レベチラセタムを検出するための誘導体、試薬、およびイムノアッセイ
レベチラセタム（ＬＥＶ）誘導体、ＬＥＶ誘導体を合成するための方法、およびＬＥＶに関する免疫診断アッセイ。本明細書記載の合成法には、選択されたＬＥＶ誘導体を高収量で産生するためのキラル選択性の液相合成工程が含まれる。ＬＥＶ誘導体には、作用基、例えば：抗ＬＥＶ抗体を調製するのに使用可能な免疫原性部分；ＬＥＶに関する免疫診断アッセイで使用可能な抗原性部分；または免疫診断アッセイで使用可能なトレーサー部分が含まれる。さらに、抗ＬＥＶ抗体に関してＬＥＶと競合させるため、免疫診断アッセイにおいて、ＬＥＶ誘導体を用いてもよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
[0001]本出願は、２０１０年６月９日に出願された、「レベチラセタムを検出するための誘導体、試薬、およびイムノアッセイ」と題される米国特許出願第１２／７９７，３４８号に優先権を主張する。本出願はまた、Ｏｕｙａｎｇらに対する、２００９年６月１１日に出願された、「レベチラセタムを検出するための誘導体、試薬、およびイムノアッセイ」と題される米国仮特許出願第６１／２６８，３３９号に優先権の利益を主張し、該出願はその全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
[0002]レベチラセタム（ＬＥＶ）（（−）−（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジンアセトアミド、ケプラ（登録商標））は、ファースト・イン・クラスの抗癲癇薬剤（ＡＥＤ）として、２００６年、ＦＤＡによって認可された。該化合物は、商標名ケプラ（登録商標）の下に、ＵＣＢ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．によって市販されている。
【０００３】
[0003]レベチラセタムは、４歳およびそれより年上の成人および小児における部分癲癇発作（ｐａｒｔｉａｌ ｏｎｓｅｔ ｓｅｉｚｕｒｅｓ）、１２歳およびそれより年上の成人および青年におけるミオクローヌス発作、ならびに６歳およびそれより年上の成人および小児における原発性全身性強直間代発作の治療において補助療法として指示されている。ＬＥＶは、脳において、シナプス小胞タンパク質ＳＶ２Ａに結合することによって、シナプス神経伝達物質放出を調節することによって作用する（１）。ＬＥＶに関する名目上の（ｎｏｍｉｎａｌ）療法範囲は、６〜２０μｇ／ｍＬである（２）。ＬＥＶの療法薬剤監視（ＴＤＭ）は、個体の最適ＬＥＶレベルを確立し（３）、そしてノンコンプライアンスを検出するために重要である。
【０００４】
[0004]ＬＥＶに関する最適トラフ血清／血漿濃度範囲は、１０〜６０ｍｇ／Ｌである（４〜６）。ＬＥＶは、主に腎臓を通じて排出され、投与された用量のおよそ６４％が変化せずに尿中に排出される。該薬剤は、最小限の肝臓代謝を経るが、細胞質アミダーゼによるアセトアミド機能の加水分解が起こり、カルボン酸代謝物、２−ピロリドン−Ｎ−酪酸が生じる。酸代謝物は尿中に排出され、そして投与された用量のおよそ２７％を占める。２−オキソピロリジン環の３位および４位の酸化もまた、肝臓代謝によって生じて、用量の約３％を占める少量の代謝物を形成する。さらに、ＬＥＶおよび２−ピロリドン−Ｎ−酪酸は２−オキソピロリジン環の５位で酸化され、そして次いで加水分解されて、開環を生じる可能性もある。ＬＥＶ薬物動態学においては、顕著な個体間変動がある。したがって、ＬＥＶの血清／血漿濃度の療法的監視が推奨される。
【０００５】
[0005]現在まで、ＬＥＶの循環レベルを測定するために、液体またはガスクロマトグラフィー技術が使用されてきた。しかし、こうした方法は、試料調製時間が長く、アッセイ時間が長く、コストが高く、スループットが低く、そして労働集約的な方法であることを含む要因のため、定期的なＴＤＭには非実用的である。したがって、有効なＴＤＭのためには、ＬＥＶ血漿レベルを測定するための迅速で経済的な分析法が必要である。
【０００６】
[0006]イムノアッセイは、一般的に、試料中に存在する抗原レベルを定量化するための、迅速で、安価であり、そして高感度の手段と見なされている。イムノアッセイ技術は、生物学的試料中の多様な薬剤を検出するために開発されてきており、そしてこうした商業的分析適用によく適している。したがって、イムノアッセイを用いて、患者の血液、血清、尿、唾液または他の体液中の薬剤および／または薬剤代謝物の量を迅速に評価することも可能である。イムノアッセイの例には、限定されるわけではないが、均一（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）微粒子イムノアッセイ（例えば免疫比濁法）または定量的微小球体系（ＱＭＳ（登録商標））、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、クローン化酵素ドナーイムノアッセイ（ＣＥＤＩＡ）、化学発光微粒子イムノアッセイ（ＣＭＩＡ）等が含まれうる。患者血液、血清、血漿、および／または他の生物学的液体または試料におけるＬＥＶを検出するために設定されたイムノアッセイがあることが好適であろう。さらに、こうしたイムノアッセイで使用するためのＬＥＶ誘導体、および／または抗レベチラセタム抗体を産生する際に使用するための、ＬＥＶに基づく免疫原があることが好適であろう。
【０００７】
[0007]典型的には、ターゲット抗原に特異的な少なくとも１つの抗体が、有用なイムノアッセイの基礎を形成するため、ＴＤＭは、大部分の療法薬剤が、元来、免疫原性ではなく、そしてしたがってマウス、ウサギ、ヤギ、ウマおよび他の哺乳動物などの、抗体産生に一般的に用いられる動物内に注射された際、免疫反応を誘発しない点で困難を提示する。また、ターゲット薬剤の活性型は、小用量であってさえ、レシピエント動物に対して有害でありうる。したがって、免疫原として作用する、療法薬剤の誘導体を作製しなければならない。しかし、免疫原に反応して産生される抗体は、患者試料中に存在すると予期される薬剤と交差反応可能でなければならず、そしてさらにより好ましくは、抗体は、試料中にも存在しうる、薬剤の不活性代謝性誘導体とは、あるとしてもわずかに測定可能な交差反応しか有してはならない。
【０００８】
[0008]イムノアッセイは、典型的には、抗体産生に必要な免疫原に加えて、他のタイプの誘導体を使用する。限定されない例として、ターゲット抗原の標識誘導体を用いて、ターゲット抗原および標識誘導体の両方を認識可能な抗体上の結合部位に関して、ターゲット抗原と競合させてもよい。競合イムノアッセイは、現在の当該技術分野において周知である。他の誘導体は、イムノアッセイを較正するための対照または標準として働きうる。
【０００９】
[0009]レベチラセタム、その代謝物および構造的に類似な薬剤を以下に示す：
【００１０】
【化１】
【００１１】
[0010]Ｋｅｎｄａらは、ＬＥＶよりもレベチラセタム結合部位に対してより高い結合アフィニティを持つ誘導体を同定する試みの中で、アルデヒド酸エステルの還元アミン化による固相合成を通じて産生される、５−アミノ−２−（２−オキソピロリジン−１−イル）ペンタン酸アミド（Ｋｅｎｄａらによって「類似体５６」とも称される）を含むＬＥＶ誘導体を記載する。記載されるように、反応は１００グラムのｒｉｎｋアミド樹脂および６６ｍｇの４−オキソ酪酸４−メトキシベンジルエステルを用いて、ＨＰＬＣによって測定した際、６５％の純度の類似体５６がわずか２ｍｇしか得られず、反応性収量は約０．１％であった。
【００１２】
【化２】
【００１３】
[0011]類似体５６は、多くの動物において、抗体産生を誘導し、そして抗体産生、結合特性および他の特性を監視するために、イムノアッセイで使用するためのＬＥＶ誘導体として有望でありうるが、免疫原性誘導体２ｍｇをかなり超える量が必要である。同様に、対照または標準として用いられる誘導体、あるいはターゲット抗原と競合する標識誘導体を含むイムノアッセイの商業化には、商業的要求を満たすのに十分な量の誘導体（単数または複数）が必要である。したがって、薬剤発見目的には、Ｋｅｎｄａらによって解説される固相合成法が適している可能性もあるが、該方法は、ＬＥＶに関するイムノアッセイを開発する目的のための誘導体を産生するには実用的な価値を持たない。
【発明の概要】
【００１４】
[0012]一般的に、本開示は、レベチラセタム（ＬＥＶ）誘導体、ＬＥＶ誘導体を合成するための方法、およびＬＥＶに関する免疫診断アッセイ（ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｓｓａｙ）に関する。ＬＥＶ誘導体には、作用基（ｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐ）、例えば：抗ＬＥＶ抗体を調製するのに使用可能な免疫原性部分；ＬＥＶに関する免疫診断アッセイで使用可能な抗原性部分；または免疫診断アッセイで使用可能なトレーサー部分が含まれてもよい。さらに、抗ＬＥＶ抗体に関してＬＥＶと競合させるため、免疫診断アッセイにおいて、ＬＥＶ誘導体を用いてもよい。本明細書記載の合成法には、十分な特異性および感度で、ＬＥＶおよびＬＥＶ誘導体に結合可能な抗体の発展に成功する免疫プログラムに必要とされる、多量のＬＥＶ誘導体を産生するのに適したキラル選択性の液相合成工程が含まれる。
【００１５】
[0013]１つの態様において、式１または式２のＬＥＶ誘導体を含む化学組成物を開示する。
【００１６】
【化３】
【００１７】
[0014]式２のｎ、ならびに式１および２のＬ、Ｘ、およびＹは、以下のように定義される：
ａ）ｎは、０〜８の値を持つ整数であり；
ｂ）Ｌは、ＣＨ２、ＣＯ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＣＯＮＨ、ＮＨ、Ｏ、またはＳ、およびその組み合わせからなる群の１つであり；
ｃ）Ｘは、末端基、芳香族基、アリール基、あるいは１〜１０の炭素原子および／またはヘテロ鎖原子を有する飽和、不飽和、置換、非置換、直鎖、または分枝鎖脂肪族基であって、ヘテロ鎖原子が、酸素、窒素、イオウ、またはリン、およびその組み合わせからなる群より選択される、前記脂肪族基であり；そして
ｄ）Ｙは場合により、そして存在する場合、アルコールアミン、アミド、カルボン酸、アルデヒド、エステル、イミノエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、無水物、チオール、チオールアセトン（ｔｈｉｏｌａｃｅｔｏｎｅ）、ジアゾニウム、ＮＨＳ、ＣＯ−ＮＨＳ、Ｏ−ＮＨＳ、マレイミドからなる群より選択される官能基の１つであり；または
ｅ）ＹはＹ１−Ｚである、式中、Ｙ１は、ＣＯＯ、ＣＯ、Ｏ、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、またはＮＨからなる群より選択され、そしてＺは作用基である。
【００１８】
[0015]本明細書に提示する式２の定義には、多くのありうる化合物が含まれる。しかし、以下に示す、５−アミノ−２−（２−オキソピロリジン−１−イル）ペンタン酸アミド（式３）は、本明細書に請求する式２の化合物クラスから特に排除される。
【００１９】
【化４】
【００２０】
[0016]方法の１つの態様において、Ｚの作用基は、検出可能標識、抗原性キャリアー、カップリング剤、末端基、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、多糖、核酸、ポリヌクレオチド、タイコ酸、放射性同位体、酵素、酵素断片、酵素ドナー断片、酵素アクセプター断片、酵素基質、酵素阻害剤、補酵素、蛍光部分、燐光部分、反ストークス上方制御部分、化学発光部分、発光部分、色素、増感剤、粒子、微粒子、磁気粒子、固体支持体、リポソーム、リガンド、受容体、ハプテン放射性同位体、およびその組み合わせからなる群より選択される。
【００２１】
[0017]式１または式２のＬＥＶ誘導体を含む、特定の化学組成物例において、ｎは、０、１、２、または４の値を持つ整数であり、Ｌは、ＮＨＣＯＯ、ＮＨ、ＮＨＣＯ、ＣＨ２、ＣＯ、Ｓ、またはＣＯＮＨからなる群の１つであり、Ｘは、Ｈ、ＯＣＨ２−Ｐｈ、ＮＨ、Ｏ、Ｏ−ＮＨＳ、ＣＨ２、Ｈ、マレイミド−Ｐｈ、ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨからなる群の１つであり、そしてＹは場合により、そして存在する場合、Ｈであり、またはＹは場合により、そして存在する場合、Ｙ１−Ｚである、式中、Ｙ１がＣＯであり、そしてＺが、−ＮＨＳ、−ＢＳＡ、または−ＫＬＨである。
【００２２】
[0018]特定の例において、式２のｎ、Ｌ、Ｘ、およびＹまたはＹ１−Ｚは：
ａ）ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯＯ、およびＸ＝ｔ−ブチル；
ｂ）ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨ、およびＸ＝Ｈ；
ｃ）ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯ、およびＸ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ；
ｄ）ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯ、Ｘ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＮＨＳ；
ｅ）ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯ、Ｘ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＫＬＨ；
ｆ）ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯ、Ｘ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；
ｇ）ｎ＝４、Ｌ＝ＣＨ２、Ｘ＝ＮＨ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；
ｈ）ｎ＝２、Ｌ＝ＣＯ、およびＸ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ；
ｉ）ｎ＝２、Ｌ＝ＣＯ、Ｘ＝Ｏ、およびＹ＝Ｈ；
ｊ）ｎ＝２、Ｌ＝ＣＯ、およびＸ＝Ｏ−ＮＨＳ；
ｋ）ｎ＝０、Ｌ＝ＣＨ２、Ｘ＝ＣＨ２、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＫＬＨ；
ｌ）ｎ＝０、Ｌ＝ＣＨ２、Ｘ＝ＣＨ２、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；
ｍ）ｎ＝１、Ｌ＝Ｓ、およびＸ＝ＣＨ２−Ｐｈ；
ｎ）ｎ＝１、Ｌ＝Ｓ、およびＸ＝Ｈ；
ｏ）ｎ＝１、Ｌ＝Ｓ、Ｘ＝マレイミド−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；または
ｐ）ｎ＝１、Ｌ＝Ｓ、Ｘ＝マレイミド−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＫＬＨ；
からなる群より選択される。
【００２３】
[0019]別の特定の実施例において、式１のＬ、Ｘ、Ｙ、およびＹ１−Ｚは：
ａ）Ｌ＝ＣＯＮＨ、Ｘ＝ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ、およびＹ＝Ｈ；
ｂ）Ｌ＝ＣＯＮＨ、Ｘ＝ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＫＬＨ；または
ｃ）Ｌ＝ＣＯＮＨ、Ｘ＝ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；
からなる群より選択される。
【００２４】
[0020]別の態様において、試料中のＬＥＶの存在を検出するための免疫診断アッセイにおいて使用するためのキットを開示する。該キットには、式１または式２：
【００２５】
【化５】
【００２６】
の一方の化学構造を有するＬＥＶ誘導体；および
少なくとも１つの結合ドメインを有する抗ＬＥＶ抗体であって、ＬＥＶおよび／またはＬＥＶ誘導体に結合可能な部分を有する、ここで抗体およびＬＥＶ誘導体間の相互作用は、ＬＥＶに対する抗体のアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つの少なくとも５０％である、前記抗ＬＥＶ抗体
が含まれる。ｎ、Ｌ、Ｘ、およびＹの定義は、化学組成物に関して上に定義したものと同じである。
【００２７】
[0021]１つの態様において、ＬＥＶ誘導体または抗ＬＥＶ抗体は、粒子、磁気粒子、微粒子、微小球体、支持体、酵素ドナー、または酵素アクセプターの１つとカップリングしている。
【００２８】
[0022]１つの態様において、キットにはさらに、以下：
ａ）ＬＥＶのストック組成物；
ｂ）異なる濃度のＬＥＶを含有する一連の組成物、濃度勾配を形成する一連の組成物；
ｃ）トレーサー・コンジュゲートを有するＬＥＶ誘導体；
ｄ）微粒子にカップリングしたＬＥＶ誘導体；
ｅ）微粒子にカップリングした抗体；
ｆ）酵素ドナーを有するＬＥＶ誘導体、および対応する酵素アクセプター；
ｇ）酵素アクセプターを有するＬＥＶ誘導体、および対応する酵素ドナー；または
ｈ）ろ過または沈降による分離に適した粒子上に装填された抗体
の少なくとも１つが含まれる。
【００２９】
[0023]さらに別の態様において、試料中のＬＥＶの存在を検出するための免疫診断システムにおいて使用するための抗体組成物を開示する。該抗体組成物には、ＬＥＶ誘導体を含む免疫原性組成物によって産生される抗ＬＥＶ抗体であって、該ＬＥＶ誘導体が、式１または式２：
【００３０】
【化６】
【００３１】
［式中：
ａ）ｎは、０〜８の値を持つ整数であり；
ｂ）Ｌは、ＣＨ２、ＣＯ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＣＯＮＨ、ＮＨ、Ｏ、またはＳ、およびその組み合わせからなる群の１つであり；
ｃ）Ｘは、末端基、芳香族基、アリール基、あるいは１〜１０の炭素原子および／またはヘテロ鎖原子を有する飽和、不飽和、置換、非置換、直鎖、または分枝鎖脂肪族基であって、ヘテロ鎖原子が、酸素、窒素、イオウ、またはリン、およびその組み合わせからなる群より選択される、前記脂肪族基であり；そして
ｄ）ＹはＹ１−Ｚである、式中、Ｙ１は、ＣＯＯ、ＣＯ、Ｏ、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、またはＮＨからなる群より選択され、そしてＺは作用基である］
の化学構造を有する、前記抗ＬＥＶ抗体が含まれる。
【００３２】
[0024]１つの態様において、ＬＥＶに比較したＬＥＶ誘導体に対する抗体のアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つは、均一または不均一免疫診断アッセイで使用するのに十分である。１つの態様において、抗体およびＬＥＶ誘導体間の相互作用は、ＬＥＶに対する抗体のアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つの少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％である。
【００３３】
[0025]１つの態様において、免疫原性部分は、タンパク質、ポリペプチド、糖タンパク質、多糖、粒子、微粒子、核酸、ポリヌクレオチド、およびその組み合わせからなる群より選択される。別の態様において、免疫原性部分は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵オボアルブミン、ウシ・ガンマ−グロブリン（ＢＧＧ）、およびその組み合わせからなる群より選択されるタンパク質である。
【００３４】
[0026]１つの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。別の態様において、抗体はポリクローナル抗体である。
[0027]抗ＬＥＶ抗体は：
ａ）式１または式２：
【００３５】
【化７】
【００３６】
の化学構造を有するＬＥＶ誘導体を含む免疫原性組成物の少なくとも第一の用量を、抗体を産生する被験体に投与し；
ｂ）抗体を産生する被験体から抗体を収集し；そして
ｃ）抗体を産生する被験体から収集した抗体を精製し、および／またはスクリーニングする；
工程を含む方法によって産生可能である。
【００３７】
[0028]１つの態様において、抗ＬＥＶ抗体を産生するための方法には、抗体を産生する被験体から抗体を収集する前に、少なくとも第二の用量の免疫原性組成物を、抗体を産生する被験体に投与する工程がさらに含まれる。
【００３８】
[0029]１つの態様において、収集工程には、血液、血清、血漿、または他の生物学的試料の少なくとも１つを、抗体を産生する被験体から得る工程が含まれる。
[0030]１つの態様において、スクリーニング工程には、ＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。
【００３９】
[0031]さらに別の態様において、本発明には、式１または式２のレベチラセタム（ＬＥＶ）誘導体を合成するための液相合成法が含まれる。
【００４０】
【化８】
【００４１】
[0032]該方法には、（１）保護されたアミノ酸出発物質を提供し、そして（２）保護されたアミノ酸出発物質を修飾して、式１または式２のＬＥＶ誘導体を生じる工程が含まれる。式２のｎ、ならびに式１および式２のＬ、Ｘ、およびＹは、以下のように定義される：
ａ）ｎは、０〜８の値を持つ整数であり；
ｂ）Ｌは、ＣＨ２、ＣＯ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＣＯＮＨ、ＮＨ、またはＳ、およびその組み合わせからなる群の１つであり；
ｃ）Ｘは、末端基、芳香族基、アリール基、あるいは１〜１０の炭素原子および／またはヘテロ鎖原子を有する飽和、不飽和、置換、非置換、直鎖、または分枝鎖脂肪族基であって、ヘテロ鎖原子が、酸素、窒素、イオウ、またはリン、およびその組み合わせからなる群より選択される、前記脂肪族基であり；そして
ｄ）Ｙは場合により、そして存在する場合、アルコールアミン、アミド、カルボン酸、アルデヒド、エステル、イミノエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、無水物、チオール、チオールアセトン、ジアゾニウム、ＮＨＳ、ＣＯ−ＮＨＳ、Ｏ−ＮＨＳ、マレイミドからなる群より選択される官能基の１つであり；または
ｅ）Ｙは場合により、そして存在する場合、Ｙ１−Ｚである、式中、Ｙ１は、ＣＯＯ、ＣＯ、Ｏ、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、またはＮＨからなる群より選択され、そしてＺは作用基である。
【００４２】
[0033]保護されたアミノ酸出発物質の適切な例には、側鎖上に誘導体化可能な官能基を有する天然および非天然アミノ酸の保護された誘導体が含まれうる。本明細書に記載する方法において、ＬＥＶ誘導体を作製するために誘導体化可能な側鎖官能基を有する天然存在アミノ酸の例示的な例には、限定されるわけではないが、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンの保護された誘導体が含まれる。１つの態様において、保護されたアミノ酸誘導体には、出発物質、中間体、および生成物を監視するのに使用可能な追跡可能な部分、例えば限定されるわけではないが、蛍光部分が含まれる。
【００４３】
[0034]保護されたアミノ酸出発物質の特定の例には、Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２、Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ、Ｈ−ｌｙｓ（Ｚ）−ＯｔＢｕ、Ｈ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＯｔＢｕ、Ｈ−Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）−ＯＭｅ、ＦＭＯＣ−Ｐｒｏ−ＯＨ、およびＢｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨが含まれる。好ましくは、式２の化合物の合成のための、保護されたアミノ酸出発物質は、Ｈ−ｌｙｓ（Ｚ）−ＯｔＢｕ、Ｈ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＯｔＢｕ、およびＨ−Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）−ＯＭｅからなる群より選択される。好ましくは、式１の化合物の合成のための、保護されたアミノ酸出発物質は、ＦＭＯＣ−Ｐｒｏ−ＯＨおよびＢｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨからなる群より選択される。
【００４４】
[0035]１つの態様において、式１または式２のレベチラセタム（ＬＥＶ）誘導体に関する合成収率は、約１０％〜約４０％の範囲である。別の態様において、式１または式２のＬＥＶ誘導体に関する合成収率は、約５％〜約２５％の範囲である。さらに別の態様において、式１または式２のＬＥＶ誘導体に関する収率は、約１％〜約１０％の範囲である。本明細書において、用語「合成収率」は、反応工程における生成物の収率（すなわち生成物／出発物質）、または多工程合成における各工程由来の合成収率の積を指す。すなわち、３工程合成反応の合成収率は、以下のように定義される：合成収率＝工程１収率％ｘ工程２収率％ｘ工程３収率％。類似の方法を用いて、より多いまたはより少ない工程を有する合成スキームに関する合成収率を計算してもよい。
【００４５】
[0036]本明細書記載の合成反応は、液相で行われるため、出発物質、中間体、および生成物を追跡可能であることが重要である。こうしたものとして、本明細書記載の方法には、追跡可能部分を用いて、出発物質、合成中間体、あるいは式１または式２のＬＥＶ誘導体の少なくとも１つの合成を監視する工程がさらに含まれる。１つの態様において、追跡可能物質には、蛍光部分が含まれる。
【００４６】
[0037]さらにさらなる別の態様において、本発明には、式２のレベチラセタム（ＬＥＶ）誘導体を合成するための液相合成法が含まれる。
【００４７】
【化９】
【００４８】
[0038]該方法には、（１）保護されたアミノ酸出発物質を提供し、そして保護されたアミノ酸出発物質を修飾して、式２のＬＥＶ誘導体を生じる工程が含まれる。式２のｎ、Ｌ、Ｘ、およびＹは、以下のように定義される：
ａ）ｎは、０〜８の値を持つ整数であり；
ｂ）Ｌは、ＣＨ２、ＣＯ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨ、またはＳ、およびその組み合わせからなる群の１つであり；
ｃ）Ｘは、末端基、芳香族基、アリール基、あるいは１〜１０の炭素原子および／またはヘテロ鎖原子を有する飽和、不飽和、置換、非置換、直鎖、または分枝鎖脂肪族基であって、ヘテロ鎖原子が、酸素、窒素、イオウ、またはリン、およびその組み合わせからなる群より選択される、前記脂肪族基であり；そして
ｄ）Ｙは場合により、そして存在する場合、アルコールアミン、アミド、カルボン酸、アルデヒド、エステル、イミノエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、無水物、チオール、チオールアセトン、ジアゾニウム、ＮＨＳ、ＣＯ−ＮＨＳ、Ｏ−ＮＨＳ、マレイミドからなる群より選択される官能基の１つであり；または
ｅ）ＹはＹ１−Ｚである、式中、Ｙ１は、ＣＯＯ、ＣＯ、Ｏ、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、またはＮＨからなる群より選択され、そしてＺは作用基である。
【００４９】
[0039]１つの態様において、式２の化合物を合成するための方法には、さらに、（１）保護されたアミノ酸出発物質の単一の立体異性体を提供し、ここで、保護されたアミノ酸出発物質の単一の立体異性体は、アミン官能基を含む少なくとも１つの立体中心周囲に選択された立体化学配向を有する、（２）アルキル化剤を用いて、保護されたアミノ酸出発物質上のアミン官能基にアルキル基を付加して、そして（３）アルキル基の少なくとも一部を環化して、ＬＥＶ誘導体の単一の立体異性体を産生する、ここで、ＬＥＶ誘導体の単一の立体異性体は、保護されたアミノ酸出発物質における立体化学配向と同じ、少なくとも１つの共有結合周囲の選択された立体化学配向を有する、工程が含まれる。
【００５０】
[0040]１つの態様において、アルキル化剤は、４−置換ブチレート誘導体であり、ここで、誘導体化基は、電子吸引性／脱離基であり、ブチレートを求核攻撃に感受性にする。４−置換ブチレート誘導体の適切な例には、限定されるわけではないが、ハロブチレート、例えば４−フルオロ酪酸エチル、４−クロロ酪酸エチル、４−ブロモ酪酸エチル、および４−ヨード酪酸エチルが含まれる。
【００５１】
[0041]さらにさらなる別の態様において、本発明には、あらかじめＬＥＶを投与されている被験体から得られる試料中のＬＥＶの存在を検出するための免疫診断アッセイを行う方法が含まれる。該方法には：
ａ）抗ＬＥＶ抗体およびＬＥＶ誘導体を試料と合わせて、第一の組成物を形成し、前記抗体はＬＥＶおよびＬＥＶ誘導体と結合可能であり、ここで、抗体およびＬＥＶ誘導体間の相互作用は、ＬＥＶに対する抗体のアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つの少なくとも５０％であり、そしてＬＥＶ誘導体は、式１または式２：
【００５２】
【化１０】
【００５３】
の１つの化学構造を有する；
ｂ）試料由来の任意の未結合ＬＥＶおよびＬＥＶ誘導体が、抗体との結合に関して競合するのを可能にし；そして
ｃ）ＬＥＶ誘導体および抗体間の結合を検出する；
工程が含まれる。
【００５４】
[0042]１つの態様において、ＬＥＶをあらかじめ投与された被験体から得られる試料中のＬＥＶの存在を検出するための免疫診断アッセイを実行する方法には、さらに：
ａ）ＬＥＶ誘導体を得て、前記ＬＥＶ誘導体には蛍光部分が含まれ；
ｂ）第一の量の偏光を有する偏光を用いて蛍光コンジュゲートを励起させ；
ｃ）第二の量の偏光を有する蛍光コンジュゲートから放出される偏光を検出し；
ｄ）第一の量の偏光と第二の量の偏光を比較し；そして
ｅ）ＬＥＶが試料中に存在するかどうかを決定する、ここで、第二の量の偏光が第一の量の偏光と異なるならば、ＬＥＶが試料中に存在する指標となる；
工程が含まれる。
【００５５】
[0043]上記方法にはさらに：
ａ）既知の量のＬＥＶとＬＥＶ誘導体および抗体を合わせて、対照結合組成物を形成し；
ｂ）第三の量の偏光を有する対照結合組成物中の蛍光コンジュゲートから放出される偏光を検出し；
ｃ）第三の量の偏光と第二の量の偏光を比較して；そして
ｄ）試料中に存在するＬＥＶの量を決定する；
工程が含まれる。
【００５６】
[0044]別の態様において、あらかじめＬＥＶを投与されている被験体から得られる試料中のＬＥＶの存在を検出するための免疫診断アッセイを実行する方法には、さらに：
ａ）ＬＥＶ誘導体および抗体を得て、ここで、ＬＥＶ誘導体および抗体の一方は、微粒子にカップリングしている；
ｂ）第一の組成物に入射光を照射し；
ｃ）第一の組成物から透過される光の第一の強度を検出し；
ｄ）ＬＥＶ誘導体および抗体を有し、そして遊離ＬＥＶを持たない対照結合組成物から透過される光の最低限の強度を同定し；
ｅ）透過光の最小限の強度と透過光の第一の強度を比較し；そして
ｆ）ＬＥＶが試料中に存在するかどうかを決定する、ここで、最小限の強度と第一の強度が異なるならば、ＬＥＶが試料中に存在する指標となる；
工程が含まれる。
【００５７】
[0045]上記方法にはさらに：
ａ）既知の量のＬＥＶとＬＥＶ誘導体および抗体を合わせて、対照結合組成物を形成し；
ｂ）対照結合組成物に入射光を照射し；
ｃ）対照結合組成物から透過される光の第二の強度を検出し；そして
ｄ）試料中に存在するＬＥＶの量を決定する、ここで、第一の強度および第二の強度間の比較が、試料中に存在するＬＥＶの量の指標となる；
工程が含まれる。
【００５８】
[0046]さらに別の態様において、あらかじめＬＥＶを投与されている被験体から得られる試料中のＬＥＶの存在を検出するための免疫診断アッセイを実行する方法には、さらに：
ａ）ＬＥＶ誘導体を得て、ここで、ＬＥＶ誘導体には酵素ドナーが含まれる；
ｂ）第一の組成物と酵素アクセプターを合わせ；
ｃ）基質と第一の組成物を合わせ、ここで、基質は、酵素ドナーおよび酵素アクセプターと相互作用することによって切断可能であり；そして
ｄ）酵素活性を検出する；
工程が含まれる。
【００５９】
[0047]上記方法にはさらに：
ａ）既知の量のＬＥＶとＬＥＶ誘導体および抗体を合わせて、対照結合組成物を形成し；
ｂ）酵素アクセプターと対照結合組成物を合わせ；
ｃ）基質と対照結合組成物を合わせ、ここで、基質は、酵素ドナーおよび酵素アクセプターと相互作用することによって切断可能である；
ｄ）対照酵素活性を検出し；そして
ｅ）試料中に存在するＬＥＶの量を決定する、ここで、酵素活性および対照酵素活性間の比較は、試料中に存在するＬＥＶの量の指標となる；
工程が含まれる。
【００６０】
[0048]さらにさらなる別の態様において、あらかじめＬＥＶを投与されている被験体から得られる試料中のＬＥＶの存在を検出するための免疫診断アッセイを実行する方法には、さらに：
ａ）ＬＥＶ誘導体を得て、ここで、ＬＥＶ誘導体にはトレーサー部分が含まれる；
ｂ）抗体を競合結合組成物から分離し；
ｃ）未結合ＬＥＶ誘導体を抗体から分離させ；そして
ｄ）抗体と結合した類似体のトレーサー部分を検出する；
工程が含まれる。
【００６１】
[0049]上記方法には、さらに：
ａ）既知の量のＬＥＶとＬＥＶ誘導体および抗体を合わせて、対照結合組成物を形成し；
ｂ）抗体を対照結合組成物から分離し；
ｃ）競合結合組成物由来の抗体と結合したトレーサー・コンジュゲートの第一の量を検出し；
ｄ）対照結合組成物由来の抗体と結合したトレーサー・コンジュゲートの第二の量を検出し；そして
ｅ）試料中に存在するＬＥＶの量を決定する、ここで、第一の量のトレーサー・コンジュゲートおよび第二の量のトレーサー・コンジュゲート間の比較は、試料中に存在するＬＥＶの量の指標となる；
工程が含まれる。
【００６２】
[0050]本発明のこれらのおよび他の目的および特徴は、以下の説明および付随する特許請求の範囲からより詳細に明らかになるであろうし、または以下に示すように、本発明の実施によって学習されうる。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
Ｉ．序論
[0051]一般的に、本発明は、レベチラセタム（ＬＥＶ）誘導体、ＬＥＶ誘導体を合成するための方法、およびＬＥＶに関する免疫診断アッセイに関する。ＬＥＶ誘導体には、作用基、例えば：抗ＬＥＶ抗体を調製するのに使用可能な免疫原性部分；ＬＥＶに関する免疫診断アッセイで使用可能な抗原性部分；または免疫診断アッセイで使用可能なトレーサー部分が含まれてもよい。さらに、免疫診断アッセイにおいて、抗ＬＥＶ抗体に関してＬＥＶと競合させるため、ＬＥＶ誘導体を用いてもよい。本明細書記載の合成法には、十分な特異性および感度で、ＬＥＶおよび／またはＬＥＶ誘導体に結合可能な抗体の発展に成功する免疫プログラムに必要とされる、多量のＬＥＶ誘導体を産生するのに適したキラル選択性の液相合成工程が含まれる。
【００６４】
ＩＩ．レベチラセタム誘導体
[0052]本発明の１つの態様において、式１または式２に基づく構造を有するＬＥＶ誘導体が提供される。
【００６５】
【化１１】
【００６６】
[0053]式１および／または式２の前述の化学構造は、それにコンジュゲート化された多様な部分を含んでもよい骨格である。こうしたものとして、骨格はさらに、以下によって定義可能である：
（ａ）ｎは、０〜８の値を持つ整数であり；
（ｂ）Ｌは、ＣＨ２、ＣＯ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＣＯＮＨ、ＮＨ、Ｏ、またはＳ、およびその組み合わせからなる群の１つであり；
（ｃ）Ｘは、末端基（例えばＨ）、芳香族基、アリール基、あるいは１〜１０の炭素原子および／またはヘテロ鎖原子を有する飽和、不飽和、置換、非置換、直鎖、または分枝鎖脂肪族基であって、ヘテロ鎖原子が、酸素、窒素、イオウ、またはリン、およびその組み合わせからなる群より選択される、前記脂肪族基であり；そして
（ｄ）Ｙは場合により、そして存在する場合、アルコールアミン、アミド、カルボン酸、アルデヒド、エステル、イミノエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、無水物、チオール、チオールアセトン、ジアゾニウム、ＮＨＳ、ＣＯ−ＮＨＳ、Ｏ−ＮＨＳ、マレイミドからなる群より選択される官能基の１つであり；または
（ｅ）ＹはＹ１−Ｚである、式中、Ｙ１は、ＣＯＯ、ＣＯ、Ｏ、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、またはＮＨからなる群より選択され、そしてＺは作用基である。
【００６７】
[0054]芳香族およびアリールＸ基の適切な例には、限定されるわけではないが、ベンゼン、フェニル、ベンジル、トルエン、トルイル、キシレン等が含まれる。芳香族基にはまた、ピリジン、フラン、テトラヒドロフラン等のヘテロ芳香族であるためのヘテロ原子も含まれてもよい。また、芳香族は、多環芳香族、例えばナフタレン、アントラセン、フェナントレン、多環芳香族炭化水素、インドール、キノリン、イソキノリン等であってもよい。用語「アリール」には、６〜１４炭素原子を持つ芳香族環系が含まれ、芳香族環系には、少なくとも１つの環が芳香族である６〜１４の環原子を有する１またはそれより多い環が含まれる。Ｃ６−１４アリール基の例には、フェニル（Ｃ６）、インデニル（Ｃ９）、ナフチル（Ｃ１０）、フルオレニル（Ｃ１３）、アントラシル（Ｃ１４）、およびフェナントリル（Ｃ１４）が含まれる。上述のアリール基において、別に言及しない限り、１またはそれより多い水素原子が、場合によって他の置換基によって置換されていてもよい。例えば、アリール基は、以下の置換基によって置換されていてもよい：ＯＨ；ＮＯ２；ＣＮ；ＮＨ２；ハロゲン、例えばフッ素または塩素；場合によって置換されたＣ１−１０アルキル、例えばメチル、エチル、またはプロピル；場合によって置換された−ＯＣ１−３アルキル、例えば−ＯＭｅ、−ＯＥｔ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ−Ｃ１−４アルキル、例えば−ＣＯＯＭｅまたは−ＣＯＯＥｔ、または−ＣＯＮＨ２。
【００６８】
[0055]脂肪族Ｘ基の適切な例には、限定されるわけではないが、ＣＨ２；（ＣＨ２）２；（ＣＨ２）３；（ＣＨ２）４；（ＣＨ２）５；（ＣＨ２）６；ＣＯＣＨ２；ＣＯ（ＣＨ２）２；ＣＯ（ＣＨ２）３；ＣＯ（ＣＨ２）４；ＣＯ（ＣＨ２）５；ＣＯ（ＣＨ２）６；ＣＨ２ＮＨ、（ＣＨ２）２ＮＨ、（ＣＨ２）３ＮＨ、（ＣＨ２）４ＮＨ、（ＣＨ２）５ＮＨ、（ＣＨ２）６ＮＨ、マレイミド−Ｐｈ、ｔ−ブチル、Ｐｈ、ＯＣＨ２−Ｐｈ、ＮＨ、ＣＨ２−Ｐｈ、その組み合わせ等が含まれる。
【００６９】
[0056]Ｙ１−ＺにおけるＺの適切な例には、限定されるわけではないが、検出可能標識、抗原性キャリアー、あるいはタンパク質、酵素、酵素断片、蛍光化合物、化学発光物質、電気化学仲介因子、粒子、レポーター基、酵素阻害剤、および／または核酸からなる群より選択される末端基が含まれる。
【００７０】
[0057]１つの例示的実施例において、Ｚ作用基の適切な例には、限定されるわけではないが、作用基が、検出可能標識、抗原性キャリアー、カップリング剤（例えば、ＮＨＳ、ＣＯ−ＮＨＳ、Ｏ−ＮＨＳ、マレイミド等）、末端基、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、多糖、核酸、ポリヌクレオチド、タイコ酸、放射性同位体、酵素、酵素断片、酵素ドナー断片、酵素アクセプター断片、酵素基質、酵素阻害剤、補酵素、蛍光部分、燐光部分、反ストークス上方制御部分、化学発光部分、発光部分、色素、増感剤、粒子、微粒子、磁気粒子、固体支持体、リポソーム、リガンド、受容体、ハプテン放射性同位体、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項１１の方法が含まれる。別の例示的な例において、Ｚは、以下のコンジュゲート基のいずれであってもよい：（ａ）ＢＳＡ；（ｂ）ＫＬＨ；（ｃ）蛍光トレーサー；および（ｄ）その他。
【００７１】
[0058]以下に示す表１および２は、いくつかの特定のＬＥＶ誘導体および対応するＬ、Ｘ、Ｙ、およびＹ１−Ｚ基を例示する。多くのＬＥＶ誘導体に関する合成収率もまた示す。
【００７２】
表１：式２のＬＥＶ誘導体
【００７３】
【表１】
【００７４】
表２：式１のＬＥＶ誘導体
【００７５】
【表２】
【００７６】
表１および２中の各ＬＥＶ誘導体の構造を以下のセクションに示す。さらに、ＬＥＶ誘導体の合成スキームを以下のセクションに示し、そして付随する実施例に詳細に論じる。
ＩＩＩ．式２のＬＥＶ誘導体
[0059]式２に基づく誘導体を合成するためのいくつかのスキームを設計した。一般的に、出発物質が商業的に入手可能であり、そして各工程での反応生成物の検出を介して、反応進行を監視可能であれば、合成は容易になる。任意の適切な手段によって反応生成物の検出を実行してもよく、蛍光部分、例えば紫外光感受性発色団を介した検出などの迅速法が好ましい。例えば、反応物および生成物を高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分離してもよく、そして反応物、中間体、および生成物の１またはそれより多くに付着する発色団などの検出可能標識を用いて、反応物、中間体、および生成物の存在を監視してもよい。
【００７７】
[0060]以下に示すスキーム１は、既知の合成法に基づき、そして商業的に入手可能な出発物質、Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２を利用する。しかし、４−オキソ酪酸は、容易に入手可能ではなく、そして入手可能であったとしても、出発物質または生成物上に検出可能部分、例えば発色団がなく、反応の監視が困難である：
【００７８】
【化１２】
【００７９】
[0061]スキーム２および２’は、商業的に入手可能な出発物質Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２を用いる、２つの新規合成経路に基づく。しかし、出発物質または生成物上に発色団がないことから、単離、精製および性質決定が困難であったため、環化生成物は単離されなかった。同様に、反応進行を監視するために、ＴＬＣ、ＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳなどの分析技術は有用ではない。染色技術（ヨウ素、アニスアルデヒド、リン酸）は、比較用の参照生成物が入手可能でないため、信頼性がない。さらに、反応性末端アミド−ＣＯ−ＮＨ２は、環化反応に干渉する可能性があった。
【００８０】
【化１３】
【００８１】
[0062]以下に示す、スキーム３のための出発物質として、Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅを用いる。唯一の反応基、ＮＨ２は誘導体化されるが、検出可能発色団がないため、環化生成物は単離が困難である。
【００８２】
【化１４】
【００８３】
[0063]スキーム４は、ＵＶ検出可能部分、ＦＭＯＣを含有する、商業的に入手可能な出発物質、Ｈ−Ｌｙｓ（ＦＭＯＣ）−ＯＭｅを利用する。しかし、ＦＭＯＣ部分は不安定であり、そして溶液に塩基を添加すると除去される。環化生成物は単離されなかった。
【００８４】
【化１５】
【００８５】
[0064]スキーム５は、ＵＶ検出可能部分を含有する、商業的に入手可能な出発物質、Ｈ−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯｔＢｕを利用する。ＴＬＣまたはＨＰＬＣを介してアルキル化および環化反応を監視する。カラムクロマトグラフィーを介して、精製および単離を達成する。環化化学反応は、反応基（アルファアミン）および化学的に安定な保護基（ベンジル）によって容易となる。
【００８６】
【化１６】
【００８７】
【化１７】
【００８８】
[0065]化合物１８ａを免疫原として用いて、商業的ＬＥＶイムノアッセイのため、望ましい特異性、感受性および交差反応性を持つ適切な抗体を産生した。
[0066]スキーム６は、商業的に入手可能なＵＶ検出可能出発物質、Ｈ−Ｇｌｕ（Ｏｂｚｌ）−ＯｔＢｕを利用する。ＴＬＣまたはＨＰＬＣを介して、アルキル化および環化反応を監視する。カラムクロマトグラフィーを介して、生成物の精製および単離を実行する。環化化学反応は、反応性アルファアミン基および化学的に安定な保護ベンジル基によって容易となる。スキーム６は、免疫原性誘導体を含むＬＥＶ誘導体を産生するため、スキーム５に対する適切な代替物である。
【００８９】
【化１８】
【００９０】
[0067]スキーム７は、検出可能な発色団を含有する、商業的に入手可能な物質、Ｈ−Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）−ＯＭｅを使用する。スキーム７は、免疫原性誘導体を含むＬＥＶ誘導体を産生するため、スキーム５に対する有用な代替物として働く。
【００９１】
【化１９】
【００９２】
【化２０】
【００９３】
ＩＶ．式１のＬＥＶ誘導体
[0068]式１にしたがって、ＬＥＶの他の誘導体を作製してもよい。式１にしたがって適切な量の誘導体を産生する１つの方法を以下のスキーム８に示す。商業的に入手可能な出発物質は、ＦＭＯＣ−Ｐｒｏ−ＯＨである。スキーム４におけるのと同様に、ＦＭＯＣ部分は不安定であり、そして保護基として最適には機能しない可能性もある。
【００９４】
【化２１】
【００９５】
[0069]スキーム９は、商業的に入手可能なＵＶ検出可能出発物質、Ｚ−Ｐｒｏ−ＯＨを使用する。ベンジル保護基は安定であり、そしてルーチンの有機合成に適している。
【００９６】
【化２２】
【００９７】
【化２３】
【００９８】
[0070]スキーム８および９は、ＬＥＶに関するイムノアッセイを発展させるために有用な免疫原性誘導体を含む、ＬＥＶ誘導体を産生するのに適している。
Ｖ．イムノアッセイにおけるＬＥＶ誘導体の使用
[0071]免疫原性誘導体、例えば、限定されるわけではないが、化合物１８ａ、２７、３７または４４のいずれかは、以下にさらに詳細に記載するような抗ＬＥＶ抗体産生を誘導するのに有用である。他の誘導体、例えば限定されるわけではないが、化合物１８ｂ、２８、３８、または４４のいずれかは、標本中のＬＥＶと競合するための抗原（競合抗原）を作製するのに有用である。
【００９９】
[0072]当該技術分野に知られるように、競合抗原および／または抗ＬＥＶ抗体を検出可能標識とコンジュゲート化してもよい。検出可能標識には、限定なしに、色素、ラテックス粒子、コロイド金、フルオロフォア、発色団、酵素、酵素断片、放射性同位体等が含まれる。
【０１００】
[0073]共有または非共有結合を介して、競合抗原および／または抗ＬＥＶ抗体を固体表面上に固定してもよい。固体表面には、限定なしに：粒子；膜およびフィルターを含む多孔物質；ガラス、金属、および非孔プラスチックを含む非孔物質；等が含まれる。
【０１０１】
[0074]抗ＬＥＶ抗体、および場合によって競合抗原は、レベチラセタム濃度を測定するための定量的イムノアッセイに必須の試薬を構成する。イムノアッセイには、限定されるわけではないが、当該技術分野に知られるような、均一微粒子イムノアッセイ（例えば免疫比濁法）または定量的微小球体系（ＱＭＳ（登録商標））、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、化学発光微粒子イムノアッセイ（ＣＭＩＡ）、クローン化酵素ドナーイムノアッセイ（ＣＥＤＩＡ）、酵素連結イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）等が含まれてもよい。
【実施例】
【０１０２】
ＶＩ．実施例
[0075]以下の実施例は、本発明の態様を例示するために提供され、そして限定することを意図されない。したがって、実施例のいくつかは実験を通じて行われており、そしていくつかは当該技術分野に周知の技術、標準、および結果に基づいて、予言的である。また、本発明には、例によっては例示されない、さらなる態様が含まれうることが明らかであるはずである。さらに、本発明にしたがって調製されたＬＥＶ誘導体、抗原、免疫原、および抗ＬＥＶ抗体を用いて、当該技術分野に周知の実験プロトコルで、多くの例が実行されてきている。
【０１０３】
実施例１：スキーム５、工程１：アルキル化
[0076]化合物１０、Ｈ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｏｔ−Ｂｕ・ＨＣｌ（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号０４−１２−５１２２）、２０．００６５ｇを、清浄な５００ｍＬ 一口丸底フラスコ内に入れた。磁気攪拌バーを反応フラスコに添加し、そしてフラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンを１５分間パージした。清浄なシリンジ、例えばＨａｍｉｌｔｏｎ Ｇａｓｔｉｇｈｔ（登録商標）シリンジを用い、セプタムを通じて、８０ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを反応フラスコに添加した。反応混合物を、アルゴン下、周囲温度で、さらに１５分間攪拌した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度で１０分間攪拌した。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、１滴ずつ、７．６８ｍＬの４−ブロモ酪酸エチルをフラスコに添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度で１０分間攪拌した。冷たい流水の水道水を伴うコンデンサーを反応フラスコ上に乗せ、そしてアルゴンラインをコンデンサーの最上部に設置した。７０℃にあらかじめ加熱した油槽内に反応フラスコを浸し、そしてアルゴン下で４０時間攪拌した。
【０１０４】
[0077]反応混合物を室温に冷却した。溶媒トラップを通じて真空ポンプに連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（ＤＭＦ）を除去した。１：３アセトン：クロロホルムを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物１１を精製した。単離された化合物１１収率は６２〜７４％であった。
【０１０５】
実施例２：スキーム５、工程２：ラクタム化／環化
[0078]化合物１１、１８．８１８ｇを清浄な２５０ｍＬ 一口丸底フラスコ（反応フラスコ）に移した。フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンをおよそ１５分間パージした。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、６１ｍＬの無水トルエンを反応フラスコ内に添加した。反応混合物を、アルゴン下、周囲温度で約１０分間攪拌し、次いで、１．１６９ｇの２−ヒドロキシピリジンを固体粉末として反応フラスコ内に添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度でおよそ１０分間攪拌した。冷たい流水の水道水を伴うコンデンサーを反応フラスコ上に乗せた。アルゴンラインをコンデンサーの最上部に設置した。１２０℃にあらかじめ加熱した油槽内に反応フラスコを浸し、そして２−ヒドロキシピリジンが完全に溶解するまで、アルゴン下で約１５時間攪拌した。
【０１０６】
[0079]反応混合物を室温に冷却した。吸引装置に連結したロータリーエバポレーター上で、溶媒（トルエン）を除去した。１：３ヘキサン：酢酸エチルを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物１２を精製した。化合物１２収率は４９〜８３％の範囲であった。
【０１０７】
実施例３：スキーム５、工程３：加水分解
[0080]１４．０１９ｇの化合物１２を清浄な２５０ｍＬ 一口丸底反応フラスコ内に移した。清浄なメスシリンダーを用いて、反応フラスコに５０ｍＬのジクロロメタンを添加した。反応混合物を周囲温度で約５分間攪拌し、清浄なメスシリンダーを用いて、１０２ｍＬのトリフルオロ酢酸を反応フラスコ内に添加した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そして周囲温度でおよそ４時間攪拌した。
【０１０８】
[0081]吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（ジクロロメタン）を除去した。１：１アセトン：酢酸エチルを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物１３を精製した。化合物１３収率は６６〜９２％の範囲であった。
【０１０９】
実施例４：スキーム５、工程４：活性化
[0082]化合物１３、１１．０７４ｇを、あらかじめ０℃に設定した循環サーモスタットに連結したジャケット型２５０ｍＬ 一口丸底反応フラスコに移した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンをおよそ１５分間パージした。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、３０ｍＬの無水アセトニトリルを反応フラスコに添加した。反応混合物を、アルゴン下、０℃で、さらに約１５分間攪拌した。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じてゆっくりと、反応フラスコ内に７．２ｍＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを添加した。反応混合物をアルゴン下、０℃で約１０分間攪拌した。
【０１１０】
[0083]１１．１５ｇのＴＳＴＵ（Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−１，１，３，３−テトラメチルウランテトラフルオロボレート；≧９８％、Ｆｌｕｋａ、カタログ番号８５９７２）を５０ｍＬの無水アセトニトリル中に完全に溶解した。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、生じた溶液を反応フラスコ内に添加した。反応混合物をアルゴン下、０℃でおよそ２．５時間攪拌した。
【０１１１】
[0084]吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（アセトニトリル）を除去した。１：９ヘキサン：酢酸エチルを溶出液として用い、フリットディスクを備えた迅速分離カラム／漏斗（ＣｈｅｍＧｌａｓｓカタログ番号ＣＧ−１４１２）を用い、フラッシュクロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物１４を精製した。生成物収率は８５〜９３％であった。
【０１１２】
実施例５：スキーム５、工程５：アミノリシス
[0085]１２．２４１ｇの化合物１４を、あらかじめ０℃に設定した循環サーモスタットに連結した清浄なジャケット型２５０ｍＬ 一口丸底反応フラスコに移した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンを約１５分間パージした。１１０ｍＬのメタノール中の７Ｎアンモニア（約−２０℃にあらかじめ冷却）を添加した際、白色固体（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）の形成が観察された。隔離された条件下（ゴムセプタムで蓋、アルゴンは含まない）、０℃で２．５時間、反応混合物を攪拌した。反応混合物をゆっくりと周囲温度にした。
【０１１３】
[0086]吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを用いて、未反応アンモニアおよび溶媒（メタノール）を除去した。溶媒を除去した際、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドがフラスコ中で結晶化した。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を反応混合物に添加し、そして結晶化したＮ−ヒドロキシスクシンイミドは、溶液から沈殿した。フリット・バックナー漏斗を通じてろ過することによって、結晶を除去した。吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを介して、ろ過した溶液からＴＨＦを除去した。１：９メタノール：酢酸エチルを溶出液として用いた、カラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物１５を精製し、収率は約６０〜７０％であった。
【０１１４】
実施例６：スキーム５、工程６：脱保護
[0087]化合物１５、１．５ｇを清浄な２００ｍＬ 一口丸底反応フラスコ内に移した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そして低流量のアルゴンでおよそ１５分間パージした。清浄なシリンジを用いて、反応フラスコ内に４０ｍＬの無水エタノールを添加した。混合物を、アルゴン下、周囲温度で、約５分間攪拌し、そして次いで、１．３７３ｇのギ酸アンモニウムを固体粉末として反応フラスコ内に添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度で５分間攪拌し、その後、１１ｍＬの脱イオン水を添加した。ギ酸アンモニウムが完全に溶解するまで、アルゴン下、周囲温度でおよそ５分間、攪拌を続けた。１１０℃にあらかじめ加熱した油槽内に反応フラスコを浸し、そしてアルゴン下で約７時間攪拌した。
【０１１５】
[0088]１：９メタノール：酢酸エチルを溶出液として用いたＢｉｏｔａｇｅ（登録商標）カラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物３を精製した。化合物３の単離収率は５０〜７０％であった。
【０１１６】
実施例７：スキーム５、工程７：アミノリシス
[0089]７０ｍｇの化合物１５を、１０ｍＬコニカルフラスコ中の３ｍＬのアセトン中に均一に溶解した。２ｍＬの溶液を抜き取り、そしてシリンジを用いて、空の清浄な５ｍＬコニカルフラスコ内に移した。ロータリーエバポレーターを用いて、５ｍＬフラスコからアセトンを蒸発させた。
【０１１７】
[0090]３ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを、化合物１５を含有するフラスコに添加した。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じてゆっくりと、０．１６４ｍＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを５ｍＬコニカルフラスコ内に添加した。
【０１１８】
[0091]別個に、７６０ｍｇの化合物１６を２００ｍＬ 一口丸底フラスコ（反応フラスコ）内に入れた。磁気攪拌バーを反応フラスコ内に入れた。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンを１５分間パージした。４５ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを反応フラスコ内に添加した。２２を完全に攪拌し、そして超音波槽中で加熱を伴わず穏やかな超音波処理で溶解させた。１：１水：エチレングリコールを満たしたジャケット型ビーカー内に反応フラスコを浸し、そしてあらかじめ０℃に設定した循環サーモスタットに連結した。０℃、アルゴン下での攪拌をさらに１０分間続けた。
【０１１９】
[0092]Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｇａｓｔｉｇｈｔ（登録商標）シリンジを用て、化合物１６を含有する反応フラスコ内に、１０分間に渡って１滴ずつ、化合物１５溶液を添加した。２つの１ｍＬ部分の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドでシリンジをリンスし、そしてリンス液を反応フラスコ内に添加した。反応混合物をアルゴン下、０℃で１時間攪拌した。冷却槽から反応フラスコを除去し、そして室温に到達させた。反応混合物をアルゴン下、室温で６時間攪拌した。
【０１２０】
[0093]２つの溶媒トラップを通じて真空ポンプに連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）を除去した。ジクロロメタン：アセトン（１００％ジクロロメタンから開始して、そして１００％アセトンで終了する）を溶出液として用いたＢｉｏｔａｇｅ（登録商標）カラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物１７を精製した。化合物１７の収率は２３〜３９％であった。
【０１２１】
実施例８：スキーム５、工程８：レベチラセタム免疫原の調製
[0094]８ｍｌ ｐＨ７．２ ＰＢＳ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）中の１６０ｍｇのキーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）の溶液を氷槽中で冷却した。約１１．８ｍＬのＤＭＳＯをＫＬＨ溶液に１滴ずつ添加して、そして室温未満で維持した。１．０ｍＬ ＤＭＳＯ中の３０ｍｇの化合物１７の溶液をＫＬＨ溶液に１滴ずつ添加して、反応混合物を形成し、そして混合物をおよそ４０時間、周囲温度で攪拌させた。生じた免疫原（化合物１８ａ）を透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れて、そして１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の３０％ＤＭＳＯ、その後、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の１０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の５％ＤＭＳＯ中で、室温で連続透析し、そして次いで、４℃で、ｐＨ７．２ ＰＢＳと４回交換した（各１Ｌで少なくとも各６時間）。
【０１２２】
実施例９：スキーム５、工程９：レベチラセタム・コンジュゲートの調製
[0095]２５ｍｌ ｐＨ７．２ ＰＢＳ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）中の４００ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液を氷槽中で冷却した。約１６ｍＬのＤＭＳＯをＢＳＡ溶液に１滴ずつ添加して、そして室温未満で維持した。
【０１２３】
[0096]１．０ｍＬ無水ＤＭＦ中の２８ｍｇの化合物３の溶液に０．２ｍＬ無水Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを添加した。異なる丸底フラスコに、４８ｍｇのカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）および１ｍＬ無水ＤＭＦを添加した。
【０１２４】
[0097]約１０分間の期間に渡って、シリンジを介して、化合物３を含有する溶液をＤＭＦ中のＣＤＩの溶液に１滴ずつ添加して、そして生じた混合物を氷槽中でおよそ５時間攪拌した。
【０１２５】
[0098]約２０分間の期間に渡って、シリンジを用いて、化合物３／ＣＤＩの溶液をＢＳＡ溶液に１滴ずつ添加した。生じた混合物を２〜８℃で一晩攪拌した。生じた化合物１８ｂを透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れて、そして１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の３０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の１０％ＤＭＳＯ中で、４℃で連続透析し、その後、ｐＨ７．２ ＰＢＳと４回交換した（各１Ｌで少なくとも各６時間）。
【０１２６】
実施例１０：スキーム６、工程１：アルキル化
[0099]化合物２０、Ｈ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＯｔＢｕ（Ｂａｃｈｅｍ、カタログ番号Ｅ３５３５、ＣＡＳ番号１０５５９０−９７−４）、５ｇを、清浄な１００ｍＬ 一口丸底フラスコ内に入れた。磁気攪拌バーを反応フラスコ内に入れ、そして反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンを１５分間パージした。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、２０ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを反応フラスコに添加した。反応混合物を、アルゴン下、周囲温度で、さらに１５分間攪拌し、そして次いで、清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、１滴ずつ、２ｍＬの４−ブロモ酪酸エチルをフラスコに添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度で約１０分間攪拌した。冷たい流水の水道水を伴うコンデンサーを反応フラスコ上に乗せ、そしてアルゴンラインをコンデンサーの最上部に設置した。７０℃にあらかじめ加熱した油槽内に反応フラスコを浸し、そしてアルゴン下でおよそ４０時間攪拌した。
【０１２７】
[00100]反応混合物を室温に冷却した。溶媒トラップを通じて真空ポンプに連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（ＤＭＦ）を除去した。蒸発装置コンデンサーコイル冷却剤（１：１エチレングリコール：水）をおよそ−１５℃にあらかじめ冷却した。１：３アセトン：クロロホルムを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物２１を精製した。単離された化合物２１収率は５０〜７０％であった。
【０１２８】
実施例１１：スキーム６、工程２：ラクタム化／環化
[00101]化合物２１、４ｇを清浄な１００ｍＬ 一口丸底フラスコ（反応フラスコ）に移した。フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンをおよそ１５分間パージした。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、１５ｍＬの無水トルエンを反応フラスコに添加した。反応混合物を、アルゴン下、周囲温度で、約１０分間攪拌し、次いで、０．３ｇの２−ヒドロキシピリジンを固体粉末として反応フラスコ内に添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度でおよそ１０分間攪拌した。冷たい流水の水道水を伴うコンデンサーを反応フラスコ上に乗せた。アルゴンラインをコンデンサーの最上部に設置した。１２０℃にあらかじめ加熱した油槽内に反応フラスコを浸し、そして２−ヒドロキシピリジンが完全に溶解するまで、アルゴン下で１５時間攪拌した。
【０１２９】
[00102]反応混合物を室温に冷却した。吸引装置に連結したロータリーエバポレーター上で溶媒（トルエン）を除去した。１：３ヘキサン：酢酸エチルを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物２２を精製した。化合物２２収率は４０〜７０％の範囲であった。
【０１３０】
実施例１２：スキーム６、工程３：加水分解
[00103]２ｇの化合物２２を清浄な１００ｍＬ 一口丸底反応フラスコに移した。清浄なメスシリンダーを用いて、反応フラスコに１０ｍＬのジクロロメタンを添加した。反応混合物を周囲温度で約５分間攪拌し、そして次いで、清浄なメスシリンダーを用いて、１０ｍＬのトリフルオロ酢酸を反応フラスコ内に添加した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そして周囲温度でおよそ４時間攪拌した。
【０１３１】
[00104]吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（ジクロロメタン、トリフルオロ酢酸）を除去した。１：１アセトン：酢酸エチルを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物２３を精製した。化合物２３収率は７０〜９０％の範囲であった。
【０１３２】
実施例１３：スキーム６、工程４：アミノリシス
[00105]化合物２３、１．７５ｇを、あらかじめ０℃に設定した循環サーモスタットに連結したジャケット型１００ｍＬ 一口丸底反応フラスコに移した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンをおよそ１５分間パージした。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、５ｍＬの無水アセトニトリルを反応フラスコに添加した。反応混合物を、アルゴン下、０℃で、さらに約１５分間攪拌した。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じてゆっくりと、反応フラスコ内に２ｍＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを添加した。反応混合物は淡黄色からより深い黄色に変化した。反応混合物をアルゴン下、０℃で約１０分間攪拌した。
【０１３３】
[00106]１．８０ｇのＴＳＴＵ（Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−１，１，３，３−テトラメチルウランテトラフルオロボレート）を１０ｍＬの無水アセトニトリル中に完全に溶解した。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、生じた溶液を反応フラスコ内に添加した。反応混合物をアルゴン下、０℃でおよそ２．５時間攪拌した。
【０１３４】
[00107]吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（アセトニトリル）を除去した。迅速分離を用いたフラッシュクロマトグラフィーを用いて、中間体を精製した。
【０１３５】
[00108]１．６ｇの中間体を、あらかじめ０℃に設定した循環サーモスタットに連結した清浄なジャケット型１００ｍＬ 一口丸底反応フラスコに移した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンを約１５分間パージした。２０ｍＬのメタノール中の７Ｎアンモニア（約−２０℃にあらかじめ冷却）を添加した際、白色固体（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）の形成が観察された。隔離された条件下（ゴムセプタムで蓋、アルゴンは含まない）、０℃で約２．５時間、反応混合物を攪拌した。反応混合物をゆっくりと周囲温度にした。
【０１３６】
[00109]吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを用いて、未反応アンモニアおよび溶媒（メタノール）を除去した。溶媒を除去した際、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドがフラスコ中で結晶化した。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を反応混合物に添加し、そして結晶化したＮ−ヒドロキシスクシンイミドは、溶液から沈殿した。フリット・バックナー漏斗を通じてろ過することによって、結晶を除去した。吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを介して、ろ過した溶液からＴＨＦを除去した。１：９メタノール：酢酸エチルを溶出液として用いた、カラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物２４を精製し、収率は約５０〜６０％であった。
【０１３７】
実施例１４：スキーム６、工程５：脱保護
[00110]化合物２４、１．５ｇを清浄な２００ｍＬ 一口丸底反応フラスコ内に移した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そして低流量のアルゴンでおよそ１５分間パージした。清浄なシリンジを用いて、反応フラスコ内に４０ｍＬの無水エタノールを添加した。混合物を、アルゴン下、周囲温度で、約５分間攪拌し、そして次いで、１．４ｇのギ酸アンモニウムを固体粉末として反応フラスコ内に添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度で５分間攪拌し、その後、１０ｍＬの脱イオン水を添加した。ギ酸アンモニウムが完全に溶解するまで、アルゴン下、周囲温度でおよそ５分間、攪拌を続けた。１１０℃にあらかじめ加熱した油槽内に反応フラスコを浸し、そしてアルゴン下で約７時間攪拌した。
【０１３８】
[00111]１：９メタノール：酢酸エチルを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物２５を精製した。化合物２５の収率は５０〜７０％であった。
【０１３９】
実施例１５：スキーム６、工程６：活性化
[00112]化合物２５、１．９０ｇを、あらかじめ０℃に設定した循環サーモスタットに連結したジャケット型１００ｍＬ 一口丸底反応フラスコに移した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンをおよそ１５分間パージした。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、５ｍＬの無水ＤＭＦを反応フラスコに添加した。反応混合物を、アルゴン下、０℃で、さらに約１５分間攪拌した。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じてゆっくりと、反応フラスコ内に２ｍＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを添加した。反応混合物をアルゴン下、０℃で約１０分間攪拌した。
【０１４０】
[00113]１．９５ｇのＴＳＴＵ（Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−１，１，３，３−テトラメチルウランテトラフルオロボレート）を５ｍＬの無水ＤＭＦ中に完全に溶解した。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、生じた溶液を反応フラスコ内に添加した。反応混合物をアルゴン下、０℃でおよそ２．５時間攪拌した。
【０１４１】
[00114]吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（ＤＭＦ）を除去した。フラッシュクロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物２６を精製した。化合物２６収率は６０〜７０％であった。
【０１４２】
実施例１６：スキーム６、工程７：レベチラセタム免疫原の調製
[00115]８ｍｌ ｐＨ７．２ ＰＢＳ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）中の１６０ｍｇのキーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）の溶液を氷槽中で冷却した。約１１．８ｍＬのＤＭＳＯをＫＬＨ溶液に１滴ずつ添加して、そして室温未満で維持した。１．０ｍＬ ＤＭＳＯ中の３２ｍｇの化合物２６の溶液をＫＬＨ溶液に１滴ずつ添加して、反応混合物を形成した。反応混合物をおよそ４０時間、室温で攪拌させた。生じたＫＬＨ免疫原２７を透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れて、そして１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の３０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の１０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の５％ＤＭＳＯ中で、室温で連続透析し、その後、４℃で、ｐＨ７．２ ＰＢＳと４回交換した（各１Ｌで少なくとも各６時間）。
【０１４３】
実施例１７：スキーム６、工程７：レベチラセタム・コンジュゲートの調製
[00116]８ｍｌ ｐＨ７．２ ＰＢＳ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）中の４００ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液を氷槽中で冷却した。約１１．８ｍＬのＤＭＳＯをＢＳＡ溶液に１滴ずつ添加して、そして室温未満で維持した。１．０ｍＬ ＤＭＳＯ中の３２ｍｇの化合物２６の溶液を、ＢＳＡ溶液に１滴ずつ添加して、反応混合物を形成した。反応混合物を４０時間、室温で攪拌させた。生じたＢＳＡコンジュゲート、化合物２８を透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れて、そして１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の３０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の１０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の５％ＤＭＳＯ中で、室温で連続透析し、そして次いで、４℃で、ｐＨ７．２ ＰＢＳと４回交換した（各１Ｌで少なくとも各６時間）。
【０１４４】
実施例１８：スキーム７、工程１：アルキル化
[00117]化合物２９、Ｈ−Ｃｙｓ（ＯＢｚｌ）−ＯＭｅ（Ｂａｃｈｅｍ、カタログ番号Ｅ１５４５、ＣＡＳ番号１６７４１−８０−３）、４．５ｇを、清浄な１００ｍＬ 一口丸底フラスコ内に入れた。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンを１５分間パージした。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、２０ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを反応フラスコに添加した。反応混合物を、アルゴン下、周囲温度で、およそ１５分間攪拌した。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、１滴ずつ、２ｍＬの４−ブロモ酪酸エチルをフラスコに添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度で１０分間攪拌した。冷たい流水の水道水を伴うコンデンサーを反応フラスコ上に乗せ、そしてアルゴンラインをコンデンサーの最上部に設置した。７０℃にあらかじめ加熱した油槽内に反応フラスコを浸し、そしてアルゴン下で４０時間攪拌した。
【０１４５】
[00118]反応混合物を室温に冷却した。溶媒トラップを通じて真空ポンプに連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（ＤＭＦ）を除去した。蒸発装置コンデンサーコイル冷却剤（１：１エチレングリコール：水）をおよそ−１５℃にあらかじめ冷却した。１：３アセトン：クロロホルムを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物３０を精製した。単離された化合物３０収率は５０〜７０％であった。
【０１４６】
実施例１９：スキーム７、工程２：ラクタム化／環化
[00119]化合物３０、３．９ｇを清浄な１００ｍＬ 一口丸底フラスコ（反応フラスコ）に移した。フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしておよそ１５分間パージし、次いで、清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、１５ｍＬの無水トルエンを反応フラスコ内に添加した。反応混合物を、アルゴン下、周囲温度で、約１０分間攪拌し、次いで、０．３１ｇの２−ヒドロキシピリジンを固体粉末として反応フラスコ内に添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度でおよそ１０分間攪拌した。冷たい流水の水道水を伴うコンデンサーを反応フラスコ上に乗せた。アルゴンラインをコンデンサーの最上部に設置した。１２０℃にあらかじめ加熱した油槽内に反応フラスコを浸し、そして２−ヒドロキシピリジンが完全に溶解するまで、アルゴン下で１５時間攪拌した。
【０１４７】
[00120]反応混合物を室温に冷却した。吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（トルエン）を除去した。１：３ヘキサン：酢酸エチルを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物３１を精製した。化合物３１収率は５０〜７０％の範囲であった。
【０１４８】
実施例２０：スキーム７、工程３：加水分解
[00121]２．１ｇの化合物３１を清浄な１００ｍＬ 一口丸底反応フラスコ内に移した。反応フラスコに１０ｍＬのメタノールおよび１０ｍＬの脱イオン水を添加した。２００ｍｇのＬｉＯＨをフラスコに添加した。反応混合物を周囲温度で約４時間攪拌した。
【０１４９】
[00122]吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（メタノール、水）を除去した。１：１アセトン：酢酸エチルを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物３２を精製した。化合物３２収率は７０〜９０％の範囲であった。
【０１５０】
実施例２１：スキーム７、工程４：アミノリシス
[00123]化合物３２、１．８０ｇを、あらかじめ０℃に設定した循環サーモスタットに連結したジャケット型１００ｍＬ 一口丸底反応フラスコに移した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンをおよそ１５分間パージした。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、５ｍＬの無水アセトニトリルを反応フラスコに添加した。反応混合物を、アルゴン下、０℃で、さらに約１５分間攪拌した。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じてゆっくりと、反応フラスコ内に２ｍＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを添加した。反応混合物は、淡黄色からより深い黄色に変化した。反応混合物をアルゴン下、０℃で約１０分間攪拌した。
【０１５１】
[00124]１．８５ｇのＴＳＴＵ（Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−１，１，３，３−テトラメチルウランテトラフルオロボレート）を１０ｍＬの無水アセトニトリル中に完全に溶解した。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、生じた溶液を反応フラスコ内に添加し、そしてアルゴン下、０℃でおよそ２．５時間攪拌した。
【０１５２】
[00125]吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（アセトニトリル）を除去した。迅速分離を用いたフラッシュクロマトグラフィーを用いて、中間体を精製した。
【０１５３】
[00126]１．６２ｇの中間体を、あらかじめ０℃に設定した循環サーモスタットに連結した清浄なジャケット型１００ｍＬ 一口丸底反応フラスコに移した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンを約１５分間パージした。２０ｍＬのメタノール中の７Ｎアンモニア（約−２０℃にあらかじめ冷却）を添加した際、白色固体（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）の形成が観察された。隔離された条件下（ゴムセプタムで蓋、アルゴンは含まない）、０℃で２．５時間、反応混合物を攪拌した。反応混合物をゆっくりと周囲温度にした。
【０１５４】
[00127]吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを用いて、未反応アンモニアおよび溶媒（メタノール）を除去した。１：９メタノール：酢酸エチルを溶出液として用いた、カラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物３３を精製し、収率は約５０〜６０％であった。
【０１５５】
実施例２２：スキーム７、工程５：脱保護
[00128]化合物３３、１．５１ｇを清浄な２００ｍＬ 一口丸底反応フラスコ内に移した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そして低流量のアルゴンでおよそ１５分間パージした。清浄なシリンジを用いて、反応フラスコ内に４０ｍＬの無水エタノールを添加した。混合物を、アルゴン下、周囲温度で、約５分間攪拌し、そして次いで、１．４ｇのギ酸アンモニウムを固体粉末として反応フラスコ内に添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度で５分間攪拌し、その後、１０ｍＬの脱イオン水を添加した。ギ酸アンモニウムが完全に溶解するまで、アルゴン下、周囲温度でおよそ５分間、攪拌を続けた。１１０℃にあらかじめ加熱した油槽内に反応フラスコを浸し、そしてアルゴン下で約７時間攪拌した。
【０１５６】
[00129]１：９メタノール：酢酸エチルを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物３４を精製した。化合物３４の収率は５０〜７０％であった。
【０１５７】
実施例２３：スキーム７、工程７：レベチラセタム免疫原の調製
[00130]３ｍｌ ｐＨ７．２ ＰＢＳ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）中の６０ｍｇのキーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）の溶液を氷槽中で冷却した。一方の端にＮＨＳエステルおよびもう一方の端にマレイミド基を含有するヘテロ二官能性架橋剤である１０．２ｍｇのｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を、０．５ｍＬ ＤＭＳＯ中に溶解し、そしてＭＢＳ溶液を氷槽中で冷却しながらＫＬＨ溶液に１滴ずつ添加した。反応混合物を氷槽中で４時間攪拌した。ＰＤ−１０脱塩カラムを介してＫＬＨ−ＭＢＳコンジュゲートを精製した（過剰なＭＢＳを除去するため）。
【０１５８】
[00131]１０．２ｍｇの化合物３４を０．５ｍＬ ＤＭＳＯ中に溶解し、そして生じた溶液を氷槽中で冷却しながら、精製ＫＬＨ−ＭＢＳ溶液に１滴ずつ添加した。混合物を室温で２時間攪拌した。生じた免疫原、化合物３７を透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れて、そして１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の３０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の１０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の５％ＤＭＳＯ中で、室温で連続透析し、その後、４℃で、ｐＨ７．２ ＰＢＳと４回交換した（各１Ｌで少なくとも各６時間）。
【０１５９】
実施例２４：スキーム７、工程８：レベチラセタム・コンジュゲートの調製
[00132]５ｍｌ ｐＨ７．２ ＰＢＳ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）中の１００ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液を氷槽中で冷却する。１０．２ｍｇのＭＢＳを、０．５ｍＬ ＤＭＳＯ中に溶解し、そして次いでＭＢＳ溶液を氷槽中で冷却しながらＢＳＡ溶液に１滴ずつ添加した。反応混合物を氷槽中で４時間攪拌させた。ＰＤ−１０脱塩カラムを介してＢＳＡ−ＭＢＳコンジュゲートを精製した（過剰なＭＢＳを除去するため）。
【０１６０】
[00133]１２．３ｍｇの化合物３４を０．５ｍＬ ＤＭＳＯ中に溶解し、そして生じた溶液を氷槽中で冷却しながら、精製ＢＳＡ−ＭＢＳ溶液に１滴ずつ添加した。混合物を室温で２時間攪拌した。生じたコンジュゲート、化合物３８を透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れて、そして１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の３０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の１０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の５％ＤＭＳＯ中で、室温で連続透析し、その後、４℃で、ｐＨ７．２ ＰＢＳと４回交換した（各１Ｌで少なくとも各６時間）。
【０１６１】
実施例２５：スキーム８、工程１：求核アシル付加
[00134]２１０ｍｇの化合物３９、ＦＭＯＣ−Ｐｒｏ−ＯＨ（Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−プロリン、Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号３３８３４−６）、７０ｍｇ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および２ｍＬ無水ＤＭＦを、磁気スターラーとともに１００ｍＬ丸底フラスコ中に入れた。混合物を氷冷メタノール槽上で冷却し、そして０．２ｍＬの３．５Ｍ ＤＣＣ（ＤＭＦ中のジシクロヘキシルカルボジイミド）で処理した。反応混合物をアルゴン下で１５分間、氷冷メタノール槽中で攪拌し、そしてさらに０．１ｍＬのＤＣＣ溶液を添加した。混合物をゆっくりと室温にしながら、そして次いで、アルゴン下、室温で一晩、攪拌した。
【０１６２】
[00135]１ｍＬのＮ−ベンジルエチレンジアミンおよび５ｍＬ無水ＤＭＦを、磁気スターラーとともに反応フラスコ中に入れた。フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンを約１５分間パージした。ＤＭＦ溶液中の活性化されたＦＭＯＣ−Ｐｒｏ−ＯＨを、シリンジを介して、ＤＭＦ溶液中のＮ−ベンジルエチレンジアミンにゆっくりと添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度でさらに６時間攪拌した。
【０１６３】
[00136]溶媒トラップを通じて真空ポンプに連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（ＤＭＦ）を除去した。蒸発装置コンデンサーコイル冷却剤（１：１エチレングリコール：水）をおよそ−１５℃にあらかじめ冷却した。１：９ヘキサン：クロロホルムを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物４０を精製した。単離された化合物４０収率は６０〜７０％であった。
【０１６４】
実施例２６：スキーム８、工程２：脱保護
[00137]化合物４０、２００ｍｇを清浄な１００ｍＬ 一口丸底フラスコ（反応フラスコ）に移した。１０ｍＬの無水ＤＭＦおよび５ｍＬピペリジンを反応フラスコ内に添加して、そして反応混合物をアルゴン下、周囲温度で４時間攪拌した。
【０１６５】
[00138]吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（ＤＭＦ、ピペリジン）を除去した。２：８メタノール：塩化メチレン（ジクロロメタン）を溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物４１を精製した。化合物４１収率は５０〜７０％の範囲であった。
【０１６６】
実施例２７：スキーム８、工程３：アルキル化
[00139]化合物４１を、清浄な１００ｍＬ 一口丸底フラスコに入れた。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンを１５分間パージした。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、２０ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを反応フラスコに添加し、そして反応混合物を、アルゴン下、周囲温度で、さらに１５分間攪拌した。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、１滴ずつ、２ｍＬの２−ブロモ酪酸エチルをフラスコに添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度で１０分間攪拌した。冷たい流水の水道水を伴うコンデンサーを反応フラスコ上に乗せ、そしてアルゴンラインをコンデンサーの最上部に設置した。７０℃にあらかじめ加熱した油槽中に反応フラスコを浸し、そしてアルゴン下で４０時間攪拌した。
【０１６７】
[00140]反応混合物を室温に冷却した。溶媒トラップを通じて真空ポンプに連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（ＤＭＦ）を除去した。蒸発装置コンデンサーコイル冷却剤（１：１エチレングリコール：水）をおよそ−１５℃にあらかじめ冷却した。１：３アセトン：クロロホルムを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物４２を精製した。単離された化合物４２収率は５０〜７０％であった。
【０１６８】
実施例２８：スキーム８、工程４：脱保護
[00141]２０ｍＬの濃水酸化アンモニウムに、２．０ｇの化合物４２および０．１ｇ塩化アンモニウムを添加した。混合物を１００℃で攪拌しながらおよそ７時間加熱し、そして次いで室温に冷却した。生じた沈殿物をろ過し、そして水およびジエチルエーテルを洗浄した。中間体の収率は６０〜７０％であった。
【０１６９】
[00142]１．０ｇの中間体を、清浄な１００ｍＬ 一口丸底反応フラスコ内に移した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そして低流量のアルゴンでおよそ１５分間パージした。清浄なシリンジを用いて、反応フラスコに２０ｍＬの無水エタノールを添加した。混合物を、アルゴン下、周囲温度で、約５分間攪拌し、そして次いで、０．８ｇのギ酸アンモニウムを固体粉末として反応フラスコ内に添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度で５分間攪拌し、その後、５ｍＬの脱イオン水を添加した。ギ酸アンモニウムが完全に溶解するまで、アルゴン下、周囲温度でおよそ５分間、攪拌を続けた。１１０℃にあらかじめ加熱した油槽内に反応フラスコを浸し、そしてアルゴン下で約７時間攪拌した。
【０１７０】
[00143]１：９メタノール：酢酸エチルを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物４３を精製した。単離された所望の生成物の収率はおよそ５０％であった。
【０１７１】
実施例２９：スキーム８、工程５：レベチラセタム免疫原の調製
[00144]８ｍｌ ｐＨ７．２ ＰＢＳ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）中の１６０ｍｇのＫＬＨの溶液を氷槽中で冷却した。約１２ｍＬのＤＭＳＯをＫＬＨ溶液に１滴ずつ添加し、そして室温未満に維持した。
【０１７２】
[00145]１．０ｍＬ無水ＤＭＦ中の２９ｍｇの化合物４３の溶液を０．２ｍＬ無水Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンに添加した。別個の丸底フラスコに、４８ｍｇのＣＤＩ（カルボニルジイミダゾール）および１ｍＬ無水ＤＭＦを添加した。
【０１７３】
[00146]約１０分間の期間に渡って、シリンジを介して１滴ずつ、化合物４３を含有する溶液をＣＤＩ／ＤＭＦ溶液に添加し、そして次いで、氷槽中でおよそ５時間攪拌した。
[00147]シリンジを用いて、化合物４３／ＣＤＩ溶液をＫＬＨ溶液に１滴ずつ２０分間に渡って添加した。混合物を２〜８℃で一晩攪拌した。生じた免疫原、化合物４４を透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れて、そして１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の３０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の１０％ＤＭＳＯ中で、４℃で連続透析し、その後、ｐＨ７．２ ＰＢＳと４回交換した（各１Ｌで少なくとも各６時間）。
【０１７４】
実施例３０：スキーム８、工程６：レベチラセタム・コンジュゲートの調製
[00148]２５ｍｌ ｐＨ７．２ ＰＢＳ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）中の４００ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液を氷槽中で冷却した。約１６ｍＬのＤＭＳＯをＫＬＨ溶液に１滴ずつ添加して、そして室温未満で維持した。
【０１７５】
[00149]１．０ｍＬ無水ＤＭＦ中の２８ｍｇの化合物４３の溶液を０．２ｍＬ無水Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンに添加した。別個の丸底フラスコに、４８ｍｇのＣＤＩ（カルボニルジイミダゾール）および１ｍＬ無水ＤＭＦを添加した。
【０１７６】
[00150]１０分間の期間に渡って、シリンジを介して１滴ずつ、化合物４３を含有する溶液をＣＤＩ／ＤＭＦ溶液に添加し、そして次いで、氷槽中で約５時間攪拌した。
[00151]次いで、シリンジを用いて、溶液をタンパク質溶液に１滴ずつ２０分間に渡って添加した。混合物を２〜８℃で一晩攪拌した。生じたレベチラセタム・コンジュゲート、化合物４５を透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れて、そして１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の３０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の１０％ＤＭＳＯ中で、４℃で連続透析し、その後、ｐＨ７．２ ＰＢＳと４回交換した（各１Ｌで少なくとも各６時間）。
【０１７７】
実施例３１：スキーム９、工程１：求核アシル付加
[00152]２０５ｍｇの化合物４６、ＢＯＣ−Ｐｒｏ−ＯＨ（Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−プロリン、Ｂａｃｈｅｍカタログ番号Ａ−２２３５、７０ｍｇ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および２ｍＬ無水ＤＭＦを、磁気スターラーとともに１００ｍＬ丸底フラスコ中に入れた。混合物を氷冷メタノール槽上で冷却し、そして０．２ｍＬの３．５Ｍ ＤＣＣ（ＤＭＦ中のジシクロヘキシルカルボジイミド）で処理し、そして次いで、アルゴン下で１５分間氷冷メタノール槽中で攪拌し、その後、さらに０．１ｍＬのＤＣＣ溶液を添加した。反応混合物をゆっくりと室温にしながら攪拌を続けた。反応混合物を、アルゴン下、室温で一晩、攪拌した。
【０１７８】
[00153]１ｍＬのＮ−ベンジルエチレンジアミンおよび５ｍＬ無水ＤＭＦを、磁気スターラーとともに反応フラスコ中に入れた。フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンを１５分間パージした。ＤＭＦ溶液中の活性化されたＦＭＯＣ−Ｐｒｏ−ＯＨを、シリンジを介して、ＤＭＦ溶液中のＮ−ベンジルエチレンジアミンにゆっくりと添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度でさらに６時間攪拌した。
【０１７９】
[00154]溶媒トラップを通じて真空ポンプに連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（ＤＭＦ）を除去した。蒸発装置コンデンサーコイル冷却剤（１：１エチレングリコール：水）をおよそ−１５℃にあらかじめ冷却した。１：９ヘキサン：クロロホルムを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物４７を精製した。単離された化合物４７収率は６５〜７５％であった。
【０１８０】
実施例３２：スキーム９、工程２：脱保護
[00155]２００ｍｇの化合物４７を清浄な１００ｍＬ 一口丸底反応フラスコ内に移した。清浄なメスシリンダーを用いて、反応フラスコに２５ｍＬのジクロロメタンを添加した。反応混合物を周囲温度で約５分間攪拌し、清浄なメスシリンダーを用いて、２５ｍＬのトリフルオロ酢酸を反応フラスコ内に添加した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そして周囲温度でおよそ４時間攪拌した。
【０１８１】
[00156]吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（ジクロロメタン）を除去した。２：８メタノール：塩化メチレン（ジクロロメタン）を溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物４１を精製した。化合物４１収率は５０〜７０％の範囲であった。
【０１８２】
実施例３３：スキーム８、工程３：アルキル化
[00157]化合物４１を、清浄な１００ｍＬ 一口丸底フラスコ内に入れた。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンを１５分間パージした。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、２０ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを反応フラスコに添加し、そして反応混合物を、アルゴン下、周囲温度で、さらに１５分間攪拌した。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、１滴ずつ、２ｍＬの２−ブロモ酪酸エチルをフラスコに添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度で１０分間攪拌した。冷たい流水の水道水を伴うコンデンサーを反応フラスコ上に乗せ、そしてアルゴンラインをコンデンサーの最上部に設置した。７０℃にあらかじめ加熱した油槽中に反応フラスコを浸し、そしてアルゴン下で４０時間攪拌した。
【０１８３】
[00158]反応混合物を室温に冷却した。溶媒トラップを通じて真空ポンプに連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（ＤＭＦ）を除去した。蒸発装置コンデンサーコイル冷却剤（１：１エチレングリコール：水）をおよそ−１５℃にあらかじめ冷却した。１：３アセトン：クロロホルムを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物４２を精製した。単離された化合物４２収率は５０〜７０％であった。
【０１８４】
実施例３４：スキーム８、工程４：脱保護
[00159]２０ｍＬの濃水酸化アンモニウムに、２．０ｇの化合物４２および０．１ｇ塩化アンモニウムを添加した。混合物を１００℃で攪拌しながらおよそ７時間加熱し、そして次いで室温に冷却した。生じた沈殿物をろ過し、そして水およびジエチルエーテルで洗浄した。中間体の収率は６０〜７０％であった。
【０１８５】
[00160]１．０ｇの中間体を、清浄な１００ｍＬ 一口丸底反応フラスコ内に移した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そして低流量のアルゴンでおよそ１５分間パージした。清浄なシリンジを用いて、反応フラスコに２０ｍＬの無水エタノールを添加した。混合物を、アルゴン下、周囲温度で、約５分間攪拌し、そして次いで、０．８ｇのギ酸アンモニウムを固体粉末として反応フラスコ内に添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度で５分間攪拌し、その後、５ｍＬの脱イオン水を添加した。ギ酸アンモニウムが完全に溶解するまで、アルゴン下、周囲温度でおよそ５分間、攪拌を続けた。１１０℃にあらかじめ加熱した油槽内に反応フラスコを浸し、そしてアルゴン下で約７時間攪拌した。
【０１８６】
[00161]１：９メタノール：酢酸エチルを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物４３を精製した。単離された所望の生成物の収率はおよそ５０％であった。
【０１８７】
実施例３５：スキーム８、工程５：レベチラセタム免疫原の調製
[00162]８ｍｌ ｐＨ７．２ ＰＢＳ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）中の１６０ｍｇのＫＬＨの溶液を氷槽中で冷却した。約１２ｍＬのＤＭＳＯをＫＬＨ溶液に１滴ずつ添加し、そして室温未満に維持した。
【０１８８】
[00163]１．０ｍＬ無水ＤＭＦ中の２９ｍｇの化合物４３の溶液を０．２ｍＬ無水Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンに添加した。別個の丸底フラスコに、４８ｍｇのＣＤＩ（カルボニルジイミダゾール）および１ｍＬ無水ＤＭＦを添加した。
【０１８９】
[00164]約１０分間の期間に渡って、シリンジを介して１滴ずつ、化合物４３を含有する溶液をＣＤＩ／ＤＭＦ溶液に添加し、そして次いで、氷槽中でおよそ５時間攪拌した。
[00165]シリンジを用いて、化合物４３／ＣＤＩ溶液をＫＬＨ溶液に１滴ずつ２０分間に渡って添加した。混合物を２〜８℃で一晩攪拌した。生じた免疫原、化合物４４を透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れて、そして１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の３０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の１０％ＤＭＳＯ中で、４℃で連続透析し、そしてその後、ｐＨ７．２ ＰＢＳと４回交換した（各１Ｌで少なくとも各６時間）。
【０１９０】
実施例３６：スキーム８、工程６：レベチラセタム・コンジュゲートの調製
[00166]２５ｍｌ ｐＨ７．２ ＰＢＳ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）中の４００ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液を氷槽中で冷却した。約１６ｍＬのＤＭＳＯをＫＬＨ溶液に１滴ずつ添加して、そして室温未満で維持した。
【０１９１】
[00167]１．０ｍＬ無水ＤＭＦ中の２８ｍｇの化合物４３の溶液を０．２ｍＬ無水Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンに添加した。別個の丸底フラスコに、４８ｍｇのカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）および１ｍＬ無水ＤＭＦを添加した。
【０１９２】
[00168]１０分間の期間に渡って、シリンジを介して１滴ずつ、化合物４３を含有する溶液をＣＤＩ／ＤＭＦ溶液に添加し、そして次いで、氷槽中で約５時間攪拌した。
[00169]次いで、シリンジを用いて、溶液をタンパク質溶液に１滴ずつ２０分間に渡って添加した。混合物を２〜８℃で一晩攪拌した。生じたレベチラセタム・コンジュゲート、化合物４５を透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れて、そして１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の３０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の１０％ＤＭＳＯ中で、４℃で連続透析し、その後、ｐＨ７．２ ＰＢＳと４回交換した（各１Ｌで少なくとも各６時間）。
【０１９３】
実施例３７：抗体産生
[00170]上述のように、免疫原を用いて、ＬＥＶと特異的に結合するポリクローナル抗体を調製する。より具体的には、ＫＬＨ免疫原性部分を有する免疫原１８ａ、２７、３７、および４４を用いて、抗レベチラセタム・ポリクローナル抗体を生成する。約０．５ｍＬの免疫原含有組成物を、約０．５ｍＬのフロイントのアジュバントと混合することによって、免疫原性組成物を調製する。次いで、生じた１ｍＬ免疫原性カクテルを動物、例えばヒツジ、ヤギ、ウサギまたは他の哺乳動物に注射する。抗レベチラセタム・ポリクローナル抗体産生を誘導するため、同様の免疫原性カクテルを用いた続く免疫原性注射を、およそ４週間ごとに動物に投与する。
【０１９４】
[00171]抗体組成物には、少なくとも１つの結合ドメインを有する抗レベチラセタム抗体が含まれてもよく、ここで、抗体は、患者標本中に存在するＬＥＶに結合可能であるか、またはＬＥＶ誘導体に結合可能である。また、抗体は、少なくとも約１：５，０００、または少なくとも約１：１０，０００、または少なくとも約１：５０，０００、または少なくとも約１：１００，０００、または少なくとも約１：３００，０００の力価で存在しうる。アッセイ条件に応じて、１：５，０００程度に低いかまたは１：３００，０００程度に高い抗体力価を有することが好ましい可能性もある。
【０１９５】
[00172]さらに、抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよい。抗体は、均一、不均一、またはその他の免疫診断アッセイで使用するのに十分である、ＬＥＶに比較したＬＥＶ誘導体に対するアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つを有してもよい。こうしたものとして、抗体およびＬＥＶ誘導体間の相互作用は、患者標本中に存在するＬＥＶに対する抗体のアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つの少なくとも５０％、さらにより好ましくは、ＬＥＶに対する抗体のアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つの少なくとも７０％、最も好ましくは、ＬＥＶに対する抗体のアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つの少なくとも９０％であってもよい。場合によって、ＬＥＶ誘導体に対する抗体のアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つは、ＬＥＶに対するものと実質的に同じである。
【０１９６】
実施例３８：抗体力価の決定
[00173]当該技術分野に知られるようなＥＬＩＳＡイムノアッセイにおける成績によって、抗体をスクリーニングした。ＥＬＩＳＡアッセイに用いるためのマルチウェルプレートを調製して、実施例３７に記載するように調製したポリクローナル抗体を試験した。抗レベチラセタム抗体に曝露する前に、異なるマルチウェルプレート中のウェルの底にＬＥＶ誘導体をコーティングすることによって、レベチラセタム誘導体、すなわち化合物１８ｂおよび１９を、抗体に結合するための抗原として用いた。より具体的には、レベチラセタム誘導体をコーティング緩衝液中で希釈し、そして次いでマルチウェルプレートのウェルに添加した。３７℃で約６０分間インキュベーションした後、コーティング緩衝液中の溶媒をデカントし、そしてＢＳＡまたはカゼインを含有するブロッキング緩衝液をプレートに添加した。プレートを再び３７℃で６０分間インキュベーションし、そしてブロッキング緩衝液中の溶媒をプレートからデカントした。いくつかのＥＬＩＳＡプレートは、調製後、数時間以内に使用されたが、他のものは、ウェル中にブロッキング溶液を含んだまま、２〜８℃で最長１週間保存された。
【０１９７】
[00174]上記のように調製したＥＬＩＳＡプレートを用いて、実施例３７にしたがって、特に免疫原１８ａを用いて調製したポリクローナル抗体に関する抗体力価を決定した。１：１０〜１：２０００の間、１０倍増分の抗体の連続希釈を、ｐＨ７．４であり、そして０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で調製した。１００μＬ体積の各希釈をＥＬＩＳＡプレート上の別個のウェルに添加した。プレートを３７℃でおよそ６０分間インキュベーションし、そしてｐＨ７．４で０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む２５０μＬのＰＢＳで３回洗浄した。次に、ｐＨ７．４であり、そして０．１％ＢＳＡを含有する１２５μＬのＰＢＳ中の酵素コンジュゲート化二次抗体（抗ヒツジＩｇＧ抗体）をプレートの各ウェルに添加した。あるいは、抗レベチラセタム抗体を酵素または他の検出可能標識に直接コンジュゲート化してもよく、そして酵素標識二次抗体を添加する工程を除いてもよい。プレートを３７℃でおよそ６０分間インキュベーションした。プレートのウェルを上述のように洗浄した。洗浄後、約１２５μＬのＡＢＴＳ基質を各ウェルに添加し、そしてマルチウェルプレートを再び２０分間インキュベーションした。４０５ｎｍの波長でマルチウェルプレート読み取り装置を用いて吸光度値を得て、そして力価値を計算した。力価結果を表３に提供する。
【０１９８】
表３
【０１９９】
【表３】
【０２００】
実施例３９：抗体アビディティの決定
[00175]結合阻害研究によって、免疫原１８ａを用いて調製した抗レベチラセタム抗体の、多様なレベチラセタム誘導体に対するアビディティを決定した。ｐＨ７．４で０．１％ＢＳＡを含む１ｍＬのＰＢＳ中で試料を調製した。３０％Ｂｍａｘ力価または５０％Ｂｍａｘ力価を有する組成物を用いて、実施例３８で得られるような力価値を、およそ半分の力価値にした。３０％Ｂｍａｘを用いて、試料調製段階中、１：１００００の抗体力価を１：５０００に希釈した。異なる濃度またはキャリブレーター値（０、５、１０、２０、４０、８０μｇ／ｍｌ）の約５０μＬのレベチラセタムを実施例３８にしたがって調製されるようなプレートに適用した。約５０μＬの希釈抗体をプレート内に分配して、そしてプレート中の組成物を水平プレート振盪装置上で１分間混合した。プレートの第一列には、レベチラセタムもまた抗レベチラセタム抗体も添加せず、これは陰性対照として働いた。抗レベチラセタム抗体を含むがレベチラセタムを含まない第二列を陽性対照として用いた。プレートを６０分間インキュベーションし、そしてｐＨ７．４で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２５０μＬのＰＢＳで３回洗浄した。約１２５μＬの例えばｐＨ７．４のＰＢＳ中の希釈誘導体、例えば１８ｂまたは１９をプレートの各ウェルに添加した。プレートを３７℃で６０分間インキュベーションし、そして上述のように洗浄した。およそ１２５μＬのＡＢＴＳ基質をプレートの各ウェルに添加し、そして２０分間インキュベーションした。４０５ｎｍでマルチウェルプレート読み取り装置を用いて、吸光度値を得て、そして結果を表４に提供する。
【０２０１】
表４
【０２０２】
【表４】
【０２０３】
[00176]本明細書において、用語「ハプテン」は、部分的または不完全抗原を指すよう意味され、そして小分子または薬剤であることも可能である。また、ハプテンは、タンパク質不含またはポリペプチド不含物質である低分子量分子であることも可能である。通常、ハプテンは、単独で抗体形成を刺激することは不可能であるが、抗体と相互作用することは可能でありうる。したがって、本発明にしたがったＬＥＶおよびＬＥＶ誘導体はハプテンであることも可能である。
【０２０４】
[00177]本明細書において、用語「類似体」または「誘導体」は、１またはそれより多い化学反応によって、親化合物または分子から作製される化学化合物または分子を指すよう意味される。こうしたものとして、類似体は、ＬＥＶの構造に類似であるかまたはＬＥＶ骨格に基づくが、特定の構成要素または構造的組み立てに関して、ＬＥＶと異なる構造を持つ化合物であってもよく、代謝的に類似の作用または反対の作用を有することも可能である。本発明記載のＬＥＶの類似体または誘導体を用いて、類似体およびＬＥＶの両方を認識する抗体との結合に関して競合させることも可能である。また、類似体には、リンカー基を通じて、ＬＥＶにカップリングした作用基が含まれることも可能である。
【０２０５】
[00178]本明細書において、用語「抗原」は、抗体または別の免疫系構成要素によって認識されることが可能な分子を指すよう意味される。
[00179]本明細書において、用語「免疫原」および「免疫原性」は、生物において、免疫応答を産生するかまたは生成することが可能な物質を指すよう意味される。免疫原は、一般的に、特定のタイプの抗原であると見なされる。別の言い方をすると、免疫原は免疫応答を誘導可能であり、一方、抗原は、ひとたび作製されたならば、免疫応答の生成物と組み合わさることが可能である。こうしたものとして、免疫原はまた、抗原でもありうる。通常、免疫原は、かなり高い分子量（例えば１０，０００ダルトンより大きい）を有し、したがって、本発明記載の免疫原を形成するため、タンパク質、リポタンパク質、多糖、いくつかの核酸、および特定のタイコ酸などの多様な巨大分子をハプテンにカップリングしてもよい。
【０２０６】
[00180]本明細書において、用語「免疫原性」は、分子が免疫応答を誘導する能力を指すよう意味され、これは、注射される分子に固有の化学構造によって、そして宿主動物が化合物を認識可能であるかどうかによっての両方で決定される。抗原の構造における小さい変化が、化合物の免疫原性を非常に改変することも可能であり、そしてこうした変化は、特に、よく保存されている抗原に対する抗体が作製される見込みを増加させる一般的な方法として、広範囲に用いられてきた。例えば、これらの修飾技術は、免疫原の領域を改変して、Ｔ細胞結合のためによりよい部位を提供するか、またはＢ細胞結合のために新規のエピトープを暴露するかいずれかである。
【０２０７】
[00181]本明細書において、用語「キャリアー」、「免疫原性部分」、または「免疫原性キャリアー」は、ハプテンにカップリング可能な免疫原性物質、一般的にはタンパク質である、作用基を指すよう意味される。ハプテンにカップリングした免疫原性部分は、免疫応答を誘導可能であり、そしてハプテンと特異的に結合可能な抗体の産生を誘発可能である。免疫原性部分は、異質（ｆｏｒｅｉｇｎ）と認識され、そしてしたがって宿主から免疫学的応答を誘発する、タンパク質、ポリペプチド、糖タンパク質、複合多糖、粒子、核酸、ポリヌクレオチド等を含む作用基である。さらに、リンカーは、修飾または非修飾ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリマー、糖および他の炭水化物、例えばポリエチレングリコールなどのポリエーテル、ポリアルコール、ポリプロピレン、プロピレングリコール、エチレンおよびプロピレングリコールの混合物、ポリアルキルアミン、スペルミジンなどのポリアミン、ポリ（アクリル酸エチル）などのポリエステル、ポリホスホジエステル、およびアルキレンを含むことも可能である。作用基およびそのリンカーの例は、コレステロール−ＴＥＧ−ホスホロアミダイトであり、ここでコレステロールは作用基であり、そしてテトラエチレングリコールおよびホスフェートがリンカーとして働く。
【０２０８】
[00182]１つの例において、作用基は、免疫原性を刺激し、そしてハプテンに対する抗体形成を刺激するため、ハプテンにカップリングさせることが可能な、免疫原性キャリアーである。通常、免疫原性キャリアーは、非常に免疫原性であり、そしてハプテンに対して免疫原性を与えることが可能な、巨大分子である。例えば、異質のタンパク質は、こうした免疫学的応答を誘発可能であるため、タンパク質を免疫原性キャリアーとして使用することも可能である。タンパク質キャリアーは高溶解性であることも可能であり、そしてハプテン分子との容易なコンジュゲート化を促進可能な官能基を含むことも可能である。今日用いられている最も一般的なキャリアータンパク質のいくつかは、キーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ；ＭＷ ４５０，０００〜１３，０００，０００）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＭＷ ６７，０００）である。キーホールリンペット・ヘモシアニンは、海生キーホールリンペットの酸素運搬タンパク質であり、そして非常に巨大であり、そして解離させてサブユニットにすると、増加した免疫原性を示すが、これはおそらく、さらなるエピトープ部位が免疫系に曝露されるためである。ＢＳＡは、コンジュゲート化に適した多くの官能基を含有する、高溶解性のタンパク質である。
【０２０９】
[00183]本明細書において、用語「抗体」は、体における異質の分子の存在に応答して産生されるタンパク質を指すよう意味される。これらは、抗原、および特殊化細胞または免疫系のタンパク質の両方に結合する能力によって、特徴付け可能である。抗体は、５つのクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤに分けられ、そして形質細胞によって産生される免疫グロブリンである。
【０２１０】
[00184]本明細書において、用語「エピトープ」は、抗体と相互作用する抗原の領域を定義するよう意味される。したがって、抗原である分子または他の物質には、抗体活性を伴う少なくとも１つのエピトープが含まれうる。これは、抗原が、同じ抗体または異なる抗体によって認識される多様なエピトープを有することを許容しうる。また、エピトープは任意の特定の構造の固有の特性ではないが、抗体と相互作用する結合部位として定義することも可能である。
【０２１１】
[00185]本明細書において、用語「アフィニティ」は、エピトープおよび抗体間の結合の強度の測定値を指すよう意味される。したがって、単一の抗体は、多様なエピトープに対して、異なるアフィニティを有することも可能である。これは、単一の抗体が、１つのエピトープに強く結合し、そして別のエピトープにより弱く結合することを許容しうる。こうしたものとして、抗体は、ＬＥＶなどの薬剤に対する第一のアフィニティを有し、そしてＬＥＶ誘導体に対する第二のアフィニティを有することも可能である。しかし、抗体が、ＬＥＶおよびＬＥＶ誘導体の両方に実質的に同等なまたは類似のアフィニティを有することが可能であり、これは、類似体を用いて、ＬＥＶに対する抗体を生成し、そして競合的結合研究において使用することを許容する。したがって、本発明記載のＬＥＶ誘導体を用いて、ＬＥＶに対するアフィニティを持つ抗体を生成することも可能である。
【０２１２】
[00186]本明細書において、用語「アビディティ」は、抗体および抗原間の複合体の全体の安定性の測定値を指すよう意味される。抗体−抗原相互作用の全体の安定性は、以下のような３つの主な要因によって支配されうる：（ａ）エピトープに対する抗体の固有のアフィニティ；（ｂ）抗体および抗原の価数；および（ｃ）相互作用構成要素の幾何学的配置。こうしたものとして、前述のパラメーターならびに他のパラメーターを変化させることによって、抗体−抗原複合体のアビディティを調節することも可能である。
【０２１３】
[00187]本明細書において、用語「特異性」は、他の利用可能なエピトープと比較した、エピトープと抗体の優先的な結合を指すよう意味される。すなわち、抗体の特異性は、ＬＥＶ代謝物ではなく、ＬＥＶおよび／または類似体に優先的に結合可能である。これを用いて、不都合な抗体−代謝物結合が混入しないようにして、ＬＥＶの真の濃度を評価可能であるように、代謝物よりもＬＥＶと優先的に結合する、抗ＬＥＶ抗体を生成することも可能である。また、ＬＥＶとの結合に関する抗体の特異性を用いて、ＬＥＶと類似かまたは実質的に同じ特異性を持つ類似体を仕立てることも可能である。
【０２１４】
[00188]本明細書において、用語「ポリクローナル抗体」は、所定の抗原またはエピトープに対して、広い範囲の特異性およびアフィニティを持つ抗体の異種混合物を指すよう意味される。したがって、ポリクローナル抗体には、各々他のものと区別可能であり、抗原と結合するかまたは別の方式で相互作用する、複数の抗体が含まれうる。エピトープを有する免疫原を動物内に注射し、そして適切な時間が経過した後、関心対象の抗体を含有する血液分画を収集し、そして場合によって精製することによって、ポリクローナル抗体を含む異なる抗体を産生するかまたは生成することも可能である。抗体を産生する際、ポリクローナル抗体に関して、最終的な使用について、いくつかのパラメーターを考慮してもよい。これらのパラメーターには以下のものが含まれる：（１）抗体の特異性（すなわち抗原間を区別する能力）；（２）抗体のアビディティ（すなわちエピトープに結合する強度）；および（３）アッセイ系における抗体の最適な希釈を決定する、抗体の力価。
【０２１５】
[00189]本明細書において、用語「モノクローナル抗体」は、通常の抗体産生細胞および１つの前駆細胞の培養物から単離された抗体を指すよう意味される。モノクローナル抗体は、均一な結合定数を有することが可能であり、そして当該技術分野に周知である。
【０２１６】
[00190]本明細書において、「抗体力価」は、血清希釈の逆数を指すよう意味される。より好適な報告および形式化のため、この方式で力価を報告する。１／５００００の力価は、抗原が１：５００００の希釈である場合に、抗体が、一緒に結合した抗原のエピトープを有効に検出することを意味する。力価は、最大Ｏ．Ｄ．の約１０％を有する終点力価によって計算される。
【０２１７】
[00191]本明細書において、用語「イムノアッセイ」または「免疫診断」は、生物学的試料における特定の抗原または特定の抗体の少なくとも１つを同定し、および／または定量化するため、抗原および抗体間の結合を利用する実験技術を指すよう意味される。現在、３種のイムノアッセイがあり、以下のように説明される：（１）抗体捕捉アッセイ；（２）抗原捕捉アッセイ；および（３）２抗体サンドイッチアッセイ。さらに、新規イムノアッセイが開発され、そしてこうしたアッセイが本発明の類似体および抗体を使用可能であろうことが意図される。
【０２１８】
[00192]本明細書において、用語「競合的イムノアッセイ」は、既知の量の同定可能な抗原が、抗体との結合に関して、別の抗原と競合する、実験プロトコルを指すよう意味される。すなわち、既知の抗体と結合する既知の抗原を、その既知の抗体とも結合する別の抗原を含有すると推測される試料と合わせる。これは、該抗体上の結合部位に関して、既知の抗原および別の抗原の両方が競合することを許容する。例えば、抗ＬＥＶ抗体と結合するＬＥＶ誘導体を、ＬＥＶを含有すると推測される試料と合わせることも可能であり、そして類似体およびＬＥＶが、抗ＬＥＶ抗体との結合に関して競合することも可能である。次いで、抗体との結合に関する競合を用いて、試料中にＬＥＶが存在するかどうかを決定することも可能であり、そしてさらに、競合を用いて、試料中のＬＥＶの量を定量化することも可能である。
【０２１９】
[00193]本明細書において、用語「比濁検出」は、凝集した粒子によって散乱される光による、入射光の透過における強度の減少、または吸光度の増加の測定値を指すよう意味される。透過光の強度の減少は、より高い透過光出発バックグラウンド強度に対して測定される。通常、読み取りは、光源と一列になった検出装置で行われ、粒子の凝集が透過光を阻害する。したがって、ＬＥＶなどのターゲット分析物の存在を評価するための手段として、凝集の阻害または促進を用いることも可能である。比濁アッセイは、多様な臨床分析装置に容易に適応可能である。
【０２２０】
[00194]本明細書において、用語「微粒子凝集アッセイ」は、ターゲット分析物による微粒子の凝集を阻害する原理を用いるイムノアッセイを指すよう意味される。すなわち、凝集の減少は、ターゲット分析物の存在に起因する。例えば、ターゲット薬剤の誘導体が微粒子表面に共有結合し、および／または増感粒子はモノクローナル抗体によって凝集する。試料が遊離薬剤を含有する場合、凝集は薬剤濃度に比例して阻害され、これによって、薬剤濃度を吸光度と関連させる古典的な阻害曲線が導かれる。
【０２２１】
[00195]本明細書において、用語「作用基」は、リンカー基を通じてＬＥＶにカップリングした分子または巨大分子を指すよう意味される。作用基には、免疫原性部分、抗原部分、トレーサー部分等が含まれることも可能である。さらに、本明細書記載の化学的骨格中のＺ基が作用基である。こうしたものとして、作用基をＹリンカー基にカップリングさせて、そしてＬＥＶ誘導体にさらなる官能性を提供することも可能である。
【０２２２】
[00196]本明細書において、用語「活性エステル」または「活性化エステル」は、例えばペプチドおよびタンパク質などの化合物の遊離アミノ基と反応可能なエステル基を指すよう意味される。活性エステルには、活性脱離基に連結されたカルボキシル基が含まれることも可能である。しばしば、活性脱離基には、エステル酸素が含まれ、したがって活性脱離基はエステル酸素を取り除く。例えば活性エステルは、一級アミンによる置換に感受性であり、これによって、エステル酸素の除去およびアミド基の形成が生じる。活性エステルを形成する活性脱離基の例には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ｐ−ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾリル等が含まれる。したがって、用語「ＮＨＳ」の使用は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとして定義されるよう意味される。
【０２２３】
[00197]本明細書において、用語「標識」、「検出分子」または「トレーサー」は、検出可能シグナルを生じるかまたは生じるように誘導可能ないかなる作用基も指すよう意味される。標識をＬＥＶ、ＬＥＶ誘導体合成系出発物質および／または中間体、ＬＥＶ誘導体、ハプテン、分析物、免疫原、抗体、あるいは受容体または受容体に結合可能な分子などの別の分子にコンジュゲート化することも可能である。トレーサーの限定されない例には、放射性同位体、酵素、酵素断片、酵素基質、酵素阻害剤、補酵素、触媒、フルオロフォア、色素、化学発光剤、発光剤、増感剤、非磁気または磁気粒子、固体支持体、リポソーム、リガンド、受容体、ハプテン放射性同位体等が含まれる。本明細書に記載するように、例えば、ＬＥＶ誘導体合成出発物質および／または合成中間体を多様なトレーサー部分（例えばフルオロフォア）にカップリングして、これを、合成反応において、出発物質および生成物を追跡するために使用してもよい。また、本明細書にも記載するように、当該技術分野に周知の方法によって、ＬＥＶ誘導体を多様な標識にカップリングして、多様なイムノアッセイ形式において有用な多様な試薬を提供することもまた可能である。イムノアッセイの結果を検出するため、フルオロフォア、例えばフルオレセイン、放射標識、または化学発光基などの検出分子を、類似体にカップリングしてトレーサーを産生することも可能である。
【０２２４】
[00198]本明細書において、用語「連結基」または「リンカー」は、例えばＬＥＶ、ＬＥＶ誘導体、ハプテン、および作用基、例えば免疫原性部分、キャリアー、免疫原、標識、トレーサー等の２またはそれより多い下部構造を連結する化学構造部分を指すよう意味される。連結基は、下部構造間に渡る、水素（または他の一価の原子）以外の原子の少なくとも１つの中断されない鎖を有しうる。通常、連結基には、置換されていてもまたは置換されていなくてもよい炭素原子またはヘテロ原子の鎖が含まれる。連結基の原子および連結基内の鎖の原子は、化学的結合によって相互連結可能である。例えば、リンカーは直鎖または分枝鎖、置換または非置換、飽和または不飽和鎖であることも可能であり、鎖の原子には炭素および／またはへテロ原子が含まれることも可能である。これには、鎖内または鎖末端の１またはそれより多いヘテロ原子も含まれうる。さらに、連結基にはまた、鎖の一部として、または鎖中の原子の１つに対する置換として、環状基および／または芳香族基も含まれてもよい。連結されている下部構造間の最短経路である、鎖の主鎖において、水素以外の原子の数を数えることによって、連結基またはリンカー中の原子の数を決定する。ハプテンをトレーサー、標識、キャリアー、免疫原性部分等とコンジュゲート化するため、連結基を用いて、利用可能な部位をハプテン上に提供することも可能である。
【０２２５】
[00199]本明細書において、用語「ヘテロ原子」は、酸素、窒素、イオウ、リン等の炭素原子以外の原子を指すよう意味される。通常、連結基または他の部分で使用可能な、少なくとも２つの共有結合を形成するために、ヘテロ原子は多価である。
【０２２６】
[00200]本明細書において、用語「生物学的試料」は、生物学的実体から得られる固体または液体試料を指すよう意味される。こうしたものとして、生物学的試料には、限定されるわけではないが、ヒトおよび他の動物などの、生物、または以前生存していたものに由来する、いかなる量の物質も含まれうる。こうした物質には、限定されるわけではないが、血液、血清、血漿、尿、涙、細胞、臓器、組織、骨、骨髄、リンパ、リンパ節、滑膜組織、軟骨細胞、滑膜マクロファージ、内皮細胞、皮膚等が含まれうる。
【０２２７】
[00201]本明細書において、用語「患者」は、ヒトおよび他の動物被験体を指すよう意味される。より詳細には、患者は、ＬＥＶなどの抗癲癇薬剤を必要としているヒトまたは他の動物被験体である。
【０２２８】
[00202]ＬＥＶ誘導体には、リンカー部分にカップリングしたＬＥＶ分子が含まれることも可能であり、そして場合によって作用基が含まれる。リンカー部分および作用基は、ＬＥＶの物理化学的特性を修飾可能な、広い範囲の任意の化学化合物であってもよい。したがって、リンカー部分は、アルキル、脂肪族、直鎖脂肪族、分枝鎖脂肪族、置換脂肪族、環状脂肪族、複素環脂肪族、芳香族、複素環芳香族、多環芳香族等で構成されることも可能である。
【０２２９】
[00203]本明細書において、用語「脂肪族」は、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和、および／または置換または非置換であることも可能であり、主鎖中に２０またはそれより少ない炭素またはヘテロ原子を有する、アルキル基などのヒドロカルビル部分を指すよう意味される。さらに、脂肪族には、主鎖中に１０またはそれより少ない炭素またはヘテロ原子が含まれることも可能である。脂肪族基は、直鎖、分枝鎖、環状および／または複素環である部分を含むことも可能であり、そしてエステル、ケトン、アルデヒド、カルボキシレート等の官能基を含有することも可能である。例示的な脂肪族基には、限定されるわけではないが、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、より多数の炭素のアルキル基等、ならびに２−メチルプロピル、２−メチル−４−エチルブチル、２，４−ジエチルプロピル、３−プロピルブチル、２，８−ジブチルデシル、６，６−ジメチルオクチル、６−プロピル−６−ブチルオクチル、２−メチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル等の置換および／または非置換基が含まれる。用語、脂肪族またはアルキルはまた、アルケニル基、例えばビニル、アリル、アラルキルおよびアルキニル基も含む。
【０２３０】
[00204]脂肪族基内の置換には、脂肪族部分において許容されうる任意の原子または基が含まれることも可能であり、これらには、限定されるわけではないが、ハロゲン、イオウ、チオール、チオエステル、アミン（一級、二級、または三級）、アミド、エーテル、エステル、アルコール、酸素等が含まれる。脂肪族基は、例えばまた、アゾ基、ケト基、アルデヒド基、カルボニル基、カルボキシル基、ニトロ、ニトロソまたはニトリル基、イミダゾールなどの複素環、ヒドラジノまたはヒドロキシルアミノ基、イソシアネートまたはシアネート基、ならびにスルホキシド、スルホン、スルフィド、およびジスルフィドなどのイオウ含有基などの修飾も含むことも可能である。さらに、置換は、適切であるかまたは可能である場合、単結合、二重結合、または三重結合を介してもよい。
【０２３１】
[00205]さらに、脂肪族基はまた、炭素原子の、例えば窒素、酸素、リン、またはイオウなどのヘテロ原子による置換である、ヘテロ置換も含有してもよい。こうしたものとして、置換脂肪族で構成されるリンカーは、炭素、窒素、酸素、イオウ、リン、および／または同様のもので構成される主鎖を有しうる。複素環置換は、１またはそれより多いヘテロ原子を有するアルキル環を指す。複素環部分の例には、限定されるわけではないが、モルホリノ、イミダゾール、およびピロリジノが含まれる。
【０２３２】
[00206]本明細書において、用語「芳香族」は、電子が原子の円形または環状配置周囲を自由に循環し、互いに交互に単結合および二重結合する分子を指すよう意味される。より適切には、これらの結合が単結合および二重結合のハイブリッドであり、環中の各結合が他のすべてと同一であるとして、理解することも可能である。
【０２３３】
[00207]本明細書において、用語「アミン」は、１つ、２つ、または３つの水素原子を、例えばアルキル基などの他の基によって置換することによって、アンモニアに直接または間接的に由来しうる部分を指すよう意味される。一級アミンは、ＲＮＨ２の一般構造を有し、そして二級アミンはＲ２ＮＨの一般構造を有する。用語、アミンには、限定されるわけではないが、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、アニリン、シクロヘキシルアミン、ベンジルアミン、多環アミン、ヘテロ原子置換アリールおよびアルキルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ジブチルアミン、メチルプロピルアミン、メチルヘキシルアミン、メチルシクロプロピルアミン、エチルシクロヘキシルアミン、メチルベンジルアミン、メチルシクロヘキシルメチルアミン、ブチルシクロヘキシルアミン、モルホリン、チオモルホリン、ピロリジン、ピペリジン、２，６−ジメチルピペリジン、ピペラジン、およびヘテロ原子置換アルキルまたはアリール二級アミンが含まれる。
【０２３４】
[00208]本明細書において、用語「ポリ（アミノ酸）」または「ポリペプチド」は、アミノ酸から形成されるポリアミドである。ポリ（アミノ酸）は、一般的に、約２００〜２，０００分子量または約２，０００を超える分子量の範囲であり、あるいは分子量上限がなく、そして通常、１０，０００，０００未満の分子量であり、そして通常、約６００，０００ダルトンを超えないであろう。通常、免疫原性キャリアーまたは酵素が関与するかどうかに応じて、異なる範囲があるであろう。
【０２３５】
[00209]本明細書において、用語「ペプチド」は、アミド（ペプチド）結合による２またはそれより多いアミノ酸の連結によって形成される任意の化合物を指すよう意味され、通常、直鎖において、各アミノ酸残基のα−アミノ基（ＮＨ２末端を除く）が、次の残基のα−カルボキシル基に連結されているα−アミノ酸のポリマーである。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「ポリ（アミノ酸）」は、本明細書において、サイズに関する制約なしに、このクラスの化合物を指すよう、同義に用いられる。このクラスの最大のメンバーは、定義されるポリペプチド配列を有し、タンパク質と称される。
【０２３６】
[00210]さらに、本発明を記載するため、本明細書に用いる用語は、前述の定義および／または当該技術分野に周知の定義を用いて解釈可能である。こうしたものとして、前述の命名法は、本発明を説明するよう意味され、そして限定するよう意図されない。
【０２３７】
[00211]本発明の精神または本質的な特性から逸脱することなく、他の特定の形式で、本発明を具現することも可能である。記載する態様は、すべての観点で、単に例示的であり、そして限定的ではないと見なされる。したがって、本発明の範囲は、前述の説明によるのではなく、付随する特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲の意味および等価の範囲内に属するすべての変化が、その範囲内に含まれるものとする。
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
[0001]本出願は、２０１０年６月９日に出願された、「レベチラセタムを検出するための誘導体、試薬、およびイムノアッセイ」と題される米国特許出願第１２／７９７，３４８号に優先権を主張する。本出願はまた、Ｏｕｙａｎｇらに対する、２００９年６月１１日に出願された、「レベチラセタムを検出するための誘導体、試薬、およびイムノアッセイ」と題される米国仮特許出願第６１／２６８，３３９号に優先権の利益を主張し、該出願はその全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
[0002]レベチラセタム（ＬＥＶ）（（−）−（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジンアセトアミド、ケプラ（登録商標））は、ファースト・イン・クラスの抗癲癇薬剤（ＡＥＤ）として、２００６年、ＦＤＡによって認可された。該化合物は、商標名ケプラ（登録商標）の下に、ＵＣＢ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．によって市販されている。
【０００３】
[0003]レベチラセタムは、４歳およびそれより年上の成人および小児における部分癲癇発作（ｐａｒｔｉａｌ ｏｎｓｅｔ ｓｅｉｚｕｒｅｓ）、１２歳およびそれより年上の成人および青年におけるミオクローヌス発作、ならびに６歳およびそれより年上の成人および小児における原発性全身性強直間代発作の治療において補助療法として指示されている。ＬＥＶは、脳において、シナプス小胞タンパク質ＳＶ２Ａに結合することによって、シナプス神経伝達物質放出を調節することによって作用する（１）。ＬＥＶに関する名目上の（ｎｏｍｉｎａｌ）療法範囲は、６〜２０μｇ／ｍＬである（２）。ＬＥＶの療法薬剤監視（ＴＤＭ）は、個体の最適ＬＥＶレベルを確立し（３）、そしてノンコンプライアンスを検出するために重要である。
【０００４】
[0004]ＬＥＶに関する最適トラフ血清／血漿濃度範囲は、１０〜６０ｍｇ／Ｌである（４〜６）。ＬＥＶは、主に腎臓を通じて排出され、投与された用量のおよそ６４％が変化せずに尿中に排出される。該薬剤は、最小限の肝臓代謝を経るが、細胞質アミダーゼによるアセトアミド機能の加水分解が起こり、カルボン酸代謝物、２−ピロリドン−Ｎ−酪酸が生じる。酸代謝物は尿中に排出され、そして投与された用量のおよそ２７％を占める。２−オキソピロリジン環の３位および４位の酸化もまた、肝臓代謝によって生じて、用量の約３％を占める少量の代謝物を形成する。さらに、ＬＥＶおよび２−ピロリドン−Ｎ−酪酸は２−オキソピロリジン環の５位で酸化され、そして次いで加水分解されて、開環を生じる可能性もある。ＬＥＶ薬物動態学においては、顕著な個体間変動がある。したがって、ＬＥＶの血清／血漿濃度の療法的監視が推奨される。
【０００５】
[0005]現在まで、ＬＥＶの循環レベルを測定するために、液体またはガスクロマトグラフィー技術が使用されてきた。しかし、こうした方法は、試料調製時間が長く、アッセイ時間が長く、コストが高く、スループットが低く、そして労働集約的な方法であることを含む要因のため、定期的なＴＤＭには非実用的である。したがって、有効なＴＤＭのためには、ＬＥＶ血漿レベルを測定するための迅速で経済的な分析法が必要である。
【０００６】
[0006]イムノアッセイは、一般的に、試料中に存在する抗原レベルを定量化するための、迅速で、安価であり、そして高感度の手段と見なされている。イムノアッセイ技術は、生物学的試料中の多様な薬剤を検出するために開発されてきており、そしてこうした商業的分析適用によく適している。したがって、イムノアッセイを用いて、患者の血液、血清、尿、唾液または他の体液中の薬剤および／または薬剤代謝物の量を迅速に評価することも可能である。イムノアッセイの例には、限定されるわけではないが、均一（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）微粒子イムノアッセイ（例えば免疫比濁法）または定量的微小球体系（ＱＭＳ（登録商標））、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、クローン化酵素ドナーイムノアッセイ（ＣＥＤＩＡ）、化学発光微粒子イムノアッセイ（ＣＭＩＡ）等が含まれうる。患者血液、血清、血漿、および／または他の生物学的液体または試料におけるＬＥＶを検出するために設定されたイムノアッセイがあることが好適であろう。さらに、こうしたイムノアッセイで使用するためのＬＥＶ誘導体、および／または抗レベチラセタム抗体を産生する際に使用するための、ＬＥＶに基づく免疫原があることが好適であろう。
【０００７】
[0007]典型的には、ターゲット抗原に特異的な少なくとも１つの抗体が、有用なイムノアッセイの基礎を形成するため、ＴＤＭは、大部分の療法薬剤が、元来、免疫原性ではなく、そしてしたがってマウス、ウサギ、ヤギ、ウマおよび他の哺乳動物などの、抗体産生に一般的に用いられる動物内に注射された際、免疫反応を誘発しない点で困難を提示する。また、ターゲット薬剤の活性型は、小用量であってさえ、レシピエント動物に対して有害でありうる。したがって、免疫原として作用する、療法薬剤の誘導体を作製しなければならない。しかし、免疫原に反応して産生される抗体は、患者試料中に存在すると予期される薬剤と交差反応可能でなければならず、そしてさらにより好ましくは、抗体は、試料中にも存在しうる、薬剤の不活性代謝性誘導体とは、あるとしてもわずかに測定可能な交差反応しか有してはならない。
【０００８】
[0008]イムノアッセイは、典型的には、抗体産生に必要な免疫原に加えて、他のタイプの誘導体を使用する。限定されない例として、ターゲット抗原の標識誘導体を用いて、ターゲット抗原および標識誘導体の両方を認識可能な抗体上の結合部位に関して、ターゲット抗原と競合させてもよい。競合イムノアッセイは、現在の当該技術分野において周知である。他の誘導体は、イムノアッセイを較正するための対照または標準として働きうる。
【０００９】
[0009]レベチラセタム、その代謝物および構造的に類似な薬剤を以下に示す：
【００１０】
【化１】
【００１１】
[0010]Ｋｅｎｄａらは、ＬＥＶよりもレベチラセタム結合部位に対してより高い結合アフィニティを持つ誘導体を同定する試みの中で、アルデヒド酸エステルの還元アミン化による固相合成を通じて産生される、５−アミノ−２−（２−オキソピロリジン−１−イル）ペンタン酸アミド（Ｋｅｎｄａらによって「類似体５６」とも称される）を含むＬＥＶ誘導体を記載する。記載されるように、反応は１００グラムのｒｉｎｋアミド樹脂および６６ｍｇの４−オキソ酪酸４−メトキシベンジルエステルを用いて、ＨＰＬＣによって測定した際、６５％の純度の類似体５６がわずか２ｍｇしか得られず、反応性収量は約０．１％であった。
【００１２】
【化２】
【００１３】
[0011]類似体５６は、多くの動物において、抗体産生を誘導し、そして抗体産生、結合特性および他の特性を監視するために、イムノアッセイで使用するためのＬＥＶ誘導体として有望でありうるが、免疫原性誘導体２ｍｇをかなり超える量が必要である。同様に、対照または標準として用いられる誘導体、あるいはターゲット抗原と競合する標識誘導体を含むイムノアッセイの商業化には、商業的要求を満たすのに十分な量の誘導体（単数または複数）が必要である。したがって、薬剤発見目的には、Ｋｅｎｄａらによって解説される固相合成法が適している可能性もあるが、該方法は、ＬＥＶに関するイムノアッセイを開発する目的のための誘導体を産生するには実用的な価値を持たない。
【発明の概要】
【００１４】
[0012]一般的に、本開示は、レベチラセタム（ＬＥＶ）誘導体、ＬＥＶ誘導体を合成するための方法、およびＬＥＶに関する免疫診断アッセイ（ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｓｓａｙ）に関する。ＬＥＶ誘導体には、作用基（ｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐ）、例えば：抗ＬＥＶ抗体を調製するのに使用可能な免疫原性部分；ＬＥＶに関する免疫診断アッセイで使用可能な抗原性部分；または免疫診断アッセイで使用可能なトレーサー部分が含まれてもよい。さらに、抗ＬＥＶ抗体に関してＬＥＶと競合させるため、免疫診断アッセイにおいて、ＬＥＶ誘導体を用いてもよい。本明細書記載の合成法には、十分な特異性および感度で、ＬＥＶおよびＬＥＶ誘導体に結合可能な抗体の発展に成功する免疫プログラムに必要とされる、多量のＬＥＶ誘導体を産生するのに適したキラル選択性の液相合成工程が含まれる。
【００１５】
[0013]１つの態様において、式１または式２のＬＥＶ誘導体を含む化学組成物を開示する。
【００１６】
【化３】
【００１７】
[0014]式２のｎ、ならびに式１および２のＬ、Ｘ、およびＹは、以下のように定義される：
ａ）ｎは、０〜８の値を持つ整数であり；
ｂ）Ｌは、ＣＨ２、ＣＯ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＣＯＮＨ、ＮＨ、Ｏ、またはＳ、およびその組み合わせからなる群の１つであり；
ｃ）Ｘは、末端基、芳香族基、アリール基、あるいは１〜１０の炭素原子および／またはヘテロ鎖原子を有する飽和、不飽和、置換、非置換、直鎖、または分枝鎖脂肪族基であって、ヘテロ鎖原子が、酸素、窒素、イオウ、またはリン、およびその組み合わせからなる群より選択される、前記脂肪族基であり；そして
ｄ）Ｙは場合により、そして存在する場合、アルコールアミン、アミド、カルボン酸、アルデヒド、エステル、イミノエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、無水物、チオール、チオールアセトン（ｔｈｉｏｌａｃｅｔｏｎｅ）、ジアゾニウム、ＮＨＳ、ＣＯ−ＮＨＳ、Ｏ−ＮＨＳ、マレイミドからなる群より選択される官能基の１つであり；または
ｅ）ＹはＹ１−Ｚである、式中、Ｙ１は、ＣＯＯ、ＣＯ、Ｏ、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、またはＮＨからなる群より選択され、そしてＺは作用基である。
【００１８】
[0015]本明細書に提示する式２の定義には、多くのありうる化合物が含まれる。しかし、以下に示す、５−アミノ−２−（２−オキソピロリジン−１−イル）ペンタン酸アミド（式３）は、本明細書に請求する式２の化合物クラスから特に排除される。
【００１９】
【化４】
【００２０】
[0016]方法の１つの態様において、Ｚの作用基は、検出可能標識、抗原性キャリアー、カップリング剤、末端基、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、多糖、核酸、ポリヌクレオチド、タイコ酸、放射性同位体、酵素、酵素断片、酵素ドナー断片、酵素アクセプター断片、酵素基質、酵素阻害剤、補酵素、蛍光部分、燐光部分、反ストークス上方制御部分、化学発光部分、発光部分、色素、増感剤、粒子、微粒子、磁気粒子、固体支持体、リポソーム、リガンド、受容体、ハプテン放射性同位体、およびその組み合わせからなる群より選択される。
【００２１】
[0017]式１または式２のＬＥＶ誘導体を含む、特定の化学組成物例において、ｎは、０、１、２、または４の値を持つ整数であり、Ｌは、ＮＨＣＯＯ、ＮＨ、ＮＨＣＯ、ＣＨ２、ＣＯ、Ｓ、またはＣＯＮＨからなる群の１つであり、Ｘは、Ｈ、ＯＣＨ２−Ｐｈ、ＮＨ、Ｏ、Ｏ−ＮＨＳ、ＣＨ２、Ｈ、マレイミド−Ｐｈ、ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨからなる群の１つであり、そしてＹは場合により、そして存在する場合、Ｈであり、またはＹは場合により、そして存在する場合、Ｙ１−Ｚである、式中、Ｙ１がＣＯであり、そしてＺが、−ＮＨＳ、−ＢＳＡ、または−ＫＬＨである。
【００２２】
[0018]特定の例において、式２のｎ、Ｌ、Ｘ、およびＹまたはＹ１−Ｚは：
ａ）ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯＯ、およびＸ＝ｔ−ブチル；
ｂ）ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨ、およびＸ＝Ｈ；
ｃ）ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯ、およびＸ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ；
ｄ）ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯ、Ｘ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＮＨＳ；
ｅ）ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯ、Ｘ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＫＬＨ；
ｆ）ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯ、Ｘ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；
ｇ）ｎ＝４、Ｌ＝ＣＨ２、Ｘ＝ＮＨ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；
ｈ）ｎ＝２、Ｌ＝ＣＯ、およびＸ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ；
ｉ）ｎ＝２、Ｌ＝ＣＯ、Ｘ＝Ｏ、およびＹ＝Ｈ；
ｊ）ｎ＝２、Ｌ＝ＣＯ、およびＸ＝Ｏ−ＮＨＳ；
ｋ）ｎ＝０、Ｌ＝ＣＨ２、Ｘ＝ＣＨ２、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＫＬＨ；
ｌ）ｎ＝０、Ｌ＝ＣＨ２、Ｘ＝ＣＨ２、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；
ｍ）ｎ＝１、Ｌ＝Ｓ、およびＸ＝ＣＨ２−Ｐｈ；
ｎ）ｎ＝１、Ｌ＝Ｓ、およびＸ＝Ｈ；
ｏ）ｎ＝１、Ｌ＝Ｓ、Ｘ＝マレイミド−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；または
ｐ）ｎ＝１、Ｌ＝Ｓ、Ｘ＝マレイミド−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＫＬＨ；
からなる群より選択される。
【００２３】
[0019]別の特定の実施例において、式１のＬ、Ｘ、Ｙ、およびＹ１−Ｚは：
ａ）Ｌ＝ＣＯＮＨ、Ｘ＝ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ、およびＹ＝Ｈ；
ｂ）Ｌ＝ＣＯＮＨ、Ｘ＝ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＫＬＨ；または
ｃ）Ｌ＝ＣＯＮＨ、Ｘ＝ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；
からなる群より選択される。
【００２４】
[0020]別の態様において、試料中のＬＥＶの存在を検出するための免疫診断アッセイにおいて使用するためのキットを開示する。該キットには、式１または式２：
【００２５】
【化５】
【００２６】
の一方の化学構造を有するＬＥＶ誘導体；および
少なくとも１つの結合ドメインを有する抗ＬＥＶ抗体であって、ＬＥＶおよび／またはＬＥＶ誘導体に結合可能な部分を有する、ここで抗体およびＬＥＶ誘導体間の相互作用は、ＬＥＶに対する抗体のアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つの少なくとも５０％である、前記抗ＬＥＶ抗体
が含まれる。ｎ、Ｌ、Ｘ、およびＹの定義は、化学組成物に関して上に定義したものと同じである。
【００２７】
[0021]１つの態様において、ＬＥＶ誘導体または抗ＬＥＶ抗体は、粒子、磁気粒子、微粒子、微小球体、支持体、酵素ドナー、または酵素アクセプターの１つとカップリングしている。
【００２８】
[0022]１つの態様において、キットにはさらに、以下：
ａ）ＬＥＶのストック組成物；
ｂ）異なる濃度のＬＥＶを含有する一連の組成物、濃度勾配を形成する一連の組成物；
ｃ）トレーサー・コンジュゲートを有するＬＥＶ誘導体；
ｄ）微粒子にカップリングしたＬＥＶ誘導体；
ｅ）微粒子にカップリングした抗体；
ｆ）酵素ドナーを有するＬＥＶ誘導体、および対応する酵素アクセプター；
ｇ）酵素アクセプターを有するＬＥＶ誘導体、および対応する酵素ドナー；または
ｈ）ろ過または沈降による分離に適した粒子上に装填された抗体
の少なくとも１つが含まれる。
【００２９】
[0023]さらに別の態様において、試料中のＬＥＶの存在を検出するための免疫診断システムにおいて使用するための抗体組成物を開示する。該抗体組成物には、ＬＥＶ誘導体を含む免疫原性組成物によって産生される抗ＬＥＶ抗体であって、該ＬＥＶ誘導体が、式１または式２：
【００３０】
【化６】
【００３１】
［式中：
ａ）ｎは、０〜８の値を持つ整数であり；
ｂ）Ｌは、ＣＨ２、ＣＯ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＣＯＮＨ、ＮＨ、Ｏ、またはＳ、およびその組み合わせからなる群の１つであり；
ｃ）Ｘは、末端基、芳香族基、アリール基、あるいは１〜１０の炭素原子および／またはヘテロ鎖原子を有する飽和、不飽和、置換、非置換、直鎖、または分枝鎖脂肪族基であって、ヘテロ鎖原子が、酸素、窒素、イオウ、またはリン、およびその組み合わせからなる群より選択される、前記脂肪族基であり；そして
ｄ）ＹはＹ１−Ｚである、式中、Ｙ１は、ＣＯＯ、ＣＯ、Ｏ、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、またはＮＨからなる群より選択され、そしてＺは作用基である］
の化学構造を有する、前記抗ＬＥＶ抗体が含まれる。
【００３２】
[0024]１つの態様において、ＬＥＶに比較したＬＥＶ誘導体に対する抗体のアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つは、均一または不均一免疫診断アッセイで使用するのに十分である。１つの態様において、抗体およびＬＥＶ誘導体間の相互作用は、ＬＥＶに対する抗体のアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つの少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％である。
【００３３】
[0025]１つの態様において、免疫原性部分は、タンパク質、ポリペプチド、糖タンパク質、多糖、粒子、微粒子、核酸、ポリヌクレオチド、およびその組み合わせからなる群より選択される。別の態様において、免疫原性部分は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵オボアルブミン、ウシ・ガンマ−グロブリン（ＢＧＧ）、およびその組み合わせからなる群より選択されるタンパク質である。
【００３４】
[0026]１つの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。別の態様において、抗体はポリクローナル抗体である。
[0027]抗ＬＥＶ抗体は：
ａ）式１または式２：
【００３５】
【化７】
【００３６】
の化学構造を有するＬＥＶ誘導体を含む免疫原性組成物の少なくとも第一の用量を、抗体を産生する被験体に投与し；
ｂ）抗体を産生する被験体から抗体を収集し；そして
ｃ）抗体を産生する被験体から収集した抗体を精製し、および／またはスクリーニングする；
工程を含む方法によって産生可能である。
【００３７】
[0028]１つの態様において、抗ＬＥＶ抗体を産生するための方法には、抗体を産生する被験体から抗体を収集する前に、少なくとも第二の用量の免疫原性組成物を、抗体を産生する被験体に投与する工程がさらに含まれる。
【００３８】
[0029]１つの態様において、収集工程には、血液、血清、血漿、または他の生物学的試料の少なくとも１つを、抗体を産生する被験体から得る工程が含まれる。
[0030]１つの態様において、スクリーニング工程には、ＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。
【００３９】
[0031]さらに別の態様において、本発明には、式１または式２のレベチラセタム（ＬＥＶ）誘導体を合成するための液相合成法が含まれる。
【００４０】
【化８】
【００４１】
[0032]該方法には、（１）保護されたアミノ酸出発物質を提供し、そして（２）保護されたアミノ酸出発物質を修飾して、式１または式２のＬＥＶ誘導体を生じる工程が含まれる。式２のｎ、ならびに式１および式２のＬ、Ｘ、およびＹは、以下のように定義される：
ａ）ｎは、０〜８の値を持つ整数であり；
ｂ）Ｌは、ＣＨ２、ＣＯ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＣＯＮＨ、ＮＨ、またはＳ、およびその組み合わせからなる群の１つであり；
ｃ）Ｘは、末端基、芳香族基、アリール基、あるいは１〜１０の炭素原子および／またはヘテロ鎖原子を有する飽和、不飽和、置換、非置換、直鎖、または分枝鎖脂肪族基であって、ヘテロ鎖原子が、酸素、窒素、イオウ、またはリン、およびその組み合わせからなる群より選択される、前記脂肪族基であり；そして
ｄ）Ｙは場合により、そして存在する場合、アルコールアミン、アミド、カルボン酸、アルデヒド、エステル、イミノエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、無水物、チオール、チオールアセトン、ジアゾニウム、ＮＨＳ、ＣＯ−ＮＨＳ、Ｏ−ＮＨＳ、マレイミドからなる群より選択される官能基の１つであり；または
ｅ）Ｙは場合により、そして存在する場合、Ｙ１−Ｚである、式中、Ｙ１は、ＣＯＯ、ＣＯ、Ｏ、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、またはＮＨからなる群より選択され、そしてＺは作用基である。
【００４２】
[0033]保護されたアミノ酸出発物質の適切な例には、側鎖上に誘導体化可能な官能基を有する天然および非天然アミノ酸の保護された誘導体が含まれうる。本明細書に記載する方法において、ＬＥＶ誘導体を作製するために誘導体化可能な側鎖官能基を有する天然存在アミノ酸の例示的な例には、限定されるわけではないが、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンの保護された誘導体が含まれる。１つの態様において、保護されたアミノ酸誘導体には、出発物質、中間体、および生成物を監視するのに使用可能な追跡可能な部分、例えば限定されるわけではないが、蛍光部分が含まれる。
【００４３】
[0034]保護されたアミノ酸出発物質の特定の例には、Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２、Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ、Ｈ−ｌｙｓ（Ｚ）−ＯｔＢｕ、Ｈ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＯｔＢｕ、Ｈ−Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）−ＯＭｅ、ＦＭＯＣ−Ｐｒｏ−ＯＨ、およびＢｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨが含まれる。好ましくは、式２の化合物の合成のための、保護されたアミノ酸出発物質は、Ｈ−ｌｙｓ（Ｚ）−ＯｔＢｕ、Ｈ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＯｔＢｕ、およびＨ−Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）−ＯＭｅからなる群より選択される。好ましくは、式１の化合物の合成のための、保護されたアミノ酸出発物質は、ＦＭＯＣ−Ｐｒｏ−ＯＨおよびＢｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨからなる群より選択される。
【００４４】
[0035]１つの態様において、式１または式２のレベチラセタム（ＬＥＶ）誘導体に関する合成収率は、約１０％〜約４０％の範囲である。別の態様において、式１または式２のＬＥＶ誘導体に関する合成収率は、約５％〜約２５％の範囲である。さらに別の態様において、式１または式２のＬＥＶ誘導体に関する収率は、約１％〜約１０％の範囲である。本明細書において、用語「合成収率」は、反応工程における生成物の収率（すなわち生成物／出発物質）、または多工程合成における各工程由来の合成収率の積を指す。すなわち、３工程合成反応の合成収率は、以下のように定義される：合成収率＝工程１収率％ｘ工程２収率％ｘ工程３収率％。類似の方法を用いて、より多いまたはより少ない工程を有する合成スキームに関する合成収率を計算してもよい。
【００４５】
[0036]本明細書記載の合成反応は、液相で行われるため、出発物質、中間体、および生成物を追跡可能であることが重要である。こうしたものとして、本明細書記載の方法には、追跡可能部分を用いて、出発物質、合成中間体、あるいは式１または式２のＬＥＶ誘導体の少なくとも１つの合成を監視する工程がさらに含まれる。１つの態様において、追跡可能物質には、蛍光部分が含まれる。
【００４６】
[0037]さらにさらなる別の態様において、本発明には、式２のレベチラセタム（ＬＥＶ）誘導体を合成するための液相合成法が含まれる。
【００４７】
【化９】
【００４８】
[0038]該方法には、（１）保護されたアミノ酸出発物質を提供し、そして保護されたアミノ酸出発物質を修飾して、式２のＬＥＶ誘導体を生じる工程が含まれる。式２のｎ、Ｌ、Ｘ、およびＹは、以下のように定義される：
ａ）ｎは、０〜８の値を持つ整数であり；
ｂ）Ｌは、ＣＨ２、ＣＯ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨ、またはＳ、およびその組み合わせからなる群の１つであり；
ｃ）Ｘは、末端基、芳香族基、アリール基、あるいは１〜１０の炭素原子および／またはヘテロ鎖原子を有する飽和、不飽和、置換、非置換、直鎖、または分枝鎖脂肪族基であって、ヘテロ鎖原子が、酸素、窒素、イオウ、またはリン、およびその組み合わせからなる群より選択される、前記脂肪族基であり；そして
ｄ）Ｙは場合により、そして存在する場合、アルコールアミン、アミド、カルボン酸、アルデヒド、エステル、イミノエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、無水物、チオール、チオールアセトン、ジアゾニウム、ＮＨＳ、ＣＯ−ＮＨＳ、Ｏ−ＮＨＳ、マレイミドからなる群より選択される官能基の１つであり；または
ｅ）ＹはＹ１−Ｚである、式中、Ｙ１は、ＣＯＯ、ＣＯ、Ｏ、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、またはＮＨからなる群より選択され、そしてＺは作用基である。
【００４９】
[0039]１つの態様において、式２の化合物を合成するための方法には、さらに、（１）保護されたアミノ酸出発物質の単一の立体異性体を提供し、ここで、保護されたアミノ酸出発物質の単一の立体異性体は、アミン官能基を含む少なくとも１つの立体中心周囲に選択された立体化学配向を有する、（２）アルキル化剤を用いて、保護されたアミノ酸出発物質上のアミン官能基にアルキル基を付加して、そして（３）アルキル基の少なくとも一部を環化して、ＬＥＶ誘導体の単一の立体異性体を産生する、ここで、ＬＥＶ誘導体の単一の立体異性体は、保護されたアミノ酸出発物質における立体化学配向と同じ、少なくとも１つの共有結合周囲の選択された立体化学配向を有する、工程が含まれる。
【００５０】
[0040]１つの態様において、アルキル化剤は、４−置換ブチレート誘導体であり、ここで、誘導体化基は、電子吸引性／脱離基であり、ブチレートを求核攻撃に感受性にする。４−置換ブチレート誘導体の適切な例には、限定されるわけではないが、ハロブチレート、例えば４−フルオロ酪酸エチル、４−クロロ酪酸エチル、４−ブロモ酪酸エチル、および４−ヨード酪酸エチルが含まれる。
【００５１】
[0041]さらにさらなる別の態様において、本発明には、あらかじめＬＥＶを投与されている被験体から得られる試料中のＬＥＶの存在を検出するための免疫診断アッセイを行う方法が含まれる。該方法には：
ａ）抗ＬＥＶ抗体およびＬＥＶ誘導体を試料と合わせて、第一の組成物を形成し、前記抗体はＬＥＶおよびＬＥＶ誘導体と結合可能であり、ここで、抗体およびＬＥＶ誘導体間の相互作用は、ＬＥＶに対する抗体のアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つの少なくとも５０％であり、そしてＬＥＶ誘導体は、式１または式２：
【００５２】
【化１０】
【００５３】
の１つの化学構造を有する；
ｂ）試料由来の任意の未結合ＬＥＶおよびＬＥＶ誘導体が、抗体との結合に関して競合するのを可能にし；そして
ｃ）ＬＥＶ誘導体および抗体間の結合を検出する；
工程が含まれる。
【００５４】
[0042]１つの態様において、ＬＥＶをあらかじめ投与された被験体から得られる試料中のＬＥＶの存在を検出するための免疫診断アッセイを実行する方法には、さらに：
ａ）ＬＥＶ誘導体を得て、前記ＬＥＶ誘導体には蛍光部分が含まれ；
ｂ）第一の量の偏光を有する偏光を用いて蛍光コンジュゲートを励起させ；
ｃ）第二の量の偏光を有する蛍光コンジュゲートから放出される偏光を検出し；
ｄ）第一の量の偏光と第二の量の偏光を比較し；そして
ｅ）ＬＥＶが試料中に存在するかどうかを決定する、ここで、第二の量の偏光が第一の量の偏光と異なるならば、ＬＥＶが試料中に存在する指標となる；
工程が含まれる。
【００５５】
[0043]上記方法にはさらに：
ａ）既知の量のＬＥＶとＬＥＶ誘導体および抗体を合わせて、対照結合組成物を形成し；
ｂ）第三の量の偏光を有する対照結合組成物中の蛍光コンジュゲートから放出される偏光を検出し；
ｃ）第三の量の偏光と第二の量の偏光を比較して；そして
ｄ）試料中に存在するＬＥＶの量を決定する；
工程が含まれる。
【００５６】
[0044]別の態様において、あらかじめＬＥＶを投与されている被験体から得られる試料中のＬＥＶの存在を検出するための免疫診断アッセイを実行する方法には、さらに：
ａ）ＬＥＶ誘導体および抗体を得て、ここで、ＬＥＶ誘導体および抗体の一方は、微粒子にカップリングしている；
ｂ）第一の組成物に入射光を照射し；
ｃ）第一の組成物から透過される光の第一の強度を検出し；
ｄ）ＬＥＶ誘導体および抗体を有し、そして遊離ＬＥＶを持たない対照結合組成物から透過される光の最低限の強度を同定し；
ｅ）透過光の最小限の強度と透過光の第一の強度を比較し；そして
ｆ）ＬＥＶが試料中に存在するかどうかを決定する、ここで、最小限の強度と第一の強度が異なるならば、ＬＥＶが試料中に存在する指標となる；
工程が含まれる。
【００５７】
[0045]上記方法にはさらに：
ａ）既知の量のＬＥＶとＬＥＶ誘導体および抗体を合わせて、対照結合組成物を形成し；
ｂ）対照結合組成物に入射光を照射し；
ｃ）対照結合組成物から透過される光の第二の強度を検出し；そして
ｄ）試料中に存在するＬＥＶの量を決定する、ここで、第一の強度および第二の強度間の比較が、試料中に存在するＬＥＶの量の指標となる；
工程が含まれる。
【００５８】
[0046]さらに別の態様において、あらかじめＬＥＶを投与されている被験体から得られる試料中のＬＥＶの存在を検出するための免疫診断アッセイを実行する方法には、さらに：
ａ）ＬＥＶ誘導体を得て、ここで、ＬＥＶ誘導体には酵素ドナーが含まれる；
ｂ）第一の組成物と酵素アクセプターを合わせ；
ｃ）基質と第一の組成物を合わせ、ここで、基質は、酵素ドナーおよび酵素アクセプターと相互作用することによって切断可能であり；そして
ｄ）酵素活性を検出する；
工程が含まれる。
【００５９】
[0047]上記方法にはさらに：
ａ）既知の量のＬＥＶとＬＥＶ誘導体および抗体を合わせて、対照結合組成物を形成し；
ｂ）酵素アクセプターと対照結合組成物を合わせ；
ｃ）基質と対照結合組成物を合わせ、ここで、基質は、酵素ドナーおよび酵素アクセプターと相互作用することによって切断可能である；
ｄ）対照酵素活性を検出し；そして
ｅ）試料中に存在するＬＥＶの量を決定する、ここで、酵素活性および対照酵素活性間の比較は、試料中に存在するＬＥＶの量の指標となる；
工程が含まれる。
【００６０】
[0048]さらにさらなる別の態様において、あらかじめＬＥＶを投与されている被験体から得られる試料中のＬＥＶの存在を検出するための免疫診断アッセイを実行する方法には、さらに：
ａ）ＬＥＶ誘導体を得て、ここで、ＬＥＶ誘導体にはトレーサー部分が含まれる；
ｂ）抗体を競合結合組成物から分離し；
ｃ）未結合ＬＥＶ誘導体を抗体から分離させ；そして
ｄ）抗体と結合した類似体のトレーサー部分を検出する；
工程が含まれる。
【００６１】
[0049]上記方法には、さらに：
ａ）既知の量のＬＥＶとＬＥＶ誘導体および抗体を合わせて、対照結合組成物を形成し；
ｂ）抗体を対照結合組成物から分離し；
ｃ）競合結合組成物由来の抗体と結合したトレーサー・コンジュゲートの第一の量を検出し；
ｄ）対照結合組成物由来の抗体と結合したトレーサー・コンジュゲートの第二の量を検出し；そして
ｅ）試料中に存在するＬＥＶの量を決定する、ここで、第一の量のトレーサー・コンジュゲートおよび第二の量のトレーサー・コンジュゲート間の比較は、試料中に存在するＬＥＶの量の指標となる；
工程が含まれる。
【００６２】
[0050]本発明のこれらのおよび他の目的および特徴は、以下の説明および付随する特許請求の範囲からより詳細に明らかになるであろうし、または以下に示すように、本発明の実施によって学習されうる。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
Ｉ．序論
[0051]一般的に、本発明は、レベチラセタム（ＬＥＶ）誘導体、ＬＥＶ誘導体を合成するための方法、およびＬＥＶに関する免疫診断アッセイに関する。ＬＥＶ誘導体には、作用基、例えば：抗ＬＥＶ抗体を調製するのに使用可能な免疫原性部分；ＬＥＶに関する免疫診断アッセイで使用可能な抗原性部分；または免疫診断アッセイで使用可能なトレーサー部分が含まれてもよい。さらに、免疫診断アッセイにおいて、抗ＬＥＶ抗体に関してＬＥＶと競合させるため、ＬＥＶ誘導体を用いてもよい。本明細書記載の合成法には、十分な特異性および感度で、ＬＥＶおよび／またはＬＥＶ誘導体に結合可能な抗体の発展に成功する免疫プログラムに必要とされる、多量のＬＥＶ誘導体を産生するのに適したキラル選択性の液相合成工程が含まれる。
【００６４】
ＩＩ．レベチラセタム誘導体
[0052]本発明の１つの態様において、式１または式２に基づく構造を有するＬＥＶ誘導体が提供される。
【００６５】
【化１１】
【００６６】
[0053]式１および／または式２の前述の化学構造は、それにコンジュゲート化された多様な部分を含んでもよい骨格である。こうしたものとして、骨格はさらに、以下によって定義可能である：
（ａ）ｎは、０〜８の値を持つ整数であり；
（ｂ）Ｌは、ＣＨ２、ＣＯ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＣＯＮＨ、ＮＨ、Ｏ、またはＳ、およびその組み合わせからなる群の１つであり；
（ｃ）Ｘは、末端基（例えばＨ）、芳香族基、アリール基、あるいは１〜１０の炭素原子および／またはヘテロ鎖原子を有する飽和、不飽和、置換、非置換、直鎖、または分枝鎖脂肪族基であって、ヘテロ鎖原子が、酸素、窒素、イオウ、またはリン、およびその組み合わせからなる群より選択される、前記脂肪族基であり；そして
（ｄ）Ｙは場合により、そして存在する場合、アルコールアミン、アミド、カルボン酸、アルデヒド、エステル、イミノエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、無水物、チオール、チオールアセトン、ジアゾニウム、ＮＨＳ、ＣＯ−ＮＨＳ、Ｏ−ＮＨＳ、マレイミドからなる群より選択される官能基の１つであり；または
（ｅ）ＹはＹ１−Ｚである、式中、Ｙ１は、ＣＯＯ、ＣＯ、Ｏ、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、またはＮＨからなる群より選択され、そしてＺは作用基である。
【００６７】
[0054]芳香族およびアリールＸ基の適切な例には、限定されるわけではないが、ベンゼン、フェニル、ベンジル、トルエン、トルイル、キシレン等が含まれる。芳香族基にはまた、ピリジン、フラン、テトラヒドロフラン等のヘテロ芳香族であるためのヘテロ原子も含まれてもよい。また、芳香族は、多環芳香族、例えばナフタレン、アントラセン、フェナントレン、多環芳香族炭化水素、インドール、キノリン、イソキノリン等であってもよい。用語「アリール」には、６〜１４炭素原子を持つ芳香族環系が含まれ、芳香族環系には、少なくとも１つの環が芳香族である６〜１４の環原子を有する１またはそれより多い環が含まれる。Ｃ６−１４アリール基の例には、フェニル（Ｃ６）、インデニル（Ｃ９）、ナフチル（Ｃ１０）、フルオレニル（Ｃ１３）、アントラシル（Ｃ１４）、およびフェナントリル（Ｃ１４）が含まれる。上述のアリール基において、別に言及しない限り、１またはそれより多い水素原子が、場合によって他の置換基によって置換されていてもよい。例えば、アリール基は、以下の置換基によって置換されていてもよい：ＯＨ；ＮＯ２；ＣＮ；ＮＨ２；ハロゲン、例えばフッ素または塩素；場合によって置換されたＣ１−１０アルキル、例えばメチル、エチル、またはプロピル；場合によって置換された−ＯＣ１−３アルキル、例えば−ＯＭｅ、−ＯＥｔ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ−Ｃ１−４アルキル、例えば−ＣＯＯＭｅまたは−ＣＯＯＥｔ、または−ＣＯＮＨ２。
【００６８】
[0055]脂肪族Ｘ基の適切な例には、限定されるわけではないが、ＣＨ２；（ＣＨ２）２；（ＣＨ２）３；（ＣＨ２）４；（ＣＨ２）５；（ＣＨ２）６；ＣＯＣＨ２；ＣＯ（ＣＨ２）２；ＣＯ（ＣＨ２）３；ＣＯ（ＣＨ２）４；ＣＯ（ＣＨ２）５；ＣＯ（ＣＨ２）６；ＣＨ２ＮＨ、（ＣＨ２）２ＮＨ、（ＣＨ２）３ＮＨ、（ＣＨ２）４ＮＨ、（ＣＨ２）５ＮＨ、（ＣＨ２）６ＮＨ、マレイミド−Ｐｈ、ｔ−ブチル、Ｐｈ、ＯＣＨ２−Ｐｈ、ＮＨ、ＣＨ２−Ｐｈ、その組み合わせ等が含まれる。
【００６９】
[0056]Ｙ１−ＺにおけるＺの適切な例には、限定されるわけではないが、検出可能標識、抗原性キャリアー、あるいはタンパク質、酵素、酵素断片、蛍光化合物、化学発光物質、電気化学仲介因子、粒子、レポーター基、酵素阻害剤、および／または核酸からなる群より選択される末端基が含まれる。
【００７０】
[0057]１つの例示的実施例において、Ｚ作用基の適切な例には、限定されるわけではないが、作用基が、検出可能標識、抗原性キャリアー、カップリング剤（例えば、ＮＨＳ、ＣＯ−ＮＨＳ、Ｏ−ＮＨＳ、マレイミド等）、末端基、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、多糖、核酸、ポリヌクレオチド、タイコ酸、放射性同位体、酵素、酵素断片、酵素ドナー断片、酵素アクセプター断片、酵素基質、酵素阻害剤、補酵素、蛍光部分、燐光部分、反ストークス上方制御部分、化学発光部分、発光部分、色素、増感剤、粒子、微粒子、磁気粒子、固体支持体、リポソーム、リガンド、受容体、ハプテン放射性同位体、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項１１の方法が含まれる。別の例示的な例において、Ｚは、以下のコンジュゲート基のいずれであってもよい：（ａ）ＢＳＡ；（ｂ）ＫＬＨ；（ｃ）蛍光トレーサー；および（ｄ）その他。
【００７１】
[0058]以下に示す表１および２は、いくつかの特定のＬＥＶ誘導体および対応するＬ、Ｘ、Ｙ、およびＹ１−Ｚ基を例示する。多くのＬＥＶ誘導体に関する合成収率もまた示す。
【００７２】
表１：式２のＬＥＶ誘導体
【００７３】
【表１】
【００７４】
表２：式１のＬＥＶ誘導体
【００７５】
【表２】
【００７６】
表１および２中の各ＬＥＶ誘導体の構造を以下のセクションに示す。さらに、ＬＥＶ誘導体の合成スキームを以下のセクションに示し、そして付随する実施例に詳細に論じる。
ＩＩＩ．式２のＬＥＶ誘導体
[0059]式２に基づく誘導体を合成するためのいくつかのスキームを設計した。一般的に、出発物質が商業的に入手可能であり、そして各工程での反応生成物の検出を介して、反応進行を監視可能であれば、合成は容易になる。任意の適切な手段によって反応生成物の検出を実行してもよく、蛍光部分、例えば紫外光感受性発色団を介した検出などの迅速法が好ましい。例えば、反応物および生成物を高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分離してもよく、そして反応物、中間体、および生成物の１またはそれより多くに付着する発色団などの検出可能標識を用いて、反応物、中間体、および生成物の存在を監視してもよい。
【００７７】
[0060]以下に示すスキーム１は、既知の合成法に基づき、そして商業的に入手可能な出発物質、Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２を利用する。しかし、４−オキソ酪酸は、容易に入手可能ではなく、そして入手可能であったとしても、出発物質または生成物上に検出可能部分、例えば発色団がなく、反応の監視が困難である：
【００７８】
【化１２】
【００７９】
[0061]スキーム２および２’は、商業的に入手可能な出発物質Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２を用いる、２つの新規合成経路に基づく。しかし、出発物質または生成物上に発色団がないことから、単離、精製および性質決定が困難であったため、環化生成物は単離されなかった。同様に、反応進行を監視するために、ＴＬＣ、ＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳなどの分析技術は有用ではない。染色技術（ヨウ素、アニスアルデヒド、リン酸）は、比較用の参照生成物が入手可能でないため、信頼性がない。さらに、反応性末端アミド−ＣＯ−ＮＨ２は、環化反応に干渉する可能性があった。
【００８０】
【化１３】
【００８１】
[0062]以下に示す、スキーム３のための出発物質として、Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅを用いる。唯一の反応基、ＮＨ２は誘導体化されるが、検出可能発色団がないため、環化生成物は単離が困難である。
【００８２】
【化１４】
【００８３】
[0063]スキーム４は、ＵＶ検出可能部分、ＦＭＯＣを含有する、商業的に入手可能な出発物質、Ｈ−Ｌｙｓ（ＦＭＯＣ）−ＯＭｅを利用する。しかし、ＦＭＯＣ部分は不安定であり、そして溶液に塩基を添加すると除去される。環化生成物は単離されなかった。
【００８４】
【化１５】
【００８５】
[0064]スキーム５は、ＵＶ検出可能部分を含有する、商業的に入手可能な出発物質、Ｈ−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯｔＢｕを利用する。ＴＬＣまたはＨＰＬＣを介してアルキル化および環化反応を監視する。カラムクロマトグラフィーを介して、精製および単離を達成する。環化化学反応は、反応基（アルファアミン）および化学的に安定な保護基（ベンジル）によって容易となる。
【００８６】
【化１６】
【００８７】
【化１７】
【００８８】
[0065]化合物１８ａを免疫原として用いて、商業的ＬＥＶイムノアッセイのため、望ましい特異性、感受性および交差反応性を持つ適切な抗体を産生した。
[0066]スキーム６は、商業的に入手可能なＵＶ検出可能出発物質、Ｈ−Ｇｌｕ（Ｏｂｚｌ）−ＯｔＢｕを利用する。ＴＬＣまたはＨＰＬＣを介して、アルキル化および環化反応を監視する。カラムクロマトグラフィーを介して、生成物の精製および単離を実行する。環化化学反応は、反応性アルファアミン基および化学的に安定な保護ベンジル基によって容易となる。スキーム６は、免疫原性誘導体を含むＬＥＶ誘導体を産生するため、スキーム５に対する適切な代替物である。
【００８９】
【化１８】
【００９０】
[0067]スキーム７は、検出可能な発色団を含有する、商業的に入手可能な物質、Ｈ−Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）−ＯＭｅを使用する。スキーム７は、免疫原性誘導体を含むＬＥＶ誘導体を産生するため、スキーム５に対する有用な代替物として働く。
【００９１】
【化１９】
【００９２】
【化２０】
【００９３】
ＩＶ．式１のＬＥＶ誘導体
[0068]式１にしたがって、ＬＥＶの他の誘導体を作製してもよい。式１にしたがって適切な量の誘導体を産生する１つの方法を以下のスキーム８に示す。商業的に入手可能な出発物質は、ＦＭＯＣ−Ｐｒｏ−ＯＨである。スキーム４におけるのと同様に、ＦＭＯＣ部分は不安定であり、そして保護基として最適には機能しない可能性もある。
【００９４】
【化２１】
【００９５】
[0069]スキーム９は、商業的に入手可能なＵＶ検出可能出発物質、Ｚ−Ｐｒｏ−ＯＨを使用する。ベンジル保護基は安定であり、そしてルーチンの有機合成に適している。
【００９６】
【化２２】
【００９７】
【化２３】
【００９８】
[0070]スキーム８および９は、ＬＥＶに関するイムノアッセイを発展させるために有用な免疫原性誘導体を含む、ＬＥＶ誘導体を産生するのに適している。
Ｖ．イムノアッセイにおけるＬＥＶ誘導体の使用
[0071]免疫原性誘導体、例えば、限定されるわけではないが、化合物１８ａ、２７、３７または４４のいずれかは、以下にさらに詳細に記載するような抗ＬＥＶ抗体産生を誘導するのに有用である。他の誘導体、例えば限定されるわけではないが、化合物１８ｂ、２８、３８、または４４のいずれかは、標本中のＬＥＶと競合するための抗原（競合抗原）を作製するのに有用である。
【００９９】
[0072]当該技術分野に知られるように、競合抗原および／または抗ＬＥＶ抗体を検出可能標識とコンジュゲート化してもよい。検出可能標識には、限定なしに、色素、ラテックス粒子、コロイド金、フルオロフォア、発色団、酵素、酵素断片、放射性同位体等が含まれる。
【０１００】
[0073]共有または非共有結合を介して、競合抗原および／または抗ＬＥＶ抗体を固体表面上に固定してもよい。固体表面には、限定なしに：粒子；膜およびフィルターを含む多孔物質；ガラス、金属、および非孔プラスチックを含む非孔物質；等が含まれる。
【０１０１】
[0074]抗ＬＥＶ抗体、および場合によって競合抗原は、レベチラセタム濃度を測定するための定量的イムノアッセイに必須の試薬を構成する。イムノアッセイには、限定されるわけではないが、当該技術分野に知られるような、均一微粒子イムノアッセイ（例えば免疫比濁法）または定量的微小球体系（ＱＭＳ（登録商標））、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、化学発光微粒子イムノアッセイ（ＣＭＩＡ）、クローン化酵素ドナーイムノアッセイ（ＣＥＤＩＡ）、酵素連結イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）等が含まれてもよい。
【実施例】
【０１０２】
ＶＩ．実施例
[0075]以下の実施例は、本発明の態様を例示するために提供され、そして限定することを意図されない。したがって、実施例のいくつかは実験を通じて行われており、そしていくつかは当該技術分野に周知の技術、標準、および結果に基づいて、予言的である。また、本発明には、例によっては例示されない、さらなる態様が含まれうることが明らかであるはずである。さらに、本発明にしたがって調製されたＬＥＶ誘導体、抗原、免疫原、および抗ＬＥＶ抗体を用いて、当該技術分野に周知の実験プロトコルで、多くの例が実行されてきている。
【０１０３】
実施例１：スキーム５、工程１：アルキル化
[0076]化合物１０、Ｈ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ｏｔ−Ｂｕ・ＨＣｌ（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号０４−１２−５１２２）、２０．００６５ｇを、清浄な５００ｍＬ 一口丸底フラスコ内に入れた。磁気攪拌バーを反応フラスコに添加し、そしてフラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンを１５分間パージした。清浄なシリンジ、例えばＨａｍｉｌｔｏｎ Ｇａｓｔｉｇｈｔ（登録商標）シリンジを用い、セプタムを通じて、８０ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを反応フラスコに添加した。反応混合物を、アルゴン下、周囲温度で、さらに１５分間攪拌した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度で１０分間攪拌した。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、１滴ずつ、７．６８ｍＬの４−ブロモ酪酸エチルをフラスコに添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度で１０分間攪拌した。冷たい流水の水道水を伴うコンデンサーを反応フラスコ上に乗せ、そしてアルゴンラインをコンデンサーの最上部に設置した。７０℃にあらかじめ加熱した油槽内に反応フラスコを浸し、そしてアルゴン下で４０時間攪拌した。
【０１０４】
[0077]反応混合物を室温に冷却した。溶媒トラップを通じて真空ポンプに連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（ＤＭＦ）を除去した。１：３アセトン：クロロホルムを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物１１を精製した。単離された化合物１１収率は６２〜７４％であった。
【０１０５】
実施例２：スキーム５、工程２：ラクタム化／環化
[0078]化合物１１、１８．８１８ｇを清浄な２５０ｍＬ 一口丸底フラスコ（反応フラスコ）に移した。フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンをおよそ１５分間パージした。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、６１ｍＬの無水トルエンを反応フラスコ内に添加した。反応混合物を、アルゴン下、周囲温度で約１０分間攪拌し、次いで、１．１６９ｇの２−ヒドロキシピリジンを固体粉末として反応フラスコ内に添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度でおよそ１０分間攪拌した。冷たい流水の水道水を伴うコンデンサーを反応フラスコ上に乗せた。アルゴンラインをコンデンサーの最上部に設置した。１２０℃にあらかじめ加熱した油槽内に反応フラスコを浸し、そして２−ヒドロキシピリジンが完全に溶解するまで、アルゴン下で約１５時間攪拌した。
【０１０６】
[0079]反応混合物を室温に冷却した。吸引装置に連結したロータリーエバポレーター上で、溶媒（トルエン）を除去した。１：３ヘキサン：酢酸エチルを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物１２を精製した。化合物１２収率は４９〜８３％の範囲であった。
【０１０７】
実施例３：スキーム５、工程３：加水分解
[0080]１４．０１９ｇの化合物１２を清浄な２５０ｍＬ 一口丸底反応フラスコ内に移した。清浄なメスシリンダーを用いて、反応フラスコに５０ｍＬのジクロロメタンを添加した。反応混合物を周囲温度で約５分間攪拌し、清浄なメスシリンダーを用いて、１０２ｍＬのトリフルオロ酢酸を反応フラスコ内に添加した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そして周囲温度でおよそ４時間攪拌した。
【０１０８】
[0081]吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（ジクロロメタン）を除去した。１：１アセトン：酢酸エチルを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物１３を精製した。化合物１３収率は６６〜９２％の範囲であった。
【０１０９】
実施例４：スキーム５、工程４：活性化
[0082]化合物１３、１１．０７４ｇを、あらかじめ０℃に設定した循環サーモスタットに連結したジャケット型２５０ｍＬ 一口丸底反応フラスコに移した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンをおよそ１５分間パージした。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、３０ｍＬの無水アセトニトリルを反応フラスコに添加した。反応混合物を、アルゴン下、０℃で、さらに約１５分間攪拌した。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じてゆっくりと、反応フラスコ内に７．２ｍＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを添加した。反応混合物をアルゴン下、０℃で約１０分間攪拌した。
【０１１０】
[0083]１１．１５ｇのＴＳＴＵ（Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−１，１，３，３−テトラメチルウランテトラフルオロボレート；≧９８％、Ｆｌｕｋａ、カタログ番号８５９７２）を５０ｍＬの無水アセトニトリル中に完全に溶解した。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、生じた溶液を反応フラスコ内に添加した。反応混合物をアルゴン下、０℃でおよそ２．５時間攪拌した。
【０１１１】
[0084]吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（アセトニトリル）を除去した。１：９ヘキサン：酢酸エチルを溶出液として用い、フリットディスクを備えた迅速分離カラム／漏斗（ＣｈｅｍＧｌａｓｓカタログ番号ＣＧ−１４１２）を用い、フラッシュクロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物１４を精製した。生成物収率は８５〜９３％であった。
【０１１２】
実施例５：スキーム５、工程５：アミノリシス
[0085]１２．２４１ｇの化合物１４を、あらかじめ０℃に設定した循環サーモスタットに連結した清浄なジャケット型２５０ｍＬ 一口丸底反応フラスコに移した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンを約１５分間パージした。１１０ｍＬのメタノール中の７Ｎアンモニア（約−２０℃にあらかじめ冷却）を添加した際、白色固体（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）の形成が観察された。隔離された条件下（ゴムセプタムで蓋、アルゴンは含まない）、０℃で２．５時間、反応混合物を攪拌した。反応混合物をゆっくりと周囲温度にした。
【０１１３】
[0086]吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを用いて、未反応アンモニアおよび溶媒（メタノール）を除去した。溶媒を除去した際、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドがフラスコ中で結晶化した。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を反応混合物に添加し、そして結晶化したＮ−ヒドロキシスクシンイミドは、溶液から沈殿した。フリット・バックナー漏斗を通じてろ過することによって、結晶を除去した。吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを介して、ろ過した溶液からＴＨＦを除去した。１：９メタノール：酢酸エチルを溶出液として用いた、カラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物１５を精製し、収率は約６０〜７０％であった。
【０１１４】
実施例６：スキーム５、工程６：脱保護
[0087]化合物１５、１．５ｇを清浄な２００ｍＬ 一口丸底反応フラスコ内に移した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そして低流量のアルゴンでおよそ１５分間パージした。清浄なシリンジを用いて、反応フラスコ内に４０ｍＬの無水エタノールを添加した。混合物を、アルゴン下、周囲温度で、約５分間攪拌し、そして次いで、１．３７３ｇのギ酸アンモニウムを固体粉末として反応フラスコ内に添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度で５分間攪拌し、その後、１１ｍＬの脱イオン水を添加した。ギ酸アンモニウムが完全に溶解するまで、アルゴン下、周囲温度でおよそ５分間、攪拌を続けた。１１０℃にあらかじめ加熱した油槽内に反応フラスコを浸し、そしてアルゴン下で約７時間攪拌した。
【０１１５】
[0088]１：９メタノール：酢酸エチルを溶出液として用いたＢｉｏｔａｇｅ（登録商標）カラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物３を精製した。化合物３の単離収率は５０〜７０％であった。
【０１１６】
実施例７：スキーム５、工程７：アミノリシス
[0089]７０ｍｇの化合物１５を、１０ｍＬコニカルフラスコ中の３ｍＬのアセトン中に均一に溶解した。２ｍＬの溶液を抜き取り、そしてシリンジを用いて、空の清浄な５ｍＬコニカルフラスコ内に移した。ロータリーエバポレーターを用いて、５ｍＬフラスコからアセトンを蒸発させた。
【０１１７】
[0090]３ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを、化合物１５を含有するフラスコに添加した。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じてゆっくりと、０．１６４ｍＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを５ｍＬコニカルフラスコ内に添加した。
【０１１８】
[0091]別個に、７６０ｍｇの化合物１６を２００ｍＬ 一口丸底フラスコ（反応フラスコ）内に入れた。磁気攪拌バーを反応フラスコ内に入れた。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンを１５分間パージした。４５ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを反応フラスコ内に添加した。２２を完全に攪拌し、そして超音波槽中で加熱を伴わず穏やかな超音波処理で溶解させた。１：１水：エチレングリコールを満たしたジャケット型ビーカー内に反応フラスコを浸し、そしてあらかじめ０℃に設定した循環サーモスタットに連結した。０℃、アルゴン下での攪拌をさらに１０分間続けた。
【０１１９】
[0092]Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｇａｓｔｉｇｈｔ（登録商標）シリンジを用て、化合物１６を含有する反応フラスコ内に、１０分間に渡って１滴ずつ、化合物１５溶液を添加した。２つの１ｍＬ部分の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドでシリンジをリンスし、そしてリンス液を反応フラスコ内に添加した。反応混合物をアルゴン下、０℃で１時間攪拌した。冷却槽から反応フラスコを除去し、そして室温に到達させた。反応混合物をアルゴン下、室温で６時間攪拌した。
【０１２０】
[0093]２つの溶媒トラップを通じて真空ポンプに連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）を除去した。ジクロロメタン：アセトン（１００％ジクロロメタンから開始して、そして１００％アセトンで終了する）を溶出液として用いたＢｉｏｔａｇｅ（登録商標）カラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物１７を精製した。化合物１７の収率は２３〜３９％であった。
【０１２１】
実施例８：スキーム５、工程８：レベチラセタム免疫原の調製
[0094]８ｍｌ ｐＨ７．２ ＰＢＳ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）中の１６０ｍｇのキーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）の溶液を氷槽中で冷却した。約１１．８ｍＬのＤＭＳＯをＫＬＨ溶液に１滴ずつ添加して、そして室温未満で維持した。１．０ｍＬ ＤＭＳＯ中の３０ｍｇの化合物１７の溶液をＫＬＨ溶液に１滴ずつ添加して、反応混合物を形成し、そして混合物をおよそ４０時間、周囲温度で攪拌させた。生じた免疫原（化合物１８ａ）を透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れて、そして１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の３０％ＤＭＳＯ、その後、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の１０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の５％ＤＭＳＯ中で、室温で連続透析し、そして次いで、４℃で、ｐＨ７．２ ＰＢＳと４回交換した（各１Ｌで少なくとも各６時間）。
【０１２２】
実施例９：スキーム５、工程９：レベチラセタム・コンジュゲートの調製
[0095]２５ｍｌ ｐＨ７．２ ＰＢＳ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）中の４００ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液を氷槽中で冷却した。約１６ｍＬのＤＭＳＯをＢＳＡ溶液に１滴ずつ添加して、そして室温未満で維持した。
【０１２３】
[0096]１．０ｍＬ無水ＤＭＦ中の２８ｍｇの化合物３の溶液に０．２ｍＬ無水Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを添加した。異なる丸底フラスコに、４８ｍｇのカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）および１ｍＬ無水ＤＭＦを添加した。
【０１２４】
[0097]約１０分間の期間に渡って、シリンジを介して、化合物３を含有する溶液をＤＭＦ中のＣＤＩの溶液に１滴ずつ添加して、そして生じた混合物を氷槽中でおよそ５時間攪拌した。
【０１２５】
[0098]約２０分間の期間に渡って、シリンジを用いて、化合物３／ＣＤＩの溶液をＢＳＡ溶液に１滴ずつ添加した。生じた混合物を２〜８℃で一晩攪拌した。生じた化合物１８ｂを透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れて、そして１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の３０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の１０％ＤＭＳＯ中で、４℃で連続透析し、その後、ｐＨ７．２ ＰＢＳと４回交換した（各１Ｌで少なくとも各６時間）。
【０１２６】
実施例１０：スキーム６、工程１：アルキル化
[0099]化合物２０、Ｈ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＯｔＢｕ（Ｂａｃｈｅｍ、カタログ番号Ｅ３５３５、ＣＡＳ番号１０５５９０−９７−４）、５ｇを、清浄な１００ｍＬ 一口丸底フラスコ内に入れた。磁気攪拌バーを反応フラスコ内に入れ、そして反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンを１５分間パージした。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、２０ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを反応フラスコに添加した。反応混合物を、アルゴン下、周囲温度で、さらに１５分間攪拌し、そして次いで、清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、１滴ずつ、２ｍＬの４−ブロモ酪酸エチルをフラスコに添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度で約１０分間攪拌した。冷たい流水の水道水を伴うコンデンサーを反応フラスコ上に乗せ、そしてアルゴンラインをコンデンサーの最上部に設置した。７０℃にあらかじめ加熱した油槽内に反応フラスコを浸し、そしてアルゴン下でおよそ４０時間攪拌した。
【０１２７】
[00100]反応混合物を室温に冷却した。溶媒トラップを通じて真空ポンプに連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（ＤＭＦ）を除去した。蒸発装置コンデンサーコイル冷却剤（１：１エチレングリコール：水）をおよそ−１５℃にあらかじめ冷却した。１：３アセトン：クロロホルムを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物２１を精製した。単離された化合物２１収率は５０〜７０％であった。
【０１２８】
実施例１１：スキーム６、工程２：ラクタム化／環化
[00101]化合物２１、４ｇを清浄な１００ｍＬ 一口丸底フラスコ（反応フラスコ）に移した。フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンをおよそ１５分間パージした。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、１５ｍＬの無水トルエンを反応フラスコに添加した。反応混合物を、アルゴン下、周囲温度で、約１０分間攪拌し、次いで、０．３ｇの２−ヒドロキシピリジンを固体粉末として反応フラスコ内に添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度でおよそ１０分間攪拌した。冷たい流水の水道水を伴うコンデンサーを反応フラスコ上に乗せた。アルゴンラインをコンデンサーの最上部に設置した。１２０℃にあらかじめ加熱した油槽内に反応フラスコを浸し、そして２−ヒドロキシピリジンが完全に溶解するまで、アルゴン下で１５時間攪拌した。
【０１２９】
[00102]反応混合物を室温に冷却した。吸引装置に連結したロータリーエバポレーター上で溶媒（トルエン）を除去した。１：３ヘキサン：酢酸エチルを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物２２を精製した。化合物２２収率は４０〜７０％の範囲であった。
【０１３０】
実施例１２：スキーム６、工程３：加水分解
[00103]２ｇの化合物２２を清浄な１００ｍＬ 一口丸底反応フラスコに移した。清浄なメスシリンダーを用いて、反応フラスコに１０ｍＬのジクロロメタンを添加した。反応混合物を周囲温度で約５分間攪拌し、そして次いで、清浄なメスシリンダーを用いて、１０ｍＬのトリフルオロ酢酸を反応フラスコ内に添加した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そして周囲温度でおよそ４時間攪拌した。
【０１３１】
[00104]吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（ジクロロメタン、トリフルオロ酢酸）を除去した。１：１アセトン：酢酸エチルを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物２３を精製した。化合物２３収率は７０〜９０％の範囲であった。
【０１３２】
実施例１３：スキーム６、工程４：アミノリシス
[00105]化合物２３、１．７５ｇを、あらかじめ０℃に設定した循環サーモスタットに連結したジャケット型１００ｍＬ 一口丸底反応フラスコに移した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンをおよそ１５分間パージした。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、５ｍＬの無水アセトニトリルを反応フラスコに添加した。反応混合物を、アルゴン下、０℃で、さらに約１５分間攪拌した。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じてゆっくりと、反応フラスコ内に２ｍＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを添加した。反応混合物は淡黄色からより深い黄色に変化した。反応混合物をアルゴン下、０℃で約１０分間攪拌した。
【０１３３】
[00106]１．８０ｇのＴＳＴＵ（Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−１，１，３，３−テトラメチルウランテトラフルオロボレート）を１０ｍＬの無水アセトニトリル中に完全に溶解した。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、生じた溶液を反応フラスコ内に添加した。反応混合物をアルゴン下、０℃でおよそ２．５時間攪拌した。
【０１３４】
[00107]吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（アセトニトリル）を除去した。迅速分離を用いたフラッシュクロマトグラフィーを用いて、中間体を精製した。
【０１３５】
[00108]１．６ｇの中間体を、あらかじめ０℃に設定した循環サーモスタットに連結した清浄なジャケット型１００ｍＬ 一口丸底反応フラスコに移した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンを約１５分間パージした。２０ｍＬのメタノール中の７Ｎアンモニア（約−２０℃にあらかじめ冷却）を添加した際、白色固体（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）の形成が観察された。隔離された条件下（ゴムセプタムで蓋、アルゴンは含まない）、０℃で約２．５時間、反応混合物を攪拌した。反応混合物をゆっくりと周囲温度にした。
【０１３６】
[00109]吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを用いて、未反応アンモニアおよび溶媒（メタノール）を除去した。溶媒を除去した際、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドがフラスコ中で結晶化した。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を反応混合物に添加し、そして結晶化したＮ−ヒドロキシスクシンイミドは、溶液から沈殿した。フリット・バックナー漏斗を通じてろ過することによって、結晶を除去した。吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを介して、ろ過した溶液からＴＨＦを除去した。１：９メタノール：酢酸エチルを溶出液として用いた、カラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物２４を精製し、収率は約５０〜６０％であった。
【０１３７】
実施例１４：スキーム６、工程５：脱保護
[00110]化合物２４、１．５ｇを清浄な２００ｍＬ 一口丸底反応フラスコ内に移した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そして低流量のアルゴンでおよそ１５分間パージした。清浄なシリンジを用いて、反応フラスコ内に４０ｍＬの無水エタノールを添加した。混合物を、アルゴン下、周囲温度で、約５分間攪拌し、そして次いで、１．４ｇのギ酸アンモニウムを固体粉末として反応フラスコ内に添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度で５分間攪拌し、その後、１０ｍＬの脱イオン水を添加した。ギ酸アンモニウムが完全に溶解するまで、アルゴン下、周囲温度でおよそ５分間、攪拌を続けた。１１０℃にあらかじめ加熱した油槽内に反応フラスコを浸し、そしてアルゴン下で約７時間攪拌した。
【０１３８】
[00111]１：９メタノール：酢酸エチルを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物２５を精製した。化合物２５の収率は５０〜７０％であった。
【０１３９】
実施例１５：スキーム６、工程６：活性化
[00112]化合物２５、１．９０ｇを、あらかじめ０℃に設定した循環サーモスタットに連結したジャケット型１００ｍＬ 一口丸底反応フラスコに移した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンをおよそ１５分間パージした。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、５ｍＬの無水ＤＭＦを反応フラスコに添加した。反応混合物を、アルゴン下、０℃で、さらに約１５分間攪拌した。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じてゆっくりと、反応フラスコ内に２ｍＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを添加した。反応混合物をアルゴン下、０℃で約１０分間攪拌した。
【０１４０】
[00113]１．９５ｇのＴＳＴＵ（Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−１，１，３，３−テトラメチルウランテトラフルオロボレート）を５ｍＬの無水ＤＭＦ中に完全に溶解した。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、生じた溶液を反応フラスコ内に添加した。反応混合物をアルゴン下、０℃でおよそ２．５時間攪拌した。
【０１４１】
[00114]吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（ＤＭＦ）を除去した。フラッシュクロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物２６を精製した。化合物２６収率は６０〜７０％であった。
【０１４２】
実施例１６：スキーム６、工程７：レベチラセタム免疫原の調製
[00115]８ｍｌ ｐＨ７．２ ＰＢＳ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）中の１６０ｍｇのキーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）の溶液を氷槽中で冷却した。約１１．８ｍＬのＤＭＳＯをＫＬＨ溶液に１滴ずつ添加して、そして室温未満で維持した。１．０ｍＬ ＤＭＳＯ中の３２ｍｇの化合物２６の溶液をＫＬＨ溶液に１滴ずつ添加して、反応混合物を形成した。反応混合物をおよそ４０時間、室温で攪拌させた。生じたＫＬＨ免疫原２７を透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れて、そして１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の３０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の１０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の５％ＤＭＳＯ中で、室温で連続透析し、その後、４℃で、ｐＨ７．２ ＰＢＳと４回交換した（各１Ｌで少なくとも各６時間）。
【０１４３】
実施例１７：スキーム６、工程７：レベチラセタム・コンジュゲートの調製
[00116]８ｍｌ ｐＨ７．２ ＰＢＳ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）中の４００ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液を氷槽中で冷却した。約１１．８ｍＬのＤＭＳＯをＢＳＡ溶液に１滴ずつ添加して、そして室温未満で維持した。１．０ｍＬ ＤＭＳＯ中の３２ｍｇの化合物２６の溶液を、ＢＳＡ溶液に１滴ずつ添加して、反応混合物を形成した。反応混合物を４０時間、室温で攪拌させた。生じたＢＳＡコンジュゲート、化合物２８を透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れて、そして１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の３０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の１０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の５％ＤＭＳＯ中で、室温で連続透析し、そして次いで、４℃で、ｐＨ７．２ ＰＢＳと４回交換した（各１Ｌで少なくとも各６時間）。
【０１４４】
実施例１８：スキーム７、工程１：アルキル化
[00117]化合物２９、Ｈ−Ｃｙｓ（ＯＢｚｌ）−ＯＭｅ（Ｂａｃｈｅｍ、カタログ番号Ｅ１５４５、ＣＡＳ番号１６７４１−８０−３）、４．５ｇを、清浄な１００ｍＬ 一口丸底フラスコ内に入れた。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンを１５分間パージした。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、２０ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを反応フラスコに添加した。反応混合物を、アルゴン下、周囲温度で、およそ１５分間攪拌した。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、１滴ずつ、２ｍＬの４−ブロモ酪酸エチルをフラスコに添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度で１０分間攪拌した。冷たい流水の水道水を伴うコンデンサーを反応フラスコ上に乗せ、そしてアルゴンラインをコンデンサーの最上部に設置した。７０℃にあらかじめ加熱した油槽内に反応フラスコを浸し、そしてアルゴン下で４０時間攪拌した。
【０１４５】
[00118]反応混合物を室温に冷却した。溶媒トラップを通じて真空ポンプに連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（ＤＭＦ）を除去した。蒸発装置コンデンサーコイル冷却剤（１：１エチレングリコール：水）をおよそ−１５℃にあらかじめ冷却した。１：３アセトン：クロロホルムを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物３０を精製した。単離された化合物３０収率は５０〜７０％であった。
【０１４６】
実施例１９：スキーム７、工程２：ラクタム化／環化
[00119]化合物３０、３．９ｇを清浄な１００ｍＬ 一口丸底フラスコ（反応フラスコ）に移した。フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしておよそ１５分間パージし、次いで、清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、１５ｍＬの無水トルエンを反応フラスコ内に添加した。反応混合物を、アルゴン下、周囲温度で、約１０分間攪拌し、次いで、０．３１ｇの２−ヒドロキシピリジンを固体粉末として反応フラスコ内に添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度でおよそ１０分間攪拌した。冷たい流水の水道水を伴うコンデンサーを反応フラスコ上に乗せた。アルゴンラインをコンデンサーの最上部に設置した。１２０℃にあらかじめ加熱した油槽内に反応フラスコを浸し、そして２−ヒドロキシピリジンが完全に溶解するまで、アルゴン下で１５時間攪拌した。
【０１４７】
[00120]反応混合物を室温に冷却した。吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（トルエン）を除去した。１：３ヘキサン：酢酸エチルを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物３１を精製した。化合物３１収率は５０〜７０％の範囲であった。
【０１４８】
実施例２０：スキーム７、工程３：加水分解
[00121]２．１ｇの化合物３１を清浄な１００ｍＬ 一口丸底反応フラスコ内に移した。反応フラスコに１０ｍＬのメタノールおよび１０ｍＬの脱イオン水を添加した。２００ｍｇのＬｉＯＨをフラスコに添加した。反応混合物を周囲温度で約４時間攪拌した。
【０１４９】
[00122]吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（メタノール、水）を除去した。１：１アセトン：酢酸エチルを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物３２を精製した。化合物３２収率は７０〜９０％の範囲であった。
【０１５０】
実施例２１：スキーム７、工程４：アミノリシス
[00123]化合物３２、１．８０ｇを、あらかじめ０℃に設定した循環サーモスタットに連結したジャケット型１００ｍＬ 一口丸底反応フラスコに移した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンをおよそ１５分間パージした。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、５ｍＬの無水アセトニトリルを反応フラスコに添加した。反応混合物を、アルゴン下、０℃で、さらに約１５分間攪拌した。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じてゆっくりと、反応フラスコ内に２ｍＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを添加した。反応混合物は、淡黄色からより深い黄色に変化した。反応混合物をアルゴン下、０℃で約１０分間攪拌した。
【０１５１】
[00124]１．８５ｇのＴＳＴＵ（Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−１，１，３，３−テトラメチルウランテトラフルオロボレート）を１０ｍＬの無水アセトニトリル中に完全に溶解した。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、生じた溶液を反応フラスコ内に添加し、そしてアルゴン下、０℃でおよそ２．５時間攪拌した。
【０１５２】
[00125]吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（アセトニトリル）を除去した。迅速分離を用いたフラッシュクロマトグラフィーを用いて、中間体を精製した。
【０１５３】
[00126]１．６２ｇの中間体を、あらかじめ０℃に設定した循環サーモスタットに連結した清浄なジャケット型１００ｍＬ 一口丸底反応フラスコに移した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンを約１５分間パージした。２０ｍＬのメタノール中の７Ｎアンモニア（約−２０℃にあらかじめ冷却）を添加した際、白色固体（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）の形成が観察された。隔離された条件下（ゴムセプタムで蓋、アルゴンは含まない）、０℃で２．５時間、反応混合物を攪拌した。反応混合物をゆっくりと周囲温度にした。
【０１５４】
[00127]吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを用いて、未反応アンモニアおよび溶媒（メタノール）を除去した。１：９メタノール：酢酸エチルを溶出液として用いた、カラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物３３を精製し、収率は約５０〜６０％であった。
【０１５５】
実施例２２：スキーム７、工程５：脱保護
[00128]化合物３３、１．５１ｇを清浄な２００ｍＬ 一口丸底反応フラスコ内に移した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そして低流量のアルゴンでおよそ１５分間パージした。清浄なシリンジを用いて、反応フラスコ内に４０ｍＬの無水エタノールを添加した。混合物を、アルゴン下、周囲温度で、約５分間攪拌し、そして次いで、１．４ｇのギ酸アンモニウムを固体粉末として反応フラスコ内に添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度で５分間攪拌し、その後、１０ｍＬの脱イオン水を添加した。ギ酸アンモニウムが完全に溶解するまで、アルゴン下、周囲温度でおよそ５分間、攪拌を続けた。１１０℃にあらかじめ加熱した油槽内に反応フラスコを浸し、そしてアルゴン下で約７時間攪拌した。
【０１５６】
[00129]１：９メタノール：酢酸エチルを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物３４を精製した。化合物３４の収率は５０〜７０％であった。
【０１５７】
実施例２３：スキーム７、工程７：レベチラセタム免疫原の調製
[00130]３ｍｌ ｐＨ７．２ ＰＢＳ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）中の６０ｍｇのキーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）の溶液を氷槽中で冷却した。一方の端にＮＨＳエステルおよびもう一方の端にマレイミド基を含有するヘテロ二官能性架橋剤である１０．２ｍｇのｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を、０．５ｍＬ ＤＭＳＯ中に溶解し、そしてＭＢＳ溶液を氷槽中で冷却しながらＫＬＨ溶液に１滴ずつ添加した。反応混合物を氷槽中で４時間攪拌した。ＰＤ−１０脱塩カラムを介してＫＬＨ−ＭＢＳコンジュゲートを精製した（過剰なＭＢＳを除去するため）。
【０１５８】
[00131]１０．２ｍｇの化合物３４を０．５ｍＬ ＤＭＳＯ中に溶解し、そして生じた溶液を氷槽中で冷却しながら、精製ＫＬＨ−ＭＢＳ溶液に１滴ずつ添加した。混合物を室温で２時間攪拌した。生じた免疫原、化合物３７を透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れて、そして１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の３０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の１０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の５％ＤＭＳＯ中で、室温で連続透析し、その後、４℃で、ｐＨ７．２ ＰＢＳと４回交換した（各１Ｌで少なくとも各６時間）。
【０１５９】
実施例２４：スキーム７、工程８：レベチラセタム・コンジュゲートの調製
[00132]５ｍｌ ｐＨ７．２ ＰＢＳ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）中の１００ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液を氷槽中で冷却する。１０．２ｍｇのＭＢＳを、０．５ｍＬ ＤＭＳＯ中に溶解し、そして次いでＭＢＳ溶液を氷槽中で冷却しながらＢＳＡ溶液に１滴ずつ添加した。反応混合物を氷槽中で４時間攪拌させた。ＰＤ−１０脱塩カラムを介してＢＳＡ−ＭＢＳコンジュゲートを精製した（過剰なＭＢＳを除去するため）。
【０１６０】
[00133]１２．３ｍｇの化合物３４を０．５ｍＬ ＤＭＳＯ中に溶解し、そして生じた溶液を氷槽中で冷却しながら、精製ＢＳＡ−ＭＢＳ溶液に１滴ずつ添加した。混合物を室温で２時間攪拌した。生じたコンジュゲート、化合物３８を透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れて、そして１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の３０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の１０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の５％ＤＭＳＯ中で、室温で連続透析し、その後、４℃で、ｐＨ７．２ ＰＢＳと４回交換した（各１Ｌで少なくとも各６時間）。
【０１６１】
実施例２５：スキーム８、工程１：求核アシル付加
[00134]２１０ｍｇの化合物３９、ＦＭＯＣ−Ｐｒｏ−ＯＨ（Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−プロリン、Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号３３８３４−６）、７０ｍｇ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および２ｍＬ無水ＤＭＦを、磁気スターラーとともに１００ｍＬ丸底フラスコ中に入れた。混合物を氷冷メタノール槽上で冷却し、そして０．２ｍＬの３．５Ｍ ＤＣＣ（ＤＭＦ中のジシクロヘキシルカルボジイミド）で処理した。反応混合物をアルゴン下で１５分間、氷冷メタノール槽中で攪拌し、そしてさらに０．１ｍＬのＤＣＣ溶液を添加した。混合物をゆっくりと室温にしながら、そして次いで、アルゴン下、室温で一晩、攪拌した。
【０１６２】
[00135]１ｍＬのＮ−ベンジルエチレンジアミンおよび５ｍＬ無水ＤＭＦを、磁気スターラーとともに反応フラスコ中に入れた。フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンを約１５分間パージした。ＤＭＦ溶液中の活性化されたＦＭＯＣ−Ｐｒｏ−ＯＨを、シリンジを介して、ＤＭＦ溶液中のＮ−ベンジルエチレンジアミンにゆっくりと添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度でさらに６時間攪拌した。
【０１６３】
[00136]溶媒トラップを通じて真空ポンプに連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（ＤＭＦ）を除去した。蒸発装置コンデンサーコイル冷却剤（１：１エチレングリコール：水）をおよそ−１５℃にあらかじめ冷却した。１：９ヘキサン：クロロホルムを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物４０を精製した。単離された化合物４０収率は６０〜７０％であった。
【０１６４】
実施例２６：スキーム８、工程２：脱保護
[00137]化合物４０、２００ｍｇを清浄な１００ｍＬ 一口丸底フラスコ（反応フラスコ）に移した。１０ｍＬの無水ＤＭＦおよび５ｍＬピペリジンを反応フラスコ内に添加して、そして反応混合物をアルゴン下、周囲温度で４時間攪拌した。
【０１６５】
[00138]吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（ＤＭＦ、ピペリジン）を除去した。２：８メタノール：塩化メチレン（ジクロロメタン）を溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物４１を精製した。化合物４１収率は５０〜７０％の範囲であった。
【０１６６】
実施例２７：スキーム８、工程３：アルキル化
[00139]化合物４１を、清浄な１００ｍＬ 一口丸底フラスコに入れた。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンを１５分間パージした。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、２０ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを反応フラスコに添加し、そして反応混合物を、アルゴン下、周囲温度で、さらに１５分間攪拌した。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、１滴ずつ、２ｍＬの２−ブロモ酪酸エチルをフラスコに添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度で１０分間攪拌した。冷たい流水の水道水を伴うコンデンサーを反応フラスコ上に乗せ、そしてアルゴンラインをコンデンサーの最上部に設置した。７０℃にあらかじめ加熱した油槽中に反応フラスコを浸し、そしてアルゴン下で４０時間攪拌した。
【０１６７】
[00140]反応混合物を室温に冷却した。溶媒トラップを通じて真空ポンプに連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（ＤＭＦ）を除去した。蒸発装置コンデンサーコイル冷却剤（１：１エチレングリコール：水）をおよそ−１５℃にあらかじめ冷却した。１：３アセトン：クロロホルムを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物４２を精製した。単離された化合物４２収率は５０〜７０％であった。
【０１６８】
実施例２８：スキーム８、工程４：脱保護
[00141]２０ｍＬの濃水酸化アンモニウムに、２．０ｇの化合物４２および０．１ｇ塩化アンモニウムを添加した。混合物を１００℃で攪拌しながらおよそ７時間加熱し、そして次いで室温に冷却した。生じた沈殿物をろ過し、そして水およびジエチルエーテルを洗浄した。中間体の収率は６０〜７０％であった。
【０１６９】
[00142]１．０ｇの中間体を、清浄な１００ｍＬ 一口丸底反応フラスコ内に移した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そして低流量のアルゴンでおよそ１５分間パージした。清浄なシリンジを用いて、反応フラスコに２０ｍＬの無水エタノールを添加した。混合物を、アルゴン下、周囲温度で、約５分間攪拌し、そして次いで、０．８ｇのギ酸アンモニウムを固体粉末として反応フラスコ内に添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度で５分間攪拌し、その後、５ｍＬの脱イオン水を添加した。ギ酸アンモニウムが完全に溶解するまで、アルゴン下、周囲温度でおよそ５分間、攪拌を続けた。１１０℃にあらかじめ加熱した油槽内に反応フラスコを浸し、そしてアルゴン下で約７時間攪拌した。
【０１７０】
[00143]１：９メタノール：酢酸エチルを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物４３を精製した。単離された所望の生成物の収率はおよそ５０％であった。
【０１７１】
実施例２９：スキーム８、工程５：レベチラセタム免疫原の調製
[00144]８ｍｌ ｐＨ７．２ ＰＢＳ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）中の１６０ｍｇのＫＬＨの溶液を氷槽中で冷却した。約１２ｍＬのＤＭＳＯをＫＬＨ溶液に１滴ずつ添加し、そして室温未満に維持した。
【０１７２】
[00145]１．０ｍＬ無水ＤＭＦ中の２９ｍｇの化合物４３の溶液を０．２ｍＬ無水Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンに添加した。別個の丸底フラスコに、４８ｍｇのＣＤＩ（カルボニルジイミダゾール）および１ｍＬ無水ＤＭＦを添加した。
【０１７３】
[00146]約１０分間の期間に渡って、シリンジを介して１滴ずつ、化合物４３を含有する溶液をＣＤＩ／ＤＭＦ溶液に添加し、そして次いで、氷槽中でおよそ５時間攪拌した。
[00147]シリンジを用いて、化合物４３／ＣＤＩ溶液をＫＬＨ溶液に１滴ずつ２０分間に渡って添加した。混合物を２〜８℃で一晩攪拌した。生じた免疫原、化合物４４を透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れて、そして１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の３０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の１０％ＤＭＳＯ中で、４℃で連続透析し、その後、ｐＨ７．２ ＰＢＳと４回交換した（各１Ｌで少なくとも各６時間）。
【０１７４】
実施例３０：スキーム８、工程６：レベチラセタム・コンジュゲートの調製
[00148]２５ｍｌ ｐＨ７．２ ＰＢＳ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）中の４００ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液を氷槽中で冷却した。約１６ｍＬのＤＭＳＯをＫＬＨ溶液に１滴ずつ添加して、そして室温未満で維持した。
【０１７５】
[00149]１．０ｍＬ無水ＤＭＦ中の２８ｍｇの化合物４３の溶液を０．２ｍＬ無水Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンに添加した。別個の丸底フラスコに、４８ｍｇのＣＤＩ（カルボニルジイミダゾール）および１ｍＬ無水ＤＭＦを添加した。
【０１７６】
[00150]１０分間の期間に渡って、シリンジを介して１滴ずつ、化合物４３を含有する溶液をＣＤＩ／ＤＭＦ溶液に添加し、そして次いで、氷槽中で約５時間攪拌した。
[00151]次いで、シリンジを用いて、溶液をタンパク質溶液に１滴ずつ２０分間に渡って添加した。混合物を２〜８℃で一晩攪拌した。生じたレベチラセタム・コンジュゲート、化合物４５を透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れて、そして１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の３０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の１０％ＤＭＳＯ中で、４℃で連続透析し、その後、ｐＨ７．２ ＰＢＳと４回交換した（各１Ｌで少なくとも各６時間）。
【０１７７】
実施例３１：スキーム９、工程１：求核アシル付加
[00152]２０５ｍｇの化合物４６、ＢＯＣ−Ｐｒｏ−ＯＨ（Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−プロリン、Ｂａｃｈｅｍカタログ番号Ａ−２２３５、７０ｍｇ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および２ｍＬ無水ＤＭＦを、磁気スターラーとともに１００ｍＬ丸底フラスコ中に入れた。混合物を氷冷メタノール槽上で冷却し、そして０．２ｍＬの３．５Ｍ ＤＣＣ（ＤＭＦ中のジシクロヘキシルカルボジイミド）で処理し、そして次いで、アルゴン下で１５分間氷冷メタノール槽中で攪拌し、その後、さらに０．１ｍＬのＤＣＣ溶液を添加した。反応混合物をゆっくりと室温にしながら攪拌を続けた。反応混合物を、アルゴン下、室温で一晩、攪拌した。
【０１７８】
[00153]１ｍＬのＮ−ベンジルエチレンジアミンおよび５ｍＬ無水ＤＭＦを、磁気スターラーとともに反応フラスコ中に入れた。フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンを１５分間パージした。ＤＭＦ溶液中の活性化されたＦＭＯＣ−Ｐｒｏ−ＯＨを、シリンジを介して、ＤＭＦ溶液中のＮ−ベンジルエチレンジアミンにゆっくりと添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度でさらに６時間攪拌した。
【０１７９】
[00154]溶媒トラップを通じて真空ポンプに連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（ＤＭＦ）を除去した。蒸発装置コンデンサーコイル冷却剤（１：１エチレングリコール：水）をおよそ−１５℃にあらかじめ冷却した。１：９ヘキサン：クロロホルムを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物４７を精製した。単離された化合物４７収率は６５〜７５％であった。
【０１８０】
実施例３２：スキーム９、工程２：脱保護
[00155]２００ｍｇの化合物４７を清浄な１００ｍＬ 一口丸底反応フラスコ内に移した。清浄なメスシリンダーを用いて、反応フラスコに２５ｍＬのジクロロメタンを添加した。反応混合物を周囲温度で約５分間攪拌し、清浄なメスシリンダーを用いて、２５ｍＬのトリフルオロ酢酸を反応フラスコ内に添加した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そして周囲温度でおよそ４時間攪拌した。
【０１８１】
[00156]吸引装置に連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（ジクロロメタン）を除去した。２：８メタノール：塩化メチレン（ジクロロメタン）を溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物４１を精製した。化合物４１収率は５０〜７０％の範囲であった。
【０１８２】
実施例３３：スキーム８、工程３：アルキル化
[00157]化合物４１を、清浄な１００ｍＬ 一口丸底フラスコ内に入れた。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そしてアルゴンを１５分間パージした。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、２０ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを反応フラスコに添加し、そして反応混合物を、アルゴン下、周囲温度で、さらに１５分間攪拌した。清浄なシリンジを用い、セプタムを通じて、１滴ずつ、２ｍＬの２−ブロモ酪酸エチルをフラスコに添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度で１０分間攪拌した。冷たい流水の水道水を伴うコンデンサーを反応フラスコ上に乗せ、そしてアルゴンラインをコンデンサーの最上部に設置した。７０℃にあらかじめ加熱した油槽中に反応フラスコを浸し、そしてアルゴン下で４０時間攪拌した。
【０１８３】
[00158]反応混合物を室温に冷却した。溶媒トラップを通じて真空ポンプに連結したロータリーエバポレーターを用いて、溶媒（ＤＭＦ）を除去した。蒸発装置コンデンサーコイル冷却剤（１：１エチレングリコール：水）をおよそ−１５℃にあらかじめ冷却した。１：３アセトン：クロロホルムを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物４２を精製した。単離された化合物４２収率は５０〜７０％であった。
【０１８４】
実施例３４：スキーム８、工程４：脱保護
[00159]２０ｍＬの濃水酸化アンモニウムに、２．０ｇの化合物４２および０．１ｇ塩化アンモニウムを添加した。混合物を１００℃で攪拌しながらおよそ７時間加熱し、そして次いで室温に冷却した。生じた沈殿物をろ過し、そして水およびジエチルエーテルで洗浄した。中間体の収率は６０〜７０％であった。
【０１８５】
[00160]１．０ｇの中間体を、清浄な１００ｍＬ 一口丸底反応フラスコ内に移した。反応フラスコにゴムのセプタムで蓋をし、そして低流量のアルゴンでおよそ１５分間パージした。清浄なシリンジを用いて、反応フラスコに２０ｍＬの無水エタノールを添加した。混合物を、アルゴン下、周囲温度で、約５分間攪拌し、そして次いで、０．８ｇのギ酸アンモニウムを固体粉末として反応フラスコ内に添加した。反応混合物をアルゴン下、周囲温度で５分間攪拌し、その後、５ｍＬの脱イオン水を添加した。ギ酸アンモニウムが完全に溶解するまで、アルゴン下、周囲温度でおよそ５分間、攪拌を続けた。１１０℃にあらかじめ加熱した油槽内に反応フラスコを浸し、そしてアルゴン下で約７時間攪拌した。
【０１８６】
[00161]１：９メタノール：酢酸エチルを溶出液として用いたカラム液体クロマトグラフィーを用いて、所望の生成物、化合物４３を精製した。単離された所望の生成物の収率はおよそ５０％であった。
【０１８７】
実施例３５：スキーム８、工程５：レベチラセタム免疫原の調製
[00162]８ｍｌ ｐＨ７．２ ＰＢＳ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）中の１６０ｍｇのＫＬＨの溶液を氷槽中で冷却した。約１２ｍＬのＤＭＳＯをＫＬＨ溶液に１滴ずつ添加し、そして室温未満に維持した。
【０１８８】
[00163]１．０ｍＬ無水ＤＭＦ中の２９ｍｇの化合物４３の溶液を０．２ｍＬ無水Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンに添加した。別個の丸底フラスコに、４８ｍｇのＣＤＩ（カルボニルジイミダゾール）および１ｍＬ無水ＤＭＦを添加した。
【０１８９】
[00164]約１０分間の期間に渡って、シリンジを介して１滴ずつ、化合物４３を含有する溶液をＣＤＩ／ＤＭＦ溶液に添加し、そして次いで、氷槽中でおよそ５時間攪拌した。
[00165]シリンジを用いて、化合物４３／ＣＤＩ溶液をＫＬＨ溶液に１滴ずつ２０分間に渡って添加した。混合物を２〜８℃で一晩攪拌した。生じた免疫原、化合物４４を透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れて、そして１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の３０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の１０％ＤＭＳＯ中で、４℃で連続透析し、そしてその後、ｐＨ７．２ ＰＢＳと４回交換した（各１Ｌで少なくとも各６時間）。
【０１９０】
実施例３６：スキーム８、工程６：レベチラセタム・コンジュゲートの調製
[00166]２５ｍｌ ｐＨ７．２ ＰＢＳ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）中の４００ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液を氷槽中で冷却した。約１６ｍＬのＤＭＳＯをＫＬＨ溶液に１滴ずつ添加して、そして室温未満で維持した。
【０１９１】
[00167]１．０ｍＬ無水ＤＭＦ中の２８ｍｇの化合物４３の溶液を０．２ｍＬ無水Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンに添加した。別個の丸底フラスコに、４８ｍｇのカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）および１ｍＬ無水ＤＭＦを添加した。
【０１９２】
[00168]１０分間の期間に渡って、シリンジを介して１滴ずつ、化合物４３を含有する溶液をＣＤＩ／ＤＭＦ溶液に添加し、そして次いで、氷槽中で約５時間攪拌した。
[00169]次いで、シリンジを用いて、溶液をタンパク質溶液に１滴ずつ２０分間に渡って添加した。混合物を２〜８℃で一晩攪拌した。生じたレベチラセタム・コンジュゲート、化合物４５を透析チューブ（１０，０００ＭＷカットオフ）に入れて、そして１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の３０％ＤＭＳＯ、次いで、１ＬのｐＨ７．２ ＰＢＳ中の１０％ＤＭＳＯ中で、４℃で連続透析し、その後、ｐＨ７．２ ＰＢＳと４回交換した（各１Ｌで少なくとも各６時間）。
【０１９３】
実施例３７：抗体産生
[00170]上述のように、免疫原を用いて、ＬＥＶと特異的に結合するポリクローナル抗体を調製する。より具体的には、ＫＬＨ免疫原性部分を有する免疫原１８ａ、２７、３７、および４４を用いて、抗レベチラセタム・ポリクローナル抗体を生成する。約０．５ｍＬの免疫原含有組成物を、約０．５ｍＬのフロイントのアジュバントと混合することによって、免疫原性組成物を調製する。次いで、生じた１ｍＬ免疫原性カクテルを動物、例えばヒツジ、ヤギ、ウサギまたは他の哺乳動物に注射する。抗レベチラセタム・ポリクローナル抗体産生を誘導するため、同様の免疫原性カクテルを用いた続く免疫原性注射を、およそ４週間ごとに動物に投与する。
【０１９４】
[00171]抗体組成物には、少なくとも１つの結合ドメインを有する抗レベチラセタム抗体が含まれてもよく、ここで、抗体は、患者標本中に存在するＬＥＶに結合可能であるか、またはＬＥＶ誘導体に結合可能である。また、抗体は、少なくとも約１：５，０００、または少なくとも約１：１０，０００、または少なくとも約１：５０，０００、または少なくとも約１：１００，０００、または少なくとも約１：３００，０００の力価で存在しうる。アッセイ条件に応じて、１：５，０００程度に低いかまたは１：３００，０００程度に高い抗体力価を有することが好ましい可能性もある。
【０１９５】
[00172]さらに、抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよい。抗体は、均一、不均一、またはその他の免疫診断アッセイで使用するのに十分である、ＬＥＶに比較したＬＥＶ誘導体に対するアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つを有してもよい。こうしたものとして、抗体およびＬＥＶ誘導体間の相互作用は、患者標本中に存在するＬＥＶに対する抗体のアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つの少なくとも５０％、さらにより好ましくは、ＬＥＶに対する抗体のアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つの少なくとも７０％、最も好ましくは、ＬＥＶに対する抗体のアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つの少なくとも９０％であってもよい。場合によって、ＬＥＶ誘導体に対する抗体のアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つは、ＬＥＶに対するものと実質的に同じである。
【０１９６】
実施例３８：抗体力価の決定
[00173]当該技術分野に知られるようなＥＬＩＳＡイムノアッセイにおける成績によって、抗体をスクリーニングした。ＥＬＩＳＡアッセイに用いるためのマルチウェルプレートを調製して、実施例３７に記載するように調製したポリクローナル抗体を試験した。抗レベチラセタム抗体に曝露する前に、異なるマルチウェルプレート中のウェルの底にＬＥＶ誘導体をコーティングすることによって、レベチラセタム誘導体、すなわち化合物１８ｂおよび１９を、抗体に結合するための抗原として用いた。より具体的には、レベチラセタム誘導体をコーティング緩衝液中で希釈し、そして次いでマルチウェルプレートのウェルに添加した。３７℃で約６０分間インキュベーションした後、コーティング緩衝液中の溶媒をデカントし、そしてＢＳＡまたはカゼインを含有するブロッキング緩衝液をプレートに添加した。プレートを再び３７℃で６０分間インキュベーションし、そしてブロッキング緩衝液中の溶媒をプレートからデカントした。いくつかのＥＬＩＳＡプレートは、調製後、数時間以内に使用されたが、他のものは、ウェル中にブロッキング溶液を含んだまま、２〜８℃で最長１週間保存された。
【０１９７】
[00174]上記のように調製したＥＬＩＳＡプレートを用いて、実施例３７にしたがって、特に免疫原１８ａを用いて調製したポリクローナル抗体に関する抗体力価を決定した。１：１０〜１：２０００の間、１０倍増分の抗体の連続希釈を、ｐＨ７．４であり、そして０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で調製した。１００μＬ体積の各希釈をＥＬＩＳＡプレート上の別個のウェルに添加した。プレートを３７℃でおよそ６０分間インキュベーションし、そしてｐＨ７．４で０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む２５０μＬのＰＢＳで３回洗浄した。次に、ｐＨ７．４であり、そして０．１％ＢＳＡを含有する１２５μＬのＰＢＳ中の酵素コンジュゲート化二次抗体（抗ヒツジＩｇＧ抗体）をプレートの各ウェルに添加した。あるいは、抗レベチラセタム抗体を酵素または他の検出可能標識に直接コンジュゲート化してもよく、そして酵素標識二次抗体を添加する工程を除いてもよい。プレートを３７℃でおよそ６０分間インキュベーションした。プレートのウェルを上述のように洗浄した。洗浄後、約１２５μＬのＡＢＴＳ基質を各ウェルに添加し、そしてマルチウェルプレートを再び２０分間インキュベーションした。４０５ｎｍの波長でマルチウェルプレート読み取り装置を用いて吸光度値を得て、そして力価値を計算した。力価結果を表３に提供する。
【０１９８】
表３
【０１９９】
【表３】
【０２００】
実施例３９：抗体アビディティの決定
[00175]結合阻害研究によって、免疫原１８ａを用いて調製した抗レベチラセタム抗体の、多様なレベチラセタム誘導体に対するアビディティを決定した。ｐＨ７．４で０．１％ＢＳＡを含む１ｍＬのＰＢＳ中で試料を調製した。３０％Ｂｍａｘ力価または５０％Ｂｍａｘ力価を有する組成物を用いて、実施例３８で得られるような力価値を、およそ半分の力価値にした。３０％Ｂｍａｘを用いて、試料調製段階中、１：１００００の抗体力価を１：５０００に希釈した。異なる濃度またはキャリブレーター値（０、５、１０、２０、４０、８０μｇ／ｍｌ）の約５０μＬのレベチラセタムを実施例３８にしたがって調製されるようなプレートに適用した。約５０μＬの希釈抗体をプレート内に分配して、そしてプレート中の組成物を水平プレート振盪装置上で１分間混合した。プレートの第一列には、レベチラセタムもまた抗レベチラセタム抗体も添加せず、これは陰性対照として働いた。抗レベチラセタム抗体を含むがレベチラセタムを含まない第二列を陽性対照として用いた。プレートを６０分間インキュベーションし、そしてｐＨ７．４で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２５０μＬのＰＢＳで３回洗浄した。約１２５μＬの例えばｐＨ７．４のＰＢＳ中の希釈誘導体、例えば１８ｂまたは１９をプレートの各ウェルに添加した。プレートを３７℃で６０分間インキュベーションし、そして上述のように洗浄した。およそ１２５μＬのＡＢＴＳ基質をプレートの各ウェルに添加し、そして２０分間インキュベーションした。４０５ｎｍでマルチウェルプレート読み取り装置を用いて、吸光度値を得て、そして結果を表４に提供する。
【０２０１】
表４
【０２０２】
【表４】
【０２０３】
[00176]本明細書において、用語「ハプテン」は、部分的または不完全抗原を指すよう意味され、そして小分子または薬剤であることも可能である。また、ハプテンは、タンパク質不含またはポリペプチド不含物質である低分子量分子であることも可能である。通常、ハプテンは、単独で抗体形成を刺激することは不可能であるが、抗体と相互作用することは可能でありうる。したがって、本発明にしたがったＬＥＶおよびＬＥＶ誘導体はハプテンであることも可能である。
【０２０４】
[00177]本明細書において、用語「類似体」または「誘導体」は、１またはそれより多い化学反応によって、親化合物または分子から作製される化学化合物または分子を指すよう意味される。こうしたものとして、類似体は、ＬＥＶの構造に類似であるかまたはＬＥＶ骨格に基づくが、特定の構成要素または構造的組み立てに関して、ＬＥＶと異なる構造を持つ化合物であってもよく、代謝的に類似の作用または反対の作用を有することも可能である。本発明記載のＬＥＶの類似体または誘導体を用いて、類似体およびＬＥＶの両方を認識する抗体との結合に関して競合させることも可能である。また、類似体には、リンカー基を通じて、ＬＥＶにカップリングした作用基が含まれることも可能である。
【０２０５】
[00178]本明細書において、用語「抗原」は、抗体または別の免疫系構成要素によって認識されることが可能な分子を指すよう意味される。
[00179]本明細書において、用語「免疫原」および「免疫原性」は、生物において、免疫応答を産生するかまたは生成することが可能な物質を指すよう意味される。免疫原は、一般的に、特定のタイプの抗原であると見なされる。別の言い方をすると、免疫原は免疫応答を誘導可能であり、一方、抗原は、ひとたび作製されたならば、免疫応答の生成物と組み合わさることが可能である。こうしたものとして、免疫原はまた、抗原でもありうる。通常、免疫原は、かなり高い分子量（例えば１０，０００ダルトンより大きい）を有し、したがって、本発明記載の免疫原を形成するため、タンパク質、リポタンパク質、多糖、いくつかの核酸、および特定のタイコ酸などの多様な巨大分子をハプテンにカップリングしてもよい。
【０２０６】
[00180]本明細書において、用語「免疫原性」は、分子が免疫応答を誘導する能力を指すよう意味され、これは、注射される分子に固有の化学構造によって、そして宿主動物が化合物を認識可能であるかどうかによっての両方で決定される。抗原の構造における小さい変化が、化合物の免疫原性を非常に改変することも可能であり、そしてこうした変化は、特に、よく保存されている抗原に対する抗体が作製される見込みを増加させる一般的な方法として、広範囲に用いられてきた。例えば、これらの修飾技術は、免疫原の領域を改変して、Ｔ細胞結合のためによりよい部位を提供するか、またはＢ細胞結合のために新規のエピトープを暴露するかいずれかである。
【０２０７】
[00181]本明細書において、用語「キャリアー」、「免疫原性部分」、または「免疫原性キャリアー」は、ハプテンにカップリング可能な免疫原性物質、一般的にはタンパク質である、作用基を指すよう意味される。ハプテンにカップリングした免疫原性部分は、免疫応答を誘導可能であり、そしてハプテンと特異的に結合可能な抗体の産生を誘発可能である。免疫原性部分は、異質（ｆｏｒｅｉｇｎ）と認識され、そしてしたがって宿主から免疫学的応答を誘発する、タンパク質、ポリペプチド、糖タンパク質、複合多糖、粒子、核酸、ポリヌクレオチド等を含む作用基である。さらに、リンカーは、修飾または非修飾ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリマー、糖および他の炭水化物、例えばポリエチレングリコールなどのポリエーテル、ポリアルコール、ポリプロピレン、プロピレングリコール、エチレンおよびプロピレングリコールの混合物、ポリアルキルアミン、スペルミジンなどのポリアミン、ポリ（アクリル酸エチル）などのポリエステル、ポリホスホジエステル、およびアルキレンを含むことも可能である。作用基およびそのリンカーの例は、コレステロール−ＴＥＧ−ホスホロアミダイトであり、ここでコレステロールは作用基であり、そしてテトラエチレングリコールおよびホスフェートがリンカーとして働く。
【０２０８】
[00182]１つの例において、作用基は、免疫原性を刺激し、そしてハプテンに対する抗体形成を刺激するため、ハプテンにカップリングさせることが可能な、免疫原性キャリアーである。通常、免疫原性キャリアーは、非常に免疫原性であり、そしてハプテンに対して免疫原性を与えることが可能な、巨大分子である。例えば、異質のタンパク質は、こうした免疫学的応答を誘発可能であるため、タンパク質を免疫原性キャリアーとして使用することも可能である。タンパク質キャリアーは高溶解性であることも可能であり、そしてハプテン分子との容易なコンジュゲート化を促進可能な官能基を含むことも可能である。今日用いられている最も一般的なキャリアータンパク質のいくつかは、キーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ；ＭＷ ４５０，０００〜１３，０００，０００）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＭＷ ６７，０００）である。キーホールリンペット・ヘモシアニンは、海生キーホールリンペットの酸素運搬タンパク質であり、そして非常に巨大であり、そして解離させてサブユニットにすると、増加した免疫原性を示すが、これはおそらく、さらなるエピトープ部位が免疫系に曝露されるためである。ＢＳＡは、コンジュゲート化に適した多くの官能基を含有する、高溶解性のタンパク質である。
【０２０９】
[00183]本明細書において、用語「抗体」は、体における異質の分子の存在に応答して産生されるタンパク質を指すよう意味される。これらは、抗原、および特殊化細胞または免疫系のタンパク質の両方に結合する能力によって、特徴付け可能である。抗体は、５つのクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤに分けられ、そして形質細胞によって産生される免疫グロブリンである。
【０２１０】
[00184]本明細書において、用語「エピトープ」は、抗体と相互作用する抗原の領域を定義するよう意味される。したがって、抗原である分子または他の物質には、抗体活性を伴う少なくとも１つのエピトープが含まれうる。これは、抗原が、同じ抗体または異なる抗体によって認識される多様なエピトープを有することを許容しうる。また、エピトープは任意の特定の構造の固有の特性ではないが、抗体と相互作用する結合部位として定義することも可能である。
【０２１１】
[00185]本明細書において、用語「アフィニティ」は、エピトープおよび抗体間の結合の強度の測定値を指すよう意味される。したがって、単一の抗体は、多様なエピトープに対して、異なるアフィニティを有することも可能である。これは、単一の抗体が、１つのエピトープに強く結合し、そして別のエピトープにより弱く結合することを許容しうる。こうしたものとして、抗体は、ＬＥＶなどの薬剤に対する第一のアフィニティを有し、そしてＬＥＶ誘導体に対する第二のアフィニティを有することも可能である。しかし、抗体が、ＬＥＶおよびＬＥＶ誘導体の両方に実質的に同等なまたは類似のアフィニティを有することが可能であり、これは、類似体を用いて、ＬＥＶに対する抗体を生成し、そして競合的結合研究において使用することを許容する。したがって、本発明記載のＬＥＶ誘導体を用いて、ＬＥＶに対するアフィニティを持つ抗体を生成することも可能である。
【０２１２】
[00186]本明細書において、用語「アビディティ」は、抗体および抗原間の複合体の全体の安定性の測定値を指すよう意味される。抗体−抗原相互作用の全体の安定性は、以下のような３つの主な要因によって支配されうる：（ａ）エピトープに対する抗体の固有のアフィニティ；（ｂ）抗体および抗原の価数；および（ｃ）相互作用構成要素の幾何学的配置。こうしたものとして、前述のパラメーターならびに他のパラメーターを変化させることによって、抗体−抗原複合体のアビディティを調節することも可能である。
【０２１３】
[00187]本明細書において、用語「特異性」は、他の利用可能なエピトープと比較した、エピトープと抗体の優先的な結合を指すよう意味される。すなわち、抗体の特異性は、ＬＥＶ代謝物ではなく、ＬＥＶおよび／または類似体に優先的に結合可能である。これを用いて、不都合な抗体−代謝物結合が混入しないようにして、ＬＥＶの真の濃度を評価可能であるように、代謝物よりもＬＥＶと優先的に結合する、抗ＬＥＶ抗体を生成することも可能である。また、ＬＥＶとの結合に関する抗体の特異性を用いて、ＬＥＶと類似かまたは実質的に同じ特異性を持つ類似体を仕立てることも可能である。
【０２１４】
[00188]本明細書において、用語「ポリクローナル抗体」は、所定の抗原またはエピトープに対して、広い範囲の特異性およびアフィニティを持つ抗体の異種混合物を指すよう意味される。したがって、ポリクローナル抗体には、各々他のものと区別可能であり、抗原と結合するかまたは別の方式で相互作用する、複数の抗体が含まれうる。エピトープを有する免疫原を動物内に注射し、そして適切な時間が経過した後、関心対象の抗体を含有する血液分画を収集し、そして場合によって精製することによって、ポリクローナル抗体を含む異なる抗体を産生するかまたは生成することも可能である。抗体を産生する際、ポリクローナル抗体に関して、最終的な使用について、いくつかのパラメーターを考慮してもよい。これらのパラメーターには以下のものが含まれる：（１）抗体の特異性（すなわち抗原間を区別する能力）；（２）抗体のアビディティ（すなわちエピトープに結合する強度）；および（３）アッセイ系における抗体の最適な希釈を決定する、抗体の力価。
【０２１５】
[00189]本明細書において、用語「モノクローナル抗体」は、通常の抗体産生細胞および１つの前駆細胞の培養物から単離された抗体を指すよう意味される。モノクローナル抗体は、均一な結合定数を有することが可能であり、そして当該技術分野に周知である。
【０２１６】
[00190]本明細書において、「抗体力価」は、血清希釈の逆数を指すよう意味される。より好適な報告および形式化のため、この方式で力価を報告する。１／５００００の力価は、抗原が１：５００００の希釈である場合に、抗体が、一緒に結合した抗原のエピトープを有効に検出することを意味する。力価は、最大Ｏ．Ｄ．の約１０％を有する終点力価によって計算される。
【０２１７】
[00191]本明細書において、用語「イムノアッセイ」または「免疫診断」は、生物学的試料における特定の抗原または特定の抗体の少なくとも１つを同定し、および／または定量化するため、抗原および抗体間の結合を利用する実験技術を指すよう意味される。現在、３種のイムノアッセイがあり、以下のように説明される：（１）抗体捕捉アッセイ；（２）抗原捕捉アッセイ；および（３）２抗体サンドイッチアッセイ。さらに、新規イムノアッセイが開発され、そしてこうしたアッセイが本発明の類似体および抗体を使用可能であろうことが意図される。
【０２１８】
[00192]本明細書において、用語「競合的イムノアッセイ」は、既知の量の同定可能な抗原が、抗体との結合に関して、別の抗原と競合する、実験プロトコルを指すよう意味される。すなわち、既知の抗体と結合する既知の抗原を、その既知の抗体とも結合する別の抗原を含有すると推測される試料と合わせる。これは、該抗体上の結合部位に関して、既知の抗原および別の抗原の両方が競合することを許容する。例えば、抗ＬＥＶ抗体と結合するＬＥＶ誘導体を、ＬＥＶを含有すると推測される試料と合わせることも可能であり、そして類似体およびＬＥＶが、抗ＬＥＶ抗体との結合に関して競合することも可能である。次いで、抗体との結合に関する競合を用いて、試料中にＬＥＶが存在するかどうかを決定することも可能であり、そしてさらに、競合を用いて、試料中のＬＥＶの量を定量化することも可能である。
【０２１９】
[00193]本明細書において、用語「比濁検出」は、凝集した粒子によって散乱される光による、入射光の透過における強度の減少、または吸光度の増加の測定値を指すよう意味される。透過光の強度の減少は、より高い透過光出発バックグラウンド強度に対して測定される。通常、読み取りは、光源と一列になった検出装置で行われ、粒子の凝集が透過光を阻害する。したがって、ＬＥＶなどのターゲット分析物の存在を評価するための手段として、凝集の阻害または促進を用いることも可能である。比濁アッセイは、多様な臨床分析装置に容易に適応可能である。
【０２２０】
[00194]本明細書において、用語「微粒子凝集アッセイ」は、ターゲット分析物による微粒子の凝集を阻害する原理を用いるイムノアッセイを指すよう意味される。すなわち、凝集の減少は、ターゲット分析物の存在に起因する。例えば、ターゲット薬剤の誘導体が微粒子表面に共有結合し、および／または増感粒子はモノクローナル抗体によって凝集する。試料が遊離薬剤を含有する場合、凝集は薬剤濃度に比例して阻害され、これによって、薬剤濃度を吸光度と関連させる古典的な阻害曲線が導かれる。
【０２２１】
[00195]本明細書において、用語「作用基」は、リンカー基を通じてＬＥＶにカップリングした分子または巨大分子を指すよう意味される。作用基には、免疫原性部分、抗原部分、トレーサー部分等が含まれることも可能である。さらに、本明細書記載の化学的骨格中のＺ基が作用基である。こうしたものとして、作用基をＹリンカー基にカップリングさせて、そしてＬＥＶ誘導体にさらなる官能性を提供することも可能である。
【０２２２】
[00196]本明細書において、用語「活性エステル」または「活性化エステル」は、例えばペプチドおよびタンパク質などの化合物の遊離アミノ基と反応可能なエステル基を指すよう意味される。活性エステルには、活性脱離基に連結されたカルボキシル基が含まれることも可能である。しばしば、活性脱離基には、エステル酸素が含まれ、したがって活性脱離基はエステル酸素を取り除く。例えば活性エステルは、一級アミンによる置換に感受性であり、これによって、エステル酸素の除去およびアミド基の形成が生じる。活性エステルを形成する活性脱離基の例には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ｐ−ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾリル等が含まれる。したがって、用語「ＮＨＳ」の使用は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとして定義されるよう意味される。
【０２２３】
[00197]本明細書において、用語「標識」、「検出分子」または「トレーサー」は、検出可能シグナルを生じるかまたは生じるように誘導可能ないかなる作用基も指すよう意味される。標識をＬＥＶ、ＬＥＶ誘導体合成系出発物質および／または中間体、ＬＥＶ誘導体、ハプテン、分析物、免疫原、抗体、あるいは受容体または受容体に結合可能な分子などの別の分子にコンジュゲート化することも可能である。トレーサーの限定されない例には、放射性同位体、酵素、酵素断片、酵素基質、酵素阻害剤、補酵素、触媒、フルオロフォア、色素、化学発光剤、発光剤、増感剤、非磁気または磁気粒子、固体支持体、リポソーム、リガンド、受容体、ハプテン放射性同位体等が含まれる。本明細書に記載するように、例えば、ＬＥＶ誘導体合成出発物質および／または合成中間体を多様なトレーサー部分（例えばフルオロフォア）にカップリングして、これを、合成反応において、出発物質および生成物を追跡するために使用してもよい。また、本明細書にも記載するように、当該技術分野に周知の方法によって、ＬＥＶ誘導体を多様な標識にカップリングして、多様なイムノアッセイ形式において有用な多様な試薬を提供することもまた可能である。イムノアッセイの結果を検出するため、フルオロフォア、例えばフルオレセイン、放射標識、または化学発光基などの検出分子を、類似体にカップリングしてトレーサーを産生することも可能である。
【０２２４】
[00198]本明細書において、用語「連結基」または「リンカー」は、例えばＬＥＶ、ＬＥＶ誘導体、ハプテン、および作用基、例えば免疫原性部分、キャリアー、免疫原、標識、トレーサー等の２またはそれより多い下部構造を連結する化学構造部分を指すよう意味される。連結基は、下部構造間に渡る、水素（または他の一価の原子）以外の原子の少なくとも１つの中断されない鎖を有しうる。通常、連結基には、置換されていてもまたは置換されていなくてもよい炭素原子またはヘテロ原子の鎖が含まれる。連結基の原子および連結基内の鎖の原子は、化学的結合によって相互連結可能である。例えば、リンカーは直鎖または分枝鎖、置換または非置換、飽和または不飽和鎖であることも可能であり、鎖の原子には炭素および／またはへテロ原子が含まれることも可能である。これには、鎖内または鎖末端の１またはそれより多いヘテロ原子も含まれうる。さらに、連結基にはまた、鎖の一部として、または鎖中の原子の１つに対する置換として、環状基および／または芳香族基も含まれてもよい。連結されている下部構造間の最短経路である、鎖の主鎖において、水素以外の原子の数を数えることによって、連結基またはリンカー中の原子の数を決定する。ハプテンをトレーサー、標識、キャリアー、免疫原性部分等とコンジュゲート化するため、連結基を用いて、利用可能な部位をハプテン上に提供することも可能である。
【０２２５】
[00199]本明細書において、用語「ヘテロ原子」は、酸素、窒素、イオウ、リン等の炭素原子以外の原子を指すよう意味される。通常、連結基または他の部分で使用可能な、少なくとも２つの共有結合を形成するために、ヘテロ原子は多価である。
【０２２６】
[00200]本明細書において、用語「生物学的試料」は、生物学的実体から得られる固体または液体試料を指すよう意味される。こうしたものとして、生物学的試料には、限定されるわけではないが、ヒトおよび他の動物などの、生物、または以前生存していたものに由来する、いかなる量の物質も含まれうる。こうした物質には、限定されるわけではないが、血液、血清、血漿、尿、涙、細胞、臓器、組織、骨、骨髄、リンパ、リンパ節、滑膜組織、軟骨細胞、滑膜マクロファージ、内皮細胞、皮膚等が含まれうる。
【０２２７】
[00201]本明細書において、用語「患者」は、ヒトおよび他の動物被験体を指すよう意味される。より詳細には、患者は、ＬＥＶなどの抗癲癇薬剤を必要としているヒトまたは他の動物被験体である。
【０２２８】
[00202]ＬＥＶ誘導体には、リンカー部分にカップリングしたＬＥＶ分子が含まれることも可能であり、そして場合によって作用基が含まれる。リンカー部分および作用基は、ＬＥＶの物理化学的特性を修飾可能な、広い範囲の任意の化学化合物であってもよい。したがって、リンカー部分は、アルキル、脂肪族、直鎖脂肪族、分枝鎖脂肪族、置換脂肪族、環状脂肪族、複素環脂肪族、芳香族、複素環芳香族、多環芳香族等で構成されることも可能である。
【０２２９】
[00203]本明細書において、用語「脂肪族」は、直鎖または分枝鎖、飽和または不飽和、および／または置換または非置換であることも可能であり、主鎖中に２０またはそれより少ない炭素またはヘテロ原子を有する、アルキル基などのヒドロカルビル部分を指すよう意味される。さらに、脂肪族には、主鎖中に１０またはそれより少ない炭素またはヘテロ原子が含まれることも可能である。脂肪族基は、直鎖、分枝鎖、環状および／または複素環である部分を含むことも可能であり、そしてエステル、ケトン、アルデヒド、カルボキシレート等の官能基を含有することも可能である。例示的な脂肪族基には、限定されるわけではないが、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、より多数の炭素のアルキル基等、ならびに２−メチルプロピル、２−メチル−４−エチルブチル、２，４−ジエチルプロピル、３−プロピルブチル、２，８−ジブチルデシル、６，６−ジメチルオクチル、６−プロピル−６−ブチルオクチル、２−メチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル等の置換および／または非置換基が含まれる。用語、脂肪族またはアルキルはまた、アルケニル基、例えばビニル、アリル、アラルキルおよびアルキニル基も含む。
【０２３０】
[00204]脂肪族基内の置換には、脂肪族部分において許容されうる任意の原子または基が含まれることも可能であり、これらには、限定されるわけではないが、ハロゲン、イオウ、チオール、チオエステル、アミン（一級、二級、または三級）、アミド、エーテル、エステル、アルコール、酸素等が含まれる。脂肪族基は、例えばまた、アゾ基、ケト基、アルデヒド基、カルボニル基、カルボキシル基、ニトロ、ニトロソまたはニトリル基、イミダゾールなどの複素環、ヒドラジノまたはヒドロキシルアミノ基、イソシアネートまたはシアネート基、ならびにスルホキシド、スルホン、スルフィド、およびジスルフィドなどのイオウ含有基などの修飾も含むことも可能である。さらに、置換は、適切であるかまたは可能である場合、単結合、二重結合、または三重結合を介してもよい。
【０２３１】
[00205]さらに、脂肪族基はまた、炭素原子の、例えば窒素、酸素、リン、またはイオウなどのヘテロ原子による置換である、ヘテロ置換も含有してもよい。こうしたものとして、置換脂肪族で構成されるリンカーは、炭素、窒素、酸素、イオウ、リン、および／または同様のもので構成される主鎖を有しうる。複素環置換は、１またはそれより多いヘテロ原子を有するアルキル環を指す。複素環部分の例には、限定されるわけではないが、モルホリノ、イミダゾール、およびピロリジノが含まれる。
【０２３２】
[00206]本明細書において、用語「芳香族」は、電子が原子の円形または環状配置周囲を自由に循環し、互いに交互に単結合および二重結合する分子を指すよう意味される。より適切には、これらの結合が単結合および二重結合のハイブリッドであり、環中の各結合が他のすべてと同一であるとして、理解することも可能である。
【０２３３】
[00207]本明細書において、用語「アミン」は、１つ、２つ、または３つの水素原子を、例えばアルキル基などの他の基によって置換することによって、アンモニアに直接または間接的に由来しうる部分を指すよう意味される。一級アミンは、ＲＮＨ２の一般構造を有し、そして二級アミンはＲ２ＮＨの一般構造を有する。用語、アミンには、限定されるわけではないが、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、アニリン、シクロヘキシルアミン、ベンジルアミン、多環アミン、ヘテロ原子置換アリールおよびアルキルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ジブチルアミン、メチルプロピルアミン、メチルヘキシルアミン、メチルシクロプロピルアミン、エチルシクロヘキシルアミン、メチルベンジルアミン、メチルシクロヘキシルメチルアミン、ブチルシクロヘキシルアミン、モルホリン、チオモルホリン、ピロリジン、ピペリジン、２，６−ジメチルピペリジン、ピペラジン、およびヘテロ原子置換アルキルまたはアリール二級アミンが含まれる。
【０２３４】
[00208]本明細書において、用語「ポリ（アミノ酸）」または「ポリペプチド」は、アミノ酸から形成されるポリアミドである。ポリ（アミノ酸）は、一般的に、約２００〜２，０００分子量または約２，０００を超える分子量の範囲であり、あるいは分子量上限がなく、そして通常、１０，０００，０００未満の分子量であり、そして通常、約６００，０００ダルトンを超えないであろう。通常、免疫原性キャリアーまたは酵素が関与するかどうかに応じて、異なる範囲があるであろう。
【０２３５】
[00209]本明細書において、用語「ペプチド」は、アミド（ペプチド）結合による２またはそれより多いアミノ酸の連結によって形成される任意の化合物を指すよう意味され、通常、直鎖において、各アミノ酸残基のα−アミノ基（ＮＨ２末端を除く）が、次の残基のα−カルボキシル基に連結されているα−アミノ酸のポリマーである。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「ポリ（アミノ酸）」は、本明細書において、サイズに関する制約なしに、このクラスの化合物を指すよう、同義に用いられる。このクラスの最大のメンバーは、定義されるポリペプチド配列を有し、タンパク質と称される。
【０２３６】
[00210]さらに、本発明を記載するため、本明細書に用いる用語は、前述の定義および／または当該技術分野に周知の定義を用いて解釈可能である。こうしたものとして、前述の命名法は、本発明を説明するよう意味され、そして限定するよう意図されない。
【０２３７】
[00211]本発明の精神または本質的な特性から逸脱することなく、他の特定の形式で、本発明を具現することも可能である。記載する態様は、すべての観点で、単に例示的であり、そして限定的ではないと見なされる。したがって、本発明の範囲は、前述の説明によるのではなく、付随する特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲の意味および等価の範囲内に属するすべての変化が、その範囲内に含まれるものとする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１または式２：
【化１】
［式中：
ｎは、０〜８の値を持つ整数であり；
Ｌは、ＣＨ２、ＣＯ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＣＯＮＨ、ＮＨ、Ｏ、またはＳ、およびその組み合わせからなる群の１つであり；
Ｘは、末端基、芳香族基、アリール基、あるいは１〜１０の炭素原子および／またはヘテロ鎖原子を有する飽和、不飽和、置換、非置換、直鎖、または分枝鎖脂肪族基であって、ヘテロ鎖原子が、酸素、窒素、イオウ、またはリン、およびその組み合わせからなる群より選択される、前記脂肪族基であり；そして
Ｙは場合により、そして存在する場合、アルコールアミン、アミド、カルボン酸、アルデヒド、エステル、イミノエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、無水物、チオール、チオールアセトン、ジアゾニウム、ＮＨＳ、ＣＯ−ＮＨＳ、Ｏ−ＮＨＳ、マレイミドからなる群より選択される官能基の１つであり；または
ＹはＹ１−Ｚである、式中、Ｙ１は、ＣＯＯ、ＣＯ、Ｏ、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、またはＮＨからなる群より選択され、そしてＺは作用基である；
但し、式２の化合物は、５−アミノ−２−（２−オキソピロリジン−１−イル）ペンタン酸アミド（式３）：
【化２】
ではない］
のレベチラセタム（ＬＥＶ）誘導体を含む化学組成物。
【請求項２】
作用基が、検出可能標識、抗原性キャリアー、カップリング剤、末端基、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、多糖、核酸、ポリヌクレオチド、タイコ酸、放射性同位体、酵素、酵素断片、酵素ドナー断片、酵素アクセプター断片、酵素基質、酵素阻害剤、補酵素、蛍光部分、燐光部分、反ストークス上方制御部分、化学発光部分、発光部分、色素、増感剤、粒子、微粒子、磁気粒子、固体支持体、リポソーム、リガンド、受容体、ハプテン放射性同位体、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
ｎが、０、１、２、または４の値を持つ整数であり；
Ｌが、ＮＨＣＯＯ、ＮＨ、ＮＨＣＯ、ＣＨ２、ＣＯ、Ｓ、またはＣＯＮＨからなる群の１つであり；
Ｘが、Ｈ、ＯＣＨ２−Ｐｈ、ＮＨ、Ｏ、Ｏ−ＮＨＳ、ＣＨ２、Ｈ、マレイミド−Ｐｈ、ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨからなる群の１つであり；そして
Ｙが場合により、そして存在する場合、Ｈであり；または
Ｙが場合により、そして存在する場合、Ｙ１−Ｚである、式中、Ｙ１がＣＯであり、そしてＺが、−ＮＨＳ、−ＢＳＡ、または−ＫＬＨからなる群の１つである；
請求項１の化学組成物。
【請求項４】
式２のｎ、Ｌ、Ｘ、およびＹまたはＹ１−Ｚが：
ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯＯ、およびＸ＝ｔ−ブチル；
ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨ、およびＸ＝Ｈ；
ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯ、およびＸ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ；
ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯ、Ｘ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＮＨＳ；
ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯ、Ｘ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＫＬＨ；
ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯ、Ｘ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；
ｎ＝４、Ｌ＝ＣＨ２、Ｘ＝ＮＨ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；
ｎ＝２、Ｌ＝ＣＯ、およびＸ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ；
ｎ＝２、Ｌ＝ＣＯ、Ｘ＝Ｏ、およびＹ＝Ｈ；
ｎ＝２、Ｌ＝ＣＯ、およびＸ＝Ｏ−ＮＨＳ；
ｎ＝０、Ｌ＝ＣＨ２、Ｘ＝ＣＨ２、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＫＬＨ；
ｎ＝０、Ｌ＝ＣＨ２、Ｘ＝ＣＨ２、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；
ｎ＝１、Ｌ＝Ｓ、およびＸ＝ＣＨ２−Ｐｈ；
ｎ＝１、Ｌ＝Ｓ、およびＸ＝Ｈ；
ｎ＝１、Ｌ＝Ｓ、Ｘ＝マレイミド−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；または
ｎ＝１、Ｌ＝Ｓ、Ｘ＝マレイミド−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＫＬＨ；
からなる群より選択される、請求項１の化学組成物。
【請求項５】
式１のＬ、Ｘ、Ｙ、およびＹ１−Ｚが：
Ｌ＝ＣＯＮＨ、Ｘ＝ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ、およびＹ＝Ｈ；
Ｌ＝ＣＯＮＨ、Ｘ＝ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＫＬＨ；または
Ｌ＝ＣＯＮＨ、Ｘ＝ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；
からなる群より選択される、請求項１の化学組成物。
【請求項６】
試料中のＬＥＶの存在を検出するための免疫診断アッセイにおいて使用するためのキットであって：
式１または式２：
【化３】
［式中：
ｎは、０〜８の値を持つ整数であり；
Ｌは、ＣＨ２、ＣＯ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＣＯＮＨ、ＮＨ、Ｏ、またはＳ、およびその組み合わせからなる群の１つであり；
Ｘは、末端基、芳香族基、アリール基、あるいは１〜１０の炭素原子および／またはヘテロ鎖原子を有する飽和、不飽和、置換、非置換、直鎖、または分枝鎖脂肪族基であって、ヘテロ鎖原子が、酸素、窒素、イオウまたはリン、およびその組み合わせからなる群より選択される、前記脂肪族基であり；そして
Ｙは場合により、そして存在する場合、アルコールアミン、アミド、カルボン酸、アルデヒド、エステル、イミノエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、無水物、チオール、チオールアセトン、ジアゾニウム、ＮＨＳ、ＣＯ−ＮＨＳ、Ｏ−ＮＨＳ、マレイミドからなる群より選択される官能基の１つであり；または
ＹはＹ１−Ｚである、式中、Ｙ１は、ＣＯＯ、ＣＯ、Ｏ、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、またはＮＨからなる群より選択され、そしてＺは作用基である］
の１つの化学構造を有するＬＥＶ誘導体；および
少なくとも１つの結合ドメインを有する抗ＬＥＶ抗体であって、ＬＥＶおよび／またはＬＥＶ誘導体に結合可能な部分を有する、ここで、抗体およびＬＥＶ誘導体間の相互作用は、ＬＥＶに対する抗体のアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つの少なくとも５０％である、前記抗ＬＥＶ抗体；
を含む、前記キット。
【請求項７】
作用基が、検出可能標識、抗原性キャリアー、カップリング剤、末端基、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、多糖、核酸、ポリヌクレオチド、タイコ酸、放射性同位体、酵素、酵素断片、酵素ドナー断片、酵素アクセプター断片、酵素基質、酵素阻害剤、補酵素、蛍光部分、燐光部分、反ストークス上方制御部分、化学発光部分、発光部分、色素、増感剤、粒子、微粒子、磁気粒子、固体支持体、リポソーム、リガンド、受容体、ハプテン放射性同位体、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項６のキット。
【請求項８】
ＬＥＶ誘導体または抗ＬＥＶ抗体の一方が、粒子、磁気粒子、微粒子、微小球体、支持体、酵素ドナー、または酵素アクセプターの１つとカップリングしている、請求項６のキット。
【請求項９】
ＬＥＶのストック組成物；
異なる濃度のＬＥＶを含有する一連の組成物、濃度勾配を形成する一連の組成物；
トレーサー・コンジュゲートを有するＬＥＶ誘導体；
微粒子にカップリングしたＬＥＶ誘導体；
微粒子にカップリングした抗体；
酵素ドナーを有するＬＥＶ誘導体、および対応する酵素アクセプター；
酵素アクセプターを有するＬＥＶ誘導体、および対応する酵素ドナー；または
ろ過または沈降による分離に適した粒子上に装填された抗体；
の少なくとも１つをさらに含む、請求項６のキット。
【請求項１０】
式２のｎ、Ｌ、Ｘ、およびＹまたはＹ１−Ｚが：
ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯＯ、およびＸ＝ｔ−ブチル；
ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨ、およびＸ＝Ｈ；
ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯ、およびＸ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ；
ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯ、Ｘ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＮＨＳ；
ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯ、Ｘ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＫＬＨ；
ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯ、Ｘ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；
ｎ＝４、Ｌ＝ＣＨ２、Ｘ＝ＮＨ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；
ｎ＝２、Ｌ＝ＣＯ、およびＸ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ；
ｎ＝２、Ｌ＝ＣＯ、Ｘ＝Ｏ、およびＹ＝Ｈ；
ｎ＝２、Ｌ＝ＣＯ、およびＸ＝Ｏ−ＮＨＳ；
ｎ＝０、Ｌ＝ＣＨ２、Ｘ＝ＣＨ２、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＫＬＨ；
ｎ＝０、Ｌ＝ＣＨ２、Ｘ＝ＣＨ２、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；
ｎ＝１、Ｌ＝Ｓ、およびＸ＝ＣＨ２−Ｐｈ；
ｎ＝１、Ｌ＝Ｓ、およびＸ＝Ｈ；
ｎ＝１、Ｌ＝Ｓ、Ｘ＝マレイミド−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；または
ｎ＝１、Ｌ＝Ｓ、Ｘ＝マレイミド−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＫＬＨ；
からなる群より選択される、請求項６のキット。
【請求項１１】
式１のＬ、Ｘ、Ｙ、およびＹ１−Ｚが：
Ｌ＝ＣＯＮＨ、Ｘ＝ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ、およびＹ＝Ｈ；
Ｌ＝ＣＯＮＨ、Ｘ＝ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＫＬＨ；または
Ｌ＝ＣＯＮＨ、Ｘ＝ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；
からなる群より選択される、請求項６のキット。
【請求項１２】
試料中のＬＥＶの存在を検出するための免疫診断システムにおいて使用するための抗体組成物であって：
ＬＥＶ誘導体を含む免疫原性組成物によって産生される抗ＬＥＶ抗体であって、ＬＥＶ誘導体が、式１または式２：
【化４】
［式中：
ｎは、０〜８の値を持つ整数であり；
Ｌは、ＣＨ２、ＣＯ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＣＯＮＨ、ＮＨ、Ｏ、またはＳ、およびその組み合わせからなる群の１つであり；
Ｘは、末端基、芳香族基、アリール基、あるいは１〜１０の炭素原子および／またはヘテロ鎖原子を有する飽和、不飽和、置換、非置換、直鎖、または分枝鎖脂肪族基であって、ヘテロ鎖原子が、酸素、窒素、イオウ、またはリン、およびその組み合わせからなる群より選択される、前記脂肪族基であり；そして
ＹはＹ１−Ｚである、式中、Ｙ１は、ＣＯＯ、ＣＯ、Ｏ、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、またはＮＨからなる群より選択され、そしてＺは免疫原性部分である］
の化学構造を有し；そして
該抗ＬＥＶ抗体が、ＬＥＶと結合可能な、および／またはＬＥＶ誘導体と結合可能な少なくとも１つの結合ドメインを有し、そして抗体およびＬＥＶ誘導体間の相互作用が、ＬＥＶに対する抗体のアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つの少なくとも５０％である；
前記抗ＬＥＶ抗体を含む、前記抗体組成物。
【請求項１３】
免疫原性部分が、タンパク質、ポリペプチド、糖タンパク質、多糖、粒子、微粒子、核酸、ポリヌクレオチド、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項１２の抗体組成物。
【請求項１４】
免疫原性部分が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵オボアルブミン、ウシ・ガンマ−グロブリン（ＢＧＧ）、およびその組み合わせからなる群より選択されるタンパク質である、請求項１３の抗体組成物。
【請求項１５】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１２の抗体組成物。
【請求項１６】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項１２の抗体組成物。
【請求項１７】
ＬＥＶに比較したＬＥＶ誘導体に対する抗体のアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つが、均一または不均一免疫診断アッセイで使用するのに十分である、請求項１２の抗体組成物。
【請求項１８】
抗体およびＬＥＶ誘導体間の相互作用が、ＬＥＶに対する抗体のアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つの少なくとも７０％である、請求項１７の抗体組成物。
【請求項１９】
抗体およびＬＥＶ誘導体間の相互作用が、ＬＥＶに対する抗体のアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つの少なくとも９０％である、請求項１７の抗体組成物。
【請求項２０】
抗体が：
式１または式２の化学構造を有するＬＥＶ誘導体を含む免疫原性組成物の少なくとも第一の用量を投与し；
抗体を産生する被験体から抗体を収集し；そして
抗体を産生する被験体から収集した抗体を精製し、および／またはスクリーニングする；
工程を含む方法によって産生される、請求項１２の抗体組成物。
【請求項１】
式１または式２：
【化１】
［式中：
ｎは、０〜８の値を持つ整数であり；
Ｌは、ＣＨ２、ＣＯ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＣＯＮＨ、ＮＨ、Ｏ、またはＳ、およびその組み合わせからなる群の１つであり；
Ｘは、末端基、芳香族基、アリール基、あるいは１〜１０の炭素原子および／またはヘテロ鎖原子を有する飽和、不飽和、置換、非置換、直鎖、または分枝鎖脂肪族基であって、ヘテロ鎖原子が、酸素、窒素、イオウ、またはリン、およびその組み合わせからなる群より選択される、前記脂肪族基であり；そして
Ｙは場合により、そして存在する場合、アルコールアミン、アミド、カルボン酸、アルデヒド、エステル、イミノエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、無水物、チオール、チオールアセトン、ジアゾニウム、ＮＨＳ、ＣＯ−ＮＨＳ、Ｏ−ＮＨＳ、マレイミドからなる群より選択される官能基の１つであり；または
ＹはＹ１−Ｚである、式中、Ｙ１は、ＣＯＯ、ＣＯ、Ｏ、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、またはＮＨからなる群より選択され、そしてＺは作用基である；
但し、式２の化合物は、５−アミノ−２−（２−オキソピロリジン−１−イル）ペンタン酸アミド（式３）：
【化２】
ではない］
のレベチラセタム（ＬＥＶ）誘導体を含む化学組成物。
【請求項２】
作用基が、検出可能標識、抗原性キャリアー、カップリング剤、末端基、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、多糖、核酸、ポリヌクレオチド、タイコ酸、放射性同位体、酵素、酵素断片、酵素ドナー断片、酵素アクセプター断片、酵素基質、酵素阻害剤、補酵素、蛍光部分、燐光部分、反ストークス上方制御部分、化学発光部分、発光部分、色素、増感剤、粒子、微粒子、磁気粒子、固体支持体、リポソーム、リガンド、受容体、ハプテン放射性同位体、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
ｎが、０、１、２、または４の値を持つ整数であり；
Ｌが、ＮＨＣＯＯ、ＮＨ、ＮＨＣＯ、ＣＨ２、ＣＯ、Ｓ、またはＣＯＮＨからなる群の１つであり；
Ｘが、Ｈ、ＯＣＨ２−Ｐｈ、ＮＨ、Ｏ、Ｏ−ＮＨＳ、ＣＨ２、Ｈ、マレイミド−Ｐｈ、ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨからなる群の１つであり；そして
Ｙが場合により、そして存在する場合、Ｈであり；または
Ｙが場合により、そして存在する場合、Ｙ１−Ｚである、式中、Ｙ１がＣＯであり、そしてＺが、−ＮＨＳ、−ＢＳＡ、または−ＫＬＨからなる群の１つである；
請求項１の化学組成物。
【請求項４】
式２のｎ、Ｌ、Ｘ、およびＹまたはＹ１−Ｚが：
ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯＯ、およびＸ＝ｔ−ブチル；
ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨ、およびＸ＝Ｈ；
ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯ、およびＸ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ；
ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯ、Ｘ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＮＨＳ；
ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯ、Ｘ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＫＬＨ；
ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯ、Ｘ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；
ｎ＝４、Ｌ＝ＣＨ２、Ｘ＝ＮＨ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；
ｎ＝２、Ｌ＝ＣＯ、およびＸ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ；
ｎ＝２、Ｌ＝ＣＯ、Ｘ＝Ｏ、およびＹ＝Ｈ；
ｎ＝２、Ｌ＝ＣＯ、およびＸ＝Ｏ−ＮＨＳ；
ｎ＝０、Ｌ＝ＣＨ２、Ｘ＝ＣＨ２、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＫＬＨ；
ｎ＝０、Ｌ＝ＣＨ２、Ｘ＝ＣＨ２、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；
ｎ＝１、Ｌ＝Ｓ、およびＸ＝ＣＨ２−Ｐｈ；
ｎ＝１、Ｌ＝Ｓ、およびＸ＝Ｈ；
ｎ＝１、Ｌ＝Ｓ、Ｘ＝マレイミド−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；または
ｎ＝１、Ｌ＝Ｓ、Ｘ＝マレイミド−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＫＬＨ；
からなる群より選択される、請求項１の化学組成物。
【請求項５】
式１のＬ、Ｘ、Ｙ、およびＹ１−Ｚが：
Ｌ＝ＣＯＮＨ、Ｘ＝ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ、およびＹ＝Ｈ；
Ｌ＝ＣＯＮＨ、Ｘ＝ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＫＬＨ；または
Ｌ＝ＣＯＮＨ、Ｘ＝ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；
からなる群より選択される、請求項１の化学組成物。
【請求項６】
試料中のＬＥＶの存在を検出するための免疫診断アッセイにおいて使用するためのキットであって：
式１または式２：
【化３】
［式中：
ｎは、０〜８の値を持つ整数であり；
Ｌは、ＣＨ２、ＣＯ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＣＯＮＨ、ＮＨ、Ｏ、またはＳ、およびその組み合わせからなる群の１つであり；
Ｘは、末端基、芳香族基、アリール基、あるいは１〜１０の炭素原子および／またはヘテロ鎖原子を有する飽和、不飽和、置換、非置換、直鎖、または分枝鎖脂肪族基であって、ヘテロ鎖原子が、酸素、窒素、イオウまたはリン、およびその組み合わせからなる群より選択される、前記脂肪族基であり；そして
Ｙは場合により、そして存在する場合、アルコールアミン、アミド、カルボン酸、アルデヒド、エステル、イミノエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、無水物、チオール、チオールアセトン、ジアゾニウム、ＮＨＳ、ＣＯ−ＮＨＳ、Ｏ−ＮＨＳ、マレイミドからなる群より選択される官能基の１つであり；または
ＹはＹ１−Ｚである、式中、Ｙ１は、ＣＯＯ、ＣＯ、Ｏ、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、またはＮＨからなる群より選択され、そしてＺは作用基である］
の１つの化学構造を有するＬＥＶ誘導体；および
少なくとも１つの結合ドメインを有する抗ＬＥＶ抗体であって、ＬＥＶおよび／またはＬＥＶ誘導体に結合可能な部分を有する、ここで、抗体およびＬＥＶ誘導体間の相互作用は、ＬＥＶに対する抗体のアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つの少なくとも５０％である、前記抗ＬＥＶ抗体；
を含む、前記キット。
【請求項７】
作用基が、検出可能標識、抗原性キャリアー、カップリング剤、末端基、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、多糖、核酸、ポリヌクレオチド、タイコ酸、放射性同位体、酵素、酵素断片、酵素ドナー断片、酵素アクセプター断片、酵素基質、酵素阻害剤、補酵素、蛍光部分、燐光部分、反ストークス上方制御部分、化学発光部分、発光部分、色素、増感剤、粒子、微粒子、磁気粒子、固体支持体、リポソーム、リガンド、受容体、ハプテン放射性同位体、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項６のキット。
【請求項８】
ＬＥＶ誘導体または抗ＬＥＶ抗体の一方が、粒子、磁気粒子、微粒子、微小球体、支持体、酵素ドナー、または酵素アクセプターの１つとカップリングしている、請求項６のキット。
【請求項９】
ＬＥＶのストック組成物；
異なる濃度のＬＥＶを含有する一連の組成物、濃度勾配を形成する一連の組成物；
トレーサー・コンジュゲートを有するＬＥＶ誘導体；
微粒子にカップリングしたＬＥＶ誘導体；
微粒子にカップリングした抗体；
酵素ドナーを有するＬＥＶ誘導体、および対応する酵素アクセプター；
酵素アクセプターを有するＬＥＶ誘導体、および対応する酵素ドナー；または
ろ過または沈降による分離に適した粒子上に装填された抗体；
の少なくとも１つをさらに含む、請求項６のキット。
【請求項１０】
式２のｎ、Ｌ、Ｘ、およびＹまたはＹ１−Ｚが：
ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯＯ、およびＸ＝ｔ−ブチル；
ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨ、およびＸ＝Ｈ；
ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯ、およびＸ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ；
ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯ、Ｘ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＮＨＳ；
ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯ、Ｘ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＫＬＨ；
ｎ＝４、Ｌ＝ＮＨＣＯ、Ｘ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；
ｎ＝４、Ｌ＝ＣＨ２、Ｘ＝ＮＨ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；
ｎ＝２、Ｌ＝ＣＯ、およびＸ＝ＯＣＨ２−Ｐｈ；
ｎ＝２、Ｌ＝ＣＯ、Ｘ＝Ｏ、およびＹ＝Ｈ；
ｎ＝２、Ｌ＝ＣＯ、およびＸ＝Ｏ−ＮＨＳ；
ｎ＝０、Ｌ＝ＣＨ２、Ｘ＝ＣＨ２、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＫＬＨ；
ｎ＝０、Ｌ＝ＣＨ２、Ｘ＝ＣＨ２、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；
ｎ＝１、Ｌ＝Ｓ、およびＸ＝ＣＨ２−Ｐｈ；
ｎ＝１、Ｌ＝Ｓ、およびＸ＝Ｈ；
ｎ＝１、Ｌ＝Ｓ、Ｘ＝マレイミド−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；または
ｎ＝１、Ｌ＝Ｓ、Ｘ＝マレイミド−Ｐｈ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＫＬＨ；
からなる群より選択される、請求項６のキット。
【請求項１１】
式１のＬ、Ｘ、Ｙ、およびＹ１−Ｚが：
Ｌ＝ＣＯＮＨ、Ｘ＝ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ、およびＹ＝Ｈ；
Ｌ＝ＣＯＮＨ、Ｘ＝ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＫＬＨ；または
Ｌ＝ＣＯＮＨ、Ｘ＝ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ、およびＹ１−Ｚ＝ＣＯ−ＢＳＡ；
からなる群より選択される、請求項６のキット。
【請求項１２】
試料中のＬＥＶの存在を検出するための免疫診断システムにおいて使用するための抗体組成物であって：
ＬＥＶ誘導体を含む免疫原性組成物によって産生される抗ＬＥＶ抗体であって、ＬＥＶ誘導体が、式１または式２：
【化４】
［式中：
ｎは、０〜８の値を持つ整数であり；
Ｌは、ＣＨ２、ＣＯ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＣＯＮＨ、ＮＨ、Ｏ、またはＳ、およびその組み合わせからなる群の１つであり；
Ｘは、末端基、芳香族基、アリール基、あるいは１〜１０の炭素原子および／またはヘテロ鎖原子を有する飽和、不飽和、置換、非置換、直鎖、または分枝鎖脂肪族基であって、ヘテロ鎖原子が、酸素、窒素、イオウ、またはリン、およびその組み合わせからなる群より選択される、前記脂肪族基であり；そして
ＹはＹ１−Ｚである、式中、Ｙ１は、ＣＯＯ、ＣＯ、Ｏ、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、またはＮＨからなる群より選択され、そしてＺは免疫原性部分である］
の化学構造を有し；そして
該抗ＬＥＶ抗体が、ＬＥＶと結合可能な、および／またはＬＥＶ誘導体と結合可能な少なくとも１つの結合ドメインを有し、そして抗体およびＬＥＶ誘導体間の相互作用が、ＬＥＶに対する抗体のアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つの少なくとも５０％である；
前記抗ＬＥＶ抗体を含む、前記抗体組成物。
【請求項１３】
免疫原性部分が、タンパク質、ポリペプチド、糖タンパク質、多糖、粒子、微粒子、核酸、ポリヌクレオチド、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項１２の抗体組成物。
【請求項１４】
免疫原性部分が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵オボアルブミン、ウシ・ガンマ−グロブリン（ＢＧＧ）、およびその組み合わせからなる群より選択されるタンパク質である、請求項１３の抗体組成物。
【請求項１５】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１２の抗体組成物。
【請求項１６】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項１２の抗体組成物。
【請求項１７】
ＬＥＶに比較したＬＥＶ誘導体に対する抗体のアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つが、均一または不均一免疫診断アッセイで使用するのに十分である、請求項１２の抗体組成物。
【請求項１８】
抗体およびＬＥＶ誘導体間の相互作用が、ＬＥＶに対する抗体のアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つの少なくとも７０％である、請求項１７の抗体組成物。
【請求項１９】
抗体およびＬＥＶ誘導体間の相互作用が、ＬＥＶに対する抗体のアフィニティ、特異性、またはアビディティの少なくとも１つの少なくとも９０％である、請求項１７の抗体組成物。
【請求項２０】
抗体が：
式１または式２の化学構造を有するＬＥＶ誘導体を含む免疫原性組成物の少なくとも第一の用量を投与し；
抗体を産生する被験体から抗体を収集し；そして
抗体を産生する被験体から収集した抗体を精製し、および／またはスクリーニングする；
工程を含む方法によって産生される、請求項１２の抗体組成物。
【公表番号】特表２０１２−５３０２４５（Ｐ２０１２−５３０２４５Ａ）
【公表日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１５１４２（Ｐ２０１２−５１５１４２）
【出願日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３８１８５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４４７１２
【国際公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【出願人】（５１１３０２２９７）セラダイン，インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３８１８５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４４７１２
【国際公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【出願人】（５１１３０２２９７）セラダイン，インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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