上皮成長因子受容体に特異的に結合する抗体
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体を提供し、これらはＥＧＦＲを介した癌を治療することに有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、１７０ｋＤａのＩ型の膜貫通タンパク質であって、種々のヒト腫瘍、例えば肺癌、乳癌、結腸癌、胃癌、脳癌、膀胱癌、頭部癌、頸部癌、卵巣癌及び前立腺癌で過剰発現されると知られている。その過剰発現はしばしばＥＧＦＲ−リガンドであるＴＧＦ−α（トランスフォーミング増殖因子−α）及びＥＧＦ（上皮成長因子）の産生を伴い、ＥＧＦＲへのリガンドの結合は細胞増殖及び腫瘍成長を誘導することが確認された。したがって、ＥＧＦＲに対する抗体を用いて前記リガンドとＥＧＦＲとの間の相互作用を遮断すれば腫瘍成長を抑制することができ、これはＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体を用いた実験によって効果的であることが立証されている。
【０００３】
転移性大膓癌の治療のための臨床応用で現在使用されている抗体Ｃ２２５（製品名：Ｅｒｂｉｔｕｘ、ＩｍＣｌｏｎｅ社製、米国）はヒト抗体ＩｇＧ１定常領域に結合されたマウス抗体の可変領域を含むキメラ抗体である（約３０％のマウスアミノ酸配列含む）。Ｃ２２５は、腫瘍細胞成長、インビトロにおけるＥＧＦＲリン酸化及びヌードマウスにおける腫瘍形成を抑制し、また、特定の化学療法剤とともに使用される場合、マウスにおいてヒト腫瘍異種移植片を根絶させることが示されている。しかし、前記抗体は当該抗体によって治療された患者の一部（１０％以内）で免疫反応を誘発するという問題点がある。よって、ＥＧＦＲに対する改善された治療用抗体が求められている。
【０００４】
最近、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって許可された抗癌剤のうち、標的治療剤が約５０％を占めている。前記抗体は標的特異性と免疫系を効果的に誘発することができる能力を提供し、これは前記抗体の長い生物学的半減期と組み合わされて、研究者らに前記抗体の治療能力について気づかせた。その結果、米国食品医薬品局は最近、癌治療のための様々な抗体の使用を承認してきた。抗体は疾患に対する多様な治療的なアプローチにおいて重要な役割を果たしており、完全なヒト抗体の開発を可能にする技術が最近出現したことによりさらに大きな関心を集めることになった。
【０００５】
本発明者らは新しい相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する新規で、かつ改善されたヒト抗体を開発するために鋭意研究を重ねた結果、前記抗体がＥＧＦＲを介した媒介シグナル伝逹を遮断することで癌を治療することに使用され得ることを確認した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の目的は上皮成長因子受容体に特異的に結合する新規抗体を提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的はそれぞれ前記抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡならびにこれを含む発現ベクターを提供することである。
【０００８】
本発明のまた他の目的は前記発現ベクターで形質転換された細胞株を提供することである。
【０００９】
本発明のさらなる目的は前記抗体を含む癌治療用の医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一つの態様によれば、ａ）それぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含む重鎖可変領域と、ｂ）それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、ｃ）重鎖定常領域と、ｄ）軽鎖定常領域とを含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体が提供される。
【００１１】
また、ａ）それぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、ｂ）それぞれ配列番号９、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、ｃ）重鎖定常領域と、ｄ）軽鎖定常領域とを含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体が提供される。
【００１２】
本発明の他の態様によれば、前記抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードするＤＮＡならびにこれを含む発現ベクターが提供される。
【００１３】
本発明のまた他の態様によれば、前記発現ベクターで形質転換された細胞株が提供される。
【００１４】
本発明のさらなる態様によれば、前記抗体を含む癌治療用の医薬組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本発明の前記及びその他の目的および特徴は、添付された図面とともに考慮するとき、下記説明によって明確になり、それぞれは次のとおりである。
【図１】図１は、ＰＣＲによって合成された本発明の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）をそれぞれコードするＤＮＡを示す電気泳動の写真（１％アガロースゲル）である。
【図２】図２は、本発明の抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、ファージ−ディスプレイ用ベクターｐＫＳ４Ｈのマップである。
【図３】図３は、バイオパニング法を用いて抗体ライブラリーから抗体を選別する工程を示す図である。
【図４】図４は、本発明の抗体であるＥＲ２及びＥＲ７９の一本鎖可変領域断片（sｃＦｖ）のアミノ酸配列である。
【図５】図５は、本発明のヒト抗体の重鎖を発現するための発現ベクターＥＲ２−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３またはＥＲ７９−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３のマップである。
【図６】図６は、本発明のヒト抗体の軽鎖を発現するためのベクターＥＲ２−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２のマップである。
【図７】図７は、本発明のヒト抗体の軽鎖を発現するためのＥＲ７９−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２のマップである。
【図８】図８は、形質転換体から発現された重鎖及び軽鎖のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析図である。
【図９】図９は、ヒト抗体（ＥＲ２及びＥＲ７９）、キメラ抗体（Ｃ２２５、Ｅｒｂｉｔｕｘ）及びその他の抗体（ＥＲ４１４）の上皮成長因子受容体に対する相対的親和度を示す図である。
【図１０】図１０は、本発明の抗体と癌細胞株（Ａ４３１）で過剰発現された上皮成長因子受容体の結合を示すフローサイトメーター図である。
【図１１】図１１は、上皮成長因子受容体のリン酸化に対する本発明の抗体の阻害効果を示す図である。
【図１２】図１２は、本発明の抗体の上皮成長因子との結合部位、及びキメラ抗体Ｃ２２５（Ｅｒｂｉｔｕｘ）との結合部位を示す表面プラズモン共鳴測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明は、ａ）それぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含む重鎖可変領域と、ｂ）それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、ｃ）重鎖定常領域と、ｄ）軽鎖定常領域とを含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体を提供する。好ましくは、前記抗体はａ）配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、ｃ）重鎖定常領域と、ｄ）軽鎖定常領域とを含む抗体であり得る。
【００１８】
また、本発明は、ａ）それぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、ｂ）それぞれ配列番号９、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、ｃ）重鎖定常領域と、ｄ）軽鎖定常領域とを含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体を提供する。好ましくは、前記抗体は、ａ）配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、ｃ）重鎖定常領域と、ｄ）軽鎖定常領域とを含む抗体であり得る。
【００１９】
本発明の抗体は好ましくはヒト抗体であってもよく、上皮成長因子（ＥＧＦ）によって誘導されるシグナル伝逹を遮断することを特徴とする。
【００２０】
前記上皮成長因子受容体に特異的な抗体は、好ましくはファージ−ディスプレイ法（Ｓｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２８、１３１５−１３１７、１９８５；及びＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ＆Ｃｈａｍｅｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ、２１、３７１−３７８、２０００）の改変法によって選別されうる。ファージ−ディスプレイ法において、線状（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ）ファージ（例えば、Ｍ１３、ＦｄまたはＦ１）の表面タンパク質をコードする遺伝子（ｇｅｎｅ III）が目的の抗体をコードする遺伝子と融合されることにより、表面に露出した前記の融合された抗体を有するウイルス粒子が抗体−ファージの形態で生成される。その後、前記抗体の高い特異度及び親和度ならびに前記ファージの高い感染性を用いて、バイオパニング法によって、ファージライブラリーから目的の抗体を選別することができる（Ｂｕｒｔｏｎ ＆ Ｂａｒｂａｓ、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５７、１９１−２８０、１９９４；Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２、４３３−４５５、１９９４；及びＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４、１−２０、１９９８）。前記ファージ−ディスプレイベクターはｐＫＳ４Ｈ（韓国特許第０６３５３７０号参照）またはｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ、好ましくはｐＫＳ４Ｈである。
【００２１】
本発明においては、ヒト抗体ＥＲ４１４をファージライブラリーから選別し、上皮成長因子受容体に対する親和度と中和能を確認した（図９及び図１１）。前記ＥＲ４１４抗体は中和能を有するが親和度は市販の抗体であるＣ２２５よりも１６倍低かった。したがって、親和性成熟のプロセスを用いてＣ２２５と類似した親和度を有する改善された抗体を選別した。すなわち、主として選別された抗体の相補性決定領域のアミノ酸ランダム化によってライブラリーを作製して、バイオパニング法を用いて親和性が成熟した抗体を選別し、最終的にＣ２２５抗体と類似した親和度を有する抗体（ＥＲ２及びＥＲ７９）を選別した。
【００２２】
抗体ＥＲ２の場合、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を有する。一方、抗体ＥＲ７９の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はそれぞれ配列番号９、５及び６のアミノ酸配列を有する。
【００２３】
本発明の抗体の重鎖定常領域及び軽鎖定常領域はヒト抗体のそれと同一であってもよく、好ましくはそれぞれ配列番号４３及び配列番号４４のアミノ酸配列を有するアミノ酸であってもよい。
【００２４】
本発明は、それぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変領域をコードするＤＮＡを提供する。好ましくは、前記ＤＮＡは前記配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号１１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、前記配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列番号１２のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド及び前記配列番号３のアミノ酸配列をコードする配列番号１３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むことができる。
【００２５】
本発明は、配列番号７のアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変領域をコードするＤＮＡを提供する。好ましくは、前記ＤＮＡは前記配列番号７のアミノ酸配列をコードする配列番号１４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むことができる。
【００２６】
また、本発明は、それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを提供する。好ましくは、前記ＤＮＡは前記配列番号４のアミノ酸配列をコードする配列番号１５のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、前記配列番号５のアミノ酸配列をコードする配列番号１６のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド及び前記配列番号６のアミノ酸配列をコードする配列番号１７のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むことができる。
【００２７】
本発明は、配列番号８のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを提供する。好ましくは、前記ＤＮＡは前記配列番号８のアミノ酸配列をコードする配列番号１８のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むことができる。
【００２８】
また、本発明は、それぞれ配列番号９、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを提供する。好ましくは、前記ＤＮＡは前記配列番号９のアミノ酸配列をコードする配列番号１９のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、前記配列番号５のアミノ酸配列をコードする配列番号１６のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド及び前記配列番号６のアミノ酸配列をコードする配列番号１７のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むことができる。
【００２９】
本発明は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを提供する。好ましくは、前記ＤＮＡは前記配列番号１０のアミノ酸配列をコードする配列番号２０のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むことができる。
【００３０】
本発明は、前記抗体の重鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域を発現させる発現ベクターを提供する。好ましくは、前記発現ベクターは図５にマップが示されている「ＥＲ２−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３」または「ＥＲ７９−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３」であり得る。
【００３１】
具体的に、前記ベクターは、親和性成熟プロセスによって選別した抗体のＶＨ断片（１−ａ：ＥＲ２Ａｂ−Ｈまたは１−ｂ：ＥＲ７９Ａｂ−Ｈ）を適したベクター、例えば、ｐＲＣ１３ベクター（受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００５４；韓国特許登録第５２３７３２号）に挿入して製造されうる。
【００３２】
本発明は、前記抗体の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域を発現させる発現ベクターを提供する。好ましくは、前記発現ベクターは図６にマップが示されている「ＥＲ２−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２」または図７にマップが示されている「ＥＲ７９−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２」であり得る。
【００３３】
具体的に、前記ベクターは、親和性成熟プロセスによって選別した抗体のそれぞれのＶＬ断片（２−ａ：ＥＲ２Ａｂ−Ｌまたは２−ｂ：ＥＲ７９Ａｂ−Ｌ）を適したベクター、例えば、ｐＫＣ１２ベクター（受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ―０００５４；韓国特許登録第５２３７３２号）に挿入して製造されうる。
【００３４】
本発明は、本発明の抗体の重鎖可変領域を発現させる発現ベクター及び本発明の抗体の軽鎖可変領域を発現させる発現ベクターで形質転換された動物細胞株を提供する。前記本発明の抗体の重鎖可変領域を発現させる発現ベクターは、好ましくはＥＲ２−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３またはＥＲ７９−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３であり得て、本発明の抗体の軽鎖可変領域を発現させる発現ベクターは、好ましくはＥＲ２−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２またはＥＲ７９−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２であり得る。前記動物細胞株はＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＨＥＫ２９３またはＮＳＯ細胞株、好ましくはＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞株であり得る。
【００３５】
本発明による抗体は前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が互いに結合されることで製造されうる。
【００３６】
本発明の抗体の抗原に対する親和度は、例えば、競合ＥＬＩＳＡ（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、２０、２６５−２７２、２００１）によって測定されうる。図９から分かるように、本発明のＥＲ２抗体の親和度はＣ２２５抗体と類似する一方、ＥＲ７９抗体の親和度はＣ２２５抗体よりも２倍低い。また、前記抗体らは癌細胞株で過剰発現された上皮成長因子受容体に結合することがフローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を用いて立証され（図１０）、乳癌細胞における上皮成長因子受容体のリン酸化阻害実験を通じて中和能を有することが確認された（図１１）。したがって、本発明の抗体は上皮成長因子受容体を通じたシグナル伝逹を抑制することで癌治療用抗体として使用されうる。
【００３７】
前記結果に鑑み、本発明は、前記抗体を含む癌治療用組成物、好ましくは医薬組成物を提供する。前記組成物はシスプラチン、ゲムシタビン、ドキソルビシン、５−ＦＵ、イリノテカン及びパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも一つをさらに含むことができる。
【００３８】
前記組成物は活性成分としてＥＲ２またはＥＲ７９抗体またはこれを含有する形質転換体を含み、さらに前記活性成分と同一または類似した機能を有する一つ以上の有効成分を含む。前記活性成分に加えて、本発明の組成物は、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセリン、エタノール、リポソーム及び前記成分のいずれか一つ以上を含む混合物のような、一つ以上の医薬に許容可能な担体を含むことができる。必要な場合、抗酸化剤、緩衝剤、及び静菌剤のような一般的な添加剤をさらに添加してもよい。本発明の組成物は、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤と混合することによって水溶液、注射用懸濁液及び乳濁液、丸剤、カプセル剤、顆粒または錠剤を含む多様な形態で剤形化され得る。標的細胞特異的抗体またはその他のリガンドを前記担体のいずれか一つと混合して標的細胞へ送達することができる。また、前記組成物は文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ］に提示された下記方法によって成分に応じて適した形態で製造され得る。
【００３９】
本発明の医薬組成物は、非経口で（例えば、静脈内、皮下、腹腔、または局所注射）投与されることができ、静脈内注射が好ましい。固形癌の場合、抗体の迅速かつ容易な接近を助ける局所投与がより好ましい。組成物の有効量は、体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与頻度、投与方法、排泄及び疾病の重症度によって決定され得る。ヒト抗体または形質転換体を約５〜５００ｍｇ／ｍ２含有する組成物の１回用量を、一日または一週間ごとに投与することができる。前記有効量は悪性腫瘍患者を治療する医者によって調節され得る。
【００４０】
本発明の医薬組成物は単独または悪性腫瘍を治療するための外科的手術、ホルモン療法、化学療法及び生物学的調節剤とともに投与され得る。
【００４１】
下記の実施例は、本発明を単に詳細に説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００４２】
実施例１：ＲＮＡの分離
上皮成長因子受容体に特異的に結合する抗体を選別するため、ヒト抗体ライブラリーを構築した。ヒト骨髄全ＲＮＡ、ヒト胸腺全ＲＮＡ、ヒト脾臓全ＲＮＡ及びヒトＢ細胞ＲＮＡの混合物を用いた。ヒトＢ細胞ＲＮＡを除いた全てのＲＮＡはＣｌｏｎｔｅｃｈ社（米国）から購入し、ヒトＢ細胞ＲＮＡは下記のように分離した。
【００４３】
健康な成人から採血した５０ｍＬの血液を５０ｍＬのＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩液；Ｓｉｇｍａ社製、米国）と混合して希釈した。５０ｍＬチューブにＨｉｓｔｏｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ社製）１０ｍＬを入れて、ここに希釈された血液２０ｍＬを添加した。前記混合物を３，０００ｒｐｍで遠心分離して白血球を分離した。前記分離された白血球２ｍＬを６ｍＬのＨＢＳＳと混合した後、１０００ｒｐｍで遠心分離した。白血球１００μＬを１ｍＬのトリゾル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、米国）と混合してＲＮＡを分離した。
【００４４】
一方、前記分離されたＲＮＡを蒸留水で希釈した後、２６０ｎｍで吸光度を測定してその量を計算した（１.８μｇ／μＬ；ウルトラスペック（Ultrospec）２０００紫外−可視分光光度計、ＧＥ社製、米国）。詳しい方法は次のようである。
【００４５】
トリゾル１ｍＬを白血球１００μＬに添加してよく振盪させた後、室温で５分間放置した。それから、クロロホルム２００μＬを加え、１５秒間強く振盪させた後３分間放置した。その後、前記混合物を２〜８℃、１５分及び１５，０００ｒｐｍの条件下で遠心分離して、上澄み液を新しいチューブに移した。イソプロピルアルコール５００μＬを入れてよく混ぜた後、室温で１０分間放置した。その後、２〜８℃で５分間１５，０００ｒｐｍで遠心分離して、上澄み液を取り除いた。７５％エタノール１ｍＬを入れて、前記混合物を２〜８℃、５分及び１５，０００ｒｐｍの条件下で遠心分離してエタノールを取り除いた後、ＲＮＡペレットを室温で５分間乾燥させた。ここに蒸留水１５０μＬを入れてＲＮＡペレットを懸濁した後、前記懸濁液の吸光度を２６０ｎｍで測定した。残りは−２０℃で保管した。
【実施例２】
【００４６】
実施例２：抗体遺伝子の増幅
実施例１で分離したＲＮＡ１μｇ及びｐｄ（Ｔ）１２−１８（０.５μｇ／μＬ）１μＬを最終体積が１２.５μＬになるように蒸留水を入れて混合した。前記混合物を７０℃で２分間反応させて氷浴で冷却させた。それから、ここに５Ｘ反応緩衝液、１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、組換え型ＲＮａｓｅ阻害剤（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、米国）を添加して最終体積を２０μＬに合わせた後、４２℃で１時間、９５℃で５分間反応させてｃＤＮＡを合成した。ＬｉｑｕｉＭｉｘ ＱＭ Ｐｒｅｍｉｘ、Ｍａｇｅｎｔａ（Ｎｅｕｒｏｔｉｃｓ Ｉｎｃ社製、韓国）、鋳型として４μＬのｃＤＮＡ、蒸留水１９μＬ、ならびに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域（κ及びλ）に結合するように考案されたそれぞれのプライマー１μＬを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲに用いられたプライマー及びこれらのヌクレオチド配列が表１に示されている。
＜表１＞
ＰＣＲ反応で用いたプライマー
【表１】
【００４７】
ＰＣＲ反応は、９５℃で５分、５５℃で２分、７２℃で２分で３０回行なった後、最後に７２℃で１５分間行った。
【００４８】
このように増幅された抗体ＤＮＡを１.２％アガロースゲルで電気泳動して確認した（図１）。図１から分かるように、重鎖及び軽鎖（κ及びλ）可変領域に当たる３５０ｂｐのＤＮＡバンドを得た。図１において、Ｍはサイズマーカーを、ＶＨは重鎖可変領域（レーン１：重鎖可変領域Ｉ型、レーン２：重鎖可変領域III型、及びレーン３：重鎖可変領域IV型）を、ＶＬは軽鎖可変領域（レーン４：軽鎖可変領域１／３κ、レーン５：軽鎖可変領域２κ、及びレーン６：軽鎖可変領域λ）を示す。
【実施例３】
【００４９】
実施例３：抗体ＤＮＡの制限酵素切断
実施例２で製造したＶＨ及びＶＬ（κ及びλ）をそれぞれ制限酵素ＳｆｉＩ／ＢｓｐＥＩ及びＢｓｐＥＩ／ＮｏｔＩで切断し、切断された断片を１.２％アガロースゲルから分離した後、キアゲンキットを用いて精製した。
【実施例４】
【００５０】
実施例４：抗体ＤＮＡのライゲーション及びライブラリーの製造
ファージ−ディスプレイベクターｐＫＳ４Ｈ（緑十字社製、韓国、韓国特許登録第０６３５３７０号参照）を制限酵素ＳｆｉＩ／ＢｓｐＥＩを用いて切断し、１.２％アガロースゲル電気泳動を用いて分離した後、キアゲンキットを用いて精製した。３０μｇのｐＫＳ４Ｈを実施例３で製造した３μｇのＶＨと混合し、ここにＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社製、米国）を添加した後、２５℃で一晩反応させた。前記ライゲーション混合物をキアゲンキットを用いて精製して大膓菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、米国）に電気穿孔法で形質転換させた。前記形質転換体を１００ｍＬの培地で一晩培養した後、プラスミドを分離した。前記プラスミドを「ｐＫＳ４Ｈ−ＶＨ−ΔＶＬ」と命名した。
【００５１】
前記プラスミドｐＫＳ４Ｈ−ＶＨ−ΔＶＬを制限酵素ＢｓｐＥＩ／ＮｏｔＩで切断して前述のように精製した。次いで、３０μｇのｐＫＳ４Ｈ−ＶＨ−ΔＶＬプラスミドを実施例３で製造された３μｇのＶＬ ＰＣＲ ＤＮＡ及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社製、米国）と混合し、２５℃で一晩反応させた。前記ライゲーション混合物をキアゲンキットを用いて精製して大膓菌ＸＬ１−ｂｌｕｅに電気穿孔法で形質転換させた。前記形質転換体をカルベニシリン及びテトラサイクリンが含有された１００ｍＬの培地で３７℃で２時間培養した。それから、前記培地にＭ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、米国）を播種して１６時間培養してエングバーグら（Ｅｎｇｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ.、Ｍｏｌ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.、６、２８７−３１０、１９９６）によって報告されたように、ファージライブラリーを製造した。一方、前記大膓菌からプラスミドを分離し、これを「ｐＫＳ４Ｈ−ＶＨ−ＶＬ」と命名した。前記プラスミドのマップが図２に示されている。
【実施例５】
【００５２】
実施例５：上皮成長因子受容体に結合する抗体の選別
ＥＧＦＲに結合する抗体をパニング法（Ｅｎｇｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ.、Ｍｏｌ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.、６、２８７−３１０、１９９６；及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ.、Ｇｅｎｅ、２４１、１９−２５、２０００）の改変法によって選別した。具体的には、ＥＧＦＲ（Ｓｉｇｍａ社製、米国）をＰＢＳで希釈して各イムノチューブ（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ、ＮＵＮＣ社製、デンマーク）上にコーティングした。次いで、前記コーティングされたイムノチューブに実施例４で製造したファージライブラリーを加えて３７℃で２時間反応させた。ＥＧＦＲに結合したファージを０.１Ｍのグリシンバッファー（ｐＨ２.０）で溶離した。その後、大膓菌ＸＬ１−ｂｌｕｅを前記ファージに感染させ、ヘルパーファージを添加した。前記大膓菌を３７℃で一晩培養して、ここに２０％ＰＥＧ８，０００及び１５％ＮａＣｌを含む溶液を添加した。それから、沈澱したファージを回収して（ファージレスキュー）、ファージを再びＥＧＦＲ−コーティングされたイムノチューブに反応させ、前記パニング手順を４回繰り返した。前記手順を通じてＥＧＦＲに結合するヒト抗体であるＥＲ２及びＥＲ７９を選別した。ファージディスプレイライブラリーを用いて抗体を選別する工程を図３に示した。
【００５３】
４回目のパニングから得られた各コロニーを前述した方法（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ.、Ｇｅｎｅ、２４１、１９−２５、２０００）によって２ｍＬの培地で成長させ、ＩＰＴＧ（イソプロピル β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）で処理して抗体発現を誘導した。抗体誘導をＥＦＧＲがコーティングされた９６−ウェルプレートを用いてＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）によって測定した。
【実施例６】
【００５４】
実施例６：選別された抗体の配列分析
前記実施例５で選別したヒト抗体ＥＲ２及びＥＲ７９を分泌するコロニーを５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ培地１０ｍＬで一晩培養した後、キアゲンプラスミドミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社製、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、米国）を用いてプラスミドを分離した。前記プラスミドを制限酵素ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動によって抗体の断片の挿入を確認した。プラスミドに挿入されたｓｃＦｖのＤＮＡ配列を分析した。
【００５５】
ｓｃＦｖのヌクレオチド配列をＧｅｎｏｔｅｃｈ社（大田、韓国）でシークエンスプライマーである配列番号３８のｐ０３３で分析した。ＥＲ２、ＥＲ７９及びＭ９６（マウス抗体）のｓｃＦｖのＤＮＡ配列をウェブ基盤のプログラム（ｗｗｗ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ：DNAからタンパク質への翻訳ツール（ＤＮＡ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌａｔｅ ｔｏｏｌ））を用いてアミノ酸に翻訳し、前記翻訳されたアミノ酸配列が図４に示されている。図４において、Ｍ９６、ＥＲ２及びＥＲ７９はそれぞれＭ９６（マウス抗体）及び本発明のＥＲ２及びＥＲ７９のｓｃＦｖのアミノ酸配列を示す。図４から分かるように、ヒト抗体ＥＲ２及びＥＲ７９は相違するアミノ酸配列を有していた。
【実施例７】
【００５６】
実施例７：発現ベクターの製造
抗体断片を完全な形態の免疫グロブリンに転換するため、抗体発現ベクターｐＲＣ１３及びｐＫＣ１２（Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原に対するヒト抗体の可変領域を挿入するためのプラスミド；韓国特許第５２３７３２号；受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００５４）を使用した。
【００５７】
各ＶＨ断片を重鎖発現ベクターｐＲＣ１３のＨｉｎｄIII及びＡｐａＩ部位内に挿入した。図５に例示されたように、ヒト抗体ＥＲ２及びＥＲ７９の重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを配列番号３９及び４０のそれぞれのプライマーを用いてＰＣＲによって増幅させ、ＨｉｎｄIII／ＡｐａＩで切断した後、同一の制限酵素で切断したｐＲＣ１３内に挿入した。前記組換えベクターを「ＥＲ２−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３」または「ＥＲ７９−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３」と命名した。前記用いたプライマーを表２に示した。
＜表２＞
ＰＣＲ反応で用いたプライマー
【表２】
【００５８】
一方、各ＶＬ断片を軽鎖発現ベクターｐＫＣ１２のＮｈｅＩ及びＡｐａＩ部位内に挿入した。図６及び７に例示されたように、ヒト抗体ＥＲ２及びＥＲ７９の軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするそれぞれのＤＮＡを配列番号４１及び４２のそれぞれのプライマーを用いてＰＣＲによって増幅させ、ＮｈｅＩ／ＡｐａＩで切断した後、同一の制限酵素で切断したｐＫＣ１２内に挿入した。前記組換えベクターを「ＥＲ２−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２」または「ＥＲ７９−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２」と命名した。前記用いたプライマーを表３に示した。
＜表３＞
ＰＣＲ反応で用いたプライマー
【表３】
【実施例８】
【００５９】
実施例８：抗体を分泌する動物細胞株の製造
トランスフェクションの２４時間前に、２×１０５個のＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を５％ＣＯ２の存在下で３７℃培養器で１０％のＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、米国）を含むα−ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、米国）が入っているＴ−２５フラスコ（ＮＵＮＣ社製、デンマーク）で密集度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）が５０％に到逹するまで培養した。それから、３０μｇのリポフェクチン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、米国）を１.５ｍＬのオプティ（opti）−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、米国）に添加して室温で９０分間放置した。同時にＥＲ２−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３ ８μｇ ＆ ＥＲ２−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２ ７μｇ、ＥＲ７９−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３ ８μｇ ＆ ＥＲ７９−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２ ７μｇを混合してオプティ−ＭＥＭ培地で１.５ｍＬにした後、室温で９０分間培養した。９０分後、リポフェクチンを含有する培地を、それぞれＥＲ２−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３ ＆ ＥＲ２−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２及びＥＲ７９−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３ ＆ ＥＲ７９−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２を含有する培地と混合した後、室温で１５分間反応させた。反応中に細胞から培地を除去し、前記細胞をトランスフェクションのためにＰＢＳで３回洗浄した。前記洗浄された細胞に前記反応混合物を加えて６時間培養した。６時間後、前記反応混合物を除去した後、α−ＭＥＭ培地を入れて４８時間培養した。それから、細胞をトリプシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、米国）で処理してフラスコから剥離した後、α−ＭＥＭ培地で希釈して９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ社製、デンマーク）にて継代した。この時、α−ＭＥＭ培地はリボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドを含有しない一方、１０％の透析ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）及び５５０μｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｓｉｇｍａ社製、米国）を含有する。前記培地を２日ごとに新しい培地に取り替えた。コロニーを形成した培養上清液をＥＬＩＳＡによる抗体発現のために回収した後、選別された細胞を１２−ウェルプレートに移した。前記細胞を６−ウェルプレートに移してメトトレキセート（ＭＴＸ、中外製薬社製、韓国）処理をした。ＭＴＸの初期濃度は２０ｎＭであり、細胞適応度に応じて８０ｎＭ、３２０ｎＭ及び１μＭに増加させた。１μＭの濃度で生存しながら抗体分泌量の高い細胞株を選別した。スピナーフラスコと無血清培地を用いて、６５ｒｐｍ、５％ＣＯ２及び３７℃の培養器で大量培養を行った。１０８細胞を１００ｍＬの無血清培地が入っている２５０ｍＬスピナーフラスコで培養した。細胞数が初期播種の２倍になると、１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を回収した。回収した細胞を２００ｍＬの培地が入っている５００ｍＬスピナーフラスコで再培養した。細胞数が初期播種の２倍になると、１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を回収してこれを１Ｌの培地が入っている３Ｌスピナーフラスコに移した。ここに酪酸ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ社製、米国）を最終濃度２ｍＭになるように添加し、細胞を５日間培養した後、培地から培養上清液を回収した。スピナーフラスコで回収した上清液から、タンパク質Ａ−アガロースコラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、米国）を用いて抗体を精製し、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【００６０】
図８に示したように、約５０ｋＤａの重鎖バンド及び２５ｋＤａの軽鎖バンドが観察され、これは抗体が正しく合成されたことを示す。
【実施例９】
【００６１】
実施例９：抗体親和度の測定
実施例８で得られた抗体のＥＧＦＲに対する親和度を競合ＥＬＩＳＡ法（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ.、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、２０、２６５−２７２、２００１）によって測定し、その結果を図９に示した。簡略な手順は次のようである。
【００６２】
（１）適正抗体濃度の決定
Ａ．プレートの準備
ＰＢＳで２μｇ／ｍＬで希釈した１００μＬのＥＧＦＲ（Ｓｉｇｍａ社製、米国）をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加して４℃で一晩培養した。プレートの各ウェルをＰＢＳＴで１回洗浄した後、各ウェルに３００μＬの１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を加えて室温で１時間培養した。
Ｂ．１次反応
連続希釈した各精製抗体（０.５μｇ／ｍＬ）１００μＬをプレートの各ウェルに添加して、室温で２時間培養した後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。
Ｃ．２次反応
１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で１：５０００で希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）−ペルオキシダーゼ複合体（Ｓｉｇｍａ社製）１００μＬを各ウェルに添加して、室温で１時間反応させた後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。
Ｄ．基質反応
１００μＬのＴＭＢ（３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン、マイクロウェルペルオキシダーゼ基質システム（Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｙｓｔｅｍ）（ＫＰＬ、ＭＤ、米国））を各ウェルに添加した後、４０５ｎｍでＯ.Ｄ値を測定した。適正抗体濃度をＥＧＦＲ−コーティングされたプレートに対して最大半量結合（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ）を示す抗体濃度で決定した。
【００６３】
（２）競合ＥＬＩＳＡ
Ａ．プレートの準備
ＰＢＳで２μｇ／ｍＬで希釈した１００μＬのＥＧＦＲ（Ｓｉｇｍａ社製、米国）をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加して４℃で一晩培養した。各ウェルをＰＢＳＴで１回洗浄した後、各ウェルに３００μＬの１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を加えて室温で１時間培養した。
Ｂ．１次反応
２μｇのＥＧＦＲに２倍連続希釈して、前記希釈された１０μＬのＥＧＦＲをプレートの各ウェルに添加した。次いで、前記（１）で決定された適正濃度で希釈された９０μＬの抗体を各ウェルに添加して、室温で２時間培養した後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。
Ｃ．２次反応
１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で１：５０００で希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）−ペルオキシダーゼ複合体（Ｓｉｇｍａ社製）１００μＬを各ウェルに添加して、室温で１時間反応させた後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。
Ｄ．基質反応
１００μＬのＴＭＢ（３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン、マイクロウェルペルオキシダーゼ基質システム（ＫＰＬ社製、ＭＤ、米国））を各ウェルに添加した後、４０５ｎｍでＯ.Ｄ値を測定した。最大結合量（競合するＥＧＦＲが存在しないＯ.Ｄ値）の５０％を抑制するＥＧＦＲの濃度をＫｄとして決定した。
【００６４】
図９から分かるように、キメラ抗体（Ｃ２２５）と比較すると、ヒト抗体ＥＲ２は類似した親和度を示し、ＥＲ７９はほぼ６３％程度の親和度を示した。また、本発明の抗体らの親和度はＥＲ４１４（バイオパニング以前のヒト抗体）よりもさらに高かった。
【実施例１０】
【００６５】
実施例１０：腫瘍細胞株における上皮成長因子受容体に対する本発明の抗体の結合確認
腫瘍細胞株で過剰発現されたＥＧＦＲに対する本発明の抗体であるＥＲ２及びＥＲ７９の結合をＦＡＣＳによって確認した。要するに、ＥＧＦＲを過剰発現する皮膚癌（epidermoid carcinoma）細胞株であるＡ４３１細胞株（受託番号ＫＣＬＢ ８０００５）を１％ＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄した。前記洗浄された細胞（１×１０６細胞）を１０μｇの本発明の抗体とともに４℃で２時間培養した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２回洗浄した。Ｍｏｃｋ（抗体なし）及び１０μｇのｈＴＴ−２（抗破傷風モノクローナル抗体、緑十字社製、韓国特許第０６２４０１１号）を陰性対照群として用い、１０μｇのＭ９６（マウス抗−ＥＧＦＲ）を陽性対照群として用いた。ＦＩＴＣ−標識ヤギ抗マウス抗体（Ｆａｂ特異的）複合体を加えて氷上で４０分間培養した。前記細胞を１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２回洗浄した後、１ｍＬの１％ＢＳＡ−ＰＢＳに懸濁させてフローサイトメトリー（製品名：ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で分析した。実験結果が図１０に示されている。これらの結果は、本発明の抗体であるＥＲ２及びＥＲ７９はＡ４３１細胞でＥＧＦＲに結合する一方、ｈＴＴ−２（抗破傷風モノクローナル抗体）は結合しないことを示す。
【実施例１１】
【００６６】
実施例１１：ＥＧＦＲリン酸化における本発明の抗体の効果
本発明の抗体ＥＲ２及びＥＲ７９のＥＧＦＲリン酸化を抑制する能力を試した。要するに、乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（受託番号ＫＣＬＢ ３００２６）を２４−ウェルプレート（ＮＵＮＣ）に１×１０５の細胞濃度で培養した。２日後、各ウェルに本発明の抗体をそれぞれ５μｇ、２５μｇ、５０μｇ及び１００μｇの量で加えた後、５０ｎｇのＥＧＦを各ウェルに加えて３０分間培養した。比較のため、Ｍ９６抗体（緑十字社製、韓国、韓国特許第０６８０１４１号）、Ｃ２２５抗体（製品名：Ｅｒｂｉｔｕｘ、ＩｍＣｌｏｎｅ社製、米国）、及びＥＲ４１４抗体を使用した。ウェル当り０.５ｍＬの溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ；１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム）を用いて細胞抽出物を製造した。前記細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、分離したタンパク質バンドをニトロセルロース膜に転写した。前記膜を５％ＢＳＡ溶液を用いて３０分間ブロッキングした後、リン酸化されたＥＧＦＲと特異的に反応する抗ホスホチロシン特異的ペルオキシダーゼ複合体（Ｚｙｍｅｄ社、米国）を用いて４℃で一晩免疫ブロッティングした。前記免疫ブロットされた膜をＰＢＳＴで洗浄してＰＢＳ及びメタノール中の０.０１８％（ｖ／ｖ）４−クロロ−１−ナフトール及び０.０４５％過酸化水素の基質を用いて発色反応をさせた。その結果を図１１に示した。これらの結果は抗体の量がＥＧＦＲリン酸化に影響を与え、Ｅｒｂｉｔｕｘで処理された陽性対照群と比較してＥＲ２及びＥＲ７９が類似したＥＧＦＲリン酸化の抑制能を有することを示す。
【実施例１２】
【００６７】
実施例１２：ＥＧＦＲに対する抗体の結合部位の確認
本発明の抗体ＥＲ２及びＥＲ７９がキメラ抗体Ｃ２２５（Ｅｒｂｉｔｕｘ、ＩｍＣｌｏｎｅ社製、米国）とＥＧＦＲに対して同一の結合部位を有するか否かを確認するために表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ；Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００）を使用した。ＥＧＦＲ抗原をカルボキシメチル化したデキストラン表面チップ（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｃｈｉｐ）（ＣＭ５ ｃｈｉｐ：Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に約１，０００の反応単位（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔ）で固定化した。その後、Ｃ２２５抗体をチップ上に注入して、抗原と抗体の解離過程なしに直ちにＥＲ２とＥＲ７９とをそれぞれ注入した後、結合反応を２５℃で測定した。その結果を図１２に示した。本発明のヒト抗体はＣ２２５抗体と異なる結合部位を有することが示された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、１７０ｋＤａのＩ型の膜貫通タンパク質であって、種々のヒト腫瘍、例えば肺癌、乳癌、結腸癌、胃癌、脳癌、膀胱癌、頭部癌、頸部癌、卵巣癌及び前立腺癌で過剰発現されると知られている。その過剰発現はしばしばＥＧＦＲ−リガンドであるＴＧＦ−α（トランスフォーミング増殖因子−α）及びＥＧＦ（上皮成長因子）の産生を伴い、ＥＧＦＲへのリガンドの結合は細胞増殖及び腫瘍成長を誘導することが確認された。したがって、ＥＧＦＲに対する抗体を用いて前記リガンドとＥＧＦＲとの間の相互作用を遮断すれば腫瘍成長を抑制することができ、これはＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体を用いた実験によって効果的であることが立証されている。
【０００３】
転移性大膓癌の治療のための臨床応用で現在使用されている抗体Ｃ２２５（製品名：Ｅｒｂｉｔｕｘ、ＩｍＣｌｏｎｅ社製、米国）はヒト抗体ＩｇＧ１定常領域に結合されたマウス抗体の可変領域を含むキメラ抗体である（約３０％のマウスアミノ酸配列含む）。Ｃ２２５は、腫瘍細胞成長、インビトロにおけるＥＧＦＲリン酸化及びヌードマウスにおける腫瘍形成を抑制し、また、特定の化学療法剤とともに使用される場合、マウスにおいてヒト腫瘍異種移植片を根絶させることが示されている。しかし、前記抗体は当該抗体によって治療された患者の一部（１０％以内）で免疫反応を誘発するという問題点がある。よって、ＥＧＦＲに対する改善された治療用抗体が求められている。
【０００４】
最近、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって許可された抗癌剤のうち、標的治療剤が約５０％を占めている。前記抗体は標的特異性と免疫系を効果的に誘発することができる能力を提供し、これは前記抗体の長い生物学的半減期と組み合わされて、研究者らに前記抗体の治療能力について気づかせた。その結果、米国食品医薬品局は最近、癌治療のための様々な抗体の使用を承認してきた。抗体は疾患に対する多様な治療的なアプローチにおいて重要な役割を果たしており、完全なヒト抗体の開発を可能にする技術が最近出現したことによりさらに大きな関心を集めることになった。
【０００５】
本発明者らは新しい相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する新規で、かつ改善されたヒト抗体を開発するために鋭意研究を重ねた結果、前記抗体がＥＧＦＲを介した媒介シグナル伝逹を遮断することで癌を治療することに使用され得ることを確認した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の目的は上皮成長因子受容体に特異的に結合する新規抗体を提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的はそれぞれ前記抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡならびにこれを含む発現ベクターを提供することである。
【０００８】
本発明のまた他の目的は前記発現ベクターで形質転換された細胞株を提供することである。
【０００９】
本発明のさらなる目的は前記抗体を含む癌治療用の医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一つの態様によれば、ａ）それぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含む重鎖可変領域と、ｂ）それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、ｃ）重鎖定常領域と、ｄ）軽鎖定常領域とを含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体が提供される。
【００１１】
また、ａ）それぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、ｂ）それぞれ配列番号９、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、ｃ）重鎖定常領域と、ｄ）軽鎖定常領域とを含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体が提供される。
【００１２】
本発明の他の態様によれば、前記抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードするＤＮＡならびにこれを含む発現ベクターが提供される。
【００１３】
本発明のまた他の態様によれば、前記発現ベクターで形質転換された細胞株が提供される。
【００１４】
本発明のさらなる態様によれば、前記抗体を含む癌治療用の医薬組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本発明の前記及びその他の目的および特徴は、添付された図面とともに考慮するとき、下記説明によって明確になり、それぞれは次のとおりである。
【図１】図１は、ＰＣＲによって合成された本発明の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）をそれぞれコードするＤＮＡを示す電気泳動の写真（１％アガロースゲル）である。
【図２】図２は、本発明の抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、ファージ−ディスプレイ用ベクターｐＫＳ４Ｈのマップである。
【図３】図３は、バイオパニング法を用いて抗体ライブラリーから抗体を選別する工程を示す図である。
【図４】図４は、本発明の抗体であるＥＲ２及びＥＲ７９の一本鎖可変領域断片（sｃＦｖ）のアミノ酸配列である。
【図５】図５は、本発明のヒト抗体の重鎖を発現するための発現ベクターＥＲ２−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３またはＥＲ７９−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３のマップである。
【図６】図６は、本発明のヒト抗体の軽鎖を発現するためのベクターＥＲ２−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２のマップである。
【図７】図７は、本発明のヒト抗体の軽鎖を発現するためのＥＲ７９−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２のマップである。
【図８】図８は、形質転換体から発現された重鎖及び軽鎖のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析図である。
【図９】図９は、ヒト抗体（ＥＲ２及びＥＲ７９）、キメラ抗体（Ｃ２２５、Ｅｒｂｉｔｕｘ）及びその他の抗体（ＥＲ４１４）の上皮成長因子受容体に対する相対的親和度を示す図である。
【図１０】図１０は、本発明の抗体と癌細胞株（Ａ４３１）で過剰発現された上皮成長因子受容体の結合を示すフローサイトメーター図である。
【図１１】図１１は、上皮成長因子受容体のリン酸化に対する本発明の抗体の阻害効果を示す図である。
【図１２】図１２は、本発明の抗体の上皮成長因子との結合部位、及びキメラ抗体Ｃ２２５（Ｅｒｂｉｔｕｘ）との結合部位を示す表面プラズモン共鳴測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明は、ａ）それぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含む重鎖可変領域と、ｂ）それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、ｃ）重鎖定常領域と、ｄ）軽鎖定常領域とを含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体を提供する。好ましくは、前記抗体はａ）配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、ｃ）重鎖定常領域と、ｄ）軽鎖定常領域とを含む抗体であり得る。
【００１８】
また、本発明は、ａ）それぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、ｂ）それぞれ配列番号９、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、ｃ）重鎖定常領域と、ｄ）軽鎖定常領域とを含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体を提供する。好ましくは、前記抗体は、ａ）配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、ｃ）重鎖定常領域と、ｄ）軽鎖定常領域とを含む抗体であり得る。
【００１９】
本発明の抗体は好ましくはヒト抗体であってもよく、上皮成長因子（ＥＧＦ）によって誘導されるシグナル伝逹を遮断することを特徴とする。
【００２０】
前記上皮成長因子受容体に特異的な抗体は、好ましくはファージ−ディスプレイ法（Ｓｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２８、１３１５−１３１７、１９８５；及びＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ＆Ｃｈａｍｅｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ、２１、３７１−３７８、２０００）の改変法によって選別されうる。ファージ−ディスプレイ法において、線状（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ）ファージ（例えば、Ｍ１３、ＦｄまたはＦ１）の表面タンパク質をコードする遺伝子（ｇｅｎｅ III）が目的の抗体をコードする遺伝子と融合されることにより、表面に露出した前記の融合された抗体を有するウイルス粒子が抗体−ファージの形態で生成される。その後、前記抗体の高い特異度及び親和度ならびに前記ファージの高い感染性を用いて、バイオパニング法によって、ファージライブラリーから目的の抗体を選別することができる（Ｂｕｒｔｏｎ ＆ Ｂａｒｂａｓ、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５７、１９１−２８０、１９９４；Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２、４３３−４５５、１９９４；及びＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４、１−２０、１９９８）。前記ファージ−ディスプレイベクターはｐＫＳ４Ｈ（韓国特許第０６３５３７０号参照）またはｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ、好ましくはｐＫＳ４Ｈである。
【００２１】
本発明においては、ヒト抗体ＥＲ４１４をファージライブラリーから選別し、上皮成長因子受容体に対する親和度と中和能を確認した（図９及び図１１）。前記ＥＲ４１４抗体は中和能を有するが親和度は市販の抗体であるＣ２２５よりも１６倍低かった。したがって、親和性成熟のプロセスを用いてＣ２２５と類似した親和度を有する改善された抗体を選別した。すなわち、主として選別された抗体の相補性決定領域のアミノ酸ランダム化によってライブラリーを作製して、バイオパニング法を用いて親和性が成熟した抗体を選別し、最終的にＣ２２５抗体と類似した親和度を有する抗体（ＥＲ２及びＥＲ７９）を選別した。
【００２２】
抗体ＥＲ２の場合、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を有する。一方、抗体ＥＲ７９の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はそれぞれ配列番号９、５及び６のアミノ酸配列を有する。
【００２３】
本発明の抗体の重鎖定常領域及び軽鎖定常領域はヒト抗体のそれと同一であってもよく、好ましくはそれぞれ配列番号４３及び配列番号４４のアミノ酸配列を有するアミノ酸であってもよい。
【００２４】
本発明は、それぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変領域をコードするＤＮＡを提供する。好ましくは、前記ＤＮＡは前記配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号１１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、前記配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列番号１２のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド及び前記配列番号３のアミノ酸配列をコードする配列番号１３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むことができる。
【００２５】
本発明は、配列番号７のアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変領域をコードするＤＮＡを提供する。好ましくは、前記ＤＮＡは前記配列番号７のアミノ酸配列をコードする配列番号１４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むことができる。
【００２６】
また、本発明は、それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを提供する。好ましくは、前記ＤＮＡは前記配列番号４のアミノ酸配列をコードする配列番号１５のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、前記配列番号５のアミノ酸配列をコードする配列番号１６のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド及び前記配列番号６のアミノ酸配列をコードする配列番号１７のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むことができる。
【００２７】
本発明は、配列番号８のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを提供する。好ましくは、前記ＤＮＡは前記配列番号８のアミノ酸配列をコードする配列番号１８のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むことができる。
【００２８】
また、本発明は、それぞれ配列番号９、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを提供する。好ましくは、前記ＤＮＡは前記配列番号９のアミノ酸配列をコードする配列番号１９のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、前記配列番号５のアミノ酸配列をコードする配列番号１６のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド及び前記配列番号６のアミノ酸配列をコードする配列番号１７のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むことができる。
【００２９】
本発明は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを提供する。好ましくは、前記ＤＮＡは前記配列番号１０のアミノ酸配列をコードする配列番号２０のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むことができる。
【００３０】
本発明は、前記抗体の重鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域を発現させる発現ベクターを提供する。好ましくは、前記発現ベクターは図５にマップが示されている「ＥＲ２−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３」または「ＥＲ７９−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３」であり得る。
【００３１】
具体的に、前記ベクターは、親和性成熟プロセスによって選別した抗体のＶＨ断片（１−ａ：ＥＲ２Ａｂ−Ｈまたは１−ｂ：ＥＲ７９Ａｂ−Ｈ）を適したベクター、例えば、ｐＲＣ１３ベクター（受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００５４；韓国特許登録第５２３７３２号）に挿入して製造されうる。
【００３２】
本発明は、前記抗体の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域を発現させる発現ベクターを提供する。好ましくは、前記発現ベクターは図６にマップが示されている「ＥＲ２−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２」または図７にマップが示されている「ＥＲ７９−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２」であり得る。
【００３３】
具体的に、前記ベクターは、親和性成熟プロセスによって選別した抗体のそれぞれのＶＬ断片（２−ａ：ＥＲ２Ａｂ−Ｌまたは２−ｂ：ＥＲ７９Ａｂ−Ｌ）を適したベクター、例えば、ｐＫＣ１２ベクター（受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ―０００５４；韓国特許登録第５２３７３２号）に挿入して製造されうる。
【００３４】
本発明は、本発明の抗体の重鎖可変領域を発現させる発現ベクター及び本発明の抗体の軽鎖可変領域を発現させる発現ベクターで形質転換された動物細胞株を提供する。前記本発明の抗体の重鎖可変領域を発現させる発現ベクターは、好ましくはＥＲ２−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３またはＥＲ７９−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３であり得て、本発明の抗体の軽鎖可変領域を発現させる発現ベクターは、好ましくはＥＲ２−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２またはＥＲ７９−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２であり得る。前記動物細胞株はＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＨＥＫ２９３またはＮＳＯ細胞株、好ましくはＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞株であり得る。
【００３５】
本発明による抗体は前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が互いに結合されることで製造されうる。
【００３６】
本発明の抗体の抗原に対する親和度は、例えば、競合ＥＬＩＳＡ（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、２０、２６５−２７２、２００１）によって測定されうる。図９から分かるように、本発明のＥＲ２抗体の親和度はＣ２２５抗体と類似する一方、ＥＲ７９抗体の親和度はＣ２２５抗体よりも２倍低い。また、前記抗体らは癌細胞株で過剰発現された上皮成長因子受容体に結合することがフローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を用いて立証され（図１０）、乳癌細胞における上皮成長因子受容体のリン酸化阻害実験を通じて中和能を有することが確認された（図１１）。したがって、本発明の抗体は上皮成長因子受容体を通じたシグナル伝逹を抑制することで癌治療用抗体として使用されうる。
【００３７】
前記結果に鑑み、本発明は、前記抗体を含む癌治療用組成物、好ましくは医薬組成物を提供する。前記組成物はシスプラチン、ゲムシタビン、ドキソルビシン、５−ＦＵ、イリノテカン及びパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも一つをさらに含むことができる。
【００３８】
前記組成物は活性成分としてＥＲ２またはＥＲ７９抗体またはこれを含有する形質転換体を含み、さらに前記活性成分と同一または類似した機能を有する一つ以上の有効成分を含む。前記活性成分に加えて、本発明の組成物は、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセリン、エタノール、リポソーム及び前記成分のいずれか一つ以上を含む混合物のような、一つ以上の医薬に許容可能な担体を含むことができる。必要な場合、抗酸化剤、緩衝剤、及び静菌剤のような一般的な添加剤をさらに添加してもよい。本発明の組成物は、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤と混合することによって水溶液、注射用懸濁液及び乳濁液、丸剤、カプセル剤、顆粒または錠剤を含む多様な形態で剤形化され得る。標的細胞特異的抗体またはその他のリガンドを前記担体のいずれか一つと混合して標的細胞へ送達することができる。また、前記組成物は文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ］に提示された下記方法によって成分に応じて適した形態で製造され得る。
【００３９】
本発明の医薬組成物は、非経口で（例えば、静脈内、皮下、腹腔、または局所注射）投与されることができ、静脈内注射が好ましい。固形癌の場合、抗体の迅速かつ容易な接近を助ける局所投与がより好ましい。組成物の有効量は、体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与頻度、投与方法、排泄及び疾病の重症度によって決定され得る。ヒト抗体または形質転換体を約５〜５００ｍｇ／ｍ２含有する組成物の１回用量を、一日または一週間ごとに投与することができる。前記有効量は悪性腫瘍患者を治療する医者によって調節され得る。
【００４０】
本発明の医薬組成物は単独または悪性腫瘍を治療するための外科的手術、ホルモン療法、化学療法及び生物学的調節剤とともに投与され得る。
【００４１】
下記の実施例は、本発明を単に詳細に説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００４２】
実施例１：ＲＮＡの分離
上皮成長因子受容体に特異的に結合する抗体を選別するため、ヒト抗体ライブラリーを構築した。ヒト骨髄全ＲＮＡ、ヒト胸腺全ＲＮＡ、ヒト脾臓全ＲＮＡ及びヒトＢ細胞ＲＮＡの混合物を用いた。ヒトＢ細胞ＲＮＡを除いた全てのＲＮＡはＣｌｏｎｔｅｃｈ社（米国）から購入し、ヒトＢ細胞ＲＮＡは下記のように分離した。
【００４３】
健康な成人から採血した５０ｍＬの血液を５０ｍＬのＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩液；Ｓｉｇｍａ社製、米国）と混合して希釈した。５０ｍＬチューブにＨｉｓｔｏｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ社製）１０ｍＬを入れて、ここに希釈された血液２０ｍＬを添加した。前記混合物を３，０００ｒｐｍで遠心分離して白血球を分離した。前記分離された白血球２ｍＬを６ｍＬのＨＢＳＳと混合した後、１０００ｒｐｍで遠心分離した。白血球１００μＬを１ｍＬのトリゾル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、米国）と混合してＲＮＡを分離した。
【００４４】
一方、前記分離されたＲＮＡを蒸留水で希釈した後、２６０ｎｍで吸光度を測定してその量を計算した（１.８μｇ／μＬ；ウルトラスペック（Ultrospec）２０００紫外−可視分光光度計、ＧＥ社製、米国）。詳しい方法は次のようである。
【００４５】
トリゾル１ｍＬを白血球１００μＬに添加してよく振盪させた後、室温で５分間放置した。それから、クロロホルム２００μＬを加え、１５秒間強く振盪させた後３分間放置した。その後、前記混合物を２〜８℃、１５分及び１５，０００ｒｐｍの条件下で遠心分離して、上澄み液を新しいチューブに移した。イソプロピルアルコール５００μＬを入れてよく混ぜた後、室温で１０分間放置した。その後、２〜８℃で５分間１５，０００ｒｐｍで遠心分離して、上澄み液を取り除いた。７５％エタノール１ｍＬを入れて、前記混合物を２〜８℃、５分及び１５，０００ｒｐｍの条件下で遠心分離してエタノールを取り除いた後、ＲＮＡペレットを室温で５分間乾燥させた。ここに蒸留水１５０μＬを入れてＲＮＡペレットを懸濁した後、前記懸濁液の吸光度を２６０ｎｍで測定した。残りは−２０℃で保管した。
【実施例２】
【００４６】
実施例２：抗体遺伝子の増幅
実施例１で分離したＲＮＡ１μｇ及びｐｄ（Ｔ）１２−１８（０.５μｇ／μＬ）１μＬを最終体積が１２.５μＬになるように蒸留水を入れて混合した。前記混合物を７０℃で２分間反応させて氷浴で冷却させた。それから、ここに５Ｘ反応緩衝液、１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、組換え型ＲＮａｓｅ阻害剤（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、米国）を添加して最終体積を２０μＬに合わせた後、４２℃で１時間、９５℃で５分間反応させてｃＤＮＡを合成した。ＬｉｑｕｉＭｉｘ ＱＭ Ｐｒｅｍｉｘ、Ｍａｇｅｎｔａ（Ｎｅｕｒｏｔｉｃｓ Ｉｎｃ社製、韓国）、鋳型として４μＬのｃＤＮＡ、蒸留水１９μＬ、ならびに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域（κ及びλ）に結合するように考案されたそれぞれのプライマー１μＬを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲに用いられたプライマー及びこれらのヌクレオチド配列が表１に示されている。
＜表１＞
ＰＣＲ反応で用いたプライマー
【表１】
【００４７】
ＰＣＲ反応は、９５℃で５分、５５℃で２分、７２℃で２分で３０回行なった後、最後に７２℃で１５分間行った。
【００４８】
このように増幅された抗体ＤＮＡを１.２％アガロースゲルで電気泳動して確認した（図１）。図１から分かるように、重鎖及び軽鎖（κ及びλ）可変領域に当たる３５０ｂｐのＤＮＡバンドを得た。図１において、Ｍはサイズマーカーを、ＶＨは重鎖可変領域（レーン１：重鎖可変領域Ｉ型、レーン２：重鎖可変領域III型、及びレーン３：重鎖可変領域IV型）を、ＶＬは軽鎖可変領域（レーン４：軽鎖可変領域１／３κ、レーン５：軽鎖可変領域２κ、及びレーン６：軽鎖可変領域λ）を示す。
【実施例３】
【００４９】
実施例３：抗体ＤＮＡの制限酵素切断
実施例２で製造したＶＨ及びＶＬ（κ及びλ）をそれぞれ制限酵素ＳｆｉＩ／ＢｓｐＥＩ及びＢｓｐＥＩ／ＮｏｔＩで切断し、切断された断片を１.２％アガロースゲルから分離した後、キアゲンキットを用いて精製した。
【実施例４】
【００５０】
実施例４：抗体ＤＮＡのライゲーション及びライブラリーの製造
ファージ−ディスプレイベクターｐＫＳ４Ｈ（緑十字社製、韓国、韓国特許登録第０６３５３７０号参照）を制限酵素ＳｆｉＩ／ＢｓｐＥＩを用いて切断し、１.２％アガロースゲル電気泳動を用いて分離した後、キアゲンキットを用いて精製した。３０μｇのｐＫＳ４Ｈを実施例３で製造した３μｇのＶＨと混合し、ここにＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社製、米国）を添加した後、２５℃で一晩反応させた。前記ライゲーション混合物をキアゲンキットを用いて精製して大膓菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、米国）に電気穿孔法で形質転換させた。前記形質転換体を１００ｍＬの培地で一晩培養した後、プラスミドを分離した。前記プラスミドを「ｐＫＳ４Ｈ−ＶＨ−ΔＶＬ」と命名した。
【００５１】
前記プラスミドｐＫＳ４Ｈ−ＶＨ−ΔＶＬを制限酵素ＢｓｐＥＩ／ＮｏｔＩで切断して前述のように精製した。次いで、３０μｇのｐＫＳ４Ｈ−ＶＨ−ΔＶＬプラスミドを実施例３で製造された３μｇのＶＬ ＰＣＲ ＤＮＡ及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社製、米国）と混合し、２５℃で一晩反応させた。前記ライゲーション混合物をキアゲンキットを用いて精製して大膓菌ＸＬ１−ｂｌｕｅに電気穿孔法で形質転換させた。前記形質転換体をカルベニシリン及びテトラサイクリンが含有された１００ｍＬの培地で３７℃で２時間培養した。それから、前記培地にＭ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、米国）を播種して１６時間培養してエングバーグら（Ｅｎｇｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ.、Ｍｏｌ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.、６、２８７−３１０、１９９６）によって報告されたように、ファージライブラリーを製造した。一方、前記大膓菌からプラスミドを分離し、これを「ｐＫＳ４Ｈ−ＶＨ−ＶＬ」と命名した。前記プラスミドのマップが図２に示されている。
【実施例５】
【００５２】
実施例５：上皮成長因子受容体に結合する抗体の選別
ＥＧＦＲに結合する抗体をパニング法（Ｅｎｇｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ.、Ｍｏｌ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.、６、２８７−３１０、１９９６；及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ.、Ｇｅｎｅ、２４１、１９−２５、２０００）の改変法によって選別した。具体的には、ＥＧＦＲ（Ｓｉｇｍａ社製、米国）をＰＢＳで希釈して各イムノチューブ（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ、ＮＵＮＣ社製、デンマーク）上にコーティングした。次いで、前記コーティングされたイムノチューブに実施例４で製造したファージライブラリーを加えて３７℃で２時間反応させた。ＥＧＦＲに結合したファージを０.１Ｍのグリシンバッファー（ｐＨ２.０）で溶離した。その後、大膓菌ＸＬ１−ｂｌｕｅを前記ファージに感染させ、ヘルパーファージを添加した。前記大膓菌を３７℃で一晩培養して、ここに２０％ＰＥＧ８，０００及び１５％ＮａＣｌを含む溶液を添加した。それから、沈澱したファージを回収して（ファージレスキュー）、ファージを再びＥＧＦＲ−コーティングされたイムノチューブに反応させ、前記パニング手順を４回繰り返した。前記手順を通じてＥＧＦＲに結合するヒト抗体であるＥＲ２及びＥＲ７９を選別した。ファージディスプレイライブラリーを用いて抗体を選別する工程を図３に示した。
【００５３】
４回目のパニングから得られた各コロニーを前述した方法（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ.、Ｇｅｎｅ、２４１、１９−２５、２０００）によって２ｍＬの培地で成長させ、ＩＰＴＧ（イソプロピル β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）で処理して抗体発現を誘導した。抗体誘導をＥＦＧＲがコーティングされた９６−ウェルプレートを用いてＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）によって測定した。
【実施例６】
【００５４】
実施例６：選別された抗体の配列分析
前記実施例５で選別したヒト抗体ＥＲ２及びＥＲ７９を分泌するコロニーを５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ培地１０ｍＬで一晩培養した後、キアゲンプラスミドミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社製、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、米国）を用いてプラスミドを分離した。前記プラスミドを制限酵素ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動によって抗体の断片の挿入を確認した。プラスミドに挿入されたｓｃＦｖのＤＮＡ配列を分析した。
【００５５】
ｓｃＦｖのヌクレオチド配列をＧｅｎｏｔｅｃｈ社（大田、韓国）でシークエンスプライマーである配列番号３８のｐ０３３で分析した。ＥＲ２、ＥＲ７９及びＭ９６（マウス抗体）のｓｃＦｖのＤＮＡ配列をウェブ基盤のプログラム（ｗｗｗ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ：DNAからタンパク質への翻訳ツール（ＤＮＡ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌａｔｅ ｔｏｏｌ））を用いてアミノ酸に翻訳し、前記翻訳されたアミノ酸配列が図４に示されている。図４において、Ｍ９６、ＥＲ２及びＥＲ７９はそれぞれＭ９６（マウス抗体）及び本発明のＥＲ２及びＥＲ７９のｓｃＦｖのアミノ酸配列を示す。図４から分かるように、ヒト抗体ＥＲ２及びＥＲ７９は相違するアミノ酸配列を有していた。
【実施例７】
【００５６】
実施例７：発現ベクターの製造
抗体断片を完全な形態の免疫グロブリンに転換するため、抗体発現ベクターｐＲＣ１３及びｐＫＣ１２（Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原に対するヒト抗体の可変領域を挿入するためのプラスミド；韓国特許第５２３７３２号；受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００５４）を使用した。
【００５７】
各ＶＨ断片を重鎖発現ベクターｐＲＣ１３のＨｉｎｄIII及びＡｐａＩ部位内に挿入した。図５に例示されたように、ヒト抗体ＥＲ２及びＥＲ７９の重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを配列番号３９及び４０のそれぞれのプライマーを用いてＰＣＲによって増幅させ、ＨｉｎｄIII／ＡｐａＩで切断した後、同一の制限酵素で切断したｐＲＣ１３内に挿入した。前記組換えベクターを「ＥＲ２−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３」または「ＥＲ７９−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３」と命名した。前記用いたプライマーを表２に示した。
＜表２＞
ＰＣＲ反応で用いたプライマー
【表２】
【００５８】
一方、各ＶＬ断片を軽鎖発現ベクターｐＫＣ１２のＮｈｅＩ及びＡｐａＩ部位内に挿入した。図６及び７に例示されたように、ヒト抗体ＥＲ２及びＥＲ７９の軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするそれぞれのＤＮＡを配列番号４１及び４２のそれぞれのプライマーを用いてＰＣＲによって増幅させ、ＮｈｅＩ／ＡｐａＩで切断した後、同一の制限酵素で切断したｐＫＣ１２内に挿入した。前記組換えベクターを「ＥＲ２−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２」または「ＥＲ７９−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２」と命名した。前記用いたプライマーを表３に示した。
＜表３＞
ＰＣＲ反応で用いたプライマー
【表３】
【実施例８】
【００５９】
実施例８：抗体を分泌する動物細胞株の製造
トランスフェクションの２４時間前に、２×１０５個のＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を５％ＣＯ２の存在下で３７℃培養器で１０％のＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、米国）を含むα−ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、米国）が入っているＴ−２５フラスコ（ＮＵＮＣ社製、デンマーク）で密集度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）が５０％に到逹するまで培養した。それから、３０μｇのリポフェクチン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、米国）を１.５ｍＬのオプティ（opti）−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、米国）に添加して室温で９０分間放置した。同時にＥＲ２−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３ ８μｇ ＆ ＥＲ２−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２ ７μｇ、ＥＲ７９−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３ ８μｇ ＆ ＥＲ７９−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２ ７μｇを混合してオプティ−ＭＥＭ培地で１.５ｍＬにした後、室温で９０分間培養した。９０分後、リポフェクチンを含有する培地を、それぞれＥＲ２−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３ ＆ ＥＲ２−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２及びＥＲ７９−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３ ＆ ＥＲ７９−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２を含有する培地と混合した後、室温で１５分間反応させた。反応中に細胞から培地を除去し、前記細胞をトランスフェクションのためにＰＢＳで３回洗浄した。前記洗浄された細胞に前記反応混合物を加えて６時間培養した。６時間後、前記反応混合物を除去した後、α−ＭＥＭ培地を入れて４８時間培養した。それから、細胞をトリプシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、米国）で処理してフラスコから剥離した後、α−ＭＥＭ培地で希釈して９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ社製、デンマーク）にて継代した。この時、α−ＭＥＭ培地はリボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドを含有しない一方、１０％の透析ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）及び５５０μｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｓｉｇｍａ社製、米国）を含有する。前記培地を２日ごとに新しい培地に取り替えた。コロニーを形成した培養上清液をＥＬＩＳＡによる抗体発現のために回収した後、選別された細胞を１２−ウェルプレートに移した。前記細胞を６−ウェルプレートに移してメトトレキセート（ＭＴＸ、中外製薬社製、韓国）処理をした。ＭＴＸの初期濃度は２０ｎＭであり、細胞適応度に応じて８０ｎＭ、３２０ｎＭ及び１μＭに増加させた。１μＭの濃度で生存しながら抗体分泌量の高い細胞株を選別した。スピナーフラスコと無血清培地を用いて、６５ｒｐｍ、５％ＣＯ２及び３７℃の培養器で大量培養を行った。１０８細胞を１００ｍＬの無血清培地が入っている２５０ｍＬスピナーフラスコで培養した。細胞数が初期播種の２倍になると、１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を回収した。回収した細胞を２００ｍＬの培地が入っている５００ｍＬスピナーフラスコで再培養した。細胞数が初期播種の２倍になると、１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を回収してこれを１Ｌの培地が入っている３Ｌスピナーフラスコに移した。ここに酪酸ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ社製、米国）を最終濃度２ｍＭになるように添加し、細胞を５日間培養した後、培地から培養上清液を回収した。スピナーフラスコで回収した上清液から、タンパク質Ａ−アガロースコラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、米国）を用いて抗体を精製し、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【００６０】
図８に示したように、約５０ｋＤａの重鎖バンド及び２５ｋＤａの軽鎖バンドが観察され、これは抗体が正しく合成されたことを示す。
【実施例９】
【００６１】
実施例９：抗体親和度の測定
実施例８で得られた抗体のＥＧＦＲに対する親和度を競合ＥＬＩＳＡ法（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ.、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、２０、２６５−２７２、２００１）によって測定し、その結果を図９に示した。簡略な手順は次のようである。
【００６２】
（１）適正抗体濃度の決定
Ａ．プレートの準備
ＰＢＳで２μｇ／ｍＬで希釈した１００μＬのＥＧＦＲ（Ｓｉｇｍａ社製、米国）をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加して４℃で一晩培養した。プレートの各ウェルをＰＢＳＴで１回洗浄した後、各ウェルに３００μＬの１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を加えて室温で１時間培養した。
Ｂ．１次反応
連続希釈した各精製抗体（０.５μｇ／ｍＬ）１００μＬをプレートの各ウェルに添加して、室温で２時間培養した後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。
Ｃ．２次反応
１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で１：５０００で希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）−ペルオキシダーゼ複合体（Ｓｉｇｍａ社製）１００μＬを各ウェルに添加して、室温で１時間反応させた後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。
Ｄ．基質反応
１００μＬのＴＭＢ（３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン、マイクロウェルペルオキシダーゼ基質システム（Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｙｓｔｅｍ）（ＫＰＬ、ＭＤ、米国））を各ウェルに添加した後、４０５ｎｍでＯ.Ｄ値を測定した。適正抗体濃度をＥＧＦＲ−コーティングされたプレートに対して最大半量結合（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ）を示す抗体濃度で決定した。
【００６３】
（２）競合ＥＬＩＳＡ
Ａ．プレートの準備
ＰＢＳで２μｇ／ｍＬで希釈した１００μＬのＥＧＦＲ（Ｓｉｇｍａ社製、米国）をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加して４℃で一晩培養した。各ウェルをＰＢＳＴで１回洗浄した後、各ウェルに３００μＬの１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を加えて室温で１時間培養した。
Ｂ．１次反応
２μｇのＥＧＦＲに２倍連続希釈して、前記希釈された１０μＬのＥＧＦＲをプレートの各ウェルに添加した。次いで、前記（１）で決定された適正濃度で希釈された９０μＬの抗体を各ウェルに添加して、室温で２時間培養した後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。
Ｃ．２次反応
１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で１：５０００で希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）−ペルオキシダーゼ複合体（Ｓｉｇｍａ社製）１００μＬを各ウェルに添加して、室温で１時間反応させた後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。
Ｄ．基質反応
１００μＬのＴＭＢ（３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン、マイクロウェルペルオキシダーゼ基質システム（ＫＰＬ社製、ＭＤ、米国））を各ウェルに添加した後、４０５ｎｍでＯ.Ｄ値を測定した。最大結合量（競合するＥＧＦＲが存在しないＯ.Ｄ値）の５０％を抑制するＥＧＦＲの濃度をＫｄとして決定した。
【００６４】
図９から分かるように、キメラ抗体（Ｃ２２５）と比較すると、ヒト抗体ＥＲ２は類似した親和度を示し、ＥＲ７９はほぼ６３％程度の親和度を示した。また、本発明の抗体らの親和度はＥＲ４１４（バイオパニング以前のヒト抗体）よりもさらに高かった。
【実施例１０】
【００６５】
実施例１０：腫瘍細胞株における上皮成長因子受容体に対する本発明の抗体の結合確認
腫瘍細胞株で過剰発現されたＥＧＦＲに対する本発明の抗体であるＥＲ２及びＥＲ７９の結合をＦＡＣＳによって確認した。要するに、ＥＧＦＲを過剰発現する皮膚癌（epidermoid carcinoma）細胞株であるＡ４３１細胞株（受託番号ＫＣＬＢ ８０００５）を１％ＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄した。前記洗浄された細胞（１×１０６細胞）を１０μｇの本発明の抗体とともに４℃で２時間培養した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２回洗浄した。Ｍｏｃｋ（抗体なし）及び１０μｇのｈＴＴ−２（抗破傷風モノクローナル抗体、緑十字社製、韓国特許第０６２４０１１号）を陰性対照群として用い、１０μｇのＭ９６（マウス抗−ＥＧＦＲ）を陽性対照群として用いた。ＦＩＴＣ−標識ヤギ抗マウス抗体（Ｆａｂ特異的）複合体を加えて氷上で４０分間培養した。前記細胞を１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２回洗浄した後、１ｍＬの１％ＢＳＡ−ＰＢＳに懸濁させてフローサイトメトリー（製品名：ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で分析した。実験結果が図１０に示されている。これらの結果は、本発明の抗体であるＥＲ２及びＥＲ７９はＡ４３１細胞でＥＧＦＲに結合する一方、ｈＴＴ−２（抗破傷風モノクローナル抗体）は結合しないことを示す。
【実施例１１】
【００６６】
実施例１１：ＥＧＦＲリン酸化における本発明の抗体の効果
本発明の抗体ＥＲ２及びＥＲ７９のＥＧＦＲリン酸化を抑制する能力を試した。要するに、乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（受託番号ＫＣＬＢ ３００２６）を２４−ウェルプレート（ＮＵＮＣ）に１×１０５の細胞濃度で培養した。２日後、各ウェルに本発明の抗体をそれぞれ５μｇ、２５μｇ、５０μｇ及び１００μｇの量で加えた後、５０ｎｇのＥＧＦを各ウェルに加えて３０分間培養した。比較のため、Ｍ９６抗体（緑十字社製、韓国、韓国特許第０６８０１４１号）、Ｃ２２５抗体（製品名：Ｅｒｂｉｔｕｘ、ＩｍＣｌｏｎｅ社製、米国）、及びＥＲ４１４抗体を使用した。ウェル当り０.５ｍＬの溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ；１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム）を用いて細胞抽出物を製造した。前記細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、分離したタンパク質バンドをニトロセルロース膜に転写した。前記膜を５％ＢＳＡ溶液を用いて３０分間ブロッキングした後、リン酸化されたＥＧＦＲと特異的に反応する抗ホスホチロシン特異的ペルオキシダーゼ複合体（Ｚｙｍｅｄ社、米国）を用いて４℃で一晩免疫ブロッティングした。前記免疫ブロットされた膜をＰＢＳＴで洗浄してＰＢＳ及びメタノール中の０.０１８％（ｖ／ｖ）４−クロロ−１−ナフトール及び０.０４５％過酸化水素の基質を用いて発色反応をさせた。その結果を図１１に示した。これらの結果は抗体の量がＥＧＦＲリン酸化に影響を与え、Ｅｒｂｉｔｕｘで処理された陽性対照群と比較してＥＲ２及びＥＲ７９が類似したＥＧＦＲリン酸化の抑制能を有することを示す。
【実施例１２】
【００６７】
実施例１２：ＥＧＦＲに対する抗体の結合部位の確認
本発明の抗体ＥＲ２及びＥＲ７９がキメラ抗体Ｃ２２５（Ｅｒｂｉｔｕｘ、ＩｍＣｌｏｎｅ社製、米国）とＥＧＦＲに対して同一の結合部位を有するか否かを確認するために表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ；Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００）を使用した。ＥＧＦＲ抗原をカルボキシメチル化したデキストラン表面チップ（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｃｈｉｐ）（ＣＭ５ ｃｈｉｐ：Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に約１，０００の反応単位（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔ）で固定化した。その後、Ｃ２２５抗体をチップ上に注入して、抗原と抗体の解離過程なしに直ちにＥＲ２とＥＲ７９とをそれぞれ注入した後、結合反応を２５℃で測定した。その結果を図１２に示した。本発明のヒト抗体はＣ２２５抗体と異なる結合部位を有することが示された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）それぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含む重鎖可変領域と、
ｂ）それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、
ｃ）重鎖定常領域と、
ｄ）軽鎖定常領域と
を含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体。
【請求項２】
ａ）配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、
ｃ）重鎖定常領域と、
ｄ）軽鎖定常領域と
を含む請求項１に記載の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体。
【請求項３】
ａ）それぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
ｂ）それぞれ配列番号９、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、
ｃ）重鎖定常領域と、
ｄ）軽鎖定常領域と
を含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体。
【請求項４】
ａ）配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、
ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、
ｃ）重鎖定常領域と、
ｄ）軽鎖定常領域と
を含む請求項３に記載の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体。
【請求項５】
前記抗体がヒト抗体である請求項１〜４のいずれか一つに記載の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体。
【請求項６】
前記抗体が上皮成長因子（ＥＧＦ）によって誘導されるシグナル伝逹を遮断する請求項１〜４のいずれか一つに記載の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体。
【請求項７】
それぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変領域をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
前記ＤＮＡが配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号１１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列番号１２のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、及び配列番号３のアミノ酸配列をコードする配列番号１３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む請求項７に記載のＤＮＡ。
【請求項９】
配列番号７のアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変領域をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
前記ＤＮＡが配列番号７のアミノ酸配列をコードする配列番号１４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む請求項９に記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ。
【請求項１２】
前記ＤＮＡが配列番号４のアミノ酸配列をコードする配列番号１５のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、配列番号５のアミノ酸配列をコードする配列番号１６のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、及び配列番号６のアミノ酸配列をコードする配列番号１７のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む請求項１１に記載のＤＮＡ。
【請求項１３】
配列番号８のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ。
【請求項１４】
前記ＤＮＡが配列番号８のアミノ酸配列をコードする配列番号１８のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む請求項１３に記載のＤＮＡ。
【請求項１５】
それぞれ配列番号９、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ。
【請求項１６】
前記ＤＮＡが配列番号９のアミノ酸をコードする配列番号１９のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、配列番号５のアミノ酸配列をコードする配列番号１６のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、及び配列番号６のアミノ酸配列をコードする配列番号１７のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む請求項１５に記載のＤＮＡ。
【請求項１７】
配列番号１０のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ。
【請求項１８】
前記ＤＮＡが配列番号１０のアミノ酸配列をコードする配列番号２０のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む請求項１７に記載のＤＮＡ。
【請求項１９】
請求項７に記載のＤＮＡを含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域を発現させる発現ベクター。
【請求項２０】
前記ベクターが、図５にマップが示されているＥＲ２−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３またはＥＲ７９−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３である請求項１９に記載の発現ベクター。
【請求項２１】
請求項１１に記載のＤＮＡを含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域を発現させる発現ベクター。
【請求項２２】
前記ベクターが、図６にマップが示されているＥＲ２−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２である請求項２１に記載の発現ベクター。
【請求項２３】
請求項１５に記載のＤＮＡを含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域を発現させる発現ベクター。
【請求項２４】
前記ベクターが、図７にマップが示されているＥＲ７９−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２である請求項２３に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
請求項１９に記載の発現ベクター及び請求項２１に記載の発現ベクターで形質転換された動物細胞株。
【請求項２６】
前記動物細胞株がＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＨＥＫ２９３、またはＮＳＯ細胞株である請求項２５に記載の動物細胞株。
【請求項２７】
請求項１９に記載の発現ベクター及び請求項２３に記載の発現ベクターで形質転換された動物細胞株。
【請求項２８】
前記動物細胞株がＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＨＥＫ２９３またはＮＳＯ細胞株である請求項２７に記載の動物細胞株。
【請求項２９】
請求項１又は３に記載の抗体を含む癌治療用組成物。
【請求項３０】
前記組成物がシスプラチン、ゲムシタビン、ドキソルビシン、５−ＦＵ、イリノテカン及びパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも一つをさらに含む請求項２９に記載の癌治療用組成物。
【請求項１】
ａ）それぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含む重鎖可変領域と、
ｂ）それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、
ｃ）重鎖定常領域と、
ｄ）軽鎖定常領域と
を含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体。
【請求項２】
ａ）配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、
ｃ）重鎖定常領域と、
ｄ）軽鎖定常領域と
を含む請求項１に記載の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体。
【請求項３】
ａ）それぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
ｂ）それぞれ配列番号９、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、
ｃ）重鎖定常領域と、
ｄ）軽鎖定常領域と
を含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体。
【請求項４】
ａ）配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、
ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、
ｃ）重鎖定常領域と、
ｄ）軽鎖定常領域と
を含む請求項３に記載の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体。
【請求項５】
前記抗体がヒト抗体である請求項１〜４のいずれか一つに記載の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体。
【請求項６】
前記抗体が上皮成長因子（ＥＧＦ）によって誘導されるシグナル伝逹を遮断する請求項１〜４のいずれか一つに記載の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体。
【請求項７】
それぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変領域をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
前記ＤＮＡが配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号１１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列番号１２のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、及び配列番号３のアミノ酸配列をコードする配列番号１３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む請求項７に記載のＤＮＡ。
【請求項９】
配列番号７のアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変領域をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
前記ＤＮＡが配列番号７のアミノ酸配列をコードする配列番号１４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む請求項９に記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ。
【請求項１２】
前記ＤＮＡが配列番号４のアミノ酸配列をコードする配列番号１５のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、配列番号５のアミノ酸配列をコードする配列番号１６のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、及び配列番号６のアミノ酸配列をコードする配列番号１７のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む請求項１１に記載のＤＮＡ。
【請求項１３】
配列番号８のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ。
【請求項１４】
前記ＤＮＡが配列番号８のアミノ酸配列をコードする配列番号１８のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む請求項１３に記載のＤＮＡ。
【請求項１５】
それぞれ配列番号９、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ。
【請求項１６】
前記ＤＮＡが配列番号９のアミノ酸をコードする配列番号１９のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、配列番号５のアミノ酸配列をコードする配列番号１６のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、及び配列番号６のアミノ酸配列をコードする配列番号１７のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む請求項１５に記載のＤＮＡ。
【請求項１７】
配列番号１０のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ。
【請求項１８】
前記ＤＮＡが配列番号１０のアミノ酸配列をコードする配列番号２０のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む請求項１７に記載のＤＮＡ。
【請求項１９】
請求項７に記載のＤＮＡを含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域を発現させる発現ベクター。
【請求項２０】
前記ベクターが、図５にマップが示されているＥＲ２−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３またはＥＲ７９−Ｈｅａｖｙ−ｐＲＣ１３である請求項１９に記載の発現ベクター。
【請求項２１】
請求項１１に記載のＤＮＡを含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域を発現させる発現ベクター。
【請求項２２】
前記ベクターが、図６にマップが示されているＥＲ２−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２である請求項２１に記載の発現ベクター。
【請求項２３】
請求項１５に記載のＤＮＡを含む、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域を発現させる発現ベクター。
【請求項２４】
前記ベクターが、図７にマップが示されているＥＲ７９−Ｌｉｇｈｔ−ｐＫＣ１２である請求項２３に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
請求項１９に記載の発現ベクター及び請求項２１に記載の発現ベクターで形質転換された動物細胞株。
【請求項２６】
前記動物細胞株がＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＨＥＫ２９３、またはＮＳＯ細胞株である請求項２５に記載の動物細胞株。
【請求項２７】
請求項１９に記載の発現ベクター及び請求項２３に記載の発現ベクターで形質転換された動物細胞株。
【請求項２８】
前記動物細胞株がＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＨＥＫ２９３またはＮＳＯ細胞株である請求項２７に記載の動物細胞株。
【請求項２９】
請求項１又は３に記載の抗体を含む癌治療用組成物。
【請求項３０】
前記組成物がシスプラチン、ゲムシタビン、ドキソルビシン、５−ＦＵ、イリノテカン及びパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも一つをさらに含む請求項２９に記載の癌治療用組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【公表番号】特表２０１３−５０５７３６（Ｐ２０１３−５０５７３６Ａ）
【公表日】平成２５年２月２１日（２０１３．２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３１９９０（Ｐ２０１２−５３１９９０）
【出願日】平成２１年１１月２日（２００９．１１．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００６３８０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４０６６８
【国際公開日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【出願人】（５０６３７９７８１）グリーン・クロス・コーポレイション (5)
【氏名又は名称原語表記】ＧＲＥＥＮ ＣＲＯＳＳ ＣＯＲＰ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月２１日（２０１３．２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月２日（２００９．１１．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００６３８０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４０６６８
【国際公開日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【出願人】（５０６３７９７８１）グリーン・クロス・コーポレイション (5)
【氏名又は名称原語表記】ＧＲＥＥＮ ＣＲＯＳＳ ＣＯＲＰ．
【Ｆターム（参考）】
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