を除去するための洗浄を２×ＳＳＣを用いて室温で５分間行った後、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣを用いて６５℃で３０分間の洗浄を２回繰り返すことなどが挙げられる。なお、２ＸＳＳＣの組成は、０．３ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ及び３０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）である。
【００３３】
［３］本発明のベクター及び形質転換体
本発明のベクターは、本発明による前記ポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明による前記ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるベクターを挙げることができる。
【００３４】
また、本発明の形質転換体も、本発明による前記ポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、本発明による前記ポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、本発明による前記ポリヌクレオチドを含むベクターの形で含有する形質転換体であることもできる。また、本発明によるポリペプチドを発現している形質転換体であることもできるし、あるいは、本発明によるポリペプチドを発現していない形質転換体であることもできる。本発明の形質転換体は、例えば、本発明による前記ベクターにより、あるいは、本発明による前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。
【００３５】
前記宿主細胞としては、例えば、通常使用される公知の微生物、例えば、大腸菌又は酵母（Saccharomyces cerevisiae）、あるいは、公知の培養細胞、例えば、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、又はＣＯＳ細胞）又は昆虫細胞（例えば、ＢｍＮ４細胞）を挙げることができる。
【００３６】
また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば、大腸菌に対しては、ｐＵＣ、ｐＴＶ、ｐＧＥＸ、ｐＫＫ、又はｐＴｒｃＨｉｓを；酵母に対しては、ｐＥＭＢＬＹ又はｐＹＥＳ２を；ＣＨＯ細胞に対してはｐｃＤＮＡ３又はｐＭＡＭｎｅｏを；ＨＥＫ−２９３細胞に対してはｐｃＤＮＡ３を；ＣＯＳ細胞に対してはｐｃＤＮＡ３を；ＢｍＮ４細胞に対しては、カイコ核多角体ウイルス（ＢｍＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（例えば、ｐＢＫ２８３）を挙げることができる。更に、公知の発現ベクターとしては、遺伝子治療用のベクターとして使用することのできるウイルスベクター、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、又はセンダイウイルス等を挙げることができる。
【００３７】
［４］本発明の医薬
本発明の医薬（好ましくはマダニに対するワクチン）は、有効成分として、本発明のポリペプチド若しくはその断片、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明のベクターを含む。すなわち、本発明においては、本発明のポリペプチド若しくはその断片、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明のベクターを、それ単独で、又は好ましくは薬剤学的若しくは獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、マダニ駆除の必要な動物、好ましくは哺乳動物（特には、ヒト）に経口的に又は非経口的に投与することができる。
【００３８】
本発明の医薬における前記有効成分である、本発明のポリペプチド若しくはその断片、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明のベクターをマダニワクチンとして投与すると、抗体産生を誘導することができ、宿主の再感染防御能を介してダニを駆除することができる。また、その結果として、マダニ媒介性感染症（例えば、人獣のピロプラズマ症、Ｑ熱、又はウイルス性脳炎など）の治療又は予防が可能である。
【００３９】
すなわち、本発明の医薬組成物（好ましくは、マダニ駆除用医薬組成物、あるいは、マダニ媒介性感染症の治療又は予防用医薬組成物）は、有効成分としての本発明のポリペプチドもしくはその断片、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明のベクターと、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる担体又は希釈剤とを含む。本発明における有効成分である、本発明のポリペプチド若しくはその断片、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明のベクターは、前記医薬（好ましくは、マダニ駆除用医薬、あるいは、マダニ媒介性感染症の治療又は予防用医薬）を製造するために使用することができる。
【００４０】
本発明の医薬をマダニワクチンとして使用する場合、本発明のポリペプチドの断片としては、投与対象に投与した場合に、前記断片に対して免疫を誘導するのに充分な断片である限り、特に限定されるものではなく、当業者であれば適宜選択することができる。
【００４１】
本発明の医薬（特にはマダニワクチン）では、例えば、本発明のポリペプチドをアジュバント等と混合して、マダニに対するワクチンとして、適当な間隔で動物（例えば、家畜等）に接種することができる。あるいは、本発明のポリペプチドを直接、適当な溶媒に溶解又は懸濁して使用することもできるし、リポソーム中に封入したり、適当なベクターに組み込んだ形にして使用することもできる。また、必要に応じて、本発明のポリペプチドに薬学的に許容し得る担体を添加し、例えば、注射剤、錠剤、カプセル剤、点眼剤、クリーム剤、坐剤、噴霧剤、又はパップ剤等の適当な剤型にして使用することができる。
【００４２】
薬学的に許容し得る担体には、当業者には周知の溶媒、基剤、安定化剤、防腐剤、溶解剤、賦形剤、及び緩衝剤等が含まれる。本発明の医薬に含有される本発明のポリペプチドは、このような剤型とした場合、例えば、投与対象の年齢、性別、疾患の種類、又は程度等に応じて、その投与方法及び投与量を適宜設定して使用することができる。
【００４３】
経口投与には舌下投与を含む。非経口投与としては、例えば、吸入、経皮投与、点眼、膣内投与、関節内投与、直腸投与、動脈内投与、静脈内投与、局所投与、筋肉内投与、皮下投与、及び腹腔内投与等から適当な方法を選んで投与することができる。
【００４４】
［５］本発明の抗体又はその断片
本発明のポリペプチドに反応する抗体（例えば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）は、各種動物に、本発明のポリペプチド、又はその断片を直接投与することで得ることができる。また、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入したプラスミドを用いて、ＤＮＡワクチン法[Raz, E.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9519-9523 (1994); 又はDonnelly, J.J.ら, J. Infect. Dis., 173, 314-320, (1996）]によっても得ることができる。
【００４５】
ポリクローナル抗体は、例えば、本発明のポリペプチド又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、腹腔、皮下、又は静脈等に免疫して感作した動物（例えば、ウサギ、ラット、ヤギ、又はニワトリ等）の血清又は卵から製造することができる。このように製造された血清又は卵から、常法のポリペプチド単離精製法によりポリクローナル抗体を分離精製することができる。そのような分離精製方法としては、例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、又はＤＥＡＥ−セルロース、ハイドロキシアパタイト、若しくはプロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法を挙げることができる。
【００４６】
モノクローナル抗体は、例えば、ケーラーとミルスタインの細胞融合法 [Kohler, G.及びMilstein, C., Nature, 256, 495-497(1975）]により、当業者が容易に製造することが可能である。すなわち、本発明のポリペプチド又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、数週間おきにマウスの腹腔、皮下、又は静脈に数回繰り返し接種することにより免疫する。最終免疫後、脾臓細胞を取り出し、ミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを作製する。
【００４７】
ハイブリドーマを得るためのミエローマ細胞としては、例えば、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損又はチミジンキナーゼ欠損のようなマーカーを有するミエローマ細胞（例えば、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．Ｕ１）を利用することができる。また、融合剤としては、例えば、ポリエチレングリコールを利用することができる。更には、ハイブリドーマ作製における培地として、例えば、イーグル氏最小必須培地、ダルベッコ氏変法最小必須培地、又はＲＰＭＩ−１６４０などの通常よく用いられている培地に、１０〜３０％のウシ胎仔血清を適宜加えて用いることができる。融合株は、ＨＡＴ選択法により選択することができる。ハイブリドーマのスクリーニングは培養上清を用い、ＥＬＩＳＡ法又は免疫組織染色法などの周知の方法により行ない、目的の抗体を分泌しているハイブリドーマのクローンを選択することができる。また、限界希釈法によってサブクローニングを繰り返すことにより、ハイブリドーマの単クローン性を保証することができる。このようにして得られるハイブリドーマは、培地中で２〜４日間、あるいは、プリスタンで前処理したＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔内で１０〜２０日間培養することで、精製可能な量の抗体を産生することができる。
【００４８】
このように製造されたモノクローナル抗体は、培養上清又は腹水から常法のポリペプチド単離精製法により分離精製することができる。そのような分離精製方法としては、例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、又はＤＥＡＥ−セルロース、ハイドロキシアパタイト、若しくはプロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法を挙げることができる。
【００４９】
また、モノクローナル抗体又はその一部分を含む抗体断片は、前記モノクローナル抗体をコードする遺伝子の全部又は一部を発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞（例えば、大腸菌、酵母、又は動物細胞）に導入して生産させることもできる。
【００５０】
以上のように分離精製された抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）について、常法により、ポリペプチド分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）によって消化を行ない、引き続き、常法のポリペプチド単離精製法により分離精製することで、活性のある抗体の一部分を含む抗体断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖを得ることができる。
【００５１】
更には、本発明のポリペプチドに反応する抗体を、クラクソンらの方法又はゼベデらの方法 [Clackson, T.ら, Nature, 352, 624-628 (1991); 又はZebedee, S. ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 3175-3179 (1992）] により、一本鎖（single chain）Ｆｖ又はＦａｂとして得ることも可能である。また、マウスの抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置き換えたトランスジェニックマウス [Lonberg, N. ら, Nature, 368, 856-859 (1994)] に免疫することで、ヒト抗体を得ることも可能である。
【００５２】
［６］本発明のスクリーニング方法並びにそのスクリーニング結果物又は本発明の抗体を含む医薬
本発明のポリペプチドを用いると、試験物質が、本発明のポリペプチドのシスタチン活性を修飾（例えば、抑制又は促進）するか否かをスクリーニングすることができる。本発明には、本発明のポリペプチドを含むスクリーニングキットが含まれる。
【００５３】
本発明のスクリーニング方法にかけることのできる試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術 [Terrett, N. K. ら, Tetrahedron, 51, 8135-8137 (1995)] 又は通常の合成技術によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法 [Felici, F. ら, J. Mol. Biol., 222, 301-310 (1991)] などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。更には、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物（ペプチドを含む）を、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることができる。
【００５４】
本発明のスクリーニング方法においては、本発明のポリペプチドと試験物質とを接触させ、前記試験物質の存在下における、本発明のポリペプチドのシスタチン活性を分析することにより、前記試験物質が、本発明のポリペプチドのシスタチン活性を修飾するか否かを判断することができる。試験物質の不在下における本発明のポリペプチドのシスタチン活性と比較して、試験物質の存在下における前記シスタチン活性が減少する場合には、前記試験物質が、本発明のポリペプチドのシスタチン活性を抑制又は阻害すると判断することができる。一方、シスタチン活性が上昇する場合には、前記試験物質が、本発明のポリペプチドのシスタチン活性を促進すると判断することができる。
【００５５】
シスタチン活性を抑制する物質（すなわち、シスタチン阻害剤）は、寄生虫駆除剤の有用な候補物質であり、例えば、マダニ駆除、又はマダニ媒介性感染症（例えば、人獣のピロプラズマ症、Ｑ熱、又はウイルス性脳炎など）の治療若しくは予防に用いることができる。シスタチン阻害剤としては、例えば、シスタチン中和抗体、構造活性相関に基づく親和物を公知のものとして挙げることができる。
【００５６】
本発明における有効成分、すなわち、シスタチン阻害剤は、所望により、種々の形態で投与することができる。このような投与形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、あるいは、注射剤、点滴剤、座薬などによる非経口投与を挙げることができる。本発明の医薬は、公知の方法によって製造することができ、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含むことができる。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射剤は、前記有効成分を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁又は乳化することによって調製することができる。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用可能であり、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用しても良い。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用しても良い。その投与量は、症状、年齢、体重、及び／又は投与経路に応じて適宜決定することができ、医師の判断及び各患者の状況に応じて決定することができる。有効用量は、例えば、インビトロにおける試験又はインビボの動物モデル試験系から導くことができる。
【００５７】
［７］本発明の抗原虫剤
本発明の抗原虫剤は、有効成分として、シスタチンを含む。
本発明においては、シスタチンを、それ単独で、又は好ましくは薬剤学的若しくは獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、原虫駆除の必要な動物、好ましくは哺乳動物（特には、ヒト）に経口的に又は非経口的に投与することができる。また、本発明における有効成分であるシスタチンは、抗原虫剤を製造するために使用することができる。
【００５８】
本発明の抗原虫剤の適当対象である原虫としては、特に限定されるものではないが、例えば、バベシア原虫（例えば、ウシバベシア原虫のバベシアボビス、バベシアビゲミナ、バベシアオバタ、イヌバベシア原虫のバベシアカニス、バベシアギブソニ、ウマバベシア原虫のバベシアカバリ、バベシアエクイ）、タイレリア原虫（例えば、ウシタイレリア原虫のタイレリアオリエンターリス、タイレリアブッフェリ、タイレリアパルバ、タイレリアアヌラータ）を挙げることができる。
【００５９】
本発明の抗原虫剤に用いることのできるシスタチンとしては、本発明の新規ポリペプチドを使用することができるだけでなく、公知の各種シスタチンを使用することができる。前記シスタチンとしては、脊椎動物（例えば、ほ乳類）、無脊椎動物（例えば、線虫、昆虫）、原虫、植物に由来する天然シスタチン、あるいは、シスタチン活性を有する改変タンパク質を用いることができ、タイプ２に属するシスタチンが好ましい。
【００６０】
後述の実施例１０に示すように、本発明の抗原虫剤の有効成分であるシスタチンは、インビトロで媒介バベシア原虫の増殖を抑制することができる。
本発明の抗原虫剤は、所望により、種々の形態で投与することができ、例えば、前記の［４］本発明の医薬、あるいは、［６］本発明のスクリーニング方法並びにそのスクリーニング結果物又は本発明の抗体を含む医薬において先述した形態で投与することができる。
【００６１】
また、本発明は、前記ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、動物の治療を目的とした治療的化合物、並びにその応用も含まれる。本発明のフタトゲチマダニのシスタチンタンパク質及び核酸は、マダニ媒介性病原体が属するウイルス、細菌、原虫、寄生虫を含むマダニ媒介性病原体による人又は動物の寄生虫病予防及び／又は治療を目的とした化合物の合成及び治療薬の開発に応用することができる。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、以下の実施例においては、各種分子生物学、ダニ学、節足動物学、免疫学、及び生化学的な技術を用いた。これらの技術は、Sambrook, Ｊ．ら, Molecular Cloning, a laboratory manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Harlow E. ら, Antibodies, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)やその関連書を参考にした。また、ＤＮＡ解析ソフトとしては、MacVectorTM（Oxford Molecular社）を使用した。
【００６３】
《実施例１：シスタチンをコードする遺伝子の単離及び塩基配列決定》
家兎を吸血４日目のフタトゲチマダニ（Haemaphysalis longicornis）の雌成ダニ５００匹から、中腸組織を実体顕微鏡下で摘出した。これらから直ちに、アシッドグアニジニウム（Acid Guanidinium）−フェノール−クロロホルム法［Chomczynski et al., Anal Biochem 162: 156-159 (1987)］（AGPC法）を用いて全ＲＮＡを調製し、この５μｇを使用し、Ｇ−キャッピング法（G-Capping法）による完全長ｃＤＮＡ合成を行った。pGCAPベクター［Kato et al., DNA Res. 12: 53-62(2005)］に２本鎖ｃＤＮＡがインサートされたプラスミドは、フェノール抽出後、エタノール沈殿により回収し、ＴＥ緩衝液に溶解した。得られたプラスミド溶液は、DH5αコンピテント細胞（Takara社）と混合し、エレクトロポレーション法により形質転換を行い、寒天培地に蒔いて培養した。
【００６４】
得られたｃＤＮＡライブラリーのサイズは約１ｘ１０５個の形質転換体を含むもので、直ちにライブラリーの予備的なインサート確認を実施した結果、ｃＤＮＡの完全長率は、９２％と極めて高率であった。作製したｃＤＮＡライブラリーに含まれる形質転換体から順次、プラスミドＤＮＡを単離・精製し、このプラスミドを鋳型にして５’端側よりサイクルシーケンス反応を行い、ＤＮＡシーケンサー（ABI社製3730型シーケンサー）でｃＤＮＡの５’端塩基配列を決定した。この中腸のｃＤＮＡライブラリーから10,000クローンずつ選択し、５’端塩基配列を決定し、全クローンをGenBank（http://www.Ncbi.nih.gov/BLAST/）データベースを用いてＢＬＡＳＴＸ検索を実施した。この結果を表計算ソフトウェア（マイクロソフトExcel）のワークシート上でアノテーションし、アセンブルを行った。その結果、中腸のｃＤＮＡライブラリーは、有効クローンを8,304（83%）含有し、さらに完全長ｃＤＮＡクローンを7,639（92%）含有していることが示された。さらに、得られた有効クローンについてクラスターリング解析を行ったところ、中腸のｃＤＮＡライブラリーに3,433種類の遺伝子（クラスター）が含有されることが示され、この遺伝子の中から、シスタチンを同定した。
【００６５】
得られたｃＤＮＡの全長（配列番号１）は５６９ｂｐであり、ＯＲＦ（Open Reading Frame）は７２位〜４６７位にあり、１３１残基のアミノ酸（配列番号２）をコードしていることが確認され、推定分子量は１２．９ｋＤａであった。また、配列番号２で表されるアミノ酸配列における１番〜１８番のアミノ酸からなる配列は、シグナルペプチドであり、１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列は、フタトゲチマダニ・シスタチン成熟体のアミノ酸配列であった。予想されるアミノ酸配列をＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のＢＬＡＳＴ法にて相同性検索を行ったところ、これまでに報告されている他の生物のシスタチンタンパク質に高い相同性を有することが確認された。例えば、同じマダニ類とは、オルニソドロス・モウバタ（Ornithodoros moubata）のシスタチンとの相同性は４８％、イクソデス・リシヌス（Ixodes ricinus）のシスタチンとは４０％、イクソデス・スカピュラーリス（Ixodes scapularis）のシスタチンとは３４％の相同性であった。
【００６６】
《実施例２：シスタチン融合タンパク質の発現用ベクターの構築》
シグナルペプチド（配列番号２で表されるアミノ酸配列における１番〜１８番のアミノ酸からなる配列）を含まない、フタトゲチマダニ・シスタチン成熟体（配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列）をコードする遺伝子断片をＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲ産物をフェノール／クロロホルム処理した後に、エタノール沈澱法にて回収し、蒸留水中に溶解した。得られたＤＮＡ液を制限酵素EcoRIで消化した後に、電気泳動にて分離し、ＤＮＡ精製キット（Biotechnologies社）にて精製し、蒸留水中に回収した。一方、大腸菌発現用ベクターpGEX-4T3（Pharmacia Biotech社）を制限酵素EcoRIで消化した後に、アルカリホスファターゼにて脱リン酸化処理し、その後、ＰＣＲ産物と同様な方法にて精製した。
【００６７】
精製したＰＣＲ産物とベクターとを、ＤＮＡライゲーションキット（Takara社）を用いて、キットに添付のプロトコールに従って反応させた。大腸菌DH5α株をライゲーション反応産物にて形質転換させ、フタトゲチマダニ・シスタチン遺伝子ＯＲＦ断片がベクターのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（GST）と同一方向に挿入された組換えクローンを選択した。プラスミド精製キット（Qiagen社）にて組換えプラスミドを精製した。
【００６８】
《実施例３：組換えフタトゲチマダニ・シスタチン融合タンパク質の大腸菌による発現》
実施例２で得られた組換えプラスミドにて、大腸菌DH5α株を形質転換させた後、３７℃でアンピシリン含有ＬＢ培地で培養した。培養液のＯＤ６００ｎｍが０．３〜０．５に達した時点で、イソプロピルチオガラクトシド（IPTG）を最終濃度が０．５ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加し、更に３７℃で４時間培養を続けた。組換えタンパク質の発現は、１０％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動［Laemmli ら, Nature, 227, 680-685 (1970)］を実施した後、クーマシー染色で確認した。
【００６９】
結果を図１に示す。図１において、レーン１は分子量マーカー、レーン２は大腸菌ライセート（ＩＰＴＧ無添加）、レーン３は大腸菌ライセート（ＩＰＴＧ添加）、レーン４は精製した組換え融合タンパク質（実施例６参照）の泳動結果である。
その結果、約３８ｋＤａの組換えタンパク質の発現が認められ、ＧＳＴリーダータンパク質（２６ｋＤａ）とフタトゲチマダニ・シスタチンタンパク質（１３ｋＤａ）の融合タンパク質（以下、組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質と称する）
【００７０】
《実施例４：組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質のシステイン・プロテアーゼ活性阻害の測定》
組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質によるシステイン・プロテアーゼの活性阻害を、市販のパパイン（SIGMA社）、ヒトカテプシンＬ（SIGMA社）、ヒトカテプシンＢ（SIGMA社）を用いて確認した。なお、パパイン及びカテプシンＬはシステイン・プロテアーゼであり、カテプシンＢはアスパラギン酸プロテアーゼである。酵素活性の阻害試験は、リン酸ナトリウム（100 mmol/L）、ジチオトレイトール（DTT; 1 mmol/L）、及びＥＤＴＡ（2 mmol/L）を含有する反応緩衝液を用いて、溶解後のｐＨが、パパインはｐＨ６．５、カテプシンＬとカテプシンＢはｐＨ６．０になるようにして、すべて０．２μｍｏｌ／Ｌ溶液とした。組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質は、０、０．１、０．２、０．４、０．８、又は１．６μｍｏｌ／Ｌの濃度になるように、市販システイン・プロテアーゼの０．２μｍｏｌ／Ｌ溶液と混合した後に、ベンジルオキシカルボニル・フェニルアラニン−アルギニン−７−アミド−４−メチルクマリン基質（ペプチド研究所）１０μｍｏｌ／Ｌを加え、３７℃で３０分間反応させた。その後、蛍光マイクロリーダ（Thermo Electron社）を用い、３５５ｎｍの励起光と４６０ｎｍの放射光にてプロテアーゼ活性を測定した。
【００７１】
結果を図２に示す。その結果、組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質は高いシステイン・プロテアーゼ阻止活性を有していることが示された。すなわち、パパイン及びカテプシンＬの酵素活性は０．４μｍｏｌ／Ｌ以上の濃度の組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質によって顕著に阻害されることが認められたが、カテプシンＢの活性は阻害されなかった。
【００７２】
《実施例５：組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質の熱安定性の測定》
２５℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃、又は１００℃に組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質（４μｍｏｌ／Ｌ）を５分間置いた後に、その０．８μｍｏｌ／Ｌ濃度液を用いて、実施例４の方法で、市販パパイン０．２μｍｏｌ／Ｌ溶液に対する活性阻害を検討した。
【００７３】
結果を図３に示す。その結果、組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質は５０℃でも活性を維持しており、７０℃以上の高温でシステイン・プロテアーゼに対する阻止活性を消失することが示された。
【００７４】
《実施例６：組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質の抗血清の調製、及びイムノブロット法によるネイティブ（天然型）シスタチンの同定》
実施例３で述べた方法により、大腸菌で発現させた組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質を、市販のキット（Pharmacia Biotech社）に添付のプロトコールに従って精製した。この１００μｇを含む溶液２００μＬと、フロイント完全アジュバント（Adjuvant Complete Freund; Difco社）２００μＬとを混合した後に、ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢，雌）に腹腔内接種した。腹腔内接種から２週間及び４週間経過後に、それぞれ、組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質１００μｇをフロイント不完全アジュバント（Difco社）と混合し、追加接種を行なった。最終接種後から２週目に採血し、得られた血清を−２０℃に保存した。得られた抗組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質マウス血清を用い、イムノブロット法［Towbin et al., Proc Natl Acad Sci USA 76: 4350-4354 (1979)］にて天然型シスタチンタンパク質の同定を行なった。なお、試料として、４日間家兎を吸血した雌成ダニの中腸と唾液腺ライセートを使用した。
【００７５】
結果を図４に示す。図４において、レーン１は、分子量マーカーの泳動結果であり、レーン２、３は、それぞれ中腸ライセート、唾液腺ライセートの泳動結果であり、レーン４は、組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質の泳動結果である。図４に示すように、中腸ライセートにおいて約１５ｋＤａの特異的バンドが検出された。天然型シスタチンタンパク質の分子量が推定理論値と一致すると考えられた。なお、免疫前の血清と組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質やダニのライセートとの反応は認められなかった。
【００７６】
《実施例７：天然型シスタチンのフタトゲチマダニの各発育期と主要内部器官における発現分布》
フタトゲチマダニの卵、幼ダニ、若ダニ、成ダニの全発育期と、家兎を４日間吸血して半飽血状態の雌ダニの主要内部器官における天然型シスタチンの発現分布について、常法に従って、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法によりｍＲＮＡ発現の分析を実施した。ＲＴ−ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ発現分析の発育期別の結果を図５に、臓器別の結果を図６に示す。
【００７７】
図５において、記号ＥＧ、ＬＡ、ＮＹ、ＡＤは、それぞれ、卵（egg）、未吸血幼ダニ（larvae）、未吸血若ダニ（nympha）、未吸血雌成ダニ（adult）のフタトゲチマダニの個体（whole tick）由来のＲＮＡの結果であることを意味する。また、図６において、記号ＳＧ、ＭＤ、ＯＶ、ＨＣ、ＦＢは、それぞれ、前記フタトゲチマダニの唾液腺（salivary glands）、中腸組織（midguts）、卵巣（ovaries）、ヘモサイト（hemocytes）、及び脂肪体（fat body）由来のＲＮＡの結果であることを意味する。図５及び図６の結果が示すとおり、天然型シスタチンは、全発育期において発現し、雌成ダニの体内臓器別では、主に中腸組織、微量がヘモサイトにおいて発現することが確認された。
【００７８】
《実施例７：天然型シスタチンのフタトゲチマダニの吸血にともなう発現の増加》
フタトゲチマダニの雌成ダニを家兎に吸血させ、吸血後１日目、４日目、７日目（飽血）の雌ダニ体内における天然型シスタチンの発現の推移について、常法に従って、ＲＴ−ＰＣＲ法によりｍＲＮＡ発現の分析を実施した。ＲＴ−ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ発現分析の結果を図７に示す。
【００７９】
図７において、天然型シスタチンは、マダニの吸血にともなって発現が増大し、飽血時（４〜７日目）において発現は最大になることが確認された。
【００８０】
《実施例８：天然型シスタチンの細菌リポタンパク質（ＬＰＳ）の接種にともなうフタトゲチマダニ体内における発現動態》
１０μＬのガラス毛細管（Microcap；Drummond Scientific社）の一端を加熱によって注射針状にしたものを用いて、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に０．１μｇ/ｍＬに溶解したＬＰＳ（Sigma社）を、１個体当たり１μＬ、フタトゲチマダニの未吸血雌成ダニ３０個体の第４基節付近から血体腔内に接種した。マダニは接種後６時間、２５℃に静置し、体内における天然型シスタチンの発現の推移を、常法に従ってＲＴ−ＰＣＲ法によりｍＲＮＡ発現の分析を実施した。ＬＰＳ接種の対照としては、ＰＢＳを１個体当たり１μＬ、合計３０個体に接種した。
【００８１】
結果を図８に示す。図８において、天然型シスタチンは、ＬＰＳの血体腔接種によって発現が対照の１．６倍に増大することが確認された。
【００８２】
《実施例９：天然型シスタチンのフタトゲチマダニのイヌバベシア感染にともなう発現動態》
１歳の摘脾ビーグル犬にイヌバベシア（Babesia gibsoni）のNRCPD株を実験感染させた [Fukumoto S.ら, J. Vet. Med. Sci., 63, 977-981 (2001)]。原虫寄生率（パラシテミア）が５％以上になったときに、雌成ダニを耳袋法で寄生させ、飽血個体を回収し、２５℃及び９０％相対湿度で産卵させた。１匹の雌ダニの産卵塊からふ化し２ヶ月後の幼ダニにおける天然型シスタチンの発現の推移を、常法に従ってＲＴ−ＰＣＲ法によりｍＲＮＡ発現の分析を実施した。あわせて、ＰＣＲ法によりダニ体内のイヌバベシアのｍＲＮＡの発現を調べ、幼ダニにおけるバベシア感染を確認した。
【００８３】
天然型シスタチンの発現に関する結果を、図９に示す。図９において、天然型シスタチンは、イヌバベシア感染幼ダニにおいて、発現が非感染幼ダニの１．８倍に増大することが確認された。
【００８４】
《実施例１０：組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質のインビトロ培養バベシア原虫に対する増殖抑制効果》
ウシバベシア原虫（Babesia bovis）のインビトロ培養方法［Bork S.ら, Am. J. Trop. Med. Hyg., 68, 334-340 (2003)］に従って、ウシバベシア原虫感染血液１００μＬを非感染ウシ赤血球で希釈してパラシテミアを１％に調整後、この０．１μＬに、１、２、又は３μｍｏｌ／Ｌの濃度で組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質を加えた０．９μＬの培養液（Growth medium）を加え、２４穴の培養プレートにて、３７℃で４日間培養した。組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質を加えた培養液は、０．９μＬを毎日更新し、更新直前に培養液のギムザ染色塗抹を作製して、原虫寄生赤血球数を鏡検し、寄生原虫の形態とパラシテミアの推移を検討することによって、ウシバベシア原虫の増殖に対する組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質の影響を確認した。なお対照として、組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質の代わりにＧＳＴ３μＬを加えた培養液で培養した系を用意した。
【００８５】
結果を図１０及び図１１に示す。図１０において、組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質は、インビトロで培養したウシバベシア原虫の発育を、用量依存的に阻止することが確認された。また、図１１において、組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質暴露下でインビトロ培養されたウシバベシア原虫は、寄生赤血球内において細胞変性と核濃縮などの形態変化を示し、発育と増殖に異常のあることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、又はベクターは、例えば、マダニ（特にはフタトゲチマダニ）媒介性感染症の治療又は予防、特にマダニワクチンの用途に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】組換えフタトゲチマダニ（Ｈｌ）シスタチン（ｃｙｓｔ）融合タンパク質の電気泳動の結果を示す、図面に代わる写真である。
【図２】組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質のシステイン・プロテアーゼ活性阻害の測定の結果を示すグラフである。
【図３】組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質の活性の熱安定性測定の結果を示すグラフである。
【図４】組換えフタトゲチマダニ（Ｈｌ）シスタチン（ｃｙｓｔ）融合タンパク質の電気泳動（イムノブロット）の結果を示す、図面に代わる写真である。
【図５】天然型シスタチンタンパク質のマダニの各発育期における発現を示すグラフである。
【図６】天然型シスタチンタンパク質のマダニの主要臓器における発現を示すグラフである。
【図７】天然型シスタチンタンパク質のマダニの吸血にともなう発現の変化を示すグラフである。
【図８】天然型シスタチンタンパク質の、ＬＰＳのマダニ血体腔への接種にともなう発現の増大を示すグラフである。
【図９】天然型シスタチンタンパク質の、マダニのバベシア感染にともなう発現の増大を示すグラフである。
【図１０】組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質のインビトロ培養ウシバベシア原虫（Babesia bovis）に対する増殖抑制効果を示すグラフである。
【図１１】組換えＨｌｃｙｓｔ融合タンパク質が、インビトロ培養されたウシバベシア原虫の発育と増殖に異常をもたらす結果を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチド；
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、シスタチン活性を示すポリペプチド；又は
（４）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が５０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換体。
【請求項５】
請求項４に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１に記載のポリペプチドを製造する方法。
【請求項６】
請求項１に記載のポリペプチド若しくはその断片、請求項２に記載のポリヌクレオチド、又は請求項３に記載のベクターを有効成分として含む、医薬。
【請求項７】
マダニに対するワクチンである、請求項６に記載の医薬。
【請求項８】
抗原虫剤である、請求項６に記載の医薬。
【請求項９】
請求項１に記載のポリペプチド若しくはその断片、請求項２に記載のポリヌクレオチド、又は請求項３に記載のベクターと、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる担体又は希釈剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載のポリペプチド若しくはその断片、請求項２に記載のポリヌクレオチド、又は請求項３に記載のベクターを、マダニ駆除の必要な対象に、有効量で投与することを含む、マダニ駆除方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチド若しくはその断片、請求項２に記載のポリヌクレオチド、又は請求項３に記載のベクターを、マダニ媒介性感染症の治療又は予防の必要な対象に、有効量で投与することを含む、マダニ媒介性感染症の治療又は予防方法。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリペプチドに対する抗体又はその断片。
【請求項１３】
請求項１に記載のポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、及び前記ポリペプチドのシスタチン活性を分析する工程を含む、前記ポリペプチドのシスタチン活性を修飾する物質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
シスタチン阻害剤、又は請求項１２に記載の抗体若しくはその断片を有効成分として含む、マダニ駆除剤。
【請求項１５】
シスタチン阻害剤、又は請求項１２に記載の抗体若しくはその断片を有効成分として含む、マダニ媒介性感染症の治療又は予防剤。
【請求項１６】
シスタチンを有効成分として含む、抗原虫剤。
【請求項１】
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチド；
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、シスタチン活性を示すポリペプチド；又は
（４）配列番号２で表されるアミノ酸配列における１９番〜１３１番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が５０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、シスタチン活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換体。
【請求項５】
請求項４に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１に記載のポリペプチドを製造する方法。
【請求項６】
請求項１に記載のポリペプチド若しくはその断片、請求項２に記載のポリヌクレオチド、又は請求項３に記載のベクターを有効成分として含む、医薬。
【請求項７】
マダニに対するワクチンである、請求項６に記載の医薬。
【請求項８】
抗原虫剤である、請求項６に記載の医薬。
【請求項９】
請求項１に記載のポリペプチド若しくはその断片、請求項２に記載のポリヌクレオチド、又は請求項３に記載のベクターと、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる担体又は希釈剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載のポリペプチド若しくはその断片、請求項２に記載のポリヌクレオチド、又は請求項３に記載のベクターを、マダニ駆除の必要な対象に、有効量で投与することを含む、マダニ駆除方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチド若しくはその断片、請求項２に記載のポリヌクレオチド、又は請求項３に記載のベクターを、マダニ媒介性感染症の治療又は予防の必要な対象に、有効量で投与することを含む、マダニ媒介性感染症の治療又は予防方法。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリペプチドに対する抗体又はその断片。
【請求項１３】
請求項１に記載のポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、及び前記ポリペプチドのシスタチン活性を分析する工程を含む、前記ポリペプチドのシスタチン活性を修飾する物質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
シスタチン阻害剤、又は請求項１２に記載の抗体若しくはその断片を有効成分として含む、マダニ駆除剤。
【請求項１５】
シスタチン阻害剤、又は請求項１２に記載の抗体若しくはその断片を有効成分として含む、マダニ媒介性感染症の治療又は予防剤。
【請求項１６】
シスタチンを有効成分として含む、抗原虫剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００７−２５９８０４（Ｐ２００７−２５９８０４Ａ）
【公開日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−９１５１７（Ｐ２００６−９１５１７）
【出願日】平成１８年３月２９日（２００６．３．２９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１７年度、独立行政法人農業・生物系特定産業技術研究機構、「新技術・新分野創出のための基礎研究推進事業」、産業再生法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４３０００８８）国立大学法人帯広畜産大学 (96)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２９日（２００６．３．２９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１７年度、独立行政法人農業・生物系特定産業技術研究機構、「新技術・新分野創出のための基礎研究推進事業」、産業再生法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４３０００８８）国立大学法人帯広畜産大学 (96)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]