リパーゼ触媒した海産油のエステル化
遊離脂肪酸またはヘキシルエステルとしてＥＰＡおよびＤＨＡを含有する海産油組成物は、本質的に有機溶媒を含まない条件下で、リパーゼ触媒の存在下で、エタノールを用いてエステル化され、蒸留による分離される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は海産油（marine oil）のリパーゼ触媒したエステル化に関する。
【背景技術】
【０００２】
海産油を含めて種々の種類の油製品を、リパーゼ触媒の助けをかりて精製することは当該技術分野で既知であり、用いた精製条件下でリパーゼ触媒の特異性は所望の製品の回収を促進する。
【０００３】
ＥＰＡ（エイコサペンタエン酸、Ｃ２０：５）およびＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸、Ｃ２２：６）としてかかる商業的に重要なＰＵＦＡを、比較的低濃度でＥＰＡおよびＤＨＡを含有する魚油のような組成物から単離するためのリパーゼ触媒した方法を開発するために、広範囲にわたる研究が行われている。
【０００４】
例えばＰＣＴ／ＮＯ９５／０００５０号（国際公開第９５／２４４５９号パンフレット）では、本発明者等は、エステル交換反応条件に対してトリグリセリドの形で飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸を含有する油組成物を、飽和脂肪酸およびモノ不飽和脂肪酸のエステル交換を優先的に触媒するのに活性なリパーゼの存在下に実質的に無水の条件下でエタノールの如きＣ１ー６アルコールで処理する方法を開示している。好ましいリパーゼ、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）リパーゼ（ＰＦＬ）および蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）リパーゼ（ＰＦＬ）を用いると、海産油供給源から、グリセリドの形で工業上および医療上重要なオメガ−３ポリ不飽和脂肪酸ＥＰＡおよびＤＨＡの７０重量％以上を含有する濃厚液を製造することができた。
【０００５】
多数のリパーゼ触媒した精製法ではグリセロールを利用した。
【０００６】
例えば、特開昭６２−９１１８８号公報（１９８７年）、国際公開第９１／１６４４３号パンフレット、Int. J. Food. Sci. Technol. (1992), 27, 73-76, Lie and Molin、Myrnes et al, JAOCS, Vol. 72, No. 11 (1995), 1339-1344、Moore et al, JAOCS, Vol. 73, No. 11 (1996), 1409-1414、McNeill et al, JAOCS, Vol. 73, No. 11 (1996), 1403-1407、国際公開第９６／３７５８号パンフレットおよび国際公開第９６／３７５８７号パンフレットを挙げることができる。
【０００７】
ＰＣＴ／ＮＯ００／０００５６号（国際公開第２０００／４９１１７号パンフレット）では、本発明者等は、遊離脂肪酸としてＥＰＡおよびＤＨＡを含有する海産油組成物を、出発組成物と比較した場合にこれらの脂肪酸の少なくとも１つに富んだ遊離脂肪酸画分を形成するようにエステル化する方法であって、減圧および本質的に有機溶媒を含まない条件下で、リパーゼ触媒であるリゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ（ＭＭＬ）の存在下にて、上記海産油組成物をグリセロールと反応させる工程、およびＥＰＡおよびＤＨＡの少なくとも１つに富んだ遊離脂肪酸画分を回収する工程を含む方法を提供した。好ましくは、短経路(short path)蒸留を用いて、グリセリド混合物から残留遊離脂肪酸を分離した。
【０００８】
しかしながら、今日では、グリセリド混合物から残留遊離脂肪酸を分離するための短経路蒸留に基づいたこの戦略は、あまり実現可能ではないことが明らかとなってきた。これは、より短鎖のモノグリセリドの揮発性が高すぎることの結果であり、留出物を非常に汚染する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は今回、メタノールまたはエタノールの遊離脂肪酸の直接的なエステル化、またはＣｍアルコール（ｍ＝１〜１２、ｎ＞ｍ）による魚油由来のＣｎアルキルエステル（ｎ＝２〜１８）のエステル交換（アルコール分解）、および続く短経路蒸留により、ＥＰＡおよびＤＨＡの濃厚液を調製するためのリパーゼ触媒した方法が、高ＤＨＡ濃厚液を提供することを発見した。これらの方法は、迅速かつ簡素な反応であり、留出物中に好ましくないモノグリセリドを生成することなく、ＥＰＡとＤＨＡとの間での優れた分離を提供する。これらの方法の本質的な特徴は、添付の特許請求の範囲で規定している。
【００１０】
本発明の好ましい実施形態では、Ｃ１〜Ｃ１２アルコールは、エタノールである（エタノール分解）。Ｃ２〜Ｃ１８アルキルエステルの中でも、ヘキシルエステルが好ましい。
【００１１】
直接的なエステル化における出発材料中の遊離脂肪酸に対するメタノールまたはエタノールのモル比は、０．５〜１０．０であり、好ましい比は、０．５〜３．０であり、最も好ましい比は、１．０〜２．０であり、さらに好ましい比は、１．０〜１．５である。
【００１２】
エステル交換におけるＣｎアルキルエステルに対するＣｍアルコールのモル比は、０．５〜１０．０であり、好ましい比は、０．５〜３．０であり、最も好ましい比は、２．０〜３．０である。
【００１３】
エステル化反応は、０℃〜７０℃の温度、好ましくは、２０℃〜４０℃の温度で実施される。
【００１４】
本発明で使用されるリパーゼ触媒は、担体上に固定化される。
【００１５】
アルコール分解中に使用するリパーゼによっては、それらがＥＰＡの相当するアルコール分解よりもかなり低速度で、ＤＨＡのアルコール分解を触媒するという特性を有するものもある。かかる特性を有する好ましいリパーゼは、リゾムコール・ミエヘイ（ＭＭＬ）である。他のリパーゼは、それらがより短鎖のおよびより飽和した脂肪酸の相当するアルコール分解よりもかなり低速度で、ＥＰＡおよびＤＨＡの両方のアルコール分解を触媒するという特性を有する。かかる特性を有するリパーゼは、シュードモナス属リパーゼ（ＰＳＬ）および蛍光菌リパーゼ（ＰＦＬ）である。
【００１６】
ＭＭＬによるエタノールを用いた魚油遊離脂肪酸の直接的なエステル化は、G.G. Haraldsson and B. Kristinsson, J. Am. Oil. Chem. Soc. 75:1551-1556 (1998)からすでに既知である。
【００１７】
【化１】
スキーム１．ＭＭＬによるエタノールを用いた魚油遊離脂肪酸の直接的なエステル化
【００１８】
しかしながら、ＤＨＡ残留遊離脂肪酸およびエチルエステルの満足のいく分離が、短経路蒸留技術で可能であるとは考えられていなかった。そこで、本発明者等は、驚くべきことに、短経路蒸留技術がかなり首尾よく使用することができることを見出した。このことは、以下の実施例に示す結果から明らかである。
【００１９】
本発明は、リパーゼによる魚油ヘキシルエステルのエタノール分解、ならびにそれに続いて分子蒸留して、残留ヘキシルエステルおよびより揮発性の高いエチルエステルを分離することをさらに開示する。
【００２０】
【化２】
スキーム２．リパーゼ（ＭＭＬ）による魚油ヘキシルエステルのエタノール分解
【００２１】
ＤＨＡの回収率および生成物中の濃度をさらに改善するために、ＰＣＴ／ＮＯ９５／０００５０号（国際公開第９５／２４４５９号パンフレット）に記載されるようにエタノール分解反応は、直接的なエステル化の前の前工程として使用することができる。
【００２２】
【化３】
スキーム３．リパーゼ（ＭＭＬ）による魚油のエタノール分解
【００２３】
直接的なエステル化の前に、グリセリド混合物を加水分解する必要がある。加水分解前に、出発材料のかさを半分減少させるために、ＰＣＴ／ＮＯ９５／０００５０号（国際公開第９５／２４４５９号パンフレット）のエタノール分解反応が有用であることがわかっている。したがって、本発明はまた、代替法として、エタノール分解および続く直接的なエステル化を開始とする２酵素工程反応を開示し、各工程後に、分子蒸留による濃縮が続く。この２工程反応はまた、ニシン油のような長鎖一不飽和に非常に富んだ油にも適している。
【００２４】
２工程反応はまた、魚油ヘキシルエステルが出発材料である場合に、適用可能かつ好適である。
【実施例】
【００２５】
本発明は、以下の実施例により説明される。
【００２６】
イワシ油（ＳＯ）、カタクチイワシ油（ＡＯ）、ニシン油（ＨＯ）、タラ肝油（ＣＬＯ）、マグロ油（ＴＯ）およびブルーホワイティング油（ＢＷＯ）のような出発材料を試験した。
【００２７】
実験手順
シュードモナス属（ＰＳＬ、リパーゼＡＫ）および蛍光菌（ＰＦＬ、リパーゼＰＳ）由来の細菌リパーゼは、Amano Enzyme Inc.から購入した。固定化リゾムコール・ミエヘイ（ＭＭＬ、リポザイムＲＭ ＩＭ）、サーモマイセス・ラヌギノサ(Thermomyces lanuginosa)（ＴＬＬ、リポザイムＴＭ ＩＭ）およびカンジダ・アンタルクチカ(Candida antarctica)（ＣＡＬ、ノボザイム４３５）リパーゼは、デンマークのNovozymeにより提供された。イワシ油（ＥＰＡ１４％およびＤＨＡ１５％）、カタクチイワシ油（ＥＰＡ１８％およびＤＨＡ１２％）、ニシン油（ＥＰＡ６％およびＤＨＡ８％）、マグロ油（ＥＰＡ６％およびＤＨＡ２３％）、タラ肝油（ＥＰＡ９％およびＤＨＡ９％）、ならびにブルーホワイティング油（ＥＰＡ１１％およびＤＨＡ７％）はすべて、Pronova Biocareにより提供された。脂肪酸分析は、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を装備したＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ８１４０ ガスクロマトグラフ（ＧＣ）を用いて実施した。キャピラリーカラムは、J & W Scientificからの３０メートルのＤＢ−２２５ ３０Ｎ、０．２５μｍキャピラリーカラムであった。短経路蒸留は、Ｌｅｙｂｏｌｄ ＫＤＬ ４蒸留器中で実施した。核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、溶媒として重水素化クロロホルム中にてＢｒｕｋｅｒ ＡＣ ２５０ＮＭＲ分光計で記録した。分取用薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）は、Merckからのシリカゲルプレート（Ａｒｔ ５７２１）で行った。溶出は、石油エーテル：ジエチルエーテル：酢酸の８０：２０：１の混合物を用いて実施した。ローダミンＧ(Merck)を用いて、バンドを可視化させた後、掻き取って、メチル化した。Ｃ１９：０のメチルエステル(Sigma)を内部標準としてサンプルに添加した後、ＧＣに注入した。
【００２８】
魚油の加水分解
魚油（５００ｇ、０．５５ｍｏｌ）を水酸化ナトリウム（１９０ｇ、４．７５ｍｏｌ）、水（５００ｍｌ）および９６％エタノール（１．７Ｌ）の溶液に添加した。得られた混合物を３０分間（透明な着色液体が観察されるまで）還流させた後、絶えず攪拌しながら室温にまで冷却した。溶液を中和するために、６．０Ｍ塩酸（８７０ｍｌ、１０％過剰）を慎重に添加して、得られた混合物を分液漏斗に移した。石油エーテルおよびジエチルエーテルの１：１の混合物（１．５Ｌ）を用いて、遊離脂肪酸を二度抽出した。続いて、有機層を水（１．５Ｌ）で三度洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥剤を濾別して、溶媒を蒸発により除去して、５０℃で２時間高真空蒸発で仕上げた。分析用ＴＬＣによる分析で、単一のスポットは、純粋な遊離脂肪酸を示した。生成物の色は、魚油に応じて、黄色がかった色から濃赤紫色まで多様であった。
【００２９】
エタノールによる魚油遊離脂肪酸の直接的なエステル化
固定化ＭＭＬ（１５ｇ）を魚油遊離脂肪酸（３００ｇ、およそ１．０３ｍｏｌ）および無水エタノール（１４３ｇ、３．１０ｍｏｌ）の溶液に添加した。所望の変換率に達するまで、得られた酵素懸濁液を窒素下にて４０℃で穏やかに攪拌した。反応中にサンプルを取り出して、０．０２Ｍ ＮａＯＨによる滴定により、遊離脂肪酸の残留量を検出して、反応の進行をモニタリングした。分別は、分取用ＴＬＣにより実施して、続いて、各脂質画分を、ＧＣにより定量化して、脂肪酸プロフィールに関して分析した。所望の変換率に達した後、酵素を濾過により除去して、過剰エタノールを真空中で蒸発させた。得られた混合物の短経路蒸留後に、残留物として高ＤＨＡ濃厚液が得られた。
【００３０】
リパーゼによる魚油のエタノール分解
固定化ＭＭＬ（２０ｇ）を魚油（４００ｇ、０．４４ｍｏｌ）および無水エタノール（６１ｇ、１．３２ｍｏｌ）の溶液に添加した。所望の変換率に達するまで、得られた酵素懸濁液を窒素下にて室温で穏やかに攪拌した。続いて、酵素を濾過により除去して、過剰エタノールを真空中で蒸発させた後、短経路蒸留した。反応の進行は、分析用ＴＬＣおよび１Ｈ−ＮＭＲによりモニタリングした。分別は、分取用ＴＬＣにより実施して、続いて、各脂質画分を、ＧＣにより定量化して、脂肪酸プロフィールに関して分析した。
【００３１】
リパーゼによる魚油のヘキサノール分解
固定化ＣＡＬ（２５ｇ）を魚油（５００ｇ、０．５５ｍｏｌ）および１−ヘキサノール（３３８ｇ、３．３１ｍｏｌ）の溶液に添加した。分析用ＴＬＣおよび／または１Ｈ−ＮＭＲに従ってトリアシルグリセロールが完全にヘキシルエステルに変換されるまで、得られた酵素懸濁液を窒素下にて６５℃で穏やかに攪拌した。酵素を濾過により除去して、過剰ヘキサノールを真空中で蒸発させた。
【００３２】
リパーゼによる魚油ヘキシルエステルのエタノール分解
固定化ＭＭＬ（１５ｇ）を魚油ヘキシルエステル（３００ｇ、０．８０ｍｏｌ）および無水エタノール（１１１ｇ、２．４１ｍｏｌ）の溶液に添加した。１Ｈ−ＮＭＲに従って所望の変換率が得られるまで、得られた酵素懸濁液を窒素下にて４０℃で穏やかに攪拌した。酵素を濾過により除去して、過剰エタノールを真空中で蒸発させた。得られた混合物の短経路蒸留後に、残留物として高ＤＨＡ濃厚液が得られた。各エステル群の脂肪酸組成は、１回のＧＣの実施により確定した。
【００３３】
（実施例１）
エタノールによる魚油遊離脂肪酸の直接的なエステル化
イワシ油（ＳＯ）
ＭＭＬ（遊離脂肪酸の重量に基づいて５％）の存在下にて４０℃でのＥＰＡ１４％およびＤＨＡ１５％を含有するＳＯ遊離脂肪酸（１４／１５）と３当量のエタノールとの直接的なエステル化反応の進行を表１に示す。これらの条件下では、リパーゼは、ＳＯ遊離脂肪酸に対して極めて高い活性を示した。７０％を超える変換率（エチルエステル％）が、たった２時間で達成された。４時間の反応後、残留遊離脂肪酸は、それぞれ回収率７３％および１０％で、ＤＨＡ４９％およびＥＰＡ６％を含有していた。ＤＨＡの濃度および回収率に関して、最適な変換率は、変換率およそ７５％であるようである。表１では、反応の進行中に生産されたエチルエステルの重量パーセントを、変換率の程度の尺度として直接使用した。
【００３４】
【表１】
【００３５】
短経路蒸留による分離後に、ＳＯ遊離脂肪酸の直接的なエステル化に関して、優れた結果が得られた。ＳＯ遊離脂肪酸を、４０℃で４時間、ＭＭＬの存在下でエタノールと反応させて、変換率７８％に達した。反応混合物の遊離脂肪酸は、ＤＨＡ回収率７５％で、ＤＨＡ４９％およびＥＰＡ６％を含んでいた。１１５℃での蒸留後、残留物は、ＤＨＡ６９％およびＥＰＡ９％、ならびにそれぞれ回収率６５％および１０％を含んでいた（表２）。ＤＨＡの回収率は、蒸留温度をわずかに下げることにより改善された（表３を参照）。本発明者等は、蒸留により残留遊離脂肪酸からエチルエステルをすべて分離することができなかった。それにもかかわらず、本発明者等は、１１５℃での短経路蒸留後に、遊離脂肪酸およそ９０％およびエチルエステル１０％を有する高ＤＨＡ濃厚液を首尾よく得た。残留物中に得られたエチルエステルは、遊離脂肪酸と同様に非常にＤＨＡに富んでいる。さらに、より飽和されたおよびより短鎖の遊離脂肪酸は蒸留され、反応後の遊離脂肪酸画分に関してよりも高いＤＨＡ濃度の残留物を生じる。
【００３６】
【表２】
【００３７】
ＳＯに関する結果は、表３に示すように、変換率および蒸留温度を低減させることにより改善した。４時間の反応後、変換率７５％が得られた。１１１℃で蒸留した後、残留物は、回収率８８％でＤＨＡ６６％を含有し、ＤＨＡ／ＥＰＡ比は４．７であった。わずかに高い蒸留温度では、残留物は、回収率７５％でＤＨＡ７４％を含み、ＤＨＡ／ＥＰＡ比はほぼ７であった。蒸留後のＤＨＡ回収率は、出発油中のＤＨＡの重量パーセントに基づくことに留意すべきである。
【００３８】
【表３】
【００３９】
エタノール含有量を１当量に低減させることができ、これは反応時間の増加をもたらす（表４）。少ないリパーゼを導入することもでき、これはかなり低い反応率をもたらす。
【００４０】
【表４】
【００４１】
カタクシイワシ油（ＡＯ）
ＳＯと同一条件下でのＥＰＡ１８％およびＤＨＡ１２％を含むＡＯ遊離脂肪酸（１８／１２）の直接的なエステル化反応の進行を表５に示す。認識され得るように、２４時間後、変換率８２％で、約６：１のＤＨＡ／ＥＰＡ比が得られ、ＥＰＡ８％およびＤＨＡ５０％を含んでいた。ＤＨＡ回収率は、８０％を少し下回った。同様に、１１時間後では、変換率７９％で、ＤＨＡ／ＥＰＡ比は５：１であり、ＤＨＡ回収率は８４％程度で高かった。したがって、ＡＯおよびＳＯはともに、重要である場合に、エチルエステル画分から、ＤＨＡが多い濃厚液を作製するための、かつ同様にＥＰＡが多い濃厚液を作製するための非常に潜在的な出発材料である。
【００４２】
【表５】
【００４３】
ＡＯに関する結果は、表６に示すように、ＤＨＡ濃度およびＤＨＡ／ＥＰＡ比に関して良好である。ＡＯ（１９／１２）の遊離脂肪酸を上述のように反応させて、１１時間で変換率７６％に達した。１２１℃で蒸留した後、残留物は、回収率がたった６４％でＤＨＡ６１％を含み、ＤＨＡ／ＥＰＡ比は５．５であった。留出物は、場合によっては、より低温度で蒸留を繰り返すことにより、高いＥＰＡ濃厚液を作製するのに使用してもよい。例えば、ＥＰＡ４５％およびＤＨＡ１０％の濃厚液は、潜在的な商品用の望ましい組成物であるとみなされる。
【００４４】
【表６】
【００４５】
ニシン油（ＨＯ）
ＥＰＡ６％およびＤＨＡ８％を含むニシン油（６／８）由来の遊離脂肪酸を、上述のような直接的なエステル化条件下で同様に処理した。反応の進行を表７に示す。１２時間の反応後の残留遊離脂肪酸は、ＤＨＡ３７％およびＥＰＡ６％を含有し、それぞれ回収率９０％および１８％であった。
【００４６】
【表７】
【００４７】
ＥＰＡ９％およびＤＨＡ９％を含む異なるＨＯ（９／９）由来の遊離脂肪酸を、上述と同じ方法で１２時間反応させて、変換率８４％に達した。反応混合物の遊離脂肪酸は、ＤＨＡ３９％およびＥＰＡ８％を含み、ＤＨＡ回収率７６％であった。１１０℃で蒸留した後、残留物は、ＤＨＡ４０％およびＥＰＡ７％を含有し、ＤＨＡ回収率６８％、ＤＨＡ／ＥＰＡ比はほぼ６：１であった（表８）。低いＤＨＡ濃度は、２０：１（４％）および２２：１（３７％）の長鎖一不飽和脂肪酸の高い含有量に起因する。ＨＯおよびカラフトシシャモ油中の長鎖一不飽和脂肪酸のこの高い含有量が、上述の方法に関して、それらをあまりふさわしくない出発材料としている。残留油中に単に尿素を含ませることを使用して、これらの一不飽和脂肪酸の大部分を除去してもよく、ＤＨＡの有価な濃厚液をもたらす。低いＥＰＡ含有量のＨＯは、高いＤＨＡ／ＥＰＡ比を得るのに、ＳＯおよびＡＯよりも適していることを付け加えるべきである。
【００４８】
【表８】
【００４９】
マグロ油（ＴＯ）
上述のＳＯと同一条件下でのＥＰＡ６％およびＤＨＡ２３％を含むＴＯ遊離脂肪酸（１６／２３）の直接的なエステル化反応の進行を下記表９に示す。８時間の反応後、変換率６８％が得られ、残留遊離脂肪酸は、ＤＨＡ７４％およびＥＰＡ３％を含み、ＤＨＡ回収率８３％で、ＤＨＡ／ＥＰＡ比は２５：１であった（表９）。明らかに、このタイプの出発油の初期ＥＰＡ／ＤＨＡ組成は、ＤＨＡを濃縮するのに理想的である。
【００５０】
【表９】
【００５１】
タラ肝油（ＣＬＯ）
上述と同様の条件下でのＥＰＡ９％およびＤＨＡ９％を含むＣＬＯ遊離脂肪酸（９／９）の直接的なエステル化反応の進行を表１０に示す。およそ変換率７９％で、残留遊離脂肪酸に関してＤＨＡ／ＥＰＡ比５：１が得られ、ＤＨＡ濃度５０％で、ＤＨＡ回収率は８０％を上回った。これらの結果は、潜在的なＤＨＡ回収率を考慮すると、ＳＯおよびＡＯに関する結果よりもさらに良好である。しかし、コストに関しては、ＳＯおよびＡＯは、ＣＬＯよりも好適である。ＣＬＯは、はるかに少ない長鎖一不飽和（２０：１および２２：１）を含有するという事実を踏まえて、ＣＬＯ（９／９）からの結果をＨＯ（９／９）からの結果と比較することは、重要であり得る。
【００５２】
【表１０】
【００５３】
ブルーホワイティング油（ＢＷＯ）
上述の条件下でのＥＰＡ１１％およびＤＨＡ７％を含むＢＷＯ遊離脂肪酸（１１／７）の直接的なエステル化反応の進行を表１１に示す。およそ変換率７３％で、残留遊離脂肪酸は、ＤＨＡ２４％を含み、回収率９５％であった。ＥＰＡは、予想したほど迅速には、エチルエステルに移行されなかった。興味深いことに、またＨＯと異なり、長鎖一不飽和遊離脂肪酸は、相当高い程度にまでエチルエステルへと変換された。ＥＰＡおよびＤＨＡの良好な分離を得るには、より高い変換率が必要である。ＢＷＯに関する低変換率の理由は明らかではないが、幾つかの試みでは、より高い変換率をもたらさなかった。
【００５４】
【表１１】
【００５５】
（実施例２）
魚油のエタノール分解および直接的なエステル化の組合せ
エタノール分解を始まりとして、直接的なエステル化が続く２工程反応（各工程後に、分子蒸留を行う）は、ＤＨＡの回収率および生成物中の濃度を改善するのに使用することができる。直接的なエステル化の前に、エタノール分解から得られるグリセリド混合物を加水分解する必要がある。したがって、エタノール分解反応を前工程として使用することができ、加水分解前に、出発材料のかさを半分減少させる。４０℃でのエタノール分解で、蒸留による分離後に、高い回収率が得られたことに注目されよう（表１２）。上述のように、また表１３および表１４に示すように、より良好な結果は、室温で得られた。室温反応からの残留物は、ＤＨＡ２３％およびＥＰＡ２５％を含み、それぞれ回収率は９７％および６５％であった（表１３）。これらの結果は、ＤＨＡ回収率が、２工程プロセスにより有意に改善することができることを示す。また、加水分解反応のためのかさ高さの劇的な減少が見られる。最終的に、このアプローチは、ＨＯのような長鎖一不飽和に非常に富んだ油に適切であり得る。
【００５６】
【表１２】
【００５７】
【表１３】
【００５８】
【表１４】
【００５９】
（実施例３）
魚油ヘキシルエステルのエタノール分解
魚油由来のヘキシルエステル（ＨＥ）のエタノール分解は、上述の魚油トリグリセリドのエタノール分解に対する代替法である（スキーム２）。結果は、リゾムコール・ミエヘイリパーゼ（ＭＭＬ）およびシュードモナス属リパーゼ（ＰＳＬおよびＰＦＬ）を含む各種リパーゼ、ならびに最近商品化されたNovozymeからのサーモマイセス・ラヌギノサリパーゼ（ＴＬＬ）を使用することができることを示す。また、分子蒸留は、残留ヘキシルエステルおよびより揮発性の高いエチルエステルを分離するのに非常に適していることが確認された。
【００６０】
カンジダ・アンタルクチカリパーゼ(Candida antarctica lipase)（ＣＡＬ）を用いて、ヘキサノールによる処理で、ＡＯトリグリセリドを相当するヘキシルエステルに変換した。得られたヘキシルエステルをエタノールおよびＰＳＬで処理した後、反応混合物の分子蒸留により、単一または２酵素工程で、およそ８０％のＥＰＡおよびＤＨＡを有する残留ヘキシルエステルが得られ得る。ヘキシルエステル中のＤＨＡを濃縮することにより、本発明者等は、エチルエステルをヘキシルエステルから分離することができるだけでなく、同様により飽和されたヘキシルエステルを留去することができる。ＣＡＬを用いて、化学的にまたは酵素的に、ヘキシルエステルをエチルエステルに変換することが可能であり得る。あるいは、ＭＭＬを用いたエタノール分解でカタクチイワシ油ヘキシルエステルを処理することが可能であり、単一酵素工程で、ヘキシルエステルとしてＤＨＡ７０％が得られ得る。それらは、さらなるＭＭＬ処理によりさらに濃縮され得る。ＥＰＡの大部分を含有するエチルエステル塊から、９５％以上のレベルにまでＥＰＡを精製することが可能であり得る。
【００６１】
代替的な２工程アプローチは、イワシ油のエタノール分解に基づき、分子蒸留後に、グリセリド混合物としてＥＰＡ＋ＤＨＡ（３０／２０）５０％の濃厚液を生じる。残留グリセリドをヘキサノールおよびＣＡＬで処理することにより、同一組成のヘキシルエステルが得られる。それらをエタノールおよびＰＳＬで処理して、およそ８０％のＥＰＡおよびＤＨＡを有するヘキシルエステルを生じてもよく、あるいはエタノールおよびＭＭＬで処理して、ＤＨＡをＥＰＡから分離してもよく、続いてＥＰＡおよびＤＨＡの両方をさらに濃縮する。この方法は、魚油のバルクをヘキサノールの代わりにエタノールで処理するという点で利点を有し得て、ともにより容易であり、あまりかさ高くなく、かつ工業的観点からより実現可能である。ＥＰＡおよびＤＨＡの両方の非常に高い優れた回収率が当該方法により期待できることも留意しなくてはならない。
【００６２】
カタクチイワシ油（ＡＯ）
魚油トリグリセリドのエタノール分解と同様に、ＭＭＬの脂肪酸選択性および活性は、温度により大いに影響を受け得る。したがって、ＭＭＬを用いて、２０℃以下でＥＰＡおよびＤＨＡの両方を濃縮することができるが、４０℃で、ＥＰＡはＤＨＡから分離され、高いＤＨＡ濃厚液を生じる。ＥＰＡ１８％およびＤＨＡ１２％を含むカタクチイワシ油ヘキシルエステルを、ＭＭＬ（ヘキシルエステルの１０重量％）の存在下で、２当量のエタノールと、４０℃で２４時間反応させて、変換率５９％に達した。リパーゼの除去後、過剰エタノールを蒸発させて、エチルエステル／ヘキシルエステル（ＥＥ／ＨＥ）混合物を１３５℃にて３×１０−３ｍｂａｒで蒸留した。残留物（２６重量％）は、ＤＨＡ４３％を含み、回収率はたった６５％であった。ＤＨＡ／ＥＰＡ比は、ほんの２．２に過ぎなかった（表１５）。
【００６３】
【表１５】
【００６４】
カタクチイワシ油ヘキシルエステル（１８／１３）の同様の反応で、反応温度を２０℃に下げた場合に、興味深い結果が得られた。１３５℃での蒸留後、残留物は、ＤＨＡ４５％およびＥＰＡ３０％を含み、それぞれ回収率は８５％および５５％であった（表１６）。
【００６５】
【表１６】
【００６６】
シュードモナス属リパーゼを小規模で試験して、良好な結果を伴い、特に反応が変換率５０％を超える場合に、高いＥＰＡ回収率を付与したが、相当低いＤＨＡ回収率を付与した。ＰＳＬおよびＰＦＬの存在下で室温でのＡＯ（１８／１２）と２当量のエタノールとのエタノール分解反応の結果を表１７に示す。ＰＦＬに関しては、２４時間でのイワシ油ヘキシルエステルのたった４４％の変換率後に、ＥＰＡ２８％およびＤＨＡ２１％の含有量が得られた一方で、２４時間でのＰＳＬに関する変換率５７％は、ＥＰＡ３３％およびＤＨＡ１７％をもたらした。
【００６７】
【表１７】
【００６８】
顆粒状シリカゲル上に固定化した新規ノボザイムリパーゼ（ＴＬＬ）をＭＭＬと比較した。新規リパーゼは、エタノールに対して感受性があることがわかり、温度を増加させるとともに、活性は迅速に減少した。２０℃で、リパーゼはともに活性であり、２４時間で、ＭＭＬに関しては変換率５４％が得られたが、ＴＬＬに関してはたったの４３％であった。ＴＴＬ反応からのＥＰＡ６％およびＤＨＡ２８％を含有するＴＯ（６／２８）の残留ヘキシルエステルは、ＥＰＡ８％およびＤＨＡ４５％を含有していた。ＭＭＬ反応は、ＥＰＡ７％およびＤＨＡ５４％を含有する残留ヘキシルエステルを生じた（表１８）。これらのリパーゼは、脂肪酸選択性においては明らかに同等であるが、ＴＬＬは、エタノール濃縮に対してより感受性が高く、このことがＴＬＬをＭＭＬに劣ったものにする。
【００６９】
【表１８】
【００７０】
４０℃でのＴＯヘキシルエステル（６／２８）とエタノールとのエタノール分解からの結果を表１９に示す。興味深いことに、４０℃では、ＴＬＬに関しては、たった１５％の変換率が、ＭＭＬに関しては変換率４７％が得られた。より高温で、リパーゼが極性のエタノールおよびその不利益な影響により感受性が高くなると考えられる。ＭＭＬに関して、２４時間で変換率４７％後、ヘキシルエステルは、ＥＰＡ９％およびＤＨＡ４９％を含んでいたのに対して、ＴＬＬ関しては、２４時間でたった１５％の変換率は、ＥＰＡ３３％およびＤＨＡ１７％をもたらした。
【００７１】
【表１９】
【００７２】
本発明により、リパーゼの存在下での魚油遊離脂肪酸または魚油ヘキシルエステルとエタノールとの溶媒を含まない直接的なエステル化によるＥＰＡおよびＤＨＡの分離が首尾よく得られる。留出物中のモノグリセリドに関する問題は、本発明による方法により回避される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は海産油（marine oil）のリパーゼ触媒したエステル化に関する。
【背景技術】
【０００２】
海産油を含めて種々の種類の油製品を、リパーゼ触媒の助けをかりて精製することは当該技術分野で既知であり、用いた精製条件下でリパーゼ触媒の特異性は所望の製品の回収を促進する。
【０００３】
ＥＰＡ（エイコサペンタエン酸、Ｃ２０：５）およびＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸、Ｃ２２：６）としてかかる商業的に重要なＰＵＦＡを、比較的低濃度でＥＰＡおよびＤＨＡを含有する魚油のような組成物から単離するためのリパーゼ触媒した方法を開発するために、広範囲にわたる研究が行われている。
【０００４】
例えばＰＣＴ／ＮＯ９５／０００５０号（国際公開第９５／２４４５９号パンフレット）では、本発明者等は、エステル交換反応条件に対してトリグリセリドの形で飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸を含有する油組成物を、飽和脂肪酸およびモノ不飽和脂肪酸のエステル交換を優先的に触媒するのに活性なリパーゼの存在下に実質的に無水の条件下でエタノールの如きＣ１ー６アルコールで処理する方法を開示している。好ましいリパーゼ、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）リパーゼ（ＰＦＬ）および蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）リパーゼ（ＰＦＬ）を用いると、海産油供給源から、グリセリドの形で工業上および医療上重要なオメガ−３ポリ不飽和脂肪酸ＥＰＡおよびＤＨＡの７０重量％以上を含有する濃厚液を製造することができた。
【０００５】
多数のリパーゼ触媒した精製法ではグリセロールを利用した。
【０００６】
例えば、特開昭６２−９１１８８号公報（１９８７年）、国際公開第９１／１６４４３号パンフレット、Int. J. Food. Sci. Technol. (1992), 27, 73-76, Lie and Molin、Myrnes et al, JAOCS, Vol. 72, No. 11 (1995), 1339-1344、Moore et al, JAOCS, Vol. 73, No. 11 (1996), 1409-1414、McNeill et al, JAOCS, Vol. 73, No. 11 (1996), 1403-1407、国際公開第９６／３７５８号パンフレットおよび国際公開第９６／３７５８７号パンフレットを挙げることができる。
【０００７】
ＰＣＴ／ＮＯ００／０００５６号（国際公開第２０００／４９１１７号パンフレット）では、本発明者等は、遊離脂肪酸としてＥＰＡおよびＤＨＡを含有する海産油組成物を、出発組成物と比較した場合にこれらの脂肪酸の少なくとも１つに富んだ遊離脂肪酸画分を形成するようにエステル化する方法であって、減圧および本質的に有機溶媒を含まない条件下で、リパーゼ触媒であるリゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ（ＭＭＬ）の存在下にて、上記海産油組成物をグリセロールと反応させる工程、およびＥＰＡおよびＤＨＡの少なくとも１つに富んだ遊離脂肪酸画分を回収する工程を含む方法を提供した。好ましくは、短経路(short path)蒸留を用いて、グリセリド混合物から残留遊離脂肪酸を分離した。
【０００８】
しかしながら、今日では、グリセリド混合物から残留遊離脂肪酸を分離するための短経路蒸留に基づいたこの戦略は、あまり実現可能ではないことが明らかとなってきた。これは、より短鎖のモノグリセリドの揮発性が高すぎることの結果であり、留出物を非常に汚染する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は今回、メタノールまたはエタノールの遊離脂肪酸の直接的なエステル化、またはＣｍアルコール（ｍ＝１〜１２、ｎ＞ｍ）による魚油由来のＣｎアルキルエステル（ｎ＝２〜１８）のエステル交換（アルコール分解）、および続く短経路蒸留により、ＥＰＡおよびＤＨＡの濃厚液を調製するためのリパーゼ触媒した方法が、高ＤＨＡ濃厚液を提供することを発見した。これらの方法は、迅速かつ簡素な反応であり、留出物中に好ましくないモノグリセリドを生成することなく、ＥＰＡとＤＨＡとの間での優れた分離を提供する。これらの方法の本質的な特徴は、添付の特許請求の範囲で規定している。
【００１０】
本発明の好ましい実施形態では、Ｃ１〜Ｃ１２アルコールは、エタノールである（エタノール分解）。Ｃ２〜Ｃ１８アルキルエステルの中でも、ヘキシルエステルが好ましい。
【００１１】
直接的なエステル化における出発材料中の遊離脂肪酸に対するメタノールまたはエタノールのモル比は、０．５〜１０．０であり、好ましい比は、０．５〜３．０であり、最も好ましい比は、１．０〜２．０であり、さらに好ましい比は、１．０〜１．５である。
【００１２】
エステル交換におけるＣｎアルキルエステルに対するＣｍアルコールのモル比は、０．５〜１０．０であり、好ましい比は、０．５〜３．０であり、最も好ましい比は、２．０〜３．０である。
【００１３】
エステル化反応は、０℃〜７０℃の温度、好ましくは、２０℃〜４０℃の温度で実施される。
【００１４】
本発明で使用されるリパーゼ触媒は、担体上に固定化される。
【００１５】
アルコール分解中に使用するリパーゼによっては、それらがＥＰＡの相当するアルコール分解よりもかなり低速度で、ＤＨＡのアルコール分解を触媒するという特性を有するものもある。かかる特性を有する好ましいリパーゼは、リゾムコール・ミエヘイ（ＭＭＬ）である。他のリパーゼは、それらがより短鎖のおよびより飽和した脂肪酸の相当するアルコール分解よりもかなり低速度で、ＥＰＡおよびＤＨＡの両方のアルコール分解を触媒するという特性を有する。かかる特性を有するリパーゼは、シュードモナス属リパーゼ（ＰＳＬ）および蛍光菌リパーゼ（ＰＦＬ）である。
【００１６】
ＭＭＬによるエタノールを用いた魚油遊離脂肪酸の直接的なエステル化は、G.G. Haraldsson and B. Kristinsson, J. Am. Oil. Chem. Soc. 75:1551-1556 (1998)からすでに既知である。
【００１７】
【化１】
スキーム１．ＭＭＬによるエタノールを用いた魚油遊離脂肪酸の直接的なエステル化
【００１８】
しかしながら、ＤＨＡ残留遊離脂肪酸およびエチルエステルの満足のいく分離が、短経路蒸留技術で可能であるとは考えられていなかった。そこで、本発明者等は、驚くべきことに、短経路蒸留技術がかなり首尾よく使用することができることを見出した。このことは、以下の実施例に示す結果から明らかである。
【００１９】
本発明は、リパーゼによる魚油ヘキシルエステルのエタノール分解、ならびにそれに続いて分子蒸留して、残留ヘキシルエステルおよびより揮発性の高いエチルエステルを分離することをさらに開示する。
【００２０】
【化２】
スキーム２．リパーゼ（ＭＭＬ）による魚油ヘキシルエステルのエタノール分解
【００２１】
ＤＨＡの回収率および生成物中の濃度をさらに改善するために、ＰＣＴ／ＮＯ９５／０００５０号（国際公開第９５／２４４５９号パンフレット）に記載されるようにエタノール分解反応は、直接的なエステル化の前の前工程として使用することができる。
【００２２】
【化３】
スキーム３．リパーゼ（ＭＭＬ）による魚油のエタノール分解
【００２３】
直接的なエステル化の前に、グリセリド混合物を加水分解する必要がある。加水分解前に、出発材料のかさを半分減少させるために、ＰＣＴ／ＮＯ９５／０００５０号（国際公開第９５／２４４５９号パンフレット）のエタノール分解反応が有用であることがわかっている。したがって、本発明はまた、代替法として、エタノール分解および続く直接的なエステル化を開始とする２酵素工程反応を開示し、各工程後に、分子蒸留による濃縮が続く。この２工程反応はまた、ニシン油のような長鎖一不飽和に非常に富んだ油にも適している。
【００２４】
２工程反応はまた、魚油ヘキシルエステルが出発材料である場合に、適用可能かつ好適である。
【実施例】
【００２５】
本発明は、以下の実施例により説明される。
【００２６】
イワシ油（ＳＯ）、カタクチイワシ油（ＡＯ）、ニシン油（ＨＯ）、タラ肝油（ＣＬＯ）、マグロ油（ＴＯ）およびブルーホワイティング油（ＢＷＯ）のような出発材料を試験した。
【００２７】
実験手順
シュードモナス属（ＰＳＬ、リパーゼＡＫ）および蛍光菌（ＰＦＬ、リパーゼＰＳ）由来の細菌リパーゼは、Amano Enzyme Inc.から購入した。固定化リゾムコール・ミエヘイ（ＭＭＬ、リポザイムＲＭ ＩＭ）、サーモマイセス・ラヌギノサ(Thermomyces lanuginosa)（ＴＬＬ、リポザイムＴＭ ＩＭ）およびカンジダ・アンタルクチカ(Candida antarctica)（ＣＡＬ、ノボザイム４３５）リパーゼは、デンマークのNovozymeにより提供された。イワシ油（ＥＰＡ１４％およびＤＨＡ１５％）、カタクチイワシ油（ＥＰＡ１８％およびＤＨＡ１２％）、ニシン油（ＥＰＡ６％およびＤＨＡ８％）、マグロ油（ＥＰＡ６％およびＤＨＡ２３％）、タラ肝油（ＥＰＡ９％およびＤＨＡ９％）、ならびにブルーホワイティング油（ＥＰＡ１１％およびＤＨＡ７％）はすべて、Pronova Biocareにより提供された。脂肪酸分析は、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を装備したＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ８１４０ ガスクロマトグラフ（ＧＣ）を用いて実施した。キャピラリーカラムは、J & W Scientificからの３０メートルのＤＢ−２２５ ３０Ｎ、０．２５μｍキャピラリーカラムであった。短経路蒸留は、Ｌｅｙｂｏｌｄ ＫＤＬ ４蒸留器中で実施した。核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、溶媒として重水素化クロロホルム中にてＢｒｕｋｅｒ ＡＣ ２５０ＮＭＲ分光計で記録した。分取用薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）は、Merckからのシリカゲルプレート（Ａｒｔ ５７２１）で行った。溶出は、石油エーテル：ジエチルエーテル：酢酸の８０：２０：１の混合物を用いて実施した。ローダミンＧ(Merck)を用いて、バンドを可視化させた後、掻き取って、メチル化した。Ｃ１９：０のメチルエステル(Sigma)を内部標準としてサンプルに添加した後、ＧＣに注入した。
【００２８】
魚油の加水分解
魚油（５００ｇ、０．５５ｍｏｌ）を水酸化ナトリウム（１９０ｇ、４．７５ｍｏｌ）、水（５００ｍｌ）および９６％エタノール（１．７Ｌ）の溶液に添加した。得られた混合物を３０分間（透明な着色液体が観察されるまで）還流させた後、絶えず攪拌しながら室温にまで冷却した。溶液を中和するために、６．０Ｍ塩酸（８７０ｍｌ、１０％過剰）を慎重に添加して、得られた混合物を分液漏斗に移した。石油エーテルおよびジエチルエーテルの１：１の混合物（１．５Ｌ）を用いて、遊離脂肪酸を二度抽出した。続いて、有機層を水（１．５Ｌ）で三度洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥剤を濾別して、溶媒を蒸発により除去して、５０℃で２時間高真空蒸発で仕上げた。分析用ＴＬＣによる分析で、単一のスポットは、純粋な遊離脂肪酸を示した。生成物の色は、魚油に応じて、黄色がかった色から濃赤紫色まで多様であった。
【００２９】
エタノールによる魚油遊離脂肪酸の直接的なエステル化
固定化ＭＭＬ（１５ｇ）を魚油遊離脂肪酸（３００ｇ、およそ１．０３ｍｏｌ）および無水エタノール（１４３ｇ、３．１０ｍｏｌ）の溶液に添加した。所望の変換率に達するまで、得られた酵素懸濁液を窒素下にて４０℃で穏やかに攪拌した。反応中にサンプルを取り出して、０．０２Ｍ ＮａＯＨによる滴定により、遊離脂肪酸の残留量を検出して、反応の進行をモニタリングした。分別は、分取用ＴＬＣにより実施して、続いて、各脂質画分を、ＧＣにより定量化して、脂肪酸プロフィールに関して分析した。所望の変換率に達した後、酵素を濾過により除去して、過剰エタノールを真空中で蒸発させた。得られた混合物の短経路蒸留後に、残留物として高ＤＨＡ濃厚液が得られた。
【００３０】
リパーゼによる魚油のエタノール分解
固定化ＭＭＬ（２０ｇ）を魚油（４００ｇ、０．４４ｍｏｌ）および無水エタノール（６１ｇ、１．３２ｍｏｌ）の溶液に添加した。所望の変換率に達するまで、得られた酵素懸濁液を窒素下にて室温で穏やかに攪拌した。続いて、酵素を濾過により除去して、過剰エタノールを真空中で蒸発させた後、短経路蒸留した。反応の進行は、分析用ＴＬＣおよび１Ｈ−ＮＭＲによりモニタリングした。分別は、分取用ＴＬＣにより実施して、続いて、各脂質画分を、ＧＣにより定量化して、脂肪酸プロフィールに関して分析した。
【００３１】
リパーゼによる魚油のヘキサノール分解
固定化ＣＡＬ（２５ｇ）を魚油（５００ｇ、０．５５ｍｏｌ）および１−ヘキサノール（３３８ｇ、３．３１ｍｏｌ）の溶液に添加した。分析用ＴＬＣおよび／または１Ｈ−ＮＭＲに従ってトリアシルグリセロールが完全にヘキシルエステルに変換されるまで、得られた酵素懸濁液を窒素下にて６５℃で穏やかに攪拌した。酵素を濾過により除去して、過剰ヘキサノールを真空中で蒸発させた。
【００３２】
リパーゼによる魚油ヘキシルエステルのエタノール分解
固定化ＭＭＬ（１５ｇ）を魚油ヘキシルエステル（３００ｇ、０．８０ｍｏｌ）および無水エタノール（１１１ｇ、２．４１ｍｏｌ）の溶液に添加した。１Ｈ−ＮＭＲに従って所望の変換率が得られるまで、得られた酵素懸濁液を窒素下にて４０℃で穏やかに攪拌した。酵素を濾過により除去して、過剰エタノールを真空中で蒸発させた。得られた混合物の短経路蒸留後に、残留物として高ＤＨＡ濃厚液が得られた。各エステル群の脂肪酸組成は、１回のＧＣの実施により確定した。
【００３３】
（実施例１）
エタノールによる魚油遊離脂肪酸の直接的なエステル化
イワシ油（ＳＯ）
ＭＭＬ（遊離脂肪酸の重量に基づいて５％）の存在下にて４０℃でのＥＰＡ１４％およびＤＨＡ１５％を含有するＳＯ遊離脂肪酸（１４／１５）と３当量のエタノールとの直接的なエステル化反応の進行を表１に示す。これらの条件下では、リパーゼは、ＳＯ遊離脂肪酸に対して極めて高い活性を示した。７０％を超える変換率（エチルエステル％）が、たった２時間で達成された。４時間の反応後、残留遊離脂肪酸は、それぞれ回収率７３％および１０％で、ＤＨＡ４９％およびＥＰＡ６％を含有していた。ＤＨＡの濃度および回収率に関して、最適な変換率は、変換率およそ７５％であるようである。表１では、反応の進行中に生産されたエチルエステルの重量パーセントを、変換率の程度の尺度として直接使用した。
【００３４】
【表１】
【００３５】
短経路蒸留による分離後に、ＳＯ遊離脂肪酸の直接的なエステル化に関して、優れた結果が得られた。ＳＯ遊離脂肪酸を、４０℃で４時間、ＭＭＬの存在下でエタノールと反応させて、変換率７８％に達した。反応混合物の遊離脂肪酸は、ＤＨＡ回収率７５％で、ＤＨＡ４９％およびＥＰＡ６％を含んでいた。１１５℃での蒸留後、残留物は、ＤＨＡ６９％およびＥＰＡ９％、ならびにそれぞれ回収率６５％および１０％を含んでいた（表２）。ＤＨＡの回収率は、蒸留温度をわずかに下げることにより改善された（表３を参照）。本発明者等は、蒸留により残留遊離脂肪酸からエチルエステルをすべて分離することができなかった。それにもかかわらず、本発明者等は、１１５℃での短経路蒸留後に、遊離脂肪酸およそ９０％およびエチルエステル１０％を有する高ＤＨＡ濃厚液を首尾よく得た。残留物中に得られたエチルエステルは、遊離脂肪酸と同様に非常にＤＨＡに富んでいる。さらに、より飽和されたおよびより短鎖の遊離脂肪酸は蒸留され、反応後の遊離脂肪酸画分に関してよりも高いＤＨＡ濃度の残留物を生じる。
【００３６】
【表２】
【００３７】
ＳＯに関する結果は、表３に示すように、変換率および蒸留温度を低減させることにより改善した。４時間の反応後、変換率７５％が得られた。１１１℃で蒸留した後、残留物は、回収率８８％でＤＨＡ６６％を含有し、ＤＨＡ／ＥＰＡ比は４．７であった。わずかに高い蒸留温度では、残留物は、回収率７５％でＤＨＡ７４％を含み、ＤＨＡ／ＥＰＡ比はほぼ７であった。蒸留後のＤＨＡ回収率は、出発油中のＤＨＡの重量パーセントに基づくことに留意すべきである。
【００３８】
【表３】
【００３９】
エタノール含有量を１当量に低減させることができ、これは反応時間の増加をもたらす（表４）。少ないリパーゼを導入することもでき、これはかなり低い反応率をもたらす。
【００４０】
【表４】
【００４１】
カタクシイワシ油（ＡＯ）
ＳＯと同一条件下でのＥＰＡ１８％およびＤＨＡ１２％を含むＡＯ遊離脂肪酸（１８／１２）の直接的なエステル化反応の進行を表５に示す。認識され得るように、２４時間後、変換率８２％で、約６：１のＤＨＡ／ＥＰＡ比が得られ、ＥＰＡ８％およびＤＨＡ５０％を含んでいた。ＤＨＡ回収率は、８０％を少し下回った。同様に、１１時間後では、変換率７９％で、ＤＨＡ／ＥＰＡ比は５：１であり、ＤＨＡ回収率は８４％程度で高かった。したがって、ＡＯおよびＳＯはともに、重要である場合に、エチルエステル画分から、ＤＨＡが多い濃厚液を作製するための、かつ同様にＥＰＡが多い濃厚液を作製するための非常に潜在的な出発材料である。
【００４２】
【表５】
【００４３】
ＡＯに関する結果は、表６に示すように、ＤＨＡ濃度およびＤＨＡ／ＥＰＡ比に関して良好である。ＡＯ（１９／１２）の遊離脂肪酸を上述のように反応させて、１１時間で変換率７６％に達した。１２１℃で蒸留した後、残留物は、回収率がたった６４％でＤＨＡ６１％を含み、ＤＨＡ／ＥＰＡ比は５．５であった。留出物は、場合によっては、より低温度で蒸留を繰り返すことにより、高いＥＰＡ濃厚液を作製するのに使用してもよい。例えば、ＥＰＡ４５％およびＤＨＡ１０％の濃厚液は、潜在的な商品用の望ましい組成物であるとみなされる。
【００４４】
【表６】
【００４５】
ニシン油（ＨＯ）
ＥＰＡ６％およびＤＨＡ８％を含むニシン油（６／８）由来の遊離脂肪酸を、上述のような直接的なエステル化条件下で同様に処理した。反応の進行を表７に示す。１２時間の反応後の残留遊離脂肪酸は、ＤＨＡ３７％およびＥＰＡ６％を含有し、それぞれ回収率９０％および１８％であった。
【００４６】
【表７】
【００４７】
ＥＰＡ９％およびＤＨＡ９％を含む異なるＨＯ（９／９）由来の遊離脂肪酸を、上述と同じ方法で１２時間反応させて、変換率８４％に達した。反応混合物の遊離脂肪酸は、ＤＨＡ３９％およびＥＰＡ８％を含み、ＤＨＡ回収率７６％であった。１１０℃で蒸留した後、残留物は、ＤＨＡ４０％およびＥＰＡ７％を含有し、ＤＨＡ回収率６８％、ＤＨＡ／ＥＰＡ比はほぼ６：１であった（表８）。低いＤＨＡ濃度は、２０：１（４％）および２２：１（３７％）の長鎖一不飽和脂肪酸の高い含有量に起因する。ＨＯおよびカラフトシシャモ油中の長鎖一不飽和脂肪酸のこの高い含有量が、上述の方法に関して、それらをあまりふさわしくない出発材料としている。残留油中に単に尿素を含ませることを使用して、これらの一不飽和脂肪酸の大部分を除去してもよく、ＤＨＡの有価な濃厚液をもたらす。低いＥＰＡ含有量のＨＯは、高いＤＨＡ／ＥＰＡ比を得るのに、ＳＯおよびＡＯよりも適していることを付け加えるべきである。
【００４８】
【表８】
【００４９】
マグロ油（ＴＯ）
上述のＳＯと同一条件下でのＥＰＡ６％およびＤＨＡ２３％を含むＴＯ遊離脂肪酸（１６／２３）の直接的なエステル化反応の進行を下記表９に示す。８時間の反応後、変換率６８％が得られ、残留遊離脂肪酸は、ＤＨＡ７４％およびＥＰＡ３％を含み、ＤＨＡ回収率８３％で、ＤＨＡ／ＥＰＡ比は２５：１であった（表９）。明らかに、このタイプの出発油の初期ＥＰＡ／ＤＨＡ組成は、ＤＨＡを濃縮するのに理想的である。
【００５０】
【表９】
【００５１】
タラ肝油（ＣＬＯ）
上述と同様の条件下でのＥＰＡ９％およびＤＨＡ９％を含むＣＬＯ遊離脂肪酸（９／９）の直接的なエステル化反応の進行を表１０に示す。およそ変換率７９％で、残留遊離脂肪酸に関してＤＨＡ／ＥＰＡ比５：１が得られ、ＤＨＡ濃度５０％で、ＤＨＡ回収率は８０％を上回った。これらの結果は、潜在的なＤＨＡ回収率を考慮すると、ＳＯおよびＡＯに関する結果よりもさらに良好である。しかし、コストに関しては、ＳＯおよびＡＯは、ＣＬＯよりも好適である。ＣＬＯは、はるかに少ない長鎖一不飽和（２０：１および２２：１）を含有するという事実を踏まえて、ＣＬＯ（９／９）からの結果をＨＯ（９／９）からの結果と比較することは、重要であり得る。
【００５２】
【表１０】
【００５３】
ブルーホワイティング油（ＢＷＯ）
上述の条件下でのＥＰＡ１１％およびＤＨＡ７％を含むＢＷＯ遊離脂肪酸（１１／７）の直接的なエステル化反応の進行を表１１に示す。およそ変換率７３％で、残留遊離脂肪酸は、ＤＨＡ２４％を含み、回収率９５％であった。ＥＰＡは、予想したほど迅速には、エチルエステルに移行されなかった。興味深いことに、またＨＯと異なり、長鎖一不飽和遊離脂肪酸は、相当高い程度にまでエチルエステルへと変換された。ＥＰＡおよびＤＨＡの良好な分離を得るには、より高い変換率が必要である。ＢＷＯに関する低変換率の理由は明らかではないが、幾つかの試みでは、より高い変換率をもたらさなかった。
【００５４】
【表１１】
【００５５】
（実施例２）
魚油のエタノール分解および直接的なエステル化の組合せ
エタノール分解を始まりとして、直接的なエステル化が続く２工程反応（各工程後に、分子蒸留を行う）は、ＤＨＡの回収率および生成物中の濃度を改善するのに使用することができる。直接的なエステル化の前に、エタノール分解から得られるグリセリド混合物を加水分解する必要がある。したがって、エタノール分解反応を前工程として使用することができ、加水分解前に、出発材料のかさを半分減少させる。４０℃でのエタノール分解で、蒸留による分離後に、高い回収率が得られたことに注目されよう（表１２）。上述のように、また表１３および表１４に示すように、より良好な結果は、室温で得られた。室温反応からの残留物は、ＤＨＡ２３％およびＥＰＡ２５％を含み、それぞれ回収率は９７％および６５％であった（表１３）。これらの結果は、ＤＨＡ回収率が、２工程プロセスにより有意に改善することができることを示す。また、加水分解反応のためのかさ高さの劇的な減少が見られる。最終的に、このアプローチは、ＨＯのような長鎖一不飽和に非常に富んだ油に適切であり得る。
【００５６】
【表１２】
【００５７】
【表１３】
【００５８】
【表１４】
【００５９】
（実施例３）
魚油ヘキシルエステルのエタノール分解
魚油由来のヘキシルエステル（ＨＥ）のエタノール分解は、上述の魚油トリグリセリドのエタノール分解に対する代替法である（スキーム２）。結果は、リゾムコール・ミエヘイリパーゼ（ＭＭＬ）およびシュードモナス属リパーゼ（ＰＳＬおよびＰＦＬ）を含む各種リパーゼ、ならびに最近商品化されたNovozymeからのサーモマイセス・ラヌギノサリパーゼ（ＴＬＬ）を使用することができることを示す。また、分子蒸留は、残留ヘキシルエステルおよびより揮発性の高いエチルエステルを分離するのに非常に適していることが確認された。
【００６０】
カンジダ・アンタルクチカリパーゼ(Candida antarctica lipase)（ＣＡＬ）を用いて、ヘキサノールによる処理で、ＡＯトリグリセリドを相当するヘキシルエステルに変換した。得られたヘキシルエステルをエタノールおよびＰＳＬで処理した後、反応混合物の分子蒸留により、単一または２酵素工程で、およそ８０％のＥＰＡおよびＤＨＡを有する残留ヘキシルエステルが得られ得る。ヘキシルエステル中のＤＨＡを濃縮することにより、本発明者等は、エチルエステルをヘキシルエステルから分離することができるだけでなく、同様により飽和されたヘキシルエステルを留去することができる。ＣＡＬを用いて、化学的にまたは酵素的に、ヘキシルエステルをエチルエステルに変換することが可能であり得る。あるいは、ＭＭＬを用いたエタノール分解でカタクチイワシ油ヘキシルエステルを処理することが可能であり、単一酵素工程で、ヘキシルエステルとしてＤＨＡ７０％が得られ得る。それらは、さらなるＭＭＬ処理によりさらに濃縮され得る。ＥＰＡの大部分を含有するエチルエステル塊から、９５％以上のレベルにまでＥＰＡを精製することが可能であり得る。
【００６１】
代替的な２工程アプローチは、イワシ油のエタノール分解に基づき、分子蒸留後に、グリセリド混合物としてＥＰＡ＋ＤＨＡ（３０／２０）５０％の濃厚液を生じる。残留グリセリドをヘキサノールおよびＣＡＬで処理することにより、同一組成のヘキシルエステルが得られる。それらをエタノールおよびＰＳＬで処理して、およそ８０％のＥＰＡおよびＤＨＡを有するヘキシルエステルを生じてもよく、あるいはエタノールおよびＭＭＬで処理して、ＤＨＡをＥＰＡから分離してもよく、続いてＥＰＡおよびＤＨＡの両方をさらに濃縮する。この方法は、魚油のバルクをヘキサノールの代わりにエタノールで処理するという点で利点を有し得て、ともにより容易であり、あまりかさ高くなく、かつ工業的観点からより実現可能である。ＥＰＡおよびＤＨＡの両方の非常に高い優れた回収率が当該方法により期待できることも留意しなくてはならない。
【００６２】
カタクチイワシ油（ＡＯ）
魚油トリグリセリドのエタノール分解と同様に、ＭＭＬの脂肪酸選択性および活性は、温度により大いに影響を受け得る。したがって、ＭＭＬを用いて、２０℃以下でＥＰＡおよびＤＨＡの両方を濃縮することができるが、４０℃で、ＥＰＡはＤＨＡから分離され、高いＤＨＡ濃厚液を生じる。ＥＰＡ１８％およびＤＨＡ１２％を含むカタクチイワシ油ヘキシルエステルを、ＭＭＬ（ヘキシルエステルの１０重量％）の存在下で、２当量のエタノールと、４０℃で２４時間反応させて、変換率５９％に達した。リパーゼの除去後、過剰エタノールを蒸発させて、エチルエステル／ヘキシルエステル（ＥＥ／ＨＥ）混合物を１３５℃にて３×１０−３ｍｂａｒで蒸留した。残留物（２６重量％）は、ＤＨＡ４３％を含み、回収率はたった６５％であった。ＤＨＡ／ＥＰＡ比は、ほんの２．２に過ぎなかった（表１５）。
【００６３】
【表１５】
【００６４】
カタクチイワシ油ヘキシルエステル（１８／１３）の同様の反応で、反応温度を２０℃に下げた場合に、興味深い結果が得られた。１３５℃での蒸留後、残留物は、ＤＨＡ４５％およびＥＰＡ３０％を含み、それぞれ回収率は８５％および５５％であった（表１６）。
【００６５】
【表１６】
【００６６】
シュードモナス属リパーゼを小規模で試験して、良好な結果を伴い、特に反応が変換率５０％を超える場合に、高いＥＰＡ回収率を付与したが、相当低いＤＨＡ回収率を付与した。ＰＳＬおよびＰＦＬの存在下で室温でのＡＯ（１８／１２）と２当量のエタノールとのエタノール分解反応の結果を表１７に示す。ＰＦＬに関しては、２４時間でのイワシ油ヘキシルエステルのたった４４％の変換率後に、ＥＰＡ２８％およびＤＨＡ２１％の含有量が得られた一方で、２４時間でのＰＳＬに関する変換率５７％は、ＥＰＡ３３％およびＤＨＡ１７％をもたらした。
【００６７】
【表１７】
【００６８】
顆粒状シリカゲル上に固定化した新規ノボザイムリパーゼ（ＴＬＬ）をＭＭＬと比較した。新規リパーゼは、エタノールに対して感受性があることがわかり、温度を増加させるとともに、活性は迅速に減少した。２０℃で、リパーゼはともに活性であり、２４時間で、ＭＭＬに関しては変換率５４％が得られたが、ＴＬＬに関してはたったの４３％であった。ＴＴＬ反応からのＥＰＡ６％およびＤＨＡ２８％を含有するＴＯ（６／２８）の残留ヘキシルエステルは、ＥＰＡ８％およびＤＨＡ４５％を含有していた。ＭＭＬ反応は、ＥＰＡ７％およびＤＨＡ５４％を含有する残留ヘキシルエステルを生じた（表１８）。これらのリパーゼは、脂肪酸選択性においては明らかに同等であるが、ＴＬＬは、エタノール濃縮に対してより感受性が高く、このことがＴＬＬをＭＭＬに劣ったものにする。
【００６９】
【表１８】
【００７０】
４０℃でのＴＯヘキシルエステル（６／２８）とエタノールとのエタノール分解からの結果を表１９に示す。興味深いことに、４０℃では、ＴＬＬに関しては、たった１５％の変換率が、ＭＭＬに関しては変換率４７％が得られた。より高温で、リパーゼが極性のエタノールおよびその不利益な影響により感受性が高くなると考えられる。ＭＭＬに関して、２４時間で変換率４７％後、ヘキシルエステルは、ＥＰＡ９％およびＤＨＡ４９％を含んでいたのに対して、ＴＬＬ関しては、２４時間でたった１５％の変換率は、ＥＰＡ３３％およびＤＨＡ１７％をもたらした。
【００７１】
【表１９】
【００７２】
本発明により、リパーゼの存在下での魚油遊離脂肪酸または魚油ヘキシルエステルとエタノールとの溶媒を含まない直接的なエステル化によるＥＰＡおよびＤＨＡの分離が首尾よく得られる。留出物中のモノグリセリドに関する問題は、本発明による方法により回避される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リパーゼを用いたエタノールまたはメタノールによる魚油遊離脂肪酸の直接的なエステル化から得られるＥＰＡ（エイコサペンタエン酸、Ｃ２０：５）に富んだエチルまたはメチルエステル画分およびＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸、Ｃ２２：６）に富んだ遊離脂肪酸画分を、分子蒸留により分離する方法。
【請求項２】
前記魚油遊離脂肪酸出発材料は、リパーゼ触媒した魚油トリグリセリドのアルコール分解、続く分子蒸留、および残留グリセリド混合物の加水分解により得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（１）出発材料と比較した場合にＤＨＡに富んだＣｎ脂肪酸アルキルエステル画分（ｎ＝２〜１８）および出発材料と比較した場合にＥＰＡに富んだＣｍ脂肪酸アルキルエステル画分（ｍ＝１〜１２、ｎ＞ｍ）、または（２）出発材料と比較した場合にＤＨＡおよびＥＰＡの両方に富んだＣｎ脂肪酸アルキルエステル画分（ｎ＝２〜１８）ならびに出発材料と比較した場合にＤＨＡおよびＥＰＡの両方が少ないＣｍ脂肪酸アルキルエステル画分（ｍ＝１〜１２、ｎ＞ｍ）を形成するように、脂肪酸のＣｎアルキルエステル（ｎ＝２〜１８）としてＥＰＡおよびＤＨＡを含有する海産油組成物をエステル化する方法であって、本質的に有機溶媒を含まない条件下で、リパーゼ触媒の存在下にて、前記海産油組成物をＣｍアルコール（ｍ＝１〜１２、ｎ＞ｍ）と反応させる工程、および分子蒸留による前記画分を分離する工程を含む方法。
【請求項４】
前記出発物質であるＣ２〜Ｃ１８アルキルエステルは、リパーゼ触媒した魚油トリグリセリドのアルコール分解、続く分子蒸留、およびＣ２〜Ｃ１８アルキルアルコールによる残留グリセリド混合物のアルコール分解により得られる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｃ２〜Ｃ１８アルキルエステルは、ヘキシルエステルである、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｃ１〜Ｃ１２アルコールは、エタノールである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記リパーゼ触媒は、リゾムコール・ミエヘイリパーゼ(Rhizomucor miehei lipase)（ＭＭＬ）、サーモマイセス・ラヌギノサリパーゼ(Thermomyces lanuginosa lipase)（ＴＬＬ）、シュードモナス属リパーゼ(Psedomonas sp. lipase)（ＰＳＬ）または蛍光菌リパーゼ(Psedomonas fluorescens lipase)（ＰＦＬ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
出発組成における遊離脂肪酸に対するメタノールまたはエタノールのモル比は、０．５〜１０．０である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記モル比は、０．５〜３．０である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記モル比は、１．０〜２．０である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記モル比は、０．５〜１．５である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
Ｃ２〜Ｃ１８アルキルエステルに対するＣ１〜Ｃ１２アルコールのモル比は、０．５〜１０．０である、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記モル比は、０．５〜３．０である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記モル比は、２．０〜３．０である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記エステル化反応は、０℃〜７０℃の温度で実施される、請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記エステル化反応は、２０℃〜４０℃の温度で実施される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記リパーゼ触媒は、担体上に固定化される、請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記リパーゼは、ＥＰＡの相当するアルコール分解よりもかなり低速度でＤＨＡのアルコール分解を触媒する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記リパーゼ触媒は、リゾムコール・ミエヘイリパーゼ（ＭＭＬ）またはサーモマイセス・ラヌギノサリパーゼ（ＴＬＬ）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項１】
リパーゼを用いたエタノールまたはメタノールによる魚油遊離脂肪酸の直接的なエステル化から得られるＥＰＡ（エイコサペンタエン酸、Ｃ２０：５）に富んだエチルまたはメチルエステル画分およびＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸、Ｃ２２：６）に富んだ遊離脂肪酸画分を、分子蒸留により分離する方法。
【請求項２】
前記魚油遊離脂肪酸出発材料は、リパーゼ触媒した魚油トリグリセリドのアルコール分解、続く分子蒸留、および残留グリセリド混合物の加水分解により得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（１）出発材料と比較した場合にＤＨＡに富んだＣｎ脂肪酸アルキルエステル画分（ｎ＝２〜１８）および出発材料と比較した場合にＥＰＡに富んだＣｍ脂肪酸アルキルエステル画分（ｍ＝１〜１２、ｎ＞ｍ）、または（２）出発材料と比較した場合にＤＨＡおよびＥＰＡの両方に富んだＣｎ脂肪酸アルキルエステル画分（ｎ＝２〜１８）ならびに出発材料と比較した場合にＤＨＡおよびＥＰＡの両方が少ないＣｍ脂肪酸アルキルエステル画分（ｍ＝１〜１２、ｎ＞ｍ）を形成するように、脂肪酸のＣｎアルキルエステル（ｎ＝２〜１８）としてＥＰＡおよびＤＨＡを含有する海産油組成物をエステル化する方法であって、本質的に有機溶媒を含まない条件下で、リパーゼ触媒の存在下にて、前記海産油組成物をＣｍアルコール（ｍ＝１〜１２、ｎ＞ｍ）と反応させる工程、および分子蒸留による前記画分を分離する工程を含む方法。
【請求項４】
前記出発物質であるＣ２〜Ｃ１８アルキルエステルは、リパーゼ触媒した魚油トリグリセリドのアルコール分解、続く分子蒸留、およびＣ２〜Ｃ１８アルキルアルコールによる残留グリセリド混合物のアルコール分解により得られる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｃ２〜Ｃ１８アルキルエステルは、ヘキシルエステルである、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｃ１〜Ｃ１２アルコールは、エタノールである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記リパーゼ触媒は、リゾムコール・ミエヘイリパーゼ(Rhizomucor miehei lipase)（ＭＭＬ）、サーモマイセス・ラヌギノサリパーゼ(Thermomyces lanuginosa lipase)（ＴＬＬ）、シュードモナス属リパーゼ(Psedomonas sp. lipase)（ＰＳＬ）または蛍光菌リパーゼ(Psedomonas fluorescens lipase)（ＰＦＬ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
出発組成における遊離脂肪酸に対するメタノールまたはエタノールのモル比は、０．５〜１０．０である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記モル比は、０．５〜３．０である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記モル比は、１．０〜２．０である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記モル比は、０．５〜１．５である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
Ｃ２〜Ｃ１８アルキルエステルに対するＣ１〜Ｃ１２アルコールのモル比は、０．５〜１０．０である、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記モル比は、０．５〜３．０である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記モル比は、２．０〜３．０である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記エステル化反応は、０℃〜７０℃の温度で実施される、請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記エステル化反応は、２０℃〜４０℃の温度で実施される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記リパーゼ触媒は、担体上に固定化される、請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記リパーゼは、ＥＰＡの相当するアルコール分解よりもかなり低速度でＤＨＡのアルコール分解を触媒する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記リパーゼ触媒は、リゾムコール・ミエヘイリパーゼ（ＭＭＬ）またはサーモマイセス・ラヌギノサリパーゼ（ＴＬＬ）である、請求項１８に記載の方法。
【公表番号】特表２００６−５０６４８３（Ｐ２００６−５０６４８３Ａ）
【公表日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５１３００（Ｐ２００４−５５１３００）
【出願日】平成１５年１０月３１日（２００３．１０．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＯ２００３／０００３６４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４３８９４
【国際公開日】平成１６年５月２７日（２００４．５．２７）
【出願人】（５０４４５３３６２）プロノヴァ・バイオケア・アーエス (10)
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＮＯＶＡ ＢＩＯＣＡＲＥ ＡＳ
【住所又は居所原語表記】Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ４２０， １３２７ Ｌｙｓａｋｅｒ， Ｎｏｒｗａｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１０月３１日（２００３．１０．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＯ２００３／０００３６４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４３８９４
【国際公開日】平成１６年５月２７日（２００４．５．２７）
【出願人】（５０４４５３３６２）プロノヴァ・バイオケア・アーエス (10)
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＮＯＶＡ ＢＩＯＣＡＲＥ ＡＳ
【住所又は居所原語表記】Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ４２０， １３２７ Ｌｙｓａｋｅｒ， Ｎｏｒｗａｙ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]