リパーゼ阻害活性および／または抗酸化活性を有するエピガロカテキン二量体および三量体
【課題】 膵リパーゼに対して高い阻害活性を示し、食事由来の脂肪吸収を抑制し、および／または肥満の抑制や予防に寄与するリパーゼ活性阻害剤、およびそれを添加した飲食品を提供すること、または、茶由来の、嗜好性の高い、香味を損なうことのないリパーゼ阻害剤を提供すること。また、本発明は、当該リパーゼ阻害剤の製造法も提供する。さらに、本発明は、抗酸化剤も提供する。
【解決手段】 エピガロカテキンの二量体（ウーロンホモビスフラバン類）または三量体を飲食物に添加することにより、食事由来の脂肪吸収を抑制することができ、また、抗酸化作用が得られる。本発明化合物の製造は、エピガロカテキンガレートとホルムアルデヒドを酸の存在下で反応させることにより達成される。
【解決手段】 エピガロカテキンの二量体（ウーロンホモビスフラバン類）または三量体を飲食物に添加することにより、食事由来の脂肪吸収を抑制することができ、また、抗酸化作用が得られる。本発明化合物の製造は、エピガロカテキンガレートとホルムアルデヒドを酸の存在下で反応させることにより達成される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リパーゼ阻害活性を有するエピガロカテキン二量体および三量体、並びに、それを添加した飲食品に関する。また、本発明は、抗酸化剤作用を有するエピガロカテキンガレート二量体および三量体、並びに、それを添加した飲食品にも関する。さらに、本発明は当該エピガロカテキン二量体および三量体の製造方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
リパーゼ阻害剤
近年、日本人の生活様式の欧米化に伴い、高脂肪食の摂取が増加の一途をたどっている。平成１１年国民栄養調査によると、エネルギー摂取量は年々減少しているにも拘らず、その脂質エネルギー比は適正比率である２５％を超え、中性脂肪値やコレステロール値が高い人の割合は６０歳以上で５〜６割に認められたとの報告がある（厚生労働省平成１１年国民栄養調査結果の概要臨床栄養 ２００１、９８（５）５７７−５８８）。
【０００３】
肥満は現代社会における最も重大な疾患の一つであるが、その主たる要因は脂肪の過剰摂取である。また、脂肪の過剰摂取は、肥満のみならず、肥満に起因する糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化等を発症させることが知られている。この肥満に対する治療薬として、国内では、食欲抑制剤のマジンドール（登録商標）が唯一承認されているが、口渇、便秘、胃部不快感、悪心・嘔吐等の副作用が報告されている（臨床評価、１９８５、１３（２）、ｐ．４１９〜４５９；臨床評価、１９８５、１３（２）、ｐ．４６１〜５１５）。また、海外においては、リパーゼ阻害活性により腸管からの脂肪吸収の抑制作用を持つゼニカル（登録商標）が肥満改善薬として市販されているが、やはり、脂肪便、排便数の増加、軟便、下痢、腹痛等の副作用が報告されている（The Lancet, 1998, 352, p.67-172）。
【０００４】
一方、肥満を予防するための他の方法として、食事制限により摂取カロリーを減らすことが有効であることが知られている。しかし、この手段においては厳密な栄養指導と管理が必要とされ、日常生活において実行することは困難である。したがって、安全かつ健康的に食事由来の脂肪の体内吸収を抑制することができれば、肥満及びそれに関連する疾患の治療あるいは健康増進のための現実的で有用な方策となる。
【０００５】
このような背景のもと、安全でかつヒトに対する有効性が証明されている特定保健用食品の開発が注目されている。これまでに、食後の血清中性脂肪値の上昇を抑える特定保健用食品として、膵リパーゼの阻害により脂肪吸収を抑制するグロビン蛋白分解物（J. Nutr. 1988, 128, p.56-60；日本臨床・食糧学会誌、１９９９、５２（２）、ｐ．７１〜７
７；健康・栄養食品研究、２００２、５（３）、ｐ．１３１〜１４４）、トリアシルグリセロールとは異なる消化吸収特性を有するジアシルグリセロール（J. Am. Coll. Nutr. 2000, 19(6), p.789-796；Clin. Chim. Acta. 2001, 11(2), p.109-117）、及び、魚油よ
り精製されたエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などが発売されている。これら特定保健用食品を用いて食事性脂肪の吸収を抑えるためには、食事と共に摂取することが望ましく、その際には飲食物の香味や風味に影響を及ぼすことが予想される。
【０００６】
また、リパーゼの阻害に関して、いくつかのポリフェノールが活性を有することが知られている。例えば、植物樹皮由来のタンニン（特公昭６０−１１９１２）、マメ科植物カワラケツメイに含まれるタンニン類やフラボノイド類およびその配糖体(特開平８−２５
９５５７)、緑茶中の主要な成分エピガロカテキンガレートおよびエピカテキンガレート
を配合した脂質吸収抑制食品（特開平３−２２８６６４）、ピーマン、シメジ、かぼちゃ、まいたけ、ひじき、緑茶、ウーロン茶などの水抽出物からなるリパーゼ阻害剤（特開平３−２１９８７２）、フラボンおよびフラボノール類（特開平７−６１９２７）、ヒドロキシ安息香酸類（没食子酸）（特開平１−１０２０２２）、トリテルペン類化合物およびその誘導体（特開平９−４０６８９）、タマリンドのプロシアニジンを有効成分とする抗肥満剤（特開平９−２９１０３９）などが報告されており、また、ブドウ種子抽出物のリパーゼ阻害作用(Nutrition, 2003, vol. 19, (10), p.876-879)、サラシア由来ポリフェ
ノールによるリパーゼ阻害作用とラットの抗肥満作用（J. Nutr., 2002, 132, p.1819-1824）、ウーロン茶抽出物によるマウスの抗肥満作用(Int. J. Obes., 1999, 23, p.98-105)なども知られている。
【０００７】
一方、ウーロン茶に関して、脂質低下効果を示した報告がある。例えば、市販ウーロン茶を1日１３３０ｍｌずつ６週間飲用させ、血中中性脂肪値の有意な低下が認められたと
の報告（日本栄養・食糧学会誌、１９９１、４４（４）、ｐ．２５１〜２５９）や、単純性肥満症の男女１０２名を対象にウーロン茶（２g×４／日）を６週間連続経口摂取させ
た結果、６７％の被験者に１ｋｇ以上の体重減少が認められ、さらに、血中中性脂肪値が高値を示した被験者においてウーロン茶摂取後に有意な改善効果が認められたとの報告（日本臨床栄養学会雑誌、１９９８、２０（１）、ｐ．８３〜９０）がなされている。
【非特許文献１】厚生労働省平成１１年国民栄養調査結果の概要臨床栄養 ２００１、９８（５）５７７−５８８
【非特許文献２】臨床評価、１９８５、１３（２）、ｐ．４１９〜４５９
【非特許文献３】臨床評価、１９８５、１３（２）、ｐ．４６１〜５１５
【非特許文献４】The Lancet, 1998, 352, p.67-172
【非特許文献５】J. Nutr. 1988, 128, p.56-60
【非特許文献６】日本臨床・食糧学会誌、１９９９、５２（２）、ｐ．７１〜７７
【非特許文献７】健康・栄養食品研究、２００２、５（３）、ｐ．１３１〜１４４
【非特許文献８】J. Am. Coll. Nutr. 2000, 19(6), p.789-796
【非特許文献９】Clin. Chim. Acta. 2001, 11(2), p.109-117
【非特許文献１０】Nutrition, 2003, vol. 19, (10), p.876-879)
【非特許文献１１】J. Nutr., 2002, 132, p.1819-1824
【非特許文献１２】Int. J. Obes., 1999, 23, p.98-105
【非特許文献１３】日本栄養・食糧学会誌、１９９１、４４（４）、ｐ．２５１〜２５９
【非特許文献１４】日本臨床栄養学会雑誌、１９９８、２０（１）、ｐ．８３〜９０
【特許文献１】特公昭６０−１１９１２
【特許文献２】特開平８−２５９５５７
【特許文献３】特開平３−２２８６６４
【特許文献４】特開平３−２１９８７２
【特許文献５】特開平７−６１９２７
【特許文献６】特開平１−１０２０２２
【特許文献７】特開平９−４０６８９
【特許文献８】特開平９−２９１０３９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記に示した既報のリパーゼ阻害剤は、効果が十分なものとはいえない。例えば、ある植物の抽出物で効果があったとしても、その中に含まれる活性成分量を明確にしない限り、天然物が起源であるので、安定的にリパーゼ阻害活性を維持させることは困難である。
【０００９】
また、嗜好性の低い植物由来のリパーゼ阻害剤は、飲食物として利用すると香味に悪影響を及ぼすことが予想される。したがって、嗜好性の高い茶に起源を発するリパーゼ阻害剤は、有効な素材候補となり得るが、嗜好性の高いウーロン茶を飲用して脂質低下を図るとしても、大量に飲用しなければ効果が得られず、日常生活のなかで行うことは現実的でない。単純に濃縮したウーロン茶を提供したとしても、苦味・渋味が強く、カフェイン量も増えてしまうため、やはり、この方法も現実的な方策とはなり得ない。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、膵リパーゼに対して高い阻害活性を示し、食事由来の脂肪吸収を抑制し、および／または肥満の抑制や予防に寄与するリパーゼ活性阻害剤を提供することである。
【００１１】
また、本発明の目的は、ウーロン茶由来の嗜好性の高い、香味を損なうことのないリパーゼ阻害剤を提供することである。
さらに、本発明の目的は、当該リパーゼ阻害剤の製造法を提供することである。
【００１２】
本発明の目的は、本発明のリパーゼ阻害剤を添加した飲食品等を提供することでもある。
本発明のさらに別の目的は、活性酸素に起因する種々の疾患、例えば、高血圧，糖尿病，高脂血症等の生活習慣病、動脈硬化等の心疾患、および、老化や癌等を予防する抗酸化剤抗酸化剤を提供することである。
【００１３】
さらに、本発明の目的は、効果量を的確に飲食品等に添加することができるリパーゼ阻害剤および／または抗酸化剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
エピガロカテキン二量体および三量体
上記課題を解決する手段として、ウーロン茶より、脂肪吸収に必須な膵リパーゼを阻害する成分を見出した。そこに存在する種々のポリフェノールのリパーゼ阻害活性を評価し、以下の構造：
【００１５】
【化１】
【００１６】
（式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立してＨまたはガロイル基である。）を有するエピガロカテキンの二量体に強い阻害活性があることを突き止めた。
本発明の好ましい二量体は、式：
【００１７】
【化２】
【００１８】
により表されるウーロンホモビスフラバン (oolonghomobisflavan) Ａ（１）、ウーロン
ホモビスフラバンＢ（２）、モノデスガロイルウーロンホモビスフラバンＡ（５）およびジデスガロイルウーロンホモビスフラバンＢ（６）である。
【００１９】
本発明によれば、合成された新規エピガロカテキンガレート二量体である、ウーロンホモビスフラバンＣ（３）：
【００２０】
【化３】
【００２１】
も高いリパーゼ阻害活性を有する。
また、本発明によると、エピガロカテキン三量体：
【００２２】
【化４】
【００２３】
（式中、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立してＨまたはガロイル基である。）も、強いリパーゼ阻害活性を有する。
好ましいエピガロカテキン三量体は、式：
【００２４】
【化５】
【００２５】
により表される化合物（４）である。
エピガロカテキン二量体および三量体の製造
本発明のエピガロカテキン二量体の多くは、当業者に周知の方法によって合成または精製・取得することができる。例えば、エピガロカテキン二量体である、ウーロンホモビスフラバンＡ（１）およびＢ（２）は Chem. Pharm. Bull 37(12), 3255-3563(1989) に記
載された方法により合成することができ、モノデスガロイルウーロンホモビスフラバンＡ（５）およびジデスガロイルウーロンホモビスフラバンＢ（６）は、Chem. Pharm. Bull 37(12), 3255-3563(1989) の方法により茶葉から取得することができる。
【００２６】
一方、本発明の三量体は以下の製造方法によって製造される。即ち、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（７）等のフラバン−３−オール類を、メタノール、エタノール等の溶媒、好ましくはメタノール中で、塩酸、硫酸等の酸、好ましくは、０．０１Ｎ塩酸の存在下、ホルムアルデヒドと反応させることを含む方法によって、製造することができる。反応温度は、原料および生成物が安定である限り特に制限されないが、室温で行うことが好ましい。あるいは、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（７）等のフラバン-３-オールをジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解させ、加熱することにより製造することができる。加熱反応条件は、原料および生成物が安定である限り特に限定されないが、好ましくは１５０〜２００℃、より好ましくは、１８０℃で、好ましくは１分から３０分、より好ましくは１５分間行う。反応溶液中のホルムアルデヒドの濃度は、３〜３７ｗ／ｖ％が好ましい。生じた生成物は、必要に応じてエステル化、加水分解等の誘導化を行うことができる。
【００２７】
上記三量体の製造方法は二量体の製造にも適する。例えば、実施例３に記載されるように、新規ホモビスフラバンＣ（３）を含むいくつかの二量体が上記製造方法により製造された。
リパーゼ阻害活性
本発明の化合物は、リパーゼ阻害活性、特に、膵リパーゼ阻害活性を有する。
【００２８】
リパーゼ阻害活性の測定は、背景技術に示した先行出願に記載されているいずれのリパーゼ活性評価法によっても行われることができ、膵リパーゼに対する阻害活性は、例えば、蛍光性の４−メチルウンベリフェロンのオレイン酸エステルを基質として使用し、リパーゼによる反応で生成した４−メチルウンベリフェロンの蛍光を測定することにより実施できる。リパーゼ活性に対して５０％の阻害を与える試料量ＩＣ５０で表すことも、常法により行うことができる。
【００２９】
実施例１に示すとおり、公知のリパーゼ阻害剤であるエピガロカテキン ３−Ｏ−ガレート（７）の膵リパーゼＩＣ５０に対して、本発明化合物は非常に低い値を示した。
従って、本発明のリパーゼ阻害剤は、従来知られている天然物由来のリパーゼ阻害剤よりも少量で食事由来の脂肪の体内吸収を抑制し、血中中性脂肪の上昇を抑制し、および／または肥満を防止することができる。本発明化合物は天然物由来の物質であるため、安全性も高く、日常的におよび／または長期にわたって摂取してその効果を発揮させるために適している。また、ウーロン茶に由来する本発明化合物は、嗜好性の点で優れている。
抗酸化剤活性
さらに、本発明者らは、本発明の二量体および三量体が、スーパーオキシドアニオンラジカルを消去する活性を有することも見出した。
【００３０】
スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２−）は体内で生成される活性酸素の一種であり、生体内で殺菌作用などに利用されるが、それのみにとどまらず生体内で無差別に強い酸化反応を惹起する。この作用は、例えば、細胞膜の不飽和脂肪酸の過酸化を通じて生体の老化、癌化等の疾患を引き起こすと考えられている（例えば、南山堂、「医学大辞典第１８版」、１９９８年１月１６日発行、ｐ．３２９参照）。また、食品中で不飽和脂肪酸の過酸化反応が生じれば食品の劣化につながり、さらに、食品の劣化臭の発生にも関与することとなる。従って、スーパーオキシドアニオンラジカルを消去することができる化合物は、活性酸素に起因する種々の疾患、例えば、高血圧，糖尿病，高脂血症等の生活習慣病、動脈硬化等の心疾患、および、老化や癌等を予防することができる等の有益な特性を有する。
【００３１】
スーパーオキシドアニオンラジカル消去活性は、実施例５に示す方法により測定された
。即ち、キサンチンオキシダーゼによりＯ２−を発生させ、トラップ剤として５，５−ジメチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシドを用い、ＥＳＲにより測定を行った。本発明化合物の存在下または非存在下で測定が行われ、その結果はＯ２−発生量を５０％抑制する試料量ＩＣ５０として表した。
【００３２】
実施例５によると、公知のスーパーオキシドアニオンラジカル消去剤である化合物（７）のＩＣ５０に対して、本発明化合物は非常に低い値を示した。
従って、本発明化合物は、従来の天然物由来スーパーオキシドアニオンラジカル消去剤と比較して少量で、活性酸素に起因する種々の疾患、例えば、高血圧、糖尿病、高脂血症等の生活習慣病、動脈硬化等の心疾患、および、老化や癌等を予防することができる。しかも、本発明化合物は天然物由来であるから、その安全性も高く、長期間にわたり摂取して効果を発揮させることが可能である。
リパーゼ阻害および／または抗酸化剤添加飲食品
本発明のエピガロカテキン二量体および／または三量体を添加して茶ポリフェノールを増強することにより、中性脂肪の低減、脂質過酸化の防止、老化防止、肥満予防等の作用、並びに、活性酸素に起因する種々の疾患、例えば、高血圧，糖尿病，高脂血症等の生活習慣病、動脈硬化等の心疾患、および、老化や癌等を予防する作用を有する飲食品を製造することができる。
【００３３】
本発明のエピガロカテキン化合物を添加する飲料の例は、清涼飲料、茶飲料、液状強壮剤、健康飲料、栄養補給飲料、スポーツドリンク、炭酸飲料等（これらの飲料の濃縮原液及び調製用粉末を含む）であり、食品の例は、ガム、キャンディ、ゼリー、錠菓、健康食品、栄養補給食品、サプリメント等である。
リパーゼ阻害および／または抗酸化剤を含む医薬組成物
本発明のエピガロカテキン二量体および／または三量体を用いることにより、中性脂肪の低減等の作用、並びに、活性酸素に起因する種々の疾患、例えば、高血圧、糖尿病、高脂血症等の生活習慣病、動脈硬化等の心疾患、および、老化や癌等を予防する作用を有する医薬品を製造することができる。
【００３４】
本発明化合物を医薬として用いる場合には、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、注射剤、皮膚用液剤、エマルジョン、軟膏等の形態で提供される。
リパーゼ阻害および／または抗酸化剤添加化粧品
本発明のエピガロカテキン二量体および／または三量体を用いることにより、脂質過酸化の防止、老化防止、美白作用等の作用を有する化粧品を製造することができる。
【００３５】
本発明化合物が添加される化粧品は、例えば、顔用、皮膚用、頭髪用のクリーム、ローション、ゲル、ムース、シャンプー、リンス等である。
本発明のエピガロカテキン化合物は、抽出精製品や合成製品を単独で飲食品、医薬組成物または化粧品に用いることもできるが、本発明の化合物の１つ以上を含む混合物の形態で飲食品に添加することもできる。
【００３６】
したがって、茶葉等の原料からの抽出物に複数の本願エピガロカテキン化合物が含まれていれば、その抽出混合物は、各成分を分離することなく、本願のリパーゼ阻害剤として用いることができる。
［発明の効果］
ウーロン茶のポリフェノール若しくはエピガロカテキン化合物のうち、リパーゼ阻害活性が高い成分を添加することにより、香味を損なうことなく、嗜好性の高くて、かつ肥満予防、健康増進を目的とした飲料が提供できる。
【００３７】
また、本発明化合物および飲食品は、抗酸化活性も有し、脂質の過酸化防止や老化の予
防にも役立つ。
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されないことは言うまでもない。
【実施例１】
【００３８】
リパーゼ阻害活性の測定
リパーゼ活性の測定は、基質として蛍光性の４−メチルウンベリフェロンのオレイン酸エステル（４−ＵＭＯ）を使用し、酵素反応によって生成した４−メチルウンベリフェロンの蛍光を測定することにより実施した。
【００３９】
測定にあたり、緩衝液は、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１．３６ｍＭ ＣａＣｌ２を含む１３ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いた。基質である４−ＵＭＯ（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ ｃｏ．社製）は、０．１ＭのＤＭＳＯ溶液として調製したものを
さらに上記緩衝液で１０００倍希釈して用いた。また、リパーゼについては、ブタ膵リパーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）を上記緩衝液を用いて４００Ｕ／ｍｌ溶液とし、酵素測定に供した。
【００４０】
酵素反応は、２５℃条件下において、９６穴マイクロプレートに５０・撃フ４−ＵＭＯ緩衝液溶液、２５・撃フ蒸留水（あるいは試料水溶液）を添加し混合した後に、２５・撃フリパーゼ緩衝液を添加することにより開始させた。３０分間反応を行った後に、１００・撃フ０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）を添加して反応を停止させ、反応によって生成した４−メチルウンベリフェロンの蛍光（励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍ）を蛍光プレートリーダー（Labsystems社製 Fluoroskan Asent CF）を用い測定した。
【００４１】
被験試料の阻害活性は、対照（蒸留水）の活性に対して５０％阻害を与える試料量ＩＣ５０（・l）として求めた。
【実施例２】
【００４２】
測定サンプル
ウーロンホモビスフラバンＡ（１）、ウーロンホモビスフラバンＢ（２）は論文 Chem.Pharm.Bull 37(12), 3255-3563(1989) に準じて合成した。モノデスガロイルウーロンホ
モビスフラバンＡ（５）およびジデスガロイルウーロンホモビスフラバンＢ（６）は、Chem.Pharm.Bull 37(12), 3255-3563(1989) の方法により茶葉から抽出、精製した。あるいは、ウーロンホモビスフラバンＡ（１）、ウーロンホモビスフラバンＢ（２）からタンナーゼにより加水分解して得ることもできる。新規化合物であるウーロンホモビスフラバンＣ（３）および三量体（４）は実施例３および４の方法で合成して精製した後、機器分析により図１の構造であることを確認した。（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣＧ、化合物７）は、和光純薬工業株式会社より購入した。
【実施例３】
【００４３】
ウーロンホモビスフラバン（ＯＨＢＦ）類の合成および精製
ア．合成：
１００ｍｇの（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（和光純薬工業株式会社）を、０．０１Ｎ ＨＣｌと１８．５％ホルムアルデヒドを含む２ｍｌのメタノ−ルに溶解し、室温で１時間撹拌した。反応終了後、高速液体クロマトグラフィーで精製した。
イ．分取ＨＰＬＣの条件：
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ３０−ＵＧ−５（２ｃｍφ×２５ｃｍ、野村化学株式会社、愛知）
移動相：Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、Ｂ：９０％ＣＨ３ＣＮ、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、６ｍｌ／ｍｉｎ
グラジエントプログラム：Ｂ１０％→４０％（０〜４０ｍｉｎ）、Ｂ４０％ｉｓｏ（４０〜６０ｍｉｎ）
検出：Ａ２８０ｎｍ
上記の条件下で分取ＨＰＬＣを行い、ＯＨＢＦ−Ａ、ＯＨＢＦ−Ｂ、ＯＨＢＦ−Ｃおよび３量体を各々２４．２ｍｇ、１７．２ｍｇ、５．６ｍｇおよび１３．８ｍｇずつ得た。各化合物のＭＳを micromass Q-TOF により測定すると、ポジティブモードで、ＯＨＢＦ
−Ａ、ＯＨＢＦ−Ｂ、ＯＨＢＦ−Ｃおよび三量体は、それぞれ、ｍ／ｚ９２９、９２９、９２９、１３９の［Ｍ＋Ｈ］＋のイオンピークが認められた。ＯＨＢＦ−Ａ、ＯＨＢＦ−Ｂは、Chem.Pharm.Bull 37(12), 3255-3563(1989) のスペクトルデータと一致したため、図１の式１および２の構造であることを確認できた。ＯＨＢＦ−Ｃおよび３量体は、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、１Ｈ｛１３Ｃ｝−ＨＳＱＣ、１Ｈ｛１３Ｃ｝−ＨＭＢＣ、ＴＯＣＳＹ、ＤＱＦ−ＣＯＳＹのＮＭＲ測定をＤＭＸ−７５０スペクトルメーター (BRUKER
BIOSPIN) で行い、図1の式３および４の構造であることが明らかになった。ＯＨＢＦ−
Ｃの１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図２および図３に示し、三量体の１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図４および図５に示した。
【実施例４】
【００４４】
ウーロンホモビスフラバン類およびその３量体のリパーゼ阻害活性
ＯＨＢＦ類の２量体、３量体の６化合物およびエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）のリパーゼ阻害活性を実施例１に従って測定し、その結果を表1に示した。なお、図１に
は評価に供した化合物の化学構造式を記載した。
【００４５】
クロマン環の３位にガロイル基がエステル結合をしているフラバン−３−オールの２量体、例えば、ウーロンホモビスフラバンＡ、Ｂ、Ｃおよび３量体は、ＥＧＣＧと比較して強力なリパーゼ阻害活性を示したので、ＥＧＣＧが重合した２量体および３量体は、リパーゼ阻害剤として有用であることが示唆された。
【００４６】
このうち、特にリパーゼ阻害活性の強いウーロンホモビスフラバンＡ、Ｂはウーロン茶中に存在することが確認されている。
表１．各種ポリフェノールのリパーゼ阻害活性
【００４７】
【表１】
【実施例５】
【００４８】
活性酸素消去活性
活性酸素の一種であるスーパーオキシドアニオンラジカルに対する消去活性を評価した。
方法：
（１）２ｍＭヒポキサンチン溶液（ｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解）、（２）５．５ｍＭジエチレントリアミン五酢酸溶液（ｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解
）を調製後、（１）の溶液５．０ｍｌ、（２）の溶液３．５ｍｌ、およびラボテック社製の５，５−ジメチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシド（ＤＭＰＯ）１．５ｍｌを混合し、試薬１とした。５０μｌの試薬１を１．５ｍｌのマイクロチューブに取り、３７℃で４分間インキュベートした。これに、サンプルのメタノール溶液２０μｌを添加し、さらに０．４ｕｎｉｔ／ｍｌキサンチンオキシダーゼ５０μｌを加えて１０秒間攪拌した。反応液をヘマトクリット管に注入後、ＥＳＲ装置にセットし、キサンチンオキシダーゼを添加して６０秒後に磁場掃引を開始した。ＥＳＲ測定条件は次のとおりとした。Ｐｏｗｅｒ：４ｍＷ、Ｃ．Ｆｉｅｌｄ：３３５．５ｍＴ、ＳｗＷｉｄ（±）：５ｍＴ、ＳｗＴｉｍｅ：１ｍｉｎ、ＭｏｄＷｉｄ：０．１ｍＴ、Ａｍｐ：１６０、ＴｉｍｅＣ：０．１ｓｅｃ、Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：２０℃。
【００４９】
ＤＭＰＯ−ＯＯＨのＥＳＲシグナルのうち最も低磁場側のシグナルの高さの、内部標準Ｍｎ２＋シグナルの高さに対する比（Ｓ／Ｍ）をＯ２−量とし、次式で表すように消去活性を算出した。
Ｏ２−消去活性(%)＝１００−{１００×(サンプル存在下のＳ／Ｍ)／(サンプル非存在下
のＳ／Ｍ)}
結果：
ウーロンホモビスフラバンＡ、Ｂ、Ｃ（二量体）及び三量体のスーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２−）に対する消去作用について、Ｏ２−を５０％消去する濃度（ＩＣ５０）をμＭで算出した。比較対照として、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を用いた。ＥＧＣＧと比較してウーロンホモビスフラバン類（二量体、三量体）はＯ２−消去活性が強いことが判明した。
表２．スーパーオキシドラジカルの消去活性
【００５０】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、リパーゼ阻害活性および抗酸化活性評価サンプルの化学構造式を示す。
【図２】図２は、ウーロンホモビスフラバンＣ（３）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図３】図３は、ウーロンホモビスフラバンＣ（３）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図４】図４は、三量体（４）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図５】図５は、三量体（４）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リパーゼ阻害活性を有するエピガロカテキン二量体および三量体、並びに、それを添加した飲食品に関する。また、本発明は、抗酸化剤作用を有するエピガロカテキンガレート二量体および三量体、並びに、それを添加した飲食品にも関する。さらに、本発明は当該エピガロカテキン二量体および三量体の製造方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
リパーゼ阻害剤
近年、日本人の生活様式の欧米化に伴い、高脂肪食の摂取が増加の一途をたどっている。平成１１年国民栄養調査によると、エネルギー摂取量は年々減少しているにも拘らず、その脂質エネルギー比は適正比率である２５％を超え、中性脂肪値やコレステロール値が高い人の割合は６０歳以上で５〜６割に認められたとの報告がある（厚生労働省平成１１年国民栄養調査結果の概要臨床栄養 ２００１、９８（５）５７７−５８８）。
【０００３】
肥満は現代社会における最も重大な疾患の一つであるが、その主たる要因は脂肪の過剰摂取である。また、脂肪の過剰摂取は、肥満のみならず、肥満に起因する糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化等を発症させることが知られている。この肥満に対する治療薬として、国内では、食欲抑制剤のマジンドール（登録商標）が唯一承認されているが、口渇、便秘、胃部不快感、悪心・嘔吐等の副作用が報告されている（臨床評価、１９８５、１３（２）、ｐ．４１９〜４５９；臨床評価、１９８５、１３（２）、ｐ．４６１〜５１５）。また、海外においては、リパーゼ阻害活性により腸管からの脂肪吸収の抑制作用を持つゼニカル（登録商標）が肥満改善薬として市販されているが、やはり、脂肪便、排便数の増加、軟便、下痢、腹痛等の副作用が報告されている（The Lancet, 1998, 352, p.67-172）。
【０００４】
一方、肥満を予防するための他の方法として、食事制限により摂取カロリーを減らすことが有効であることが知られている。しかし、この手段においては厳密な栄養指導と管理が必要とされ、日常生活において実行することは困難である。したがって、安全かつ健康的に食事由来の脂肪の体内吸収を抑制することができれば、肥満及びそれに関連する疾患の治療あるいは健康増進のための現実的で有用な方策となる。
【０００５】
このような背景のもと、安全でかつヒトに対する有効性が証明されている特定保健用食品の開発が注目されている。これまでに、食後の血清中性脂肪値の上昇を抑える特定保健用食品として、膵リパーゼの阻害により脂肪吸収を抑制するグロビン蛋白分解物（J. Nutr. 1988, 128, p.56-60；日本臨床・食糧学会誌、１９９９、５２（２）、ｐ．７１〜７
７；健康・栄養食品研究、２００２、５（３）、ｐ．１３１〜１４４）、トリアシルグリセロールとは異なる消化吸収特性を有するジアシルグリセロール（J. Am. Coll. Nutr. 2000, 19(6), p.789-796；Clin. Chim. Acta. 2001, 11(2), p.109-117）、及び、魚油よ
り精製されたエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などが発売されている。これら特定保健用食品を用いて食事性脂肪の吸収を抑えるためには、食事と共に摂取することが望ましく、その際には飲食物の香味や風味に影響を及ぼすことが予想される。
【０００６】
また、リパーゼの阻害に関して、いくつかのポリフェノールが活性を有することが知られている。例えば、植物樹皮由来のタンニン（特公昭６０−１１９１２）、マメ科植物カワラケツメイに含まれるタンニン類やフラボノイド類およびその配糖体(特開平８−２５
９５５７)、緑茶中の主要な成分エピガロカテキンガレートおよびエピカテキンガレート
を配合した脂質吸収抑制食品（特開平３−２２８６６４）、ピーマン、シメジ、かぼちゃ、まいたけ、ひじき、緑茶、ウーロン茶などの水抽出物からなるリパーゼ阻害剤（特開平３−２１９８７２）、フラボンおよびフラボノール類（特開平７−６１９２７）、ヒドロキシ安息香酸類（没食子酸）（特開平１−１０２０２２）、トリテルペン類化合物およびその誘導体（特開平９−４０６８９）、タマリンドのプロシアニジンを有効成分とする抗肥満剤（特開平９−２９１０３９）などが報告されており、また、ブドウ種子抽出物のリパーゼ阻害作用(Nutrition, 2003, vol. 19, (10), p.876-879)、サラシア由来ポリフェ
ノールによるリパーゼ阻害作用とラットの抗肥満作用（J. Nutr., 2002, 132, p.1819-1824）、ウーロン茶抽出物によるマウスの抗肥満作用(Int. J. Obes., 1999, 23, p.98-105)なども知られている。
【０００７】
一方、ウーロン茶に関して、脂質低下効果を示した報告がある。例えば、市販ウーロン茶を1日１３３０ｍｌずつ６週間飲用させ、血中中性脂肪値の有意な低下が認められたと
の報告（日本栄養・食糧学会誌、１９９１、４４（４）、ｐ．２５１〜２５９）や、単純性肥満症の男女１０２名を対象にウーロン茶（２g×４／日）を６週間連続経口摂取させ
た結果、６７％の被験者に１ｋｇ以上の体重減少が認められ、さらに、血中中性脂肪値が高値を示した被験者においてウーロン茶摂取後に有意な改善効果が認められたとの報告（日本臨床栄養学会雑誌、１９９８、２０（１）、ｐ．８３〜９０）がなされている。
【非特許文献１】厚生労働省平成１１年国民栄養調査結果の概要臨床栄養 ２００１、９８（５）５７７−５８８
【非特許文献２】臨床評価、１９８５、１３（２）、ｐ．４１９〜４５９
【非特許文献３】臨床評価、１９８５、１３（２）、ｐ．４６１〜５１５
【非特許文献４】The Lancet, 1998, 352, p.67-172
【非特許文献５】J. Nutr. 1988, 128, p.56-60
【非特許文献６】日本臨床・食糧学会誌、１９９９、５２（２）、ｐ．７１〜７７
【非特許文献７】健康・栄養食品研究、２００２、５（３）、ｐ．１３１〜１４４
【非特許文献８】J. Am. Coll. Nutr. 2000, 19(6), p.789-796
【非特許文献９】Clin. Chim. Acta. 2001, 11(2), p.109-117
【非特許文献１０】Nutrition, 2003, vol. 19, (10), p.876-879)
【非特許文献１１】J. Nutr., 2002, 132, p.1819-1824
【非特許文献１２】Int. J. Obes., 1999, 23, p.98-105
【非特許文献１３】日本栄養・食糧学会誌、１９９１、４４（４）、ｐ．２５１〜２５９
【非特許文献１４】日本臨床栄養学会雑誌、１９９８、２０（１）、ｐ．８３〜９０
【特許文献１】特公昭６０−１１９１２
【特許文献２】特開平８−２５９５５７
【特許文献３】特開平３−２２８６６４
【特許文献４】特開平３−２１９８７２
【特許文献５】特開平７−６１９２７
【特許文献６】特開平１−１０２０２２
【特許文献７】特開平９−４０６８９
【特許文献８】特開平９−２９１０３９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記に示した既報のリパーゼ阻害剤は、効果が十分なものとはいえない。例えば、ある植物の抽出物で効果があったとしても、その中に含まれる活性成分量を明確にしない限り、天然物が起源であるので、安定的にリパーゼ阻害活性を維持させることは困難である。
【０００９】
また、嗜好性の低い植物由来のリパーゼ阻害剤は、飲食物として利用すると香味に悪影響を及ぼすことが予想される。したがって、嗜好性の高い茶に起源を発するリパーゼ阻害剤は、有効な素材候補となり得るが、嗜好性の高いウーロン茶を飲用して脂質低下を図るとしても、大量に飲用しなければ効果が得られず、日常生活のなかで行うことは現実的でない。単純に濃縮したウーロン茶を提供したとしても、苦味・渋味が強く、カフェイン量も増えてしまうため、やはり、この方法も現実的な方策とはなり得ない。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、膵リパーゼに対して高い阻害活性を示し、食事由来の脂肪吸収を抑制し、および／または肥満の抑制や予防に寄与するリパーゼ活性阻害剤を提供することである。
【００１１】
また、本発明の目的は、ウーロン茶由来の嗜好性の高い、香味を損なうことのないリパーゼ阻害剤を提供することである。
さらに、本発明の目的は、当該リパーゼ阻害剤の製造法を提供することである。
【００１２】
本発明の目的は、本発明のリパーゼ阻害剤を添加した飲食品等を提供することでもある。
本発明のさらに別の目的は、活性酸素に起因する種々の疾患、例えば、高血圧，糖尿病，高脂血症等の生活習慣病、動脈硬化等の心疾患、および、老化や癌等を予防する抗酸化剤抗酸化剤を提供することである。
【００１３】
さらに、本発明の目的は、効果量を的確に飲食品等に添加することができるリパーゼ阻害剤および／または抗酸化剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
エピガロカテキン二量体および三量体
上記課題を解決する手段として、ウーロン茶より、脂肪吸収に必須な膵リパーゼを阻害する成分を見出した。そこに存在する種々のポリフェノールのリパーゼ阻害活性を評価し、以下の構造：
【００１５】
【化１】
【００１６】
（式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立してＨまたはガロイル基である。）を有するエピガロカテキンの二量体に強い阻害活性があることを突き止めた。
本発明の好ましい二量体は、式：
【００１７】
【化２】
【００１８】
により表されるウーロンホモビスフラバン (oolonghomobisflavan) Ａ（１）、ウーロン
ホモビスフラバンＢ（２）、モノデスガロイルウーロンホモビスフラバンＡ（５）およびジデスガロイルウーロンホモビスフラバンＢ（６）である。
【００１９】
本発明によれば、合成された新規エピガロカテキンガレート二量体である、ウーロンホモビスフラバンＣ（３）：
【００２０】
【化３】
【００２１】
も高いリパーゼ阻害活性を有する。
また、本発明によると、エピガロカテキン三量体：
【００２２】
【化４】
【００２３】
（式中、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立してＨまたはガロイル基である。）も、強いリパーゼ阻害活性を有する。
好ましいエピガロカテキン三量体は、式：
【００２４】
【化５】
【００２５】
により表される化合物（４）である。
エピガロカテキン二量体および三量体の製造
本発明のエピガロカテキン二量体の多くは、当業者に周知の方法によって合成または精製・取得することができる。例えば、エピガロカテキン二量体である、ウーロンホモビスフラバンＡ（１）およびＢ（２）は Chem. Pharm. Bull 37(12), 3255-3563(1989) に記
載された方法により合成することができ、モノデスガロイルウーロンホモビスフラバンＡ（５）およびジデスガロイルウーロンホモビスフラバンＢ（６）は、Chem. Pharm. Bull 37(12), 3255-3563(1989) の方法により茶葉から取得することができる。
【００２６】
一方、本発明の三量体は以下の製造方法によって製造される。即ち、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（７）等のフラバン−３−オール類を、メタノール、エタノール等の溶媒、好ましくはメタノール中で、塩酸、硫酸等の酸、好ましくは、０．０１Ｎ塩酸の存在下、ホルムアルデヒドと反応させることを含む方法によって、製造することができる。反応温度は、原料および生成物が安定である限り特に制限されないが、室温で行うことが好ましい。あるいは、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（７）等のフラバン-３-オールをジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解させ、加熱することにより製造することができる。加熱反応条件は、原料および生成物が安定である限り特に限定されないが、好ましくは１５０〜２００℃、より好ましくは、１８０℃で、好ましくは１分から３０分、より好ましくは１５分間行う。反応溶液中のホルムアルデヒドの濃度は、３〜３７ｗ／ｖ％が好ましい。生じた生成物は、必要に応じてエステル化、加水分解等の誘導化を行うことができる。
【００２７】
上記三量体の製造方法は二量体の製造にも適する。例えば、実施例３に記載されるように、新規ホモビスフラバンＣ（３）を含むいくつかの二量体が上記製造方法により製造された。
リパーゼ阻害活性
本発明の化合物は、リパーゼ阻害活性、特に、膵リパーゼ阻害活性を有する。
【００２８】
リパーゼ阻害活性の測定は、背景技術に示した先行出願に記載されているいずれのリパーゼ活性評価法によっても行われることができ、膵リパーゼに対する阻害活性は、例えば、蛍光性の４−メチルウンベリフェロンのオレイン酸エステルを基質として使用し、リパーゼによる反応で生成した４−メチルウンベリフェロンの蛍光を測定することにより実施できる。リパーゼ活性に対して５０％の阻害を与える試料量ＩＣ５０で表すことも、常法により行うことができる。
【００２９】
実施例１に示すとおり、公知のリパーゼ阻害剤であるエピガロカテキン ３−Ｏ−ガレート（７）の膵リパーゼＩＣ５０に対して、本発明化合物は非常に低い値を示した。
従って、本発明のリパーゼ阻害剤は、従来知られている天然物由来のリパーゼ阻害剤よりも少量で食事由来の脂肪の体内吸収を抑制し、血中中性脂肪の上昇を抑制し、および／または肥満を防止することができる。本発明化合物は天然物由来の物質であるため、安全性も高く、日常的におよび／または長期にわたって摂取してその効果を発揮させるために適している。また、ウーロン茶に由来する本発明化合物は、嗜好性の点で優れている。
抗酸化剤活性
さらに、本発明者らは、本発明の二量体および三量体が、スーパーオキシドアニオンラジカルを消去する活性を有することも見出した。
【００３０】
スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２−）は体内で生成される活性酸素の一種であり、生体内で殺菌作用などに利用されるが、それのみにとどまらず生体内で無差別に強い酸化反応を惹起する。この作用は、例えば、細胞膜の不飽和脂肪酸の過酸化を通じて生体の老化、癌化等の疾患を引き起こすと考えられている（例えば、南山堂、「医学大辞典第１８版」、１９９８年１月１６日発行、ｐ．３２９参照）。また、食品中で不飽和脂肪酸の過酸化反応が生じれば食品の劣化につながり、さらに、食品の劣化臭の発生にも関与することとなる。従って、スーパーオキシドアニオンラジカルを消去することができる化合物は、活性酸素に起因する種々の疾患、例えば、高血圧，糖尿病，高脂血症等の生活習慣病、動脈硬化等の心疾患、および、老化や癌等を予防することができる等の有益な特性を有する。
【００３１】
スーパーオキシドアニオンラジカル消去活性は、実施例５に示す方法により測定された
。即ち、キサンチンオキシダーゼによりＯ２−を発生させ、トラップ剤として５，５−ジメチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシドを用い、ＥＳＲにより測定を行った。本発明化合物の存在下または非存在下で測定が行われ、その結果はＯ２−発生量を５０％抑制する試料量ＩＣ５０として表した。
【００３２】
実施例５によると、公知のスーパーオキシドアニオンラジカル消去剤である化合物（７）のＩＣ５０に対して、本発明化合物は非常に低い値を示した。
従って、本発明化合物は、従来の天然物由来スーパーオキシドアニオンラジカル消去剤と比較して少量で、活性酸素に起因する種々の疾患、例えば、高血圧、糖尿病、高脂血症等の生活習慣病、動脈硬化等の心疾患、および、老化や癌等を予防することができる。しかも、本発明化合物は天然物由来であるから、その安全性も高く、長期間にわたり摂取して効果を発揮させることが可能である。
リパーゼ阻害および／または抗酸化剤添加飲食品
本発明のエピガロカテキン二量体および／または三量体を添加して茶ポリフェノールを増強することにより、中性脂肪の低減、脂質過酸化の防止、老化防止、肥満予防等の作用、並びに、活性酸素に起因する種々の疾患、例えば、高血圧，糖尿病，高脂血症等の生活習慣病、動脈硬化等の心疾患、および、老化や癌等を予防する作用を有する飲食品を製造することができる。
【００３３】
本発明のエピガロカテキン化合物を添加する飲料の例は、清涼飲料、茶飲料、液状強壮剤、健康飲料、栄養補給飲料、スポーツドリンク、炭酸飲料等（これらの飲料の濃縮原液及び調製用粉末を含む）であり、食品の例は、ガム、キャンディ、ゼリー、錠菓、健康食品、栄養補給食品、サプリメント等である。
リパーゼ阻害および／または抗酸化剤を含む医薬組成物
本発明のエピガロカテキン二量体および／または三量体を用いることにより、中性脂肪の低減等の作用、並びに、活性酸素に起因する種々の疾患、例えば、高血圧、糖尿病、高脂血症等の生活習慣病、動脈硬化等の心疾患、および、老化や癌等を予防する作用を有する医薬品を製造することができる。
【００３４】
本発明化合物を医薬として用いる場合には、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、注射剤、皮膚用液剤、エマルジョン、軟膏等の形態で提供される。
リパーゼ阻害および／または抗酸化剤添加化粧品
本発明のエピガロカテキン二量体および／または三量体を用いることにより、脂質過酸化の防止、老化防止、美白作用等の作用を有する化粧品を製造することができる。
【００３５】
本発明化合物が添加される化粧品は、例えば、顔用、皮膚用、頭髪用のクリーム、ローション、ゲル、ムース、シャンプー、リンス等である。
本発明のエピガロカテキン化合物は、抽出精製品や合成製品を単独で飲食品、医薬組成物または化粧品に用いることもできるが、本発明の化合物の１つ以上を含む混合物の形態で飲食品に添加することもできる。
【００３６】
したがって、茶葉等の原料からの抽出物に複数の本願エピガロカテキン化合物が含まれていれば、その抽出混合物は、各成分を分離することなく、本願のリパーゼ阻害剤として用いることができる。
［発明の効果］
ウーロン茶のポリフェノール若しくはエピガロカテキン化合物のうち、リパーゼ阻害活性が高い成分を添加することにより、香味を損なうことなく、嗜好性の高くて、かつ肥満予防、健康増進を目的とした飲料が提供できる。
【００３７】
また、本発明化合物および飲食品は、抗酸化活性も有し、脂質の過酸化防止や老化の予
防にも役立つ。
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されないことは言うまでもない。
【実施例１】
【００３８】
リパーゼ阻害活性の測定
リパーゼ活性の測定は、基質として蛍光性の４−メチルウンベリフェロンのオレイン酸エステル（４−ＵＭＯ）を使用し、酵素反応によって生成した４−メチルウンベリフェロンの蛍光を測定することにより実施した。
【００３９】
測定にあたり、緩衝液は、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１．３６ｍＭ ＣａＣｌ２を含む１３ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いた。基質である４−ＵＭＯ（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ ｃｏ．社製）は、０．１ＭのＤＭＳＯ溶液として調製したものを
さらに上記緩衝液で１０００倍希釈して用いた。また、リパーゼについては、ブタ膵リパーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）を上記緩衝液を用いて４００Ｕ／ｍｌ溶液とし、酵素測定に供した。
【００４０】
酵素反応は、２５℃条件下において、９６穴マイクロプレートに５０・撃フ４−ＵＭＯ緩衝液溶液、２５・撃フ蒸留水（あるいは試料水溶液）を添加し混合した後に、２５・撃フリパーゼ緩衝液を添加することにより開始させた。３０分間反応を行った後に、１００・撃フ０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）を添加して反応を停止させ、反応によって生成した４−メチルウンベリフェロンの蛍光（励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍ）を蛍光プレートリーダー（Labsystems社製 Fluoroskan Asent CF）を用い測定した。
【００４１】
被験試料の阻害活性は、対照（蒸留水）の活性に対して５０％阻害を与える試料量ＩＣ５０（・l）として求めた。
【実施例２】
【００４２】
測定サンプル
ウーロンホモビスフラバンＡ（１）、ウーロンホモビスフラバンＢ（２）は論文 Chem.Pharm.Bull 37(12), 3255-3563(1989) に準じて合成した。モノデスガロイルウーロンホ
モビスフラバンＡ（５）およびジデスガロイルウーロンホモビスフラバンＢ（６）は、Chem.Pharm.Bull 37(12), 3255-3563(1989) の方法により茶葉から抽出、精製した。あるいは、ウーロンホモビスフラバンＡ（１）、ウーロンホモビスフラバンＢ（２）からタンナーゼにより加水分解して得ることもできる。新規化合物であるウーロンホモビスフラバンＣ（３）および三量体（４）は実施例３および４の方法で合成して精製した後、機器分析により図１の構造であることを確認した。（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣＧ、化合物７）は、和光純薬工業株式会社より購入した。
【実施例３】
【００４３】
ウーロンホモビスフラバン（ＯＨＢＦ）類の合成および精製
ア．合成：
１００ｍｇの（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（和光純薬工業株式会社）を、０．０１Ｎ ＨＣｌと１８．５％ホルムアルデヒドを含む２ｍｌのメタノ−ルに溶解し、室温で１時間撹拌した。反応終了後、高速液体クロマトグラフィーで精製した。
イ．分取ＨＰＬＣの条件：
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ３０−ＵＧ−５（２ｃｍφ×２５ｃｍ、野村化学株式会社、愛知）
移動相：Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、Ｂ：９０％ＣＨ３ＣＮ、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、６ｍｌ／ｍｉｎ
グラジエントプログラム：Ｂ１０％→４０％（０〜４０ｍｉｎ）、Ｂ４０％ｉｓｏ（４０〜６０ｍｉｎ）
検出：Ａ２８０ｎｍ
上記の条件下で分取ＨＰＬＣを行い、ＯＨＢＦ−Ａ、ＯＨＢＦ−Ｂ、ＯＨＢＦ−Ｃおよび３量体を各々２４．２ｍｇ、１７．２ｍｇ、５．６ｍｇおよび１３．８ｍｇずつ得た。各化合物のＭＳを micromass Q-TOF により測定すると、ポジティブモードで、ＯＨＢＦ
−Ａ、ＯＨＢＦ−Ｂ、ＯＨＢＦ−Ｃおよび三量体は、それぞれ、ｍ／ｚ９２９、９２９、９２９、１３９の［Ｍ＋Ｈ］＋のイオンピークが認められた。ＯＨＢＦ−Ａ、ＯＨＢＦ−Ｂは、Chem.Pharm.Bull 37(12), 3255-3563(1989) のスペクトルデータと一致したため、図１の式１および２の構造であることを確認できた。ＯＨＢＦ−Ｃおよび３量体は、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、１Ｈ｛１３Ｃ｝−ＨＳＱＣ、１Ｈ｛１３Ｃ｝−ＨＭＢＣ、ＴＯＣＳＹ、ＤＱＦ−ＣＯＳＹのＮＭＲ測定をＤＭＸ−７５０スペクトルメーター (BRUKER
BIOSPIN) で行い、図1の式３および４の構造であることが明らかになった。ＯＨＢＦ−
Ｃの１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図２および図３に示し、三量体の１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図４および図５に示した。
【実施例４】
【００４４】
ウーロンホモビスフラバン類およびその３量体のリパーゼ阻害活性
ＯＨＢＦ類の２量体、３量体の６化合物およびエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）のリパーゼ阻害活性を実施例１に従って測定し、その結果を表1に示した。なお、図１に
は評価に供した化合物の化学構造式を記載した。
【００４５】
クロマン環の３位にガロイル基がエステル結合をしているフラバン−３−オールの２量体、例えば、ウーロンホモビスフラバンＡ、Ｂ、Ｃおよび３量体は、ＥＧＣＧと比較して強力なリパーゼ阻害活性を示したので、ＥＧＣＧが重合した２量体および３量体は、リパーゼ阻害剤として有用であることが示唆された。
【００４６】
このうち、特にリパーゼ阻害活性の強いウーロンホモビスフラバンＡ、Ｂはウーロン茶中に存在することが確認されている。
表１．各種ポリフェノールのリパーゼ阻害活性
【００４７】
【表１】
【実施例５】
【００４８】
活性酸素消去活性
活性酸素の一種であるスーパーオキシドアニオンラジカルに対する消去活性を評価した。
方法：
（１）２ｍＭヒポキサンチン溶液（ｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解）、（２）５．５ｍＭジエチレントリアミン五酢酸溶液（ｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解
）を調製後、（１）の溶液５．０ｍｌ、（２）の溶液３．５ｍｌ、およびラボテック社製の５，５−ジメチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシド（ＤＭＰＯ）１．５ｍｌを混合し、試薬１とした。５０μｌの試薬１を１．５ｍｌのマイクロチューブに取り、３７℃で４分間インキュベートした。これに、サンプルのメタノール溶液２０μｌを添加し、さらに０．４ｕｎｉｔ／ｍｌキサンチンオキシダーゼ５０μｌを加えて１０秒間攪拌した。反応液をヘマトクリット管に注入後、ＥＳＲ装置にセットし、キサンチンオキシダーゼを添加して６０秒後に磁場掃引を開始した。ＥＳＲ測定条件は次のとおりとした。Ｐｏｗｅｒ：４ｍＷ、Ｃ．Ｆｉｅｌｄ：３３５．５ｍＴ、ＳｗＷｉｄ（±）：５ｍＴ、ＳｗＴｉｍｅ：１ｍｉｎ、ＭｏｄＷｉｄ：０．１ｍＴ、Ａｍｐ：１６０、ＴｉｍｅＣ：０．１ｓｅｃ、Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：２０℃。
【００４９】
ＤＭＰＯ−ＯＯＨのＥＳＲシグナルのうち最も低磁場側のシグナルの高さの、内部標準Ｍｎ２＋シグナルの高さに対する比（Ｓ／Ｍ）をＯ２−量とし、次式で表すように消去活性を算出した。
Ｏ２−消去活性(%)＝１００−{１００×(サンプル存在下のＳ／Ｍ)／(サンプル非存在下
のＳ／Ｍ)}
結果：
ウーロンホモビスフラバンＡ、Ｂ、Ｃ（二量体）及び三量体のスーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２−）に対する消去作用について、Ｏ２−を５０％消去する濃度（ＩＣ５０）をμＭで算出した。比較対照として、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を用いた。ＥＧＣＧと比較してウーロンホモビスフラバン類（二量体、三量体）はＯ２−消去活性が強いことが判明した。
表２．スーパーオキシドラジカルの消去活性
【００５０】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、リパーゼ阻害活性および抗酸化活性評価サンプルの化学構造式を示す。
【図２】図２は、ウーロンホモビスフラバンＣ（３）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図３】図３は、ウーロンホモビスフラバンＣ（３）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図４】図４は、三量体（４）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図５】図５は、三量体（４）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
のエピガロカテキンガレート三量体。
【請求項２】
請求項１に記載の新規三量体を添加した飲食品。
【請求項３】
請求項１に記載の新規三量体を含む化粧品。
【請求項４】
請求項１に記載の新規三量体を含む医薬組成物。
【請求項５】
酸の存在下でフラバン−３−オール類とホルムアルデヒドとを反応させることを特徴とする、請求項１記載のエピガロカテキンガレート三量体の製造方法。
【請求項１】
式：
【化１】
のエピガロカテキンガレート三量体。
【請求項２】
請求項１に記載の新規三量体を添加した飲食品。
【請求項３】
請求項１に記載の新規三量体を含む化粧品。
【請求項４】
請求項１に記載の新規三量体を含む医薬組成物。
【請求項５】
酸の存在下でフラバン−３−オール類とホルムアルデヒドとを反応させることを特徴とする、請求項１記載のエピガロカテキンガレート三量体の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−２８０７１６（Ｐ２０１０−２８０７１６Ａ）
【公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１９８０３３（Ｐ２０１０−１９８０３３）
【出願日】平成２２年９月３日（２０１０．９．３）
【分割の表示】特願２００４−１５８４６３（Ｐ２００４−１５８４６３）の分割
【原出願日】平成１６年５月２７日（２００４．５．２７）
【出願人】（３０９００７９１１）サントリーホールディングス株式会社 (307)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月３日（２０１０．９．３）
【分割の表示】特願２００４−１５８４６３（Ｐ２００４−１５８４６３）の分割
【原出願日】平成１６年５月２７日（２００４．５．２７）
【出願人】（３０９００７９１１）サントリーホールディングス株式会社 (307)
【Ｆターム（参考）】
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